JP2005532547A - 生細胞の研究方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、１又は複数の生細胞からラマン信号を誘発する方法で、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを細胞に照射することを含む方法に関する。
Description
本発明は、１又は複数の生細胞を研究する方法に関する。特に、本発明は、生細胞の変化を検出するための新たな分光法に関する。
ラマン分光法は、生物学サンプルを研究するのに万能な技術で、分子構造、相互作用、及び細胞間効果に関する情報を提供するものであることが立証されている。［A. Mahadevan-Jansen, R. Richards-Kortum, Journal of Biomedical Optics 1(1996), 31-70; G. J. Thomas Jr. , Annu. Rev. Biomol. Struct. 28 (1999), 1-27; P. R. Carey, The Journal of Biological Chemistry 274 (1999), 26625-26628; D. Pappas, B. W. Smith, J. D. Winefordner, Talanta 51 (2000), 131-144; D. Naumann, FT-Infrared and FT-Raman Spectroscopy in Biomedical Research, in: Infrared and Raman Spectroscopy of Biological Materials, H. U. Gremlich and B. Yan eds. , Marcel Dekker Inc., New York, 2001, pp. 323-377; E. A. Carter, H. G. M. Edwards, Biological Applications of Raman Spectroscopy, in: Infrared and Raman Spectrpscopy of Biological Materials, H. U. Gremlich and B. Yan eds., Marcel Dekker Inc., New York, 2001, pp. 421-476; L. -P. Choo-Smith, H. M. Edwards, H. P. Endtz, J. M. Kros, F. Heule, H. Barr, J. S. Robinson Jr. , H. A. Bruining, G. J. Puppels, Biopolymers (Biospectroscopy) 67 (2002), 1-9］.
赤外分光法は、細胞死及び細胞周期の分析に既に用いられているが、［N. Jamin, P. Dumas, J. Moncuit, W. -H. Fridman, J. -L. Teillaud, G. L. Carr, G.P. Williams, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95 (1998), 4837-4840; S.Boydston-White, T. Gopen, S. Houser, J. Bargonetti, M. Diem, Biospectroscopy 5 (1999), 219-227; H. Y. N.Holman, M. C. Martin, E. A. Blakely, K.Bjornstad, W. R.Mckinney, Biopolymers (Biospectroscopy) 57 (2000), 329-335; H. Y. N. Holman, R. Goth- Goldstein, M. C. Martin, M. L. Russel, W. R. Mckinney, Environ. Sci. Technol. 34 (2000), 2513-2517; P. Lash, M. Boese, A. Pacifico, M. Diem, Vibrational Spectroscopy 848 (2002), 1-11］、これらの研究は、赤外領域の水の強い吸収により、インサイチュー（in situ）で行うことはできない。
赤外分光法と比較して、ラマン分光法は、非観血的技術である利点があり、低い水のラマン散乱断面積という環境のため、生物学的サンプルの研究を行うことが可能である。共焦点ラマン顕微分光計は、高い空間分析能（１μｌ）により、細胞内の様々な位置（例、核心、細胞質）での生細胞のインサイチュースペクトルの測定を可能にしている。［G. J. Puppels, F. F. de Mul, C. Otto, J. Greve, M. Robert-Nicoud, D. J. Arndt-Jovin, T. M. Jovin, Nature 347 (1990), 301-303; G. J. Puppels, H. S. P. Garritsen, G. M. J. Segers-Nolten, F. F. de Mul, J. Greve, Biophys. J. 60 (1991), 1046-1056; G. J. Puppels, J. Greve, Whole cell studies and tissue characterisation by Raman Spectroscopy, in: Advances in Spectroscopy v25, R. J. H. Clark and R. E. Hester eds., John Wiley & Sons Ltd. , Chichester, 1996, pp. 1-47; N. J. Sijtsema, S. D. Wouters, C. J. de Grauw, C. Otto, J. Greve, Appl. Spectrosc. 52 (1998), 348-355; S. Y. Arzhantsev, A. Y. Chikishev, N.I. Koroteev, J. Greve, C. Otto, N. M. Sijtsema, J. Raman Spectrosc. 30 (1999), 205-208］
一方、個別の細胞におけるラマン散乱効率の低さは、測定を困難にしている。ラマン信号は、ＵＶレーザーを用いることによって強化されうる［A. V. Feofanov, A.I. Grichine, L. A. Shitova, T. A. Karmakova, R. I. Yakubovskaya, M. Egret-Chalier, P. Vigny, Biophysical Journal 78 (2000), 499-512］が、ＵＶ中の核酸及びタンパク質の強い吸収は、細胞の表現型を変化させる変性を誘導する[M. S. Feld, J. R. Kramer, Am. Heart J. 122 (1991), 1803- 1805; R. E. Rasmussen, M. Hammer-Wilson, M. W.Berns, Photochem. Photobiol. 49 (1989), 413-418]。
本発明は、先行技術に関連する問題点を１つ以上解決する、ラマン分光法を用いた、生細胞をモニターする改善された方法を提供するものである。特に、本発明は、細胞への損傷を低減するが、高い信号対雑音比（signal-to-noise ratio）を示す、ラマン分光法を用いた細胞をモニターする方法を提供することにある。
第一の態様では、本発明は、１又は複数の生細胞からラマン信号を誘発する方法を提供する。かかる方法は、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを細胞に照射することを含む。
本発明の第二の態様は、ラマン信号を誘発するために、波長７８５±６０ｎｍのレーザーの使用に関する。
上記の通り、本発明は、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを使用し、ラマン信号を誘発するために、生細胞を照射することに関する。この特別な波長は、細胞を死なすことなく、約６００〜１８００ｃｍ−１の振動範囲で、生細胞から強いラマンスペクトルを励磁することができる。
可視領域で、核酸及びタンパク質の吸収が低いことが予測されていても、低いレーザー出力が細胞を損傷することがあり得ることは、当該技術において既知である。出願人による研究により、４８８ｎｍ及び５１４ｎｍで、短時間（例、２〜２０分）の、低い出力レベル（数ミリワット、例、５ｍＷ）でＭＬＥ１２細胞に照射すると、劇的な形態的変化をもたらすことが示され、トリパンブルー試験により細胞死が確認された。細胞死は、ＤＮＡ及び／又はタンパク質分子のエネルギー性光子の吸収によって起きる光触媒のプロセスによるものである。さらに、この低い出力レベルでは、ラマンスペクトルにおける信号対雑音比は低い。
同様の結果が、Puppels et alにより、ヒトリンパ球で報告されている［G. J. Puppels, J. H. F. Olminkhof, G. M. J. Segers-Nolten, C. Otto, F. F. de Mul, J. Greve, Experimental Cell Research 195 (1991), 361-367; J. Greve, G. J. Puppels, Raman microspectroscopy of single whole cells, in: Advances in Spectroscopy v20, R. J. H. Clark and R. E. Hester eds. , John Wiley & Sons, Chichester, 1993, pp. 231-169］。同じ４８８ｎｍ及び５１４ｎｍの波長で、５分間の５ｍWで照射した場合、スペクトル分解を誘因し、生細胞の数は半減する。本発明者らは、細胞の損傷は、レーザーにより惹起された光化学的反応によって起きることを示唆している［J. Greve et al, ibid］。
したがって、現在までは、光子が誘導する細胞死により、細胞代謝のインサイチュー分析用にラマン分光法を日常的に使用することができず、細胞の有糸分裂、細胞分裂、細胞分化、アポトーシス（プログラムされた細胞死）及び細胞のネクローシス等リアルタイムの重要な生物学上のプロセスを経ることが不可能であった。
出願人による研究により、生細胞に、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを照射することは、細胞の分解を低減させながら、同時に高い信号対雑音比を有するラマンスペクトルを導くことを立証している。好ましくは、細胞を死なすことなく、さらに長い時間（例、最長４０分、又はそれ以上）このレーザー光の特別な波長の範囲に生細胞を曝すことができる。この特性により、決められた時間内にスペクトルを連続して測定することができ、細胞内の変化を検出することを可能にする。特に、本発明の方法は、細胞の表現型における変化と、設計された組織構成内の細胞の成長に関連するスペクトルの変化とを一定の時間又は日数モニターするために、培養中の個別の細胞をサンプリングすることを可能にする。
この波長では、細胞の分解と蛍光性は非常に低く、シグナル強度はかなり高い。７８５ｎｍでは、ラマン散乱は、可視領域より若干弱いが、高い処理量（〜３０％）であり、高感度のＣＣＤ検出器を有する最近のラマン分光計の発達により、非常に短い時間で、合理的な信号対雑音比で、個別の細胞のスペクトルを検出することを可能にする。
先行技術において、波長７８５±６０ｎｍのレーザーで、生細胞のラマン信号を誘発することについて、教示も示唆もされていないことは注目すべきである。
好ましい態様では、本出願においてクレームされている方法で用いられるレーザーの波長は、７８５±５０ｎｍ、好ましくは７８５±４０ｎｍ、より好ましくは７８５±３０ｎｍ、特に好ましくは７８５±２０ｎｍである。
特に好ましい態様では、波長７８５±１０ｎｍのレーザーを細胞に照射する。
さらに好ましい態様では、波長７８５±５ｎｍのレーザーを細胞に照射する。
驚くべきことに、そして先行技術の教示に反して、生細胞におけるラマンスペクトルを誘発するために、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを用いることには、下記に概要を示す予期しなかった数多くの利点があった。
好ましい態様では、細胞は、少なくとも約２０ジュールの全エネルギーに曝される。
特に好ましい態様では、細胞は、少なくとも約５０ジュールの全エネルギーに曝される。
さらに好ましい態様では、細胞は少なくとも約１００ジュールの全エルギー、より好ましくは少なくとも約１５０ジュール、最も好ましくは少なくとも約２００ジュールに曝される。
より好ましくは、細胞は少なくとも２５０ジュールの全エネルギー、さらに好ましくは少なくとも２７５ジュールに曝される。
先行技術において、生細胞におけるラマンスペクトルを誘発するために７８５±６０ｎｍの波長を有するレーザーを用いることは、細胞が顕著なスペクトル分解の兆候を示すことなくエネルギーの予期せぬ利点を導く点について、教示も示唆もされていないことは注目すべきである。
波長４５７．５〜６６０ｎｍで細胞に照射した実験に基づく推定は、７８５ｎｍで、細胞の生存度を維持するためのレーザーの最大エネルギーは、約１０ジュールでなければならないと示唆している。しかし、７８５ｎｍで、細胞の生存度を維持するための最大エネルギーは、実際には２７６ジュールであることが見い出された。すなわち予期されていた値の２５倍だった。この結果を図８に示す。
本発明の１つの好ましい態様では、１１５±５０ｍＷの強度で細胞に照射する。
特に好ましい態様では、波長７８５±２０ｎｍのレーザーを、１１５±５０ｍＷの強度で細胞に照射する。好ましくは、細胞に、波長７８５±２０ｎｍを、１１５±５０ｍＷの強度で照射することは、細胞を死なさずに、優れた信号雑音比を有するラマンスペクトルを生じさせる。
特に好ましい態様では、波長７８５±２０ｎｍのレーザーを、１１５±５０ｍＷの強度で細胞に最長４０分間照射する。
別の好ましい態様では、１１５±５０ｍＷのレーザー出力で細胞を最長９０分間照射する。
さらに別の好ましい態様では、１２０±６０ｍＷの強度で細胞を照射する。
特に好ましい態様では、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを、１２０±６０ｍＷの強度で細胞に照射する。
さらに好ましい態様では、波長７８５±６０ｎｍのレーザーを、１２０±６０ｍＷの強度で細胞に最長４０分間照射する。
特に好ましい態様では、１２０±６０ｍＷのレーザー出力で細胞を最長９０分間照射する。
本発明の好ましい１つの態様では、細胞の細胞質内でレーザーの焦点を合わせる。つまり、７８５±６０ｎｍのレーザー光は、細胞を死なすことなく、各種細胞内タンパク質のラマンスペクトル特性を引き出すことができるように、細胞質内で焦点を合わせることができる。
別の好ましい態様では、細胞の核内でレーザーの焦点を合わせる。したがって、７８５±６０ｎｍのレーザー光は、インサイチューで生細胞の核内の一点で焦点を合わせることができ、細胞の遺伝子物質を損傷することなく、各ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の特定のピークやＤＮＡバックボーン、立体配座の折り畳み特有のスペクトルピークを含む核タンパク質及び核内のＤＮＡのラマンスペクトル特性を励起する。
さらに好ましい態様では、細胞外マトリックス内でレーザーの焦点を合わせる。つまり、細胞の外で７８５±６０ｎｍのレーザーの焦点を合わせることは、ヒドロキシアパタイト等の無機質相を含む細胞外マトリックスのラマンスペクトルを誘発する。
１つの好ましい態様では、生細胞のクラスターからラマン信号を誘発するためにレーザーを用いることができ（例、
）、細胞死を誘くことなく、個別の細胞に同様のスペクトルを作成することができる。これにより、組織構造の細胞の成長をモニターするためや、細胞外マトリックスの存在下で生細胞の群における毒性若しくは薬学的な薬剤の効果をモニターするため等に、複数の細胞を同時に研究することが可能となる。
）、細胞死を誘くことなく、個別の細胞に同様のスペクトルを作成することができる。これにより、組織構造の細胞の成長をモニターするためや、細胞外マトリックスの存在下で生細胞の群における毒性若しくは薬学的な薬剤の効果をモニターするため等に、複数の細胞を同時に研究することが可能となる。
本発明の方法は、１又は複数の生細胞における変化をモニターするために用いることができる。好ましくは、細胞をバイオ不活性物質上で培養する。
さらに好ましくは、バイオ不活性物質はポリ−Ｌリシンでコーティングした溶融シリカ(fused silica)である。
さらに好ましくは、バイオ不活性物質は、フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）又は溶融シリカ（ＳｉＯ２）である。
１つの好ましい態様では、バイオ不活性な足場(bioinert scaffold) 上で細胞を培養する。
別の好ましい態様では、コーティングされていない生物活性ガラス、又はゾルゲルのゲルガラス(gel glass)で細胞を培養する。コーティングされていない生物活性ガラスの一例として、４５Ｓ５バイオグラスが挙げられる。コーティングされていないゲルガラスの一例として、メソポーラスシリカ（mesoporoussilica）(ＳｉＯ２)ゲルガラスが挙げられる。このようなコーティングされていないゲルガラスの別の例としては、７０mol% ＳｉＯ２、30 mol % ＣａＯが挙げられる。
本発明の別の好ましい態様は、１又は複数の生細胞における変化を検出する方法で、以下のステップを含む方法に関する：
１）上記の本発明の方法にしたがって、ラマン信号を誘発するステップ、及び
２）一定時間内のラマン信号の変化を測定するステップ。
１）上記の本発明の方法にしたがって、ラマン信号を誘発するステップ、及び
２）一定時間内のラマン信号の変化を測定するステップ。
１つの特に好ましい態様では、かかる方法は細胞の表現型における変化を検出するために用いる。
別の特に好ましい態様では、かかる方法は、細胞分化（有糸分裂）を含む細胞の成長をモニターするために用いる。
別の好ましい態様では、かかる方法は薬学的物質又は細胞毒性物質により誘導された生細胞における変化を検出するために用いる。
別の好ましい態様では、かかる方法は、細胞周期における変化を検出するために用いる。
別の好ましい態様では、かかる方法は、タンパク質レベルにおける変化を検出するために用いる。
別の特に好ましい態様では、かかる方法はＤＮＡ又はＲＮＡレベルにおける変化を検出するために用いる。
１つの別の好ましい態様では、かかる方法は細胞外マトリックスにおける変化を検出するために用いる。
細胞レベルで生物学の現象をモニターする完全に非侵略的なリアルタイム技術が欠失していることを鑑みると、本発明は細胞生物学及び組織工学（tissue engineering）の分野における大きな進歩となるであろう。この技術に関する出願は数多く、細胞内の内因性メカニズムの研究から、外部要因と細胞の相互作用までと幅広い。
一例として、現在は細胞増殖、細胞分化及び細胞死の研究は、細胞を死なすことなく行うことが可能である。異なる化学的要因に対する病理細胞及び癌細胞の応答も、例えば光線力学的治療及び化学療法で検査することができる。インサイチューバイオ光学のスペクトル分析中の迂回する光子(circumventing photon)が誘導する細胞死は、前ガン病変［Mahadevan-Jansen et al, ibid; T.C. Bakker, G. J. Puppels, Y.M. Kraan, J. Greve, L.L. Van Der Maas, C. G. Fidgor, Int. J. Cancer (Pred. Oncol) 74(1997), 20-25; S. R. Hawi, W.B. Campbell, A. Kajdacsy-Balla, R. Murphy, F. Adar, K. Nithipatikom, Cancer. Letters 110 (1996), 35-40］又は組織病態[E. B. Hanlon, R. Manoharaw, T. W. Koo, K.E. Shafer, J. T. Motz, M. Fitzmaurice, J.R. Kramer, I.Itzkan, R.R. Dasari, M.S. Feld, Phys. Med. Biol. 45 (2000), R1-R59; R. Wolthuis, T.C. Bakker Schut, P.J. Caspers, H.P.J. Bushman, T.J. Romer, H.A. Bruining, G. J. Puppels, Raman Spectroscopic Methods for In Vitro and In Vivo Tissue Characterisation, in: Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, W. T. Mason ed., Academic Press, London, 1999, pp. 433-455; L.P-Choo-Smith et al, ibid]の非侵食性のインビボでのモニタリングの可能性があるので、非常に重要である。
さらなる出願は、組織工学の分野に関するものであり、異なる生物活性３Ｄ足場への細胞吸着や遊離イオンとの細胞間相互作用が研究されている。この点に関して、インビトロで生細胞の性質をモニターすることは、組織工学及び、患者への移植前、移植後の再生コンストラクト(tissue engineered constructs)の非侵食的な機能分析に対するバイオリアクターのフィードバック制御を得るための手段として重要である。
各種化学物質との細胞相互作用のインサイチューモニタリングも重要である。特に、生細胞のインサイチュー光学モニタリングによって、毒性化合物用や薬物検査用のバイオ検出システムにおいて、細胞を研究することが可能となる。例えば、タンパク質合成における変化のインサイチュー分析では、動物実験を行う前に、候補薬物の様々な投与量で、ＤＮＡ又はＲＮＡを研究することが可能となる。毒性物質のバイオ光学検出システムに関して、長い照射時間に対する細胞耐性は、毒性物質の同定及び定量化を行うために、リアルタイムソフトウェア分析と組み合わせて生細胞の連続的なサンプリングを行うことを可能にする。
本発明は、さらに実施例を参照して、以下の図面を参照して記載されている。
サンプル調製
継代６〜１５までのＭＬＥ１２細胞を用いた。これらの細胞は、不死化マウス肺上皮細胞であり［K.A. Wikenheiser, D.K. Vorbroker, W.R. Rice, J. C. Clark, C. J. Bachurski, H. K. Oie, J.A. Whitsett, Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993), 11029-11033］、少なくとも継代３０まで、分化された表現型を維持している。細胞は、一定の密度（２．１０４細胞／ｃｍ２）で、４５Ｓ５バイオグラスディスク、及びポリ−Ｌリシン（３０−７０ＫＤａ，３０μｇ／ｍｌ）でコーティングした溶融シリカ物質に播種し、ＨＩＴＥＳ培養培地で、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。［K. A. Wikenheiser et al, ibid］
分析の前に、サンプルをリンスし、標準ＰＢＳ溶液に浸した。死細胞のラマンスペクトルの測定用に、細胞を同じ条件で調製し、死細胞の比率を高めるために４日間培養培地を変えずにインキュベーターに放置した。細胞生存度の検査には、ラマン測定の終了後、標準トリパンブルー染色法を用いた［D. C. Allison, P. Ridolpo, J. Histochem. Cytochem. 28(1980), 700-703］。この検査は、死細胞の色素取込みにより決定した膜の完全性の変化に依存している。
継代６〜１５までのＭＬＥ１２細胞を用いた。これらの細胞は、不死化マウス肺上皮細胞であり［K.A. Wikenheiser, D.K. Vorbroker, W.R. Rice, J. C. Clark, C. J. Bachurski, H. K. Oie, J.A. Whitsett, Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993), 11029-11033］、少なくとも継代３０まで、分化された表現型を維持している。細胞は、一定の密度（２．１０４細胞／ｃｍ２）で、４５Ｓ５バイオグラスディスク、及びポリ−Ｌリシン（３０−７０ＫＤａ，３０μｇ／ｍｌ）でコーティングした溶融シリカ物質に播種し、ＨＩＴＥＳ培養培地で、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。［K. A. Wikenheiser et al, ibid］
分析の前に、サンプルをリンスし、標準ＰＢＳ溶液に浸した。死細胞のラマンスペクトルの測定用に、細胞を同じ条件で調製し、死細胞の比率を高めるために４日間培養培地を変えずにインキュベーターに放置した。細胞生存度の検査には、ラマン測定の終了後、標準トリパンブルー染色法を用いた［D. C. Allison, P. Ridolpo, J. Histochem. Cytochem. 28(1980), 700-703］。この検査は、死細胞の色素取込みにより決定した膜の完全性の変化に依存している。
ラマンスペクトルの測定
スペクトルは、励起用に７８５ｎｍダイオードレーザーを装備した、Renishaw ２０００ラマンマイクロ分光計で測定した。倍率６３×、開口数０．９の水浸型Leica対物レンズを用いて、細胞の浸水を最小限にするために、フリー作動距離を２ｍｍとした。測定用に、レーザー出力は１１５ｍＷとし、信号を１２０秒間インテグレートした。回収後、基質及び培地の影響によるスペクトルの修正を行い、ベースラインの修正には５次方式を使用した。細胞の可視レーザーによる結果を研究するために、７８５ｎｍのレーザーを、波長４８８ｎｍ及び５１４ｎｍで、Ａｒｇｏｎイオンレーザーに変えた。これらの波長で、使用した出力は５ｍＷだった。
スペクトルは、励起用に７８５ｎｍダイオードレーザーを装備した、Renishaw ２０００ラマンマイクロ分光計で測定した。倍率６３×、開口数０．９の水浸型Leica対物レンズを用いて、細胞の浸水を最小限にするために、フリー作動距離を２ｍｍとした。測定用に、レーザー出力は１１５ｍＷとし、信号を１２０秒間インテグレートした。回収後、基質及び培地の影響によるスペクトルの修正を行い、ベースラインの修正には５次方式を使用した。細胞の可視レーザーによる結果を研究するために、７８５ｎｍのレーザーを、波長４８８ｎｍ及び５１４ｎｍで、Ａｒｇｏｎイオンレーザーに変えた。これらの波長で、使用した出力は５ｍＷだった。
結果
ポリＬリシンでコーティングした溶融シリカで培養したＭＬＥ１２細胞の（約５細胞）クラスター用の典型的なラマンスペクトルを、図１に示す。表１は、図１に示すスペクトルピーク割当て（spectral peak assignment）を要約している。ピーク割当ては、文献の基づいている［A. Mahadevan-Janse et al, ibid, D. naumann et al, ibid, E. A. Carter et al, ibid, Puppels et al, Ciophys. J. 1991, ibid; S.A. Overman, L.L. Aubrey, K.E. Reilly, O. Osman, S.J. Hayes, P. Serwer, G.J. Thomas Jr., Biospectroscopy 4 (1998), S47-S56］。ＭＬＥ１２生細胞のラマンスペクトルは、核酸及びタンパク質の振動バンドによって左右され、膜脂質の関与はごく僅かである。中央が１６５９ｃｍ−１に位置するアミドＩバンドと、９３７ｃｍ−１におけるＣ−Ｃ骨格振動の位置は、ＭＬＥ１２細胞のタンパク質の支配的な配座（predominant conformation）が、αヘリカルであることを示唆している。［６］１０９４ｃｍ−１及び８３３ｃｍ−１におけるＤＮＡバンドは、ＤＮＡがＢ型であることを示唆している［Puppels et al, Biophys J, 1991, ibid］。
ポリＬリシンでコーティングした溶融シリカで培養したＭＬＥ１２細胞の（約５細胞）クラスター用の典型的なラマンスペクトルを、図１に示す。表１は、図１に示すスペクトルピーク割当て（spectral peak assignment）を要約している。ピーク割当ては、文献の基づいている［A. Mahadevan-Janse et al, ibid, D. naumann et al, ibid, E. A. Carter et al, ibid, Puppels et al, Ciophys. J. 1991, ibid; S.A. Overman, L.L. Aubrey, K.E. Reilly, O. Osman, S.J. Hayes, P. Serwer, G.J. Thomas Jr., Biospectroscopy 4 (1998), S47-S56］。ＭＬＥ１２生細胞のラマンスペクトルは、核酸及びタンパク質の振動バンドによって左右され、膜脂質の関与はごく僅かである。中央が１６５９ｃｍ−１に位置するアミドＩバンドと、９３７ｃｍ−１におけるＣ−Ｃ骨格振動の位置は、ＭＬＥ１２細胞のタンパク質の支配的な配座（predominant conformation）が、αヘリカルであることを示唆している。［６］１０９４ｃｍ−１及び８３３ｃｍ−１におけるＤＮＡバンドは、ＤＮＡがＢ型であることを示唆している［Puppels et al, Biophys J, 1991, ibid］。
顕微ラマン分光計の高い空間解像度によって、同じ細胞の異なる位置からスペクトルを集めることが可能となる。単一の生肺細胞における核と細胞質との間のスペクトル差を、図２に示す。細胞質に対応するスペクトルの方がかなり弱く、予測通りＤＮＡと関連するピークが欠如している。このことは、核は、図１に示す細胞クラスターのスペクトルに最も寄与していることを示唆している。異なる細胞（ｎ＝１０）と核内の異なる位置（ｎ＝３）で測定したスペクトルとでは、些細な差しか生じなかった。これらの差は、１４８７ｃｍ−１、１４２２ｃｍ−１、１３７５ｃｍ−１、７８９ｃｍ−１での核塩基、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの量に相応する。１１５０ｃｍ−１と１５１０ｃｍ−１との間のインテグレートされたラマン信号の標準偏差は、約５％である。しかし、１４４９ｃｍ−１及び１０９５ｃｍ−１でのピークに対応する領域の割合として計算された、ＤＮＡに対するタンパク質の割合は、核内の焦点位置に応じて、１．９〜２．７の範囲内の変動を示した。これらの値は、顆粒球にラマン分光計を使用した報告された値と非常に似通っている。
７８５ｎｍレーザーでのＭＬＥ１２細胞での結果を理解するために、測定と同じレーザー波長（７８５ｎｍ）及び出力（１１５ｍＷ）を用いた４０分間のレーザー照射の間に、８０秒の短い測定を３回行った。図３は、典型的なＭＬＥ１２細胞の、４０分の照射前（図３ａ）と照射後（図３ｂ）の顕微鏡写真を示す。図３ｂの細胞は、形が微妙に変化し、スペクトルは変化しなかった。トリパンブルー染色を認めなかったので細胞の生存が証明された。同じ実験を５ｍＷレーザー出力で４８８ｎｍ及び５１４ｎｍのレーザーで行ったところ、細胞の形態は５分という短い時間で著しく変化した。トリパンブルー検査により、細胞は青く染色されたので、細胞が死んでいることを示唆した。細胞の可視レーザー照射前後の顕微鏡写真を図４（４８８ｎｍ、５ｍＷで１０分間）及び図５（５１４ｎｍ、５ｍＷで２０分間）に示す。
ラマン分光計が、生細胞と死細胞とを区別する性能を証明するために、培養培地を変えずに、インキュベーターに４日間隔離して放置されていた細胞のスペクトルを測定した。トリパンブルー検査が、死細胞の割合の高さを示した。測定した細胞の死を確認し、測定したスペクトルへの干渉を避けるために、ラマン測定が終了する毎にトリパンブルー検査を行った。死細胞の典型的なスペクトルは、図６ａに示した。比較しやすいように、生細胞のスペクトルを一緒に示した（図６ｂ）。細胞死は、スペクトル差の図（図６ｃ）に示すように、タンパク質とＤＮＡ両方のスペクトルの特徴に多くの変化をもたらす。主な違いは、１５３０〜１７００ｃｍ−１及び１０７０〜１１５０ｃｍ−１のスペクトルの範囲間で生じる。死細胞のスペクトルのハイピークは、１５７８及び１６０７ｃｍ−１であり、新たなピークは１１１４ｃｍ−１である。
組織工学を適用するには、細胞は吸着、増殖することができ、分化した表現型を長い期間維持することが可能でなくてはならない。ポリ−Ｌ−リシンでコーティングした溶融シリカは、生体不活性なので、コーティングされていないソルゲル由来生物活性ガラス及びゲルガラスからなる生物活性な足場の方が対象物に向いている［W. Cao, L.L. Hench, Ceramics International 22 (1995), 493-507; L.L. Hench, J. K. West, Life Chemistry Reports 13 (1996), 187-241; L.L. Hench, Biomaterials 19 (1998), 1419-1423; J.R. Jones, L.L. Hench, Materials Science and Technology 17 (2001), 891-900］。４５S５バイオガラス(重量で４５％ＳｉＯ２、２４．５％ ＮＡ２Ｏ、２４．５％Ｃａｏ、及び６％Ｐ２Ｏ５)は、細胞基質の相互作用（例、制御されたイオン遊離）により生じる遺伝子の活性化に関連する細胞の吸着及び増殖に重要な役割を果たしていることは、文献［I. D. Xynos, M. V. Hukkanen, J. J. Batten, L. D. Buttery, L. L. Hench, J. M. Polak, Calcif. Tissue Int. 67(2000), 321-329; I. D. Xynos, A. J. Edgar, L. D. Buttery, L. L. Hench, J. M. Polak, Biochemical and Byophysical Research Communications 276 (2000) 461-465］に記されている。しかし、４５S５バイオガラスのラマンスペクトルは、Ｐ−Ｏ振動によるより強い信号を有する溶融シリカの単純性がないので、その測定及びデータ処理がより複雑なものになっている。４５Ｓ５バイオガラスディスクで成長した細胞中の単一のＭＬＥ１２肺細胞のラマンスペクトルを、図７に示す。９６０ｃｍ−１付近の４５Ｓ５バイオガラス信号の減算が、生物活性表面で形成されたヒドロキシアパタイト（ＨＡ）のＰ−Ｏ群の対称伸縮（symmetric stretching）に対応する強いバンドによるエラーを導くことにより、細胞のラマンスペクトルを得るのが困難である［I. Rehman, L.L. Hench, W. Bonfield, Bioceramics 6 (1993), 123-128］。しかし、この歪みは、本発明の目的を妨げるものではない。なぜなら、タンパク質の２次的構造の決定を少し困難なものとする９３７ｃｍ−１でのタンパク質の骨格Ｃ−Ｃ振動を包含せず、ＤＮＡバンドの干渉が起きないからである。
図７に示すスペクトルは、特に、ＤＮＡ塩基による１４８７ｃｍ−１、１４２２ｃｍ−１、１３７５ｃｍ−１及び１２５２ｃｍ−１バンドにおいて、図１及び２のスペクトルと異なる部分がある。この僅かな変動は、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングした溶融シリカを基質として用いて、各種細胞を測定した場合にも見られた。しかし、ＤＮＡのマーカーとしてのバンドのスペクトル位置及びタンパク質の２次的構造は図１、２及び７において同じであり、４５ｓ５バイオガラス基質がＤＮＡや細胞内のタンパク質の構造を妨害しないことを示唆している。
高出力の７８５ｎｍレーザー（サンプルでは
）の使用が、生細胞に１時間連続して曝した後にも、細胞死を誘導しないという、予測に反した結果に続き、各細胞の測定したラマンスペクトルの有意性を調査する研究が行われた。先ず、ラマンスペクトルと、細胞周期を通しての進行、細胞死及び分化等の基本的な生物学上プロセスにおける生細胞の生化学的及び生物物理学的な変化とを関連づけた。次に、細胞を、化学薬品、各種基質、毒素又は薬品に曝したときの細胞の行動変化をモニターした。これらの実験の結果を以下に記載する。
）の使用が、生細胞に１時間連続して曝した後にも、細胞死を誘導しないという、予測に反した結果に続き、各細胞の測定したラマンスペクトルの有意性を調査する研究が行われた。先ず、ラマンスペクトルと、細胞周期を通しての進行、細胞死及び分化等の基本的な生物学上プロセスにおける生細胞の生化学的及び生物物理学的な変化とを関連づけた。次に、細胞を、化学薬品、各種基質、毒素又は薬品に曝したときの細胞の行動変化をモニターした。これらの実験の結果を以下に記載する。
（ｉ）細胞周期
ＤＮＡ振動（ＤＮＡ鎖及び窒素性塩基の両方）に対応するピークが、生細胞のラマンスペクトルに存在するため、これらのピークのマグニチュードは、細胞周期において細胞が進行するにしたがって変化しなければならない。異なる細胞周期相の細胞間の相違を観察するために、細胞を高密度で播種し、上部に円形細胞がある連続した細胞層を形成した。連続した細胞層の各細胞は、他の細胞に囲まれ、栄養分へのアクセスが少ないため、Ｇ１／Ｇ０相であるようだ。反対に、上層の円形細胞は、分割するための充分な空間が回りにあるため、細胞有糸分裂（Ｓ／Ｇ２相）を含む周期中のどの段階であってもよい。
ＤＮＡ振動（ＤＮＡ鎖及び窒素性塩基の両方）に対応するピークが、生細胞のラマンスペクトルに存在するため、これらのピークのマグニチュードは、細胞周期において細胞が進行するにしたがって変化しなければならない。異なる細胞周期相の細胞間の相違を観察するために、細胞を高密度で播種し、上部に円形細胞がある連続した細胞層を形成した。連続した細胞層の各細胞は、他の細胞に囲まれ、栄養分へのアクセスが少ないため、Ｇ１／Ｇ０相であるようだ。反対に、上層の円形細胞は、分割するための充分な空間が回りにあるため、細胞有糸分裂（Ｓ／Ｇ２相）を含む周期中のどの段階であってもよい。
円形細胞と連続層の細胞とのラマンスペクトル差を、図９に示す。円形細胞は、７８８ｃｍ−１（１００％増加）、１０９５ｃｍ−１、及び１５７８ｃｍ−１での高いピークによって示されるように高い量の核酸を示す。これらの差は、下層の細胞がＧ１／Ｇ０相にあり、Ｓ／Ｇ２相の細胞有糸分裂を行う直前の上層の円形細胞と比較して核酸の量が少ないという仮説を確認するものであった。
（ｉｉ）細胞死
細胞死は、各種要因によって起こり得る。また細胞内の多くの生化学的、生物物理的変化を誘因する。特に、細胞死は、タンパク質の変性及び構造変化及びＤＮＡの細分化に関連している。培養には、常に死細胞が数パーセント含まれているので、新鮮な培養培地における細胞死を調査した。弱い細胞吸着を示す細胞が、可視状態で少数同定され、そのラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定後、細胞死を確認するためにトリパンブルーの生存度テストを行った。図１０は、Ａ５４９細胞の生細胞及び死細胞のラマンスペクトルを示す。
細胞死は、各種要因によって起こり得る。また細胞内の多くの生化学的、生物物理的変化を誘因する。特に、細胞死は、タンパク質の変性及び構造変化及びＤＮＡの細分化に関連している。培養には、常に死細胞が数パーセント含まれているので、新鮮な培養培地における細胞死を調査した。弱い細胞吸着を示す細胞が、可視状態で少数同定され、そのラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定後、細胞死を確認するためにトリパンブルーの生存度テストを行った。図１０は、Ａ５４９細胞の生細胞及び死細胞のラマンスペクトルを示す。
これらの細胞のラマンスペクトルは、よく吸着した安定した細胞と比較して、スペクトル差は大きかった。死細胞のスペクトルは、７８６ｃｍ−１及び１０９５ｃｍ−１で核酸に対応するピーク強度が著しく減少し、１００５ｃｍ−１でフェニルアラニンに対応するピークが著しく減少した。
Ａ５４９細胞の生細胞と死細胞（細胞死のマーカーとしてのさらなる研究に用いることができる）とのスペクトル差を定量するために、最も激しい変化が観察されたスペクトル領域でピークフィッティングを行った：７７０〜８０３ｃｍ−１、９９５〜１０２０ｃｍ−１、１０２０〜１１５０ｃｍ−１、１１９０〜１３８５ｃｍ−１。この分析の結果は、Ａ５４９生細胞の値に対する比率で、図１１に示す。
細胞死に最も敏感な分子振動は、８０％減少する７８８ｃｍ−１におけるＤＮＡのＯ−Ｐ−Ｏ伸縮であると思われる。この著しい減少は、リン酸ジエステル結合の切断が、ＤＮＡ鎖の断片化を誘因することを示唆している。核酸に対応するピークの減少の他に、Ａ５４９死細胞のラマンスペクトルは、タンパク質の振動における変化を示す。図１１は、フェニルアラニンに対応する１００５ｃｍ−１ピークからの４５％の大幅な減少があることを示している。タンパク質構造における変化も観察された。任意のコイルに対応する１２３１ｃｍ−１におけるタンパク質のピークからの６６％の減少は、タンパク質鎖が細胞死の間αヘリックス及びβシートとさらに会合することを示唆している。このことは、１６６０ｃｍ−１アミドＩの幅が、３８ｃｍ−１から２８ｃｍ−１に減少したことによっても確認される。死細胞中のタンパク質構造における同様の変化が、シンクロトンＦＴＩＲ顕微鏡を用いた細胞死に関する文献で報告されている。
（iii）細胞分化
マウス胎性幹細胞（ｍＥＳ）株は、初期胚に由来する多能性細胞であり、インビトロで繁殖し、分化に誘導することができる。ｍＥＳ細胞は、胚様体の形成を介して、分化に誘導される。ラマンスペクトルを、分化の１６及び２０日後に測定した（図１２）。分化段階中ＤＮＡの量が安定していると仮定して、スペクトルを７８８ｃｍ−１でＤＮＡピークに標準化した。
マウス胎性幹細胞（ｍＥＳ）株は、初期胚に由来する多能性細胞であり、インビトロで繁殖し、分化に誘導することができる。ｍＥＳ細胞は、胚様体の形成を介して、分化に誘導される。ラマンスペクトルを、分化の１６及び２０日後に測定した（図１２）。分化段階中ＤＮＡの量が安定していると仮定して、スペクトルを７８８ｃｍ−１でＤＮＡピークに標準化した。
図１３は、未分化ＥＳ細胞と、胚様体を介して分化した細胞の１６日及び２０日後の、タンパク質に対応するピークのマグニチュードを示す。最も著しい変化は９３８ｃｍ−１で起こり、分化の１６日後に３４３％の増加（Ｐ＝０．００２４）及び２０日後に２１２％の増加（Ｐ＝０．０００６）を観察した。Ｃ−Ｈピークの著しい増加も観察された。培養液内で、１６日後に１８４％（Ｐ＝０．０００１）、２０日後に１２８％（Ｐ＝０．０００５）。アミノ酸に対応するピークのマグニチュードも著しく高かった。チロシンでは、１６日後に１６９％（Ｐ＝０．０００７）、２０日後に１２８％（Ｐ＝０．０００５）；フェニルアラニンでは１６日後に１００％（Ｐ＝０．０００８）及び２０日後に５７％（Ｐ＝０．００４７）。
分化細胞におけるタンパク質の著しい増加は、細胞の分化において通常観察される特定のタンパク質の生産の増加に対応する。分化細胞のラマンスペクトルで観察された変化は、培養液が、異なる細胞形態学で観察されたように、異なる表現型の細胞の混合物であるとことによるものかもしれない。
一本鎖ＤＮＡの濃度は、生細胞のラマンスペクトルの８１３ｃｍ−１におけるピークと比例している。分化中のｍＥＳ細胞内のＲＮＡ量の変化を、図１４に示す。ＲＮＡピークの強度は、培養液内で１６日後に、分化細胞で５０％減少する（Ｐ＝０．００４４）。１６日後のＲＮＡ濃度の増加は、分化２０日後の細胞に対応するラマンスペクトルのＲＮＡピークの増加により示唆されている。
ｍＥＳ細胞で観察されたＲＮＡの高い濃度は、ＲＮＡが翻訳されていないことを示唆している。これは、観察されたタンパク質の量の低さと一致している。分化細胞におけるＲＮＡの減少は、図１３で観察されるタンパク質量の増加と関連しうる。細胞は、分化中に新しい特異タンパク質を産生するために、ＥＳ細胞で観察されるＲＮＡのプールを用いているようである。この結果は、翻訳されていないｍＲＮＡ（抑圧されたｍＲＮＡ）が初期胚形成で観察されたという文献の報告と一致している。
（ｉｖ）Ａ５４９細胞における毒性洗浄剤トリトンＸ１００の影響
Ａ５４９細胞を１００μＭトリトンＸ１００に２４、４８、７２時間曝した後のラマンスペクトルを図１５に示す。
Ａ５４９細胞を１００μＭトリトンＸ１００に２４、４８、７２時間曝した後のラマンスペクトルを図１５に示す。
図１５と図１０を比較すると、トリトンＸ１００での処理後、対応するラマンスペクトルは、死細胞のスペクトルと同様の変化を辿る。図１６は、ＤＮＡの減少とタンパク質のラマンピークの減少と、処理時間との関係を示す。
（ｖ）骨小結節（bone nodule）の形成及びミネラル化
初期ヒト骨芽細胞を、新たな骨の形成を誘導するために、４５Ｓ５バイオガラス基質で培養した。新しい骨の形成は、７８５ｎｍのレーザーを有するラマン顕微鏡を用いて高感度で検出することができ、ハイドロキシアパタイトのラマンピーク９６２ｃｍ−１を検出した（骨のミネラル段階）。しかし、培養液で１０日後、ラマンスペクトルでは骨小結節の形成の証拠は観察されなかった（図１７）。内因性細胞構成成分に対応するピークのみが測定された。
初期ヒト骨芽細胞を、新たな骨の形成を誘導するために、４５Ｓ５バイオガラス基質で培養した。新しい骨の形成は、７８５ｎｍのレーザーを有するラマン顕微鏡を用いて高感度で検出することができ、ハイドロキシアパタイトのラマンピーク９６２ｃｍ−１を検出した（骨のミネラル段階）。しかし、培養液で１０日後、ラマンスペクトルでは骨小結節の形成の証拠は観察されなかった（図１７）。内因性細胞構成成分に対応するピークのみが測定された。
しかし、骨細胞の培養培地に、ベータグリセロリン酸（ＢＧＰ）を添加したときに、ハイドロキシアパタイトに対応する強いピークを、ラマンスペクトルで検出した（図１７）。
要約すると、本発明は、共焦点ラマン顕微鏡が、不活性シリカ及び生物活性ゾルゲルのガラス（４５Ｓ５バイオガラス）で培養した個別生細胞のインサイチュー特徴付けに適切であることを立証している。本研究者らは、波長７８５ｎｍで、１１５ｍＷ又は１２０ｍＷの高いレーザー出力を４０分間又はそれ以上使用して、細胞スペクトル及び形態学を変更することなく、又細胞死を誘導することなく、細胞の生物学的な状態を連続してモニタリングすることを可能にしていることを示した。ＭＬＥ１２細胞生細胞と死細胞との実質的な違いを立証した。現在クレームされている方法は、細胞周期の変化、細胞分化及び細胞死と関連する変化のモニタリングに適切である。
本発明に記載の方法は、当業者によっては明らかである各種変更や修正は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく行うことができる。本発明は、好ましい態様を参照して記載されているが、本発明を実施するために、化学又は関連分野の熟練者が行う記載された態様の各種修正を行う場合には、下記のクレームの範囲内でなければならない。
Claims (29)
- １又は複数の生細胞から、ラマン信号を誘発する方法で、波長７８５±６０ｎｍのレーザーで細胞を照射することを含む方法。
- 波長７８５±２０ｎｍのレーザーで細胞を照射することを含む、請求項１記載の方法。
- 細胞を、少なくとも約２０ジュールの全エネルギーに曝すことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
- 細胞を、少なくとも約１００ジュールの全エネルギーに曝すことを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の方法。
- 細胞を、少なくとも約２００ジュールの全エネルギーに曝すことを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の方法。
- 細胞を、少なくとも約２７５ジュールの全エネルギーに曝すことを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の方法。
- 細胞に、１１５±５０ｍＷの強度で照射することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
- 細胞に、１２０±６０ｍＷの強度で照射することを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載の方法。
- 細胞に、最長４０分間照射することを特徴とする、請求項１〜８いずれか記載の方法。
- 細胞の細胞質内でレーザーの焦点を合わせることを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の方法。
- 細胞の核内でレーザーの焦点を合わせることを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の方法。
- 細胞外マトリックス内でレーザーの焦点を合わせることを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の方法。
- 細胞を、バイオ不活性物質上で培養することを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の方法。
- バイオ不活性物質が、ポリ−Ｌ―リシンでコーティングした溶融シリカであることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
- 細胞を、生物活性足場上で培養することを特徴とする、請求項１〜１４いずれか記載の方法。
- 細胞を、コーティングされていない生体不活性ガラス又はゾルゲルのゲルガラスで培養することを特徴とする、請求項１〜１２いずれか記載の方法。
- １又は複数の生細胞における変化を検出する方法で、
（i）請求項１〜１６いずれかに従ってラマン信号を誘発するステップ；及び
（ii）一定の時間、ラマン信号の変化を測定するステップ、
を含む方法。 - 細胞表現型の変化を検出するための請求項１７記載の方法。
- 細胞の成長をモニターするための、請求項１７記載の方法。
- 薬学的物質又は細胞毒性物質により誘導された生細胞の変化を検出するための、請求項１７記載の方法。
- タンパク質レベルの変化を検出するための、請求項１７〜２０いずれか記載の方法。
- ＤＮＡ又はＲＮＡレベルの変化を検出するための、請求項１７〜２０いずれか記載の方法。
- 細胞外マトリックス内の変化を検出するための、請求項１７〜２０いずれか記載の方法。
- 生細胞の細胞周期を検出するための、請求項１〜２３いずれか記載の方法。
- 生細胞の細胞周期の変化を検出するための、請求項１〜２４いずれか記載の方法。
- アポトーシスによる細胞死の開始を検出するための、請求項１〜２５いずれか記載の方法。
- ネクローシスによる細胞死の開始を検出するための、請求項１〜２６いずれか記載の方法。
- １又は複数の生細胞におけるラマン信号を誘発するための、波長７８５±６０ｎｍのレーザーの使用。
- レーザーが、波長７８５±２０ｎｍであることを特徴とする、請求項２８記載の使用。
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