JP2015094637A - 吸収顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】モル濃度の値が低い試料や厚みの少ない試料上の各部位の濃度等の差異を適切に知ることのできる吸収顕微鏡を提供すること。【解決手段】光学キャビティを構成する凹面鏡１２，１３のうち、少なくとも、検査光となるレーザー光の入射側に位置する凹面鏡１２の背面に平凸レンズ１７を形成し、凹面鏡１２の背面側から照射された検査光が屈折を伴わずに凹面鏡１２，１３に共通する集光点Ｐに到達するようにすることで、光路長増幅のために必要とされる凹面鏡１２と凹面鏡１３の間の反射の繰り返しに伴う集光点の位置ずれを抑制し、吸収顕微鏡１における空間分解能を向上させる。【選択図】図１

Description

本発明は、照射側の検査光の強度と試料を透過した出射側の検査光の強度から求まる吸光度を利用して試料の特性を探る吸収顕微鏡の改良に関する。

試料に照射される検査光の強度をＩ_０，試料を透過した出射側の検査光の強度をＩ，モル吸光係数をε，モル濃度をｃ，試料を透過する検査光の光路長をｌ，吸光度をO.D.として、O.D.＝−ｌｏｇ_１０（Ｉ／Ｉ_０）＝ε・ｃ・ｌで表されるランバート・ベールの法則を応用した吸収測定装置が既に公知である。

この種の吸収測定装置は、キュベット（箱型の透明容器）を満たすようにして収められた試料、例えば、液体やガス等の分析に利用されるのが一般的であり、厚みの少ない試料、例えば、厚さ１０μm前後の細胞といった試料の分析には余り向かない。

その理由は、試料を透過する検査光の光路長ｌが余りにも短いため、試料を透過することで発生する光の減衰が少なく、試料上の各部位における性状の違い、例えば、試料上の各部位に濃度等の差異があった場合でも、その差異が吸光度O.D.の検査結果に十分な影響を与えないからである。
O.D.＝−ｌｏｇ_１０（Ｉ／Ｉ_０）＝ε・ｃ・ｌで表されるランバート・ベールの法則から明らかなように、モル濃度ｃの値が低い試料の場合にも前記と同様の問題が生じる。

そこで、本出願人らは、オゾンの濃度測定等に用いられるキャビティリングダウン分光法（非特許文献１参照）や風洞の気流診断等に用いられるキャビティリングダウン分光法（非特許文献２参照）に利用される光学キャビティ構造を転用して試料を挟んで設置される一対の鏡の間で検査光を往復させることにより、試料を透過する検査光の実質的な光路長を増大させ、モル濃度の値が低い試料や厚みの少ない試料上の各部位における濃度等の差異を吸光度の検査結果に明確に反映させる技術に想到した。

なお、非特許文献１に開示されるキャビティリングダウン分光法は、検査光としてパルスレーザーを用い、対向する一対の平面鏡の間で検査光を複数回往復させ、一方の平面鏡の裏面から漏れ出す光が減衰する際の時定数を求めることによって試料である吸収物質の濃度を測定するものである。つまり、試料である吸収物質が全体として均一であるもの、例えば、大気を構成する気体等を測定対象としたものであって、試料上の各部位の濃度等の差異を識別する機能（空間分解能）は全くなく、一対の鏡によって構成される光学キャビティ構造の類似性を除き、試料上の各部位における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を吸光度に明確に反映させようとする本発明とでは、発明の技術思想や構成が全く相違する。
また、非特許文献２に開示されるキャビティリングダウン分光法は、検査光としてレーザー光を用い、一対の凹面鏡の間で検査光を複数回往復させて共振させることで実効吸収長を増大させた吸収分光法であるが、やはり、試料上の各部位の濃度等の差異を識別する機能（空間分解能）は殆どなく、一対の凹面鏡によって構成される光学キャビティ構造の類似性を除き、試料上の各部位における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を吸光度に明確に反映させようとする本発明とでは、発明の技術思想や構成が全く相違する。
つまり、これらのキャビティリングダウン分光法と本発明との共通点は、試料を挟んで設置される一対の鏡の間で検査光を往復させることにより、試料を透過する検査光の実質的な光路長を増大させるという点のみである。

非特許文献２に開示される光学キャビティ構造にあっては、キャビティを構成する一対の凹面鏡の集光点および中心軸が一致するので、この集光点に厚みの少ない試料、例えば、厚さ１０μm前後の細胞といった試料を配置し、一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光を一方の凹面鏡の反射面と他方の凹面鏡の反射面との間で試料を透過して繰り返し反射させ、他方の凹面鏡の背面から出射した検査光の強度を測定するようにすれば、一見、空間分解能が確保され、試料上の特定部位つまり集光点における試料の濃度等の差異を適切に増幅して反映した吸光度が求められそうなものであるが、非特許文献２のＦＩＧ．５に見られるように、実際には、集光点における集光スポットの径は大きく、このことは、検査光が収差の影響を受けて試料上の様々な部位を透過して集光スポットの径を広げていることを意味する。
従って、非特許文献２に開示されるような光学キャビティ構造をそのまま転用して試料を透過する検査光の実質的な光路長を単純に増大させたとしても、試料上の各部位の濃度等の差異を識別するに足る十分な機能（空間分解能）を備えた吸収顕微鏡を提供することはできない。

「光資源を活用し、創造する科学技術の振興−持続可能な「光の世紀」に向けて−」，文部科学省科学技術・学術審議会・資源調査分科会報告書，平成１９年９月５日，［online］，文部科学省ホームページ，［平成２５年１１月６日検索］，インターネット＜http://www.mext.go.jp/b_menu/shingi/gijyutu/gijyutu3/toushin/07091111/002.htm＞（３地球環境を光で計測する／（２）光を応用したその場環境計測／(2)新しい光応用環境計測技術：キャビティリングダウン分光法，図１４） 高柳大樹・松井信・小柴公也・荒川義博 共著，「高反射ミラーによるレーザー吸収分光法の感度向上」，プラズマ応用科学会，プラズマ応用科学 Ｖｏｌ.１３，２００５，ｐｐ．７５−８０，［online］、東京大学学術機関リポジトリホームページ，［平成２５年１１月６日検索］，インターネット＜http://repository.dl.itc.u-tokyo.ac.jp/dspace/bitstream/2261/35650/1/16_Org_Plasma_13_75.pdf＞（３実験装置，ＦＩＧ．２，ＦＩＧ．５）

本発明の目的は、モル濃度の値が低い試料や厚みの少ない試料、例えば、細胞等といった試料であっても、試料上における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を適切に知ることのできる吸収顕微鏡を提供することにある。

本出願人らは、集光スポットの径が広がる原因を追究し、その原因が、凹面鏡の反射面の形状や寸法の異常によるものではなく、一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光が一方の凹面鏡を通過する際に生じる光の屈折によるものであること、つまり、検査光の最初の集光点の位置が一対の凹面鏡に共通する集光点の位置から光軸方向にずれることによって起こるものであるとの知見を得た。
本発明の吸収顕微鏡は、光の透過を許容する反射面を対向させて相互の集光点および中心軸が一致するように配置した一対の凹面鏡の間の集光点に試料を設置し、一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光を前記一方の凹面鏡の反射面と他方の凹面鏡の反射面との間で前記試料を透過して繰り返し反射させ、前記他方の凹面鏡の背面から出射した検査光を受光素子に収束させて強度を測定し、照射側の検査光の強度と出射側の検査光の強度に基いて前記集光点に位置する試料上の部位の吸光度を求めるようにした吸収顕微鏡であり、前記目的を達成するため、特に、
前記一方の凹面鏡の背面に、前記一方の凹面鏡の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズを形成することにより、前記一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光が屈折を伴わずに前記集光点に到達するようにしたことを特徴とする構成を有する。

以上の構成によれば、まず、一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光が一方の凹面鏡の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズと前記一方の凹面鏡を透過して、集光点に配置された試料に照射される。この際、一方の凹面鏡の背面に形成された平凸レンズにより前記一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光の屈折が排除され、直進する検査光が一対の凹面鏡に共通した集光点に導かれる。
そして、試料に照射された検査光の一部が試料を透過して他方の凹面鏡の反射面に至り、更に、その一部が他方の凹面鏡の反射面で反射されて集光点に配置された試料上の同一部位つまり集光点に照射され、その一部が試料を透過して一方の凹面鏡の反射面に戻る。
以下、一方の凹面鏡の反射面と他方の凹面鏡の反射面との間で試料上の同一部位つまり集光点を透過して同様の反射が繰り返される。試料を透過する検査光は必ず試料上の同一部位つまり集光点を通るので、反射の繰り返しによって集光点の集光スポットの径が増大することはない。
そして、前記他方の凹面鏡の反射面で反射されずに其の背面から出射した検査光、つまり、一対の凹面鏡の間を繰り返し往復した後の検査光の強度が受光素子により測定され、既知の値をとる照射側の検査光の強度と出射側の検査光の強度に基いて、集光点に位置する試料上の部位の吸光度が求められる。
反射の繰り返しによって試料上の同一部位つまり集光点を繰り返し透過する検査光の光路長が増幅されるので、モル濃度の値が低い試料や厚みの少ない試料、例えば、細胞等といった試料であっても、試料上における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を吸光度の値から適切に知ることができる。
また、この吸光度は試料上の同一部位つまり径の小さな集光点を透過した検査光の情報のみを反映した値であり、試料上の他の部位を透過した検査光の影響といった外乱を含まない値であるので、この値によって試料上における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を適切に知ることができる。

更に、前記他方の凹面鏡の背面に前記他方の凹面鏡の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズを形成することにより、前記他方の凹面鏡の背面側から出射する検査光の屈折を除去するようにしてもよい。

他方の凹面鏡の背面に其の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズを形成して他方の凹面鏡の背面側から出射する検査光の屈折を除去し、受光素子に収束する検査光のスポット径を小さくすることができるため、試料上の各部位の濃度等の差異を更に正確に知ることができるようになる。

前述した各平凸レンズは、これに対応する凹面鏡と独立した平凸レンズとして形成し、貼り合わせによって対応する凹面鏡と光学的に一体化してもよいし、あるいは、その製造段階で対応する凹面鏡に一体成形してもよい。

前記一対の凹面鏡の反射面の球面曲率は等しく設定することが望ましい。

一対の凹面鏡に共通する集光点の位置つまり試料の配置位置が凹面鏡と凹面鏡の間の中央に位置することになるので、試料の両側に等しいワーキングディスタンスが確保され、試料の設置作業等を容易に行なうことができる。

また、前記他方の凹面鏡の背面から前記受光素子に到る光路上において前記受光素子に直近した位置にピンホールを配置してもよい。

ピンホールを設置することで他方の凹面鏡の背面から出射した検査光の光束の中心部のみが受光素子に到達することになるので、凹面鏡間での反射の繰り返しに際して集光点のスポット中心を通った検査光のみを受光素子に送ることが可能となり、外乱を排除して試料上の各部位の濃度等の差異をより正確に知ることができるようになる。

更に、前記集光点に設置された試料に対して前記中心軸に直交した第１の方向と前記中心軸および前記第１の方向に直交した第２の方向の各々に送りを掛ける試料送り手段と、
予め設定された移動量に基いて前記試料送り手段を駆動することにより前記試料上の各部位を順に前記集光点に位置決めし、各位置決め位置で求められた吸光度を各位置決め位置に対応させてメモリに記憶させ、前記メモリに記憶された各位置決め位置と吸光度の対応関係に基いて前記試料上の各部位における吸光度を前記試料の全範囲に亘り吸光度に応じた濃度もしくは色彩でモニタ上に一括して拡大して可視表示する顕微鏡画像生成手段とを備えた構成とすることが望ましい。

このような構成を適用した場合、試料送り手段によって試料上の各部位が次々と集光点に位置決めされ、その位置で求められた吸光度の値が各軸の位置決め位置、つまり、一対の凹面鏡に共通する中心軸に直交した第１の方向と一対の凹面鏡に共通する中心軸および第１の方向に直交した第２の方向とで構成される直交２軸上の座標位置に対応してメモリに記憶され、メモリに記憶された各位置決め位置と吸光度との対応関係に基いて試料上の各部位における吸光度が試料の全範囲に亘って吸光度に応じた濃度もしくは色彩でモニタ上に一括して拡大して可視表示される。
試料の各部位の吸光度に応じた濃度や色彩を試料の全範囲に亘ってモニタ上に一括して可視表示して得られる画像は、試料全体を照射して得られる透過光のコントラストを増幅し且つスケールを拡大して直視した映像と実質的に等価であるから、このモニタを参照することによって、試料上の各部位における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を目視によって容易に観察することができる。

本発明の吸収顕微鏡は、一対の凹面鏡の間に生じる反射の繰り返しによって試料上の同一部位つまり集光点を繰り返し透過する検査光の光路長を増幅するようにしているので、モル濃度の値が低い試料や厚みの少ない試料、例えば、細胞等といった試料であっても、試料上における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を吸光度の値から適切に知ることができる。
しかも、この吸光度は試料上の同一部位つまり径の小さな集光点を透過した検査光の情報のみを反映した値であり、試料上の他の部位を透過した検査光の影響といった外乱を含まない値であるので、この値によって試料上における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を適切に知ることができる。

更に、検査光の出射側となる凹面鏡の背面に其の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズを形成した構成を適用した場合にあっては、凹面鏡の背面側から出射する検査光の屈折を除去して受光素子に収束する検査光のスポット径を小さくすることができるため、試料上の各部位の濃度等の差異を更に正確に知ることができるようになる。

特に、一対の凹面鏡の反射面の球面曲率を等しく設定する構成を適用した場合にあっては、一対の凹面鏡に共通する集光点の位置つまり試料の配置位置が凹面鏡と凹面鏡の間の中央に位置することになるので、試料の両側に等しいワーキングディスタンスが確保され、試料の設置作業等を容易に行なうことができる。

また、検査光の出射側となる凹面鏡の背面から出射側の検査光の強度を測定する受光素子に到る光路上において受光素子に直近した位置にピンホールを配置するようにすれば、凹面鏡の背面から出射した検査光の光束の中心部のみが受光素子に到達することになるので、凹面鏡間での反射の繰り返しに際して集光点のスポット中心を通った検査光のみを受光素子に送ることが可能となり、外乱を排除して試料上の各部位の濃度等の差異をより正確に知ることができるようになる。

更に、集光点に設置された試料に対して一対の凹面鏡に共通する中心軸に直交した第１の方向と前記中心軸および第１の方向に直交した第２の方向の各々に送りを掛ける試料送り手段と、予め設定された移動量に基いて試料送り手段を駆動することにより試料上の各部位を順に集光点に位置決めし、各位置決め位置で求められた吸光度を各位置決め位置に対応させてメモリに記憶させ、メモリに記憶された各位置決め位置と吸光度の対応関係に基いて試料上の各部位における吸光度を試料の全範囲に亘り吸光度に応じた濃度もしくは色彩でモニタ上に一括して拡大して可視表示する顕微鏡画像生成手段とを備えた構成とすれば、モニタを参照するだけで試料上の各部位における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を目視によって容易に観察することができるようになる。
その理由は、試料の各部位の吸光度に応じた濃度や色彩を試料の全範囲に亘ってモニタ上に一括して可視表示して得られる画像が、試料全体を照射して得られる透過光のコントラストを増幅し且つスケールを拡大して直視した映像と実質的に等価なものとなるからである。

本発明を適用した一実施形態の吸収顕微鏡の構成の概略を示した機能ブロック図である。 単体の凹面鏡で得られる集光状態と平凸レンズを形成した凹面鏡で得られる集光状態との相違を示した作用原理図で、図２（ａ）では単体の凹面鏡で得られる集光状態について示し、図２（ｂ）では平凸レンズを形成した凹面鏡で得られる集光状態について示している。 平凸レンズを備えない凹面鏡を光学キャビティとして利用した場合と平凸レンズを備えた凹面鏡を光学キャビティとして利用した場合のスキャン画像の相違の一例を示した図で、図３（ａ）は平凸レンズを備えない凹面鏡を光学キャビティとして利用した場合のスキャン画像、また、図３（ｂ）は平凸レンズを備えた凹面鏡を光学キャビティとして利用した場合のスキャン画像である。 濃度依存的な吸光度の上昇特性を示した線図であり、図４（ａ）は１００umの厚さのキュベットを用いて蛍光タンパク質Venusの吸光度を計測した結果について、また、図４（ｂ）は１０um厚さのキュベットを用いて蛍光タンパク質Venusの吸光度を計測した結果を表している。 蛍光タンパク質Venusの発現の有無による画像の変化と吸収スペクトルの特徴を示した図であり、図５（ａ）は野生型の細胞の吸光度を示す画像、また、図５（ｂ）は細胞質にVenusを発現した細胞の吸光度を示す画像であり、図５（ｃ）は吸収スペクトルの反映状況を示した線図である。 HeLa，COS7，NIH3T3，PC12，GH3，colon26，iPSの各細胞の画像の表示状況と細胞毎の吸収スペクトルの特性を示した図で、図６（ａ）は各細胞の画像の表示状況を纏めて示した図、また、図６（ｂ）は各細胞毎の吸収スペクトルを表した線図である。

図１は本発明を適用した一実施形態の吸収顕微鏡１の構成の概略を示した機能ブロック図である。

この吸収顕微鏡１は、検査光として使用する４００nm〜６００nmの範囲の波長を利用可能な白色レーザー光を生成するスーパーコンティニュームレーザー（以下、単にレーザー光源という）２と、レーザー光源２で生成されたレーザー光を導くファイバーケーブル３と、ファイバーケーブル３の端部から照射されたレーザー光を平行化する反射型コリメーター４と、レーザー光から６００nm以上の波長の光をカットするショートパスフィルター５と、光路変更用の平面鏡６と、集光用の球面アクロマティックレンズ７と、空間フィルタとして機能するピンホール８と、球面アクロマティックレンズ７で集光されたレーザー光を平行化するための球面アクロマティックレンズ９と、ビーム径を調整するための絞り１０と、集光用の球面アクロマティックレンズ１１と、レーザー光の透過を許容する反射面を有する凹面鏡１２，１３と、凹面鏡１３の背面から出射したレーザー光を平行化するための球面アクロマティックレンズ１４と、球面アクロマティックレンズ１４で平行化されたレーザー光を集光するための球面アクロマティックレンズ１５と、蛍光フィルタ１９と、球面アクロマティックレンズ１５で集光されたレーザー光の強度を測定するための受光素子として機能する光電子増倍管１６とを備える。

凹面鏡１２，１３は共に４００nm〜６００nmのレーザー光に対して９９．５％の反射率を有する高反射凹面鏡であり、０．５％のレーザー光の透過を許容する。

そして、一方の凹面鏡１２はレーザー光の進行方向の下流側に凹面からなる反射面を向ける一方、凹面鏡１２よりも下流側に位置する他方の凹面鏡１３はレーザー光の進行方向の上流側に凹面からなる反射面を向けるようにして対称に対をなすかたちで、互いに対向して相互の集光点および中心軸を一致させて光路上に設置されている。

この実施形態にあっては凹面鏡１２，１３の凹面の球面曲率を共に６０mmと等しく設定しているので、相互の集光点を一致させる関係上、凹面鏡１２と凹面鏡１３の離間距離は１２０mm（６０mm＋６０mm）となり、凹面鏡１２，１３から共に６０mmの位置に共通の集光点Ｐが位置することになる。
凹面鏡１２，１３に共通する集光点Ｐの位置つまり試料の配置位置が凹面鏡１２と凹面鏡１３の間の中央に位置することになるので、試料の両側に等しいワーキングディスタンスが確保され、試料やキュベット２３の設置作業等を容易に行なうことができる。
また、レーザー光を回折限界まで集光点に集光させるためには、球面曲率共通型のキャビティ構造（いわゆるコンセントリックタイプ）を採用することが望ましい。
ワーキングディスタンスを広げたいのであれば、焦点距離の長い凹面鏡１２，１３を採用することが望まれる。
なお、主要な光路を鉛直方向に備える吸収顕微鏡、つまり、キュベット２３を水平に設置する構成の吸収顕微鏡の場合にあっては、中央部に孔を設けたピエゾステージの上にキュベット２３を設置することになるので、対向する一対の凹面鏡の球面曲率を異ならせ、ピエゾステージの上方に長いワーキングディスタンスを保証するようにしてもよい。

そして、一方の凹面鏡１２の背面、つまり、凹面鏡１２における検査光の入射側には、凹面鏡１２の反射面に倣った表面形状を有する平凸レンズ１７が形成され、他方の凹面鏡１３の背面、つまり、凹面鏡１３における検査光の出射側には、凹面鏡１３の反射面に倣った表面形状を有する平凸レンズ１８が形成されている。凹面鏡１２の材質と平凸レンズ１７の材質、および、凹面鏡１３平凸レンズ１８の材質は共に等しい。

この実施形態においては、平凸レンズ１７，１８が凹面鏡１２，１３と独立した平凸レンズとして形成され、貼り合わせによって対応する凹面鏡１２，１３と光学的に一体化されているが、平凸レンズ１７を備えた凹面鏡１２や平凸レンズ１８を備えた凹面鏡１３を其の製造段階で一体成形するようにしてもよい。
なお、一対の平面鏡あるいは凹面鏡を対向させて設置した構成は一般に光学キャビティと呼ばれる公知のものであるが、大気を構成する気体等の分析や風洞の気流診断等のように空間分解能を必要としない測定で利用される従来型の凹面鏡１２は図２（ａ）に示されるように背面に平凸レンズのない凹面鏡１２を単体で利用したものであるのに対し、この実施形態の凹面鏡１２は図２（ｂ）に示されるように其の背面に平凸レンズ１７を形成したものであって、両者は構成が相違する。図２（ａ）および図２（ｂ）では入射側の凹面鏡１２についてのみ示しているが、出射側の凹面鏡１３についても状況は同じである。

また、他方の凹面鏡１３の背面から光電子増倍管１６に到る光路上において光電子増倍管１６に直近した位置に空間フィルタとして機能するピンホール２９が配置されると共に、他方の凹面鏡１３の背面から光電子増倍管１６に到る光路上に設置された球面アクロマティックレンズ１５と蛍光フィルタ１９の間には、他方の凹面鏡１３の背面から出射したレーザー光の経路を２つに分割するためのビームスプリッタ２０が設置され、ビームスプリッタ２０により分割されたレーザー光を受ける分光器２１が設けられている。

そして、凹面鏡１２と凹面鏡１３の間には、共通する集光点Ｐに設置された試料に対して凹面鏡１２，１３の中心軸に直交した第１の方向と、前記中心軸および第１の方向に直交した第２の方向と、前記中心軸に沿った第３の方向の各々に送りを掛ける試料送り手段として機能するピエゾステージ２２が設置されている。
ここでは、便宜上、凹面鏡１２，１３の中心軸に直交した第１の方向、例えば、図１の紙面と平行で且つ凹面鏡１２，１３の中心軸と直交する第１の方向をｘ軸方向と規定し、前記中心軸および第１の方向に直交する第２の方向つまり図１の紙面に直交する方向をｙ軸方向と規定し、前記中心軸に沿った第３の方向をｚ軸方向と規定する。

ピエゾステージ２２は、ピエゾステージ２２に対してｘ軸方向に送りを掛けるための圧電素子と、ピエゾステージ２２に対してｙ軸方向に送りを掛けるための圧電素子と、ピエゾステージ２２に対してｚ軸方向に送りを掛けるための圧電素子とを含み、ピエゾステージ２２上に、細胞等の試料を担持した透明なキュベット２３等が垂直に取り付けられるようになっている。

この実施形態における顕微鏡画像生成手段は、ＣＰＵ，ＲＯＭ，ＲＡＭ（課題を解決するための欄でいうところのメモリ），不揮発性メモリ，ハードディスク，入出力インターフェイス等を備えたワークステーション，パーソナルコンピューター，ノートパソコン等を始めとする市販のコンピューター（以下、単にコンピューターという）２４と、そのハードディスク等に収められた専用の制御プログラムによって構成される。
なお、図１中の符号２５は液晶ディスプレイ等からなるモニタ、また、符号２６はコンピューター２４のマン・マシン・インターフェイス（以下、単にＭＭＩという）として機能キーボードやマウスである。

顕微鏡画像生成手段とした機能するコンピューター２４のＣＰＵは、コンピューター２４のハードディスクに収められた専用の制御プログラムを読み出して実行対象プログラムとしてコンピューター２４のＲＡＭの記憶領域の一部であるワークメモリ領域に展開し、これを実行する。

この制御プログラムには、少なくとも、予め設定された移動量に基いて軸制御回路２７を駆動制御してピエゾステージ２２の各軸ｘ，ｙの圧電素子を伸縮させてピエゾステージ２２に送りを掛けることによってキュベット２３に担持された試料上の各部位、例えば、１umで区切られる試料上の測定スポットを順に集光点Ｐに位置決めし、各位置決め位置において、予め求められたブランク光の強度Ｉ_０’（試料のみを除いた状態のキュベット２３をピエゾステージ２２に設置してレーザー光源２を作動させたときに光電子増倍管１６によって検出されるレーザー光の強度）と試料をセットした状態で光電子増倍管１６によって測定されノイズ除去用のロックインアンプ２８を経由してＣＰＵに入力される出射側のレーザー光の強度ＩとO.D.＝−ｌｏｇ_１０（Ｉ／Ｉ_０’）で表されるランバート・ベールの法則とに基いて集光点Ｐに位置する試料上の測定スポットＱ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を求め、位置決め位置の現在座標値Ｑ（ｘ，ｙ）にO.D.（ｘ，ｙ）の値を対応させて（Ｑ，O.D.）のかたちで二次元配列的にコンピューター２４のＲＡＭのデータ一時記憶領域に記憶させる作業を、試料上の各部位たとえば１umで区切られる測定スポットに対して重複せず満遍なく繰り返し実行するスキャニング処理と、スキャニング処理が完了して最後の一時記憶処理が終了した後の時点でコンピューター２４のＲＡＭのデータ一時記憶領域から（Ｑ，O.D.）からなるデータの組を全て読み出し、少なくとも、各位置決め位置Ｑ（ｘ，ｙ）と吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の対応関係に基いて、試料上の各測定スポットＱ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を吸光度O.D.（ｘ，ｙ）に応じた濃度でモニタ２５の座標系ｘ’−ｙ’を基準としてモニタ２５上に一括して拡大して可視表示する画像構築処理と、ＭＭＩ２６に対するユーザの入力操作、例えば、左右方向の矢印キーの操作に応じて軸制御回路２７を駆動制御してピエゾステージ２２における軸ｚの圧電素子を伸縮させてピエゾステージ２２に送りを掛けることによってキュベット２３に担持された試料をｚ軸方向に微速で送るピント合わせ処理と、スキャニング処理で得られた一連の二次元配列データ（Ｑ，O.D.）の組に試料名やスキャニングの実施日あるいは他の識別可能なタイトルを付して此のスキャニング処理における吸収スペクトルのデータＳと共にコンピューター２４のハードディスクに格納するデータ格納処理が含まれる。

マシン座標系ｘ−ｙつまり試料上の測定スポットＱ（ｘ，ｙ）を表す座標系ｘ−ｙとモニタ２５上の座標系ｘ’−ｙ’の関係は、画像構築処理で生成された試料の濃度画像が試料の実際の大きさに比べて拡大されるように調整されている。
スキャニング処理における送りのピッチが１umであり、一般的なモニタ２５の解像度が７２dpi程度であることから倍率の大きな拡大表示が可能である。モニタ上における画像の拡大率を変更するズーミング処理に関しては公知である。

この実施形態ではスキャニング処理の送りピッチを１umとしているが、この値は集光点Ｐにおける集光スポットの径に応じて決めることが望ましい。
なお、この実施形態における集光スポットの径は約１０umであるが、スポット径の改善に直接的に関連する平凸レンズ１７の他にも前述した平凸レンズ１８やピンホール２９がもたらす空間分解能の改善を見込んで、スキャニング処理の送りピッチを１umとしている。

試料上の各測定スポットＱ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を吸光度O.D.（ｘ，ｙ）に応じた濃度でモニタ２５上に一括して拡大して可視表示する際には、例えば、２５６の階調を使用して、吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値が大きい箇所を暗く、また、吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値が小さい箇所を明るくするように表示することが望ましい。無論、ポジ／ネガの関係に相当する反転表示も可能である。
あるいは、濃度の相違に代えて色調の相違によって各測定スポットＱ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を可視的に表現してもよい。

データ格納処理によってコンピューター２４のハードディスクに格納された二次元配列データ（Ｑ，O.D.）の組と此れに対応する吸収スペクトルのデータＳを其のデータの格納時に設定したタイトルをキーワードとして検索し、ハードディスクから読み出してＲＡＭのデータ一時記憶領域に一時記憶した後、この二次元配列データ（Ｑ，O.D.）の組に対して画像構築処理を実施することも可能である。

次に、この実施形態における吸収顕微鏡１の動作原理をスキャニング処理で実行される固定サイクルの１つの工程を参照して説明する。

但し、この段階では既に細胞等の試料を担持した透明なキュベット２３がｚ軸に対して垂直になるようにしてピエゾステージ２２に取り付けられているものとする。
また、レーザー光源２は既に作動しており、ＭＭＩ２６に対するユーザの送り指令の入力操作によるピント合わせ処理が完了し、ｚ軸方向における試料の位置が集光点Ｐに位置決めされているものとする。

レーザー光源２で生成された４００nm〜６００nmのレーザー光はファイバーケーブル３を経由して反射型コリメーター４に導かれ、反射型コリメーター４によって平行化される。

反射型コリメーター４で平行化されたレーザー光はショートパスフィルター５で６００nm以上の波長の光をカットされ、平面鏡６によって光路を変更されて集光用の球面アクロマティックレンズ７に照射されて空間フィルタとして機能するピンホール８で集光した後、再び広がって球面アクロマティックレンズ９に照射されて平行化される。

球面アクロマティックレンズ９で平行化されたレーザー光は絞り１０でビーム径を絞られ、凹面鏡１２，１３に共通の集光点Ｐに向かうべく、球面アクロマティックレンズ１１によって集光され、図２（ｂ）に示されるように、その光路上にある平凸レンズ１７および凹面鏡１２によって屈折されることなく、平凸レンズ１７および凹面鏡１２を真っ直ぐに突き抜けるようにして凹面鏡１２，１３に共通の集光点Ｐに正確に集光する。（ここで、仮に、平凸レンズ１７を形成していない従来型の凹面鏡１２のみを使用していたとすれば、凹面鏡１２，１３に共通の集光点Ｐに向かうべく球面アクロマティックレンズ１１によって集光されたレーザ光は、図２（ａ）に示されるように、凹面鏡１２に入射する過程と凹面鏡１２から出射する過程の各々で屈折を生じるため、その集光位置は凹面鏡１２，１３に共通の集光点Ｐとは一致せず、僅かに光軸方向にずれた位置で集光することになる。）

このようにして集光点Ｐに正確に集光したレーザー光は、集光点Ｐに位置する試料上の部位を透過することで僅かにエネルギーを吸収されて再び広がり、他方の凹面鏡１３の反射面に至る。

そして、その一部（９９．５％）が他方の凹面鏡１３の反射面によって集光点Ｐに集光すべく反射され、集光点Ｐに配置された試料上の同一部位つまり集光点Ｐに再び照射され、試料上の同一部位を透過することによって僅かにエネルギーを吸収されて再び広がり、一方の凹面鏡１２の反射面に戻る。

そして、その一部（９９．５％）が一方の凹面鏡１２の反射面によって集光点Ｐに集光すべく反射され、集光点Ｐに配置された試料上の同一部位つまり集光点Ｐに照射される。

以下、一方の凹面鏡１２の反射面と他方の凹面鏡１３の反射面との間で試料上の同一部位つまり集光点Ｐを透過して前記と同様の反射が繰り返されるが、試料を透過するレーザー光は必ず試料上の同一部位つまり集光点Ｐを通るので、凹面鏡１２と凹面鏡１３の間で発生する反射の繰り返しによって集光点Ｐの集光スポットの径が増大することはない。（ここで、仮に、平凸レンズ１７を形成していない従来型の凹面鏡１２のみを使用していたとすれば、集光点Ｐに向かうべく球面アクロマティックレンズ１１によって集光されたレーザ光の位置ずれが反射の繰り返しによって積算的に増幅されることになるので、集光点Ｐの近傍のスポット径が著しく増大するといった不都合が発生してしまう。）

そして、最終的に、一対の凹面鏡１２，１３の間で繰り返し往復して反射されたレーザー光の一部（０．５％）は、その光路上にある凹面鏡１３および平凸レンズ１８によって屈折されることなく、凹面鏡１３および平凸レンズ１８を真っ直ぐに突き抜けるようにして広がりながら球面アクロマティックレンズ１４に照射される。

平凸レンズ１８が凹面鏡１３に及ぼす効果は前述した平凸レンズ１７が凹面鏡１２に及ぼす効果と同様である。

そして、球面アクロマティックレンズ１４で平行化されたレーザー光は、出射側のレーザー光の強度を測定するための受光素子として機能する光電子増倍管１６に向かうべく球面アクロマティックレンズ１５によって集光され、その一部がビームスプリッタ２０を透過し、蛍光フィルタ１９および空間フィルタとして機能するピンホール２９を経由して光電子増倍管１６に到り、光電子増倍管１６によって出射側のレーザー光の強度Ｉの値が測定される。

そして、光電子増倍管１６からの信号出力はロックインアンプ２８でノイズ成分を除去されてコンピューター２４のＣＰＵに読み込まれ、顕微鏡画像生成手段として機能するＣＰＵが、予め求められたブランク光の強度Ｉ_０’と光電子増倍管１６によって測定された出射側のレーザー光の強度ＩとO.D.＝−ｌｏｇ_１０（Ｉ／Ｉ_０’）で表されるランバート・ベールの法則とに基いて集光点Ｐに位置する試料上の測定スポットＱ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を求め、マシン座標系ｘ−ｙにおけるピエゾステージ２２の現在位置Ｑ（ｘ，ｙ）つまり試料上の測定スポットＱ（ｘ，ｙ）の位置に対応させてO.D.（ｘ，ｙ）の値を（Ｑ，O.D.）の二次元配列のかたちでコンピューター２４が備えるＲＡＭのデータ一時記憶領域に記憶させる。

反射の繰り返しによって試料上の同一部位Ｑ（ｘ，ｙ）を透過するレーザー光の光路長が増幅されるので、モル濃度の値が低い試料や厚みの少ない試料、例えば、細胞等といった試料であっても、試料上における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異といったものを増幅させるかたちで出射側のレーザー光の強度Ｉの値に的確に反映させることができる。
従って、例えば、厚みの少ない１０um程度の試料やモル濃度の低い１細胞レベルの試料からでも試料の部位毎の性状の相違を識別するに足りる有意な差を有する吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を得ることができ、通常の分光光度計では困難な極微量サンプル（１ピコリットル）の吸光度測定や創薬応用あるいは細胞腫の違いによる診断なども可能となる。
しかも、ここで求められる吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値は、集光点Ｐつまり試料上の同一部位Ｑ（ｘ，ｙ）の位置を透過したレーザー光の情報のみを反映した出射側のレーザー光の強度Ｉに基いて算出された値であり、試料上の他の部位を透過したレーザー光の影響といった外乱を含まない値であるので、この値によって試料上の部位Ｑ（ｘ，ｙ）における濃度等の差異を適切に知ることができ、空間分解能の精度が向上する。
また、出射側のレーザー光の強度Ｉを測定する光電子増倍管１６に直近する光路上にピンホール２９を配置しているので、他方の凹面鏡１３の背面から出射したレーザー光の光束の中心部のみが光電子増倍管１６に到達することになり、凹面鏡間１２，１３間での反射の繰り返しに際して集光点のスポット中心を通った検査光のみを測定することが可能となり、外乱を排除して試料上の各部位の濃度等の差異をより正確に知ることができる。

一方、光電子増倍管１６に向かうべく球面アクロマティックレンズ１５で集光された後にビームスプリッタ２０で反射されたレーザー光は分光器２１に到り、分光器２１によって吸収スペクトルを測定され、吸収スペクトルのデータＳの値がコンピューター２４のＣＰＵに読み込まれ、顕微鏡画像生成手段として機能するＣＰＵが、試料上の測定スポットＱ（ｘ，ｙ）の位置と吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値に加え、吸収スペクトルのデータＳの値をコンピューター２４のＲＡＭのデータ一時記憶領域に記憶させる。

スキャニング処理は、予め設定された移動量に基いて軸制御回路２７を駆動制御してピエゾステージ２２の各軸ｘ，ｙの圧電素子を伸縮させてピエゾステージ２２に送りを掛けることによってキュベット２３に担持された試料上の各部位、例えば、１umで区切られる試料上の測定スポットを順に集光点Ｐに位置決めし、その都度に上述の固定サイクルの処理（段落０４７〜００５９参照）を実行するものである。

そして、試料上の各部位たとえば１umで区切られる測定スポットに対して重複せず満遍なく固定サイクルの処理が実行されて測定スポットの全数に相当する（Ｑ，O.D.）のデータ組が取得されると、一連のスキャニング処理が完了し、コンピューター２４のＲＡＭに（Ｑ，O.D.）からなる一連の二次元配列データが全て記憶される。

一連の二次元配列データと吸収スペクトルのデータＳは、前述したデータ格納処理の実施により、タイトルを付してコンピューター２４のハードディスクに格納することが可能である。

また、スキャニング処理の完了時点でコンピューター２４のＲＡＭに一時記憶されているデータを利用して直ちに前述の画像構築処理を実行することも可能である。

画像構築処理を起動すると、顕微鏡画像生成手段として機能するコンピューター２４のＣＰＵがＲＡＭのデータ一時記憶領域から（Ｑ，O.D.）からなるデータの組を全て読み出し、少なくとも、各位置決め位置Ｑ（ｘ，ｙ）と吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の対応関係に基いて、試料上の各測定スポットＱ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の値を吸光度O.D.（ｘ，ｙ）に応じた濃度でモニタ２５の座標系ｘ’−ｙ’を基準としてモニタ２５上に一括して拡大して可視表示する。
この際、対応する吸収スペクトルのデータＳをモニタ２５上にテキスト形式で表示するようにしてもよい。

既に述べた通り、この実施形態にあっては、平凸レンズ１７，１８やピンホール２９を配置することにより、試料上の部位Ｑ（ｘ，ｙ）における吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の算出に際し、近接する試料上の部位Ｑ’（ｘ±Δ，ｙ±Δ）の吸光度がＩの値に関与しないようしているので、試料上の部位Ｑ（ｘ，ｙ）に対応した吸光度O.D.（ｘ，ｙ）の信頼性が高く、吸収顕微鏡１における空間分解能（解像度）と其の精度（シャープネス）が向上する。
従って、試料の各部位Ｑ（ｘ，ｙ）の吸光度O.D.（ｘ，ｙ）に応じた濃度を試料の全範囲に亘ってモニタ２５上に一括して可視表示して得られる画像は、試料全体を照射して得られる透過光のコントラストを増幅し且つスケールを拡大して直視した映像と実質的に等価であり、モニタ２５を参照することによって、試料上の各部位Ｑ（ｘ，ｙ）における性状の違い、例えば、試料上の各部位の濃度等の差異を目視によって容易に観察することができる。
平凸レンズ１７，１８を備えない凹面鏡１２，１３を光学キャビティとして利用した場合と平凸レンズ１７，１８を備えた凹面鏡１２，１３を光学キャビティとして利用した場合のスキャン画像の相違の一例を図３に示す。スキャン対象はHeLa細胞（ヒト子宮頚部癌細胞）であり、図３（ａ）が平凸レンズ１７，１８を備えない凹面鏡１２，１３を光学キャビティとして利用した場合のスキャン画像、また、図３（ｂ）が平凸レンズ１７，１８を備えた凹面鏡１２，１３を光学キャビティとして利用した場合のスキャン画像であり、両者の表示スケールは同一である。

濃度の相違を利用した可視表示のうち、２５６の階調を使用して、吸光度O.D.の値が大きい箇所を暗く、また、吸光度O.D.の値が小さい箇所を明るくして識別するようにした場合のモニタ２５上の画像の表示状況等を参考として何例か示す。
〔実験結果１〕
厚さ１０umと１００umの両面テープとカバーガラスでキュベット２３を作成し、蛍光タンパク質Venusの吸光度の計測を行った。
図４（ａ），図４（ｂ）に示す通り、１００um，１０umの何れの光路長においても濃度依存的な吸光度の上昇を計測することができた。
特に、光路長を１０umとした場合、その光路長が一般的な１０mmキュベットの分光光度計の光路長の１０００分の１であるにも関わらず計測を行うことができた。
また、吸収スペクトルの計測を行うこともできた。
〔実験結果２〕
蛍光タンパク質Venusを細胞質に発現した細胞の吸収像の計測を行った。図５（ａ）は野生型の細胞の吸光度を示す画像、また、図５（ｂ）は細胞質にVenusを発現した細胞の吸光度を示す画像であり、野生型の細胞に比べてVenusを発現した細胞が高い吸光度を示している。
図５（ｃ）に示されるように、吸収スペクトルは野生型と異なりVenusの吸収スペクトルを反映していた。
〔実験結果３〕
様々な細胞の吸収像および吸収スペクトルを調べた。HeLa（ヒト子宮頸部癌細胞），COS7（アフリカミドリザル腎臓細胞），NIH3T3（NIH Swissマウス胎仔由来細胞），PC12(+NGF)（ヒト副腎髄質褐色細胞腫由来細胞），GH3（ラット下垂体腫瘍細胞），colon26（マウス直腸癌由来細胞），iPS（ヒト人工多能性幹細胞）の固定細胞の吸収増幅像（モニタ２５上の表示）を図６（ａ）に示す。細胞の形状を分解できる程度の空間分解能で吸収増幅像の計測を行うことに成功した。
更に、細胞ごとの吸収スペクトルの計測を行った。図６（ｂ）に示されるように４８０nm，５０７nm，５４０nm付近に吸光度のピークを確認した。細胞によってピーク位置や大きさが変化していた。

本発明は、一対の凹面鏡を備えた光学キャビティを利用して試料を通る検査光の光路長を増幅する測定装置一般に適用できる。

１ 吸収顕微鏡
２ スーパーコンティニュームレーザー（レーザー光源）
３ ファイバーケーブル
４ 反射型コリメーター
５ ショートパスフィルター
６ 平面鏡
７ 球面アクロマティックレンズ
８ ピンホール
９ 球面アクロマティックレンズ
１０ 絞り
１１ 球面アクロマティックレンズ
１２ 一方の凹面鏡
１３ 他方の凹面鏡
１４ 球面アクロマティックレンズ
１５ 球面アクロマティックレンズ
１６ 光電子増倍管（受光素子）
１７ 平凸レンズ
１８ 平凸レンズ
１９ 蛍光フィルタ
２０ ビームスプリッタ
２１ 分光器
２２ ピエゾステージ（試料送り手段）
２３ キュベット
２４ コンピューター（顕微鏡画像生成手段）
２５ モニタ
２６ マン・マシン・インターフェイス
２７ 軸制御回路
２８ ロックインアンプ
２９ ピンホール
Ｐ 集光点
HeLa ヒト子宮頸部癌細胞
COS7 アフリカミドリザル腎臓細胞
NIH3T3 NIH Swissマウス胎仔由来細胞
PC12 ヒト副腎髄質褐色細胞腫由来細胞
GH3 ラット下垂体腫瘍細胞
Colon26 マウス直腸癌由来細胞
iPS ヒト人工多能性幹細胞

Claims (6)

1. 光の透過を許容する反射面を対向させて相互の集光点および中心軸が一致するように配置した一対の凹面鏡の間の集光点に試料を設置し、一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光を前記一方の凹面鏡の反射面と他方の凹面鏡の反射面との間で前記試料を透過して繰り返し反射させ、前記他方の凹面鏡の背面から出射した検査光を受光素子に収束させて強度を測定し、照射側の検査光の強度と出射側の検査光の強度に基いて前記集光点に位置する試料上の部位の吸光度を求めるようにした吸収顕微鏡であって、
   前記一方の凹面鏡の背面に、前記一方の凹面鏡の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズを形成することにより、前記一方の凹面鏡の背面側から照射された検査光が屈折を伴わずに前記集光点に到達するようにしたことを特徴とする吸収顕微鏡。
2. 前記他方の凹面鏡の背面に、前記他方の凹面鏡の反射面に倣った形状の表面を有する平凸レンズを形成することにより、前記他方の凹面鏡の背面側から出射する検査光の屈折を除去するようにしたことを特徴とする請求項１記載の吸収顕微鏡。
3. 前記平凸レンズが、これに対応する凹面鏡と独立した平凸レンズとして形成され、貼り合わせによって対応する凹面鏡と光学的に一体化されていることを特徴とする請求項１または請求項２のうち何れか一項に記載の吸収顕微鏡。
4. 前記一対の凹面鏡の反射面の球面曲率が等しいことを特徴とする請求項１，請求項２，請求項３のうち何れか一項に記載の吸収顕微鏡。
5. 前記他方の凹面鏡の背面から前記受光素子に到る光路上において前記受光素子に直近した位置にピンホールを配置したことを特徴とする請求項１，請求項２，請求項３，請求項４のうち何れか一項に記載の吸収顕微鏡。
6. 前記集光点に設置された試料に対して前記中心軸に直交した第１の方向と前記中心軸および前記第１の方向に直交した第２の方向の各々に送りを掛ける試料送り手段と、
   予め設定された移動量に基いて前記試料送り手段を駆動することにより前記試料上の各部位を順に前記集光点に位置決めし、各位置決め位置で求められた吸光度を各位置決め位置に対応させてメモリに記憶させ、前記メモリに記憶された各位置決め位置と吸光度の対応関係に基いて前記試料上の各部位における吸光度を前記試料の全範囲に亘り吸光度に応じた濃度もしくは色彩でモニタ上に一括して拡大して可視表示する顕微鏡画像生成手段とを備えたことを特徴とする請求項１，請求項２，請求項３，請求項４または請求項５のうち何れか一項に記載の吸収顕微鏡。

Images