JP3002144B2 - 癌細胞分化を促進する薬学組成物及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト尿から抽出精
製した細胞分化を促進する薬学組成物及びその製造方法
に関するものである。本発明は、細胞分化剤ＣＤＡ−II
が癌細胞のメチル化酵素複合体異常を改善し、その結
果、癌細胞を最終分化に導くという医療効果に達するこ
とを示す。これは抗癌剤の新しい方法であり、病因を直
接除去するため、治療効果が非常に高い。ＣＤＡ−IIは
癌細胞に対してメチル化酵素複合体と結合したたんぱく
質の作用を除去する効果があり、治療上で特異選択性が
見られ、副作用がない。ＣＤＡ−IIの有効成分は分化促
進剤、分化補助剤、抗悪病質剤（Anticachexia agent）
であり、これらの有効成分は相乗効果で最も高い治療効
果を得ることができる。なお、この明細書で使用してい
る略語については、「略語の説明」として後掲してい
る。

【０００２】

【従来の技術】癌は治療が困難な病気で、癌細胞自身の
組成が複雑であり、癌細胞が絶え間なく分裂を繰り返す
ため、正常な器官や組織に侵入して、最終的には死に至
る。従来の医学界では癌細胞の分裂を癌の最も根本的な
障害と考え、細胞分裂を止めるため細胞毒でＤＮＡ合成
を停止させる方法を採ってきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、研究の結
果、メチル化酵素複合体が癌細胞の分裂持続を促進して
おり、癌における最も根本的な障害となっていることを
発見した。メチル化酵素複合体は細胞の分裂と分化にお
いて非常に重要な役割を演じる。これらの酵素活性が高
い時に細胞は分裂を行い、活性が低下した時、細胞はメ
チル基を欠いた核酸を合成して、細胞の分化が促進さ
れ、再度分裂を行わない最終分化細胞となる。すべての
癌細胞は異常なメチル化酵素複合体を持ち、これらの酵
素は活性が高く、安定な状況に固定され、細胞は絶え間
なく分裂を繰り返している。このため異常なメチル化酵
素複合体は癌の原因であり、持続する細胞分裂が癌の症
状となる。

【０００４】本発明者は、１９７７年にノビコフ肝臓癌
細胞のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ（以
下、ＭＡＴと記す。）と正常細胞の酵素が異なり（参考
文献(19)を参照）、その相違は量的なものだけではな
く、質的にも異なることを発見した。当時メチルトラン
スファーに最も重要なＤＮＡメチルトランスファーの機
能がまだ発見されていなかった。ＤＮＡメチルトランス
ファーが調節遺伝子の機能において確認されたあと（参
考文献(13)と(15)を参照）、異常ＭＡＴの重要性が一挙
に高まった。癌細胞の酵素と正常細胞の酵素は質的な違
いがあるため、我々はこの違いを利用して理想的な特異
選択性抗癌剤を見つけることができた。

【０００５】［メチル化酵素複合体の機能］ＭＡＴはメ
チル化酵素複合体を構成する３酵素の一つである。その
他２つの酵素はメチルトランスフェラーゼとｓ−アデノ
シルホモシステイン・ヒドロラーゼ（以下、ＳＡＨＨと
記す。）である。メチルトランスフェラーゼには多くの
種類があり、各酵素は特異的な基質選択性を持つため、
互いに干渉しあわない。しかし、ＭＡＴ、ＳＡＨＨと同
じく複合酵素を形成するが、これらの機能が特異なメチ
ルトランスフェラーゼは同一のメカニズムで活性が調整
される。これら３つのの構成酵素は結合することで初め
てメチルトランスファー機能を発揮することができる。
正常細胞内において、複合酵素の結合は外来の促進因子
に依存している。例えば、ステロイドホルモンは、ホル
モン標的組織における複合酵素の促進因子である。ステ
ロイドホルモンがある場合、これら３つの構成酵素は結
合し、安定で活性な複合酵素となる。ステロイドホルモ
ンが存在しない場合、複合酵素は単独酵素に分離し、単
独の構成酵素の安定性は低く、すぐに破壊され、活性を
失ってしまう（参考文献(23)を参照）。非ステロイドホ
ルモンの標的組織の細胞において、メチル化酵素複合体
の形成は成長ホルモンの刺激に依存しており、当該細胞
にステロイドホルモンに類似する促進因子を生じさせ
る。つまり、正常細胞のメチル化酵素複合体活性は完全
に外来の促進因子に制御されている。核酸のメチル化酵
素複合体は、細胞の分裂と分化において非常に重要な役
割を演じる。その重要性は成長ホルモンに相当する。核
酸のメチルトランスファーの種類は非常に多いが、その
内２種類が細胞分裂と分化に関連している。このメチル
トランスファーはＤＮＡの５−メチルシトシン（以下、
５−ｍＣと記す。）とＲＮＡの２´−メチルリボースで
ある。５−ｍＣはＤＮＡの２本の配列において対称に位
置する。

【０００６】

【化１】

【０００７】１つの遺伝子のプロモーター配列にこの種
のメチル基を持つ場合、この遺伝子は制御され、機能を
発揮できない。ＤＮＡのメチル基は選択遺伝子の役割を
演じている（参考文献(12)及び(15)を参照）。各器官及
び組織にはその特殊な基礎細胞を持ち、これらの基礎細
胞はすでにある程度まで分化しているが、最終段階には
達していないため、依然分裂能力を持っている。しかし
特殊機能を持つ分化遺伝子が基礎細胞にあり、依然メチ
ル基の導入で非制御状態に置かれている。基礎細胞が成
長ホルモンの刺激で分裂する時、メチル化酵素複合体の
活性は成長ホルモンに伴い高くなる。ＤＮＡメチル基の
分布は複製によるため、分裂した細胞は母細胞と同一
で、基礎細胞となる。成長ホルモンが存在しなくなった
時、メチル化酵素複合体の活性はすぐに下がるが、ＤＮ
Ａ合成酵素はかなり安定しており、この時メチル基の欠
落したＤＮＡが合成される。２回の細胞分裂周期でメチ
ル基の欠落したＤＮＡが合成され、特殊で分化に関連す
る遺伝子の機能が発揮され、特殊機能を持つ最終分化細
胞に変化する。この種の細胞はすでに分裂能力を持たな
い。メチル基の欠落したＤＮＡの合成作用は細胞分化の
重要なメカニズムである（参考文献(28)を参照）。

【０００８】ｒＲＮＡのメチル基の大部分は、ヌクレオ
チドの２´酸素の位置に発生している。この種のメチル
基導入はヌクレオチドの製造に重要な調節作用を持って
いる（参考文献(18)を参照）。細胞はヌクレオチドの製
造過程において分子量が最終生成物の２倍大きいＲＮＡ
前駆体を合成し、ＲＮＡ分解酵素により不要な配列が切
断され、有用な配列を残してヌクレオチドを形成する。
メチル基の分布は全部有用な配列にあり、この部分の配
列にメチル基が欠落する場合、この部分の有用な配列は
有用でない配列と同様分解されしまう。このため、メチ
ル化の進行が完全な場合、有用なヌクレオチドを生成す
ることができ、完全でない場合、ヌクレオチドは生成さ
れない。ヌクレオチドの増産は細胞がＤＮＡ合成前の必
須条件である。ヌクレオチドの増産する細胞のみが、核
酸合成酵素、染色体たんぱく質、細胞構成たんぱく質な
ど、ＤＮＡの複製に必要なたんぱく質を提供することが
でき、ヌクレオチドが増産されない場合、これらの必要
なたんぱく質は十分に生産されず、細胞もＤＮＡ合成を
行うことができない。ヌクレオチド増産の細胞分裂に対
する重要性は２つの簡単な実験から証明できる。

【０００９】第１の実験は放射線菌Ｄの特殊感度を利用
したもので、細胞を成長ホルモンで８時間刺激したあ
と、ヌクレオチドの生産が増加するが、この時ヌクレオ
チド生産を抑制する微量の放射線菌Ｄを加えると、細部
はＧ１段階で停止することが認められている（参考文献
(13)を参照）。もう１つの実験は特殊な温度に感度が高
い細胞を利用したもので、この種の細胞のｒＲＮＡ加工
分解酵素は３９℃で完全に活性を失う。成長ホルモンで
８時間刺激したあと、温度を３７℃から３９℃に上げる
と、ヌクレオチドの生産は停止し、細胞もＧ１段階で停
止することが分かっている（参考文献(41)を参照）。こ
の２つの実験はヌクレオチドの増産が細胞分裂に必要な
要素であることを明らかに証明している。ヌクレオチド
生産調整を決定する要素はメチル化酵素複合体にあり、
もちろん細胞成長にも影響を及ぼすことになる。一旦成
長ホルモンが存在しなくなれば、細胞は分裂を停止し、
大量のヌクレオチドは必要でなくなる。メチル化酵素複
合体が先に活性を失ったあとも、細胞は短時間ではある
がメチル基が欠落したｒＲＮＡ前駆体を依然合成する。
これらの生成物は有用なヌクレオチドを生産することが
できず、必要なたんぱく質が減産され、細胞は分化の過
程に進み、最終的には最終分化細胞となる。メチル化酵
素複合体が細胞の成長及び分化において非常に重要な役
割を演じていることが分かる。

【００１０】［異常メチル化酵素複合体の癌における役
割］異常ＭＡＴは癌細胞が生産する特殊なたんぱく質因
子で、この要素は正常なＭＡＴと結合し、異常な癌細胞
酵素を生成する（参考文献(21)を参照）。この結合は元
来正常であった酵素の活性と調節機構を完全に変えてし
まう。癌細胞の特殊たんぱく質因子はステロイドホルモ
ンのように正常な複合酵素にも作用する。３つの構成酵
素は結合して、非常に安定で活性を持つ複合酵素とな
る。これはこの種の特殊たんぱく質要素を持つためで、
癌細胞複合酵素の安定性と活性は正常細胞の複合酵素を
大きく上回っている（参考文献(21)を参照）。正常酵素
と癌細胞の特殊たんぱく質要素との結合は複合酵素の調
節機能を変えてしまうだけでなく、単独の構成酵素の動
力学的機能をも変化させてしまう。正常なＭＡＴと異常
なＭＡＴのメチオニン（以下、Ｋｍと記す。）値は異な
る。前者は３μＭ、後者は２０μＭであった。区別する
ため、前者をＭＡＴ^L 、後者をＭＡＴ^LTとする。Ｔは特
殊な癌の因子を表す。癌細胞のＭＡＴと正常酵素の相違
はすでにその他研究者によって証明されている（参考文
献(40)を参照）。癌細胞のＳＡＨＨも同様または類似し
た因子がその動力学的機能を変えてしまう（参考文献(2
4)を参照）。癌細胞は自らメチル化酵素複合体の促進因
子を生成するため、癌細胞のこの種の酵素活性は外来の
因子に依存することなく、自ら活性を維持することがで
きる。この高活性は癌細胞の分裂期を繰り返すよう促す
ため、異常なメチル化酵素複合体は癌の根本的な原因と
いえる。

【００１１】すべての癌細胞は異常なメチル化酵素複合
体を持つ。異常なメチル化酵素複合体は、正常な成長及
び異常な癌成長の間で特殊な相違があり、我々はその相
違を利用して異常メチル化酵素複合体を特異選択的に抑
制する薬物を探すことができる。実際、早期の実験でも
オリゴヌクレオチドなどのような、癌細胞メチル化酵素
複合体を抑制できる化合物は、正常酵素に対する作用が
非常に弱く、全く作用しない場合もあることが証明され
ている。逆に、正常な複合酵素活性を促進する化合物は
異常な癌複合酵素に対して同じ効果を上げることができ
ない（参考文献(18)，(20)を参照）。これらの実験は癌
細胞の異常メチル化酵素複合体が癌に化学治療において
最も適当な標的となることを示している。

【００１２】［異常メチル化酵素複合体を標的とする化
学治療］上記に記載した通り、異常メチル化酵素複合体
は癌の根本的な原因である。この異常酵素を除去できれ
ば、癌細胞は正常細胞と同様に分化が進み、それ以上分
裂しない最終分化細胞となる。この仮説が正しいことが
実証されている。ノビコフ腹水肝臓癌はｐｏｌｙ（Ｉ）
（Ｃ）で処理したあと、異常なメチル化酵素複合体は正
常な酵素に変化し、やや遅れて核酸の合成速度も低下
し、ついに細胞分裂は停止している（参考文献(17)，(2
4)を参照）。ｐｏｌｙ（Ｉ）（Ｃ）は細胞内に入れず、
ｐｏｌｙ（Ｉ）（Ｃ）の効果は非常に間接的である。先
ず、ｐｏｌｙ（Ｉ）（Ｃ）は癌細胞にオリゴイソアデニ
レート合成酵素の生成を促す（参考文献(9）を参照）。
この酵素の生成物を通して、オリゴイソアデニレートは
異常なメチル化酵素複合体を正常な酵素に変えている。
オリゴイソアデニレートは分化細胞の生成物である。オ
リゴイソアデニレートに類似し、異常なメチル化酵素複
合体を正常酵素に変えることができるものには、オリゴ
ペプチドや一部の有機酸がある（参考文献(22)，(29)を
参照）。Burzynski はこれらの抗癌性を持つ天然の人体
内生成物を「アンチネオプラストン」と命名している
（参考文献(4）を参照）。これらの抗癌物質は多くが低
分子量を持つ代謝生成物で、腎臓で濾過されたあとさら
に吸収され、血液に戻って一定の濃度を維持している。
再吸収は往々にして不完全であり、健常人の尿から少量
の有用な抗癌物質が排泄されている。体内では十分な抗
癌物質が癌細胞の形成を抑制し、バランスを維持してい
る。発明者らはこの種の天然の化学抗癌作用を「化学監
察（Chemo-Surveillance）」と命名している（参考文献
(26)を参照）。健常人の尿中抗癌物質は抽出精製された
あと、２種類の主成分が異常ＭＡＴを有効に抑制してい
ることがわかった。このうちの１種は色素と結合する酸
性ペプチド、１種は有機酸である（参考文献(29)を参
照）。正常酵素は異常因子がないため、抗癌物質の影響
を全く受けない。これも天然の化学抗癌物質の持つ特異
選択性である。この選択性があるため、健康に影響を及
ぼさない。癌細胞はこれらの精製された有効成分で処理
したあと、分化が促進され最終分化細胞に変化する（参
考文献(28)を参照）。酵素の研究から、異常なメチル化
酵素複合体が正常な酵素に変化する部分が、癌細胞を最
終分化に導くネックとなることが分かっている。細胞内
のＳ−アデノシルメチオニン（以下、ＡｄｏＭｅｔと記
す。）とＳ−アデノシルホモシステイン（以下、Ａｄｏ
Ｈｃｙと記す。）の量を分析し、酵素の変化が癌細胞の
分化において重要な役割を演じていることを証明してい
る。癌細胞のＡｄｏＭｅｔ量は正常細胞より高い（参考
文献(11)を参照）。癌細胞のＭＡＴ^LTは正常細胞のＭＡ
Ｔ^L Ｋｍ値に比べてかなり高い。癌細胞は一旦分化して
最終分化細胞に変化すれば、ＡｄｏＭｅｔとＡｄｏＨｃ
ｙの量が同時に大きく低下する（Chiba et al., 198
8）。ＭＡＴ^LTとＳＡＨＨ^LTが同時に発癌因子を失い、
ＭＡＴ^L とＳＡＨＨ^L となる。これらは別な角度から得
られた証拠で本発明と矛盾しない。

【００１３】

【課題を解決するための手段】

［天然化学監察及び癌の形成］人体内には天然の抗癌物
質があるのになぜ癌が発生するのか。大部分の癌患者は
健常人に比べて尿からの低分子量代謝物の排出が多く、
長い間大量に流出することは体内で抗癌物質が欠乏し、
癌細胞の繁殖を抑制できず、臨床症状が発現することに
つながる。重症患者ほどこの状況はより深刻である（参
考文献(25)及び(26)を参照）。これは一種の悪循環であ
り、ある原因で病人は過度に抗癌物質を排泄し、このた
め癌細胞に発生や繁殖の機会を与えてしまい、癌細胞の
繁殖によりさらに多量の抗癌物質が排出されてしまい、
最終的には完全に化学監察能力を失ってしまう。この時
癌細胞は全く拘束されずに繁殖することができる。癌の
病害において、異常メチル化酵素複合体は重要な因子で
あるが、天然化学監察能力の破壊も非常に重要な因子で
ある。有効に癌を克服するためにこの両方の因子を同時
に考慮する必要があり、異常メチル化酵素複合体を抑制
するほか、病人の天然抗癌物質の過度排泄を低減する必
要がある。尿から精製された抗癌製剤や細胞分化剤（Ce
ll Diffirentiation Agent、ＣＤＡと記す。）にはこれ
ら２つの因子に同時に働きかけることができる。病人の
低分子量代謝物の過度排泄を徐々に減少し、病状が好転
した時健常人の状況に回復している（参考文献(25)を参
照）。病人が低分子量代謝物を排泄するのは炎症の結果
である可能性があり、炎症症状があれば過度排泄現象が
見られる（参考文献(10)，(3），(2）を参照）。有効に
過度排泄を制御することは癌治療において最も重要な課
題である。周知の通り細胞毒薬物自身も過度排泄を促進
し（参考文献(26)を参照）、天然化学監察に悪い影響を
及ぼし、保護するどころか破壊作用を持っている。細胞
毒療法は全ての癌細胞をきれいに除去するが、病人は長
期の細胞毒による破壊で、残った癌細胞を制御する自衛
能力をも失ってしまう。逆に尿から精製された抗癌剤の
成分は病人の過度排泄を改善し、病人の天然化学監察能
力を回復したあと、自分自身の自衛能力で残った癌細胞
を制御することができる。この尿精製抗癌剤に含まれる
フェニルグルタミドは癌患者の過度排泄を改善する作用
がある。癌細胞に対して直接制御作用を持たないが、抗
癌物質の過度排泄を防止することで、ヒトや動物の天然
化学監察能力を保護し、軽症の癌患者に有効は治療効果
が見られている（参考文献(25)を参照）。さらに、動物
の癌形成に対しては顕著な予防効果が見られた（参考文
献(16)及び(35)を参照）。

【００１４】臨床経験から、分化治療は追求する価値が
高い治療法であることが知られている。アンチネプラス
トンは１９８５年以前、Burzynski が末期癌患者に使用
して、６割の患者に症状の改善が見られたほか、そのう
ち３分の１は５年以上の安全期にまで延命している（参
考文献(5），(6），(7）を参照）。この種の薬物は副作
用が全くない。当初全ての分化治療剤の治療標的が同じ
であったわけではなく、その後異常メチル化酵素複合体
の修正を通じて癌細胞の分化を促進しているという結果
に到達している。例えば、インターフェロンやretinoic
acid は、これらの薬物が癌細胞にアンチネプラストン
類似物質を生成させるのを促進させ、異常メチル化酵素
複合体に作用し癌細胞の最終分化に導く。この種のアネ
チネプラストン類似物質はオリゴイソアデニルレートで
ある可能性が高い。インターフェロンは多毛白血病（ha
iry cell leukemia)に対して、retinoic acid は、Acut
eG-ranulocytic leukemiaに対して、最適の薬剤（参考
文献(14)及び(42)を参照）と認められている。しかし、
再発の問題は解決されていない（参考文献(34)及び(1）
を参照）。

【００１５】［分化補助剤］分化促進剤は直接又は間接
的に癌メチル化酵素複合体の異常因子を除去し、癌細胞
を最終分化に導くことができる。メチル化酵素複合体は
３つの構成酵素が結合したもので、我々は各構成酵素の
インヒビターは分化促進剤の異常因子除去作用を増進す
ることを発見した。このインヒビター自身は顕著な分化
促進作用がないが、本案の発明者らはこの化合物を分化
補助剤（Helper Inducer）と命名している（参考文献(3
2)を参照）。ＭＡＴのインヒビターであるｎ−酪酸、フ
ェニル酪酸、フェニル酢酸などは顕著な分化補助活性を
持つ。一般的に、フェニル酢酸のような分化補助剤は容
易に入手でき、毒性が低く、分化促進剤の必要量を低減
することができる。とくに脳腫瘍に適している。脳部は
構造上非常に特殊で、血液脳関門の保護において分化促
進剤の消失は非常に速くなるには至らず、この関門を通
過しやすいフェニル酢酸を単独で使用することで、良好
な治療効果が得られる（参考文献(38)を参照）。

【００１６】

【発明の実施の形態】一般的に、癌患者は抗癌物質の排
泄過多により癌細胞の増殖を制御する能力を失ってい
る。この点から見て、分化療法は根治治療であるだけで
なく、天然の抗癌処方であるといえる。尿には癌細胞を
最終分化に導く化学物質を含むため、本発明では健常人
の尿から細胞分化剤を抽出精製した。この製剤は癌細胞
の異常メチル化酵素複合体を改善することができ、その
結果癌細胞は最終分化に導かれ、分裂を継続できなくな
り、死滅するため、癌に対する治療及び予防効果が認め
られる。本発明における細胞分化剤の製造フォローチャ
ートを図１に示す。また、以下に具体的な実施例を示
し、本発明をさらに詳しく説明する。

【００１７】

【実施例】

〔実施例１〕 細胞分化剤の製造 尿を収集する際、収集タンクに十分な１Ｎ塩酸を入れて
おく。大体、２０ｌの尿に１ｌの塩酸を使用する。ｐＨ
を２まで調節したあと、尿をナイロン布で濾過し、さら
に10,000ドルトンより大きい分子量の物質を濾過して除
去する。これにはＡｍｉｃｏｎ濾過繊維を使用するか又
はその他の一般的な方法で行う。吸着剤ＸＡＤ−１６
（Ｓｉｇｍａ社）を袋に詰めて、ステンレス製漏斗に置
く。使用前に先ず２倍（ｖ／ｗ）のエタノールで洗浄
し、再度２倍（ｖ／ｗ）の脱イオン水でエタノールを洗
い落とす。これを２回繰り返す。吸着剤ＸＡＤ−１６に
通す尿は４倍量（ｖ／ｗ）とする。ＸＡＤ−１６に吸着
した物質は４倍量（ｖ／ｗ）の脱イオン水で洗浄したあ
と、再度２倍量（ｖ／ｗ）のエタノールで溶出する。中
和エタノールで抽出したあと、乾燥機でエタノールを蒸
発乾燥させる。乾燥槽内の温度は５０℃以下を維持す
る。乾燥物質は無パイロジェン水で溶解して、ＣＤＡ−
IIの原料薬とする。エタノールで抽出した後の吸着剤は
２倍量（ｖ／ｗ）の脱イオン水で洗浄したあと、再度使
用し、吸着能力が新品の７割程度にまで低下した時点で
交換する。一般的にＸＡＤ−１６の場合２００回以上反
復使用できる。

【００１８】人体が１日に排泄するクレアチニンの量は
一定で、尿中の固体濃度はクレアチニンと正比例の関係
にあり、尿化学物質の定量はクレアチニンを基準とする
のが信頼性が高い。上記の収集した尿のクレアチニン濃
度は１．２〜３．７ｇ／ｌ、平均２．４±０．６ｇ／ｌ
であった。ＣＤＡ−IIの生成率は吸着剤の通過１回目か
ら１００回目までにおいて、０．５１±０．１７ｇ／ク
レアチニンｇで、尿の固体成分は４６．７ｇ／クレアチ
ニンｇであった。つまり、ここで得られたＣＤＡ−II原
料薬の生成率は固体成分の１．１％前後であった。

【００１９】〔実施例２〕 細胞分化剤注射液の製造 細胞分化剤（ＣＤＡ−II）注射液の最終濃度は５０±２
mg／mlとし、原料薬の濃度は一般的に２５０mg／ml以上
である。このため、希釈分配した原料薬濃度は最終製剤
濃度の１３０％前後とする。まず、原料薬を無パイロジ
ェン水で希釈した後、濾過を行う。スピードの遅い濾紙
で濾過し、再度濾孔が１μｍと０．４５μｍの濾過膜で
濾過し、最後に特殊濾過膜でパイロジェンを除去する。
パイロジェンを除去した濾液は無パイロジェン水で適当
な濃度に調節したあと、８時間以内に無菌室（１００ク
ラス）にて０．２２μｍの濾器を用いて菌を濾過する。
除菌したあと、すぐに１００mlまたは２５０mlの細胞分
化剤注射液製剤に包装する。

【００２０】〔実施例３〕 細胞分化剤カプセルの製造 一部のＣＤＡ−IIでカプセル製剤を製造する。上記原料
薬は、スピードの遅い濾紙、濾孔が１μｍと０．４５μ
ｍの濾過膜で濾過する。濾過液は再冷凍乾燥で固体に乾
燥させる。乾燥固体は粉末にした後、自動カプセル包装
機で１粒当たり５００mgのカプセル製剤を製造してアル
ミ箔で密封し、最後に放射線で滅菌する。

【００２１】〔実施例４〕 細胞分化剤の抗癌活性分析 細胞分化剤の抗癌効果は有効成分が癌細胞メチル化酵素
複合体を抑制し、癌細胞の最終分化を導き、細胞分裂を
停止させることに基づいている。つまり細胞分化剤は癌
異常酵素ＭＡＴ^LTを抑制する作用を有し、ＨＬ−６０癌
細胞の分化を導き、並びにヒト乳癌細胞群の形成を抑制
するという活性を持つ。これらの活性測定方法はすでに
文献が発表されている（参考文献(19)、(27)及び(29)を
参照）。本発明ではＣＤＡ−II製剤３バッチについて抗
癌活性をそれぞれ分析しており、その操作手順は以下の
通りである。

【００２２】ＣＤＡ−II注射液製剤１mg／mlを使用す
る。ＭＡＴ^LTはＨＬ−６０癌細胞から採取し、先ず沈殿
した細胞を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７、０．５ｍＭ
塩化マグネシウムに懸濁させる。その後Ｄｏｕｎｃｅホ
モジナイザーで細胞膜を破壊する。酵素抽出液は高速遠
心分離法（２２６，０００ｘｇ、０．５時間）で分離す
る。この抽出液をＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフ
ィーで塩化カルシウム傾斜溶離を行い、ＭＡＴ^LTを溶出
して精製する（参考文献(19)を参照）。ＭＡＴ^LTの活性
測定も前述の方法で行う（参考文献(19)を参照）。０．
０５mlの反応液には０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．
２、０．１５Ｍ塩化カリウム、１５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ及び１μＭ〔 ³Ｈ
−ＣＨ₃ 〕メチオニンを含み、３７℃で３０分反応させ
る。反応液を酸化し、その後全部を１平方インチのホス
ホセルロースに移し、この紙は一緒にビーカーに入れて
５ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７で、未反応の〔 ³Ｈ−ＣＨ
₃ 〕メチオニンを洗い落とす。最終的に吸着された〔 ³
Ｈ−ＣＨ₃ 〕ＡｄｏＭｅｔの放射線を測定し、ＭＡＴ^LT
の活性を測定する（結果は表１を参照）。

【００２３】ＨＬ−６０癌細胞の終末分化はＮＢＴ＋測
定方法（参考文献(27)を参照）で測定する。まず、ＨＬ
−６０癌細胞を希釈培養し、各培養瓶に１０mlの開始細
胞液を入れ、濃度を１．５×１０⁵ 細胞／mlとする。コ
ントロールとＣＤＡ−IIを含む培養瓶をそれぞれ９６時
間培養したあと、一部分を取り出して細胞を遠心分離に
かけ、沈殿させる。これらの細胞はＮＢＴ試薬を用い、
３７℃で３０分間反応させたあと取り出し、１滴を細胞
計数器に入れ、顕微鏡下で細胞総数と黒色に染色された
（ＮＢＴ＋）細胞数を数える。ＮＢＴ＋の占めるパーセ
ントがＣＤＡ−IIの分化誘導活性となる（結果は表１を
参照）。

【００２４】ＣＤＡ−II抗癌活性のもう一つの指標はＨ
ＢＬ−１００乳癌細胞群の抑制である。等比級数で増殖
する乳癌細胞を生理食塩水で１回洗浄し、さらに、約２
mlの０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ培
養液を加え、３７℃で１０分間培養する。まず、細胞濃
度を測定し、さらに一部希釈して３×１０³ 細胞／mlと
する。０．５mlの希釈液を取り、４．５mlのコントロー
ルまたはＣＤＡ−IIを加えた培養瓶を３７℃で５日間培
養する。培養液を取り出し、生理食塩水で１回洗浄す
る。メタノールで１５分間固定したあと、固定された細
胞群を２０倍希釈のＧｉｅｍｓａ染色液に３０分間浸
す。染色液を捨てたあと、水洗いして乾燥させ、解剖鏡
の下で細胞群数を計測し、これからＣＤＡ−IIの抗癌活
性を決定する（結果は表１を参照）。

【００２５】

【表１】 注；ＣＤＡ−II製剤は注射液剤を使用する。使用した製
剤の濃度は１mg／ml。ＭＡＴ^LTはＨＬ−６０癌細胞から
前述したようにＤＥＡＤ−セルロースを通して純化し、
製造する。活性測定も前述した方法（参考文献(19)を参
照）で行う。ＨＬ−６０癌細胞の最終分化はＮＢＴ＋測
定方法で測定する（参考文献(27)を参照）。癌細胞群形
成の抑制作用はヒトＨＢＬ−１００乳癌細胞の培養方法
を採用する（参考文献(29)を参照）。

【００２６】〔実施例５〕 細胞分化剤の有効成分分析 実施例２で得られたＣＤＡ−II細胞分化剤注射液を冷凍
乾燥し、２００mg／mlにまで濃縮する。５mlの濃縮液を
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２のクロマトカラム（４．１cm×４
４cm）に入れ、蒸留水で溶離させ、７分毎に試験管１本
に収集し、１本当たり１０mlとする。分離が完了したあ
と、各試験管から２５μｌを採取し、水で希釈して１ml
として、Ａ２５５の吸光度で測定する。その外１本の試
験管から２５μｌを採取して、ＭＡＴ^LT活性抑制の測定
に使用する。ＭＡＴ^LT活性の測定は実施例４に従って行
う。その後、Ａ２５５の吸光値によって、試験管を図２
のように８つのパートに分ける。各パート毎に冷凍乾燥
し、水分を完全に除去する。測定乾燥量は重量％の分布
で決定する。乾燥固体は蒸留水で再度溶解し、ＨＬ−６
０癌細胞の分化活性測定に用いる。この活性はＮＢＴ＋
％で表示し、分化活性の測定は実施例４で示した方法で
行い、その結果は図２の通りである。

【００２７】細胞分化剤の抗癌有効成分で最も重要なの
は癌細胞の分化を促進する分化促進剤である。分化促進
剤の分離精製及び作用機構については文献で発表されて
いる（参考文献(27)，(28)，(29)，(30)を参照）。分化
促進剤には主に２種類の化学成分を持つ。１つは色素結
合した酸性ペプチドで、以下、ＰＰ−Ｏとする。もう１
つは有機酸で、以下ＯＡ−０．７９とする。ＰＰ−Ｏは
図２に示した第１パート、ＯＡ−０．７９は第５、６の
パートにある。ここで特に説明しておきたいことは、細
胞分化剤の分化活性は分化促進剤が単独で行っているも
のではなく、分化補助剤と協力しあって活性が発生す
る。分化補助剤は細胞分化剤の主成分であり、分化促進
剤は微量で、構造を決定する純度にまで精製されていな
いため、化学構造も分かっていない。図２に示した分化
促進の活性とＭＡＴ^LT抑制の活性は非常に合致する。し
かし、図２の第２、３パートでは明らかにＭＡＴ^LT抑制
活性が見られるが、癌細胞の分化促進活性はない。この
パートは僅かな分化補助剤が含まれているが、分化促進
剤は含まれていない。このため癌細胞の分化促進活性が
ないのである。分化補助剤は、メチル化酵素複合体のイ
ンヒビターであり（参考文献(31)を参照）、分化促進剤
がメチル化酵素複合体を正常な酵素に変化させるのを助
け、促進分化剤の分化機能を増進する。

【００２８】ＣＤＡ製剤においてすでにＭＡＴインヒビ
ターとして知られているのは、フェニル酢酸、インドー
ル酢酸、馬尿酸である。フェニル酢酸はフェニルグルタ
ミドの乾燥過程において加水分解され発生した可能性が
高い。図２の第６、７パートに分布し、Ｃ１８ ＨＰＬ
Ｃで測定されている。インドール酢酸もこの部分に分布
する。馬尿酸は第５パートの主成分である。これらのＭ
ＡＴインヒビターは、０．５低減指数（reduction inde
x 、つまり分化促進剤有効量を半減する指標）の濃度に
達する必要があり、それぞれフェニル酢酸が４ｍＭ、馬
尿酸が８ｍＭ、インドール酢酸が０．９５ｍＭである。
分化補助剤の中のメチルトランスフェラーゼインヒビタ
ーはＭＡＴインヒビターより効果が高い。前者は後者の
千分の１又はそれより少ない量で同じ効果を得ることが
できる。ＣＤＡ製剤中のすでに知られているメチルトラ
ンスフェラーゼインヒビター２種類は、いずれも優れた
分化補助剤活性を持つ。これら２種類の成分はビタミン
Ｂ₂ とウロルビンである。ビタミンＢ₂ は図２の第８パ
ートの後半部分に分布する。前述した通り（参考文献(3
1)を参照）、この黄色成分はＣ１８ ＨＰＬＣを通し
て、非常に純粋なビタミンＢ₂ を得ることができる。含
有量は０．０４％前後。ウロルビンは図２の第６、７パ
ートに分布する。この部分をＳｅｐａｄｏｘ ＳＨカラ
ムクロマトグラフィー及びシリカゲル薄膜クロマトグラ
フィーにより純粋なウロルビンを得ることができる。含
有量はＣＤＡ−II製剤の０．５％前後。純化の過程にお
いてロスがあるものと見られ、ＣＤＡ−II製剤もかなり
の赤色を呈しているため、含有量は０．５％以上と推測
される。

【００２９】〔実施例６〕 ウロルビンとビタミンＢ₂ の分化補助剤活性の測定 分化補助剤活性の測定は発明者が以前設計した方法（参
考文献(32)を参照）を採用する。実験は培養したＨＬ−
６０白血病癌細胞を用い、ＮＢＴの定量方法で癌細胞の
分化程度を測定する。先ずＨＬ−６０細胞を希釈培養
し、各培養瓶には１０mlの開始細胞液を入れ、その濃度
を１．５×１０⁵ 細胞／mlとする。１組４瓶の培養瓶は
コントロールとし、それには、retinoic acid 分化促進
剤のみを添加する。ＮＢＴ＋細胞を１５〜６０％誘導す
るまでの量に調整する。もう１つは溶剤のみのコントロ
ールとする。retinoic acid はメタノールに溶けるがメ
タノールの総量は癌細胞の分化に影響を与えないよう、
２％を越えてはならない。その他の各組は１組４瓶の培
養瓶とするが、比較的低い量のretinoic acid を用い、
もう１つは溶剤だけのコントロールとし、各組には異な
った量の分化補助剤を加える。９６時間培養したあと、
各瓶の細胞数を測定し、実施例４で述べた方法でＮＢＴ
測定を行う。一般的に、ＨＬ−６０細胞の自然分化、つ
まり添加剤がない場合は、４％以下となる。分化補助剤
のみの組で使用した量の範囲では、細胞分化はほとんど
１０％を越えない。各瓶のＮＢＴ＋数値はこれらのコン
トロール値を基数として控除する必要がある。

【００３０】薬剤の量とＮＢＴ＋との相対関係が曲線と
して描かれ、これからＥＤ₅₀値が得られた。つまりＮＢ
Ｔ＋５０％に必要な分化促進剤の量である。これらのＥ
Ｄ₅₀値から分化補助剤の低減指数が得られる。低減指数
＝分化補助剤存在時のＥＤ₅₀値／分化促進剤単独時のＥ
Ｄ₅₀値となる。低減指数は低いほど、分化補助剤の機能
が高いことを示す。図３に示したように、ビタミンＢ₂
とウロルビンは０．５低減指数の濃度である３．０μ
Ｍ、１．８μＭに達すると、上記のＭＡＴインヒビター
の活性を大きく上回る。

【００３１】〔実施例７〕 ウロルビンとビタミンＢ₂ のｔＲＮＡメチルトランスフ
ェラーゼに対する抑制活性 ｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼはＨＬ−６０癌細胞
から抽出する。つまり実施例４で示した高速細胞抽出液
である。まず、細胞抽出液をｐＨ５まで調整し、沈殿し
たたんぱく質を遠心分離機で分離し、再度０．０５Ｍ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、
５ｍＭ ＨＳＣＨ₂ ＣＨ₂ ＯＨの混合液に溶かす。この
酵素溶液は再度ＤＥＡＤ−セルロースクロマトグラフィ
ーで、塩化カリウム傾斜抽出液を採り、ｔＲＮＡメチル
トランスフェラーゼを抽出精製する（参考文献(20)を参
照）。ｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ活性は０．２
５ml反応液中で測定する。それには０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ７．８、０．１Ｍ塩化アンモニウム、０．０４
Ｍ フッ化アンモニウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、５ｍＭ ＤＴＴ、２０μｇ大腸桿菌Ｂ ｔＲＮＡ、
０．２５μＣｉ〔 ³Ｈ−ＣＨ₃ 〕ＡｄｏＭｅｔ、２５μ
ｇ酵素を含む。反応は３７℃で３０分間行う。ｔＲＮＡ
は冷たい５％ＴＣＡ沈殿を用い、その後ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ（膜孔０．４５μｍ）薄膜で濾過する。薄膜は乾燥
したあと、放射線量を測定し、ｔＲＮＡメチルトランス
フェラーゼの活性を測定する。

【００３２】結果は図４に示した通り、ウロルビンとビ
タミンＢ₂ にはｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼを抑
制する活性を持つ。しかしメチルトランスフェラーゼ抑
制活性の有効量は分化補助剤の有効量よりかなり多い。
これはこれらの異なった活性の生理化学環境を測定する
ことに関連がある可能性がある。異なった生理化学環境
（例えば塩の濃度）は化学物質と酵素の有効接触に影響
を及ぼし得る。感度についてかなりの差があり、異なっ
たメチルトランスフェラーゼのインヒビターと分化補助
剤の活性は一定の比例関係がある。より有効なメチルト
ランスフェラーゼインヒビターはより有効な分化補助剤
となる。我々もその他にethidium brom-ide やhycantho
ne(NSC 142982)のようなメチルトランスフェラーゼイン
ヒビターを発見した。それらはウロルビンやビタミンＢ
₂ と同様に有効な分化補助剤活性を有する。この２種類
のメチルトランスフェラーゼインヒビターは０．５低減
指数濃度がeth-idium bromide で０．９５μＭとhycant
honeで２μＭに到達する必要がある。メチルトランスフ
ェラーゼインヒビターは有効な分化補助剤であることに
疑いの余地はない。

【００３３】〔実施例８〕 分化補助剤の分化促進作用の分析 分化補助剤は分化促進剤の有効量を減らすことができる
だけでなく、分化程度を完全に促進することができる。
ＨＬ−６０癌細胞を培養する。培養の開始濃度は１．５
×１０⁵ 細胞／ml。培養瓶は３組にわけ、１組あたり４
〜５瓶とする。そのうち１瓶は添加剤を加えないコント
ロールとする。１組にはretinoic acid を０．０２５〜
１．１５μＭを加えてコントロール組とする。その外２
組には４μＭのウロルビンとビタミンＢ₂ を加える。９
６時間培養したあと、実施例４に述べたＮＢＴ測定を行
う。各測定値から添加剤を加えないコントロールの数値
を控除する。

【００３４】結果は図５に示す通りで、分化導入剤を単
独で使用した場合分化程度は最高でも８５％にしか達し
なかった。ウロルビン又はビタミンＢ₂ を加えると、分
化程度は１００％に達する。分化程度を完全に促進する
ことは治療上において分化促進剤の有効量を減らすより
重要なことである。周知の通り、retinoic acid は抗癌
剤であり、治療効果が高い（参考文献(14)を参照）が、
すぐに癌細胞が再発してしまう（参考文献(34)及び(1）
を参照）。分化促進剤を単独使用して、分化が不完全で
あることと再発することは関連性がある。分化促進剤が
細胞に傷害を与え、細胞が完全に分化を行えないことが
原因である。分化の手順において、緩慢な２回分の細胞
分裂周期が必要であり（参考文献(43)、(44)及び(45)を
参照）、細胞が傷害を受ければ、分化が停止し、最終分
化にまで至らない。異常メチルトランスフェラーゼが分
化促進剤で改善され癌蛋白因子を除去され、複合酵素は
３つの構成酵素に分解する。一部のメチルトランスフェ
ラーゼは単体の場合、核酸を分解する活性を持ち、細胞
に傷害を与えることが分かっている（参考文献(18)を参
照）。傷害が深刻であれば細胞は死滅してしまう。しか
し傷害が深刻でなければ、長時間停止し修復され、reti
noic acid の有効濃度が維持できない場合、この復活し
た細胞は原状に戻り、再発してしまう。分化補助剤の重
要性は分化促進剤には及ばないが、分化補助剤は分化治
療においては不可欠な成分である。

【００３５】細胞分化剤は必要な分化促進剤と補助剤以
外に、もう１つ癌治療に非常に有効な成分がある。それ
は抗悪病質剤（anticachexia agent）である。我々はフ
ェニルグルタミドは癌患者のcachexiaが過度排泄を促進
するのに対抗することを発見している（参考文献(26)を
参照）。とくに癌に対する予防効果は顕著である（参考
文献(16)及び(35)を参照）。フェニルグルタミドは図２
の第４パートの主要成分である。つまり、細胞分化剤は
多くの必要な化学成分を含んでおり、相乗効果をあげて
いる。必要でない化学成分を含まれているが、これらは
身体に有害ではなく、これらを除去する必要性はない。

【００３６】〔実施例９〕 分化補助剤とその他の抗癌化学治療剤との相乗効果 発癌の原因は多いが、異常メチル化酵素複合体は重要な
因子である。その他の発癌遺伝子も症状を引き起こす重
要な因子である。異常メチルトランスフェラーゼの解決
ですでに大きな問題が除去されているが、より多くの方
面から攻撃することで、さらに高い治療効果が得られる
ものと我々は考えている。癌細胞は非常に活性の高いメ
チル化酵素複合体を含み、化学薬物を単独使用してＤＮ
Ａ合成を抑制すると、過度なメチルトランスファーが促
進される。これは遺伝子重複合成を惹起し、遺伝子重複
合成は薬物耐性を持つ細胞を形成してしまう（参考文献
(33)を参照）。これは化学療法が失敗する大きな原因と
なる。細胞分化剤で異常メチル化酵素複合体を抑制すれ
ば、薬物耐性細胞の形成を低減でき、癌治療に役立つ。
この事実は細胞分化剤が一部の抗癌薬物と相乗効果を上
げるのを証明している。

【００３７】

【略語の説明】

(1) ＡｄｏＨｃｙ：S-adenosylhomocysteine (2) ＡｄｏＭｅｔ：S-adenosylmethionine (3) ＣＤＡ：cell diffirentiation agent（細胞分化
剤） (4) ＤＴＴ：dithiothreitol (5) ＨＰＬＣ：high performance liquid chromatograp
hy（高速液体クロマトグラ フィー） (6) ＭＡＴ：methionine adenosyltransferase (7) ＮＢＴ：nitroblue tetrazolium (8) ＳＡＨＨ：S-adenosylhomocysteine hydrolase (9) ＸＡＤ：吸着剤（Sigma 社製）

【００３８】

【発明の効果】本発明の効果は異常メチル化酵素複合体
に関して癌症状の治療と予防を行うため、健常人の尿液
から細胞分化剤を抽出精製するものである。この製剤は
癌細胞の異常なメチル化酵素複合体を正常にすることが
でき、その結果癌細胞は最終分化を促進され、さらに分
裂が行われなくなり、死滅する。このように癌に対して
治療、予防効果が見られる。

【００３９】

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on. Exp. Cell Res. 156:198-212.

【図面の簡単な説明】

【図１】細胞分化剤の製造フローチャートである。

【図２】細胞分化剤のゲル濾過分析結果のグラフであ
る。ＣＤＡ−II注射剤を冷凍乾燥で濃縮したあと、クロ
マトカラムで分離する。その際にＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２
のカラム（４１cm×４４cm）を使用する。収集した流出
液はそれぞれＡ２５５吸収度（実線）、ＭＡＴ^LT活性抑
制（点線）、重量％、ＨＬ−６０癌細胞分化活性（ＮＢ
Ｔ＋％で表示）を測定する。

【図３】ウロルビン（実線）とビタミンＢ₂ （点線）の
分化補助剤活性についてのグラフである。横軸は濃度
（μＭ）、縦軸は低減指数を示す。

【図４】ウロルビン（実線）とビタミンＢ₂ （点線）の
ｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼに対する抑制活性に
ついてのグラフである。横軸は濃度（ｍＭ）、縦軸は相
対活性％である。

【図５】ウロルビンとビタミンＢ₂ の分化促進剤に対す
る増進作用を示すグラフである。縦軸はＮＢＴ＋細胞の
占める％、実線は異なった濃度のretinoic acid を添加
したコントロール組、点線は４μＭビタミンＢ₂ を添加
した試験組、一点鎖線は４μＭウロルビンを添加した試
験組を示す。

【図６】ＣＤＡ−IIとチミジンの癌に対する相乗効果に
ついてのグラフである。横軸は薬剤量（mg／ml）、縦軸
は癌細胞群形成の相対活性（％）であり、実線はチミジ
ン単独使用の試験組、点線はＣＤＡ−II単独使用の試験
組、一点鎖線はチミジンとＣＤＡ−IIを１：１の比率で
併用した組を示す。抗癌効果は、併用した方が単独使用
するより高く、相乗効果が顕著に現れている。癌細胞群
形成の活性は実施例４に示したＨＢＬ−１００乳癌細胞
で測定する。コントロール組の癌細胞群形成に対する比
率で示す。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト尿から吸着剤ＸＡＤ−１６に治療有効
   量を吸着させた後抽出精製した細胞分化剤及びその基剤
   を含み、異常なメチル化酵素複合体を抑制する、癌細胞
   分化を促進する薬学組成物。
2. 【請求項２】さらにチミジンを含有する、請求項１記載
   の薬学組成物。
3. 【請求項３】注射剤、カプセルなどの剤型を持つ、請求
   項１又は２記載の薬学組成物。
4. 【請求項４】細胞分化剤は文化促進剤及び分化補助剤を
   含み、該分化促進剤は、ＭＡＴインヒビターであるとこ
   ろのフェニル酢酸、馬尿酸、インドール酢酸を含み、分
   化補助剤は、メチルトランスフェラーゼインヒビターで
   あるところのビタミンＢ₂ 、ウロルビンを含む、ことを
   特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
5. 【請求項５】細胞分化剤はフェニルグルタミドを含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
6. 【請求項６】クレアチン濃度が１．２〜３．７g／１の
   ヒト尿を収集し、吸着剤ＸＡＤ−１６を通過させ、エタ
   ノール又は類似の構造を持つ有機溶剤で抽出し、純化さ
   れた細胞分化剤製剤を回収するという、細胞分化剤の製
   造方法。