KR20180019519A - 체세포로의 분화 유도에 적합한 줄기 세포 클론을 제조하는 방법 - Google Patents
체세포로의 분화 유도에 적합한 줄기 세포 클론을 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 줄기 세포 클론을 제조하는 방법이며, (i) 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자를 줄기 세포에 도입하는 공정, (ii) 외래성 유전자가 도입된 줄기 세포를 상기 체세포로 분화 유도하는 공정, (iii) 분화 유도된 체세포를 탈분화하는 공정 및 (iv) 공정 (iii)에서 형성된 줄기 세포 콜로니로부터, 염색체에 상기 외래성 유전자가 혼입된 줄기 세포를 단리하는 공정을 포함하는, 방법을 제공한다.
Description
본 발명은, 체세포의 초기화를 이용한, 다양한 집단으로 구성되어 있는 줄기 세포 또는 체세포를 단일 세포 유래 세포 집단화, 즉 클론화하는 방법 등에 관한 것이다.
세포주 개발에 있어서, 클로닝은 중요한 공정이며, 종래 이 클로닝은 한계 희석법을 사용해서 행해지고 있다.
세포에 외래성의 유전자를 도입함으로써, 원하는 세포종으로 세포를 변화시키는 것이 행해지고 있지만(특허문헌 1, 비특허문헌 1 및 2), 도입된 외래성의 유전자의 카피수나 염색체에 있어서의 도입 부위 등이 다른 점에서, 얻어진 세포는 균일하지 않다. 그래서, 한계 희석법에 의해, 클로닝을 행하는 것을 생각할 수 있지만, 모든 세포에 있어서, 한계 희석법을 적용할 수 있다고는 할 수 없다.
또한, 외래성의 유전자를 도입해서 얻어진 세포는, 동일한 방법을 행했다 하더라도 다시 원하는 세포가 얻어질 확률은 낮기 때문에, 당해 세포에 있어서 상동 재조합 등의 유전자 조작을 필요로 하는 경우, 이러한 조작을 할 수 있는 세포종은 한정되어 있다.
근년, 원하는 TCR형을 보유하는 T 임파구를 초기화해서 얻어진 iPS 세포로부터 다시 T 임파구로 유도함으로써의 보충 요법이 제안되어 있지만(특허문헌 2 또는 비특허문헌 3), 클로닝 또는 유전자 조작을 겨냥한 것은 아니다.
Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014
Tanaka A, et al, PLoS One. 8:e61540, 2013
Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013.
본 발명의 목적은, 다양한 집단으로 구성되어 있는 줄기 세포 또는 체세포를 단일 세포 유래 세포 집단화, 즉 클론화하는 데에 있다.
본 발명자들은, 1 또는 복수회의 탈분화를 거쳐서 제조된 줄기 세포 콜로니로부터, 체세포의 분화 유도에 관련된 유전자가 염색체에 혼입된 줄기 세포를 단리한바, 단리된 줄기 세포가 체세포로의 분화 유도에 적합한 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명을 제공하는 것이다.
[A1] 줄기 세포 클론을 제조하는 방법이며,
(i) 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자를 줄기 세포에 도입하는 공정,
(ii) 상기 외래성 유전자가 도입된 줄기 세포를 상기 체세포로 분화 유도하는 공정,
(iii) 분화 유도된 체세포를 탈분화하는 공정 및
(iv) 공정 (iii)에서 형성된 줄기 세포 콜로니로부터, 염색체에 상기 외래성 유전자가 혼입된 줄기 세포를 단리하는 공정
을 포함하는, 방법.
[A2] 단리된 줄기 세포 클론의 체세포로의 분화 유도 효율이, 클론화 전의 줄기 세포와 비교해서 높은, [A1]에 기재된 방법.
[A3] 상기 체세포가 조혈 전구 세포, 거핵 전구 세포, 적아구, 신경 세포, 신경 줄기 세포, 신경 능선 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 연골 세포, 간 세포 또는 멜라닌 세포인, [A1] 또는 [A2]에 기재된 방법.
[A4] 상기 체세포가 거핵구 전구 세포이고, 상기 분화 유도에 관련된 외래성 유전자가, MYC 패밀리 유전자를 포함하는 암 유전자, Bmi1을 포함하는 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자(폴리콤 유전자) 및 BCL-XL 유전자를 포함하는 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 외래성 유전자인, [A3]에 기재된 방법.
[A5] MEG3을 발현하는 줄기 세포가 단리되는, [A1] 내지 [A4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[A6] 상기 분화 유도에 관련된 외래성 유전자가 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, [A1] 내지 [A5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[A7] 공정 (iii)의 탈분화가 OCT3/4, SOX2 및 KLF4로 이루어지는 군에서 선택되는 초기화 인자의 도입에 의해 실시되는, [A1] 내지 [A6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[A8] 체세포를 제조하는 방법이며,
[A1] 내지 [A7]에 기재된 방법에 따라 제조된 줄기 세포 클론을 체세포로 분화 유도하는 공정을 포함하는, 방법.
[A9] 혈소판을 제조하는 방법이며,
[A1] 내지 [A6]에 기재된 방법에 따라 제조된 줄기 세포 클론을 거핵 전구 세포로 분화 유도하는 공정 및
분화 유도된 거핵구 전구 세포를 거핵구 세포로 성숙시켜서, 혈소판을 방출시키는 공정
을 포함하는, 방법.
[A10]
제조되는 혈소판이 HLA를 결손하고 있는, [A9]에 기재된 방법.
[B1] 다음 공정을 포함하는, 체세포를 클론화하는 방법이며, 당해 체세포가, 외래성 유전자를 발현함으로써 제조되는 체세포인, 방법;
(i) 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성 유전자가 염색체에 혼입된 체세포에 초기화 인자를 도입하여, 줄기 세포 콜로니를 형성시키는 공정,
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 줄기 세포 콜로니를 단리하는 공정 및
(iii) 상기 공정 (ii)에서 단리된 줄기 세포 콜로니에 포함되는 줄기 세포를 체세포로 유도하는 공정이며, 당해 줄기 세포로부터 당해 체세포로의 어느 분화 단계의 세포를 대응하는 약제와 접촉시키는 공정을 포함하는 공정;
[B2] 상기 체세포가 거핵구 전구 세포이고, 상기 외래성 유전자가, MYC 패밀리 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자인, [B1]에 기재된 방법;
[B3] 상기 공정 (iii)이 다음 공정을 포함하는, [B2]에 기재된 방법;
(a) 상기 공정 (ii)에서 단리된 줄기 세포 콜로니에 포함되는 줄기 세포를 조혈 전구 세포로 유도하는 공정 및
(b) 상기 공정 (a)에서 얻어진 조혈 전구 세포를 대응하는 약제와 접촉시키는 공정;
[B4] 상기 초기화 인자가, OCT3/4, SOX2 및 KLF4를 포함하는 인자인, [B1] 내지 [B3] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[B5] 상기 약제 응답성 프로모터가 TRE 서열을 갖는 프로모터이고, 적어도 상기 공정 (iii)의 세포에 있어서, 또한 reverse tetR 융합 단백질을 발현시키는, [B1] 내지 [B4] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[B6] 상기 공정 (iii)에 있어서, 상기 공정 (ii)에서 단리된 줄기 세포 콜로니에 포함되는 줄기 세포에 있어서, MEG3을 발현하는 줄기 세포를 선택하는 공정을 더 포함하는, [B2] 내지 [B5] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[B7] 상기 공정 (iii)에 있어서, 상기 공정 (ii)에서 단리된 줄기 세포 콜로니에 포함되는 줄기 세포에 있어서, HLA를 결손시키는 공정을 더 포함하는, [B1] 내지 [B6] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[B8] 상기 HLA가 클래스 I 항원인, [B7]에 기재된 방법;
[B9] 상기 클래스 I 항원이 β2-마이크로글로불린인, [B8]에 기재된 방법;
[B10] 다음 공정을 포함하는, 혈소판의 제조 방법:
[B2] 내지 [B9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 거핵구 전구 세포를 클론화하는 공정 및
클론화된 거핵구 전구 세포를 거핵구 세포로 성숙시켜서, 혈소판을 방출시키는 공정;
[B11] 다음 공정을 포함하는, HLA를 결손시킨 체세포를 제조하는 방법;
(i) 체세포에 초기화 인자를 도입하여, 다능성 줄기 세포를 형성시키는 공정,
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 다능성 줄기 세포에 있어서 HLA를 결손시키는 공정 및
(iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 HLA를 결손시킨 다능성 줄기 세포를 체세포로 유도하는 공정;
[B12] 상기 초기화 인자가, OCT3/4, SOX2 및 KLF4를 포함하는 인자인, [B11]에 기재된 방법;
[B13] 상기 공정 (i)에서 사용되는 체세포가 거핵구 전구 세포이고, 당해 거핵구 전구 세포가, 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 MYC 패밀리 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 염색체에 혼입함으로써 제조된 거핵구 전구 세포인, [B11] 또는 [B12]에 기재된 방법;
[B14] 상기 공정 (iii)이 다음 공정을 포함하는, [B13]에 기재된 방법;
(A) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 HLA를 결손시킨 다능성 줄기 세포를 조혈 전구 세포로 유도하는 공정 및
(B) 상기 공정 (A)에서 얻어진 조혈 전구 세포를 대응하는 약제와 접촉시키는 공정;
[B15] 상기 HLA가 클래스 I 항원인, [B11] 내지 [B14] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[B16] 상기 클래스 I 항원이 β2-마이크로글로불린인, [B15]에 기재된 방법;
[B17] 다음 공정을 포함하는, HLA를 결손시킨 혈소판의 제조 방법:
[B13] 내지 [B16] 중 어느 하나에 기재된 방법으로, HLA를 결손시킨 거핵구 전구 세포를 제조하는 공정 및
HLA를 결손시킨 거핵구 전구 세포를 거핵구 세포로 성숙시켜서, 혈소판을 방출시키는 공정;
[B18] 외래성의 암 유전자 및 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자를 포함하는, iPS 세포이고, 당해 외래성의 암 유전자에 대한 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자의 함유율이 2배 내지 7배인, iPS 세포;
[B19] 상기 암 유전자가 c-Myc이고, 그리고 상기 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자가 Bmi1인, [B18]에 기재된 iPS 세포;
[B20] 외래성의 암 유전자 및 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자를 포함하는, 거핵구 전구 세포이고, 당해 외래성의 암 유전자에 대한 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자의 함유율이 2배 내지 7배인, 거핵구 전구 세포;
[B21] 상기 암 유전자가 c-Myc이고, 그리고 상기 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자가 Bmi1인, [B20]에 기재된 거핵구 전구 세포; 및
[B22] 거핵구 전구 세포의 유도에 적합한 다능성 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포를 선택하는 방법이며, MEG3을 발현하는 다능성 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포를 선택하는 공정을 포함하는, 방법.
본 발명에 따르면, 체세포로의 분화 유도에 적합한 줄기 세포 클론을 제조하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 의해 클론화된 줄기 세포는, 종래의 한계 희석법에 의해 클론화된 줄기 세포와 비교해서 세포 증식능 등이 우수하다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 2차 거핵구 전구 세포 클론은, 종래의 것보다 세포 증식능이나 거핵구로의 성숙능이 우수할 뿐만 아니라, 동 클론으로부터 제조된 거핵구는 혈소판 산생능도 높다.
도 1은 한계 희석법에 의해 얻어진 22개의 거핵구 전구 세포 클론 후보 및 원래의 다양한 집단으로 구성되어 있는 거핵구 전구 세포(H+)로부터 유도된 혈소판 산생수(도 1의 A) 및 당해 혈소판의 PMA 자극에 의해 형성된 GPIIb/IIIa 복합체수를 대체하는 형광 강도(도 1의 B)를 나타내는 그래프이다.
도 2는 도 1의 22개의 거핵구 전구 세포 클론 후보 중 5개의 거핵구 전구 세포 클론 및 원래의 다양한 집단으로 구성되어 있는 거핵구 전구 세포(H)로부터 유도된 혈소판 산생수(도 2의 A) 및 당해 혈소판의 PMA 자극에 의해 형성된 GPIIb/IIIa 복합체수를 대체하는 형광 강도(도 2의 B)를 다시 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 도 2의 5개의 거핵구 전구 세포 클론 및 원래의 거핵구 전구 세포(H)로부터 유도된 혈소판 산생수(도 3의 A) 및 당해 혈소판의 PMA 자극에 의해 형성된 GPIIb/IIIa 복합체수를 대체하는 형광 강도(도 3의 B)를 다시 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4의 A는, 거핵구 전구 세포의 제조와, 초기화에 의한 클론화 및 2차 iPS 세포로부터 2차 거핵구 전구 세포를 제조하는 모식도를 나타낸다. 도 4의 B는, 거핵구 전구 세포를 초기화함으로써 얻어진 2차 iPS 세포 클론의 염색체에 포함되는 c-MYC 또는 BMI1의 1세포당 카피수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 각 2차 iPS 세포 클론으로부터 유도된 거핵구 전구 세포에 있어서의 CD42b 및 CD41a의 발현 세포 분포 및 CD235 및 CD41a의 발현 세포 분포를 유세포분석기에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 6의 A는 β2-마이크로글로불린의 Exon1을 결실시키기 위한 상동 재조합의 모식도를 나타낸다. 도 6의 B는 타깃 벡터(Target vector) 도입 후의 2차 iPS 세포 클론에 있어서의 상동 재조합을 확인하기 위한 PCR의 결과를 나타낸다.
도 7의 A는 β2-마이크로글로불린의 Exon1을 결실한 2차 iPS 세포 클론 유래의 거핵구 전구 세포(imMKCL)(좌측 도면) 및 당해 거핵구 전구 세포로부터 산생된 혈소판(우측 도면)에 있어서의 β2-마이크로글로불린 및 HLA의 발현 세포 분포를 유세포분석기에서 측정한 결과를 나타낸다. 도 7의 B는, β2-마이크로글로불린의 Exon1을 결실한 2차 iPS 세포 클론(HLA(-)) 또는 2차 iPS 세포 클론(HLA(+)) 유래의 거핵구 전구 세포로부터 산생된 혈소판에 있어서의 PMA 자극 후의 PAC1의 형광 강도비를 나타낸다. 형광 강도는 2차 iPS 세포 클론(HLA(+)) 유래의 혈소판의 값을 1로 하였다.
도 8은 거핵구 전구 세포로 유도 가능한 2차 iPS 세포 클론(Good iPS) 및 거핵구 전구 세포로 유도 불가능한 2차 iPS 세포 클론(Bad iPS), 또는 거핵구 전구 세포로 유도 가능한 2차 iPS 세포 클론 유래의 조혈 전구 세포(Good HPC) 및 거핵구 전구 세포로 유도 불가능한 2차 iPS 세포 클론 유래의 조혈 전구 세포(Bad HPC)를 일루미나(Illumina)사(도 8의 A) 또는 아피메트릭스(Affymetrix)사(도 8의 B)의 마이크로 어레이에서 유전자의 발현량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 9의 A 및 B는 2차 iPS 세포 클론 유래 거핵구 세포(Clone(클론) 2)와 클론화 전의 거핵 전구 세포주(Parental)의 증식 곡선과, 당해 증식 곡선으로부터 산출한 배가 시간을 각각 나타낸다(** P＜0.01).
도 10의 A 및 B는 2차 iPS 세포 클론 유래 거핵구 세포(Clone 2)와 클론화 전의 거핵 전구 세포주(Parental)의 성숙 전후의 세포 외관 및 각 세포의 사이즈 변화를 각각 나타낸다.
도 11은 혈소판의 전구(progenitor)인 Proplatelet(프로혈소판) 형성수를 비교한 그래프이다.
도 2는 도 1의 22개의 거핵구 전구 세포 클론 후보 중 5개의 거핵구 전구 세포 클론 및 원래의 다양한 집단으로 구성되어 있는 거핵구 전구 세포(H)로부터 유도된 혈소판 산생수(도 2의 A) 및 당해 혈소판의 PMA 자극에 의해 형성된 GPIIb/IIIa 복합체수를 대체하는 형광 강도(도 2의 B)를 다시 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 도 2의 5개의 거핵구 전구 세포 클론 및 원래의 거핵구 전구 세포(H)로부터 유도된 혈소판 산생수(도 3의 A) 및 당해 혈소판의 PMA 자극에 의해 형성된 GPIIb/IIIa 복합체수를 대체하는 형광 강도(도 3의 B)를 다시 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4의 A는, 거핵구 전구 세포의 제조와, 초기화에 의한 클론화 및 2차 iPS 세포로부터 2차 거핵구 전구 세포를 제조하는 모식도를 나타낸다. 도 4의 B는, 거핵구 전구 세포를 초기화함으로써 얻어진 2차 iPS 세포 클론의 염색체에 포함되는 c-MYC 또는 BMI1의 1세포당 카피수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 각 2차 iPS 세포 클론으로부터 유도된 거핵구 전구 세포에 있어서의 CD42b 및 CD41a의 발현 세포 분포 및 CD235 및 CD41a의 발현 세포 분포를 유세포분석기에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 6의 A는 β2-마이크로글로불린의 Exon1을 결실시키기 위한 상동 재조합의 모식도를 나타낸다. 도 6의 B는 타깃 벡터(Target vector) 도입 후의 2차 iPS 세포 클론에 있어서의 상동 재조합을 확인하기 위한 PCR의 결과를 나타낸다.
도 7의 A는 β2-마이크로글로불린의 Exon1을 결실한 2차 iPS 세포 클론 유래의 거핵구 전구 세포(imMKCL)(좌측 도면) 및 당해 거핵구 전구 세포로부터 산생된 혈소판(우측 도면)에 있어서의 β2-마이크로글로불린 및 HLA의 발현 세포 분포를 유세포분석기에서 측정한 결과를 나타낸다. 도 7의 B는, β2-마이크로글로불린의 Exon1을 결실한 2차 iPS 세포 클론(HLA(-)) 또는 2차 iPS 세포 클론(HLA(+)) 유래의 거핵구 전구 세포로부터 산생된 혈소판에 있어서의 PMA 자극 후의 PAC1의 형광 강도비를 나타낸다. 형광 강도는 2차 iPS 세포 클론(HLA(+)) 유래의 혈소판의 값을 1로 하였다.
도 8은 거핵구 전구 세포로 유도 가능한 2차 iPS 세포 클론(Good iPS) 및 거핵구 전구 세포로 유도 불가능한 2차 iPS 세포 클론(Bad iPS), 또는 거핵구 전구 세포로 유도 가능한 2차 iPS 세포 클론 유래의 조혈 전구 세포(Good HPC) 및 거핵구 전구 세포로 유도 불가능한 2차 iPS 세포 클론 유래의 조혈 전구 세포(Bad HPC)를 일루미나(Illumina)사(도 8의 A) 또는 아피메트릭스(Affymetrix)사(도 8의 B)의 마이크로 어레이에서 유전자의 발현량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 9의 A 및 B는 2차 iPS 세포 클론 유래 거핵구 세포(Clone(클론) 2)와 클론화 전의 거핵 전구 세포주(Parental)의 증식 곡선과, 당해 증식 곡선으로부터 산출한 배가 시간을 각각 나타낸다(** P＜0.01).
도 10의 A 및 B는 2차 iPS 세포 클론 유래 거핵구 세포(Clone 2)와 클론화 전의 거핵 전구 세포주(Parental)의 성숙 전후의 세포 외관 및 각 세포의 사이즈 변화를 각각 나타낸다.
도 11은 혈소판의 전구(progenitor)인 Proplatelet(프로혈소판) 형성수를 비교한 그래프이다.
본 발명에 따른 줄기 세포 클론을 제조하는 방법은 이하의 공정을 포함한다:
(i) 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자를 줄기 세포에 도입하는 공정,
(ii) 상기 외래성 유전자가 도입된 줄기 세포를 상기 체세포로 분화 유도하는 공정,
(iii) 분화 유도된 체세포를 탈분화하는 공정 및
(iv) 공정 (iii)에서 형성된 줄기 세포 콜로니로부터, 염색체에 상기 외래성 유전자가 혼입된 줄기 세포를 단리하는 공정.
단리된 줄기 세포 클론은, 클론화 전의 줄기 세포와 비교해서 체세포로의 분화 유도에 적합하며, 1세포당의 체세포로의 분화 유도 효율이 높다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 줄기 세포 클론의 제조 방법은, 이하의 공정을 포함해도 된다:
(i) 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성 유전자가 염색체에 혼입된 체세포에 초기화 인자를 도입하여, 줄기 세포 콜로니를 형성시키는 공정 및
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 줄기 세포 콜로니를 단리하는 공정.
얻어진 줄기 세포 클론은, 추가로 체세포로 분화 유도되어도 된다. 분화 유도는 당업자가 원하는 체세포로의 분화 유도에 적합한 방법을 적절히 선택해서 실시되는 것이며, 특별히 한정되지 않지만, 이하의 공정을 포함해도 된다:
(iii) 공정 (ii)에서 단리된 줄기 세포 콜로니에 포함되는 줄기 세포를 체세포로 유도하는 공정이며, 당해 줄기 세포로부터 당해 체세포로의 어느 분화 단계의 세포를 대응하는 약제와 접촉시키는 공정을 포함하는 공정.
본 발명에 있어서, 클론화란, 세포 집단의 클론화를 의미하고, 불균일한 유전 정보를 갖는 세포 집단으로부터, 균일한 유전 정보를 갖는 세포 집단을 단리하는 것을 의미한다.
클론화에
제공하는 체세포
본 발명에 있어서, 클론화에 제공되는 체세포(1차 체세포라고 한다)는, 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 유전자를 염색체에 혼입함으로써 제조된 세포이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 신경 세포(WO2014/148646, Wapinski OL et al, Cell. 155:621-635, 2013), 신경 줄기 세포(Han DW et al, Cell Stem Cell. 10:465-472, 2012), 신경 능선 세포(Kim YJ, et al, Cell Stem Cell. 15:497-506, 2014), 심근 세포(Ieda M et al, Cell. 142:375-386, 2010), 골격근 세포(Tanaka A, et al, PLoS One. 8:e61540, 2013), 연골 세포(Outani H, et al, PLoS One. 8:e77365, 2013), 간 세포(Huang P, et al, Cell Stem Cell. 14:370-384, 2014), 멜라닌 세포(Yang R, et al, Nat Commun. 5:5807, 2014), 조혈 전구 세포(Batta K, Cell Rep. 9:1871-84, 2014), 적아구(Hirose S, et al, Stem Cell Reports. 1:499-508, 2013) 및 거핵구 전구 세포(Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014)를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 거핵구 전구 세포는, 한계 희석법에 의해 클론화할 수 없는 점에서, 본 발명의 방법에 의해 클론화하는 체세포로서 적합하다. 적아구도 본 발명에 있어서의 체세포로서 바람직하다. 그러나, 이들 이외의 체세포여도, 원하는 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자가 염색체에 도입된 줄기 세포 클론을 얻는 것이 가능하기 때문에, 체세포는 거핵 전구 세포나 적아구에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자는 넓게는, 줄기 세포로부터 체세포로 분화 유도할 때에 세포에 도입되는 유전자를 의미한다. 체세포가 거핵구 전구 세포인 경우를 예로 설명하면 분화 유도에 관련된 유전자는, 암 유전자, 바람직하게는 MYC 패밀리 유전자, 보다 바람직하게는 c-Myc; p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자(폴리콤 유전자), 바람직하게는 Bmi1; 및 아포토시스 억제 유전자, 바람직하게는 BCL-XL 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자여도 된다. 체세포가 적아구인 경우를 예로 들면, 분화 유도에 관련된 유전자는, 암 유전자, 바람직하게는 MYC 패밀리 유전자, 보다 바람직하게는 c-Myc; 아포토시스 억제 유전자, 바람직하게는 BCL-XL 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자여도 된다. 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자는 약제 응답성 프로모터와 작용 가능하게 연결되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 약제 응답성 프로모터란, 대응하는 약제의 존재 하 또는 비존재 하에서 유전자를 발현하는 프로모터를 말한다. 대응하는 약제의 존재 하에서 유전자를 발현하는 프로모터로서 TRE 프로모터(tetO 서열이 7회 연속된 Tet 응답 서열을 갖는 CMV 최소 프로모터)가 예시된다. TRE 프로모터를 사용한 경우, 동일한 세포에 있어서, reverse tetR(rtetR) 및 VP16AD와의 융합 단백질(reverse tetR 융합 단백질)을 동시에 발현시킴으로써, 대응하는 약제(예를 들어, 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 예시된다)의 존재 하에서 유전자 발현을 유도하는 양식을 사용하는 것도 바람직하다. reverse tetR 융합 단백질을 사용하는 경우, 당해 융합 단백질은, 적어도 후술하는 「줄기 세포로부터 2차 체세포로 유도하는 공정」에 있어서 발현시키면 된다. 예를 들어, 1차 체세포를 제작할 때, reverse tetR 융합 단백질을 코딩하는 유전자를, 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결시켜서 도입함으로써, 「줄기 세포로부터 2차 체세포로 유도하는 공정」에 있어서, 대응하는 약제의 첨가 또는 제거에 의해 reverse tetR 융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 약제 응답성 프로모터를 2종류 이상의 유전자와 기능적으로 연결하는 경우, 약제 응답성 프로모터는 모두 동일한 종류를 사용해도 되고, 2종류 이상 사용해도 된다.
1차 거핵구 전구 세포의 유도 방법
본 발명에 있어서의 「거핵구 전구 세포」란, 성숙함으로써 거핵구가 되는 세포이고, 다핵화하지 않은 세포이며, 예를 들어 CD41a 양성/CD42a 양성/CD42b 약양성으로서 특징지어지는 세포를 포함한다. 본 발명의 거핵구 전구 세포는, 바람직하게는 확대 배양에 의해 증식시키는 것이 가능한 세포이고, 예를 들어 적어도 60일 이상은, 적절한 조건에서 확대 배양 가능한 세포이다. 본 발명에 있어서, 거핵구 전구 세포는 클론화되어 있어도 되어 있지 않아도 되며, 특별히 한정되지 않지만, 클론화된 것을 거핵구 전구 세포주라 칭하는 경우도 있다. 본 발명에 있어서의 거핵구 전구 세포는 조혈 전구 세포로부터 유도되어도 된다.
본 발명에 있어서의 「거핵구」는 혈소판 전구 세포, 거핵 세포라고도 칭해지고, 그 세포질을 분리함으로써 혈소판을 산생하는 세포이고, 다핵화한 세포여도 되고, 예를 들어 CD41a 양성/CD42a 양성/CD42b 양성으로서 특징지어지는 세포를 포함한다. 이 외에도, 거핵구란, GATA1, FOG1, NF-E2 및 β1-튜불린(tubulin)이 발현하고 있는 세포로서 특징지어도 된다. 다핵화한 거핵구란, 거핵구 전구 세포와 비교해서 핵의 수가 상대적으로 증대한 세포 또는 세포군을 말한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 적용하는 거핵구 전구 세포의 핵이 2N인 경우에는, 4N 이상의 세포가 다핵화한 거핵구가 된다. 또한, 본 발명에 있어서, 거핵구는, 거핵구주로서 불사화되어 있어도 되고, 클론화된 세포군이어도 된다.
본 발명에 있어서, 조혈 전구 세포(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))란, 림프구, 호산구, 호중구, 호염기구, 적혈구, 거핵구 등의 혈구계 세포로 분화가능한 세포이며, 본 발명에 있어서, 조혈 전구 세포와 조혈 줄기 세포는, 구별되는 것은 아니고, 특별한 언급이 없으면 동일한 세포를 나타낸다. 조혈 줄기 세포/전구 세포는, 예를 들어 표면 항원인 CD34 및/또는 CD43이 양성인 것에 의해 인식할 수 있다. 본 발명에 있어서, 조혈 줄기 세포는, 다능성 줄기 세포, 제대혈·골수혈·말초혈 유래의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 등으로부터 분화 유도된 조혈 전구 세포에 대해서도 적용할 수 있다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 조혈 전구 세포는, Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830(2010)에 기재된 방법에 따라서, 다능성 줄기 세포를 VEGF의 존재 하에서 C3H10T1/2 상에서 배양함으로써 얻어지는 네트-유사 구조물(ES-sac 또는 iPS-sac라고도 칭한다)로부터 제조할 수 있다. 여기서, 「네트-유사 구조물」이란, 다능성 줄기 세포 유래의 입체적인 낭상(囊狀)(내부에 공간을 수반하는 것) 구조체이며, 내피 세포 집단 등으로 형성되고, 내부에 조혈 전구 세포를 포함하는 구조체이다. 이 외에도, 다능성 줄기 세포로부터의 조혈 전구 세포의 유도 방법으로서, 배양체의 형성과 사이토카인의 첨가에 의한 방법(Chadwick et al. Blood 2003, 102:906-15, Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4:248-62, Saeki et al. Stem Cells 2009, 27:59-67) 또는 이종 유래의 스트로마 세포와의 공배양법(Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77) 등이 예시된다.
해당 다능성 줄기 세포로서, 수정란, 배성 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배성 생식 세포(EG 세포)와 같은 세포를 들 수 있다. 본 발명의 체세포로서의 거핵구 전구 세포는, 조혈 전구 세포에 암 유전자, p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자(폴리콤 유전자), 및/혹은 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜서 해당 세포를 배양하는 공정에 의해 유도된 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 「암 유전자」란, 그의 발현, 구조 또는 기능 등이 정상 세포와 다른 것에 기인하여 정상 세포의 암화를 일으키는 유전자이며, 예를 들어 MYC 패밀리 유전자, Src 패밀리 유전자, Ras 패밀리 유전자, Raf 패밀리 유전자, c-Kit나 PDGFR, Abl등의 단백질 키나아제 패밀리 유전자 등을 들 수 있다. MYC 패밀리 유전자로서, c-MYC, N-MYC 및 L-MYC가 예시된다. c-MYC 유전자란, 예를 들어NCBI의 액세션 번호 NM_002467로 나타나는 핵산 서열로 이루어지는 유전자이다. 또한, c-MYC 유전자에는, 그의 호몰로그도 포함되어도 되고, c-MYC 유전자 호몰로그란, 그의 cDNA 서열이, 예를 들어 NCBI의 액세션 번호 NM_002467로 나타나는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 유전자이다. NCBI의 액세션 번호 NM_002467로 나타나는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 cDNA란, NCBI의 액세션 번호 NM_002467로 표현되는 서열로 이루어지는 DNA와, 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 약 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 DNA, 혹은, NCBI의 액세션 번호 NM_002467로 표현되는 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA이며, 이들 DNA에 의해 코딩되는 단백질이, 조혈 전구 세포 등, 분화 단계의 세포 증폭에 기여한 것이다.
여기서, 스트린젠트 조건이란, 당업자에 의해 용이하게 결정되는 하이브리다이제이션의 조건이며, 일반적으로 프로브 길이, 세정 온도 및 염 농도에 의존하는 경험적인 실험 조건이다. 일반적으로, 프로브가 길어지면 적절한 어닐링을 위한 온도가 높아지고, 프로브가 짧아지면 온도는 낮아진다. 하이브리드 형성은, 일반적으로, 상보적 쇄가 그의 융점보다 약간 낮은 환경에 있어서의 재어닐링 능력에 의존한다.
예를 들어, 저스트린젠트 조건으로서, 하이브리다이제이션 후의 필터의 세정 단계에 있어서, 37℃ 내지 42℃의 온도 조건 하, 0.1×SSC, 0.1% SDS 용액 중에서 세정하는 것 등을 들 수 있다. 또한, 고스트린젠트 조건으로서, 예를 들어 세정 단계에 있어서, 65℃, 5×SSC 및 0.1% SDS 중에서 세정하는 것 등을 들 수 있다. 스트린젠트 조건을 보다 높게 함으로써, 상동성이 높은 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, c-MYC의 발현량을 억제하는 것이 바람직하기 때문에, 불안정화 도메인과 융합시킨 단백질을 코딩하는 c-MYC여도 된다. 불안정화 도메인은, ProteoTuner사 또는 Clontech사로부터 구입해서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자」로서, BMI1, Id1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HDAC, D㎚t1/3a/3b 등이 예시된다. BMI1 유전자란, 예를 들어 NCBI의 액세션 번호 NM_005180로 나타나는 핵산 서열로 이루어지는 유전자이다. 또한, BMI1 유전자에는, 그 호몰로그도 포함되어도 되고, BMI1 유전자의 호몰로그란, 그의 cDNA 서열이, 예를 들어 NCBI의 액세션 번호 NM_005180로 나타나는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 유전자이다. NCBI의 액세션 번호 NM_005180로 나타나는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 cDNA란, NCBI의 액세션 번호 NM_005180로 표현되는 서열로 이루어지는 DNA와, 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 약 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 DNA, 혹은, NCBI의 액세션 번호 NM_005180으로 표현되는 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA이며, 그 DNA에 의해 코딩되는 단백질이, MYC 패밀리 유전자 등의 암 유전자가 발현하고 있는 세포 내에서 발생하는 암 유전자 유도성 세포 노화를 억제하여, 해당 세포의 증폭을 촉진하는 것이다.
본 발명에 있어서, 「아포토시스 억제 유전자」란, 아포토시스를 억제하는 유전자이면 특별히 한정되지 않고 예를 들어, BCL2 유전자, BCL-XL 유전자, Survivin, MCL1 등을 들 수 있다. BCL-XL 유전자란, 예를 들어 NCBI의 액세션 번호 NM_001191 또는 NM_138578로 나타나는 핵산 서열로 이루어지는 유전자이다. 또한, BCL-XL 유전자에는, 그의 호몰로그도 포함되어도 되고, BCL-XL 유전자의 호몰로그란, 그의 cDNA 서열이, 예를 들어 NCBI의 액세션 번호 NM_001191 또는 NM_138578로 나타나는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 유전자이다. NCBI의 액세션 번호 NM_001191 또는 NM_138578로 나타나는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 cDNA란, NCBI의 액세션 번호 NM_001191 또는 NM_138578로 표현되는 서열로 이루어지는 DNA와, 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 약 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 DNA, 혹은, NCBI의 액세션 번호 NM_001191 또는 NM_138578로 표현되는 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA이며, 그 DNA에 의해 코딩되는 단백질이, 아포토시스를 억제하는 효과를 갖는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자를 조혈 전구 세포에 있어서 강제 발현시키는 방법은, 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 유전자를 염색체에 혼입함으로써 행해지는 것이 바람직하고, 예를 들어 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 유전자를 포함하는 발현 벡터를 조혈 전구 세포에 도입함으로써 이룰 수 있다. 이들 유전자를 발현하는 벡터로서, 예를 들어 레트로 바이러스, 렌티 바이러스 등의 바이러스 벡터, 동물 세포 발현 플라스미드(예, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등이 사용될 수 있다. 염색체에 혼입한다고 하는 점에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터가 바람직한 벡터이다.
발현 벡터는, 프로모터 외에, 소망에 따라 인핸서, 폴리A 부가 시그널, 선택 마커 유전자, SV40 복제 기점 등을 함유하고 있어도 된다. 유용한 선택 마커 유전자로서는, 예를 들어 디히드로엽산 환원효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 동시에 복수의 유전자를 도입하기 위해서, 유전자가 세로로 연결되어 폴리시스트론 벡터를 얻어도 된다. 폴리시스트론 발현을 가능하게 하기 위해서, 강제 발현시키는 복수의 유전자 사이에, 구제역 바이러스의 2A 자기 개열 펩티드(Science, 322, 949-953, 2008 등을 참조) 및 IRES(Internal ribosome entry site(내부 리보솜 진입 부위)) 서열 등을 라이게이션해도 된다.
본 발명에 있어서, 발현 벡터를 조혈 전구 세포에 도입하는 방법은, 바이러스 벡터의 경우, 해당 핵산을 포함하는 플라스미드를 적당한 패키징 세포(예, Plat-E 세포)나 보완 세포주(예, 293 세포)에 도입하고, 배양 상청 중에 산생된 바이러스를 회수하고 조혈 전구 세포와 접촉시켜서 감염시킴으로써 이룰 수 있다. 비바이러스 벡터의 경우, 리포펙션법, 리포솜법, 일렉트로포레이션법, 인산칼슘 공침전법, DEAE 덱스트란법, 미세 주입법, 유전자 총법 등을 사용해서 플라스미드 벡터를 세포에 도입할 수 있다.
본 발명에 따른 거핵구 전구 세포의 유도 방법의 일 형태로서, 조혈 전구 세포에 암 유전자, 혹은 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자를 강제 발현시킨 후에, 또한 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜도 된다. 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현도, 상술과 마찬가지로, 발현 벡터, 또는 이들 유전자가 코딩하는 단백질 또는 이들 유전자를 코딩하는 RNA를 조혈 전구 세포에 도입함으로써 이룰 수 있다. 아포토시스 억제 유전자를 후에 강제 발현시키는 경우, 특별히 한정하지 않지만, 암 유전자 및 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자를 적어도 14일간 이상 강제 발현한 후에 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현이 행해질 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서는, 아포토시스 억제 유전자를 조혈 전구 세포에 있어서 강제 발현시키는 것 대신에, 카스파제 저해제를 세포와 접촉시켜도 된다. 본 발명에 있어서, 카스파제 저해제는, 펩티드성 화합물, 비펩티드성 화합물, 혹은 생물 유래의 단백질 중 어느 것이어도 된다. 펩티드성 화합물로서는, 예를 들어 인공적으로 화학 합성된 하기 (1) 내지 (10)의 펩티드성 화합물을 들 수 있다.
(1) Z-Asp-CH2-DCB(분자량 454.26)
(2) Boc-Asp(OMe)-FMK(분자량 263.3)
(3) Boc-Asp(OBzl)-CMK(분자량 355.8)
(4) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-YVAD-CHO(분자량 1990.5)(서열 번호 1)
(5) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-DEVD-CHO(분자량 2000.4)(서열 번호 2)
(6) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEVD-CHO(분자량 1998.5)(서열 번호 3)
(7) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-IETD-CHO(분자량 2000.5)(서열 번호 4)
(8) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEHD-CHO(분자량 2036.5)(서열 번호 5)
(9) Z-DEVD-FMK(Z-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone)(서열 번호 6)
(10) Z-VAD FMK
예를 들어, 펩티드성 화합물의 카스파제 저해제로서, (1) VX-740-Vertex Pharmaceuticals(Leung-Toung et al., Curr. Med. Chem. 9, 979-1002(2002)), (2) HMR-3480-Aventis Pharma AG(Randle et al., Expert Opin. Investig. Drugs 10, 1207-1209(2001))를 들 수 있다.
비펩티드성 화합물의 카스파제 저해제로서는, (1) 아닐리노퀴나졸린(anilinoquinazolines(AQZs))-AstraZeneca Pharmaceuticals(Scott et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 304, 433-440(2003)), (2) M826-Merck Frosst(Han et al., J. Biol. Chem. 277, 30128-30136(2002)), (3) M867-Merck Frosst(Methot et al., J. Exp. Med. 199, 199-207(2004)), (4) 니코티닐 아스파틸 케톤즈(Nicotinyl aspartyl ketones)-Merck Frosst(Isabel et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 2137-2140(2003)) 등을 예시할 수 있다.
또한, 그 외의 비펩티드성 화합물의 카스파제 저해제로서, (1) IDN-6556-Idun Pharmaceuticals(Hoglen et al., J.Pharmacol. Exp. Ther. 309, 634-640(2004)), (2) MF-286 and MF-867-Merck Frosst(Los et al., Drug Discov. Today 8, 67-77(2003)), (3) IDN-5370-Idun Pharmaceuticals(Deckwerth et al., Drug Dev. Res. 52, 579-586(2001)), (4) IDN-1965-Idun Pharmaceuticals(Hoglen et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 811-818(2001)), (5) VX-799-Vertex Pharmaceuticals(Los et al., Drug Discov. Today 8, 67-77(2003)) 등을 들 수 있다. 이 외에, M-920 and M-791-Merck Frosst(Hotchkiss et al., Nat. Immunol. 1, 496-501(2000)) 등도 카스파제 저해제로서 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 카스파제 저해제는 Z-VAD FMK이다. 카스파제 저해제로서 Z-VAD FMK를 사용하는 경우, 그의 첨가는 조혈 전구 세포를 배양하는 배지에 대하여 행해진다. 배지 중에서의 Z-VAD FMK의 바람직한 농도는, 예를 들어 10μM 이상, 20μM 이상, 30μM 이상, 40μM 이상 및 50μM 이상을 들 수 있고, 바람직하게는 30μM 이상이다.
본 발명에 있어서 조혈 전구 세포로부터 거핵구 전구 세포를 유도하기 위해서 사용하는 배지는 특별히 한정되지 않지만, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 제조할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(이글 최소 필수 배지; EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(둘베코 변형 이글 배지; DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's(피셔) 배지, Neurobasal Medium(뉴로베이슬 배지)(라이프 테크놀로지스) 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지에는, 혈청이 함유되어 있어도 되고, 혹은 무혈청이어도 된다. 필요에 따라서, 배지는, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트란스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티올 글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, 비필수 아미노산, 비타민, 증식인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 사이토카인 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 사이토카인이란, 혈구계 분화를 촉진하는 단백질이며, 예를 들어 VEGF, TPO, SCF 등이 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 배지는, 혈청, 인슐린, 트란스페린, 세린, 티올 글리세롤, 아스코르브산, TPO를 포함하는 IMDM 배지이다. 보다 바람직하게는, SCF를 더 포함한다. 또한, 약제 응답성의 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 사용한 경우, 강제 발현하는 공정에 있어서는, 대응하는 약제, 예를 들어 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 배지에 함유시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 조혈 전구 세포로부터 거핵구 전구 세포를 유도하기 위한 온도 조건은 특별히 한정되지 않지만, 37℃ 이상의 온도에서 조혈 전구 세포를 배양함으로써, 거핵구 전구 세포로의 분화를 촉진하는 것이 확인되어 있다. 여기서, 37℃ 이상의 온도란, 세포에 손상을 주지 않을 정도의 온도가 적당한 점에서, 예를 들어 약 37℃ 내지 약 42℃ 정도, 약 37 내지 약 39℃ 정도가 바람직하다. 또한, 37℃ 이상의 온도에 있어서의 배양 기간에 대해서는, 당업자이면 거핵구 전구 세포의 수 등을 모니터하면서, 적절히 결정하는 것이 가능하다. 원하는 거핵구 전구 세포가 얻어지는 한, 일수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 적어도 6일간 이상, 12일 이상, 18일 이상, 24일 이상, 30일 이상, 42일 이상, 48일 이상, 54일 이상, 60일 이상이며, 바람직하게는 60일 이상이다. 배양 기간이 긴 것에 대해서는, 거핵구 전구 세포의 유도에 있어서는 문제가 되지 않는다. 또한, 배양 기간 중은, 적절히, 계대를 행하는 것이 바람직하다.
체세포의 초기화 방법
본 발명에 있어서, 체세포를 초기화하는 방법으로서, 체세포로 초기화 인자를 도입함으로써 행할 수 있다. 여기서, 초기화 인자란, 예를 들어 Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin(베타-카테닌), Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a 2, Tbx3 또는 Glis1 등의 유전자 또는 유전자 산물이 예시되고, 이들 초기화 인자는, 단독으로 사용해도 되고, 조합해서 사용해도 된다. 초기화 인자의 조합으로서는, WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al.(2008), Nat. Biotechnol., 26:795-797, Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 2:525-528, Eminli S, et al.(2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al.(2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al.(2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al.(2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917, Kim JB, et al.(2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al.(2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al.(2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al.(2010), Stem Cells. 28:713-720, Maekawa M, et al.(2011), Nature. 474:225-9.에 기재된 조합이 예시된다. 더 바람직한 초기화 인자는, Oct3/4, Sox2 및 Klf4를 포함하는 조합이다.
상기 초기화 인자에는, 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제[예를 들어, 발프로산(VPA), 트리코스타틴 A, 부티르산나트륨, MC 1293, M344 등의 저분자 저해제, HDAC에 대한 siRNA 및 shRNA(예, HDAC1 siRNA Smartpool(등록상표)(Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1(OriGene) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], MEK 저해제(예를 들어, PD184352, PD98059, U0126, SL327 및 PD0325901), Glycogen synthase kinase-3(글리코겐 신타제 키나아제-3) 저해제(예를 들어, Bio 및 CHIR99021), DNA 메틸 트랜스페라아제 저해제(예를 들어, 5-azacytidine(5-아자시티딘)), 히스톤 메틸 트랜스페라아제 저해제(예를 들어, BIX-01294 등의 저분자 저해제, Suv39hl, Suv39h2, SetDBl 및 G9a에 대한 siRNA 및 shRNA 등의 핵산성 발현 저해제 등), L-channel calcium agonist(L-채널 칼슘 작용제)(예를 들어 Bayk8644), 부티르산, TGFβ 저해제 또는 ALK5 저해제(예를 들어, LY364947, SB431542, 616453 및 A-83-01), p53 저해제(예를 들어 p53에 대한 siRNA 및 shRNA), ARID3A 저해제(예를 들어, ARID3A에 대한 siRNA 및 shRNA), miR-291-3p, miR-294, miR-295 및 miR-302 등의 miRNA, Wnt Signaling(시그널링)(예를 들어 soluble(가용성) Wnt3a), 신경 펩티드 Y, 프로스타글란딘류(예를 들어, 프로스타글란딘 E2 및 프로스타글란딘 J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLISl, PITX2, DMRTBl 등의 수립 효율을 높이는 것을 목적으로 해서 사용되는 인자도 포함되어 있고, 본 명세서에 있어서는, 이들 수립 효율의 개선 목적으로 사용된 인자에 대해서도 초기화 인자와 특별한 구별을 하지 않기로 한다.
초기화 인자는, 단백질 형태인 경우, 예를 들어 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드(예를 들어, HIV 유래의 TAT 및 폴리아르기닌)과의 융합, 미세 주입 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입해도 된다.
한편, DNA의 형태인 경우, 예를 들어 바이러스, 플라스미드, 인공 염색체 등의 벡터, 리포펙션, 리포솜, 미세 주입 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입할 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터(이상, Cell, 126, pp.663-676, 2006;Cell, 131, pp.861-872, 2007;Science, 318, pp.1917-1920, 2007), 아데노 바이러스 벡터(Science, 322, 945-949, 2008), 아데노 수반 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터(WO2010/008054) 등이 예시된다. 또한, 인공 염색체 벡터로서는, 예를 들어 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC, PAC) 등이 포함된다. 플라스미드로서는, 포유 동물 세포용 플라스미드를 사용할 수 있다(Science, 322:949-953, 2008). 벡터에는, 핵 초기화 물질이 발현 가능하도록, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 터미네이터, 폴리아데닐화 사이트 등의 제어 서열을 포함할 수 있고, 또한 필요에 따라서, 약제 내성 유전자(예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등), 티미딘 키나아제 유전자, 디프테리아 독소 유전자 등의 선택 마커 서열, 녹색 형광 단백질(GFP), β 글루쿠로니다아제(GUS), FLAG 등의 리포터 유전자 서열 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터에는, 체세포로의 도입 후, 초기화 인자를 코딩하는 유전자 혹은 프로모터와 그것에 결합하는 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 모두 절제하기 위해서, 그들 전후에 LoxP 서열을 가져도 된다.
초기화 인자가 RNA의 형태인 경우, 예를 들어 리포펙션, 미세 주입 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입해도 되고, 분해를 억제하기 위해서, 5-메틸시티딘 및 pseudouridine(슈도우리딘)(TriLink Biotechnologies)을 도입시킨 RNA를 사용해도 된다(Warren L, (2010)Cell Stem Cell.7:618-630).
초기화 후의 세포를 위한 배양액으로서는, 예를 들어 10 내지 15% FBS를 함유하는 DMEM, DMEM/F12 또는 DME 배양액(이들 배양액에는 또한, LIF, penicillin/streptomycin(페니실린/스트렙토마이신), puromycin(퓨로마이신), L-글루타민, 비필수 아미노산류, β-머캅토에탄올 등을 적절히 포함할 수 있다) 또는 시판되고 있는 배양액(예를 들어, 마우스 ES 세포 배양용 배양액(TX-WES 배양액, 트롬보 X사), 영장류 ES 세포 배양용 배양액(영장류 ES/iPS 세포용 배양액, 리프로셀사), 무혈청 배양지(mTeSR, Stemcell Technology사)) 등이 포함된다.
초기화 후의 세포의 배양법의 예로서는, 예를 들어 37℃, 5% CO2 존재 하에서, 10% FBS 함유 DMEM 또는 DMEM/F12 배양액 상에서 체세포와 초기화 인자를 접촉시켜 약 4 내지 7일간 배양하고, 그 후, 세포를 피더 세포(예를 들어, 마이토마이신 C 처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에 다시 뿌리고, 체세포와 초기화 인자의 접촉으로부터 약 10일 후부터 bFGF 함유 영장류 ES 세포 배양용 배양액에서 배양하고, 해당 접촉으로부터 약 30 내지 약 45일 또는 그 이상 후에 iPS-유사 콜로니를 발생시킬 수 있다.
혹은 37℃, 5% CO2 존재 하에서, 피더 세포(예를 들어, 마이토마이신 C 처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에서 10% FBS 함유 DMEM 배양액(여기에는 추가로, LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산류, β-머캅토에탄올 등을 적절히 포함할 수 있다)으로 배양하고, 약 25 내지 약 30일 또는 그 이상 후에 ES-유사 콜로니를 발생시킬 수 있다. 바람직하게는, 피더 세포 대신에, 초기화되는 체세포 그 자체를 사용하거나(Takahashi K, et al.(2009), PLoS One. 4:e8067 또는 WO2010/137746), 혹은 세포 외 기질(예를 들어, Laminin-5(라미닌-5)(WO2009/123349) 및 마트리겔(BD사))을 사용하는 방법이 예시된다.
그 외에도, 혈청을 함유하지 않는 배지를 사용해서 배양하는 방법도 예시된다(Sun N, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725, 2009 또는 Nakagawa M, et al, Sci Rep. 4:3594, 2014). 또한, 수립 효율을 높이기 위해서, 저산소 조건(0.1% 이상, 15% 이하의 산소 농도)에 의해 iPS 세포를 수립해도 된다(Yoshida Y, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5:237-241 또는 WO2010/013845).
상기 배양 동안에는, 배양 개시 2일째 이후부터 매일 1회 신선한 배양액으로 배양액 교환을 행한다. 또한, 초기화에 사용하는 체세포의 세포수는 한정되지 않지만, 배양 디쉬 10㎠당 약 5×103 내지 약 5×106 세포의 범위가 예시된다.
체세포의 초기화에 의해 얻어지는
줄기 세포
콜로니를
단리하는
공정
본 발명에서는, 상술한 바와 같이 체세포에 초기화 인자를 도입하고 배양함으로써, 줄기 세포 콜로니를 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 줄기 세포란, 분열해서 자신과 동일한 세포를 만드는 자기 복제능과, 별도 종류의 세포로 분화되는 능력을 가지며, 끝없이 증식할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 줄기 세포는, 콜로니를 형성하는 한 특별히 한정되지 않지만, 줄기 세포 중 태반을 제외한 조직 세포로 분화하는 능력을 갖는 다능성 줄기 세포이다.
본 발명에 있어서, 콜로니란, 단일 세포에서 유래하는 세포 덩어리를 의미한다.
본 발명의 클론화 방법에 있어서는, 얻어진 줄기 세포 콜로니를 단리하는 공정을 포함한다. 단리에 있어서는, 단일 콜로니를 적절히 채취하여, 다른 배양 접시로 옮김으로써 행할 수 있다.
거핵구 전구 세포 유도용
iPS
세포
본 발명에 있어서, 체세포가 거핵구 전구 세포인 경우, 상술한 바와 같이, 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성의 암 유전자 및 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자를 거핵구 전구 세포의 염색체 내에 포함하고 있어도 된다. 그 경우, 당해 거핵구 전구 세포를 상술한 방법에 의해 초기화함으로써 얻어지는 2차 iPS 세포는, 마찬가지로 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성의 암 유전자 및 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자를 그 염색체 내에 포함한다. 이때, 거핵구 전구 세포 유도용 iPS 세포에 있어서의 외래성의 암 유전자에 대한 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성의 암 유전자에 대한 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자의 함유율이, 2배 내지 7배인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3배 내지 5배이다. 마찬가지로, 거핵구 전구 세포에 있어서의 외래성의 암 유전자에 대한 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성의 암 유전자에 대한 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결된 외래성의 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자의 함유율이, 2배 내지 7배인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3배 내지 5배이다. 또한, 암 유전자 및 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자는, 상술한 유전자로서 적절히 선택된다.
줄기 세포로부터
2차 체세포로 유도하는 공정
본 발명의 클론화 방법에 있어서, 상기 방법에서 얻어진 줄기 세포를 2차 체세포로 유도하는 공정을 포함한다. 본 발명에 있어서, 2차 체세포란, 1차 체세포로부터 줄기 세포로 초기화된 후, 유도되어 얻어지는 체세포를 의미하며, 바람직하게는 1차 체세포와 2차 체세포는 동일한 체세포이다. 본 유도 공정에서는, 혼입된 유전자를 다시 발현시킴으로써 행할 수 있다. 유전자의 재발현은, 1차 체세포의 초기화에 의해 얻어진 줄기 세포로부터 2차 체세포까지의 어느 분화 단계의 세포를 대응하는 약제와 접촉시키는 것(대응하는 약제의 존재 하에서 유전자를 발현하는 프로모터인 경우), 또는 1차 체세포의 초기화에 의해 얻어진 줄기 세포로부터 2차 체세포까지의 어느 분화 단계의 세포와 대응하는 약제와의 접촉을 중지하는 것(대응하는 약제를 제거하면 유전자를 발현하는 프로모터인 경우)에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, rtetR 및 VP16AD의 융합 유전자(reverse tetR)를 사용하는 경우, 대응하는 약제를 투여함으로써 유전자를 다시 발현시킬 수 있다. 「1차 체세포의 초기화에 의해 얻어진 줄기 세포로부터 2차 체세포까지의 어느 분화 단계의 세포」란, 당해 줄기 세포가 2차 체세포로 분화할 때까지 거치는 모든 세포라 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 유전자를 재발현하기 전에, 당해 줄기 세포를 다른 세포로 유도해도 되고, 당해 유도 후의 세포로서, 섬유아세포, 조혈 전구 세포 등을 들 수 있다. 「다른 세포」로의 유도는 공지된 방법에 따라서 행할 수 있다. 체세포로서 거핵구 전구 세포를 사용하는 경우, 상술한 조혈 전구 세포로의 유도 방법이 예시된다. 즉, 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 유도하고, 상술한 조혈 전구 세포로부터 거핵구 전구 세포를 유도하기 위해서 사용하는 배지에 대응하는 약제를 투여함으로써, 암 유전자, p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자, 및/혹은 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현할 수 있다.
줄기 세포
또는 조혈 전구 세포를 선택하는 공정
본 발명에 있어서, 체세포로서 거핵구 전구 세포를 사용하는 경우, 반드시 모든 줄기 세포가 거핵구 전구 세포로 유도 가능하다고는 할 수 없는 점에서, 거핵구 전구 세포로 유도 가능한 줄기 세포를 적절히 선택하는 것이 바람직하고, 당해 방법으로서, 줄기 세포에 있어서, MEG3을 발현하는 줄기 세포를 선택하는 방법이 예시된다. 본 발명에 있어서, MEG3을 발현하는 줄기 세포 유래의 조혈 전구 세포를 선택해도 된다. 본 발명에 있어서, MEG3이란, 인간의 경우, 예를 들어 NCBI의 액세션 번호 NR_002766, NR_003530, NR_003531, NR_033358, NR_033359, NR_033360, NR_046464, NR_046465, NR_046466, NR_046467, NR_046468, NR_046469, NR_046470, NR_046471, NR_046472 또는 NR_046473으로 나타나는 핵산 서열로 이루어지는 비-코딩 RNA이다. 본 발명의 방법을 적용하는 줄기 세포는 특별히 한정되지 않지만, 1차 다능성 줄기 세포여도 되고, 보다 바람직하게는 상기 방법에서 얻어진 줄기 세포 클론이다. 발현이 높다는 것은, 동시에 측정한 복수의 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포에 있어서, 평균값보다 발현이 높은 것을 의미해도 되고, 또는 거핵구 전구 세포로 유도할 수 없는 기지의 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포에서의 발현과 비교해서 높은 것을 의미해도 된다.
본 발명에 있어서, MEG3의 발현을 확인하는 방법으로서, 당업자에게 주지의 방법을 사용해서 행할 수 있고, 예를 들어 역전사 효소 PCR 분석, 정량적인 역전사 효소 PCR 분석, 노던 블롯 분석, 면역 조직 화학, 어레이 분석 및 그들의 조합이 예시된다.
체세포의
HLA를
결손시키는
방법 및
HLA를
결손시킨
체세포를 제조하는 방법
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 다음 공정을 포함하는, 체세포의 HLA를 결손시키는 방법, 또는 HLA를 결손시킨 체세포를 제조하는 방법을 제공한다;
(i) 체세포에 초기화 인자를 도입하여, 다능성 줄기 세포를 형성시키는 공정,
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 다능성 줄기 세포에 있어서 HLA를 결손시키는 공정 및
(iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 HLA를 결손시킨 다능성 줄기 세포를 체세포로 유도하는 공정.
본 발명의 HLA를 결손시키는 방법에 제공되는 체세포, 사용하는 초기화 인자, 다능성 줄기 세포를 형성시키는 방법 및 다능성 줄기 세포를 체세포로 유도하는 방법은, 상술한 클론화에 제공되는 체세포와 동일하다. 따라서, 본 발명에서는, 체세포를 클론화하고, 또한 HLA를 결손시키는 방법도 제공한다.
본 발명에 있어서, HLA란, 인간 백혈구형 항원이며 α쇄 및 L쇄로 이루어지는 클래스 I 항원, DRB1 유전자가 코딩하는 β쇄와 DRA 유전자가 코딩하는 α쇄로 이루어지는 클래스 II 항원 및 클래스 III 항원을 의미한다. 체세포에 따라, 발현하는 HLA가 다른 점에서, 적절히 결손해야 할 HLA를 선택해서 행할 수 있고, 체세포로서 거핵구 전구 세포를 사용하는 경우, 클래스 I 항원을 HLA로서 선택해서 결손시키는 것이 바람직하다. HLA의 결손이란, α쇄, L쇄, β쇄의 어느 것을 결손 시켜도 되고, 클래스 I 항원을 결손시키는 경우, L쇄, 즉 β2-마이크로글로불린을 결손시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 다능성 줄기 세포에 있어서 염색체의 HLA를 결손시키는 방법은, 상동 재조합법 등 자체 공지의 방법을 적절히 선택해서 행할 수 있다.
혈소판의 제조 방법
본 발명의 혈소판 제조 방법은, 본 발명의 클론화 방법에서 거핵구 전구 세포를 클론화하는 공정과, 클론화된 거핵구 전구 세포를 거핵구 세포로 성숙시켜서, 혈소판을 방출시키는 공정을 포함한다. 거핵구 전구 세포를 성숙시켜서, 혈소판을 방출시키는 공정은, 공지의 방법 또는 그에 준하는 방법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들어, 거핵구 전구 세포가, MYC 패밀리 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 경우, 거핵구 세포의 성숙은, 상기 공정 (iii) 후, 대응하는 약제를 배지로부터 제거함으로써, MYC 패밀리 유전자, 폴리콤 유전자 및/또는 아포토시스 억제 유전자의 발현을 억제함으로써 행할 수 있다. 성숙한 거핵구 세포는 다핵화하여 혈소판을 방출한다.
혈소판은, ACD-A액, FFP, 시트르산나트륨, 시트르산, 포도당 등과 조합해서 혈소판 제제로 해도 되고, 적혈구 세포와 조합해서 혈액 제제로 해도 된다.
상술한 방법으로 HLA를 결손시킨 거핵구 세포의 클론을 얻은 경우, 이것을 성숙시켜서 혈소판을 방출시킴으로써, HLA를 결손시킨 혈소판을 얻을 수 있다. HLA를 결손시킨 혈소판은, 레시피언트의 HLA형에 관계없이 수혈에 사용할 수 있으므로 유용하다.
거핵구 전구 세포의 증식 능력을 개선하는 방법
본 발명은, 상술한 바와 같이, 거핵구 전구 세포를 초기화에 의해 줄기 세포를 제작하고, 추가로 거핵구 전구 세포로 변환함으로써, 당해 거핵구 전구 세포의 증식 능력을 개선하는 방법을 제공한다. 따라서, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 거핵구 전구 세포의 증식 능력을 개선하는 방법은 이하의 공정을 포함한다;
(i) 약제 응답성으로 발현하는 외래성의 유전자를 갖는 거핵구 전구 세포로 초기화 인자를 도입하여, 줄기 세포 콜로니를 형성시키는 공정,
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 줄기 세포 콜로니를 단리하는 공정 및
(iii) 상기 공정 (ii)에서 단리된 줄기 세포 콜로니에 포함되는 줄기 세포를 거핵구 전구 세포로 유도하는 공정이며, 당해 체세포에 대한 유도가, 대응하는 약제와 접촉시키는 공정을 포함하는 방법인, 공정.
본 발명에 있어서, 증식 능력을 개선한다는 것은, 염색체에 있어서의 텔로미어 서열이 길어진다는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 텔로미어 서열이란, TTAGGG의 반복 서열을 의미하며, 텔로미어 서열이 길어진다는 것은, 당해 반복수가 많아진다는 것을 의미한다.
실시예
이하, 실시예 및 시험예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
거핵구 전구 세포의 제조
3x105cells/dish로 MEF를 파종한 6㎝ dish에서 유지되고 있는 세미-콘플루언트(semi-confluent) 상태의 iPS 세포(SeV2: neonate human fibroblast(신생 인간 섬유모세포)에 WO2010/134526의 방법에 따라, 센다이 바이러스 벡터에 의해 c-MYC, OCT3/4, SOX2 및 KLF4를 도입함으로써 제작)로부터, iPS-sac를 통해서 조혈 전구 세포(HPC)의 유도를 행하였다. 상세하게는, iPS 세포를 인간 트립신 용액을 사용해서 유리시켜서, 1/50 내지 1/30 정도의 세포를, 콜로니의 덩어리로서, 마이토마이신 C(MMC) 처리한 C3H10T1/2(리켄에서 입수 가능) 상에 파종했다. 또한, MMC 처리한 C3H10T1/2는, iPS 세포를 파종하기 전날에 8x105 cells/dish로 10㎝ dish로 파종해서 준비했다. 파종 후, 20ng/ml VEGF를 첨가한 Eagel's Basal Medium(이글 기초 배지; EBM) 중에서 5% O2, 5% CO2, 37℃ 분위기 하에서 배양을 개시했다(제0일). 제3일 및 제6일에 있어서, 동일한 배지로 배지 교환을 행하였다.
제7일에 있어서, 20% O2, 5% CO2, 37℃의 분위기 하에서 배양을 계속했다. 제9일, 제11일 및 제13일에 있어서, 동일한 배지로 배지 교환을 행하였다. 제14일에 셀 스크레이퍼 또는 피펫 선단을 사용해서 물리적으로 세포를 박리하고, 40마이크로미터의 셀 스트레이너를 통해서 균일한 크기의 세포를 회수했다. 세포의 크기로부터, 당해 회수한 세포는, 조혈 전구 세포(HPC)인 것이 확인되었다.
제14일에 있어서, 회수된 HPC를 MMC 처리한 C3H10T1/2 상에 3x104 내지 1x105cells/well로 파종했다. 배지는 SCF 50ng/ml, TPO 50ng/ml, 독시사이클린 0.5μg/ml를 첨가한 EBM을 사용했다. 계속해서, 렌티 바이러스 벡터에 의해 c-MYC 및 BMI1을 HPC에 도입했다. 사용한 렌티 바이러스 벡터는 Tetracycline(테트라사이클린) 제어성의 inducible vector(유도성 벡터)이고, LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G의 mOKS 카세트를 c-MYC 또는 BMI1에 재조합함으로써 제작하였다(각각, LV-TRE-c-MYC-xL-Ubc-tTA-I2G 또는 LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G)(Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014). 감염에 사용한 바이러스 입자는, 293T 세포에 당해 렌티 바이러스 벡터를 감염시켜서 제작되었다(MOI 300). 감염 시에만 프로타민을 첨가했다. 이후, 1일 간격으로 배지 교환을 행하고, 주에 한번 또는 두번 C3H10T1/2 및 배지를 교환했다.
c-MYC 및 BMI1을 도입하고 나서 2주일 후에, 렌티 바이러스 벡터를 사용해서 BCL-xl을 MOI 10에 도입했다. BCL-xl의 도입에 사용한 렌티 바이러스 벡터는, Tetracycline 제어성의 inducible vector이고, 상술과 마찬가지로 mOKS 카세트를 BCL-xl에 재조합함으로써 제작되었다(LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G)(Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014). 감염 시에만 프로타민을 첨가했다. 이후, 10㎝ dish의 10T1/2 피더 상에서 SCF 50ng/ml, TPO 50ng/ml, 독시사이클린 0.5μg/ml를 첨가한 EBM 중에서 유지 배양하여, 거핵구 전구 세포주(imMKCL이라고도 한다)를 제작했다.
참고예 1
한계 희석법
거핵구 전구 세포(imMKCL)를 96-well plate(웰 플레이트) 상에 1.5cells/300uL/well의 밀도로 파종하고, 15% fetal bovine serum(소 태아 혈청; FBS), 50ng/mL human SCF(R&D systems), 50ng/mL TPO, 5㎎/mL doxycycline(독시사이클린)(Clontech), 2㎎/mL puromycin(Sigma-Aldrich)을 함유하는 Iscove's modified Dulbecco's medium(이스코브 변형 둘베코 배지; IMDM) 중, 37℃, 5% CO2 분위기 하에서, 10 내지 14일간 배양했다. 스케일업을 위해, 각 well(웰)을 각각 24-well plate 및 6-well plate로 옮기고, 마찬가지로 배양을 계속했다. 각 well 중의 세포를 거핵구 전구 세포 클론이라고 칭한다.
거핵구 전구 세포 클론의 해석(1회째)
상기 방법에서 얻어진 각 거핵구 전구 세포 클론을 PBS를 사용해서 두번 세정하고, 4x105/3mL로 6-well plate에 파종하고, 50ng/mL human SCF, 50ng/mL human TPO, 750 nM SR1(Calbiochem), 15% FBS를 함유하는 IMDM 중에서 배양했다. 7일 후, 배양 상청을 회수하고, 혈소판 산생수 및 혈소판 기능을 평가했다. 혈소판 산생수의 평가는 다음과 같이 행하였다. 즉, CD41(BioLegend), CD42a(eBioscience) 및 CD42b(BioLegend)에 대한 형광 색소 결합 항체 및 propidium iodide(요오드화프로피듐)(Sigma-Aldrich)을 배양 상청에 첨가하고, 30분간 인큐베이트 후에 FACSVerseO(BD Biosciences)을 사용해서 분석했다. 분석은, 크기로 거핵구 전구 세포를 배제한 후, CD41, CD42a 및 CD42b가 양성인 것을 지표로 해서 계수하고, 거핵구 전구 세포당의 혈소판수로서 산출했다. 혈소판 기능의 평가는 다음과 같이 행하였다. 즉, CD41, CD42b, 활성화된 glycoprotein(당단백질; GP) IIb/IIIa(PAC-1; BD Biosciences)에 대한 형광 색소 결합 항체 및 0.4 mM phorbol 12-myristate 13-acetate(포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트; PMA)(Sigma-Aldrich)를 배양 상청에 첨가하고, 30분간 인큐베이트 후에 FACSVerseO을 사용해서 분석했다. 분석은 활성화된 GP IIb/IIIa의 발현 레벨을 형광 강도(MFI)로 계측하고, 평가에 사용하였다.
상기 방법에 의해, 22개의 거핵구 전구 세포 클론에 대해서, 혈소판 산생량 및 혈소판 기능을 평가한바, 클론 1, 클론 4 및 클론 13에서, 1.6배 내지 1.9배 정도 대조(클론화 전의 거핵구 전구 세포)보다 혈소판 산생량이 높은 것이 확인되었다(도 1의 A). 혈소판 기능으로서는, 클론 13이 가장 그 활성이 높고, 대조와 비교해서 PMA 자극에 잘 반응하는 것으로 나타났다(도 1의 B).
거핵구 전구 세포 클론의 해석(2회째)
1회째의 해석 결과에 있어서 혈소판 산생량이 많고, 혈소판 기능이 높았던 5개의 클론(1, 2, 4, 11 및 13)에 대해서, 다시 마찬가지로 해석을 행하였다. 혈소판 산생량은, 클론 4만이, 대조에 대하여 1.3배 정도 많은 것이 확인되었다(도 2의 A). 또한, 혈소판 기능으로서는, 클론 13이, 대조에 대하여 3.7배 정도 많은 것이 확인되었지만, 클론 1, 2, 4 및 11에서는, 1회째의 해석 결과와는 달리, 대조에 대하여 변화가 없었다(도 2의 B).
거핵구 전구 세포 클론의 해석(3회째)
2회째의 해석 결과에 대해서, 다시 마찬가지로 해석을 행하였다. 혈소판 산생량은, 대조에 대하여 변화가 없었다(도 3의 A). 또한, 혈소판 기능으로서는, 클론 4 및 13이, 대조에 대하여 각각 1.7배 및 1.6배 정도 많은 것이 확인되었지만, 차이는 작아졌다(도 3의 B).
이상의 결과로부터, 한계 희석에 의해 얻어진 거핵구 전구 세포 클론은, 혈소판 산생능 및 산생된 혈소판에 있어서 안정된 기능을 나타내지 않는 것이 확인되었다. 따라서, 거핵구 전구 세포의 클론화에 있어서, 한계 희석법을 사용하는 것은 부적절하다고 시사되었다.
실시예 1
거핵구 전구 세포의 초기화에 의한
클론화
상술한 방법으로 얻어진 거핵구 전구 세포를 초기화에 의해 iPS 세포를 제작하고(2차 iPS 세포), 2차 iPS 세포로 클론화를 행하고, 다시 거핵구 전구 세포로 유도하여 클론화하였다(2차 거핵구 전구 세포)(도 4의 A). 상세하게는, 이하와 같다.
1x106cells의 초대 거핵구 전구 세포주에 Amaxa Nucleofector를 사용해서 4종류의 에피솜 벡터 플라스미드(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL 및 pCXWB-EBNA1;Okita K, et al., Stem Cells. 31:458-66, 2013 및 Okita K, et al., Nat Methods. 8:409-12, 2011)를 일렉트로포레이션에 의해 도입한 후, 피더 세포인 1-2x105 cells/6㎝ dish의 MEF 상에 3x105 cells로 파종했다. 14일 후, 얻어진 콜로니를 픽업하여, 확대 배양하고, 10개의 2차 iPS 세포 클론을 해석에 사용했다.
2차
iPS
세포 클론의 해석
상술한 방법으로 얻어진 10개의 2차 iPS 세포 클론으로부터 게놈 DNA를 추출하고, c-MYC 및 BMI1에 대하여 exon(엑손) 내에서 PCR 반응 가능한 primer(프라이머)를 사용하여, 정량 PCR을 행하였다. 그 결과, 내재성의 2카피 이외의 외래성의 c-MYC 및 BMI1의 삽입수를 검토한바, 10종의 2차 iPS 세포 클론의 외래성의 BMI1의 삽입수는 약 7 카피 내지 26 카피이고, 외래성의 c-MYC의 삽입수는 약 1 카피 내지 6 카피로 모두 달랐다(도 4의 B).
상술한 방법으로 얻어진 10개의 2차 iPS 세포 클론(상기와 일부 다른 클론을 사용했다)으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 전체 게놈 서열 해석을 행하고, 외래성의 c-MYC 및 BMI1의 삽입수를 검토한바, 이하의 표 1에 나타내는 비율로, 염색체에 삽입되어 있는 것이 확인되었다. 2차 iPS 세포 클론은, c-MYC의 삽입수에 대하여 BMI1의 삽입수를 약 3배 내지 5배 함유하고 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 거핵구 전구 세포의 제조 공정에 있어서 도입된 외래성의 유전자의 혼입수는, 거핵구 전구 세포마다 다르지만, 일정한 비율로 혼입된 경우에, 거핵구 전구 세포가 제조되는 것이 시사되었다.
2차 iPS
세포 클론으로부터의 2차 거핵구 전구 세포 클론의 유도
3개의 2차 iPS 세포 클론(#4, #11 및 #12)으로부터 상술한 방법으로 iPS-sac를 통해서 14일 후에 HPC 클론을 각각 얻었다. 얻어진 HPC 클론을 1x105 cells/well로 6-well에 파종하고, SCF 50ng/ml, TPO 50ng/ml, 독시사이클린 0.5μg/ml를 첨가한 EBM 중에서 27일간 배양하여, 2차 거핵구 전구 세포 클론을 얻었다. 얻어진 3개의 거핵구 전구 세포 클론을 해석한바, CD41a 및 CD41b 양성이고, CD235 음성인 균일한 세포군이 얻어졌다(도 5의 A 및 B)
HLA
결손(
HLA
-null) 2차
iPS
세포 클론의 제작
상술한 방법으로 얻어진 2차 iPS 세포 클론(#11)에, 도 6의 A에 나타낸 타깃 벡터를 도입하고, 상동 재조합에 의해 β2-Microglobulin(β2m)의 Exon1을 결실시켰다. 상동 재조합이 적절하게 행해지고 있는지에 대해서는, 야생형과 재조합형에 있어서 도 6의 A에 나타난 위치에 설계된 프라이머를 사용해서 PCR 산물을 확인함으로써 행해졌다(도 6의 B). 그 결과, 2개의 클론(Clone 3 및 4)에 있어서 β2m의 결손형 2차 iPS 세포 클론이 수립되었다.
계속해서, 상술한 방법에 의해, β2m의 결손형 2차 거핵구 전구 세포 클론을 유도했다. 또한, 상기 방법에 의해, 배양 상청으로부터 혈소판을 얻었다. β2m의 결손형 2차 거핵구 전구 세포 클론 및 혈소판에 있어서, β2m(BD Pharmingen) 및 HLA(BD Pharmingen)에 대한 항체를 사용하여, 유세포분석을 행한바, 어느 것에 있어서도 β2m 및 HLA가 결실되어 있는 것이 확인되었다(도 7의 A).
β2m의
결손형 2차 거핵구 전구 세포 클론의 혈소판 기능의 확인
야생형 2차 iPS 세포 클론(#11) 및 β2m의 결손형 2차 거핵구 전구 세포 클론의 배양 상청 중의 혈소판을 상술과 마찬가지로 PMA로 자극한 후, CD42a 항체, CD42b 항체 및 PAC1과 접촉시켜서, CD42a, CD42b 및 PAC1의 양성 레벨을 형광 강도(MFI)로 계측하고, 평가한바, 야생형과 β2m의 결손형에 있어서, 그 차이는 보이지 않았다(도 7의 B). 이상으로부터, β2m을 결손한 혈소판은, 야생형의 혈소판과 기능은 변함없는 것이 나타났다.
실시예 2
거핵구 전구 세포의 유도에 적합한
iPS
세포의
마커
탐색
상술한 방법으로 얻어진 imMKCL을 수립할 수 있었던 2종의 2차 iPS 세포(이하, Good-iPSC라고 한다) 및, 상술한 방법에서는, imMKCL을 수립할 수 없었던 2종의 iPS 세포(이하, Bad-iPSC라고 한다)로부터, mRNA를 추출하고, 제조자 매뉴얼에 따라, 일루미나 휴먼HT-12(Illumina HumanHT-12) v4.0 또는 아피메트릭스 진칩 휴먼 진(Affymetrix GeneChip Human Gene) 2.0 ST 어레이(Array)를 사용해서 마이크로 어레이를 행하고, 각 2종의 Good-iPSC 및 Bad-iPSC의 발현량을 평균화하여, 해석을 행했다(도 8의 A 및 B).
또한, Good-iPSC 및 Bad-iPSC로부터, 상술과 마찬가지 방법으로, 조혈 전구 세포(HPC)를 유도하고(이하, 각각, Good-HPC 및 Bad-HPC라고 한다), 마찬가지로 유도하고, Illumina HumanHT-12 v4.0 또는 Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST Array를 사용해서 마이크로 어레이를 행했다(도 8의 A 및 B).
이상 마이크로 어레이의 해석 결과, Good-iPSC 및 Good-HPC 모두, MEG3이 고발현되어 있는 것이 확인되었다. 따라서, 2차 iPS 세포 클론 또는 그것으로부터 유도된 HPC에 있어서, MEG3의 발현을 확인함으로써, 거핵구 전구 세포의 유도에 적합한 2차 iPS 세포 클론을 선택할 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 3
2차
iPS
세포 클론 유래 거핵구 전구 세포의 세포
증식능
본 발명에 따른 클론화의 효과를 검토하기 위해, 2차 iPS 세포 클론 유래 거핵구 전구 세포의 세포 증식능을 클론화 전의 거핵 전구 세포주와 비교했다. 본 실험에 있어서는, 2차 iPS 세포 클론으로서, 표 1의 2nd-iPS_11 유래의 것을 사용했다. 구체적으로는, 2nd-iPS_11로부터 상술한 방법으로 iPS-sac를 통해서 14일 후에 얻어진 HPC 클론을 1x105cells/well로 6-well에 파종하고, SCF 50ng/ml, TPO 50ng/ml, 독시사이클린 0.5μg/ml를 첨가한 EBM 중에서 27일간 배양함으로써, 2차 거핵구 전구 세포 클론을 얻었다(Clone 2). 비교예로서, 「거핵 전구 세포의 제조」의 항에서 제조한 클론화 전의 거핵 전구 세포(Parental)를 사용했다. 이들 세포를 1x105 cells/well로 6-well에 파종하고, SCF 50ng/ml, TPO 50ng/ml, 독시사이클린 0.5μg/ml를 첨가한 EBM 중에서 15일간 배양했다.
15일간의 배양 기간 중 정기적으로 세포를 카운트한 결과, 2차 iPS 세포 클론 유래의 거핵구 전구 세포는 클론화 전의 거핵 전구 세포보다 빠른 증식을 나타내는 것이 명백해졌다. 결과를 도 9의 A 및 B에 나타낸다.
2차
iPS
세포 클론 유래 거핵구 전구 세포의
성숙능
15일간 배양한 2차 거핵구 전구 세포 클론(Clone 2)을 추가로 거핵구 성숙 조건(EBM 중에 SCF 50ng/ml, TPO 50ng/ml를 첨가하고, 또한 SR-1(StemRegenin1)(Selleckchem사 제조) 750nM과 Y27632(wako사 제조) 10 microM을 첨가한 배양 조건)에서 배양했다. 거핵 전구 세포(Parental)도 2차 거핵구 전구 세포 클론과 마찬가지 배양 조건에서 거핵구로 성숙시켰다. 양 세포에 대해서 타임-랩스 이미징(time-lapse imaging)을 행하여 촬영한 화상을 도 10의 A에, 그리고 얻어진 화상을 ImageJ로 해석한 결과를 도 10의 B에 도시한다. 이들 결과로부터, 본 발명에 따라 클론화된 거핵구 쪽이 원래 클론의 세포로부터 유도된 거핵구보다 우수한 성숙능(세포 비대화)을 나타냈다.
2차
iPS
세포 클론 유래 거핵구 세포의 혈소판
산생능
계속해서, 얻어진 거핵구의 혈소판 산생능을 비교하기 위해서, 도 10의 A의 화상 중에서 혈소판을 형성한 세포의 수를 눈으로 계측하였다. 그 결과, 본 발명에 따라 클론화된 세포에서 유래하는 거핵구 쪽이 우수한 혈소판 산생능(proplatelet 형성수)을 나타내는 것이 명백해졌다(** p ＜0.01).
SEQUENCE LISTING
<110> KYOTO UNIVERSITY
Megakaryon Corporation
<120> Method for Preparing Stem Cell Clone Suitable for Inducing Differentiation into Somatic Cells
<130> 4793
<140> PCT/JP2016/062040
<141> 2016-04-14
<150> JP2015-082768
<151> 2015-04-14
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A synthesized caspase inhibitor peptide.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Acetaldehyde-modified aspartic acid.
<400> 1
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
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20
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<211> 20
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<222> (20)..(20)
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<220>
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<220>
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<223> Acetaldehyde-modified aspartic acid.
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<222> (1)..(1)
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<222> (20)..(20)
<223> Acetaldehyde-modified aspartic acid.
<400> 5
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20
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Benzyloxycarbonyl-modified aspartic acid.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Fluoromethylketone-modified aspartic acid.
<400> 6
Asp Glu Val Asp
1
Claims (10)
- 줄기 세포 클론을 제조하는 방법이며,
(i) 체세포로의 분화 유도에 관련된 외래성 유전자를 줄기 세포에 도입하는 공정,
(ii) 상기 외래성 유전자가 도입된 줄기 세포를 상기 체세포로 분화 유도하는 공정,
(iii) 분화 유도된 체세포를 탈분화하는 공정 및
(iv) 공정 (iii)에서 형성된 줄기 세포 콜로니로부터, 염색체에 상기 외래성 유전자가 혼입된 줄기 세포를 단리하는 공정
을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 단리된 줄기 세포 클론의 체세포로의 분화 유도 효율이, 클론화 전의 줄기 세포와 비교해서 높은, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 체세포가 조혈 전구 세포, 거핵 전구 세포, 적아구, 신경 세포, 신경 줄기 세포, 신경 능선 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 연골 세포, 간 세포 또는 멜라닌 세포인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 체세포가 거핵구 전구 세포이고, 상기 분화 유도에 관련된 외래성 유전자가, MYC 패밀리 유전자를 포함하는 암 유전자, Bmi1을 포함하는 p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자(폴리콤 유전자) 및 BCL-XL 유전자를 포함하는 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 외래성 유전자인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, MEG3을 발현하는 줄기 세포가 단리되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 유도에 관련된 외래성 유전자가 약제 응답성 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (iii)의 탈분화가 OCT3/4, SOX2 및 KLF4로 이루어지는 군에서 선택되는 초기화 인자의 도입에 의해 실시되는, 방법.
- 체세포를 제조하는 방법이며,
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 제조된 줄기 세포 클론을 체세포로 분화 유도하는 공정을 포함하는, 방법. - 혈소판을 제조하는 방법이며,
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 제조된 줄기 세포 클론을 거핵 전구 세포로 분화 유도하는 공정 및
분화 유도된 거핵구 전구 세포를 거핵구 세포로 성숙시켜서, 혈소판을 방출시키는 공정
을 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서, 제조되는 혈소판이 HLA를 결손하고 있는, 방법.
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| KR20140029488A (ko) * | 2011-05-13 | 2014-03-10 | 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠 | 다핵화 거핵구 세포, 및 혈소판의 제조방법 |
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| Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014 |
| Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013. |
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