KR20140029488A - 다핵화 거핵구 세포, 및 혈소판의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 거핵구 세포의 다핵화를 촉진하여, 보다 다핵화된 다핵화 거핵구 세포를 하는 방법, 또한 다핵화 거핵구 세포로부터 효율적으로 혈소판을 산생시키는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 다핵화 거핵구 세포를 제조하는 방법으로서, 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜, 상기 세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

다핵화 거핵구 세포, 및 혈소판의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING POLYPLOIDIZED MEGAKARYOCYTE AND PLATELETS}

본 발명은 다핵화 전의 거핵구 세포를 효율적으로 다핵화시키는 방법, 및 이러한 거핵구 세포로부터 혈소판을 제조하는 방법 등에 관한 것이다.

혈액 관련 질환의 치료나 외과적인 치료에는, 많은 혈액 세포가 필요해진다. 혈액 세포 중에서도, 혈액 응고 및 지혈을 위해 필수적인 세포인 혈소판은 특히 중요한 혈액 세포의 하나이다. 혈소판은, 백혈병, 골수 이식, 항암 치료 등에 있어서 수요가 많아, 안정 공급의 필요성이 높다. 지금까지 혈소판은, 도너로부터의 헌혈에 의해 채취하는 방법 외에, TPO형 유사 구조(미메틱스) 제제를 투여하는 방법, 제대혈 또는 골수 세포로부터 거핵구 세포를 분화시키는 방법 등에 의해 확보되어 왔다. 최근에는, ES 세포 또는 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포를 시험관내(in vitro)에 있어서 분화 유도하여, 혈소판 등의 혈액 세포를 조제하는 기술도 개발되어 있다.

발명자들은, 인간 ES 세포로부터 거핵구 세포 및 혈소판을 분화 유도하는 기술을 확립시켜, 혈소판의 소스로서의 ES 세포의 유효성을 나타내고 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 1). 또한 발명자들은, iPS 세포로부터의 거핵구 세포 및 혈소판의 조제법을 확립시켜, ES 세포 유래의 혈소판의 수혈에서는 회피 곤란했던, 백혈구 항원(human leukocyte antigen ; HLA) 적합성의 문제를 해결 가능하게 했다(특허문헌 2).

또한 발명자들은, 줄기 세포로부터 조제되는 혈소판 등의 양적인 문제에 대하여, 줄기 세포를 기초로 불사화한 거핵구 전구 세포주의 수립 방법을 발견함으로써 그 조제를 행하여, 시험관내에 있어서 혈소판 등을 대량으로 조제하기 위해 중요한 기술을 개발했다(특허문헌 3).

생체에 있어서, 거핵구는, proplatelets(혈소판 전구체)라고 불리는 위족 형상(pseudopodial formation)을 형성하고, 그 세포질을 단편화하여 혈소판을 방출한다. 거핵구는, 혈소판을 방출할 때까지, 핵내 분열(endomitosis)에 의해 다핵화되는 것으로 생각되고 있다. 거핵구의 핵내 분열은, 분열구 형성 및 방추체 신장을 수반하지 않는, 핵 분열 및 세포질 분열의 이상에 의한 다극성 유사 분열이고, 그 결과, 몇개로 분엽화된 핵을 포함하는 세포가 형성된다. 이러한 핵내 분열이 반복하여 생김으로써, 거핵구의 다핵화가 유도된다.

거핵구의 다핵화에 관해, 지금까지 많은 연구 결과가 보고되어 있다. Lodier 등은(비특허문헌 1), 거핵구의 핵내 분열에 있어서, 분열구는 형성되지만, 비근세포 미오신 II의 수축환에 대한 국재가 확인되지 않고, 수축환 형성 및 방추체 신장에 결함이 생긴 것을 밝혔다. 그리고, 이들 수축환이나 방추체 신장의 이상은, RhoA 및 Rock의 활성을 저해함으로써, 보다 현저해지는 것이 나타났다(비특허문헌 2). RhoA는 분열구에 축적되어, Rho 키나아제(Rock), 시트론 키나아제(citron kinase), LIM 키나아제(LIM kinase) 및 mDia/포르민(formins) 등을 포함하는 몇개의 이펙터 인자의 활성화를 촉진한다. 이들 결과로부터, RhoA 및 Rock 등 수축환 형성 등에 관여하는 인자의 활성을 저해함으로써, 거핵구의 핵내 분열이 촉진되는 것이 시사되어 있다. 또한, 인테그린(integrin) alpha2/beta1 하류에 위치하는 Rho의 시그널이 증강되면, 미숙한 다핵화되지 않은 거핵구의 proplatelet 형성이 저해된다는 보고도 있다.

전사 인자인 올 트랜스 레티노산(ATRA ; all trans retinoic acid), 히스톤 탈아세틸화 효소의 저해제로서 알려진 발프로산이 거핵구의 분화에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다. Schweinfurth 등은, 올 트랜스 레티노산 또는 발프로산으로 미성숙한 거핵구를 처리하면 다핵화가 촉진되는 것을 발견했다(비특허문헌 3). 또한, 암 억제 유전자 산물인 p53을 녹다운하면 거핵구의 다핵화를 촉진하는 것(비특허문헌 4)도 보고되어 있다.

그 밖에, 거핵구의 분화 과정에 대한 영향으로서, 미성숙한 거핵구를, 통상의 배양 온도보다 고온인 39℃에서 배양하면 다핵화된 성숙 거핵구의 유도 및 proplatelets의 형성을 촉진하는 것 등도 개시되어 있다(비특허문헌 5).

특허문헌 1 : WO2008/041370 특허문헌 2 : WO2009/122747 특허문헌 3 : WO2011/034073

비특허문헌 1 : Takayama 등, Blood, 111 : 5298-5306 2008 비특허문헌 2 : Lordier 등, Blood, 112 : 3164-3174 2009 비특허문헌 3 : Schweinfurth 등, Platelets, 21 : 648-657 2010 비특허문헌 4 : Fuhrken 등, J. Biol. Chem., 283 : 15589-15600 2008 비특허문헌 5 : Proulx 등, Biotechnol. Bioeng., 88 : 675-680 2004

본 발명자들은, 「다핵화」가 진행되지 않은 거핵구 세포로부터 얻어지는 기능적인 혈소판(지혈 작용 등 생체 내에서의 활성을 유지하고 있는 혈소판으로, CD42b+로서 특징지어짐)의 양이 임상 응용 전개를 실시하기 위해서는 매우 적은 것을 발견하고, 시험관내에 있어서 기능적인 혈소판을 효율적으로 산생시키기 위해서는, 거핵구 세포의 다핵화를 촉진할 필요가 있다고 생각했다.

그래서, 본 발명은, 거핵구 세포의 다핵화를 촉진하여, 보다 다핵화된 다핵화 거핵구 세포를 조제하는 방법, 또한 다핵화 거핵구 세포로부터 효율적으로 혈소판을 산생시키는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 감안하여, 본 발명자들은, 다능성 줄기 세포(ES 세포, iPS 세포 등)로부터 조제한 다핵화가 진행되지 않은 거핵구 세포의 다핵화를 촉진하는 것을 시도했다. 우선, 본 발명자들은, 이 시도를, 스스로 개발한 다능성 줄기 세포로부터 조제한 불사화 거핵구 전구 세포주(특허문헌 3 참조)를 이용하여 행했다. 이 불사화 거핵구 전구 세포주는, 다능성 줄기 세포로부터 유도한 거핵구의 전구 세포 내에서, MYC 등의 암 유전자 및 BMI1 등의 유전자를 발현시킴으로써, 증식능을 높이고, 주화(株化)(불사화)한 것이다.

발명자들은, 이 불사화 거핵구 전구 세포주를 이용하여 다핵화를 촉진하기 위해, 암 유전자 및 폴리콤 유전자의 발현 억제를 행할 때, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시킴으로써, 다핵화를 보다 효율적으로 진행시키는 것에 성공했다.

또한, 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현에 덧붙여, p53 유전자 산물의 발현 또는 기능을 저해함으로써, 다핵화의 효율이 한층 더 상승하는 것을 확인했다. 또한, 상기 거핵구 전구 세포주에 대하여, ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho 결합 키나아제) 저해제, HDAC 저해제, 39℃에서의 배양 등의 처리를 행하는 것도, 다핵화의 유도에 유효한 것을 확인하고, 또한, 악토미오신 복합체(악틴과 미오신의 복합체)의 기능 저해제로 처리하면, 다핵화가 보다 고도로 촉진되는 것을 발견했다.

그리고, 본 발명에 의해 산생되는 다핵화가 촉진된 거핵구 세포는, 4N, 혹은, 8N 이상의 거핵구 세포의 비율이 이미 알려진 것보다 높고, 또한, 생체 내에서 생성되는 성숙 거핵구 세포와 비교하더라도 그 비율이 매우 높은 것을 발견했다.

또한, 본 발명자들은, 충분히 다핵화된 성숙 거핵구 세포에 있어서, 상기 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현을 억제함으로써, 하나의 거핵구 세포로부터 산생되는 혈소판의 수가 비약적으로 증가하는 것을 발견함과 동시에, 배지에 ROCK 저해제를 첨가하여 배양하는 것 등에 의해, 혈소판 산생 효율을 더욱 높일 수 있는 것을 확인하고, 배양 기간, 배양 온도 등의 최적의 조건을 조사하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

[1] 다핵화 거핵구 세포를 제조하는 방법으로서, 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜, 상기 세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법;

[2] 상기 아포토시스 억제 유전자가 BCL-XL 유전자인, 상기 [1]에 기재된 방법;

[3] 상기 배양 공정에서, p53 유전자 산물의 발현 또는 기능을 저해하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법;

[4] 상기 배양 공정에서, 다핵화 전의 거핵구 세포에 대하여 이하의 (a)∼(c) 중 적어도 하나를 행하는, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 방법:

(a) 악토미오신 복합체 기능 저해제에 의한 처리;

(b) ROCK 저해제에 의한 처리; 및

(c) HDAC 저해제에 의한 처리 ;

[5] 상기 ROCK 저해제가 Y27632이고, 상기 HDAC 저해제가 발프로산이고, 상기 악토미오신 복합체 기능 저해제가 블레비스타틴인, 상기 [4]에 기재된 방법;

[6] 상기 배양 공정을 37℃보다 높은 온도에서 행하는, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법;

[7] 상기 다핵화 전의 거핵구 세포는,

조혈 전구 세포로부터 다핵화 전의 거핵구 세포에 이르는 분화 단계 중 어느 단계에서, 상기 세포에 있어서, 암 유전자와 이하의 (i)∼(iii) 중 어느 유전자를 강제 발현시키고, 상기 세포를 배양하여 증식시키는 공정에 의해 얻어진 것인, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법:

(i) p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자;

(ii) Ink4a/Arf 유전자의 발현을 억제하는 유전자; 및

(iii) 폴리콤 유전자;

[8] 상기 암 유전자로서 c-MYC 유전자를, 상기 (i)∼(iii)의 유전자로서 BMI1을 이용하는, 상기 [7]에 기재된 방법;

[9] 상기 조혈 전구 세포는, iPS 세포, ES 세포, 및, 제대혈, 골수혈 혹은 말초혈 유래의 조혈 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포에서 유래되는, 상기 [7] 또는 [8]에 기재된 방법;

[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 혈액 세포 조성물;

[11] 혈소판의 제조방법으로서,

상기 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 다핵화 거핵구 세포를 얻어, 이것을 배양하는 공정과,

상기 다핵화 거핵구 세포의 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정을 포함하는 방법;

[12] 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정은, 상기 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현을 억제하여, 또는, 상기 아포토시스 억제 유전자를 세포로부터 제거하여 행하는, 상기 [11]에 기재된 방법;

[13] 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정은, 혈청 없이, 및/또는 피더 세포 없이 행하는, 상기 [11] 또는 [12]에 기재된 방법;

[14] 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정을, 1일 내지 15일간 행하는, 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법;

[15] 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정은, 37℃에서 행하는, 상기 [11] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 방법;

[16] 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정에서, 배지에 ROCK 저해제 및/또는 악토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가하는, 상기 [11] 내지 [15] 중 어느 한 항에 기재된 방법;

[17] 상기 ROCK 저해제가 Y27632이고, 악토미오신 복합체 기능 저해제가 블레비스타틴인, 상기 [16]에 기재된 방법;

[18] 상기 [11] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 혈소판; 및

[19] 상기 [18]에 기재된 혈소판을 포함하는 혈액 제제에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 거핵구 세포의 다핵화를 인위적으로 촉진하는 것이 가능해진다. 특히, 본 발명은, 이미 알려진 시험관내에서 조제한 거핵구 세포의 다핵화의 촉진에도 효과적이고, 생체로부터 얻어지는 거핵구 세포와 비교하더라도, 보다 다핵화의 정도가 진행된 거핵구 세포(예컨대, 4N 이상의 거핵구 세포의 비율이 높은 거핵구 세포 집단)를 취득할 수 있게 한다.

또한, 본 발명에 의하면, 다핵화된 거핵구 세포 1개당 산생되는 혈소판의 수를 현저히 증가시키는 것이 가능해진다.

줄기 세포로부터 다핵화 전의 거핵구 세포를 유도하고, 예컨대 특허문헌 3에 기재된 방법으로 이 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시키고, 본 발명의 방법에 따라, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜 혈소판을 산생시킴으로써, 줄기 세포로부터 혈소판을 제조하는 데 필요로 하는 시간을 비약적으로 단축시켜, 대량 조제를 가능하게 한다. 또한, 얻어진 혈소판은, CD42b 양성이고, 임상 응용에도 크게 공헌한다.

도 1a는 iMKPC-typeI의 증식의 사이토카인 의존성을 조사하기 위해 행한 실험의 개요를 도시한다.
도 1b는 도 1a에 도시한 스케줄에 따라, SCF와 TPO(S+T), SCF와 EPO(S+E), SCF(S), TPO(T) 및 EPO(E)를 배지에 첨가하여 iMKPC-typeI을 배양했을 때의, 세포수의 변화를 도시한다.
도 1c는 도 1a에 도시한 스케줄의 8일째에, iMKPC-typeI의 표면 마커의 발현을 플로우 사이토미터로 해석한 결과를 도시한다.
도 1d는 제대혈 유래 CD34 양성 세포에서 c-MYC와 BMI1을 강제 발현시켜, 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식을 촉진시킨 결과를 도시한다.
도 2a는 iMKPC-typeII의 증식에 대한 사이토카인의 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 2b는 iMKPC-typeII에서의 CD41a와 CD42b의 발현을 조사한 결과를 도시한다.
도 3은 iMKPC-typeII에서 BCL-XL의 강제 발현과 p53 유전자의 발현 억제를 행했을 때의 다핵화와, 또한 블레비스타틴을 배지에 첨가한 경우의 다핵화를 현미경으로 관찰한 결과를 도시한다.
도 4는 iMKPC-typeII의 증식에 대한 BCL-XL의 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 5는 ROCK 저해제의 거핵구 세포의 다핵화에 대한 영향. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제한 후(독시사이클린 존재하, 에스트라디올 비존재하에서의 배양), ROCK 저해제(Y27632)(10 μM)를 첨가하고, 7일간 배양한 후, 다핵화의 정도를 조사했다. A는, ROCK 저해제를 첨가하지 않은 세포(vehicle)와 첨가한 세포(Rock i)를, 핵을 염색하는 훽스트로 염색 후, 거핵구 마커인 CD41a를 항(抗)CD41a 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석한 결과이다. B는, A의 결과를 그래프화한 것이다.
도 6은 39℃에서 배양에서의, 거핵구의 성숙에 관련되는 유전자의 발현량을 조사한 결과이다. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제한 후, 39℃에서 5일간 배양한 후, 거핵구의 성숙에 필수인 유전자군(GATA1(A), PF4(B), NFE2(C), β-튜불린(D))의 발현량을 정량 PCR(q-PCR)법에 의해 검토했다. 발현량은, GAPDH의 발현량에 대한 비율을 나타낸다.
도 7은 아포토시스 억제 유전자의 하나인 BCL-XL의 거핵구 세포의 다핵화에 대한 영향을 검토한 결과이다. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제하고, ROCK 저해제(10 μM) 존재하에, BCL-XL을 발현시켜, 7일간 배양한 후, 다핵화의 정도를 조사했다. A는, MYC/BMI1 발현 세포(좌측 도면), MYC/BMI1의 발현을 억제하고 ROCK 저해제 처리를 행한 세포(중앙 도면), MYC/BMI1의 발현 억제 및 ROCK 저해제 처리에 덧붙여, BCL-XL을 발현시킨 세포(우측 도면)를, 각각, 핵을 염색하는 훽스트로 염색 후, 거핵구 마커인 CD41a를 항CD41a 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석한 결과이다. B는, A의 결과를 그래프화한 것이다. 또한, C는, 핵이 2N, 4N, 8N 및 8N 이상으로 되어 있는 세포의 현미경 사진이다.
도 8은 BCL-XL 발현 세포의 증식 곡선이다. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제하고, ROCK 저해제(10 μM) 존재하에, BCL-XL을 발현시킨 세포(CD41a+)(■)와 발현시키지 않은 세포(CD41a+)(▲)의 세포수의 변화를 배양일수에 대하여 그래프화한 결과이다.
도 9는 p53 녹다운의 다핵화에 대한 영향. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제하고, ROCK 저해제(10 μM) 존재하에, BCL-XL을 발현시키고, 또한, p53 유전자를 녹다운한 후, 39℃에서 7일간 배양하여, CD41a+ 세포의 다핵화의 정도를 조사했다. A는, p53을 녹다운하지 않은 컨트롤 세포(컨트롤)와 p53을 녹다운한 세포(Si P53)를, 각각, 핵을 염색하는 훽스트로 염색 후, 거핵구 마커인 CD41a를 항CD41a 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석한 결과이다. B는, A의 결과를 그래프화한 것이다.
도 10은 발프로산 처리의 다핵화에 대한 영향. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제하고, ROCK 저해제 존재(10 μM)하에, BCL-XL을 발현시키고, p53 유전자를 녹다운하고, 또한, 발프로산(0.5 mM)으로 처리하여, 39℃에서 7일간 배양한 후, CD41a+ 세포의 다핵화의 정도를 조사했다. A는, 발프로산 처리하지 않은 세포(Si P53)와 발프로산 처리한 세포(Si P53 VLP)를, 각각, 핵을 염색하는 훽스트로 염색 후, 거핵구 마커인 CD41a를 항CD41a 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석한 결과이다. B는, A의 결과를 그래프화한 것이다.
도 11은 미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제(악토미오신 복합체 기능 저해제)의 거핵구 세포의 다핵화에 대한 영향. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제한 후(독시사이클린 존재하, 에스트라디올 비존재하에서의 배양), 미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제인 블레비스타틴(10 μg/ml)을 첨가하고, 7일간 배양한 후, 다핵화의 정도를 조사했다. A는, 블레비스타틴을 첨가하지 않은 세포(-)와 블레비스타틴(10 μg/ml)을 첨가한 세포(+)를, 핵을 염색하는 훽스트로 염색 후, 거핵구 마커인 CD41a를 항CD41a 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석한 결과이다. B는, A의 결과를 그래프화한 것이다.
도 12는 블레비스타틴 처리를 다른 처리와 병용한 경우의 거핵구 세포의 다핵화에 대한 영향. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제하고, Y27632(10 μM) 및 발프로산(0.5 mM) 존재하에, BCL-XL을 발현시키고, p53 유전자를 녹다운하고, 또한, 블레비스타틴(10 μg/ml)을 첨가하고, 39℃에서 7일간 배양한 후, CD41a+ 세포의 다핵화의 정도를 조사했다. A는, 블레비스타틴 처리를 행하지 않은 세포(-)와 블레비스타틴 처리를 행한 세포(+)를, 각각, 핵을 염색하는 훽스트로 염색 후, 거핵구 마커인 CD41a를 항CD41a 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석한 결과이다. B는, A의 결과를 그래프화한 것이다.
도 13은 블레비스타틴 처리를 다른 처리와 병용한 세포의 증식 곡선이다. 거핵구 세포 중의 MYC/BMI1의 발현을 억제하고, Y27632(10 μM) 및 발프로산(0.5 mM) 존재하에, BCL-XL을 발현시키고, p53 유전자를 녹다운하고, 블레비스타틴 처리를 한 세포(CD41a+)(▲)와 블레비스타틴 처리를 하지 않은 세포(CD41a+)(■)의 세포수의 변화를 배양일수에 대하여 그래프화했다(A). 또한, B에 이들 세포의 현미경 사진을 도시한다.
도 14는 혈소판 방출기에, BCL-XL의 발현을 억제한 경우와 억제하지 않은 경우에 있어서, 거핵구와 혈소판에서의 CD41a와 CD42b의 발현을 조사한 결과이다.
도 15는 도 14와 동일한 결과에 기초하여, BCL-XL 발현의 ON/OFF시에서의 세포수를 계측한 결과를 도시한다. A는, CD42b 양성 혈소판수, B는, CD41a 양성/CD42b 양성 거핵구 세포수, C는, CD41a 양성 거핵구 세포수를 나타낸다.
도 16은 혈소판 방출기에, BCL-XL의 발현을 억제한 경우와 억제하지 않은 경우에 있어서, 배양 온도를 35℃, 37℃, 39℃로 하여, 혈소판수에 대한 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 17은 혈청, 피더 세포, 블레비스타틴의 유무가, 혈소판수에 미치는 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 18은 혈청, 피더 세포, 블레비스타틴의 유무가, CD42b 혈소판의 비율에 미치는 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 19는 거핵구 세포의 다핵화 공정(MCB 증식)과 혈소판 방출기(혈소판 생산)의 적합한 배양 조건의 일례를 도시한다.
도 20은 BCL-XL의 발현 억제에 의해 CD42b 혈소판의 비율이 상승하고, 배지로부터 혈청 및 피더 세포를 제외하고, 블레비스타틴을 첨가함으로써 CD42b 혈소판의 비율이 더욱 상승한 것을 도시한다.
도 21은 말초혈 혈소판의 리스토세틴 응집 효과에, CD42b에 대한 기능적 저해 항체 HIP1이 미치는 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 22는 생체내(in vivo)의 혈전 형성에, CD42b에 대한 기능적 저해 항체 HIP1이 미치는 영향을 조사한 결과를 도시한다.
도 23은 ADAM17 저해제 KP-457(S-45457)을 첨가하여 산생시킴으로써 GPIba(CD42b)의 발현량을 높게 한 iPS 세포 유래 혈소판과, ADAM17 저해제를 첨가하지 않고 산생시킨 iPS 세포 유래 혈소판을, 각각 NOG 마우스에 수혈하여, 혈전 형성에 기여한 혈소판의 수를 측정한 결과를 도시한다.
도 24는 인간 말초혈 혈소판을 KP-457 존재하에서 혈소판 상해제 CCCP 100 μM을 첨가하여 의사 열화시킨 것, KP-457 비존재하에서 CCCP를 첨가한 것, 신선 혈소판을, 각각 수혈하여, 혈전 형성에 기여한 혈소판의 수를 측정한 결과를 도시한다.

(다핵화 거핵구 세포의 제조방법)

본 발명은, 거핵구 세포의 다핵화를 촉진함으로써, 다핵화된 거핵구 세포를 조제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다핵화 거핵구 세포의 제조방법의 한 양태는, 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜, 상기 세포를 배양하는 공정을 포함한다.

본 발명에서의 「다핵화 전의 거핵구 세포」는, 특별히 한정은 없고, 제대혈이나 골수 세포로부터 얻어지는 다핵화가 진행되지 않은 거핵구 세포여도 좋고, 또한, ES 세포, iPS 세포, 제대혈·골수혈·말초혈 유래의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 등으로부터 분화 유도된 다핵화가 진행되지 않은 거핵구 세포여도 좋다.

또한, 본 발명에서의 「다핵화 전의 거핵구 세포」에는, 예컨대, CD41a 양성/CD42a 양성/CD42b 양성으로서 특징지어지는 세포도 포함된다.

「다핵화 거핵구 세포」 또는 「다핵화된 거핵구 세포」란, 「다핵화 전의 거핵구 세포」와 비교하여 핵의 수가 상대적으로 증대된 세포 또는 세포군을 말한다. 예컨대, 본 발명의 방법을 적용하는 거핵구 세포의 핵이 2N인 경우에는, 4N 이상의 세포가 「다핵화 거핵구 세포」 혹은 「다핵화된 거핵구 세포」가 된다. 다핵화 전의 거핵구 세포라도, 핵의 수가 1개라고는 할 수 없다. 또한, 세포군에 있어서, 일정 기간 경과 후에 그 세포군에 전체에서의 핵의 수가 유의적으로 증가한 경우, 상기 기간 경과 전의 세포군을 다핵화 전의 거핵구 세포라고 하고, 기간 경과 후의 세포군을 다핵화된 거핵구 세포라고 하는 경우도 있다.

본 발명은, 다능성 줄기 세포(ES 세포나 iPS 세포 등), 제대혈·골수혈·말초혈 유래의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 등으로부터 분화 유도된 다핵화 전의 거핵구 세포에 대해서도 적용할 수 있다. 예컨대, ES 세포 또는 iPS 세포로부터 조제되는 네트형 구조물(ES-sac 또는 iPS-sac라고도 칭함)로부터 얻어지는 거핵구 세포가 바람직하다. 여기서, ES 세포 또는 iPS 세포로부터 조제되는 「네트형 구조물」이란, ES 세포 또는 iPS 세포 유래의 입체적인 주머니형(내부에 공간을 수반하는 것) 구조체로, 내피 세포 집단 등으로 형성되고, 내부에 조혈 전구 세포를 포함하는 것을 말한다(특허문헌 1, 특허문헌 2 및 비특허문헌 2를 참조할 것).

본 발명에서 사용되는 ES 세포는, 특별히 한정되지 않고, 일반적으로는, 배반포기의 수정란을 피더 세포와 함께 배양하여, 증식한 내부 세포 덩어리 유래의 세포를 따로따로 흩어지게 하고, 또한, 계대 배양하는 조작을 반복하여, 최종적으로 ES 세포주로서 수립된 것을 사용할 수 있다.

또한, iPS 세포를 사용하는 경우, 체세포(예컨대, 선유아세포나 혈액 세포 등)에 분화 다능성을 부여하는 여러 종류의 전사 인자(이하, 여기서는 「분화 다능성 인자」라고 칭함) 유전자를 도입함으로써, ES 세포와 마찬가지의 분화 다능성을 획득한 세포이면, 어떠한 유래의 세포여도 좋다. 분화 다능성 인자로는, 이미 많은 인자가 보고되어 있고, 한정은 되지 않지만, 예컨대, Oct 패밀리(예컨대, Oct3/4), SOX 패밀리(예컨대, SOX2, SOX1, SOX3, SOX15 및 SOX17 등), Klf 패밀리(예컨대, Klf4, Klf2 등), MYC 패밀리(예컨대, c-MYC, N-MYC, L-MYC 등), NANOG, LIN28 등을 들 수 있다.

본 발명자들은, 다능성 줄기 세포로부터 유도한 다핵화 전의 거핵구 세포(특허문헌 3 중에서 「거핵 전구 세포」라고 기재하고 있는 것을 포함함) 중에서 MYC 등의 암 유전자와 BMI1 등의 유전자 등을 강제 발현시켜, 상기 거핵구 세포의 증식능을 높이는 것에 관해 보고하고 있다(특허문헌 3, JEM, 207 : 2817-2830 2010).

이 방법에 의해 조제된 다핵화 전의 거핵구 세포는, 본 발명의 방법에 적합하게 이용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 다핵화 거핵구 세포의 제조방법에서는, 다핵화 전의 거핵구 세포로서, 조혈 전구 세포로부터 다핵화 전의 거핵구 세포에 이르는 분화 단계 중 어느 단계에서, 상기 세포에 있어서, 암 유전자와 이하의 (i)∼(iii) 중 어느 유전자를 강제 발현시키고, 상기 세포를 배양하여 증식시키는 공정에 의해 얻어진 것을 이용할 수 있다.

(i) p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자 ;

(ii) Ink4a/Arf 유전자의 발현을 억제하는 유전자 ; 및

(iii) 폴리콤 유전자.

암 유전자로는, 예컨대, MYC 패밀리 유전자, Src 패밀리 유전자, Ras 패밀리 유전자, Raf 패밀리 유전자, c-Kit나 PDGFR, Abl 등의 프로테인 키나아제 패밀리 유전자 등을 들 수 있다. 또한, (i)∼(iii)의 유전자로는, 예컨대, BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC, Dnmt1/3a/3b 등을 들 수 있지만, BMI1 유전자가 특히 바람직하다. 암 유전자 및 폴리콤 유전자의 발현 제어는, 당업자가 통상법에 따라 행할 수 있고, 예컨대 특허문헌 3 등에 상세하게 기재된 방법을 이용할 수 있다. 암 유전자 및 (i)∼(iii)의 유전자는, 조혈 전구 세포로부터 다핵화 전의 거핵구 세포로 분화되는 어느 단계에서, 세포에 도입하면 된다. 어떻게 하든, 본 발명에서 사용되는 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서 이들 유전자의 발현이 유도되면 된다.

본 발명에서 이용되는 암 유전자 및 (i)∼(iii)의 유전자(예컨대, BMI1 유전자)에는, 이미 그 cDNA 서열이 공개되어 있는 유전자는 물론이고, 이들 공지된 cDNA 서열의 상동성에 기초하여 종래 기술에 의해 동정되는 호몰로그도 포함된다.

예컨대, MYC 패밀리 유전자 중, c-MYC 유전자란, 예컨대, 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열로 이루어지는 유전자이다. 또한, c-MYC 유전자의 호몰로그란, 그 cDNA 서열이, 예컨대, 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 유전자를 말한다. 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 cDNA란, 서열번호 1로 표시되는 서열로 이루어지는 DNA와, 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 약 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 DNA, 혹은, 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA로서, 이들 DNA에 의해 코드되는 단백질이, 다핵화 전의 거핵구 세포 등, 분화 단계의 세포의 증폭에 기여하는 것을 말한다.

BMI1 유전자란, 예컨대, 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열로 이루어지는 유전자이다. 또한, BMI1 유전자의 호몰로그란, 그 cDNA 서열이, 예컨대, 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 유전자를 말한다. 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 cDNA란, 서열번호 2로 표시되는 서열로 이루어지는 DNA와, 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 약 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 DNA, 혹은, 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA로서, 그 DNA에 의해 코드되는 단백질이, MYC 패밀리 유전자 등의 암 유전자가 발현되어 있는 세포 내에서 생기는 암 유전자 유도성 세포 노화를 억제하고, 상기 세포의 증폭을 촉진하는 것을 말한다.

상기 암 유전자 및 (i)∼(iii)의 유전자는, 세포 증식에는 필요하지만, 다핵화의 촉진이나 혈소판 방출 등을 저해할 수 있기 때문에, 다핵화 공정에 들어가기 전에 이들 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 세포 내의 이들 유전자 발현을 억제함으로써, 기능적인 혈소판이 보다 방출되기 쉬워진다(특허문헌 3).

본 명세서에 있어서 「아포토시스 억제 유전자」란, 아포토시스를 억제하는 유전자이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, BCL2 유전자, BCL-XL 유전자, 서바이빈(Survivin), MCL1 등을 들 수 있다.

본 발명자들은, 상기 암 유전자 및 (i)∼(iii)의 유전자의 강제 발현을 억제하면, 증식시킨 다핵화 전의 거핵구 세포의 세포사가 유도될 수 있는 것을 발견했다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 다핵화 전의 거핵구 세포 중의 암 유전자와 (i)∼(iii)의 유전자의 발현 억제를 행함과 동시에, 아포토시스 억제 유전자를 상기 세포 중에서 강제 발현시킴으로써, 상기 거핵구 세포의 다핵화가 촉진되고, 그 결과 다핵화 전의 거핵구 세포로부터 혈소판을 효율적으로 산생시킬 수 있다.

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시킴으로써, 거핵구 세포는 장기적으로 증식을 계속한다.

본 발명에서 이용되는 BCL-XL 유전자, BCL2 유전자 등의 아포토시스를 억제하는 유전자에는, 이미 그 cDNA 서열이 공개되어 있는 유전자는 물론이고, 이들 공지된 cDNA 서열의 상동성에 기초하여 종래 기술에 의해 동정되는 호몰로그도 포함된다. 예컨대, 아포토시스를 억제하는 유전자의 하나인 BCL-XL 유전자란, 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열로 이루어지는 유전자이다. 또한, BCL-XL 유전자의 호몰로그란, 그 cDNA 서열이, 예컨대, 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 유전자를 말한다. 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열과 실질적으로 동일한 서열로 이루어지는 cDNA란, 서열번호 3으로 표시되는 서열로 이루어지는 DNA와, 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 약 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 DNA, 혹은, 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA로서, 그 DNA에 의해 코드되는 단백질이, 아포토시스를 억제하는 효과를 갖는 것을 말한다.

여기서, 스트린젠트한 조건이란, 당업자에 의해 용이하게 결정되는 하이브리다이제이션의 조건을 말하며, 일반적으로 프로브 길이, 세정 온도, 및 염 농도에 의존하는 경험적인 실험 조건이다. 일반적으로, 프로브가 길어지면 적절한 어닐링을 위한 온도가 높아지고, 프로브가 짧아지면 온도는 낮아진다. 하이브리드 형성은, 일반적으로, 상보적 쇄가 그 융점보다 약간 낮은 환경에서의 재(再)어닐 능력에 의존한다.

예컨대, 저(低)스트린젠트한 조건으로서, 하이브리다이제이션 후의 필터의 세정 단계에서, 37℃∼42℃의 온도 조건하, 0.1×SSC, 0.1% SDS 용액 중에서 세정하는 것 등을 들 수 있다. 또한, 고(高)스트린젠트한 조건으로서, 예컨대, 세정 단계에서, 65℃, 5×SSC 및 0.1% SDS 중에서 세정하는 것 등을 들 수 있다. 스트린젠트한 조건을 보다 높게 함으로써, 상동성이 높은 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다.

암 유전자, (i)∼(iii)의 유전자, 아포토시스 억제 유전자 등의 유전자를 세포 내에서 강제 발현시키는 경우, 당업자에게 주지된 어떠한 방법에 의해 실시해도 좋지만, 예컨대, 유전자를, 렌티바이러스나 레트로바이러스 등에 의한 유전자 도입 시스템을 이용하여, 세포 내에 도입하고, 발현시켜도 좋다. 바이러스 유전자 도입 벡터에 의해 유전자 발현을 행하는 경우, 적당한 프로모터의 하류에 상기 유전자를 작용 가능하게 연결하고, 이것을 유전자 도입 벡터에 삽입하고, 세포 내에 도입하여 목적 유전자를 발현시켜도 좋다. 여기서, 「작용 가능」하게 연결한다란, 상기 프로모터에 의해 목적 유전자가 시스에 지배되고, 목적 유전자의 원하는 발현이 실현되도록 프로모터와 목적 유전자를 연결하는 것을 의미한다. 본 발명의 실시에 있어서는, 예컨대, CMV 프로모터, EF1 프로모터 등을 사용하여 항상적으로 목적 유전자를 발현시켜도 좋고, 혹은, 테트라사이클린 등의 약제 응답 엘리먼트 등의 트랜스 인자에 의해 활성 제어되는 엘리먼트의 지배하에, 적당한 프로모터(유도형의 프로모터)를 배치하고, 예컨대, 약제 첨가 등의 제어에 의해 목적 유전자를 유도적으로 발현시킬 수도 있다. 이러한 약제에 의한 유전자 발현 시스템은, 암 유전자 또는 (i)∼(iii)의 유전자의 원하는 발현 제어를 실현하기 위해, 당업자가 적당한 시스템을 용이하게 선택할 수 있다. 이러한 발현을 행하기 위해, 시판되는 키트 등을 사용해도 좋다. 또한, 발현 제어의 목적 유전자인 암 유전자와 (i)∼(iii)의 유전자는, 각각 별개의 벡터에 삽입해도 좋고, 동일한 벡터에 삽입해도 좋다.

또한, 거핵구 세포 내에서의 암 유전자나 (i)∼(iii)의 유전자의 발현의 억제는, 예컨대, 상술한 유도적인 발현 시스템에 의한 발현의 유도를, 약제 등의 제거에 의해 해제함으로써 달성해도 좋다. 혹은, 도입한 암 유전자나 (i)∼(iii)의 유전자를 Cre/lox 시스템 등을 사용하여 제거하고, 이들 유전자의 발현을 억제적으로 제어해도 좋다. 암 유전자 또는 (i)∼(iii)의 유전자의 발현을 억제적으로 조절하기 위해, 시판되는 키트 등을 적절히 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 다핵화 거핵구 세포의 제조방법의 한 양태는, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시킨 세포에 있어서, 병행하여 p53 유전자 산물의 발현 또는 기능을 저해하는 공정을 포함한다. 여기서 발현이란, 전사 및 번역을 포함하는 개념으로 사용되고, 발현을 저해한다고 하는 경우, 전사 레벨로 저해하는 것도 번역 레벨로 저해하는 것도 포함할 수 있다.

p53 유전자 산물은, 암 억제 유전자로서 널리 알려져 있는 것으로, 여러가지 동물종에서의 유전자 서열 등도 공지되어 있다.

거핵구 세포 내의 p53 유전자 산물의 기능을 저해하는 방법은, 상기 기술 분야에서의 통상의 기술에 의해 달성할 수 있다. 그 방법으로서, 예컨대, p53 유전자에 돌연 변이(치환, 삽입 또는 결실, 혹은, 개변 또는 수식)를 도입함으로써 상기 유전자 산물의 생산을 저해하는 방법, 상기 유전자 산물의 기능을 직접 저해하는 방법 등을 들 수 있다. 유전자에 돌연 변이(치환, 삽입 또는 결실, 혹은, 개변 또는 수식)를 도입하는 방법으로는, 적절한 유전자 타겟팅 벡터를 이용하여 p53 유전자 전체를 상동 재조합에 의해 파괴하는 방법, Cre/lox 시스템 등을 이용하여, 상기 유전자 산물의 활성에 중요한 영역에 변이를 도입하는 방법을 들 수 있다.

또한, p53 유전자 산물의 기능을 저해하는 방법으로서, 도미넌트 네거티브법을 이용해도 좋다. 도미넌트 네거티브법은, 변이를 도입하여 활성을 저하 또는 상실시킨 p53 단백질을 세포 내에서 대량으로 발현시켜, 세포 내의 정상 p53 단백질에 대한 불활성인 p53 단백질의 비율을 압도적으로 높게 하여, 결과적으로 p53 단백질의 기능이 얻어지지 않게 된 거동을 나타내는 세포를 얻는 방법이다.

p53 유전자 산물의 발현을 억제하는 방법으로는, 안티센스법, 리보자임법, RNAi법 등을 이용해도 좋다.

안티센스법은, 표적 유전자(기본적으로는 전사 산물인 mRNA)에 상보적인 염기 서열을 갖고, 일반적으로는 10 염기 길이∼100 염기 길이, 바람직하게는 15 염기 길이∼30 염기 길이의 일본쇄 핵산을 이용하여 유전자의 발현을 억제하는 방법이다. 안티센스 핵산을 세포 내에 도입하여, 표적 유전자에 하이브리다이즈시킴으로써 유전자의 발현이 저해된다. 안티센스 핵산은, 표적 유전자의 발현 저해 효과가 얻어지는 한, 표적 유전자와 완전히 상보적이지 않아도 좋다. 안티센스 핵산은, 공지된 소프트웨어 등을 이용하여 당업자가 적절히 설계할 수 있다. 안티센스 핵산은, DNA, RNA, DNA-RNA 키메라의 어느 것이어도 좋고, 또한 수식되어 있어도 좋다.

리보자임은, 표적 RNA를 촉매적으로 가수 분해하는 핵산 분자이고, 표적 RNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 영역과, 절단 반응을 담당하는 촉매 중심 영역으로 구성되어 있다. 리보자임은 당업자가 공지된 방법에 따라 적절히 설계할 수 있다. 리보자임은 일반적으로는 RNA 분자이지만, DNA-RNA 키메라형 분자를 이용할 수도 있다.

RNAi법은, 이본쇄 핵산에 의해 유도되는 서열 특이적인 유전자 발현 억제 기구이다. 표적 특이성이 매우 높고, 생체 내에 원래 존재하는 유전자 발현 억제 메카니즘을 이용하는 방법이기 때문에 안전성이 높다.

RNAi 효과를 갖는 이본쇄 핵산으로는, 예컨대, siRNA를 들 수 있다. siRNA는, 포유 동물 세포에 이용되는 경우, 통상 19∼30 염기 정도, 바람직하게는 21 염기∼25 염기 정도의 이본쇄 RNA이다. RNAi 효과를 갖는 이본쇄 핵산은, 일반적으로, 그 한쪽이 표적 핵산의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖고, 다른 쪽이 이것에 상보적인 서열을 갖는다.

RNAi 효과를 갖는 이본쇄 핵산은, 표적 유전자의 염기 서열에 기초하여, 공지된 방법에 따라 설계할 수 있다. 또한, RNAi 효과를 갖는 이본쇄 핵산은, 이본쇄 RNA여도 좋고, DNA-RNA 키메라형 이본쇄 핵산이어도 좋고, 인공 핵산이나 각종 수식이 실시된 핵산이어도 좋다.

siRNA, 안티센스 핵산, 리보자임은, 각각을 코드하는 핵산을 포함하는 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 세포 내에 도입함으로써, 세포 내에서 발현시킬 수 있다. siRNA는, 이본쇄의 각각을 코드하는 DNA를 이용해도 좋고, 이본쇄 핵산이 루프를 통해 연결되어 생기는 일본쇄 핵산을 코드하는 DNA를 이용해도 좋다. 후자의 경우, 세포 내에서 전사에 의해 얻어지는 일본쇄 RNA는, 그 상보적인 부분이 분자 내에서 하이브리다이즈하여, 헤어핀형의 구조를 취한다. 이 RNA는 shRNA(short hairpin RNA)라고 불린다. shRNA는 세포질에 이행하면 효소(Dicer)에 의해 루프 부분이 절단되고, 이본쇄 RNA가 되어 RNAi 효과를 발휘한다.

그 밖에, 거핵구 세포 내의 p53 유전자 산물의 기능을 저해하는 방법으로서, p53 유전자 산물의 기능을 직접 또는 간접적으로 저해하는 방법, p53의 인산화를 저해함으로써 간접적으로 p53의 활성화를 저해하는 방법 등이어도 좋다.

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현과, p53 유전자 산물의 발현 또는 기능의 저해를 행하기 전의 거핵구 세포는, 증식을 계속하지만, 사이토카인 의존성이 SCF이고, 방출되는 혈소판도 CD42b 양성이 아닌 것을 포함한다. 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현과, p53 유전자 산물의 발현 또는 기능의 저해를 행하면, 거핵구 세포는, 그 후에도 증식하면서 일부 다핵화되고, CD42b 양성의 혈소판을 많이 방출하게 된다. 이 단계에서는, 거핵구 세포의 사이토카인 의존성이 SCF로부터 TPO로 변하고, 증식과 성숙화가 병행하여 진행된다.

본 발명에 따른 다핵화 거핵구 세포의 제조방법의 한 양태는, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 배양하고 있는 세포를, (a) 악토미오신 복합체 기능 저해제로 처리하는 공정, (b) ROCK 저해제로 처리하는 공정, (c) HDAC 저해제로 처리하는 공정 중 적어도 하나를 포함한다. 이들 처리에 의해, 보다 안정된 증식과 다핵화가 진행된다.

여기서, 악토미오신 복합체란, 악틴과 미오신 II의 복합체를 말하며, 예컨대, 세포질 분열시에 출현하는 수축환 등을 구성하고 있다. 악토미오신 복합체에 있어서, 미오신 II는, 악틴과 상호 작용을 하면서, 모터 단백질로서 기능하고, 수축환의 수축 운동 등에 관여하고 있다. 본 발명의 「악토미오신 복합체 기능 저해제」는, 어떠한 메카니즘으로 그 기능을 저해하는 것이어도 좋고, 예컨대, 악토미오신 복합체의 형성을 저해함으로써 악토미오신 복합체의 기능을 저해하는 것, 미오신 중쇄(Myosin heavy chain: MHC) IIA/B ATPase 저해에 수반하여 악토미오신 복합체의 기능을 저해하는 것, 미오신 경쇄 키나아제 저해제(Myosin light chain kinase: MLCK) 저해에 수반하여 악토미오신 복합체의 기능을 저해하는 것 등이 포함된다. 미오신 중쇄 IIA/B ATPase는, 세포질 분열시에, 수축환의 수축 운동에 있어서 중요한 역할을 담당하는 분자이고, 미오신 경쇄 키나아제는, 미오신 경쇄 중 L2를 인산화하고, 악틴-미오신 사이의 미끄럼 운동을 유도한다.

지금까지, ROCK 저해제가 거핵구 세포의 핵내 분열을 억제하여, 다핵화를 촉진하는 것은 보고되어 있지만, 악토미오신 복합체의 형성 또는 기능을 제어하는 미오신 중쇄 IIA/B ATPase나 미오신 경쇄 키나아제는, ROCK 시그널의 하류에서 기능하고 있고, 악토미오신 복합체의 형성 또는 기능 조절을 통해, 보다 직접적으로 수축환의 수축 운동의 제어를 행하고 있다. 그 때문에, 악토미오신 복합체 기능 저해제는, ROCK 저해제보다 효과적으로 거핵구 세포의 핵내 분열을 억제하여, 다핵화를 한층 더 촉진하는 것으로 생각된다.

본 발명에서 사용 가능한 악토미오신 복합체 기능 저해제로는, 미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제인, 블레비스타틴(Blebbistatin ; Science, 299 : 1743-1747 2003)을 들 수 있다. 또한, 미오신 경쇄 키나아제 저해제인, ML7 등을 들 수 있다. 그 밖에, 미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제 또는 미오신 경쇄 키나아제 저해제로서, 미오신 중쇄 IIA/B ATPase 또는 미오신 경쇄 키나아제의 활성을 저해하는 핵산(예컨대, shRNA 등)이나 항체 등도 사용할 수 있다.

또, 본 명세서 중에서 「처리」란, 저해제 등의 효과가 대상 세포에 있어서 발휘되도록 하는 조작을 말하며, 예컨대, 세포의 배양액 중에 적당량의 저해제 등을 첨가하고, 세포 내에 삽입시키는 것과 같은 상태로 두는 것이다. 경우에 따라서는, 세포에 대한 삽입을 촉진하는 것과 같은 조작을 병용해도 좋다.

본 발명에 따른 거핵구 세포의 제조방법의 한 양태는, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 배양하고 있는 세포를, Rock 저해제로 처리하는 공정을 포함한다.

ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho 결합 키나아제) 저해제로는, 예컨대, [(R)-(+)-트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복사마이드·2HCl·H₂O](Y27632) 등을 들 수 있다. 경우에 따라서는, Rho 키나아제 활성을 저해하는 것과 같은 항체, 혹은 핵산(예컨대, shRNA 등)도, ROCK 저해제로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 거핵구 세포의 제조방법의 한 양태는, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 배양하고 있는 세포를, HDAC 저해제로 처리하는 공정을 포함한다.

HDAC 저해제는, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 활성을 저해하는 작용을 갖는다. 지금까지 HDAC 저해제는 다수 알려져 있고, 예컨대, 발프로산, 트리코스타틴 A, SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산), APHA(아로일피롤릴히드록시아미드) 등을 들 수 있고, 특히, 발프로산, 트리코스타틴 A 등을 적합하게 사용할 수 있다. 사용 약품이 염의 형태를 갖는 경우에는, 염의 형태로 사용해도 좋다.

악토미오신 복합체 기능 저해제, ROCK 저해제, HDAC 저해제 등으로 세포를 처리하는 경우의 최적 농도 등은, 당업자라면, 예비적인 실험에 의해 미리 결정할 수 있다. 또한, 처리하는 기간이나 방법 등도, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예컨대, 미오신 중쇄 II ATPase 저해제인 블레비스타틴 처리의 경우, 2∼15 μg/ml, 혹은 5∼10 μg/ml 정도를 배양액 중에 첨가하고, 배양 기간으로는, 예컨대, 5∼10일간 정도, 특히 6∼7일간 정도가 바람직하다. 또한, ROCK 저해제인 Y27632는, 5∼15 μM, 혹은 8∼12 μM, 바람직하게는 10 μM 정도로 사용하고, HDAC 저해제인 발프로산은, 0.1∼1 mM, 혹은, 0.2∼0.7 mM, 바람직하게는 0.5 mM 정도로 사용할 수 있다. Y27632, 발프로산의 처리 시간으로는, 10∼21일간, 바람직하게는 14일간 정도이다.

본 발명에 따른 다핵화 거핵구 세포의 제조방법의 한 양태는, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 배양하고 있는 세포를, 37℃ 이상의 온도에 두는 것을 포함한다.

또한, 거핵구 세포를 통상의 37℃ 이상의 온도에서 배양함으로써, 다핵화된 거핵구 세포의 분화를 촉진하는 것이 확인되어 있다. 여기서, 37℃ 이상의 온도란, 세포에 손상을 주지 않는 정도의 온도가 적당한 점에서, 예컨대, 약 37℃∼약 42℃ 정도, 약 37℃∼약 39℃ 정도가 바람직하다. 또한, 37℃ 이상의 온도에서의 배양 기간에 관해서는, 다핵화된 거핵구 세포의 수 등을 모니터하면서, 적절하게 결정하는 것이 가능한데, 예컨대, 10일간∼28일간, 바람직하게는 14일간∼21일간 정도이다.

다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 배양하는 공정의 다른 배양 조건 등은, 본 발명의 효과가 적합하게 얻어지는 한 특별히 한정되지 않고, 공지된 배양 조건이나 그것에 준하는 조건을 사용할 수 있다. 예컨대, TPO, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, EPO, GM-CSF, SCF, G-CSF, Flt3 리간드, Heparin 등 중 어느 하나 또는 이들 중의 2개 이상을 조합하여 배지에 첨가해도 좋다.

또한, 적절히 피더 세포를 이용하여 배양해도 좋다.

상술한 방법으로 얻어진 다핵화된 거핵구 세포는, CD42b 양성의 기능적인 혈소판을 효율적으로 산생한다. 실시예에 나타내는 바와 같이, CD42b 양성의 혈소판은, 생체내 및 시험관내에 있어서, 높은 혈전 형성능을 갖고 있다. 또한, 다핵화된 거핵구 세포는, 동결 보존 후, 융해시켜도 기능적인 혈소판을 산생할 수 있다.

본 발명은 또한, 다핵화 거핵구 세포의 함유율이 높은 혈액 세포 조성물을 제공한다. 여기서 「혈액 세포 조성물」에는, 본 발명의 방법으로 다핵화가 촉진된 「다핵화 거핵구 세포」를 포함하는 것 외에, 그 밖의 방법에 의해 조제된 거핵구 세포, 또는 그 밖의 혈액 세포가 포함되어 있어도 좋다.

본 발명의 방법에 의해 다핵화 전의 거핵구 세포를 처리하면, 4N 이상의 다핵화 거핵구 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 그 때문에, 예컨대, 다능성 줄기 세포 등으로부터 분화시킨 거핵구 세포 집단에 대하여, 본 발명의 방법을 적용함으로써, 4N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 함유율이 높은 혈액 세포 조성물을 취득할 수 있다. 본 발명의 방법으로 거핵구 세포 집단을 처리한 경우, 4N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 함유율을, 적어도 20% 이상, 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 도 11의 B 참조)으로까지 증대시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 다핵화 거핵구 세포의 존재 비율이 높은 거핵구 세포 집단, 혹은 혈액 세포 집단을 조제하는 것이 가능해진다.

이러한 혈액 세포 조성물도 동결 보존이 가능하다. 따라서, 동결 보존한 상태로 유통시켜, 사용자가 후술하는 혈소판의 제조방법을 행해도 좋다.

본 발명의 방법으로 처리를 행하여 다핵화가 촉진된 거핵구 세포 등은, 적절한 방법에 의해, 생체 내에 이식하여, 생체 내에서의 기능성 혈소판을 산생시키기 위해서도 유효하다.

현재, 조혈 줄기 세포의 이식 방법으로서, 골수 이식이나 제대혈 이식 등이 행해지고 있고, 특히, 제대혈 이식은, 도너수의 부족이나 도너에 대한 부담의 크기와 같은 골수 이식에서의 문제를 경감시키는 것이 가능해지는 점에서, 최근, 제대혈 이식의 기회가 증가하고 있다. 그러나, 제대혈 이식에 의해 생체 내에 산생되는 거핵구 세포는, 다핵화의 정도가 낮고, 충분한 혈소판을 생체 내에서 산생하기 까지는 시간이 필요하여, 조급히 혈소판의 산생 능력을 높일 필요가 있는 경우에는, 제대혈 이식으로는 충분한 대응을 하기 어려운 상황에 있다.

본 발명의 방법에 의해 얻어지는 다핵화 거핵구 세포 등의 이식은, 골수 이식에서의 도너수의 부족 및 도너의 부담의 문제, 제대혈 이식에서의 생체 내에서의 혈소판 산생 능력의 문제를 해결하는 것이 가능하여, 종래의 이식법과 비교하여 매우 우수한 방법이라고 할 수 있다.

(혈소판의 제조방법)

한편, 본 발명에 따른 혈소판의 제조방법은, 본 발명의 방법으로 얻어진 다핵화 거핵구 세포 등으로부터, 시험관내에서 혈소판을 산생시키는 것이다.

본 발명에 따른 혈소판의 제조방법은, 상술한 방법으로 얻어진 다핵화된 거핵구 세포를 배양하고, 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정을 포함한다.

배양 조건은, 한정은 되지 않지만, 예컨대, TPO(10∼200 ng/mL, 바람직하게는 50∼100 ng/mL 정도)의 존재하에서, 혹은 TPO(10∼200 ng/mL, 바람직하게는 50∼100 ng/mL 정도), SCF(10∼200 ng/mL, 바람직하게는 50 ng/mL 정도) 및 Heparin(10∼100 U/mL, 바람직하게는 25 U/ml 정도)의 존재하에서, 7∼15일간 정도 배양해도 좋다.

본 발명에 따른 혈소판의 제조방법의 한 양태에서는, 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정에서, 상기 아포토시스 유전자의 강제 발현을 억제하거나, 상기 아포토시스 억제 유전자를 다핵화 거핵구 세포로부터 제거한다.

아포토시스 억제 유전자의 발현의 억제는, 예컨대, 상술한 유도적인 발현 시스템에 의한 발현의 유도를, 약제 등의 제거에 의해 해제함으로써 달성해도 좋다. 혹은, 도입한 아포토시스 억제 유전자를 Cre/lox 시스템 등을 사용하여 제거하여, 이들 유전자의 발현을 억제적으로 제어해도 좋다. 아포토시스 억제 유전자의 발현을 억제적으로 조절하기 위해, 시판되는 키트 등을 적절히 사용할 수도 있다.

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 다핵화의 촉진을 위해 강제 발현시킨 아포토시스 억제 유전자의 발현을 억제하면, CD41a 양성/CD42b 양성의 기능적인 혈소판의 산생 효율이 상승한다.

아포토시스 억제 유전자의 발현 억제 또는 제거는, 혈소판 회수의 15일 전부터, 바람직하게는 10일 전부터, 보다 바람직하게는 3일∼7일 전부터, 더욱 바람직하게는 약 3일 전부터 행한다.

또, 이 공정에서는, 외인성의 아포토시스 억제 유전자만이 아니라, 내인성의 아포토시스 억제 유전자의 발현도 억제해도 좋다. 또한, p53 유전자 산물의 발현 또는 기능 저해를, 본 공정에서 계속해서 행해도 좋다.

배양 온도는, 본 발명의 효과가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않고, 35℃∼40℃에서 행할 수 있지만, 실시예에 나타내는 바와 같이, 37℃∼39℃가 적합하다.

본 발명에 따른 제조방법에서는, 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정을, 혈청 프리 및/또는 피더 세포 프리의 조건에서 행해도 좋다. 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에서는, 소 태아 혈청을 배지에 첨가한 경우와, 혈청 프리 배지에서 배양한 경우에서는, 혈소판의 산생량에는 큰 차가 보이지 않았지만, 혈청 프리 배지 또는 피더 세포 프리 배지에서 배양한 경우 쪽이, CD42b 양성 혈소판의 비율이 높았다. 혈소판 산생 공정을 혈청 프리, 또한 피더 세포 프리로 행할 수 있으면, 얻어진 혈소판을 임상적으로 이용하는 경우에 면역원성의 문제가 잘 생기지 않는다.

또한, 피더 세포를 이용하지 않고 혈소판을 산생시킬 수 있으면, 피더 세포를 접착시킬 필요가 없기 때문에, 플라스크 등에서 부유 배양할 수 있으므로, 제조 비용을 억제할 수 있음과 동시에, 대량 생산에 적합하다. 또, 피더 세포를 이용하지 않는 경우에는, 조정 배지(conditioned medium)를 사용해도 좋다. 조정 배지는, 특별히 한정되지 않고, 당업자가 공지된 방법 등에 따라 제작할 수 있지만, 예컨대, 피더 세포를 적절히 배양하고, 배양물로부터 피더 세포를 필터로 제거함으로써 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 혈소판의 제조방법의 한 양태에서는, 배지에 ROCK 저해제 및/또는 악토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가한다. ROCK 저해제 및 악토미오신 복합체 기능 저해제로는, 상술한 다핵화 거핵구 세포의 제조방법에서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. ROCK 저해제로는, 예컨대 Y27632를 들 수 있다. 악토미오신 복합체 기능 저해제로는, 미오신 중쇄 II ATPase 저해제인, 블레비스타틴을 들 수 있다. ROCK 저해제를 단독으로 첨가해도 좋고, ROCK 저해제와 악토미오신 복합체 기능 저해제를 단독으로 첨가해도 좋고, 이들을 조합하여 첨가해도 좋다.

ROCK 저해제 및/또는 악토미오신 복합체 기능 저해제는, 0.1 μM∼30 μM로 첨가하는 것이 바람직하고, 예컨대 0.5 μM∼25 μM, 5 μM∼20 μM 등으로 해도 좋다.

ROCK 저해제 및/또는 악토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가한 후의 배양 기간은 1일∼15일로 할 수 있고, 3일, 5일, 7일 등으로 해도 좋다. ROCK 저해제 및/또는 악토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가함으로써, CD42b 양성 혈소판의 비율을 더욱 증가시키는 것이 가능하다.

본 발명의 실시형태에는, 거핵구 세포의 다핵화를 촉진하고, 성숙 거핵구 세포 및/또는 혈소판을 제조하기 위한 키트가 포함된다. 상기 키트에는, 암 유전자, 상기 (i)∼(iii)의 유전자, BCL-XL 유전자 등을 세포 내에서 발현하는 데 필요한 발현 벡터 등 및 시약 등 외에, 세포 배양을 위한 배지, 혈청, 증식 인자 등의 서플리먼트(예컨대, TPO, EPO, SCF, Heparin, IL-6, IL-11 등), 항생 물질 등이 포함된다. 그 밖에, 예컨대, ES 세포 또는 iPS 세포 유래의 세포를 사용하는 경우, 이들 세포로부터 조제한 네트형 구조물을 동정하기 위한 마커 확인용 항체(예컨대, Flk1, CD31, CD34, UEA-I 렉틴 등에 대한 항체) 등도 포함된다. 키트 중에 포함되는 시약, 항체 등은, 구성 성분이 활성을 장기간 유효하게 지속하고, 용기의 재질에 따라 흡착되지 않고, 변질을 받지 않는 것과 같은 어느 종류의 용기 중에 공급된다.

또한, 본 발명의 키트에는, 암 유전자 및 상기 (i)∼(iii)의 유전자를 강제 발현한 다핵화 전의 거핵구 세포가 포함되어 있어도 좋다.

본 명세서 중에 기재된 「세포」의 유래는, 인간 및 비인간 동물(예컨대, 마우스, 래트, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이, 개, 고양이, 새 등)이고 특별히 한정은 되지 않지만, 특히 바람직하게는 인간 유래의 세포이다.

이하에 실시예를 나타내어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다.

실시예

1. 다핵화 전의 거핵구 세포의 조제

1-1. ES 세포로부터의 다핵화 전의 거핵구 세포의 조제

거핵구의 다핵화에 관해 검토하기 위해, ES 세포로부터 다핵화하기 전의 거핵구 세포의 조제를 행했다(상세한 것에 관해서는, 특허문헌 3을 참조할 것).

인간 ES 세포주[KhES-3]를 20 ng/ml VEGF 존재하에서 14일간 배양하여 네트형 구조물을 조제하고, 이 네트형 구조물로부터 취출한 조혈 전구 세포를 회수하여, 10T1/2 세포 상에 세포수 1×10⁵/웰이 되도록 파종했다.

이와 같이 조제한 조혈 전구 세포에, c-MYC-2A-BMI1을 삽입한 pMx tet off c-MYC 2A BMI1 레트로바이러스 벡터를 MOI=10(Jurkat 세포로 확인)으로 12시간마다 3회 감염시켜 c-MYC와 BMI1의 발현 유도를 행했다(특허문헌 3). pMx tet off c-MYC 2A BMI1 벡터는, 에스트라디올 존재하에서, c-MYC 유전자 및 BMI1 유전자를 발현시키는 한편, 독시사이클린(Dox) 존재하, 에스트라디올 비존재하에서는, c-MYC 유전자 및 BMI1 유전자의 발현을 억제한다.

1회째의 감염과 동시에 에스트라디올 2 mM을 첨가하고, 또한, 마지막 감염으로부터 12시간 후에 바이러스를 제거했다. 이 시기는, c-MYC 유전자나 BMI1 유전자의 발현을 Off로 해도, CD42b 양성 혈소판의 방출이 적고, 미성숙한 거핵구 세포인 것으로 생각되었다. 이 세포를 이후, 「iMKPC-typeI」이라고 하는 경우도 있다.

iMKPC-typeI의 사이토카인 의존성을 조사하기 위해, 10T1/2 피더 세포 상에 2×10⁵개의 iMKPC-typeI을 파종하고, 2 uM β-에스트라디올 존재하, 37℃에서 SCF(50 ng/ml), TPO(50 ng/ml), EPO(6 U/ml)의 사이토카인을 이용하여, 도 1a에 도시한 조건에서 14일간 배양했다. 4, 11일째에 증식이 확인된 군은 세포수를 측정하고 2×10⁵개로 재파종하고, 그 이외는 배지 교환을 행했다. 8, 14일째에 세포수를 측정하고 2×10⁵개로 재파종함과 동시에, 8일째에는, 일부의 세포를 CD41 항체, CD42b 항체 및 GPA 항체를 이용하여 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석을 행했다.

결과를 도 1b 및 1c에 도시한다. 도 1b에 도시된 바와 같이, iMKPC-typeI의 증식은 SCF에 강하게 의존하고 있었다. 또한, 도 1c에 도시된 바와 같이, 어느 군도 거의 CD41 양성이었지만, SCF를 제외한 군에서는, CD41+/CD42b-의 군의 증식이 극단적으로 저하되어 있었다. CD41+/CD42b-의 군이, iMKPC-typeI 중에서도 증식이 양호한 집단이다.

SCF 의존성인 점에서도, iMKPC-typeI은 미성숙한 거핵구 세포인 것이 시사되었다.

1-2. 제대혈 유래 CD34 양성 세포로부터의 다핵화 전의 거핵구 세포의 조제

제대혈 유래 CD34 양성 세포로부터도, ES 세포나 iPS 세포와 동일한 방법으로 다핵화 전의 거핵구 세포를 조제할 수 있는 것을 확인했다.

구체적으로는, 제대혈 유래 CD34 양성 세포에 pMx-c-MYC와 DNsam BMI1 바이러스(모두 레트로바이러스 벡터)를 MOI10으로 3회 감염 후, 14일째와 21일째의 세포에 관해, FACS를 이용하여 CD41a(거핵구 마커) 양성 세포를 카운트했다. 컨트롤로서, Mock(Empty vector)를 이용했다.

결과를 도 1d에 나타낸다. Mock와 비교하여, c-MYC와 BMI1을 강제 발현시킨 군에서는 CD41 양성 거핵구의 증식이 관찰되고, 제대혈 유래 세포로부터도, 1-1.과 동일한 방법으로 다핵화 전의 거핵구 세포가 얻어지는 것을 확인했다.

2. 다핵화 전의 거핵구 세포로부터의 다핵화 거핵구의 조제

2-1. BCL-XL 발현에 의한 다핵화에 대한 영향

1-1.에 있어서, c-MYC-2A-BMI1을 삽입한 pMx tet off c-MYC 2A BMI1 레트로바이러스 벡터 감염 후, 23일째에, 독시사이클린 유도성의 Lv-BCL-XL-GFP(렌티바이러스 벡터)를 MOI10으로 1회 감염시켰다. 이 벡터는, EcoRI, BamHI 처리한 Ai-Lv tet on 벡터(clontech)에 PCR 증폭한 BCL-XL의 cDNA를, In-Fusion advance PCR cloning kit(clontech)를 이용하여 도입함으로써 제작했다. 감염으로부터 24시간 후에, 바이러스 제거했다. 에스트라디올을 제거하고, 독시사이클린을 첨가함으로써, c-MYC와 BMI1의 발현을 억제하고, 동시에 BCL-XL의 발현을 개시했다.

2-2. p53 유전자의 녹다운에 의한 다핵화에 대한 영향

독시사이클린 유도성의 Lv-BCL-XL-GFP 렌티바이러스 벡터에 덧붙여, FG12-sh p53 렌티바이러스 벡터를 감염시키고, p53 유전자를 녹다운했다. 이후, 이 세포를 「iMKPC-typeII」라고 하는 경우가 있다.

2-3. iMKPC-typeII의 사이토카인 의존성

10T1/2 피더 세포 상에, 2×10⁵개의 iMKPC-typeII를 파종하고, Dox 0.5 μg/ml 존재하, 39℃에서, SCF(50 ng/ml), TPO(50 ng/ml), EPO(6 U/ml)의 사이토카인 조건에서 21일간 배양했다. 결과를 도 2의 A에 도시한다. iMKPC-typeII 주는, 사이토카인의 비존재하에서도 증식하지만, TPO의 첨가에 의해 증식이 보다 촉진되는 것이 확인되었다. iMKPC-typeI은 SCF 의존성이고, TPO는 증식에 무관했지만, typeII에서는, TPO 존재하에서의 증식이 촉진되고, SCF는 증식에 무관했다.

2-4. iMKPC-typeII의 표면 마커의 해석

사이토카인 첨가 후 21일째에, 세포를 CD41 항체, CD42b 항체, 및 GPA 항체를 이용하여 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석했다. 결과를 도 2의 B에 도시한다. TPO를 첨가한 군에서는, 다른 군에 비해 CD41a 및 CD42b의 발현이 높았다. 보다 거핵구에 커미트한 집단인 것으로 생각되었다.

2-5. 형태적 변화 및 블레비스타틴의 영향

iMKPC-typeI 및 typeII를 현미경으로 관찰한 결과를 도 3에 도시한다. c-MYC와 BMI1의 발현을 off로 하고, BCL-XL을 강제 발현시킴과 동시에, p53을 녹다운함으로써, 다핵화가 진행되는 것이 관찰되었다. 또한, 블레비스타틴(5 μg/ml)을 첨가하면 더욱 다핵화가 진행되는 것이 확인되었다.

2-3.∼2-5.에 나타낸 바와 같이, iMKPC-typeII의 단계에서는, 거핵구 세포는 증식하면서, 방출되는 혈소판에서는 CD42b 양성의 비율이 높아지고, 일부 다핵화가 진행되고, 사이토카인의 의존성이 TPO로 변한 점에서, 증식과 성숙화가 병행하여 진행되고 있는 것으로 생각되었다.

2-6. BCL-XL 발현 억제의 영향

10T1/2 피더 세포 상에, 2×10⁵개의 iMKPC-typeII를 파종하고, Dox 0.5 μg/ml 존재하(BCL-XL ON) 또는 비존재하(BCL-XL OFF), 39℃에서 장기간 배양했다. 2일∼5일에 한번 세포수를 측정하고, 2×10⁵개를 재파종했다.

결과를 도 4에 도시한다. Dox OFF에 의해 BCL-LX의 발현을 억제하면, iMKPC-typeII의 증식 속도가 저하되고, 장기간 경과 후(100일 이후)에는 증식능이 상실되었다. BCL-XL은, iMKPC-typeII의 장기간 증식에 필수임을 알 수 있었다.

2-7. 그 밖의 처리의 다핵화에 대한 영향의 검토

2-7-1. ROCK 저해제의 영향

MYC 및 BMI1 유전자 도입 후, 독시사이클린 비존재하 및 에스트라디올 존재하에서, 배양 조건, 37℃, 5% CO₂ 존재하에서, 거핵구 세포(10⁵ 정도)를 30일간 정도 배양하여, 10¹¹개 정도로 증식시켰다. 증식한 거핵구 세포주 중의 MYC 유전자 및 BMI1 유전자의 발현을 억제하기 위해, 독시사이클린 존재하, 에스트라디올 비존재하의 조건으로 바꾸고, ROCK 저해제(Y27632; 와코 준야쿠)의 다핵화에 대한 영향을 보기 위해, Y27632를 배양액 중에 10 μM이 되도록 첨가하고, 더욱 배양을 계속했다. Y27632를 첨가하고 나서 배양 7일째에 FACS에 의해 다핵화의 정도를 조사했다(도 5). ROCK 저해제를 첨가한 세포(도 5의 상측 도면(Rock i), 하측 도면의 흰색)는, 첨가하지 않은 세포(도 5의 상측 도면(vehicle), 하측 도면의 검정색)와 비교하여 4N 이상의 세포수가 증가했다. 이러한 점에서, ES 세포로부터 유도하고, c-MYC 유전자 및 BMI1 유전자의 발현에 의해 증식능을 획득한 다핵화 전의 거핵구 세포에 대하여, ROCK 저해제는 다핵화를 촉진하는 것이 밝혀졌다.

2-7-2. ROCK 저해제+고온 조건에서의 배양의 영향

지금까지, 미성숙 거핵구 세포를 39℃와 같은 통상의 배양 온도보다 고온에서 배양하면, 다핵화나 proplatelet 형성 등, 거핵구의 성숙이 촉진되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5). 이 점을 ES 세포로부터 유도한 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서 확인하기 위해, 거핵구의 성숙에 수반하여 발현이 상승하는 것이 알려져 있는 유전자(GATA1, PF4, NFE2 및 β-튜불린)의 발현량에 관해 정량 PCR법에 의해 검토를 행했다.

다핵화 전의 거핵구 세포의 증식을 촉진했다. 얻어진 다핵화 전의 거핵구 세포 중의 MYC 유전자 및 BMI1 유전자의 발현을 억제하기 위해, 독시사이클린 존재하, 에스트라디올 비존재하의 조건으로 바꾸고, 배양 온도를 39℃로 하여, 5일간 배양 후, 정량 PCR법에 의해, 각종 유전자의 발현량을 측정했다(도 6). 그 결과, 37℃에서 배양할 때보다, 39℃에서 배양을 행했을 때의 쪽이, 거핵구의 성숙화의 지표가 되는 유전자의 발현이 상승한 것을 알 수 있었다.

2-7-3. ROCK 저해제+BCL-XL 유전자 강제 발현의 영향

다핵화 전의 거핵구 세포 중에서의 MYC/BMI1의 발현을 억제함과 동시에 독시사이클린 존재하에서 2-1.과 동일한 BCL-XL을 발현시키는 렌티바이러스 벡터를 세포 내에 도입했다.

BCL-XL 유전자의 발현의 유무가, ROCK 저해제에 의해 유도되는 거핵구 전구 세포의 다핵화에 어떠한 영향을 미치는지를 조사했다(도 7).

10 μM의 Y27632 존재하에서 MYC/BMI1의 발현을 억제하며, 또한, BCL-XL을 발현시켜, 7일간 배양한 후, 다핵화의 정도를 검토했다(ploidy assay). BCL-XL 발현 세포주(도 7의 B, 사선 바)는 BCL-XL을 발현시키지 않은 세포주(도 7의 B, 흰색 바)와 비교하여, 8N 이상의 다핵화 세포가 우수하게 증가한 것이 확인되었다. 또한, BCL-XL을 발현시키지 않은 세포의 세포수가 감소해가는 반면(도 8, ▲), BCL-XL을 발현시킨 세포의 세포수는, 완만하게 증식해가는 것이 관찰되었다(도 8, ■).

이상의 점에서, 암 유전자의 강제 발현에 의해 높은 증식능을 획득한 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서, 암 유전자 의존성을 회피하기 위해서는, BCL-XL 유전자 등의 아포토시스를 억제하는 유전자가 효과적인 것이 밝혀졌다.

2-7-4. ROCK 저해제+BCL-XL 유전자 강제 발현+p53 유전자 억제의 영향

다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서, p53의 발현 억제가 다핵화를 촉진하는지의 여부를 검토했다.

p53 유전자의 발현 억제는, 2-2.와 마찬가지로, 1 프로모터, shp53을 도입한 렌티바이러스 FG12 벡터를 이용하여 MOI10으로 렌티바이러스 감염시켜 행했다.

MYC/BMI1의 발현을 억제하고, BCL-XL을 강제 발현시키고, Y27632의 존재하에, p53의 발현 억제를 행하고, 39℃에서, 7간 배양을 행했다. 배양 후, 다핵화의 정도를 조사한 바, p53을 녹다운하지 않은 컨트롤 세포(도 9의 B, 검정색 바)와 비교하여, p53을 녹다운한 세포(도 9의 B, 흰색 바)에서는, 8N 이상의 세포수가 증가하여, 다핵화가 촉진되어 있었다.

2-7-5. ROCK 저해제+BCL-XL 유전자 강제 발현+p53 유전자 억제+발프로산의 영향

상기 2-7-4의 처리에 덧붙여, 세포에 대하여 발프로산의 처리를 더 행하고, 다핵화에 대한 영향을 검토했다. MYC/BMI1의 발현을 억제, BCL-XL의 강제 발현, ROCK 저해제 처리(10 μM), p53 발현 억제에 덧붙여, 배지 중에 발프로산(최종 농도 0.5 mM)을 첨가하고, 39℃에서 7일간 배양한 바, 발프로산 처리를 행하지 않은 컨트롤 세포(도 10의 B, 흑색 바)와 비교하여, 발프로산으로 처리한 세포(도 10의 B, 흰색 바)에서는, 다핵화가 촉진되어 있었다.

2-7-6. BCL-XL 유전자 강제 발현+미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제의 영향, 및 ROCK 저해제+BCL-XL 유전자 강제 발현+p53 유전자 억제+발프로산+미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제의 영향

다핵화가 진행되지 않은 거핵구 세포를, 미오신 중쇄 IIA/B ATPase 저해제의 블레비스타틴으로 처리한 경우, 다핵화의 정도에 영향이 생기는지의 여부를 검토했다. MYC/BMI1의 발현을 억제, BCL-XL의 강제 발현, 블레비스타틴(10 μg/ml) 처리를 행하고, 39℃에서 7일간 배양했다. 블레비스타틴 처리를 행하지 않은 컨트롤 세포(도 11의 B, 흑색 바)와 비교하여, 블레비스타틴 처리를 행한 세포(도 11, 흰색 바)에서는, 8N 이상의 세포수가 증가하여, 다핵화가 촉진되어 있었다.

다음으로, 다른 처리와 블레비스타틴 처리를 조합한 경우의 다핵화의 정도에 관해 검토를 행했다. 상기 2-7-5.의 처리에 덧붙여, 세포에 대하여 블레비스타틴 처리를 행하고, 다핵화에 대한 영향을 검토했다. MYC/BMI1의 발현을 억제, BCL-XL의 강제 발현, ROCK 저해제(10 μM) 처리, p53 발현 억제, 발프로산(0.5 mM) 처리에 덧붙여, 블레비스타틴(10 μg/ml) 처리를 행하고, 39℃에서 7일간 배양했다. 블레비스타틴 처리를 행하지 않은 컨트롤 세포(도 12의 B, 흑색 바)와 비교하여, 블레비스타틴 처리를 행한 세포(도 12, 흰색 바)에서는, 8N 이상의 세포수가 증가하여, 다핵화가 촉진되어 있었다. 또한, 배양 7일 후, 블레비스타틴 처리를 행한 세포에서는 약간 증식능은 저하되어 있지만(도 13, 상측 도면), 세포질의 비대화가 관찰되고, 성숙 거핵구로의 유도가 확인되었다(도 13, 하측 도면).

3. 다핵화 거핵구 세포로부터의 혈소판의 산생

3-1. BCL-XL 발현 억제의 혈소판 산생에 대한 영향(1)

10T1/2 피더 세포 상에, 2-2.에서 얻어진 2×10⁵개의 iMKPC-typeII를 파종하고, Dox 0.5 μg/ml 존재하(BCL-XL ON)에서, 또는 Dox를 배양액 중으로부터 제거하여(BCL-XL OFF), 39℃에서 배양했다. 3-4일째에 거핵구 및 배양액 중의 혈소판을 CD41 항체 및 CD42b 항체를 이용하여 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석을 행했다.

결과를 도 14에 도시한다. Dox ON에 의해 BCL-XL이 발현되어 있는 거핵구 세포(A)에 비교하여, Dox OFF에 의해 BclxL의 발현을 억제한 군에서는 CD42b를 발현하고 있는 성숙한 거핵구 세포가 주체로 되어 있었다(B). 또한, 그곳으로부터 방출된 혈소판도, BCL-XL ON의 거핵구 세포로부터 방출된 혈소판(C)에 비교하여, 기능 발현에 필요한 CD42b를 발현하고 있는 것의 비율이 증가되어 있었다(D).

3-2. BCL-XL 발현 억제의 혈소판 산생에 대한 영향(2)

3-1.과 동일한 결과에 기초하여, BCL-XL 발현의 ON/OFF시에서의 세포수를 계측한 결과를 도 15에 도시한다. BCL-XL의 발현을 억제한 군에서는 혈소판수가 현저히 증가했다.

A는, CD42b 양성 혈소판수, B는, CD41a 양성/CD42b 양성 거핵구 세포수, C는, CD41a 양성 거핵구 세포수를 나타낸다.

CD41을 발현하고 있는 거핵구 세포의 수에 있어서는 BclxL의 발현에 의한 영향은 보이지 않지만(C), CD41+ 중의 CD42b 발현 비율이 BclxL의 발현 억제에 의해 증가하고, 보다 성숙한 거핵구가 증가되어 있었다고 할 수 있다.

3-3. 배양 온도의 혈소판 산생에 대한 영향

10T1/2 피더 세포 상에 2∼3×10⁵개의 iMKPC-typeII를 파종하고, Dox 0.5 μg/mL의 첨가 혹은 비첨가 조건에 있어서, 35, 37, 39℃의 배양 온도에서 3일간 배양했다. 상청 중에 포함되는 혈소판을 CD41 항체 및 CD42b 항체를 이용하여 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석을 행했다. 37℃ Dox+를 1로 하여, 각 군의 CD41+CD42b+혈소판수의 평균치 및 표준 편차를 도 16에 도시한다.

배양 온도는, 37℃ 또는 39℃가 적당한 것을 알 수 있었다. 이후의 실험에서는, 배양 온도를 37℃로 했다.

3-4. 피더 세포, 배지 중의 혈청, 및 블레비스타틴의 유무의 혈소판 산생에 대한 영향

피더 세포 사용/비사용, 조정 배지 사용/비사용, 혈청 배지 사용/무혈청 배지 사용, 블레비스타틴 투여/비투여의 조건을 도 17에 도시한 바와 같이 조합하여 혈소판 산생 효율을 측정했다.

조정 배지는, 젤라틴 코팅(Gelatin coating)한 10 cm 디쉬에 MMC 처리한 10T1/2를 8×10⁵ 파종하고, 다음날(세포가 접착한 후) SCF(50 ng/ml), TPO(50 ng/ml)를 포함하는 15% 혈청을 포함하는 분화 배지(EBM) 또는 혈청 프리의 분화 배지 10 ml로 교환하고, 24시간 후에 배지를 회수하여 새로운 배지(SCF, TPO 포함)를 10 ml 첨가하고, 3일분의 조정 배지를 풀링하고, 0.22 ㎛의 필터를 통과시켜, 10T1/2를 제거하여 조제했다. 시험에 이용할 때에는 SCF, TPO는 새롭게 첨가했다.

피더 세포 사용군은, 10T1/2 피더 세포 상에 2∼3×10⁵개의 iMKPC-typeII를 파종하고, 비사용군은, 젤라틴 코팅한 디쉬 상에 마찬가지로 세포를 파종했다. 혈청 배지 사용군은, 15% 혈청을 포함하는 분화 배지 또는 조정 배지를 이용하고, 블레비스타틴 투여군은, 배지에 5 μM의 블레비스타틴을 첨가했다. 배양은, 37℃에서 3일간 행했다.

배양 상청 중에 포함되는 혈소판을 CD41 항체 및 CD42b 항체를 이용하여 염색하고, 플로우 사이토미터로 해석을 행했다. 피더 세포 상에서 블레비스타틴 비첨가, 15% 혈청 첨가하여 배양한 것을 정상 조건(normal condition)으로 하고, 각 군의 CD41+CD42b+혈소판수의 정상 조건에 대한 비율의 평균치 및 표준 편차를 막대 그래프로 한 것을 도 17에 도시한다. 혈소판 산생량으로는, 어느 군에 있어서도 큰 차는 확인되지 않았다.

또한, 각 군의 CD41 양성 혈소판 중의 CD42b 발현량(각 군의 평균 형광 강도의, 정상 조건의 평균 형광 강도에 대한 비율)의 비교를 도 18에 도시한다. 혈청 없고, 피더 세포 없는 조건에서, 가장 CD42b의 발현이 높은 혈소판이 산생되었다. 블레비스타틴의 영향은 보이지 않았다.

최적화한 조건의 일례를 도 19에 도시한다. 또한, 이 조건에서 배양했을 때의 CD41 양성, CD42b(GPIba라고도 함) 양성 혈소판의 비율을 도 20에 도시한다.

도 20에 도시된 바와 같이, 본 발명에 의해 얻어지는 다핵화 거핵구 세포로부터 얻어지는 혈소판은, 약 20%가 CD41 양성 CD42b 양성이고, BCL-XL의 발현을 억제함으로써, 그 비율이 55%로 상승하고, 또한 피더 세포와 혈청을 제외하고 배양함으로써 81%까지 상승시킬 수 있었다.

4. CD42b 발현의 혈소판 기능에 대한 중요성(참고)

인간 말초혈 혈소판을 이용하여, 리스토세틴 응집 반응(vWF와 혈소판 상의 리셉터[GPIba, GPIX 등으로 이루어지는 헤테로 5량체]를 통한 응집 반응)에 대한 HIP1 항체의 저해 효과를 측정했다. HIP1 항체는, GPIba의 기능적 저해 항체이다.

1×10⁸개의 혈소판을 50% 혈장 중에 현탁시키고, HIP1 항체를 첨가하고 37℃에서 3분간 전배양하여 GPIba의 효과를 저해한 후, 리스토세틴(최종 농도 2 mg/ml)을 첨가하여 응집 반응을 야기하고, 7분간 광투과도를 모니터했다. 각 군의 최대 광투과도(응집의 강도를 나타냄)를 나타내는 막대 그래프를 도 21에 도시한다. HPI1 항체는 10 μg/ml 이상의 농도로 GPIb/alpha-von Willebrand factor(vWF) 회합에 의한 응집을 완전히 저해했다.

다음으로, NOG 마우스 체내에 100 ug의 HIP1 항체 또는 컨트롤 IgG를 투여하고, TAMRA(적색 색소)로 염색한 혈소판을 수혈했다. 혈관 내피를 레이저 조사에 의해 상해하여 혈전 형성을 야기하고, 혈전 형성에 기여한 인간 혈소판(적색)수를 카운트했다.

혈전 중의 인간 혈소판수를 단위 혈관 길이로 보정한 값의 평균치 및 표준 오차를 막대 그래프로 도시했다(도 22). HIP1 항체 투여군에서는, 인간 혈소판의 혈전에 대한 기여가 저해되었다.

이상으로부터, GPIba(CD42b)는 생체내 및 시험관내에서의 혈전 형성에 중요한 역할을 수행하고 있는 분자인 것을 알 수 있다.

본 발명은, 거핵구 전구 세포의 다핵화를 촉진하고, 또한, 혈소판의 방출을 효율적으로 행하게 하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은, 각종 줄기 세포 등으로부터 시험관내에 있어서 거핵구나 혈소판을 조제할 때에 매우 유효하여, 의료 분야에서의 치료법이나 혈액 제제의 개발에 크게 기여하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo <120> A method for producing polyploidized megakaryocyte and platelet <130> T0529ADP0012 <150> JP 2011-108253 <151> 2011-05-13 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1319 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcccctca acgttagctt caccaacagg aactatgacc tcgactacga ctcggtgcag 60 ccgtatttct actgcgacga ggaggagaac ttctaccagc agcagcagca gagcgagctg 120 cagcccccgg cgcccagcga ggatatctgg aagaaattcg agctgctgcc caccccgccc 180 ctgtccccta gccgccgctc cgggctctgc tcgccctcct acgttgcggt cacacccttc 240 tcccttcggg gagacaacga cggcggtggc gggagcttct ccacggccga ccagctggag 300 atggtgaccg agctgctggg aggagacatg gtgaaccaga gtttcatctg cgacccggac 360 gacgagacct tcatcaaaaa catcatcatc caggactgta tgtggagcgg cttctcggcc 420 gccgccaagc tcgtctcaga gaagctggcc tcctaccagg ctgcgcgcaa agacagcggc 480 agcccgaacc ccgcccgcgg ccacagcgtc tgctccacct ccagcttgta cctgcaggat 540 ctgagcgccg ccgctcagag tgcatcgacc cctcggtggt cttcccctac cctctcaacg 600 acagcagctc gcccaagtcc tgcgcctcgc aagactccag cgccttctct ccgtcctcgg 660 attctctgct ctcctcgacg gagtcctccc cgcagggcag ccccgagccc ctggtgctcc 720 atgaggagac accgcccacc accagcagcg actctgagga ggaacaagaa gatgaggaag 780 aaatcgatgt tgtttctgtg gaaaagaggc aggctcctgg caaaaggtca gagtctggat 840 caccttctgc tggaggccac agcaaacctc ctcacagccc actggtcctc aagaggtgcc 900 acgtctccac acatcagcac aactacgcag cgcctccctc cactcggaag gactatcctg 960 ctgccaagag ggtcaagttg gacagtgtca gagtcctgag acagatcagc aacaaccgaa 1020 aatgcaccag ccccaggtcc tcggacaccg aggagaatgt caagaggcga acacacaacg 1080 tcttggagcg ccagaggagg aacgagctaa aacggagctt ttttgccctg cgtgaccaga 1140 tcccggagtt ggaaaacaat gaaaaggccc ccaaggtagt tatccttaaa aaagccacag 1200 catacatcct gtccgtccaa gcagaggagc aaaagctcat ttctgaagag gacttgttgc 1260 ggaaacgacg agaacagttg aaacacaaac ttgaacagct acggaactct tgtgcgtaa 1319 <210> 2 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcatcgaa caacgagaat caagatcact gagctaaatc cccacctgat gtgtgtgctt 60 tgtggagggt acttcattga tgccacaacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120 acgtgtattg ttcgttacct ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaagtt 180 cacaagacca gaccactact gaatataagg tcagataaaa ctctccaaga tattgtatac 240 aaattagttc cagggctttt caaaaatgaa atgaagagaa gaagggattt ttatgcagct 300 catccttctg ctgatgctgc caatggctct aatgaagata gaggagaggt tgcagatgaa 360 gataagagaa ttataactga tgatgagata ataagcttat ccattgaatt ctttgaccag 420 aacagattgg atcggaaagt aaacaaagac aaagagaaat ctaaggagga ggtgaatgat 480 aaaagatact tacgatgccc agcagcaatg actgtgatgc acttaagaaa gtttctcaga 540 agtaaaatgg acatacctaa tactttccag attgatgtca tgtatgagga ggaaccttta 600 aaggattatt atacactaat ggatattgcc tacatttata cctggagaag gaatggtcca 660 cttccattga aatacagagt tcgacctact tgtaaaagaa tgaagatcag tcaccagaga 720 gatggactga caaatgctgg agaactggaa agtgactctg ggagtgacaa ggccaacagc 780 ccagcaggag gtattccctc cacctcttct tgtttgccta gccccagtac tccagtgcag 840 tctcctcatc cacagtttcc tcacatttcc agtactatga atggaaccag caacagcccc 900 agcggtaacc accaatcttc ttttgccaat agacctcgaa aatcatcagt aaatgggtca 960 tcagcaactt cttctggttg a 981 <210> 3 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtctcaga gcaaccggga gctggtggtt gactttctct cctacaagct ttcccagaaa 60 ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtg gaagagaaca ggactgaggc cccagaaggg 120 actgaatcgg agatggagac ccccagtgcc atcaatggca acccatcctg gcacctggca 180 gacagccccg cggtgaatgg agccactggc cacagcagca gtttggatgc ccgggaggtg 240 atccccatgg cagcagtaaa gcaagcgctg agggaggcag gcgacgagtt tgaactgcgg 300 taccggcggg cattcagtga cctgacatcc cagctccaca tcaccccagg gacagcatat 360 cagagctttg aacaggtagt gaatgaactc ttccgggatg gggtaaactg gggtcgcatt 420 gtggcctttt tctccttcgg cggggcactg tgcgtggaaa gcgtagacaa ggagatgcag 480 gtattggtga gtcggatcgc agcttggatg gccacttacc tgaatgacca cctagagcct 540 tggatccagg agaacggcgg ctgggatact tttgtggaac tctatgggaa caatgcagca 600 gccgagagcc gaaagggcca ggaacgcttc aaccgctggt tcctgacggg catgactgtg 660 gccggcgtgg ttctgctggg ctcactcttc agtcggaaat ga 702

Claims (19)

1. 다핵화 거핵구 세포를 제조하는 방법으로서,
   다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜, 상기 세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 아포토시스 억제 유전자가 BCL-XL 유전자인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양 공정에서, p53 유전자 산물의 발현 또는 기능을 저해하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 공정에서, 다핵화 전의 거핵구 세포에 대하여 이하의 (a)∼(c) 중 적어도 하나를 행하는 방법 :
   (a) 악토미오신 복합체 기능 저해제에 의한 처리;
   (b) ROCK 저해제에 의한 처리; 및
   (c) HDAC 저해제에 의한 처리.
5. 제4항에 있어서, 상기 ROCK 저해제가 Y27632이고, 상기 HDAC 저해제가 발프로산이고, 상기 악토미오신 복합체 기능 저해제가 블레비스타틴인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 공정을 37℃보다 높은 온도에서 행하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포는,
   조혈 전구 세포로부터 다핵화 전의 거핵구 세포에 이르는 분화 단계 중 어느 단계에서, 상기 세포에 있어서, 암 유전자와 이하의 (i)∼(iii) 중 어느 유전자를 강제 발현시키고, 상기 세포를 배양하여 증식시키는 공정에 의해 얻어진 것인 방법 :
   (i) p16 유전자 또는 p19 유전자의 발현을 억제하는 유전자;
   (ii) Ink4a/Arf 유전자의 발현을 억제하는 유전자; 및
   (iii) 폴리콤 유전자.
8. 제7항에 있어서, 상기 암 유전자로서 c-MYC 유전자를, 상기 (i)∼(iii)의 유전자로서 BMI1을 이용하는 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 조혈 전구 세포는, iPS 세포, ES 세포, 및, 제대혈, 골수혈 혹은 말초혈 유래의 조혈 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포에서 유래되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 혈액 세포 조성물.
11. 혈소판의 제조방법으로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 다핵화 거핵구 세포를 얻어, 이것을 배양하는 공정과,
    상기 다핵화 거핵구 세포의 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정을 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정은, 상기 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현을 억제하여, 또는, 상기 아포토시스 억제 유전자를 세포로부터 제거하여 행하는 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정은, 혈청 없이, 및/또는 피더 세포 없이 행하는 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정을, 1일 내지 15일간 행하는 방법.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정은, 37℃에서 행하는 방법.
16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포의 배양 공정에서, 배지에 ROCK 저해제 및/또는 악토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 ROCK 저해제가 Y27632이고, 상기 악토미오신 복합체 기능 저해제가 블레비스타틴인 방법.
18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 혈소판.
19. 제18항에 기재된 혈소판을 포함하는 혈액 제제.

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