CN117500913A - 血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法、血小板的制造方法、血小板制剂的制造方法及血液制剂的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于，提供能够提高血小板的产生量的方法。本发明的制造方法为血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法，所述制造方法包括下述多核化工序：在多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，使多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞，在所述多核化工序中，在抑制选自由芳香族烃受体(AhR)、Rho结合激酶(ROCK)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明(Harmine)存在下使所述多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞。
Description
技术领域
本发明涉及血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法、血小板的制造方法、血小板制剂的制造方法及血液制剂的制造方法。
背景技术
对手术、外伤等出血时、其它伴有血小板减少的患者给药血小板制剂。目前由通过献血而得到的血液制造血小板制剂。但是，由于人口构成的变化，献血量在减少，血小板制剂不足的情况令人担忧。
另外，献血者罹患细菌等的感染症时，有血液被细菌污染的可能性，因此存在因给药被细菌污染的血小板制剂而导致感染症的风险。因此，正在开发体外制造血小板的方法(非专利文献1)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Takayama N et.al,“Generation of functional platelets fromhuman embryonic stem cells in vitro via ES-sacs,VEGF-promoted structures thatconcentrate hematopoietic progenitors.”,2008,Blood,Vol.111,No.11,pages 5298-5306
发明内容
发明要解决的问题
但是，在通过上述非专利文献1的方法来制造给药于人的1次常规剂量的血小板时，存在需要巨大的制备槽的问题。
多核化前的巨核细胞(以下称为“多核化前巨核细胞”)在多核化后会产生血小板。具体而言，多核化前巨核细胞通过多核化而使细胞质膨大化。并且，得到的多核化巨核细胞(以下也称为“多核化巨核细胞”)通过膨大化的细胞质的断裂而产生血小板。因此，本发明人们尝试了通过促进多核化前的巨核细胞的多核化及与此相伴的膨大化来提高血小板产生能力。但是发现，即使发生多核化及膨大化，所得到的多核化巨核细胞的血小板产生能力也未必会提高。推测这是由于，通过促进巨核细胞的多核化及膨大化，血小板产生的最大能力提高，但是巨核细胞的分化或成熟未充分进行，其结果是血小板的释放能力并不提高。
因此，本发明的目的在于，提供血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明的制造方法(以下也称为“多核化巨核细胞的制造方法”)为血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法，其包括下述多核化工序：在多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，使多核化前的巨核细胞或其祖细胞多核化，诱导多核化巨核细胞，
在上述多核化工序中，在抑制选自由芳香族烃受体(AhR)、Rho结合激酶(ROCK)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)及肌球蛋白(myosin)2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明(Harmine)存在下，使上述多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞。
本发明的血小板的制造方法包括：
多核化工序，由多核化前的巨核细胞诱导多核化巨核细胞；和
血小板产生工序，由上述多核化巨核细胞产生血小板，
上述多核化工序通过上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法来实施。
本发明的血小板制剂的制造方法包括下述制剂工序：由血小板制造血小板制剂，
上述血小板的特征在于，通过上述本发明的血小板的制造方法而得到。
本发明的血液制剂的制造方法包括下述血液制剂工序：通过将血小板和其它成分混合而制造血液制剂，
上述血小板的特征在于，通过上述本发明的血小板的制造方法而得到。
本发明的细胞群为包含多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞的核相(nuclear phases)包含16N以上的多核化巨核细胞，
上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20％以上。
本发明的细胞群为包含多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞的核相包含32N以上的多核化巨核细胞，
上述细胞群中，上述32n以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
发明的效果
根据本发明，可以制造血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞。
附图说明
图1为示出实施例1中的多核化程度的图表。
图2为示出实施例1中每个巨核细胞的血小板产生量的图表。
图3A为示出参考例1A中的多核化程度及细胞大小的图表。
图3B为示出参考例1B中的多核化程度及细胞大小的图表。
图3C为示出实施例1中的多核化程度及细胞大小的图表。
图4为示出实施例1中的F1分级的细胞相位差图像的照片。
图5为示出实施例1中每个巨核细胞的血小板产生量的图表。
图6为示出实施例2中每个巨核细胞的血小板产生量的图表。
图7为示出实施例3中多核化巨核细胞的核相的图表。
具体实施方式
＜多核化巨核细胞的制造方法＞
本发明的多核化巨核细胞的制造方法如上所述为血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法，其包括下述多核化工序：在多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，使多核化前的巨核细胞或其祖细胞多核化，诱导多核化巨核细胞，在上述多核化工序中，在选自由芳香族烃受体(AhR)、Rho结合激酶(ROCK)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明(Harmine)存在下，使上述多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞。根据本发明，通过在抑制选自由AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明(Harmine)存在下使上述多核化前的巨核细胞多核化，从而能够增强所得到的多核化巨核细胞的血小板的产生能力。
本发明的血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法例如也可以称为分化推进或成熟度增加的多核化巨核细胞的制造方法。另外，根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法，可以促进巨核细胞的多核化，因此也可以称为巨核细胞的多核化促进方法或巨核细胞的核相增强方法。
本发明中，上述“增强”是指：与对照组相比，期望的参数显著增加。因此，上述增强也可以称为例如增加、提高或强化。
本发明的多核化巨核细胞的制造方法能够增强血小板的产生能力，其结果是例如能够增强血小板的产生量，因此例如也可以称为血小板产生或血小板产生量的增强方法、血小板产生或血小板产生量的提高方法、血小板产生或血小板产生量的改善方法等。本发明的多核化巨核细胞的制造方法例如为在体外实施的方法。
本发明中，“巨核细胞(巨核球)”是生物体内存在于骨髓中的最大的细胞，是指可释放出血小板的细胞、释放出血小板的细胞及具有同等功能的细胞。上述具有同等功能的细胞是指具有血小板产生能力的细胞。本发明中，巨核细胞可以是多核化(多倍体化)前的巨核细胞、即未成熟的巨核细胞或增殖期的巨核细胞，也可以是多核化后的巨核细胞(多核化巨核细胞)。作为具体例，上述巨核细胞例如可以为巨核系祖细胞(日语：前巨核芽球)、原巨核细胞、幼巨核细胞及成熟巨核细胞中的任意者。上述多核化后的巨核细胞所具有的染色体的组数(核相：N)超过2组即可，作为具体例，为4～64组(4N～64N)、4～32组(4N～32N)、8～64组(8～64N)、16～32组(16～32N)或16～64组(16～64N)。
上述巨核细胞的来源没有特别限制，可列举例如人及非人动物。上述非人动物可列举例如猴子、大猩猩、黑猩猩、狨猴等灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、兔子、绵羊、马、豚鼠等。
本发明中，上述巨核细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。上述巨核细胞源自人的情况下，上述细胞表面标记物可列举CD41a、CD42a及CD42b。即，上述巨核细胞是CD41a、CD42a及CD42b为阳性的细胞。上述巨核细胞源自人的情况下，上述细胞表面标志物例如可以为选自由CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131及CD203c组成的组中的至少1种。
上述多核化前的巨核细胞及上述多核化巨核细胞例如可以通过染色体的组数来确定。作为具体例，对象巨核细胞中染色体的组数(N)小于8N则可以将上述对象巨核细胞评价为多核化前的巨核细胞。另一方面，对象巨核细胞中染色体的组数(N)为8N以上、优选为16N以上的上述对象巨核细胞可以评价为多核化巨核细胞。上述染色体的组数(核相)可以基于后述实施例1的(3)来评价。
上述对象巨核细胞为多个、即上述对象巨核细胞群(细胞群)的情况下，上述对象巨核细胞群中染色体的组数(N)为8N以上的细胞的比例小于10％的情况下，可以将上述对象巨核细胞群评价为多核化前的巨核细胞群。另外，上述对象巨核细胞群中染色体的组数(N)为8N以上的细胞的比例为20％以上、21％以上、22％以上、23％以上、24％以上、25％以上、26％以上、27％以上、28％以上、29％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上或50％以上的情况下，可以将上述对象巨核细胞群评价为包含多核化巨核细胞的群。上述对象巨核细胞群例如为1×105～1×106个细胞。
本发明中，“血小板的产生能力”例如可以将供于血小板产生的巨核细胞数作为基准、以此时的血小板数形式来评价。上述巨核细胞可列举例如多核化前的巨核细胞、多核化巨核细胞、成熟巨核细胞等。上述“血小板的产生能力”例如可以通过使用处于大致相同的分化、成熟或培养阶段的巨核细胞并培养数量大致相同的巨核细胞来进行比较研究。作为具体例，上述“血小板的产生能力”例如可以以上述血小板产生工序后的血小板数(P)相对于上述血小板产生开始时的多核化巨核细胞数(M)的比(P/M比)来表示。该情况下，上述多核化巨核细胞的血小板产生能力提高例如是指：在AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性未受抑制且在哈尔明不存在下，以使上述多核化前的巨核细胞多核化而成的多核化巨核细胞的P/M比计，P/M比显著高。如后所述，使用永生化巨核细胞开始产生血小板时，可以将上述开始产生血小板时的多核化巨核细胞数(M)替换为解除了基因强制表达时的永生化巨核细胞数(M)并援引上述P/M比的说明。
本发明中，“血小板”是血液中的细胞成分之一，是指CD41a及CD42b为阳性的细胞成分。上述血小板例如不具有细胞核，另外，与上述巨核细胞相比，大小较小。因此，上述血小板与上述巨核细胞例如可以根据细胞核的有无和/或大小进行区分。已知：上述血小板在血栓形成和止血中发挥重要的作用、且还参与损伤后的组织再生、炎症的病理生理。另外已知：由于出血等而血小板被激活时，上述血小板在其膜上表达整联蛋白αIIBβ3(glycoprotein IIb/IIIa；CD41a与CD61的复合体)等细胞粘附因子的受体。另外，若上述血小板被激活，则血小板彼此聚集，从血小板中释放出的各种凝血因子使纤维蛋白凝固，由此形成血栓，实现止血。本发明中，上述血小板的来源与上述巨核细胞的来源相同。
本发明中，上述血小板的生理活性可以通过公知的方法来评价。上述血小板的生理活性例如可以使用针对特异性结合活化血小板膜上的整联蛋白αIIBβ3的PAC-1的抗体而评价活化血小板量。另外，上述血小板的生理活性例如也可以利用抗体来检测血小板活化标志物CD62p(P-选择素)而评价活化血小板量。上述血小板的生理活性例如还可以如下实施：使用流式细胞术，用针对活化非依赖性血小板标志物CD61或CD41的抗体进行打靶，然后检测抗PAC-1抗体、抗CD62p抗体的结合，由此而实施。这些血小板的生理活性的评价可以在腺苷二磷酸(ADP)存在下实施。
本发明中，上述血小板的生理活性的评价例如可以通过观察在ADP存在下与纤维蛋白原结合与否来评价。上述血小板与纤维蛋白原结合则发生在血栓形成初期必需的整联蛋白活化。进而，关于上述血小板的生理活性，例如可以如国际公开第2011/034073号的图6所示那样，通过可视化观察体内的血栓形成能力的方法来实施。
本发明中，“功能性高(生理活性高)”例如是指：与通过以往方法得到的血小板相比，通过上述任意方法测定的血小板生理活性显著高、有高的倾向、或与从生物体分离出的血小板的生理活性为同等水平。另外，上述“功能性高”例如是指：通过上述任意方法测定的血小板的生理活性与从生物体分离出的血小板的生理活性相比为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上。
例如，上述血小板的CD42b的表达率低或膜联蛋白V阳性率低时，可以将上述血小板评价为劣化或异常(以下也统称为“劣化”)、即上述血小板的生理活性低。因此，所产生的血小板中劣化的血小板的比例越低，例如越可以将上述所产生的血小板评价为生理活性高。另外，劣化的血小板例如不具有充分的血栓形成功能(凝血功能)及止血功能，临床有用性低。
本发明中，上述“血小板劣化”例如是指上述血小板表面的CD42b(GPIbα)减少。即，劣化的血小板例如包括CD42b的表达下降的血小板及CD42b的胞外区域因脱落(shedding)反应而被切除的血小板。如果上述血小板表面的CD42b消失，则上述血小板例如无法与血管性血友病因子(von Willebrand factor：VWF)缔合，结果是上述血小板丧失凝血功能。上述血小板的劣化例如可以以上述血小板分级中的、相对于CD42b阳性率(或CD42b阳性颗粒数)的CD42b阴性率(或CD42b阴性颗粒数)为指标来进行评价。作为具体例，相对于CD42b阳性率的CD42b阴性率越高或相对于CD42b阳性颗粒数的CD42b阴性颗粒数越多，越可以将上述血小板评价为劣化。上述CD42b阳性率是指上述血小板分级所含的血小板中的、抗CD42b抗体能结合的血小板的比例。另外，上述CD42b阴性率是指血小板分级中所含的血小板中的、抗CD42b抗体不能结合的血小板的比例。
本发明中“异常的血小板”例如是指：作为带负电的磷脂的磷脂酰丝氨酸从脂质双层的内侧露出到外侧的血小板。已知在生物体内，磷脂酰丝氨酸随着血小板的活化而在表面上露出，在此结合多种凝血因子而将凝血级联反应放大。另一方面，上述异常的血小板例如由于大量的磷脂酰丝氨酸总是在表面上露出，因此如果将上述异常的血小板给药于患者则例如引发过度的凝血反应，有可能会引起弥散性血管内凝血综合征等严重的病情。已知膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合，因此上述血小板表面上的磷脂酰丝氨酸例如可以以荧光标记的膜联蛋白V的结合量为指标使用流式细胞仪来检测。因此，上述异常的血小板的量例如可以以上述血小板分级中的膜联蛋白V阳性率、即膜联蛋白V所结合的血小板的比例或数量来进行评价。作为具体例，膜联蛋白V阳性率越高或膜联蛋白V颗粒数越多，越可以将对象血小板评价为异常的血小板多。
本发明中，上述多核化前的巨核细胞例如可以由与巨核细胞相比未分化的细胞(“也称为多核化前的巨核细胞的祖细胞”)来诱导。因此，本发明的多核化巨核细胞的制造方法例如在上述多核化工序之前可以包括由与巨核细胞相比未分化的细胞来诱导多核化前的巨核细胞的巨核细胞诱导工序。上述巨核细胞诱导工序中使用的培养基、培养条件等例如可以援引后述的多核化工序的说明。
上述“与巨核细胞相比未分化的细胞”是指具有向上述巨核细胞分化的能力的细胞。作为具体例，上述与巨核细胞相比未分化的细胞可列举例如造血干细胞、造血祖细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞-红细胞祖细胞(megakaryocyte-erythroid progenitor：MEP)、巨核细胞祖细胞等。上述与巨核细胞相比未分化的细胞例如可以从骨髓、脐带血、外周血等中分离，也可以由ES细胞(胚胎干细胞、embryonic stem cells)、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells、iPS细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖干细胞、体干细胞、胚胎癌性细胞等多能细胞或多能干细胞诱导。
上述巨核细胞的诱导方法没有特别限制，可以通过公知的诱导方法实施。作为具体例，上述巨核细胞的诱导方法可列举例如国际公开第2011/034073号、国际公开2012/157586号等中记载的方法。作为具体例，上述巨核细胞诱导工序例如可以使上述与巨核细胞相比未分化的细胞中强制表达癌基因及多梳基因。由此，上述巨核细胞诱导工序中例如可以得到与多核化前的巨核细胞相当且无限增殖的永生化巨核细胞。进而，例如通过解除上述永生化巨核细胞的上述强制表达，上述永生化巨核细胞可以被诱导为多核化巨核细胞并产生血小板。因此，上述永生化巨核细胞与多核化前的巨核细胞相当。另外，上述巨核细胞诱导工序中例如可以使上述巨核细胞祖细胞强制表达凋亡抑制基因。由此上述巨核细胞诱导工序中可以得到上述永生化巨核细胞。进而，在后述的血小板产生工序中，例如通过解除上述永生化巨核细胞的上述强制表达，从而上述永生化巨核细胞成熟并产生上述血小板。
上述巨核细胞诱导工序中，例如，可以强制表达上述癌基因、上述多梳基因及上述凋亡抑制基因。在此情况下，上述癌基因、上述多梳基因及上述凋亡抑制基因的强制表达可以同时进行，也可以独立地进行。作为具体例，上述巨核细胞诱导工序中，可以在强制表达上述癌基因及上述多梳基因后解除上述强制表达、再强制表达上述凋亡抑制基因，还可以强制表达上述癌基因、上述多梳基因及上述凋亡抑制基因，也可以强制表达上述癌基因及上述多梳基因，进而表达上述凋亡抑制基因。由此，上述巨核细胞诱导工序中，能够得到上述永生化巨核细胞。进而，在后述的血小板产生工序中，例如通过解除上述永生化巨核细胞的上述强制表达而使上述永生化巨核细胞成熟、产生上述血小板。
对于上述巨核细胞诱导工序，例如，从能够改善各基因的导入效率的方面考虑，优选包括如下工序：第1表达工序，使由与上述巨核细胞相比未分化的细胞强制表达癌基因及多梳基因；第2表达工序，使上述未分化的细胞强制表达Bcl-xL基因等凋亡抑制基因；及解除工序，解除全部上述强制表达。如上所述、通过解除上述强制表达，例如由上述永生化巨核细胞诱导多核化巨核细胞并产生上述血小板。因此，上述解除工序也可以称为后述的血小板产生工序。
各基因的强制表达及强制表达的解除例如可以通过国际公开第2011/034073号、国际公开第2012/157586号、国际公开第2014/123242号或下述参考文献1中记载的方法等公知的方法、或基于这些的方法而实施。作为具体例，各基因的强制表达及强制表达的解除例如可以使用药剂应答性的基因表达诱导系统来实施。上述基因表达诱导系统可列举例如Tet-on(注册商标)系统、Tet-off(注册商标)系统等。使用上述Tet-on系统时，例如，在上述强制表达的工序中，在四环素类抗生素、多西环素等诱导基因表达的药剂存在下实施培养，在解除上述强制表达的工序中，在上述药剂不存在的情况下实施上述培养。
参考文献1：Nakamura S et al,“Expandable megakaryocyte cell linesenable clinically applicable generation of platelets from human inducedpluripotent stem cells.”,Cell Stem Cell,2014,vol.14,No.4,pages 535-548
本发明中，“癌基因”是指可在生物体内诱导细胞的癌变的基因，可列举例如c-MYC、N-MYC、L-MYC等MYC家族基因、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-kit(CD117)、PDGFR(血小板生长因子受体)、Abl(Abelson murine leukemia viral oncogenehomolog，埃希尔森小鼠白血病病毒癌基因同源物)等蛋白激酶家族基因等。
本发明中，“多梳基因”是指：已知负调节CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A、INK4a/ARF)而发挥避免细胞老化作用的基因(下述参考文献2～4)。作为具体例，上述多梳基因可列举例如BMI1(多梳复合蛋白BMI-1、多梳家族环指蛋白4(PCGF4)、环指蛋白51(RNF51))、Mel18(多梳家族环指蛋白2)、Ring(环指蛋白)1a/b、Phc(Polyhomeotichomolog，多聚同源同系物)1/2/3、Cbx(色素框)2/4/6/7/8、Ezh2(Zeste 2多梳抑制复合物2亚基的增强子)、Eed(胚胎外胚层发育蛋白)、Suz12(SUZ12多梳抑制复合物2亚基)、HADC(组蛋白脱乙酰基酶类)、Dnmt(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶)1/3a/3b等。
参考文献2：小黑秀行等、“ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御、再生医疗、2007年、第6卷、第4号、26-32页
参考文献3：Jesus Gil et.al,“Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumoursuppressor locus:all for one or one for all”,Nature Reviews Molecular CellBiology,2007,vol.7,pages 667-677
参考文献4：Soo-Hyun Kim et.al.,“Absence of p16INK4a and truncation ofARF tumor suppressors in chickens”,PNAS,2003,vol.100,No.1,pages 211-216
本发明中，“凋亡抑制基因”是指具有能够抑制细胞凋亡的功能的基因，可列举例如BCL2(B淋巴细胞瘤-2)、Bcl-xL(大B细胞淋巴瘤)、存活蛋白(Survivin，含杆状病毒IAP重复序列蛋白5)、MCL1(BCL2家族凋亡调节剂)等。
本发明的多核化巨核细胞的制造方法可以包括：在上述多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，使上述多核化前的巨核细胞增殖的增殖工序。该情况下，上述增殖工序中，不抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性且在哈尔明(Harmine)不存在下，使上述多核化前的巨核细胞增殖。由此，上述增殖工序能够使上述多核化前的巨核细胞在维持多核化前的状态的情况下增殖。具体而言，上述增殖工序中，在上述多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，培养多核化前巨核细胞，使上述多核化前巨核细胞增殖。上述多核化前的巨核细胞的生长因子可以存在于培养液中，也可以存在于上述多核化前巨核细胞内。另外，上述增殖工序中，可以通过不向上述培养液添加抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性的物质及哈尔明，从而在不抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性且在哈尔明不存在下实施增殖。上述增殖工序中使用的培养基、培养条件等例如可以援引后述的多核化工序的说明。
作为上述多核化前的巨核细胞的生长因子，可列举例如干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)等。
上述多核化前的巨核细胞的生长因子的浓度没有特别限制，例如，可以根据上述生长因子的种类及有效浓度适当设定。上述生长因子为SCF或TPO的情况下，上述生长因子的浓度例如为0.1～1000ng/ml、或1～200ng/ml。
上述增殖工序的培养期例如可以设为足以得到期望细胞数的多核化前巨核细胞的时间。具体而言，上述增殖工序的培养期例如为1天以上，作为具体例，为1～20天、1～15天、1～10天、1～5天、2～5天、或2～4天。
使用上述永生化巨核细胞作为上述多核化前巨核细胞时，上述永生化巨核细胞如果表达上述癌基因及上述多梳基因或者表达上述癌基因、上述多梳基因及上述凋亡抑制基因，则上述永生化巨核细胞能够在维持多核化前的状态的情况下增殖。因此，使用上述永生化巨核细胞的情况下，可以将上述第1表达工序和/或上述第2表达工序称为增殖工序。另外，上述癌基因、上述多梳基因和/或上述凋亡抑制基因所编码的蛋白质、即由上述癌基因、上述多梳基因和/或上述凋亡抑制基因表达的蛋白质也可以称为上述多核化前的巨核细胞的生长因子。使用上述永生化巨核细胞作为上述多核化前巨核细胞的情况下，上述增殖工序可以援引关于上述永生化巨核细胞的巨核细胞诱导工序的说明。
接着，本发明的多核化巨核细胞的制造方法中，在上述多核化工序中在上述多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，由上述多核化前的巨核细胞来诱导多核化巨核细胞。另外，上述多核化工序中，在抑制选自由AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明存在下，使上述多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞。具体而言，上述多核化工序中，在上述多核化前的巨核细胞的生长因子以及选自由AhR活性抑制物质、ROCK活性抑制物质、DYRK活性抑制物质及肌球蛋白2活性抑制物质组成的组中的至少1种和哈尔明存在下培养上述多核化前巨核细胞，诱导上述多核化巨核细胞。上述多核化前的巨核细胞的生长因子可以存在于培养液中，也可以存在于上述多核化前巨核细胞内。上述AhR活性抑制物质、上述ROCK活性抑制物质、上述DYRK活性抑制物质、上述肌球蛋白2活性抑制物质和/或哈尔明例如包含于上述多核化前巨核细胞的培养基。上述多核化工序中会诱导巨核细胞的膨大化，因此也可以称为例如膨大化工序。上述多核化前的巨核细胞的生长因子、上述AhR活性抑制物质、上述ROCK活性抑制物质、上述DYRK活性抑制物质和/或上述肌球蛋白2活性抑制物质为蛋白质或核酸分子时，也可以在上述多核化工序中通过脂质转染、电穿孔等而导入到上述多核化前巨核细胞中。
上述多核化工序中，可以抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2中的任一种活性，也可以抑制两种以上活性。在后者的情况下，活性受抑制的对象的组合可以为任意组合，从促进多核化能力或提高血小板产生能力的角度出发，优选AhR与肌球蛋白2的组合、AhR与ROCK与肌球蛋白2的组合、AhR与DYRK与肌球蛋白2的组合、或AhR与ROCK与DYRK与肌球蛋白2的组合。因此，上述多核化工序优选在抑制AhR及肌球蛋白2的活性且在哈尔明存在下实施，或者优选在抑制AhR、ROCK及肌球蛋白2的活性且在哈尔明存在下实施；或者优选在抑制AhR、DYRK及肌球蛋白2的活性且在哈尔明存在下实施，或者优选在抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性且在哈尔明存在下实施。
上述AhR是指芳香族烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor)。上述AhR通常存在于细胞质，随着活化而进入核内而发挥转录活性。
上述多核化工序中，AhR活性抑制是指：与上述AhR活性抑制物质不存在下相比，AhR的活性下降。上述AhR的活性例如可以以AhR进入核内为指标来测定。关于上述AhR的活性，例如可以利用市售的AhR蛋白活性测定试剂盒，作为具体例，可列举核内受体测试试剂盒(PURACYP公司制)等。本发明中，上述活性抑制例如也可以称为活性的抑制、活性的下降、活化的抑制、活化的防止等。
上述AhR为属于Per/ARNT/SIM(PAS)家族的转录因子。AhR例如在未结合配体的状态下无活性，如果结合芳香族烃化合物来作为配体则进入核内。并且，在上述进入核内后，上述AhR例如与ARNT(Ahr Nuclear Translocator，芳香烃受体核转位因子)形成杂二聚体，与异源响应元件(Xenobiotic Responsive Element(XRE)、也称为DRE)结合并对转录进行活化。
上述AhR抑制剂没有特别限制，可列举例如AhR拮抗剂、可抑制AhR表达的表达抑制核酸分子等。上述AhR拮抗剂没有特别限制，可列举例如4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(SR1)、α-萘黄酮(CAS 604-59-1)、1,4-二羟基蒽醌、1,5-二羟基蒽醌、1,8-二羟基蒽醌、高良姜素(CAS 548-83-4)、白藜芦醇、2-甲基-2H-吡唑-3-甲酸(2-甲基-4-邻甲苯偶氮-苯基)-酰胺(CH-223191)、N-(2-(3H-吲哚-3-基)乙基)-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)-7H-嘌呤-6-胺(GNF351)、2-(29-氨基-39-甲氧基苯基)-氧杂萘-4-酮(PD98059)、(Z)-3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)甲基茚基]-2-吲哚酮(TSU-16)、6,2’,4’-三甲氧基黄酮(TMF)、3’,4’-二甲氧基黄酮(DMF)等。另外，上述AhR拮抗剂例如可以为国际公开第2012/015914号中作为AhR拮抗剂而记载的化合物。上述AhR表达抑制核酸分子例如可列举靶向编码上述AhR的mRNA的siRNA、miRNA等表达抑制核酸分子等。针对上述AhR的表达抑制核酸分子例如可以基于数据库中登录的AhR的mRNA的碱基序列来适当设定。作为具体例，人AhR的mRNA例如可列举Genbank中以登录号：NM_001621登录的碱基序列所构成的多核苷酸。上述AhR活性抑制物质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
上述多核化工序中，上述AhR抑制剂的浓度没有特别限制，可以根据化合物的种类及其有效浓度来适当确定。上述AhR抑制剂的浓度可列举例如以下浓度。
SR1：200nmmol/L以上且小于1000mmol/L
CH-223191：0.2μmol/l以上且小于4μmol/l
GNF351：20nmol/l以上且小于300nmol/l、20nmol/l以上且小于1000nmol/l
TMF：2.5μmol/l以上且小于40μmol/l
DMF：2.5μmol/l以上且小于40μmol/l
上述ROCK是指Rho结合激酶(Rho-associated coiled-coil forming kinase(ROCK))。
上述多核化工序中，ROCK活性抑制例如是指：与上述ROCK活性抑制物质不存在下相比，使ROCK活性下降。上述ROCK活性例如可以以ROCK催化的底物磷酸化为指标来测定。上述ROCK活性例如可以使用市售的ROCK蛋白活性测定试剂盒，作为具体例，可列举ROCK活性测定试剂盒(96-Well ROCK Activity Assay Kit、Cell Bioloabs公司制)等。本发明中，上述活性抑制例如也可以称为活性的抑制、活性的下降、活化的抑制、活化的防止等。
上述ROCK抑制剂可列举例如ROCK拮抗剂、可抑制ROCK的表达的表达抑制核酸分子等。上述ROCK抑制剂可列举例如(R)-(+)-反-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺(Y-27632)、4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯甲酰胺(Y-39983)、法舒地尔盐(Fasudil(HA1077)盐酸盐)、4-氟-5-[[(2S)-六氢-2-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基]磺酰基]-异喹啉(Ripasudil)、2-(3-(4-((1H-吲唑-5-基)氨基)喹唑啉-2-基)苯氧基)-N-异丙基乙酰胺(SLx-2119)、N-[(3-羟基苯基)甲基]-N’-[4-(4-吡啶基)-2-噻唑基]脲二盐酸盐(RKI-1447)、6-氯-N4-[3,5-二氟-4-[(3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基]苯基]-2,4-嘧啶二胺(TC-S 7001,Azaindole 1)、N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二噁烷-2-甲酰胺(SR-3677)、星形孢菌素(Staurosporine)、(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪(H-1152)、rac-(2R)-2-(二甲基氨基)-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-6-基)-2-(噻吩-3-基)乙酰胺(AR-12286)、N-(1-{[4-(甲硫基)苯基]甲基}哌啶-3-基)-1H-吲唑-5-胺(INS-117548)等。上述ROCK的表达抑制核酸分子可列举例如靶向编码上述ROCK的mRNA的siRNA、miRNA等表达抑制核酸分子等。针对上述ROCK的表达抑制核酸分子例如可以基于数据库中登录的ROCK的mRNA的碱基序列适当设定。作为具体例，人ROCK1的mRNA可列举例如Genbank中以登录号：NM_005406登录的碱基序列所构成的多核苷酸。另外，人ROCK2的mRNA可列举例如Genbank中以登录号：NM_004850登录的碱基序列所构成的多核苷酸。上述ROCK活性抑制物质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
上述多核化工序中，上述ROCK抑制剂的浓度没有特别限制，可以根据化合物的种类及其有效浓度适当确定。上述ROCK活性抑制物质为Y-39983的情况下，上述ROCK活性抑制物质的浓度例如为1×10-8～1×10-3mol/l，优选为1×10-7～1×10-5mol/l。
上述DYRK是指双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(Dual Specificity TyrosinePhosphorylation Regulated Kinase)。
上述DYRK活性抑制中，作为对象的DYRK可列举例如DYRK1A、DYRK1B、DYRK2等，优选为DYRK1A。作为一例，以下列举抑制DYRK1A活性的情况作为例子来进行说明。
上述多核化工序中，上述DYRK1A活性抑制是指：与上述DYRK1A活性抑制物质不存在下相比，DYRK1A的活性下降。上述DYRK1A的活性例如可以以使用DYRK1A蛋白和底物的测定系统中底物的磷酸化为指标来进行测定。作为前者，可利用例如市售的DYRK1A蛋白活性测定试剂盒，作为具体例，可列举DYRK1A Kinase Enzyme System(Promega公司制、Cat.No.VA7423、VA7424)等。作为后者，可以参照例如下述参考文献5。本发明中，上述活性抑制例如也可以称为活性的抑制、活性的下降、活化的抑制、活化的防止等。
参考文献5：Isao Kii et.al.,“Selective inhibition of the kinase DYRK1Aby targeting its folding process”,Nat.Commun.,2016,vol.7,article number 11391
上述DYRK1A活性抑制物质没有特别限制，可列举例如抑制上述DYRK1A的活性或表达的化合物、蛋白质、核酸分子等。上述DYRK1A活性抑制化合物可以使用例如公知的DYRK1A活性抑制化合物(DYRK1A抑制剂)。作为具体例，上述DYRK1A活性抑制化合物(DYRK1A拮抗剂)可列举例如Harmine(哈尔明、7-甲氧基-1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚、Cas No.442-51-3)、INDY((1Z)-1-(3-乙基-5-羟基-2(3H)-苯并噻唑亚基)-2-丙酮、Pubchem No.：69538603)、GSK626616((5Z)-2-[(2,6-二氯苯基)氨基]-5-(6-喹喔啉亚甲基)-4(5H)-噻唑酮、Cas No.1025821-33-3)、TBB(酪蛋白激酶2抑制剂1、4,5,6,7-四溴苯并噻唑、CasNo.17374-26-4)、AZ191(N-[2-甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基]-4-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)-2-苯胺基嘧啶、Cas No.1594092-37-1)、Mrik-IN-1(TC-S 7004、N-[2-氯-5-[[[(3-氯苯基)甲基]氨基]羰基]苯基]-7,8-二氢-2-甲氧基-7-氧代吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺、Cas No.1386979-55-0)、EHT5372(9-((2,4-二氯苯基)氨基)噻唑并[5,4-f]喹唑啉-2-甲酰亚氨酸甲酯、Cas No.1425945-60-3)、GNF4877((R)-1-(3-(3-氨基-6-(2-氟-5-异丙氧基苯基)吡嗪-2-甲酰胺基)吡啶-4-基)哌啶-3-甲酸、Cas No.2041073-22-5)、FINDY((5Z)-5-[[4-甲氧基-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙炔基]苯基]亚甲基]-2-三氧代-4-噻唑烷酮、Cas No.1507367-37-4)、ML351(5-(甲基氨基)-2-(1-萘基)-4-噁唑甲腈、CasNo.847163-28-4)、CLK-IN-T3(N-(6-(3,5-二叔丁基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)-4-(2-甲基-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代丙烷-2-基)苯甲酰胺、Cas No.2109805-56-1)、酪蛋白激酶2抑制剂IX.IQA(5-氧代-5,6-二氢吲哚并[1,2-a]喹唑啉-7-乙酸、CasNo.391670-48-7)、蛋白激酶抑制剂1((E)-5-((2-氧代-6’-(哌嗪-1-基)-1,2-二氢-[3,3’-二吡啶]-5-基)亚甲基)噻唑烷-2,4-二酮盐酸盐、Cas No.1365986-44-2)、Leucettine L41((5Z)-5-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-3,5-二氢-2-(苯基氨基)-4H-咪唑-4-酮、Cas No.1112978-84-3)等。上述DYRK1A活性抑制化合物例如可以不包括哈尔明。如上所述，上述多核化工序在哈尔明存在下实施。因此，上述DYRK1A活性抑制化合物优选除了上述哈尔明以外还使用除上述哈尔明以外的化合物，作为具体例，可列举AZ191。上述DYRK1A活性抑制蛋白质可列举例如DYRK1A的显性失活型(DN)蛋白质。作为具体例，人DYRK1A的DN蛋白质可列举例如第188位的赖氨酸(K)被精氨酸(R)置换而成的突变蛋白。上述DYRK1A表达抑制核酸分子可列举例如靶向编码上述DYRK1A的mRNA的siRNA、miRNA等表达抑制核酸分子等。针对上述DYRK1A的表达抑制核酸分子例如可以基于数据库中登录的DYRK1A的mRNA的碱基序列来适当设定。作为具体例，人DYRK1A的mRNA可列举例如Genbank中以登录号：NM_001396、NM_101395、NM_130436、NM_130437、NM_130438、NM_001347721、NM_001347722或NM_001347723登录的碱基序列所构成的多核苷酸。上述DYRK1A活性抑制物质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
上述DYRK1A活性抑制物质的浓度没有特别限制，例如，可以根据上述DYRK1A活性抑制物质的种类及有效浓度适当设定。上述DYRK1A活性抑制物质为哈尔明的情况下，上述DYRK1A活性抑制物质的浓度例如为1×10-8～1×10-3mol/l，优选为1×10-6～1×10-4mol/l。上述DYRK1A活性抑制物质为AZ191的情况下，上述DYRK1A活性抑制物质的浓度例如为1×10-9～1×10-3mol/l，优选为1×10-7～1×10-5mol/l。
上述肌球蛋白2为具有ATPase活性的在肌动蛋白上运动的蛋白质，是指由2条重链和各重链分别附带的2条轻链(合计4条)构成的复合体。
上述多核化工序中，肌球蛋白2活性抑制是指：与上述肌球蛋白2活性抑制物质不存在下相比，肌球蛋白2的ATPase活性下降。上述肌球蛋白2的活性例如可以以肌球蛋白2所释放出的磷酸为指标来测定。关于上述肌球蛋白2的活性，例如可以利用市售的肌球蛋白2蛋白的活性测定试剂盒。本发明中，上述活性抑制例如也可以称为活性的抑制、活性的下降、活化的抑制、活化的防止等。
上述肌球蛋白2抑制剂可列举例如肌球蛋白2拮抗剂、可抑制肌球蛋白2的表达的表达抑制核酸分子、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂等。上述肌球蛋白2抑制剂可列举例如3a-羟基-6-甲基-1-苯基-2,3-二氢吡咯并[2,3-b]喹啉-4-酮(Blebbistatin，布比他汀)、CK1122534、Omecamtiv mecarbil(4-[[2-氟-3-[(6-甲基吡啶-3-基)氨甲酰基氨基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸甲酯)、氨酰胺(Ammosamides)A&B、CTK2018448、木脂素(Manassantin B)((1R,2R)-1-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-[4-[(2S,3R,4R,5S)-5-[4-[(1R,2R)-1-(3,4-二甲氧基苯基)-1-羟基丙烷-2-基]氧-3-甲氧基苯基]-3,4-二甲基氧杂环戊烷-2-基]-2-甲氧基苯氧基]丙-1-醇)等。上述MLCK抑制剂可列举例如ML7(六氢-1-[(5-碘代-1-萘基)磺酰基]-1H-1,4-二氮杂)、ML9(1-(5-氯萘-1-磺酰基)-1H-六氢-1,4-二氮杂/>)等。上述肌球蛋白2的表达抑制核酸分子可列举例如靶向编码上述肌球蛋白2或肌球蛋白轻链激酶的mRNA的siRNA、miRNA等表达抑制核酸分子等。针对上述肌球蛋白2的表达抑制核酸分子例如可以基于数据库中登录的构成肌球蛋白2的重链或轻链、或者肌球蛋白轻链激酶的mRNA的碱基序列来适当设定。作为具体例，构成人肌球蛋白2的重链的mRNA可列举例如在Genbank中以登录号：NM_005963、NM_001100112、NM_017534、NM_002470、NM_017533、NM_002147、NM_002471、NM_000257、NM_002472、NM_002473、NM_001256012、NM_002474、NM_001382347、NM_003802、NM_001145809、或NM_014981登录的碱基序列所构成的多核苷酸。构成人肌球蛋白2的轻链的mRNA可列举例如在Genbank中以登录号：NM_079420、NM_000432、NM_000258、NM_002476、NM_001363650、NM_021019、NM_021223、NM_006097、NM_138403、或NM_001324458登录的碱基序列所构成的多核苷酸。人肌球蛋白轻链激酶的mRNA可列举例如Genbank中以登录号：NM_001321309、NM_053025、NM_053026、NM_053027、NM_053028、NM_053031、NM_053032、NM_033118、NM_053032、或NM_18249登录的碱基序列所构成的多核苷酸。上述肌球蛋白2活性抑制物质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
上述多核化工序中，上述肌球蛋白2抑制剂的浓度没有特别限制，可以根据化合物的种类及其有效浓度适当确定。上述肌球蛋白2活性抑制物质为布比他汀的情况下，上述肌球蛋白2活性抑制物质的浓度例如为1×10-8～1×10-3mol/l，优选为1×10-6～1×10-4mol/l。
上述多核化工序中，上述哈尔明的浓度例如为1×10-8～1×10-3mol/l，优选为1×10-6～1×10-4mol/l。
上述多核化工序中，AhR、ROCK、DYRK和/或肌球蛋白2活性抑制与哈尔明的共存可以同时实施，也可以在不同时期实施，优选同时实施。即，由上述多核化前巨核细胞向上述多核化巨核细胞的诱导优选在下述状态下实施：进行了抑制选自由AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性，并且进行了哈尔明的共存的状态。
上述多核化前的巨核细胞为永生化巨核细胞的情况下，上述多核化工序例如可以如下实施。具体而言，由上述癌基因、上述多梳基因和/或上述凋亡抑制基因表达的蛋白质如上所述作为上述永生化巨核细胞中的多核化前的巨核细胞的生长因子起作用。因此，在使用上述永生化巨核细胞的情况下，例如，通过在维持上述癌基因、上述多梳基因和/或上述凋亡抑制基因的强制表达、抑制选自由AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性并且在哈尔明存在下培养上述永生化巨核细胞，可诱导多核化巨核细胞。该情况下，上述多核化工序可以如下实施：在上述永生化巨核细胞的培养中，将包含上述永生化巨核细胞的培养基交换成例如包含选自由上述AhR抑制剂、上述ROCK抑制剂、上述DYRK抑制剂及上述肌球蛋白2抑制剂组成的组中的至少1种且包含哈尔明的培养基；或者，向包含上述永生化巨核细胞的培养基中添加选自由上述AhR抑制剂、上述ROCK抑制剂、上述DYRK抑制剂及上述肌球蛋白2抑制剂组成的组中的至少1种，且添加哈尔明。上述添加或交换例如可以实施1次，也可以实施2次以上。
上述多核化工序中的培养基没有特别限制，例如可列举适于上述巨核细胞或由巨核细胞产生血小板的公知的培养基和依据其的培养基。作为具体例，上述培养基例如可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。上述基础培养基例如可列举IMDM培养基、Medium 199培养基、伊戈尔最低必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal(注册商标)培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)等单一培养基或它们的混合培养基。上述培养基例如可以包含血清或血浆，也可以是不包含这些的无血清培养基，优选无血清培养基。通过使用无血清培养基作为上述多核化工序的培养基，本发明的多核化巨核细胞的制造方法例如可以提高上述多核化前的巨核细胞至多核化巨核细胞的多核化的程度。上述无血清培养基可列举例如StemSpan ACF(StemCell Technologies公司制、Cat.No.:9855)、Stemline 2(Sigma Aldrich公司制、Cat.No.:S0192)等。上述血清和血浆的来源优选为与上述巨核细胞的来源相同的来源。作为具体例，上述巨核细胞源自人时，上述血清和血浆优选分别源自人。通过使上述巨核细胞与血清的来源相同，本发明的制造方法例如可以在上述多核化工序中进一步促进上述巨核细胞的多核化。
上述培养基例如可以包含其它成分。上述其它成分没有特别限制，例如可列举白蛋白、胰岛素、运铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、单硫代甘油(MTG)、脂质、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、抗坏血酸、肝素、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。上述其它成分例如可以是1种，也可以是2种以上。上述细胞因子例如是促进血细胞系细胞的分化的物质，作为具体例，可列举血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促血小板生成素(TPO)、各种TPO样作用物质、干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF)、ITS(胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸盐)补充剂、ADAM抑制剂、FLT抑制剂、WNT抑制剂等。上述培养基例如优选包含血清、胰岛素、运铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、抗坏血酸、TPO的IMDM培养基。上述培养基例如可以进一步包含SCF，也可以进一步包含肝素。上述其它成分的浓度没有特别限制。上述TPO的浓度例如为约10ng/ml～约200ng/ml、约50ng/ml～约100ng/ml。上述SCF的浓度例如为约10ng/ml～约200ng/ml、约50ng/ml。上述肝素的浓度例如为约10U/ml～约100U/ml、约25U/ml。上述培养基例如可以进一步包含佛波酯(例如，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯；PMA)。
上述多核化工序中，上述开始时的多核化前的巨核细胞的细胞密度没有特别限制。上述细胞密度的下限例如为1×105个细胞/ml、2×105个细胞/ml、3×105个细胞/ml、4×105个细胞/ml。上述细胞密度的上限没有特别限制，例如为4×105个细胞/ml、6×105个细胞/ml、8×105个细胞/ml。上述细胞密度的范围例如为1×105个细胞/ml～8×105个细胞/ml、1×105个细胞/ml～8×105个细胞/ml、1×105个细胞/ml～5×105个细胞/ml、2×105个细胞/ml～8×105个细胞/ml、3×105个细胞/ml～6×105个细胞/ml、4×105个细胞/ml～6×105个细胞/ml，从可以促进多核化或可以提高血小板的产生的角度出发，优选为1×105个细胞/ml～8×105个细胞/ml、或1×105个细胞/ml～5×105个细胞/ml。上述细胞密度例如可以通过将上述多核化前的巨核细胞的细胞数除以(除)悬浮上述多核化前的巨核细胞的培养基的体积来计算。
上述多核化工序中的培养条件没有特别限制，可以采用上述巨核细胞的通常的培养条件。作为具体例，培养温度例如为约35～约42℃、约36～约40℃、约37～约39℃。CO2浓度例如为约5～约15％。O2浓度例如为约15～约25％、约20％。
上述多核化工序的培养期例如可以设为直至上述多核化前的巨核细胞发生多核化的时间。上述多核化工序的培养期可以根据培养中的巨核细胞中多核化巨核细胞所占的比例来适当设定。上述多核化工序的培养期例如优选设为：培养中的巨核细胞中8N以上的多核化巨核细胞所占的比例达到15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上、21％以上、22％以上、23％以上、24％以上、25％以上、26％以上、27％以上、28％以上、29％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、或60％以上的时间。作为具体例，上述多核化工序的培养期例如为0～20天、1～15天。上述巨核细胞中多核化巨核细胞所占的比例例如可以取一部分培养中的巨核细胞并基于后述的实施例1的(3)来计算。
上述多核化工序中，上述多核化前的巨核细胞的培养例如可以在饲养细胞上实施，也可以在无饲养细胞下实施。上述多核化前的巨核细胞例如可以悬浮培养，因此可以在上述饲养细胞下培养。上述饲养细胞是指：为了提供欲使其增殖或分化的目标细胞(作为目标的细胞)的培养所需的环境而与上述目标细胞共培养的细胞。上述饲养细胞为能够与上述目标细胞相区别的细胞即可，可以为与上述目标细胞源自同种的细胞，也可以为源自不同种的细胞。上述饲养细胞例如可以为为了使其以不增殖而利用抗生素、抗癌剂、γ射线照射等处理后的细胞。
上述多核化工序后中，本发明的制造方法包含多核化巨核细胞。上述多核化工序后的多核化巨核细胞例如可以仅由多核化巨核细胞构成，也可以包含其它细胞。后者的情况下，上述多核化工序后的多核化巨核细胞例如也可以称为包含多核化巨核细胞的细胞群。上述多核化巨核细胞例如可以为8N以上的多核化巨核细胞，可以为16N以上的多核化巨核细胞，可以为32N以上的多核化巨核细胞。上述多核化工序后的多核化巨核细胞例如包含上述8N以上的多核化巨核细胞、上述16N以上的多核化巨核细胞和/或上述32N以上的多核化巨核细胞。根据本发明的制造方法，例如可以增强上述16N以上的多核化巨核细胞及上述32N以上的多核化巨核细胞的比例。
上述多核化巨核细胞包含核相为8N以上的多核化巨核细胞的情况下，上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)的下限值例如为15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上、21％以上、22％以上、23％以上、24％以上、25％以上、26％以上、27％以上、28％以上、29％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、或60％以上。上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)的上限值例如为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、59％以下、58％以下、57％以下、56％以下、55％以下、54％以下、53％以下、52％以下、51％以下、50％以下、49％以下、48％以下、47％以下、或46％以下。上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)例如为15～90％、20～90％、25～90％、30～90％、35～90％、40～90％、45～90％、50～90％、55～90％、60～90％、15～85％、15～80％、15～75％、15～70％、15～65％、16～60％、17～59％、18～58％、19～57％、20～56％、21～55％、22～54％、23～54％、24～53％、25～51％、26～50％、27～49％、28～48％、29～47％、或30～46％。上述比例(细胞数)例如可以如下测定：使对象细胞群充分悬浮后，将得到的细胞悬浮液的一部分取出，基于后述的实施例1的(3)的染色体的组数(核相)的测定方法进行测定(以下也同样)。
上述多核化巨核细胞包含核相为16N以上的多核化巨核细胞的情况下，上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)的下限值例如为15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上、21％以上、22％以上、23％以上、24％以上、或25％以上。上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)的上限值例如为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、54％以下、53％以下、52％以下、51％以下、50％以下、49％以下、48％以下、47％以下、46％以下、45％以下、44％以下、或43％以下。上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)例如为15～90％、15～85％、15～80％、15～75％、15～70％、15～65％、15～60％、16～55％、17～54％、18～53％、19～52％、20～51％、21～50％、22～49％、23～48％、24～47％、25～46％、25～45％、25～44％、或25～43％。
上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞的情况下，上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)的下限值例如为5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、或15％以上。上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)的上限值例如为50％以下、49％以下、48％以下、47％以下、46％以下、45％以下、44％以下、43％以下、42％以下、41％以下、40％以下、39％以下、38％以下、37％以下、36％以下、35％以下、34％以下、33％以下、32％以下、31％以下、或30％以下。上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)例如为5～50％、5～49％、5～48％、5～47％、5～46％、5～45％、5～44％、5～43％、5～42％、5～41％、5～40％、6～39％、7～38％、8～37％、9～36％、10～35％、11～34％、12～33％、13～32％、14～31％、15～31％、或15～30％。
如上所述，本发明的多核化巨核细胞的制造方法可以制造血小板的产生能力得到增强的巨核细胞。根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法，可以得到富含核相得到增强的多核化巨核细胞、特别是具有16N及32N的核相的多核化巨核细胞的细胞群。因此，根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法，可得到血小板的产生能力优异的多核化巨核细胞。因此，上述多核化巨核细胞的血小板产生能力优异。因此，根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法，例如，可以准备可提高血小板产生量的多核化巨核细胞。
＜包含多核化巨核细胞的细胞群＞
另一方式中，本发明提供包含血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的细胞群。本发明的细胞群为包含多核化巨核细胞的细胞群，上述多核化巨核细胞包含核相为16N以上的多核化巨核细胞，上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为15％以上。
另外，本发明的细胞群为包含多核化巨核细胞的细胞群，上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，上述细胞群中，上述32n以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
上述多核化巨核细胞可以包含8N以上的多核化巨核细胞。上述8N以上的多核化巨核细胞、上述16N以上的多核化巨核细胞及上述32N以上的多核化巨核细胞的比例例如可以援引上述的例示。
本发明的细胞群特征在于包含一定量的具有规定的核相的多核化巨核细胞，其它构成及条件没有特别限制。本发明的细胞群例如可以援引本发明的多核化巨核细胞的制造方法的说明。本发明的细胞群富集了核相高的多核化巨核细胞。上述巨核细胞发生了核相的多核化，从而细胞质相对变大，血小板产生能力提高。另外，上述巨核细胞如果进一步发生核相的多核化，则进一步趋于成熟。本发明的细胞群中，核相特别高的多核化巨核细胞(例如16N以上或32N以上)的比例得到提高。因此，本发明的细胞群例如血小板产生能力增强。
上述多核化前巨核细胞例如为源自多能细胞的细胞，优选在体外由多能细胞诱导出的细胞。上述多核化前巨核细胞优选永生化巨核细胞。上述永生化巨核细胞例如如上所述可以通过导入上述癌基因、上述多梳基因和/或上述凋亡抑制基因而制备。因此，上述多核化前的巨核细胞及上述多核化巨核细胞例如包含外源性的癌基因、多梳基因和/或凋亡抑制基因。上述癌基因优选c-MYC基因。上述多梳基因优选BMI1基因。上述凋亡抑制基因优选BCL-xL基因。上述多核化前的巨核细胞及上述多核化巨核细胞例如表达外源性的癌基因、多梳基因和/或凋亡抑制基因。
本发明的细胞群例如可以通过上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法来制造。另外，本发明的细胞群例如可以如下制备：对于包含多核化巨核细胞的细胞群，基于后述的实施例1的(5)使用血清白蛋白溶液进行分级，以富含多核化巨核细胞的细胞群形式而制备。
＜血小板的制造方法＞
另一方式中，本发明提供血小板的制造方法。本发明的血小板的制造方法如上所述包括：诱导工序，由多核化前的巨核细胞诱导多核化巨核细胞；和，血小板产生工序，由上述多核化巨核细胞产生血小板，上述诱导工序可通过上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法来实施。本发明的血小板的制造方法的特征在于，上述诱导工序通过上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法来实施，其它工序及条件没有特别限制。本发明的血小板的制造方法例如可以援引本发明的多核化巨核细胞的制造方法的说明。根据本发明的血小板的制造方法，可提高血小板的产生量。
本发明的血小板的制造方法中，上述诱导工序中，由多核化前的巨核细胞诱导多核化巨核细胞。上述诱导工序可以与上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法的多核化工序同样实施。
接着，本发明的血小板的制造方法中，上述血小板产生工序(以下也称为“产生工序”)中，如上所述由上述多核化巨核细胞产生血小板。上述产生工序例如可以通过在培养基存在下培养上述多核化巨核细胞而实施。上述多核化巨核细胞的培养例如可以在饲养细胞上实施，也可以在无饲养细胞下实施。
上述产生工序中，由上述多核化巨核细胞产生血小板的时间没有特别限制，例如为1～10天、3～6天。
例如，从提高所产生的血小板的生理活性的角度出发，上述产生工序可以在AhR抑制剂存在下实施。具体而言，上述产生工序例如在包含AhR抑制剂的培养基存在下实施。上述产生工序例如可以如下实施：将包含上述巨核细胞的培养基交换成例如包含AhR抑制剂的培养基；或者，向包含上述巨核细胞的培养基中添加AhR抑制剂。
在上述AhR抑制剂存在下培养的时间没有特别限制，例如，可以根据产生的血小板数量、生理活性等适当决定。上述AhR抑制剂例如在上述产生工序的全部时间或一部分时间存在。上述AhR抑制剂为SR1的情况下，从得到功能性特别高的血小板的角度出发，上述培养期优选约5天。
上述产生工序中，上述AhR抑制剂的浓度没有特别限制，可以根据化合物的种类及其有效浓度适当确定。例如，从进一步提高产生的血小板的生理活性的角度出发，作为一例，上述AhR拮抗剂的浓度可列举以下浓度。
SR1：200nmmol/L以上且小于1000mmol/L
CH-223191：0.2μmol/L以上且小于4μmol/L
GNF351：20nmol/L以上且小于300nmol/L
TMF：2.5μmol/L以上且小于40μmol/L
DMF：2.5μmol/L以上且小于40μmol/L
例如，从可以提高产生的血小板的生理活性的角度出发，上述产生工序可以在ROCK抑制剂存在下实施。具体而言，上述产生工序例如在包含ROCK抑制剂的培养基存在下实施。例如，从进一步得到功能性提高的血小板的角度出发，上述产生工序优选将上述ROCK抑制剂和上述AhR抑制剂组合使用。上述产生工序例如可以如下实施：将包含上述巨核细胞的培养基交换成例如包含ROCK抑制剂的培养基；或者，向包含上述巨核细胞的培养基中添加ROCK抑制剂。将上述ROCK抑制剂和上述AhR抑制剂组合使用时，上述ROCK抑制剂和上述AhR抑制剂例如可以同时进行添加或交换，也可以分别进行添加或交换。
上述产生工序中，上述血小板的产生开始时的多核化巨核细胞的细胞密度没有特别限制。上述细胞密度的下限例如为1×105个细胞/ml、2×105个细胞/ml、3×105个细胞/ml、4×105个细胞/ml。上述细胞密度的上限没有特别限制，例如为4×105个细胞/ml、6×105个细胞/ml、8×105个细胞/ml。上述细胞密度的范围例如为1×105个细胞/ml～8×105个细胞/ml、2×105个细胞/ml～8×105个细胞/ml、3×105个细胞/ml～6×105个细胞/ml、4×105个细胞/ml～6×105个细胞/ml。上述细胞密度例如可以通过将上述多核化巨核细胞的细胞数除以(除)悬浮上述多核化巨核细胞的培养基的体积来进行计算。
上述产生工序中，上述巨核细胞的培养条件没有特别限制，可以采用上述巨核细胞的常规培养条件。作为具体例，培养温度例如为约35～约42℃、约36～约40℃、约37～约39℃。CO2浓度例如为约5～约15％。O2浓度例如为约15～约25％、约20％。
因此，可以由上述巨核细胞产生血小板。上述产生工序后的培养基例如包含上述血小板。
本发明的血小板的制造方法例如可以包括对上述产生工序中得到的血小板进行纯化的纯化工序。上述血小板的纯化方法没有特别限制，例如，可以通过使用中空纤维膜等分离手段的纯化方法、基于离心分离的纯化方法等公知方法来实施。
＜血小板＞
本发明的血小板的特征在于，通过上述本发明的血小板的制造方法而得到。本发明的血小板的特征在于，通过上述本发明的血小板的制造方法而得到，其它工序及条件没有特别限制。本发明的血小板例如可以援引上述本发明的血小板的制造方法的说明。
＜血小板制剂的制造方法＞
本发明的血小板制剂的制造方法如上所述包括由血小板制造血小板制剂的制剂工序，上述血小板的特征在于，通过上述本发明的血小板的制造方法而得到。本发明的血小板制剂的制造方法的特征在于，上述血小板通过上述本发明的血小板的制造方法而得到，其它工序及条件没有特别限制。本发明的血小板制剂的制造方法可以援引上述本发明的血小板的制造方法的说明。
上述制剂工序中，例如可以添加其它成分。上述其它成分可列举例如药学上可接受的添加剂或载体等，如上述血小板等细胞的稳定剂等。
本发明的血小板制剂的制造方法可以在上述制剂工序之前包括血小板制造工序，所述血小板制造工序通过上述本发明的血小板的制造方法而制造血小板。上述血小板制造工序例如可以援引上述本发明的血小板的制造方法的说明。
＜血小板制剂＞
本发明的血小板制剂的特征在于，通过上述本发明的血小板制剂的制造方法而得到。本发明的血小板制剂的特征在于，通过上述本发明的血小板制剂的制造方法而得到，其它工序及条件没有特别限制。本发明的血小板制剂例如可以援引上述本发明的血小板的制造方法及血小板制剂的制造方法的说明。
＜血液制剂的制造方法＞
本发明的血液制剂的制造方法如上所述包括血液制剂工序，所述血液制剂工序通过将血小板和其它成分混合而制造血液制剂，上述血小板的特征在于通过上述本发明的血小板的制造方法而得到。本发明的血液制剂的制造方法的特征在于，上述血小板通过上述本发明的血小板的制造方法而得到，其它工序及条件没有特别限制。本发明的血液制剂的制造方法可以援引上述本发明的血小板的制造方法的说明。
上述其它成分没有特别限制，可列举例如红细胞等其它血细胞系细胞等细胞；上述血小板等细胞的稳定化剂等添加剂；等。
本发明的血液制剂的制造方法中，可以在上述血液制剂工序之前包括通过上述本发明的血小板的制造方法制造血小板的血小板制造工序。上述血小板制造工序例如可以援引上述本发明的血小板的制造方法的说明。
＜血液制剂＞
本发明的血液制剂的特征在于，通过上述本发明的血液制剂的制造方法而得到。本发明的血液制剂的特征在于，通过上述本发明的血液制剂的制造方法而得到，其它工序及条件没有特别限制。本发明的血液制剂例如可以援引上述本发明的血小板的制造方法及血液制剂的制造方法的说明。
＜多核化巨核细胞的诱导剂＞
另一方式中，本发明提供血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的诱导剂。本发明的诱导剂为血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的诱导剂，包含选自由AhR活性抑制物质、ROCK活性抑制物质、DYRK活性抑制物质及肌球蛋白2活性抑制物质组成的组中的至少1种且包含哈尔明。本发明的诱导剂的特征在于包含选自由AhR活性抑制物质、ROCK活性抑制物质、DYRK活性抑制物质及肌球蛋白2活性抑制物质组成的组中的至少1种且包含哈尔明，其它构成及条件没有特别限制。本发明的诱导剂例如可以援引上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法的说明。本发明的诱导剂例如也可以称为血小板的产生能力得到提高的成熟巨核细胞或多核化巨核细胞的诱导剂。另外，本发明的诱导剂例如也可以称为巨核细胞的多核化促进剂或巨核细胞的核相的增强剂。
＜应用＞
本发明为选自由AhR活性抑制物质、ROCK活性抑制物质、DYRK活性抑制物质及肌球蛋白2活性抑制物质组成的组中的至少1种与哈尔明的、用于诱导血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的应用。另外，本发明为选自由AhR活性抑制物质、ROCK活性抑制物质、DYRK活性抑制物质及肌球蛋白2活性抑制物质组成的组中的至少1种与哈尔明的、用于促进巨核细胞的多核化或用于增强巨核细胞的核相的应用。本发明例如可以援引上述本发明的多核化巨核细胞的制造方法的说明。
实施例
以下使用实施例详细地说明本发明，但是本发明不受实施例中记载的方式限定。
[实施例1]
确认了通过在AhR抑制剂、ROCK抑制剂、DYRK抑制剂及肌球蛋白2抑制剂存在下且在哈尔明存在下培养多核化前巨核细胞而能够增强血小板的产生能力。
(1)永生化巨核细胞的制作
作为多核化前巨核细胞，使用永生化巨核细胞。上述永生化巨核细胞通过以下步骤而制作。
(1-1)由iPS细胞制备造血祖细胞
按照下述参考文献7中记载的方法，实施由人iPS细胞向血细胞的分化培养。具体而言，将在层粘连蛋白511-E8(NIPPI)上维持的人iPS细胞集落在50ng/ml激活素A(WAKO)、3μM CHIR99021(WAKO)存在下培养一晚，然后在20ng/mL VEGF(R&D SYSTEMS公司制)存在下与C3H10T1/2饲养细胞共培养14天，由此制作造血祖细胞(Hematopoietic ProgenitorCells：HPC)。关于培养条件，在iPS细胞维持和HPC诱导的前7天设为37℃、5％O2、5％CO2，此后在37℃、20％O2、5％CO2下实施。
参考文献7：Takayama N.et al.,“Transient activation of c-MYC expressionis critical for efficient platelet generation from human induced pluripotentstem cells”,J.Exp.Med.,2010,vo.13,pages 2817-2830
(1-2)基因导入系统
基因导入系统利用慢病毒载体系统。慢病毒载体使用四环素控制性Tet-on(注册商标)基因表达诱导系统载体。上述载体为在TRE启动子下导入有c-MYC、BMI1、或BCL-xL的载体，各载体分别构成为EN-TRE-c-Myc-Ubc-rtTA-KR、EN-TRE-BMI1-Ubc-rtTA-KR及EN-TRE-BCL-xL-Ubc-rtTA-KR。接着，通过将上述慢病毒载体向293T细胞中进行基因导入，由此制备包含c-MYC、BMI1及BCL-xL的载体的病毒(上述参考文献1及下述参考文献8)。然后，使得到的病毒感染目标细胞，由此可以将c-MYC、BMI1及BCL-xL基因导入目标细胞的基因组序列。另外，得到的细胞中如果在基因组序列中稳定地导入了c-MYC、BMI1及BCL-xL基因，则可通过向培养基中加入多西环素(clontech#631311)而使上述细胞强制表达c-MYC、BMI1及BCL-xL基因。
参考文献8：Yamaguchi et al.,“Development of an All-in-One InducibleLentiviral Vector for Gene Specific Analysis of Reprogramming.”PLoS ONE,2012,vol.7(7)e41007
(1-3)通过向造血祖细胞中导入3种基因而诱导巨核细胞株
使上述实施例1的(1-2)中制作的3种慢病毒感染上述实施例1的(1-1)中制作的HPC，从而诱导巨核细胞祖细胞。对于上述感染起约25天后具有充分的增殖能力的株，使用抗人CD41a-APC抗体(BioLegend公司制)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience公司制)及抗人CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB；BioLegend公司制)抗体进行免疫染色后，使用FACS Verse(商标)进行分析。将CD41a阳性率、CD42b阳性率均为50％以上的株作为永生化巨核细胞株(MKCL、相当于多核化前的巨核细胞)，用于以后的研究中。
(1-4)巨核细胞株的增殖培养
得到的MKCL的增殖培养在10cm培养皿(10ml/培养皿)或125ml振荡烧瓶中进行。培养基以IMDM(Sigma Aldrich#I3390)为基本培养基且加入了以下成分(浓度为终浓度、增殖培养基)。培养条件为37℃、5％CO2，振荡时的振荡速度通过旋转直径为19mm的振荡器而设为100rpm。
FBS(Hyclone#SH30071.03、胎牛血清)15％
Glutamax(GIBCO#3505-061)2mmol/l
ITS-G(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(monothioglycerol,富士胶片和光纯药#195-157)450μmol/l
抗坏血酸(NIPRO#49871900040329)50μg/ml
SCF(AGC#MEGAKARYON-SCF)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/mL
多西环素(DOX)(clontech#631311)1μg/ml
(2)永生化巨核细胞的多核化的诱导
接着，在除了DOX以外还添加了AhR抑制剂、ROCK抑制剂、DYRK抑制剂及肌球蛋白2抑制剂且添加了哈尔明的培养基中进行培养，由此诱导永生化巨核细胞的多核化。具体而言，将上述实施例1的(1)中得到的永生化巨核细胞株以3.0×105个细胞/ml的方式悬浮于以下多核化培养基。然后以2ml/孔播种于6孔培养皿或以25ml/烧瓶播种于125mL容积的锥形瓶，以100rpm振荡培养3天。培养条件设为37℃、5％CO2。
(多核化培养基)
FBS(Hyclone#SH30071.03)15％
Glutamax(GIBCO#3505-061)2mmol/L
ITS-G(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(monothioglycerol,富士胶片和光纯药#195-157)450μmol/l
抗坏血酸(NIPRO#49871900040329)50μg/ml
脂质混合液1已知组成(Sigma Aldrich#L0288-100ML)0.75％
SCF(AGC#MEGAKARYON-SCF)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/ml
多西环素(clontech#631311)1μg/ml
芳香族烃受体(AhR)抑制剂GNF351(Calbiochem#182707)500nmol/l
ROCK抑制剂Y-39983(Medchemexpress#MCH-HY-13300-10)500nmol/l
哈尔明(Sigma Aldrich#286044-1G)5μmol/l
DYRK抑制剂AZ191(Medchem Express#HY-12277)1μmol/l
肌球蛋白2抑制剂(-)-布比他汀(Medchem Express#HY-13441)10μmol/l
(3)对多核化的作用
将上述培养后的细胞悬浮液回收，使用流式细胞仪测定上述细胞悬浮液中的染色体的组数及细胞的大小。具体而言，对于细胞悬浮液，使用经冷却的100％乙醇以终浓度70％在-20℃下进行30分钟的固定处理后，用PBS(-)清洗。接着使用核染色液进行染色。上述各染色液以1mg/ml的PI(碘丙啶、Sigma Aldrich#P4864-10ML)的终浓度10μg/mL、100mg/mL RNase(NIPPON GENE#318-06391)的终浓度20μg/mL的方式添加于PBS中而制备。对于染色后样品，用流式细胞仪进行测定。对于得到的结果，基于FSC及PI的染色强度分析巨核细胞所含有的染色体的组数(N)及细胞的大小(实施例1)。对照1除了使用上述增殖培养基代替上述多核化培养基以外同样地实施，对照2除了使用向上述增殖培养基中以10μmol/l方式添加哈尔明而成的培养基代替上述多核化培养基以外同样地实施。将这些结果示于图1。
图1为示出多核化程度的图表。图1中，横轴表示PI染色强度，纵轴表示计数结果，图中的数值表示各染色体的组数的细胞的比例。如图1所示，对照1中永生化巨核细胞维持增殖，因此几乎未检测出多核化巨核细胞。另一方面，如图1所示，添加哈尔明时，永生化巨核细胞发生多核化，也检测到一些32N的多核化巨核细胞。与这些相对地，实施例1中巨核细胞的多核化进一步推进，不仅检测到32N的多核化巨核细胞，也检测到64N及128N的多核化巨核细胞。由这些可知，根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法，可得到多核化程度进一步推进的多核化巨核细胞。
(4)血小板的产生
接着，在向除去了DOX的IMDM中添加以下成分而成的下述产生培养基中进行培养，由此由多核化巨核细胞产生血小板。具体而言，将上述实施例1的(2)中得到的多核化巨核细胞用PBS(-)清洗2次，在以下产生培养基中以1.0×105cells/ml方式悬浮。然后以2ml/孔播种于6孔培养皿，培养6天。
(产生培养基)
人AB血清10％(AccessBiologicals)
Glutamax(GIBCO#3505-061)2mmol/L
ITS-G(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(硫代甘油,富士胶片和光纯药#195-157)450μmol/L
抗坏血酸(NIPRO#49871900040329)50μg/mL
SCF(AGC#MEGAKARYON-SCF)50ng/mL
TPO样作用物质200ng/mL
芳香族烃受体(AhR)抑制剂GNF351(Calbiochem#182707)500nmol/L
ROCK抑制剂Y-39983(Medchemexpress#MCH-HY-13300-10)500nmol/L
依诺肝素(Sanofi)1U/mL
接着，对于包含血小板的细胞悬浮液，使用流式细胞仪测定上述细胞悬浮液中的血小板浓度。具体而言，向5mL FACS管中添加Tyrode’s缓冲液180μL，添加上述细胞悬浮液20μL，混合。然后，向各管中添加下述标记抗体并静置15分钟而进行染色。染色后向各管中添加PBS(-)400μL并混合，将其中的500μL添加到Trucount Tube(商标)中并混合，用流式细胞仪测定。对于得到的结果，通过前方散射光(FSC)及侧方散射光(SSC)提取血小板级分后，求出CD41+CD42b+级分的比例，基于通过绝对计数珠(Trucount beads)的计数结果而计算的测定液量来计算血小板浓度。由上述血小板浓度计算上述细胞悬浮液中的血小板总数后，由上述血小板总数和播种的多核化巨核细胞数计算每个巨核细胞的血小板产生量(实施例1)。另外，对照除了在上述实施例1的(2)中使用上述增殖培养基代替上述多核化培养基以外同样地实施。将这些结果示于图2。
·血小板浓度的测定
0.5μL抗CD41抗体APC标记(BioLegend、Cat.No.:303710)
0.5μL抗CD42b抗体PE标记(BioLegend、Cat.No.:303906)
图2为示出每个巨核细胞的血小板产生量的图表。图2中，横轴表示样品的种类，纵轴表示每个巨核细胞的血小板产生量。如图2所示，实施例1与对照相比，血小板的产生量增加到4倍左右。由这些结果可知，根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法，可增强血小板的产生量。
(5)血小板的产生能力
通过与上述实施例1的(2)同样地培养上述实施例1的(1)中得到的永生化巨核细胞株而诱导多核化。对于得到的多核化巨核细胞，使用牛血清白蛋白基于多核化巨核细胞的大小而进行分级。具体而言，在去掉推杆的50ml注射器上安装三通活塞，注射筒尖向下地用夹子固定。将30％(w/v)白蛋白溶液(源自牛血清无脂肪酸、富士胶片和光纯药#017-22231)用1×HBSS(ThermoFisher#14175095)稀释而进行制备，制备2％、4％、16％的BSA溶液后，向上述注射器内按照16％(10ml)、4％(4ml)、2％(4ml)及0％(2ml)的顺序依次进行重叠。接着，加入用2ml的HBSS制备的包含75×105个多核化巨核细胞的细胞悬浮液后，静置50分钟而使细胞在自然重力下沉降。然后，松开上述三通活塞，通过滴加而回收细胞。由此将上述包含多核化巨核细胞的细胞群分级为级分1～4(F1～F4)。对于各级分的多核化巨核细胞，与上述实施例1的(3)同样地分析染色体的组数(N)(实施例1)。参考例1A中除了使用未添加哈尔明、AZ191及布比他汀的多核化培养基代替上述多核化培养基以外同样地实施，参考例1B除了使用未添加哈尔明的多核化培养基代替上述多核化培养基以外同样地实施。
上述分级后在除去了DOX的上述产生培养基中进行培养，由此由多核化巨核细胞产生血小板。具体而言，将F1～F4的多核化巨核细胞分别用PBS(-)清洗2次，在上述产生培养基中以1.0×105个细胞/ml的方式悬浮。然后以2ml/孔播种于6孔培养皿，培养4～7天(合计7～10天)。在上述产生培养基培养的第1天，用相位差显微镜(ECLIPSE TS100、ニコンインステック公司制)观察各孔的细胞。然后，在上述培养后，对于包含血小板的细胞悬浮液与上述实施例1的(4)同样地计算每个巨核细胞的血小板产生量。将这些结果示于图3～图5。
图3A～图3C为示出多核化程度及细胞大小的图表。图3A～图3C中，图3A示出参考例1A的结果，图3B示出参考例1B的结果，图3C示出实施例1的结果。图3A～图3C中，横轴表示PI染色强度或细胞大小(FSC)，纵轴表示计数结果，图中的数值表示各染色体的组数的细胞的比例。如图3A～图3C所示，可以确认在参考例1A、参考例1B及实施例1中，F1中均富集了最大的细胞，F2～F4中细胞的大小依次变小。另外，比对参考例1B与实施例1，对于F1～F4任一者而言，细胞的大小均为同等程度。
接着，图4示出F1分级的细胞的相位差像照片。图4中，(A)为参考例1A的结果，(B)为参考例1B的结果，(C)为实施例1的结果。如图4的(A)～(C)所示，可知添加AZ191及布比他汀而抑制DYRK及肌球蛋白2时多核化巨核细胞的膨大化得到促进。另一方面，如图4的(B)～(C)所示，可知即使添加哈尔明，对多核化巨核细胞的膨大化也没有影响。
图5为示出每个巨核细胞的血小板产生量的图表。图5中，横轴表示样品的种类及级分，纵轴表示每个巨核细胞的血小板产生量。如图5所示，关于明显富集了多核化巨核细胞的F1级分及F2级分，实施例1与参考例1A及参考例1B相比，血小板产生量增强了2～3倍左右。由此可知，本发明的多核化巨核细胞的制造方法得到了血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞。另外，如上所述，实施例1的多核化巨核细胞和参考例1B的多核化巨核细胞具有同等程度的大小。由此推测，实施例1的多核化巨核细胞和参考例1B的多核化巨核细胞在血小板的血小板产生最大能力、即将全部细胞质作为血小板而释放时所能释放出的血小板数为同等程度。但是，如图5所示，实施例1的多核化巨核细胞与参考例1B的多核化巨核细胞的血小板产生量明显不同，由此可知实施例1的多核化巨核细胞与参考例1B的多核化巨核细胞相比能够高效地释放出血小板，即，血小板产生能力得到增强。另外推测，上述血小板产生能力的增强是由实施例1的多核化巨核细胞与参考例1B的多核化巨核细胞等相比而言巨核细胞的分化的推进或成熟度的增大带来的。
[实施例2]
使用实施例1中使用的抑制剂，确认了尤其有助于多核化的分子。
(1)添加剂的研究
(1-1)永生化巨核细胞的多核化的诱导
对于永生化巨核细胞的多核化诱导中使用的AhR抑制剂、ROCK抑制剂及肌球蛋白2抑制剂以及哈尔明这5种添加剂中有助于增加血小板产生数的添加剂进行了研究。上述研究具体为：将实施例1的(1)中得到的永生化巨核细胞株以3.0×105个细胞/ml悬浮于以下多核化培养基。然后以2ml/孔播种于6孔培养皿，或者以25ml/烧瓶播种于125mL容积的锥形瓶，以100rpm振荡培养3天。培养条件设为37℃、5％CO2。上述多核化培养基中，(1)添加下述抑制剂(GYHAB)全部、(2)添加AZ191以外的下述抑制剂(A(-))、(3)添加GNF351以外的下述抑制剂(G(-))、(4)添加Y-39983以外的下述抑制剂(Y(-))、(5)添加哈尔明以外的下述抑制剂(H(-))、(6)添加布比他汀以外的下述抑制剂(B(-))、(7)添加除AZ191及Y-39983以外的下述抑制剂(GHB)。
(多核化培养基)
FBS(Hyclone#SH30071.03)15％
Glutamax(GIBCO#3505-061)2mmol/L
ITS-G(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(硫代甘油,富士胶片和光纯药#195-157)450μmol/l
抗坏血酸(NIPRO#49871900040329)50μg/ml
SCF(AGC#MEGAKARYON-SCF)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/ml
多西环素(clontech#631311)1μg/ml
(抑制剂)
(G)芳香族烃受体(AhR)抑制剂GNF351(Calbiochem#182707)500nmol/l
(Y)ROCK抑制剂Y-39983(Medchemexpress#MCH-HY-13300-10)500nmol/l
(H)哈尔明(Sigma Aldrich#286044-1G)5μmol/l
(A)DYRK抑制剂AZ191(Medchem Express#HY-12277)1μmol/l
(B)肌球蛋白2抑制剂(-)-布比他汀(Medchem Express#HY-13441)10μmol/l
(1-2)对多核化的作用
将上述培养后的细胞悬浮液回收，使用流式细胞仪测定上述细胞悬浮液中的染色体的组数及细胞的大小。具体而言，通过与实施例1的(3)同样的方法来进行。对于得到的结果，基于FSC及PI的染色强度来分析巨核细胞所含有的染色体的组数(N)及细胞的大小。将这些结果示于图6。
图6为示出每个巨核细胞的血小板产生量的图表。图6中，横轴表示样品的种类，纵轴表示每个巨核细胞的血小板产生量。如图6所示，未添加AZ191的(A(-))中，与添加了全部抑制剂的(GYHAB)相比血小板产生量未减少。另外，未添加AZ191及Y-39983的(GHB)时，与未添加AZ191的(A(-))或添加了全部抑制剂的(GYHAB)相比血小板产生量未减少。另外，其它的去除了一种抑制剂的情况下，与添加了全部抑制剂(GYHAB)时相比，血小板产生量减少。由以上结果可知，通过抑制AhR、肌球蛋白2的活性且在哈尔明存在下进行培养，可协同地促进巨核细胞的多核化，由此可提高血小板的产生能力。
[实施例3]
确认通过本发明的多核化巨核细胞的制造方法促进了巨核细胞的多核化。
对通过本发明的多核化巨核细胞的制造方法而得到的多核化巨核细胞的核相进行了研究。使用将通过上述实施例1的(1)而得到的永生化巨核细胞株以2.0～3.0×105个细胞/ml悬浮于包含15％FBS的上述多核化培养基而得的悬浮液，除此以外与上述实施例2的(2)同样地进行培养。对于得到的包含多核化巨核细胞的细胞群，与上述实施例1的(3)同样地用流式细胞仪进行测定。对于得到的结果，基于FSC及PI的染色强度分析巨核细胞所含有的染色体的组数(N)及细胞的大小。将同样的实验实施11次(n＝12)。将这些结果示于图7。
图7为示出多核化巨核细胞的核相的图表。图7的(A)～(C)中，横轴表示在细胞群中所占的比例，纵轴表示每个巨核细胞的血小板产生量。图7中，(A)示出细胞群中的核相为8N以上的多核化巨核细胞的比例，(B)示出细胞群中的核相为16N以上的多核化巨核细胞的比例，(C)示出细胞群中的核相为32N以上的多核化巨核细胞的比例。如图7的(A)～(C)所示，核相为8N以上的多核化巨核细胞的比例为28.2～56.7％，核相为16N以上的多核化巨核细胞的比例为20.2～45.9％，核相为32N以上的多核化巨核细胞的比例为9.15～30.7％。需要说明的是，通过改变播种密度，可调整16N以上及32N以上的多核化巨核细胞的含有比例。
综上，根据本发明的多核化巨核细胞的制造方法可制备特别是核相为16N以上的多核化巨核细胞及核相为32N以上的多核化巨核细胞的含有比例高的细胞群，即巨核细胞的多核化得到促进。
以上参照实施方式及实施例说明了本发明，但是本发明不受上述实施方式及实施例限定。本发明的构成、详细情况可在本发明的范畴内进行本领域技术人员可理解的各种变更。
该申请以2021年6月18日提出申请的日本申请特愿2021-102068为基础而要求优先权，其公开全部引入于此。
＜附录＞
上述实施方式及实施例的一部分或全部可如以下附录那样来记载，但是不限于以下。
＜多核化巨核细胞的制造方法＞
(附录1)
一种血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法，其包括下述多核化工序：在多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，使多核化前的巨核细胞或其祖细胞多核化，诱导多核化巨核细胞，
在上述多核化工序中，在抑制选自由芳香族烃受体(AhR)、Rho结合激酶(ROCK)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明(Harmine)存在下使上述多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞。
(附录2)
根据附录1所述的制造方法，其中，在上述多核化工序中，在选自由AhR抑制剂、ROCK抑制剂、DYRK抑制剂及肌球蛋白2抑制剂组成的组中的至少1种抑制剂以及哈尔明的存在下培养上述多核化前的巨核细胞或其祖细胞而使其多核化，诱导多核化巨核细胞。
(附录3)
根据附录2所述的制造方法，其中，在上述多核化工序中，在上述AhR抑制剂、上述肌球蛋白2抑制剂及哈尔明的存在下培养上述多核化前的巨核细胞或其祖细胞而使其多核化，诱导多核化巨核细胞。
(附录4)
根据附录1至3中任一项所述的制造方法，其包括下述增殖工序：在上述多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下使上述多核化前的巨核细胞增殖，
在上述增殖工序中，使上述多核化前的巨核细胞在不抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性且哈尔明(Harmine)不存在下增殖。
(附录5)
根据附录4所述的制造方法，其中，在上述增殖工序后实施上述多核化工序。
(附录6)
根据附录1至5中任一项所述的制造方法，其中，在上述多核化工序中，使用AhR抑制剂抑制上述AhR的活性。
(附录7)
根据附录2、3及6中任一项所述的制造方法，其中，上述AhR抑制剂包含GNF351。
(附录8)
根据附录1至7中任一项所述的制造方法，其中，在上述多核化工序中，使用ROCK抑制剂抑制上述ROCK的活性。
(附录9)
根据附录2、3及8中任一项所述的制造方法，其中，上述ROCK抑制剂包含Y-39983。
(附录10)
根据附录1至9中任一项所述的制造方法，其中，在上述多核化工序中，使用DYRK抑制剂抑制上述DYRK的活性。
(附录11)
根据附录2、3及10中任一项所述的制造方法，其中，上述DYRK抑制剂包含AZ191。
(附录12)
根据附录1至11中任一项所述的制造方法，其中，在上述多核化工序中，使用肌球蛋白2抑制剂抑制上述肌球蛋白2的活性。
(附录13)
根据附录2、3及12中任一项所述的制造方法，其中，上述肌球蛋白2抑制剂包含布比他汀(Blebbistatin)。
(附录14)
根据附录1至13中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化巨核细胞为包含上述多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞包含核相为16N以上的多核化巨核细胞，
在包含上述多核化巨核细胞的细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20％以上。
(附录15)
根据附录14所述的制造方法，其中，在上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
(附录16)
根据附录15所述的制造方法，其中，在上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～70％。
(附录17)
根据附录1至16中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化巨核细胞为包含上述多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞包含核相为8N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
(附录18)
根据附录16所述的制造方法，其中，在上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为25～60％。
(附录19)
根据附录1至17中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化巨核细胞为包含上述多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
(附录20)
根据附录19所述的制造方法，其中，上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～35％。
(附录21)
根据附录1至20中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化前的巨核细胞的生长因子为癌基因、多梳基因和/或凋亡抑制基因所编码的蛋白质。
(附录22)
根据附录1至21中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化前的巨核细胞为永生化巨核细胞。
(附录23)
根据附录1至22中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化前的巨核细胞源自多能细胞。
(附录24)
根据附录23所述的制造方法，其中，上述多能细胞为诱导多能干细胞。
(附录25)
根据附录1至24中任一项所述的制造方法，其中，上述多核化前的巨核细胞源自人。
＜血小板的制造方法＞
(附录26)
一种血小板的制造方法，其包括：
多核化工序，由多核化前的巨核细胞诱导多核化巨核细胞；和
血小板产生工序，由上述多核化巨核细胞产生血小板，
上述多核化工序通过附录1至25中任一项所述的多核化巨核细胞的制造方法来实施。
＜血小板制剂的制造方法＞
(附录27)
一种血小板制剂的制造方法，其特征在于，其包括由血小板制造血小板制剂的制剂工序，
上述血小板是通过附录26所述的血小板的制造方法而得到的。
＜血液制剂的制造方法＞
(附录28)
一种血液制剂的制造方法，其特征在于，其包括下述血液制剂工序：通过将血小板和其它成分混合而制造血液制剂，
上述血小板是通过附录26所述的血小板的制造方法而得到的。
＜包含多核化巨核细胞的细胞群＞
(附录29)
一种包含多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞包含核相为16N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20％以上。
(附录30)
根据附录29所述的细胞群，其中，在上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
(附录31)
根据附录30所述的细胞群，其中，在上述细胞群中，上述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～70％。
(附录32)
根据附录29至31中任一项所述的细胞群，其中，上述多核化巨核细胞包含核相为8N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
(附录33)
根据附录32所述的细胞群，其中，在上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为25～60％。
(附录34)
根据附录29至33中任一项所述的细胞群，其中，上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
(附录35)
根据附录34所述的细胞群，其中，上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～35％。
(附录36)
一种包含多核化巨核细胞的细胞群，
上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
(附录37)
根据附录36所述的细胞群，其中，上述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～35％。
(附录38)
根据附录36或37所述的细胞群，其中，上述多核化巨核细胞包含核相为8N以上的多核化巨核细胞，
在上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～70％。
(附录39)
根据附录38所述的细胞群，其中，在上述细胞群中，上述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为25～60％。
(附录40)
根据附录29至39中任一项所述的细胞群，其中，上述多核化前的巨核细胞为永生化巨核细胞。
(附录41)
根据附录29至40中任一项所述的细胞群，其中，上述多核化前的巨核细胞源自多能细胞。
(附录42)
根据附录29至41中任一项所述的细胞群，其中，上述多核化前的巨核细胞包含外源性的癌基因、多梳基因和/或凋亡抑制基因。
产业上的可利用性
如上所述，根据本发明，可得到血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞。因此，根据本发明，例如可提高血小板的产生量。因此，本发明例如在使用血小板的细胞药物领域、医疗领域等中极为有用。
Claims (30)
1.一种血小板产生能力得到增强的多核化巨核细胞的制造方法，其包括下述多核化工序：在多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下，使多核化前的巨核细胞或其祖细胞多核化，诱导多核化巨核细胞，
在所述多核化工序中，在抑制选自由芳香族烃受体(AhR)、Rho结合激酶(ROCK)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)及肌球蛋白2组成的组中的至少1种的活性且在哈尔明(Harmine)存在下使所述多核化前的巨核细胞多核化，诱导多核化巨核细胞。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在所述多核化工序中，在选自由AhR抑制剂、ROCK抑制剂、DYRK抑制剂及肌球蛋白2抑制剂组成的组中的至少1种抑制剂以及哈尔明的存在下培养所述多核化前的巨核细胞或其祖细胞而使其多核化，诱导多核化巨核细胞。
3.根据权利要求2所述的制造方法，其中，在所述多核化工序中，在所述AhR抑制剂、所述肌球蛋白2抑制剂及哈尔明的存在下培养所述多核化前的巨核细胞或其祖细胞而使其多核化，诱导多核化巨核细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制造方法，其包括下述增殖工序：在所述多核化前的巨核细胞的生长因子的存在下使所述多核化前的巨核细胞增殖，
在所述增殖工序中，使所述多核化前的巨核细胞在不抑制AhR、ROCK、DYRK及肌球蛋白2的活性且哈尔明(Harmine)不存在下增殖。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，在所述增殖工序后实施所述多核化工序。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法，其中，在所述多核化工序中，使用AhR抑制剂抑制所述AhR的活性。
7.根据权利要求2、3及6中任一项所述的制造方法，其中，所述AhR抑制剂包含GNF351。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，在所述多核化工序中，使用ROCK抑制剂抑制所述ROCK的活性。
9.根据权利要求2、3及8中任一项所述的制造方法，其中，所述ROCK抑制剂包含Y-39983。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制造方法，其中，在所述多核化工序中，使用肌球蛋白2抑制剂抑制所述肌球蛋白2的活性。
11.根据权利要求2、3及10中任一项所述的制造方法，其中，所述肌球蛋白2抑制剂包含布比他汀(Blebbistatin)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制造方法，其中，所述多核化巨核细胞为包含所述多核化巨核细胞的细胞群，
所述多核化巨核细胞包含核相为16N以上的多核化巨核细胞，
在包含所述多核化巨核细胞的细胞群中，所述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20％以上。
13.根据权利要求12所述的制造方法，其中，在所述细胞群中，所述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
14.根据权利要求13所述的制造方法，其中，在所述细胞群中，所述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～70％。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的制造方法，其中，所述多核化巨核细胞为包含所述多核化巨核细胞的细胞群，
所述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在所述细胞群中，所述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，所述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在所述细胞群中，所述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～35％。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的制造方法，其中，所述多核化前的巨核细胞的生长因子为癌基因、多梳基因和/或凋亡抑制基因所编码的蛋白质。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的制造方法，其中，所述多核化前的巨核细胞为永生化巨核细胞。
19.一种血小板的制造方法，其包括：
多核化工序，由多核化前的巨核细胞诱导多核化巨核细胞；和
血小板产生工序，由所述多核化巨核细胞产生血小板，
所述多核化工序通过权利要求1至18中任一项所述的多核化巨核细胞的制造方法来实施。
20.一种血小板制剂的制造方法，其特征在于，其包括由血小板制造血小板制剂的制剂工序，
所述血小板是通过权利要求19所述的血小板的制造方法而得到的。
21.一种血液制剂的制造方法，其特征在于，其包括下述血液制剂工序：通过将血小板和其它成分混合而制造血液制剂，
所述血小板是通过权利要求19所述的血小板的制造方法而得到的。
22.一种包含多核化巨核细胞的细胞群，
所述多核化巨核细胞包含核相为16N以上的多核化巨核细胞，
在所述细胞群中，所述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20％以上。
23.根据权利要求22所述的细胞群，其中，在所述细胞群中，所述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
24.根据权利要求23所述的细胞群，其中，在所述细胞群中，所述16N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～70％。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞群，其中，所述多核化巨核细胞包含核相为8N以上的多核化巨核细胞，
在所述细胞群中，所述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为20～90％。
26.根据权利要求25所述的细胞群，其中，在所述细胞群中，所述8N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为25～60％。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的细胞群，其中，所述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在所述细胞群中，所述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～50％。
28.根据权利要求27所述的细胞群，其中，所述多核化巨核细胞包含核相为32N以上的多核化巨核细胞，
在所述细胞群中，所述32N以上的多核化巨核细胞的比例(细胞数)为5～35％。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的细胞群，其中，所述多核化前的巨核细胞为永生化巨核细胞。
30.根据权利要求22至29中任一项所述的细胞群，其中，所述多核化前的巨核细胞包含外源性的癌基因、多梳基因和/或凋亡抑制基因。
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