KR20240019327A - 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법, 혈소판의 제조 방법, 혈소판 제제의 제조 방법 및 혈액 제제의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
혈소판의 산생량을 향상 가능한 방법의 제공을 목적으로 한다. 본 발명의 제조 방법은, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법으로서, 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정을 포함하고, 상기 다핵화 공정에 있어서, 방향족 탄화수소 수용체(AhR), Rho 결합 키나아제(ROCK), 이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제(DYRK) 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민(Harmine)의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도한다.
Description
본 발명은 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법, 혈소판의 제조 방법, 혈소판 제제의 제조 방법 및 혈액 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
혈소판 제제는 수술, 상해 등의 출혈 시, 기타 혈소판의 감소를 수반하는 환자에 대하여 투여된다. 혈소판 제제는 헌혈로 얻어진 혈액으로부터 현재 제조되고 있다. 그러나, 인구 구성의 변화로부터, 헌혈량이 저감하여, 혈소판 제제가 부족할 것이 염려되고 있다.
또한, 헌혈의 제공자가 세균 등의 감염증으로 이환하고 있는 경우, 혈액이 세균 오염되어 있을 가능성이 있기 때문에, 세균 오염된 혈소판 제제의 투여에 의한 감염증의 리스크가 있다. 이 때문에, 시험관 내에서 혈소판을 제조하는 방법이 개발되고 있다(비특허문헌 1).
Takayama N et.al, "Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs, VEGF-promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors.", 2008, Blood, Vol. 111, No.11, pages 5298-5306
그러나, 상기 비특허문헌 1의 방법으로, 인간에게 1회에 통상 투여하는 양의 혈소판을 제조하는 경우, 거대한 제조 탱크가 필요하게 된다는 문제가 있다.
다핵화 전의 거핵구 세포(이하, 「다핵화 전 거핵구」라고 한다)는, 다핵화 후에 혈소판을 산생한다. 구체적으로는, 다핵화 전 거핵구는, 다핵화함으로써 세포질을 비대화시킨다. 그리고, 얻어진 다핵화 거핵구 세포(이하, 「다핵화 거핵구」라고도 한다)는, 비대화한 세포질이 단열함으로써 혈소판이 발생한다. 그래서, 본 발명자들은, 다핵화 전의 거핵구 세포에 대해서, 다핵화 및 그것에 수반하는 비대화의 촉진에 의해, 혈소판 산생능을 향상시키고자 시도하였다. 그러나, 다핵화 및 비대화가 발생해도, 반드시 얻어진 다핵화 거핵구의 혈소판 산생능이 향상되지는 않는다고 하는 것을 알아냈다. 이것은 거핵구 세포의 다핵화 및 비대화의 촉진에 의해, 혈소판 산생의 최대 능력은 향상되지만, 거핵구 세포의 분화 또는 성숙이 충분히 진행되지 않고, 그 결과 혈소판의 방출능이 향상되지 않는 것에 기인한다고 추정된다.
그래서, 본 발명은 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구의 제조 방법의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 제조 방법(이하, 「다핵화 거핵구의 제조 방법」이라고도 한다)은 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법으로서,
다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정을 포함하고,
상기 다핵화 공정에 있어서, 방향족 탄화수소 수용체(AhR), Rho 결합 키나아제(ROCK), 이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제(DYRK) 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민(Harmine)의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도한다.
본 발명의 혈소판의 제조 방법은, 다핵화 전의 거핵구 세포로부터 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정과,
상기 다핵화 거핵구 세포로부터 혈소판을 산생하는 혈소판 산생 공정을 포함하고,
상기 다핵화 공정은, 상기 본 발명의 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법에 의해 실시된다.
본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법은, 혈소판으로부터 혈소판 제제를 제조하는 제제 공정을 포함하고,
상기 혈소판은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에서 얻어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 혈액 제제의 제조 방법은, 혈소판과 다른 성분을 혼합함으로써, 혈액 제제를 제조하는 혈액 제제 공정을 포함하고,
상기 혈소판은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에서 얻어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 집단은, 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20% 이상이다.
본 발명의 세포 집단은 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구는 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32n 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%이다.
본 발명에 따르면, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구를 제조할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 있어서의 다핵화의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 있어서의 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 참고예 1A에 있어서의 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 참고예 1B에 있어서의 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 실시예 1에 있어서의 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 1에 있어서의 F1 분획의 세포의 위상차상을 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 1에 있어서의 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 있어서의 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 3에 있어서의 다핵화 거핵구의 핵상을 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 있어서의 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 참고예 1A에 있어서의 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 참고예 1B에 있어서의 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 실시예 1에 있어서의 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 1에 있어서의 F1 분획의 세포의 위상차상을 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 1에 있어서의 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 있어서의 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 3에 있어서의 다핵화 거핵구의 핵상을 나타내는 그래프이다.
<다핵화 거핵구의 제조 방법>
본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법으로서, 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정을 포함하고, 상기 다핵화 공정에 있어서, 방향족 탄화수소 수용체(AhR), Rho 결합 키나아제(ROCK), 이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제(DYRK) 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민(Harmine)의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도한다. 본 발명에 따르면, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민(Harmine)의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시킴으로써, 얻어진 다핵화 거핵구의 혈소판 산생능을 증강할 수 있다.
본 발명의 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법은, 예를 들어 분화가 진행된 또는 성숙도의 증진된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법이라고 할 수도 있다. 또한, 본 발명의 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법에 의하면, 거핵구의 다핵화를 촉진할 수 있기 때문에, 거핵구 세포의 다핵화 촉진 방법 또는 거핵구 세포의 핵상의 증강 방법이라고 할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 「증강」은, 대조군과 비교하여, 원하는 파라미터가 유의미하게 증가하고 있는 것을 의미한다. 이 때문에, 상기 증강은, 예를 들어 증가, 향상 또는 강화라고 할 수도 있다.
본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법은, 혈소판의 산생능을 증강 가능하고, 그 결과, 예를 들어 혈소판의 산생량을 증강 가능한 점에서, 예를 들어 혈소판 산생 또는 혈소판 산생량의 증강 방법, 혈소판 산생 또는 혈소판 산생량의 향상 방법, 혈소판 산생 또는 혈소판 산생량의 개선 방법 등이라고 할 수도 있다. 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법은, 예를 들어 시험관 내에 있어서 실시하는 방법이다.
본 발명에 있어서, 「거핵구 세포(거핵구)」는, 생체 내에 있어서는 골수 중에 존재하는 최대의 세포이고, 혈소판을 방출할 수 있는 세포, 혈소판을 방출하는 세포 및 동등한 기능을 갖는 세포를 의미한다. 상기 동등의 기능을 갖는 세포는, 혈소판 산생능을 갖는 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서, 거핵구는 다핵화(다배체화) 전의 거핵구, 즉 미성숙한 거핵구 또는 증식기의 거핵구여도 되고, 다핵화 후의 거핵구(다핵화 거핵구)여도 된다. 구체예로서, 상기 거핵구는, 예를 들어 전 거핵아구, 거핵아구구, 전거핵구 및 성숙 거핵구의 어느 것이어도 된다. 상기 다핵화 후의 거핵구가 갖는 염색체의 세트수(핵상: N)는 2세트를 초과하면 되고, 구체예로서 4 내지 64세트(4N 내지 64N), 4 내지 32세트(4N 내지 32N), 8 내지 64세트(8 내지 64N), 16 내지 32세트(16 내지 32N) 또는 16 내지 64세트(16 내지 64N)이다.
상기 거핵구의 유래는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 인간 및 비인간 동물을 들 수 있다. 상기 비인간 동물은, 예를 들어 원숭이, 고릴라, 침팬지, 마모셋 등의 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 양, 말, 모르모트 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 거핵구는 세포 표면 마커에 의해 특정할 수 있다. 상기 거핵구가 인간 유래의 경우, 상기 세포 표면 마커는 CD41a, CD42a 및 CD42b를 들 수 있다. 즉, 상기 거핵구는 CD41a, CD42a 및 CD42b가 양성의 세포이다. 상기 거핵구가 인간 유래의 경우, 상기 세포 표면 마커는, 예를 들어 CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 및 CD203c로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나여도 된다.
상기 다핵화 전의 거핵구 및 상기 다핵화 거핵구는, 예를 들어 염색체의 세트수에 의해 특정할 수 있다. 구체예로서, 대상의 거핵구 세포에 있어서, 염색체의 세트수(N)가 8N 미만, 상기 대상의 거핵구 세포는, 다핵화 전의 거핵구라고 평가할 수 있다. 한편, 대상의 거핵구 세포에 있어서, 염색체의 세트수(N)가 8N 이상, 바람직하게는 16N 이상의 상기 대상의 거핵구 세포는, 다핵화 거핵구라고 평가할 수 있다. 상기 염색체의 세트수(핵상)는 후술하는 실시예 1(3)에 준해서 평가할 수 있다.
상기 대상의 거핵구 세포가 복수인 경우, 즉 상기 대상의 거핵구 세포의 집단(세포 집단)인 경우, 상기 대상의 거핵구 세포의 집단에 있어서, 염색체의 세트수(N)가 8N 이상의 세포의 비율이 10% 미만인 경우, 상기 대상의 거핵구 세포의 집단은 다핵화 전의 거핵구의 집단이라고 평가할 수 있다. 또한, 상기 대상의 거핵구 세포의 집단에 있어서, 염색체의 세트수(N)가 8N 이상의 세포의 비율이 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상 또는 50% 이상인 경우, 상기 대상의 거핵구 세포의 집단은, 다핵화 거핵구를 포함하는 집단이라고 평가할 수 있다. 상기 대상의 거핵구 세포의 집단은, 예를 들어 1×105 내지 1×106개의 세포이다.
본 발명에 있어서, 「혈소판의 산생능」은, 예를 들어 혈소판 산생에 제공하는 거핵구 세포의 수를 기준으로 했을 때의 혈소판의 수로서 평가할 수 있다. 상기 거핵구 세포는, 예를 들어 다핵화 전의 거핵구, 다핵화 거핵구, 성숙 거핵구 등을 들 수 있다. 상기 「혈소판의 산생능」은, 예를 들어 대략 동일한, 분화, 성숙 또는 배양 단계의 거핵구 세포를 사용해, 대략 동일수의 거핵구 세포를 배양함으로써, 비교 검토할 수 있다. 구체예로서, 상기 「혈소판의 산생능」은, 예를 들어 상기 혈소판의 산생 개시 시의 다핵화 거핵구의 수(M)에 대한 상기 혈소판 산생 공정 후에 있어서의 혈소판의 수(P)의 비(P/M비)로서 나타낼 수 있다. 이 경우, 상기 다핵화 거핵구의 혈소판 산생능의 향상은, 예를 들어 AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하지 않고, 또한 하르민의 비존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시킨 다핵화 거핵구의 P/M비로서, 유의미하게 P/M비가 높은 것을 의미한다. 후술하는 바와 같이, 불사화 거핵구를 사용해서 혈소판의 산생을 개시하는 경우, 상기 혈소판의 산생 개시 시의 다핵화 거핵구의 수(M)는 유전자의 강제 발현을 해제했을 때의 불사화 거핵구의 수(M)로 바꾸어 읽어, 상기 P/M비의 설명을 원용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「혈소판」은 혈액 중의 세포 성분 중 하나이며, CD41a 및 CD42b가 양성인 세포 성분을 의미한다. 상기 혈소판은, 예를 들어 세포핵을 갖지 않고, 또한 상기 거핵구와 비교하여 크기가 작다. 이 때문에, 상기 혈소판과 상기 거핵구란, 예를 들어 세포핵의 유무 및/또는 크기에 따라 구별할 수 있다. 상기 혈소판은, 혈전 형성과 지혈에 있어서 중요한 역할을 함과 함께, 손상 후의 조직 재생이나 염증의 병태 생리에도 관여하는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 혈소판은 출혈 등에 의해 혈소판이 활성화되면, 그 막 상에 인테그린 αIIBβ3(당단백질 IIb/IIIa; CD41a와 CD61의 복합체) 등의 세포 접착 인자의 수용체가 발현하는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 혈소판이 활성화되면, 혈소판끼리가 응집하고, 혈소판으로부터 방출되는 각종 혈액 응고 인자에 의해 피브린이 응고함으로써, 혈전이 형성되고, 지혈이 진행된다. 본 발명에 있어서, 상기 혈소판의 유래는, 상기 거핵구의 유래와 동일하다.
본 발명에 있어서, 상기 혈소판의 생리 활성은, 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 혈소판의 생리 활성은, 예를 들어 활성화한 혈소판막 상의 인테그린 αIIBβ3에 특이적으로 결합하는 PAC-1에 대한 항체를 사용하여, 활성화한 혈소판량을 평가할 수 있다. 또한, 상기 혈소판의 생리 활성은, 예를 들어 혈소판의 활성화 마커인 CD62p(P-셀렉틴)를 항체에서 검출하고, 활성화한 혈소판량을 평가 해도 된다. 상기 혈소판의 생리 활성은, 예를 들어 플로 사이토메트리를 사용하고, 활성화 비의존성의 혈소판 마커 CD61 또는 CD41에 대한 항체에서 게이팅을 행하고, 그 후, 항PAC-1 항체나 항CD62p 항체의 결합을 검출함으로써 실시해도 된다. 이들의 혈소판의 생리 활성의 평가는 아데노신이인산(ADP) 존재 하에서 실시해도 된다.
본 발명에 있어서, 상기 혈소판의 생리 활성의 평가는, 예를 들어 ADP 존재 하에서 피브리노겐과 결합하는지의 여부를 보고 평가해도 된다. 상기 혈소판이 피브리노겐과 결합함으로써, 혈전 형성의 초기에 필요한 인테그린의 활성화가 발생한다. 또한, 상기 혈소판의 생리 활성은, 예를 들어 국제공개 제2011/034073호의 도 6에 나타나는 바와 같이, 생체 내에서의 혈전 형성능을 가시화해서 관찰하는 방법으로 실시해도 된다.
본 발명에 있어서, 「기능성이 높다(생리 활성이 높다)」는, 예를 들어 종래가 방법에서 얻어진 혈소판과 비교하여, 전술한 어느 것의 방법으로 측정한 혈소판의 생리 활성이 유의미하게 높거나, 높은 경향이 있거나, 또는 생체로부터 단리된 혈소판과 생리 활성이 동등한 것을 의미한다. 또한, 상기 「기능성이 높다」는, 예를 들어 전술의 어느 것의 방법으로 측정한 혈소판의 생리 활성이, 생체로부터 단리된 혈소판의 생리 활성과 비교하여, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상인 것을 의미해도 된다.
상기 혈소판은, 예를 들어 상기 혈소판의 CD42b의 발현율이 낮은 경우 또는 아넥신 V 양성률이 낮은 경우, 열화되어 있거나 또는 이상(이하, 아울러 「열화」라고도 한다)이라고 평가할 수 있는, 즉 상기 혈소판의 생리 활성은 낮다고 평가할 수 있다. 이 때문에, 산생된 혈소판에 있어서의 열화되어 있는 혈소판의 비율이 낮을수록, 예를 들어 상기 산생된 혈소판은, 생리 활성이 높다고 평가할 수 있다. 또한, 열화하고 있는 혈소판은, 예를 들어 혈전 형성 기능(혈액 응고 기능) 및 지혈 기능을 충분히 갖지 않고, 임상적인 유용성이 낮다.
본 발명에 있어서, 상기 「혈소판의 열화」는, 예를 들어 상기 혈소판 표면의 CD42b(GPIbα)가 감소하는 것을 말한다. 즉, 열화되어 있는 혈소판은, 예를 들어 CD42b의 발현이 저하된 혈소판 및 쉐딩 반응에 의해 CD42b의 세포외 영역이 절단된 혈소판을 포함한다. 상기 혈소판 표면의 CD42b가 없어지면, 상기 혈소판은, 예를 들어 폰·윌브랜드 인자(von Willebrand factor: VWF)와의 회합을 할 수 없게 되어, 결과적으로, 상기 혈소판의 혈액 응고 기능이 상실된다. 상기 혈소판의 열화는, 예를 들어 상기 혈소판 분획 중의 CD42b 양성률(또는 CD42b 양성 입자수)에 대한 CD42b 음성률(또는 CD42b 음성 입자수)을 지표로 해서 평가할 수 있다. 구체예로서, CD42b 양성률에 대한 CD42b 음성률이 높을수록, 또는 CD42b 양성 입자수에 대한 CD42b 음성 입자수가 많을수록, 상기 혈소판은, 열화되어 있다고 평가할 수 있다. 상기 CD42b 양성률은, 상기 혈소판 분획에 포함되는 혈소판 중, 항CD42b 항체를 결합할 수 있는 혈소판의 비율을 의미한다. 또한, 상기 CD42b 음성률은, 혈소판 분획에 포함되는 혈소판 중, 항CD42b 항체가 결합하지 않는 혈소판의 비율을 의미한다.
본 발명에 있어서 「이상 혈소판」은, 예를 들어 음성 전하 인지질인 포스파티딜세린이 지질 이중층의 내측으로부터 외측으로 노출된 혈소판을 말한다. 생체 내에 있어서는, 포스파티딜세린은 혈소판의 활성화에 따라 표면에 노출하고, 거기에 많은 혈액 응고 인자가 결합함으로써, 혈액 응고 캐스케이드 반응이 증폭되는 것이 알려져 있다. 한편, 상기 이상 혈소판에서는, 예를 들어 항상 많은 포스파티딜세린이 표면에 노출되어 있기 때문에, 상기 이상 혈소판이 환자에 투여되면, 예를 들어 과잉 혈액 응고 반응을 야기하고, 파종성 혈관 내 응고 증후군 등이 위중한 병태가 야기될 가능성이 있다. 포스파티딜세린에는 아넥신 V가 결합하는 것이 알려져 있기 때문에, 상기 혈소판 표면 상의 포스파티딜세린은, 예를 들어 형광 표지한 아넥신 V의 결합량을 지표로 하고, 플로 사이토미터를 사용해서 검출할 수 있다. 이 때문에, 상기 이상 혈소판의 양은, 예를 들어 상기 혈소판 분획 중의 아넥신 V 양성률, 즉 아넥신 V가 결합하는 혈소판의 비율 또는 수로 평가할 수 있다. 구체예로서, 아넥신 V 양성률이 높을수록 또는 아넥신 V 입자수가 많을수록, 대상의 혈소판에는, 이상 혈소판이 많다고 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구는, 예를 들어 거핵구로부터 미분화하는 세포(「다핵화 전의 거핵구의 전구 세포」라고도 한다)로부터 유도될 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법은, 예를 들어 상기 다핵화 공정에 앞서, 거핵구로부터 미분화하는 세포로부터 다핵화 전의 거핵구를 유도하는 거핵구 유도 공정을 포함해도 된다. 상기 거핵구 유도 공정에 있어서 사용하는 배지, 배양 조건 등은, 예를 들어 후술하는 다핵화 공정의 설명을 원용할 수 있다.
상기 「거핵구로부터 미분화하는 세포」는, 상기 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 의미한다. 구체예로서, 상기 거핵구로부터 미분화하는 세포는, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, CD34 양성 세포, 거핵구·적아구 전구 세포(megakaryocyte-erythroid progenitor: MEP), 거핵구 전구 세포 등을 들 수 있다. 상기 거핵구로부터 미분화하는 세포는, 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈 등으로부터 단리해도 되고, ES 세포(배아줄기 세포, embryonic stem cells), 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells, iPS 세포), 핵이식 ES 세포(ntES 세포), 생식성 줄기 세포, 체성 줄기 세포, 배성 종양 세포 등의 다능성 세포 또는 다능성 줄기 세포로부터 유도해도 된다.
상기 거핵구의 유도 방법은, 특별히 제한되지 않고, 공지된 유도 방법에 의해 실시할 수 있다. 구체예로서, 상기 거핵구의 유도 방법은, 예를 들어 국제공개 제2011/034073호, 국제공개 2012/157586호 등으로 기재된 방법을 들 수 있다. 구체예로서, 상기 거핵구 유도 공정에서는, 예를 들어 상기 거핵구로부터 미분화하는 세포에, 암 유전자 및 폴리콤 유전자를 강제 발현시켜도 된다. 이에 의해, 상기 거핵구 유도 공정에서는, 예를 들어 다핵화 전의 거핵구에 상당하는 무한히 증식하는 불사화 거핵구를 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어 상기 불사화 거핵구의 상기 강제 발현을 해제함으로써, 상기 불사화 거핵구는 다핵화 거핵구로 유도되어, 혈소판을 산생시킬 수 있다. 이 때문에, 상기 불사화 거핵구는, 다핵화 전의 거핵구에 상당한다. 또한, 상기 거핵구 유도 공정에서는, 예를 들어 상기 거핵구 전구 세포에 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜도 된다. 이에 의해, 상기 거핵구 유도 공정에서는, 상기 불사화 거핵구를 얻을 수 있다. 또한, 후술하는 혈소판 산생 공정에 있어서, 예를 들어 상기 불사화 거핵구의 상기 강제 발현을 해제함으로써, 상기 불사화 거핵구가 성숙하고, 상기 혈소판이 산생된다.
상기 거핵구 유도 공정에서는, 예를 들어 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자 및 상기 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜도 된다. 이 경우, 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자 및 상기 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현은, 동시에 행해도 되고, 별개로 행해도 된다. 구체예로서, 상기 거핵구 유도 공정에서는, 상기 암 유전자 및 상기 폴리콤 유전자를 강제 발현 후, 상기 강제 발현을 해제하고, 다음에, 상기 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜도 되고, 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자 및 상기 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜도 되고, 상기 암 유전자 및 상기 폴리콤 유전자를 강제 발현시키고, 또한 상기 아포토시스 억제 유전자를 발현시켜도 된다. 이에 의해, 상기 거핵구 유도 공정에서는, 상기 불사화 거핵구를 얻을 수 있다. 또한, 후술하는 혈소판 산생 공정에 있어서, 예를 들어 상기 불사화 거핵구의 상기 강제 발현을 해제함으로써, 상기 불사화 거핵구가 성숙하고, 상기 혈소판이 산생된다.
상기 거핵구 유도 공정은, 예를 들어 각 유전자의 도입 효율을 향상시킬 수 있는 점에서, 상기 거핵구로부터 미분화하는 세포에, 암 유전자 및 폴리콤 유전자를 강제 발현시키는 제1 발현 공정과, 상기 미분화하는 세포에 있어서, Bcl-xL 유전자 등의 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시키는 제2 발현 공정과, 상기 강제 발현을 모두 해제하는 해제 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 상기 강제 발현을 해제함으로써, 예를 들어 상기 불사화 거핵구로부터 다핵화 거핵구가 유도되어, 상기 혈소판이 산생된다. 이 때문에, 상기 해제 공정은, 후술하는 혈소판 산생 공정이라고 할 수도 있다.
각 유전자의 강제 발현 및 강제 발현의 해제는, 예를 들어 국제공개 제2011/034073호, 국제공개 제2012/157586호, 국제공개 제2014/123242호 또는 하기 참고 문헌 1에 기재된 방법 등의 공지된 방법, 또는 그것에 준하는 방법으로 실시할 수 있다. 구체예로서, 각 유전자의 강제 발현 및 강제 발현의 해제는, 예를 들어 약제 응답성의 유전자 발현 유도 시스템을 사용해서 실시할 수 있다. 상기 유전자 발현 유도 시스템은, 예를 들어 Tet-on(등록상표) 시스템, Tet-off(등록상표) 시스템 등을 들 수 있다. 상기 Tet-on 시스템을 사용하는 경우, 예를 들어 상기 강제 발현하는 공정에서는, 테트라사이클린, 독시사이클린 등의 유전자 발현을 유도하는 약제의 존재 하, 배양을 실시하고, 상기 강제 발현을 해제하는 공정에서는, 상기 약제의 비존재 하에서, 상기 배양을 실시한다.
참고 문헌 1: Nakamura S et al, "Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.", Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
본 발명에 있어서, 「암 유전자」는 생체 내에서 세포의 암화를 유도 가능한 유전자를 의미하고, 예를 들어 c-MYC, N-MYC, L-MYC 등의 MYC 패밀리 유전자, SRC패밀리 유전자, RAS 패밀리 유전자, RAF 패밀리 유전자, c-kit(CD117), PDGFR(혈소판 성장 인자 수용체), Abl(아벨손 쥐 백혈병 바이러스 종양 유전자 호몰로그(Abelson murine leukemia viral oncogene homolog)) 등의 프로테인 키나아제 패밀리 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「폴리콤 유전자」는 CDKN2a(사이클린 의존성 키나아제 저해 2A, INK4a/ARF)를 부로 제어하고, 세포 노화를 회피하기 위해서 기능한다고 알려져 있는 유전자를 의미한다(하기 참고 문헌 2 내지 4). 구체예로서, 상기 폴리콤 유전자는, 예를 들어 BMI1(폴리콤 콤플렉스 단백질 BMI-1, 폴리콤 그룹 링 핑거 단백질 4(PCGF4), 링 핑거 단백질 51(RNF51)), Mel18(폴리콤 그룹 링 핑거 단백질 2), 링(링 핑거 단백질) 1a/b, Phc(폴리호메오틱 호몰로그) 1/2/3, Cbx(크로모박스) 2/4/6/7/8, Ezh2(제스트 2의 인핸서 폴리콤 억제 콤플렉스 2 서브유닛), Eed(배아 외배엽 발달), Suz12(SUZ12 폴리콤 억제 콤플렉스 2 서브유닛), HADC(히스톤 디아세틸라아제), D㎚t(DNA (사이토신-5)-메틸트랜스퍼라아제) 1/3a/3b 등을 들 수 있다.
참고 문헌 2: 오구로 히데유키 외, 「폴리콤군 단백 복합체에 의한 줄기 세포의 노화 제어」, 재생 의료, 2007년, 제6권, 제4호, 26-32 페이지
참고 문헌 3: Jesus Gil et.al, "Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all", Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007, vol.7, pages 667-677
참고 문헌 4: Soo-Hyun Kim et.al.," Absence of p16 INK4a and truncation of ARF tumor suppressors in chickens", PNAS, 2003, vol.100, No.1, pages 211-216
본 발명에 있어서, 「아포토시스 억제 유전자」는, 세포의 아포토시스를 억제 가능한 기능을 갖는 유전자를 의미하고, 예를 들어 BCL2(B-세포 림프종 2), Bcl-xL(B-세포 림프종-특대), 서바이빈(배큘로바이러스 IAP 반복 포함 5), MCL1(BCL2 패밀리 아포토시스 레큘레이터) 등을 들 수 있다.
본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에서는, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시키는 증식 공정을 포함해도 된다. 이 경우, 상기 증식 공정에서는, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하지 않고, 또한 하르민(Harmine)의 비존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시킨다. 이에 의해, 상기 증식 공정에서는, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포에 대해서, 다핵화 전의 상태를 유지한 채, 증식시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 증식 공정에서는, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 다핵화 전 거핵구를 배양하고, 상기 다핵화 전 거핵구를 증식시킨다. 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자는, 배양액 중에 존재해도 되고, 상기 다핵화 전 거핵구 내에 존재해도 된다. 또한, 상기 증식 공정에서는, 상기 배양액에, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 저해하는 물질 및 하르민을 첨가하지 않음으로써, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하지 않고, 하르민 비존재 하에서, 증식을 실시할 수 있다. 상기 증식 공정에 있어서 사용하는 배지, 배양 조건 등은, 예를 들어 후술하는 다핵화 공정의 설명을 원용할 수 있다.
상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자로서는, 예를 들어 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO) 등을 들 수 있다.
상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상기 증식 인자의 종류 및 유효 농도에 따라, 적절히 설정할 수 있다. 상기 증식 인자가 SCF 또는 TPO의 경우, 상기 증식 인자의 농도는, 예를 들어 0.1 내지 1000ng/ml 또는 1 내지 200ng/ml이다.
상기 증식 공정의 배양 기간은, 예를 들어 원하는 세포수의 다핵화 전 거핵구가 얻어질 때까지의 기간으로 할 수 있다. 구체적으로는, 상기 증식 공정의 배양 기간은, 예를 들어 1일 이상이고, 구체예로서 1 내지 20일, 1 내지 15일, 1 내지 10일, 1 내지 5일, 2 내지 5일 또는 2 내지 4일이다.
상기 다핵화 전 거핵구로서, 상기 불사화 거핵구를 사용하는 경우, 상기 불사화 거핵구는, 상기 암 유전자 및 상기 폴리콤 유전자 또는 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자 및 상기 아포토시스 억제 유전자가 발현하고 있으면, 상기 불사화 거핵구가 다핵화 전의 상태를 유지하면서, 증식한다. 이 때문에, 상기 불사화 거핵구를 사용하는 경우, 상기 제1 발현 공정 및/또는 상기 제2 발현 공정을, 증식 공정이라고 할 수 있다. 또한, 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자, 및/또는 상기 아포토시스 억제 유전자가 코드하는 단백질, 즉 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자, 및/또는 상기 아포토시스 억제 유전자로부터 발현하는 단백질은, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자라고 할 수도 있다. 상기 다핵화 전 거핵구로서, 상기 불사화 거핵구를 사용하는 경우, 상기 증식 공정은, 상기 불사화 거핵구에 관한 거핵구 유도 공정의 설명을 원용할 수 있다.
다음에, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에서는, 상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포로부터 다핵화 거핵구를 유도한다. 또한, 상기 다핵화 공정에서는, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시키고, 다핵화 거핵구 세포를 유도한다. 구체적으로는, 상기 다핵화 공정에서는, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자와, AhR의 활성 억제 물질, ROCK의 활성 억제 물질, DYRK의 활성 억제 물질 및 미오신 2의 활성 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민의 존재 하, 상기 다핵화 전 거핵구를 배양하고, 상기 다핵화 거핵구를 유도한다. 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자는, 배양액 중에 존재해도 되고, 상기 다핵화 전 거핵구 내에 존재해도 된다. 상기 AhR의 활성 억제 물질, 상기 ROCK의 활성 억제 물질, 상기 DYRK의 활성 억제 물질, 상기 미오신 2의 활성 억제 물질, 및/또는 하르민은, 예를 들어 상기 다핵화 전 거핵구의 배지에 함유된다. 상기 다핵화 공정에서는, 거핵구의 비대화가 유도되는 것으로부터, 예를 들어 비대화 공정이라고 할 수도 있다. 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자, 상기 AhR의 활성 억제 물질, 상기 ROCK의 활성 억제 물질, 상기 DYRK의 활성 억제 물질, 및/또는 상기 미오신 2의 활성 억제 물질이 단백질 또는 핵산 분자일 경우, 상기 다핵화 공정에서는, 리포펙션, 일렉트로포레이션 등에 의해, 상기 다핵화 전 거핵구에 도입해도 된다.
상기 다핵화 공정에 있어서, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2 중, 어느 하나의 활성을 억제 해도 되고, 2개 이상의 활성을 억제해도 된다. 후자의 경우, 활성을 억제하는 대상의 조합은, 임의의 조합으로 할 수 있고, 다핵화의 촉진능 또는 혈소판의 산생 향상능이 높은 점에서, 바람직하게는 AhR 및 미오신 2의 조합, AhR, ROCK 및 미오신 2의 조합, AhR, DYRK 및 미오신 2의 조합 또는 AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 조합이다. 이 때문에, 상기 다핵화 공정은, 바람직하게는 AhR 및 미오신 2의 활성을 억제하고, 하르민의 존재 하 실시하거나, AhR, ROCK 및 미오신 2의 활성을 억제하고, 하르민의 존재 하 실시하거나, AhR, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하고, 하르민의 존재 하 실시하거나, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하고, 하르민의 존재 하 실시한다.
상기 AhR은 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor)를 의미한다. 상기 AhR은, 통상 세포질에 존재하고, 활성화에 수반하여 핵 내로 이행하고, 전사 활성을 발휘한다.
상기 다핵화 공정에 있어서, AhR의 활성 억제는, 상기 AhR의 활성 억제 물질 비존재 하와 비교하여, AhR의 활성이 저하되고 있는 것을 의미한다. 상기 AhR의 활성은, 예를 들어 AhR의 핵 내 이행을 지표로 측정할 수 있다. 상기 AhR의 활성은, 예를 들어 시판되는 AhR 단백질의 활성 측정 키트를 이용할 수 있고, 구체예로서, 핵 내 수용체 어세이 키트(PURACYP사제) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 활성의 억제는, 예를 들어 활성의 저해, 활성의 저하, 활성화의 억제, 활성화의 방지 등이라고 할 수도 있다.
상기 AhR은 Per/ARNT/SIM (PAS) 패밀리에 속하는 전사 인자이다. AhR은, 예를 들어 리간드가 결합하지 않고 있는 상태에서는 불활성이며, 방향족 탄화수소 화합물이 리간드로서 결합하면, 핵 내로 이행한다. 그리고, 상기 핵 내 이행 후, 상기 AhR은, 예를 들어 ARNT(Ahr Nuclear Translocator)와 헤테로 이량체를 형성하고, 이물 응답 배열(Xenobiotic Responsive Element(XRE), DRE라고도 한다)과 결합하고, 전사를 활성화한다.
상기 AhR 저해제는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 AhR 안타고니스트, AhR의 발현을 억제 가능한 발현 억제 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 AhR 안타고니스트는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀(SR1), α-나프토플라본(CAS 604-59-1), 1,4-디히드로시안트라퀴논, 1,5-디히드로시안트라퀴논, 1,8-디히드로시안트라퀴논, 갈랑긴(CAS 548-83-4), 레스베라트롤, 2-메틸-2H-피라졸-3-카르복실산(2-메틸-4-o-톨릴아조-페닐)-아미드(CH-223191), N-(2-(3H-인돌-3-일)에틸)-9-이소프로필-2-(5-메틸-3-피리딜)-7H-퓨린-6-아민(GNF351), 2-(29-아미노-39-메톡시페닐)-옥사나프탈렌-4-온(PD98059), (Z)-3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸리데닐]-2-인돌리논(TSU-16), 6,2',4'-트리메톡시플라본(TMF), 3',4'-디메톡시플라본(DMF) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 AhR 안타고니스트는, 예를 들어 국제공개 제2012/015914호에 AhR 안타고니스트로서 기재된 화합물이어도 된다. 상기 AhR의 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 상기 AhR을 코드하는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, miRNA 등의 발현 억제 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 AhR에 대한 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 데이터베이스에 등록되어 있는 AhR의 mRNA의 염기 서열에 기초하여, 적절히 설정할 수 있다. 구체예로서, 인간 AhR의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_001621로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 상기 AhR의 활성 억제 물질은, 1종류를 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 AhR 저해제의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 화합물의 종류 및 그 유효 농도에 따라, 적절히 결정할 수 있다. 상기 AhR 저해제의 농도는, 예를 들어 이하의 농도를 들 수 있다.
SR1: 200nmmol/L 이상 1000mmol/L 미만
CH-223191: 0.2μmol/l 이상 4μmol/l 미만
GNF351: 20nmol/l 이상 300nmol/l 미만, 20nmol/l 이상 1000nmol/l 미만
TMF: 2.5μmol/l 이상 40μmol/l 미만
DMF: 2.5μmol/l 이상 40μmol/l 미만
상기 ROCK는, Rho 결합 키나아제(Rho-associated coiled-coil forming kinase(ROCK))를 의미한다.
상기 다핵화 공정에 있어서, ROCK의 활성 억제는, 예를 들어 상기 ROCK의 활성 억제 물질 비존재 하와 비교하여, ROCK의 활성이 저하되고 있는 것을 의미한다. 상기 ROCK의 활성은, 예를 들어 ROCK에 의한 기질의 인산화를 지표로 측정할 수 있다. 상기 ROCK의 활성은, 예를 들어 시판되는ROCK 단백질의 활성 측정 키트를 이용할 수 있고, 구체예로서, ROCK 활성 측정 키트(96-Well ROCK Activity Assay Kit, Cell Bioloabs사제) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 활성의 억제는, 예를 들어 활성의 저해, 활성의 저하, 활성화의 억제, 활성화의 방지 등이라고 할 수도 있다.
상기 ROCK 저해제는 예를 들어 ROCK 안타고니스트, ROCK의 발현을 억제 가능한 발현 억제 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 ROCK 저해제는 예를 들어 (R)-(+)-트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복사미드(Y-27632), 4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)벤즈아미드(Y-39983), 파수딜염(파수딜(HA1077) 염산염), 4-플루오로-5-[[(2S)-헥사히드로-2-메틸-1H-1,4-디아제핀-1-일]술포닐]-이소퀴놀린(리파수딜), 2-(3-(4-((1H-인다졸-5-일)아미노)퀴나졸린-2-일)페녹시)-N-이소프로필아세트아미드(SLx-2119), N-[(3-히드록시페닐)메틸]-N'-[4-(4-피리디닐)-2-티아졸릴]우레아 디히드로클로라이드(RKI-1447), 6-클로로-N4-[3,5-디플루오로-4-[(3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)옥시]페닐]-2,4-피리미딘디아민(TC-S 7001, 아자인돌 1), N-[2-[2-(디메틸아미노)에톡시]-4-(1H-피라졸-4-일)페닐-2,3-디히드로-1,4-벤조다이옥신-2-카르복사미드(SR-3677), 스타우로스포린, (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]호모피페라진(H-1152), rac-(2R)-2-(디메틸아미노)-N-(1-옥소-1,2-디히드로이소퀴놀린-6-일)-2-(티오펜-3-일)아세트아미드(AR-12286), N-(1-{[4-(메틸술파닐)페닐]메틸}피페리딘-3-일)-1H-인다졸-5-아민(INS-117548) 등을 들 수 있다. 상기 ROCK의 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 상기 ROCK를 코드하는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, miRNA 등의 발현 억제 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 ROCK에 대한 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 데이터베이스에 등록되어 있는 ROCK의 mRNA의 염기 서열에 기초하여, 적절히 설정할 수 있다. 구체예로서, 인간 ROCK1의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_005406로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 인간 ROCK2의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_004850로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 상기 ROCK의 활성 억제 물질은, 1종류를 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 ROCK 저해제의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 화합물의 종류 및 그 유효 농도에 따라, 적절히 결정할 수 있다. 상기 ROCK의 활성 억제 물질이 Y-39983의 경우, 상기 ROCK의 활성 억제 물질의 농도는, 예를 들어 1×10-8 내지 1×10-3mol/l이고, 바람직하게는 1×10-7 내지 1×10-5mol/l이다.
상기 DYRK는, 이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제(Dual Specificity Tyrosine Phosphorylation Regulated Kinase)를 의미한다.
상기 DYRK 활성의 억제에 있어서, 대상으로 하는 DYRK는, 예를 들어 DYRK1A, DYRK1B, DYRK2 등을 들 수 있어, 바람직하게는 DYRK1A이다. 일례로서, 이하에,DYRK1A 활성을 저해하는 경우를 예로 들어 설명한다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 DYRK1A 활성의 억제는, 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질 비존재 하와 비교하여, DYRK1A의 활성이 저하되고 있는 것을 의미한다. 상기 DYRK1A의 활성은, 예를 들어 DYRK1A 단백질과, 기질을 사용한 측정계, 기질의 인산화를 지표로 측정할 수 있다. 전자로서는, 예를 들어 시판되는 DYRK1A 단백질의 활성 측정 키트를 이용할 수 있고, 구체예로서, DYRK1A Kinase Enzyme System(Promega사 제조, Cat. No. VA7423, VA7424) 등을 들 수 있다. 후자로서는, 예를 들어 하기 참고 문헌 5를 참조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 활성의 억제는, 예를 들어 활성의 저해, 활성의 저하, 활성화의 억제, 활성화의 방지 등이라고 할 수도 있다.
참고 문헌 5: Isao Kii et.al., "Selective inhibition of the kinase DYRK1A by targeting its folding process", Nat. Commun., 2016, vol. 7, article number 11391
상기 DYRK1A의 활성 억제 물질은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상기 DYRK1A의 활성 또는 발현을 억제하는 화합물, 단백질, 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 DYRK1A 활성 억제 화합물은, 예를 들어 공지된 DYRK1A 활성 억제 화합물 (DYRK1A 저해제)을 사용할 수 있다. 구체예로서, 상기 DYRK1A 활성 억제 화합물 (DYRK1A 안타고니스트)은, 예를 들어 하르민(harmine, 7-메톡시-1-메틸-9H-피리도[3,4-b]인돌, Cas No. 442-51-3), INDY((1Z)-1-(3-에틸-5-히드록시-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)-2-프로파논, Pubchem No.: 69538603), GSK626616((5Z)-2-[(2,6-디클로로페닐)아미노]-5-(6-퀴녹살리닐메틸렌)-4(5H)-티아졸론, Cas No. 1025821-33-3), TBB(카세인 키나아제 2 저해제 1, 4,5,6,7-테트라브로모벤조트리아졸, Cas No. 17374-26-4), AZ191(N-[2-메톡시-4-(4-메틸-1-피페라진일)페닐]-4-(1-메틸-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-3-일)-2-피리미딘아민, Cas No. 1594092-37-1), Mrik-IN-1(TC-S 7004, N-[2-클로로-5-[[[(3-클로로페닐)메틸]아미노]카르보닐]페닐]-7,8-디히드로-2-메톡시-7-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-6-카르복사미드, Cas No. 1386979-55-0), EHT5372(메틸 9-((2,4-디클로로페닐)아미노)티아졸로[5,4-f]퀴나졸린-2-카르비미데이트, Cas No. 1425945-60-3), GNF4877((R)-1-(3-(3-아미노-6-(2-플루오로-5-이소프로폭시페닐)피라진-2-카르복사미도)피리딘-4-일)피페리딘-3-카르복실산, Cas No. 2041073-22-5), FINDY((5Z)-5-[[4-메톡시-3-[2-(트리메틸실릴)에티닐]페닐]메틸렌]-2-티옥소-4-티아졸리디논, Cas No. 1507367-37-4), ML351(5-(메틸아미노)-2-(1-나프탈레닐)-4-옥사졸카르보니트릴, Cas No. 847163-28-4), CLK-IN-T3(N-(6-(3,5-디-tert-부틸페닐)이미다조[1,2-a]피리딘-2-일)-4-(2-메틸-1-(4-메틸피페라진-1-일)-1-옥소프로판-2-일)벤즈아미드, Cas No. 2109805-56-1), 카세인 키나아제 2 저해제 IX.IQA(5-옥소-5,6-디히드로인돌로[1,2-a]퀴나졸린-7-아세트산, Cas No. 391670-48-7), 프로테인 키나아제 저해제 1((E)-5-((2-옥소-6'-(피페라진-1-일)-1, 2-디히드로-[3,3'-비피리딘]-5-일)메틸렌)티아졸리딘-2,4-디온 히드로클로라이드, Cas No. 1365986-44-2), 류세틴 L41((5Z)-5-(1,3-벤조디옥솔-5-일메틸렌)-3,5-디히드로-2-(페닐아미노)-4H-이미다졸-4-온, Cas No. 1112978-84-3) 등을 들 수 있다. 상기 DYRK1A 활성 억제 화합물은, 예를 들어 하르민을 제외해도 된다. 전술한 바와 같이, 상기 다핵화 공정은, 하르민의 존재 하에서 실시한다. 이 때문에, 상기 DYRK1A 활성 억제 화합물은, 상기 하르민에 더하여, 상기 하르민 이외의 화합물을 사용하는 것이 바람직하고, 구체예로서, AZ191을 들 수 있다. 상기 DYRK1A의 활성 억제 단백질은, 예를 들어 DYRK1A의 도미넌트 네거티브 폼(DN)의 단백질을 들 수 있다. 구체예로서, 인간 DYRK1A의 DN 단백질은, 예를 들어 188번째의 리신(K)을, 아르기닌(R)에 치환한 변이체 단백질을 들 수 있다. 상기 DYRK1A의 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 상기 DYRK1A를 코드하는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, miRNA 등의 발현 억제 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 DYRK1A에 대한 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 데이터베이스에 등록되어 있는 DYRK1A의 mRNA의 염기 서열에 기초하여, 적절히 설정할 수 있다. 구체예로서, 인간 DYRK1A의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_001396, NM_101395, NM_130436, NM_130437, NM_130438, NM_001347721, NM_001347722 또는 NM_001347723으로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질은, 1종류를 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.
상기 DYRK1A의 활성 억제 물질의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질의 종류 및 유효 농도에 따라, 적절히 설정할 수 있다. 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질이 하르민의 경우, 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질의 농도는, 예를 들어 1×10-8 내지 1×10-3mol/l이고, 바람직하게는 1×10-6 내지 1×10-4mol/l이다. 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질이 AZ191의 경우, 상기 DYRK1A의 활성 억제 물질의 농도는, 예를 들어 1×10-9 내지 1×10-3mol/l이고, 바람직하게는 1×10-7 내지 1×10-5mol/l이다.
상기 미오신 2는, AT㎩se 활성을 갖는 액틴상을 운동하는 단백질이고, 2개의 중쇄와, 각중쇄에 대하여 각각 부속되는 2개의 경쇄(합계 4개)로 구성되는 복합체를 의미한다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 미오신 2의 활성 억제는, 상기 미오신 2의 활성 억제 물질 비존재 하와 비교하여, 미오신 2의 AT㎩se 활성이 저하되고 있는 것을 의미한다. 상기 미오신 2의 활성은, 예를 들어 미오신 2로부터 방출되는 인산을 지표로 측정할 수 있다. 상기 미오신 2의 활성은, 예를 들어 시판되는 미오신 2 단백질의 활성 측정 키트를 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 활성의 억제는, 예를 들어 활성의 저해, 활성의 저하, 활성화의 억제, 활성화의 방지 등이라고 할 수도 있다.
상기 미오신 2 저해제는 예를 들어 미오신 2 안타고니스트, 미오신 2의 발현을 억제 가능한 발현 억제 핵산 분자, 미오신 경쇄 키나아제(MLCK) 저해제 등을 들 수 있다. 상기 미오신 2 저해제는 예를 들어 3a-히드록시-6-메틸-1-페닐-2,3-디히드로피롤로[2,3-b]퀴놀린-4-온(블레비스타틴), CK1122534, 오메캄티브 메카르빌(메틸 4-[[2-플루오로-3-[(6-메틸피리딘-3-일)카르바모일아미노]페닐]메틸]피페라진-1-카르복실레이트), 암모사마이드스 A & B, CTK2018448, 마나싼틴 B((1R,2R)-1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-[4-[(2S,3R,4R,5S)-5-[4-[(1R,2R)-1-(3,4-디메톡시페닐)-1-히드록시프로판-2-일]옥시-3-메톡시페닐]-3,4-디메틸옥솔란-2-일]-2-메톡시페녹시]프로판-1-올) 등을 들 수 있다. 상기 MLCK 저해제는 예를 들어 ML7(헥사히드로-1-[(5-이오도-1-나프탈레닐)술포닐]-1H-1,4-디아제핀), ML9(1-(5-클로로나프탈렌-1-술포닐)-1H-헥사히드로-1,4-디아제핀) 등을 들 수 있다. 상기 미오신 2의 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 상기 미오신 2 또는 미오신 경쇄 키나아제를 코드하는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, miRNA 등의 발현 억제 핵산 분자 등을 들 수 있다. 상기 미오신 2에 대한 발현 억제 핵산 분자는, 예를 들어 데이터베이스에 등록되어 있는 미오신 2를 구성하는 중쇄 혹은 경쇄 또는 미오신 경쇄 키나아제의 mRNA의 염기 서열에 기초하여, 적절히 설정할 수 있다. 구체예로서, 인간 미오신 2를 구성하는 중쇄의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_005963, NM_001100112, NM_017534, NM_002470, NM_017533, NM_002147, NM_002471, NM_000257, NM_002472, NM_002473, NM_001256012, NM_002474, NM_001382347, NM_003802, NM_001145809 또는 NM_014981로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 인간 미오신 2를 구성하는 경쇄의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_079420, NM_000432, NM_000258, NM_002476, NM_001363650, NM_021019, NM_021223, NM_006097, NM_138403 또는 NM_001324458로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 인간 미오신 경쇄 키나아제의 mRNA는, 예를 들어 Genbank에 있어서, 액세션 번호: NM_001321309, NM_053025, NM_053026, NM_053027, NM_053028, NM_053031, NM_053032, NM_033118, NM_053032 또는 NM_18249로 등록된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 상기 미오신 2의 활성 억제 물질은, 1종류를 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 미오신 2 저해제의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 화합물의 종류 및 그 유효 농도에 따라, 적절히 결정할 수 있다. 상기 미오신 2의 활성 억제 물질이 블레비스타틴의 경우, 상기 미오신 2의 활성 억제 물질의 농도는, 예를 들어 1×10-8 내지 1×10-3mol/l이고, 바람직하게는 1×10-6 내지 1×10-4mol/l이다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 하르민의 농도는, 예를 들어 1×10-8 내지 1×10-3mol/l이고, 바람직하게는 1×10-6 내지 1×10-4mol/l이다.
상기 다핵화 공정에 있어서, AhR, ROCK, DYRK 및/또는 미오신 2의 활성 억제와, 하르민의 공존은, 동시에 실시해도 되고, 다른 시기에 실시해도 되지만, 동시에 실시하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 다핵화 전 거핵구로부터 상기 다핵화 거핵구에의 유도는, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민과의 공존을 행한 상태에서 실시하는 것이 바람직하다.
상기 다핵화 전의 거핵구가 불사화 거핵의 경우, 상기 다핵화 공정은, 예를 들어 이하와 같이 실시할 수 있다. 구체적으로, 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자, 및/또는 상기 아포토시스 억제 유전자로부터 발현하는 단백질은, 전술한 바와 같이, 상기 불사화 거핵구에 있어서의 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자로서 기능한다. 그래서, 상기 불사화 거핵구를 사용하는 경우, 상기 불사화 거핵구는, 예를 들어 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자, 및/또는 상기 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현을 유지하고, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민의 존재 하, 배양함으로써, 다핵화 거핵구를 유도한다. 이 경우, 상기 다핵화 공정에서는, 상기 불사화 거핵구의 배양중에, 상기 불사화 거핵구를 포함하는 배지를, 예를 들어 상기 AhR 저해제, 상기 ROCK 저해제, 상기 DYRK 저해제 및 상기 미오신 2 저해제로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민을 포함하는 배지로 교환하는 또는 상기 불사화 거핵구를 포함하는 배지가 상기 AhR 저해제, 상기 ROCK 저해제, 상기 DYRK 저해제 및 상기 미오신 2 저해제로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민을 첨가함으로써 실시할 수 있다. 상기 첨가 또는 교환은, 예를 들어 1회 실시해도 되고, 2회 이상 실시해도 된다.
상기 다핵화 공정에서의 배지는, 예를 들어 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상기 거핵구 또는 거핵구로부터 혈소판을 산생하기에 적합한 공지된 배지 및 그것에 준하는 배지를 들 수 있다. 구체예로서, 상기 배지는, 예를 들어 동물 세포의 배양에 사용하는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 상기 기초 배지는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, 이글의 최소 필수 배지(EMEM) 배지, αMEM 배지, 둘베코의 수정 이글 배지(DMEM), Ham's F12 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal(등록상표) Medium(Thermo Fisher Scientific사제) 등의 단독 배지 또는 이들의 혼합 배지를 들 수 있다. 상기 배지는, 예를 들어 혈청 또는 혈장을 포함해도 되고, 이들을 포함하지 않는 무혈청 배지에서도 되지만, 무혈청 배지가 바람직하다. 상기 다핵화 공정의 배지로서 무혈청 배지를 사용함으로써, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법은, 예를 들어 상기 다핵화 전의 거핵구로부터 다핵화 거핵구의 다핵화의 정도를 향상시킬 수 있다. 상기 무혈청 배지는, 예를 들어 StemSpan ACF (StemCell Technologies사 제조, Cat.No.:9855), Stemline 2(Sigma Aldrich사 제조, Cat.No.:S0192) 등을 들 수 있다. 상기 혈청 및 혈장의 유래는, 상기 거핵구의 유래와 같은 유래인 것이 바람직하다. 구체예로서, 상기 거핵구가 인간 유래인 경우, 상기 혈청 및 혈장은, 각각, 인간 유래인 것이 바람직하다. 상기 거핵구 및 혈청의 유래를 동일하게 함으로써, 본 발명의 제조 방법은, 예를 들어 상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 거핵구의 다핵화를 보다 촉진할 수 있다.
상기 배지는, 예를 들어 다른 성분을 포함해도 된다. 상기 다른 성분은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티올글리세롤, 모노티오글리세롤(MTG), 지질, 아미노산(예를 들어, L-글루타민), 아스코르브산, 헤파린, 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 사이토카인 등을 들 수 있다. 상기 다른 성분은, 예를 들어 1종류 이어도 되고, 2종류 이상이어도 된다. 상기 사이토카인은, 예를 들어 혈구계 세포의 분화를 촉진하는 물질이며, 구체예로서, 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 트롬보포이에틴(TPO), 각종TPO 유사 작용 물질, Stem Cell Factor(SCF), ITS(인슐린-트랜스페린-셀레나이트)서플리먼트, ADAM저해제, FLT저해제, WNT저해제 등을 들 수 있다. 상기 배지는, 예를 들어 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 세린, 티올글리세롤, 아스코르브산, TPO를 포함하는 IMDM 배지가 바람직하다. 상기 배지는, 예를 들어 또한 SCF를 포함하고 있어도 되고, 또한 헤파린을 포함하고 있어도 된다. 상기 다른 성분의 농도는, 특별히 제한되지 않는다. 상기TPO의 농도는, 예를 들어 약 10ng/ml 내지 약 200ng/ml, 약 50ng/ml 내지 약 100ng/ml이다. 상기 SCF의 농도는, 예를 들어 약 10ng/ml 내지 약 200ng/ml, 약 50ng/ml이다. 상기 헤파린의 농도는, 예를 들어 약 10U/ml 내지 약 100U/ml, 약 25U/ml이다. 상기 배지는, 예를 들어 또한, 포르볼에스테르(예를 들어, 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트;PMA)를 포함해도 된다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 개시 시의 다핵화 전의 거핵구의 세포 밀도는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 세포 밀도의 하한은, 예를 들어 1×105 세포/ml, 2×105 세포/ml, 3×105 세포/ml, 4×105 세포/ml이다. 상기 세포 밀도의 상한은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 4×105 세포/ml, 6×105 세포/ml, 8×105 세포/ml이다. 상기 세포 밀도의 범위는, 예를 들어 1×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml, 1×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml, 1×105 세포/ml 내지 5×105 세포/ml, 2×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml, 3×105 세포/ml 내지 6×105 세포/ml, 4×105 세포/ml 내지 6×105 세포/ml이고, 다핵화를 촉진할 수 있는 또는 혈소판의 산생을 향상시킬 수 있는 점에서, 바람직하게는 1×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml 또는 1×105 세포/ml 내지 5×105 세포/ml이다. 상기 세포 밀도는, 예를 들어 상기 다핵화 전의 거핵구의 세포수를, 상기 다핵화 전의 거핵구를 현탁하는 배지의 체적으로 제산함으로써 산출할 수 있다.
상기 다핵화 공정에서의 배양 조건은, 특별히 제한되지 않고, 상기 거핵구의 통상 배양 조건을 채용할 수 있다. 구체예로서, 배양 온도는, 예를 들어 약 35 내지 약 42℃, 약 36 내지 약 40℃, 약 37 내지 약 39℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 5 내지 약 15%이다. O2 농도는, 예를 들어 약 15 내지 약 25%, 약 20%이다.
상기 다핵화 공정의 배양 기간은, 예를 들어 상기 다핵화 전의 거핵구가 다핵화할 때까지의 기간으로서 설정할 수 있다. 상기 다핵화 공정의 배양 기간은, 배양 중인 거핵구에 차지하는 다핵화 거핵구의 비율에 따라, 적절히 설정해도 된다. 상기 다핵화 공정의 배양 기간은, 예를 들어 배양 중인 거핵구에 차지하는 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율이 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상 또는 60% 이상이 되는 기간으로 설정하는 것이 바람직하다. 구체예로서, 상기 다핵화 공정의 배양 기간은, 예를 들어 0 내지 20일, 1 내지 15일이다. 상기 거핵구에 차지하는 다핵화 거핵구의 비율은, 예를 들어 배양 중인 거핵구의 일부를 발취하고, 후술하는 실시예 1(3)에 준하여, 산출할 수 있다.
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구의 배양은, 예를 들어 피더 세포 상에서 실시해도 되고, 피더 세포없이 실시해도 된다. 상기 다핵화 전의 거핵구는, 예를 들어 부유 배양할 수 있기 때문에, 상기 피더 세포없이 배양할 수 있다. 상기 피더 세포는, 증식 또는 분화시키려고 하는 목적의 세포(목적 세포)의 배양에 필요한 환경을 정돈하기 위해서, 상기 목적 세포와 공배양되는 세포를 의미한다. 상기 피더 세포는, 상기 목적 세포와 식별 가능한 세포이면 되고, 상기 목적 세포와 동종 유래의 세포여도 되고, 이종 유래의 세포여도 된다. 상기 피더 세포는, 예를 들어 항생 물질, 항암제, γ선 조사 등에 의해 증식하지 않도록 처리된 세포여도 된다.
상기 다핵화 공정 후에 있어서, 본 발명의 제조 방법은, 다핵화 거핵구를 포함한다. 상기 다핵화 공정 후의 다핵화 거핵구는, 예를 들어 다핵화 거핵구만으로 구성되어도 되고, 다른 세포를 포함해도 된다. 후자의 경우, 상기 다핵화 공정 후의 다핵화 거핵구는, 예를 들어 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단이라고 할 수도 있다. 상기 다핵화 거핵구는, 예를 들어 8N 이상의 다핵화 거핵구여도 되고, 16N 이상 다핵화 거핵구여도 되고, 32N 이상의 다핵화 거핵구여도 된다. 상기 다핵화 공정 후의 다핵화 거핵구는, 예를 들어 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구, 상기 16N 이상 다핵화 거핵구, 및/또는 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함한다. 본 발명의 제조 방법에 의하면, 예를 들어 상기 16N 이상 다핵화 거핵구 및 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율을 증강할 수 있다.
상기 다핵화 거핵구가, 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하는 경우, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)의 하한값은, 예를 들어 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상 또는 60% 이상이다. 상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)의 상한값은, 예를 들어 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 59% 이하, 58% 이하, 57% 이하, 56% 이하, 55% 이하, 54% 이하, 53% 이하, 52% 이하, 51% 이하, 50% 이하, 49% 이하, 48% 이하, 47% 이하 또는 46% 이하이다. 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 예를 들어 15 내지 90%, 20 내지 90%, 25 내지 90%, 30 내지 90%, 35 내지 90%, 40 내지 90%, 45 내지 90%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 60 내지 90%, 15 내지 85%, 15 내지 80%, 15 내지 75%, 15 내지 70%, 15 내지 65%, 16 내지 60%, 17 내지 59%, 18 내지 58%, 19 내지 57%, 20 내지 56%, 21 내지 55%, 22 내지 54%, 23 내지 54%, 24 내지 53%, 25 내지 51%, 26 내지 50%, 27 내지 49%, 28 내지 48%, 29 내지 47% 또는 30 내지 46%이다. 상기 비율(세포수)은 예를 들어 대상의 세포 집단에 대해서 충분히 현탁 후, 얻어진 세포 현탁액의 일부를 분취하고, 후술하는 실시예 1(3)에 준한 염색체의 세트수(핵상)의 측정 방법에 의해 측정할 수 있다(이하, 마찬가지).
상기 다핵화 거핵구가, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하는 경우, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)의 하한값은, 예를 들어 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상 또는 25% 이상이다. 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)의 상한값은, 예를 들어 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 54% 이하, 53% 이하, 52% 이하, 51% 이하, 50% 이하, 49% 이하, 48% 이하, 47% 이하, 46% 이하, 45% 이하, 44% 이하 또는 43% 이하이다. 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 예를 들어 15 내지 90%, 15 내지 85%, 15 내지 80%, 15 내지 75%, 15 내지 70%, 15 내지 65%, 15 내지 60%, 16 내지 55%, 17 내지 54%, 18 내지 53%, 19 내지 52%, 20 내지 51%, 21 내지 50%, 22 내지 49%, 23 내지 48%, 24 내지 47%, 25 내지 46%, 25 내지 45%, 25 내지 44% 또는 25 내지 43%이다.
상기 다핵화 거핵구가, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하는 경우, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)의 하한값은, 예를 들어 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상 또는 15% 이상이다. 상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)의 상한값은, 예를 들어 50% 이하, 49% 이하, 48% 이하, 47% 이하, 46% 이하, 45% 이하, 44% 이하, 43% 이하, 42% 이하, 41% 이하, 40% 이하, 39% 이하, 38% 이하, 37% 이하, 36% 이하, 35% 이하, 34% 이하, 33% 이하, 32% 이하, 31% 이하 또는 30% 이하이다. 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 예를 들어 5 내지 50%, 5 내지 49%, 5 내지 48%, 5 내지 47%, 5 내지 46%, 5 내지 45%, 5 내지 44%, 5 내지 43%, 5 내지 42%, 5 내지 41%, 5 내지 40%, 6 내지 39%, 7 내지 38%, 8 내지 37%, 9 내지 36%, 10 내지 35%, 11 내지 34%, 12 내지 33%, 13 내지 32%, 14 내지 31%, 15 내지 31% 또는 15 내지 30%이다.
이와 같이 해서, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법은, 혈소판의 산생능이 증강된 거핵구를 제조할 수 있다. 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의하면, 핵상이 증강된 다핵화 거핵구, 특히, 16N 및 32N의 핵상을 갖는 다핵화 거핵구가 부화된 세포 집단을 얻을 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의하면, 혈소판의 산생능이 우수한 다핵화 거핵구가 얻어진다. 이 때문에, 상기 다핵화 거핵구는, 혈소판의 산생능이 우수하다. 따라서, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의하면, 예를 들어 혈소판의 산생량을 향상 가능한 다핵화 거핵구를 준비할 수 있다.
<다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단>
다른 양태에 있어서, 본 발명은, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 세포 집단은, 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단이고, 상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 15% 이상이다.
또한, 본 발명의 세포 집단은, 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단이고, 상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 32n 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%이다.
상기 다핵화 거핵구는, 8N 이상의 다핵화 거핵구를 포함해도 된다. 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 및 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율은, 예를 들어 전술의 예시를 원용할 수 있다.
본 발명의 세포 집단은, 소정의 핵상을 갖는 다핵화 거핵구를 일정량 포함하는 것이 특징이며, 기타 구성 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 세포 집단은, 예를 들어 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다. 본 발명의 세포 집단은, 핵상이 높은 다핵화 거핵구가 부화되어 있다. 상기 거핵구에서는, 핵상의 다핵화가 진행되면, 세포질이 상대적으로 커지고, 혈소판 산생능이 향상된다. 또한, 상기 거핵구에서는, 보다 핵상의 다핵화가 진행되면, 보다 성숙이 진행된다. 본 발명의 세포 집단은, 핵상이 특히 높은 다핵화 거핵구(예를 들어, 16N 이상 또는 32N 이상)의 비율이 부화되어 있다. 이 때문에, 본 발명의 세포 집단은, 예를 들어 혈소판 산생능이 증강되어 있다.
상기 다핵화 전 거핵구 세포는, 예를 들어 다능성 세포에서 유래하는 세포이고, 바람직하게는 시험관 내에서 다능성 세포로부터 유도된 세포이다. 상기 다핵화 전 거핵구는, 불사화 거핵구인 것이 바람직하다. 상기 불사화 거핵구는, 예를 들어 전술한 바와 같이, 상기 암 유전자, 상기 폴리콤 유전자, 및/또는 상기 아포토시스 억제 유전자를 도입함으로써, 조제할 수 있다. 이 때문에, 상기 다핵화 전의 거핵구 및 상기 다핵화 거핵구는, 예를 들어 외래성의 암 유전자, 폴리콤 유전자, 및/또는 아포토시스 억제 유전자를 포함한다. 상기 암 유전자는, 바람직하게는 c-MYC 유전자이다. 상기 폴리콤 유전자는, 바람직하게는 BMI1 유전자이다. 상기 아포토시스 억제 유전자는, 바람직하게는 BCL-xL 유전자이다. 상기 다핵화 전의 거핵구 및 상기 다핵화 거핵구는, 예를 들어 외래성의 암 유전자, 폴리콤 유전자, 및/또는 아포토시스 억제 유전자를 발현하고 있다.
본 발명의 세포 집단은, 예를 들어 상기 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 집단은, 예를 들어 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단에 대해서, 후술하는 실시예 1(5)에 준하고, 혈청 알부민 용액을 사용해서 분획하고, 다핵화 거핵구가 부화된 세포 집단으로서 조제해도 된다.
<혈소판의 제조 방법>
다른 양태에 있어서, 본 발명은, 혈소판의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 혈소판의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 다핵화 전의 거핵구 세포로부터 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 유도 공정과, 상기 다핵화 거핵구 세포로부터 혈소판을 산생하는 혈소판 산생 공정을 포함하고, 상기 유도 공정은, 상기 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 혈소판의 제조 방법은, 상기 유도 공정이, 상기 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의해 실시되는 것이 특징이고, 기타의 공정 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 혈소판의 제조 방법은, 예를 들어 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다. 본 발명의 혈소판의 제조 방법에 의하면, 혈소판의 산생량이 향상된다.
본 발명의 혈소판의 제조 방법에 있어서, 상기 유도 공정에서는, 다핵화 전의 거핵구 세포로부터 다핵화 거핵구 세포를 유도한다. 상기 유도 공정은, 상기 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법 다핵화 공정과 마찬가지로 하여 실시할 수 있다.
다음에, 본 발명의 혈소판의 제조 방법에 있어서, 상기 혈소판 산생 공정(이하, 「산생 공정」이라고도 한다)에서는, 전술한 바와 같이, 상기 다핵화 거핵구로부터 혈소판을 산생한다. 상기 산생 공정은, 예를 들어 배지의 존재 하, 상기 다핵화 거핵구를 배양하는 것에 의해 실시할 수 있다. 상기 다핵화 거핵구의 배양은, 예를 들어 피더 세포 상에서 실시해도 되고, 피더 세포없이 실시해도 된다.
상기 산생 공정에 있어서, 상기 다핵화 거핵구로부터 혈소판을 산생시키는 기간은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 1 내지 10일, 3 내지 6일이다.
상기 산생 공정은, 예를 들어 산생된 혈소판의 생리 활성을 향상시킬 수 있는 점에서, AhR 저해제의 존재 하, 실시해도 된다. 구체적으로는, 상기 산생 공정은, 예를 들어 AhR 저해제를 포함하는 배지의 존재 하, 실시한다. 상기 산생 공정은, 예를 들어 상기 거핵구를 포함하는 배지를, 예를 들어 AhR 저해제를 포함하는 배지로 교환하는 또는 상기 거핵구를 포함하는 배지에, AhR 저해제를 첨가함으로써 실시할 수 있다.
상기 AhR 저해제의 존재 하에서 배양하는 기간은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 산생된 혈소판의 수, 생리 활성 등에 따라, 적절히 결정할 수 있다. 상기 AhR 저해제는 예를 들어 상기 산생 공정의 전 기간 또는 일부의 기간 존재한다. 상기 AhR 저해제가 SR1의 경우, 특히 기능성이 높은 혈소판이 얻어지는 점에서, 상기 배양 기간은, 바람직하게는 약 5일이다.
상기 산생 공정에 있어서, 상기 AhR 저해제의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 화합물의 종류 및 그 유효 농도에 따라, 적절히 결정할 수 있다. 상기 AhR 안타고니스트의 농도는, 예를 들어 산생된 혈소판의 생리 활성을 보다 향상시킬 수 있는 점에서, 일례로서, 이하의 농도를 들 수 있다.
SR1: 200nmmol/L 이상 1000mmol/L 미만
CH-223191: 0.2μmol/L 이상 4μmol/L 미만
GNF351: 20nmol/L 이상 300nmol/L 미만
TMF: 2.5μmol/L 이상 40μmol/L 미만
DMF: 2.5μmol/L 이상 40μmol/L 미만
상기 산생 공정은, 예를 들어 산생된 혈소판의 생리 활성을 향상시킬 수 있는 점에서, ROCK 저해제의 존재 하, 실시해도 된다. 구체적으로는, 상기 산생 공정은, 예를 들어 ROCK 저해제를 포함하는 배지의 존재 하, 실시한다. 상기 산생 공정은, 예를 들어 기능성이 높여진 혈소판을 더 얻는 점으로부터, 상기 ROCK 저해제와 상기 AhR 저해제를 병용하는 것이 바람직하다. 상기 산생 공정은, 예를 들어 상기 거핵구를 포함하는 배지를, 예를 들어 ROCK 저해제를 포함하는 배지로 교환하는 또는 상기 거핵구를 포함하는 배지에, ROCK 저해제를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 상기 ROCK 저해제와 상기 AhR 저해제를 병용하는 경우, 상기 ROCK 저해제와 상기 AhR 저해제는, 예를 들어 동시에 첨가 또는 교환해도 되고, 별개로 첨가 또는 교환해도 된다.
상기 산생 공정에 있어서, 상기 혈소판의 산생 개시 시의 다핵화 거핵구의 세포 밀도는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 세포 밀도의 하한은, 예를 들어 1×105 세포/ml, 2×105 세포/ml, 3×105 세포/ml, 4×105 세포/ml이다. 상기 세포 밀도의 상한은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 4×105 세포/ml, 6×105 세포/ml, 8×105 세포/ml이다. 상기 세포 밀도의 범위는, 예를 들어 1×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml, 2×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml, 3×105 세포/ml 내지 6×105 세포/ml, 4×105 세포/ml 내지 6×105 세포/ml이다. 상기 세포 밀도는, 예를 들어 상기 다핵화 거핵구 세포의 세포수를, 상기 다핵화 거핵구 세포를 현탁하는 배지의 체적으로 제산함으로써 산출할 수 있다.
상기 산생 공정에 있어서, 상기 거핵구의 배양 조건은, 특별히 제한되지 않고, 상기 거핵구의 통상 배양 조건을 채용할 수 있다. 구체예로서, 배양 온도는, 예를 들어 약 35 내지 약 42℃, 약 36 내지 약 40℃, 약 37 내지 약 39℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 5 내지 약 15%이다. O2 농도는, 예를 들어 약 15 내지 약 25%, 약 20%이다.
이와 같이 해서, 상기 거핵구로부터 혈소판을 산생할 수 있다. 상기 산생 공정 후의 배지는, 예를 들어 상기 혈소판을 포함한다.
본 발명의 혈소판의 제조 방법은, 예를 들어 상기 산생 공정에서 얻어진 혈소판을 정제하는 정제 공정을 포함해도 된다. 상기 혈소판의 정제 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 중공사막 등의 분리 수단을 사용한 정제 방법, 원심 분리에 의한 정제 방법 등의 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다.
<혈소판>
본 발명의 혈소판은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 혈소판은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에 의해 얻어진 것이 특징이며, 기타의 공정 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 혈소판은, 예를 들어 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<혈소판 제제의 제조 방법>
본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 혈소판으로부터 혈소판 제제를 제조하는 제제 공정을 포함하고, 상기 혈소판은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에서 얻어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법은, 상기 혈소판이, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에서 얻어진 것을 특징으로 하고, 기타의 공정 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
상기 제제 공정에서는, 예를 들어 다른 성분을 첨가해도 된다. 상기 다른 성분은, 예를 들어 상기 혈소판 등의 세포의 안정화제 등의 약학적으로 허용되는 첨가제 또는 담체 등을 들 수 있다.
본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법은, 상기 제제 공정에 앞서, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에 의해, 혈소판을 제조하는 혈소판 제조 공정을 포함해도 된다. 상기 혈소판 제조 공정은, 예를 들어 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<혈소판 제제>
본 발명의 혈소판 제제는, 상기 본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 혈소판 제제는, 상기 본 발명의 혈소판 제제의 제조 방법에 의해 얻어진 것이 특징이고, 기타의 공정 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 혈소판 제제는, 예를 들어 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법 및 혈소판 제제의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<혈액 제제의 제조 방법>
본 발명의 혈액 제제의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 혈소판과 다른 성분을 혼합함으로써, 혈액 제제를 제조하는 혈액 제제 공정을 포함하고, 상기 혈소판은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에서 얻어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 혈액 제제의 제조 방법은, 상기 혈소판이, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에서 얻어진 것을 특징으로 하고, 기타 공정 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 혈액 제제의 제조 방법은, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
상기 다른 성분은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 적혈구 등의 다른 혈구계 세포 등의 세포; 상기 혈소판 등의 세포의 안정화제 등의 첨가제; 등을 들 수 있다.
본 발명의 혈액 제제의 제조 방법은, 상기 혈액 제제 공정에 앞서, 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법에 의해, 혈소판을 제조하는 혈소판 제조 공정을 포함해도 된다. 상기 혈소판 제조 공정은, 예를 들어 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<혈액 제제>
본 발명의 혈액 제제는, 상기 본 발명의 혈액 제제의 제조 방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 혈액 제제는, 상기 본 발명의 혈액 제제의 제조 방법에 의해 얻어진 것이 특징이며, 기타의 공정 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 혈액 제제는, 예를 들어 상기 본 발명의 혈소판의 제조 방법 및 혈액 제제의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
<다핵화 거핵구의 유도제>
다른 양태에 있어서, 본 발명은, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구의 유도제를 제공한다. 본 발명의 유도제는, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구의 유도제이며, AhR의 활성 억제 물질, ROCK의 활성 억제 물질, DYRK의 활성 억제 물질 및 미오신 2의 활성 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민을 포함한다. 본 발명의 유도제는, AhR의 활성 억제 물질, ROCK의 활성 억제 물질, DYRK의 활성 억제 물질 및 미오신 2의 활성 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민을 포함하는 것이 특징이며, 기타의 구성 및 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 유도제는, 예를 들어 상기 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다. 본 발명의 유도제는, 예를 들어 혈소판의 산생능이 향상된 성숙 거핵구 또는 다핵화 거핵구 세포의 유도제라고 할 수도 있다. 또한, 본 발명의 유도제는, 예를 들어 거핵구 세포의 다핵화 촉진제 또는 거핵구 세포의 핵상의 증강제라고 할 수도 있다.
<사용>
본 발명은, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구의 유도 위한, AhR의 활성 억제 물질, ROCK의 활성 억제 물질, DYRK의 활성 억제 물질 및 미오신 2의 활성 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민의 사용이다. 또한, 본 발명은, 거핵구 세포의 다핵화 촉진 또는 거핵구 세포의 핵상의 증강에 사용하기 위한 AhR의 활성 억제 물질, ROCK의 활성 억제 물질, DYRK의 활성 억제 물질 및 미오신 2의 활성 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나와, 하르민의 사용이다. 본 발명은, 예를 들어 상기 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법의 설명을 원용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 사용해서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 실시예에 기재된 양태에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
다핵화 전 거핵구를, AhR 저해제, ROCK 저해제, DYRK 저해제 및 미오신 2 저해제와, 하르민의 존재 하에서 배양함으로써, 혈소판의 산생능을 증강할 수 있는 것을 확인했다.
(1) 불사화 거핵구의 제작
다핵화 전 거핵구로서는, 불사화 거핵구를 사용했다. 상기 불사화 거핵구는, 이하의 수순으로 제작했다.
(1-1) iPS 세포로부터의 조혈 전구 세포의 조제
인간 iPS 세포로부터, 하기 참고 문헌 7에 기재된 방법에 따라, 혈구 세포에의 분화 배양을 실시했다. 구체적으로는, 라미닌 511-E8(닛피) 상에서 유지한 인간 iPS 세포 콜로니를 50 ng/ml 액티빈 A(WAKO), 3μM CHIR99021(WAKO) 존재 하에서 밤새 배양한 뒤, 20ng/mL VEGF(R&D SYSTEMS사제) 존재 하에서 C3H10T1/2 피더 세포와 14일간 공배양해서 조혈 전구 세포(Hematopoietic Progenitor Cells: HPC)을 제작했다. 배양 조건은 iPS 세포의 유지와, HPC 유도의 전반 7일간은, 37℃, 5% O2, 5% CO2로 하고, 그 후는 37℃, 20% O2, 5% CO2로 실시했다.
참고 문헌 7: Takayama N. et al., "Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells", J. Exp. Med., 2010, vo.13, pages 2817-2830
(1-2) 유전자 도입 시스템
유전자 도입 시스템은, 렌티바이러스 벡터 시스템을 이용했다. 렌티바이러스 벡터는, 테트라사이클린 제어성의 Tet-on(등록상표) 유전자 발현 유도 시스템 벡터를 사용했다. 상기 벡터는, TRE 프로모터 하에, c-MYC, BMI1 또는 BCL-xL이 도입된 벡터로 하고, 각 벡터는 각각, EN-TRE-c-Myc-Ubc-rtTA-KR, EN-TRE-BMI1-Ubc-rtTA-KR 및 EN-TRE-BCL-xL-Ubc-rtTA-KR로 구성했다. 다음에, c-MYC, BMI1 및 BCL-xL의 벡터를 포함하는 바이러스는, 상기 렌티바이러스 벡터를 293T 세포에 유전자 도입함으로써 조제했다(상기 참고 문헌 1 및 하기 참고 문헌 8). 그리고, 얻어진 바이러스를 목적의 세포에 감염시킴으로써 c-MYC, BMI1 및 BCL-xL 유전자를, 목적의 세포의 게놈 배열에 도입할 수 있다. 또한, 얻어진 세포에 있어서, c-MYC, BMI1 및 BCL-xL 유전자가, 안정적으로 게놈 배열에 도입되면, 상기 세포는, 배지에 독시사이클린(clontech#631311)을 첨가함으로써, c-MYC, BMI1 및 BCL-xL 유전자를 강제 발현할 수 있다.
참고 문헌 8: Yamaguchi et al., "Development of an All-in-One Inducible Lentiviral Vector for Gene Specific Analysis of Reprogra㎜ing." PLoS ONE, 2012, vol.7 (7) e41007
(1-3) 조혈 전구 세포로의 3유전자의 도입에 의한 거핵구 세포주의 유도
상기 실시예 1(1-1)에서 제작한 HPC에, 상기 실시예 1(1-2)에서 제작한 3종류의 렌치 바이러스를 감염시켜서, 거핵구 전구 세포를 유도했다. 상기 감염으로부터 약 25일 후에 충분한 증식능을 갖고 있는 주에 대해서, 항 인간 CD41a-APC 항체(BioLegend사제), 항 인간 CD42b-PE 항체(eBioscience사제) 및 항 인간 CD235ab-㎩cific Blue(Anti-CD235ab-PB; BioLegend사제) 항체를 사용하여, 면역 염색한 후에 FACS Verse(상표)를 사용해서 해석했다. CD41a 양성률, CD42b 양성률이 모두 50% 이상인 주를 불사화 거핵구 세포주(MKCL, 다핵화 전의 거핵구 세포에 상당)로 하고, 이후의 검토에 사용했다.
(1-4) 거핵구 세포주의 증식 배양
얻어진 MKCL의 증식 배양은 10㎝ 디쉬(10ml/디쉬) 또는 125ml 진탕 플라스크로 행하였다. 배지는 IMDM(Sigma Aldrich #I3390)을 기본 배지로 하여, 이하의 성분을 첨가했다(농도는 최종 농도, 증식 배지). 배양 조건은, 37℃, 5% CO2, 진탕 시의 진탕 속도는, 회전 직경 19㎜의 셰이커로 100rpm으로 설정했다.
FBS(Hyclone #SH30071.03, 소 태아 혈청) 15%
Glutamax(GIBCO #3505-061) 2mmol/l
ITS-G(Gibco #41400-045) 100배 희석
MTG(모노티오글리세롤, 후지 필름 와코준야쿠 #195-157) 450μmol/l
아스코르브산(NIPRO #49871900040329) 50μg/ml
SCF(AGC #MEGAKARYON-SCF) 50ng/ml
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
독시사이클린(DOX)(clontech #631311) 1μg/ml
(2) 불사화 거핵구의 다핵화의 유도
다음에, DOX에 더하여, AhR 저해제, ROCK 저해제, DYRK 저해제 및 미오신 2 저해제와, 하르민을 첨가한 배지에서 배양함으로써, 불사화 거핵구의 다핵화를 유도했다. 구체적으로는, 상기 실시예 1(1)에서 얻은 불사화 거핵구 세포주를, 이하의 다핵화 배지에, 3.0×105cells/ml가 되도록 현탁했다. 그리고, 6웰 디쉬에, 2ml/웰 또는, 125mL 용기의 삼각 플라스크에 25ml/플라스크에 파종하고, 3일간 100rpm으로 진탕 배양했다. 배양 조건은 37℃, 5% CO2로 하였다.
(다핵화 배지)
FBS(Hyclone #SH30071.03) 15%
Glutamax(GIBCO #3505-061) 2mmol/L
ITS-G(Gibco #41400-045) 100배 희석
MTG(모노티오글리세롤, 후지 필름 와코준야쿠 #195-157) 450μmol/l
아스코르브산(NIPRO #49871900040329) 50μg/ml
지질 혼합액 1 기지 조성(Sigma Aldrich #L0288-100ML) 0.75%
SCF(AGC #MEGAKARYON-SCF) 50ng/ml
TPO 유사 작용 물질 200ng/ml
독시사이클린(clontech #631311) 1μg/ml
방향족 탄화수소 수용체(AhR) 저해제 GNF351(Calbiochem #182707) 500nmol/l
ROCK 저해제 Y-39983(Medchemexpress #MCH-HY-13300-10) 500nmol/l
하르민(Sigma Aldrich #286044-1G) 5μmol/l
DYRK 저해제 AZ191(Medchem Express #HY-12277) 1μmol/l
미오신 2 저해제(-)-블레비스타틴(Medchem Express #HY-13441) 10μmol/l
(3) 다핵화에 대한 작용
상기 배양후의 세포 현탁액을 회수하고, 상기 세포 현탁액 중의 염색체의 세트수 및 세포의 크기를, 플로 사이토미터를 사용하여 측정했다. 구체적으로는, 세포 현탁액에 대해서, 냉각한 100% 에탄올을 사용하여, 최종 농도 70%, -20℃에서 30분간의 고정 처리 후, PBS(-)로 세정했다. 계속해서, 핵 염색액을 사용해서 염색했다. 상기 각 염색액은, 1㎎/ml의 PI(프로피듐 아이오다이드, Sigma Aldrich #P4864-10ML)를 최종 농도 10μg/mL, 100㎎/mL RNase(NIPPON GENE #318-06391)을 최종 농도 20μg/mL가 되도록 PBS에 첨가해서 조제했다. 염색 후 샘플에 대해서, 플로 사이토미터로 측정했다. 얻어진 결과에 대해서, FSC 및 PI의 염색 강도에 기초하여, 거핵구가 함유하는 염색체의 세트수(N) 및 세포의 크기를 해석하였다(실시예 1). 컨트롤 1은, 상기 다핵화 배지 대신에, 상기 증식 배지를 사용한 것 이외에는 마찬가지로 하여, 컨트롤 2는 상기 다핵화 배지 대신에, 상기 증식 배지에, 하르민 10μmol/l가 되도록 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 실시했다. 이들 결과를, 도 1에 나타낸다.
도 1은 다핵화의 정도를 나타내는 그래프이다. 도 1에 있어서, 횡축은 PI의 염색 강도를 나타내고, 종축은 카운트수를 나타내고, 도면 중의 수치는 각 염색체의 세트수의 세포의 비율을 나타낸다. 도 1에 도시한 바와 같이, 컨트롤 1에서는, 불사화 거핵구의 증식이 유지되기 때문에, 다핵화 거핵구는 대부분 검출되지 않았다. 한편, 도 1에 도시한 바와 같이, 하르민을 첨가한 경우, 불사화 거핵구가 다핵화되어, 32N의 다핵화 거핵구도 약간 검출되었다. 이들에 대하여, 실시예 1에서는, 거핵구의 다핵화가 보다 진행하고, 32N의 다핵화 거핵구뿐만 아니라, 64N 및 128N의 다핵화 거핵구가 검출되었다. 이러한 점에서, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의하면, 보다 다핵화의 정도가 진행된 다핵화 거핵구가 얻어지는 것을 알 수 있다.
(4) 혈소판의 산생
다음에, DOX를 제외한 IMDM에 이하의 성분을 첨가한 하기 산생 배지에서 배양함으로써, 다핵화 거핵구로부터 혈소판을 산생시켰다. 구체적으로는, 상기 실시예 1(2)에서 얻은 다핵화 거핵구를, PBS(-)로 두번 세정하고, 이하의 산생 배지에, 1.0×105 cells/ml가 되도록 현탁했다. 그리고, 6웰 디쉬에, 2ml/웰로 파종하고, 6일간 배양했다.
(산생 배지)
인간 AB 혈청 10%(AccessBiologicals)
Glutamax(GIBCO #3505-061) 2mmol/L
ITS-G(Gibco #41400-045) 100배 희석
MTG(모노티오글리세롤, 후지 필름 와코준야쿠 #195-157) 450μmol/L
아스코르브산(NIPRO #49871900040329) 50μg/mL
SCF(AGC #MEGAKARYON-SCF) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
방향족 탄화수소 수용체(AhR) 저해제 GNF351(Calbiochem #182707) 500nmol/L
ROCK 저해제 Y-39983(Medchemexpress #MCH-HY-13300-10) 500nmol/L
에녹사파린(Sanofi) 1U/mL
다음에, 혈소판을 포함하는 세포 현탁액에 대해서, 상기 세포 현탁액 중의 혈소판 농도를, 플로 사이토미터를 사용하여 측정했다. 구체적으로는, 5mL FACS 튜브에 Tyrode's 버퍼 180μL를 첨가하고, 상기 세포 현탁액 20μL를 첨가하고, 혼합했다. 이어서, 각 튜브에 하기 표지 항체를 첨가해서 15분간 정치해서 염색했다. 염색 후에 각 튜브에 PBS(-)를 400μL 첨가해서 혼합하고, 그 중 500μL를 Trucount Tube(상표)에 첨가해서 혼합해서 플로 사이토미터에서 측정했다. 얻어진 결과에 대해서, 전방 산란광(FSC) 및 측방 산란광(SSC)에서, 혈소판의 분획을 추출한 후, CD41+CD42b+ 분획의 비율을 구하고, Trucount beads의 카운트수에 의해 산출된 측정 액량에 기초하여, 혈소판 농도를 산출했다. 상기 혈소판 농도로부터 상기 세포 현탁액 중의 혈소판의 총 수를 산출 후, 상기 혈소판의 총 수와, 파종한 다핵화 거핵구의 수로부터, 거핵구당 혈소판 산생량을 산출하였다(실시예 1). 또한, 컨트롤은, 상기 실시예 1(2)에 있어서, 상기 다핵화 배지 대신에, 상기 증식 배지를 사용한 것 이외에는 마찬가지로 하여 실시했다. 이들 결과를 도 2에 나타낸다.
·혈소판 농도의 측정
0.5μL 항CD41 항체 APC 표지(BioLegend, Cat.No.:303710)
0.5μL 항CD42b 항체 PE 표지(BioLegend, Cat.No.:303906)
도 2는 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다. 도 2에 있어서, 횡축은, 샘플의 종류를 나타내고, 종축은, 거핵구당 혈소판 산생량을 나타낸다. 도 2에 도시한 바와 같이, 실시예 1은, 컨트롤과 비교하여, 혈소판의 산생량이 4배 정도로 증강되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의하면, 혈소판의 산생량을 증강할 수 있는 것을 알 수 있다.
(5) 혈소판의 산생능
상기 실시예 1(1)에서 얻은 불사화 거핵구 세포주를, 상기 실시예 1(2)와 마찬가지로 배양함으로써, 다핵화를 유도했다. 얻어진 다핵화 거핵구에 대해서, 소 혈청 알부민을 사용하여, 다핵화 거핵구의 크기에 의해 분획했다. 구체적으로는, 압자를 뗀 50ml 주사 시린지에 삼방 활전을 장착하고, 통끝을 아래로 해서 클램프로 고정했다. 30%(w/v) 알부민 용액(소 혈청 유래 지방산 프리, 후지 필름 와코준야쿠 #017-22231)을, 1×HBSS(ThermoFisher #14175095)로 희석해서 조제하고, 2%, 4%, 16%의 BSA 용액을 조제 후, 상기 시린지 내에, 16%(10ml), 4%(4ml), 2%(4ml) 및 0%(2ml)의 순으로 중층했다. 다음에, 2ml의 HBSS에서 조제한 75×105 세포의 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 현탁액을 어플라이한 후, 50분간 정치해서 세포를 자연중력 하에서 침강시켰다. 그리고, 상기 삼방 활전을 완화하여, 적하로 세포를 회수했다. 이에 의해, 상기 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단을 프랙션 1 내지 4(F1 내지 F4)로 분획했다. 각 분획의 다핵화 거핵구에 대해서, 상기 실시예 1(3)과 마찬가지로 하여, 염색체의 세트수(N)를 해석하였다(실시예 1). 참고예 1A는, 상기 다핵화 배지 대신에, 하르민, AZ191 및 블레비스타틴을 첨가하지 않는 다핵화 배지를 사용한 것 이외에는 마찬가지로 하여, 참고예 1B는 상기 다핵화 배지 대신에, 하르민을 첨가하지 않는 다핵화 배지를 사용한 것 이외에는 마찬가지로 하여 실시했다.
상기 분획 후, DOX를 제외한 상기 산생 배지에서 배양함으로써, 다핵화 거핵구로부터 혈소판을 산생시켰다. 구체적으로는, F1 내지 F4의 다핵화 거핵구를, 각각, PBS(-)로 두번 세정하고, 상기 산생 배지에, 1.0×105 cells/ml가 되도록 현탁했다. 그리고, 6웰 디쉬에, 2ml/웰로 파종하고, 4 내지 7일간(합계 7 내지 10일간)배양했다. 상기 산생 배지의 배양 1일째에 있어서, 각 웰의 세포를 위상차 현미경(ECLIPSE TS100, 니콘 인스테크사제)을 사용해서 관찰했다. 그리고, 상기 배양후, 혈소판을 포함하는 세포 현탁액에 대해서, 상기 실시예 1(4)와 마찬가지로 하여, 거핵구당 혈소판 산생량을 산출했다. 이들의 결과를 도 3 내지 도 5에 나타낸다.
도 3a 내지 c는, 다핵화의 정도 및 세포의 크기를 나타내는 그래프이다. 도 3a 내지 c에 있어서, 도 3a는 참고예 1A의 결과를 나타내고, 도 3b는 참고예 1B의 결과를 나타내고, 도 3c는 실시예 1의 결과를 나타낸다. 도 3a 내지 c에 있어서, 횡축은, PI의 염색 강도 또는 세포의 크기(FSC)를 나타내고, 종축은 카운트수를 나타내고, 도면 중의 수치는, 각 염색체의 세트수의 세포의 비율을 나타낸다. 도 3a 내지 c에 나타내는 바와 같이, 참고예 1A, 참고예 1B 및 실시예 1의 어느 것에 있어서도, F1이 가장 큰 세포가 부화되어 있어, F2 내지 F4로 진행함에 따라서, 세포의 크기가 작게 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 참고예 1B와 실시예 1을 비교하면, F1 내지 F4의 어느 것에 있어서도, 세포의 크기는 동일 정도였다.
다음에, 도 4는 F1 분획의 세포의 위상차상을 나타내는 사진이다. 도 4에 있어서, (A)는 참고예 1A의 결과이고, (B)는 참고예 1B의 결과이고, (C)는 실시예 1의 결과이다. 도 4의 (A) 내지 (C)에 나타내는 바와 같이, AZ191 및 블레비스타틴을 첨가하고, DYRK 및 미오신 2를 저해하면, 다핵화 거핵구의 비대화가 촉진되는 것을 알 수 있다. 한편, 도 4의 (B) 내지 (C)에 나타내는 바와 같이, 하르민을 첨가해도, 다핵화 거핵구의 비대화에는 영향이 없는 것을 알 수 있다.
도 5는 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다. 도 5에 있어서, 횡축은, 샘플의 종류 및 분획을 나타내고, 종축은 거핵구당 혈소판 산생량을 나타낸다. 도 5에 도시한 바와 같이, 다핵화 거핵구가 특히 부화되어 있는 F1 분획 및 F2 분획에 있어서, 실시예 1은, 참고예 1A 및 참고예 1B와 비교하여, 혈소판 산생량이 2 내지 3배 정도 증강되어 있었다. 이 때문에, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에서는, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구가 얻어지는 것을 알 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이, 실시예 1의 다핵화 거핵구와 참고예 1B의 다핵화 거핵구는, 동일 정도의 크기를 갖는다. 이 때문에, 실시예 1의 다핵화 거핵구와 참고예 1B의 다핵화 거핵구는, 혈소판의 혈소판 산생의 최대 능력, 즉 모든 세포질을 혈소판으로서 방출했을 때에 방출할 수 있는 혈소판수는 동일 정도다라고 추정된다. 그러나, 도 5에 도시한 바와 같이, 실시예 1의 다핵화 거핵구와 참고예 1B의 다핵화 거핵구는, 혈소판 산생량이 크게 다른 점으로부터, 실시예 1의 다핵화 거핵구는, 참고예 1B의 다핵화 거핵구와 비교하여, 효율적으로 혈소판을 방출할 수 있는 것, 즉 혈소판의 산생능이 증강되어 있는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 혈소판의 산생능의 증강은, 실시예 1의 다핵화 거핵구에서는, 참고예 1B의 다핵화 거핵구 등과 비교하여, 거핵구 세포의 분화 진행 또는 성숙도의 증진에 따르는 것으로 추정되었다.
[실시예 2]
실시예 1에서 사용한 저해제를 사용하여, 다핵화에 특히 기여하는 분자를 확인했다.
(1) 첨가제의 검토
(1-1) 불사화 거핵구의 다핵화의 유도
불사화 거핵구의 다핵화의 유도에 사용한 AhR 저해제, ROCK 저해제 및 미오신 2 저해제와, 하르민의 5종류의 첨가제 중에서, 혈소판 산생수를 증가시키는 데 기여하는 첨가제에 대해서, 검토를 행하였다. 상기 검토는, 구체적으로는, 실시예 1(1)에서 얻은 불사화 거핵구 세포주를, 이하의 다핵화 배지에, 3.0×105 cells/ml가 되도록 현탁했다. 그리고, 6웰 디쉬에, 2ml/웰 또는 125mL 용기의 삼각 플라스크에 25ml/플라스크로 파종하고, 3일간 100rpm으로 진탕 배양했다. 배양 조건은, 37℃, 5% CO2로 하였다. 상기 다핵화 배지에 있어서, (1) 모든 하기 저해제(GYHAB), (2) AZ191 이외의 하기 저해제(A(-)), (3) GNF351 이외의 하기 저해제(G(-)), (4) Y-39983 이외의 하기 저해제(Y(-)), (5) 하르민 이외의 하기 저해제(H(-)), (6) 블레비스타틴 이외의 하기 저해제(B(-)), (7) AZ191 및 Y-39983 이외의 하기 저해제(GHB)를 첨가했다.
(다핵화 배지)
FBS(Hyclone #SH30071.03) 15%
Glutamax(GIBCO #3505-061) 2mmol/L
ITS-G(Gibco #41400-045) 100배 희석
MTG(모노티오글리세롤, 후지 필름 와코준야쿠 #195-157) 450μmol/l
아스코르브산(NIPRO #49871900040329) 50μg/ml
SCF(AGC #MEGAKARYON-SCF) 50ng/ml
TPO 유사 작용 물질 200ng/ml
독시사이클린(clontech #631311) 1μg/ml
(저해제)
(G) 방향족 탄화수소 수용체(AhR) 저해제 GNF351(Calbiochem #182707) 500nmol/l
(Y) ROCK 저해제 Y-39983(Medchemexpress #MCH-HY-13300-10) 500nmol/l
(H) 하르민(Sigma Aldrich #286044-1G) 5μmol/l
(A) DYRK 저해제 AZ191(Medchem Express #HY-12277) 1μmol/l
(B) 미오신 2 저해제(-)-블레비스타틴(Medchem Express #HY-13441) 10μmol/l
(1-2) 다핵화에 대한 작용
상기 배양 후의 세포 현탁액을 회수하고, 상기 세포 현탁액 중의 염색체의 세트수 및 세포의 크기를, 플로 사이토미터를 사용하여 측정했다. 구체적으로는, 실시예 1(3)과 마찬가지 방법으로 행하였다. 얻어진 결과에 대해서, FSC 및 PI의 염색 강도에 기초하여, 거핵구가 함유하는 염색체의 세트수 (N) 및 세포의 크기를 해석했다. 이들 결과를, 도 6에 나타낸다.
도 6은 거핵구당 혈소판 산생량을 나타내는 그래프이다. 도 6에 있어서, 횡축은, 샘플의 종류를 나타내고, 종축은, 거핵구당 혈소판 산생량을 나타낸다. 도 6에 도시한 바와 같이, AZ191을 첨가하지 않은 (A(-))에 있어서는, 모든 저해제를 첨가한 (GYHAB)와 비교하여, 혈소판 산생량은 감소하지 않았다. 또한, AZ191 및 Y-39983을 첨가하지 않은 (GHB)에 있어서는, AZ191을 첨가하지 않은 (A(-)) 또는 모든 저해제를 첨가한 (GYHAB)와 비교하여, 혈소판 산생량은 감소하지 않았다. 또한, 다른 1제를 뺀 경우에 있어서는, 모든 저해제(GYHAB)를 첨가한 경우와 비교하여, 혈소판 산생량이 감소했다. 이상의 결과로부터, AhR, 미오신 2의 활성을 억제하고, 하르민의 존재 하 배양함으로써, 거핵구의 다핵화를 상승적으로 촉진할 수 있고, 이에 의해, 혈소판의 산생능을 향상할 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 3]
본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 있어서, 거핵구의 다핵화가 촉진되어 있는 것을 확인했다.
본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에서 얻어지는 다핵화 거핵구의 핵상에 대해서 검토했다. 상기 실시예 1(1)에서 얻은 불사화 거핵구 세포주를, 15% FBS를 포함하는 상기 다핵화 배지에, 2.0 내지 3.0×105 cells/ml가 되도록 현탁한 현탁액을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 2(2)와 마찬가지로 하여 배양했다. 얻어진 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단에 대해서, 상기 실시예 1(3)과 마찬가지로 하여, 플로 사이토미터에서 측정했다. 얻어진 결과에 대해서, FSC 및 PI의 염색 강도에 기초하여, 거핵구가 함유하는 염색체의 세트수 (N) 및 세포의 크기를 해석했다. 같은 실험을 11회 실시했다(n=12). 이들 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7은 다핵화 거핵구의 핵상을 나타내는 그래프이다. 도 7의 (A) 내지 (C)에 있어서, 횡축은 세포 집단에 차지하는 비율을 나타내고, 종축은 거핵구당 혈소판 산생량을 나타낸다. 도 7에 있어서, (A)는 세포 집단에 있어서의 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율을 나타내고, (B)는 세포 집단에 있어서의 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율을 나타내고, (C)는 세포 집단에 있어서의 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율을 나타낸다. 도 7의 (A) 내지 (C)에 나타내는 바와 같이, 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율이 28.2 내지 56.7%이고, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율이, 20.2 내지 45.9%이고, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율이, 9.15 내지 30.7%였다. 또한, 파종 밀도를 변화시킴으로써, 16N 이상 및 32N 이상의 다핵화 거핵구의 함유 비율을 조정할 수 있었다.
이상으로부터, 본 발명의 다핵화 거핵구의 제조 방법에 의하면, 특히 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구 및 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구의 함유 비율이 높은 세포 집단을 조제할 수 있는 것, 즉 거핵구의 다핵화가 촉진되어 있는 것을 알 수 있다.
이상, 실시 형태 및 실시예를 참조하여 본 발명을 설명했지만, 본 발명은 상기 실시 형태 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구성이나 상세하게는, 본 발명의 스코프 내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러가지 변경을 할 수 있다.
이 출원은, 2021년 6월 18일에 출원된 일본 출원 특원 2021-102068을 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시 전부를 여기에 도입한다.
<부기>
상기의 실시 형태 및 실시예의 일부 또는 전부는, 이하의 부기 기재될 수 있지만, 이하에는 한정되지 않는다.
<다핵화 거핵구 세포의 제조 방법>
(부기 1)
혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법으로서,
다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정을 포함하고,
상기 다핵화 공정에 있어서, 방향족 탄화수소 수용체(AhR), Rho 결합 키나아제(ROCK), 이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제(DYRK) 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민(Harmine)의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는, 제조 방법.
(부기 2)
상기 다핵화 공정에 있어서, AhR 저해제, ROCK 저해제, DYRK 저해제 및 미오신 2 저해제로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 저해제와, 하르민의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 배양해서 다핵화시키고, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는, 부기 1에 기재된 제조 방법.
(부기 3)
상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 AhR 저해제, 상기 미오신 2 저해제 및 하르민의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 배양해서 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는, 부기 2에 기재된 제조 방법.
(부기 4)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시키는 증식 공정을 포함하고,
상기 증식 공정에서는, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하지 않고, 또한 하르민(Harmine)의 비존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시키는, 부기 1 내지 3의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 5)
상기 증식 공정 후에, 상기 다핵화 공정을 실시하는, 부기 4에 기재된 제조 방법.
(부기 6)
상기 다핵화 공정에 있어서, AhR 저해제를 사용하여, 상기 AhR의 활성을 저해하는, 부기 1 내지 5의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 7)
상기 AhR 저해제는 GNF351을 포함하는, 부기 2, 3 및 6의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 8)
상기 다핵화 공정에 있어서, ROCK 저해제를 사용하여, 상기 ROCK의 활성을 저해하는, 부기 1 내지 7의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 9)
상기 ROCK 저해제는 Y-39983을 포함하는, 부기 2, 3 및 8의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 10)
상기 다핵화 공정에 있어서, DYRK 저해제를 사용하여, 상기 DYRK의 활성을 저해하는, 부기 1 내지 9의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 11)
상기 DYRK 저해제는 AZ191을 포함하는, 부기 2, 3 및 10의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 12)
상기 다핵화 공정에 있어서, 미오신 2 저해제를 사용하여, 상기 미오신 2의 활성을 저해하는, 부기 1 내지 11의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 13)
상기 미오신 2 저해제는 블레비스타틴(Blebbistatin)을 포함하는, 부기 2, 3 및 12의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 14)
상기 다핵화 거핵구 세포는, 상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포를 포함하고,
상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20% 이상인, 부기 1 내지 13의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 15)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 부기 14에 기재된 제조 방법.
(부기 16)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20 내지 70%인, 부기 15에 기재된 제조 방법.
(부기 17)
상기 다핵화 거핵구 세포는, 상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구 세포를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 부기 1 내지 16의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 18)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 25 내지 60%인, 부기 16에 기재된 제조 방법.
(부기 19)
상기 다핵화 거핵구 세포는, 상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%인, 부기 1 내지 17의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 20)
상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 35%인, 부기 19에 기재된 제조 방법.
(부기 21)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자는, 암 유전자, 폴리콤 유전자, 및/또는 아포토시스 억제 유전자가 코드하는 단백질인, 부기 1 내지 20의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 22)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 불사화 거핵구인, 부기 1 내지 21의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 23)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 다능성 세포에서 유래하는, 부기 1 내지 22의 어느 것에 기재된 제조 방법.
(부기 24)
상기 다능성 세포는, 인공 다능성 줄기 세포인, 부기 23에 기재된 제조 방법.
(부기 25)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 인간 유래인, 부기 1 내지 24의 어느 것에 기재된 제조 방법.
<혈소판의 제조 방법>
(부기 26)
다핵화 전의 거핵구 세포로부터 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정과,
상기 다핵화 거핵구 세포로부터 혈소판을 산생하는 혈소판 산생 공정을 포함하고,
상기 다핵화 공정은, 부기 1 내지 25의 어느 것에 기재된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법에 의해 실시되는, 혈소판의 제조 방법.
<혈소판 제제의 제조 방법>
(부기 27)
혈소판으로부터 혈소판 제제를 제조하는 제제 공정을 포함하고,
상기 혈소판은, 부기 26에 기재된 혈소판의 제조 방법으로 얻어진 것을 특징으로 하는, 혈소판 제제의 제조 방법.
<혈액 제제의 제조 방법>
(부기 28)
혈소판과 다른 성분을 혼합함으로써, 혈액 제제를 제조하는 혈액 제제 공정을 포함하고,
상기 혈소판은, 부기 26에 기재된 혈소판의 제조 방법으로 얻어진 것을 특징으로 하는, 혈액 제제의 제조 방법.
<다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단>
(부기 29)
다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단으로서,
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20% 이상인, 세포 집단.
(부기 30)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 부기 29에 기재된 세포 집단.
(부기 31)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 70%인, 부기 30에 기재된 세포 집단.
(부기 32)
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 부기 29 내지 31의 어느 것에 기재된 세포 집단.
(부기 33)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 25 내지 60%인, 부기(32)에 기재된 세포 집단.
(부기 34)
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%인, 부기 29 내지 33의 어느 것에 기재된 세포 집단.
(부기 35)
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 35%인, 부기 34에 기재된 세포 집단.
(부기 36)
다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%인, 세포 집단.
(부기 37)
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 35%인, 부기 36에 기재된 세포 집단.
(부기 38)
상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 70%인, 부기 36 또는 37에 기재된 세포 집단.
(부기 39)
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 25 내지 60%인, 부기 38에 기재된 세포 집단.
(부기 40)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 불사화 거핵구인, 부기 29 내지 39의 어느 것에 기재된 세포 집단.
(부기 41)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 다능성 세포에서 유래하는, 부기 29 내지 40의 어느 것에 기재된 세포 집단.
(부기 42)
상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 외래성의 암 유전자, 폴리콤 유전자, 및/또는 아포토시스 억제 유전자를 포함하는, 부기 29 내지 41의 어느 것에 기재된 세포 집단.
이상과 같이, 본 발명에 따르면, 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구를 얻을 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 따르면, 예를 들어 혈소판의 산생량을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어 혈소판을 사용하는 세포 의약 분야, 의료 분야 등에 있어서 매우 유용하다.
Claims (30)
- 혈소판 산생능이 증강된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법으로서,
다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정을 포함하고,
상기 다핵화 공정에 있어서, 방향족 탄화수소 수용체(AhR), Rho 결합 키나아제(ROCK), 이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제(DYRK) 및 미오신 2로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 활성을 억제하고, 또한 하르민(Harmine)의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서, 상기 다핵화 공정에 있어서, AhR 저해제, ROCK 저해제, DYRK 저해제 및 미오신 2 저해제로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 저해제와, 하르민의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 배양해서 다핵화시키고, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는, 제조 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 다핵화 공정에 있어서, 상기 AhR 저해제, 상기 미오신 2 저해제 및 하르민의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 배양해서 다핵화시켜, 다핵화 거핵구 세포를 유도하는, 제조 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자의 존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시키는 증식 공정을 포함하고,
상기 증식 공정에서는, AhR, ROCK, DYRK 및 미오신 2의 활성을 억제하지 않고, 또한 하르민(Harmine)의 비존재 하, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포를 증식시키는, 제조 방법. - 제4항에 있어서, 상기 증식 공정 후에, 상기 다핵화 공정을 실시하는, 제조 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 공정에 있어서, AhR 저해제를 사용하여, 상기 AhR의 활성을 저해하는, 제조 방법.
- 제2항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AhR 저해제는 GNF351을 포함하는, 제조 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 공정에 있어서, ROCK 저해제를 사용하여, 상기 ROCK의 활성을 저해하는, 제조 방법.
- 제2항, 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROCK 저해제는 Y-39983을 포함하는, 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 공정에 있어서, 미오신 2 저해제를 사용하여, 상기 미오신 2의 활성을 저해하는, 제조 방법.
- 제2항, 제3항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미오신 2 저해제는 블레비스타틴(Blebbistatin)을 포함하는, 제조 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포는, 상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포를 포함하고,
상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20% 이상인, 제조 방법. - 제12항에 있어서, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 제조 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구 세포의 비율(세포수)은 20 내지 70%인, 제조 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포는, 상기 다핵화 거핵구 세포를 포함하는 세포 집단이고,
상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%인, 제조 방법. - 제15항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구 세포는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 35%인, 제조 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식 인자는, 암 유전자, 폴리콤 유전자, 및/또는 아포토시스 억제 유전자가 코드하는 단백질인, 제조 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 불사화 거핵구인, 제조 방법.
- 다핵화 전의 거핵구 세포로부터 다핵화 거핵구 세포를 유도하는 다핵화 공정과,
상기 다핵화 거핵구 세포로부터 혈소판을 산생하는 혈소판 산생 공정을 포함하고,
상기 다핵화 공정은, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 다핵화 거핵구 세포의 제조 방법에 의해 실시되는, 혈소판의 제조 방법. - 혈소판으로부터 혈소판 제제를 제조하는 제제 공정을 포함하고,
상기 혈소판은, 제19항에 기재된 혈소판의 제조 방법으로 얻어진 것을 특징으로 하는, 혈소판 제제의 제조 방법. - 혈소판과 다른 성분을 혼합함으로써, 혈액 제제를 제조하는 혈액 제제 공정을 포함하고,
상기 혈소판은, 제19항에 기재된 혈소판의 제조 방법으로 얻어진 것을 특징으로 하는, 혈액 제제의 제조 방법. - 다핵화 거핵구를 포함하는 세포 집단으로서,
상기 다핵화 거핵구는 핵상이 16N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20% 이상인, 세포 집단. - 제22항에 있어서, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 세포 집단.
- 제23항에 있어서, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 16N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 70%인, 세포 집단.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 8N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 20 내지 90%인, 세포 집단. - 제25항에 있어서, 상기 세포 집단에 있어서, 상기 8N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 25 내지 60%인, 세포 집단.
- 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 50%인, 세포 집단. - 제27항에 있어서, 상기 다핵화 거핵구는, 핵상이 32N 이상의 다핵화 거핵구를 포함하고,
상기 세포 집단에 있어서, 상기 32N 이상의 다핵화 거핵구의 비율(세포수)은 5 내지 35%인, 세포 집단. - 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 불사화 거핵구인, 세포 집단.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다핵화 전의 거핵구 세포는, 외래성의 암 유전자, 폴리콤 유전자, 및/또는 아포토시스 억제 유전자를 포함하는, 세포 집단.
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