CN102666853B - 由干细胞向肝细胞的分化诱导方法 - Google Patents

由干细胞向肝细胞的分化诱导方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102666853B
CN102666853B CN201080057923.0A CN201080057923A CN102666853B CN 102666853 B CN102666853 B CN 102666853B CN 201080057923 A CN201080057923 A CN 201080057923A CN 102666853 B CN102666853 B CN 102666853B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
cell
cells
carrier
hex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201080057923.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102666853A (zh
Inventor
水口裕之
川端健二
稻村充
古江美保
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Health Sciences Foundation
Original Assignee
Japan Health Sciences Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Health Sciences Foundation filed Critical Japan Health Sciences Foundation
Publication of CN102666853A publication Critical patent/CN102666853A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102666853B publication Critical patent/CN102666853B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供由ES细胞或iPS细胞等干细胞有效地向肝细胞分化诱导时的基因导入方法；此外，本发明还提供导入有对于向肝细胞分化诱导有用的基因的干细胞，并且提供由导入有基因的干细胞生成的肝细胞；通过使用腺病毒载体，能够在ES细胞或iPS细胞等干细胞中导入特定的基因；并且，通过导入该基因，能够有效地向肝细胞分化诱导；具体而言，通过将选自HEX基因、HNF4A基因及SOX17基因中的任意一个或多个基因导入ES细胞或iPS细胞等干细胞中，能够有效地向肝细胞分化诱导；所述干细胞不是人胚胎干细胞。

Description

由干细胞向肝细胞的分化诱导方法
技术领域
本发明涉及由胚胎干细胞(以下也称为“ES细胞”)或诱导性多能干细胞(以下也称为“iPS细胞”)等多能干细胞向肝细胞分化诱导的方法。此外，本发明还涉及导入有对于向肝细胞分化诱导有用的基因的干细胞。
本申请要求以参考的形式援引于此的日本申请：日本特愿2009-247342号、日本特愿2010-121282号及日本特愿2010-154225号的优先权。
背景技术
多能干细胞是具有多向分化潜能和自我更新能力的未分化细胞，被揭示在组织损伤后具有组织修复能力。因此，多能干细胞在各种疾病的治疗用物质的筛选、再生医疗领域中是有用的，正在进行积极的研究。多能干细胞中，iPS细胞(InducedPluripotent Stem Cells，诱导多能干细胞)是通过在成纤维细胞等体细胞中导入特定的转录因子例如OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC等、使体细胞去分化而制作的诱导性多能干细胞。理论上而言，具有分化万能性(pluripotency)的细胞能够分化诱导为包括肝脏等在内的所有组织、器官。
作为由多能干细胞向肝细胞的分化诱导方法，主要尝试过使其形成细胞聚集体(胚状体)的方法；在培养基中添加体液因子的方法；或者选择适当的细胞外基质、饲养细胞、基质胶等来使用的方法等。但是，据报道，这些方法的培养期间长，分化诱导效率也极低，所得到的肝细胞的药物代谢酶活性也低(非专利文献1～4)。为了提高分化诱导效率，考虑在多能干细胞等中导入对于分化而言重要的基因，但由于尚未建立效率高的基因导入方法，因此几乎没有利用基因导入来诱导肝分化的相关报道。要由干细胞分化为成熟肝细胞，需要由干细胞经过内胚层细胞、肝干细胞、幼稚肝细胞的阶段。各分化阶段中，在培养体系中使用激活素(activin)A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；basic Fibroblast Growth Factor)、BMP4(bonemorphogenetic protein4，骨形态发生蛋白4)、FGF4、视黄酸或DMSO等体液因子。此外，据报道，作为发生学上能够使其分化为肝细胞的因子，需要HEX、HNF4A、HNF6、FOXA2等转录因子(非专利文献5)。例如，HEX基因在甲状腺、肺、肝脏、血液细胞、血管内皮细胞等中发现了表达。HEX基因缺陷小鼠未发现肝实质细胞，并在出生10.5天(E10.5)前后观察到死亡。认为HEX基因对例如GATA4、HNF4A、FGF受体基因等的表达进行调节。
有文献中提到，在如上所述将发生学上被认为是肝细胞特异性转录因子的FOXA2导入ES细胞中时，虽然观察到部分ES细胞向肝细胞分化，但是也确认到向肝细胞以外的细胞的分化(非专利文献6)。由此可见，FOXA2在导入到ES细胞之类的多能干细胞中时，不能成为可诱导仅向肝细胞分化的转录因子，其作用还未充分明确。
作为下一代基因治疗用载体系统，开发出了使用腺病毒(以下简称“Ad”)的系统。Ad的结构呈由252个壳粒构成的正20面体结构，位于顶点的12个壳粒称为具有突起结构的五邻体(由五邻体基底和纤突构成)，其他240个壳粒称为六邻体。病毒向细胞内的侵入通过纤突与Ad受体(CAR；coxsackievirus-adenovirus receptor，柯萨奇病毒-腺病毒受体)结合、然后五邻体基底的RGD基序与细胞表面上的整合素(αvβ3、αvβ5)结合而发生。但是，在之后的研究中，为了也能够将Ad载体导入未表达CAR或者即使表达CAR其表达量也非常低的细胞中而进行了各种的研究，并公开了研究结果(专利文献1～3)。已有关于使用这种改良型Ad载体向间充质干细胞内传递基因的报道(非专利文献7)。在此，记载了使用各种改良型Ad载体、将基因导入间充质干细胞等的技术方案。但是，间充质干细胞与ES细胞完全不同。此外，该非专利文献中，只不过是公开了Ad载体具有能够将基因导入到细胞中的DDS(Drug Delivery System，药物传递系统)的作用。有报道称腺病毒载体能够作为小鼠ES或iPS细胞的分化工具使用(非专利文献8、9)。但是，这些非专利文献中并没有公开由干细胞向肝细胞分化诱导的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-272480号公报(日本专利第3635462号公报)
专利文献2：日本特开2003-250566号公报
专利文献3：日本特开2008-136381号公报
非专利文献
非专利文献1：Genes to Cells，13，731-746(2008)
非专利文献2：Stem Cells，26，894-902(2008)
非专利文献3：Stem Cells，26，1117-1127(2008)
非专利文献4：Hepatology，45，1229-1239(2007)
非专利文献5：Nature Reviews Genetics，3，499-215(2002)
非专利文献6：FASEB Journal，16，1444-1446(2002)
非专利文献7：Biochem.Biophys.Res.Commun.，332，1101-1106(2005)
非专利文献8：Mol Ther.，12(3)，547-554(2005)
非专利文献9：Stem Cells，27(8)，1802-1811(2009)
发明内容
本发明的课题在于，提供将分化诱导相关的基因导入ES细胞或iPS细胞等多能干细胞中、由干细胞向肝细胞分化诱导的方法。此外，本发明的课题还在于，提供导入有对向组织细胞分化诱导有用的基因的干细胞，并且，本发明的课题还在于提供由导入有基因的干细胞通过分化而生成的肝细胞。
本发明人等为实现上述课题反复进行了深入研究，结果发现，通过使用Ad载体，能够在ES细胞或iPS细胞等多能干细胞中导入特定的基因。通过使用该载体来导入特定的基因，能够有效地向肝细胞分化诱导，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下内容。
1.一种由干细胞向肝细胞的分化诱导方法，其中，所述干细胞不是人胚胎干细胞，该分化诱导方法包括以下步骤：
1)将HEX基因重组到Ad载体中的步骤；
2)使干细胞与上述1)中重组有基因的Ad载体接触，从而将HEX基因导入到细胞内的步骤；
3)对导入有基因的干细胞进行培养的步骤。
2.如前项1所述的由干细胞向肝细胞的分化诱导方法，其中，在前项1)～3)所述的步骤之前，包括以下步骤：
a)将SOX17基因重组到Ad载体中的步骤；
b)使干细胞与上述a)中重组有基因的Ad载体接触，从而将SOX17基因导入到细胞内的步骤；
c)对导入有基因的干细胞进行培养的步骤。
3.如前项1所述的分化诱导方法，在如前项1所述的由干细胞向肝细胞的分化诱导方法中，在上述3)的对导入有HEX基因的干细胞进行培养的步骤之后，包括以下步骤：使培养的细胞与重组有HNF4A基因的Ad载体接触，从而进一步将HNF4A基因导入到细胞内的步骤。
4.如前项1所述的分化诱导方法，其中，包括用体液性分化诱导因子对干细胞进行处理的步骤。
5.如前项1所述的分化诱导方法，其中，干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
6.如前项5所述的分化诱导方法，其中，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞为人的诱导性多能干细胞。
7.一种干细胞，其通过前项1～6中任一项所述的分化诱导方法导入了基因。
发明效果
通过使用本发明的Ad载体，确认到与ES细胞或iPS细胞等多能干细胞的分化诱导相关的基因被有效地导入，并能够向肝细胞分化诱导。具体而言，通过将选自HEX基因、HNF4A基因、HNF6基因及SOX17基因中的任意一个或多个基因导入ES细胞或iPS细胞等干细胞中，能够使其有效地向肝细胞分化诱导。特别是确认到：通过将HEX基因导入干细胞中，能够有效地由干细胞向肝细胞分化诱导。此外确认到：作为其他基因，通过根据细胞的分化程度而适当导入SOX17基因和/或HNF4A基因等，能够更有效地由干细胞向肝细胞分化诱导。
附图说明
图1是表示通过使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例1、3)。
图2是利用免疫染色显示由人iPS细胞向肝细胞分化的状态的照片图(实验例1-1)。
图3是表示以甲胎蛋白(AFP)的表达为指标、对各种培养条件下培养时人iPS细胞向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例1-2)。
图4是表示以白蛋白的表达为指标、对各种培养条件下培养时人iPS细胞向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例1-2)。
图5是表示以AFP的表达为指标、对各种培养条件下培养时人ES细胞向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例2)。
图6是表示以白蛋白的表达为指标、对各种培养条件下培养时人ES细胞向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例2)。
图7是利用免疫染色显示由人iPS细胞向肝细胞分化的状态的照片图(实验例3-1)。
图8是表示通过使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例4)。
图9是表示以AFP及白蛋白的表达为指标、对各种培养条件下培养时人iPS细胞向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例4-1)。
图10是利用免疫染色显示由人iPS细胞向肝细胞分化的状态的照片图(实验例4-2)。
图11是表示通过使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例5)。
图12是表示对培养3种人干细胞时内胚层标志物即FOXA2及SOX17的表达量进行确认的结果的图(实验例5-1)。
图13是表示以甲胎蛋白(AFP)及白蛋白的表达为指标、对培养3种人干细胞时向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例5-1)。
图14是表示通过使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例6)。
图15是利用免疫染色显示由人iPS细胞向肝细胞分化的状态的照片图(实验例6-1)。
图16是表示通过使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例7、8)
图17是表示通过药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的表达、对导入有HEX基因的人iPS细胞(Tic株)的功能进行确认的结果的图(实验例7-1)。
图18是表示通过药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的功能及药物反应性、对导入有HEX基因的人iPS细胞的功能进行确认的结果的图(实验例7-2)。
图19是表示以白蛋白的表达为指标、对导入有HEX基因的人iPS细胞(Tic株、Dotcom株)向肝细胞的分化进行确认，并且通过药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的表达对细胞的功能进行确认的结果的图(实验例8-1)。
图20是表示通过使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例9)
图21是对导入有HEX基因的人iPS细胞(Tic株)的形态变化进行确认的照片图(实验例9-1)。
图22是表示通过使用Ad载体将SOX17基因及HEX基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例10)。
图23是利用免疫染色显示由人iPS细胞向肝细胞分化的状态的照片图(实验例10-1)。
图24是表示以AFP及白蛋白的表达为指标、对各种培养条件下培养时人iPS细胞向肝细胞的分化进行确认的结果的图(实验例10-2)。
图25是表示通过使用Ad载体将HEX基因及HNF4A基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例11)。
图26是利用免疫染色显示导入有各基因的人iPS细胞中药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的表达的照片图(实验例11-1)。
图27是表示通过药物代谢酶细胞色素P4502D6(CYP2D6)、3A4(CYP3A4)及7A1(CYP7A1)的表达，对导入有HEX基因及HNF4A基因的人iPS细胞的功能进行确认的结果的图(实验例11-2)。
图28是表示通过药物代谢活性对导入有HEX基因及HNF4A基因的人iPS细胞的功能进行确认的结果的图(实验例11-3)。
图29是表示通过使用Ad载体将SOX17基因、HEX基因及HNF4A基因导入人iPS细胞中而由iPS细胞向肝细胞分化诱导的实验的路线的图(实施例12)。
图30是表示通过药物代谢酶细胞色素P4502D6(CYP2D6)、3A4(CYP3A4)及7A1(CYP7A1)的表达，对利用SOX17基因、HEX基因及HNF4A基因的各种组合导入有基因的人iPS细胞的功能进行确认的结果的图(实验例12)。
具体实施方式
本发明涉及使用Ad载体将基因导入干细胞中、并由干细胞向肝细胞分化诱导的方法。本发明中，干细胞是指ES细胞或iPS细胞等多能干细胞，特别优选指人iPS细胞，进一步包括通过将基因导入人iPS细胞中而使其能够定向地向肝细胞分化的细胞，例如中内胚层细胞、内胚层细胞或肝干细胞等。本发明中的肝细胞，更具体而言由导入有基因的干细胞生成的肝细胞，除了成熟肝细胞以外，还包括通过向干细胞中导入基因而能够定向地向肝细胞分化的细胞，可以列举例如肝干细胞、幼稚肝细胞。
一般而言，ES细胞是指将位于囊胚期胚的内部的称为内细胞团(inner cell mass)的细胞团块转移至体外(in vitro)培养、并以未分化干细胞集团的形式分离出的多能干细胞。ES细胞是由GR.Martin(Natl.Acad.Sci.USA，78，7634，1981)继M.J.Evans&M.H.Kaufman(Nature，292，154，1981)之后在小鼠中作为具有多向分化潜能的细胞株而建立的。关于来源于人的ES细胞，也已经建立了多个细胞株，可以从ES CellInternational公司、威斯康星大学校友研究基金会、美国国家干细胞库(NSCB)等获得。ES细胞一股通过对早期胚进行培养来建立，但也可以由移植有体细胞核的早期胚来制作ES细胞。此外，还有下述方法：将异种动物的卵细胞或去核的卵细胞进行多份分割，在所得到的细胞囊胞(胞质体(cytoplasts)、卵质体(ooplastoids))中移植所期望的动物的细胞核，制作囊胚期胚样的细胞结构体，并基于此而制作ES细胞。此外，还报道了使孤雌生殖胚发育到与囊胚期同等的阶段、并由此制作ES细胞的尝试，以及通过使ES细胞与体细胞融合而制作具有体细胞核的遗传信息的ES细胞的方法。本发明中使用的ES细胞可以是利用上述自身公知的方法制作的ES细胞、或利用今后开发的新方法制作的ES细胞。
此外，iPS细胞是指通过向体细胞中导入多种基因而在不使用卵子、胚胎或ES细胞的情况下诱导分化细胞的初始化、从而具有与ES细胞同样的多潜能或增殖能力的诱导多能干细胞，2006年在世界上首次由小鼠的成纤维细胞制作而成。此外，还有将用于建立小鼠iPS细胞的4个基因的人同源基因即OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC导入来源于人的成纤维细胞中从而成功地建立了人iPS细胞的报道(Cell131：861-872，2007)。本发明中使用的iPS细胞，可以是利用上述自身公知的方法制作的iPS细胞、或利用今后开发的新方法制作的iPS细胞。
ES细胞或iPS细胞等干细胞的培养方法没有特别限制，可以使用自身公知的方法。作为能够维持ES细胞的未分化性及多潜能的培养基或适合分化诱导的培养基，可以使用自身公知的培养基或今后开发的新培养基。具体而言，可以使用在DMEM和/或DMEM/F12等市售的哺乳类细胞用基础培养基中添加血清或knock-out血清替代品(KSR)以及bFGF等而得到的培养基、市售的灵长类ES细胞用培养基、灵长类ES细胞增殖用基础培养基hESF-GRO、灵长类ES细胞分化诱导用基础培养基hESF-DIF、灵长类ES细胞增殖培养基CSTI-7等。此外，可以在培养基中以适当的浓度添加适合ES细胞或iPS细胞等多能干细胞的培养的自身公知的添加物，例如可以添加选自N2补充剂、B27补充剂、胰岛素、bFGF、激活素A、肝素、ROCK抑制剂或GSK-3抑制剂等各种抑制剂等中的一种或多种添加物。培养基及其添加物可以根据所使用的细胞、分化状态等进行适当选择来使用。例如，可以根据Tiss.Cult.Res.Commun.，27：139-147(2008)所述的方法来使用。
本发明中，Ad载体没有特别限制，可以使用利用自身公知的方法制作的Ad载体。例如，可以是进行了改良以便能够将Ad载体导入到未表达CAR的细胞或者即使表达CAR表达量也非常低的细胞中的改良型Ad载体，也可以是能够在表达CAR的细胞中使用的Ad载体。具体而言，可以使用导入有编码作为粘附肽代表的细胞粘附肽(RGD序列)的DNA、编码与硫酸类肝素具有亲和性的肽(K7(KKKKKKK)序列)的DNA、编码与层粘连蛋白受体具有亲和性的肽的DNA、编码与E-选择素具有亲和性的肽的DNA等的Ad载体，例如可以使用专利文献1～3中所述的Ad载体。
关于在Ad载体中重组以下所示的期望基因的方法，可以采用自身公知的方法或今后开发的所有方法。本发明的Ad载体可以利用各限制性内切酶对一种或多种限制性内切酶的识别序列进行消化，并借助穿梭载体或者不借助穿梭载体而通过体外连接对导入基因进行导入。
本发明中，能够使用Ad载体而导入的基因只要是能够由ES细胞或iPS细胞等多能干细胞向肝细胞有效地诱导分化的基因即可。具体而言，可以将选自HEX基因、HNF4A基因、HNF6基因及SOX17基因中的任意一个或多个基因导入干细胞中，特别优选导入HEX基因(参考图1、8、11、14、16、20)。通过导入HEX基因，能够由干细胞向肝细胞分化诱导。并且，为了有效地促进向肝细胞的分化诱导，优选先导入SOX17基因，进行由干细胞向内胚层细胞的分化诱导的定向后，再导入HEX基因(参考图22)。此外，利用HEX基因进行向肝细胞的分化诱导的定向后，可以进一步导入选自HNF4A基因、HNF6基因及FOXA2基因中的任意一个或多个基因、特别优选导入HNF4A基因，以促进向肝细胞的分化诱导(参考图25)。为了最高效地进行由干细胞向肝细胞的分化诱导，最优选在导入SOX17基因、进行由干细胞向肝细胞的分化诱导的定向后，导入HEX基因，然后进一步导入HNF4A基因(参考图29)。例如，可以通过包括以下步骤1)～3)的步骤的操作，由ES细胞或iPS细胞向肝细胞分化诱导。
1)在Ad载体中重组能够由ES细胞或iPS细胞等干细胞向肝细胞有效地诱导分化的基因的步骤。
2)使干细胞与上述1)中重组有基因的Ad载体接触，从而将能够由干细胞向肝细胞有效地诱导分化的基因导入到细胞内的步骤。
3)对导入有基因的干细胞进行培养的步骤。
上述1)中，能够由干细胞向肝细胞有效地诱导分化的基因为选自HEX基因、HNF4A基因及HNF6基因中的任意一个或多个基因，更优选为HEX基因。在导入上述基因之前，通过将SOX17基因导入干细胞并进行培养，能够更有效地进行向肝细胞的分化的定向。进而，在上述3)的步骤之后，通过在培养的细胞内导入选自HNF4A基因、HNF6基因及FOXA2基因中的任意一个或多个基因、特别优选HNF4A基因，能够更有效地向肝细胞进行分化诱导。认为除SOX17、HEX、HNF4A以外，通过导入GATA4、GATA6、HNF1A、HNF1B、FOXA1/HNF3A、FOXA2/HNF3B、FOXA3/HNF3G、CEBPA、CEBPB、TBX3、PROX1等参与肝细胞的分化和增殖的基因，能够有效地由iPS细胞制作肝细胞，各基因的导入步骤可以根据细胞的分化程度而适当选择。此外，为了制作围绕肝细胞的胆管上皮细胞，认为导入Sall4基因及HNF6基因是有效的。这些基因的导入可以通过使重组有期望的基因的Ad载体与对应于各分化状态的干细胞接触来进一步将任意一种基因导入细胞内。
关于导入的基因，HEX基因可以使用例如GenBank收录号BC014336中收录的基因，HNF4A基因可以使用例如GenBank收录号NM000457中收录的基因，HNF6基因可以使用例如GenBank收录号NM004498中收录的基因，FOXA2基因可以使用例如GenBank收录号BC011780中收录的基因，SOX17基因可以使用例如GenBank收录号NM_022454中收录的基因。
本发明的Ad载体可以通过包括下述A)和B)的步骤的制造方法来制作。
A)构建在导入基因的非翻译区含有启动子序列的表达构建体的步骤。
B)将Ad基因组用限制性内切酶进行切割、并将A)中制作的表达构建体连接到Ad基因组中的步骤。
本发明的Ad载体也可以通过在上述A)与B)的步骤之间构建含有A)的表达构建体的穿梭载体、并将该基因表达穿梭载体连接到Ad基因组中来制作。
在由未分化的细胞向成熟肝细胞分化的各步骤中，使用激活素A、bFGF、BMP4、FGF-4等体液因子是公知的，本发明的由ES细胞或iPS细胞等干细胞向肝细胞分化诱导的步骤中，也可以组合使用各体液因子而使其与细胞接触。使体液因子与细胞接触的步骤没有特别限制，可以在上述各种被选择的基因的导入之前，也可以在导入之后。此外，在多次导入基因的情况下，可以在各基因的导入与导入之间与细胞接触。正常细胞的生长和分裂需要细胞间的相互粘附、与其他细胞或基质的粘附，因而还需要作为细胞与细胞、或细胞与基质的中介的蛋白质(细胞外基质)。本发明的向肝细胞分化诱导的方法中，在上述步骤中还可以添加上述的细胞外基质。作为细胞外基质，可列举基质胶、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、肌腱蛋白、凝血酶敏感蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、明胶或与它们相当的合成基质等，本发明中可以特别优选使用基质胶或层粘连蛋白。具体而言，可以通过包被或添加到培养用容器中来进行使用。
本发明还涉及导入了重组有上述基因的Ad载体的ES细胞或iPS细胞等干细胞。此外，还涉及由导入了重组有上述基因的Ad载体的干细胞生成的肝细胞。
使用由本发明的分化诱导方法制作的肝细胞，能够进行药物毒性评价或药物动态评价。具体而言，通过向由本发明制作的肝细胞中添加药品候选化合物、并对肝毒性标志物的表达变动进行分析，能够事先预测药品候选化合物在生物体内的毒性。此外，通过向由本发明制作的肝细胞中添加药品候选化合物、并对化合物的代谢产物进行分析，能够事先预测药品候选化合物在生物体内的药物动态(代谢产物)。由此，能够早期筛选出因毒性或药物动态的问题而应被排除的药品候选化合物，从而可望加速药物的创制。本发明还涉及由本发明的分化诱导方法制作的肝细胞在药物毒性评价或药物动态评价中的使用方法。
实施例
以下，为了加深本发明的理解，列举实施例及实验例具体地说明本发明，当然这些例子并不用于限定本发明的范围。
另外，由于本实施例及实验例中需要使用针对人iPS细胞或人ES细胞的各种培养基，因此，作为参考例对各种培养基的组成进行了说明，之后在各实施例中，对分化诱导方法进行了说明。
(参考例)各种培养基组成
1)作为人iPS细胞未分化维持用培养基，使用Tiss.Cult.Res.Commun.，27：139-147(2008)的表2所示的组成中、以Knockout DMEM/F12为基本培养基并含有bFGF(10ng/ml)的培养基。以下，将该培养基称为“培养基1”。
2)作为人ES细胞未分化维持用培养基，使用Tiss.Cult.Res.Commun.，27：139-147(2008)的表2所示的组成中、以DMEM/F12为基本培养基并含有bFGF(5ng/ml)的培养基。以下，将该培养基称为“培养基2”。
3)作为未分化维持用培养基，使用在人ES细胞培养用基本培养基即hESF-GRO培养基(Cell Science&Technology Institute公司)中含有胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(5μg/ml)、白蛋白偶联油酸(9.4μg/ml)、2-巯基乙醇(10μM)、2-乙醇胺(10μM)、亚硒酸钠(20nM)、肝素(100ng/ml)及bFGF(10ng/ml)的培养基(Proc Natl AcadSci U SA.；105(36)：13409-13414(2008))。以下，将该培养基称为“培养基3”。培养基3不需要饲养细胞，并且也不需要KnockoOut血清替代品(KSR)，能够维持人iPS细胞的未分化状态或多向分化潜能而进行培养。
4)作为分化诱导用培养基，使用在人ES细胞培养用基本培养基即hESF-GRO(Cell Science&Technology Institute公司)中含有胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(5μg/ml)、2-巯基乙醇(10μM)、2-乙醇胺(10μM)、亚硒酸钠(20nM)及牛血清白蛋白(BSA)(1mg/ml)的培养基。以下，将该培养基称为“培养基4”。
5)作为分化诱导用培养基的其他方式，使用在人ES细胞分化诱导用基本培养基即hESF-DIF(Cell Science&Technology Institute公司)中含有胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(5μg/ml)、2-巯基乙醇(10μM)、2-乙醇胺(10μM)、亚硒酸钠(20nM)的培养基(FASEB J.23：114-22(2009))。以下，将该培养基称为“培养基5”。
(实施例1)由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图1。
1)HEX基因导入用Ad载体的构建
制作了在E1缺陷型的5型Ad基因组(pAdHM41-K7)的E1缺陷部位搭载有导入基因并在其上游搭载有EF-1α启动子的Ad载体。导入基因是由GenBank收录号BC014336中所示的序列构成的HEX基因。
2)人iPS细胞的培养
本实施例中，使用人iPS细胞(Tic(JCRB1331)、Dotcom(JCRB1327)、Squeaky(JCRB1329))。以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养细胞，按照Tiss.Cult.Res.Commun.，27：139-147(2008)所述的方法，准备使用参考例中所示的培养基1进行培养的人iPS细胞。在人iPS细胞的分化诱导2天前，将上述培养的培养基更换为参考例所示的培养基3。
接着，使用细胞剥离液即Accutase(商标)(Invitrogen公司)在37℃处理3分钟，并将含有悬浮的饲养细胞的上清液除去。然后，使用培养基3将人iPS细胞剥离，并以1300rpm进行3分钟的离心处理。使用参考例所示的培养基4，以1300rpm进行2次3分钟的离心处理。
将离心处理所得到的人iPS细胞悬浮于添加有50ng/ml的激活素A(R&DSystems公司)及10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基4中，然后，在由层粘连蛋白(sigma公司)包被的细胞培养板(12孔)的各孔中接种2.5×105细胞/孔的人iPS细胞，并在37℃进行了培养。使用添加有50ng/ml的激活素A(R&DSystems公司)及10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基4每天进行了培养基更换。将接种人iPS细胞的时刻作为分化诱导第0天。
3)HEX基因向人iPS细胞中的导入
在分化诱导第5天，利用0.0125％胰蛋白酶(trypsin)-0.01325mM EDTA将人iPS细胞从细胞培养板剥离后，利用0.1mg/ml的胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶，然后，使用参考例所示的培养基5，以1300rpm进行了2次3分钟的离心处理。将离心处理所得到人iPS细胞悬浮于添加有50ng/ml的激活素A(R&D Systems公司)及10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基5中，以5.0×105细胞/孔接种到由层粘连蛋白(sigma公司)包被的细胞培养板(12孔)的各孔中，并在37℃进行了培养。
培养24小时后，使上述1)中插入有HEX基因的K7型Ad载体以3000VP(载体颗粒)/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有10ng/ml的BMP4(R&D Systems公司)和10ng/ml的FGF-4(R&D Systems公司)的培养基5。然后，使用添加有10ng/ml的MBP4(R&D Systems公司)和10ng/ml的FGF-4(R&D Systems公司)的培养基5每天进行了培养基更换。
(实验例1-1)抗体免疫染色法的结果
在培养第12天，使用由Alexa(商标)594标记的抗甲胎蛋白(AFP)抗体(Dako公司制)及由Alexa(商标)488标记的抗CK7抗体(Invitrogen公司制)，通过免疫抗体染色法对各基因的表达进行了确认。AFP为肝干细胞的标志物，CK7为胆管上皮细胞的标志物。如图2所示，在使用Ad载体导入了HEX基因的系统中，与未导入基因的系统相比，观察到各种标志物发生了较强的反应。由此确认，通过使用Ad载体导入HEX基因，促进了由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导。
(实验例1-2)实时PCR法的结果
对培养第0天(未分化的细胞)、第5天(内胚层细胞)及第12天的细胞，使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(Applied Biosystems公司、目录号：对于AFP为Hs01040607_ml、对于白蛋白为Hs00910225_m)，通过实时PCR法，考察了能够作为肝干细胞的标志物的AFP及白蛋白的表达量。表达量以人胎肝总RNA(Clontech公司、目录号636540)中的各基因表达量为基准(100)来进行计算。
结果，对于AFP及白蛋白的任意一种，在导入有HEX基因的系统中均明显确认到表达量增加，可知导入有HEX基因的系统中显示出分化诱导倾向(图3、4)。
(实施例2)由人ES细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，使用Ad载体将HEX基因导入到京都大学再生医科学研究所建立的人ES细胞(KhES-1)中来代替人iPS细胞，进行由人ES细胞向肝细胞的分化诱导实验。本实施例中，以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养细胞，按照Tiss.Cult.Res.Commun.，27：139-147(2008)所述的方法，准备使用参考例中所示的培养基2所培养的人ES细胞，除此之外，利用与实施例1相同的方法进行1)HEX基因导入用Ad载体的构建和3)HEX基因向人ES细胞中的导入操作，由此进行实验。
(实验例2)实时PCR法的结果
对培养第0天(未分化的细胞)、第5天(内胚层细胞)及第12天的细胞，通过与实验例1-2相同的方法，利用实时PCR法考察了能够作为分化指标的AFP及白蛋白的表达量。
结果，对于AFP及白蛋白的任意一种，在导入有HEX基因的系统中均明显确认到表达量增加，可知导入有HEX基因的系统中显示出分化诱导倾向(图5、6)。
(实施例3)由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图1。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建、2)人iPS细胞的培养、3)HEX基因向人iPS细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行。使用了人iPS细胞(Squeaky(JCRB1329))。
(实验例3-1)抗体免疫染色法的结果
在培养第12天，使用由Alexa(商标)594标记的抗AFP抗体(Dako公司制)及由Alexa(商标)488标记的抗CK7抗体(Invitrogen公司制)，通过免疫抗体染色法对AFP及CK7各基因的表达进行了确认。AFP为肝干细胞的标志物，CK7为胆管上皮细胞的标志物。如图7所示，在使用Ad载体导入了HEX基因的系统中，与未导入基因的系统相比，观察到各种标志物发生了较强的反应。由此确认，通过使用Ad载体导入HEX基因，促进了由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导。
(实施例4)由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图8。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建、2)人iPS细胞的培养、3)HEX基因向人iPS细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行。使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331))。
(实验例4-1)实时PCR法的结果
对培养第0天(未分化的细胞)、第5天(内胚层细胞)及第12天的细胞，使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(Applied Biosystems公司、目录号：对于AFP为Hs01040607_m1、对于白蛋白为Hs00910225_m)，通过实时PCR法，考察了能够作为肝干细胞的标志物的AFP及白蛋白各基因的表达量。表达量以人胎肝总RNA(Clontech公司、目录号636540)中的各基因表达量为基准(100)来进行计算。
结果，对于AFP及白蛋白的任意一种，在导入有HEX基因的系统中均明显确认到表达量增加，可知导入有HEX基因的系统中显示出分化诱导倾向(图9)。
(实验例4-2)抗体免疫染色法的结果
在培养第12天，使用由Alexa(商标)594标记的抗AFP抗体(Dako公司制)、由Alexa(商标)594标记的抗白蛋白(ALB)抗体(SIGMA公司制)及由Alexa(商标)488标记的抗CK7抗体(Invitrogen公司制)，通过免疫抗体染色法对AFP、白蛋白及CK7各基因的表达进行了确认。AFP为肝干细胞的标志物，白蛋白为肝细胞的标志物，CK7为胆管上皮细胞的标志物。如图10所示，在使用Ad载体导入了HEX基因的系统中，与未导入基因的系统相比，观察到各种标志物发生了较强的反应。由此确认，通过使用Ad载体导入HEX基因，促进了由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导。
(实施例5)由人iPS细胞、ES细胞向肝细胞的分化诱导方法
1)人iPS细胞及人ES细胞的培养
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞或ES细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞及人ES细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图11。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建、2)细胞的培养、3)HEX基因向细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行。对于人iPS细胞使用了Tic(JCRB1331)、Dotcom(JCRB1327)，对于ES细胞使用了khES1ES细胞。
(实验例5-1)实时PCR法的结果
对培养第0天(未分化的细胞)、第6天(内胚层细胞)及第12天的细胞，考察了能够作为内胚层标志物的FOXA2及SOX17、以及能够作为肝干细胞标志物的AFP及白蛋白各基因的表达量。各基因的表达使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(Applied Biosystems公司、目录号：对于FOXA2为Hs00232764_m1、对于SOX17为Hs00751752_s1、对于AFP为Hs01040607mi、对于白蛋白为Hs00910225_m)，通过实时PCR法进行考察。表达量以人iPS细胞Tic的培养第0天(未分化的细胞)为基准(1)进行计算。
如图12所示，第6天(内胚层细胞)时，内胚层标志物即FOXA2及SOXl7在细胞株Dotcom中的表达量最高。此外，如图13所示，通过使用Ad载体导入HEX基因，能够作为肝干细胞标志物的AFP及能够作为肝细胞标志物的白蛋白在细胞株Dotcom中确认到最显著的表达量增加。由此确认，通过使用Ad载体导入HEX基因，更有效地促进了由内胚层标志物表达较强的细胞向肝细胞的分化诱导。
(实施例6)HEX基因的肝分化诱导效果(培养第18天)
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图14。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建及3)HEX基因向人iPS细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行。2)人iPS细胞通过以下方法进行了培养。
2)人iPS细胞的培养
本实施例中，使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331))。到分化诱导第9天为止，通过与(实验例1)同样的方法进行了培养。然后，利用0.0125％胰蛋白酶-0.01325mMEDTA回收培养第9天的细胞，按照Stem Cells.，26：1117-27(2008)的记载，悬浮于添加有SingleQuots(商标)(Lonza公司)、10ng/mL成纤维细胞生长因子4(FGF4)、10ng/mL肝细胞生长因子(HGF)(R&D Systems公司)、10ng/mL抑瘤素M(R&DSystems公司)及10-7M地塞米松(Sigma公司)的HCM(商标)肝细胞培养基(Lonza公司)中后，接种到了由I型胶原蛋白(Nitta Gelatin公司)包被的细胞培养板(12孔)中。每天进行了培养基更换。
(实验例6-1)抗体免疫染色法的结果
在培养第18天，使用由Alexa(商标)594标记的抗白蛋白(ALB)抗体(SIGMA公司制)、由Alexa(商标)594标记的抗药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)抗体(Santa Cruz公司制)及由Alexa(商标)594标记的抗药物代谢酶细胞色素P4507A1(CYP7A1)抗体(Santa Cruz公司制)，通过免疫抗体染色法对各基因的表达进行了确认。白蛋白、CYP3A4、CYP7A1均为肝细胞标志物。如图15所示，在培养第18天，在使用Ad载体导入了HEX基因的系统中，与未导入基因的系统相比，任意一种肝细胞标志物均观察到较强的反应。
(实施例7)导入有HEX基因的细胞的功能性评价
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图16。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建及3)HEX基因向人iPS细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行，2)人iPS细胞的培养通过与实施例6相同的方法进行。本实施例中，使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331))。
(实验例7-1)实时PCR法的结果
对培养第18天的细胞，使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(AppliedBiosystems公司、目录号：对于CYP3A4为Hs00430021_m1)，通过实时PCR法，考察了药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的表达量。表达量以人成体肝总RNA(Clontech公司、目录号636531)中的各基因表达量为基准(100)进行计算(图17)。
结果，通过使用Ad载体导入HEX基因，CYP3A4的表达量显著增加，能够得到与胎肝细胞相当的表达量。
(实验例7-2)药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的活性测定
向分化诱导第18天的来源于人iPS细胞的肝细胞或人肝癌细胞株HepG2中添加25μM利福平(Sigma公司)或DMSO，72小时后使用P450-Glo(商标)CYP3A4分析试剂盒(Promega公司)，测定了CYP3A4的活性。活性使用发光检测仪(LumatLB9507、Berthold公司)进行了定量。
结果，在培养第18天，在使用Ad载体导入了HEX基因的系统中，与未导入基因的系统相比，观察到CYP3A4的活性增加，并且观察到对利福平的药物反应性也增加(图18)。
(实施例8)由内胚层分化能力高的iPS细胞株向肝细胞的分化诱导
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图16。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建及3)HEX基因向人iPS细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行，2)人iPS细胞的培养通过与实施例6相同的方法进行。本实施例中，使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331)、Dotcom(JCRB1327))。
(实验例8-1)药物代谢酶细胞色素P4503A4(CYP3A4)的活性测定
通过与实验例7-2相同的方法，测定了CYP3A4的活性。结果，在使用Ad载体导入了HEX基因的情况下，能够由向内胚层分化能力高的细胞株Dotcom分化诱导出白蛋白或CYP3A4的表达量更高的肝细胞(图19)。
(实施例9)分化诱导时的形态变化
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图20。对于1)HEX基因导入用Ad载体的构建及3)HEX基因向人iPS细胞中的导入，通过与实施例1相同的方法进行，2)人iPS细胞的培养通过与实施例6相同的方法进行。本实施例中，使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331))。
(实验例9-1)形态观察
对培养第0天(未分化的细胞)、第6天(内胚层细胞)、第9天(肝干细胞)及第21天的细胞的形态进行了观察。结果，由致密的细胞形态(培养第0天)变化为细胞间密度低、分化细胞所特有的形态(培养第6天)。进而，从培养第9天至第21天，在使用Ad载体导入有HEX基因的系统中，变化为肝细胞所特有的上皮样细胞形态。因此，由细胞的形态也暗示，通过导入HEX基因而分化诱导的细胞为肝细胞(图21)。
(实施例10)利用SOX17基因与HEX基因的组合的、由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，对使用Ad载体将SOXI7基因及HEX基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图22。
1)SOX17基因导入用Ad载体的构建
作为SOX17基因导入用Ad载体，制作了在E1缺陷型的5型Ad基因组(pAdHM41-K7)的E1缺陷部位搭载有导入基因并在其上游搭载有EF-1α启动子的Ad载体。导入基因是由GenBank收录号NM_022454所示的序列构成的SOX17基因。另外，HEX基因导入用Ad载体通过与实施例1相同的方法进行了制作。
2)人iPS细胞的培养
本实施例中，使用了人iPS细胞(201B7(JCRB))。到分化诱导第3天为止，利用与实施例1同样的方法进行了培养。
3)SOX17基因向人iPS细胞中的导入
从开始分化诱导起培养72小时后，使上述1)中插入有SOX17基因的K7型Ad载体以3000VP/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有50ng/ml的激活素A(Activin A；R&D Systems公司)和10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基4。然后，使用添加有50ng/ml的激活素A(R&D Systems公司)和10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基4每天进行了培养基更换。
4)HEX基因向导入有SOX17基因的细胞中的导入
在分化诱导第5天，利用0.0125％胰蛋白酶-0.01325mM EDTA将人iPS细胞从细胞培养板剥离后，利用0.1mg/ml的胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶，然后，使用参考例所示的培养基5，以1300rpm进行了2次3分钟的离心处理。将离心处理所得到人iPS细胞悬浮于添加有50ng/ml的激活素A(R&D Systems公司)及10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基5中，以5.0×105细胞/孔接种到由层粘连蛋白(sigma公司)包被的细胞培养板(12孔)的各孔中，并在37℃进行了培养。培养24小时后，使插入有HEX基因的K7型Ad载体以3000VP/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有10ng/ml的BMP4(R&D Systems公司)和10ng/ml的FGF4(R&D Systems公司)的培养基5。然后，使用添加有10ng/ml的BMP4(R&D Systems公司)和10ng/ml的FGF4(R&D Systems公司)的培养基5每天进行了培养基更换。
(实验例10-1)抗体免疫染色法的结果
在培养第9天及培养第12天，使用由Alexa(商标)594标记的抗甲胎蛋白(AFP)抗体(Dako公司制)、由Alexa(商标)594标记的抗白蛋白(ALB)抗体(SIGMA公司制)及由Alexa(商标)488标记的抗CK7抗体(Invitrogen公司制)，通过免疫抗体染色法对各基因的表达进行了确认。AFP为肝干细胞的标志物，白蛋白为肝细胞的标志物，CK7为胆管上皮细胞的标志物。如图23所示，在培养第9天，在使用Ad载体导入了SOX17基因和HEX基因的系统中，与仅导入了HEX基因的系统相比，观察到肝干细胞标志物发生了较强的反应，但胆管上皮细胞标志物在任意一个系统中均未表达。此外，在培养第12天，在使用Ad载体导入了SOX17基因和HEX基因的系统中，与仅导入了HEX基因的系统相比，观察到肝细胞标志物发生了较强的反应。
(实验例10-2)实时PCR法的结果
对培养第9天及培养第12天的细胞，使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(Applied Biosystems公司、目录号：对于AFP为Hs01040607_m1、对于白蛋白为Hs00910225_m)，通过实时PCR法，考察了能够作为肝干细胞标志物的AFP及白蛋白的表达量。表达量以人胎肝总RNA(Clontech公司、目录号636540)中的各基因表达量为基准(100)进行计算。结果，通过使用Ad载体导入SOX17基因和HEX基因，与仅使用HEX基因的情况相比，确认到具有更有效地促进由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导的倾向(图24)。
(实施例11)利用HEX基因与HNF4A基因的组合的、由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，对使用Ad载体将HEX基因及HNF4A基因导入人iPS细胞中、并由导入有该基因的人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图25。
1)HNF4A基因导入用Ad载体的构建
制作了在E1缺陷型的5型Ad基因组(pAdHM41-K7)的E1缺陷部位搭载有导入基因并在其上游搭载有EF-1α启动子的Ad载体。导入基因是由GenBank收录号NM000457所示的序列构成的HNF4A基因。另外，HEX基因导入用Ad载体通过与实施例1相同的方法进行了制作。
2)人iPS细胞的培养
本实施例中，使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331)、Dotcom(JCRB1327)、201B7)。到分化诱导第9天为止，利用与实施例1同样的方法进行了培养。
3)HEX基因及HNF4A基因向人iPS细胞中的导入
在分化诱导第9天，使上述1)中插入有HNF4A基因的K7型Ad载体以3000VP/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有10ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)(R&D Systems公司)、10ng/ml的抑瘤素M(R&D Systems公司)及10-7M地塞米松(Sigma公司)的HCM(商标)培养基(Lonza公司)。然后，使用添加有10ng/ml的HGF(R&D Systems公司)、10ng/ml的抑瘤素M(R&D Systems公司)及10-7M地塞米松(Sigma公司)的HCM(商标)培养基(Lonza公司)，每两天进行了一次培养基更换。
(实验例11-1)抗体免疫染色法的结果
在培养第18天，使用由Alexa(商标)594标记的抗药物代谢酶P4502D6(CYP2D6)抗体(Santa Cruz公司制)、由Alexa(商标)594标记的抗药物代谢酶P4503A4(CYP3A4)抗体(Santa Cruz公司制)及由Alexa(商标)594标记的抗药物代谢酶P4507A1(CYP7A1)抗体(Santa Cruz公司制)，通过免疫抗体染色法对各基因的表达进行了确认。CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1均为肝细胞标志物。如图26所示，在培养第18天，在使用Ad载体导入了HEX基因和HNF4A基因的系统中，与仅导入了HEX基因的系统相比，观察到任意一种肝细胞标志物均发生了较强的反应。
(实验例11-2)实时PCR法的结果
对培养第18天的细胞，使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(AppliedBiosystems公司、目录号：对于CYP2D6为Hs02576168_g1、对于CYP3A4为Hs00430021_m1、对于CYP7A1为Hs00167982_m1)，通过实时PCR法，考察了能够作为肝细胞标志物的CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1的表达量。表达量以人成体肝总RNA(Clontech公司、目录号636531)中的各基因表达量为基准(100)进行计算。结果，通过使用Ad载体导入HEX基因和HNF4A基因，与仅使用HEX基因的情况相比，CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1的表达量显著增加，能够得到药物代谢的表达量比以往高的肝细胞(图27)。
(实验例11-3)药物代谢酶P4503A4的活性测定
向分化诱导第18天的来源于人iPS细胞的肝细胞或人肝癌细胞株HepG2中添加25μM利福平(Sigma公司)或DMSO，72小时后使用P450-Glo(商标)CYP3A4分析试剂盒(Promega公司)，测定了CYP3A4的活性。活性使用发光检测仪(LumatLB9507、Berthold公司)进行了定量。结果，通过使用Ad载体导入HEX基因和HNF4A基因，与仅使用HEX基因的情况相比，观察到CYP3A4的活性增加，并且观察到对利福平的药物反应性也增加。因此，根据本方法，通过使用Ad载体导入HEX基因和HNF4A基因，能够得到药物代谢酶的活性比以往高的肝细胞(图28)。
(实施例12)利用SOX17、HEX基因、HNF4A基因的组合的、由人iPS细胞向肝细胞的分化诱导方法
本实施例中，对使用Ad载体适时地将SOX17基因、HEX基因、HNF4A基因导入人iPS细胞中、并由人iPS细胞向肝细胞分化诱导的情况进行说明。本实施例的实验路线示于图29。
1)SOX17基因、HEX基因、HNF4A基因导入用Ad载体
使用了与申请例1同样的Ad载体。
2)人iPS细胞的培养
本实施例中，使用了人iPS细胞(Tic(JCRB1331))。到分化诱导第3天为止，通过与实施例1同样的方法进行了培养。
3)SOX17基因的导入
分化诱导开始3天后，使插入有SOX17基因的K7型Ad载体以3000VP/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有50ng/ml的激活素A(R&D Systems公司)和10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基4。然后，使用添加有50ng/ml的激活素A(R&D Systems公司)和10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基4每天进行了培养基更换。将未导入SOX17基因的细胞作为对照组。
4)HEX基因的导入
在分化诱导第6天，利用0.0125％胰蛋白酶-0.01325mM EDTA将上述各细胞从细胞培养板剥离后，利用0.1mg/ml的胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶，然后，使用参考例所示的培养基5，以1300rpm进行了2次3分钟的离心处理。将离心处理所得到人iPS细胞悬浮于添加有50ng/ml的激活素A(R&D Systems公司)及10ng/ml的bFGF(R&D Systems公司)的培养基5中，以5.0×105细胞/孔接种到由层粘连蛋白(sigma公司)包被的细胞培养板(J2孔)的各孔中，并在37℃进行了培养。培养24小时后，使插入有HEX基因的K7型Ad载体以3000VP/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有10ng/ml的BMP4(R&D Systems公司)和10ng/ml的FGF4(R&D Systems公司)的培养基5。然后，使用添加有10ng/ml的BMP4(R&DSystems公司)和10ng/ml的FGF4(R&D Systems公司)的培养基5每天进行了培养基更换。将未导入HEX基因的细胞作为对照组。
5)HNF4A基因的导入
在分化诱导第9天，使上述1)中插入有HNF4A基因的K7型Ad载体以3000VP/细胞进行1.5小时感染，然后，更换为添加有10ng/ml的HGF(R&D Systems公司)、10ng/ml的抑瘤素M(R&D Systems公司)及10-7M地塞米松(Sigma公司)的HCM(商标)培养基(Lonza公司)。然后，使用添加有10ng/ml的HGF(R&D Systems公司)、10ng/ml的抑瘤素M(R&D Systems公司)及10-7M地塞米松(Sigma公司)的HCM(商标)培养基(Lonza公司)，每两天更换一次培养基。将未导入HNF4A基因的细胞作为对照组。
导入的基因的组合如表1所示。
[表1]
导入的基因的组合
(实验例12)实时PCR法的结果
对培养第18天的细胞，使用TaqMan(商标)基因表达分析试剂盒(AppliedBiosystems公司、目录号：对于白蛋白(ALB)为Hs00910225_m、对于CYP2D6为Hs02576168_gl、对于CYP3A4为Hs00430021_m1、对于CYP7A1为Hs00167982_m1)，通过实时PCR法，考察了作为肝细胞标志物的ALB、CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1的表达量。表达量以人成体肝组织(人成体肝总RNA：Clontech公司、目录号636531)中的各基因表达量为基准(100)进行计算。其结果示于图30。图30的横轴所示的编号为表1的基因的组合的编号。结果，在使用Ad载体导入了SOX17基因、HEX基因、HNF4A基因全部3个基因的细胞中，与导入了其他组合的基因的情况相比，白蛋白、CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1的表达量显著增加，能够得到药物代谢的表达量比以往高的肝细胞。
(产业上的利用可能性)
如以上所述，通过使用本发明的Ad载体，确认到与ES细胞或iPS细胞等多能干细胞的分化诱导相关的基因被有效地导入，并能够向肝细胞分化诱导。具体而言，通过将选自HEX基因、HNF4A基因、HNF6基因及SOX17基因中的任意一个或多个基因导入ES细胞或iPS细胞等干细胞中，能够使其有效地向肝细胞分化诱导。特别是确认到：通过将HEX基因导入干细胞中，能够由干细胞有效地向肝细胞分化诱导。另外确认到：作为其他基因，通过根据细胞的分化程度而适当导入SOX17基因和/或HNF4A基因等，能够更有效地由细胞向肝细胞分化诱导。
使用由本发明的分化诱导方法制作的肝细胞，能够进行例如药物毒性评价或药物动态评价。具体而言，通过向由本发明制作的肝细胞中添加药品候选化合物、并对肝毒性标志物的表达变动进行分析，能够事先预测药品候选化合物在生物体内的毒性。此外，通过向由本发明制作的肝细胞中添加药品候选化合物、并对化合物的代谢产物进行分析，能够事先预测药品候选化合物在生物体内的药物动态(代谢产物)。由此，能够早期筛选出因毒性或药物动态的问题而应被排除的药品候选化合物，从而可望加速药物的创制。
根据本发明的方法，如果能够由ES细胞或iPS细胞之类的多能干细胞向肝细胞分化诱导，则能够在体外实现肝细胞结构的再建，进而可望实现成熟肝细胞或分化诱导而来的肝脏的制作。通过使用本发明的Ad载体，无需制作表达特定基因的稳定株，即可由各种ES细胞或iPS细胞分化诱导肝细胞。因此，只要准备iPS细胞，就能够快速地制作该人所特有的自体来源的肝脏。此外，根据本发明的方法，对于以往只有通过器官移植才能应对的疾病，也开辟了利用再生医疗进行治疗的可能性，因而非常有用。

Claims (7)

1.一种由干细胞向肝细胞的分化诱导方法，其中，所述干细胞不是人胚胎干细胞，该分化诱导方法包括以下步骤：
1)将HEX基因重组到腺病毒载体中的步骤；
2)使干细胞与所述1)中重组有基因的腺病毒载体接触，从而将HEX基因导入到细胞内的步骤；
3)对导入有基因的干细胞进行培养的步骤。
2.如权利要求1所述的由干细胞向肝细胞的分化诱导方法，其中，在所述1)～3)记载的步骤之前，包括以下步骤：
a)将SOX17基因重组到腺病毒载体中的步骤；
b)使干细胞与所述a)中重组有基因的腺病毒载体接触，从而将SOX17基因导入到细胞内的步骤；
c)对导入有基因的干细胞进行培养的步骤。
3.如权利要求1所述的分化诱导方法，在如权利要求1所述的由干细胞向肝细胞的分化诱导方法中，在所述3)的对导入有HEX基因的干细胞进行培养的步骤之后，包括以下步骤：
使培养的细胞与重组有HNF4A基因的腺病毒载体接触，从而进一步将HNF4A基因导入到细胞内的步骤。
4.如权利要求1所述的分化诱导方法，其中，包括用体液性分化诱导因子对干细胞进行处理的步骤。
5.如权利要求1所述的分化诱导方法，其中，干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
6.如权利要求5所述的分化诱导方法，其中，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞为人的诱导性多能干细胞。
7.一种干细胞，其中，通过权利要求1～6中任一项所述的分化诱导方法导入了基因。
CN201080057923.0A 2009-10-28 2010-10-22 由干细胞向肝细胞的分化诱导方法 Expired - Fee Related CN102666853B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009247342 2009-10-28
JP2009-247342 2009-10-28
JP2010-121282 2010-05-27
JP2010121282 2010-05-27
JP2010-154225 2010-07-06
JP2010154225 2010-07-06
PCT/JP2010/068703 WO2011052504A1 (ja) 2009-10-28 2010-10-22 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102666853A CN102666853A (zh) 2012-09-12
CN102666853B true CN102666853B (zh) 2014-12-03

Family

ID=43921926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080057923.0A Expired - Fee Related CN102666853B (zh) 2009-10-28 2010-10-22 由干细胞向肝细胞的分化诱导方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20120231490A1 (zh)
EP (1) EP2495320B1 (zh)
JP (1) JP5745423B2 (zh)
CN (1) CN102666853B (zh)
WO (1) WO2011052504A1 (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2011102532A1 (ja) * 2010-02-16 2013-06-17 国立大学法人九州大学 誘導肝細胞
JP5968871B2 (ja) 2010-04-13 2016-08-10 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド フォワードプログラミングによる肝細胞の産生
JP6148429B2 (ja) * 2011-01-31 2017-06-14 協和発酵バイオ株式会社 ヒト多能性幹細胞の培養方法
JP5970245B2 (ja) * 2012-06-06 2016-08-17 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法
CN103981147B (zh) * 2013-02-08 2017-11-10 中国科学院上海生命科学研究院 一种新的制备肝实质细胞的方法
CN105189738A (zh) 2013-04-08 2015-12-23 国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所 肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物
CN104830906B (zh) * 2014-02-12 2018-09-04 北京维通达生物技术有限公司 一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法
LT3059307T (lt) * 2015-02-20 2019-01-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Laminino panaudojimas pliuripotentinių ląstelių diferenciacijai į hepatocitų linijos ląsteles
JP6773268B2 (ja) * 2015-03-09 2020-10-21 学校法人慶應義塾 多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化する方法
WO2016147975A1 (ja) * 2015-03-13 2016-09-22 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 小腸上皮様細胞
CA2982568A1 (en) * 2015-04-14 2016-10-20 Kyoto University Method for producing stem cell clone suitable for inducing differentiation into somatic cells
JP6792857B2 (ja) * 2016-01-29 2020-12-02 国立大学法人千葉大学 肝細胞系譜細胞を取得するための方法および物質
KR102586507B1 (ko) * 2016-11-16 2023-10-11 알렐 바이오테크놀로지 앤 파마슈티칼스, 인크. Ｒｎａ를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 간세포의 유도
EP3583201B1 (en) * 2017-02-14 2024-01-17 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue
WO2018227016A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Wild Type, Inc. Ex vivo meat production
WO2019082874A1 (ja) * 2017-10-23 2019-05-02 国立大学法人九州大学 ダイレクトリプログラミングによる肝幹細胞又は肝前駆細胞の製造方法
AU2021235252A1 (en) 2020-03-11 2022-10-06 Bit Bio Limited Method of generating hepatic cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7473555B2 (en) * 2000-04-27 2009-01-06 Geron Corporation Protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
JP3635462B2 (ja) 2000-05-31 2005-04-06 国立医薬品食品衛生研究所長 アデノウイルスベクター
JP2003250566A (ja) 2002-03-01 2003-09-09 Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho アデノウイルスベクター
JP2008136381A (ja) 2006-11-30 2008-06-19 Japan Health Science Foundation 改変型アデノウイルスベクター及びその作製方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI JUN等.Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Functional Hepatic Cells.《HEPATOLOGY》.2007,第45卷第1229-1239页. *
Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Functional Hepatic Cells;CAI JUN等;《HEPATOLOGY》;20070531;第45卷;第1229-1239页 *
Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells;Song Zhihua等;《Cell Research》;20090908;第19卷;第1234页图1A *
Kubo A等.The homeobox gene HEX regulates proliferation and differentiation of hemangioblasts and endothelial cells during ES cell differentiation.《BLOOD》.2005,第105卷第4590-4597页. *
Shimoda M等.Sox17 plays a substantial role in late-stage differentiation of the extraembryonic endoderm in vitro.《Journal of Cell Science》.2007,第120卷(第21期),第3862页右栏第4段. *
Song Zhihua等.Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.《Cell Research》.2009,第19卷第1234页图1A. *
Sox17 plays a substantial role in late-stage differentiation of the extraembryonic endoderm in vitro;Shimoda M等;《Journal of Cell Science》;20071016;第120卷(第21期);第3862页右栏第4段 *
The homeobox gene HEX regulates proliferation and differentiation of hemangioblasts and endothelial cells during ES cell differentiation;Kubo A等;《BLOOD》;20050222;第105卷;第4590-4597页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102666853A (zh) 2012-09-12
EP2495320A1 (en) 2012-09-05
US20120231490A1 (en) 2012-09-13
EP2495320A4 (en) 2013-07-24
EP2495320B1 (en) 2019-02-27
JPWO2011052504A1 (ja) 2013-03-21
US20170009203A1 (en) 2017-01-12
WO2011052504A1 (ja) 2011-05-05
JP5745423B2 (ja) 2015-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102666853B (zh) 由干细胞向肝细胞的分化诱导方法
Ali et al. The effect of Young’s modulus on the neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells
Luo et al. Three-dimensional hydrogel culture conditions promote the differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocytes
US20130336933A9 (en) 3-dimensional scaffolds for improved differentiation of pluripotent stem cells to hepatocytes
US20120329152A1 (en) Induction, propagation and isolation of liver progenitor cells
JP5970245B2 (ja) 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法
Meng et al. The differentiation and isolation of mouse embryonic stem cells toward hepatocytes using galactose-carrying substrata
JP6421335B2 (ja) 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物
Fukusumi et al. Feeder-free generation and long-term culture of human induced pluripotent stem cells using pericellular matrix of decidua derived mesenchymal cells
Yan et al. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films
Knöspel et al. Periodic harvesting of embryonic stem cells from a hollow‐fiber membrane based four‐compartment bioreactor
WO2020030821A1 (en) Biliary organoids
JP6486619B2 (ja) 薬物評価用細胞及び薬物評価方法
Huang et al. Culture Conditions for Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Schwann Cells: A Two-Centre Study
Lee et al. Clump-passaging-based efficient 3D culture of human pluripotent stem cells under chemically defined conditions
Elham et al. The roles of the co-culture of mEScs with pancreatic islets and liver stromal cells in the differentiation of definitive endoderm cells
Liu et al. Characterization of the iPSC-derived conditioned medium that promotes the growth of bovine corneal endothelial cells
Kidwai et al. Differentiation of epidermal keratinocytes from human embryonic stem cells
Bosch et al. A new alternative for corneal endothelial regeneration using autologous dental pulp stem cells
Gu et al. A uterus-inspired 3D niche drives embryo development beyond implantation
Karsari et al. MULTIPOTENCY OF RABBIT (ORYCTOLAGUS CUNICULUS) SKIN-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS (SMSCs) INDUCED TO ADIPOGENIC PROGENITORS IN VITRO.
Zhu et al. Induce pluripotency via specific distal enhancer-promoter associations
Pettinato et al. Human embryoid bodies to hepatocyte-like clusters: Preparing for translation
EP4198121A1 (en) A method for obtaining a neuromuscular organoid and use thereof
Tsukamoto et al. A passage-free, simplified, and scalable novel method for iPSC generation in three-dimensional culture

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141203

Termination date: 20191022

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee