CN112481209A - iPS细胞定向分化为NK细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，包括：在第一、第二、第三培养皿中用第一培养基培养OP9‑DL1细胞；将iPS细胞用第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y‑27632，加入第一培养皿，共同培养OP9‑DL1细胞和iPS细胞；收集共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，将培养液和消化后的细胞悬液共同离心，用第二培养基重悬细胞沉淀后，将细胞悬液转移到第二培养皿中培养；进一步收集共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，将培养液和消化后的细胞悬液共同离心，用第二培养基重悬细胞沉淀后，将细胞悬液转移到含有OP9‑DL1细胞的第三培养皿中培养。本发明的方法可以提高iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的分化效率，高效地获取大量的NK细胞。

Description

iPS细胞定向分化为NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞)是一种大颗粒的固有免疫细胞，是淋巴细胞中被发现较晚的独特细胞群体，可直接识别和杀伤病毒感染的以及癌变的细胞，在过继转输治疗应用中有很大的前景。随着细胞免疫治疗的兴起，NK细胞越来越为人们所重视。然而，足够的NK细胞数量及强大的杀伤功能是目前NK细胞应用的限制因素。由于人体自身NK细胞数量有限，而且在NK细胞不同发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型和功能都存在很大的差异，这些都严重限制了NK细胞在临床上大规模运用。因此，从原代NK细胞扩增或由干细胞分化扩增获得足够数量的杀伤性较强的NK细胞是促进NK细胞临床应用及提高治疗疗效的前提。
在适宜的条件下，干细胞可以在体内和体外分化为NK细胞。在NK细胞的发育过程中，干细胞首先可以发育为共同淋巴细胞前体(CLPs)和共同髓系细胞前体(CMPs)；随后，CLPs进一步引起T、B以及NK细胞前体(NKP)的产生，NKP可以进一步特异性地生成NK细胞。
干细胞可以分化为多种不同的细胞类型，其分化方向受到多种外部信号的影响，外部信号通过促进特定的分化通路影响相应细胞的分化。因此，通过外部信号促进其向CLPs方向分化，才能获得更多的NK细胞。
诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)可以在适当条件下,在体外分化成含各个胚层来源的拟胚体(embryoid body,EB),并进一步分化为治疗相关的功能细胞,如胰岛素分泌细胞、造血细胞、神经细胞等。由于iPS细胞直接由患者的体细胞重编程而来,所以在进行细胞移植的时候不存在免疫排斥,且不用考虑细胞来源的伦理问题，因此,具有广阔的临床应用前景。
iPS细胞的出现解决了ES细胞伦理问题的困扰,其应用价值令人期待,但在应用于人体细胞移植或药物研究领域还面临很多问题有待解决。例如，iPS细胞的再分化机制还不明确,人类仍不能按照自己的意愿将其定向分化为所需的细胞。因此,需要进一步深入研究iPS细胞定向分化的分机理和提高iPS细胞的分化效率,高效地获得所需的功能性细胞；如何确保分化后的功能细胞移植后能稳定地发挥功效。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的局限，提供一种由iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，提高NK细胞的分化效率，高效地获取大量的NK细胞。
本发明的技术方案如下：
(1)在第一培养皿、第二培养皿、第三培养皿中用第一培养基培养OP9-DL1细胞；
(2)将iPS细胞用新鲜的第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y-27632，吸掉第一培养皿中的第一培养基，加入细胞悬液，共同培养OP9-DL1细胞和iPS细胞；
(3)收集步骤(2)中共同培养后的培养液，且对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第二培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第二培养皿中培养；
第二培养基为含有以下组分的αMEM培养基:
20Vol％FBS(胎牛血清)；
1Vol％P/S(青霉素和链霉素)；
10ng/mL SCF(干细胞因子，STem Cell Factor)；
5ng/mL FLT3L(Fms-like tyrosine kinase,FMS样的酪氨酸激酶3)；
5ng/mL IL-7(白细胞介素-7)；
10ng/mL IL-15(白细胞介素-15)；
(4)收集步骤(3)中共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第三培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第三培养皿中培养。
OP9细胞是小鼠骨髓的基质细胞，用Notch配体分子DL1(Delta-like 1)的逆转录病毒表达载体转染OP9细胞，得到稳定表达DL1分子的OP9-DL1细胞。DL1分子在OP9基质细胞表面的过表达可以提供了NK细胞定向分化所需的Notch信号，可高效诱导NK细胞的体外生成。OP9-DL1细胞可使与其共培养的iPS细胞发生大量扩增(1 000～4 000倍)，并按正常的发育程序分化为功能完全成熟的NK细胞。本发明经过多次将iPS细胞与OP9-DL1细胞共培养，且加入不同的外部信号诱导因子，使得iPS细胞分化为NK细胞的效率大大地提高。
iPS是贴壁生长的，但是在诱导成NK细胞之后是悬浮的，在中间过程可能有一些悬浮，有一些还贴壁。所以，除了收集共同培养的培养液，同时也要把贴壁的iPS细胞消化下来。这个消化过程没办法保证只消化iPS细胞，需要在消化下来之后，用第一培养基重悬放培养皿静置40min，让OP9-DL1细胞贴壁；短时间内iPS细胞不容易贴壁，从而分离。
作为上述技术方案的进一步改进，其中所述步骤(4)重复2～3次。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(2)中共同培养时间为7～10天，中途更换1～2次培养液。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(3)中培养时间为12～16天，每3～4天更换培养液。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(4)中培养时间为12～16天，每3～4天更换培养液。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(3)和步骤(4)中均采用IV型胶原酶进行消化，且离心条件为300rcf，5min。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(1)中第一培养皿、第二培养皿和第三培养皿均加入0.1％的明胶进行预处理，OP9-DL1细胞生长在明胶上。
作为上述技术方案的进一步改进，步骤(1)中第一培养基为含有为以下组分的αMEM培养基:
20Vol％FBS；
1Vol％P/S。
另一方面，本发明还提供了一种采用上述方法制备的NK细胞。
另一方面，本发明还提供了上述NK细胞在制备用于治疗病毒感染和/或癌症的药物/生物制品中的应用。
本发明的方法简单高效，安全性高，利用本发明方法，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的NK细胞，且让iPS细胞向NK细胞分化的比例明显提高。同时，本发明的方法可以大规模生产高品质的NK细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于NK细胞相关的科学研究，相关疾病的细胞治疗，细胞移植以及药物筛选的应用需求。
附图说明
图1为未分化的iPS细胞的显微镜图片。
图2为iPS细胞定向诱导分化而成的NK细胞。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
在本发明中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的iPS细胞获得特化细胞(例如NK细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。
本文使用的术语“约"，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％，9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内。
本发明培养基的配置按照各组分的比例采用常规的方法配置即可。
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例通过iPS细胞与OP9-DL1细胞进行多次共培养，更换培养液且加入外部诱导分化因子，将iPS定向分化成NK细胞。
第一阶段：OP9-DL1细胞的培养
(1)准备0.1％明胶涂层6孔板：加入0.1％明胶(2ml/孔)到6孔板，将培养板转移进培养箱中静置处理1h待用。
(2)OP9-DL1细胞接种：取出OP9-DL1细胞的T75培养瓶，弃掉旧培养基后加入3mlDPBS清洗一次；加入2ml胰酶EDTA后将培养瓶放置于培养箱中静置2min后，取出，加入2ml第一培养基终止消化，并将贴壁细胞吹打下来，将细胞悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心3min后，弃上清。用3ml第一培养基重悬细胞，并取10μl进行计数。将OP9-DL1细胞按20万/孔的密度接种到明胶涂层的6孔板上，再补第一培养基至总溶液量为2ml/孔。剩余的OP9-DL1细胞传代至T25培养瓶继续培养。3天后，用第一培养基半换液。
因为后续需要将iPS细胞与OP9-DL1细胞进行多次共培养，所以OP9-DL1细胞需要准备多批。
第二阶段：iPS细胞接种，与OP9-DL1细胞共培养
OP9-DL1细胞接种7天后(第8天)，处理iPS细胞(未分化的Ips细胞如图1所示)：取出iPS细胞的T25培养瓶，弃掉旧培养基后加入3ml DPBS清洗两次；再加入3ml AccutaseTM消化液后，将培养瓶放置于培养箱中静置5min；等待消化的过程中，准备4个干净的15ml离心管，加入9ml DMEM/F12待用；消化结束后，将培养瓶取出，用移液枪将贴壁细胞吹打下并将细胞悬液转移至含9ml DMEM/F12的15ml离心管，混合均匀后，取10μl进行计数，计数200万细胞转移至另一个干净的15ml离心管，做好标记；将两个离心管于1000rpm离心5min后，弃上清。
用4ml第一培养基重悬含100万iPS细胞的离心管的细胞沉淀，再加入4μl Y-27632后，按2ml/孔加入含OP9-DL1细胞的六孔板(弃掉旧培养基之后再加入iPS细胞悬液)中(也就是第一批OP9-DL1细胞)，持续培养7天。
其中，在iPS细胞接种第2天(第9天)弃旧培养基，按2ml/孔重新加入第一培养基继续培养。iPS细胞接种4天后(第12天)用第一培养基半换液一次。
第三阶段：促进iPS细胞向NK细胞分化
(1)iPS细胞接种7天后(第15天)，取出接种了iPS细胞的6孔板，收集旧培养基，加入2ml DPBS/孔清洗2次，收集洗液，再加入2ml 1mg/mL的IV型胶原酶，转移进培养箱中静置处理3min；等待消化的过程中，准备1个干净的15ml离心管，加入4ml第一培养基，待用；消化完毕后，用1ml移液枪将贴壁细胞吹打下来并将细胞悬液转移进含4ml第一培养基的15ml离心管中(同一块6孔板的2个孔可以合并)，300rcf离心5min后，用5ml DPBS清洗一次，弃洗液。再加入2mlTrypLETMExpress(胰蛋白酶替代品)，将15ml离心管转移进培养箱中静置处理3min后，取出，加入2ml第一培养基终止消化。
(2)在300rcf条件下离心5min收集细胞。
(3)吸弃上清液，用5ml DPBS洗涤细胞沉淀两次，洗涤完离心条件都是300rcf，5min。
(4)用10mL第一培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至两个10cm培养皿中。
(5)将培养皿放置于培养箱中静置40min。
(6)用1ml移液枪小心收集非贴壁细胞(细胞悬液)进15ml离心管，而不要干扰附着的OP9-DL1细胞。
(7)将细胞悬液和第一步收集的旧培养液、洗液在300rcf条件下离心5min。
(8)用4ml第二培养基重悬细胞沉淀并将细胞悬液按2ml/孔转移到含OP9-DL1细胞的六孔板中(也就是第二批OP9-DL1细胞)(第二培养基：20％FBS，10ng/mLSCF，5ng/mLFLT3L，5ng/mL IL-7和10ng/mLIL-15的αMEM培养基)。
(9)每3-4天用第二培养基半换液一次(要注意不要弃掉悬浮细胞)。
(10)这一阶段持续时长为两周。
第四阶段：进一步促进iPS细胞向NK细胞分化
(1)第29天取出接种了iPS细胞的6孔板，收集旧培养基，加入2mlDPBS/孔清洗2次，洗液收集，再加入2ml 0.5mM EDTA后，转移进培养箱中静置处理5min。等待消化的过程中，准备2个干净的15ml离心管，加入6ml DMEM/F12，待用。消化完毕后，用1ml移液枪将贴壁细胞吹打下来并将细胞悬液转移进含6ml DMEM/F12的15ml离心管中。
(2)在300rcf条件下离心5min收集细胞。
(3)吸弃上清液，用5ml DPBS洗涤细胞沉淀两次，洗涤完离心条件都是300rcf，5min。
(4)用10mL/管第一培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液分别转移至两个10cm培养皿中。
(5)将培养皿放置于培养箱中静置40min。
(6)用1ml移液枪小心收集非贴壁细胞(细胞悬液)进15ml离心管，而不要干扰附着的OP9-DL1细胞(两皿可以合并)。
(7)将悬液和第一步收集的旧培养液、洗液在300rcf条件下离心5min。
(8)用4ml第二培养基重悬细胞沉淀并将细胞悬液按2ml/孔转移到含OP9-DL1细胞的六孔板中(也就是第三批OP9-DL1细胞)。
(9)每3-4天用第二培养基半换液一次(要注意不要弃掉悬浮细胞)。
(10)这一阶段持续时长为两周。
第五阶段：重复第四阶段，得到由iPS细胞定向诱导分化而成的NK细胞，如图2所示。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在第一培养皿、第二培养皿、第三培养皿中用第一培养基培养OP9-DL1细胞；
(2)将iPS细胞用新鲜的第一培养基重悬后，在细胞悬液加入1Vol‰的Y-27632，吸掉第一培养皿中的第一培养基，加入细胞悬液，共同培养OP9-DL1细胞和iPS细胞；
(3)收集步骤(2)中共同培养后的培养液，且对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第二培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第二培养皿中培养；
第二培养基为含有以下组分的αMEM培养基:
20Vol％FBS；
1Vol％P/S；
10ng/mL SCF；
5ng/mL FLT3L；
5ng/mL IL-7；
10ng/mL IL-15；
(4)收集步骤(3)中共同培养后的培养液，对共同培养的细胞进行消化，消化终止后进行离心、重悬和静置；将培养液和静置后的细胞悬液共同离心，收集细胞沉淀，用第二培养基重悬细胞沉淀后，吸掉第三培养皿中的第一培养基，将细胞悬液转移到含有OP9-DL1细胞的第三培养皿中培养。
2.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，其中所述步骤(4)重复2～3次。
3.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，步骤(2)中共同培养时间为7～10天，中途更换1～2次培养液。
4.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，步骤(3)中培养时间为12～16天，每3～4天更换培养液。
5.如权利要求2所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，步骤(4)中培养时间为12～16天，每3～4天更换培养液。
6.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，步骤(3)采用IV型胶原酶进行消化，步骤(4)中采用0.5mM EDTA进行消化，且离心条件为300rcf，5min。
7.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，步骤(1)中第一培养皿、第二培养皿和第三培养皿均加入0.1％的明胶进行预处理，OP9-DL1细胞生长在明胶上。
8.如权利要求1所述的iPS细胞定向诱导分化为NK细胞的方法，步骤(1)中第一培养基为含有为以下组分的αMEM培养基:
20Vol％FBS；
1Vol％P/S。
9.一种采用如权利要求1～8任一项所述的方法制备的NK细胞。
10.如权利要求9所述的NK细胞在制备用于治疗病毒感染和/或癌症的药物/生物制品中的应用。
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