JP2020517720A - ネガティブ選択により誘導されるｃｄ３４＋幹細胞を含む治療用製剤 - Google Patents

ネガティブ選択により誘導されるｃｄ３４＋幹細胞を含む治療用製剤 Download PDF

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Abstract

ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋幹細胞を含む治療用製剤を記載する。製剤内の細胞は、多くの治療目的のために遺伝子改変することができる。本開示は、脆弱な幹細胞又はＣＤ３４＋発現レベルが低い幹細胞を有する患者の治療に特に有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４９１，１１６号明細書及び２０１７年５月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５０３，８０１号明細書の優先権を主張するものであり、当該出願は両方とも、本明細書において完全に記載されたと同じように参照により組み込まれる。
配列表の参照
２０１８年４月２４日に作成されたファイルサイズ１７６ＫＢの「１７−０９８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルのコンピューター読み取り可能なテキストファイルには本出願の配列表が含まれており、このファイルは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋幹細胞を含む治療用製剤を提供する。製剤内の細胞は、多くの治療目的のために遺伝子改変することができる。本開示は、脆弱な幹細胞又はＣＤ３４＋発現レベルが低い幹細胞を有する患者の治療に、特に有用である。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、免疫系の白血球（例えば、ウイルスと戦うＴ細胞及び抗体産生Ｂ細胞）及び赤血球など、すべての血球系を生じ得る幹細胞である。ＨＳＣの治療的投与は、免疫不全疾患、血液疾患、悪性がん、感染症、放射線被曝（例えば、がん治療、事故又は攻撃に基づく放射線被曝）などのさまざまな有害な状態の治療に使用することができる。例として、８０以上の原発性免疫不全症が世界保健機関によって認定されている。これらの疾患は、免疫系の内因性欠陥によって特徴付けられ、場合によっては、身体は感染症に対する抗体を、まったく、又は十分に産生することができない。他の症例では、感染症と戦うための細胞防御が適切に機能できない。通常、原発性免疫不全は遺伝性障害である。
原発性免疫不全の一例は、ファンコーニ貧血（ＦＡ）である。ＦＡは、骨髄（ＢＭ）不全を引き起こす遺伝性血液障害である。部分的には、ＤＮＡ修復機構の不全として特徴付けられる。ＦＡ患者の少なくとも２０％は、急性骨髄性白血病、並びに皮膚、肝臓、消化管及び婦人科系のがんなどのがんを、発症する。皮膚及び胃腸の腫瘍は、通常、扁平上皮癌である。がんを発症する患者の平均年齢は、白血病では１５歳、肝臓腫瘍では１６歳、その他の腫瘍では２３歳である。
原発性免疫不全の別の例は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）である。ＳＣＩＤは、Ｔ細胞の欠如、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の欠如及び機能的Ｂ細胞の欠如により機能的免疫系の欠如をもたらす遺伝性疾患である。ＳＣＩＤは多くの場合、例えば、ＢＭ移植（ＢＭＴ）又は遺伝子治療によって免疫系が再構成されない限り、人生の最初の２年間で死に至る。
続発性又は後天性の免疫不全は、遺伝性の遺伝子異常の結果ではなく、免疫系が免疫系外の因子によって損なわれている個人に発症する。例としては、外傷、ウイルス、化学療法、毒素及び汚染が挙げられる。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる続発性免疫不全障害の例であり、Ｔリンパ球の枯渇により、身体が感染症と戦うことができなくなる。
臨床環境では、ＨＳＣは、ＨＳＣを含む生体試料（例えばＢＭ試料）を入手し、この試料を操作して、そこからＨＳＣを取得することにより得られる。ＨＳＣは、それらが細胞表面で発現する特定のタンパク質に基づいて、試料内で「同定」することができる。
生体試料からＨＳＣを取得するための現在のゴールドスタンダードは、細胞表面タンパク質のＣＤ３４に基づいている。例えば、ＣＤ３４に結合する抗体を使用することによって、ＣＤ３４を発現するＨＳＣをポジティブ選択することができる。いくつかの手順では、ＣＤ３４に結合する抗体は、抗体と結合したＣＤ３４＋ＨＳＣを試料の残部と磁気的に分離できるように、磁気要素を含む。他の手順では、抗体と結合したＣＤ３４＋ＨＳＣを、蛍光活性化セルソーターを使用して試料から分離できるように、抗体は、蛍光要素を含むことができる。他の手順では、ＣＤ３４結合抗体のコピーを固体マトリックス（プレートなど）に結合させ、試料を、ＣＤ３４＋ＨＳＣが抗体に「捕捉」されるように該固体マトリックス上を通過させることができる。この手順は「パニング」と呼ばれる。
生体試料からＣＤ３４＋ＨＳＣを取得するための上記の各手順では、ＣＤ３４＋ＨＳＣに対するポジティブ選択を使用する。つまり、ＨＳＣはＣＤ３４の存在（つまり、ＣＤ３４＋）に基づいて同定され、試料の残部と直接分離される。しかし残念ながら、そのような積極的な実験室操作は、細胞を損傷及び／又は殺す可能性がある。別の欠点は、細胞に結合した抗体が、磁気要素又は蛍光要素に結合しているかどうかにかかわらず、患者に再導入されたときに、治療用細胞に結合したままになることである。患者が機能的免疫系を有している場合、この免疫系は外来の磁気要素又は蛍光要素を攻撃し、意図しない炎症を患者に引き起こす。
これらの欠点に基づいて、とりわけ、ネガティブ選択を使用してＣＤ３４＋ＨＳＣを単離する別のアプローチが検討されている。ネガティブ選択では、試料からＣＤ３４＋ＨＳＣではない細胞を同定して、除去することが目的である。この様式では、目的の治療用細胞は直接操作されないので、実験室操作の悪影響は低減する。したがって、ＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択に取って代わる１つのアイデアが、他の細胞型を除去するネガティブ選択であった。
ＣＤ３４＋ＨＳＣの治療用集団を取得するためのネガティブ選択の使用に対する１つの障害は、出発生体試料中に存在する多様な量の細胞型である。各細胞型は、細胞表面でタンパク質の異なるアレイを発現し、細胞型ごとに１つの抗体を使用して、試料からＣＤ３４＋ＨＳＣ以外のすべての不要な細胞を除去することは不可能である。したがって、ネガティブ選択はＣＤ３４＋ＨＳＣの直接操作がより少ないという事実にもかかわらず、ポジティブ選択が臨床使用標準のままであった。
臨床においてＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択を使用し続けている間、このアプローチに対する追加の欠点が、特に治療される個々の疾患又は状態に関連して現れてきた。例えば、ＦＡの特徴は、ＢＭ不全をもたらすＣＤ３４＋ＨＳＣの加速的な低減である。ＦＡ患者のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞集団は比較的限られているため、十分な出発ＣＤ３４＋ＨＳＣを含む試料を取得することは困難である。出発数が少ないため、処理及び製剤化の際に試料中の既存のＣＤ３４＋ＨＳＣが損傷を受けないことがさらに重要となる。さらに、ＦＡ患者での作業において、本明細書でさらに説明する追加の欠点により、ＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択に代わるものが必要であることがさらに明らかとなった。
本開示は、ＣＤ３４＋ＨＳＣのネガティブ選択を達成するためのシステム及び方法を提供する。このシステム及び方法は、ＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択に以前から頼り続けた先行技術の多くの課題に対処する。また、特定の疾患状態におけるＣＤ３４＋ＨＳＣの収集での、これまで知られていなかった新しい課題にも対処する。例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の絶対数が少ないことに加えて、本開示は、ＦＡ患者における既存のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の多くは、発現するＣＤ３４が比較的少量であることを提示する。ＣＤ３４の発現レベルが低いということは、ＣＤ３４シグナルが弱いため、ポジティブ選択の際に同定される細胞が少なくなることを意味する。本開示は、たとえ得られたとしても、特定の治療目的に効果的に使用できるものは、主に大量のＣＤ３４を発現するＣＤ３４＋ＨＳＣであることを提供する。さらに、ＦＡ患者に由来し得る治療目的のＣＤ３４＋ＨＳＣの画分は非常に脆弱であり、ポジティブ選択の実験室処理により損傷を受けやすい。したがって、特定の患者集団中で最適なＣＤ３４＋レベルを発現するＨＳＣの数が非常に少ないこと、及びその脆弱性により、ポジティブ選択が課す実験室操作でこれらの既存の細胞を危険にさらさないことが非常に重要になる。
本明細書で開示されるシステム及び方法は、以下によってネガティブ選択から誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用製剤を実現する：（１）ＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用製剤の開発に問題のある細胞を生体試料から同定し、除去する工程；（２）これらの不要な細胞を試料から効率的に除去する細胞表面マーカーの選択された組み合わせを使用する工程、並びに（３）実験室環境においてＣＤ３４＋ＨＳＣの健康と維持を支援する細胞を維持する工程。
利点（１）、「ＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用製剤の開発に問題のある細胞を生体試料から同定し、除去する工程」に関しては、投与用のＣＤ３４＋ＨＳＣの製剤化と、その後の製剤化されたＨＳＣの患者への投与との両方に有害な細胞型が多く存在する。例えば、顆粒球は短命の細胞型である。これらの細胞は、試料の処理と製剤化に必要な期間中に死ぬことが多く、その内容物を治療用製剤中に放出する。その後、治療用製剤が患者に投与されると、顆粒球から放出された細胞内容物が患者の体内で炎症反応を引き起こす可能性がある。
Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、他の細胞に対して細胞毒性があるため、試料の処理及び製剤化の際に問題となる可能性がある。つまり、ＣＤ３４＋ＨＳＣを患者に投与する前に、それらの細胞が治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣなどの他の有益な細胞を殺す可能性がある。これは、開始時にＣＤ３４＋ＨＳＣの数が少ない、及び／又はそれらが脆弱である生体試料では特に問題となる。
他の細胞型は、対象への投与後に有害になるため、除去することが重要である。例えば、単球は抗原提示細胞である。それらが製剤中に保持され、患者に投与された場合、患者において望ましくない免疫応答及び炎症が引き起こされる。
利点（２）、「不要な細胞を試料から効率的に除去する細胞表面マーカーの選択された組み合わせを使用する工程」に関しては、生体試料内の各細胞型は、細胞表面で別々のタンパク質のアレイを発現し、細胞型ごとに１つの抗体又は結合タンパク質を使用して試料からすべての不要な細胞を除去することは、不可能である。本開示は、細胞を効率的に標的化及び除去して、ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用製剤を取得するために使用できるマーカーの組み合わせを提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られたＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られたＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用集団を取得する。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、標的となる不要な細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の除去をもたらす。
利点（３）「実験室環境においてＣＤ３４＋ＨＳＣの健康と維持を支援する細胞を維持する工程」に関しては、不要な細胞を除去するマーカーの組み合わせは、ＣＤ３４＋ＨＳＣを含む治療用製剤内において他の細胞を保持する能力に基づいて選択された。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、処理中及び投与後のＣＤ３４＋ＨＳＣの健康と機能を促進する。したがって、特定の実施形態では、選択されたマーカーの組み合わせはＭＳＣを除去しない。
開示されたシステム及び方法は、ＣＤ３４＋ＨＳＣポジティブ選択に対する臨床的に実行可能な代替手段を提供し、ＦＡのための遺伝子治療の臨床試験などを悩ませてきた血液幹細胞及び前駆細胞の単離における障壁を克服する。初期の血液産物処理の際に利用可能なＣＤ３４＋ＨＳＣを保存するための開示されたアプローチは、ＦＡ、並びにＳＣＩＤ、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）及び先天性角化異常症などの直接ＣＤ３４選択が非効率的であることが証明されている他の疾患を含む特にＣＤ３４＋ＨＳＣの可用性が限られている状況で、自己幹細胞移植、遺伝子治療及び遺伝子編集を改善する。特定の実施形態では、ネガティブ選択の使用は、試料内の出発ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団の少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％を保存する。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＣはＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ−及びＣＤ９０＋ＨＳＣである。
特定の実施形態では、本開示は、ウイルスベクターを利用する遺伝子治療を利用する。
本明細書に提出された図面の多くは、色によりさらによく理解される。出願者は、図面のカラー版を提出物原本の一部とみなし、後の手続きで図面のカラー画像を提示する権利を保有する。
臨床試験ＮＣＴ０１３３１０１８に登録されたファンコーニ貧血Ａの遺伝的欠陥を有する３人の患者の臨床的特徴の図である。１人の成人患者と２人の小児患者は、ファンコーニ貧血Ａ（ＦＡ−Ａ）欠損症のためのレンチウイルス遺伝子治療で治療された。３人の患者は、治療前の末梢血中の好中球（ＡＮＣ）及び血小板の絶対数が着実に減少しており、骨髄細胞密度が３０％未満であることが示された。遺伝子配列決定によって行われたＦＡＮＣＡ遺伝子欠損の分子特性解析により、患者１はスプライシングバリアントに関してＦＡＮＣＡ遺伝子においてホモ接合性であることが示された。患者２については、ＦＡＮＣＡ遺伝子の多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＢＡ）により、エクソン６〜３１のホモ接合性の大きな欠失が特定された。患者３の配列決定解析は実施されなかった。＊骨片粒子を含まない調製物を含む評価可能な骨髄がなかった。 ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ造血細胞の減少を示す図である。ベースライン骨髄（（ＢＭ）患者１、２、３及び健康なドナー１、図２Ａ〜２Ｄ）又は動員白血球除去（患者３及び健康なドナー２、図２Ｅ〜２Ｆ）産物におけるＣＤ３４発現は、蛍光染色及びフローサイトメトリー分析によって決定した。ポジティブ細胞の画分は、非染色及びアイソタイプ染色対照試料に基づいて、２つのＣＤ３４発現レベルにゲートする：低発現、ＣＤ３４Ｌｏ又は高発現、ＣＤ３４Ｈｉ。ＣＤ３４Ｌｏ集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３５１２；平均の標準誤差（ＳＥＭ）＝６２７及びＣＤ３４Ｈｉ集団＝２００７０；ＳＥＭ＝５００８。 ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ造血細胞の減少を示す図である。ベースライン骨髄（（ＢＭ）患者１、２、３及び健康なドナー１、図２Ａ〜２Ｄ）又は動員白血球除去（患者３及び健康なドナー２、図２Ｅ〜２Ｆ）産物におけるＣＤ３４発現は、蛍光染色及びフローサイトメトリー分析によって決定した。ポジティブ細胞の画分は、非染色及びアイソタイプ染色対照試料に基づいて、２つのＣＤ３４発現レベルにゲートする：低発現、ＣＤ３４Ｌｏ又は高発現、ＣＤ３４Ｈｉ。ＣＤ３４Ｌｏ集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３５１２；平均の標準誤差（ＳＥＭ）＝６２７及びＣＤ３４Ｈｉ集団＝２００７０；ＳＥＭ＝５００８。 ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ造血細胞の減少を示す図である。ベースライン骨髄（（ＢＭ）患者１、２、３及び健康なドナー１、図２Ａ〜２Ｄ）又は動員白血球除去（患者３及び健康なドナー２、図２Ｅ〜２Ｆ）産物におけるＣＤ３４発現は、蛍光染色及びフローサイトメトリー分析によって決定した。ポジティブ細胞の画分は、非染色及びアイソタイプ染色対照試料に基づいて、２つのＣＤ３４発現レベルにゲートする：低発現、ＣＤ３４Ｌｏ又は高発現、ＣＤ３４Ｈｉ。ＣＤ３４Ｌｏ集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３５１２；平均の標準誤差（ＳＥＭ）＝６２７及びＣＤ３４Ｈｉ集団＝２００７０；ＳＥＭ＝５００８。 ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ造血細胞の減少を示す図である。ベースライン骨髄（（ＢＭ）患者１、２、３及び健康なドナー１、図２Ａ〜２Ｄ）又は動員白血球除去（患者３及び健康なドナー２、図２Ｅ〜２Ｆ）産物におけるＣＤ３４発現は、蛍光染色及びフローサイトメトリー分析によって決定した。ポジティブ細胞の画分は、非染色及びアイソタイプ染色対照試料に基づいて、２つのＣＤ３４発現レベルにゲートする：低発現、ＣＤ３４Ｌｏ又は高発現、ＣＤ３４Ｈｉ。ＣＤ３４Ｌｏ集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３５１２；平均の標準誤差（ＳＥＭ）＝６２７及びＣＤ３４Ｈｉ集団＝２００７０；ＳＥＭ＝５００８。 ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ造血細胞の減少を示す図である。ベースライン骨髄（（ＢＭ）患者１、２、３及び健康なドナー１、図２Ａ〜２Ｄ）又は動員白血球除去（患者３及び健康なドナー２、図２Ｅ〜２Ｆ）産物におけるＣＤ３４発現は、蛍光染色及びフローサイトメトリー分析によって決定した。ポジティブ細胞の画分は、非染色及びアイソタイプ染色対照試料に基づいて、２つのＣＤ３４発現レベルにゲートする：低発現、ＣＤ３４Ｌｏ又は高発現、ＣＤ３４Ｈｉ。ＣＤ３４Ｌｏ集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３５１２；平均の標準誤差（ＳＥＭ）＝６２７及びＣＤ３４Ｈｉ集団＝２００７０；ＳＥＭ＝５００８。 ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ造血細胞の減少を示す図である。ベースライン骨髄（（ＢＭ）患者１、２、３及び健康なドナー１、図２Ａ〜２Ｄ）又は動員白血球除去（患者３及び健康なドナー２、図２Ｅ〜２Ｆ）産物におけるＣＤ３４発現は、蛍光染色及びフローサイトメトリー分析によって決定した。ポジティブ細胞の画分は、非染色及びアイソタイプ染色対照試料に基づいて、２つのＣＤ３４発現レベルにゲートする：低発現、ＣＤ３４Ｌｏ又は高発現、ＣＤ３４Ｈｉ。ＣＤ３４Ｌｏ集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３５１２；平均の標準誤差（ＳＥＭ）＝６２７及びＣＤ３４Ｈｉ集団＝２００７０；ＳＥＭ＝５００８。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再増殖能がＣＤ３４Ｈｉ造血細胞のみに限定されていることを示す図である。ＦＡ−Ａ患者３（図３Ａ）及び健康なドナー（図３Ｂ）からの動員白血球除去物を、抗ＣＤ３４抗体で蛍光染色して、ＣＤ３４Ｈｉ及び低ＣＤ３４Ｌｏ細胞について選別精製した。１，５００個のＣＤ３４発現細胞に相当する全有核細胞（ＴＮＣ）を、並行コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイにおいて播種した。アッセイで播種されたＣＤ３４＋細胞がコロニーを生じた割合は、ＣＦＣの％として表した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再増殖能がＣＤ３４Ｈｉ造血細胞のみに限定されていることを示す図である。ＦＡ−Ａ患者３（図３Ａ）及び健康なドナー（図３Ｂ）からの動員白血球除去物を、抗ＣＤ３４抗体で蛍光染色して、ＣＤ３４Ｈｉ及び低ＣＤ３４Ｌｏ細胞について選別精製した。１，５００個のＣＤ３４発現細胞に相当する全有核細胞（ＴＮＣ）を、並行コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイにおいて播種した。アッセイで播種されたＣＤ３４＋細胞がコロニーを生じた割合は、ＣＦＣの％として表した。 自己造血ＦＡ−Ａ ＨＳＰＣの単離及びＬＶ形質導入についての図である。 形質導入についての図である。注入産物の生存率は、トリパンブルー色素排除染色によって決定した。形質導入後のバルク形質導入集団におけるベクターコピー数（ＶＣＮ）は、参照標準曲線に対する定量的ＰＣＲ法により決定した。注入産物のコロニー形成率は、注入されたＣＤ３４＋細胞のコロニー形成能力を有する割合として決定した。ＦＡＮＣＡ遺伝子欠損の機能的修正は、さまざまな濃度のマイトマイシンＣのストレス下でのコロニー形成率を計算することにより決定した。ＣＦＣにおける遺伝子導入は、個々のコロニーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析により、レンチウイルス骨格の存在についてポジティブと分析されたコロニーの割合として決定した。 直接ＣＤ３４濃縮対系列＋細胞の枯渇を表す図である。産物にはＢＭ又はｍＡＰＨを含めることができる（工程１）。ＢＭ産物を、赤血球（ＲＢＣ）を枯渇させるためにヘタスターチ沈降によって最初に処理した。白血球除去産物は、血小板を枯渇させるために最初に数回洗浄した。ＣＤ３４＋細胞の直接選択には、抗ＣＤ３４抗体結合免疫磁気ビーズ（マイクロビーズ）を使用し、一方、系列枯渇には抗ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋のマイクロビーズを使用した（工程２）。どちらの場合も、マイクロビーズ結合細胞はカラムに保持され、洗浄工程に供された。系列枯渇が使用される場合、ＣＤ３４発現細胞は精製中に受ける操作は最小限である。精製後、細胞を培養して、５−１０ ＩＵ／細胞のＭＯＩでＶＳＶＧ偽型ＬＶを形質導入する（工程３）。１６時間のインキュベーション後、細胞を回収した（工程４）。＊これらの方法は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ製のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）デバイスで実行した。 系列枯渇の際のＢＭ及びｍＡＰＨ試料のフローサイトメトリー分析及びゲーティング戦略を示す図である。ＢＭ（図７Ａ）及びｍＡＰＨ（図７Ｂ）の両方に関する、初期、系列枯渇及び系列濃縮産物から収集された細胞試料の典型的なプロファイルである。各列の上の角括弧（［ ］）内に表されるサブセットは、それぞれのゲートの親集団を表す。すべての系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４）を、ＣＤ４５＋細胞集団内でゲーティングした。ＣＤ４５＋細胞集団を、前方及び側方散乱パラメーターを使用して同定された単一細胞集団内で順番にゲーティングした。 系列枯渇の際のＢＭ及びｍＡＰＨ試料のフローサイトメトリー分析及びゲーティング戦略を示す図である。ＢＭ（図７Ａ）及びｍＡＰＨ（図７Ｂ）の両方に関する、初期、系列枯渇及び系列濃縮産物から収集された細胞試料の典型的なプロファイルである。各列の上の角括弧（［ ］）内に表されるサブセットは、それぞれのゲートの親集団を表す。すべての系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４）を、ＣＤ４５＋細胞集団内でゲーティングした。ＣＤ４５＋細胞集団を、前方及び側方散乱パラメーターを使用して同定された単一細胞集団内で順番にゲーティングした。 系列枯渇及び形質導入されたＢＭ及びｍＡＰＨ産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着を示す図である。ＴＮＣ、ＣＤ３４＋細胞及び系列＋細胞の回収を図８Ａ及び８Ｂに示す。遺伝子導入効率を、図８Ｃ〜８Ｅに示す。標準的なＣＦＣアッセイにおける形質導入細胞のコロニー形成能は、コロニー形成率（ＴＮＣ）として定義される。播種されたＣＤ３４＋細胞の数に対して正規化されたコロニー形成能は、コロニー形成率（ＣＤ３４＋）として示される。個々のコロニーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析によりレンチウイルス骨格の存在についてポジティブと分析されたコロニーの割合は、形質導入効率として示される。バルク形質導入集団のベクターコピー数／細胞は、ＶＣＮとして示す。個々のＣＦＣの平均ＶＣＮ／細胞は、単一コロニーＶＣＮとして表す。データは、９種の健康なＢＭ産物と１０種の健康なｍＡＰＨ産物の平均を表す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 系列枯渇及び形質導入されたＢＭ及びｍＡＰＨ産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着を示す図である。ＴＮＣ、ＣＤ３４＋細胞及び系列＋細胞の回収を図８Ａ及び８Ｂに示す。遺伝子導入効率を、図８Ｃ〜８Ｅに示す。標準的なＣＦＣアッセイにおける形質導入細胞のコロニー形成能は、コロニー形成率（ＴＮＣ）として定義される。播種されたＣＤ３４＋細胞の数に対して正規化されたコロニー形成能は、コロニー形成率（ＣＤ３４＋）として示される。個々のコロニーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析によりレンチウイルス骨格の存在についてポジティブと分析されたコロニーの割合は、形質導入効率として示される。バルク形質導入集団のベクターコピー数／細胞は、ＶＣＮとして示す。個々のＣＦＣの平均ＶＣＮ／細胞は、単一コロニーＶＣＮとして表す。データは、９種の健康なＢＭ産物と１０種の健康なｍＡＰＨ産物の平均を表す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 系列枯渇及び形質導入されたＢＭ及びｍＡＰＨ産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着を示す図である。ＴＮＣ、ＣＤ３４＋細胞及び系列＋細胞の回収を図８Ａ及び８Ｂに示す。遺伝子導入効率を、図８Ｃ〜８Ｅに示す。標準的なＣＦＣアッセイにおける形質導入細胞のコロニー形成能は、コロニー形成率（ＴＮＣ）として定義される。播種されたＣＤ３４＋細胞の数に対して正規化されたコロニー形成能は、コロニー形成率（ＣＤ３４＋）として示される。個々のコロニーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析によりレンチウイルス骨格の存在についてポジティブと分析されたコロニーの割合は、形質導入効率として示される。バルク形質導入集団のベクターコピー数／細胞は、ＶＣＮとして示す。個々のＣＦＣの平均ＶＣＮ／細胞は、単一コロニーＶＣＮとして表す。データは、９種の健康なＢＭ産物と１０種の健康なｍＡＰＨ産物の平均を表す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 系列枯渇及び形質導入されたＢＭ及びｍＡＰＨ産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着を示す図である。ＴＮＣ、ＣＤ３４＋細胞及び系列＋細胞の回収を図８Ａ及び８Ｂに示す。遺伝子導入効率を、図８Ｃ〜８Ｅに示す。標準的なＣＦＣアッセイにおける形質導入細胞のコロニー形成能は、コロニー形成率（ＴＮＣ）として定義される。播種されたＣＤ３４＋細胞の数に対して正規化されたコロニー形成能は、コロニー形成率（ＣＤ３４＋）として示される。個々のコロニーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析によりレンチウイルス骨格の存在についてポジティブと分析されたコロニーの割合は、形質導入効率として示される。バルク形質導入集団のベクターコピー数／細胞は、ＶＣＮとして示す。個々のＣＦＣの平均ＶＣＮ／細胞は、単一コロニーＶＣＮとして表す。データは、９種の健康なＢＭ産物と１０種の健康なｍＡＰＨ産物の平均を表す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 系列枯渇及び形質導入されたＢＭ及びｍＡＰＨ産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着を示す図である。ＴＮＣ、ＣＤ３４＋細胞及び系列＋細胞の回収を図８Ａ及び８Ｂに示す。遺伝子導入効率を、図８Ｃ〜８Ｅに示す。標準的なＣＦＣアッセイにおける形質導入細胞のコロニー形成能は、コロニー形成率（ＴＮＣ）として定義される。播種されたＣＤ３４＋細胞の数に対して正規化されたコロニー形成能は、コロニー形成率（ＣＤ３４＋）として示される。個々のコロニーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析によりレンチウイルス骨格の存在についてポジティブと分析されたコロニーの割合は、形質導入効率として示される。バルク形質導入集団のベクターコピー数／細胞は、ＶＣＮとして示す。個々のＣＦＣの平均ＶＣＮ／細胞は、単一コロニーＶＣＮとして表す。データは、９種の健康なＢＭ産物と１０種の健康なｍＡＰＨ産物の平均を表す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 系列枯渇及び形質導入されたＢＭ及びｍＡＰＨ産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着を示す図である。ヒトＣＤ４５＋細胞の生着並びにＴ細胞（ＣＤ３＋）、単球（ＣＤ１４＋）及びＢ細胞（ＣＤ２０＋）への系列発生は、系列枯渇細胞産物の注入後２０週間にわたるフローサイトメトリーによって決定した。データはそれぞれ、６人のドナーｍＡＰＨによる３６匹のマウスと６人のドナーＢＭによる４２匹のマウスの典型である。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 コロニー形態の代表的な画像である。ＢＭ又はｍＡＰＨ産物由来の系列枯渇され、形質導入された細胞を標準ＣＦＣアッセイにおいて播種した。アッセイで生じた造血コロニーを４倍拡大、広視野で観察し、比較的大きな細胞外観とゆるい群叢を有するＣＦＵマクロファージ（Ｍ）コロニー（図９Ａ）、拡散した外観を有するＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＧＭ）（図９Ｂ）、ヘモグロビン産生（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｚａｔｉｏｎ）及び緊密な群叢を有するＣＦＵ−赤血球系（Ｅ）（図９Ｃ）、並びに混合外観及び部分的ヘモグロビン産生を有するＣＦＵ−顆粒球赤血球マクロファージ巨核球（ＧＥＭＭ）（図９Ｄ）として形態をスコア化した。 コロニー形態の代表的な画像である。ＢＭ又はｍＡＰＨ産物由来の系列枯渇され、形質導入された細胞を標準ＣＦＣアッセイにおいて播種した。アッセイで生じた造血コロニーを４倍拡大、広視野で観察し、比較的大きな細胞外観とゆるい群叢を有するＣＦＵマクロファージ（Ｍ）コロニー（図９Ａ）、拡散した外観を有するＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＧＭ）（図９Ｂ）、ヘモグロビン産生（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｚａｔｉｏｎ）及び緊密な群叢を有するＣＦＵ−赤血球系（Ｅ）（図９Ｃ）、並びに混合外観及び部分的ヘモグロビン産生を有するＣＦＵ−顆粒球赤血球マクロファージ巨核球（ＧＥＭＭ）（図９Ｄ）として形態をスコア化した。 コロニー形態の代表的な画像である。ＢＭ又はｍＡＰＨ産物由来の系列枯渇され、形質導入された細胞を標準ＣＦＣアッセイにおいて播種した。アッセイで生じた造血コロニーを４倍拡大、広視野で観察し、比較的大きな細胞外観とゆるい群叢を有するＣＦＵマクロファージ（Ｍ）コロニー（図９Ａ）、拡散した外観を有するＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＧＭ）（図９Ｂ）、ヘモグロビン産生（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｚａｔｉｏｎ）及び緊密な群叢を有するＣＦＵ−赤血球系（Ｅ）（図９Ｃ）、並びに混合外観及び部分的ヘモグロビン産生を有するＣＦＵ−顆粒球赤血球マクロファージ巨核球（ＧＥＭＭ）（図９Ｄ）として形態をスコア化した。 コロニー形態の代表的な画像である。ＢＭ又はｍＡＰＨ産物由来の系列枯渇され、形質導入された細胞を標準ＣＦＣアッセイにおいて播種した。アッセイで生じた造血コロニーを４倍拡大、広視野で観察し、比較的大きな細胞外観とゆるい群叢を有するＣＦＵマクロファージ（Ｍ）コロニー（図９Ａ）、拡散した外観を有するＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＧＭ）（図９Ｂ）、ヘモグロビン産生（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｚａｔｉｏｎ）及び緊密な群叢を有するＣＦＵ−赤血球系（Ｅ）（図９Ｃ）、並びに混合外観及び部分的ヘモグロビン産生を有するＣＦＵ−顆粒球赤血球マクロファージ巨核球（ＧＥＭＭ）（図９Ｄ）として形態をスコア化した。 系列枯渇細胞産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着レベルが、同じドナー由来のＣＤ３４濃縮細胞産物に匹敵することを示す図である。グラフは、枯渇又は濃縮後の各アームからの全有核細胞（ＴＮＣ）及びＣＤ３４＋細胞の回収率を示す。 系列枯渇細胞産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着レベルが、同じドナー由来のＣＤ３４濃縮細胞産物に匹敵することを示す図である。各アームで処理された１×１０８個の細胞に対して正規化されたＣＦＣの総数及び形質導入されたＣＦＣ数、並びに培養１０日後のバルク形質導入細胞のＶＣＮ数である。データは、２つの健康なドナーのＢＭ産物の代表である。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 系列枯渇細胞産物のＮＳＧマウスにおける多系列生着レベルが、同じドナー由来のＣＤ３４濃縮細胞産物に匹敵することを示す図である。ヒトＣＤ４５＋細胞の生着及びＴ細胞（ＣＤ３＋）、単球（ＣＤ１４＋）及びＢ細胞（ＣＤ２０＋）への系列発生を、注入後２６週間にわたるフローサイトメトリーにより決定した。データはそれぞれ、系列枯渇（Ｌｉｎ−）アームの９匹のマウス、及びＣＤ３４濃縮（ＣＤ３４＋）アームの６匹のマウスの代表である。 ＨＳＣ遺伝子治療前の３人のＦＡ−Ａ患者の血球数である。患者１（図１１Ａ）、患者２（図１１Ｂ）及び患者３（図１１Ｃ）のＨＳＣ遺伝子治療介入前の時間に対する好中球（黒丸）、血小板（灰色の丸）及びヘマトクリットパーセント（白四角）の末梢血球数を示す。 ＨＳＣ遺伝子治療前の３人のＦＡ−Ａ患者の血球数である。患者１（図１１Ａ）、患者２（図１１Ｂ）及び患者３（図１１Ｃ）のＨＳＣ遺伝子治療介入前の時間に対する好中球（黒丸）、血小板（灰色の丸）及びヘマトクリットパーセント（白四角）の末梢血球数を示す。 ＨＳＣ遺伝子治療前の３人のＦＡ−Ａ患者の血球数である。グラフは、患者１（図１１Ａ）、患者２（図１１Ｂ）及び患者３（図１１Ｃ）のＨＳＣ遺伝子治療介入前の時間に対する好中球（黒丸）、血小板（灰色の丸）及びヘマトクリットパーセント（白四角）の末梢血球数を示す。 ＦＡ−Ａ患者３の動員及び白血球除去療法プロトコルを示す図である。ＣＤ３４＋細胞の動員は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；１６μｇ／ｋｇ ＢＩＤ）とプレリキサフォル（２４０μｇ／ｋｇ）の組み合わせにより達成された。図１２Ａは、動員薬物レジメン及び動員の４日目からフローサイトメトリーにより毎日評価される末梢血ＣＤ３４＋細胞数の概要を示す。 ＦＡ−Ａ患者３の動員及び白血球除去療法プロトコルを示す図である。ＣＤ３４＋細胞の動員は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；１６μｇ／ｋｇ ＢＩＤ）とプレリキサフォル（２４０μｇ／ｋｇ）の組み合わせにより達成された。動員により毎日記録されたＡＮＣ、血小板及びヘモグロビンの末梢血数を図１２Ｂに示す。 ＦＡ−Ａ患者３の動員及び白血球除去療法プロトコルを示す図である。ＣＤ３４＋細胞の動員は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；１６μｇ／ｋｇ ＢＩＤ）とプレリキサフォル（２４０μｇ／ｋｇ）の組み合わせにより達成された。図１２Ｃは、再注入後の患者の血液学及び介入を示している。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。 本開示を確認する配列を示す図である。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、白血球及び赤血球などのすべての血球系を生じ得る幹細胞である。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、わずかにより分化の進んだ細胞型を反映しているが、本明細書のＨＳＣの説明の範囲内に含まれる。ＨＳＣの治療的投与は、免疫不全疾患、血液疾患、悪性がん、感染症、放射線被曝（例えば、がん治療、偶発的又は攻撃に基づく）などのさまざまな有害な状態の治療に使用することができる。例として、８０以上の原発性免疫不全症が、世界保健機関によって認定されている。これらの疾患は、免疫系の内因性欠陥によって特徴付けられ、場合によっては、身体は感染症に対する抗体をまったく、又は十分に産生することができない。他の症例では、感染症と戦うための細胞防御が適切に機能できない。通常、原発性免疫不全は遺伝性障害である。
原発性免疫不全の一例は、ファンコーニ貧血（ＦＡ）である。ＦＡは、骨髄（ＢＭ）不全を引き起こす遺伝性血液障害である。部分的には、ＤＮＡ修復機構の不全として特徴付けられる。ＦＡ患者の少なくとも２０％は、急性骨髄性白血病などのがん、皮膚、肝臓、消化管及び婦人科系のがんを発症する。皮膚及び胃腸の腫瘍は通常、扁平上皮癌である。がんを発症する患者の平均年齢は、白血病では１５歳、肝臓腫瘍では１６歳、その他の腫瘍では２３歳である。
原発性免疫不全の別の例は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）である。ＳＣＩＤは、Ｔ細胞の欠如、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の欠如及び機能的Ｂ細胞の欠如により機能的免疫系の欠如をもたらす遺伝性疾患である。ＳＣＩＤは多くの場合、例えば、ＢＭ移植（ＢＭＴ）又は遺伝子治療によって免疫系が再構成されない限り、人生の最初の２年間で死に至る。
続発性又は後天性の免疫不全は遺伝性の遺伝子異常の結果ではなく、免疫系が免疫系外の因子によって損なわれている個人に発症する。例としては、外傷、ウイルス、化学療法、毒素及び汚染が挙げられる。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる続発性免疫不全障害の例であり、Ｔリンパ球の枯渇により、身体が感染症と戦うことができなくなる。
臨床環境では、ＨＳＣは、ＨＳＣを含む生体試料（例えばＢＭ試料）を入手し、この試料を操作して、そこからＨＳＣを取得することにより得られる。ＨＳＣは、細胞表面で発現する特定のタンパク質に基づいて、試料内で「同定」することができる。
生体試料からＨＳＣを取得するための現在のゴールドスタンダードは、細胞表面タンパク質のＣＤ３４に基づいている。例えば、ＣＤ３４に結合する抗体を使用することによって、ＣＤ３４を発現するＨＳＣをポジティブ選択することができる。いくつかの手順では、抗体は、抗体と結合したＣＤ３４＋ＨＳＣを試料の残部から磁気的に分離できるように、磁気要素を含む。他の手順では、抗体は、抗体と結合したＣＤ３４＋ＨＳＣを蛍光活性化セルソーターを使用して試料から分離できるように、蛍光要素を含むことができる。他の手順では、ＣＤ３４結合抗体のコピーを固体マトリックス（プレートなど）に結合させ、試料を、ＣＤ３４＋ＨＳＣが抗体に「捕捉」されるように該固体マトリックス上を通過させることができる。この手順は「パニング」と呼ばれる。
上記の各手順では、ＣＤ３４＋ＨＳＣに対するポジティブ選択を使用する。つまり、ＨＳＣはＣＤ３４の存在（つまり、ＣＤ３４＋）に基づいて同定され、試料の残部から直接分離される。しかし残念ながら、そのような積極的な実験室操作は、細胞を損傷する及び／又は殺す可能性がある。別の欠点は、細胞に結合した抗体が、磁気要素又は蛍光要素に結合しているかどうかにかかわらず、患者に再導入されたときに治療用細胞に結合したままになることである。患者が機能的免疫系を有している場合、この免疫系は外来の磁気要素又は蛍光要素を攻撃し、意図しない炎症を患者に引き起こす。
これらの欠点に基づいて、とりわけ、ネガティブ選択を使用してＣＤ３４＋ＨＳＣを単離する別のアプローチが検討されている。ネガティブ選択では、試料からＣＤ３４＋ＨＳＣではない細胞を同定して、除去することが目的である。この様式では、目的の治療用細胞は直接操作されないので、実験室操作の悪影響が低減する。したがって、ＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択に取って代わる１つのアイデアが、他の細胞型を除去するネガティブ選択であった。
ＣＤ３４＋ＨＳＣの治療用集団を取得するためのネガティブ選択の使用に対する１つの障害は、出発生体試料中に存在する多様な量の細胞型である。各細胞型は、細胞表面でタンパク質の異なるアレイを発現し、細胞型ごとに１つの抗体を使用して、試料からＣＤ３４＋ＨＳＣ以外のすべての不要な細胞を除去することは不可能である。したがって、ネガティブ選択はＣＤ３４＋ＨＳＣの直接操作がより少ないという事実にもかかわらず、ポジティブ選択が臨床使用標準のままであった。
臨床においてＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択を使用し続けている間、このアプローチに対する追加の欠点が、特に治療される個々の疾患又は状態に関連して現れてきた。例えば、ＦＡの特徴は、ＢＭ不全をもたらすＣＤ３４＋ＨＳＣの加速的な低減である。ＦＡ患者のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞集団は比較的限られているため、十分な出発ＣＤ３４＋ＨＳＣを含む試料を取得することは困難である。出発数が少ないため、処理及び製剤化の際に試料中の既存のＣＤ３４＋ＨＳＣが損傷を受けないことがさらに重要となる。さらに、ＦＡ患者での作業において、本出願においてさらに説明する追加の欠点により、ＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択に代わるものが必要であることがさらに明らかとなった。
本開示は、ＣＤ３４＋ＨＳＣのネガティブ選択を達成するためのシステム及び方法を提供する。このシステム及び方法は、ＣＤ３４＋ＨＳＣのポジティブ選択に以前から頼り続けた先行技術の多くの課題に対処する。また、特定の疾患状態におけるＣＤ３４＋ＨＳＣの収集での、これまで知られていなかった新しい課題にも対処する。例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の絶対数が少ないことに加えて、本開示は、健康なドナーと比較して原発性免疫不全の患者におけるＣＤ３４Ｈｉ細胞とＣＤ３４Ｌｏ細胞との比率の改変、及びＣＤ３４Ｈｉ細胞のみでの排他的なｉｎ ｖｉｔｒｏ再増殖能を実証する。例えば、コロニー播種アッセイにより、ＣＤ３４Ｈｉ細胞のみがＦＡ及び健康なドナーの血液産物のｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー形成能に寄与することが実証され、これらの患者への遺伝子導入のためのｅｘ ｖｉｖｏ操作の際に可能な限り多くの利用可能なＣＤ３４＋細胞が保存される必要性を強調している。
重要なのは、総ＣＤ３４＋細胞数の減少がＦＡに限定されないことである。ヒドロキシ尿素で治療された鎌状赤血球症（ＳＣＤ）患者もＢＭ中のＣＤ３４＋細胞の頻度の減少を示し、血管閉塞の危険性が高まるため、利用可能なＣＤ３４＋細胞の動員は禁忌である。先天性角化異常症などの他の遺伝性ＢＭ不全症候群も、ＣＤ３４＋細胞の異常な頻度と挙動に関連している。多数の疾患標的が遺伝子治療研究に関連する可能性があり、追加の患者集団はＣＤ３４＋細胞の頻度の変動及び抗原発現を示すことがあり得る。
さらに、ＦＡ患者に由来し得る治療目的のＣＤ３４＋ＨＳＣの画分は非常に脆弱であり、ポジティブ選択の実験室処理により損傷を受けやすい。特定の実施形態では、脆弱なＣＤ３４＋細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでの培養及び操作中に、フリーラジカルによって誘発されるＤＮＡ損傷に対する感受性が高い。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、細胞を本明細書に記載の標準メチルセルロースアッセイにより測定した場合に２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満又はそれ以下のコロニー形成能を有する場合に脆弱である。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、細胞が本明細書に記載される標準メチルセルロースアッセイにより測定されるコロニー形成能を有さない場合、脆弱である。特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏでの培養及び操作によるＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択後に、得られたＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋細胞の総出発量のうちの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、又はそれ以下である場合、ＣＤ３４＋細胞は脆弱である。したがって、特定の患者集団中でこれらの細胞の数が非常に少ないこと、及びその脆弱性により、ポジティブ選択が課す実験室操作でこれらの既存の細胞を危険にさらさないことが非常に重要になる。
本明細書に記載の特定の実施形態は、生体試料からＣＤ３４＋細胞を間接的に濃縮する、臨床的に実行可能な手順を提供する。特定の実施形態では、この方法は、初期ＣＤ３４＋細胞画分の６０％以上を保持しながら、健康なドナー産物から系列＋細胞の９０％超を効率的に枯渇させ、全有核細胞を１〜２ｌｏｇ減少させ、遺伝子導入後の形質導入効率及び細胞生存率を維持する。形質導入系列細胞産物は免疫不全マウスモデルに生着し、同等のＣＤ３４＋細胞用量で移植した場合、同じドナー由来の精製ＣＤ３４＋細胞のものと同等であった。この新規な選択戦略は、ＦＡ−Ａ患者の遺伝子治療研究において規制当局によって承認されている（臨床プロトコル（ＮＣＴ０１３３１０１８））。
このシステム及び方法は、以下によってネガティブ選択から誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣの治療用製剤を実現する：（１）さまざまな理由で治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の開発に問題のある細胞を生体試料から同定し、除去する工程；（２）不要な細胞を試料から効率的に除去する細胞表面マーカーの選択された組み合わせを使用する工程、並びに（３）実験室環境においてＣＤ３４＋ＨＳＣの健康と維持を支援する細胞を維持する工程。
利点（１）「治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞の開発に問題のある細胞を生体試料から同定し、除去する工程」に関しては、投与用のＣＤ３４＋ＨＳＣの製剤化と、その後の製剤化されたＨＳＣの患者への投与との両方に有害な細胞型が多く存在する。例えば、顆粒球は短命の細胞型である。これらの細胞は、試料の処理と製剤化に必要な期間中に死ぬことが多く、その内容物を治療用製剤中に放出する。その後、治療用製剤が患者に投与されると、顆粒球から放出された細胞内容物が患者の体内で炎症反応を引き起こす可能性がある。
Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、他の細胞に対して細胞毒性があるため、試料の処理及び製剤化の際に問題となる可能性がある。つまり、ＣＤ３４＋ＨＳＣを患者に投与する前に、それらの細胞が治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣなどの他の有益な細胞を殺す可能性がある。これは、開始時にＣＤ３４＋ＨＳＣの数が少ない、及び／又はそれらが脆弱である生体試料では特に問題となる。
他の細胞は、対象への投与後に有害になるため、除去することが重要である。例えば、単球は抗原提示細胞である。それらが製剤中に保持され、患者に投与された場合、患者において望ましくない免疫応答及び炎症が引き起こされる。
特定の実施形態は、生体試料からＢ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、顆粒球及びＮＫ細胞（合せて不要な細胞）を枯渇させる工程を含む。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、不要な細胞の少なくとも７０％の減少、不要な細胞の少なくとも８０％の減少、又は不要な細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、「選択された不要な細胞」は、不要な細胞の特定のサブセットを指し得る。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１４＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１４＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１４＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１６＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１６＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１６＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋及びＣＤ１４＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋及びＣＤ１４＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋及びＣＤ１４＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１４＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１４＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１４＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１６＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。特定の実施形態では、ネガティブ選択は、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも７０％の減少、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも８０％の減少、又はＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％の減少をもたらす。
利点（２）、「不要な細胞を試料から効率的に除去する細胞表面マーカーの選択された組み合わせを使用する工程」に関しては、生体試料内の各細胞型は、細胞表面でタンパク質の異なるアレイを発現し、細胞型ごとに１つの抗体を使用して、試料からすべての不要な細胞を除去することは不可能である。本開示は、不要な細胞を効率的に標的化及び除去して、ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣの治療用製剤を取得するために使用できるマーカーの組み合わせを提供する。
特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ３を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１４を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１６を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１９を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１９のうちの１以上を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ１４及びＣＤ１９を発現する細胞を標的とし、試料から除去して、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。特定の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９を発現する細胞を標的にして試料から除去し、ネガティブ選択により得られた治療用ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団を取得する。
利点（３）「実験室環境においてＣＤ３４＋ＨＳＣの健康と維持を支援する細胞を維持する工程」に関しては、不要な細胞を除去するマーカーの組み合わせは、ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣの治療用製剤内において他の細胞を保持する能力に基づいて選択される。特定の実施形態では、特にＢＭ由来産物の場合、本明細書で開示されるシステム及び方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を枯渇させるマーカーを含まない。ＭＳＣは、処理中及び投与後のＣＤ３４＋ＨＳＣの健康と機能を促進することができる。したがって、特定の実施形態では、選択されたマーカーの組み合わせはＭＳＣを除去しない。
以下の項では、ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣの治療用製剤の製造を支援するための情報及び手順について記載する：（ｉ）ＨＳＣ源；（ｉｉ）末梢血（ＰＢ）の動員；（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団及びアクセサリー細胞を取得するためのネガティブ選択；（ｉｖ）ネガティブ選択されたＣＤ３４＋ＨＳＣ集団の遺伝子改変；（ｖ）細胞製剤；（ｖｉ）使用方法；（ｖｉｉ）対照集団から誘導された参照レベル；並びに（ｖｉｉｉ）キット。
（ｉ）ＨＳＣ源。特定の実施形態では、ＨＳＣ及びＨＳＰＣは、本明細書で互換的に使用される。特定の実施形態では、ＨＳＣはＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋ＨＳＣである。ＨＳＣ源としては、臍帯血、胎盤血、ＢＭ及びＰＢが挙げられる（ＵＳ５００４６８１、ＵＳ７３９９６３３及びＵＳ７１４７６２６を参照されたい）。ＨＳＣのさらなる供給源としては、胎児肝、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＨＳＣに分化可能な人工多能性幹細胞、大動脈−性腺−中腎由来細胞、並びに適切な年齢のドナーからのリンパ、肝臓、胸腺及び脾臓が挙げられる。血液及び組織試料の収集、抗凝固及び処理などに関する方法は、当技術分野において周知である。収集されたすべてのＨＳＣ供給源は、その時点で承認されている現在の基準に従って、不要な成分についてスクリーニングし、廃棄、処理又は使用することができる。
ＢＭが生体試料である場合、ＢＭは針穿刺吸引により後腸骨稜から取得することができる。特定の実施形態では、ネガティブ選択の前に、ＢＭ試料をＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）補填細胞培養培地で希釈して、２５％以下のヘマトクリット値を得ることができる。
（ｉｉ）末梢血（ＰＢ）の動員。ＢＭ採取を行うための外科的処置を避けるために、ＰＢからＨＳＣを採取するアプローチが開発されている。動員は、収集のためにＨＳＣがＢＭニッチからＰＢへと刺激される方法である。動員は、ＰＢ内でのＨＳＣの増殖の促進にもつながり得る。したがって、動員により、ＰＢ内のＨＳＣの頻度の増加、ＨＳＣ収集の目標値に達するためのアフェレーシスの日数の最小化、ドナーの不快感の最小化が可能になる。
特定の実施形態では、ＰＢ試料を取得する前に、患者は、指定数のＣＤ３４＋ＨＳＣがＰＢ中を循環していることが検出されるまで動員される。特定の実施形態では、指定数は８細胞／μＬ以上、９細胞／μＬ以上又は１０細胞／μＬ以上である。特定の実施形態では、患者は５、６又は７日間動員される。
特定の実施形態では、患者は６日間動員される。１〜６日目に、患者は顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム）を１６μｇ／ｋｇの用量で皮下投与される。４〜６日目に、患者はＣＸＣＲ４アンタゴニストのプレリキサフォル（ＡＭＤ３１００としても知られている）を２４０μｇ／ｋｇの用量で皮下投与される。
特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦを単一薬剤として投与し、次いでＡＭＤ３１００を同時投与することができる。特定の実施形態では、治療プロトコルには６日間の治療が含まれ、Ｇ−ＣＳＦを１日目、２日目、３日目及び４日目に投与することができ、５日目に、ＰＢ収集の６〜８時間前にＧ−ＣＳＦ及びＡＭＤ３１００が投与される。
特定の実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を単一薬剤として投与し、次いでＡＭＤ３１００を同時投与することができる。特定の実施形態では、治療プロトコルには５日間の治療が含まれ、ＧＭ−ＣＳＦを１日目、２日目、３日目及び４日目に投与することができ、５日目に、ＰＢ収集の６〜８時間前にＧＭ−ＣＳＦ及びＡＭＤ３１００が投与される。
ＰＢからのＨＳＰＣは、対象の静脈に挿入された注射器又はカテーテルを介して血液から収集することができる。例えば、ＰＢはアフェレーシス装置を使用して収集することができる。血液は静脈からカテーテルを通ってアフェレーシス装置に流れ込み、ＨＳＰＣを含む白血球を血液の残部から分離し、その後残りの血液を対象の体に戻す。アフェレーシスは、十分なＨＳＰＣが収集されるまで、数日間（例えば、１〜５日間）実行することができる。
特定の実施形態では、循環ＣＤ３４＋細胞が１０細胞／μＬ以上であるときに出発して、大量白血球除去療法が２日間にわたって実施される。初日、得られた試料は、自己血漿試料で２００×１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に希釈される。２日目に、得られた試料は最初の試料と一緒にプールされる。プールの前又は後に、試料を洗浄して血小板を除去する。特定の実施形態では、大量白血球除去療法は、ドナー又は患者の３〜６総血液量（ＴＢＶ）を処理することを指す。特定の実施形態では、大量白血球除去療法は、ドナー又は患者の３ＴＢＶ以上を処理することを指す。特定の実施形態では、大量白血球除去療法は、ドナー又は患者の４ＴＢＶ以上を処理することを指す。特定の実施形態では、大量白血球除去療法は、ドナー又は患者の５ＴＢＶ以上を処理することを指す。特定の実施形態では、大量白血球除去療法は、より大量の血液の処理、血流量の増加、ヘパリン抗凝固剤の追加及び／又は長期間の手順により、標準容量の白血球除去療法とは異なる。特定の実施形態では、本開示のシステム及び方法は、標準容量白血球除去療法を使用することができる。
本開示内で、動員は、対象のＰＢ内を循環するＨＳＣの数を増加させる、本明細書に記載の、又は当技術分野で公知の任意の（１以上の）薬剤で対象を処置することにより実施することができる。一般的に使用される動員剤としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＡＭＤ３１００が挙げられる。
Ｇ−ＣＳＦはサイトカインであり、ＨＳＰＣ動員におけるその機能としては、顆粒球拡大の促進、接着分子のプロテアーゼ依存性及び非依存性の減衰、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸の破壊が挙げられる。特定の実施形態では、任意の市販の形態のＧ−ＣＳＦを使用することができる（例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）及び／又はＮｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、カリフォルニア）。特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは配列番号１〜４のいずれかを含むことができる。特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦの有効量には０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇが含まれる。特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦの有効量には、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ又は２０μｇ／ｋｇ。が含まれる。特定の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦの有効量には１６μｇ／ｋｇが含まれる。
ＧＭ−ＣＳＦはコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても知られる単量体の糖タンパク質で、サイトカインとして機能し、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞及び線維芽細胞によって自然に分泌される。特定の実施形態では、任意の市販の形態のＧＭ−ＣＳＦを使用することができる（例えば、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ、Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）及びモルグラモスチム（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ））。特定の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦは配列番号５を含むことができる。投与するＧＭ−ＣＳＦの有効量には、例えば０．１〜５０μｇ／ｋｇ又は０．５〜３０μｇ／ｋｇの範囲の用量が含まれ得る。
ＡＭＤ３１００（プレリキサフォルとしても知られている；ＵＭＫ１２１、ＡＭＤ３０００、ＧＺ ３１６４５５、ＧＺ３１６４５５、ＪＭ３１００及びＳＤＺＳＩＤ７９１）は、ビシクラムクラスの合成有機分子である。これはケモカイン受容体拮抗薬で、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を可逆的に阻害し、ＨＳＰＣの動員を促進する。ＡＭＤ３１００は、骨髄腫及びリンパ腫患者のＨＳＰＣ動員のためにＧ−ＣＳＦと組み合わせて使用することが承認されている。ＡＭＤ３１００の構造は以下のとおりである：
Figure 2020517720
特定の実施形態では、ＡＭＤ３１００の有効量には０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが含まれる。特定の実施形態では、ＡＭＤ３１００の有効量には、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、又は３５０μｇ／ｋｇが含まれる。特定の実施形態では、ＡＭＤ３１００の有効量は２４０μｇ／ｋｇである。
幹細胞因子（ＳＣＦ；ＫＩＴリガンド、ＫＬ、ｃ−ｋｉｔリガンド、マスト細胞成長因子又はスチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）としても知られる）は、ｃ−ｋｉｔ受容体（ＣＤ１１７）に結合するサイトカインである。ＳＣＦは、膜貫通タンパク質及び可溶性タンパク質の両方として存在することができる。このサイトカインは、造血、精子形成及びメラニン形成に重要な役割を果たす。特定の実施形態では、任意の市販の形態のＳＣＦを使用することができる（例えば、Ａｎｃｅｓｔｉｍ、Ｓｔｅｍｇｅｎ（Ｒ）、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、カリフォルニア）。特定の実施形態では、ＳＣＦは配列番号６を含むことができる。投与するＳＣＦの有効量には、例えば０．１〜１００μｇ／ｋｇ又は０．５〜５０μｇ／ｋｇの範囲の用量が含まれ得る。
特定の実施形態では、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ３リガンド又はトロンボポエチン（ＴＰＯ）から選択される１以上のサイトカイン又は成長因子で対象を処置することによってＰＢを動員することができる。特定の実施形態では、１以上のケモカイン（例えば、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ１α））、ケモカイン受容体リガンド（例えば、ＧＲＯβ及び／又はＧＲＯβΔ４（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９７：１５３４−１５４２））及び／又はケモカイン受容体類似体（例えば、間質細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α））で対象を処置することによりＰＢを動員することができる。
特定の実施形態では、１以上の抗インテグリンシグナル伝達薬で対象を処置することによりＰＢを動員することができる。抗インテグリンシグナル伝達薬としては、抗超後期抗原４（ＶＬＡ−４）阻害剤又は抗体（例えば、ナタリズマブ（Ｚｏｈｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ １１１：３８９３−３８９５））；ＢＩＯ５１９２（Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４：１３４０−１３４３）；抗血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）；α４β１及びα４β７インテグリン阻害剤、α４β１／７（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ １２８：２４５７−２４６１）；ベドリズマブ（Ｒｏｓａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｄｒｕｇ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ３６：９１３−９２３）；及びＮ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７：１１００７）が挙げられる。
特定の実施形態では、シクロホスファミド、エトポシド、イホスファミド、シスプラチン、シタラビン及び／又はパクリタキセルなどの化学療法剤を動員因子として使用することができる。
特定の実施形態では、１以上の動員因子を皮下又は静脈内に投与することができる。特定の実施形態では、１以上の動員因子を、１日、連続２日、連続３日、連続４日、連続５日、連続６日又はそれ以上にわたって投与することができる。特定の実施形態では、１以上の動員因子を、指定数のＣＤ３４＋ＨＳＣがＰＢ中を循環するまで投与することができる。
ＰＢ動員に関する追加の情報及び選択肢については、Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｍｅｄ Ｈｅｍｏｔｈｅｒ ４４：１５１−１６４；Ｂｅｎｄａｌｌ ＆ Ｂｒａｄｓｔｏｃｋ（２０１４）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２５：３５５−３６７；Ｃｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０（１２）：４７７９−４７８８；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３９；Ｐｅｌｕｓ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５（４）：２８５−２９２；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１（７）：２２３１−２２３９；Ｔｒｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９３（１１）：１７３９−１７４２；Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７（２）：Ｓ２３−Ｓ２９）；ＷＯ２００３／０４３６５１；ＷＯ２００５／０１７１６０；ＷＯ２０１１／０６９３３６；ＵＳ５６３７３２３；ＵＳ７２８８５２１；ＵＳ９７８２４２９；ＵＳ２００２／０１４２４６２；及びＵＳ２０１０／０２２６８を参照されたい。
（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋ＨＳＣ集団及びアクセサリー細胞を取得するためのネガティブ選択。特定の実施形態では、ネガティブ選択を妨げる可能性のある汚染細胞集団を除去することが重要である。例えば、生体試料がＢＭである場合、ネガティブ選択の前に赤血球（ＲＢＣ）を除去することができる。ＲＢＣは、界面活性剤使用する溶解、ヘタスターチ、ヘタスターチ及び遠心分離、細胞洗浄、細胞洗浄及び密度勾配、フィコール・ハイパック、Ｓｅｐｘ、Ｏｐｔｉｐｒｅｓｓ、フィルター並びにＨＳＣ細胞の製造及び／又は研究及び治療目的の遺伝子治療の両方に使用されている他のプロトコルによって除去することができる。特定の実施形態は、ヘタスターチ沈降を利用してＲＢＣを枯渇させる。例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ−Ｓｃｉ−ＵＳＡ ９２（２２）：１０１１９−２２を参照されたい。特定の実施形態では、ヘタスターチ沈降は、１ｍＭ ＮＡＣを補填した０．９％ＮａＣｌ中６％のＨＥＳをヘマトクリット値が２５％以下の血液又は骨髄試料に加え、３０分以上沈降させる工程、及びＲＢＣ層を除去する工程を含み得る。特定の実施形態では、沈降は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）を用いて実施される。
動員されたＰＢが生体試料として使用される場合、血小板は、ネガティブ選択の前に、例えば血小板洗浄により除去することができる。特定の実施形態では、血小板洗浄は、血液試料のフィコール・パック密度勾配遠心分離から得られたバフィーコート（白血球及び血小板）に対して室温で低速回転（１２０ｇ〜４００ｇ）を実施する工程、血小板が豊富な上清を除去及び廃棄する工程、細胞ペレットを培養培地又は緩衝液（例えばＰＢＳ）などの新しい緩衝液に再懸濁する工程、並びにこれらの工程を少なくとも２回繰り返し、合計で３回以上洗浄する工程を含み得る。特定の実施形態では、血小板洗浄は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）を用いて実施される。特定の実施形態では、血小板洗浄は、最初のバフィーコート工程なしで白血球除去産物に対して行うことができる。特定の実施形態では、血小板洗浄は、白血球除去産物に対して室温で低速回転（１２０ｇ〜４００ｇ）を実施する工程、血小板が豊富な上清を除去及び廃棄する工程、細胞ペレットを培養培地又は緩衝液（例えばＰＢＳ）などの新しい緩衝液に再懸濁する工程、並びにこれらの工程を少なくとも２回繰り返し、合計で３回以上洗浄する工程を含み得る。
ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９に関しては、当業者によって理解されている。他の読者にとって、ＣＤ（表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ））抗原は、細胞の表面に発現されるタンパク質であり、特異的結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片）を介して検出可能である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＤ抗原をコードする配列及びＣＤ抗原の配列は、配列番号７〜３０であり得る。ＣＤ３４は、ＢＭ細胞の１〜４％に発現される高度にグリコシル化されたＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ４５ＲＡはフィブロネクチンＩＩＩ型に関連し、分子量２０５〜２２０ｋＤａを有し、Ｂ細胞、ナイーブＴ細胞及び単球上に発現される。ＣＤ３は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）とＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）との両方の活性化を助けるＴ細胞共受容体である。ＣＤ３には、成熟Ｔ細胞の表面に発現される、４つの異なる鎖を含むタンパク質複合体が含まれる。哺乳動物では、この複合体にはＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖が含まれる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖（ゼータ鎖）と結合して、Ｔ細胞で活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖及びＣＤ３分子が一緒になってＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ１４は先天性免疫系の成分であり、病原体関連分子パターンを認識する機能を果たし、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）及びＭＤ２（リンパ球抗原９６）の共受容体として作用して、リポ多糖（ＬＰＳ）及びリポテイコ酸などの細菌性リガンドと結合する。ＣＤ１４は、グリコシルホスファチジルイノシトールの尾部を介した膜固定型（ｍＣＤ１４）と、ｍＣＤ１４の脱落後に現れる（４８ｋＤａ）か、若しくは細胞内小胞から直接分泌される（５６ｋＤａ）可溶性型（ｓＣＤ１４）との２つの形態で存在する。ＣＤ１４は主にマクロファージによって発現され、その発現は好中球、樹状細胞、及び腸細胞（腸管吸収細胞）においても見出される。ＣＤ１６は、ＮＫ細胞、好中球多形核白血球、単球及びマクロファージの表面において見出されるＩＩＩ型Ｆｃγ膜受容体（ＦｃγＲＩＩＩ）である。ＣＤ１６はＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合でき、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与している。ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）とＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）との２つの形態で存在する。ＣＤ１９は膜貫通タンパク質であり、ヒトでは形質細胞を除くすべてのＢ系列細胞及び濾胞樹状細胞において発現される。ヒトＢ細胞では、ＣＤ１９はアダプタータンパク質として作用して細胞質シグナル伝達タンパク質を膜に動員することができ、ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体で機能してＢ細胞受容体シグナル伝達経路の閾値を下げることもできる。すべてのＢ細胞に存在するため、ＣＤ１９はＢ細胞発生のバイオマーカーである。
選択された各ＣＤマーカーに対する抗体は市販されており、当業者には公知である。例えば、ＣＤ４５ＲＡに対するヒト抗体としては、クローン５Ｈ９（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア）、クローンＪＳ−８３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、クローンＨＩ１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び抗ＣＤ４５ＲＡ［ＭＥＭ−５６］（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が挙げられる。ＣＤ３に対するヒト抗体としては、クローンＵＣＨＴ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア）、クローンＳＫ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）、クローンＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）及びクローンＣＤ３−１２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）が挙げられる。ＣＤ１４に対するヒト抗体としては、クローン６１Ｄ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ペンシルバニア）、クローンＨＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）、クローン６３Ｄ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）及びクローンＭ５Ｅ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）が挙げられる。ＣＤ１６に対するヒト抗体としては、クローン３Ｇ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア）、クローンＬＮＫ１６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）、クローンＤＪ１３０ｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）及びクローンＫＤ１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）が挙げられる。ＣＤ １９に対するヒト抗体としては、クローン４Ｇ７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）、クローンＨＩＢ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）、クローンＬＴ１９（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）及びクローンＦＭＣ６３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が挙げられる。実施例１に詳述されているように、さらなる実験作業のためのマウス抗体も利用可能である。
除去のために選択されたマーカーの組み合わせに応じて、選択された不要な細胞を、任意の適切な技術を使用して試料から除去することができる。適切な収集及び単離手順としては、磁気分離（例えば、抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用）；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）；フルオロフォア発現に基づくナノ選別；アフィニティークロマトグラフィー；モノクローナル抗体に結合した、又はモノクローナル抗体と組み合わせて使用される細胞傷害剤、例えば補体及び細胞毒；固体マトリックスに結合された結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片）による「パニング」；大豆などのレクチンを使用した選択的凝集；又はこれらの技術の組み合わせなどが挙げられる。
特定の実施形態では、生体試料を処理して、磁性粒子に直接又は間接的に結合したＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１９の１以上に対する適切な結合タンパク質を、磁気細胞分離器、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせて使用して、選択した不要な細胞を除去することができる。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍは、特異的モノクローナル抗体に結合した酸化鉄及びデキストランで構成されるナノサイズの超常磁性粒子を用いる。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒは、単回使用の使い捨てチューブセットを備えた密閉滅菌システムである。使い捨てセットは、単一の生体試料を処理して、選択された不要な細胞を除去するために使用し、その後廃棄することができる。
特定の実施形態では、細胞集団は、側方散乱チャネル（ＳＳＣ）輝度及び前方散乱チャネル（ＦＳＣ）輝度に基づく細胞の光散乱特性に基づいて除去することができる。側方散乱とは、フローサイトメトリーで測定された、直交方向（レーザー光源の方向から９０°）に散乱される光の量を指す。前方散乱は、光源の方向から概して９０°未満で散乱される光の量を指す。一般に、細胞の粒度が増加すると、側方散乱が増加し、細胞の直径が増加すると、前方散乱が増加する。
側方散乱と前方散乱は、光の強度として測定される。当業者は、側方散乱の量はユーザー定義の設定により差異を生じさせることが可能であることを認識している。特定の実施形態では、低（ｌｏ）側方散乱は、フローサイトメーターの側方散乱チャネルにおいて５０％未満の強度、４０％未満の強度、３０％未満の強度、又はさらに低い強度を指す。逆に、高（ｈｉ）側方散乱細胞は、低側方散乱ではない細胞の相反集団である。前方散乱は、側方散乱と同じ様式で定義されるが、光は前方散乱チャネルで収集される。したがって、特定の実施形態は、細胞表面マーカー（ＣＤマーカー）とこれらの細胞の関連する光散乱特性との正確な組み合わせに基づく細胞集団の除去を含む。
「ｈｉ」、「ｉｎｔ」、「ｌｏ」、「＋」及び「−」が、ネガティブ又は他の集団に対するシグナルの強度を指すことは、フローサイトメトリーの当業者によって理解されている。特定の実施形態では、ポジティブ発現（＋）は、マーカーがフローサイトメトリーを使用して細胞上で検出可能であることを意味する。特定の実施形態では、ネガティブ発現（−）は、マーカーがフローサイトメトリーを使用して検出できないことを意味する。特定の実施形態では、「ｈｉ」は、目的のマーカーのポジティブ発現が、（例えばＦＡＣＳを使用して）蛍光により測定した場合に他のポジティブな発現の細胞よりも明るいことを意味する。これらの実施形態では、当業者は、明るさが検出の閾値に基づいていることを認識している。一般的に、当業者はまずネガティブ対照チューブを分析し、ＦＳＣ及びＳＳＣによって目的の集団の周囲にゲート（ビットマップ）を設定し、光電子増倍管の電圧と所望の発光波長における蛍光の増加を、ネガティブ対照では、９７％の細胞が蛍光マーカーで染色されていないように見えるように調整する。これらのパラメーターが確立されると、染色細胞を検出及び／又は除去できる。特定の実施形態では、典型的なＦＡＣＳプロットの表示では、ｈｉは最も右端（ｘ線）又は最上部の最上線（右又は左上方）を意味し、ｌｏは左下象限内又は右象限と左象限の中間（ただし、ネガティブ集団に対してシフトしている）を意味する。特定の実施形態では、「ｈｉ」は、＋細胞と比較して検出可能な蛍光の増加が２０倍超の＋、３０倍超の＋、４０倍超の＋、５０超の＋、６０倍超の＋、７０倍超の＋、８０倍超の＋、９０倍超の＋、１００倍超の＋、又はそれ以上を指す。逆に、「ｌｏ」は、「ｈｉ」と定義された集団の相反集団を指す。
任意選択的に、選択された不要な細胞を除去する前に、生体試料のアリコートを、全有核細胞数及び／又はＣＤ３４＋含有量について確認することができる。特定の実施形態では、選択された不要な細胞の除去後、ＣＤ３４＋ＨＳＣが回収される。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＣはＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ９０＋ＨＳＣである。
ネガティブ選択により誘導されたＣＤ３４＋ＨＳＣ試料は、その後処理することができる。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＣの処理は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア）でコーティングされた培養フラスコにおいて、４μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン；１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦ；１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３リガンド；及び１ｍＭのＮＡＣを補填したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）培地中１×１０６細胞／ｍＬ及び２．９×１０５細胞／ｃｍ２の密度でＣＤ３４＋ＨＳＣを培養する工程を含む。
特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＣの処理は、輸送又は保存のために適切な細胞培養培地中でＣＤ３４＋ＨＳＣを培養する工程を含む。特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３Ｌ及びＳＣＦを補填したＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）無血清増殖培地からなる。
特定の実施形態では、ＨＳＣ増殖を実施することができる。増殖は、１以上の成長因子、例えば、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ、例えば、Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ７、Ａｎｇｐｔ１５及びＭｆａｐ４）、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）、ＦＬＴ３−Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インスリン成長因子−２（ＩＦＧ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びそれらの類似体の存在下で生じ得る（類似体には、天然に存在する成長因子の生物学的活性を有する成長因子の任意の構造的変異体が含まれる；例えば、ＷＯ２００７／１１４５２２７及びＵＳ２０１０／０１８３５６４を参照されたい）。明確にするために、成長因子剤を動員剤として使用することもできる。特定の実施形態は、ＳＣＦ、ＴＰＯとＦＬＴ３−Ｌ、又はＳＣＦとＩＬ−３、又は成長因子の他の組み合わせのいずれかが補填されたＨＳＣ支援培地（例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ）での増殖を利用する。
特定の実施形態では、ＨＳＣを増殖させるために適した成長因子のタイプ、量及び／又は濃度は、増殖を促進するのに有効な量又は濃度である。ＨＳＣ集団は、好ましくは、ヒト対象への少なくとも１回の注入を提供するのに十分な細胞数、典型的には約１０４細胞／ｋｇ〜１０９細胞／ｋｇが得られるまで増殖させる。
ＨＳＣの増殖に適した成長因子の量又は濃度は、成長因子調製物の活性、及び成長因子とＨＳＣの間の種の対応などに依存する。一般に、（１以上の）成長因子とＨＳＣとが同じ種の場合、培養培地中の成長因子の総量は１ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ又は５ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、成長因子の量は、５〜１０００又は５０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。
培養中のＨＳＣを増殖及び／又は維持するための追加の方法は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ又はＡＣＦ培地（両方ともＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）又はＸＶｉｖｏ培地タイプ（Ｌｏｎｚａ）などの市販の基礎培地の１以上に、下記の１以上を補填したものが利用できる：サイト／ケモカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３−Ｌ、ＩＬ−３、ＩＬ−６）；アリール炭化水素受容体拮抗薬などの小分子（例えば、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１（フェノール、４−［２−［［２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−６−イル］アミノ］エチル］）；ＧＮＦ３５１（Ｎ−（２−（３Ｈ−インドール−３−イル）エチル）−９−イソプロピル−２−（５−メチル−３−ピリジル）−７Ｈ−プリン−６−アミン、Ｎ−（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）−９−イソプロピル−２−（５−メチルピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−６−アミン）；ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド）、ピリミドインドール誘導体（例えば、ＵＭ１７１（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン）；ＵＭ７２９（メチル４−（（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル）アミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート）；ＵＭ１１８４２８（トラニルシプロミンＨＣｌ、（トランス−２−フェニルシクロプロピルアミン塩酸塩））及びグルココルチコイド受容体拮抗薬（例えば、ミフェプリストン（ＲＵ−４８６）、ＲＵ−４３０４４、ミコナゾール、１１−オキサコルチゾール、１１−オキサプレドニゾロン、メシル酸デキサメタゾン）。利用できる追加の薬剤には、硫酸プロタミン、ラパマイシン、ポリブレン、フィブロネクチン断片、プロスタグランジン又は非ステロイド性抗炎症薬（例えば、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク及びトルメチン）が含まれる。内皮細胞の共培養も使用することができる。
（ｉｖ）ネガティブ選択されたＣＤ３４＋ＨＳＣ集団の遺伝子改変。ネガティブ選択されたＣＤ３４＋ＨＳＣ集団は、例えば研究及び／又は治療目的のために遺伝子改変することができる。特定の実施形態では、ネガティブ選択されたＣＤ３４＋ＨＳＣ集団は、治療用遺伝子を含むように、及び／又は治療用遺伝子産物を産生するように遺伝子改変することができる。
特定の実施形態では、遺伝子とは、１以上のタンパク質のすべて又は一部を含み、例えば、遺伝子発現の条件を決定するプロモータ配列などの制御（非転写）ＤＮＡを含むことができる特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指す。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’−ＵＴＲ並びにコード配列を含む非翻訳領域を含んでもよい。特定の実施形態では、遺伝子は、エンハンサー、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、マルチクローニング部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル及びエピトープタグを含むことができる。
免疫不全を治療するための治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の特定の例としては、以下を含むＦＡ関連遺伝子を挙げることができる：ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１（ＢＲＣＡ２）、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ（ＢＲＩＰ１）、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ（ＰＡＬＢ２）、ＦａｎｃＯ（ＲＡＤ５１Ｃ）、ＦａｎｃＰ（ＳＬＸ４）、ＦａｎｃＱ（ＥＲＣＣ４）、ＦａｎｃＲ（ＲＡＤ５１）、ＦａｎｃＳ（ＢＲＣＡ１）、ＦａｎｃＴ（ＵＢＥ２Ｔ）、ＦａｎｃＵ（ＸＲＣＣ２）、ＦａｎｃＶ（ＭＡＤ２Ｌ２）及びＦａｎｃＷ（ＲＦＷＤ３）。ＦＡに関連する例示的な遺伝子及びタンパク質としては以下のものが挙げられる：ホモサピエンスＦＡＮＣＡコード配列（配列番号３１）；ホモサピエンスＦＡＮＣＣコード配列（配列番号３２）；ホモサピエンスＦＡＮＣＥコード配列（配列番号３３）；ホモサピエンスＦＡＮＣＦコード配列（配列番号３４）；ホモサピエンスＦＡＮＣＧコード配列（配列番号３５）；ホモサピエンスＦＡＮＣＡ ＡＡ（配列番号３６）；ホモサピエンスＦＡＮＣＣ ＡＡ（配列番号３７）；ホモサピエンスＦＡＮＣＥ ＡＡ（配列番号３８）；ホモサピエンスＦＡＮＣＦ ＡＡ（配列番号３９）；及びホモサピエンスＦＡＮＣＧ ＡＡ（配列番号４０）。
免疫不全を治療する治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の特定の例としては、以下を含むＳＣＩＤ関連遺伝子を挙げることができる：γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ及びＳＬＣ４６Ａ１。ＳＣＩＤに関連する例示的な遺伝子及びタンパク質としては以下が挙げられる：例示的コドン最適化ヒトγＣ ＤＮＡ（配列番号４１）；例示的天然ヒトγＣ ＤＮＡ（配列番号４２）；例示的天然イヌγＣ ＤＮＡ（配列番号４３）；例示的ヒトγＣ ＡＡ（配列番号４４）；及び例示的天然イヌγＣ ＡＡ（９１％がヒトで保存されている）（配列番号４５）。ＳＣＩＤに関連する例示的な遺伝子及びタンパク質としては、以下が挙げられる：ホモサピエンスＪＡＫ３コード配列（配列番号４６）；ホモサピエンスＰＮＰコード配列（配列番号４７）；ホモサピエンスＡＤＡコード配列（配列番号４８）；ホモサピエンスＲＡＧ１コード配列（配列番号４９）；ホモサピエンスＲＡＧ２コード配列（配列番号５０）；ホモサピエンスＪＡＫ３ ＡＡ（配列番号５１）；ホモサピエンスＰＮＰ ＡＡ（配列番号５２）；ホモサピエンスＡＤＡ ＡＡ（配列番号５３）；ホモサピエンスＲＡＧ１ ＡＡ（配列番号５４）；及びホモサピエンスＲＡＧ２ ＡＡ（配列番号５５）。
治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の追加の例には、赤血球及び凝固に関連する疾患に対して治療上有効な応答を提供できるものが含まれる。特定の実施形態では、疾患は、サラセミアのような異常ヘモグロビン症、又はＳＣＤ／形質である。例示的治療用遺伝子には、Ｆ８及びＦ９が含まれる。
治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の追加の例には、リソソーム蓄積症に対して治療上有効な応答を提供できるものが含まれる。特定の実施形態では、リソソーム蓄積症はムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ型；ＭＰＳ ＩＩ又はハンター症候群；ＭＰＳ ＩＩＩ又はサンフィリッポ症候群；ＭＰＳ ＩＶ又はモルキオ症候群；ＭＰＳ Ｖ；ＭＰＳ ＶＩ又はマロトーラミー症候群；ＭＰＳ ＶＩＩ又はスライ症候群；アルファ−マンノース症；ベータ−マンノース症；ＧＳＤＩ、フォン・ギールケ病としても知られる糖源病Ｉ型又はテイ・サックス病；ポンペ病；ゴーシェ病；又はファブリー病である。治療用遺伝子は、例えば、酵素をコードする、若しくはその産生を誘導する遺伝子、又はそうでなければリソソーム中のムコ多糖の分解を引き起こす遺伝子であり得る。例示的な治療用遺伝子としては、ＩＤＵＡ又はイズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ及びＨＹＡＬ１が挙げられる。
治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の追加の例には、がんに対して治療上有効な応答を提供できるものが含まれる。治療用遺伝子は、例えば、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子又はホルモンをコードする遺伝子であり得る。例示的な治療用の遺伝子及び遺伝子産物としては、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ−１、ＢＤＮＦ、ベータ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ−１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ−１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ−１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ−４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ１、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ−１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ−３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭ Ａ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ−ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ−１、ＹＥＳ及びｚａｃ１が挙げられる。
治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の追加の例には、感染症に対して治療上有効な応答を提供できるものが含まれる。特定の実施形態では、感染症はＨＩＶである。治療用遺伝子は、例えば、免疫細胞をＨＩＶ感染に耐性にする遺伝子、又は免疫再構築により免疫細胞がウイルスを効果的に中和することを可能にする遺伝子、免疫細胞により発現されるタンパク質をコードする遺伝子の多型、感染と戦うのに有利な患者において発現していない遺伝子、感染因子、受容体又は共受容体をコードする遺伝子；受容体又は共受容体のリガンドをコードする遺伝子；ウイルス複製に不可欠なウイルス性及び細胞性遺伝子、例えば、特定の転写因子の作用を遮断するための、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はデコイＲＮＡをコードする遺伝子；ドミナントネガティブウイルスタンパク質、細胞内抗体、イントラカイン及び自殺遺伝子をコードする遺伝子であり得る。例示的な治療用の遺伝子及び遺伝子産物としては、α２β１；αｖβ３；αｖβ５；αｖβ６３；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ−３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼ−Ｎ；ＨＨＶ−７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ−１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；α−ジストログリカン；ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ；及びラミニン受容体が挙げられる。
治療用の遺伝子及び／又は遺伝子産物の追加の例としては、可溶性ＣＤ４０；ＣＴＬＡ；Ｆａｓ Ｌ；ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２などに対する抗体；ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６に対する抗体；自己反応性Ｔ細胞に特異的に存在するＴＣＲに対する抗体；ＩＬ４；ＩＬ１０；ＩＬ１２；ＩＬ１３；ＩＬ１Ｒａ、ｓＩＬ１ＲＩ、ｓＩＬ１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；ｓＴＮＦＲＩＩ；ＴＮＦに対する抗体；Ｐ５３、ＰＴＰＮ２２及びＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２；グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；及び／又はＣ９ＯＲＦ７２が挙げられる。
治療用遺伝子は、任意の適切な方法を使用して送達することができる。特定の実施形態では、治療用遺伝子はウイルスベクターを利用して送達される。
特定の実施形態では、ウイルス媒介遺伝子導入は、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファレトロウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクターを利用することができる。
レンチウイルスベクター。「レンチウイルス」とは、分裂細胞及び非分裂細胞に感染することができ、典型的には高いウイルス力価を生じるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスベクターは、多くの疾患の遺伝子治療に使用されている。例えば、レンチウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクターを使用した造血遺伝子治療は、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー及びベータサラセミアに使用されている。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）；ウマ感染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
ウイルスベクターの追加の例としては、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス５（Ａｄ５）、アデノウイルス３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス１１（Ａｄ１１）、アデノウイルス２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス４８（Ａｄ４８）又はアデノウイルス５０（Ａｄ５０））、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、ＵＳ５６０４０９０を参照されたい）、アルファウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、フラビウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペス）、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス（例えば、ヒト及びウシのパピローマウイルス、ＵＳ５７１９０５４を参照されたい）、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ又はそれらに由来する株が挙げられる。他の例としては、鶏痘ベクター（例えば、ＦＰ９）又はカナリア痘ベクター（例えば、ＡＬＶＡＣ及びそれに由来する株）などの禽痘ベクターが挙げられる。
特定の実施形態では、組込みの効率、組み込むことができるＤＮＡ配列のサイズ及びゲノムに組み込むことができるＤＮＡ配列のコピー数を、トランスポゾンを使用することにより改善することができる。トランスポゾン又は転位因子には、上流及び下流に末端反復配列を持つ短い核酸配列が含まれる。活性トランスポゾンは、標的ＤＮＡ配列への核酸の切除及び挿入を促進する酵素をコードすることができる。
ヒトを含む脊椎動物のゲノムへの核酸の挿入を促進する多くの転位因子が当技術分野で記載されている。例としては、スリーピングビューティ（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）（例えば、サケ科の魚のゲノム由来）；ピギーバック（ｐｉｇｇｙｂａｃ）（例えば、鱗翅目細胞及び／又はトビイロホオヒゲコウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）由来）；ｍａｒｉｎｅｒ（例えば、ショウジョウバエ由来）；フロッグプリンス（ｆｒｏｇ ｐｒｉｎｃｅ）（例えば、ヒョウガエル（Ｒａｎａ ｐｉｐｉｅｎｓ）由来）；Ｔｏｌ２（例えば、メダカ由来）；ＴｃＢｕｓｔｅｒ（例えば、コクヌストモドキ（ｒｅｄ ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）トリボリウム・カスタネウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）由来）及びｓｐｉｎＯＮが挙げられる。
遺伝子送達の他の方法としては、哺乳動物人工染色体（Ｖｏｓ、１９９８）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体ベクターの使用が挙げられる。ＹＡＣは通常、挿入された核酸が従来のベクターに対して大きすぎる場合（例えば、１２ｋｂを超える場合）に使用される。
特定の実施形態では、核酸は細胞のゲノムに安定に組み込まれる。特定の実施形態では、核酸は、別個のエピソームセグメントとして細胞内で安定に維持される。
核酸を送達するベクター及び他の方法は、核酸分子の発現を制御する調節配列を含むことができる。これらの調節配列は、本質的に真核生物配列であっても、又は原核生物配列であってもよい。特定の実施形態では、調節配列は、組織特異的プロモータであり得、したがって、１以上の治療用タンパク質の発現は、他の型の組織と比較して標的組織型において実質的に大きくなる。特定の実施形態では、調節配列は、細胞へのベクターの進入時に１以上の治療用タンパク質の恒常的発現をもたらし得る。又は、調節配列は誘導配列を含むことができる。誘導性調節配列は、当業者に周知であり、１以上の治療用タンパク質の発現をもたらすために追加の誘導因子の存在を必要とする配列である。適切な調節配列の例には、内因性核タンパク質に基づく組織特異的転写因子に対応する結合部位、特定の細胞型における発現を指示する配列、ｌａｃオペレーター、テトラサイクリンオペレーター及びステロイドホルモンオペレーターが含まれる。当業者に公知の任意の誘導性調節配列を使用することができる。
遺伝子改変の手順に関する追加情報については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
（ｖ）細胞製剤。ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣは、対象への投与用に製剤化することができる。例示的な担体としては、食塩水、緩衝生理食塩水、生理食塩水、水、ハンクス液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ−Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ（Ｒ）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ、イリノイ）、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、細胞系製剤は、最初の製剤に続いて合理的に可能な限り早く対象に投与される。
特定の実施形態では、担体には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）若しくは他のヒト血清成分又はウシ胎児血清若しくは他の種の血清成分を補填することができる。特定の実施形態では、注入用の担体には、５％ＨＳＡ又はデキストロースを含む緩衝生理食塩水が含まれる。追加の等張剤としては、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールなどの、三価以上の糖アルコールを含む多価糖アルコールが挙げられる。
担体としては、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び／又はトリメチルアミン塩などの緩衝剤を挙げることができる。
安定剤とは、増量剤から、細胞が容器壁に付着するのを防ぐ助けをする添加剤までの機能範囲に及ぶ広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸及びスレオニンなどのアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール及びイノシトールなどのシクリトールなどの有機糖又は糖アルコール；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤、；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類；ラフィノースなどの三糖類並びにデキストランなどの多糖類が挙げられる。
必要又は有益な場合、細胞系製剤には、注射部位の痛みを和らげるためにリドカインなどの局所麻酔薬を含めることができる。
細胞系製剤内の細胞の治療有効量は、１０２細胞超、１０３細胞超、１０４細胞超、１０５細胞超、１０６細胞超、１０７細胞超、１０８細胞超、１０９細胞超、１０１０細胞超又は１０１１細胞超であり得る。
本明細書に開示される細胞系製剤では、細胞は一般に１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下又は１００ｍｌ以下の体積中にある。したがって、投与される細胞の密度は、典型的には１０４細胞／ｍｌ、１０７細胞／ｍｌ又は１０８細胞／ｍｌよりも大きい。
本明細書に開示される細胞系製剤は、例えば、注射、注入、灌流、又は洗浄による投与用に調製することができる。
特定の実施形態では、細胞及び／又は細胞系製剤を凍結保存することが必要又は有益であり得る。「凍結（ｆｒｏｚｅｎ／ｆｒｅｅｚｉｎｇ）」と「凍結保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ／ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）」という用語は互換的に使用することができる。凍結には凍結乾燥が含まれる。当業者によって理解されるように、細胞の凍結は破壊的であり得る（Ｍａｚｕｒ，Ｐ．，１９７７，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２５１−２７２を参照されたい）が、そのような損傷を防ぐために利用可能な多くの手順がある。例えば、（ａ）凍結防止剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御及び／又は（ｃ）分解反応を最小限に抑えるために十分に低い温度での保存により、損傷を回避することができる。例示的な凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，１９５９，Ｎａｔｕｒｅ １８３：１３９４−１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，１９６１，Ｎａｔｕｒｅ １９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，１９６０，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ １９６：５４８）、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９６２）、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．．，１９６０）、アミノ酸（Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ，１９６０）、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ，１９５４）及び無機塩（Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ，１９６０；Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ，１９６１）が挙げられる。特定の実施形態では、ＤＭＳＯを使用することができる。血漿の添加（例えば、２０〜２５％の濃度まで）は、ＤＭＳＯの保護効果を高めることができる。１％の濃度のＤＭＳＯは、４℃を超える温度では有毒になる可能性があるため、ＤＭＳＯを添加した後、凍結するまで細胞を０℃に維持することができる。
細胞の凍結保存では、冷却速度を低速に制御することが重要になる場合があり、凍結保護剤の違い及び細胞型の違いにより最適な冷却速度が異なる。水が氷に変わる融合相の熱は最小限に抑える必要がある。冷却手順は、例えば、プログラム可能な凍結装置又はメタノール浴手順の使用により実施することができる。プログラム可能な凍結装置は、最適な冷却速度の決定を可能にし、標準的な再現可能な冷却を促進する。
特定の実施形態では、ＤＭＳＯ処理細胞を氷上で予冷し、冷メタノールを含むトレイに移し、次に、これを−８０℃の械式冷蔵庫（例えば、Ｈａｒｒｉｓ又はＲｅｖｃｏ）に入れる。メタノール浴と試料の熱電対測定により、冷却速度は１°〜３℃／分が好ましいことが示される。少なくとも２時間後、標本は−８０℃の温度に達し、液体窒素（−１９６℃）に直接入れることができる。
完全に凍結した後、細胞は素早く長期極低温保存容器に移すことができる。好ましい実施形態では、試料は、液体窒素（−１９６℃）又は蒸気（−１℃）中で極低温保存することができる。このような保存は、非常に効率的な液体窒素冷凍機の利用可能性によって容易である。
細胞の操作、凍結保存及び長期保存に関するさらなる考察及び手順は、以下の例示的な参考文献に記載されている：ＵＳ４１９９０２２；ＵＳ３７５３３５７；及びＵＳ４５５９２９８；Ｇｏｒｉｎ，１９８６；Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ Ｐａｎｅｌ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｊｕｌｙ ２２−２６，１９６８，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ，Ｖｉｅｎｎａ，ｐｐ．１０７−１８６）。
凍結保存後、凍結細胞は、当業者に公知の方法に従って使用のために解凍することができる。凍結細胞は迅速に解凍され、解凍後すぐに冷却されることが好ましい。特定の実施形態では、凍結細胞を含むバイアルを温水浴にその首まで浸し、穏やかに回転させることにより、細胞懸濁液が解凍するときに確実に混合され、温水から内部の氷塊への熱伝達が増加する。氷が完全に溶けたらすぐに、バイアルをすぐに氷上に置くことができる。
特定の実施形態では、解凍中の細胞凝集を防ぐための方法を使用することができる。例示的な方法としては、凍結の前及び／又は後の、ＤＮａｓｅ、低分子量デキストラン及びシトレート、ヒドロキシエチルデンプンなどの添加が挙げられる。
ヒトに対して毒性である凍結保護剤が使用される場合、治療的使用の前に除去されなければならないことは、当業者によって理解されている。ＤＭＳＯは深刻な毒性を有していない。
（ｖｉ）使用方法。本明細書に開示される製剤は、対象（ヒト、獣医動物（犬、猫、爬虫類、鳥など）、家畜（馬、牛、山羊、豚、鶏など）、及び研究動物（猿、ラット、マウス、魚など））を治療するために使用することができる。特定の実施形態では、対象はヒト患者である。対象の治療には、治療有効量の送達が含まれる。治療有効量には、予防処置及び／又は治療処置の有効量を提供する量が含まれる。
「有効量」とは、対象に望ましい生理学的変化をもたらすのに必要な製剤の量である。有効量は、多くの場合研究目的で投与される。
「予防処置」には、治療される状態の兆候若しくは症状を示さないか、又は治療される状態の初期の兆候若しくは症状のみを示す対象に施される処置が含まれ、したがって、処置は、状態を発症するリスクを縮小、予防又は減少させる目的で施される。したがって、予防処置は、状態に対する予防的処置として機能する。
「治療処置」には、状態の症状又は兆候を示す対象に施される処置が含まれ、状態の重症度又は進行を軽減する目的で対象に施される。
特定の対象に投与される治療用製剤の実際の用量及び量は、医師、獣医、又は研究者が、標的；体重；状態のタイプ；状態の重症度；既知の場合の今後の関連イベント；以前又は同時発生の治療的介入；対象の突発性疾患；投与経路などを含む物理的及び生理学的要因などのパラメーターを考慮して決定することができる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイを任意選択的に使用して、最適な投与量範囲を特定できる。
治療有効量は、注射、注入、灌流、洗浄などの任意の適切な投与経路を通じて投与することができる。
特定の実施形態では、本開示の方法を使用してＦＡを治療することができる。特定の実施形態では、リンパ球の再構成、クローンの多様性及び胸腺形成の改善、感染の減少及び／又は患者の予後の改善を通じて治療効果を観察することができる。治療効果は、体重の増加と成長、胃腸機能の改善（下痢の減少など）、上気道症状の減少、口の真菌感染症（鵞口瘡）の減少、肺炎の発生率と重症度の減少、髄膜炎及び血流感染の減少並びに耳感染の減少の１以上を通じて観察することもできる。特定の実施形態では、本開示の方法でＦＡを治療する工程は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）に対するＢＭ由来細胞の耐性を増加させる工程を含む。特定の実施形態では、ＭＭＣに対するＢＭ由来細胞の耐性は、メチルセルロース及びＭＭＣにおける細胞生存アッセイにより測定することができる。
特定の実施形態では、本開示の方法を使用してＳＣＩＤを治療することができる。特定の実施形態では、リンパ球の再構成、クローンの多様性及び胸腺形成の改善、感染の減少、及び／又は患者の予後の改善を通じて治療効果を観察することができる。治療効果は、体重の増加と成長、胃腸機能の改善（下痢の減少など）、上気道症状の減少、口の真菌感染症（鵞口瘡）の減少、肺炎の発生率と重症度の減少、髄膜炎及び血流感染の減少並びに耳感染の減少の１以上を通じて観察することもできる。
特定の実施形態では、本開示の方法を使用して低ガンマグロブリン血症を治療することができる。低ガンマグロブリン血症は、Ｂリンパ球の不足によって引き起こされ、血中の抗体レベルが低いことが特徴である。低ガンマグロブリン血症は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び白血病関連の免疫機能障害と治療関連の免疫抑制の両方の結果として、他の関連する悪性腫瘍の患者に発症し得る。そのような血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症の患者、及びポストＨＳＰＣ移植を受けている患者は、細菌感染症にかかりやすい。体液性免疫の不全は、特にカプセル化された微生物によるこれらの患者の感染関連の罹患率及び死亡率のリスク増加の主な原因である。例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）並びにレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）及びノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．）は、ＣＬＬの患者において肺炎を引き起こす高頻度の病原性微生物である。ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、真菌、ウイルス、マイコバクテリアなどの日和見感染も観察されている。これらの患者の感染の数と重症度は、免疫グロブリンの投与により大幅に減少させることができる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｌｏｏｄ ７３：３６６−３６８；Ｃｈａｐｅｌ ＨＭ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４３：１０５９−１０６３）。
特定の実施形態では、本開示の方法は、ＢＭ機能の回復を必要とする対象のＢＭ機能を回復させることができる。特定の実施形態では、ＢＭ機能を回復する工程は、本明細書に記載の治療を施されていない、それを必要とする対象と比較して、遺伝子修正細胞によるＢＭ再増殖を改善する工程を含み得る。遺伝子修正された細胞によるＢＭ再増殖の改善には、遺伝子修正された細胞の割合を増加させる工程が含まれる。特定の実施形態では、細胞は白血球及びＢＭ由来細胞から選択される。特定の実施形態では、遺伝子修正された細胞の割合は、定量的リアルタイムＰＣＲ及びフローサイトメトリーから選択されたアッセイを使用して測定することができる。
特定の実施形態では、本開示の方法は、それを必要とする対象における免疫化に対する一次及び二次抗体応答を正常化することができる。免疫化に対する一次及び二次抗体応答を正常化する工程には、抗原に対するクラススイッチング及びメモリ応答で機能するＢ細胞及び／又はＴ細胞サイトカインシグナル伝達プログラムを回復する工程が含まれる。免疫化に対する一次及び二次抗体応答の正常化は、バクテリオファージ免疫化アッセイにより測定することができる。特定の実施形態では、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞サイトカインシグナル伝達プログラムの回復は、Ｔ細胞依存性ネオ抗原バクテリオファージφＸ１７４による免疫化後にアッセイすることができる。特定の実施形態では、免疫化に対する一次及び二次抗体応答を正常化する工程は、それを必要とする対象におけるＩｇＡ、ＩｇＭ及び／又はＩｇＧのレベルを、対照集団に由来する参照レベルに匹敵するレベルまで増加させる工程を含み得る。特定の実施形態では、免疫化に対する一次及び二次抗体応答の正常化は、それを必要とする対象におけるＩｇＡ、ＩｇＭ及び／又はＩｇＧのレベルを、本明細書に記載の遺伝子治療を施されていない、それを必要とする対象のレベルよりも高いレベルまで増加させる工程を含み得る。ＩｇＡ、ＩｇＭ及び／又はＩｇＧのレベルは、例えば免疫グロブリン試験により測定することができる。特定の実施形態では、免疫グロブリン試験は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖及び／又は重鎖に結合する抗体を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリン試験には、血清タンパク質電気泳動、免疫電気泳動、放射状免疫拡散、ネフェロメトリー及び比濁法が含まれる。市販の免疫グロブリン検査キットとしては、ＭＩＮＩＮＥＰＨ（商標）（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）、Ｄａｋｏ（Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＤａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の免疫グロブリン検査システムが挙げられる。特定の実施形態では、免疫グロブリンレベルの測定に使用できる試料には、血液試料、血漿試料、脳脊髄液試料及び尿試料が含まれる。
特定の実施形態では、製剤は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎白質ジストロフィー、突発性骨髄化生、先天性無巨核球性血小板減少症（ａｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｓｉｓ／ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、毛細血管拡張性運動失調症、重症型β−サラセミア、慢性肉芽腫症、ＣＬＬ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、補体障害、先天性無ガンマグロブリン血症、ダイヤモンドブラックファン症候群、家族性赤血球貪食性リンパ組織球増多症、ホジキンリンパ腫、ハーラー症候群、高ＩｇＭ、ＩｇＧサブクラス欠損症、若年性骨髄単球性白血病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、多発性骨髄腫、骨髄異形成、非ホジキンリンパ腫、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、抗体欠損を伴う原発性免疫不全疾患、赤芽球癆、難治性貧血、シュワッハマン−ダイヤモンド−ブラックファン貧血、選択的ＩｇＡ欠損、重症再生不良性貧血、ＳＣＤ、特異的抗体欠損、ウィスコット−アルドリッジ症候群及び／又はＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）を治療するために対象に投与される。
特定の実施形態は、外傷、ウイルス、化学療法、毒素及び汚染によって引き起こされる免疫不全などの続発性又は後天性免疫不全の治療を含む。前述のように、ＡＩＤＳは、ウイルスのＨＩＶによって引き起こされる続発性免疫不全障害の例であり、Ｔリンパ球の枯渇により、身体が感染症と戦うことができなくなる。ＨＩＶの治療のための治療有効量は、例えば、ＨＩＶに対する対象の免疫を高め、ＡＩＤＳ若しくはＨＩＶに関連する症状を改善する、又はＨＩＶに対する対象の先天性若しくは適応性の免疫応答を誘導することができる。ＨＩＶに対する免疫応答には抗体産生が含まれ、ＡＩＤＳの予防及び／又は対象のＡＩＤＳの症状若しくはＨＩＶ感染の改善、又はＨＩＶの感染性及び／又は毒性の減少若しくは除去をもたらし得る。
特定の実施形態では、本開示の方法は、それを必要とする対象におけるリンパ球再構成の動態及び／又はクローン多様性を改善することができる。特定の実施形態では、リンパ球再構成の動態を改善する工程は、循環Ｔリンパ球の数を、対照集団に由来する参照レベルの範囲内まで増加させる工程を含み得る。特定の実施形態では、リンパ球再構成の動態を改善する工程は、絶対ＣＤ３＋リンパ球数を、対照集団に由来する参照レベルの範囲内まで増加させる工程を含み得る。参照レベルの範囲は、所定のパラメーターについて正常な（すなわち、非免疫無防備状態の）対象で観察される、又は示される値の範囲であり得る。特定の実施形態では、リンパ球再構成の動態を改善する工程は、本明細書に記載の治療を施されていない、それを必要とする対象と比較して、正常リンパ球数に達するのに必要な時間を短縮する工程を含み得る。特定の実施形態では、リンパ球再構成の動態を改善する工程は、本明細書に記載の治療を施されていない、それを必要とする対象と比較して、遺伝子修正リンパ球の頻度を増加させる工程を含み得る。特定の実施形態では、リンパ球再構成の動態を改善する工程は、本明細書に記載の遺伝子治療を施されていない、それを必要とする対象と比較して、対象の遺伝子修正リンパ球のクローンレパートリの多様性を増加させる工程を含み得る。遺伝子修正リンパ球のクローンレパートリの多様性を増加させる工程には、ＲＩＳ分析で測定した特有のレトロウイルス組込み部位（ＲＩＳ）のクローン数を増加させる工程を含み得る。
特定の実施形態では、本開示の方法は、それを必要とする対象においてＴ細胞媒介免疫応答を回復させることができる。Ｔ細胞媒介免疫応答の回復には、胸腺からの流出を回復する工程及び／又は正常なＴリンパ球発生を回復する工程を含み得る。
特定の実施形態では、胸腺からの流出を回復する工程は、ＰＢにおいてＣＤ４５ＲＡを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度を、対照集団に由来する参照レベルの頻度に匹敵するレベルまで回復させる工程を含み得る。特定の実施形態では、胸腺出力を回復する工程は、１０６個の成熟Ｔ細胞あたりのＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）の数を、対照集団に由来する参照レベルの数に匹敵するレベルまで回復させる工程を含み得る。１０６個の成熟Ｔ細胞あたりのＴＲＥＣの数は、Ｋｅｎｎｅｄｙ ＤＲ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １４２：３６−４８に記載されているように決定することができる。
特定の実施形態では、正常なＴリンパ球の発生を回復する工程は、ＣＤ４＋細胞：ＣＤ８＋細胞の比率を２に回復させる工程を含む。特定の実施形態では、正常なＴリンパ球の発生を回復する工程は、循環Ｔリンパ球中のαβＴＣＲの存在を検出する工程を含む。循環Ｔリンパ球におけるαβＴＣＲの存在は、例えば、ＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖に結合する抗体を使用するフローサイトメトリーにより検出することができる。特定の実施形態では、正常なＴリンパ球の発生を回復させる工程は、対照集団に由来する参照レベルのレパートリに匹敵する多様なＴＣＲレパートリの存在を検出する工程を含む。ＴＣＲの多様性は、ＴＣＲβ遺伝子の可変領域の遺伝的再配列を分析するＴＣＲＶβスペクトルタイピングによって評価することができる。強い正常なスペクトルタイプのプロファイルは、ＴＣＲＶβセグメントの１７ファミリーにまたがるサイズの断片のガウス分布によって特徴付けることができる。特定の実施形態では、正常なＴリンパ球の発生を回復する工程は、Ｔ細胞特異的シグナル伝達経路を回復させる工程を含む。Ｔ細胞特異的シグナル伝達経路の回復は、Ｔ細胞マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）への暴露後のリンパ球増殖によって評価することができる。特定の実施形態では、正常なＴリンパ球の発生を回復する工程は、白血球数、好中球数、単球数、リンパ球数及び／又は血小板細胞数を、対照集団に由来する参照レベルに匹敵するレベルに回復させる工程を含む。
特定の実施形態では、治療有効量は、免疫及び他の血球に機能を提供し、免疫媒介状態を軽減又は排除する、及び／又は免疫媒介状態の症状を軽減又は排除することができる。
特定の実施形態では、特定の使用方法は、修正された細胞が修正されていない細胞よりも選択的な利点を有する、状態の治療を含む。例えば、ＦＡ及びＳＣＩＤでは、修正された細胞には利点があり、治療用遺伝子を「少数」のＨＳＰＣに形質導入するだけで治療効果には十分である。
（ｖｉｉ）対照集団に由来する参照レベル。本明細書に記載の治療に関連するパラメーターについて得られた値は、対照集団に由来する参照レベルと比較することができ、この比較は、本明細書に記載の治療がそれを必要とする対象に有効かどうかを示すことができる。参照レベルは、対照集団に由来する１以上の関連データセットから取得することができる。本細書で使用される「データセット」は、所望の状態の試料（又は試料集団）の評価から生じる数値のセットである。データセットの値は、例えば、試料から測定値を実験的に取得し、これらの測定値からデータセットを構築することにより取得することができる。当業者によって理解されるように、参照レベルは、例えば、個々のデータポイント、例えば、平均、中央値、平均の中央値の集合から意味のある集合参照レベルに到達するために当技術分野において有用で公知の任意の数式又は統計式に基づくことができる。又は、参照レベル若しくは参照レベルを作成するためのデータセットは、実験室などのサービスプロバイダーから、又はデータセットが保存されているデータベース若しくはサーバーから取得することができる。
データセットからの参照レベルは、対照集団に由来する以前の測定値から誘導することができる。「対照集団」とは、指定の特徴などによりグループ化された任意の対象又は試料である。グループ化は、例えば、臨床パラメーター、臨床評価、治療計画、疾患状態、状態の重症度などに従って行うことができる。特定の実施形態では、グループ化は、年齢範囲（例えば、０〜２歳）及び非免疫無防備状態に基づいている。特定の実施形態では、正常な対照集団には、試験対象と年齢が一致し、非免疫無防備状態である個体が含まれる。特定の実施形態では、年齢が一致するとは、例えば、状況に応じて臨床的に関連する０〜６ヶ月齢；０〜１歳；０〜２歳；０〜３歳；１０〜１５歳が含まれる。特定の実施形態では、対照集団は、免疫不全を有し、治療有効量が投与されたことがない集団を含み得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載の治療に関連する特定のパラメーターの値に対する関連参照レベルは、本明細書に開示の治療がそれを必要とする対象にとって治療的に有効であるかどうかを判断するために、対照集団の治療に関連する特定の対応パラメーターの値に基づいて取得される。
特定の実施形態では、試料の値が参照レベルと統計的に有意差があるか、統計的に有意差がないかどうかに基づいて結論が導き出される。差が偶然のみに基づいて発生すると予想されるレベル内にある場合、測定値は統計的に有意差がない。対照的に、統計的に有意な差又は増加は、偶然のみにより発生すると予想されるものよりも大きいものである。統計的有意性又はその欠如は、当技術分野で周知のさまざまな方法のいずれかによって判定することができる。一般的に使用される統計的有意性の尺度の例は、ｐ値である。ｐ値は、特定のデータポイントに相当する所与の結果が得られる確率を表し、このデータポイントは偶然のみの結果である。ｐ値が０．０５以下の場合、結果は多くの場合（偶然ではなく）重要とみなされる。特定の実施形態では、試料の値と参照レベルとが、統計的に有意差がない場合、試料値は正常な対照集団に由来する参照レベルと「同等」である。
（ｖｉｉｉ）キット。本明細書に開示される方法を実施するための成分の組み合わせを使用して、ネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋ＨＳＣを作製及び／又は使用するキットを作製することができる。
特定の実施形態では、キットは、ＢＭ試料又は動員されたＰＢ試料を取得するための医療用品を含む。特定の実施形態では、キットは、Ｇ−ＣＳＦ／Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ （Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，カリフォルニア）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ）、ＳＣＦ及び／又は化学療法剤を含む。特定の実施形態では、キットは、Ｇ−ＣＳＦ／Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、カリフォルニア）及びＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ）を含む。
特定の実施形態では、キットは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１９に結合する１以上のタンパク質（例えば、抗体）を含む。特定の実施形態では、キットは、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（例えば、クローン５Ｈ９）、抗ＣＤ３抗体（例えば、クローンＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ１４抗体（例えば、クローン６１Ｄ３）、抗ＣＤ１６抗体（例えば、クローン３Ｇ８）、抗ＣＤ１９抗体（例、クローン４Ｇ７）のうちの１以上を含む。特定の実施形態では、キットは磁気要素及び／又は蛍光要素を含む。
特定の実施形態では、キットはチューブセットを含む。
特定の実施形態では、キットはＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）を含む。特定の実施形態では、キットは硫酸プロタミンを含む。特定の実施形態では、キットはヒトＳＣＦを含む。特定の実施形態では、キットはＴＰＯを含む。特定の実施形態では、キットはＦｌｔ−３リガンドを含む。特定の実施形態では、キットはＮＡＣを含む。
特定の実施形態では、キットは、ウイルスベクターなどの遺伝子治療のための成分を含む。特定の実施形態では、キットはレンチウイルスベクターを含む。特定の実施形態では、キットは、本明細書に開示の治療用遺伝子（例えば、治療ＦＡ遺伝子）をコードする核酸を含む。
特定の実施形態では、キットは、対象への投与のために細胞を製剤化するための培地を含む。
キットには、医薬品又は生物製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知を含めることもでき、この通知は、前記機関によるヒト投与のための製造、使用又は販売の承認を反映している。通知には、提供された活性成分を対象に投与できる旨を記載することができる。キットは、このキットを使用するためのさらなる使用説明書、例えば、製剤及び／又は動員因子の投与に関する使用説明書を含むことができる。使用説明書は、キット内に提供される印刷された使用説明書の形態であっても、又はキット自体の一部に印刷することもできる。使用説明書は、シート、パンフレット、パンフレット、ＣＤ−ＲＯＭ、又はコンピューターで読み取り可能なデバイスの形式であっても、又はウェブサイトなどの遠隔地にある使用説明書への指示を提供することができる。特定の実施形態では、キットは、このキットを効果的に使用するために必要な必須の医療用品、例えば、注射器、アンプル、チューブ、フェイスマスク、注射キャップ、スポンジ、滅菌接着ストリップ、Ｃｈｌｏｒａｐｒｅｐ、手袋などの一部又はすべてを含むこともできる。本明細書に記載のキットのいずれの内容も変更が可能である。
例示的実施形態。
１．生体試料からネガティブ選択により誘導されるＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を形成する工程を含む方法。
２．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋細胞のみを除去する、実施形態１の方法。
３．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞の１以上を除去する、実施形態１の方法。
４．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ３＋細胞を除去する、実施形態１の方法。
５．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ１４＋細胞を除去する、実施形態１の方法。
６．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を除去する、実施形態１の方法。
７．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ１９＋細胞を除去する、実施形態１の方法。
８．ネガティブ選択がＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞を除去する、実施形態１の方法。
９．ネガティブ選択がＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞のみを除去する、実施形態１の方法。
１０．ネガティブ選択が、生体試料と、除去される細胞型に関連するＣＤマーカーに結合する結合タンパク質とを接触させる工程を含む、実施形態１〜９のいずれかの方法。
１１．結合タンパク質が抗体又はその結合断片を含む、実施形態１０の方法。
１２．抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＪＳ−８３、クローンＨＩ１００、抗ＣＤ４５ＲＡ［ＭＥＭ−５６］、クローンＵＣＨＴ１、クローンＳＫ７、クローンＯＫＴ３、クローンＣＤ３−１２、クローン６１Ｄ３、クローンＨＣＤ１４、クローン６３Ｄ３、クローンＭ５Ｅ２、クローン３Ｇ８、クローンＬＮＫ１６、クローンＤＪ１３０ｃ、クローンＫＤ１、クローン４Ｇ７、クローンＨＩＢ１９、クローンＬＴ１９及び／又はクローンＦＭＣ６３を含む、実施形態１１の方法。
１３．抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＵＣＨＴ１、クローン６１Ｄ３、クローン３Ｇ８及びクローン４Ｇ７を含む、実施形態１２の方法。
１４．ネガティブ選択が、磁気分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）、ナノ選別、アフィニティークロマトグラフィー、パニング及び／又は選択的凝集を実施する工程を含む、実施形態１〜１３のいずれかの方法。
１５．結合タンパク質が磁気ビーズ、フルオロフォア及び／又は親和性タグに結合されている、実施形態１０〜１４のいずれかの方法。
１６．ネガティブ選択により、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞が、合せて少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少する、実施形態１〜１５のいずれかの方法。
１７．ネガティブ選択により、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及び／又はＣＤ１９＋細胞から選択される系列＋細胞が、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少する、実施形態１〜１５のいずれかの方法。
１８．ネガティブ選択により、生体試料中の出発ＣＤ３４＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも９０％が保持される、実施形態１〜１７のいずれかの方法。
１９．保持されたＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ−及びＣＤ９０＋である、実施形態１８の方法。
２０．ネガティブ選択後に生体試料中に保持される細胞が間葉系幹細胞を含む、実施形態１〜１９のいずれかの方法。
２１．培養培地におけるネガティブ選択後、生体試料中に保持されたＣＤ３４＋細胞を培養する工程をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれかの方法。
２２．培養培地に硫酸プロタミン、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド及びＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を補填する、実施形態２１の方法。
２３．ＣＤ３４＋細胞を、フィブロネクチン断片でコーティングされた培養フラスコにおいて培養する、実施形態１８〜２２のいずれかの方法。
２４．生体試料が骨髄試料又は動員末梢血試料である、実施形態１〜２３のいずれかの方法。
２５．ネガティブ選択の前に生体試料の赤血球（ＲＢＣ）を枯渇させる工程をさらに含む、実施形態１〜２４のいずれかの方法。
２６．生体試料が、２５％以下のヘマトクリット値を得るためにＮＡＣを含む細胞培養培地で希釈された骨髄試料である、実施形態１〜２５のいずれかの方法。
２７．ネガティブ選択により誘導されたＣＤ３４＋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞を遺伝子改変する工程をさらに含む、実施形態１〜２６のいずれかの方法。
２８．遺伝子改変が、治療用遺伝子をコードする核酸の挿入である、実施形態２７の方法。
２９．治療用遺伝子が、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ、ＦａｎｃＷ、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ、ＳＬＣ４６Ａ１、Ｆ８、Ｆ９、ＩＤＵＡ、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ−１、ＢＤＮＦ、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ−１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ−１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ−１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ−４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ １、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ ２１、Ｇｅｎｅ ２６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１ ＩＬ−１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ−１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ−３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭ Ａ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ−ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ−１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、α２β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６３、ＢＯＢ／ＧＰＲ１５、Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ−３３／ＴＹＭＳＴＲ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＸＣＲ４、アミノペプチダーゼ−Ｎ、ＨＨＶ−７、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ、ＨｖｅＡ、α−ジストログリカン、ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ、ＰＶＲ、ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、可溶性ＣＤ４０、ＣＴＬＡ、Ｆａｓ Ｌ、グロビンファミリー遺伝子、ＷＡＳ、ｐｈｏｘ、ジスロトフィン、ピルビン酸キナーゼ、ＣＬＮ３、ＡＢＣＤ１、アリールスルファターゼＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＮＬＸ２．１、ＡＢＣＡ３、ＧＡＴＡ１、リボソームタンパク質遺伝子、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＣ、ＤＫＣ１、ＴＩＮＦ２、ＣＦＴＲ、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＡＰＰ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ユビキリン２、Ｃ９ＯＲＦ７２及び／又はＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６に対する抗体；ＴＮＦ；自己反応性Ｔ細胞に特異的に存在するＰ５３、ＰＴＰＮ２２、ＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２若しくはＴＣＲ；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２；ＩＬ−１３；ＩＬ−１Ｒａ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；及び／又はｓＴＮＦＲＩＩの１以上から選択される、実施形態２８の方法。
３０．核酸が配列番号３１〜３５、４１〜４３及び／又は４６〜５０から選択される配列を含む、実施形態２８又は２９の方法。
３１．核酸が、配列番号３６〜４０、４４、４５及び／又は５１〜５５から選択されるタンパク質をコードする、実施形態２８〜３０のいずれかの方法。
３２．治療用遺伝子をコードする核酸が転位因子を含む、実施形態２８〜３１のいずれかの方法。
３３．遺伝子改変がウイルスベクターを利用する、実施形態２７〜３２のいずれかの方法。
３４．ウイルスベクターがレンチウイルスベクターから選択される、実施形態３３の方法。
３５．遺伝子改変が、５〜１０感染単位（ＩＵ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入する工程を含む、実施形態２７〜３４のいずれかの方法。
３６．レンチウイルスベクターが自己不活性化レンチウイルスベクターである、実施形態３４又は３５の方法。
３７．レンチウイルスベクターがヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータを含む、実施形態３４〜３６のいずれかの方法。
３８．ヒトＰＧＫプロモータが配列番号５６を含む、実施形態３７の方法。
３９．ネガティブ選択により誘導されたＣＤ３４＋細胞集団を対象への投与のために製剤化する工程をさらに含む、実施形態１〜３８のいずれかの方法。
４０．製剤化されたＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋細胞の参照集団に匹敵するコロニー形成能を有する、実施形態３９の方法。
４１．コロニー形成能が、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイによって測定される、実施形態４０の方法。
４２．製剤化されたＣＤ３４＋細胞の投与が、ＣＤ３４＋細胞の参照集団に匹敵する、対象におけるＣＤ４５＋細胞生着、Ｔ細胞生着、単球生着、及び／又はＢ細胞生着をもたらす、実施形態３９〜４１のいずれかの方法。
４３．ＣＤ３４＋細胞の参照集団が、ＣＤ３４＋マーカーのポジティブ選択を受けた細胞である、実施形態４２の方法。
４４．実施形態１〜４３のいずれかの方法によって作製された治療用細胞製剤。
４５．治療用製剤を対象に投与することにより、実施形態４４の治療用細胞製剤で対象を治療する工程を含む方法。
４６．対象が脆弱なＣＤ３４＋細胞集団を有する、実施形態４５の方法。
４７．対象がＣＤ３４ｌｏ細胞集団を有する、実施形態４５又は４６の方法。
４８．対象が、ファンコーニ貧血（ＦＡ）、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）又は先天性角化異常症を有する、実施形態４５〜４７のいずれかの方法。
４９．対象が原発性免疫不全、続発性免疫不全及び／又はがんを有する、実施形態４５〜４７のいずれかの方法。
５０．続発性免疫不全がＨＩＶによって引き起こされる、実施形態４９の方法。
５１．がんが白血病である、実施形態４９の方法。
５２．対象に動員因子を投与する工程をさらに含む、実施形態４５〜５１のいずれかの方法。
５３．指定数のＣＤ３４＋細胞が末梢血中を循環していることが検出されるまで、動員因子を連続した日に投与する、実施形態５２の方法。
５４．指定数が１０個のＣＤ３４＋細胞／μＬ以上である、実施形態５３の方法。
５５．動員因子が、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＡＭＤ３１００及び／又は化学療法剤から選択される、実施形態５２〜５４のいずれかの方法。
５６．動員因子を投与する工程が、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目及び６日目にＧ−ＣＳＦを投与する工程、並びに４日目、５日目及び６日目にＡＭＤ３１００を投与する工程を含む、実施形態５２〜５５のいずれかの方法。
５７．動員因子を投与する工程が、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目及び６日目に１６μｇ／ｋｇ／日のＧ−ＣＳＦを投与する工程、並びに４日目、５日目及び６日目に２４０μｇ／ｋｇ／日のプレリキサフォルを投与する工程を含む、実施形態５２〜５６のいずれかの方法。
５８．動員因子を投与する工程が皮下投与を含む、実施形態５２〜５７のいずれかの方法。
５９．白血球除去療法を実施する工程をさらに含む、実施形態４５〜５８のいずれかの方法。
６０．白血球除去療法が２日間にわたって行われる、実施形態５９のいずれかの方法。
６１．白血球除去療法が大量白血球除去療法である、実施形態５９又は６０の方法。
６２．収集された動員末梢血試料が自己血漿で希釈される、実施形態５９〜６１のいずれかの方法。
６３．収集された動員末梢血試料が、１日目に自己血漿で２００×１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に希釈される、実施形態５９〜６２の方法。
６４．２日目に収集された動員末梢血試料が、希釈された１日目試料と一緒にプールされる、実施形態５９〜６３のいずれかの方法。
６５．白血球除去療法後に血小板洗浄を実施する工程をさらに含む、実施形態５９〜６４のいずれかの方法。
６６．対象から骨髄試料を取得する工程をさらに含む、実施形態４５〜５１のいずれかの方法。
６７．骨髄試料に対してヘタスターチ沈降を実施して赤血球（ＲＢＣ）を除去する工程をさらに含む、実施形態６６の方法。
本明細書に開示のタンパク質及び／又は核酸配列の変異体も、使用することができる。変異体には、本明細書に記載又は開示のタンパク質及び核酸配列との少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性又は９９％の配列同一性を有する配列が含まれ、この変異体は実質的に類似又は改善された生物学的機能を示す。
「配列同一性％」とは、配列を比較することにより決定される、２以上の配列間の関係を指す。当技術分野において、「同一性」とは、このような配列のストリング間の一致により決定される、タンパク質配列及び核酸配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」（「類似性」と呼ばれることも多い）は、以下に記載されている方法を含む公知の方法で容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）。同一性を決定するための好ましい方法は、被験配列間の最適な一致をもたらすように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムで体系化されている。配列アライメントと同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実行することができる。配列の多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法（デフォルトのパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いたＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１−１５３（１９８９））を使用して実行することもできる。関連するプログラムとしては、ＧＣＧ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．も挙げられる。本開示の文脈内で、配列解析ソフトウェアが解析に使用される場合、解析結果は参照プログラムの「デフォルト値」に基づいていることは理解されよう。「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされている値又はパラメーターのセットを意味する。
［実施例１］
系列枯渇は、遺伝子治療用の自己血ＨＳＣを保存する。ファンコーニ貧血（ＦＡ）の遺伝的基礎は、ヌクレオチド除去とその後の相同組換えによる、ストランド間架橋のＤＮＡ修復を担う、ＦＡ／乳がん経路を構成するタンパク質成分を有する１９の遺伝子のいずれか１つの突然変異である。結果として生じる遺伝子完全性の損傷は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）のほぼ均一な減少、青年期までの骨髄異形成症候群又は急性骨髄性白血病の５０％の発生率、及び頭頸部扁平上皮癌又は婦人科系がんの２５％の生涯発生率と関連している。一部の患者では、血球クローンは野生型への自然復帰（つまり、体細胞モザイク現象）を示し、最大２７年間、血球数の改善と安定化につながる。したがって、ＦＡ造血欠陥の修正は、疾患の臨床経過を大きく変える可能性があり、このことがＦＡのＨＳＰＣ遺伝子治療の数十年の研究を推進している。
初期の臨床試験では、原発性免疫不全の治療を受けた患者など、他の遺伝子治療患者と比較して、ＦＡ患者の真のＨＳＰＣの数が劇的に５０倍減少したことが示された。さらに、遺伝子導入のためにｅｘ ｖｉｖｏで操作した場合、ＦＡ ＨＳＰＣは非常に脆弱であった。治療を受けた患者のいずれも、血球数の安定した改善及び遺伝子修正された血球の長期持続を示さなかった。これらの研究は、ＦＡ遺伝子治療における技術革新の２つの必要性を強調している：（１）遺伝子導入及び注入のための収集に利用可能なＨＳＰＣの数を増やすこと、及び（２）遺伝子導入後のこれらの細胞の生着能を高めること。
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＦＡ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐの勧告に従って、ＦＡ相補群Ａ（ＦＡ−Ａ）患者に対する遺伝子治療の第Ｉ相臨床試験が２０１４年に開始された（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ＩＤ ＮＣＴ０１３３１０１８）。この試験計画には、ＨＳＰＣの数と適合性の向上を目的としたいくつかの特徴が組み込まれている。これらには、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモータによって制御されるＦＡＮＣＡ ｃＤＮＡを導入するための自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ＬＶ）、ｅｘ ｖｉｖｏ操作を最小限に抑える短い一晩の形質導入、並びに操作を通しての抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の添加及び酸化的ＤＮＡ損傷を制限するための低酸素（５％）下での培養が含まれる。
遺伝子導入の標的ＨＳＰＣ集団は、ＣＤ３４細胞表面タンパク質を発現する（ＣＤ３４＋）。ＣＤ３４に対するフルオロフォア結合抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析すると、ＢＭ細胞のごく一部がＣＤ３４＋であり、原始幹細胞とよりコミットされた前駆細胞との両方が表された。これらの細胞を分離するための標準的な臨床手順には、まず、ＢＭ収集又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）若しくはＧ−ＣＳＦとケモカイン受容体ＣＸＣＲ４アンタゴニストのプレリキサフォルとの組み合わせによるサイトカイン刺激を介した循環への細胞の動員、続くＰＢ白血球除去療法（ｍＡＰＨ）が含まれる。初期の分離技術は、細胞表面でのＣＤ３４抗原の発現に依存しており、ビオチン−アビジン親和性、パニング又は免疫磁気ビーズベースのアプローチを利用していた。予想される収率は、利用可能なＣＤ３４＋細胞全体の５０％であり、純度はさまざまであり、技術全体で２０〜９０％の範囲であった［Ｃｏｌｌｉｎｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．１９９４；１２（６）：５７７−５８５で総説］。これらのうち、免疫磁気ビーズベースのポジティブ選択は、今日の臨床規模で最も広く適用されており、２０１４年にヒト用の臨床機器が最初のＦＤＡ承認を受けている。自動化を含むこの技術の進歩により、回収の確実性が平均収率７０％に向上し、純度は定常的に９０％を超えている［Ｓｐｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；１７（１０）：１４６５−１４７１及びＡｖｅｃｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１６；５６（５）：１００８−１０１２］。ただし、これらの値はＢＭ及びｍＡＰＨ産物に基づいており、全細胞の１〜３％がＣＤ３４抗原を発現し、これらの細胞の大部分は高レベルのＣＤ３４を提示する。ＦＡ患者の場合、ＣＤ３４＋細胞の頻度ははるかに低く、ＢＭでは０．１〜１．５％である。Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ．２００９；６６８（１−２）：１４１−１４９；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７；１５（１）：２１１−２１９。これは、ＦＡでの遺伝子導入のために、限られた数のＨＳＰＣを保存する非標準的な方法が必要であり得ることを意味する。
ここでは、３人の患者のＨＳＰＣ収集結果について記載する。最初に、このプロトコルは、動員を事前に試みずにＢＭからＣＤ３４＋細胞を直接単離することを提案しており、ＦＡ患者中の限られた数のＨＳＰＣを使い尽くす可能性がある。これにより、ＣＤ３４発現パターンの評価と、標準的な臨床プロトコルを使用した直接分離の可能性が可能になり、代替ＨＳＰＣ分離戦略の必要性のエビデンスが得られた。
方法。患者の選択。この研究は、ヘルシンキ宣言及び米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に従って、フレッド・ハッチンソンがん研究センター（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）（フレッド・ハッチ（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈ））の施設内倫理委員会により承認され、組換えＤＮＡ分子を含む研究に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠している。インフォームドコンセントはすべての患者から得た。４歳以上のＦＡ患者は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）又はジエポキシブタンによる染色体切断に対する感受性の増加についてのポジティブ試験により診断された。試験で定義されたＢＭ分析において正常な核型を示したＡ相補群の患者を研究の対象とみなした。登録された患者の特徴は、図１において利用可能である。
レンチウイルスベクター。すべてのＳＩＮ ＬＶベクターを、第３世代の分割パッケージングシステムで作製し、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）でシュードタイプ化した。健康なドナー細胞の形質導入に使用されるＬＶは、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）導入遺伝子（ｐＲＳＣ−ＰＧＫ．ｅＧＦＰ−ｓＷ）又は完全長のＦＡＮＣＡ ｃＤＮＡ（ｐＲＳＣ−ＰＧＫ．ＦＡＮＣＡ−ｓＷ）のいずれかをコードし、これらは双方ともヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータにより調節される。特定の実施形態では、ＰＧＫプロモータは配列番号５６の配列を有する。研究グレードのベクターを、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｒｅによって作製した。臨床グレードＬＶ（ｐＲＳＣ−ＰＧＫ．ＦＡＮＣＡ−ｓＷ）は、ＩＵＶＰＦが保有する承認済みのドラッグマスターファイルに基づき優良医薬品製造基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に従って、大規模で検証済みの方法を使用してＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＩＵＶＰＦ）によって生産された。感染力価は、ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫由来細胞の連続形質導入によって決定し、ｅＧＦＰ発現に関するフローサイトメトリーによって、又はＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲのいずれかによって評価した。
研究デザイン及びＨＳＰＣの単離。患者に、１５ｃｃ／ｋｇ体重の標的収集目標でＢＭ採取を行うか、又は毎日Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム；１６μｇ／ｋｇ ＢＩＤ；１〜６日目）及びプレリキサフォル（２４０μｇ／ｋｇ／日；４〜６日目）を皮下投与するかのいずれかで、ＣＤ３４＋細胞を動員した。動員された患者を、循環ＣＤ３４＋血球数が１０細胞／μＬ以上になったときに大量白血球除去療法に供した。健康なドナー血液産物は、市販の供給源（ＢＭ産物；ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、Ｆｏｌｓｏｍ、カリフォルニア）又は機関共有供給源（ｍＡＰＨ産物）から購入した。免疫磁気ビーズは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｍｂｈ（Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）から入手した。ＢＭ産物の場合、ヘタスターチ沈降によりＲＢＣを減量し、その後ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）デバイス（Ｍｉｌｔｎｅｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）で標識した。ｍＡＰＨ産物の場合、まず血小板洗浄を行い、その後標識した。系列枯渇のカスタムプログラミングを設計し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）デバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）で実行した。完全な処理方法は、次の項に含まれている。
ＢＭ及びｍＡＰＨ産物の処理。すべての処理は、クラスＩＩ、タイプＡ２の生物学的安全キャビネット又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）デバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）で行った。デバイスに充填する前に、１ＬのＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、イリノイ）にＮＡＣを最終濃度１ｍＭまで補填し、十分混合した。３ＬバッグのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）に、６０ｍＬの２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮＡＣを最終濃度１ｍＭまで補填し、十分混合した。ＢＭ産物の場合、６００ｍＬバッグの０．９％ＮａＣｌ中６％ヘタスターチ（ＨＥＳ）（Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、イリノイ）に、ＮＡＣを最終濃度１ｍＭまで補填した。免疫磁気ビーズ試薬を、カスタムプログラム及びＴＳ ５１０チューブセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）を使用してデバイス上で濃縮し、総量を１４ｍＬ以下にした後、３ｍＬの１０％ＩＶＩｇ（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び２０ｍＬの空気を含む６０ｍＬの注射器に移し、必要になるまで２〜８°Ｃで保存した。デバイスに充填するために、ＴＳ ５１０チューブセットを取り付けた。
ＢＭ産物を、標準的な臨床手順によって収集した。収集したら、全血球計算値を取得し、ＢＭをＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ＋ＮＡＣで希釈し、ヘマトクリット値を２５％以下にして、その後チューブセットのアプリケーションバッグに充填した。ＨＥＳの沈降を促進するために、４００ｍＬの漏斗付クライオバッグ（ＯｒｉＧｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス）を取り付け前にチューブセットに滅菌接合した。複数のバッグを使用する場合、色分けされた三分岐標準ボア延長セット（Ｓｍｉｔｈｓ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｓａｉｎｔ Ｐａｕｌ、ミネソタ）に滅菌接合によりバッグを接続し、次いでチューブセットに取り付けた。
大量のｍＡＰＨ産物を、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ又はＯｐｔｉａアフェレーシスシステム（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、コロラド）において標準的な臨床手順によって収集した。ｍＡＰＨ産物の場合、初日収集は全血球計算値を得るためにサンプリングし、必要に応じて自己血漿で２００×１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に希釈して、２〜８°Ｃで一晩保存した。２日目の収集を行ったら、産物をプールし、全血球計算値を得た。ＴＳ ５１０チューブセットの準備中に、提供された標的細胞及び非標的細胞バッグを取り外し、３Ｌのトランスファーパック（Ｆｅｎｗａｌ、Ｌａｋｅ Ｚｕｒｉｃｈ、イリノイ）に交換して、大量の細胞産物を収容した。ｍＡＰＨ産物は、アプリケーションバッグを介してチューブセットに充填した。
デバイスのセットアップ及び運転：
すべての過程で、バルブの構成は以下のとおりである：
バルブ１：ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）バッファー＋ＮＡＣ＋ＨＳＡ
バルブ２：空っぽ
バルブ３：濃縮ビーズ試薬＋ＩＶＩｇ
バルブ４：漏斗付クライオバッグ（ＢＭ産物のみ）
バルブ５：ＨＥＳ＋ＮＡＣ（ＢＭ産物のみ）
バルブ６：空っぽ
バルブ７：空っぽ
バルブ８：アプリケーションバッグ（チューブセット付き標準）
バルブ９：予備分離カラム
バルブ１０：プライミングバッグ
バルブ１１〜１６及び２１：方向バルブ
バルブ１７〜１８：Ｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔユニット
バルブ１９：廃棄バッグ
バルブ２０：非標的細胞バッグ
バルブ２２：標的細胞バッグ
バルブ２３：中間保管バッグ
バルブ２４：空っぽ
チューブセットが充填され、プログラムが起動されると、ユーザーは初期産物がＢＭかｍＡＰＨかを選択する。ＢＭが選択されている場合、処理を開始するために必要な５つのユーザー入力がある：（１）充填された希釈ＢＭ産物の体積（完全な充填には＋１０ｍＬ）、（２）測定された希釈後ヘマトクリット値、（３）充填に必要なステージ数（総希釈ＢＭ体積をステージごとに３００ｍＬで除算し、最も近い整数に切り上げ）、（４）枯渇（「ビーズ結合」）細胞を標的とする系列マーカーを発現する細胞の推定頻度、及び（５）アプリケーションバッグに充填された細胞の百万単位の数。入力後、デバイスは、デバイスへの充填が正確であることを確認するためにクランプと接続のいくつかのチェックを実行するようにユーザーに促し、自動化方法が開始される。開始したら、ＨＥＳ沈降が完了するまで、ユーザーインターフェイスは必要ない。ユーザーは、方法を続行するか、又は必要に応じてより長い沈降を許可するかを選択することができる。沈降が完了すると、ユーザーはＲＢＣの除去を開始するように促され、ユーザーが減量されたＲＢＣの体積に満足するまで、漏斗付クライオバッグの底部から（複数のバッグを使用する場合は一度に１つずつ）移送されるＲＢＣの体積を入力する。ユーザーがＲＢＳの除去が十分であることを示すと、プログラムは自動的に継続して系列枯渇を開始する。系列枯渇が完了すると、標的細胞産物バッグには、形質導入のための所望の系列細胞画分が含まれ、チューブセットをヒートシールすることによりデバイスから取り外される。
ｍＡＰＨが選択された場合、処理を開始するために必要な２つのユーザー入力がある：（１）アプリケーションバッグに充填された細胞の百万単位の数、及び（２）枯渇（「ビーズ−結合」）細胞を標的とする系列マーカーを発現する細胞の推定頻度。入力後、デバイスは、デバイスへの充填が正確であることを確認するためにクランプと接続のいくつかのチェックを実行するようにユーザーに促し、自動化方法が開始される。ユーザーは、自動プログラムの開始時の２回のすすぎ工程でアプリケーションバッグを混合するように促される。このインターフェイスの後、系列枯渇過程が完了するまで、他のユーザーインターフェイスは必要ない。系列枯渇が完了すると、標的細胞産物バッグには、形質導入のための所望の系列画分が含まれ、チューブセットをヒートシールすることによりデバイスから取り外される。
患者１単独については、ＲＢＣ減量ＢＭ産物をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙデバイスから取り外し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ抗ＣＤ３４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）によって標識することによってさらに処理し、次いでＣＤ３４＋細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｌｕｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）において製造業者の推奨事項に従って免疫磁気ポジティブ選択を使用して精製した。患者２のＢＭ産物には、ＲＢＣ減量後のさらなる濃縮戦略は適用しなかった。患者３から初日に収集したｍＡＰＨ産物は、１ｍＭ濃度のＮＡＣの存在下でオービタルシェーカー上で一晩４°Ｃにおいて保持し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＰｒｏｄｉｇｙデバイスでのＲＢＣ減量及び系列枯渇のために翌日の２回目の収集と一緒にプールした。
形質導入。ＣＤ３４濃縮細胞を、４μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ；ＡＰＰ、Ｅａｓｔ Ｓｈａｕｍｂｕｒｇ、イリノイ）、各１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、トロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）及びＦｌｔ−３リガンド（ｒｈＦＬＴ３Ｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）並びに１ｍＭのＮ−アセチルシスチン（Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、テネシー）を補填したＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ブリティッシュコロンビア）において、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティング培養フラスコで１ｘ１０６細胞／ｍＬ及び２．９ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で培養した。細胞を、５〜１０感染単位（ＩＵ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で即時形質導入した。３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２で１２〜２４時間インキュベートした後、注入及び／又は分析のために細胞を回収した。
ＮＳＧマウスへの移植。すべての動物実験は、フレッド・ハッチ施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコル１８６４の下で実施した。ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒγｔｍｌＷｊ／Ｓｚｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスは、アメリカ実験動物認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）によって承認された病原体のない状態でフレッド・ハッチにおいて飼育された。８〜１２週齢のマウスに２７５ ｃＧｙ ＴＢＩを行った。ＴＢＩの４時間後、１％ヘパリン（ＡＰＰ）を含む２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク）に再懸濁した１ｘ１０６個の遺伝子改変総有核細胞（ＴＮＣ）を、尾静脈を介して注入した。血液試料を、眼窩後部穿刺によりエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）マイクロテイナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア）に収集し、分析前にＰＢＳで１：１に希釈した。剖検で、脾臓とＢＭを収集した。組織を７０μｍメッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で濾過し、ダルベッコのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）で洗浄した。
コロニー形成細胞アッセイ。形質導入された細胞産物を、下記を例外とした前述（Ｒａｄｔｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７；９（４１４））のメチルセルロース培地（Ｈ４２３０、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での標準コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ（Ｒａｄｔｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ。２０１７；９（４１４））において播種した：ＦＡＮＣＡ遺伝子機能を評価するために、ＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ）を０ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ又は２０ｎＭの濃度で添加した。完全なコロニーＤＮＡ抽出及びＰＣＲ方法については、次の項に記載する。
コロニー形成アッセイの方法。コロニー形成アッセイでは、２％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ）及び各１００ｎｇ／ｍＬの以下の成長因子を含むメチルセルロースにプレーティングした：ｒｈ−インターロイキン３（ＩＬ−３）、ｒｈＩＬ−６、ｒｈ−ＴＰＯ、ｒｈ−エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｒｈＳＣＦ、ｒｈ−顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びｒｈ−顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＴＰＯはＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入、ＥＰＯ、ＳＣＦ及びＧ−ＣＳＦは、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、カリフォルニアから購入、並びにＧＭ−ＣＳＦは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニアから購入した］。細胞を堅牢なコロニーの発達が達成されるまで１２〜１４日間培養し、コロニー数と表現型、ハローの出現を伴う濃い白いコロニーとして識別される顆粒球−単球（ＧＭ）コロニー、ヘモグロビン産生による明瞭な赤色として識別される赤血球（Ｅ）コロニー、又はヘモグロビン産生コロニーと白色コロニーの混合物によって識別される混合型（ＧＥＭＭ）コロニーとして評価した。個々のコロニーを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １．０（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ウィスコンシン）にも突いて採取した。６５℃で２０分間加熱した後、酵素反応を停止させるために、９９℃で１０分間加熱してゲノムＤＮＡを単離した。ＬＶ骨格に特異的なプライマー（フォワード、５’−ＡＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡ（配列番号５７）、リバース、５’−ＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡ（配列番号５８））を使用したＰＣＲによってＤＮＡを分析した。反応混合物を、最初の変性のために９４℃で２分間、続いて９４℃で１分間（変性）、６５℃で０．５分間（アニーリング）及び７２℃（伸長）の３８サイクル、最後に７２℃で１０分間（最終延長）のＰＣＲ条件に供した。ＤＮＡ試料を、内在性ＤＮＡ対照であるβ−アクチンに関する別の反応にも供した（フォワード、５’−ＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＣＴ（配列番号５９）；リバース、５’−ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴ（配列番号６０））。この反応混合物を、最初の変性のために９５℃で２分間、続いて９５℃で１分間（変性）、６２℃で１分間（アニーリング）及び７２℃（伸長）の３７サイクル、最後に７２℃で１０分間（最終延長）のＰＣＲ条件に供した。ＬＶ及びβ−アクチンの両方に対して予想されるバンドを含むコロニーを、形質導入に関してポジティブであるとスコア化した。β−アクチン産物を産生しなかった反応は、評価不能とみなした。
ベクターコピー数の定量的リアルタイムＰＣＲに基づく測定。ゲノム等価物あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）を、ＬＶ特異的プライマー／プローブの組み合わせ（フォワード、５’−ＴＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡ（配列番号６１）；リバース、５’−ＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＴＴＣＡＧ（配列番号６２）；プローブ、５’−ＡＧＣＴＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣ（配列番号６３；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、アイオワ））を用いた２連の反応で、並びにβ−グロビン特異的プライマー／プローブの組み合わせ（フォワード、５’−ＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ（配列番号６４）；リバース、５’−ＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴ（配列番号６５）；プローブ、５’−ＴＧＧＣＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴＡ（配列番号６６）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、アイオワ））を用いた別の反応で、ＴａｑＭａｎ ５’ヌクレアーゼ定量的リアルタイムＰＣＲアッセイによって評価した。２つの標準曲線を、同じＬＶ骨格の単一の組込み体を含むことが確認されたヒト細胞株（ＨＴ１０８０）から、及び健康なドナーから収集された末梢白血球から、両方のプライマー−プローブセットを独立して使用して単離されたｇＤＮＡの連続希釈によって確立した。
個々のコロニーｇＤＮＡ試料をマルチプレックスリアルタイムＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲに供し、ＬＶ特異的産物及び内在性対照を増幅させた（Ｔａｑｍａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｓｓａｙ ＲＮａｓｅＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ペンシルバニア）。平均ＶＣＮが０．５以上の試料を、形質導入されたとみなした。
造血サブセットのフローサイトメトリー分析。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ又はＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア製）で染色細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０．０．８（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ、オレゴン）を使用して分析した。分析は最大２０，０００個の細胞に対して実施した。ゲートを、フル・マイナス・ワン（ｆｕｌｌ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）染色対照を使用して確立した。
抗体には、抗ヒトＣＤ３４（クローン５６３）、ＣＤ１６（クローン３Ｇ８）、ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（クローンＬ２００）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア；ＣＤ１４（クローン６１Ｄ３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ペンシルバニア）；ＣＤ１９（クローン４Ｇ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）；ＣＤ９０（クローン５Ｅ１０）、ＣＤ２０（クローン２Ｈ７）、ＣＤ１５（クローンＷ６Ｄ３）、すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）；ＣＤ１３３（クローン２９３Ｃ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ａｕｂｕｒｎ、カリフォルニア）；ＣＤ４５（クローンＤ０５８−１２８３）及びＣＤ４５ＲＡ（クローン５Ｈ９）、どちらもＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア）が含まれた。
マウス試料の場合、抗体は抗マウスＣＤ４５−Ｖ５００（５６１４８７、クローン３０−Ｆ１１）、抗ヒトＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（３４７４６４、クローン２Ｄ１）、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（５５５３３２、クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４−Ｖ４５０（５６０３４５、クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８−ＡＰＣＣｙ７（５５７８３４、クローンＳＫ１）、ＣＤ２０−ＰＥ（５５５６２３、クローン２Ｈ７）及びＣＤ１４−ＡＰＣ（５５５８２４、クローン５８１）、すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡであった。
結果。ＦＡ−Ａ ＢＭ及びｍＡＰＨにおいて減少したＣＤ３４Ｈｉ発現細胞。登録された２人の患者に、入手可能なＣＤ３４＋ＨＳＰＣを収集するためにＢＭ採取を行った（患者１及び２）。３番目の患者には、フィルグラスチムとプレリキサフォルを用いて動員して、次いでＰＢ白血球除去療法を行った（患者３）。３人の患者全員が、収集及び治療前のＢＭ吸引物のスクリーニングで、並びにＣＤ３４＋細胞の単離及び遺伝子導入のために収集された細胞産物において、健康なドナーのＢＭ産物と比較してＣＤ３４発現及びＣＤ３４＋細胞の推定数の減少を示した（図２Ａ−２Ｆ）。２つのＣＤ３４発現レベル、ＣＤ３４Ｌｏ（平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝３，５１２±６２７）及びＣＤ３４Ｈｉ（ＭＦＩ＝２０，０７０±５，００８）が観察された。注目すべきことに、ＣＤ３４Ｈｉ細胞の割合は、健康なドナーで観察されたものと比較してＦＡ−Ａ患者で著しく減少していた（図２Ａ−２Ｆ）。
ＦＡ−Ａ ＣＤ３４Ｈｉ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの再増殖能を示したが、ＣＤ３４Ｌｏ細胞は示さなかった。どのＣＤ３４＋細胞が再増殖能を示したかを判定するために、ＣＦＣ能を代理として使用した。これには、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ用にＣＤ３４Ｌｏ及びＣＤ３４Ｈｉ細胞をフロー選別するのに十分な血液産物が必要であった。患者３から収集されたｍＡＰＨ産物のみがこの研究に十分であった。直接比較するために、ＣＤ３４Ｌｏ及びＣＤ３４Ｈｉ細胞を、健康なドナーｍＡＰＨ産物から選別精製した。ＦＡ−Ａ患者由来のＣＤ３４Ｈｉ細胞のみがコロニー形成能を示した（図３Ａ）。健康なドナーでは、ＣＤ３４Ｈｉ細胞はまた、ＣＤ３４Ｌｏ細胞と比較してより高いＣＦＣ能力を示し、ＦＡ−Ａ患者と比較してはるかに高いレベルであった（図３Ｂ）。これらのデータは、再増殖能がＣＤ３４Ｈｉ細胞画分に限定されていることを示唆しており、遺伝子導入法のためにこれらの細胞を可能な限り多く保存する必要があることを強調している。
現在の臨床精製プロトコルでのＦＡ−Ａ ＣＤ３４Ｈｉ細胞の大幅な損失。ＣＤ３４＋細胞濃縮の現在の臨床標準は、ＣＤ３４Ｈｉ細胞の収集に最適化されている。しかし、患者１では、このプロトコルを使用したＣＤ３４＋細胞の直接濃縮は非効率的であり、結果として収量は２９％であり、遺伝子導入に利用可能な総ＣＤ３４＋細胞はわずか９．４×１０６であった（図４）。さらに、濃縮細胞産物の純度はわずか５９．６％であり、培養及び遺伝子導入中に生細胞の５０％の損失が観察された。得られた遺伝子改変細胞は、コロニー形成能力を保持し、ＬＶ媒介ＦＡＮＣＡ遺伝子導入後のＭＭＣに対する獲得耐性を示した（図５）。
患者２では、ＣＤ３４の直接濃縮及び遺伝子導入の際の推定損失は、形質導入に利用可能な細胞産物が患者１で観察されるよりも低いレベルに低下すると予想された。したがって、ＣＤ３４の直接濃縮工程を排除し、赤血球（ＲＢＣ）枯渇ＢＭ産物全体を形質導入可能にするための緊急の修正をＦＤＡに提出した。この処理の変更により、ＣＤ３４＋細胞がより多く保存され（図４）、形質導入及び生存率が改善されたが（図５）、法外な量（８０ｍＬ）の濃縮された臨床グレードのＬＶベクターが必要であった。合せて、これらのデータは、ＦＡ−Ａ患者由来の標的ＣＤ３４＋細胞の最小限の操作が、ｉｎ ｖｉｖｏでの収量、遺伝子導入効率及び機能を改善できるが、実行可能なＬＶ使用を達成するために非標的細胞の数を減らす必要があることを示唆していた。
系列＋細胞を枯渇させる新規な戦略の開発。非標的成熟Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球及び顆粒球を枯渇させると、ＣＤ３４発現細胞を直接標識、選択又は洗浄することがないので、最小限の操作で貴重なＣＤ３４＋細胞を保持しながら、ＢＭ細胞産物の形質導入に必要なＬＶの量が減少すると仮定した（図６）。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）デバイス（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１３１７３）を使用して細胞の選択と遺伝子導入を自動化する以前の研究に基づいて、カスタマイズされた自動ＲＢＣ減量及び免疫磁気ビーズベースの系列枯渇戦略を設計した。このアプローチでは、４種の異なるビーズ結合抗体試薬：抗ＣＤ３（Ｔ細胞除去）、抗ＣＤ１４（単球除去）、抗ＣＤ１６（顆粒球及びＮＫ細胞除去）及び抗ＣＤ１９（Ｂ細胞除去）を使用した。このプロトコルは、ＢＭ産物及びｍＡＰＨ産物の両方のために設計した。
系列枯渇は、利用可能なＣＤ３４＋細胞を保存し、ＬＶ媒介遺伝子導入のためにＴＮＣを実行可能な数に減少させる。合計９種のＢＭ及び１０種のｍＡＰＨ産物を処理して、方法の有効性を確立した。ＢＭ ＣＤ４５＋細胞の平均６０％及びｍＡＰＨ ＣＤ４５＋細胞の５０％が、４つの標的マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６又はＣＤ１９）のうちの１つを発現した（それぞれ図７Ａ及び図７Ｂ）。これらの産物のＣＤ３４＋細胞含有量は、ＢＭ中で０．３５％〜１．４％、ｍＡＰＨ産物中で０．０６％〜０．９％の範囲であった。ＢＭ産物の平均方法実行時間は１０時間であったが、ｍＡＰＨ産物は１３時間かけて処理された。観察されたＴＮＣの減少は、系列枯渇後のＢＭ及びｍＡＰＨ産物の両方で１ｌｏｇであった（図８Ａ）。すべての標的系列＋細胞は初期の１０％未満まで枯渇し、ＣＤ３４＋細胞はＢＭ産物では９０％超、ｍＡＰＨ産物では７０％超保持された（図８Ｂ）。ＢＭ ＣＤ３４＋細胞の２４％は標準的なメチルセルロースアッセイにおいてコロニーを形成し、一方、ｍＡＰＨ ＣＤ３４＋細胞は５１％がコロニーを形成した（図８Ｃ、図９Ａ〜９Ｄ）。しかし、ＦＡ−Ａ患者細胞に対して提案された同じプロトコルを使用したこれらの細胞のＬＶ形質導入後、両方の細胞産物タイプ由来のＣＦＣへの５０％の遺伝子導入率が一貫して観察された（図８Ｄ）。単一コロニーの分析により、ＶＣＮ／ＣＦＣの平均はＢＭ ＣＤ３４＋細胞では０．７、ｍＡＰＨ ＣＤ３４＋細胞では１．６が示された。ＶＣＮをまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０日間培養されたバルク形質導入細胞で評価し、ＢＭ及びｍＡＰＨ産物の両方について平均値５を示した（図８Ｅ）。マイコプラズマと無菌性に関して試験した最終細胞産物はネガティブであり、エンドトキシン試験は患者の注入基準内の値を示した。６つのｍＡＰＨ及びＢＭ産物由来の系列枯渇細胞及び形質導入細胞はそれぞれ、１×１０６ ＴＮＣ／マウスの標的細胞用量でＮＳＧマウスに注入された。平均して、ＢＭ産物のＣＤ３４＋細胞用量／マウスは２．８６×１０４ ＣＤ３４＋細胞（ＳＥＭ＝６．６７×１０３）であり、ｍＡＰＨ産物については１．０８×１０５ ＣＤ３４＋細胞（ＳＥＭ＝１．４５×１０４）であった。ＰＢ ＷＢＣについてのフローサイトメトリー分析を使用して、経時的な生着（ヒトＣＤ４５＋）及びＴ細胞（ヒトＣＤ３＋）、Ｂ細胞（ヒトＣＤ２０＋）及び単球（ヒトＣＤ１４＋）への系列発生を評価した（図８Ｆ）。ｍＡＰＨとＢＭ産物は両方とも、２０週間にわたるモニタリングで長期生着を示した。ＢＭから精製され、同様の細胞用量で注入されたＣＤ３４＋細胞による生着レベルは、Ｗｉｅｋｍｅｉｊｅｒら（Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ．２０１４；３（３）：１１０−１１６）により報告された結果に匹敵した。
系列枯渇細胞産物を、ＣＤ３４濃縮産物と同等に異種移植（ｘｅｎｏｅｎｇｒａｆｔ）する。この実施例では、健康なドナーのＢＭ産物を２つのアリコートに分割した。一方は系列を枯渇させ、他方はＣＤ３４を濃縮した。得られた細胞集団に同一の条件下で同じＬＶベクターを形質導入し、ＮＳＧマウスに同等のＣＤ３４＋細胞用量で注入した。ＣＤ３４の選択と比較して、系列枯渇でより高いＣＤ３４＋細胞の保持が観察されたが、形質導入効率やコロニー形成能に他の違いは観察されなかった（図１０Ａ、１０Ｂ）。ＣＤ３４選択細胞を与えられたマウスと比較して、形質導入された系列枯渇細胞を与えられたマウスにおけるヒトＣＤ４５＋血球生着のレベルはわずかに高いが、有意差は認められなかった。ＣＤ３４選択細胞産物を与えられたマウスと比較して、系列枯渇細胞産物を与えられたマウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞の生着のより高い安定性も観察された（図１０Ｃ）。
系列枯渇プロトコルは、限定されたＦＡ ＣＤ３４Ｈｉ細胞を保存する。これらのデータはまとめて、系列枯渇が利用可能なＣＤ３４＋細胞を保存し、形質導入効率又は細胞適合性を損なうことなく、形質導入のためのＴＮＣ数を実現可能な数に減らしたことを示唆している。ＦＤＡの承認の下、臨床プロトコルは、ＢＭ産物及びｍＡＰＨ産物の両方、並びにＣＤ３４＋細胞濃縮の方法として系列枯渇を含むように改変された。改変されたプロトコルで最初に治療された患者３は、相補性研究によりＦＡ−Ａが確認された５歳の男子であった。ベースライン好中球は平均１．７Ｋ／ｍｃＬであり、ベースライン血小板は治療の６ヶ月前で平均３２Ｋ／ｍｃＬであり、好中球及び血小板は過去２年間にわたって減少している（図１１Ａ〜１１Ｃ）。１０個以上のＣＤ３４＋細胞／μＬ ＰＢの動員が達成され、２回の連続したアフェレーシス収集により、合計１．６ｘ１０８のＣＤ３４＋細胞を含む８．５ｘ１０１０のＴＮＣが得られた（図４及び１２Ａ）。カラムの制限により、５×１０１０ＴＮＣ（９．５×１０７の総ＣＤ３４＋細胞に相当）を系列枯渇に供し、残りは凍結保存した。系列枯渇により、ＴＮＣが９４％減少し、利用可能なＣＤ３４＋細胞が５６％保持された。ＣＤ３４の純度は１．６％であり、患者１及び２と比較して、形質導入及び注入に利用可能なＣＤ３４＋細胞／ｋｇの総数が１〜２ｌｏｇ倍数増加した（図４）。合計５２．８×１０６のＣＤ３４＋細胞に５ ＩＵ／細胞で形質導入し、最終細胞用量は２．４×１０６総ＣＤ３４＋細胞／ｋｇが得られ、トリパンブルー色素排除に基づいて生存率は９９．３％であった。この細胞産物中のＣＦＣの２６％が形質導入され、平均ＶＣＮは１（０．９）を示した（図５）。他のすべての注入基準が満たされたが、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）ラピッドテストを使用したマイコプラズマの偽陽性結果が観察され、ｑＰＣＲアッセイの陰性結果によって確認された。したがって、限られたＣＤ３４＋細胞を、形質導入効率を損なうことなくＦＡ−Ａ患者由来の血液産物の系列枯渇を使用して、間接的に濃縮した。
細胞産物は、合併症を起こすことなく再注入された。患者は、動員及び白血球除去療法の際に合計２回の血小板輸血及び２回の濃縮血球輸血パックを必要とした（図１２Ｂ）。患者は、注入後５日で始まり注入後３６日で終了する追加の５回の血小板輸血を受けた（図１２Ｃ）。低ヘマトクリットの場合、注入後１５日目及び２８日目に濃縮血球輸血パックを２回追加投与した。
当業者によって理解されるように、本明細書に開示される各実施形態は、その特定の記載された要素、工程、構成要素若しくは成分を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなり得る。したがって、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）、又は本質的からになる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」と列挙していると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という移行用語には、不特定の要素、工程、構成要素又は成分を含むことを意味するが、これらに限定されるものではない。移行句「からなる」は、指定されていない任意の要素、工程、構成要素又は成分を除外する。「本質的からになる」という移行句は、実施形態の範囲を、特定の要素、工程、構成要素又は成分、及びこの実施形態に重大な影響を及ぼさないものに限定する。重大な影響とは、本明細書に記載のシステム及び方法のＣＤ３４＋細胞のネガティブ選択を達成する能力の低下を引き起こすものである。
特に他のことが明記されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される構成要素の量、分子量などの特性、反応条件などを表すすべての数字は、すべての場合に「約」という用語によって修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本発明によって取得することが求められる所望の特性に応じて変わり得る近似値である。少なくとも、及び特許請求の範囲に対する等価物の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された有効桁数を考慮して、通常の端数処理技法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。さらに明確にする必要がある場合、「約」という用語は、記載された数値又は範囲と組み合わせて使用される場合、当業者によって合理的に割り当てられた意味を有する、すなわち、記載された値の±２０％、記載された値の±１９％、記載された値の±１８％、記載された値の±１７％、記載された値の±１６％、記載された値の±１５％、記載された値の±１４％、記載された値の±１３％、記載された値の±１２％、記載された値の±１１％、記載された値の±１０％、記載された値の±９％、記載された値の±８％、記載された値の±７％、記載された値の±６％、記載された値の±５％、記載された値の±４％、記載された値の±３％、記載された値の±２％又は記載された値の±１％の範囲内の記載された値又は範囲よりもいくぶん大きいか又はいくぶんか小さいことを表す。
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値は可能な限り正確に報告されている。ただし、数値には、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に生じる特定の誤差が本質的に含まれている。
用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲で）使用される類似の指示対象は、特に他のことが明記されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る個々の値を個別に参照する簡略表記方法として機能することを意図している。本明細書において特に他のことが明記されない限り、各個別の値は、あたかも個別に本明細書に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明されるすべての方法は、特に他のことが明記されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言語は、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
本明細書に開示された本発明の代替の要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書で見出される他の要素との任意の組み合わせで、参照及び特許請求することができる。グループの１以上のメンバーが、利便性及び／又は特許性の理由でグループに含まれたり、グループから削除されたりすることが予想される。そのような包含又は削除が発生した場合、本明細書は、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述を満たすように修正されたグループを含むとみなされる。
本明細書では、本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む本発明の特定の実施形態が記載される。当然のことながら、これらの記載された実施形態の変形は、前述の説明を読むことにより当業者には明らであろう。発明者は、当業者が必要に応じてそのような変形を使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法で許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修正及び等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、特に他のことが明記されない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
さらに、本明細書全体を通じて、特許、印刷出版物、雑誌記事及び他の書面のテキストに対して多くの参照が行われている（参照資料）。参照資料のそれぞれは、参照された教示のために、その全体が参照により本明細書に個別に組み込まれている。
最後に、本明細書で開示される本発明の実施形態が、本発明の原理の例示であることを理解されたい。採用され得る他の修正は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替構成を本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は、示され説明されたとおりのものに限定されない。
本明細書に示される詳細は、例としてであり、本発明の好ましい実施形態の例示的な説明のみを目的としており、本発明のさまざまな実施形態の原理及び概念的態様の最も有用及び容易に理解されると考えられるものを提供するために提示される。その際、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細を示す試みは行われず、図面及び／又は実施例の説明は、本発明のいくつかの形態がどのように実際に具体化され得るかを当業者に明らかにする。
本開示で使用される定義及び説明は、以下の実施例で明白及び明確に変更されない限り、又は意味の適用が任意の構造を無意味又は本質的に無意味にする場合を除き、将来の任意の構造において制御されることを意味及び意図する。用語の構成が定義及び説明を無意味又は本質的に無意味にする場合、定義はＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、又は当業者に公知の辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ．Ａｔｔｗｏｏｄ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００６）から解釈されるべきである。

Claims (82)

  1. 脆弱なＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を有する対象を同定する工程；
    脆弱なＣＤ３４＋細胞を含む生体試料を前記対象から取得する工程；
    ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞のみを前記生体試料から除去する工程；
    前記生体試料内に残ったＣＤ３４＋細胞を、治療用遺伝子を含むウイルスベクターを前記残ったＣＤ３４＋細胞のゲノムに挿入することによって遺伝子改変する工程；並びに
    前記遺伝子改変されたＣＤ３４＋細胞を、前記対象への投与のために製剤化する工程を含む、方法。
  2. 前記対象がファンコーニ貧血を有するヒト患者である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記除去する工程により、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞が、合せて少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生体試料中の出発ＣＤ３４＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも９０％が、保持される、請求項１に記載の方法。
  5. 保持されたＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ−及びＣＤ９０＋である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記除去する工程の後に、前記生体試料中に間葉系幹細胞が残る、請求項１に記載の方法。
  7. 治療用遺伝子が、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ又はＦａｎｃＷを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記除去する工程が、ＣＤ３に結合する結合タンパク質、ＣＤ１４に結合する結合タンパク質、ＣＤ１６に結合する結合タンパク質及びＣＤ１９に結合する結合タンパク質からなる結合タンパク質と、前記生体試料を接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 結合タンパク質が、抗体又はその結合断片を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 結合タンパク質が、磁気ビーズ、フルオロフォア及び／又は親和性タグに結合されている、請求項８に記載の方法。
  11. 前記除去する工程が、磁気分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）、ナノ選別、アフィニティークロマトグラフィー、パニング及び／又は選択的凝集を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＪＳ−８３、クローンＨＩ１００、抗ＣＤ４５ＲＡ［ＭＥＭ−５６］、クローンＵＣＨＴ１、クローンＳＫ７、クローンＯＫＴ３、クローンＣＤ３−１２、クローン６１Ｄ３、クローンＨＣＤ１４、クローン６３Ｄ３、クローンＭ５Ｅ２、クローン３Ｇ８、クローンＬＮＫ１６、クローンＤＪ１３０ｃ、クローンＫＤ１、クローン４Ｇ７、クローンＨＩＢ１９、クローンＬＴ１９及びクローンＦＭＣ６３から選択される、請求項９に記載の方法。
  13. 前記抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＵＣＨＴ１、クローン６１Ｄ３、クローン３Ｇ８及びクローン４Ｇ７からなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記遺伝子改変が、５〜１０感染単位（ＩＵ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記レンチウイルスベクターが、自己不活性化レンチウイルスベクターである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記レンチウイルスベクターが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータを含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記ヒトＰＧＫプロモータが、配列番号５６を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記生体試料が、骨髄試料又は動員末梢血試料である、請求項１に記載の方法。
  20. 治療的又は実験的目的のために、ネガティブ選択を利用して、アクセサリー細胞を含むＣＤ３４＋細胞集団を形成する工程を含む方法であって、
    骨髄試料又は動員末梢血試料を取得する工程；
    ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及び／又はＣＤ１９＋細胞を生体試料から除去する工程；
    を含み、
    これにより、治療的又は実験的目的のために、ネガティブ選択を利用して、アクセサリー細胞を含むＣＤ３４＋細胞集団を形成する方法。
  21. ＣＤ４５ＲＡ＋細胞のみを除去する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞を除去する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  23. ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ１９＋細胞を除去する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  24. ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１９＋細胞のみを除去する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記アクセサリー細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２０に記載の方法。
  26. 前記除去する工程により、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞が、合せて少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少する、請求項２０に記載の方法。
  27. 前記生体試料中の出発ＣＤ３４＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも９０％が、保持される、請求項２０に記載の方法。
  28. 保持されたＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ−及びＣＤ９０＋である、請求項２７に記載の方法。
  29. ＣＤ３４＋細胞集団内のＣＤ３４＋細胞を遺伝子改変する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  30. 前記遺伝子改変する工程が、レンチウイルスベクターを形質導入する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記レンチウイルスベクターが、自己不活性化レンチウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記レンチウイルスベクターが、配列番号３１〜３５、４１〜４３及び４６〜５０から選択される配列を含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記レンチウイルスベクターが、配列番号３６〜４０、４４、４５及び５１〜５５から選択されるタンパク質をコードする配列を含む、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記レンチウイルスベクターが、治療用遺伝子を含む、請求項３０に記載の方法。
  35. 前記治療用遺伝子が、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ、ＦａｎｃＷ、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ、ＳＬＣ４６Ａ１、Ｆ８、Ｆ９、ＩＤＵＡ、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ−１、ＢＤＮＦ、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ−１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ−１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ−１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ−４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ １、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ ２１、Ｇｅｎｅ ２６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１ ＩＬ−１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ−１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ−３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭ Ａ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ−ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ−１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、α２β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６３、ＢＯＢ／ＧＰＲ１５、Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ−３３／ＴＹＭＳＴＲ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＸＣＲ４、アミノペプチダーゼ−Ｎ、ＨＨＶ−７、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ、ＨｖｅＡ、α−ジストログリカン、ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ、ＰＶＲ、ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、可溶性ＣＤ４０、ＣＴＬＡ、Ｆａｓ Ｌ、グロビンファミリー遺伝子、ＷＡＳ、ｐｈｏｘ、ジスロトフィン、ピルビン酸キナーゼ、ＣＬＮ３、ＡＢＣＤ１、アリールスルファターゼＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＮＬＸ２．１、ＡＢＣＡ３、ＧＡＴＡ１、リボソームタンパク質遺伝子、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＣ、ＤＫＣ１、ＴＩＮＦ２、ＣＦＴＲ、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＡＰＰ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ユビキリン２、Ｃ９ＯＲＦ７２及び／又はＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６に対する抗体；ＴＮＦ；自己反応性Ｔ細胞に特異的に存在するＰ５３、ＰＴＰＮ２２、ＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２若しくはＴＣＲ；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２；ＩＬ−１３；ＩＬ−１Ｒａ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；及び／又はｓＴＮＦＲＩＩを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記除去する工程が、前記生体試料を、ＣＤ４５ＲＡに結合する結合タンパク質、ＣＤ３に結合する結合タンパク質、ＣＤ１４に結合する結合タンパク質、ＣＤ１６に結合する結合タンパク質及び／又はＣＤ１９に結合する結合タンパク質を含む結合タンパク質と接触させる工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  37. 結合タンパク質が、抗体又はその結合断片を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 結合タンパク質が、磁気ビーズ、フルオロフォア及び／又は親和性タグに結合されている、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記除去する工程が、磁気分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）、ナノ選別、アフィニティークロマトグラフィー、パニング及び／又は選択的凝集を実施する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  40. 前記抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＪＳ−８３、クローンＨＩ１００、抗ＣＤ４５ＲＡ［ＭＥＭ−５６］、クローンＵＣＨＴ１、クローンＳＫ７、クローンＯＫＴ３、クローンＣＤ３−１２、クローン６１Ｄ３、クローンＨＣＤ１４、クローン６３Ｄ３、クローンＭ５Ｅ２、クローン３Ｇ８、クローンＬＮＫ１６、クローンＤＪ１３０ｃ、クローンＫＤ１、クローン４Ｇ７、クローンＨＩＢ１９、クローンＬＴ１９及び／又はクローンＦＭＣ６３を含む、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＵＣＨＴ１、クローン６１Ｄ３、クローン３Ｇ８及び／又はクローン４Ｇ７を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記除去する工程の前に、前記生体試料から赤血球を除去する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  43. 前記生体試料が、骨髄試料であり、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含む細胞培養培地で前記骨髄試料を希釈して、２５％以下のヘマトクリット値を得る工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  44. 硫酸プロタミン、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド及びＮ−アセチルシステインを補填した培地におけるネガティブ選択後に前記生体試料中に保持されたＣＤ３４＋細胞を培養する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  45. ＣＤ３４＋細胞を、対象への投与のために製剤化する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  46. 脆弱なＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）集団、ＣＤ３４＋ｌｏ ＨＳＣ集団、原発性免疫不全、続発性免疫不全及び／又はがんを有する対象を同定する工程；
    ＣＤ３４＋細胞を含む生体試料を前記対象から取得する工程；
    ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及び／又はＣＤ１９＋細胞を前記生体試料から除去する工程；並びに
    前記生体試料内に残ったＣＤ３４＋細胞を、治療用遺伝子をコードする核酸をゲノム内に挿入することによって遺伝子改変する工程を含む、方法。
  47. 前記遺伝子改変されたＣＤ３４＋細胞を、前記対象への投与のために製剤化する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記対象が、ファンコーニ貧血、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）又は先天性角化異常症を有するヒト患者である、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記続発性免疫不全が、ＨＩＶによって引き起こされる、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記がんが白血病である、請求項４６に記載の方法。
  51. 前記除去する工程により、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ１９＋細胞が、合せて少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少する、請求項４６に記載の方法。
  52. 前記生体試料中の出発ＣＤ３４＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも９０％が保持される、請求項４６に記載の方法。
  53. 保持されたＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ−及びＣＤ９０＋である、請求項５２に記載の方法。
  54. 間葉系幹細胞が、前記除去する工程の後に前記生体試料中に残る、請求項４６に記載の方法。
  55. 前記遺伝子改変する工程が、５〜１０感染単位（ＩＵ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
  56. 前記遺伝子改変する工程が、レンチウイルスベクターを形質導入する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
  57. 前記レンチウイルスベクターが、自己不活性化レンチウイルスベクターである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記レンチウイルスベクターが、配列番号３１〜３５、４１〜４３及び４６〜５０から選択される配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記レンチウイルスベクターが、配列番号３６〜４０、４４、４５及び５１〜５５から選択されるタンパク質をコードする配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記除去する工程が、ＣＤ４５ＲＡに結合する結合タンパク質、ＣＤ３に結合する結合タンパク質、ＣＤ１４に結合する結合タンパク質、ＣＤ１６に結合する結合タンパク質及び／又はＣＤ１９に結合する結合タンパク質を含む結合タンパク質と、前記生体試料を接触させる工程を含む、請求項４６に記載の方法。
  61. 結合タンパク質が、抗体又はその結合断片を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 結合タンパク質が、磁気ビーズ、フルオロフォア及び／又は親和性タグに結合されている、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記除去する工程が、磁気分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）、ナノ選別、アフィニティークロマトグラフィー、パニング及び／又は選択的凝集を実施する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
  64. 前記抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＪＳ−８３、クローンＨＩ１００、抗ＣＤ４５ＲＡ［ＭＥＭ−５６］、クローンＵＣＨＴ１、クローンＳＫ７、クローンＯＫＴ３、クローンＣＤ３−１２、クローン６１Ｄ３、クローンＨＣＤ１４、クローン６３Ｄ３、クローンＭ５Ｅ２、クローン３Ｇ８、クローンＬＮＫ１６、クローンＤＪ１３０ｃ、クローンＫＤ１、クローン４Ｇ７、クローンＨＩＢ１９、クローンＬＴ１９及び／又はクローンＦＭＣ６３を含む、請求項６１に記載の方法。
  65. 前記抗体が、クローン５Ｈ９、クローンＵＣＨＴ１、クローン６１Ｄ３、クローン３Ｇ８及びクローン４Ｇ７を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 請求項１〜６５のいずれかに記載のネガティブ選択の後に生体試料中に保持されたＣＤ３４＋細胞を含む、治療用細胞製剤。
  67. 請求項１〜６６のいずれかに記載のネガティブ選択の後に生体試料中に保持されたＣＤ３４＋細胞を含み、請求項１〜６６のいずれかに記載の遺伝子改変を含む、治療用細胞製剤。
  68. ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１９に結合する１以上のタンパク質；
    培養培地；並びに
    ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ、ＦａｎｃＷ、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ、ＳＬＣ４６Ａ１、Ｆ８、Ｆ９、ＩＤＵＡ、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ−１、ＢＤＮＦ、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ−１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ−１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ−１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ−４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ １、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ ２１、Ｇｅｎｅ ２６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１ ＩＬ−１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ−１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ−３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭ Ａ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ−ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ−１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、α２β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６３、ＢＯＢ／ＧＰＲ１５、Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ−３３／ＴＹＭＳＴＲ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＸＣＲ４、アミノペプチダーゼ−Ｎ、ＨＨＶ−７、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ、ＨｖｅＡ、α−ジストログリカン、ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ、ＰＶＲ、ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、可溶性ＣＤ４０、ＣＴＬＡ、Ｆａｓ Ｌ、グロビンファミリー遺伝子、ＷＡＳ、ｐｈｏｘ、ジスロトフィン、ピルビン酸キナーゼ、ＣＬＮ３、ＡＢＣＤ１、アリールスルファターゼＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＮＬＸ２．１、ＡＢＣＡ３、ＧＡＴＡ１、リボソームタンパク質遺伝子、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＣ、ＤＫＣ１、ＴＩＮＦ２、ＣＦＴＲ、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＡＰＰ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ユビキリン２、Ｃ９ＯＲＦ７２及び／又はＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６に対する抗体；ＴＮＦ；自己反応性Ｔ細胞に特異的に存在するＰ５３、ＰＴＰＮ２２、ＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２若しくはＴＣＲ；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２；ＩＬ−１３；ＩＬ−１Ｒａ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；及び／又はｓＴＮＦＲＩＩから選択される治療用遺伝子を含むウイルスベクターを含む、キット。
  69. 結合するタンパク質が、ＣＤ４５ＲＡに結合するタンパク質からなる、請求項６８に記載のキット。
  70. 結合するタンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９に結合するタンパク質からなる、請求項６８に記載のキット。
  71. 結合するタンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ１４及びＣＤ１９に結合するタンパク質からなる、請求項６８に記載のキット。
  72. 治療用遺伝子が、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ及びＦａｎｃＷを含む、請求項６８に記載のキット。
  73. 硫酸プロタミン、ヒト幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ−３リガンド及びＮ−アセチルシステインのうち１つ以上を含む、請求項６８に記載のキット。
  74. 動員因子を含む、請求項６８に記載のキット。
  75. 動員因子が、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＡＭＤ３１００及び化学療法剤から選択される、請求項７４に記載のキット。
  76. 結合タンパク質が、クローン５Ｈ９、クローンＪＳ−８３、クローンＨＩ１００、抗ＣＤ４５ＲＡ［ＭＥＭ−５６］、クローンＵＣＨＴ１、クローンＳＫ７、クローンＯＫＴ３、クローンＣＤ３−１２、クローン６１Ｄ３、クローンＨＣＤ１４、クローン６３Ｄ３、クローンＭ５Ｅ２、クローン３Ｇ８、クローンＬＮＫ１６、クローンＤＪ１３０ｃ、クローンＫＤ１、クローン４Ｇ７、クローンＨＩＢ１９、クローンＬＴ１９及び／又はクローンＦＭＣ６３を含む、請求項６８に記載のキット。クローン５Ｈ９、クローンＵＣＨＴ１、クローン６１Ｄ３、クローン３Ｇ８及び／又はクローン４Ｇ７を含む。
  77. 磁気ビーズ、フルオロフォア及び／又は親和性タグをさらに含む、請求項６８に記載のキット。
  78. 骨髄試料又は動員末梢血試料を取得するための医療用品をさらに含む、請求項６８に記載のキット。
  79. チューブセットをさらに含む、請求項６８に記載のキット。
  80. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６８記載のキット。
  81. 前記レンチウイルスベクターが、自己不活性化レンチウイルスベクターである、請求項８０に記載のキット。
  82. 対象への投与のために細胞を製剤化する培地をさらに含む、請求項６８に記載のキット。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3980036A4 (en) * 2019-06-06 2023-01-25 Medeor Therapeutics, Inc. PROCEDURE FOR PRODUCTION OF CELL PRODUCTS BY POST-MORTEM MOBILIZATION AND RECOVERY OF HEMATOPOETIC CELLS
US20230183370A1 (en) * 2020-04-03 2023-06-15 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Stem cell immunomodulatory therapy for covid-19 infection
WO2022032226A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Spacecraft Seven, Llc Plakophilin-2 (pkp2) gene therapy using aav vector

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005528319A (ja) * 2001-07-10 2005-09-22 ジョンソン・アンド・ジョンソン・リサーチ・プロプライエタリー・リミテッド 造血前駆細胞を遺伝的に改変する方法及び改変された細胞の使用
JP2014530002A (ja) * 2011-09-23 2014-11-17 ブルーバードバイオ， インコーポレイテッド 改善された遺伝子治療方法
WO2016118780A1 (en) * 2015-01-21 2016-07-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Point-of-care and/or portable platform for gene therapy

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004520448A (ja) * 2001-05-30 2004-07-08 ガンブロ、 インコーポレイテッド 酸化防止剤を使用するウイルスの不活性化法
US20060051755A1 (en) * 2002-04-15 2006-03-09 Rigel Pharmaceuticals Methods of assaying for cell cycle modulators
US9381210B2 (en) * 2013-04-15 2016-07-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Induced pluripotent stem cell model of chronic myeloid leukemia revealed olfactomedin 4 as a novel therapeutic target in leukemia stem cells
US9789162B2 (en) * 2014-11-05 2017-10-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Veteran Affairs Systemic and local ex vivo gene therapy of the skeleton

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005528319A (ja) * 2001-07-10 2005-09-22 ジョンソン・アンド・ジョンソン・リサーチ・プロプライエタリー・リミテッド 造血前駆細胞を遺伝的に改変する方法及び改変された細胞の使用
JP2014530002A (ja) * 2011-09-23 2014-11-17 ブルーバードバイオ， インコーポレイテッド 改善された遺伝子治療方法
WO2016118780A1 (en) * 2015-01-21 2016-07-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Point-of-care and/or portable platform for gene therapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD CANCER JOURNAL, 2011, VOL.1, E36, JPN6022011403, ISSN: 0004737293 *
MOLECULAR THERAPY, 2015, VOL.23, SUPPL.1, PP.S34-S35, JPN6022011400, ISSN: 0004737294 *

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