JPH08510134A - Ｈｉｖ感染およびエイズを対象としたリボザイム遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、polIIIプロモータの制御下において、抗HIV-型特異的因子をコードしている核酸を有する5'側および3'側の長鎖末端部反復配列間に挿入された感染型レトロウイルスを提供する。本発明におけるレトロウイルスベクターを含有する宿主細胞も本発明に含有される。さらには、HIBに感染したか、または感染されると予測される細胞中においてHIVウイルスの複製に干渉または抑制を及ぼす方法についても提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 HIV感染およびエイズを対象としたリボザイム遺伝子治療 この出願書類は、1993年5月17日において正式に提出された米国シリアル番号0 8/062,465の一部継続出願であり、上記内容の一部は援用してここに含まれる。 政府は、本発明について合衆国陸軍から授与された契約番号DAMD17-90-C-0094 に準じる権利を有する。 発明の背景 ＡＩＤＳは現在、ヒト免疫ウイルス（HIV）によって引き起こされることが判 明しており、世界的規模で公衆衛生を脅かすに至っている。これ以上の蔓延を防 ぐことは、米国および諸外国において最優先すべき健康上の課題である。HIVは 、1984年当初から、エイズの原因となる病原体であることが確認されてきたが、 エイズの治療及び予防に有効であるとして公表された薬品及びワクチンは数少な い。この病原体がそれ自体複雑さを呈していることに多くの原因がある。 HIVは体内で様々な組織及び細胞に感染する。さらに、細胞内に入ると、中枢 神経系の細胞内に入り込んで、症候疾病が表面化するまでに何年間も「隠れてい る」ことがある。 HIV感染者の臨床上の進行は、新たに感染した細胞が増してウイルスの発現が 続くか否かに依存している。よって、ウイルスの増殖を疫学的に明示することが 、抗HIV療法の開発に理論を提供することとなる。実際に、ウイルスの逆転写酵 素を阻害するヌクレオシドアナログには、臨床効果がみられる。しかし、これら 薬品固有の毒性と、治療過程における薬物耐性HIV変異体の発現は避けられない ために、この類の治療薬はエイズ療法として深く考慮されなかった。そのため、 新規かつ効果的な治療法の模索が続いている。 本発明では、今までのヌクレオチドにもとづくエイズの予防及び治療法の限界 を克服する、新規の抗HIVさらにはエイズ治療法を提供する。 発明の概要 本発明では、レトロウィルスの5'側長末端反復配列と3'側長末端反復配列の間 に、pol IIIプロモータの制御下の抗HIV特異的因子をコードする核酸が挿入された、感染 型レトロウイルスを提供する。本発明では、レトロウイルスのベクターを含有す る宿主細胞も提供する。さらには、HIV感染細胞内において、HIVによるウイルス の複製を抑制する方法についても言及する。この方法は、抗HIV特異的因子をコ ードしている核酸を含有するレトロウイルスベクターを使い、感染細胞の形質導 入を、細胞内でのベクターの形質導入及び当該因子の安定した発現に都合のよい 条件下において、行うものである。HIV感染に先だち、レトロウイルスベクター による形質導入を行うことも可能かもしれない。それができれば、HIV感染は予 防可能となる。 図面の簡単な説明 図１は、”Rz-1”としたHIV特異的リボザイム遺伝子（スケールは記載せず） を含んだ様々なプラスミド及びレトロウイルスベクターの図解を示す。各々のプ ラスミドの図解については、「発明の詳細な説明」を参照。 図2A〜Cは、一時的アッセイにおいて、抗HIV-1特異的リボザイムがHIV-1の発 現に及ぼす影響を示す。エフェクタープラスミド（援用して本明細書の一部にさ れているRatner，L．et al．AIDS Res．Hum．Retroviruses Vol 3:57-69（1987 ）によれば、pHXB2gpt）、及びレポータープラスミド（pC15CAT）は、pUC19、ま たはエフェクタープラスミド：レポータープラスミドの比が1:10μgとなるよう 、pβ-HR、pJT-HRまたはpJV-HRがそれぞれ含まれている抗HIV-1リボザイムを使 って、HeLa細胞内へ３回トランスフェクションされる。各々の棒に、それらのプ ラスミドの名称を表示した。図2-A：トランスフェクションさせたHeLa細胞を48 時間後に採取し、CAT酵素アッセイにかけた。シンチレーションカウンターを使 ってTLCスライスを計数し、対照に対する相対値としての結果を示す。図2-B：上 清をp24抗原解析にかけ、得られた値を対照値の相対パーセントとして示した。 図2-C：高速単離法（「発明の詳細な説明」以下を参照）を使い、総RNA量を単離 した。20μgの総RNAでドットを形成させて、［α-32p］UTPで内部標識したHIV-1 特異的プローブをでハイブリダイズさせた。レーン１は、pUC19/pHXB2gptでトラ ンスフェクションした細胞から調製したRNA、およびレーン２は、pJV-HR/pHXB2g ptでトランスフェクションした細胞から調製したRNAを示す。 図３は、HIV-1単離株における標的リーダー配列のアライメントを示す（それ ぞれ配列認 識番号６から12まで）。 図4Aおよび4Bは、レトロウイルスベクターにおけるHIV-1 SF-2の発現、及びリ ボザイムの発現に及ぼす抗HIV-1特異的リボザイムの影響を示す。図4Aは、エフ ェクタープラスミド（pSF-2）を、レトロウイルスベクター含有リボザイム（エ フェクタープラスミドとレポータープラスミドの混合比を0.5:10μgとしたもの ）すなわちpMJF-1、pMJT、pMJV及びpMHR（それぞれ棒１、３、４および５）と共 にHeLa細胞内へ２回または３回トランスフェクションするか、又はリボザイム遺 伝子を含まないレトロウイルスベクターpLRNL-2（棒２）を使ってトランスフェ クションした。48時間後、細胞を採取して（「発明の詳細な説明」以下を参照） 、上清をp24抗原解析にかけた。図4Bは、pMJF-1、pLRNL-2（ベクターのみ）、pM JT、及びpMHRを使って形質導入したHeLa細胞から、総RNAを単離し、メンブレン 上にドット形成させ（「発明の詳細な説明」以下を参照）、5'末端を放射標識し たリボザイム特異的プローブを使ってハイブリダイズさせた。ドットの程度をホ スホロイメージャー（phosphoroimager）（Molecular Dynamics，California） を使い、スキャンユニットで定量した。 図5A及び5Bは、一時的アッセイにおいて、HIV-1 Eli株及びMN株上での、レト ロウイルスベクターに対して抗HIV-1特異的リボザイムの発現が及ぼす影響を示 す。エフェクタープラスミド（pEliまたはpMN）を、レトロウイルスベクターす なわちpMJT、pMJV及びpMHR（それぞれ棒２、３及び４）を含有するリボザイム、 あるいはリボザイム遺伝子pLRNL-2を含まないレトロウイルス（棒１）を使って 、HeLa細胞内へ２回又は３回トランスフェクションした。図5Aでは、HIV-1 pEli 用に、（エフェクタープラスミドとレポータープラスミドの混合比を0.25:10μg として）一緒にトランスフェクションさせた。図5Bでは、HIV-1 pMN用に、（エ フェクタープラスミドとレポータープラスミドの混合比を）0.25:10μgとして- 緒にトランスフェクションさせた。48時間後、細胞を採取し（「発明の詳細な説 明」以下を参照）、上清をp24抗原解析にかけた。 図6A及び6Bは、形質導入の11週間後（図6A）及び25週間後（図6B）の安定細胞 株におけるHIV-1特異的リボザイムの発現を示す。安定細胞株由来の総RNA量は、 援用するChomczynski，P and Sacch，N．Anal．Biochem．162:156（1987）に掲 載の方法、酸グアニジニウムチオシアネート酸-フェノール/クロロホルム抽出法 により抽出した。RNaseを含まないDNase（RQ1 DNase:Promega）で処理した後の 総RNA量1μgを、逆転写における鋳型として使用した。逆転写を含むPCR反応（94 ℃で１分、42℃で１分、72℃で１分、これを30サイクル行う）を、Ri b4（5'-CAC、ACA、ACA、AGA、AGG-3'）（配列番号１）及びRib2（5'-TAC、CAG、 GTA、ATA、TAC、CAC-3'）（配列番号２）から成るプライマーペアを使い、援用 するYamada，O．et al．J．Virol．Methods 27:203（1990）に掲載された方法に 従い実施した。ただし、ガラス粉末による抽出ステップは省略してある。逆転写 を含む、又は含まないPCRを実施した後、増幅した各々の産物10μgを、トリス- ホウ酸緩衝液（pH7.2）中において、3%低溶解性アガロースゲル（Boehringer） の電気泳動にかけ、［³²P］で末端標識したRib3（5'-CAA、CCA、GAG、AAA、CAC 、ACG、TT-3'）を使ってサザンブロット解析を行った。未感染NLNL6（リボザイ ムなし）、MMJF-1、MMJT、JLN6（リボザイムなし）、JMJF-1及びJMJT細胞中にお けるリボザイムの発現を示した。リボザイムを含有するレトロウイルスベクター プラスミド（pMJT）を、リボザイムDNAの陽性対照として使用した。-RT:PCRでは 、逆転写酵素を含めずに実施した。増幅産物のサイズは54bpであった。 図７は、HIV-1特異的リボザイムを発現するJurkat細胞の増殖を示す。親Jurka t細胞株（Jurkatクローン3.8）及び被験細胞株を、U底の96穴プレートに細胞数 が10⁴個/100μl/ウェルとなるよう、４穴ずつスプリットした。1μCiの［³H］- （メチル）-チミジン（NET-027、NEN）を含有する10%FBSを補給したRPMI1640を 、100μlずつ各ウェルに添加した。48時間後、フィルターに細胞を採取した。フ ィルターの放射活性をシンチレーション分光光度計（Beckman）を使って測定し た。データは平均値±S.D.（n=4）で示している。 図８は、異なったHIV-1株由来のp24抗原の発現に対するHIV-1特異的リボザイ ムの阻害効果を示す。HIV-1株であるHXB2、MN、Eli又はJ677-2（クローン化され ていない臨床単離株）を、リボザイムを発現するJurkat細胞（JMJF-1細胞及びJM JT細胞）、並びにリボザイムを含まないレトロウイルスベクター（JLNL6細胞） によって、0.01（ゆっくりと増殖する細胞株J677-2の場合は0.1）のインプットM .O.I.で形質導入した対照Jarkat細胞を感染させた。エイズ患者由来のPBMCを正 常PBMCと共存培養することにより、単離後にMT-4細胞中で１回継代培養した。○ JLNL6、●JMJF-1、□JMJT。 図９は、HIV-1特異的リボザイムによるHIV-2の複製阻害の欠損を示す。HIV-1 HXB2又はHIV-KRを、リボザイム（MMJF-1及びMMJT）を発現するMolt-4/細胞及び 、リボザイムを含まないレトロウイルスベクター（MLNL6）によって形質導入さ せたMolt-4/8細胞へ、0.01のインプットM.O.I.又は増殖の速い細胞株HIV-2 KRで は0．001のインプットM.O.I.で感染させた。○MLNL6、●MMJF-1、□MMJT。これ らウイルス株から成るウイルス製剤の感染力価 （TCID₅₀）を、援用するYamada，O．et al．AIDS Res．Hum．Retroviruses 4:28 7（1988）に掲載されている方法に従い、MT-2細胞を使って測定した。２時間ウ イルス吸着を行った後、RPMI1640培地で２回洗浄し、細胞濃度を10⁵細胞/mlとし て10%FBSを補給したRPMI1640培地中に再度懸濁した。この感染細胞を６日間培養 した。少量の培養液を１日おきに採取し、HIV-1又はSIV/HIV-2抗体捕獲ELISA試 験（Coulter）により、p24又はp26抗原量を測定した。 図10は、感染後９日目におけるMLNL6細胞及びMMJF-1細胞のシンシチウム形成 を示す。0.01のインプットM.O.I.でリボザイムを発現するMolt4/8細胞を感染さ せるために、HIV-1 HXB2株又はMN株を使用した。２時間ウイルス吸着を行った後 、RPMI1640培地で２回洗浄し、細胞濃度が10⁵細胞/mlとなるよう10%FBSを補給し たRPMI1640培地中に、細胞を再度懸濁した。感染後５日経過してから、１日おき に細胞を分割して、細胞濃度を3×10⁵細胞/mlとした。 図11は、長期培養において、HIV-1特異的リボザイムを発現するJurkat細胞にH IV-1/HXB2又はHIV-1/MNを感染させた場合のRT活性の阻害を示す。HIV-1 GXB2（A ）及びMN（B）を、0.01のインプットM.O.I.でそれぞれJLNL6、JMJF-1及びJMJT細 胞へ感染させた。２時間のウイルス吸着後に、RPMI1640を使って細胞を２回洗浄 し、細胞濃度が10⁵細胞/mlとなるよう10%FBSを補給し再度懸濁した。５日目以降 、１日おきに細胞を分割して細胞濃度を3X10⁵細胞/mlに維持した。HIV RT活性の 存在下で、培養上清を試験した。要するに、0.5mlずつ２つの（デュプリケート ）上清を、0.24mlの30%ポリエチレングリコール6000及び20mlの4M NaClで各々混 合した。14000rpmで30分間超遠心分離にかけたあと、上清を除去し、10mlのTNE 溶液（10mMトリス-HCl pH7.8、100mM NaCl、1mM EDTA）をそれぞれの試験管に添 加した。以上を混合した後、250mMのトリス-HCl pH7.8、250mM MgCl₂、250mM KC l、25mMジチオトライトール、1.25mg/40mlのpoly（rA）p（dT）12-18（Pharmaci a）、2.5mCi/0.25nmol/40mlの［³H］dTTP（NEN）を含有する混合液40mlと混合し て、37℃で１時間インキュベートした。ここへ0.2M EDTAを10ml添加した。サン プル１検体（50ml）をDE81試験紙（Whatman）にスポットし、風乾して5%ピロリ ン酸ナトリウムで５回洗浄し、水で２回以上洗浄した。この試験紙を乾燥させ、 シンチレーション分光光度計（Beckman）中で放射活性を測定した。poly（rA）p oly（dT）の代わりにpoly（dA）poly（dT）を使用した場合には、放射活性を検 出しなかった。○JLNL6、●JMJF-1、□JMJT 図11（インセット）は、感染後における安定細胞株中でのHIV-1特異的リボザ イムの発現 を示す。HIV-1/MNで感染後23日目における、Jurkat細胞JMJT及びJMJF-1上でのHI V-1特異的リボザイムの発現を、図６に説明するようにRT PCRによって測定した 。未感染のJLNL6細胞を、陰性対照として使用した。逆転写を伴わないPCRをも実 施したが、増幅産物は検出されなかった。 図12は、「逸脱した」ウイルスを伴うHIV-1特異的リボザイムを発現するJurka t細胞の再試行を示す。HIV-1 SXB2株又はMN株で感染させ、35日目又は23日目に それぞれ採取したJMJF-1細胞の培養上清を、図11に明示した実験で、JLNL6、JMJ F-1及びJMJT細胞に再感染させた。HXB2及びMN細胞中におけるインプットM.O.I. はそれぞれ0.0004及び0.01であった。35日目に採取したHXB2の感染率が極めて低 かったため、インプットM.O.I.を0.01に調製することは出来なかった。p24の量 を、HIV-1抗原捕獲ELISA試験（Coulter）によって測定した。○JLNL6、●JMJF-1 、□JMJT。 図13は、HIV-1で感染後、初期のJMJT細胞におけるプロウイルスDNAの合成に対 して、HIV-1特異的リボザイムが及ぼす効果を示す。JLNL6細胞及びJMJT細胞中に おいて、HXB2で感染させた初期段階におけるHIV-1のプロウイルスDNAの濃度を、 ネスト（nested）二重PCRを使い、半定量的に測定した。JLNL6細胞及びJMJT細胞 にHIV-1 HXB2を感染させた後、18時間後に、プロテイナーゼＫ及びフェノール/ クロロホルムを使用した方法を使って細胞ゲノムDNAを抽出した。各々1mMのDNA 抽出液を、１回目のPCRにおける鋳型として使用した。１回目及び２回目のPCRに おける反応混液の組成は、50mMトリス（pH8.3）、6mMのMgCl₂、40mMのKCl、1mM のジチオトライトール、各々200mMのdATP、dGTP、dTTP及びdCTP、2.5ユニットの Taqポリメラーゼ、及び1mMずつのプライマー（Promega）であった。HIV-1 LTRに おけるプライマーペアを、HIV-1 DNA（増幅産物にはリボザイムに対する標的配 列も含まれる）の増幅に使用した。１回目のPCR（94℃で１分、54℃で１分、72 ℃で１分とし、30サイクル行う）には、SK29及びGK2（5'-CGG、CGG、ATC、CCG、 GGC、GCT、TCA、GCA、AGC、CGA-3'）（配列番号４）のプライマーペアを使用し た。β-グロビンに対するプライマーペアを、１回目のPCRの10サイクル後の時点 で同一の反応チューブへ添加し、内部標準とした。２回目のPCRにおいては、１ 回目のPCRの1/10量を添加し、援用するOu，C-Y．et al.,Science 239:295（1988 ）に掲載されている、SK29/SK30から成るプライマーペア、及びRS06（援用するS aiki，R．et al.Science 239:487（1988）参照）/GH21を使い、30回の増幅を行 った。２回目のPCR産物を、５サイクルごとに10μlずつ採取し、増幅産物をゲル 電気泳動及びサザンブロット 解析によって測定した。HIV-1またはβ-グロビンDNAに対しては各々、［³²P］を 末端標識したSK31（Ou，C-Y et al.,前出、援用して本文の一部としている）又 はRS06を使ったハイブリダイゼイションにより別々にサザンブロット解析を行っ た。HIV-1特異的な増幅産物のサイズは105bp、β-グロビンDNA特異的な増幅産物 のサイズは204bpであった。異なるサイクルにおいて検出された増幅産物の結果 が示されている。 図14は、形質導入/選択を行ったヒト末梢血リンパ球細胞へのHIV-1試行。フィ コール-ハイパック比重遠心法によってヒトPBMCを単離し、10%ウシ胎仔血清、5 μg/mlのPHA-P及び20U/mlのIL-2を添加したRPMI培地中で細胞密度が1X10⁶細胞/m lとなるよう播いた。37℃で２日間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、 形質導入の前に洗浄した。PALNL6細胞又はPAMJTパッケージ細胞株由来の濾過済 み上清を、4μg／mlのポリブレン存在下で3x10⁶の剌激したPBMCと共に37℃で４- ６時間インキュベートした。このPBMCを1×10⁶細胞/mlの細胞濃度で10%FCS、20U /mlのIL-2を補給したRPMI中において、一晩培養した。形質導入の手順を３日間 毎日実施した。RMPI+10%FCS、20U/mlのIL-2に400μg/mlのG418を加えた溶液中で ８日間培養し、G418を含まない溶液中で３日間培養して、細胞を選択した。パッ ケージング細胞株の上清に曝露されなかった対照細胞は、トリパンブルー色素排 出法による測定として、この方法では生存することはできなかった。選択された 細胞（2X10⁵）を２時間（M.O.I.=0.01）感染させ、１回洗浄後、RPMI+10%FCS、2 0U/ml IL-2なる培地中で、細胞濃度が1X10⁶/mlとなるように播いた。１日おきに 培養用培地の半分を採取し、新鮮な培地と交換した。抗原捕獲ELISA法（Coulter ）によってウイルスの産生をモニターした。LNL-6細胞及びMJT形質導入/選択細 胞株を、それぞれTLNL及びTMJTとした。 図15は、多標的性リボザイム（スケールは明示せず）を発現するレトロウイル スベクター構成物における概略の図解を示す。詳細は、「発明の詳細な説明」を 参照。 図16は、HIV-1 HXB2で感染させた初期段階において、リボザイムがプロウイル スDNAの合成に及ぼす影響を示す。JLNL6細胞及びJMJT細胞にHIV-1 HXB2を感染さ せて６時間経過した時点でのHIV-1プロウイルスの濃度を、ネスト二重PCRにより 半定量的に測定した。増幅産物を、２回目のPCRの15、20、25、及び30サイクル の時点で検出した結果を明示した。異なる量（0.5-5fg）のpSF-2を、同一のプラ イマー及び試験条件（以下参照）により増幅させ、HIV-1 DNAの相対量を計算し た。 図17は、形質導入/選択を行った培養由来のRT-PCR産物におけるサザンブロッ ト解析を 示す。-及び+は、RT-PCR反応における逆転写酵素の存在を示す。RNAを以下のも のから単離する。即ち、MJTによって安定して形質導入されたMolt4/クローン８ 細胞であるMMJT細胞、MJT又はLNL-6のいずれかで形質導入したPBMCであるMJT細 胞及びLNL細胞。これらは、G418含有培地中で８日間培養し、続いてG418を含ま ない培地中で１週間培養して選択された。 図18A及び18Bは、被選択培養物の増殖及びCD4/CD8特性（ドナー番号054）を示 す。Aは、G418選択を行った48時間後のLNL-6△、及びMJT□、Bは、FACSでの測定 による選択後のCD4+□及びCD8+■の百分率を示す。 図19Aから19Dは、HIV-1及びHIV-2による形質導入/選択処理した培養物の試行 を示す。形質導入/選択処理した培養液中におけるA、C:HIV-1 HXB2とB:HIV-2KR とのウイルス産生;LNL-6△及びMJT□。パネルA及びB（ドナー番号054）における 培養物を、HIV-1又はHIV-2によって並行して感染させた。パネルCは、ドナー番 号029に由来する、形質導入/選択処理済みの培養物の長期間に及ぶHIV-1試行を 示す。D:形質導入/選択処理した培養物における、臨床上のHIV-1単離産物。ドナ ー番号052+臨床単離株F（LNL-6△、及びMJT□）。ドナー番号061+臨床単離株G（ LNL-6▲及びMJT■）。 図20Aは、レトロウイルス構成物の概略図解を示す。内部polIIIによって誘発 されたリボザイムを含むベクターの構成は以下の通りである:ヒトtRNAval又はア デノウイルスVA1polIIIプロモーター/リボゾームカセット（終止シグナルを含む ）（援用するOjwang et al．P.N.A.S.，U.S.A．89:10809（1992）を参照）を含 むフラグメントを、図示されるようにneo遺伝子の下流にあるHindIII認識部位に おいて、レトロウイルスベクターpLNL6へ挿入した。この結果生じたレトロウイ ルスベクターをpMJT（tRNAプロモータを伴うベクター）及びpMJV（VA1プロモー タを伴うベクター）とした。このレトロウイルスベクターを、エコトロピック細 胞株であるpsi2、及びアンフォトロピック細胞株PA317を使った標準法に従って パッケージングした。３つのベクターすべての力価を、208F細胞を使い、約10⁵C FU/mlであると測定した。Ｂは、RNAのPCRによるリボザイム発現アッセイを示す 。酸グアニジウムチオシアネート-フェノール/クロロホルム抽出法によって、各 々のサンプルから10個のコロニーを得、総RNAを抽出した。デオキシリボヌクレ アーゼI（RQ1 DNase I，Promega）を、逆転写酵素（RT）に対する鋳型として使 用した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）をRTと組み合わせ、Rib4（5'-CAC、ACA、 ACA、AGA、AGG-3'）（配列番号１）とRib2（5'-TAC、CAG、GTA、ATA、TAC、CAC- 3'）（配列番号２）をプライマーペアとして使用して実施した（94℃で１分、45 ℃で１分、72℃で１分を１サイクルとして30サイクル）。RTを含む、又は含まな いPCRを実施した後、増幅産物の各々10μlをドットブロットアッセイにかけた。 リボザイムの内部配列から派生し、［³²P］で末端標識した３番目のオリゴヌク レオチドRib3（5'-CAA、CCA、GAG、AAA、CAC、ACG、TT-3'）（配列番号３）を使 い、ハイブリダイゼーションを行った。a=MJT、b=MJV、c=LNL6、d=その他の対照 。d1及びd2は未導入の幹細胞/前駆細胞、d3はb1-b5（RTを含まない）の組み合わ せ、d4はd6-d10（RTを含まない）、b5はa1-a5（RTを含まない）の組み合わせ、d 6はa6-a10（RTを含まない）の組み合わせ、d9及びd10は、2x10³個のMJTで形質導 入したJurkat T-細胞で、陽住対照としたもの。 図21は、レトロウイルスベクターによって形質導入した幹細胞/前駆細胞のコ ロニー形成能の比較を示す。播種した幹細胞数（5000）により、形成コロニーの 総数（表IIの底部に示す数値）を割ることにより、コロニー形成率を計算した。 誤差を示すバーの表示は、個別のドナーの臍帯血から得た幹細胞/前駆細胞を使 い、３つの実験から得られたコロニー数の偏差を明示している。 図22A-Cは、幹細胞由来のマクロファージ細胞における、リボザイムを使ったH IV-1の複製阻害を示す。形質導入した幹細胞/前駆細胞を、IMDM IL-3、IL-6、S CFを含む15mlの培養試験管中（デルタカルチャー）で３週間培養した。培養を、 ヒト血清で被覆したプレート（コースター24穴 #3524）上へ２-４時間播いてお き、プレートへ吸着しない細胞を除去した。この後、10%FCS、10%正常ヒト血清 、及びGM-CSF（1ng/ml）を補給したRPMI培地中で継代培養した。さらに３-４週 間経過した後、幹細胞から派生したマクロファージ/単球を、増殖条件下でマク ロファージトロピック株HIV-1/Balを用いて試行した。指定した時点において細 胞培養の上清を採取し、標準p24 ELISAを実施した。Ｂは形質導入した幹細胞の 増殖曲線を示す。この図における凡例Ａに説明した試験条件下において、LNL6、 MJT及びMJVレトロウイルス形質導入幹細胞を培養した。指定された様々な時点に おいて、総細胞数を計数した。死細胞の数を除去するには、顕微鏡下において、 0.4%トリパンブルー（GIBCO BRL）染色を行うことによって計数した。Ｃは、形 質導入した幹細胞から派生したマクロファージにおける、長期間に及ぶリボザイ ムの発現を示す。各々のサンプルにつき、10⁴個のマクロファージ細胞（幹細胞 の形質導入から約２カ月経過した時点）を、酸グアニジニウムチオシアネート- フェノール/クロロホルム抽出法によって、総RNA量を抽出した。総RNA量のうち0 .1μgを、逆転写（RT）の鋳型とし、Rib4（LTR転写特異性を呈する、レーン２及 び５）又 はRib2（polIII転写特異性を有する、レーン３及び６）のいずれかの存在下で使 用した。図1Bに説明した反応条件の下で、２番目のプライマーを添加することに より、PCRを実施した。RTと共に（レーン１、２、３、４、及び６）、又はRTを 使わず（レーン４及び７）PCRを実施した後、増幅した産物の各々10μl（10%） を、トリス-ホウ酸緩衝液（pH７．２）中で3%低融点アガロースゲル（Boehringe r）を使用した電気泳動にかけ、リボザイムの内部配列から派生した［³²P］-末 端標識した３番目のプローブRib3を使ってサザンブロット解析を実施した。レー ン２、３、４はMJT細胞；レーン５、６、７はMJV細胞、レーン１はLNL-6細胞、 レーン８はプラスミドpMJTを鋳型として使用したDNAのPCR産物におけるリボザイ ムの陽性対照物質である。対照としたレーン全体（１、４、７及び８）のうち、 Rib2及びRib4プライマーを、逆転写のステップにおいて同時に添加した。 発明の詳細な説明 遺伝子治療は、ヒトの疾患を対象とする剌激的かつ新しい方法である。機能性 を有する細胞遺伝子を挿入することによって遺伝的欠損を捕正できるのに加え遺 伝子療法はまた、腫瘍細胞あるいはウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を 剌激し、あるいは感染性を有する病原性因子の発現/機能を抑制する目的にも使 うことができる。 ヒト免疫不全ウイルス（HIV）が後天性免疫不全症候群（AIDS）を引き起こす 因子であることが認識されて以来、ウイルスの複製を抑制する戦略を開発するべ く努力が重ねられてきた。理論上は、ウイルスのライフサイクル中において、ウ イルスの侵入、逆転写、組込み、転写、RNAのプロセシング、トランス作用、翻 訳、パッケージング及びウイルス粒子の放出を含む様々なキーステップを干渉す れば、HIVの複製を抑制できるはずである。実際、HIVのライフサイクルには、遺 伝子治療の介入できる可能性を秘めた魅力的なステップが多くあるであろうし、 このステップには、HIV感染細胞内へ、HIVウイルスの侵入を阻害するトランスド ミナント（transdominant）変異gag及びエンベロープ遺伝子の導入、HIVの転写 及びトランス作用を阻害するTARおとり（decoys）の導入、HIVのRNAプロセシン グを阻害するRREおとり及びトランスドミナントREV変異体の導入等が含まれてお り、若干の実施例を提供している。 アンチセンス（RNA又はDNA）ヌクレオチドは、HIV-1のライフサイクルにおい て、ウイルスmRNAの利用を標的とし妨げるするために使用されてきた。しかし、 アンチセンス阻害に おける化学量論性が、細胞内におけるHIV感染と複製を阻害しようとするアプロ ーチを制限してきた。 HIV-1特異的リボザイムは、従来のアンチセンス技術を克服し、細胞におけるH IV感染と複製を妨げることが本報において明示されている。リボザイムとは、RN Aの触媒活性（catalytic activity）を保持するRNA分子である。触媒鎖が標的RN A中の特定の部位を切断するので、切断されたRNAの数は、化学量論に基づいて予 測した数よりも多くなる。 本報で利用されているように、「リボザイム」は特定の部位を認識するアンチ センス配列を含んだRNA分子を含み、RNA切断性の酵素活性を有するのが好ましい とされる。触媒鎖は、化学量論濃度よりも高い濃度で標的RNA中の特定の部位を 切断する。本発明においては、ハンマーヘッド型リボザイム（Rossie，J.J．et al.，Pharmac．Ther. 50:245-254（1991）、援用して本文の一部とする）と、ヘ アピン型リボザイム（Hampel et al.，Nucl．Acids Res. 18:299-304（1990）及 び米国特許第5、254、678号、1993年10月19日公開、いずれも援用して本文の一 部とする）からなる二つの「型」のリボザイムが特に有効である。ハンマーヘッ ド型リボザイム及びヘアピン型リボザイムは、共に触媒分子であり、アンチセン ス活性及びエンドリボヌクレオチダーゼ活性を有するため、リボザイム技術が遺 伝子活性化において極めて強力な拡大を示してきた。詳しく後述するように、HI V-1 RNAに対して方向付けられるハンマーヘッド型リボザイムとヘアピン型リボ ザイムが細胞内で発現することにより、HIV-1感染に対して有意な抵抗性を示す ことを示している。 このリボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイム（Foster and Symons（1987 ）Cell 48:211-220；Haseloff and Gerlach（1988）Nature 328:526-600；Walbo t and Bruening（1988）Nature 334:196；Haseloff and Gerlach（1988）Nature 334:585、いずれも援用して本文の一部とする）、又はヘアピン型リボザイム（ たとえば、Haseloffらが1993年10月19日において、米国特許第5、254、678号で 公開し、Hampelらが1990年3月26日において、欧州特許第0 360 257号で公開、い ずれも援用して本文の一部とする）が、特定の標的に向かい、HIV RNAを切断し て不活化する能力を有している。 ヘアピン型リボザイムに必須とされる配列は、NNNG/CN*GUCNNNNNNNN（配列番 号15）を有するすべてのRNA配列である（ここでN*Gは切断部位を示し、ＮはＧ、 Ｕ、Ｃ又はＡのいずれかである）。ハンマー型リボザイムにおける開裂部位に必 須な配列は、NUX（ここでＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡであり、ＸはＣ、Ｕ、又はＡの いずれかである）を有するすべてのRNA配列であり、これ が標的とされうる。従って、ヘアピン型のリーダー配列中にある同様の標的GUC は、ハンマーヘッド型リボザイムにとって有用である。さらに、ハンマーヘッド 型リボザイム又はヘアピン型リボザイムの付加的なヌクレオチドは、標的フラン キングヌクレオチドとハンマーヘッドの共通配列によって決定される。 Cechら（米国特許第4,987,071号、1991年１月22日公開）は、エンドリボヌク レアーゼ活性を有するある合成リボザイムの調製及び利用について開示した。こ れらリボザイムは、テトラヒメナのリボゾームRNAの自己スプライシング反応の 特性に基づいており、８つの塩基対を標的部位として必要とする。エンドリボヌ クレアーゼ活性の発現に最適な温度は50℃であることが報告されている。切断に よって生じるフラグメントには、5'側のリン酸及び3'側のヒドロキシル基を含み 、切断されたRNAの5'側末端部には、遊離型グアノシンヌクレオチドが付加して いる。これとは対照的に、本発明におけるリボザイムは、生理的温度で効率よく 標的配列とハイブリッド形成をするので、in vivoでの応用に適しているが、研 究用ツールとして利用されることはまれである（Cechらの米国特許第4,987,071 号においてカラム15の18-42レーン参照）。 本発明におけるリボザイム及びリボザイムをコードするDNAは、以下に詳しく 記述されるが、本発明における周知の方法（たとえば、Promega，Madison，Wis. ，USAのプロトコル、援用して本文の一部とする）を使って化学的に合成するこ とができる。リボザイムはまた、RNAポリメラーゼのプロモーター、例えばT7 R NAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼにおけるプロモータに操作可能に連結 したDNA分子（転写時に得られ、RNA分子が生成する）から調製することもできる 。従って、本発明においては、本発明におけるリボザイムをコードしている核酸 分子、すなわちDNA又はcDNAも提供される。ベクターはDNA分子に操作して連結し たRNAポリメラーゼプロモータをも含む場合、in vitroでRNAポリメラーゼ及びヌ クレオチドとのインキュベーションにおいて、リボザイムが産生されうる。また 、別の実施例には、参考文献として記載のCotten and Birnstiel（1989）EMBO J ．8（12）:3861-3866、Hampel et al.,Biochemistry 28:4929-4933（1989）、Yu et al.,P.N.A.S. 90:6340-6344（1993）、で記述したように、DNAは発現カセッ ト又は転写カセット中へ挿入される。分子生物学の方法論に関する詳しい記述は 、援用して本文の一部とするSambrook et al．（1989）Molecular Cloning：A L aboratory Manual ，Cold Spring Harbor Pressで述べている。合成後、このRNA 分子を、リボザイムを安定化し、RNaseに耐性を示す能力を 備えたDNA分子へのライゲーションによって改変することができる。そうでない 場合には、このリボザイムがリポソーム輸送システムで利用するフォスフォチオ 誘導体に修飾される。この修正が生じるため、リボザイムがエンドヌクレアーゼ 活性に耐性を示すことになる。 DNA分子はまた、宿主である原核生物あるいは培養真核細胞、又は生命体の細 胞中に存在する。適切な原核細胞及び真核細胞は、本発明におけるリボザイムを コードしたDNA分子を含有する転移ベクターを伴って形質導入を行う。RNAの転写 用のプロモーターにDNA分子を操作可能に連結した場合は、DNAの転写に好適な条 件下で宿主細胞が増殖を行うとき、その宿主細胞内にRNAが取り込まれることが できる。このベクターは、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン又はコ スミドに限定されない。このようなベクターの実施例は、本報の参考文献にも記 載の米国特許第5、166、320号において開示されている。アデノ関連ベクター１ 型（AAV-1）又はアデノ関連ベクター２型（AAV-2）（援用して本文の一部とする Chatterjee et al.，（1992）Science Vol. 258:1485-1488参照）などは極めて 有用である。遺伝子治療の方法は本発明において周知のとおりであり、たとえば 、参考文献として記載のLarrick，J．W．and Burck，K．L．Gene Therapy：Appl ication of Molecular Biology， Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，New York，New York（1991）及びKreigler,M．Gene Transfer and Expression：A L aboratory Manual ，W．H．Freeman and Company，New York（1990）、を参照の こと。 また本発明においては、polIII転写カセットも提供されており、pMJV及びpMJT 等のベクター中に存在する。これらのカセットは、以下に示す塩基配列を有する ： pMJTは、 pMJVは、 又、本発明にはpolIII転写カセット及び外部遺伝子から構成されるベクターも 含まれる 。宿主細胞、及びこれら転写カセットを使った発現方法についても後述する。こ れら転写カセットは遺伝子又はDNA配列の発現にとって有用であり、ここで開示 したHIVリボザイムの発現のみに限定されない。 ベクターを使ってリボザイムを産生するには、リボザイムをコードしているヌ クレオチド配列を、例えばlac、SV40の後期配列、SV40初期配列、又はラムダプ ロモーター強力なプロモーターの制御下におく。こうすると、形質導入ベクター からin vivoにおいて直接リボザイムが産生する。 別の具体例においては、ウイルスベクターが非ビルレントなワクシニアを基本 とするウイルスベクター又はモロニーマウス由来白血病ウイルス等のレトロウイ ルスである。かかる遺伝子療法に供するレトロウイルスベクターとして適切なも のは、たとえば、レトロウイルス性LTR、又はヒトtRNA^Valプロモーター、あるい はアデノウイルスVA1プロモーター等の、挿入polIIIプロモーターの制御下にお いて、レトロウィルスの5'及び3'長末端反復（ＬＴＲ）領域の間に外来核酸（DN A又はcDNA）配列を挿入した自己複製レトロウイルスである。レトロウィルスベ クターは、宿主細胞中で、むしろ安定的にリボザイムを発現する。 本発明が目的としている一つには、in vitroにおいて患者由来サンプル中のHI Vの存在を検出するか、又は患者へ注入する前に、HIVの組織片サンプルを精製す る作業がある。in vitroにおける検出システムへ使用する場合は、ウイルスが隠 れていると疑われる細胞サンプルをほ乳動物から除去しておく。この「ほ乳動物 」という用語には、霊長類、マウス及びヒト患者が含まれることを強く望むもの であるが、これに限定されることはない。このレトロウイルスベクターを細胞内 へ形質導入し、この細胞を増殖させる。レトロウイルスベクターを含むリボザイ ムと細胞を接触させず、HIVフラグメントが存在しない状態で、細胞から単離し た核酸を（ハイブリダイゼーション解析によって）釣り上げる。リボザイム特異 的なフラグメントが存在すれば、HIVが存在することを陽性として示すことにな る。放射性同位元素又は酵素等をアッセイ中で使用することにより、このフラグ メントを検出することができる。in vivoにおいては、HIV感染及び複製に対して の遺伝子療法としてこのレトロウイルスベクターを使用することができる。本発 明におけるレトロウイルスベクターは、polIIIプロモーターの制御下において、 外来核酸（DNA、RNA又はcDNA）を、レトロウイルスの5'及び3'長末端反復（LTR ）領域に挿入した、感染住のレトロウイルスベク ターである。このレトロウイルスベクターは、宿主細胞内において、外部遺伝子 産物を安定して発現する。ここで使用されている「感染性の」という用語は、こ のレトロウイルスベクターが感染を起こし、外来核酸の塩基配列を統合させ、発 現させる能力を有することを意味している。例示のみの目的では、本発明におけ るレトロウイルスの構築に有用な、適正レトロウイルスには、モロニーマウス白 血病ウイルス、HIV-1及びHIV-2から派生したレトロウイルスが含まれる。外来核 酸配列には、抗HIVアンチセンス分子等、又はHIVを特異的に切断するリボザイム 、あるいはTAR等のようなHIV制御型配列等の、抗HIV型特異的因子をコードする 核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。 一つの具体例において、核酸配列がHIV-1型又はHIV-2型ウイルスに特異性を示 すリボザイムをコードしている。一つの特殊な具体例において、あるレトロウイ ルスが、HIV-1型の様々な株を特異的に切断するリボザイムを発現すると明示さ れている。あるHIV-1型特異的リボザイムは、HIV-1ウイルス中の保存配列を特異 的に切断し、この保存配列はHIV-1型の多様な株中には発見されるが、HIV-2型の 株には発見されない。 このほかのHIV-1型特異的リボザイムは、HIVゲノムの3'末端部を標的とする。 3'末端部に特異性を呈するリボザイムの一例は、以下の配列を有する： この配列は、mRNAの読みとり開始位置U3/R境界部から9079-9097番目にほぼ相 当する。このほかの例としては、HIVゲノムのRev/ENV領域が挙げられる。この配 列は、5'TTGGAGTCAGGAACTA 3'（配列番号16）である。この配列は、HXB2の8629- 8644番目に相当する。本発明の目的にはまた、実質的にこれらの配列と同一であ る配列も含まれる。「実質的に類似の」又は「実質的に同一の」という用語は、 前述の配列に関してHIVの感染力を標的とし、これを抑制する能力を有するリボ ザイム配列を含んでいる。実質的に類似の配列は、厳格な条件の下で、この配列 又はその相補的配列にハイブリッド形成することができる配列である。ハイブリ ッド形成の方法は、本報において周知の技術からなる方法であり、本報の参考文 献に含まれるSambrookらの文献以下を参照のこと。 又は、HIV-2型の様々な株における保存配列を特異的に切断するリボザイムを 構築することができ、以下の教義によってin vivoで発現させることができる。 本発明においてさらに提供されるのは、5'及び3'LTR間に二つ以上の外来部遺 伝子配列を挿入させたレトロウイルスベクターであり、各々の外部遺伝子が個別 にpolIIIプロモー ターの制御を受けるか、又は単一のpolIIIプロモーターの制御を受けるようなレ トロウイルスベクターである。この外部遺伝子配列は、同一または異なる遺伝子 産物をコードすることができ、たとえば、抗HIV-1型アンチセンス分子をコード する核酸を、HIV-1特異的リボザイムをコードする核酸配列として、同一のレト ロウイルスベクターに挿入することができる。かかるレトロウイルスベクターに は、HIV感染に対して多機能的な治療法を提供できるという利点があり、各々の 特的療法が共同で作用することになる。さらには、使用するベクターの数を制限 するだけで、宿主細胞内における統合部位の数を減らすことができ、これによっ て宿主細胞のDNA配列が、挿入されたレトロウイルスベクターによって活性化さ れる可能性を下げることができる。 前述のごとく、レトロウイルスベクターによって安定的に形質導入された宿主 細胞もまた、本発明によって提供される。安定な宿主細胞には、ヒトまたは霊長 類由来線維芽細胞、末梢血リンパ球細胞、末梢血単核細胞、CD4⁺Ｔ細胞、又は肝 由来幹細胞が含まれる。本発明におけるこの他の目的には、前述のレトロウイル スベクターを、成熟する前に挿入される成熟し、分化した幹細胞、又は胎児性臍 帯血細胞がある。この分化幹細胞は、今や、外来遺伝子産物を安定して発現する べく構築されている。レトロウイルスベクターの形質導入法については、本発明 の技術において周知である。たとえば、援用して本文の一部とするLarrick，J.W ．and Burck，K.L．Gene Therapy：Application of Molecular Biology，Elsevi er Science Publishing Co.，Inc.New York，New York（1991）を参照のこと。 本発明により、HIV感染を来した細胞内において、HIVウイルスの複製を阻害又 は抑制する方法を提供する。本法では、poly IIIプロモータを挿入させた条件下 において、5'及び及び3'LTRの間に、前述のリボザイム等の抗HIV型特異的因子を コードした核酸配列からなる挿入部位を有するレトロウイルスを使って、細胞を 形質導入する必要がある。ベクターを標的細胞内へ挿入させ、HIV型特異的リボ ザイムをコードした核酸が発現するに好適な条件の下で、この標的細胞を形質導 入する。標的細胞にはほ乳類細胞を含むが、これに限定されない。適切なほ乳類 細胞には、これに限定されないけれども、線維芽細胞、ＣＤ４⁺細胞、末梢血リ ンパ球細胞、胎児臍帯血細胞、末梢単核細胞又は肝由来幹細胞等の霊長類又はヒ ト細胞が含まれる。HIV感染よりも先に細胞への形質導入がされていれば、標的 細胞又はその子孫が感染を免れることができる。 胎児の臍帯血は、健常な新生児、HIV感染者から生まれた新生児、又は分娩中 の母体から採血することができる。プログラムフリーザーを利用して血液を凍結 させ、血液細胞の生存率を最大限にすることができる。 本報において使用されている、細胞内におけるHIVウイルスの複製を「阻害ま たは抑制する」という用語は、レトロウイルスベクターによる一時的または安定 的な形質導入を受けていない細胞と比較したとき、細胞内においてHIVの複製を 低化させたり、又は子孫ウイルスに必須なHIV成分の産生を抑制することを意味 する。この用語に包括される内容には、さらに、パッケージされた子孫RNAの切 断によって起こされた、感染比ウイルスの相対的産生の低下がある。HIVのウイ ルス産生が低下したか否かを測定する単純かつ汎用的手法が、HIV p24抗原（gag 遺伝子産物）を対象としたELISAアッセイである。又は、形質導入され感染した ”対照”細胞からの総RNAを単離し、ドットブロットを行い、HIV特異的DNAをプ ローブとして解析することによりHIV複製が減少したかを測定することができる 。対照細胞に対して、50％以上のHIV複製減少をHIV複製の阻害として表す。 本発明の目的としては、HIVがあらゆる派生HIV、例えばHIV-1、HIV-2、または 臨床で格付けされていない単離物を包括することが望まれる。本発明の予期せぬ 利点は、あらゆるHIVのタイプ又は派生型体の多くの株に対する効力にある。 本発明における具体例の一つには、本発明において周知の技術を使い、前述の ごとく形質導入することによって、ほ乳類細胞例えば霊長類又はヒト患者から標 的細胞を除去できることがある。形質導入された標的細胞は、同一の動物又は同 種の別の動物に再度導入される。 以下の実施例は、例示のためのものであり本発明を限定するものではない。 実験の詳細 実験１ 酵素及び薬品。 使用した制限酵素は全てBethesda Research Laboratories（BRL）あるいはBoe hringer Mannheim Biochemicalsから入手した。制限酵素の緩衝剤は製造元から 供給された。T4 DNAリガーゼ及び塩基配列決定キットはPharmaciaから入手した 。in vitro転写キット及び関連の酵素はPromegaから入手した。仔ウシ血清、抗 生物質（ペニシリン及びストレプトマ イシン）、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、リン酸緩衝生理食塩水（PBS ）及びDulbeccoが修正したイーグル培地（DMEM）はGIBCOから購入した。HIV-1 p 24抗原検出キットはCoulterから入手し、製造元の指示に従って使用した。 pol IIIに誘導されるリボザイムプラスミドの構築。 他に特に断りのない限り、組換えDNA法は全て、参考文献として記載のSambroo k et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab .，Cold Spring Harbor，NY（1989）で述べられている通り実施した。HIV-15'リ ーダー配列特異的ヘアピンリボザイム（5'-ACA，CAA，CAA，GAA，GGC，AAC，CAG ，AGA，AAC，ACA，CGT，TGT，GGT，ATA，TTA，CCT，GGT，A-3'（配列認識番号13 ））は次の通りクローニングした。ヒトtRNA^VAlプロモーター（138 bp）及びア デノウイルスVA1（104 bp）プロモーターに対応する化学的に合成した二本鎖デ オキシリボヌクレオチドを、EcoRI-to-BamHI部位のリボザイムコーディング配列 の上流で、pHR及びpdHR（Ojwang et al.,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10802 -10806（1992）、参考文献として記載）のプラスミド（それぞれ活性リボザイム と不活性化したリボザイムを含む）にクローニングした（図１）。その結果得ら れる、pol IIIプロモーターを含むプラスミドを、参考文献として記載のGeidusc hek，E.P.，Ann．Rev．Biochem.57:873-914（1988）に要約されている方法で、M lu I及びPst Iで消化し自己触媒カセットを除去し、それをpol III終結配列と置 換した。クローン配列はDNA塩基配列決定法で確認した。プラスミドベクターは 、tRNA^Valプロモーターを含むプラスミドについてはpJT-HR、VA1プロモーター構 成を含むプラスミドについてはpJV-HRとした（図１）。 HIV-1特異的リボザイムは、5'キャップ部位より数えて111/112の位置にある２ つの塩基の間で分裂する。 レトロウイルスベクターの構築。 リボザイムが内部のpol IIIプロモーターに誘導されるベクターは次の通り構 築した。ヒトtRNA^valあるいはアデノウイルスVA1 pol IIIプロモーター−リボザ イム（Rz）カセット（pol III終止シグナルを含む））を含むフラグメントを、H ind IIIでの消化により、pJT-HRあるいはpJV-HR（HIVリーダー配列ヘアピンリボ ザイムを誘導するため、合成tRNAあるいはVA1プロモーターを構築したプラスミ ド（Yu et al.，P.N.A.S.（1993）、参考文献と して記載）から除去し、レトロウイルスベクターpLNL6のHind III部位に挿入し た（University of California，San DiegoのDr．Fred Levineより）。この段階 で、内部プロモーター転写カセットはベクターのLTRの逆向きである。その結果 生じるレトロウイルスベクターをpMJT（tRNA^VAl内部プロモーターの場合）及びp MJV（VA1内部プロモーターの場合）とした（図１）。 内部β−アクチンプロモーターを持つレトロウイルスベクターを、pβ-HRから 採取したEcoRI-BamHI挿入断片を持つ同一のベクターを用いて、構築した（Ojwan g et al．前出）。後者の挿入断片には、ヘアピン自己触媒カセット（Ojwang et al．前出）が含まれている。その結果、連結反応の後で得られるレトロウイル スベクターをpMHRと名付けた（図１）。内部プロモーターからのリボザイム発現 とレトロウイルスLTRを比較するため、もうひとつのベクター（pLRNL-2、Univer sity of California，San DiegoのDr．Jiing-Kuan Yeeより）を使用した。EcoRI 及びHind III消化によりpHRからリボザイム配列を切断し、挿入断片及び線形化 したベクトルの双方の末端を平滑にした後、Hind IIIクローニング部位に挿入し た。neo遺伝子を誘導するRSVプロモーターのすぐ上流にリボザイム配列を置いた （図１）。 レトロウイルスベクターpMJV及びpMJTのサンプルはAmerican Type Culture Co llection（ATCC）12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852に預けら れた。これらのサンプルは、1993年５月17日に、「特許手続きのための微生物の 保管の国際的認知に関するブタペスト条約」の規定に基づいて預けられ、それぞ れATCC受入番号75471及び75470が与えられた。 多標的性リボザイム発現ベクター。 HIV感染に対するリボザイム遺伝子療法の有効性を確認するため、多標的性リ ボザイム発現ベクター（図15）を構築した。dicistronicレトロウイルスベクタ ー、pLPONL（Jiing-Kuan Yee，University of California at San Diego）を使 用した。tRNA^ValあるいはVA1プロモーターを含む抗リーダーリボザイム遺伝子（ Rz-1）をpMJTあるいはMJVから除去する（図１）。HIV-１３'配列のセグメントを 標的とするリボザイム遺伝子（Rz-2）を、内部翻訳開始部位（PO）の前で、ポリ オウイルスの未翻訳の領域からクローニングした。一時的なトランスフェクショ ンの結果は、p24産生の減少に示されるように、これらの構築物のH IV-1発現に対する阻害効果を示した。Jurkat細胞株はこれらのリボザイムの両方 を安定して発現することができる。その他のリボザイムおよび／またはアンチセ ンス配列もまたこれらの構築物の中に組み込まれている可能性がある。 細胞とトランスフェクション。 HeLa細胞は10%のウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリン−ストレプトマイシン100 μg/ml、L-グルタミン２mM及びピルビン酸ナトリウム1mMを含むDMEM中で増殖し た。細胞は12穴プレート（1ｘ10⁵細胞／ウェル）で約70％のconfluenceまで増殖 させた。プレートでの培養はトランスフェクションの１日前から開始した。トラ ンスフェクションの前に、培地を、同じ添加物を含有する2mlの新鮮なDMEMと取 り替えた。リン酸カルシウムで沈殿させたプラスミドDNAを細胞に添加した。12 時間から24時間後に培地を取り除き、細胞を1X PBSで２、３回洗浄した。その後 、培養を、10%FBS、ペニシリン−ストレプトマイシン100μg/ml、L-グルタミン2 mM及びピルビン酸ナトリウム1mMを含有する2mlのDMEMにて維持した。 安定細胞株。 レトロウイルス粒子を作成するため、両種性パッケージング細胞株PA317を以 下の様に、リン酸カルシウム法（Sambrook et al.，1989、前出）でトランスフ ェクションさせた。100mmの組織培養皿で、ピルビン酸ナトリウム1mM、ペニシリ ン100単位／ml、ストレプトマイシン100μg/ml、ヒポキサンチン13μg/ml、チミ ジン3.9μg/ml、アミノプテリン18ng/ml及び10％のウシ胎仔血清（FBS；Gemini Bioproducts）を補給したDulbeccoが修正したEagle培地（GIBCO）の中で、subco nfluentなPA317培養を、リン酸カルシウムで沈殿させた20μgずつのpLNL6、pMJF -1あるいはpMJTで12時間トランスフェクションさせた。リン酸緩衝生理食塩水（ pH7.4，Ca²⁺及びAg²⁺の含まれていないもの）で細胞を２回洗浄し、新鮮な培地 において更に24時間インキュベートした。培養の上清を使いヒトCD4+リンパ球由 来のJurkatあるいはMolt-4クローン８細胞（Molt-4/8）を感染させた（Kikukawa ，R.，etal.，J．Virol．57:1159-1162（1986））。Jurkat及びMolt-4/8細胞（1 ｘ10⁶細胞）を5mlずつの上清に懸濁した。４時間後、上清を除去し、ペニシリン 100単位／ml、ストレプトマイシン100μg/ml、10%FBS及びG418 400μg/ml（GIBC O）を補給したRPMI-1640 培地（GIBCO）で細胞を培養した。G418含有培地で３週間から４週間増殖させて 抵抗性のある細胞を選択した。pLNL6、pMJF-1及びpMJTで形質導入させたG418抵 抗性Jurkat細胞あるいはMolt-4/8細胞をそれぞれJLNL6、JMJF-1及びJMJTあるい はMLNL6、MMJF-1及びMMJTと名付けた。 安定細胞株におけるリボザイムの発現。 安定した細胞株由来の総RNAは、Chomczynski及びSacchi、Anal．Biochem. 162 :156-159（1987）（参考文献として記載）で報告されている、酸グアニジニウム チオシアン酸塩−フェノール／クロロホルム抽出法で抽出した。デオキシリボヌ クレアーゼ（RQ1 DNase；Promega）で処理した後の総RNA1μgを、逆転写（RT） の鋳型として使用した。Rib4（5'-CAC，ACA，ACA，AGA，AGG-3'（配列認識番号 １）及びRib２（5'-TAC，CAG，GTA，ATA，TAC，CAC-3'）（配列認識番号）から 成るプライマーペアを用いて、既に述べられている方法に従い、RTを含むポリメ ラーゼ連鎖反応（PCR）を実施した（94℃で１分、45℃で１分、72℃で１分；30 サイクル）。ただし、ガラス粉末による抽出のステップは省略した。本文書に参 考文献として記載したYamada，O.，et al.，J．Virol．Methods 27:203-210（19 90）参照。RTを含む、あるいは含まないPCRを実施した後、増幅産物10μlずつを トリス−ホウ酸緩衝液（pH7.2）において、3％の低融解性のアガロースゲル（Bo ehringer）の電気泳動にかけ、既に述べられているように、［³²P］で末端標識 したRib3（5'-CAA，CCA，GAG，AAA，CAC ACG，TT-3'）（配列標識番号３）を用 いてサザンブロット分析を行った。参考文献として記載のYamada，O.，etal．（ 1990）前出参照。 安定細胞株の増殖。 細胞増殖は細胞に取り込まれた［³H］チミジンのレベルで測定した。要するに 、親Jurkat細胞及び試験細胞株を、Ｕ型の96穴プレートに10⁴細胞/100μ/ウェル となるよう、４穴ずつスプリットした。１μCi［³H］-（メチル）チミジン（NET -027；NEN）を含有する10%FBSを補給したRPMI-1640を100μlずつ各ウェルに添加 した。48時間後、フィルターに細胞を採取した。シンチレーション分光光度計で フィルターの放射活性を測定した（Beckman）。 HIV感染。 クローニングしたHIV-1 pHXE2（Starcich，B.，et al.，Science 227:538-540 （1985）に報告）、pMN（Gurgo，C.，et al.，Vir. 164:531-540（1988））及び pEli（Alizon,M.，Cell 46:63-74（1986））からHIV-1株のHXB2、MN及びEliを作 製した。これらの文献は参考文献として記載した。最初に、AIDS患者由来の末梢 血単核細胞（PBMC）を正常なPBMCと共存培養させ、クローニングしていないHIV- 1 J677-2を単離し、その後、ヒトＴ細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）の宿主と なるヒトCD4+ T-細胞株のMT-4中で１回継代培養した。これらのウイルス株のウ イルス標本の感染力価を、HTLV-1に感染したヒトCD4＋T細胞株であるMT-2を用い て、Yamada，O.，et al.，AIDS Res．Hum．Retroviruses 4:287-294（1988）（ 参考文献として記載）で述べられている方法に従い測定した。短期の培養実験で は、これらのウイルス株を用いて、インプットm.o.i.を0.01、あるいはもっと増 殖の遅いJ677-2株に対しては0.1として、リボザイム（JMJF-1及びJMJT）を発現 するJurkat細胞及び対照Jurkat細胞（JLNL6）を感染させた。長期の培養実験で は、インプットm.o.i.を0.01として、HXB2及び門が用いてJMJF-1、JMJT及びJLNL 6を感染させた。HIV-2 KR株は、Talbott，R，et al.,P.N.A.S.，USA 90:4226-42 30（1993）（参考文献として記載）に報告されている感染性の分子クローンから 作製された。Molt-4/8細胞の感染に関して、Yamada，O.，et al.，（1988），前 出.の方法で、HIV-2 KR標本のTCID₅₀を測定した。短期の培養実験では、HXB2及 びHIV-2 KRを用いて、リボザイム（MMJF-1及びMMJT）を発現するMolt-4/8細胞、 及び対照レトロウイルスベクター（MLNL6）によって形質導入されるMolt-4/8細 胞を、インプットm.o.i.をそれぞれ0.01及び0.001として、感染させた。２時間 ウイルス吸着を行った後、細胞をRPMI-1640で２回洗浄し、10%FBSを補給したRPM I-1640に、10⁵細胞/mlの濃度で、再度懸濁した。短期の培養実験では、感染細胞 を６日間培養させ、培養液の小さなアリコートを１日おきに採取し、HIV-1ある いはSIV/HIV-2抗原捕獲ELISA試験（Coulter）で、HIV-1 p24抗原あるいはHIV-2 p26抗原の濃度を測定した。長期的な培養実験では、第５日目以降、１日おきに 感染細胞を分割し、3ｘ10⁵細胞／mlに維持した。培養上清について、HIV逆転写 （RT）活性の存在を調べた。要するに、30%ポリエチレングリコール6000 0.24ml 及び４M NaCl 20μlを0.5mlの上清に添加して、標本を２つずつ作製した。14000 x gで30分間超遠心分離にかけた後、上清を除去し、10μlのTNE溶液（0.1%Trit on x 100，10mMトリス-HCL pH7.8，100mM NaCl，1mM EDTA）をそれぞれの試験管 に添加した。混合後、62.5mMのトリス-HCL pH7.8、25mMのMgCl₂、25mMのKCl、2. 5mMのジチオスレイトー ル、31.25μg/mlのポリ（rA）p（dt）_12- ¹⁸（Pharmacia）、62.5μCi/6.25nmol/ molの［³H］dTTP（NEN）を含有する混合液40μlを添加し、37℃で１時間インキ ュベートした。ここへ10μlの0.2M EDTAを添加した。混合液のサンプル（50μl ）をDE81試験紙（Whatman）にスポットし、自然乾燥させ、5%ピロリン酸ナトリ ウムで３回洗浄し、更に２回、水で洗浄した。このペーパーを乾燥させ、シンチ レーショ分光光度計（Beckman）で放射活性を測定した。 長期培養後の逸脱したウイルスの再試行 図12に示す実験で、それぞれ第35日あるいは第23日に採集したHIV-1 BXB2ある いはMN株で感染させたJMJF-1細胞の培養上清を用いて、JLNL6、JMJF-1及びJMJT 細胞を再感染させた。インプットm.o.i.は、HXB2、題でそれぞれ0.0004、0.01と した（第35日に採集したHXB2は感染率が非常に低かったので、インプットm.o.i. を0.01に調節することはできなかった）。これらの感染細胞を６日間培養した。 １日おきに培養液の小さなアリコートを採取し、HIV-1抗原捕獲ELISA試験（Coul ter）でp24抗原の濃度を測定した。 ウイルスDNAの半定量的二重PCR。 HIV-1 HXB2感染の６時間後、Sambrook et al.,前出に報告された、プロテイナ ーゼKおよびフェノール／クロロホルムを用いた方法で、JLNL6及びJMJT細胞から 細胞ゲノムDNAを抽出した。最初のPCRの鋳型として、それぞれのDNA抽出物を１ μgずつ使用した。１回目及び２回目のPCRの反応混液の組成は、50mM Tris pH8. 3、6mM MgCl₂、40mM KCl、1mMジチオトレイトール、200mMずつのdATP、dGTP、dT TPおよびdCTP、1mMずつのプライマー、及び2.5ユニットのTagポリメラーゼ（Pro mega）であった。HIV-1 LTRのプライマーペアをHIV-1 DNAの増幅に使用した（増 幅産物にはリボザイムに対する標的配列が含まれる）。１回目のPCRはプライマ ーペアSK29（Talbott，R.，et al.，P.N.A.S．前出.，（1993）参照）、及びGK2 （5'-CGG，CGG，ATC，CCG，GGC，GCT，TCA，GCA，AGC，CGA-3'（配列認識番号14 ））を用いて実施した（94℃で１分、54℃で１分、72℃で１分；30サイクル）。 β−グロビンに対するプライマーペアであるPC03/GH21（Saiki，R.，et al.,Sci ence 239:487-491（1988）、参考文献として記載）を、最初のPCRの10回目のサ イクル後、同一反応試験管に添加し、内部対照とした。２回目のPCRでは、最初 のPCR産物の1/3量を添加し、SK29/SK30（Talbott，R.，et al.，（1993）,前出 ）及びRS06/GH21（Saiki，R.，et al.，（1988） ,前出）の両方のプライマーペアを使い増幅を行った（30サイクル）。５サイク ル毎に２回目のPCR産物を10μlずつ採取し、ゲル電気泳動及びサザンブロット分 析で増幅産物を検出した。サザンブロット分析は、HIV-1については［³²P］で末 端標識したSK31（Talbott，R.，et al.，（1993）,前出）と、β-グロブリンに ついてはRS06とハイブリッド形成をし、別々に実施した。細胞DNA抽出物中のHIV -1 DNAの相対量を推定するため、同一のプライマー及び条件を用いて、HIV-1 SF 2を含有するプラスミドDNA（Sanches-Peseador，R.，et al.，Science 227:484- 492（1985）、参考文献として記載）を異なる濃度（0.05-500fg/ml）で増幅させ た。 p24抗原の定量。 Coulter HIV-1 p24 ELISAキットを使用して、製造元の指示に従い、コア抗原 を定量した。ELISAプレート読取器を用いて450nmで光学的密度を測定した。吸光 度から、標準曲線を用いて、トランスフェクションの40時間から48時間後に採取 した培養上清中のウイルス蛋白（p24）濃度を測定した。数値は活性のパーセン テージで表示するか、あるいは直接p24蛋白濃度で表示した。HIV-1 p24発現阻害 のパーセントを用いて、HIV-1複製及び発現の阻害因子としてのリボザイムの有 効性を測定した。同様の方法（Coulter）を用いて、HIV-2 p26を定量した。 点染分析。 Ojwang et al.,前出（参考文献として記載）で既に報告された方法を用いて、 異なるDNA標本でトランスフェクションしたHeLa細胞の総RNAを分離した。要する に、氷温の1X PBSで細胞を２回洗浄し、10mM EDTA（pH8.0）、0.5%SDS，0.1M酢 酸ナトリウム（pH5.2）を添加して溶解した。水飽和フェノール及びエタノール 沈殿を用いた１回の抽出で、総RNAを細胞溶解産物から採取した。鋳型DNAを除去 するため、分離されたRNAにDNase I処理を施した。10mMのEDTA及び0.2%SDSを添 加して反応を中止し、フェノール：クロロホルム処理により、そして最終的にエ タノール沈降によりRNAを抽出した。採取した総RNAを再度DEPCで処理した水に溶 解し、ブロッティングマニホルド（Bethesda Research Laboratory）で丁寧に吸 引しながら20μgをGeneScreen Plus膜（Dupont）上に固定した。その後その膜を 、5'-終末を放射標識した、リボザイムRNAと相補的な合成DNAプローブ、あるい は試 験管内で形質導入し、内側から放射標識した、HIV-1 RRE RNAと相補的なRNAプロ ーブを用い調べた。phosphoroimager（Molecular Dynamics，California）でド ットの程度を定量した。 pol IIIプロモーターに誘導されたリボザイムのHIV-1発現への影響。 ヒトtRNA^VAl及びVA1プロモーターを、HIV-15'リーダー配列特異的リボザイム 遺伝子の上流に挿入した。pol III終結部位は、Ratner et al.,AIDS Res．Hum． Retroviruses 3:57-69（1987）（参考文献として記載）で明らかにされた方法を 用いて、リボザイム遺伝子の下流に挿入した。これらのプラスミドでトランスフ ェクションしたHeLa細胞におけるリボザイムの発現を、RNA点染分析で測定した 。以前に報告されたpol IIプロモーターヒトβ−アクチン（Chang et al.，Clin ical Biotech． 2:23-31（1990）、参考文献として記載）と比較すると、pol III プロモーターに誘導されたリボザイムの発現率の方が88％高かった。 一時的アッセイによって、リボザイムが介在するHIV発現阻害の有効性を調べ るため、エフェクタープラスミド（pHX32gpt）及びレポータープラスミド（pC15 CAT）（Arya et al.,Scince 229:69-73（1985）、参考文献として記載）を、プ ラスミドを含有するリボザイム（pJT-HR及びpJV-HR）あるいは対照としてpUC19 を用いて、Ojwang et al.,前出に報告されたリン酸カルシウム法によって、HeLa 細胞の中にトランスフェクションした。比較のため、Ojwang et al．前出が報告 した、β−アクチンプロモーターに誘発される同じリボザイムを平行して使用し た。細胞溶解産物についてCATアッセイを実施し、培養上清におけるHIV-1 p24抗 原（gag遺伝子産物）の濃度をエンザイムイムノアッセイ（ELISA）で分析した。 得られた結果は、対照値を100%として、相対パーセントとしてグラフ表示した（ 図2A及び2B）。pol IIIプロモーターで発現されるHIV-1リボザイムはHIV-1の発 現とウイルス産生を有意に阻害した（全体として70-95％）。Tat蛋白活性の検定 において（図2A）、tRNA^VAlプロモーターに導かれたリボザイムによる阻害は、 β−アクチンプロモータに導かれたリボザイムによる阻害よりも10％大きかった 。p24発現（図2B）については、pol IIIプロモーターに導かれたリボザイムによ る阻害は、β−アクチンプロモータに導かれたリボザイムによる阻害よりも15-3 0％大きかった。更に、pol IIIプロモータープラスミドを含むリボザイムのHIV- 1発現阻害効果はDNAの用量に依存していた。 リボザイムの分裂及び標的の特異性。 β−アクチンプロモーターに誘発されるリボザイムがHIVを阻害するのは、そ の触媒特性のためであって、そのアンチセンス特性によるものではない。更に、 その作用は標的配列の存在に依存する。同様の機能及び特異性がpol IIIプロモ ーターに誘発されるリボザイムについても認められている。HIV-1発現の阻害に 触媒活性及びアンチセンス活性がどの程度貢献しているのか調べるため、pol II Iプロモータープラスミドにおいて、３つの点変異（22-AAA-24から22-UGU-24） を示す不活性化したリボザイム（Ojwang et al.,前出）を構築した。点変異はリ ボザイムを不活性化させたが、標的RNAへの結合には影響を及ぼさなかった。自 然種のリボザイムと不活性化したリボザイムはトランスフェクションした細胞に おいて同じレベルで発現されたが、不活性化したリボザイムはHIV-1発現を10％ 程度までしか阻害しなかった。従って、観察されたHIV-1の複写及び発現の阻害 は主にリボザイムの触媒特性に起因するものであり、アンチセンス特性によるも のではない。pTATを用いてpHXB2_g ^PTを置換し、Tat蛋白in transを供給したとこ ろ、pJT-HRもpJV-HRもCAT活性の阻害を示さなかった。このことは、HIV-1リボザ イムが、標的配列を含むメッセンジャーの発現だけを阻害することを裏付けてい る。 pHXB2gpt/pJV-HR（1:10μg）及びpHXB22gpt/pUC19でトランスフェクションし たHeLa細胞からの総RNAを同量ずつそれぞれ点染を行い、HIV-1特異的DNAで探査 して、HIV-1蛋白の発現の減少は、HIV-1 mRNAの量の減少の直接の結果として起 こったものなのかどうか調べた。図2Cに示した結果によると、リボザイムの存在 がHIV-1の転写を71％減少させた。体内で観察されたウイルス蛋白p24阻害のレベ ル（80-90%、図2C）は、何らかのウイルスmRNAが部分的にのみ損なわれており、 点染では検出できるが、蛋白質には転写されないという事実に起因している可能 性がある。 リーダー配列リボザイムは各種のHIV-1株を阻害する。 HIV感染及びAIDSに対する有効な治療薬に必要な特徴は、異なるHIV-1株を阻害 する能力である。リボザイムを含む異なるレトロウイルスベクター（図１）を、 様々なHIV-1株からのDNA構築物とトランスフェクションをすることによりこの重 要な問題を検討した。HBXB2からの遺伝距離の異なるMN、SF-2及びEliの３つの株 を選んだ。Zairian株であるEliは 最も距離が長い。興味深いことに、本試験でリボザイムの標的となるリーダー配 列は、MNを除く既知のHIV-1株において完全に保存される。MNは１カ所、塩基変 異を示す（Myers et al.，Human Retroviruses and AIDS 1992、Theoretical Bi ology and Biophysics，New Mexico、参考文献として記載）（図３）。図4Aに示 すように、リボザイム遺伝子が内部プロモーターによって誘導される３つのレト ロウイルスベクターはすべて（図１）、SF-2の発現を有意に阻害している（右側 の３つの棒グラフを左から２つめの対照の棒グラフと比較していただきたい）。 これらの内部プロモーターの中には、既に報告したpol IIβアクチンプロモータ ー（pMHR）及びここに報告するtRNA^VAl及びVA1のpol IIIプロモーター（pMJT及 びpMJV）が含まれる。一方、リボザイム遺伝子力がMoMLV LTRによって直接誘導 されるレトロウイルスベクターpMJF-1（図１）はHIV-1の発現を阻害しなかった （図4A、左から２つの棒グラフを比較していただきたい）。pMJF-1がSF-2を阻害 しないのはこのベクターにリボザイムが発現していないためなのかどうか調べる ため、RNA点染を実施した（図4B）。リボザイム配列の発現は、pMJF-1を含むリ ボザイム遺伝子を持つすべてのレトロウイルスベクターで検出された。それに対 し、ベクター単独（棒グラフ＃２）ではリボザイムを産生しなかった。事実、HI V-1の発現を阻害しなかったpMJF-1は、発現率の高かったベクターのひとつであ る。このベクターがウイルスの発現を阻害できなかったひとつの理由は、リボザ イムのクローニング部位が転写開始部位から数百塩基対分離れていたことである 。リボザイムの5'終結に付いた予備の長腕が細胞の核酸あるいは蛋白質と相互作 用し、それが基質への接近しやすさに影響を及ぼしている可能性がある。 次に、pMJT、pMJV及びpMHRのEli及びMNへの影響を検討した。図5Aに示すよう に、SF-2株及びEli株については同程度の阻害が観察された（図4A及び図5A）。M N株については阻害の程度は若干低いものの、依然として有意な阻害が観察され た（図5B）。このことは標的配列におけるひとつの塩基の置換がリボザイム活性 に何らかの影響を及ぼすこと、またより重要なこととして、ヘアピンリボザイム がこの基質において特定の変異を許容できることを示唆している。 実験２ 構成的にリボザイムを発現するＴ細胞株の誘導 前述のように、レトロウイルスベクター、PMJF-1およびPMJT（図１）を親ベク ターLNL-6およびLRNL-2から構築した。これらプラスミドDNAおよびPLNL6ベクタ ー対照DNAを両種性パッケージング細胞株PA317にトランスフェクションさせ、培 養上清を用いてヒトCD4+ T細胞株JurkatおよびMolt-4/8を感染させた。LNL6、MJ F-1およびMJTによって形質導入されたG418抵抗性JurkatあるいはMolt-4/8細胞を 、それぞれJLNL6、JMJF-1およびJMJT、あるいはMLNL6、MMJF-1およびMMJTとした 。逆転写と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、リボザイム配 列内に含まれるプライマーを用いて、これら細胞におけるリボザイム発現を検討 した（図６）。増幅産物が検出されたのはJMJF-1、JMJT、MMJF-1およびMMJTだけ であり、ベクターのみの対照（JLNL6およびVLNL6）では検出されなかった。さら に、逆転写が存在しない場合には増幅が認められなかったことから、この産物は DNAではなくRNAに由来するものであった。このPCR法は定量を目的とするもので はなかったが、JMJTおよびMMJTにおけるリボザイムの発現量は一貫してJMJF-1お よびMMJF-1より高く、内部tRNA^valプロモータの発現駆動能がより強力なことが 示唆された。チミジン取り込み（図７）あるいは細胞数を指標とすれば、リボザ イムの構成的発現は細胞増殖には悪影響を与えなかった。さらに、３ヶ月間にわ たって継代培養を４日に１回行なった際の生存率（99％以上）に関して、形質導 入細胞と非形質導入（親）細胞の間に差がなかった。 安定Ｔ細胞株におけるリボザイム発現は種々のHIV株による感染を抑制する 抗HIV療法を開発する上で考慮すべき最も重要な点は広範囲のウイルス分離株 に対する有効性を確保することである。今回使用したヘアピンリボザイム中に特 定された標的配列は、北米／ヨーロッパおよびアフリカの分離株中に高度に保存 されている。MN株だけがこの配列中の一つの塩基が置換されている（Myers et a l.,前出）。このリボザイム遺伝子と一時的にトランスフェクションしたHela細 胞中では、クローン化されたHXB2、MNSF2およびEli DNAのp24抗原の発現は抑制 される。しかし、より重要なクローン化されていない単離株に対する抑制効果を 評価するには、一時的なトランスフェクションを用いることはできない。この所 見を確認し、ヒトＴ細胞株のウイルス感染に拡大するため、HXB2、MN、ELIなら びに非クローン臨床単離株J677-2を用いて、JMJF-1、JMJTおよびJLNL-6細胞を感 染させた。J677-2は、患者の末梢血単核細胞（PBMC）と正常PBMCとの共存培養に よって直接得られたものであり、増幅のためにMT-4細胞で一度継代した。臨床単 離株を含むすべてのHIV- 1株で感染させた細胞の培養上清中のP24抗原の発現量は著しく減少した（図８） 。６日間の培養期間中に、標的配列中に１塩基ミスマッチを含む門の複製もやは り完全に抑制された。ウイルス抑制が標的配列に特異的なものかを明らかにする ため、複製能が高いHIV-2 KRおよびHIV-1 HXB2を用いて、平行してMMJF-1、MMJT およびALNL-6細胞に感染させた。図９に示すように、リボザイムを発現する細胞 中ではHIV-2 KRの発現はまったく抑制されなかったが、HXB2複製は完全に抑制さ れた。これらの結果が示すのは、HIV-1の保存リーダー配列を標的とするヘアピ ンリボザイムは、研究室でＴ細胞株に適応させていない非クローンウイルスを含 む種々のHIV-1株を抑制する効果があるが、その領域中に高度に多様な配列を含 むHIV-2には影響を与えないということである。このリボザイムの効果は、感染 後９日目にMLNL6およびMMJF-1細胞中にHXB2およびMNによって誘発されるシンシ チウム形成に対しても明らかであった（図10参照）。この両ウイルスはベクター のみによって形質導入された対照細胞では大きなシンシチウムを誘発したが、リ ボザイムを発現している細胞ではほとんどあるいはまったくシンシチウムは見ら れなかった。 リボザイム発現によってHIV発現が長期間抑制される JLNL6、JMJF-1およびJMJT細胞にHXB2またはMNを感染させた。HXB2またはMNを 感染させたJLNL6細胞の上清中のRT活性は、それぞれ感染後19日目または13日目 にピークに達した（図11）。その後、RT活性は低下し、これら対照培養はウイル スの強い細胞変性作用によって死滅した。HXB2を感染させたJMJT細胞におけるRT 活性は感染35日後まで著しくに抑制され、EXB2を感染させたJMJF-1におけるRT活 性は対照細胞のピーク時のRT活性の1％未満に低下した（図11）。JMJTの上清中 では17日後でも35日後でも感染性は検出されず、JMJF-1では35日後に低い感染性 （101.25TCID₅₀/ml）が検出されたが、それでも、JLNL-6細胞の上清で17日後に 見られたTCID₅₀/mlより３桁低かった（表１）。JMJT上清では17日後および35日 後に低量のp24抗原量が検出された（表１）。MNを感染させたJMJTおよびJMJF-1 のRT活性は、MNを感染させたJLNL6のピーク値と比較すると、それぞれ2％および 5％未満に抑制された（図11）。JMJF-1培養中では13日後および23日後にも感染 住ウイルスが採取された（表１）。この救急RT活性が培養期間中におけるリボザ イムの非持続的発現に起因するのかどうかを明らかにするため、リボザイム特異 的プライマーを用いたRT-PCRによって、感染23日後に採取した門感染JMJTおよび JMJF-1細胞中のRNAの検討を行なった（図11、挿入図）。 有意な量のリボザイムRNAがJMJT細胞にもJMJF-1細胞にも検出され、ウイルス 感染前の細胞と同じであった（図6Aおよび6B）。このRT-PCRは定量を目的として いなかったため、感染23日後の安定細胞株におけるリボザイム発現量を感染前の 発現量と比較できない。した がって、長期培養中にリボザイム発現量が保護作用の得られる閾値以下に減少し たという可能性が残っている。しかし、図6Bに示すように、安定細胞株では形質 導入の25週後でもリボザイムRNAが検出されなかった。リボザイムのMNに対する 抑制作用が弱いことは、標的配列中の１塩基置換が長期培養時のリボザイム活性 に影響を与えることを示唆している。 逸脱変異体 HXB2またはMNで感染させたJMJF-1細胞の長期培養後に採取された感染性ウイル ス（図11および表１に示す）がリボザイムに対する耐性を獲得した逸脱変異体で あるのかどうかを明らかにするため、JMJF-1培養の23日後（MN）および35日後（ HXB2）の培養上清を用いて、JINL6、JMJF-1およびJMJT細胞に再感染させた。６ 日間の培養期間中に培養上清中のP24抗原の発現量の推移を監視した。最初の感 染（図８、９および11）と同様に、P24抗原の発現量は両ウイルスとも大きく抑 制された（図12）。したがって、感染細胞の長期培養後に見られた低量のウイル ス発現は、ウイルスのリボザイム感受性を低下させるような特異的突然変異の結 果ではなかった。むしろ、少なくとも一部は、ウイルスRNAの量が徐々に増加し 行き、最後にリボザイムの抗ウイルス効果を越えたという可能性がある。 リボザイムはウイルス複製の初期事象も抑制する ウイルスDNAとリボザイム遺伝子を一時的に同時に導入するとウイルスRNAおよ び蛋白の産生景が減少したことは、恐らく転写されたウイルスmRNAの切断を介し てリボザイムがウイルス遺伝子発現を抑制することを示している。さらに、ウイ ルスゲノムDNAは標的配列も含むため、リボザイムは外来ウイルスRNAを切断する ことによって、ウイルスRNAの宿主への組み込みの確立も抑制する。 リボザイムが実際にウイルス複製の初期事象に干渉するかどうかを調べるため 、下記に示すように、半定量的なnested二重PCRを用いて、HIV-1感染の18時間後 および６時間後にリボザイム発現細胞と非発現細胞におけるプロウイルスDNA合 成量を測定した。感染多重度0.1のHXB2による感染の18時間後にJMJTおよびJLNL6 細胞から採取した細胞ゲノムDNA中のHIV-1 LTR由来配列の増幅を、最初にHIV-1 LTRのプライマー［SK29（参考文献：Ou，C-Y et al.，Science239:295（1988） ）およびGK2］で30サイクル行なった。内部対照として、 βグロビン遺伝子のプライマーペア［PCO3およびGH21（参考文献：Saiki et al. ，Science 239:487（1988））］を最初の10サイクルのPCR後に反応試験管に加え て、βグロビン産物によるLTR配列の増幅に対する干渉を防いだ。その理由は、 感染細胞の百分率が低いために、細胞抽出物中のβグロビンDNAの量がHIV-1 DNA の量より高いと推定されたからである。 ２回目のPCRでは、最初のPCR産物の1/10量を加え、プライマーペアとしてHIV にはSK29/30（Ou，C-Y et al.,前出）、βグロビンにはRS06/GH21（Saiki et al .,前出）を用いて増幅を行なった。５サイクル毎に２回目のPCRの各PCR産物を1 μl採取し、増幅産物をゲル電気泳動およびサザンブロット分析で検出した。最 初のPCRの後には、ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色ではJMJTおよびJLNL6 の抽出物中にβグロビン産物もリボザイムの標的配列を含むHIV-1 LTR産物も検 出されなかった。２回目のPCRでは、10サイクル以後の増幅でJMJTでもJLNL6でも βグロビン産物が検出された。32P標識プローブとハイブリッド形成させたβグ ロビンのシグナル強度については、JMJTとJLNL6の間に有意差が無かったため、 これら２試料の増幅効率は同様であると考えられた（図12）。βグロビン産物と 同じ反応試験管で増幅されたHIV-1 LTR産物は、JLNL6細胞では15回目のサイクル 、JMJT細胞では25回目のサイクルで最初に検出された（図16）。細胞DNA抽出物 のHIV-1 DNAの相対量を推定するため、同じプライマーと条件を用いて、HIV-1 S F2に含まれるプラスミドDNAの種々の濃度（0.05〜500fg/μl）を増幅した。15回 目および25回目サイクルにおけるHIV-1 LTR産物の検出は、それぞれ50fgおよび0 .5fgのプラスミドDNAに一致した。したがって、同じ細胞DNAインプット量ではJM JT中にはJLNL6の約1/50〜1/100のHIV-DNAが含まれた。同じ結果が、HXB2による 感染の18時間後にJMJTおよびJLNL6を検討した際にも得られた。この結果は、リ ボザイムが恐らく外来ウイルスDNAを切断することによってウイルス複製におけ る早期事象を有効に抑制することを示している。 HIVに対するリボザイム遺伝子療法 前述したように、HIV-1の5'リーダー配列を標的とするヘアピンリボザイムをH eLa細胞へ一時的に同時に導入すると数種類のHIVプロウイルスDNAクローンのウ イルス発現を抑制することは既に明らかにされている。さらに、能力を失ったリ ボザイムは10％の効力しか示さないことから、この抑制は主にリボザイムの触媒 作用によるものであり、アンチセンス性によるものではない。このリボザイム遺 伝子を安定して発現するＴ細胞株はHIV-1感染 に対して長期間（35日間の実験期間）にわたって抵抗性を示した。 リボザイム療法の一つのユニークな特徴は、レトロウイルス複製サイクルの複 数の段階、即ち、脱外被後の外来ウイルスのゲノムRNA、ウイルスmRNA転写物お よび子孫ビリオンが挿入されるゲノムRNAを標的とすることができることである 。これらはいずれもリボザイムによる切断の基質になりうる。リボザイム遺伝子 とプロウイルスDNAクローンの同時導入でも、ウイルスRNAおよび蛋白の発現が有 意（95％まで）に抑制されることが認められ、リボザイムには既存のプロウイル スDNAからのウイルス発現を遮断する効果があることが立証された。しかし、後 に行われた実験は、１ラウンド感染におけるプロウイルスDNAの合成もリボザイ ム発現細胞では約1/100に抑制されることを示した。即ち、リボザイムは、ウイ ルス感染確立を遮断する効果があった。 リーダー配列特異的リボザイムが形質導入されたJurkat細胞では、しばしば、 上清中に低量のP24が認められた場合でも感染ウイルスが検出されなかったこと は興味深い（表１）。したがって、リボザイムは、挿入された子孫RNAを切断す ることによって感染住ビリオンの相対的産生を抑制し得ると言える。 上記の方法および構築は、他のAIDS療法と併用して抗ウイルス効果が相乗的に 高くすることができる。例えば、感染確立を遮断する治療法を、感染細胞からの ウイルス産生を遮断する方法と併用できる。即ち、リボザイムは単独で併用療法 が可能な治療法としてユニークである。 リボザイムは、ザイール株（ELI）や非クローン臨床ウイルス分離株を含む種 々のHIV-1株に対して有効であることが明らかにされている。標的配列は既知のH IV-1配列中では完全に保存されている。唯一の例外はMNであり、この株はCUG切 断部位から６位遠位側における１塩基置換を含む（Myers et al.,を参照するこ と、前出）。実際、MNの発現は他のウイルス株ほど完全には抑制されなかった。 このMNという例外から、リボザイムの存在下に１部位突然変異によって速やかに ウイルス逸脱変異体が生じる可能性が懸念された。しかし、少なくとも実験期間 中には、逸脱変異体が高頻度に生じるという形跡は見られなかった。HXB-2およ びMNで感染させた細胞から採取されたウイルスは、長期培養後でもリボザイムに よる抑制作用に対して強い感受性を示した。 実験No.３ レトロウイルスベクターによるヒト末梢血リンパ細胞（PBL）の形質導入 レトロウイルスベクターを用いたヒト末梢血リンパ細胞（PBL）への形質導入 の可能性も検討した。これは、ヒト一次Ｔ細胞におけるリボザイムの有効性の研 究だけに重要なのではなく、HIV臨床分離株の複製に対するリボザイムの効果の 研究にPBL系が理想的であるという理由から重要である。さらに、このモデルに よってHU-PBL-SCIDマウスモデルにHIVリボザイム遺伝子療法を使用した場合の成 功を予測できる。 剌激条件では、リンパ細胞は増殖して、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする レトロウイルスベクターによって形質導入することができる（例えば、参考文献 として、Fauser，A.A．et al.，J．of Cell Biochem.45:353-358（1991）を参照 すること）。形質導入されなかったPBMCは抗生物質G418の存在下に培養すること によって除去できる。IL-2補強培地中で維持すれば、耐性組換え体を1000倍まで 増やすことができる［参考文献、Culver,K.W.et al.，Transplantation Proceed ings 23:170-171（1991）］。 次に示す条件を用いて、ヒトPBMC（末梢血リンパ細胞からマクロファージが欠 損していない）にレトロウイルスベクター、pMJT、pMJF-1およびpLNL-6で形質導 入した。FicoII-hypaqueで精製したPBMCをRPMI＋10％FCS＋PHA-Pに懸濁して、２ 〜３日放置した。活性化後に、リンパ細胞を連続的にIL-2（20U/ml）補強培地で 維持した。剌激された培養を上清と共にインキュベートするか、または種々のレ トロウイルスベクターを産生するPA317細胞株と共培養した。３日間の形質導入 処理後に、G418（400μg/ml）およびIL-2を添加した培地で８〜９日培養して、 組換え体を選択した。1x106個の最初のPBMCから，約2x106個のG418耐性組換え体 が得られた。LNL-6およびMJT形質導入培養を、それぞれTLNLおよびTMJTと名付け た。TLN細胞とTMJT細胞の16日間の増殖を比較して判断したところ、形質導入／ 選択された培養の生存率はリボザイムの存在による影響を受けなかった。生存し たPBMCをHIV-1（HXB2）で感染させたところ、リボザイムが形質導入された細胞 ではウイルス産生が大きく抑制され、対照ベクター（LNL-6）が形質導入された 細胞はウイルス産生を生じる感染が見られた。 実験４ 抗HIV-1リボザイム遺伝子の一次ヒトリンパ球への導入 抗HIV-1リボザイム遺伝子療法を調べるのにin vivoでの感染過程をより綿密に シミュレ ートするために、リボザイム遺伝子を新たに単離したヒト末梢血リンパ球（PBL ）にマウス・レトロウイルス・ベクターを使って導入する系を開発した。形質導 入およびG418選択の後で、複数ドナーから得たヒトPBLはリボザイムを発現し、H IV-1ウイルス・クローンや臨床単離ウイルスを負荷しても抵抗を示したが、対照 ベクター形質導入PBLは全面的にHIV-1感染を許容した。リボザイム発現PBLでは 、標的をもたないHIV-2クローンの阻害は見られなかった。リボザイム発現は、 一次リンパ球の生存性にも増殖速度にも影響を及ぼさなかった。この試験は、一 次ヒトＴ細胞で遺伝子導入によりHIV-1感染に対する抵抗性がもたらされるのを 初めて実証したものである。 ベクターの作製 レトロウイルス構成物であるpLNL-6（対照ベクター）およびpMJT（リボザイム ・ベクター）を、前述の標準的な方法により作製した両種性PA317レトロウイル ス・ベクター産生細胞を使って導入した。上清を含むレトロウイルス・ベクター を産生系から収集して濾過し、−80℃で保存した。208F細胞で力価を求めた。 PBLの導入および選択 様々なドナーから静脈穿剌により末梢血単核細胞（PMC）を採取してから、フ ィコール・ハイパック比重遠心法により分離した。リンパ球の比重は、RPMI＋10 ％FCS、IL-2 20〜100U/ml、ペニシリン100単位/ml、ストレプトマイシン100μg/ mlの中で、1〜3×10⁶細胞/mlに維持した。抗CD3抗体のOKT3（Ortho Diagnostics ）（5ng/ml）をフィコール精製の第１日に添加すると、増殖が促進された。 OKT3による剌激を開始して２〜３日後に、培地を4μg/mlの硫酸プロタミン（M .O.I.=0.5〜2.0）を含有する濾過パッケージング系上清に置き換えた。４〜６時 間後、リンパ球を元の培地（IL-2およびOKT3を含有）に戻し、一晩インキュベー トした。この導入手順を毎日、２〜４日間にわたり繰り返し行った。G418（400 μg/ml、活性状態）を、最終導入の24時間後に培養に添加した。導入していない 対照培養が完全に殺されるまで、約８〜11日は培養を選択的条件下に置き続けた 。場合によっては、死亡した細胞をフィコール比重遠心法により除去した。CD4/ CD8表面マーカーを、フローサイトメトリーで調べた（Cassel et al.，Exp．Hem atol 21:585（1993）参考文献として記載）。 HIV試行 G418選択培養を、M.O.I.が0.01になるようにHXB2、臨床単離ウイルスまたはHI V-2 KRと一晩インキュベートし、２回洗浄した。HIV-1臨床単離ウイルスは、HIV 血清陽性者から採取したPBLをIL-2含有培地でインキュベートしてから、MT4細胞 株を１回通過させて得た。負荷中は、リンパ球（1×106細胞/ml、総量0.2ml）を 20U/mlのIL-2（G418なし）を添加したRPMI 1640中に維持し、２〜３日毎に試料 を採取した。HIV産生をp24またはp26 ELISA（Coulter）でモニターした。 結果 導入PBLの選択および特徴検査：複数ドナーから採取したPBMCを抗CD3抗体で刺 激し、２つの両種性ベクターで並行して形質導入した。この２つのベクターとは 、RNAポリメラーゼIIIにより転写された5'リーダー配列特異性リボザイムをコー ドするMJT、および対照ベクターのLNL-6である（図16A）。その後これらの培養 で、それぞれのG418に対する抵抗性に基づいて導入体を選択した。いずれの構造 体にも存在するLTR誘導ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（NPTII） により抵抗性がもたらされる。導入しなかった培養は８〜11日以内に完全に殺さ れたが、LNL-6またはMJTを導入した培養はこのような条件下でも生存することが できた。新たに単離したPBLは、前述の条件下で最高５〜６週間にわたって再生 可能な状態で維持することができた。 G418選択PBLで発現される抗HIVリボザイム 選択した培地からの全RNAを逆転写してからPCRを行うことで、5'リーダー配列 リボザイムの発現が検出された（図17）。LTRおよびtRNA誘導転写は組み込まれ たベクターDNAの反対側の鎖にコードされているので、PCRプロトコルのRTステッ プ実施中にリボザイム特異プライマーを使えば、polIII開始リボザイムRNAは容 易にLTR-ネイオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ転写と区別することができ る。手順の中から逆転写酵素を排除すると検出可能な産物がなくなったことから 、逆転写されたRNA鋳型に由来するDNAのみが増幅されたことがわかる。 G418選択PBLの特徴 LNL-6およびMJT導入リンパ球の選択培養の増殖速度を比較した結果、リボザイ ムの発現はこれらの細胞の生存性または増殖に有意な影響を及ぼさないことがわ かった（図18A）。 形質導入された細胞の生存性および増殖には、形質導入ベクターとは無関係に 外性IL-2が存在する必要があった。形質導入され選択された培養の表現型のCD4/ CD8比を比較した（図18B）。これらの細胞表面マーカーにはドナーによっていく らか違いが見られはしたが、CD4およびCD8細胞集団の分布は、リボザイムまたは 対照ベクター導入細胞に関して異なっていなかった。 HIV感染からのPBL発現リボザイムの長期的保護 G418選択培養にHXB2、ならびに完全に保存されたHIV5'リーダー配列リボザイ ム標的配列を含むHIV-1ウイルス・クローンを負荷した。感染の10日後に比較し たところ、LNL-6導入培養に比べてMJT導入培養ではHIV産生が1000倍単位で阻害 されていた（図19A）。観察された阻害が他の理由（たとえば細胞表面受容体の ダウンレギュレーション、インターフェロンの導入）でもはや感染不能であった 培養を選択しただけのことではないのを確認するために、標的部位に完全に異な る配列を含むHIV-2も負荷してみた。図19に示すように、HIV-2に感染させるとLN L-6およびMJTのいずれを導入したPBLでも同等の産生量で感染が生じ、ウイルス 阻害が標的配列に特異であることがわかる。PBL培養では細胞変性作用は認めら れないので、rIL-2（20U/ml）を定期的に加えると、HIV負荷リンパ球を数週間維 持することができた。この期間を通じてウイルス複製は抑制された（図19）。 臨床単離株への保護の拡大 臨床に応用するには、抗HIV遺伝子はヒト集団で自然に見られる広範囲のHIV-1 株に対して抵抗性をもたらさなければならない。したがって、研究者たちは実験 室内でのHIV単離株をはるかに超えて、HIV-1の臨床単離株も含めて、様々なドナ ーからの導入し選択したリンパ球の負荷を行ってきている。図19Dに、２名のド ナーから得たリボザイム導入PBLにおける２種類の臨床単離株による感染を有効 に阻止することを示している。 実験５ HIV-1に対するリボザイムを有するヒト造血幹細胞／前駆細胞の細胞内免疫化 この試験では、これまでのプロトコルに従って、CD34+細胞を精製し、レトロ ウイルス導入を行った（Lu，M.，et al.，Human Gene Therapy 5:203（1994）； Smith，C.，J．Hematotherapy 1:155（1992）:Cassel，A.，et al.，Exp．Hemat ol．21:585（1993）参考文献として記載）。ただし、LNL6ベースのベクターには 内部polIIIプロモーターの制御下でリボザイム遺伝子が含まれており、これによ ってpolIIプロモーターに比較して遺伝子発現がより確実かつより持続的になる 。これらのベクター構成物を図20Aに示す。２種類のpolIIIプロモーターを使用 した。ハウスキーピング細胞遺伝子プロモーターであるtRNA_val、および強力な ウイルス・プロモーターであるアデノウイルスVA1である。CD34+細胞の入手源と しては、幾つかの理由からヒト胎児臍帯血を使用した。すなわち、臍帯血由来の 前駆細胞は導入効率がよいこと、成人骨髄に比べて臍帯血のほうが幹細胞／前駆 細胞の比率が高いこと、また骨髄細胞に比べて臍帯血幹細胞のほうが増殖および 自己再生能が高いことによる。さらに、小児に対する臍帯血由来幹細胞遺伝子療 法は、論理的に問題がより少なく、また同種移植の場におけるHLA適合成人にま で利用を拡げられる可能性もある。 精製したCD34+幹細胞／前駆細胞2×10⁵をあらかじめ成長因子、SCF（幹細胞因 子、25ng/ml）、IL-3（500U/ml）、IL-6（500U/ml）で24時間刺激しておいてか ら、無細胞組換えウイルスのMJTまたはMJVで感染させ、さらにはM.O.I.が１〜５ （208F細胞に対する力価）の細胞株を生成するクローンPA317からベクターLNL6 を生成した。図20Aの凡例を参照。そのためには、細胞に等容積のウイルス上清 を加え、ポリブレン4μg/ml存在下で16〜24時間インキュベートした。洗浄後、 細胞を上記の濃度でSCF、IL-3、IL-6を含有する培養基に戻し、48〜72時間イン キュベートした。G418が存在しない状態でクローン原性定量分析を行った。各プ レートからコロニーを取り出し、neo遺伝子プライマーを使ってnested DNA PCR を行い、導入効率を明らかにした。高い誘導効率（80〜100％）が得られかつ再 現性があった。これらの子孫細胞におけるリボザイムの発現を、リボザイム特異 プライマーを使用したRNA PCRで定量した。PCR産物の特異性を、第３のリボザイ ム特異プローブを使って点染検定により確認した。図20に示すように、導入した 幹細胞／前駆細胞から得たコロニーすべてにおいて、どちらの内部polIIIプロモ ーターもリボザイム発現を支持し（MJTおよびMJV）、LNL6-導入細胞または非導 入幹細胞／前駆細胞（dlおよびd2）で信号は検出で きなかった。 さらに、リボザイム導入細胞でPCR手順からRTを除いた時には信号を検出する ことはできず（d3-d5 MJT；d4-d8 MJV）、DNA信号ではなくRNA信号が検出される ことが確認された。陽性試料におけるリボザイム発現のレベルが変動するのは、 一部には取り出したコロニーの大きさが（細胞数）が異なることに起因するかも しれない。陽比対照としては2×10³のMJT導入JURKAT細胞（d9およびd10）を使用 したが、これはHIV-1感染に対して完全に抵抗を示した。これらの細胞に比較す ると、導入済みCD34+細胞コロニー（それぞれ100〜500細胞のみから成る）の子 孫は、測定法は半定量的分析でしかなかったが、高レベルでリボザイムを発現す るようであった。 MMLVベースのレトロウイルス・ベクターは分割中の細胞にしか感染できないの で、導入前にサイトカインを組み合わせたもので幹細胞をあらかじめ剌激すると いう方法が通常採用されている。この過程では、一部のCD34+幹細胞はより先駆 的な前駆細胞に分化し、その分化したものでもなおコロニー形成能が維持されて いる。単なるより先駆的な前駆細胞ではなくCD34+幹細胞集団をより高い効率で 導入可能かどうかという問題について調べるために、フローサイトメトリーを利 用して、あらかじめ剌激し導入した後のCD34+細胞を再分割した。全細胞集団の 約25％はCD34+のままであった。それからCD34+単一細胞を96ウェル・プレートに 分け、IMDM培地で10％FCSを使って培養した。SCF（25ng/ml）、IL-3（500U/ml） 、IL-6（500U/ml）に加え、GM-CSF（500U/ml）を培養基に添加した。300〜500細 胞から成るコロニーを、一部ウェルの液体培養中の単一細胞から、２週間の期間 にわたり得た（コロニー効率は約30％）。前述のneoプライマーを使用するneste d DNA PCRから、この細胞集団についても80〜100％という導入効率が得られたこ とがわかった。したがって、CD34+細胞集団と全体的な細胞集団とで導入効率に 検出可能な差はなかった。 HIV感染についての自己由来または同種の幹細胞を標的とした遺伝子療法の最 終的目標は、遺伝的に変化したHIV抵抗細胞を持つ免疫系を再構築することであ る。ただし、第１の要件は、形質導入または形質転換あるいはその両者の発現に よって幹細胞が分化して複数の細胞系統になる能力が低下しないということであ る。クローン原性定量分析および子孫発現型評価を実施して、この重大な問題に 対処した。導入中に感染ウイルスの代わりに培養基を使用するという点を除いて 、形質導入していない幹細胞を、同じ条件下で培養した。表IIに示すように、導 入していない細胞でも対照またはリボザイム・ベクターで導入 した細胞でも、異なる系統の細胞が等しい数で得られた。したがって、レトロウ イルス導入もリボザイム発現も幹細胞の分化にまったく影響を及ぼさなかった。 同じく重要な問題として、形質導入およびリボザイムの発現によって全幹細胞コ ロニー形成効率に変化が生じるかどうかということがある。図21に示すように、 リボザイム導入幹細胞とベクター対照導入幹細胞との間でコロニー形成効率に有 意な差はやはりなく（最後の３つの欄を比較）、リボザイム発現が幹細胞の先駆 能に明らかに有害な影響を及ぼさないことがわかった。形質導入そのものは、幹 細胞のコロニー形成効率を仮に低下させるとしてもほんのわずかしか低下させる ことはなかった（図21）。 レトロウイルス・ベクター導入幹細胞のクローン原性定量分析および子孫表現型 決定：レトロウイルス導入の48時間後に、0.5×10⁴の導入済み幹細胞または未導 入幹細胞を、20％FCS、1.2％メチルセルロース、25ng/mlのSCF、500U/mlのIL-3 、500U/mlのIL-6、5ng/mlのGM-CSF、2.5U/mlのエリスロポエチンおよび5×10^-5 のM2-メルカプトエタノールを含有するIscoveの改良ダルベッコ培地（IMDM、GIB CO）と混ぜた。培養を２枚のプレートにして、加湿大気中の5％CO₂中で37℃で14 日間インキュベートした。各コロニーは50を超える細胞から成る。顆粒球-マク ロファージ・コロニー（CFU-GM）および赤血球バースト（BFU-E）は、顕微鏡下 で形態を調べて識別した。コロニーの各番号は、独立したドナーの臍帯血から単 離した幹細胞／前駆細胞を使った３つの同一の実験を表している。 リボザイム遺伝子のin vitroでの有効性を評価するために、導入済み幹細胞／ 前駆細胞 に由来する子孫細胞にHIVを負荷してそれに対する抵抗性を調べた。HIV感染者で は、ウイルスの主要標的はCD4+Ｔリンパ球およびマクロファージ／単球である。 導入幹細胞／前駆細胞が、異なる組み合わせのサイトカインおよび成長因子を持 つリンパ球に分化するのを促進しようとしたが、成功しなかった。ただし、図22 Aの凡例に述べる実験条件を使って、付着単球／マクロファージを得ることには 成功した。細胞培養過程では、培地にG418は入れなかった。M・Luらが前掲文献 （1994年）でLNL6ベクターでのneo遺伝子発現は持続性がなかったと報告してお り、また我々の試験系では形質導入およびリボザイム発現が高い効率であること がすでに認められていたからである。これらの細胞はリンパ球好性株であるHIV- 1/HXB2では感染不能だが、マクロファージ好性株であるHIV-1/Balによっては盛 んに感染することができた。これらの細胞にHIV-1/Balを負荷して、リボザイム 導入幹細胞／前駆細胞に由来する子孫マクロファージ細胞がHIV-1感染から保護 されるかどうかを明らかにした。図22Aに示すように、MJTおよびMJVの双方の導 入細胞で、対照ベクターLNL6導入細胞に比べて、最高６日間までHIV-1複製が有 意に減少した（細胞培養はこれ以降は終了）。MJTよりもMJVを導入した幹細胞の ほうで、より大きな阻害が認められた（図22A）。これらのデータは、別のドナ ーから単離した幹細胞／前駆細胞でも再現できた。阻害は、細胞の生存性の違い が原因では生じそうになかった。というのもLNL6、MJTおよびMTVは、ウイルス負 荷前にはこれらの液体培養条件下では同じような増殖速度を示していたからであ る（図22Bの増殖曲線を参照）。RT-PCRを行って、これらの子孫細胞でリボゾー ムの発現が維持されていて、そのためにウイルス複製の阻害が認められたのかど うかを明らかにした（図22C）。リボザイム発現は、導入の約２カ月後にMJTおよ びMJVの導入細胞（レーン３および６）では検出されたが、LNL6導入細胞（レー ン１）では検出されなかった。ここでもまた、反応からRTを除いた場合（レーン ４および７）にはシグナルが検出されておらず、DNAではなく特異的RNAが検出さ れたことがわかる。MJTおよびMJVでそのリボザイム発現のレベルに有意な差はな かったので、なぜMJV導入幹細胞のほうでより大きな阻害が認められたのかは明 らかでない。リボザイム発現カセットは、LTRに関してはアンチセンス・オリエ ンテーションで構築されたので（図１）、逆転写ステップでの２つのプライマー のうち１つを使用することにより、polIIIよびpolII（MMLV LTR）プロモーター から分化転写を得ることができる。polIII転写（レーン３および６）については polII転写（レーン２および５、詳細については凡例を参照）の場合よりも強い 信号が検出された 。これは、造血幹細胞のLTRからは低いneo遺伝子発現が認められたという結果と 一致する。ウイルス発現のレベルが低いのは、G418選択が行われなかったので未 導入の細胞の部分が少ない結果かもしれない。ただし、短期G418選択を導入後に 行って、HIV-1感染からの保護がより完全になるよう確保することもできた。こ こに示したデータは、出願者の知る限りでは、マクロファージ／単球細胞集団の 細胞内免疫化に関するin vitroでの有効性に関する最初の報告である。 要約すると、これらの結果から、HIV-1に対するリボザイムを使った造血幹細 胞／前駆細胞の細胞内免疫化は、HIV感染治療のための遺伝子療法のやり方とし て実行可能であることがわかる。幹細胞遺伝子療法の標的集団としては、HIV-1 陽性新生児が適切かもしれない。ex vivo手順を使ってリボザイム遺伝子で臍帯 血から単離した幹細胞を形質導入し、遺伝的に変化させた幹細胞をHIV陽性であ ることを確認した後に患者に再注入することができる。HIV陽性の母親から生ま れた乳児の25％は実際にHIVに感染していると報告された。出生時またはその後 できるだけ早い時期で、胸腺またはリンパ系臓器に対して有意なウイルス損傷が 生じる前に遺伝子療法を開始するとより効果がある。というのも、遺伝的に変化 した幹細胞による免疫的再構築、特にＴ細胞の再構築がうまくいくかどうかは、 これらの臓器の機能が正常かどうかによって基本的に決まるからである。小児の AIDSは成人の場合よりも急速に進行するので（感染乳児の80％は生まれて１年目 に症状が現れるようになる）、この集団ではin vivoでの遺伝子療法の有効性を より早く評価することができる。CD34+細胞がHIVによって感染しうるかどうかは まだ議論のあるところだが、一般に、CD34+幹細胞の大部分は感染しないという 点では一般に意見が一致している。これらの結果から、CD34+細胞にリボザイム 遺伝子で形質導入でき、それによって感染とウイルス発現の双方を阻害できるこ とがわかる。したがって、幹細胞を標的とするリボザイム遺伝子療法は、HIV感 染治療のための有望な先制攻撃的戦略となりうる。 ヒトCD34+幹細胞のリボザイム導入 長期再増殖造血幹細胞は自己再生できるばかりでなくHIV標的細胞に入り込ん で増殖することができることから、これらの細胞をAIDSに対する遺伝子療法に使 用するのは理想的である。我々は最近、CD34+細胞に最高90％の効率で導入でき る方法を開発した。精製した幹細胞を無細胞組換えウイルスMJT、MJVおよびLNL- 6（図１）で、4μg/mlのポリブレン 存在下で別々に感染させた。半固形寒天で増殖させた幹細胞由来のコロニーのPC Rによって導入効率を求めた。 実験６ HU-PBL-SCIDマウス・モデルにおける導入：hu-SCIDマウスは、ヒト末梢血白血球 をSCIDマウスの腹腔に注入して作製したヒト／マウス・キメラである（Koch，J ．A．and Ruprecht，R．M．Antiviral Res．19:91-109(1992)）。キメラの血液 およびリンパ系組織から表現型および機能が正常なヒトリンパ球を単離すること ができる。これらのマウスは、実験室内単離株および実験室順応株のいずれでも HIV-1で感染させ、しかもそれを再現することができる。 一次PBLに、HIV特異触媒リボザイムをコードする核酸を含有するレトロウイル ス・ベクターで形質導入する。形質導入および選択を行った後に、PBLを重症複 合免疫不全症（SCID）のマウスに腹腔内注入し（2×10⁷細胞／マウス）、２日後 にHIV、好ましくはHIV-1を負荷する。負荷の30日後に、マウスを屠殺し、腹膜お よび脾臓から細胞を単離する。異なる時間間隔で採取した血液試料でp24 ELISA を実施して、ウイルス感染および産生を検出する。この代わりに、これらの試料 を使って新鮮PBLと同時培養してウイルスを単離したり、HIV gag PCRを行ってウ イルス負荷量を調べることもできる。さらに、CD4+Ｔ細胞の減損についてFACSに より調べる。 臨床治験 HIV血清陽性者に、HIV特異触媒リボサイムをコードする核酸を含有するレトロ ウイルス・ベクターで形質導入した自己Ｔ細胞を投与する。成分除去により末梢 血リンパ球を採集し、負の選択によりCD4細胞を濃縮する。濃縮細胞を培養で剌 激し、その後レトロウイルス・ベクターで形質導入する。これとは別に、細胞の 一部をマーカー・ベクターで形質導入して生存率を比較することができる。リボ ザイムを持つレトロウイルスに感染させた後、細胞をG418で選択する。導入した 細胞を、外因性HIVが広まるのを制限するような培養条件で拡大させる。遺伝的 に修飾した細胞を混ぜてドナーに再注入する。 有効性を評価するために、参加者の機能的免疫状態、血漿ウイルス血症、p24 抗原レベ ル、HIV感染末梢血細胞の割合、およびレトロウイルス導入細胞と対照細胞の生 存比を追跡する。 患者選択基準：本発明により治療する患者としては、ELISAまたはウエスタンブ ロット法でHIV陽性であり、血漿ウイルス血症および測定可能なp24抗原が確認さ れている者を選ぶのが好ましい。CD4数は200〜600細胞/mm³で、予想生存期間が ３カ月以上であることが好ましい。動作状態は０、１または２が望ましい（以下 参照）。さらに、患者のin vivoのHIVに存在するリボザイム標的部位のヌクレオ チド配列決定に基づいて選択することもできる。これは、PCRおよび患者のPBLか ら直接適当な標的配列の配列を決定して実行する。標的部位によってHIVの存在 量が有意に異なる患者は除外する。 患者の動作状態（５段階尺度）段階 状態 ０ 制限なしにあらゆる正常な動作を実行できる。 １ 激しい身体活動は制限されるが、歩行や軽い作業はできる。 ２ 歩行やあらゆるセルフケアはできるが、いかなる作業もできない。 覚醒時の50％以上は起きあがっている。 ３ 限られたセルフケアしかできず、50％以上の時間をベッド上または 椅子に座ってすごす。 ４ 完全に障害状態。いかなるセルフケアもできない。 完全に寝たきりまたは座ったきり。 臨床評価 好ましくは全患者について、下記に概略を述べるように完全な病歴聴取、理学 的検査、臨床検査、心電図、および胸部Ｘ線に基づいて評価を行う。 完全な病歴としては、HIV感染診断、発症、合併症発症からの期間、既知のあ らゆるアレルギー歴、日和見感染および悪性腫瘍の既往歴、淋疾、梅毒、肝炎、 単球増加症、CMV感染、ヘルペス、および寄生虫症を含む性感染症の既往歴、大 衆薬も含めて現在服用している薬剤、薬物濫用歴や麻薬使用歴、うつ病、不安、 精神疾患、情緒上の問題、向精神薬 の使用、および精神療法歴、「安全な性行為」に関する知識と実践、現在とって いる避妊手段、および外科的処置とその結果を入れる。 完全な理学的検査としては、患者の動作の状態（前述）、体重、身長、バイタ ルサイン、肺検査、心臓検査、腹部検査、神経学的検査、口咽頭検査、便グアヤ ク法を行う。 臨床検査およびその他の検査（好ましくはスクリーニング時、試験参加時、お よび経過観察来院時に以下のスケジュールに従って行う）としては、下記の項目 を入れることができる。CBCおよび分画、血小板数、網赤血球数、尿検査、プロ トロンビン時間（PT）および部分トロンボプラスチン時間（PTT）、血清電解質 （NA+、K+、Cl-、HCO3-など）、血糖、血中尿素窒素（BUN）、尿酸、総ビリルビ ン、アルカリホスファターゼ（正常上限の２倍以上の場合にはγ-グルタミルト ランスペプチダーゼ（GTP）を測定）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、乳酸デヒドロゲナーゼ （LDH）（上昇している場合にはLDHイソ酵素も）、カルシウム、アルブミン、総 蛋白、定量免疫グロブリン、Ｂ型およびＣ型肝炎の血清スクリーニング、Mycoba cterium avium-intracellulareの血液培養、血清クリプトコッカル抗原、リンパ 球プロフィール、HIVポリエラーゼ鎖反応（PCR）、HIV ELISAと確認用ウエスタ ンブロット法、血清p24抗原、血漿の定量的HIV培養、β2マクログロブリン、レ トロウイルス・ベクターおよび対照の双方に特異なプライマーを利用した末梢血 単核細胞（PBMC）から抽出したDNAの定量的DNA PCR、精製ツベルクリン蛋白体（ PPD）および破傷風トキソイド・コントロール、破傷風トキソイド追加免疫。 リンパ球プロフィールとしては以下のものを入れることができるが、これらに 限定はされない。FACS分析による末梢血の細胞表現型（CD4+およびCD8+の数およ び割合を含む）、有糸分裂促進因子（PHA、PWM、Copn-A）に対する反応を含むin vitroリンパ球増殖定量分析、可溶性抗原（ジフテリア、破傷風、Candida albi cans）、同種抗原、抗CD3+/IL2、および細胞毒性細胞機能の測定。 末梢血単核細胞（PBMC）の成分除去 白血球瀉血を、用手法あるいは自動化細胞分離装置を使って実施する。用手法 による場合には、全血１単位を適当な抗凝固薬（たとえばACD-Aまたはヘパリン ）を使って抜き、遠心分離によって成分に分ける。白血球を収集し、残りの赤血 球および血漿は患者に戻す 。この方法で１〜５単位の血液を連続的に処理できる。標準的には１回静脈穿剌 すればよく、30〜45分で手順が完了する。 自動化細胞分離装置を使って成分除去をすることもできる。静脈穿剌部位から 全血を約50〜60ml/分の速度で抜き、細胞分離装置に送り込み、そこで細胞と血 漿分画を遠心分離により分ける。白血球を成分バッグに収集し、赤血球および血 漿は別の穿剌部位から患者に再注入する。ACD-Aまたはそれと同等のものを使用 し、全血と抗凝固薬の比が13:1になるようにして抗凝固をする。最大体外血液量 は使用する装置により異なるが約300mlから約600mlの範囲である。血液１〜５リ ットルを処理するのに１〜２時間かかる。標準的には、１の白血球瀉血で取り出 される白血球は5×10⁹を超えない。成人では体外にある血液量が全血液量の15％ を超えないような手順で行う。これらの容積は、標準公式を使って算出する。 白血球瀉血の危険と注意 成分除去処置に対する有害反応が生じることはまれで、具体的には針挿入およ び一時的な血液量喪失に関連する血管迷走神経系の事象、ならびにクエン酸誘発 住低カルシウム血症に関連する皮膚知覚異常がある。前者の反応には体位を操作 し、輸液を投与することで対処する。後者は、抗凝固薬注入の速度を遅くするか 、あるいは一時的に中断することでたいてい緩和される。状況によっては、抗凝 固処理をした血液産物が再注入されることが原因で患者の凝固関連パラメーター がわずかに上昇し、出血傾向がやや大きくなることもある。ただし、このような 作用は一過性のもので、治療により解消する。 CD4 T細胞の細胞分離と濃縮 フィコール-ハイパック比重遠心法を利用して、すでに確立された手順に従い 、赤血球および好中球からPBMCを分離する。細胞は修飾AIM-V（AIM-V（GIBCO） に2mMのグルタミン、10μg/mlの硫酸ゲンタマイシン、50μg/mlのストレプトマ イシンから成る）に１％ウシ胎仔血清（FBS）を補足したもので洗浄する。CD4細 胞の濃縮は、標準的な技法により磁気ビーズに結合させた抗CD8モノクロナール 抗体を使った負の選択により行う。細胞のアリコートを、CD4、CD8、CD3およびC D14などの細胞表面表現型について分析する。 CD4濃縮細胞の形質導入および拡張 細胞を、上記のように修飾したAIM-Vで5％FBSおよび100U/mlの組換えIL-2（rI L-2）を含有するもの（補足済みAIM-V）1mlあたり5×10⁵細胞の濃度で洗浄して 再懸濁する。場合によっては、25nMのCD4-PE40（転座にリンクしたHIV-1結合CD4 ドメインおよびPseudomonas aerugginosaエンドトキシンAのADP-リボシル化ドメ インから成る組換え蛋白）を残りの細胞拡張のために細胞培養に添加して、培養 からHIV感染細胞を選択的に除去するようにすることもできる。CD4-PE40は、HIV -1感染細胞培養におけるp24産生を阻害し、またHIV-1感染細胞を選択的に殺すこ とがわかっている。さらに、CD4-PE40および逆転写酵素阻害因子はヒト一次Ｔ細 胞に広がっているHIV-1に対して強い協働作用をもたらす。 増殖を剌激するために、OKT3モノクロナール抗体（Ortho Diagnostics）を10n g/mlの濃度まで添加し、細胞を24ウェル・プレートに１ウェルあたり0.5mlずつ 入れる。この細胞を5％CO₂の加湿インキュベーター中で37℃で48時間培養する。 細胞から培地を吸引し、1mlのベクター含有上清（下記に説明）に5μg/mlの硫酸 プロタミン、I00U/mlのrIL-2、100U/mlのペニシリン、0.25μg/mlのアンフォテ リシンＢ、さらに追加のストレプトマイシン100μg/mlを補充する（前述のよう に25nMのCD4-PE40を加えることもできる）。 ベクター作製および上清精製はGMPに従って行う。形質導入のためには、PBMC 含有ウェルの80％を、リボザイムをコードする核酸を含有するレトロウイルス・ ベクターとインキュベートし、20％は対照ベクターとインキュベートする。ベク ター上清を加える。この手順を４〜６回繰り返す。最終処置の８〜16時間後に、 ベクター上清を取り除き、細胞を補足済みAIM-Vで24時間培養する。 培地を、最高1000IU/mlのrIL-2、40uMのDDI（HIV複製を阻害するため）、およ び250〜500μg/mlの活性G418を含むAIM-V302に変えて、導入されていない細胞を 除外するためのG418選択を開始する。G418を含む培地中で６〜８日培養した後、 細胞を補足済みAIM-Vと40uMのDDI（±25nMのCD4-PE40）に移し、1×10⁸から4×1 0⁹細胞に拡張する。細胞拡張のための培養条件は、新しい細胞培養技術が開発さ れたならばプロトコル中に修正できる。 再注入用末梢血細胞の作製 確立された方法に従って細胞を調製する。いずれも参考文献として記載のAbra hamsen et al.,J．Clin．Apheresis 6:48-53（1991），Carteretal.，J．Clin． Apheresis 4:113 -117（1988），Aebersold et al.,J．Immunol．Methods 112:1-7（1988），Muul et al.,J．Immunol．Methods 101:171-181（1987），and Carte et al., Trans fusion 27:362-365（1987）を参照のこと。約２週間の培養期間の後、細胞の数 が1×10⁸から4×10⁹の間になっているようにする。細胞の増殖特性は患者によっ てかなり違う。導入細胞を再注入する約72時間前に、アリコートを採り、表現型 、組込みベクター含有細胞の割合、組込みHIVプロウイルス含有細胞の割合、HIV 培養およびHIV p24抗原について分析する。同じく試料を採って、グラム染色、 好気性菌および嫌気性菌の微生物培養、真菌培養を行う。再注入を行う日にもア リコートを採って同じ試験を行う。G418選択で増殖不能の細胞が10％を超える場 合には、フィコール-ハイパック比重遠心法によりそれらを除くことができる。 拡張、形質導入した細胞のドナーへの再注入 注入前に血液試料を採って分析用に保存しておく。1×10⁸から4×10⁹の形質導 入細胞を60分間かけて静注する。下記のスケジュールに従って、バイタルサイン およびパルスオキシメトリーによる酸素飽和度を綿密にモニターする。注入の５ 分後および１時間後に血液試料を採取し、続く分析用に保存しておく。白血球瀉 血、形質導入およ再注入の処置を、２〜３カ月毎に、１年間で合計４〜６回にな るよう実施する。最初の処置の後は、臨床医の裁量により外来で注入を行うこと ができる。再注入を外来で行う場合には、療法実施後最低４時間は参加者をモニ ターする。 注入関連反応に対する治療 患者が発熱、悪寒、筋肉痛を生じた場合には、適当な用量でアスピリン、イブ プロフェンまたはアセトアミノフェンを投与する。アセトアミノフェンは、患者 がアスピリンまたはイブプロフェンに対する許容がない場合に使用する。発疹が 出たならば、最初は経口ジフェンヒドラミンで治療する。注入に対して発熱、悪 寒、筋肉痛などの反応を生じた患者には、その後の注入時には注入の30分前にア スピリン、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミンのいずれかをあらかじめ投 与する。悪寒や筋肉痛が比較的重度で解熱薬や抗ヒスタミン薬に素早く反応しな い場合にはメペリジンを使用する。反応の重症度に応じて細胞注入を遅くしたり 中断したりする。重症の反応が生じた場合には、ただちに緊急生命維持手段をと る。 実験７ 骨髄吸引 対象になりうる患者全員において、手術室内で全麻下で腸骨稜から骨髄を複数 回吸引できる。骨髄吸引の量は約1,000mlで、後腸骨および腸骨稜から採取する 。採集した細胞の総数が＜2×10⁸/kgの場合には、後腸骨稜に加えて腹板および 前腸骨稜を使って２回目の吸引を行うことができる。操作実施中に、吸引した骨 髄の量に置き換えるために照射済み濃厚赤血球２単位を投与する。 CD34+細胞の精製： 造血前駆細胞および幹細胞は、CD34表面膜抗原が存在する という特徴がある。この特徴を精製に利用する。骨髄収集後に、フィコール比重 遠心法により単核細胞を他の成分から分離する。これは、細胞分離装置（Baxter Fenwal CS3000+またはTerumo製機器のいずれか）を用いた半自動的方法により 実行する。大部分が単核細胞から成る低比重細胞を採集し、その細胞をプラスチ ック製フラスコで37℃で1.5時間インキュベートする。付着細胞は多数の単球、 マクロファージ、Ｂ細胞から成るが、これらは廃棄する。付着しない細胞を採集 し、静かに回転させながらマウスモノクロナール抗CD34抗体（9C5）と４℃で30 分間インキュベートする。抗CD34抗体の最終濃度は10μg/mlである。２回洗浄し た後、ヒツジ抗マウスIgG（Fc）抗体で被覆した常磁性マイクロスフェア（Dynal Bead、Baxter Immunotherapy Group（Santa ana，California）が供給）を、２ 細胞／１ビーズの比で細胞懸濁液に加える。4℃でさらに30分間インキュベート した後、磁気ビーズでロゼットした細胞を磁石で採集する。最終濃度200U/mlの キモパパイン（Baxter Immunotherapy Group（Santa ana，California）が供給 ）を加えて、CD34+細胞からビーズを遊離させる。こうして遊離させたCD34+細胞 を48時間培養する。その後、前述のレトロウイルス・ベクター構成体を使用した 形質導入実験を行う。 遺伝工学的に作られたCD34+前駆細胞の再注入 形質導入実験の後かつ対応する品質管理（微生物学試験、クローン原性定量分 析、生存性試験）実施後に、遺伝子工学的に作られた骨髄前駆細胞を患者に再注 入して戻すが、標準的なプロトコルに従って事前にジフェンヒドライミンおよび ヒドロコルチゾンを投与す る。たとえば、参考文献として記載のKorbling，M．et al．Blood, 67:529-532 （1986）or Haas，R．et al．Exp．Hematol．18:94-98（1990）を参照のこと。 再注入後には、骨髄だけでなく循環血をも定期的に検査して骨髄中に存在する 遺伝子工学的に作製した幹細胞を追跡するが、最初の４週間は毎週実施する。そ の後は、月１回ベースで約６カ月間実施する。 本発明については現時点での好ましい実施例を参照しながら記述しているが、 本発明の精神から外れることなく様々な変形を行うことができる点を理解された い。したがって、本発明を限定するのは下記の請求の範囲だけである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/44 7431−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/44 35/76 7431−4Ｃ 35/76 Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/00 9/00 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ユ、マング アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州 サンディエゴ アイ―106 フィオー ル テラス 526 (72)発明者 ヤマダ、オサム アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州 サンディエゴ カミーノ トランキロ 7924 (72)発明者 オジウァング、ジョーシュア オー. アメリカ合衆国 77386 テキサス州 ス プリング ピンチャー クリーク ドライ ブ 2218 (72)発明者 リーヴィット、マーク アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州 ラジョラ ナンバー 47 ヴィア ソ ノマ 8460 (72)発明者 ホー、アンソニー アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サンディエゴ ランドフェア ロード 13396

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．polIIIプロモーターの制御下において、抗HIV型に特異性を有する因子を コードする核酸配列をレトロウイルスの5'及び3'長末端反復配列の間に挿入した 感染比レトロウイルスを含むレトロウイルスベクター。 ２．請求項１のレトロウイルスベクターにおいて、かかる抗HIV型特異的因子 がHIV-1型ウイルス特異的なリボザイムであるレトロウイルスベクター。 ３．請求項１のレトロウイルスベクターにおいて、かかるリボザイムがRz-1又 はRz-2と表されたリボザイムと実質的に同一の配列を有するレトロウイルスベク ター。 ４．請求項１のレトロウイルスベクターにおいて、かかる抗HIV型特異的な因 子がHIV-2型ウイルスに特異的なリボザイムであるレトロウイルスベクター。 ５．請求項１のレトロウイルスベクターにおいて、かかるpolIIIプロモーター がヒトtRNA^valプロモーター又はアデノウイルスVA1プロモーターであるレトロウ イルスベクター。 ６．請求項２のレトロウイルスベクターにおいて、かかるHIV-1特異的なリボ ザイムがHIV-1のラダー配列内部で開裂するレトロウイルスベクター。 ７．請求項５のレトロウイルスベクターにおいて、かかる抗HIV型特異的因子 がHIVの核酸に対する結合能及び、HIVの複製の抑制態を有するアンチセンス分子 であるレトロウイルスベクター。 ８．ベクターpMJTまたはpMJVにおける、polIIIプロモーター転写カセット。 ９．請求項１のレトロウイルスで安定して形質転換された宿主細胞。 10．請求項９の宿主細胞において、かかる宿主細胞が霊長類、マウス又はヒト 由来細胞である宿主細胞。 11．請求項10の宿主細胞において、かかる宿主細胞が線維芽細胞、CD4⁺Ｔ細胞 、胎児臍帯血細胞、末梢血リンパ球細胞、末梢血単核細胞又は肝由来幹細胞であ る宿主細胞。 12．外来遺伝子又はウイルスに感染した細胞内において、外来遺伝子又はウイ ルスの発現を妨害または抑制する方法であって、レトロウイルスの形質導入及び 細胞での当該の核酸の安定発現に好適な条件下において、請求項１のレトロウイ ルスで細胞を形質導入することを含む方法。 13．請求項12の方法において、かかる細胞がヒト又は霊長類由来細胞である方 法。 14．請求項13の方法において、かかるヒト細胞が線維芽細胞、ヒトCD4⁺Ｔ細胞 、ヒト 末梢血リンパ球細胞、胎児臍帯血細胞、ヒト末梢血単核球細胞又はヒト肝由来幹 細胞であるような方法。 15．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対する易感染性細胞内におけるHIVウィル ス感染を予防する方法であって、レトロウイルスベクターを使った形質導入及び 細胞内での当該核酸の安定発現に好適な条件下において、請求項１のレトロウイ ルスを使って形質導入を行うことを含む方法。 16．請求項15の方法において、かかる細胞がヒト細胞又は霊長類細胞である方 法。 17．請求項16に示す方法において、かかるヒト細胞がヒト線維芽細胞、ヒトCD 4⁺Ｔ細胞、ヒト末梢血リンパ球細胞、胎児臍帯血細胞、ヒト末梢血単核細胞であ る方法。 18．請求項12又は請求項15の方法において、レトロウイルスで形質導入した細 胞を、形質導入細胞を得たものと同種のほ乳類細胞へ投与することを更に含む方 法。 19．請求項18に示す方法において、レトロウイルスベクターで形質導入細胞が 、形質導入された細胞を受け入れたほ乳類細胞から獲得された方法。 20．Rz-2として設計されたリボザイムの塩基配列と実質的に同一な配列を有す る、抗HIV-1型特異的リボザイム。