JP2021521849A - 遺伝子編集ｔ細胞におけるヒトｆｏｘｐ３の発現 - Google Patents

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Abstract

本明細書で述べる本発明の態様は、FOXP3 cDNA（たとえばヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNAの全長）をFOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座へと標的化することによって、ヒト初代リンパ球において構成的にあるいは制御下でFOXP3を発現させることに関する。本明細書に記載の組成物および材料は、CRISPR/Casを介したマウス、非ヒト霊長類またはヒトのFOXP3遺伝子の制御に対して特異性を提供するものである。ガイドRNA配列を使用して、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座およびその他の候補遺伝子座を標的化して、CRISPR/Casを介した遺伝子制御を行うとともに、相同組換え修復に基づく遺伝子改変用の遺伝子送達カセットを提供する。本明細書に記載の代替組成物は、リボ核タンパク質（RNP）の形態で送達することができ、ヒトおよび／または非ヒト霊長類のFOXP3を標的化するために使用してもよい。試薬は新規ガイドRNA配列で構成され、この試薬は、FOXP3 cDNAおよび／またはその他のシス配置遺伝子産物を含む新規遺伝子送達カセットならびにCasタンパク質と併用することによって、オンターゲットな切断を高頻度で発生させることができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年4月27日に出願された「EXPRESSION OF MRNA ENCODING HUMAN FOXP3 FROM A NON-FOXP3 OR A FOXP3 GENETIC LOCI IN GENE EDITED T CELLS」という名称の米国仮出願第62/663,561号、および2018年11月30日に出願された「EXPRESSION OF HUMAN FOXP3 IN GENE EDITED T CELLS」という名称の米国仮出願第62/773,414号の優先権の利益を主張するものであり、これらの文献はいずれもあらゆる目的で引用によりその全体が本明細書に援用される。
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI187WOSEQLISTのファイル名で2019年4月25日に作成された約496kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書に記載の本発明の態様は、リンパ球細胞のFOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座にFOXP3のコード配列を組み込むことによって、遺伝子編集されたリンパ球細胞（Ｔ細胞など）において構成的にあるいは制御下でFOXP3を発現させることに関する。
FOXP3（フォークヘッドボックスタンパク質P3、フォークヘッドボックスP3、AAID、DIETER、IPEX、JM2、PIDX、XPIDまたはscurfinとしても知られている）のレンチウイルスを使用した遺伝子導入は、Chen, C. et al. (2011). Transplant. Proc. 43(5):2031-2048, Passerini, L. et al. (2013). Sci. Transl. Med. , 5(215):215ra174、およびPasserini, L. et al. (2017). Front. Immunol. 8:1282（これらの文献はいずれも引用によってその全体が本明細書に明示的に援用される）において過去に報告されている。また、Passeriniら（2017）は、FOXP3に変異を有する患者から得たＴリンパ球においてTreg機能を回復させる方法の開発を過去に報告している。Passeriniら（2017）によって報告されたように、CD4+Ｔ細胞およびエフェクターＴ細胞において、レンチウイルスを介した遺伝子導入が使用され、これによって、これらのＴ細胞が制御性Ｔ細胞に変換され、Treg様細胞の特性が示され、強力なインビトロ抑制活性およびインビボ抑制活性が付与された。さらに、Passeriniら（2013） は、レンチウイルスを介したFOXP3遺伝子の導入によって、CD4+Ｔ細胞がTreg細胞に変換されることを実証しており、このTreg細胞は炎症状態において安定であることが示された。また、Chenら（2011） は、FOXP3-IRES-GFP断片をコードするレンチウイルスベクターを感染させた組換えＴ細胞の養子移入を報告している。これらの細胞は、マウスモデルレシピエントにおいてGVHDを防ぐことが示された。初代ヒトリンパ球においてFOXP3を発現および制御する新たなアプローチが必要とされている。
制御性Ｔ細胞は、抗原特異的免疫寛容を誘導できる可能性があることから、制御性Ｔ細胞による自己免疫疾患の治療に興味を持っている研究者は多い。制御性Ｔ細胞（「Treg」）には様々な形態があり、現在の命名法によれば、Ｔ細胞の発生過程において胸腺で生じる制御性Ｔ細胞（胸腺由来制御性Ｔ細胞または「tTreg」と呼ばれる）と、末梢で誘導される制御性Ｔ細胞（末梢由来制御性Ｔ細胞または「pTreg」と呼ばれる）とに分類される。
制御性Ｔ細胞の生態の重要な一面として、転写因子であるFOXP3の発現がある（FOXP3は、フォークヘッドボックスタンパク質P3、フォークヘッドボックスP3、AAID、DIETER、IPEX、JM2、PIDX、XPIDまたはscurfinとしても知られている）。FOXP3は、制御性Ｔ細胞系の分化の誘導に必要であると考えられている。この概念は、FOXP3を欠損したヒトでは新生児期に重症自己免疫疾患が発症するという観察に基づくものである。FOXP3の発現はエピジェネティックな調節を受けると考えられていることから、自己免疫疾患の治療法においてtTregまたはpTregを使用することは最善策ではない可能性がある。tTregでは、FOXP3遺伝子の「胸腺特異的脱メチル化領域」として知られている上流領域が完全に脱メチル化されており、これによって、FOXP3が安定に発現すると考えられている。通常、完全な脱メチル化はpTregでは観察されない。FOXP3は、炎症状態のpTregにおいてエピジェネティックにサイレンシングされていると考えられ、恐らくはtTregにおいてもエピジェネティックにサイレンシングされており、この結果、pTregが炎症促進性CD4+Ｔ細胞に変化する場合があると考えられている。炎症性の表現型に戻ってしまうpTregを点滴に使用すると、自己免疫疾患の症状を悪化させる可能性があるため、pTregの安定性の欠如は重大な問題である。
一方、レンチウイルスコンストラクトを利用したアプローチの多くは、細胞のゲノムに無作為な組み込みを起こし、これによってがん抑制遺伝子が破壊されたり、癌原遺伝子が活性化される可能性がある。さらに、低発現を特徴とするゲノム領域に組み込み部位が存在する場合があり、この結果、FOXP3を安定に発現できないこともある。
本発明の一態様は、
デオキシリボ核酸（DNA）エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
リンパ球細胞（たとえばＴ細胞）のFOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座内の配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA（gRNA）、または該gRNAをコードする核酸；および
FOXP3タンパク質またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を含むシステムである。
いくつかの実施形態において、前記gRNAは、
ｉ）配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；
ii）配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；または
iii）配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント
を含む。
いくつかの実施形態において、前記FOXP3またはその機能性誘導体は、ヒト野生型FOXP3である。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼはCasエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼはCas9である。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸はmRNAである。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子への内包化により製剤化される。
また、本明細書では、リンパ球細胞のゲノムを編集する方法であって、本明細書に記載のシステムのいずれか１つをリンパ球細胞に提供する工程を含む方法について述べる。いくつかの実施形態において、前記リンパ球細胞は生殖細胞ではない。
さらに、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれか１つによりリンパ球細胞のゲノムが編集された遺伝子組換えリンパ球細胞、および該遺伝子組換えリンパ球細胞を含む組成物について述べる。
さらに、本明細書では、対象において、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態を治療する方法であって、本明細書に記載のシステムのいずれか１つを対象のリンパ球細胞に提供する工程を含む方法について述べる。前記疾患または前記状態は、炎症性疾患または自己免疫疾患であってもよく、たとえば、IPEX症候群または移植片対宿主病（GVHD）などであってもよい。いくつかの実施形態は、対象におけるFOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態の治療において使用するための医薬品を含む。さらなる実施形態は、IPEX症候群または移植片対宿主病（GVHD）などの、炎症性疾患または自己免疫疾患などのFOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態の抑制または治療において使用するための、本明細書に記載の方法のいずれか１つによってゲノム編集された遺伝子組換えリンパ球細胞に関する。さらなる実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれか１つによってゲノム編集された遺伝子組換えリンパ球細胞の、医薬品としての使用に関する。
フレーム内にGFPコード配列を含み、それぞれ異なるプロモーターエレメントを有する複数のAAV5ドナー鋳型の設計を示した図である。
フレーム内にLNFGRおよびP2Aのコード配列を含み、プロモーターエレメントとしてMND、sEF1aまたはPGKを有する複数のAAV5ドナー鋳型の設計を示した図である。
各実験におけるFOXP3 MFIを示した棒グラフである。
非ヒト霊長動物由来T細胞に遺伝子編集を行った結果である：アカゲザルCD4+エレクトロポレーション。
非ヒト霊長動物由来T細胞に遺伝子編集を行った結果である：アカゲザルCD4+AAV血清型判定。ヒトTRAC遺伝子の最後のエキソンを標的とする2つの異なるガイドRNAおよびそれらのバリアントを設計した。これらのガイドRNAをそれぞれ単独で使用した場合と、または図6に記載の3つの異なる遺伝子トラップ（GT）AAVドナー鋳型のいずれかと組み合わせた場合の編集（NHEJおよびHDR）効率を求めた。
例示的なTCRa遺伝子トラップコンストラクトを示した図である。
炎症性サイトカインIL-2、IFNγおよびTNFαの発現レベルを測定した細胞内フローサイトメトリーの結果をまとめたものである。p値は、対応のないスチューデントｔ検定で算出した。
各群の生存率（%）を経時的（日数）に示したカプランマイアー曲線である。各群の動物数は凡例に記載の通りであり、健常なT細胞ドナー（N=2）を用いて実施した2回の実験から得られたデータである。mock編集群とedTreg群に関するp値は、Teff単独群に対する値である。
AAVドナー鋳型#1303、FWD 07UCOE、RVS 07UCOEおよびコントロール（07UCOEなし）の模式図である。
実施例１９のin vivoマウスxenoGVHD実験において、異なるedTreg調製物で処置を行ったマウスのGVHDスコアを示したものである。
実施例１９のマウスxenoGVHD実験における動物の免疫表現型解析の結果であり、LNGFR-細胞集団およびLNGFR+細胞集団における各細胞の割合を示す。
実施例１９のin vivo xenoGVHD実験のデータである。Teff単独、Teff + mock編集T細胞、またはTeff + edTregを腹腔内投与（IP）または静脈内投与（IV）したマウス群における生存率（%）を示す。
実施例２０に従って、IPEX対象由来のCD4+ T細胞を、Cas9/gRNA-T9（比1:2.5）RNPとAAVドナー鋳型#3066とを用いて編集した実験の結果である。棒グラフは、HDR効率（%）とサイトカインプロファイルを示す。
実施例２０に従って、IPEX対象由来のCD4+ T細胞を、Cas9/gRNA-T9(比1:2.5)RNPとAAVドナー鋳型#3080とを用いて編集した実験の結果である。棒グラフは、HDR効率(%)とサイトカインプロファイルを示す。
3つの異なるバッチのedTregを用いて実施した、edTregを介する抑制アッセイのin vitroとin vivoの結果である。図15に、方法1のアッセイプロトコルで実施したin vitro抑制実験における、mock編集したCD4+細胞、実施例１０に従ってAAVドナー鋳型#3066で編集したCD4+細胞（「3066」）、または実施例１０に従ってAAVドナー鋳型#3080で編集したCD4+細胞（「3080」）の結果を示す（左と中央のグラフ）。照射およびTreg:Teff比は、X軸上の表示の通りである。さらに、実施例１３に記載のマウスCATIモデルにおいて、同じバッチのedTregを用いたin vivo実験の結果を示す（右グラフ）。図16に、方法2のアッセイプロトコルで実施したin vitro抑制実験における、mock編集したCD4+細胞、または実施例１０に従ってAAVドナー鋳型#3066で編集したバッチ#2のCD4+細胞の結果を示す（左と中央のグラフ）。Treg:Teff比は、X軸上の表示の通りである。さらに、実施例１３に記載のマウスCATIモデルにおいて、バッチ#2のedTregを用いたin vivo実験の結果を示す（右グラフ）。図17に、方法2のアッセイプロトコルで実施したin vitro抑制実験における、mock編集したCD4+細胞、または実施例１０に従ってAAVドナー鋳型#3066で編集したバッチ#3のCD4+細胞の結果を示す(左グラフ)。Treg:Teff比は、X軸上の表示の通りである。さらに、実施例１３に記載のマウスCATIモデルにおいて、バッチ#3のedTregを用いたin vivo実験の結果を示す（右グラフ）。
本明細書では、FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に組み込まれたDNA配列（たとえばコドンが最適化されたDNA配列、たとえば、ヒト細胞において発現させるためにコドンが最適化されたDNA配列）からのFOXP3の発現について述べる。ガイドRNAを使用して（たとえばマウス、ヒトまたはヒト以外の霊長類の）FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座を標的化し、CRISPR/Casを介してゲノム編集を行う。したがって、本発明の態様は、新規ガイドRNAをCasタンパク質と併用することにより、FOXP3遺伝子座または非FOXP3標的遺伝子座においてDNAを切断し、FOXP3のコード配列の組み込みを促すことに関する。いくつかの実施形態において、この組み込みは、FOXP3のコード配列を含むドナー鋳型と関連した非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え修復（HDR）により行われる。本明細書に記載の実施形態は、LNGFR、RQR8、CISC/DISC/μDISCなどの広範囲な選択マーカーと組み合わせて使用することができ、別の標的遺伝子座の編集または別の遺伝子産物（サイトカインなど）の共発現と組み合わせて多重化することができる。
より詳しくは後述するが、本出願人らは、遺伝子送達カセットを含む新規AAVドナー鋳型およびCasタンパク質と併用することによって、Ｔ細胞（たとえば、Treg細胞（本明細書において「edTreg細胞」、「edTreg」または「edTreg」とも呼ぶ）の表現型を有するゲノム編集Ｔ細胞を発生するヒトＴ細胞）においてオンターゲットな切断を高頻度に生じさせ、FOXP3遺伝子座へ前記遺伝子送達カセットを組み込むことができるガイドRNAを同定した。edTreg細胞を発生させるこのアプローチを使用して、IPEX症候群に罹患した対象から得たCD4+Ｔ細胞において免疫抑制性の表現型を発現させることに成功した。さらに、NSGレシピエントマウスにedTreg細胞を持続的に生着させることができ、処置したマウスにおいて高い生存率を得ることができた。これらの知見から、本明細書に記載のCRISPR/Casシステムなどのゲノム編集システムは、効率的な編集を行うことができ、これにより、ヒト造血幹細胞においてヒト野生型FOXP3を発現させ、かつ、たとえばIPEX症候群を有する対象への自家細胞の養子細胞療法などとして投与した後に、FOXP3の機能に異常を有する疾患または障害に臨床的有用性を提供できると予測されるレベルで生着を持続させることができることが示された。
内在性FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座にFOXP3のコード配列を挿入するように構成された、gRNAおよびドナー鋳型を含むCRISPR/Casシステムの使用は、IPEX症候群の治療法として有望である。IPEX症候群は、遺伝子全体にわたって広がった様々な変異に起因する場合があり、このため、開始コドンへのFOXP3 cDNAの全体（たとえばヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNAの全体）の挿入が望ましい場合がある。内在性FOXP3プロモーターを利用することによって、編集されたリンパ球において許容されるFOXP3発現量を得るために必要とされる転写シグナルを提供できると予想される。
FOXP3を発現させるための過去の技術は、内在性FOXP3遺伝子を介した発現またはレンチウイルスによるFOXP3遺伝子の導入に依存するものであった。より具体的には、レンチウイルスベクターの送達、または遺伝子編集を行った内在性FOXP3遺伝子座からの発現によってFOXP3の発現が行われてきた。FOXP3発現用の既存のレンチウイルス送達方法には問題があり、発現が無作為なウイルスの組み込みに依存するため、発現量の制御能に限界があり、ウイルスのサイレンシングにより発現が消失するという課題が生じる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて開示したように、部位特異的な遺伝子編集技術（たとえばTALENまたはCRISPR/Casシステムを使用したもの）を利用することによって、リンパ球の内在性FOXP3遺伝子座にDNA切断を生じさせることができた。したがって、本明細書に記載の実施形態において提供する遺伝子編集方法によって、FOXP3のコード配列の部位特異的な標的化および組み込みを行うことができ、この方法は、安全性がより高く、より制御されたアプローチであると考えられる。
ガイドRNA（gRNA）と会合したCasポリペプチドを含むリボ核タンパク質（RNP）複合体を使用したシステムでは、RNPが細胞に送達されると、直ちにその機能を発揮しうることから、TALENまたはCas mRNAに基づくアプローチよりも高い効率で標的化された組み込みを行うことができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、CRISPR/Casシステムの構成要素がRNPの形態で細胞に送達され、ヒトおよび／または非ヒト霊長類のFOXP3遺伝子座、またはAAVS1（アデノ随伴ウイルス組み込み部位１）やTCRa（TRAC）などのその他の遺伝子座の標的化に使用される。
本明細書に記載の実施形態を使用して、ヒトＴ細胞において機能性FOXP3の全長を発現させ、制御性または抑制性の表現型を得てもよい。このような細胞製剤は、IPEX症候群、自己免疫疾患、移植片対宿主病、固形臓器移植などの（ただしこれらに限定されない）、広範囲な病態の治療に有用である可能性がある。想定されるその他の用途として、たとえば、マウス、ヒトまたは非ヒト霊長類のFOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座内におけるFOXP3遺伝子の破壊および／または部位特異的な遺伝子組み込み；AAVS1部位または別の遺伝子座における片方のアレルまたは両方のアレルへの遺伝子組み込みによる目的遺伝子の構成的発現または制御性発現；IPEX症候群患者の治療法における前記アプローチのいずれかの使用；ならびに前記アプローチのいずれかを使用した、自己免疫疾患の治療用または緩和用のTreg細胞集団のCD34細胞からの作製が挙げられる。
また、本明細書に記載の実施形態を使用してFOXP3発現ヒトＴ細胞を作製することにより、たとえば制御性の表現型または抑制性の表現型をＴ細胞に付与して、Ｔ細胞の表現型を改変することもできる。このアプローチの利点の１つは、内在性遺伝子の発現にFOXP3を関連付けることができることである。別の利点として、インビトロまたはインビボにおいて、CISC／DISCを使用することにより、遺伝子編集細胞の濃縮を可能にしたり、その拡大増殖を仲介したりする遺伝子産物の共発現にFOXP3の発現を関連付けることができることが挙げられる。さらに、両方のアレルに遺伝子編集を行うことによって得られた変化を利用して、細胞製剤の機能を濃縮または増強することもできる。
本明細書では、FOXP遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に組み込まれ、ヒトのコドンに最適化されたDNA配列からのFOXP3 mRNAの転写についても述べる。ガイドRNA配列を使用して、マウス、ヒトおよび非ヒト霊長類のFOXP3遺伝子のFOXP3を標的とし、CRISPR/Casを介した遺伝子制御を行う。したがって、本発明の態様は、Casタンパク質と組み合わせて新規ガイドRNA配列を利用することにより、ヒトおよび非ヒト霊長類のFOXP3遺伝子座およびヒトAAVS1遺伝子座にDNA切断を生じさせ、修復ドナー鋳型の非存在下での非相同末端結合（NHEJ）を介した遺伝子破壊、または修復ドナー鋳型の存在下での相同性依存的修復（HDR）を介した遺伝子組み込みを促すことに関する。本明細書に記載の実施形態のいくつかは、LNGFR、RQR8、CISC/DISC/μDISCなどの広範囲な選択マーカーと組み合わせて使用することができ、別の標的遺伝子座の編集または別の遺伝子産物（サイトカインなど）の共発現と組み合わせて多重化することができる。
より詳しくは後述するが、リボ核タンパク質（RNP）を使用して前述の試薬を送達し、ヒトおよび／または非ヒト霊長類のFOXP3を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、前記試薬はユニークなガイドRNA配列を含み、このガイドRNA配列は、FOXP3 cDNAおよび／またはその他のシス配置遺伝子産物を含む新規遺伝子送達カセットならびにCasタンパク質と併用することによって、オンターゲットな切断を高頻度で発生させることができる。
レンチウイルスを使用したFOXP3の遺伝子導入は過去に報告されている。レンチウイルスコンストラクトは、無作為にゲノムに組み込まれ、がん抑制遺伝子を破壊したり、癌原遺伝子を活性化したりする可能性がある。さらに、組み込み部位がサイレンシングされてしまい、FOXP3を安定に発現できない場合もある。これとは対照的に、遺伝子編集では、部位特異的な標的化および組み込みが可能である。したがって、遺伝子編集は、安全性がより高く、より良好に制御されたアプローチであると考えられる。RNPは、細胞に送達されると、直ちにその機能を発揮することから、TALENやCas mRNAよりも効率が高い。
さらに、本明細書では、AAVに効率的にパッケージできるように相同アームが短縮されたAAVコンストラクトの設計方法も想定される。編集効率がわずかに低くなる可能性があるが、LNGFRなどの選択マーカーによって編集細胞を濃縮することができ、あるいは編集効率の低下を克服するためのその他のアプローチを使用することもできる。
本発明により作製される細胞は、修復ドナーDNA鋳型と組み合わせたCRISPRシステムを使用して作製された、がん、自己免疫疾患、臓器移植などの広範囲な臨床状態に対する養子免疫療法用または遺伝性免疫障害であるIPEX症候群の治療用の組換え制御性Ｔ細胞である。さらに、本明細書では、CRISPRシステムを使用して内在性FOXP3遺伝子の発現を破壊する方法についても述べる。
本明細書では、Ｔ細胞においてFOXP3の発現を安定化させる工学的アプローチによって、抑制機能に関与するエピジェネティックな修飾に感受性を示さなくなった抑制性Ｔ細胞の拡大増殖集団を作製することが可能であるという証拠が示されている。このようにして得られた細胞は、治療に適用可能な特性が改善されている可能性がある。
本明細書に記載の実施形態において、遺伝子編集ヌクレアーゼを使用してFOXP3遺伝子座の調節エレメントを改変することによりFOXP3を安定に発現させて、FOXP3を安定に発現する治療用細胞を作製する。本明細書において提供した代表的なデータでは、FOXP3のコーディングエキソンの上流にプロモーター（構成的プロモーターの例としては、EF1αプロモーター、PGKプロモーターおよび／またはMNDプロモーターなどが挙げられる）を配置してFOXP3の発現を誘導した。しかし、FOXP3を安定に発現させるために、様々なアプローチを使用して調節エレメントを改変できると想定される。いくつかのアプローチを使用して内在性調節エレメントを改変することによって、本発明の治療用細胞において内在性FOXP3遺伝子を構成的に発現させることができ、この結果、FOXP3遺伝子のサイレンシングや非抑制性細胞表現型への転換を引き起こす制御に対して感受性を示さなくなった。したがって、本明細書に記載の方法では、内在性調節配列および内在性プロモーターに対するエピジェネティックな作用によってFOXP3の発現が欠失するという問題が解決されている。
いくつかの実施形態において、CD34+細胞のバルク集団においてFOXP3の発現を増強する方法も想定される。自己免疫疾患の患者または臓器移植片の拒絶反応を起こした対象の炎症性Ｔ細胞集団の内在性TCRレパトアには、臓器中の炎症を起こした組織または外来組織を認識し、正確に結合する特異性を備えたTCRが見られる。このようなＴ細胞は、自己炎症反応または臓器拒絶を媒介すると考えられている。バルクＴ細胞集団の一部を制御性の表現型に変換することによって、炎症促進性集団のTCR特異性を、治療効果のある細胞集団において利用することができる。この点において、本発明の方法は、胸腺由来制御性Ｔ細胞（炎症性Ｔ細胞と重複することのない異なるTCRレパトアを有すると考えられている）を利用した他の治療法よりも優れている。さらに、自己免疫疾患の患者または臓器拒絶を起こした患者では、恐らく、生体内のtTreg集団は、炎症の回避に必要な免疫寛容の誘導に失敗していると考えられる。本明細書に記載の方法は、自己免疫疾患の治療、および移植臓器に対する免疫寛容の誘導に使用することができる。
顕著な欠点としては、FOXP3遺伝子座において効率的に組換えを行うことができる遺伝子編集ツールを使用する必要があることが挙げられる。本明細書で提供する方法では、TALENまたはCAS/CRISPRヌクレアーゼを使用してこの反応を効率的に行うことができることを示したが、原則として、どのようなヌクレアーゼプラットフォームであっても同様かつ良好に組換えを行うことができると考えられる。
制御性Ｔ細胞療法は、移植および自己免疫疾患において免疫寛容を誘導するために使用することができる。現在、Treg輸液はエクスビボで拡大培養されている。第１相試験では、１型糖尿病（T1D）に対して限定的な有効性しか認められていないが、移植後にGVHDに対してベネフィットが認められたケースもいくつかあった。いくつかの実施形態において、次世代の遺伝子組換え制御性Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）によって指向性を付与した内在性Tregであってもよい。FOXP3を発現させることによって、エフェクターＴ細胞をTregに変換することもできる。
しかし、治療方法に使用される内在性Tregと遺伝子組換えTregでは、なんらかの差異があると考えられる。内在性Treg療法は安全であると考えられるが、内在性Tregの数が少なすぎるため、自己免疫を引き起こしてしまう。Tregは、IPEX症候群、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの様々な自己免疫疾患において極めて重要な役割を果たしていると考えられている。ヒトTreg細胞の数またはその機能を増強するための様々なアプローチは、現在臨床試験段階にあり、たとえば、低用量のIL-2と拡大培養した自己由来Tregの養子移入とを組み合わせた治療法が臨床試験中である。IL-2療法は、その多面的活性と、炎症を増強しうる潜在的な「オフターゲット」効果を有することから、その有効性は限定的である。また、養子移入Treg療法も、拡大培養したTregはインビボでの安定性と生存能力に問題があり、治療に有用な抗原特異性が欠如していることから、恐らく限定的にしか利用できない。
内在性Treg（nTreg）の使用には潜在的な欠点もある。たとえば、自己免疫疾患患者は、Tregが不安定であるという遺伝的素因を有する。たとえば、CAR発現nTregからCAR発現エフェクターＴ細胞への変換が起こりうる。さらに、nTreg細胞は、FOXP3のエピジェネティックな調節を受ける可能性があることから、FOXP3の誘導がダウンレギュレートされることがあり、これは、nTreg集団の機能を完全には予測できないことを意味している。さらに、内在性Tregは、TCR（Ｔ細胞受容体）に対する正確な特異性を有していない場合がある。Tregの機能は選択マーカーとも関連しており、拡大増殖した内在性Treg細胞集団には、炎症性細胞が常に混在していると考えられる。したがって、本明細書で提供される方法は、組換え細胞を使用していることから、CARの発現により制御性Ｔ細胞の機能を誘導することができるとともに、生着させたCAR Tregが炎症促進性CAR Ｔ細胞に変換されてしまうという可能性を回避することができ、このような点において、天然のTregを移植する方法と比べて改良された方法である。
胸腺に由来する制御性Ｔ細胞（tTregまたはnTreg）は、Tregの抑制性機能に極めて重要な役割を果たしているFOXP3を安定に発現する。本明細書に記載の代表的な研究では、FOXP3遺伝子の上流に構成的プロモーターをノックインすることによってFOXP3を安定に発現させることにより、tTregに類似した抑制性機能を有するCD4+Tconv細胞が得られることが示された。これについてはPCT/US2016/059729にも記載されている（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。
内在性FOXP3の発現を誘導するアプローチでは、FOXP3遺伝子座の編集が制限されるため、FOXP3変異を有するドナーには適していない可能性がある（たとえば実施例１を参照されたい）。この技術の適用をさらに広げるため、FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に、プロモーターおよびコドン最適化されたFOXP3 cDNA配列を導入することによって、FOXP3のmRNAを発現させた。たとえばLNGFRやDISC/μDISCなどの選択マーカーを使用して、細胞製剤を濃縮することができる。
用語の定義
本明細書において「核酸」または「核酸分子」は、たとえば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られた断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、エキソヌクレアーゼ作用および合成のいずれかにより得られた断片などが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNA、RNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合およびホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
「コード鎖」は、たとえば、産生されるRNA転写物と同じ塩基配列を有するDNA鎖（ただし、チミンはウラシルで置換される）を含むが、これに限定されない。コード鎖はコドンを含み、非コード鎖はアンチコドンを含む。
「調節エレメント」は、たとえば、生物体内において特定の遺伝子の発現を増加または減少させることが可能な核酸分子のセグメントを含み、たとえば、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写および／または翻訳に影響を与えることができる核酸分子のセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター（たとえばMNDプロモーター）、リーダー、イントロン、転写終結領域などの調節エレメントは、遺伝子調節活性を有し、生細胞における遺伝子の全体的な発現において不可欠な役割を果たすDNA分子である。したがって、植物において機能する単離された調節エレメント（プロモーターなど）は、遺伝子工学的方法により植物の表現型を修飾するのに有用である。遺伝子発現の制御は、あらゆる生物およびウイルスの基本的な機能である。調節エレメントとしては、CAATボックス、CCAATボックス、プリブノーボックス、TATAボックス、SECISエレメント、mRNAポリアデニル化シグナル、Ａボックス、Ｚボックス、Ｃボックス、Ｅボックス、Ｇボックス、インスリン遺伝子制御配列などのホルモン応答エレメント、DNA結合領域、活性化領域および／またはエンハンサー領域が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、５’末端または３’末端のいずれかに前記特徴のいずれかを提供するさらなるセグメントを含む。たとえば、適切な第３のセグメントとして、５’末端キャップ（たとえば、７−メチルグアニル酸キャップ（m7G））；３’末端ポリアデニル化テール（たとえば、３’末端ポリ（Ａ）テール）；リボスイッチ配列（たとえば、制御下での安定化させたり、かつ／または制御下においてタンパク質もしくはタンパク質複合体によるアクセスを可能にするもの）；安定性制御配列；dsRNA二本鎖（たとえば、ヘアピン）を形成する配列；RNAを細胞レベル以下の場所（たとえば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡を可能とする修飾または配列（たとえば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（たとえば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAメチル基分解酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどの、DNAに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列；およびこれらの組み合わせが挙げられる。
ガイドRNAおよびCasタンパク質は、リボ核タンパク複合体を形成してもよい（たとえば、非共有結合性相互作用を介して結合してもよい）。ガイドRNAは、標的DNAの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、リボ核タンパク複合体に標的特異性を提供する。リボ核タンパク複合体の部位特異的修飾酵素は、エンドヌクレアーゼ活性を提供する。換言すれば、部位特異的修飾酵素は、ガイドRNAのタンパク質結合セグメントとの会合により、標的DNA配列（たとえば、染色体の核酸中の標的配列；染色体外の核酸中の標的配列（たとえば、エピソームの核酸、ミニサークルなど）；ミトコンドリアの核酸中の標的配列；葉緑体の核酸中の標的配列；プラスミド中の標的配列など）に先導される。
本明細書において「FOXP3」は、たとえば、免疫系の応答に関与するタンパク質を含むが、これに限定されない。FOXP3遺伝子は１１個のコーディングエキソンを含んでいる。Foxp3は、内在性制御性Ｔ細胞（nTreg（Ｔ細胞系））および養子移入／誘導制御性Ｔ細胞（a/iTreg）の特異的マーカーである。動物研究では、FOXP3陽性Ｔ細胞を誘導または投与すると、糖尿病モデル、多発性硬化症モデル、喘息モデル、炎症性腸疾患モデル、甲状腺炎モデルまたは腎臓病モデルにおいて疾患（自己免疫性疾患）の重症度が顕著に低下することが示された。しかし、Ｔ細胞は可塑性を示すことが報告されている。したがって、対象に移入された制御性Ｔ細胞は、制御性細胞ではなく炎症促進性のヘルパーT17（Th17）細胞に変化する可能性があるため、制御性Ｔ細胞の治療への使用は複雑なものとなる。これを踏まえ、制御性細胞から炎症促進性細胞への変化に起因する合併症を回避するための方法を本明細書において提供する。たとえば、iTregから発現されたFOXP3は、免疫系のマスター調節因子として利用されるとともに、免疫寛容および免疫抑制にも利用される。Tregは、IPEX症候群、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの様々な自己免疫疾患において極めて重要な役割を果たしていると考えられている。ヒトTreg細胞の数またはその機能を増強するための様々なアプローチは、現在臨床試験段階にあり、たとえば、低用量のIL-2と拡大培養した自己由来Tregの養子移入とを組み合わせた治療法が臨床試験中である。IL-2療法は、その多面的活性と、炎症を増強しうる潜在的な「オフターゲット」効果を有することから、その有効性は限定的である。また、養子移入Treg療法も、拡大培養したTregはインビボでの安定性と生存能力に問題があり、治療に有用な抗原特異性が欠如していることから、恐らく限定的にしか利用できない。
「ヌクレアーゼ」は、たとえば、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断することができるタンパク質または酵素を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載のヌクレアーゼは「遺伝子編集」に使用される。遺伝子編集とは、１種類のヌクレアーゼもしくは遺伝子組換えヌクレアーゼまたは複数の種類のヌクレアーゼを使用して、生物のゲノムにおいてDNAの挿入、欠失または置換を行う遺伝子工学技術の１種である。ヌクレアーゼとしては、CRISPR／CASシステムで使用されるヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびTALENヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼは、遺伝子座または特定の核酸配列を標的とするために使用することができる。
「コーディングエキソン」は、たとえば、RNAスプライシングによってイントロンが除去された後の遺伝子により産生される最終的な成熟RNAの一部をコードする遺伝子の一部を含むが、これに限定されない。「エキソン」は、遺伝子内のDNA配列と、これに対応するRNA転写物配列の両方を指す。RNAスプライシングによってイントロンが除去され、残されたエキソン同士が互いに共有結合で連結し、成熟メッセンジャーRNAの一部を構成する。
本明細書において「Casエンドヌクレアーゼ」または「Casヌクレアーゼ」は、たとえば、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）獲得免疫系と関連したRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素を含むが、これに限定されない。本明細書において「Casエンドヌクレアーゼ」は、天然Casエンドヌクレアーゼおよび組換えCasエンドヌクレアーゼの両方を指す。「Cas9」は、たとえば、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）獲得免疫系と関連したRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素を含むが、これに限定されない。
本明細書において「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、たとえば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインとDNA分解ドメインを融合させることにより作製された人工制限酵素を含むが、これに限定されない。ジンクフィンガードメインは、所望とする特定のDNA配列を標的とするように修飾することができ、これによって、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、複雑なゲノム内のユニークな配列を標的とすることが可能となる。
本明細書において「TALEN」すなわち「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」は、たとえば、特定のDNA配列を切断するように修飾することができる制限酵素を含むが、これに限定されない。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインを、DNA分解ドメイン（DNA鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、事実上、所望とするあらゆるDNA配列に結合するように修飾することができることから、ヌクレアーゼと組み合わせることによって、特定の位置でDNAを切断することができる。制限酵素は、インサイチューで遺伝子編集またはゲノム編集を行うことを目的として細胞に導入することができ、この技術は、遺伝子組換えヌクレアーゼを使用したゲノム編集技術として知られている。TALENは、ジンクフィンガーヌクレアーゼやCRISPR/Cas9と並んで、ゲノム編集分野における卓越したツールの１つである。
「ノックイン」は、たとえば、遺伝子座内に異なるコピーを持つDNA配列情報を１対１で置換したり、遺伝子座内に存在しない配列情報を挿入したりするための遺伝子工学的方法を含むが、これに限定されない。
「プロモーター」は、たとえば、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に位置し、構造遺伝子の転写開始点の近傍にある。転写を開始させるプロモーター配列のエレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始させるDNA領域である。プロモーターは、同じDNA鎖内の上流（センス鎖の５’領域方向）の遺伝子転写開始部位の近傍に位置する。プロモーターの長さは、100塩基対、200塩基対、300塩基対、400塩基対、500塩基対、600塩基対、700塩基対、800塩基対もしくは1000塩基対、または約100塩基対、約200塩基対、約300塩基対、約400塩基対、約500塩基対、約600塩基対、約700塩基対、約800塩基対もしくは約1000塩基対、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さであってもよい。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制型プロモーター、誘導型プロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導型プロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による制御を受けない。抑制型プロモーターも公知である。プロモーターの例としては、構成的プロモーター、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）、および誘導型プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、プロモーターの例として、EF1αプロモーター、PGKプロモーター、MNDプロモーター、KIプロモーター、Ki-67遺伝子プロモーター、ならびに／またはタモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物などの薬物によって誘導可能なプロモーターが挙げられる。一般的に使用される構成的プロモーターとしては、哺乳動物系において使用されるSV40、CMV、UBC、EF1A、PGKおよび／またはCAGGが挙げられるが、これらに限定されない。
弱いプロモーターと強いプロモーターによって同じコード配列を発現させた場合、弱いプロモーターは、強いプロモーターよりもmRNAの発現が低くなる。これは、たとえば、アガロースゲルで分析することによって比較することができる。近接するクロマチンによる制御を受けるプロモーターの一例としては、短いEF1αプロモーターが挙げられ、このプロモーターは、いくつかの遺伝子座において非常に活発であるが、その他の遺伝子座においてはほぼ不活性である（Eyquem, J. et al. (2013). Biotechnol. Bioeng., 110(8):2225-2235）。
「転写エンハンサードメイン」は、たとえば、タンパク質（アクチベーター）が結合することができる短いDNA領域（50〜1500bp）であって、アクチベーターが転写エンハンサードメインに結合することによって特定の遺伝子の転写が起こる可能性やその転写量を高めたり、促進したり、増強させたりすることができるDNA領域を含むが、これに限定されない。このようなアクチベータータンパク質は、通常、転写因子と呼ばれる。エンハンサーは、通常、シス作用性であり、標的遺伝子から最大で1Mbp（1,000,000 bp）離れて位置し、転写開始部位の上流または下流に存在し、順方向または逆方向である。エンハンサーは、制御対象の遺伝子の上流または下流に位置していてもよい。いくつかの実施形態において、転写量を増加させるために複数のエンハンサードメインを使用してもよく、たとえば、多量体化した活性化結合ドメインを使用して、転写量をさらに増強または増加させることができる。さらに、エンハンサーは、転写開始部位から数十万塩基対離れた上流または下流に位置することが何人かの研究者によって見出されたことから、転写に影響を与えるためにエンハンサーを転写開始部位の近傍に置く必要はない。エンハンサーは、プロモーター領域自体には作用しないが、アクチベータータンパク質と結合する。アクチベータータンパク質は、メディエーター複合体と相互作用し、ポリメラーゼIIおよび基本転写因子を動員し、遺伝子の転写を開始する。エンハンサーもイントロン内に存在する。エンハンサーの方向は、逆方向であってもよく、逆方向であることによってその機能は影響を受けない。さらに、エンハンサーは、切断されてもよく、染色体の任意の位置に挿入されてもよく、このような処理を行っても遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態において、FOXP3遺伝子の転写を阻止する抑制機構をサイレンシングするためにエンハンサーを使用する。エンハンサー結合ドメインの一例として、TCRαエンハンサーが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態におけるエンハンサードメインは、TCRαエンハンサーである。いくつかの実施形態において、エンハンサー結合ドメインをプロモーターの上流に配置し、これによってプロモーターを活性化して、タンパク質の転写を増加させる。いくつかの実施形態において、エンハンサー結合ドメインをプロモーターの上流に配置し、これによってプロモーターを活性化して、FOXP3遺伝子の転写を増加させる。
「転写活性化ドメイン」は、たとえば、転写因子が結合することができる特定のDNA配列であって、転写因子が転写活性化領域に結合することによって、DNAからメッセンジャーRNAへの遺伝子情報の転写率を制御することができるDNA配列を含むが、これに限定されない。転写因子の具体例としては、SP1、AP1、C/EBP、熱ショック因子、ATF/CREB、c-Myc、Oct-1、および／またはNF-1が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アクチベータードメインを利用して、FOXP3遺伝子の転写を阻止する抑制機構をサイレンシングする。
「遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）」は、たとえば、ハウスキーピング遺伝子由来の非メチル化CpGアイランドに存在し双方向に転写されるデュアルプロモーターを特徴とするエレメントを含むが、これに限定されない。UCOEは、細胞株、多能性造血幹細胞、PSC、これらから分化した子孫細胞などの様々な細胞モデルにおいて、導入外来遺伝子のサイレンシングを阻止し、かつ発現を維持するための有望なツールである。「作動可能に連結される」は、たとえば、調節配列と異種核酸配列との間の機能的な連結により、この異種核酸配列が発現されることを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、第１の分子が第２の分子に結合されており、第１の分子が第２の分子の機能に対して影響を及ぼすようにこれらの分子が配置されている。これら２つの分子は、連続した単一分子の一部であってもよく、互いに隣接していてもよい。たとえば、プロモーターが細胞内の転写可能な目的のDNA分子の転写を調節する場合、このプロモーターは、この転写可能なDNA分子に作動可能に連結されている。
ペプチド断片などの分子についての説明において使用される「濃度」という用語は、所定の体積の溶液中に存在する分子の量、たとえば、分子のモル数を指す。
「個体」、「対象」および「宿主」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、診断、治療または治療法が所望とされる任意の対象を指す。いくつかの態様において、前記対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、前記対象はヒトである。いくつかの態様において、前記対象はヒト患者である。いくつかの態様において、前記対象は、FOXP3に関連する障害または健康状態を有しているか、FOXP3に関連する障害または健康状態を有している疑いがある。いくつかの態様において、前記対象は、診断時またはその後に、FOXP3に関連する障害または健康状態のリスクがあると診断されたヒトである。いくつかの場合、FOXP3に関連する障害または健康状態のリスクを有するという診断は、FOXP3をコードする内在性遺伝子またはFOXP3の発現に影響を与えうる近傍のゲノム配列における１つ以上の変異の存在に基づいて決定することができる。たとえば、いくつかの態様において、前記対象は、自己免疫障害を有しているか、自己免疫障害を有している疑いがあるか、かつ／または自己免疫障害の１つ以上の症状を有している。いくつかの態様において、前記対象は、診断時またはその後に、自己免疫障害のリスクがあると診断されたヒトである。いくつかの場合、自己免疫障害のリスクを有するという診断は、内在性FOXP3遺伝子またはFOXP3遺伝子の発現に影響を与えうる近傍のゲノム配列における１つ以上の変異の存在に基づいて決定することができる。
「治療」という用語は、疾患または状態を指すときに使用される場合、個体が罹患している状態に関連する症状が少なくとも緩和されることを意味し、ここで「緩和」は、広い意味で使用され、治療を受けている状態（たとえば自己免疫疾患）に関連するパラメータ（たとえば症状）の程度が少なくとも減少することを指す。したがって、治療には、病的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制される状態、たとえば、病的状態やその症状の発症が予防される状態、または病的状態やその症状が完全に排除されて、病的状態または少なくとも病的状態を特徴付ける症状によって宿主が苦しむことがなくなる状態も含まれる。したがって、治療には、（ｉ）予防、すなわち、臨床症状を発症するリスクの低減、たとえば疾患の進行の予防などの臨床症状の発症の予防、および（ii）抑制、すなわち、臨床症状の発症またはさらなる発症の阻止、たとえば、活動性疾患の軽減または完全な抑制が含まれる。
本明細書において「有効量」、「医薬的有効量」および「治療有効量」は、特定の状態を有する対象に投与されたときに所望の有用性を提供するのに十分な組成物の量を意味する。自己免疫障害のエクスビボ治療に関する説明において使用される「有効量」という用語は、自己免疫障害の少なくとも１つ以上の徴候または症状を予防または緩和するために必要とされる治療用細胞またはその子孫細胞の集団の量を指し、所望の効果を提供するため、たとえば、対象において自己免疫障害の症状を治療するために十分な、治療用細胞またはその子孫細胞を含む組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、自己免疫障害を有するかまたはそのリスクがある対象などの、治療を必要とする対象に投与されたときに特定の効果を促進するのに十分な治療用細胞の数または治療用細胞を有する組成物の量を指す。また、「有効量」は、疾患の症状の発症を予防もしくは遅延させるのに十分な量、疾患の症状の経過を変えるのに十分な量（たとえば、疾患の症状の進行を遅らせるのに十分な量（ただしこれに限定されない）、または疾患の症状を改善するのに十分な量を含む場合もある。対象（たとえば、患者）における自己免疫障害のインビボ治療またはインビトロで培養された細胞におけるゲノム編集に関する説明において、「有効量」は、対象における細胞もしくはインビトロで培養された細胞のゲノムを編集するために必要とされるgRNA、ドナー鋳型および／または部位特異的ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）などの、ゲノム編集に使用される構成要素の量を指す。どのような症例であっても、適切な「有効量」は、当業者が日常的な実験を行うだけで決定することができる。
「自己免疫疾患」は、たとえば、免疫系の活性が異常に低くなっているか、あるいは免疫系が過剰に活性化されている状態を含むが、これらに限定されない。免疫系が過剰に活性化されている場合、自己組織が攻撃され、損傷を受ける（自己免疫疾患）。免疫不全疾患では、侵入物に対する生体の攻撃力が弱まるため、感染に対して抵抗性が低くなる。自己免疫障害または自己免疫疾患の例としては、たとえば、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症、IPEX、免疫制御異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群および／または毛細血管拡張性運動失調症を挙げることができるが、これらに限定されない。免疫疾患は、たとえば、対象の血清または脳脊髄液において神経特異的自己抗体またはその他のバイオマーカーが検出された場合、これらの神経特異的自己抗体またはその他のバイオマーカーのプロファイルを調べることによって分析することができる。本明細書において提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、これらの方法は、自己免疫障害を治療、緩和または抑制する方法である。いくつかの実施形態において、自己免疫障害は、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症、IPEX、免疫制御異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群および／または毛細血管拡張性運動失調症である。
「IPEX症候群」とは、免疫制御異常、多腺性内分泌障害、腸疾患およびＸ連鎖を特徴とする症候群を指し、制御性Ｔ細胞系統のマスター調節因子であると広く考えられているFOXP3の機能不全に関連するまれな疾患である。IPEX症候群に罹患した対象は、自己免疫性腸疾患、乾癬状もしくは湿疹性の皮膚炎、爪ジストロフィー、自己免疫性内分泌障害、ならびに／または自己免疫性皮膚疾患（全身性脱毛症および／もしくは水疱性類天疱瘡など）などの症状を示すことがある。IPEXは、免疫系が自己の組織や臓器を攻撃する自己免疫疾患である。IPEX症候群は、CD4+CD25+T制御性細胞の欠損、および転写因子FOXP3の発現の欠損を招く。FOXP3の減少は、制御性Ｔ細胞の欠損に続いて、Ｔ細胞がチェックを受けずに活性化することに起因すると考えられている。
「臓器移植」は、たとえば、１つの体から別の体へと臓器を移動させたり、患者自身の体内のドナー部位から別の部位へと臓器を移動させることによって、レシピエントの損傷臓器を置き換えたり、レシピエントの体内に存在しない臓器を移すことを含むが、これらに限定されない。同一人物の生体内における臓器および／または組織の移植は自家移植と呼ばれる。近年実施されているような、同じ生物種に属する２つの対象間での移植は同種移植と呼ばれる。同種移植では、生体または死体から得た臓器または組織が移植される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法を提供する。
移植可能な臓器としては、たとえば、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸管および／または胸腺が挙げられる。移植可能な組織としては、たとえば、骨および腱（これらを筋骨格移植片と呼ぶ）、角膜、皮膚、心臓弁、神経および／または静脈が挙げられる。腎臓、肝臓および心臓は、最も一般的に移植が行われている臓器である。角膜および筋骨格移植片は、最も一般的に移植が行われている組織である。
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記対象は、１種以上の抗拒絶反応薬の投与対象として選択または特定された対象である。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、および／またはプログラフ（タクロリムス）を含む。
いくつかの実施形態において、前記対象は、本発明の実施形態に記載の遺伝子組換え細胞を使用した抑制、緩和または治療を実施する対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗炎症薬または抗拒絶反応薬に対して１種以上の副作用を経験したことのある対象である。したがって、本明細書において提供される代表的な細胞または組成物を、前記選択された対象に提供する。抗拒絶反応薬の副作用としては、他の薬物との相互作用による血中タクロリムス量の上昇または低下、腎毒性、高血圧、神経毒性（振戦、頭痛、刺痛および不眠）、糖尿病（高血糖）、下痢、悪心、脱毛および／または高カリウム血症が挙げられる。したがって、本明細書に記載の治療方法、抑制方法または緩和方法を実施するため、臨床的評価または診断的評価によって前記対象が選択される。
本明細書において「臓器拒絶」または「移植拒絶反応」は、たとえば、レシピエントの免疫系によって移植組織が拒絶されて、移植組織が破壊されることを含むが、これに限定されない。
「移植片対宿主病（GVHD）」は、遺伝学的に異なるヒトからの組織移植を受けた後に起こる医学的合併症を含むが、これに限定されない。GVHDは、幹細胞移植または骨髄移植に付随して起こることが多いが、GVHDという用語は、その他の形態の移植組織片による合併症を指す場合にも使用される。ドナーから提供された組織中の免疫細胞は、レシピエントを「自己」ではなく異物として認識する。本発明の実施形態のいくつかにおいて、本発明の方法は、GVHDに起因する合併症を予防または緩和するために使用することができる。
「医薬添加剤」は、たとえば、細胞を添加して組成物を得るための不活性物質を含むが、これに限定されない。
本明細書において「キメラ抗原受容体（CAR）」は、たとえば、キメラＴ細胞受容体としても知られており、エフェクター免疫細胞に所望の特異性を移植することができる人工Ｔ細胞受容体または遺伝子組換え受容体を含むが、これらに限定されない。CARは、前記疾患または障害に関連する分子と結合する抗体配列やその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含む合成設計された受容体であってもよく、該リガンド結合ドメインが、スペーサードメインを介して、Ｔ細胞受容体またはその他の受容体に由来する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）に連結されている。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸を含み、キメラ抗原受容体を含む細胞（哺乳動物細胞など）が作製される。キメラ抗原受容体を使用して、たとえば、モノクローナル抗体またはその結合部分の特異性をＴ細胞に移植することができる。本発明の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え細胞は、キメラ抗原受容体をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞上の分子に特異的である。Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子組換え細胞またはキメラ抗原受容体を使用して、FOXP3の発現を必要とする特定の組織を標的することができる。本発明の実施形態のいくつかにおいて、特定の組織を標的とすることによってFOXP3を提供および送達する方法を含む。いくつかの実施形態において、前記組織は移植組織である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、移植組織上の標的分子に特異的である。
本明細書で述べるように、本発明の遺伝子組換え細胞は、FOXP3を発現するように遺伝子組換えされた細胞であり、したがって、本発明の実施形態において、これらの細胞を「Treg表現型」細胞とも呼ぶ。
本明細書において「タンパク質配列」は、たとえば、タンパク質の一次構造であるアミノ酸のポリペプチド配列を含むが、これに限定されない。また、本明細書において「上流」は、ポリヌクレオチド上の５’位側の位置、およびポリペプチド上のＮ末端側に向かった位置を意味する。また、本明細書において「下流」は、ヌクレオチド上の３’位側の位置、およびポリペプチド上のＣ末端側に向かった位置を意味する。したがって、「Ｎ末端」は、ポリペプチド上のＮ末端側の位置に向かったポリヌクレオチド上のエレメントの位置または特定の位置を指す。
タンパク質の説明に関する「機能性等価物」または「機能性等価物の断片」は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有していてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、元のアミノ酸と同等の特性を有する別のアミノ酸へのアミノ酸置換を指す。保存的アミノ酸群を以下に示す。
Figure 2021521849
保存的置換は、所定のペプチドまたはその断片のどの位置に導入してもよい。しかしながら、非保存的置換が望ましい場合もあり、特に、任意の１つ以上の位置に非保存的置換を導入することが望ましい場合もあるが、これに限定されない。ペプチドの機能的等価物断片を形成することが可能な非保存的置換は、たとえば、極性、電荷、および／または立体的嵩高さが実質的に異なるが、誘導体またはバリアントの断片の機能性を維持している。
「配列同一性（%）」は、比較ウィンドウ上の最適アライメントにおいて２つの配列を比較することによって決定される。比較ウィンドウ上のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメント用の参照配列（付加や欠失を含まない）と比較して付加または欠失（ギャップなど）を有していてもよい。場合によっては、配列同一性（%）は、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を測定して、核酸塩基またはアミノ酸残基が一致する位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ上の位置の総数で割り、得られた結果に100を掛けることにより、配列同一性（%）を算出することができる。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する「同一性」または「同一性（%）」は、後述する配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手動のアラインメントおよび目視での判別により測定した場合に、比較ウィンドウまたは指定された領域において最大の一致が得られるように比較および整列した際に、同一であると判定された２つ以上の配列または部分配列を指すか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドが特定のパーセンテージ（たとえば特定の領域、たとえばポリペプチド配列全体またはポリペプチドの個々のドメインにおいて、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。このような配列を「実質的に同一」と呼ぶ。この定義は、試験配列の相補鎖にも当てはまる。
本明細書において「相補的」または「実質的に相補的」という用語は、同じ意味で使用され、特定の核酸（たとえばDNAまたはRNA）が、配列特異的かつ逆平行に別の核酸に非共有結合を介して結合し（たとえば、特定の核酸が相補的な核酸に特異的に結合し）、たとえば、ワトソン−クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成することが可能なヌクレオチド配列を有することを意味する。当技術分野で知られているように、標準的なワトソン−クリック塩基対合として、チミジン（Ｔ）とアデニン（Ａ）の対合、ウラシル（Ｕ）とアデニン（Ａ）の対合、およびシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対合がある。
特定のRNAを「コードする」DNA配列は、RNAに転写されうるDNA核酸配列である。DNAポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるRNA（mRNA）をコードすることもあれば、タンパク質に翻訳されないRNA（たとえば、tRNA、rRNA、またはガイドRNA；本明細書において「非コード」RNAまたは「ncRNA」とも呼ぶ）をコードすることもある。「タンパク質のコード配列」または「特定のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列」は、インビトロまたはインビボにおいて適切な調節配列の制御下に置かれたときに、mRNAに転写され（DNAの場合）、ポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。
本明細書において「コドン」は、DNA分子またはRNA分子において、３つのヌクレオチドからなる配列によって形成される１つの遺伝コード単位を指す。本明細書において「コドンの縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列の変化を可能にする遺伝コードの特性を指す。
「コドン最適化された」または「コドンの最適化」は、様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指し、DNAによってコードされるポリペプチドの変化を伴わずに宿主生物において典型的に使用されるコドンを反映させるための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更を指す。このような最適化には、その生物の遺伝子において使用頻度の高い１つ以上のコドンで、少なくとも１つのコドン、複数のコドン、または非常に多数の数のコドンを置き換えることが含まれる。コドンの使用頻度を示した表は、たとえば、www.kazusa.or.jp/codon/（2019年3月20日に訪問）において利用可能な「Codon Usage Database」から容易に入手することができる。当業者であれば、各生物におけるコドンの使用頻度またはコドンの嗜好性に関する知識を利用して、所定のポリペプチド配列にコドンの頻度を適用することによって、ポリペプチドをコードし、所定の生物種に最適なコドンが使用されたコドン最適化コード領域の核酸断片を製造することができる。コドン最適化されたコード領域は、当業者に公知の様々な方法によって設計することができる。
たとえば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される「組換え」または「操作された」という用語は、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、実験室的方法により改変されたものであるか、実験室的方法の結果として得られたものであることを示す。したがって、たとえば、組換えタンパク質または操作されたタンパク質には、実験室的方法によって生成されたタンパク質が含まれる。組換えタンパク質または操作されたタンパク質は、天然（非組換えまたは野生型）のタンパク質には見られないアミノ酸残基を含んでいたり、修飾（たとえば標識）されたアミノ酸残基を含むことがある。「組換え」または「操作された」という用語は、ペプチド、タンパク質または核酸配列への何らかの改変を含むことがある。このような改変には、ペプチド、タンパク質または核酸配列（１つ以上のアミノ酸、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む）の化学的改変；ペプチドまたはタンパク質における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換；ならびに核酸配列における１つ以上の核酸の付加、欠失、および／または置換が含まれていてもよい。
「ゲノムDNA」または「ゲノム配列」は、細菌、真菌、古細菌、植物または動物のゲノムDNAを含む（ただし、これらに限定されない）、生物のゲノムDNAを指す。
本明細書において、核酸に関する「導入遺伝子」、「外来性遺伝子」または「外来性配列」は、細胞のゲノムには存在しないが、たとえばゲノム編集などを介してゲノムに人工的に導入された核酸配列または遺伝子を指す。
本明細書において、核酸に関する「内在性遺伝子」または「内在性配列」は、人工的手段を介して導入されることなく、細胞のゲノムに元から存在する核酸配列または遺伝子を指す。
本明細書において「発現」または「タンパク質発現」いう用語は、転写されたRNA分子がタンパク質分子へと翻訳されることを指す。タンパク質発現は、その時間的特性、空間的特性、発生的特性または形態学的特性、および定量的指標または定性的指標によって特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記複数のタンパク質は、リガンドの存在下で二量体化できる配置で発現される。
本明細書において「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、元は別々のタンパク質または別々のタンパク質の一部分をコードしていた２つ以上の遺伝子を連結することによって作製されたタンパク質である。融合タンパク質は別々の２つ以上のタンパク質に由来する特定のタンパク質ドメインから作製することもできる。このような融合遺伝子を翻訳することによって、元の各タンパク質に由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドまたは複数のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療に使用される組換えDNA技術により人工的に作製することができる。このような融合タンパク質の作製方法は、当業者に公知である。いくつかの融合タンパク質は、複数のペプチド全体を組み合わせたものであり、したがって、元のタンパク質のすべてのドメインを含み、特にすべての機能ドメインを含むことがある。しかしながら、その他の融合タンパク質、特に天然に存在しないタンパク質は、コード配列の一部のみを組み合わせたものであることから、このようなタンパク質が由来する親遺伝子の元の機能を維持していない。
「ベクター」、「発現ベクター」または「コンストラクト」は、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であり、様々な調節エレメントを含むことから、細胞において異種核酸を発現させることができる。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母またはウイルスゲノムである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターであるいくつかの実施形態において、前記ベクターは、大腸菌などの細菌系におけるタンパク質発現用のベクターである。本明細書において「発現」または「タンパク質発現」は、転写されたRNA分子がタンパク質分子へと翻訳されることを指す。タンパク質発現は、その時間的特性、空間的特性、発生的特性または形態学的特性、および定量的指標または定性的指標によって特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記複数のタンパク質は、リガンドの存在下で二量体化できる配置で発現される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである（たとえば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11などが挙げられるが、これらに限定されない）。
本明細書において「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、たとえば、元は別々のタンパク質または別々のタンパク質の一部分をコードしていた２つ以上の遺伝子を連結することによって作製されたタンパク質を含むが、これに限定されない。融合タンパク質は別々の２つ以上のタンパク質に由来する特定のタンパク質ドメインから作製することもできる。このような融合遺伝子を翻訳することによって、元の各タンパク質に由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドまたは複数のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療に使用される組換えDNA技術により人工的に作製することができる。このような融合タンパク質の作製方法は、当業者に公知である。いくつかの融合タンパク質は、複数のペプチド全体を組み合わせたものであり、したがって、元のタンパク質のすべてのドメインを含み、特にすべての機能ドメインを含むことがある。しかしながら、その他の融合タンパク質、特に天然に存在しないタンパク質は、コード配列の一部のみを組み合わせたものであることから、このようなタンパク質が由来する親遺伝子の元の機能を維持していない。いくつかの実施形態において、インターフェロンおよび／もしくはPD-1タンパク質またはその両方を含む融合タンパク質を提供する。
「条件的」プロモーターまたは「誘導型」プロモーターは、誘導因子の存在下で遺伝子を発現させるが、誘導因子の非存在下では実質的に遺伝子を発現させないプロモーターを含む核酸コンストラクトを指す。
本明細書において「構成的」は、 構成的なプロモーターを含むことから、継続的に産生されるポリペプチドを発現させる核酸コンストラクトを指す。
いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、基底レベルでの活性が低い。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを用いる場合、発現が誘導されていない細胞における基底レベルでの活性は、細胞において遺伝子の発現が誘導された場合の20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%もしくはこれら以下（ただし0%ではない）、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内のパーセンテージである。基底レベルでの活性は、フローサイトメトリーを用いて、誘導因子（たとえば薬物）の非存在下で導入遺伝子（たとえばマーカー遺伝子）の発現量を測定することによって決定することができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、Aktなどのマーカータンパク質を使用して発現が測定される。
いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターが発現されると、発現が誘導されていない場合や基底レベルでの活性と比べて高い活性を誘導することができる。いくつかの実施形態において、発現が誘導された場合の活性レベルは、発現が誘導されていない場合の２倍、４倍、６倍、８倍、９倍、１０倍もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の倍率である。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターの制御下にある導入遺伝子は、トランス活性化因子の非存在下において、１０日未満、８日未満、６日未満、４日未満、２日未満もしくは１日未満、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間でオフの状態となるが、０日ではオフの状態とはならない。
いくつかの実施形態において、基底レベルでの活性が低く、高レベルの発現が誘導され、かつ／または短期間でオンとオフとを切り替えることができるように、誘導型プロモーターを設計および／または改変する。
本明細書において、「二量体化した化学誘導シグナル伝達複合体（dimeric chemical-induced signaling complex）」、「二量体化CISC」または「二量体」は、CISCを構成する２つの構成要素を指し、これらの２つの構成要素は、互いに結合して融合タンパク質複合体を形成してもよく、互いに結合せずに融合タンパク質複合体を形成していなくてもよい。「二量体化」とは、２つの別々のものが互いに結合して単一のものになるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、リガンドまたは薬剤によって二量体化が刺激される。いくつかの実施形態において、「二量体化」はホモ二量体化を指し、すなわち、２つの同一のものが結合して二量体化すること、たとえば、２つの同一のCISC構成要素が結合して二量体化することを指す。いくつかの実施形態では、「二量体化」はヘテロ二量体化を指し、２つの異なるものが結合して二量体化すること、たとえば、２つの異なる別々のCISC構成要素が結合して二量体化することを指す。いくつかの実施形態では、CISC構成要素の二量体化によって、細胞シグナル伝達経路が形成される。いくつかの実施形態では、CISC構成要素の二量体化によって、細胞または細胞集団の選択的な拡大増殖が可能となる。さらなるCISCシステムは、CISCとジベレリンによるCISC二量体化システム、またはSLF−TMPを使用したCISC二量体化システムを含んでいてもよい。その他の化学的に誘導可能な二量体化（CID）システムおよびその構成要素を使用してもよい。
本明細書において「化学誘導シグナル伝達複合体（chemical-induced signaling complex）」または「CISC」は、細胞の内部においてシグナルを開始し、その直接的な結果として、リガンドの誘導により二量体化を起こす遺伝子組換え複合体を指す。CISCは、ホモ二量体（２つの同一の構成要素が二量体化したもの）であってもよく、ヘテロ二量体（２つの異なる構成要素が二量体化したもの）であってもよい。したがって、本明細書において「ホモ二量体」という用語は、同一のアミノ酸配列を有する本明細書中に記載の２つのタンパク質構成要素からなる二量体を指す。また、「ヘテロ二量体」という用語は、アミノ酸配列が同一ではない本明細書に記載の２つのタンパク質構成要素からなる二量体を指す。
CISCは、本明細書においてさらに詳細に述べるような合成複合体であってもよい。本明細書において「合成」は、天然のものではなく、自然界でも見られない本明細書に記載の複合体、タンパク質、二量体または組成物を指す。いくつかの実施形態において、「IL2R−CISC」は、インターロイキン２受容体の構成要素を含むシグナル伝達複合体を指す。いくつかの実施形態において、「IL2/15−CISC」は、インターロイキン２および／またはインターロイキン１５によって共有される受容体シグナル伝達サブユニットを含むシグナル伝達複合体を指す。いくつかの実施形態において、「IL7−CISC」は、インターロイキン７受容体の構成要素を含むシグナル伝達複合体を指す。したがって、CISCは、特定のCISCの構成要素を構成する構成要素部分に従って命名してもよい。当業者であれば、化学誘導シグナル伝達複合体の構成要素部分が、CISCへの組み込みに有用な天然または合成の構成要素から構成されていてもよいことを認識できるであろう。したがって、本明細書で提供されるこれらの例は、本発明を限定するものではない。
CISC（化学誘導性シグナル伝達複合体（chemically induced signaling complex））は、国際特許出願PCT/US2017/065746（この文献は引用によってその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、宿主細胞において２種のキメラタンパク質として共発現するように構成された、複数の構成要素からなる合成タンパク質複合体である。CISCに含まれる２つのキメラタンパク質構成要素は、一方が、ラパマイシン結合複合体の半分を構成する細胞外ドメインであり、これが、ラパマイシン結合複合体の残りの半分を構成する細胞内シグナル伝達複合体に融合されている。CISCをコードする核酸を宿主細胞に送達することによって、この宿主細胞において、ラパマイシンまたはラパマイシン関連化合物の存在によって制御可能な細胞内シグナル伝達を発生させることができる。
本明細書において「サイトカイン受容体」は、サイトカインを認識してこれに結合する受容体分子を指す。いくつかの実施形態において、サイトカイン受容体は、サイトカイン受容体のアミノ酸配列および／または核酸配列に置換、欠失および／または付加を含む修飾サイトカイン受容体分子（たとえば「サイトカイン受容体のバリアント」）を包含する。したがって、「サイトカイン受容体」という用語は、野生型サイトカイン受容体のみならず、組換えサイトカイン受容体、合成サイトカイン受容体およびサイトカイン受容体のバリアントを包含することが意図される。いくつかの実施形態において、サイトカイン受容体は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、受容体の構成要素（すなわち受容体の各ドメイン）は、天然のものまたは合成されたものである。いくつかの実施形態において、各ドメインは、ヒト由来のドメインである。
本明細書において「FKBP」は、FK506結合タンパク質ドメインである。FKBPは、プロリルイソメラーゼ活性を有するタンパク質ファミリーを指し、シクロフィリンと機能の点で関連しているが、アミノ酸配列の点では類似していない。FKBPは、酵母からヒトを含む多くの真核生物において同定されており、プロリン残基を含むタンパク質のタンパク質フォールディングシャペロンとして機能する。FKBPは、シクロフィリンとともにイムノフィリンファミリーに属する。FKBPは、たとえば、FKBP12を含むとともに、AIP遺伝子、AIPL1遺伝子、FKBP1A遺伝子、FKBP1B遺伝子、FKBP2遺伝子、FKBP3遺伝子、FKBP5遺伝子、FKBP6遺伝子、FKBP7遺伝子、FKBP8遺伝子、FKBP9遺伝子、FKBP9L遺伝子、FKBP10遺伝子、FKBP11遺伝子、FKBP14遺伝子、FKBP15遺伝子、FKBP52遺伝子、および／またはLOC541473遺伝子によってコードされるタンパク質；それらのホモログおよび機能性タンパク質断片を含む。
本明細書において「FRB」は、FKBPラパマイシン結合ドメインである。FRBドメインは、FKBPタンパク質とラパマイシンまたはそのラパログと一緒になって三者複合体を形成するように構成されたポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。FRBドメインは、様々な天然のタンパク質中に存在し、ヒトおよびその他の生物種に由来するmTORタンパク質（本明細書中でFRAP、RAPT１またはRAFTとも呼ばれる）；Tor1および／もしくはTor2を含む酵母タンパク質；ならびに／またはカンジダ属のFRAPホモログなどに存在する。FKBPおよびFRBはいずれも、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）のシグナル伝達の主要構成要素である。
「ネイキッドなFKBPラパマイシン結合ドメインポリペプチド」または「ネイキッドなFRBドメインポリペプチド」は、FRBドメインのアミノ酸配列のみを含むポリペプチドを指すか、あるいはタンパク質のアミノ酸配列の90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%、または約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%がFRBドメインのアミノ酸配列からなるタンパク質を指す。FRBドメインは、12kDaの可溶性タンパク質として発現させることができる（Chen, J. et al. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(11):4947-4951）。FRBドメインは４ヘリックスバンドルを形成し、これは球状タンパク質に一般に見られる構造モチーフである。FRBドメイン全体の寸法は、30Å×45Å×30Åであり、４本のヘリックス同士は、シトクロムb562のフォールディングに類似した下側の短いループで連結されている（Choi, J. et al. (1996). Science, 273(5272):239-242）。いくつかの実施形態において、ネイキッドなFRBドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
セレブロンは、損傷を受けたDNA結合タンパク質１と相互作用し、Cullin4とともにE3ユビキチンリガーゼ複合体を形成する。このE3ユビキチンリガーゼ複合体は、基質受容体として機能し、セレブロンによって認識されたタンパク質は、ユビキチン化され、プロテアソームによって分解されうる。不必要なタンパク質または損傷を受けたタンパク質のプロテアソームを介した分解は、細胞の正常な機能（たとえば細胞の生存、増殖および／または成長など）の維持に非常に重要な役割を果たしている。セレブロンへの免疫調節性イミド薬（IMIDs）（たとえばサリドマイド）の結合は催奇形と関連しており、さらにレナリドミドなどではIMIDsの細胞傷害性も見られる。セレブロンは、ミエローマ細胞の機能維持に関与する因子の結合、ユビキチン化および分解において中心的な役割を果たしている。
「セレブロンのサリドマイド結合ドメイン」は、たとえば、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドミド、アプレミラスト、またはこれらの関連類似体などのIMIDと相互作用する細胞外結合ドメインを指す。本明細書で提供される実施形態のいくつかは、セレブロンのサリドマイド結合ドメインの類似体または変異体を利用する。いくつかの実施形態において、これらの細胞外結合ドメインは、IMIDリガンド同時に結合するように構成されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用される免疫調節性イミド薬は、サリドマイド（その類似体、誘導体および／または薬学的に許容される塩を含む）を含んでいてもよい。サリドマイドとして、Immunoprin、サロミド、Talidex、Talizer、Neurosedyn、α−（Ｎ−フタルイミド）グルタルイミド、２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−１，３−ジオン）；またはポマリドマイド（その類似体、誘導体および／または薬学的に許容される塩を含む）を挙げることができる。ポマリドマイドとして、ポマリスト、Imnovid、（ＲＳ）−４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオン；またはレナリドミド（その類似体、誘導体および／または薬学的に許容される塩を含む）を挙げることができる。レナリドマイドとして、レブリミド、（ＲＳ）−３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオン；またはアプレミラスト（その類似体、誘導体および／または薬学的に許容される塩を含む）を挙げることができる。アプレミラストとして、オテズラ、CC-10004、Ｎ−｛２−［（１Ｓ）−１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−（メチルスルホニル）エチル］−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝アセトアミド）；またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
本明細書で述べる「細胞外結合ドメイン」は、複合体を構成するドメインの１つであり、特定の原子または特定の分子に結合するように構成され、細胞の外側に存在するドメインを指す。いくつかの実施形態において、CISCの細胞外結合ドメインは、FKBPドメインまたはその一部である。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、FRBドメインまたはその一部である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは、リガンドまたは薬剤に結合することにより、２つのCISC構成要素の二量体化を刺激するように構成されている。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、サイトカイン受容体モジュレーターに結合するように構成されている。
本明細書において「サイトカイン受容体モジュレーター」は、サイトカイン受容体の下流の標的のリン酸化、サイトカイン受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化、および／またはサイトカインなどの特定のタンパク質の発現を調節する薬剤を指す。そのような薬剤は、サイトカイン受容体の下流の標的のリン酸化、サイトカイン受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化、および／またはサイトカインなどの特定のタンパク質の発現を、直接的または間接的に調節してもよい。したがって、サイトカイン受容体モジュレーターの例としては、サイトカイン；サイトカインの断片；融合タンパク質；および／またはサイトカイン受容体もしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体もしくはその結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、サイトカイン受容体モジュレーターの例としては、サイトカインまたはその断片に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド（たとえば可溶性サイトカイン受容体）、融合タンパク質、および／または抗体もしくはその結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「活性化する」とは、目的のタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性の増強を指す。同様に、「活性化」は、活性が増強した状態にある目的のタンパク質の状態を指す。「活性化可能」は、目的のタンパク質が、シグナル、薬剤、リガンド、化合物または刺激の存在下で活性化可能であることを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二量体は、シグナル、薬剤、リガンド、化合物または刺激の存在下で活性化され、シグナル伝達能を有する二量体になる。本明細書中において「シグナル伝達能を有する」とは、下流のシグナル伝達経路を開始または持続させることができるという二量体の能力またはその配置を指す。
本明細書において「ヒンジドメイン」は、細胞外結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し、それによって細胞外結合ドメインに柔軟性を付与してもよいドメインを指す。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインによって細胞外ドメインを細胞膜の近くに配置し、抗体またはその結合断片による認識の可能性を最小限に抑える。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは、ヒンジドメインのＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。
本明細書において「膜貫通ドメイン」または「TMドメイン」は、細胞膜などの膜の内部で安定なドメインを指す。「膜貫通スパン」、「膜内在性タンパク質」、および「膜内在性ドメイン」という用語も本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインおよび細胞外ドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然のドメインまたは合成されたドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、IL-2膜貫通ドメインである。
本明細書において「シグナル伝達ドメイン」は、細胞（哺乳動物細胞など）の内部のシグナル伝達カスケードに関与する融合タンパク質のドメインまたはCISCの構成要素のドメインを指す。「シグナル伝達ドメイン」は、TCR／CD3複合体のCD3ζ鎖などによって提供される第１のシグナルに加えて、細胞性応答（Ｔ細胞応答など）を仲介するシグナルを細胞（Ｔ細胞など）に提供するシグナル伝達部分を指し、仲介される細胞性応答としては、活性化、増殖、分化および／またはサイトカイン分泌が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインおよび細胞外ドメインのＮ末端側にある。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、合成ドメインまたは天然のドメインである。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、連結された細胞質内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、サイトカインシグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、抗原シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、インターロイキン２受容体γサブユニット（IL2RγまたはIL2Rg）ドメインである。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、インターロイキン２受容体βサブユニット（IL2RβまたはIL2Rb）ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインに薬剤またはリガンドが結合することにより、CISC構成要素が二量体化し、その結果、シグナル伝達経路が活性化され、シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達が起こる。本明細書において「シグナル伝達」は、細胞外ドメインにリガンドまたは薬剤が結合することによって、シグナル伝達経路が活性化されることを指す。リガンドまたは薬剤に細胞外ドメインが結合することによって、CISC構成要素が二量体化し、シグナルが活性化される。
本明細書において「IL2Rb」または「IL2Rβ」は、インターロイキン２受容体βサブユニットを指す。同様に、「IL2Rg」または「IL2Rγ」は、インターロイキン２受容体γサブユニットを指し、「IL2Ra」または「IL2Rα」はインターロイキン２受容体αサブユニットを指す。IL-2受容体には３つの形態、すなわちα鎖、β鎖およびγ鎖があり、これらは、その他のサイトカインの受容体のサブユニットでもある。IL2RβおよびIL2Rγは、I型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。本明細書において「IL2R」は、インターロイキン２受容体を指し、Ｔ細胞を介した免疫応答に関与する。IL2Rは、受容体依存性エンドサイトーシス、およびインターロイキン２からの細胞分裂促進性シグナルの伝達に関与する。同様に、「IL-2/15R」は、IL-2およびIL-15によって共有される受容体シグナル伝達サブユニットを指し、αサブユニット（IL2/15RaまたはIL2/15Rα）、βサブユニット（IL2/15RbまたはIL2/15Rβ）またはγサブユニット（IL2/15RgまたはIL2/15Rγ）を含みうる。
いくつかの実施形態では、化学誘導シグナル伝達複合体は、２つの構成要素を含むヘテロ二量体化活性化シグナル伝達複合体である。いくつかの実施形態において、第１の構成要素は、ヘテロ二量体化ペアの一方である細胞外結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上の連結された細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の構成要素は、ヘテロ二量体化ペアのもう一方である細胞外結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上の連結された細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、２種の遺伝子組換えイベントが起こる。いくつかの実施形態において、これら２つのCISC構成要素は、哺乳動物細胞などの細胞において発現される。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞集団などの細胞集団を、ヘテロ二量体化を起こすリガンドまたは因子と接触させ、それによってシグナル伝達を開始させる。いくつかの実施形態において、ホモ二量体化ペアが二量体化し、それによって単一のCISC構成要素が哺乳動物細胞などの細胞において発現され、ホモ二量体化したCISC構成要素がシグナル伝達を開始する。
本明細書において「リガンド」または「薬剤」は、所望の生物学的効果を有する分子を指す。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインがリガンドを認識してこれに結合し、リガンドと２つの結合性CISC構成要素を含む三者複合体を形成する。リガンドとしては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、抗体、その結合部分などの（ただしこれらに限定されない）タンパク質性分子；小分子（1000ダルトン未満）、無機化合物または有機化合物；ならびに二本鎖DNAもしくは一本鎖DNA、二本鎖RNAもしくは一本鎖RNA（たとえば、アンチセンスRNA、RNAiなど）、アプタマー、三重らせん核酸分子などの（ただしこれらに限定されない）核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドは、公知の生物（動物（たとえば哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物））、植物、細菌、真菌および／もしくは原生生物またはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）であればどのような生物に由来するものであってもよく、これらから得られたものであってもよく、あるいは合成分子ライブラリーに由来するものであってもよく、これらから得られたものであってもよい。いくつかの実施形態において、リガンドは、タンパク質、抗体もしくはその一部、小分子、または薬物である。いくつかの実施形態において、リガンドは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体（ラパログ）である。いくつかの実施形態において、前記ラパログは、Ｃ７位、Ｃ４２位および／もしくはＣ２９位のメトキシの脱メチル化、除去もしくは置換；Ｃ１３位、Ｃ４３位および／もしくはＣ２８位のヒドロキシの除去、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４位、Ｃ２４位および／もしくはＣ３０位のケトンの還元、除去もしくは誘導体化；６員ピペコラート環の５員プロリル環による置換；およびシクロヘキシル環上の別の置換もしくはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換のうちの１つ以上の修飾をラパマイシンに対して行ったラパマイシンのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ラパログは、エベロリムス、merilimus、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、CCI-779、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、C16-iRap、AP21967、ミコフェノール酸ナトリウム、塩酸ベニジピン、AP23573もしくはAP1903、またはこれらのいずれかの代謝物、誘導体および／もしくは組み合わせである。いくつかの実施形態において、リガンドは、IMID系薬物（たとえば、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドまたはこれらに関連する類似体）である。
本明細書において「同時結合」は、２つ以上のCISC構成要素がリガンドに同時に結合し、場合によっては、２つ以上のCISC構成要素が実質的に同時にリガンドに結合して、CISC構成要素とリガンド構成要素を含む複数の構成要素からなる複合体を形成し、その結果、シグナルの活性化がもたらされることを指す。同時結合がなされるには、CISC構成要素が単一のリガンドに空間的に結合するように構成されている必要があり、かつ両方のCISC構成要素が、同じリガンド（の異なる部分）に結合するように構成されている必要がある。
本明細書において「選択的な拡大増殖」は、哺乳動物細胞のような所望の細胞、または哺乳動物細胞集団のような所望の細胞集団の拡大増殖能を指す。いくつかの実施形態では、選択的な拡大増殖は、２種の遺伝子が組換えられた純粋な細胞（哺乳動物細胞など）の集団の発生または拡大増殖を指す。二量体化CISCを構成する一方の構成要素は、一方の遺伝子組換えに関与し、もう一方の構成要素は、もう一方の遺伝子組換えに関与する。したがって、ヘテロ二量体化CISCの各構成要素は、各遺伝子組換えと関連している。細胞をリガンドに曝露することによって、所望とする両方の改変を有する細胞（哺乳動物細胞など）のみを選択的に拡大増殖させることが可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、リガンドとの接触に対して応答することができる細胞（たとえば哺乳動物細胞）は、ヘテロ二量体化CISCの両方の構成要素を発現する細胞のみである。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達複合体の化学的誘導のための本明細書に記載の方法において使用されるリガンドまたは薬剤として、ラパマイシンが挙げられる（その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む）。ラパマイシンとしては、シロリムス、Rapamune、（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン）を挙げることができる。また、エベロリムスが挙げられ、エベロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。エベロリムスとしては、RAD001、Zortress、サーティカン、アフィニトール、Votubia、４２−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−［（２Ｒ）−１−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］プロパン−２−イル］−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペントンを挙げることができる。また、merilimusが挙げられ、merilimusは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。merilimusとしては、SAR943、４２−Ｏ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン（Merilimus-1）；４２−Ｏ−（オキセタン−３−イル）ラパマイシン（Merilimus-2）、４２−Ｏ−（テトラヒドロピラン−３−イル）ラパマイシン（Merilimus-3）、４２−Ｏ−（４−メチル、テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン、４２−Ｏ−（２，５，５−トリメチル、テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン、４２−Ｏ−（２，５−ジエチル−２−メチル、テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン、４２−Ｏ−（２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−６−メトキシ−２−メチル）ラパマイシン、または４２−Ｏ−（２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２，２−ジメチル−６−フェニル）ラパマイシンを挙げることができる）。また、ノボリムスが挙げられ、ノボリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。ノボリムスとしては、１６−Ｏ−デメチルラパマイシンを挙げることができる。また、ピメクロリムスが挙げられ、ピメクロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。ピメクロリムスとしては、Elidel、（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，８Ｒ，９Ｅ，１２Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ，１６Ｓ，１８Ｒ，１９Ｒ，２６ａＳ）−３−（（Ｅ）−２−（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−クロロ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル）−８−エチル−５，６，８，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２４，２６，２６ａ−ヘキサデカヒドロ−５，１９−エポキシ−３Ｈ−ピリド（２，１−ｃ）（１，４）オキサアザシクロトリコシン−１，１７，２０，２１（４Ｈ，２３Ｈ）−テトロン、３３−エピ−クロロ−３３−デスオキシアスコマイシンを挙げることができる。また、リダホロリムスが挙げられ、リダホロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。リダホロリムスとしては、AP23573、MK-8669、デホロリムス、（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１２−（（１Ｒ）−２−（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（（ジメチルホスフィノイル）オキシ）−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルエチル）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ（３０．３．１．０４，９）ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペントンを挙げることができる。また、タクロリムスが挙げられ、タクロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。タクロリムスとしては、FK-506、フジマイシン、プログラフ、Advagraf、プロトピック、３Ｓ−［３Ｒ*［Ｅ（１Ｓ*，３Ｓ*，４Ｓ*）］，４Ｓ*，５Ｒ*，８Ｓ*，９Ｅ，１２Ｒ*，１４Ｒ*，１５Ｓ*，１６Ｒ*，１８Ｓ*，１９Ｓ*，２６ａＲ*５，６，８，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２４，２５，２６，２６ａ−ヘキサデカヒドロ−５，１９−ジヒドロキシ−３−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルエテニル］−１４，１６−ジメトキシ−４，１０，１２，１８−テトラメチル−８−（２−プロペニル）−１５，１９−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロトリコシン−１，７，２０，２１（４Ｈ，２３Ｈ）−テトロン一水和物を挙げることができる。また、テムシロリムスが挙げられ、テムシロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。テムシロリムスとしては、CCI-779、CCL-779、トーリセル、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−｛（２Ｒ）−２−［（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，２７−ジヒドロキシ−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−１，５，１１，２８，２９−ペンタオキソ−１，４，５，６，９，１０，１１，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３１，３２，３３，３４，３４ａ−テトラコサヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−３−イル］プロピル｝−２−メトキシシクロヘキシル ３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノアートを挙げることができる。また、ウミロリムスが挙げられ、ウミロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。ウミロリムスとしては、Biolimus、Biolimus A9、BA9、TRM-986、４２−Ｏ−（２−エトキシエチル）ラパマイシンを挙げることができる。また、ゾタロリムスが挙げられ、ゾタロリムスは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。ゾタロリムスとしては、ABT-578、（４２Ｓ）−４２−デオキシ−４２−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）−ラパマイシンを挙げることができる。また、Ｃ２０−メタリルラパマイシンが挙げられ、Ｃ２０−メタリルラパマイシンは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。Ｃ２０−メタリルラパマイシンとしては、C20-Marapを挙げることができる。また、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシンが挙げられ、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシンは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシンとしてはC16-iRapを挙げることができる。また、AP21967が挙げられ、AP21967は、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。AP21967としては、Ｃ−１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシンを挙げることができる。また、ミコフェノール酸ナトリウムが挙げられ、ミコフェノール酸ナトリウムは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。ミコフェノール酸ナトリウムとしては、セルセプト、Myfortic、（４Ｅ）−６−（４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−２−ベンゾフラン−５−イル）−４−メチルヘキサ−４−エン酸を挙げることができる。また、塩酸ベニジピンが挙げられ、塩酸ベニジピンは、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。塩酸ベニジピンとしては、Benidipinumおよびコニールを挙げることができる。また、AP1903が挙げられ、AP1903は、その類似体、誘導体および薬学的に許容される塩を含む。AP1903としては、rimiducid、［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１−［３−［２−［２−［［２−［３−［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１−［（２Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブタノイル］ピペリジン−２−カルボニル］オキシプロピル］フェノキシ］アセチル］アミノ］エチルアミノ］−２−オキソエトキシ］フェニル］プロピル］ （２Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブタノイル］ピペリジン−２−カルボキシレートを挙げることができる。さらに、これらの任意の組み合わせを挙げることができる。
本明細書において「ジベレリン」は、色素体中のテルペノイド経路で合成された後、小胞体および細胞質ゾルで修飾されて生物学的活性型となった、ジテルペノイド酸の合成形態または天然形態を指す。ジベレリンは、天然のジベレリンまたはその類似体であってもよく、たとえば、ent-ジベレラン骨格に由来するジベレリン、またはent-カウレンを介して合成されたジベレリンが挙げられ、ジベレリン１（GA1）、GA2、GA3、…、GA136、ならびにこれらの類似体および誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、ジベレリンまたはその類似体もしくは誘導体は、CISCの二量体化に利用される。
本明細書において「SLF−TMP」または「トリメトプリムに結合した合成FKBPリガンド」は、CISC二量体化に使用される二量体化剤を指す。いくつかの実施形態において、SLF部分が第１のCISC構成要素に結合し、TMP部分が第２のCISC構成要素に結合して、CISCの二量体化が起こる。いくつかの実施形態において、SLFは、たとえばFKBPに結合することができ、TMPは、大腸菌由来ジヒドロ葉酸還元酵素（eDHFR）に結合することができる。
本明細書において「同時結合」は、２つ以上のCISC構成要素がリガンドに同時に結合し、場合によっては、２つ以上のCISC構成要素が実質的に同時にリガンドに結合して、CISC構成要素とリガンド構成要素を含む複数の構成要素からなる複合体を形成し、その結果、シグナルの活性化がもたらされることを指す。同時結合がなされるには、CISC構成要素が単一のリガンドに空間的に結合するように構成されている必要があり、かつ両方のCISC構成要素が、同じリガンド（の異なる部分）に結合するように構成されている必要がある。
本明細書において「選択的な拡大増殖」は、哺乳動物細胞のような所望の細胞、または哺乳動物細胞集団のような所望の細胞集団の拡大増殖能を指す。いくつかの実施形態では、選択的な拡大増殖は、２種の遺伝子が組換えられた純粋な細胞（哺乳動物細胞など）の集団の発生または拡大増殖を指す。二量体化CISCを構成する一方の構成要素は、一方の遺伝子組換えに関与し、もう一方の構成要素は、もう一方の遺伝子組換えに関与する。したがって、ヘテロ二量体化CISCの各構成要素は、各遺伝子組換えと関連している。細胞をリガンドに曝露することによって、所望とする両方の改変を有する細胞（哺乳動物細胞など）のみを選択的に拡大増殖させることが可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、リガンドとの接触に対して応答することができる細胞（たとえば哺乳動物細胞）は、ヘテロ二量体化CISCの両方の構成要素を発現する細胞のみである。
本明細書において「宿主細胞」は、核酸コンストラクトまたはベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは形質導入に感受性を有するあらゆる種類の細胞（たとえば哺乳動物細胞）を含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの宿主細胞は、Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞（Treg）である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD34+細胞、CD8+細胞またはCD4+細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である。本明細書において「細胞集団」は、２種以上の細胞を含む細胞群（哺乳動物細胞群など）を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質配列または該タンパク質配列をコードする発現ベクターを含む細胞（哺乳動物細胞など）が製造される。
本明細書において「形質転換された」または「トランスフェクトされた」とは、コンストラクトなどの外来ポリヌクレオチド分子が導入された細胞（哺乳動物細胞など）、組織、臓器または生物を指す。導入されたポリヌクレオチド分子は、レシピエント細胞（哺乳動物細胞など）、組織、臓器または生物のゲノムDNAに組み込まれてもよく、それによって、導入されたポリヌクレオチド分子が次の子孫に受け継がれてもよい。さらに、「トランスジェニックな」細胞（哺乳動物細胞など）もしくは「トランスジェニックな」生物、または「トランスフェクトされた」細胞（哺乳動物細胞など）もしくは「トランスフェクトされた」生物は、トランスジェニックな細胞もしくは生物またはトランスフェクトされた細胞もしくは生物の子孫を含み、そのようなトランスジェニック生物を親として交配に使用した繁殖計画により作製された子孫を含み、かつ外来ポリヌクレオチド分子の存在により生じた改変表現型を示すものを含む。「トランスジェニック」は、１種以上の異種ポリ核酸分子を含む細菌、真菌または植物も指す。「形質導入」は、哺乳動物細胞などの細胞にウイルスを介して遺伝子を移入することを指す。
本明細書において「対象」は、処置、観察または実験の対象となる動物を指す。「動物」には、変温脊椎動物、温血脊椎動物、および魚類、甲殻類、爬虫類などの無脊椎動物、特に哺乳動物が含まれる。「哺乳動物」には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長動物（サル、チンパンジー、類人猿など）、特にヒトが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、二量体化の誘導に使用されるリガンドの有効量は、0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、もしくは100nM、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度である。
本明細書に記載の「マーカー配列」は、目的のタンパク質を有する細胞（哺乳動物細胞など）または目的のタンパク質を選択または追跡するために使用されるタンパク質をコードする。本明細書に記載の実施形態において、フローサイトメトリーなどの実験において選択可能なマーカー配列を含んでいてもよい融合タンパク質を提供する。
本明細書において「細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）」は、細胞表面上にCD8を発現するＴリンパ球（たとえばCD8+Ｔ細胞）を指す。いくつかの実施形態において、このような細胞は、抗原を経験したことのある「メモリー」Ｔ細胞（TM細胞）であることが好ましい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質を分泌させるための細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。本明細書において「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「TCM」）は、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）であり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にCD62L、CCR-7および／またはCD45ROを発現するが、CD45RAを発現していないか、CD45RAの発現が低下しているCTLを指す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質を分泌させるための細胞を提供する。いくつかの実施形態おいて、前記細胞はセントラルメモリーＴ細胞（TCM）である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO、および／またはCD95の発現が陽性であるが、CD54RAの発現が低下していることがある。本明細書において「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「TEM」）は、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面上にCD62Lを発現していないか、CD62Lの発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較して、CD45RAを発現していないか、CD45RAの発現が低下しているＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質を分泌させるための細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記細胞はエフェクターメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、CD62Lおよび／またはCCR7の発現が陰性であり、CD28および／またはCD45RAの発現が陽性または陰性であってもよい。
本明細書に記載の「ナイーブ」Ｔ細胞は、抗原を経験していないＴリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、CD62Lおよび／またはCD45RAを発現しており、CD45ROを発現していないＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質を分泌させるための細胞（哺乳動物細胞など）を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞（哺乳動物細胞など）はナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、CD62L、CCR7、CD28、CD127、および／またはCD45RAが挙げられる。
本明細書に記載の「エフェクター」Ｔ細胞は、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、CD62L、CCR7、および／もしくはCD28を発現していないか、またはCD62L、CCR7、および／もしくはCD28の発現が低下しており、かつグランザイムＢ陽性および／またはパーフォリンが陽性であるＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質を分泌させるための細胞（哺乳動物細胞など）を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞（哺乳動物細胞など）はエフェクターＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞（哺乳動物細胞など）は、セントラルメモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、CD62L、CCR7および／またはCD28を発現していないか、CD62L、CCR7および／またはCD28の発現が低下しており、かつグランザイムＢ陽性および／またはパーフォリンが陽性である。
本明細書に記載の「エピトープ」は、抗体、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含む免疫系によって認識される抗原または分子の一部を指す。エピトープは、通常、少なくとも７個のアミノ酸を有し、線状エピトープであってもよく、高次構造エピトープであってもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質を発現する細胞（哺乳動物細胞など）が提供され、この細胞はキメラ抗原受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、がん細胞上のエピトープを認識することができるscFvを含む。本明細書において開示される様々なポリペプチドまたは核酸について述べる際に使用される「単離」または「精製」という用語は、ポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある他の構成要素から同定、分離かつ／または回収されたポリペプチドまたは核酸を指す。単離されたポリペプチドまたは核酸は、これらが本来関連する他の成分を全く含まないことが好ましい。単離されたポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある不純物は、通常、該ポリペプチドまたは核酸の診断用途または治療用途を妨害する物質であり、たとえば、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性の溶質または非タンパク質性の溶質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる核酸または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる発現ベクターを、細菌細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞に送達する工程、前記細胞を培養物中で増殖させる工程、融合タンパク質の発現を誘導する工程、および前記融合タンパク質を精製して処理を行う工程を含む方法を提供する。
本明細書に記載の配列（たとえばCISC配列）に関する「アミノ酸配列同一性（%）」は、候補配列中の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインのそれぞれのアミノ酸残基が、参照配列中の各ドメインのアミノ酸残基と一致しているパーセンテージとして定義され、このアミノ酸配列同一性は、配列同一性（%）の最大値を算出するため、候補配列と参照配列をアラインし、必要に応じてギャップを挿入した後に算出されたものであり、保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。アミノ酸配列同一性（%）を決定するためのアラインメントは、当技術分野の範囲に含まれる様々な方法で行うことができ、たとえば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、Megalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。当業者であれば、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができ、このようなパラメータとしては、比較される複数の配列の全長にわたってアラインメントを最大とするのに必要な任意のアルゴリズムが含まれる。たとえば、WU-BLAST-2コンピュータープログラム（Altschul, S. F. et al. （1996）. Methods Enzymol., 266:460-480）を用いてアミノ酸配列同一性（%）を算出するには、いくつかの検索パラメータを用いるが、それらのほとんどはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないパラメータ（たとえば調整可能なパラメータ）は、overlap span=1、overlap fraction=0.125、word threshold (T) =11およびscoring matrix=BLOSUM62に設定される。CISCの実施形態のいくつかにおいて、CISCは、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、各ドメインは、天然ドメインもしくは合成ドメイン、または天然ドメインの変異型もしくは切断型を含む。いくつかの実施形態において、所定のドメインの変異型または切断型は、本明細書で提供する配列に示される配列と、100%、95%、90%もしくは85%の配列同一性、または前記パーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（%）を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において「CISCのバリアントのポリペプチド配列」または「CISCのバリアントのアミノ酸配列」は、以下で定義するように、本明細書で提供するタンパク質配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性（またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内のアミノ酸配列同一性（%））を有するタンパク質配列、または特異的に誘導されたその断片、たとえば、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインのタンパク質配列を指す。通常、CISCのバリアントのポリペプチドまたはその断片は、CISCのアミノ酸配列またはそれに由来する断片と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも81%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも82%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも83%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも84%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも86%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも87%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも88%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも89%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも91%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも92%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも93%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも94%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも96%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも97%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性、またはより好ましくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。バリアントは、天然のタンパク質配列を包含しない。
本明細書において「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、どのような哺乳動物から得られたものであってもよく、サル、イヌおよびヒトを含む、霊長類またはその他の生物種から得られたものであることが好ましい。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、レシピエント対象と同種（同種であるが別のドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は自己由来である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は同系である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。
本明細書において、請求項の移行句、本体部を問わず、「含む（comprise（s））」および「含んでいる（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものと解釈される。すなわち、これらの用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含んでいる」という表現と同義であると解釈される。「含む」という用語が方法に関わる文脈で用いられる場合、当該方法が、明記された工程を少なくとも含み、さらに別の工程を含んでもよいことを意味する。また、「含む」という用語が化合物、組成物または装置に関わる文脈で用いられる場合、当該化合物、当該組成物または当該装置が、明記された特徴または構成要素を少なくとも含み、さらに別の特徴または構成要素を含んでもよいことを意味する。
ゲノム編集システム
FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸を細胞のゲノムに標的化して組み込むことなどによって、FOXP3の発現、機能および／または活性を調節するために、細胞（たとえばリンパ球細胞）のゲノム編集用システムを提供する。また、本開示は、特に、エクスビボおよび／またはインビボにおけるゲノム編集を使用して、FOXP3に関連する障害または健康状態を有する対象またはFOXP3に関連する障害または健康状態を有すると疑われる対象を治療するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患（たとえばIPEX症候群）または臓器移植に起因する障害（たとえば移植片対宿主病（GVHD））を有するか、これらの疾患を有することが疑われる対象である。
いくつかの実施形態において、
（ａ）DNAエンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
（ｂ）細胞のゲノム内のFOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座（たとえばAAVS1（アデノ随伴ウイルス組み込み部位など））に前記DNAエンドヌクレアーゼを標的化することができるgRNA（たとえばsgRNA）または該gRNAをコードする核酸；および
（ｃ）FOXP3のコード配列を含むドナー鋳型
を含むシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼは、Cas1エンドヌクレアーゼ、Cas1Bエンドヌクレアーゼ、Cas2エンドヌクレアーゼ、Cas3エンドヌクレアーゼ、Cas4エンドヌクレアーゼ、Cas5エンドヌクレアーゼ、Cas6エンドヌクレアーゼ、Cas7エンドヌクレアーゼ、Cas8エンドヌクレアーゼ、Cas9エンドヌクレアーゼ（Csn1およびCsx12としても知られている）、Cas100エンドヌクレアーゼ、Csy1エンドヌクレアーゼ、Csy2エンドヌクレアーゼ、Csy3エンドヌクレアーゼ、Cse1エンドヌクレアーゼ、Cse2エンドヌクレアーゼ、Csc1エンドヌクレアーゼ、Csc2エンドヌクレアーゼ、Csa5エンドヌクレアーゼ、Csn2エンドヌクレアーゼ、Csm2エンドヌクレアーゼ、Csm3エンドヌクレアーゼ、Csm4エンドヌクレアーゼ、Csm5エンドヌクレアーゼ、Csm6エンドヌクレアーゼ、Cmr1エンドヌクレアーゼ、Cmr3エンドヌクレアーゼ、Cmr4エンドヌクレアーゼ、Cmr5エンドヌクレアーゼ、Cmr6エンドヌクレアーゼ、Csb1エンドヌクレアーゼ、Csb2エンドヌクレアーゼ、Csb3エンドヌクレアーゼ、Csx17エンドヌクレアーゼ、Csx14エンドヌクレアーゼ、Csx10エンドヌクレアーゼ、Csx16エンドヌクレアーゼ、CsaXエンドヌクレアーゼ、Csx3エンドヌクレアーゼ、Csx1エンドヌクレアーゼ、Csx15エンドヌクレアーゼ、Csf1エンドヌクレアーゼ、Csf2エンドヌクレアーゼ、Csf3エンドヌクレアーゼ、Csf4エンドヌクレアーゼ、およびCpf1エンドヌクレアーゼ、ならびにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼ（たとえば化膿レンサ球菌由来のCas9エンドヌクレアーゼ）などの、Casエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、FOXP3遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、FOXP3遺伝子座のエキソン１内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、FOXP3遺伝子座のエキソン１内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７および２７〜２９いずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する該スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２もしくは５に示されるスペーサー配列、または配列番号２もしくは５と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、非FOXP3遺伝子座（たとえばAAVS1またはTRAC）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１５〜２０のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１５〜２０のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号３３もしくは３４に示されるスペーサー配列、または配列番号３３もしくは３４と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、FOXP3のコード配列は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする。いくつかの実施形態において、FOXP3のコード配列はFOXP3 cDNAである。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列と、少なくとも70%または少なくとも約70%の配列同一性を有し、たとえば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくともそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記システムは、Cas DNAエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、Cas DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記システムはgRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAはsgRNAである。いくつかの実施形態において、前記システムは、gRNAをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、１つ以上のさらなるgRNAまたは該１つ以上のさらなるgRNAをコードする核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、前記gRNAは、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２に示されるスペーサー配列、または配列番号２と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号３に示されるスペーサー配列、または配列番号３と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号５に示されるスペーサー配列、または配列番号５と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、前記Cas DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記Cas9エンドヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌由来のCas9エンドヌクレアーゼ（spCas9）である。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）由来のCas9（SluCas9）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列と、少なくとも70%または少なくとも約70%の配列同一性を有し、たとえば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくともそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドンが最適化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、該システムは、DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、ヒト細胞における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、DNA（DNAプラスミドなど）である。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、RNA（mRNAなど）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、ドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列と、FOXP3またはその機能性誘導体を発現させるように構成されたプロモーターとを含むドナーカセットを含む。プロモーターの例としては、MNDプロモーター、PGKプロモーター、およびEF1プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、配列番号１１３〜１１５のいずれかに示される配列、または配列番号１１３〜１１５のいずれか１つと少なくとも85%の同一性を有するバリアントを有する。いくつかの実施形態では、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、ドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナー鋳型は、相同組換え修復（HDR）によって、該システムに含まれるgRNAにより標的化されたゲノム遺伝子座にドナーカセットを組み込むことができるように構成されている。いくつかの実施形態において、標的化されたゲノム遺伝子座の配列に対応する相同アームがドナーカセットを挟んで両側に配置される。いくつかの実施形態において、相同アームの長さは、少なくとも0.2kbまたは少なくとも約0.2kb（たとえば、少なくとも0.3kb、少なくとも0.4kb、少なくとも0.5kb、少なくとも0.6kb、少なくとも0.7kb、少なくとも0.8kb、少なくとも0.9kb、少なくとも1kbもしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約0.3kb、少なくとも約0.4kb、少なくとも約0.5kb、少なくとも約0.6kb、少なくとも約0.7kb、少なくとも約0.8kb、少なくとも約0.9kb、少なくとも約1kbもしくは少なくともそれ以上）である。いくつかの実施形態において、相同アームの長さは、少なくとも0.4kbまたは少なくとも約0.4kbであり、たとえば0.45kb、0.6kbまたは0.8kbである。典型的な相同アームとして、配列番号９０〜９７および１０６〜１０７のいずれかに示される配列を有する５’相同アーム、ならびに配列番号９８〜１０５および１０８〜１０９のいずれかに示される配列を有する３’相同アームが挙げられる。典型的な相同アームとして、配列番号３７または３８の配列を有するドナー鋳型に含まれる相同アームがさらに挙げられる。典型的なドナー鋳型として、配列番号３７または３８の配列を有するドナー鋳型が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV2ベクター、AAV5ベクターまたはAAV6ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、ドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナー鋳型は、非相同末端結合（NHEJ）によって、該システムに含まれるgRNAにより標的化されたゲノム遺伝子座にドナーカセットを組み込むことができるように構成されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットの片側または両側にgRNA標的部位が隣接して配置される。いくつかの実施形態において、ドナーカセットの両側にgRNA標的部位が隣接して配置される。いくつかの実施形態において、gRNA標的部位は、前記システムに含まれるgRNAの標的部位である。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型のgRNA標的部位は、前記システムに含まれるgRNAが標的とする細胞ゲノムgRNA標的部位の逆相補鎖である。いくつかの実施形態では、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV2ベクター、AAV5ベクターまたはAAV6ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかは、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型を含み、該ドナーカセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス（WHP）の転写後調節エレメント（WPRE）を含む。いくつかの実施形態において、WPREはWPREの全長である。いくつかの実施形態において、WPREは切断型WPREである。典型的なWPREとして、配列番号１３５〜１４７のいずれかに示される配列を有するドナー鋳型に含まれるWPREが挙げられる。WPREを有する典型的なドナー鋳型として、配列番号１３５〜１４７のいずれかに示される配列を有するドナー鋳型が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかは、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型を含み、該ドナーカセットは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を含む。典型的なUCOEとして、配列番号１５８、１５９および１６２のいずれかに示される配列を有するドナー鋳型に含まれるUCOEが挙げられる。UCOEを有する典型的なドナー鋳型として、配列番号１５８、１５９および１６２のいずれかに示される配列を有するドナー鋳型が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかは、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型を含み、該ドナーカセットは、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列を含む。いくつかの実施形態において、LNGFRのコード配列は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列の上流にある。いくつかの実施形態において、LNGFRのコード配列は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列の下流にある。典型的なLNGFRのコード配列として、配列番号３７、３８、４０、４２、４６、４７、７４、７６、８０および８１のいずれかに示される配列を有するドナー鋳型に含まれるLNGFRのコード配列が挙げられる。典型的なLNGFRのコード配列として、配列番号８８もしくは１１８に示される配列、または配列番号８８もしくは１１８と少なくとも85%の同一性を有するバリアントが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかは、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型を含み、該ドナーカセットは、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列の３’末端に連結された３’非翻訳領域（UTR）を含む。いくつかの実施形態において、前記３’UTRは、SV40-ポリＡシグナルを含む。SV40-ポリＡシグナルを含む典型的な３’UTRは、配列番号１１６に示される配列を有する３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、前記３’UTRは、ヒトFOXP3遺伝子に由来する３’UTRを含む。ヒトFOXP3遺伝子に由来する典型的な３’UTRとして、配列番号１１７に示される配列を有する３’UTRが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、ドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、該ドナー鋳型は、前記システムの構成要素をコードする隣接する核酸の間に2A自己切断ペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、前記システムの構成要素をコードする隣接する各核酸の間に2A自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、各2A自己切断ペプチドは、それぞれ独立してT2A自己切断ペプチドまたはP2A自己切断ペプチドである。たとえば、いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、５’末端から３’末端の方向に、プロモーター、FOXP3またはその機能性バリアントの発現をコードする核酸、2A自己切断ペプチドをコードする核酸、および選択マーカーをコードする核酸をこの順序で含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、配列番号８９に示される核酸、または配列番号８９と少なくとも85%の同一性を有する核酸のバリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、前記DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子への内包化により製剤化される。いくつかの実施形態において、前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子はgRNAをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、前記システムは、DNAエンドヌクレアーゼおよびgRNAをコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、DNAエンドヌクレアーゼをコードするmRNAである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかによれば、前記DNAエンドヌクレアーゼは、gRNAと複合体化して、リボ核タンパク質（RNP）複合体を形成する。
核酸
ゲノム標的化核酸またはガイドRNA
本開示は、関連するポリペプチド（たとえば、部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼ）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向させることができるゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記ゲノム標的化核酸は、RNAである。本明細書では、ゲノム標的化RNAを「ガイドRNA」または「gRNA」と呼ぶ。ガイドRNAは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズできるスペーサー配列とCRISPR反復配列を少なくとも有する。II型のシステムでは、gRNAは、tracrRNA配列と呼ばれる第２のRNAをさらに有する。II型ガイドRNA（gRNA）は、CRISPR反復配列とtracrRNA配列が互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。Ｖ型ガイドRNA（gRNA）では、crRNAが二本鎖を形成する。いずれのシステムにおいても、部位特異的ポリペプチドに前記二本鎖が結合して、ガイドRNAと部位特異的ポリペプチドの複合体が形成される。このゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドと会合することによって、形成される複合体に標的特異性を付与する。したがって、このゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性に指向性を付与する。
いくつかの実施形態において、前記ゲノム標的化核酸は、二分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドRNAである。二分子ガイドRNAは２本のRNA鎖を有する。第１の鎖は、５’末端から３’末端の方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、およびCRISPR最小反復配列を有する。第２の鎖は、（CRISPR最小反復配列に相補的な）tracrRNA最小配列、３’tracrRNA配列、および任意のtracrRNA伸長配列を有する。II型システムの単分子ガイドRNA（sgRNA）は、５’末端から３’末端の方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、CRISPR最小反復配列、単分子ガイドリンカー、tracrRNA最小配列、３’tracrRNA配列、および任意のtracrRNA伸長配列を有する。任意で設けられるtracrRNA伸長配列は、ガイドRNAにさらなる機能（たとえば、安定性）を付与するエレメントを有していてもよい。単分子ガイドリンカーは、CRISPR最小反復配列とtracrRNA最小配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意で設けられるtracrRNA伸長配列は、１つ以上のヘアピンを有する。Ｖ型システムの単分子ガイドRNA（sgRNA）は、５’末端から３’末端の方向に、CRISPR最小反復配列とスペーサー配列を有する。
一例として、CRISPR/Cas/Cpf1システムで使用されるガイドRNA、またはその他のより小さなRNAは、当技術分野で公知の後述する化学的手段によって容易に合成することができる。化学的合成手順は継続的に拡充されているが、ポリヌクレオチドの長さが約100ヌクレオチド長を大幅に超えるため、高速液体クロマトグラフィー（PAGEなどのゲルを使用しないHPLC）などの手順による前記RNAの精製は難しくなる傾向がある。長いRNAの作製に使用されるアプローチの１つとして、２個以上の分子を作製して、後からこれらを連結する方法が挙げられる。Cas9エンドヌクレアーゼまたはCpf1エンドヌクレアーゼをコードするRNAなどの、非常に長いRNAは容易に酵素的に作製することができる。RNAの化学合成および／または酵素的作製の工程中またはその後に様々なRNA修飾を導入することができ、たとえば、当技術分野で報告されているように、安定性を高める修飾、自然免疫応答の可能性もしくはその程度を低減する修飾、および／またはその他の属性を高める修飾が挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞のFOXP3遺伝子座内のゲノム配列または該FOXP3遺伝子の近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA（gRNA）を提供する。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する該スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、細胞のAAVS1遺伝子内のゲノム配列または該AAVS1遺伝子内の近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA（gRNA）を提供する。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１５〜２０のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１５〜２０のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。
インビトロ転写によって作製されたガイドRNAは、ガイドRNA分子の全長とガイドRNA分子の一部の混合物を含んでいる場合がある。化学合成されたガイドRNA分子は、通常、ガイド分子の全長の占める割合が75%を超えており、細胞内のヌクレアーゼによる切断に対するガイドRNAの耐性を増強するための化学修飾塩基などの、化学的に修飾された塩基をさらに含む場合がある。
スペーサー伸長配列
ゲノムを標的とした核酸の実施形態のいくつかにおいて、スペーサー伸長配列は、活性を調節し、安定性を付与し、かつ／またはゲノムを標的とした核酸を修飾するための場所を提供することができる。また、スペーサー伸長配列は、オンターゲット活性もしくはオフターゲット活性または特異性を調節することができる。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列を提供する。スペーサー伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長を超える長さ、5ヌクレオチド長を超える長さ、10ヌクレオチド長を超える長さ、15ヌクレオチド長を超える長さ、20ヌクレオチド長を超える長さ、25ヌクレオチド長を超える長さ、30ヌクレオチド長を超える長さ、35ヌクレオチド長を超える長さ、40ヌクレオチド長を超える長さ、45ヌクレオチド長を超える長さ、50ヌクレオチド長を超える長さ、60ヌクレオチド長を超える長さ、70ヌクレオチド長を超える長さ、80ヌクレオチド長を超える長さ、90ヌクレオチド長を超える長さ、100ヌクレオチド長を超える長さ、120ヌクレオチド長を超える長さ、140ヌクレオチド長を超える長さ、160ヌクレオチド長を超える長さ、180ヌクレオチド長を超える長さ、200ヌクレオチド長を超える長さ、220ヌクレオチド長を超える長さ、240ヌクレオチド長を超える長さ、260ヌクレオチド長を超える長さ、280ヌクレオチド長を超える長さ、300ヌクレオチド長を超える長さ、320ヌクレオチド長を超える長さ、340ヌクレオチド長を超える長さ、360ヌクレオチド長を超える長さ、380ヌクレオチド長を超える長さ、400ヌクレオチド長を超える長さ、1000ヌクレオチド長を超える長さ、2000ヌクレオチド長を超える長さ、3000ヌクレオチド長を超える長さ、4000ヌクレオチド長を超える長さ、5000ヌクレオチド長を超える長さ、6000ヌクレオチド長を超える長さ、もしくは7000ヌクレオチド長を超える長さ、またはそれ以上のヌクレオチド長を超える長さであってもよい。スペーサー伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長もしくは約1ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長もしくは約5ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長もしくは約10ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長もしくは約15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長もしくは約20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長もしくは約25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長もしくは約30ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長もしくは約35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長もしくは約40ヌクレオチド長、45ヌクレオチド長もしくは約45ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長もしくは約50ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長もしくは約60ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長もしくは約70ヌクレオチド長、80ヌクレオチド長もしくは約80ヌクレオチド長、90ヌクレオチド長もしくは約90ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長もしくは約100ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長もしくは約120ヌクレオチド長、140ヌクレオチド長もしくは約140ヌクレオチド長、160ヌクレオチド長もしくは約160ヌクレオチド長、180ヌクレオチド長もしくは約180ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長もしくは約200ヌクレオチド長、220ヌクレオチド長もしくは約220ヌクレオチド長、240ヌクレオチド長もしくは約240ヌクレオチド長、260ヌクレオチド長もしくは約260ヌクレオチド長、280ヌクレオチド長もしくは約280ヌクレオチド長、300ヌクレオチド長もしくは約300ヌクレオチド長、320ヌクレオチド長もしくは約320ヌクレオチド長、340ヌクレオチド長もしくは約340ヌクレオチド長、360ヌクレオチド長もしくは約360ヌクレオチド長、380ヌクレオチド長もしくは約380ヌクレオチド長、400ヌクレオチド長もしくは約400ヌクレオチド長、1000ヌクレオチド長もしくは約1000ヌクレオチド長、2000ヌクレオチド長もしくは約2000ヌクレオチド長、3000ヌクレオチド長もしくは約3000ヌクレオチド長、4000ヌクレオチド長もしくは約4000ヌクレオチド長、5000ヌクレオチド長もしくは約5000ヌクレオチド長、6000ヌクレオチド長もしくは約6000ヌクレオチド長、もしくは7000ヌクレオチド長もしくは約7000ヌクレオチド長、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。スペーサー伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長未満、5ヌクレオチド長未満、10ヌクレオチド長未満、15ヌクレオチド長未満、20ヌクレオチド長未満、25ヌクレオチド長未満、30ヌクレオチド長未満、35ヌクレオチド長未満、40ヌクレオチド長未満、45ヌクレオチド長未満、50ヌクレオチド長未満、60ヌクレオチド長未満、70ヌクレオチド長未満、80ヌクレオチド長未満、90ヌクレオチド長未満、100ヌクレオチド長未満、120ヌクレオチド長未満、140ヌクレオチド長未満、160ヌクレオチド長未満、180ヌクレオチド長未満、200ヌクレオチド長未満、220ヌクレオチド長未満、240ヌクレオチド長未満、260ヌクレオチド長未満、280ヌクレオチド長未満、300ヌクレオチド長未満、320ヌクレオチド長未満、340ヌクレオチド長未満、360ヌクレオチド長未満、380ヌクレオチド長未満、400ヌクレオチド長未満、1000ヌクレオチド長未満、2000ヌクレオチド長未満、3000ヌクレオチド長未満、4000ヌクレオチド長未満、5000ヌクレオチド長未満、6000ヌクレオチド長未満、7000ヌクレオチド長未満、またはそれ以上のヌクレオチド長未満であってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列の長さは、10ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列の長さは、10〜30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列の長さは、30〜70ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列は、別の部分（たとえば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイムなど）を有する。いくつかの実施形態において、前記別の部分は、核酸を標的とする核酸の安定性を減少または増加させる。いくつかの実施形態において、前記別の部分は、転写ターミネーターセグメント（たとえば転写終結配列）である。いくつかの実施形態において、前記別の部分は真核細胞において機能する。いくつかの実施形態において、前記別の部分は原核細胞において機能する。いくつかの実施形態において、前記別の部分は、真核細胞および原核細胞の両方において機能する。適切な部分の例としては、５’末端キャップ（たとえば、７−メチルグアニル酸キャップ（m7G））；リボスイッチ配列（たとえば、制御下での安定化させたり、かつ／または制御下においてタンパク質もしくはタンパク質複合体によるアクセスを可能にするもの）；dsRNA二本鎖（たとえば、ヘアピン）を形成する配列；RNAを細胞レベル以下の場所（たとえば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡を可能とする修飾または配列（たとえば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）；および／またはタンパク質（たとえば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAメチル基分解酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどの、DNAに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列が挙げられるが、これらに限定されない。
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（たとえば塩基対合）を介して配列特異的に標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動する。
本明細書に記載のCRISPR/Casシステムにおいて、スペーサー配列は、このシステムで使用されるCas9酵素において、PAMの５’末端側に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列と完全に一致する場合もあれば、ミスマッチを有する場合もある。各Cas9酵素は、標的DNAを認識する特定のPAM配列を有する。たとえば、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）は、標的核酸において、配列5’-NRG-3’（Ｒは、ＡまたはＧを示し、Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の３’末端に隣接する任意のヌクレオチドである）を有するPAMを認識する。
いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２０個を超えるヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、または少なくともそれ以上の個数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、最大でも５個、最大でも１０個、最大でも１５個、最大でも１６個、最大でも１７個、最大でも１８個、最大でも１９個、最大でも２０個、最大でも２１個、最大でも２２個、最大でも２３個、最大でも２４個、最大でも２５個、最大でも３０個、または最大でもそれ以上の個数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、PAMの１番目のヌクレオチドの５’末端側に隣接する２０個の塩基を有する。いくつかの実施形態において、化膿レンサ球菌（S.p.）由来のCas9によって認識される配列として本開示の組成物および方法で使用されるPAM配列は、NGGである。
いくつかの実施形態において、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列の長さは、少なくとも6ヌクレオチド長（nt）または少なくとも約6ヌクレオチド長（nt）である。スペーサー配列の長さは、少なくとも6ntもしくは少なくとも約6nt、少なくとも10ntもしくは少なくとも約10nt、少なくとも15ntもしくは少なくとも約15nt、少なくとも18ntもしくは少なくとも約18nt、少なくとも19ntもしくは少なくとも約19nt、少なくとも20ntもしくは少なくとも約20nt、少なくとも25ntもしくは少なくとも約25nt、少なくとも30ntもしくは少なくとも約30nt、少なくとも35ntもしくは少なくとも約35nt、または少なくとも40ntもしくは少なくとも約40nt、約6nt〜約80nt、約6nt〜約50nt、約6nt〜約45nt、約6nt〜約40nt、約6nt〜約35nt、約6nt〜約30nt、約6nt〜約25nt、約6nt〜約20nt、約6nt〜約19nt、約10nt〜約50nt、約10nt〜約45nt、約10nt〜約40nt、約10nt〜約35nt、約10nt〜約30nt、約10nt〜約25nt、約10nt〜約20nt、約10nt〜約19nt、約19nt〜約25nt、約19nt〜約30nt、約19nt〜約35nt、約19nt〜約40nt、約19nt〜約45nt、約19nt〜約50nt、約19nt〜約60nt、約20nt〜約25nt、約20nt〜約30nt、約20nt〜約35nt、約20nt〜約40nt、約20nt〜約45nt、約20nt〜約50nt、または約20nt〜約60ntであってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は20ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサーは19ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサーは18ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサーは17ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサーは16ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサーは15ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性（%）は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性（%）は、最大でも約30%、最大でも約40%、最大でも約50%、最大でも約60%、最大でも約65%、最大でも約70%、最大でも約75%、最大でも約80%、最大でも約85%、最大でも約90%、最大でも約95%、最大でも約97%、最大でも約98%、最大でも約99%、または100%である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性（%）は、標的核酸の相補鎖の標的配列の６個の連続する５’最末端ヌクレオチドにおいて100%である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列と標的核酸の間の相補性（%）は、約２０個の連続するヌクレオチドにおいて少なくとも60%である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の長さと標的核酸の長さは、1〜6ヌクレオチド長の差があってもよく、この差は１個または複数個のバルジと見なすことができる。
いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、コンピュータープログラムを使用して設計または選択される。コンピュータープログラムは変数を使用することができ、このような変数として、たとえば、予測される融解温度、二次構造の形成、予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンのアクセス性、GC比（%）、ゲノム発生頻度（たとえば、同一または類似の配列において、ミスマッチ、挿入または欠失により発生した１つ以上の位置における変化など）、メチル化状態、SNPの存在などが挙げられる。
CRISPRの最小反復配列
いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列は、参照CRISPR反復配列（たとえばS.pyogenes由来のcrRNA）と少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、少なくとも40%もしくは少なくとも約40%、少なくとも50%もしくは少なくとも約50%、少なくとも60%もしくは少なくとも約60%、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%、少なくとも95%もしくは少なくとも約95%、または100%の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列は、細胞においてtracrRNAの最小配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチドを有する。CRISPRの最小反復配列とtracrRNAの最小配列は、二本鎖を形成し、たとえば、塩基対二本鎖構造を形成する。CRISPRの最小反復配列とtracrRNAの最小配列は一緒になって、部位指向性ポリペプチドに結合する。CRISPRの最小反復配列の少なくとも一部は、tracrRNAの最小配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列の少なくとも一部は、tracrRNAの最小配列と少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも100%の相補性を有する。いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列の少なくとも一部は、tracrRNAの最小配列と最大でも約30%、最大でも約40%、最大でも約50%、最大でも約60%、最大でも約65%、最大でも約70%、最大でも約75%、最大でも約80%、最大でも約85%、最大でも約90%、最大でも約95%、または最大でも100%の相補性を有する。
CRISPRの最小反復配列の長さは、約7ヌクレオチド長〜約100ヌクレオチド長である。たとえば、CRISPRの最小反復配列の長さは、7ヌクレオチド長（nt）〜50ntもしくは約7nt〜約50nt、7nt〜40ntもしくは約7nt〜約40nt、7nt〜30ntもしくは約7nt〜約30nt、7nt〜25ntもしくは約7nt〜約25nt、7nt〜20ntもしくは約7nt〜約20nt、7nt〜15ntもしくは約7nt〜約15nt、8nt〜40ntもしくは約8nt〜約40nt、8nt〜30ntもしくは約8nt〜約30nt、8nt〜25ntもしくは約8nt〜約25nt、8nt〜20ntもしくは約8nt〜約20nt、8nt〜15ntもしくは約8nt〜約15nt、15nt〜100ntもしくは約15nt〜約100nt、15nt〜80ntもしくは約15nt〜約80nt、15nt〜50ntもしくは約15nt〜約50nt、15nt〜40ntもしくは約15nt〜約40nt、15nt〜30ntもしくは約15nt〜約30nt、または15nt〜25ntもしくは約15nt〜約25ntである。いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列の長さは約9ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列の長さは約12ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列は、少なくとも６個、７個または８個の連続するヌクレオチドからなる配列において、参照CRISPR最小反復配列（たとえばS.pyogenes由来の野生型crRNA）と少なくとも約60%の同一性を有する。たとえば、CRISPRの最小反復配列は、少なくとも６個、７個または８個の連続するヌクレオチドからなる配列において、参照CRISPR最小反復配列と、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約75%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約85%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約98%の同一性、少なくとも約99%の同一性、または少なくとも100%の同一性を有する。
tracrRNAの最小配列
いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列は、参照tracrRNA配列（たとえばS.pyogenes由来の野生型tracrRNA）と少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、少なくとも40%もしくは少なくとも約40%、少なくとも50%もしくは少なくとも約50%、少なくとも60%もしくは少なくとも約60%、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%、少なくとも95%もしくは少なくとも約95%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列は、細胞においてCRISPRの最小反復配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチドを有する。tracrRNAの最小配列とCRISPRの最小反復配列は、二本鎖を形成し、たとえば、塩基対二本鎖構造を形成する。tracrRNAの最小配列とCRISPRの最小反復配列は一緒になって、部位指向性ポリペプチドに結合する。tracrRNAの最小配列の少なくとも一部は、CRISPRの最小反復配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列は、CRISPRの最小反復配列と、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも100%の相補性を有する。
tracrRNAの最小配列の長さは、約7ヌクレオチド長〜約100ヌクレオチド長である。たとえば、tracrRNAの最小配列の長さは、約7ヌクレオチド長（nt）〜約50nt、約7nt〜約40nt、約7nt〜約30nt、約7nt〜約25nt、約7nt〜約20nt、約7nt〜約15nt、約8nt〜約40nt、約8nt〜約30nt、約8nt〜約25nt、約8nt〜約20nt、約8nt〜約15nt、約15nt〜約100nt、約15nt〜約80nt、約15nt〜約50nt、約15nt〜約40nt、約15nt〜約30nt、または約15nt〜約25ntであってもよい。いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列の長さは約9ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列の長さは約12ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列は、Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821に記載の23〜48ntのtracrRNAからなる。
いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列は、少なくとも６個、７個または８個の連続するヌクレオチドからなる配列において、参照tracrRNA最小配列（たとえばS.pyogenes由来の野生型tracrRNA）と、少なくとも約60%の同一性を有する。たとえば、tracrRNAの最小配列は、少なくとも６個、７個または８個の連続するヌクレオチドからなる配列において、参照tracrRNA最小配列と、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%の同一性、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%の同一性、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%の同一性、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%の同一性、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%の同一性、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%の同一性、少なくとも95%もしくは少なくとも約95%の同一性、少なくとも98%もしくは少なくとも約98%の同一性、少なくとも99%もしくは少なくとも約99%の同一性、または少なくとも100%の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、CRISPR RNA最小配列とtracrRNA最小配列により形成される二本鎖は、二重らせん構造を有する。いくつかの実施形態において、CRISPR RNA最小配列とtracrRNA最小配列により形成される二本鎖は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、または少なくともそれ以上の個数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、CRISPR RNA最小配列とtracrRNA最小配列により形成される二本鎖は、最大でも約１個、最大でも２個、最大でも３個、最大でも４個、最大でも５個、最大でも６個、最大でも７個、最大でも８個、最大でも９個、最大でも１０個、または最大でもそれ以上の個数のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、前記二本鎖はミスマッチを有する（たとえば、二本鎖に含まれる２本の鎖は100%の相補性を有さない）。いくつかの実施形態において、前記二本鎖は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個または少なくとも約５個のミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、前記二本鎖は、最大でも約１個、最大でも約２個、最大でも約３個、最大でも約４個、または最大でも約５個のミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、前記二本鎖は２個以下のミスマッチを有する。
バルジ
いくつかの実施形態では、CRISPR RNA最小配列とtracrRNA最小配列により形成される二本鎖に「バルジ」が存在する。バルジは、前記二本鎖内のヌクレオチド非対合領域である。いくつかの実施形態において、バルジは、部位特異的ポリペプチドへの前記二本鎖の結合に寄与する。バルジは、二本鎖の一方に、非対合配列5’-XXXY-3’を有し（Ｘは任意のプリン塩基であり、Ｙは、反対鎖のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成しうるヌクレオチドを有する）、二本鎖のもう一方に非対合ヌクレオチド領域を有する。二本鎖の各鎖にある非対合ヌクレオチドの数は異なる場合がある。
一例では、前記バルジは、該バルジを形成しているCRISPR最小反復鎖上に非対合プリン塩基（たとえばアデニン）を有する。いくつかの実施形態において、前記バルジは、該バルジを形成しているtracrRNA最小配列鎖上に非対合配列5’-AAGY-3’を有する（Ｙは、CRISPR最小反復鎖上のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成しうるヌクレオチドを有する）。
いくつかの実施形態において、二本鎖を形成するCRISPR最小反復鎖側のバルジは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくともそれ以上の個数の非対合ヌクレオチドを有する。二本鎖を形成するCRISPR最小反復鎖側のバルジは、最大でも１個、最大でも２個、最大でも３個、最大でも４個、最大でも５個、または最大でもそれ以上の個数の非対合ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二本鎖を形成するCRISPR最小反復鎖側のバルジは、１個の非対合ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、二本鎖を形成するtracrRNA最小配列側のバルジは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または少なくともそれ以上の個数の非対合ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二本鎖を形成するtracrRNA最小配列側のバルジは、最大でも１個、最大でも２個、最大でも３個、最大でも４個、最大でも５個、最大でも６個、最大でも７個、最大でも８個、最大でも９個、または最大でも１０個、または最大でもそれ以上の個数の非対合ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二本鎖を形成する第２の鎖上（たとえば二本鎖を形成するtracrRNA最小配列側上）のバルジは、４個の非対合ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、バルジは、少なくとも１個のゆらぎ塩基対を有する。いくつかの実施形態において、バルジは、１個以下のゆらぎ塩基対を有する。いくつかの実施形態において、バルジは、少なくとも１個のプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジは、少なくとも３個のプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジ配列は、少なくとも５個のプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジ配列は、少なくとも１個のグアニンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジ配列は、少なくとも１個のアデニンヌクレオチドを有する。
ヘアピン
様々な実施形態において、３’tracrRNA配列中のtracrRNA最小配列の３’末端側に１つ以上のヘアピンが存在する。
いくつかの実施形態において、前記ヘアピンは、CRISPR最小反復配列とtracrRNA最小配列からなる二本鎖の最後の対合ヌクレオチドから３’末端側の少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、または少なくともそれ以上の個数のヌクレオチドから始まる。いくつかの実施形態において、前記ヘアピンは、CRISPR最小反復配列とtracrRNA最小配列からなる二本鎖の最後の対合ヌクレオチドから３’末端側の最大でも約１個、最大でも約２個、最大でも約３個、最大でも約４個、最大でも約５個、最大でも約６個、最大でも約７個、最大でも約８個、最大でも約９個、最大でも約１０個、または最大でもそれ以上の個数のヌクレオチドから始まってもよい。
いくつかの実施形態において、前記ヘアピンは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個もしくは少なくともそれ以上の個数、または少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個もしくは少なくともそれ以上の個数の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、前記ヘアピンは、最大でも約１個、最大でも約２個、最大でも約３個、最大でも約４個、最大でも約５個、最大でも約６個、最大でも約７個、最大でも約８個、最大でも約９個、最大でも約１０個、最大でも約１５個または最大でもそれ以上の個数の連続したヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ヘアピンは、CCジヌクレオチド（たとえば、２個の連続したシトシンヌクレオチド）を有する。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、二本鎖ヌクレオチド（たとえば、ヌクレオチドが互いにハイブリダイズしたヘアピンヌクレオチド）を有する。たとえば、ヘアピンは、３’tracrRNA配列のヘアピン二本鎖中に、GGジヌクレオチドにハイブリダイズするCCジヌクレオチドを有する。
１つ以上のヘアピンは、部位特異的ポリペプチドのガイドRNA相互作用領域と相互作用することができる。
いくつかの実施形態では、２つ以上のヘアピンが存在し、いくつかの実施形態では、３つ以上のヘアピンが存在する。
３’tracrRNA配列
いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列は、参照tracrRNA配列（たとえばS.pyogenes由来のtracrRNA）と少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を有する。
いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列の長さは、6ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長または約6ヌクレオチド長〜約100ヌクレオチド長である。たとえば、３’tracrRNA配列の長さは、約6ヌクレオチド長（nt）〜約50nt、約6nt〜約40nt、約6nt〜約30nt、約6nt〜約25nt、約6nt〜約20nt、約6nt〜約15nt、約8nt〜約40nt、約8nt〜約30nt、約8nt〜約25nt、約8nt〜約20nt、約8nt〜約15nt、約15nt〜約100nt、約15nt〜約80nt、約15nt〜約50nt、約15nt〜約40nt、約15nt〜約30nt、または約15nt〜約25ntであってもよい。いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列の長さは、約14ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列は、少なくとも６個、７個または８個の連続するヌクレオチドからなる配列において、参照３’tracrRNA配列（たとえばS.pyogenes由来の野生型３’tracrRNA配列）と、少なくとも約60%の同一性を有する。たとえば、３’tracrRNA配列は、少なくとも６個、７個または８個の連続するヌクレオチドからなる配列において、参照３’tracrRNA配列（たとえばS.pyogenes由来の野生型３’tracrRNA配列）と、少なくとも約60%の同一性、少なくとも約65%の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約75%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約85%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約98%の同一性、少なくとも約99%の同一性、または少なくとも100%の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、３’tracrRNA配列は、２つ以上の二本鎖領域（たとえば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を有する。いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列は、２つの二本鎖領域を有する。
いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列は、ステムループ構造を有する。いくつかの実施形態において、３’tracrRNAのステムループ構造は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個または少なくともそれ以上の個数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、３’tracrRNAのステムループ構造は、最大でも１個、最大でも２個、最大でも３個、最大でも４個、最大でも５個、最大でも６個、最大でも７個、最大でも８個、最大でも９個、最大でも１０個または最大でもそれ以上の個数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ステムループ構造は機能性部分を有する。たとえば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、CRISPRアレイ、イントロン、またはエキソンを有していてもよい。いくつかの実施形態において、ステムループ構造は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、または少なくともそれ以上の個数の機能性部分を有する。いくつかの実施形態において、ステムループ構造は、最大でも約１個、最大でも約２個、最大でも約３個、最大でも約４個、最大でも約５個または最大でもそれ以上の個数の機能性部分を有する。
いくつかの実施形態において、３’tracrRNA配列のヘアピンは、Ｐドメインを有する。いくつかの実施形態において、ヘアピン上の前記Ｐドメインは、二本鎖領域を有する。
tracrRNA伸長配列
いくつかの実施形態において、ガイドRNAが単一分子ガイドまたは二分子ガイドである場合、tracrRNA伸長配列を提供する。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、約1ヌクレオチド長〜約400ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長を超える長さ、5ヌクレオチド長を超える長さ、10ヌクレオチド長を超える長さ、15ヌクレオチド長を超える長さ、20ヌクレオチド長を超える長さ、25ヌクレオチド長を超える長さ、30ヌクレオチド長を超える長さ、35ヌクレオチド長を超える長さ、40ヌクレオチド長を超える長さ、45ヌクレオチド長を超える長さ、50ヌクレオチド長を超える長さ、60ヌクレオチド長を超える長さ、70ヌクレオチド長を超える長さ、80ヌクレオチド長を超える長さ、90ヌクレオチド長を超える長さ、100ヌクレオチド長を超える長さ、120ヌクレオチド長を超える長さ、140ヌクレオチド長を超える長さ、160ヌクレオチド長を超える長さ、180ヌクレオチド長を超える長さ、200ヌクレオチド長を超える長さ、220ヌクレオチド長を超える長さ、240ヌクレオチド長を超える長さ、260ヌクレオチド長を超える長さ、280ヌクレオチド長を超える長さ、300ヌクレオチド長を超える長さ、320ヌクレオチド長を超える長さ、340ヌクレオチド長を超える長さ、360ヌクレオチド長を超える長さ、380ヌクレオチド長を超える長さ、または400ヌクレオチド長を超える長さである。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、約20ヌクレオチド長〜約5000ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1000ヌクレオチド長を超える。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長未満、5ヌクレオチド長未満、10ヌクレオチド長未満、15ヌクレオチド長未満、20ヌクレオチド長未満、25ヌクレオチド長未満、30ヌクレオチド長未満、35ヌクレオチド長未満、40ヌクレオチド長未満、45ヌクレオチド長未満、50ヌクレオチド長未満、60ヌクレオチド長未満、70ヌクレオチド長未満、80ヌクレオチド長未満、90ヌクレオチド長未満、100ヌクレオチド長未満、120ヌクレオチド長未満、140ヌクレオチド長未満、160ヌクレオチド長未満、180ヌクレオチド長未満、200ヌクレオチド長未満、220ヌクレオチド長未満、240ヌクレオチド長未満、260ヌクレオチド長未満、280ヌクレオチド長未満、300ヌクレオチド長未満、320ヌクレオチド長未満、340ヌクレオチド長未満、360ヌクレオチド長未満、380ヌクレオチド長未満、400ヌクレオチド長未満またはそれ以上のヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1000ヌクレオチド長未満であってもよい。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、10ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、10〜30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、30〜70ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列は、機能性部分（たとえば、安定性制御配列、リボザイム、またはエンドリボヌクレアーゼ結合配列）を有する。いくつかの実施形態において、前記機能性部分は、転写ターミネーターセグメント（たとえば転写終結配列）である。いくつかの実施形態において、前記機能性部分の全長は、約10ヌクレオチド長（nt）〜約100ヌクレオチド長、約10nt〜約20nt、約20nt〜約30nt、約30nt〜約40nt、約40nt〜約50nt、約50nt〜約60nt、約60nt〜約70nt、約70nt〜約80nt、約80nt〜約90nt、約90nt〜約100nt、約15nt〜約80nt、約15nt〜約50nt、約15nt〜約40nt、約15nt〜約30nt、または約15nt〜約25ntである。いくつかの実施形態において、前記機能性部分は真核細胞において機能する。いくつかの実施形態において、前記機能性部分は原核細胞において機能する。いくつかの実施形態において、前記機能性部分は、真核細胞および原核細胞の両方において機能する。
tracrRNA伸長配列の適切な機能性部分の例として、３’末端ポリアデニル化テール；リボスイッチ配列（たとえば、制御下での安定化させたり、かつ／または制御下においてタンパク質もしくはタンパク質複合体によるアクセスを可能にするもの）；dsRNA二本鎖を形成する配列（たとえばヘアピン）；RNAを細胞レベル以下の場所（たとえば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡を可能とする修飾または配列（たとえば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）；および／またはタンパク質（たとえば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAメチル基分解酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどの、DNAに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列は、プライマー結合部位または分子インデックス（たとえば、バーコード配列）を有する。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列は、１つ以上のアフィニティータグを有する。
単一分子ガイドのリンカー配列
いくつかの実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカー配列の長さは、約3ヌクレオチド長〜約100ヌクレオチド長である。Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821では、たとえば、４個のヌクレオチドからなる単純な「テトラループ」（-GAAA-）が使用された。前記リンカーの長さは、約3ヌクレオチド長（nt）〜約90nt、約3nt〜約80nt、約3nt〜約70nt、約3nt〜約60nt、約3nt〜約50nt、約3nt〜約40nt、約3nt〜約30nt、約3nt〜約20nt、または約3nt〜約10ntである。たとえば、前記リンカーの長さは、約3nt〜約5nt、約5nt〜約10nt、約10nt〜約15nt、約15nt〜約20nt、約20nt〜約25nt、約25nt〜約30nt、約30nt〜約35nt、約35nt〜約40nt、約40nt〜約50nt、約50nt〜約60nt、約60nt〜約70nt、約70nt〜約80nt、約80nt〜約90nt、または約90nt〜約100ntであってもよい。いくつかの実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカーの長さは、4〜40ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、少なくとも約100ヌクレオチド長、少なくとも約500ヌクレオチド長、少なくとも約1000ヌクレオチド長、少なくとも約1500ヌクレオチド長、少なくとも約2000ヌクレオチド長、少なくとも約2500ヌクレオチド長、少なくとも約3000ヌクレオチド長、少なくとも約3500ヌクレオチド長、少なくとも約4000ヌクレオチド長、少なくとも約4500ヌクレオチド長、少なくとも約5000ヌクレオチド長、少なくとも約5500ヌクレオチド長、少なくとも約6000ヌクレオチド長、少なくとも約6500ヌクレオチド長、もしくは少なくとも約7000ヌクレオチド長、または少なくともそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、最大でも約100ヌクレオチド長、最大でも約500ヌクレオチド長、最大でも約1000ヌクレオチド長、最大でも約1500ヌクレオチド長、最大でも約2000ヌクレオチド長、最大でも約2500ヌクレオチド長、最大でも約3000ヌクレオチド長、最大でも約3500ヌクレオチド長、最大でも約4000ヌクレオチド長、最大でも約4500ヌクレオチド長、最大でも約5000ヌクレオチド長、最大でも約5500ヌクレオチド長、最大でも約6000ヌクレオチド長、最大でも約6500ヌクレオチド長、もしくは最大でも約7000ヌクレオチド長、または最大でもそれ以上のヌクレオチド長である。
リンカーは、様々な配列を有することができるが、いくつかの実施形態において、リンカーは、ガイドRNAのその他の部分との相同性を備えた広範な領域を有する配列を持たず、これは、このような相同性を有する広範な領域が存在すると、ガイドRNAのその他の機能性領域を妨害しうる分子内結合が起こることがあるからである。Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821では、４個のヌクレオチドからなる単純な配列-GAAA-が使用されたが、より長い配列などのその他の様々な配列も同様に使用することができる。
いくつかの実施形態において、前記リンカー配列は機能性部分を有する。たとえば、前記リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、タンパク質結合部位、CRISPRアレイ、イントロン、エキソンなどの、１種以上の特徴を有していてもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカー配列は、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、または少なくともそれ以上の個数の機能性部分を有する。いくつかの実施形態において、前記リンカー配列は、最大でも約１個、最大でも約２個、最大でも約３個、最大でも約４個、最大でも約５個、または最大でもそれ以上の個数の機能性部分を有する。
いくつかの実施形態において、本開示に従ってgRNAによって標的化されるゲノム部位は、ゲノム（たとえばヒトゲノム）内のFOXP3遺伝子に存在してもよく、ゲノム内のFOXP3遺伝子内に存在してもよく、ゲノム内のFOXP3遺伝子座の近傍に存在していてもよい。このような部位を標的とするガイドRNAとして典型的なものとして、配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９に示されるスペーサー配列が挙げられる。たとえば、配列番号１に示されるスペーサー配列を含むgRNAは、ｉ）配列番号１の配列、ii）配列番号１の２番目〜２０番目からなる配列、iii）配列番号１の３番目〜２０番目からなる配列、iv）配列番号１の４番目〜２０番目からなる配列などを含むスペーサー配列を有していてもよい。当業者であれば理解できるように、各ガイドRNAは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。たとえば、配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９に示される各スペーサー配列は、単一のRNAキメラまたは（対応するtracrRNAとともに）crRNAに組み込むことができる。Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821およびDeltcheva, E. et al. (2011). Nature, 471:602-607を参照されたい。
ドナーDNAまたはドナー鋳型
DNAエンドヌクレアーゼなどの部位指向性ポリペプチドは、核酸（たとえばゲノムDNA）に二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断により、細胞に内在するDNA修復経路（たとえば、相同性依存的修復（HDR）、非相同末端結合、代替非相同末端結合（A-NHEJ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ））を刺激することができる。NHEJは、相同鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。これによって、切断部位の標的核酸に小さな欠失または挿入（indel）が生じることがあり、遺伝子発現の破壊または変化がもたらされる場合がある。相同性依存的修復（HDR）は相同組換え（HR）としても知られ、相同修復鋳型またはドナーが利用可能な場合に発生することがある。
相同ドナー鋳型は、標的核酸の切断部位を挟んで隣接する配列と相同な配列を有する。一般に、姉妹染色分体は、修復鋳型として細胞により利用される。一方、ゲノム編集を目的とした修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外来性核酸として提供されることが多い。外来性ドナー鋳型では、一般に、隣り合う相同領域の間にさらなる核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（１個もしくは複数個の塩基の変化または欠失など）を導入することによって、該さらなる核酸配列または変更された核酸配列が標的遺伝子座に組み込まれるようにする。MMEJは、小さな欠失と挿入が切断部位で起こりうるという点でNHEJと類似した遺伝的結果が得られる。MMEJは、切断部位を挟んで隣接する数個の塩基対からなる相同配列を利用することにより、所望の末端結合DNA修復結果を得るものである。場合によっては、ヌクレアーゼの標的領域において予測される短い相同配列（マイクロホモロジー）の分析に基づいて、得られる見込みのある修復結果を予測できる場合もある。
したがって、場合によっては、相同組換えを使用して、標的核酸の切断部位に外来性のポリヌクレオチド配列が挿入される。本明細書では、外来性ポリヌクレオチド配列をドナーポリヌクレオチド（またはドナー、ドナー配列またはポリヌクレオチドドナー鋳型）と呼ぶ。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的核酸の切断部位に挿入される。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、外来性ポリヌクレオチド配列であり、たとえば、天然では標的核酸の切断部位に存在しない配列である。
二本鎖切断が起こる細胞の核内に外来性DNA分子が十分な濃度で供給されると、NHEJ修復プロセスにおいて外来性DNAが二本鎖切断部位に挿入されるため、ゲノムに永続的に付加されることになりうる。このような外来性DNA分子を、いくつかの実施形態ではドナー鋳型と呼ぶ。ドナー鋳型が、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列および／またはスプライスアクセプター配列などの関連する調節配列とともに、FOXP3遺伝子などの目的の遺伝子のコード配列を含む場合（本明細書では「ドナーカセット」とも呼ぶ）、ゲノムに組み込まれたコピーから目的の遺伝子が発現され、細胞が生きている間はこの遺伝子が永続的に発現されうる。さらに、ドナーDNA鋳型から組み込まれたコピーは、細胞が分裂するときに娘細胞に伝達されうる。
二本鎖切断部位の両側のDNA配列と相同性を有する隣接したDNA配列（相同アームと呼ばれる）を含むドナーDNA鋳型が十分な濃度で存在する場合、このドナーDNA鋳型はHDR経路を介して組み込むことができる。相同アームは、ドナー鋳型と二本鎖切断部位の両側の配列の間での相同組換えの基質として作用する。これによって、二本鎖切断部位の両側の配列が未修飾ゲノムの配列から変更されていないドナー鋳型を、エラーを起こすことなく挿入することが可能になる。
HDRによる編集用に提供されるドナーは非常に多様であるが、一般に、意図する編集用の配列と、これを挟んで両側に位置する短いまたは長い相同アームとを含むことから、ゲノムDNAへのアニーリングが可能になる。導入された遺伝子変化部位に隣接する相同領域は、30bp以下であってもよく、あるいはプロモーターやcDNAなどを含んでいてもよい数キロベースのカセットと同程度に大きいものであってもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドドナーおよび二本鎖オリゴヌクレオチドドナーをいずれも使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドのサイズは、100nt未満〜数kb以上にも及ぶが、より長いssDNAを生成して使用することもできる。PCRアンプリコン、プラスミド、ミニサークルなどの二本鎖ドナーを使用することが多い。一般に、AAVベクターはドナー鋳型の送達に非常に効果的な手段であることが分かっているが、個々のドナーにパッケージングする際の限界は5kb未満である。ドナーの活発な転写によりHDR率が３倍に増加したことから、プロモーターを含めることで変換を増加可能であることが示されている。逆に、ドナーのCpGメチル化は、遺伝子発現とHDR率を低下させる場合がある。
いくつかの実施形態において、たとえば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、ウイルスによる形質導入などの様々な方法によって、ドナーDNAを単独であるいはヌクレアーゼと一緒に導入することができる。いくつかの実施形態では、ドナーDNAとヌクレアーゼを連結する様々な方法を使用して、HDRにおけるドナーの利用性を高めることができる。このような方法の例としては、ドナーをヌクレアーゼに結合させる方法、ドナーおよびヌクレアーゼの近傍に結合するDNA結合タンパク質に結合させる方法、またはDNA末端結合もしくはDNA修復に関与するタンパク質に結合させる方法などが挙げられる。
NHEJまたはHDRによるゲノム編集に加えて、NHEJ経路とHRの両方を使用した部位指向性遺伝子挿入を行うことができる。このような併用手法は、イントロン／エキソンの境界を含む可能性のある特定の状況で適用可能である。NHEJは、イントロンでのライゲーションに効果的であることが実証可能であるが、一方、エラーのないHDRはコード領域により適している場合がある。
いくつかの実施形態において、ゲノムへの挿入が意図される外来性配列は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードするヌクレオチド配列である。FOXP3の機能性誘導体としては、野生型FOXP3（たとえば野生型ヒトFOXP3など）と実質的に同等な活性を有するFOXP3誘導体が挙げられ、たとえば、野生型FOXP3の活性の少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、40%もしくは少なくとも約40%、50%もしくは少なくとも約50%、60%もしくは少なくとも約60%、70%もしくは少なくとも約70%、80%もしくは少なくとも約80%、90%もしくは少なくとも約90%、95%もしくは少なくとも約95%または少なくとも100%もしくは少なくとも約100%の活性を示すFOXP3誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、FOXP3の機能性誘導体は、FOXP3（たとえば野生型のFOXP3）と、少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、40%もしくは少なくとも約40%、50%もしくは少なくとも約50%、60%もしくは少なくとも約60%、70%もしくは少なくとも約70%、80%もしくは少なくとも約80%、85%もしくは少なくとも約85%、90%もしくは少なくとも約90%、95%もしくは少なくとも約95%、96%もしくは少なくとも約96%、97%もしくは少なくとも約97%、98%もしくは少なくとも約98%または99%もしくは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、当業者であれば、当技術分野で公知の様々な方法を使用して、化合物（たとえばペプチドやタンパク質など）の機能性または活性を試験することができる。FOXP3の機能性誘導体として、さらに、野生型FOXP3の全長の１つ以上のアミノ酸残基に保存的修飾を有する修飾FOXP3の断片または野生型FOXP3の断片を挙げることができる。したがって、いくつかの実施形態において、FOXP3の機能性誘導体をコードする核酸配列は、FOXP3をコードする核酸配列（たとえば野生型のFOXP3）と、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%の核酸配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、FOXP3は、ヒト野生型FOXP3である。
FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸が挿入される実施形態のいくつかにおいて、FOXP3遺伝子またはその機能性誘導体のcDNAは、異常のあるFOXP3遺伝子またはその調節配列を有する対象のゲノムに挿入することができる。このような場合、ドナーDNAまたはドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする配列（たとえばcDNA配列）を含む発現カセットまたはベクターコンストラクトであってもよい。
ドナーカセットを含む本明細書に記載のドナー鋳型による実施形態のいくつかにおいて、このドナーカセットは、一端がgRNA標的部位と隣接しているか、両端がgRNA標的部位と隣接している。たとえば、このようなドナー鋳型は、５’末端側にgRNA標的部位を有し、かつ／または３’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、５’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、３’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、５’末端側にgRNA標的部位を有し、かつ３’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、５’末端側にgRNA標的部位を有し、かつ３’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含み、これら２つのgRNA標的部位は同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、少なくとも１つのgRNA標的部位を含み、前記ドナー鋳型中のこの少なくとも１つのgRNA標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座中のgRNA標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、少なくとも１つのgRNA標的部位を含み、前記ドナー鋳型中のこの少なくとも１つのgRNA標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座中のgRNA標的部位の逆相補鎖を含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、５’末端側にgRNA標的部位を有し、かつ３’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含み、前記ドナー鋳型中のこれら２つのgRNA標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座中のgRNA標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、５’末端側にgRNA標的部位を有し、かつ３’末端側にgRNA標的部位を有するドナーカセットを含み、前記ドナー鋳型中のこれら２つのgRNA標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座中のgRNA標的部位の逆相補鎖を含む。
いくつかの実施形態において、FOXP3遺伝子座への標的化された組み込みを行うための、FOXP3またはその機能性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むドナー鋳型を提供し、このドナー鋳型は、５’末端から３’末端の方向に、ｉ）第１のgRNA標的部位；ii）スプライスアクセプター；iii）FOXP3またはその機能性誘導体をコードするヌクレオチド配列；およびiv）ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、iv）ポリアデニル化シグナルの下流に第２のgRNA標的部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のgRNA標的部位と第２のgRNA標的部位は同じものである。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、ｉ）第１のgRNA標的部位とii）スプライスアクセプターとの間にポリヌクレオチドスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドスペーサーは、18ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、一方の末端が第１のAAV ITRに隣接し、かつ／または他方の末端が第２のAAV ITRに隣接している。いくつかの実施形態において、第１のAAV ITRはAAV2 ITRであり、かつ／または第２のAAV ITRはAAV2 ITRである。いくつかの実施形態において、FOXP3は、ヒト野生型FOXP3である。
部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸
いくつかの実施形態において、前述を踏まえれば、前記ゲノム編集方法および前記組成物において、部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列（またはオリゴヌクレオチド）を使用することができる。部位指向性ポリペプチドをコードする核酸配列は、DNAであってもよく、RNAであってもよい。部位指向性ポリペプチドをコードする核酸配列がRNAである場合、このRNA は、gRNA配列に共有結合することができるか、別個の配列として存在することができる。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼのペプチド配列を、これらの核酸配列の代わりに使用することができる。
ベクター
別の一態様において、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、本開示の部位指向性ポリペプチド、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質分子を提供する。いくつかの実施形態において、このような核酸は、ベクター（たとえば組換え発現ベクター）である。
本発明において想定される発現ベクターとして、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、シミアンウイルス４０（SV40）、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（たとえば、マウス白血病ウイルス；脾臓壊死ウイルス；およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づくウイルスベクター、ならびにその他の組換えベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞に対しての使用が想定されるその他のベクターとして、pXT1ベクター、pSG5ベクター、pSVK3ベクター、pBPVベクター、pMSGベクター、およびpSVLSV40ベクター（ファルマシア）が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞に対しての使用が想定されるさらなるベクターとして、pCTx-1ベクター、pCTx-2ベクター、およびpCTx-3ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。その他のベクターでも、宿主細胞と適合性がある限り使用することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメントを有する。利用する宿主／ベクターシステムに応じて、構成的プロモーター、誘導型プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの、様々な適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを発現ベクターにおいて使用することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルス配列またはCRISPR機構の構成要素またはその他のエレメントを不活化する自己不活化ベクターである。
適切な真核生物プロモーター（たとえば、真核生物細胞において機能するプロモーター）の例として、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）の最も初期のチミジンキナーゼプロモーター、初期SV40、後期SV40、レトロウイルス由来のロングターミナルリピート（LTR）、ヒト伸長因子1プロモーター（EF1）、ニワトリβアクチンプロモーター（CAG）にサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーを融合させたハイブリッドコンストラクト、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（MSCV）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子座プロモーター（PGK）、およびマウスメタロチオネインＩが挙げられるが、これらに限定されない。
Casエンドヌクレアーゼとともに使用されるガイドRNAなどの小型RNAを発現させるために、たとえばU6やH1などのRNAポリメラーゼIIIプロモーターなどの様々なプロモーターが有益である場合がある。このようなプロモーターの使用を容易にする説明およびパラメータは当技術分野で知られており、新たな情報およびアプローチが常時報告されている。たとえば、Ma, H. et al. (2014). Molecular Therapy - Nucleic Acids 3:e161, doi:10.1038/mtna.2014.12を参照されたい。
発現ベクターは、翻訳開始および転写終了のためのリボソーム結合部位をさらに含むことができる。また、発現ベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含むことができる。さらに、発現ベクターは、部位指向性ポリペプチドに融合されていることから、融合タンパク質の一部として発現される非天然タグ（たとえば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導型プロモーター（たとえば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン制御性プロモーター、ステロイド制御性プロモーター、金属制御性プロモーター、エストロゲン受容体制御性プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（たとえば、CMVプロモーター、またはUBCプロモーター）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、空間的に制限されるプロモーターおよび／または時間的に制限されるプロモーター（たとえば、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、宿主細胞において発現される少なくとも１つの遺伝子がゲノムに挿入された後、このゲノムに存在する内在性プロモーターの制御下で発現される場合、ベクターは、この遺伝子のためのプロモーターを含まない。
いくつかの実施形態において、第１のベクターは、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部を含む第１のCISC構成要素をコードすることができ、第２のベクターは、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部を含む第２のCISC構成要素をコードすることができる。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、配列番号４８〜６１のいずれかに示されるタンパク質配列をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、配列番号６７に示される核酸配列を含む。配列番号６７は、配列番号５４に示されるタンパク質配列をコードする。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、配列番号６５に示される配列番号６７のバリアントである。配列番号６５は、配列番号５０および５１に示されるタンパク質配列をコードする。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、配列番号６６に示される配列番号６７のバリアントである。配列番号６６は、配列番号５２および５３に示されるタンパク質配列をコードする。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、本明細書で提供されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%の核酸配列同一性（またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の核酸配列同一性（%））を有する核酸、または特異的に誘導されたその断片を含む。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターはプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、融合タンパク質をコードする前記核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはRNAまたはDNAである。
部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼ
NHEJおよび／またはHDRによる標的DNAの修飾によって、たとえば、変異、欠失、変化、組み込み、遺伝子の修正、遺伝子の置換、遺伝子へのタグ付加、導入遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子破壊、転座、および／または遺伝子変異が起こりうる。ゲノムDNAへの非天然核酸の組み込みは、ゲノム編集の一例である。
部位指向性ポリペプチドは、DNAを切断するためのゲノム編集で使用されるヌクレアーゼである。部位指向性ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする１つ以上のmRNAとして細胞または対象に投与することができる。
CRISPR/CasシステムまたはCRISPR/Cpf1システムに関して、部位指向性ポリペプチドはガイドRNAに結合し、それによって、ガイドRNAが、部位指向性ポリペプチドが指向される標的DNAの部位を特定する。本明細書に記載のCRISPR/CasシステムまたはCRISPR/Cpf1システムの実施形態では、部位指向性ポリペプチドは、DNAエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、複数の核酸切断ドメイン（たとえばヌクレアーゼ部位）を有する。リンカーを介して２つ以上の核酸切断ドメインを連結することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは柔軟性のあるリンカーを有する。リンカーの長さは、1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長、21アミノ酸長、22アミノ酸長、23アミノ酸長、24アミノ酸長、25アミノ酸長、30アミノ酸長、35アミノ酸長、40アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。
天然の野生型Cas9酵素は、HNHヌクレアーゼドメインとRuvCドメインの２つのヌクレアーゼドメインを有する。本明細書で想定されるCas9酵素は、HNHヌクレアーゼドメインもしくはHNH様ヌクレアーゼドメイン、および／またはRuvCヌクレアーゼドメインもしくはRuvC様ヌクレアーゼドメインを有する。
HNHドメインまたはHNH様ドメインは、McrA様の折り畳みを有する。HNHドメインまたはHNH様ドメインは、２本の逆平行β鎖と１つのαヘリックスを有する。HNHドメインまたはHNH様ドメインは、金属結合部位（たとえば２価カチオン結合部位）を有する。HNHドメインまたはHNH様ドメインは、標的核酸の一本鎖（たとえば、crRNAの標的鎖の相補鎖）を切断することができる。
RuvCドメインまたはRuvC様ドメインは、RNaseHの折り畳みまたはRNaseH様の折り畳みを有する。RuvCドメインまたはRNaseHドメインは、RNAとDNAの両方に対する作用など、核酸に基づく多様な一連の機能に関与している。RNaseHドメインは、複数のαヘリックスに囲まれた５本のβ鎖を有する。RuvCドメインもしくはRNaseHドメインまたはRuvC様ドメインもしくはRNaseH様ドメインは、金属結合部位（たとえば、２価カチオン結合部位）を有する。RuvCドメインもしくはRNaseHドメインまたはRuvC様ドメインもしくはRNaseH様ドメインは、標的核酸の一本鎖（たとえば、二本鎖標的DNAの非相補鎖）を切断することができる。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、典型的な野生型部位指向性ポリペプチド（［たとえば、S.pyogenes由来のCas9、US2014/0068797に記載の配列番号８、またはSapranauskas , R. et al. (2011). Nucleic Acids Res, 39(21): 9275-9282に記載のCas9］、およびその他の様々な部位指向性ポリペプチド）と、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、典型的な野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえばS.pyogenes由来のCas9（上掲））のヌクレアーゼドメインと、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、１０個の連続するアミノ酸において、野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえば前記のS.pyogenes由来のCas9）と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、１０個の連続するアミノ酸において、野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえば前記のS.pyogenes由来のCas9）と、最大でも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドのHNHヌクレアーゼドメインは、１０個の連続するアミノ酸において、野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえば前記のS.pyogenes由来のCas9）と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドのHNHヌクレアーゼドメインは、１０個の連続するアミノ酸において、野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえば前記のS.pyogenes由来のCas9）と、最大でも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドのRuvC ヌクレアーゼドメインは、１０個の連続するアミノ酸において、野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえば前記のS.pyogenes由来のCas9）と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドのRuvCヌクレアーゼドメインは、１０個の連続するアミノ酸において、野生型の部位指向性ポリペプチド（たとえば前記のS.pyogenes由来のCas9）と、最大でも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%または100%の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、典型的な野生型部位指向性ポリペプチドの修飾形態を有する。典型的な野生型部位指向性ポリペプチドの修飾形態は、部位指向性ポリペプチドの核酸切断活性を低下させる変異を有する。いくつかの実施形態において、典型的な野生型部位指向性ポリペプチドの修飾形態は、典型的な野生型部位指向性ポリペプチド（たとえば、前記のS.pyogenes由来のCas9）の核酸切断活性の90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満の核酸切断活性を有する。また、部位指向性ポリペプチドの修飾形態は、核酸切断活性を実質的に有していない場合もある。部位指向性ポリペプチドが、核酸切断活性を実質的に有していない修飾形態である場合、このような修飾形態を本明細書では「酵素的に不活性」と呼ぶ。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドの修飾形態は、（たとえば、二本鎖の標的核酸の糖−リン酸骨格の１つのみを切断することによって）標的核酸上で一本鎖切断（SSB）を誘導することができる変異を有する。いくつかの実施形態において、この変異によって、野生型部位指向性ポリペプチド（たとえば、上記のS.pyogenes由来のCas9）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性の90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満の核酸切断活性となる。いくつかの実施形態において、前記変異によって、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持しながらも、標的核酸の非相補鎖を切断する能力が低下する。いくつかの実施形態において、前記変異によって、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持しながらも、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低下する。たとえば、Asp10、His840、Asn854、Asn856などの、典型的な野生型S.pyogenes Cas9ポリペプチドの残基において、複数の核酸切断ドメイン（たとえばヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上が不活化される変異が生じる。いくつかの実施形態において、変異が誘導される残基は、（たとえば、配列および／または構造のアライメントによって決定した場合）典型的な野生型S.pyogenes由来のCas9ポリペプチドのAsp10残基、His840残基、Asn854残基、およびAsn856残基に対応する。このような変異の例として、D10A、H840A、N854A、またはN856Aが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、アラニン置換以外の変異も適切であることを理解するであろう。
いくつかの実施形態において、D10A変異は、H840A変異、N854A変異およびN856A変異のうちの１つ以上と組み合わせることにより、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、H840A変異は、D10A変異、N854A変異およびN856A変異のうちの１つ以上と組み合わせることにより、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、N854A変異は、H840A変異、D10A変異およびN856A変異のうちの１つ以上と組み合わせることにより、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、N856A変異は、H840A変異、N854A変異およびD10A変異のうちの１つ以上と組み合わせることにより、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生成する。実質的に不活性な１つのヌクレアーゼドメインを有する部位指向性ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、RNA誘導性エンドヌクレアーゼ（たとえばCas9）のバリアントを使用して、CRISPRを介したゲノム編集の特異性を高めることができる。野生型Cas9は、一般に、標的配列中の特定の約２０個のヌクレオチドからなる配列（内在性ゲノム遺伝子座など）とハイブリダイズするように設計された単鎖ガイドRNAによって先導される。しかしながら、ガイドRNAと標的遺伝子座の間では数個のミスマッチは許容されうることから、標的部位で必要とされる相同配列の長さが、たとえば13ntほどの相同配列にまで効率良く短縮され、それによって、CRISPR/Cas9複合体が標的ゲノムの他の場所に結合して二本鎖核酸を切断する可能性が高まる場合がある。これは、オフターゲット切断としても知られている。一方、Cas9のニッカーゼバリアントはそれぞれ１本の鎖のみを切断するため、二本鎖切断を生じるには、一対のニッカーゼが、標的核酸の向かい合った鎖上で近接して結合する必要があり、それによって一対のニックが作製され、二本鎖切断が生じる。これには、２つの別々のガイドRNA（各ニッカーゼにつき１つ）が、標的核酸の向かい合った鎖上で近接して結合する必要がある。この要件に従うと、二本鎖切断を生じるために必要な相同配列の最短長は実質的に２倍になり、その結果、２つのガイドRNA部位は（これらが存在する場合）、二本鎖切断部分を生じることができるほど互いに十分に接近している可能性は低くなることから、二本鎖切断がゲノムのその他の場所で生じる可能性を低減することができる。当技術分野で報告されているように、ニッカーゼは、NHEJよりもHDRを促進するために使用することもできる。所望の変更を効果的に仲介する特定のドナー配列を使用してHDRを行うことにより、選択した変更をゲノムの標的部位に導入することができる。遺伝子編集で使用するための様々なCRISPR/Casシステムの説明は、たとえば、WO2013/176772およびSander, J. D. et al. (2014). Nature Biotechnology, 32(4):347-355、ならびにこれらの文献で引用されている参考文献に記載されている。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチド（たとえば、部位指向性ポリペプチドのバリアント、部位指向性ポリペプチドの変異体、酵素的に不活性な部位指向性ポリペプチド、および／または特定の条件下で酵素的に不活性な部位指向性ポリペプチド）は、核酸を標的とする。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチド（たとえば、エンドリボヌクレアーゼのバリアント、エンドリボヌクレアーゼの変異体、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ、および／または特定の条件下で酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、DNAを標的とする。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチド（たとえば、エンドリボヌクレアーゼのバリアント、エンドリボヌクレアーゼの変異体、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ、および／または特定の条件下で酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、RNAを標的とする。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、１つ以上の非天然配列を有する（たとえば、部位指向性ポリペプチドは融合タンパク質である）。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9と少なくとも15%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（HNHドメインおよびRuvCドメインなど）を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9と少なくとも15%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（HNHドメインおよびRuvCドメインなど）を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9と少なくとも15%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメインを有し、該核酸切断ドメインの一方または両方が、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9のヌクレアーゼドメインと少なくとも50%のアミノ酸同一性を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9と少なくとも15%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（たとえばHNHドメインおよびRuvCドメインなど）、および非天然配列（たとえば核移行シグナル）または部位指向性ポリペプチドを非天然配列に連結するリンカーを有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9と少なくとも15%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（たとえばHNHドメインおよびRuvCドメインなど）を有し、該核酸切断ドメインの一方または両方に、これらのヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも50%低下させる変異を有する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、細菌（たとえばS.pyogenes）に由来するCas9と少なくとも15%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（たとえばHNHドメインおよびRuvCドメインなど）を有し、該ヌクレアーゼドメインの一方の10番目のアスパラギン酸に変異を有し、かつ／または該ヌクレアーゼドメインの一方の840番目のヒスチジンに変異を有し、この変異によって該ヌクレアーゼドメインの切断活性が少なくとも50%低下する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）は、２つのニッカーゼを含み、これらは協働してゲノム内の特定の遺伝子座に１つの二本鎖切断を生じ、あるいは、１つ以上の部位指向性ポリペプチドは、４つのニッカーゼを含み、これらは協働してゲノム内の特定の遺伝子座に２つの二本鎖切断を生じる。あるいは、１つの部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）は、ゲノムの特定の遺伝子座において１つの二本鎖切断に作用する。
いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムの編集に使用することができる。このような実施形態のいくつかにおいて、部位指向性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法に従って、目的の標的DNAを含む細胞における発現のためにコドン最適化されている。たとえば、目的とする標的核酸がヒト細胞内に存在する場合、Cas9をコードするポリヌクレオチドをヒトのコドンに対して最適化し、これを使用してCas9ポリペプチドを作製することが想定される。
以下、本開示の様々な実施形態で使用することができる部位指向性ポリペプチドのいくつかの例を提供する。
CRISPRエンドヌクレアーゼシステム
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）のゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（細菌や古細菌など）のゲノムに見出すことができる。原核生物では、CRISPR遺伝子座は、ウイルスやファージなどの外来侵入物からの原核生物の防御に有用な免疫系の一種として機能する生成物をコードする。CRISPR遺伝子座の機能には３つの段階があり、CRISPR遺伝子座への新たな配列の組み込み、CRISPR RNA（crRNA）の発現、および外来侵入核酸のサイレンシングからなる。５つの種類のCRISPRシステム（たとえば、Ｉ型、II型、III型、Ｕ型、およびＶ型）が同定されている。
CRISPR遺伝子座には、「反復配列」と呼ばれる短い反復配列が多数含まれている。反復配列は、発現すると、二次ヘアピン構造（たとえばヘアピン）および／または一定の構造をとっていない一本鎖配列を形成することができる。反復配列は、通常、クラスターとして発生し、生物種間で様々に異なっている。反復配列は、「スペーサー」と呼ばれるユニークな介在配列で一定の間隔が設けられ、反復配列−スペーサー−反復配列という構造を有する遺伝子座が形成される。スペーサーは、既知の外来侵入配列と同一であるか、または高い相同性を有する。スペーサーと反復配列からなるユニットは、crisprRNA（crRNA）をコードし、これがプロセシングされて、スペーサーと反復配列からなるユニットの成熟形態が得られる。crRNAは、標的核酸の標的化に関与する「シード」配列またはスペーサー配列を有する（原核生物に天然の形態では、スペーサー配列は外来侵入物の核酸を標的とする）。スペーサー配列は、crRNAの５’末端または３’末端に位置する。
CRISPR遺伝子座は、CRISPR関連（Cas）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに有する。Cas遺伝子は、原核生物におけるcrRNA機能の生合成段階および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかのCas遺伝子は、相同的な二次および／または三次構造を有する。
II型CRISPRシステム
自然界のII型CRISPRシステムにおけるcrRNAの生合成では、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）が必要とされる。tracrRNAは内在性RNaseIIIによって修飾され、次いでpre-crRNAアレイのcrRNA反復配列にハイブリダイズする。内在性RNaseIIIが、pre-crRNAの切断ために動員される。切断されたcrRNAは、エキソリボヌクレアーゼによりトリミングされ（たとえば、５’末端のトリミング）、成熟形態のcrRNAを生成する。tracrRNAは、crRNAにハイブリダイズしたまま残り、tracrRNAとcrRNAが、部位指向性ポリペプチド（たとえばCas9）と会合する。crRNA−tracrRNA−Cas9複合体では、crRNAがハイブリダイズできる標的核酸へと該複合体がcrRNAにより先導される。crRNAが標的核酸にハイブリダイズすることによって、Cas9が活性化されて、標的核酸を切断する。II型CRISPRシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる。実際、PAMは、標的核酸への部位指向性ポリペプチド（たとえばCas9）の結合を促すために必須である。II型システム（NmeniまたはCASS4とも呼ばれる）は、II-Ａ型（CASS4）とII-Ｂ型（CASS4a）にさらに細分化される。Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821では、RNAでプログラム可能なゲノム編集にCRISPR/Cas9システムが有用であることが示されており、さらにWO 2013/176772では、部位指向性遺伝子編集にCRISPR/Casエンドヌクレアーゼシステムを使用した多数の例と適用が記載されている。
Ｖ型CRISPRシステム
Ｖ型のCRISPRシステムは、II型システムとはいくつかの重要な違いがある。たとえば、Cpf1は単鎖RNA誘導性エンドヌクレアーゼであるが、II型システムとは異なり、tracrRNAを欠く。実際、Cpf1と会合したCRISPRアレイは、トランス活性化されたtracrRNAをさらに必要とすることなく、成熟したcrRNAにプロセシングされる。Ｖ型CRISPRアレイは、42〜44ヌクレオチド長の短い成熟crRNAにプロセシングされ、各成熟crRNAは、19ヌクレオチド長の直接反復配列から始まり、その後に23〜25ヌクレオチド長のスペーサー配列が続く。これとは対照的に、II型システムの成熟crRNAでは、20〜24ヌクレオチド長のスペーサー配列から始まり、その後に22ヌクレオチド長または約22ヌクレオチド長の直接反復配列が続く。また、Cpf1は、Ｔリッチのプロトスペーサー隣接モチーフを利用することにより、この短いＴリッチPAMの後に続く標的DNAがCpf1-crRNA複合体によって効率的に切断される。これは、II型システムにおいて、標的DNAに続くＧリッチのPAMが利用されることとは対照的である。したがって、Ｖ型システムはPAMから離れた位置で標的を切断し、II型システムはPAMに隣接する位置で標的を切断する。さらに、II型システムとは対照的に、Cpf1は、ずれた位置でDNA二本鎖を切断することから、４ヌクレオチド長または５ヌクレオチド長の５’末端突出を形成する。これに対して、II型システムによる二本鎖切断では、平滑末端が形成される。Cpf1は、II型システムと同様に、RuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含むと予測されているが、II型システムとは異なり、第２のHNHエンドヌクレアーゼドメインを持たない。
Cas遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
典型的なCRISPR/Casポリペプチドとして、Fonfara, I. et al. (2014). Nucleic Acids Research, 42(4):2577-2590の図１に示されるCas9ポリペプチドが挙げられる。CRISPR/Cas遺伝子の命名システムは、Cas遺伝子が発見されて以来、大幅に改訂が重ねられている。Fonfaraら（2014）による図５で、様々な生物種に由来するCas9ポリペプチド用のPAM配列が示されている。
ゲノム標的化核酸と部位指向性ポリペプチドの複合体
ゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチド（たとえばCas9などの核酸誘導性ヌクレアーゼ）と相互作用することにより、複合体を形成する。ゲノム標的化核酸（たとえばgRNA）は、部位指向性ポリペプチドを標的核酸に先導する。
前述したように、いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドとゲノム標的化核酸は、それぞれ別々に細胞または対象に投与することができる。一方、別のいくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドは、１つ以上のガイドRNAとあらかじめ複合体化することができ、あるいは部位指向性ポリペプチドは、tracrRNAおよび１つ以上のcrRNAとあらかじめ複合体化することができる。あらかじめ複合体化した材料を細胞または対象に投与することができる。このようなあらかじめ複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（RNP）として知られている。
CISC構成要素
本明細書で述べるように、いくつかの実施形態において、二量体化するCISC構成要素をコードする１つ以上のタンパク質配列を提供する。前記１つ以上のタンパク質配列は、第１の配列および第２の配列を有していてもよい。いくつかの実施形態において、第１の配列は、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部を含んでいてもよい第１のCISC構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、第２の配列は、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部を含んでいてもよい第２のCISC構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、第１のCISC構成要素と第２のCISC構成要素は、発現された場合にリガンドの存在下で、好ましくは同時に、二量体化するように配置されていてもよい。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体化する２つのCISC構成要素のタンパク質配列、またはヘテロ二量体化する２つのCISC構成要素をコードする配列を提供する。いくつかの実施形態において、第１のCISC構成要素は、IL2Rγ−CISC複合体である。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rγ−CISC複合体は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号４８のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rγ−CISC複合体は、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５０のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rγ−CISC複合体は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５２のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rγ−CISC複合体は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５４のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、第１のCISC構成要素のタンパク質配列は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードするタンパク質配列を含む。また、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、第１の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む第１のCISC構成要素のタンパク質配列は、配列番号４８、５０、５２または５４に示される配列と、100%、99%、98%、95%、90%、85%もしくは80%の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のCISC構成要素は、IL2Rβを含む複合体である。いくつかの実施形態において、前記IL2Rβ−CISC複合体は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号４９のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rβ−CISC複合体は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５１のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rβ−CISC複合体は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５３のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rβ−CISC複合体は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５５のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、第２のCISC構成要素は、IL7Rαを含む複合体である。
いくつかの実施形態において、前記IL7Rα−CISC複合体は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５６のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、第２のCISC構成要素のタンパク質配列は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードするタンパク質配列を含む。また、第２のCISC構成要素の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、第２の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む第２のCISC構成要素のタンパク質配列は、配列番号４９、５１、５３、５５または５６に示される配列と、100%、99%、98%、95%、90%、85%もしくは80%の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記タンパク質配列は、リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸（グリシンなど）を含むか、または多数のアミノ酸（グリシンなど）を含むか、これらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記グリシンスペーサーは、少なくとも３個のグリシンを含む。いくつかの実施形態において、前記グリシンスペーサーは、配列番号６２、配列番号６３または配列番号６４に示される配列を含む。また、配列番号６２〜６４をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置し、ヒンジドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端に位置し、リンカーは、ヒンジドメインのＮ末端に位置し、細胞外結合ドメインは、リンカーのＮ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、ホモ二量体化する２つのCISC構成要素のタンパク質配列、またはホモ二量体化する２つのCISC構成要素をコードする配列を提供する。いくつかの実施形態において、第１のCISC構成要素は、IL2Rγ−CISC複合体である。いくつかの実施形態において、前記IL2Rγ−CISC複合体は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５８のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、第１のCISC構成要素のタンパク質配列は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードするタンパク質配列を含む。また、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、第１の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む第１のCISC構成要素のタンパク質配列は、配列番号５８に示される配列と、100%、99%、98%、95%、90%、85%もしくは80%の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２のCISC構成要素は、IL2Rβを含む複合体またはIL2Rαを含む複合体である。いくつかの実施形態において、前記IL2Rβ−CISC複合体は、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５７のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記IL2Rα−CISC複合体は、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号５９のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、第２のCISC構成要素のタンパク質配列は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードするタンパク質配列を含む。また、第２のCISC構成要素の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、第２の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む第２のCISC構成要素のタンパク質配列は、配列番号５７または配列番号５９に示される配列と、100%、99%、98%、95%、90%、85%もしくは80%の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記タンパク質配列は、リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸（グリシンなど）を含むか、または多数のアミノ酸（グリシンなど）を含むか、これらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記グリシンスペーサーは、少なくとも３個のグリシンを含む。いくつかの実施形態において、前記グリシンスペーサーは、配列番号６２、配列番号６３または配列番号６４に示される配列を含む。また、配列番号６２〜６４をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置し、ヒンジドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端に位置し、リンカーは、ヒンジドメインのＮ末端に位置し、細胞外結合ドメインは、リンカーのＮ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、ホモ二量体化する２つのCISC構成要素をコードする配列には、リガンドであるAP1903とともにホモ二量体化するFKBP F36Vドメインが組み込まれている。
いくつかの実施形態において、ホモ二量体化する単一のCISC構成要素のタンパク質配列、またはホモ二量体化する単一のCISC構成要素をコードする配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記単一のCISC構成要素は、IL7Rα−CISC複合体である。いくつかの実施形態において、前記IL7Rα−CISC複合体は、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号６０のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記単一のCISC構成要素は、MPL−CISC複合体である。いくつかの実施形態において、前記MPL−CISC複合体は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む。また、配列番号６１のタンパク質配列をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記単一のCISC構成要素のタンパク質配列は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードするタンパク質配列を含む。また、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、第１の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む第１のCISC構成要素のタンパク質配列は、配列番号６０または配列番号６１に示される配列と、100%、99%、98%、95%、90%、85%もしくは80%の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記タンパク質配列は、リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸（グリシンなど）を含むか、または多数のアミノ酸（グリシンなど）を含むか、これらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記グリシンスペーサーは、少なくとも３個のグリシンを含む。いくつかの実施形態において、前記グリシンスペーサーは、配列番号６２、配列番号６３または配列番号６４に示される配列を含む。また、配列番号６２〜６４をコードする核酸配列も実施形態に含まれる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置し、ヒンジドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端に位置し、リンカーは、ヒンジドメインのＮ末端に位置し、細胞外結合ドメインは、リンカーのＮ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、ホモ二量体化する単一のCISC構成要素をコードする配列には、リガンドであるAP1903とともにホモ二量体化するFKBP F36Vドメインが組み込まれている。
ゲノムの編集方法
FOXP3タンパク質またはその機能性誘導体の発現を必要とする生物において、FOXP3タンパク質またはその機能性誘導体を発現させる方法の１つとして、内在性FOXP3遺伝子または関連する細胞種（たとえばＴ細胞）において十分に発現される非FOXP3遺伝子に、FOXP3タンパク質をコードするコード配列を含む核酸が組み込まれるようにゲノム編集により標的化し、それによって、組み込まれたコード配列の発現を、内在性FOXP3遺伝子または非FOXP3遺伝子の内在性プロモーターにより誘導する方法が挙げられる。非FOXP3遺伝子が標的化されるいくつかの実施形態において、非FOXP3遺伝子の発現は、関連しない細胞種での発現を防ぐため、標的化される細胞種（たとえばリンパ球細胞、たとえばCD4+Ｔ細胞などのCD4+細胞、またはそれに由来する細胞（たとえばTreg細胞））に特異的であることが望ましい。
いくつかの実施形態において、ノックイン法は、野生型FOXP3遺伝子（たとえば、野生型ヒトFOXP3遺伝子）、FOXP3 cDNAまたはFOXP3ミニ遺伝子（天然または合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエキソン、天然または合成のイントロン、および天然または合成の３’UTRおよびポリアデニル化シグナルを有する）などの、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする配列をゲノム配列にノックインすることを含む。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする配列が挿入されているゲノム配列は、FOXP3遺伝子座に存在するか、FOXP3遺伝子座内に存在するか、FOXP3遺伝子座の近傍に存在する。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする配列が挿入されているゲノム配列は、FOXP3遺伝子座のエキソン１に存在するか、FOXP3遺伝子座のエキソン１内に存在するか、FOXP3遺伝子座のエキソン１の近傍に存在する。
本明細書で提供する実施形態のいくつかにおいて、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする配列をゲノムにノックインする方法を提供する。一態様において、本開示は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする配列を含む核酸の細胞ゲノムへの挿入を提供する。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする配列は、野生型FOXP3をコードする。FOXP3の機能性誘導体としては、野生型FOXP3（たとえば野生型ヒトFOXP3など）と実質的に同等な活性を有するFOXP3誘導体が挙げられ、たとえば、野生型FOXP3の活性の少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、40%もしくは少なくとも約40%、50%もしくは少なくとも約50%、60%もしくは少なくとも約60%、70%もしくは少なくとも約70%、80%もしくは少なくとも約80%、90%もしくは少なくとも約90%、95%もしくは少なくとも約95%または少なくとも100%もしくは少なくとも約100%の活性を示すFOXP3誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記FOXP3の機能性誘導体は、FOXP3（たとえば野生型のFOXP3）と、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、FOXP3は、イントロンを欠失するヌクレオチド配列（たとえばFOXP3 cDNA）によってコードされる。当業者であれば、当技術分野で公知の方法を使用して、FOXPの誘導体の機能性または活性を試験することができる。FOXP3の機能性誘導体として、さらに、野生型FOXP3の全長の１つ以上のアミノ酸残基に修飾を有する野生型FOXP3断片を挙げることができる。したがって、いくつかの実施形態において、FOXP3の機能性誘導体をコードする核酸配列は、FOXP3をコードする核酸配列（たとえば野生型のFOXP3）と、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%の核酸配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性バリアントは、ヒト野生型FOXP3である。
いくつかの実施形態において、本発明のゲノム編集方法では、CRISPR/CasエンドヌクレアーゼなどのDNAエンドヌクレアーゼを利用して、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする配列を遺伝的に導入（ノックイン）する。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼは、Cas1エンドヌクレアーゼ、Cas1Bエンドヌクレアーゼ、Cas2エンドヌクレアーゼ、Cas3エンドヌクレアーゼ、Cas4エンドヌクレアーゼ、Cas5エンドヌクレアーゼ、Cas6エンドヌクレアーゼ、Cas7エンドヌクレアーゼ、Cas8エンドヌクレアーゼ、Cas9エンドヌクレアーゼ（Csn1およびCsx12としても知られている）、Cas100エンドヌクレアーゼ、Csy1エンドヌクレアーゼ、Csy2エンドヌクレアーゼ、Csy3エンドヌクレアーゼ、Cse1エンドヌクレアーゼ、Cse2エンドヌクレアーゼ、Csc1エンドヌクレアーゼ、Csc2エンドヌクレアーゼ、Csa5エンドヌクレアーゼ、Csn2エンドヌクレアーゼ、Csm2エンドヌクレアーゼ、Csm3エンドヌクレアーゼ、Csm4エンドヌクレアーゼ、Csm5エンドヌクレアーゼ、Csm6エンドヌクレアーゼ、Cmr1エンドヌクレアーゼ、Cmr3エンドヌクレアーゼ、Cmr4エンドヌクレアーゼ、Cmr5エンドヌクレアーゼ、Cmr6エンドヌクレアーゼ、Csb1エンドヌクレアーゼ、Csb2エンドヌクレアーゼ、Csb3エンドヌクレアーゼ、Csx17エンドヌクレアーゼ、Csx14エンドヌクレアーゼ、Csx10エンドヌクレアーゼ、Csx16エンドヌクレアーゼ、CsaXエンドヌクレアーゼ、Csx3エンドヌクレアーゼ、Csx1エンドヌクレアーゼ、Csx15エンドヌクレアーゼ、Csf1エンドヌクレアーゼ、Csf2エンドヌクレアーゼ、Csf3エンドヌクレアーゼ、Csf4エンドヌクレアーゼ、もしくはCpf1エンドヌクレアーゼ、これらのホモログ、天然分子の組換え体、これらがコドン最適化もしくは修飾されたもの、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼはCas9である。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、化膿レンサ球菌由来のCas9（spCas9）である。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）由来のCas9（SluCas9）である。
いくつかの実施形態において、ゲノム編集の対象となる細胞は、変異を有していない正常細胞における発現と比較して内在性FOXP3遺伝子の発現が低下する１つ以上の変異をゲノムに有する。正常細胞は、FOXP3遺伝子異常を有していない別の対象に由来する（から単離された）健常な細胞またはコントロール細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、ゲノム編集の対象となる細胞は、FOXP3遺伝子関連状態またはFOXP3遺伝子関連障害の治療を必要とする対象（たとえば自己免疫障害（たとえばIPEX症候群）に罹患した対象）に由来する（から単離された）細胞であってもよい。したがって、いくつかの実施形態において、このような細胞における内在性FOXP3遺伝子の発現は、正常細胞における内在性FOXP3遺伝子の発現と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%または約100%低下している。
いくつかの実施形態において、リンパ球細胞のゲノムを編集する方法であって、
（ａ）Cas DNAエンドヌクレアーゼ（たとえばCas9エンドヌクレアーゼ）または該Cas DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
（ｂ）前記リンパ球細胞のゲノム内のFOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座（たとえばAAVS1）に前記Cas DNAエンドヌクレアーゼを標的化することができるgRNA（たとえばsgRNA）または該gRNAをコードする核酸；および
（ｃ）FOXP3のコード配列を含むドナー鋳型
をリンパ球細胞に提供する工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記Cas DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼ（たとえば化膿レンサ球菌由来のCas9エンドヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、FOXP3遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、FOXP3遺伝子座のエキソン１内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する該スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、非FOXP3遺伝子座（たとえばAAVS1）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１５〜２０のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１５〜２０のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、FOXP3のコード配列は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする。いくつかの実施形態において、FOXP3のコード配列はFOXP3 cDNAである。代表的なFOXP3 cDNA配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を有するAAVドナー鋳型に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記リンパ球細胞に前記Cas DNAエンドヌクレアーゼを提供する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記Cas DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記リンパ球細胞に提供する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記gRNAを前記リンパ球細胞に提供する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAはsgRNAである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記gRNAをコードする核酸を前記リンパ球細胞に提供する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、１つ以上のさらなるgRNAまたは該１つ以上のさらなるgRNAをコードする核酸を前記リンパ球細胞に提供する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、前記DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9である。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、化膿レンサ球菌由来のCas9（spCas9）である。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）由来のCas9（SluCas9）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、前記リンパ球における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、配列番号６８に示される配列と、少なくとも約70%の配列同一性を有し、たとえば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくともそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、該方法は、DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を使用する。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記リンパ球における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ヒト細胞、たとえばヒトCD4+Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、DNA（DNAプラスミドなど）である。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、RNA（mRNAなど）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、前記ドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、該ドナー鋳型は、前記（ｂ）のgRNAにより標的化された前記ゲノム遺伝子座に、前記ドナーカセットが相同組換え修復（HDR）により組み込まれるように構成されている。いくつかの実施形態において、標的化されたゲノム遺伝子座の配列に対応する相同アームがドナーカセットを挟んで両側に配置される。いくつかの実施形態において、相同アームの長さは、少なくとも約0.2kb（たとえば、少なくとも約0.3kb、少なくとも約0.4kb、少なくとも約0.5kb、少なくとも約0.6kb、少なくとも約0.7kb、少なくとも約0.8kb、少なくとも約0.9kb、少なくとも約1kbもしくは少なくともそれ以上）である。いくつかの実施形態において、相同アームの長さは、少なくとも約0.4kbである。典型的な相同アームとして、配列番号９０〜９７および１０６〜１０７のいずれかに示される配列を有する５’相同アーム、ならびに配列番号９８〜１０５および１０８〜１０９のいずれかに示される配列を有する３’相同アームが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型の５’末端の相同アームと３’末端の相同アームは同じものである。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型の５’末端の相同アームと３’末端の相同アームは異なるものである。
いくつかの実施形態では、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、前記ドナー鋳型は、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、該ドナー鋳型は、前記（ｂ）のgRNAにより標的化された前記ゲノム遺伝子座に、前記ドナーカセットが非相同末端結合（NHEJ）により組み込まれるように構成されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットの片側または両側にgRNA標的部位が隣接して配置される。いくつかの実施形態において、ドナーカセットの両側にgRNA標的部位が隣接して配置される。いくつかの実施形態において、gRNA標的部位は、前記システムに含まれるgRNAの標的部位である。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型のgRNA標的部位は、前記システムに含まれるgRNAが標的とする細胞ゲノムgRNA標的部位の逆相補鎖である。いくつかの実施形態では、前記ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、前記DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子への内包化により製剤化される。いくつかの実施形態において、前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子はgRNAをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、前記方法は、DNAエンドヌクレアーゼおよびgRNAをコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を使用する。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、DNAエンドヌクレアーゼをコードするmRNAである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、前記DNAエンドヌクレアーゼは、gRNAとあらかじめ複合体化されて、リボ核タンパク質（RNP）複合体を形成する。いくつかの実施形態において、前記RNP複合体は、エレクトロポレーションによって前記リンパ球に提供される。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、AAVベクター（たとえばAAV6ベクター）にコードされたAAVドナー鋳型である。いくつかの実施形態において、前記AAVドナー鋳型は、前記RNP複合体が細胞に提供されるのと同時またはほぼ同時に該細胞に提供される。たとえば、いくつかの実施形態において、前記RNP複合体が前記細胞にエレクトロポレーションされ、同日にAAVドナー鋳型が形質導入される。いくつかの実施形態において、前記細胞に前記RNP複合体がエレクトロポレーションされ、AAVドナー鋳型が形質導入されるが、このエレクトロポレーションと形質導入の時間差は約12時間以内（たとえば、11時間以内、10時間以内、9時間以内、8時間以内、7時間以内、6時間以内、5時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、1時間以内、またはこれら以下）である。いくつかの実施形態において、前記RNP複合体を前記細胞にエレクトロポレーションした後、該細胞を播種し、AAVドナー鋳型で該細胞を形質導入する。いくつかの実施形態において、前記細胞にRNPとAAVドナー鋳型を提供する前に、該細胞を活性化および拡大増殖させることができる因子（たとえば抗CD3抗体および／または抗CD28抗体、たとえば抗CD3／抗CD28ビーズ）の存在下で該細胞をあらかじめ刺激する。いくつかの実施形態において、前刺激は、少なくとも約12時間かけて実施される（たとえば、少なくとも約16時間、少なくとも約20時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間またはそれ以上かけて実施される）。いくつかの実施形態において、前刺激は、少なくとも約72時間かけて実施される。いくつかの実施形態において、前刺激は、約１×１０５個／ｍｌ〜１×１０７個／ｍｌの密度の細胞組成物において実施される（約２．５×１０５個／ｍｌ、約５×１０５個／ｍｌ、約７．５×１０５個／ｍｌ、約１×１０６個／ｍｌ、約２．５×１０６個／ｍｌ、約５×１０６個／ｍｌ、または約７．５×１０６個／ｍｌの密度の細胞組成物において実施され、これらの数値の間の任意の範囲も含む）。いくつかの実施形態において、前記細胞組成物中の前記細胞の濃度は、約５×１０５個／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによれば、細胞ゲノム内のFOXP3遺伝子座へのドナー鋳型の標的化された組み込みの頻度は、約0.1%〜約99%である。いくつかの実施形態において、標的化された組み込みの頻度は、約2%〜約70%（たとえば、約2%〜約65%、約2%〜約55%、約3%〜約70%、約5%〜約70%、約5%〜約60%、約5%〜約50%、または約10%〜約50%）である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、対象（ヒト対象など）の細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法によれば、該細胞は、編集後に凍結保存される。
標的配列の選択
いくつかの実施形態において、特定の参照遺伝子座に対して５’末端の境界の位置および／または３’末端の境界の位置を移動させて、遺伝子編集の特定の適用を容易にしたり、増強したりすることができ、本明細書でさらに説明および図示するように、これは、遺伝子編集を行うために選択されるエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する。
このような標的配列の選択の第１の態様において（ただしこれに限定されない）、多くのエンドヌクレアーゼシステムでは、切断可能な標的部位を最初に選択する際の規則または基準があり、たとえば、CRISPR II型またはＶ型エンドヌクレアーゼの場合は、DNA切断部位に隣接する特定の位置のPAM配列モチーフに特定の要件が必要とされる。
標的配列の選択または最適化に関する別の態様において（ただしこれに限定されない）、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼの特定の組み合わせによる「オフターゲット」活性の頻度（たとえば、選択した標的配列以外の部位で生じる二本鎖切断の頻度）は、オンターゲット活性の頻度に対して評価される。場合によっては、所望の遺伝子座で正確に編集された細胞は、その他の細胞と比較して選択的な利点を有しうる。選択的な利点の具体例として、複製速度の向上、持続性、特定の条件に対する耐性、対象へのインビボ導入後の生着の成功率または持続性の向上などの様々な属性の獲得、およびこのような細胞の数または生存能力の維持または向上に関連するその他の属性の獲得が挙げられるが、これらに限定されない。別の場合、所望の遺伝子座において正確に編集された細胞は、正確に編集された細胞の同定、選別またはその他の目的での選択に使用される１種以上のスクリーニング方法によって陽性細胞として選択することができる。選択的な利点と指向的な選択方法では、修正に関連した表現型を利用することができる。いくつかの実施形態において、細胞を２回以上編集して、意図する細胞集団の選択または精製に使用される新しい表現型を作製するための第２の修飾を作製することができる。このような第２の修飾は、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーのための第２のgRNAを追加することによって作製することができる。場合によっては、cDNAと選択マーカーを含むDNA断片を使用して、所望の遺伝子座において細胞を正確に編集することができる。
実施形態において、特定の場合に選択的な利点が適用可能であるか、指向的な選択が適用されるのかにかかわらず、選択的な利点または指向的な選択の適用の有効性を向上し、かつ／または所望の標的以外の部位での望ましくない変更の可能性を低減するため、オフターゲット頻度を考慮して標的配列が選択される。本明細書および当技術分野においてさらに詳しく説明および図解されているように、オフターゲット活性は様々な要因の影響を受けて発生し、このような要因として、標的部位と様々なオフターゲット部位の間の類似性および相違性、および使用される特定のエンドヌクレアーゼが挙げられる。オフターゲット活性の予測を支援するバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、多くの場合、そのようなツールを使用して、オフターゲット活性が起こる可能性が最も高い部位を同定することができ、このような予測や同定を実験により評価して、オンターゲット活性に対するオフターゲット活性の相対頻度を推定することができ、これによって、相対的なオンターゲット活性が高い配列の選択が可能となる。そのような技術の具体例が本明細書で提供されており、その他のものも当技術分野で知られている。
標的配列の選択の別の態様は、相同組換えイベントに関連する。相同領域を共有する配列は、介在配列を欠失させる相同組換えイベントにおいて中心的役割を果たしうる。このような組換えイベントは、染色体やその他のDNA配列の通常の複製過程で発生し、また、通常の細胞複製サイクルにおいて定期的に起こる二本鎖切断修復の際などの、DNA配列が合成されるその他の時点でも発生するが、様々なイベント（UV光やその他のDNA切断誘導物質など）の発生または特定の薬剤（様々な化学誘導物質など）の存在によっても増強されることがある。このような誘導物質の多くは、ゲノム内で二本鎖切断（DSB）を無差別に発生させ、正常細胞でもDSBは定期的に誘導され、修復されている。二本鎖切断の修復中に、元の配列を完全に忠実に再構築することができるが、場合によっては、DSB部位に短い挿入または欠失（「indel」と呼ばれる）が導入されることがある。
また、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼシステムを使用した場合のように、二本鎖切断（DSB）を特定の位置に特異的に誘導することができ、これを利用して、選択された染色体の位置において指向的または選択的な遺伝子組換えイベントを起こすことができる。DNA修復（および複製）において、相同配列が組換えられる傾向は、様々な状況で利用することができ、CRISPRなどの遺伝子編集システムの適用のうちの１つの基礎をなすものであり、このような遺伝子編集システムでは、「ドナー」ポリヌクレオチドを使用することにより提供される目的の配列が、相同組換え修復により所望の染色体の特定の位置に挿入される。
特定の配列間の相同領域を使用して、所望の欠失を作製することができるが、この相同領域は、わずか10塩基対以下でありうる短い「マイクロホモロジー」領域である場合もある。たとえば、単一の二本鎖切断（DSB）が、近傍の配列とのマイクロホモロジーを示す部位に導入される。そのようなDSBの通常の修復過程では、介在配列の欠失が高頻度で発生し、これは、DSBおよびこれに付随する細胞修復プロセスによって促進される組換えの結果として起こる。
しかしながら、状況によっては、相同領域内で標的配列を選択すると、遺伝子融合（コード領域内での欠失）などのはるかに大きな欠失が生じる可能性もあり、このような結果は、特定の状況では、所望される場合と所望されない場合がある。
本明細書で提供される例では、FOXP3をコードする遺伝子を挿入するように設計されたDSBを作製するための様々な標的領域の選択、およびオンターゲットイベントに対するオフターゲットイベントが最小限に抑えられるように設計されたそのような領域内の特定の標的配列の選択をさらに説明している。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座およびTCRa（TRAC）遺伝子座から選択される。
核酸の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書で詳しく説明し、当技術分野でも知られているように、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、たとえば、活性、安定性もしくは特異性の増強、送達の変更、宿主細胞の自然免疫応答の低減またはその他の増強のための、個別または組み合わせて利用可能な１つ以上の修飾を有する。
特定の実施形態において、修飾されたポリヌクレオチドは、CRISPR/Cas9システムにおいて使用され、この場合、細胞に導入されるガイドRNA（単一分子ガイドまたは二分子ガイド）および／またはCasエンドヌクレアーゼをコードするDNAもしくはRNAは、以下で説明および図示するように修飾することができる。このような修飾ポリヌクレオチドをCRISPR/Cas9システムで使用して、１つ以上のゲノム遺伝子座を編集することができる。
このような一例としての用途を目的として（ただしこれに限定されない）CRISPR/Cas9システムを使用する際に、ガイドRNAを修飾することにより、該ガイドRNAを含むCRISPR/Cas9ゲノム編集複合体の形成または安定性を向上させることができるが、この複合体は、単一分子ガイドまたは二分子ガイドとCasエンドヌクレアーゼから形成されてもよい。別の方法では、ガイドRNAを修飾することにより、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列の間の相互作用の開始、安定性または動態を向上させることができ、これは、たとえばオンターゲット活性を増強するために使用することができる。別の方法では、ガイドRNAを修飾することにより、特異性を向上させてもよく、たとえば、他の部位での効果（オフターゲット）と比較した場合の、オンターゲット部位における相対的なゲノム編集率を向上させることができる。
別の方法として、あるいは前記に加えて、たとえば、細胞中に存在するリボヌクレアーゼ（RNase）による分解に対するガイドRNAの耐性を修飾により向上させることによって、ガイドRNAの安定性を向上させることができ、その結果、細胞におけるガイドRNAの半減期を延長することができる。ガイドRNAの半減期を延長する修飾は、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるRNAを使用してCasエンドヌクレアーゼが細胞に導入されて編集が行われる実施形態において特に有用でありうるが、この理由として、エンドヌクレアーゼをコードするRNAと同時に導入されるガイドRNAの半減期が延長されることを利用して、ガイドRNAとコードされたCasまたはCpf1エンドヌクレアーゼが細胞内で共存する時間を延長することができることが挙げられる。
別の方法として、あるいは前記に加えて、細胞に導入されたRNAが自然免疫応答を誘導する可能性またはその程度を低減するために修飾を利用することができる。本明細書において後述し、当技術分野でも知られているように、このような免疫応答は、低分子干渉RNA（siRNA）などのRNA干渉（RNAｉ）に関して十分に評価されており、RNAの半減期の短縮および／またはサイトカインもしくは免疫応答に関連するその他の因子の誘導に関連する傾向がある。
細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするRNAに１種以上の修飾を加えることも可能であり、このような修飾として、RNAの安定性を向上させる修飾（細胞内に存在するRNAseによる分解を増加させる修飾など）、生成物（たとえばエンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、および／または細胞に導入されたRNAが自然免疫応答を誘導する可能性またはその程度を低減させる修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
前述した修飾やその他の修飾などの様々な修飾を組み合わせて同様に使用することができる。たとえば、CRISPR/Cas9の場合、ガイドRNAに１種以上の修飾を加えることができ（前記で例示したものを含む）、かつ／またはCasエンドヌクレアーゼをコードするRNAに１種以上の修飾を加えることができる（前記で例示したものを含む）。
送達
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法で使用される核酸分子、たとえば、本開示のゲノム標的化核酸および／または部位指向性ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達用の送達担体の内部またはその表面にパッケージされる。想定される送達担体として、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で報告されているように、様々な標的化部分を使用して、このような担体と所望の細胞種または位置との選択的な相互作用を増強することができる。
本開示の複合体、ポリペプチドまたは核酸の細胞への導入は、ウイルスもしくはバクテリオファージの感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（PEI）を介したトランスフェクション、DEAE−デキストランを介したトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、またはナノ粒子を介した核酸送達などにより行うことができる。
実施形態において、ガイドRNAポリヌクレオチド（RNAまたはDNA）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（RNAまたはDNA）は、当技術分野で公知のウイルスを使用した送達担体またはウイルスを使用しない送達担体によって送達することができる。別法として、単一または複数のエンドヌクレアーゼポリペプチドは、エレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子などの、当技術分野で公知のウイルスを使用した送達担体またはウイルスを使用しない送達担体によって送達することができる。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で送達することができ、あるいは１つ以上のガイドRNAとあらかじめ複合体化して送達することができ、またはtracrRNAおよび１つ以上のcrRNAとあらかじめ複合体化して送達することができる。
実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスを使用しない送達担体によって送達することができ、このようなウイルスを使用しない送達担体として、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正帯電ペプチド、小分子RNAコンジュゲート、アプタマー-RNAキメラ、およびRNA融合タンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスを使用しない送達担体のいくつかの具体例は、Peer, D. et al. (2011). Gene Therapy, 18: 1127-1133に記載されている（この文献は、その他のポリヌクレオチドの送達にも有用な、siRNA用の非ウイルス送達担体に焦点を当てている）。
実施形態において、ガイドRNA、sgRNA、およびエンドヌクレアーゼをコードするmRNAなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（LNP）によって細胞または対象に送達することができる。
ウイルスを使用しない核酸送達法が動物モデルとヒトの両方で試験されているが、最もよく開発されたシステムは脂質ナノ粒子である。脂質ナノ粒子（LNP）は、一般に、イオン化可能なカチオン性脂質と３種以上のさらなる構成要素で構成されており、このさらなる構成要素は、通常、コレステロール、DOPE、および脂質含有ポリエチレングリコール（PEG）である（たとえば実施例２を参照されたい）。カチオン性脂質は、正に帯電した核酸に結合して、核酸を分解から保護する稠密な複合体を形成することができる。マイクロ流体システムを通過する際に、各構成要素が自己集合して50〜150nMのサイズの粒子を形成し、カチオン性脂質と複合体化したコアに核酸が封入されて、脂質二重層様構造に囲まれる。対象の循環系への注射後、これらの粒子はアポリポタンパク質E（apoE）に結合することができる。ApoEはLDL受容体のリガンドであり、受容体を介したエンドサイトーシスにより肝臓の肝細胞への取込みを仲介する。このタイプのLNPは、げっ歯類、霊長類およびヒトの肝臓の肝細胞にmRNAおよびsiRNAを効率的に送達できることが示されている。エンドサイトーシス後、LNPはエンドソームに存在する。封入された核酸は、カチオン性脂質のイオン化可能な性質によって、エンドソームを脱出する。これにより、核酸が細胞質に送達され、コードされたタンパク質へとmRNAが翻訳される。エンドソームからの脱出後、Cas9 mRNAはCas9タンパク質に翻訳され、gRNAと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質配列に核局在化シグナルを含めることによって、Cas9タンパク質／gRNA複合体の核内移行が促進される。別法として、小さなgRNAは核膜孔複合体を通過し、核内のCas9タンパク質と複合体を形成する。gRNA／Cas9複合体が核内に入ると、ゲノムをスキャンして相同な標的部位を探し、ゲノム内の所望の標的部位で選択的に二本鎖切断を作製する。インビボでのRNA分子の半減期は一般に短く、数時間から数日程度である。同様に、タンパク質の半減期も短い傾向があり、数時間から数日程度である。したがって、いくつかの実施形態において、LNPを使用したgRNAおよびCas9 mRNAの送達は、gRNA／Cas9複合体の一過性に過ぎない発現および活性をもたらすことができる。これは、オフターゲット切断の頻度を低減するという利点を提供することができ、したがって、いくつかの実施形態において遺伝毒性のリスクを最小限に抑えることができる。LNPは一般にウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くのヒトではAAVに対して免疫性を既に有しているが、LNPに対する既存の免疫性はない。さらに、LNPに対する適応免疫反応が発生する可能性は低く、LNPの反復投与が可能になる。
LNPにおいて使用するため、いくつかの種類のイオン化可能なカチオン性脂質が開発されている。このようなものとして、C12-200（Love, K. T. et al. (2010). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107(5):1864-1869）、MC3、LN16、MD1などが挙げられる。LNPの１つのタイプでは、GalNac部分がLNPの外側に付加されており、アシアロ糖タンパク質受容体を介して肝臓に取り込むためのリガンドとして機能する。これらのカチオン性脂質のいずれかを使用して、gRNAおよびCas9 mRNAを肝臓に送達するためのLNPが製剤化される。
いくつかの実施形態において、LNPは、1000nm未満、500nm未満、250nm未満、200nm未満、150nm未満、100nm未満、75nm未満、50nm未満または25nm未満の直径を有する粒子を指す。あるいは、ナノ粒子のサイズは、1〜1000nm、1〜500nm、1〜250nm、25〜200nm、25〜100nm、35〜75nmまたは25〜60nmの範囲であってもよい。
LNPは、カチオン性脂質、アニオン性脂質、または中性脂質から作製することができる。融合性リン脂質であるDOPEや膜構成要素であるコレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性とナノ粒子の安定性を高めるための「ヘルパー脂質」としてLNPに含めることができる。カチオン性脂質の制限事項として、安定性の低さと急速なクリアランスにより有効性が低いこと、および炎症反応または抗炎症反応が発生することが挙げられる。また、LNPは、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質と親水性脂質の両方を有することができる。
当技術分野で公知の脂質またはその組み合わせであれば、どのようなものであってもLNPの作製に使用することができる。LNPの作製に使用される脂質の例としては、DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC−コレステロール、DOTAP−コレステロール、GAP-DMORIE-DPyPEおよびGL67A-DOPE-DMPE−ポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。カチオン性脂質の例としては、98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA（KC2）、DLin-MC3-DMA（MC3）、XTC、MD1および7C1が挙げられる。中性脂質の例としては、DPSC、DPPC、POPC、DOPEおよびSMが挙げられる。PEG修飾脂質の例としては、PEG-DMG、PEG-CerC14およびPEG-CerC20が挙げられる。
実施形態において、複数種の脂質を任意のモル数比で組み合わせてLNPを作製することができる。さらに、単一または複数のポリヌクレオチドと単一または複数の脂質を様々なモル比で組み合わせてLNPを作製することもできる。
実施形態において、部位指向性ポリペプチドとゲノム標的化核酸は、それぞれ別々に細胞または対象に投与することができる。一方、部位指向性ポリペプチドは、１つ以上のガイドRNAとあらかじめ複合体化することができ、あるいはtracrRNAおよび１つ以上のcrRNAとあらかじめ複合体化することができる。あらかじめ複合体化した材料を細胞または対象に投与することができる。このようなあらかじめ複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（RNP）として知られている。
RNAは、別のRNAまたはDNAと特定の相互作用を形成することができる。この特性は多くの生物学的プロセスで利用されているが、核酸が豊富な細胞環境において無差別な相互作用が起こるリスクも伴う。この問題の解決策の１つとして、RNAをエンドヌクレアーゼとあらかじめ複合体化させたリボ核タンパク質粒子（RNP）を形成させることが挙げられる。RNPの別の利点として、分解からのRNAの保護がある。
いくつかの実施形態において、RNPに含まれるエンドヌクレアーゼは、修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。同様に、gRNA、crRNA、tracrRNAまたはsgRNAも、修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。様々な修飾が当技術分野で知られており、これらを使用することができる。
エンドヌクレアーゼとsgRNAを、通常、１：１のモル比で組み合わせることができる。別法として、エンドヌクレアーゼ、crRNAおよびtracrRNAを、通常、１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかしながら、様々なモル比を用いてRNPを作製することができる。
いくつかの実施形態において、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用して送達を行うことができる。送達するポリヌクレオチド、rep遺伝子およびcap遺伝子を含むようにパッケージ化されるAAVゲノムとヘルパーウイルスの機能を細胞に提供するためのrAAV粒子を作製する技術は当技術分野で知られている。rAAVの作製には、rAAVゲノム、このrAAVゲノムから分離された（たとえば内部には含まれない）AAV rep遺伝子およびcap遺伝子、ならびにヘルパーウイルスの機能を単一の細胞内に（本明細書においてパッケージング細胞と呼ぶ）存在させる必要がある。AAV rep遺伝子およびcap遺伝子は、組換えウイルスを作製することが可能などのような血清型のAAVに由来するものであってもよく、rAAVのゲノム内のITRとは異なる血清型のAAVに由来するものであってもよく、AAVの血清型としては、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13およびAAV rh.74が挙げられるが、これらに限定されない。シュードタイプ化したrAAVの作製については、たとえば、国際特許出願WO01／83692に開示されている。表１を参照されたい。表１に、選択したいくつかのAAVのAAV血清型とGenbankアクセッション番号を示す。
Figure 2021521849
いくつかの実施形態において、パッケージング細胞を作製する方法は、AAV粒子の作製に必要なすべての構成要素を安定して発現する細胞株を作製することを含む。たとえば、AAV rep遺伝子およびcap遺伝子を持たないrAAVゲノムと、このrAAVゲノムとは別個AAV rep遺伝子およびcap遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーとを有する単一のプラスミド（または複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込む。AAVゲノムは、GCテーリング（Samulski, R. J. et al. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79(6):2077-2081）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Laughlin, C. A. et al. (1983). Gene, 23(1):65-73）、または直接的な平滑末端ライゲーション（Senapathy, P. et al. (1984). J. Biol. Chem., 259:4661-4666）などの手法によって、細菌プラスミドに導入される。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点として、細胞を選択可能であり、細胞はrAAVの大量生産に適していることが挙げられる。好適な別の方法の例として、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、rAAVゲノムならびに／またはrep遺伝子およびcap遺伝子をパッケージング細胞に導入する方法が挙げられる。
rAAVの製造の一般的な原則は、たとえば、Carter, B. J. (1992). Curr. Opin. Biotechnol., 3(5):533-539;およびMuzyczka, M. (1992). Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-129においてレビューされている。様々なアプローチは、 Tratschin, J. D. et al. (1984). Mol. Cell. Biol., 4(10):2072-2081; Hermonat, P. L. et al. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(20):6466-6470; Tratschin, J. D. et al. (1985). Mo1. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; McLaughlin, S. K. et al. (1988). J. Virol. , 62(6):1963-1973; Lebkowski, J. S. et al. (1988). Mol. Cell. Biol., 8(10):3988-3996.; Samulski, R. J. et al. (1989), J. Virol. , 63(9):3822-3828; 米国特許第5,173,414号; WO 95/13365およびこれに対応する米国特許第5,658.776号; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441(PCT/US96/14423); WO 97/08298(PCT/US96/13872); WO 97/21825(PCT/US96/20777); WO 97/06243(PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin, P. et al. (1995). Vaccine, 13(13):1244-1250; Paul, R. W. et al. (1993). Hum. Gene Ther. , 4(5):609-615; Clark, K. R. et al. (1996). Gene Ther. 3(12):1124-1132; 米国特許第5,786,211号;米国特許第5,871,982号;ならびに米国特許第6,258,595号に記載されている。
AAVベクターの血清型を標的細胞種に一致させることができる。たとえば、後述する典型的な細胞種は、本明細書に記載の血清型のAAVを形質導入することができる。たとえば、造血幹細胞に適したAAVベクターの血清型として、AAV2およびAAV6が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、AAVベクターの血清型は、AAV6である。
いくつかの実施形態において、AAVベクターは、配列番号３３〜３６および１６１のいずれか１つと少なくとも90%または少なくとも約90%（たとえば、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、配列番号３３と少なくとも90%または少なくとも約90%（たとえば、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、配列番号３４と少なくとも90%または少なくとも約90%（たとえば、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、配列番号３５と少なくとも90%または少なくとも約90%（たとえば、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、配列番号３６と少なくとも90%または少なくとも約90%（たとえば、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、配列番号１６１と少なくとも90%または少なくとも約90%（たとえば、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、またはそれ以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、その他のウイルスベクターを使用することもできる。このようなウイルスベクターとして、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、Cas9 mRNA、FOXP3遺伝子の１つまたは２つの遺伝子座を標的とするsgRNA、およびドナーDNAは、それぞれ別々に脂質ナノ粒子への内包化により製剤化されるか、これらのすべてが一緒に１つの脂質ナノ粒子への内包化により製剤化されるか、これらのすべてが一緒に２つ以上の脂質ナノ粒子への内包化により製剤化される。
いくつかの実施形態において、Cas9 mRNAは、脂質ナノ粒子への内包化により製剤化され、一方、sgRNAおよびドナーDNAは、AAVベクターに組み込まれて送達される。いくつかの実施形態において、Cas9 mRNAおよびsgRNAは一緒に脂質ナノ粒子への内包化により製剤化され、一方、ドナーDNAは、AAVベクターに組み込まれて送達される。
Cas9ヌクレアーゼをDNAプラスミドとして、mRNAとして、またはタンパク質として送達することもできる。ガイドRNAを同じDNAから発現させることができ、あるいはRNAとして送達することもできる。このRNAを化学的に修飾して、その半減期を変更または向上し、かつ／または免疫応答が起こる可能性またはその程度を低下させることができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達前にgRNAと複合体化することもできる。ウイルスベクターにより、効率的な送達が可能となる。スプリット型のCas9およびCas9のより小さなオーソログは、HDR用ドナーと同様に、AAVにパッケージングすることができる。また、これらの構成要素のそれぞれを送達することができる様々な非ウイルス性の送達方法が存在し、非ウイルス性送達方法とウイルス性送達方法を併用することができる。たとえば、ナノ粒子を使用してタンパク質とガイドRNAを送達し、AAVを使用してドナーDNAを送達することができる。
治療的処置用のゲノム編集構成要素の送達に関連するいくつかの実施形態では、少なくとも２つの構成要素、すなわち配列特異的ヌクレアーゼとDNAドナー鋳型が、形質転換を受ける細胞（たとえばリンパ球細胞）の核内に送達される。いくつかの実施形態において、AAVは、AAV2およびAAV6の血清型から選択される。いくつかの実施形態において、AAVにパッケージされたDNAドナー鋳型が、末梢静脈注射によって対象（たとえばヒト対象）に最初に投与され、続いて配列特異的ヌクレアーゼが投与される。AAVにパッケージされたドナーDNA鋳型を最初に送達することの利点は、送達されたドナーDNA鋳型が、形質導入されたリンパ球細胞の核内で安定して維持され、これによって次の配列特異的ヌクレアーゼの投与が可能になり、ゲノムに二本鎖切断が作製されて、HDRまたはNHEJによるDNAドナーの組み込みが行われることが挙げられる。いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、所望の治療効果を発揮するのに十分なレベルで、導入遺伝子の標的化組み込みを促進するために必要とされる時間だけ、標的細胞において活性を維持することが望ましい。配列特異的ヌクレアーゼが細胞内で長期間にわたり活性を維持する場合、これによって、オフターゲット部位での二本鎖切断の頻度が増加することになる。具体的には、オフターゲット切断の頻度は、オフターゲット切断効率にヌクレアーゼが活性な時間を掛けた関数である。mRNAおよびこれから翻訳されたタンパク質は細胞内で短命であるため、配列特異的ヌクレアーゼをmRNAの形態で送達すると、数時間から数日間の範囲でヌクレアーゼ活性の持続時間が短くなる。したがって、ドナー鋳型を既に含む細胞に配列特異的ヌクレアーゼを送達すると、オフターゲットな組み込みに対する標的化された組み込みの比率を可能な限り高くできると予想される。
いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、FOXP3遺伝子座に対して指向性のsgRNAとCas9ヌクレアーゼから構成されるCRISPR-Cas9である。いくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（NLS）に作動可能に融合されたCas9タンパク質をコードするmRNAとして送達される。いくつかの実施形態において、sgRNAおよびCas9 mRNAは、脂質ナノ粒子にパッケージされることによって、リンパ球細胞（たとえばCD4+Ｔ細胞）に送達される。
いくつかの実施形態において、ドナー鋳型の核局在化を促進するため、プラスミドの核局在化を促進することができるDNA配列、たとえば、シミアンウイルス４０（SV40）の複製起点および初期プロモーターからなる366bpの領域をドナー鋳型に付加することができる。細胞タンパク質に結合するその他のDNA配列も、DNAの核内移行を向上させるために使用することができる。
遺伝子組換え細胞および遺伝子組換え細胞集団
一態様において、本明細書の開示は、細胞のゲノムを編集して、遺伝子組換え細胞を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、遺伝子組換え細胞集団を提供する。したがって、遺伝子組換え細胞は、ゲノム編集（たとえばCRISPR/Cas9システムを使用したゲノム編集）によって導入された少なくとも１つの遺伝子組換えを有する細胞を指す。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えされたリンパ球細胞、たとえば、ヒトCD4+Ｔ細胞などのＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、IPEX症候群に罹患した対象から得たヒトＴ細胞である。組み込まれたFOXP3のコード配列を有する遺伝子組換え細胞が本明細書において想定される。
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のタンパク質配列または発現ベクターを含む遺伝子組換え細胞（たとえば哺乳動物細胞）を提供する。したがって、二量体化CISCを分泌するための細胞（哺乳動物細胞など）が提供され、この細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるタンパク質配列または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は、リンパ球などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、リンパ球などのリンパ球細胞である。
いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は幹細胞、たとえば造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD34+Ｔリンパ球、CD8+Ｔリンパ球および／またはCD4+Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は神経幹細胞である。
いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+ Ｔ細胞傷害性リンパ球であり、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞またはバルクCD8+Ｔ細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+ヘルパーＴリンパ球であり、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞またはバルクCD4+Ｔ細胞を含んでいてもよい。
前記リンパ球（Ｔリンパ球）は、公知の技術によって回収することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような、抗体との親和性結合などの公知の技術によって濃縮または除去することができる。濃縮工程および／または除去工程を行った後、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法によって所望のＴリンパ球をインビトロで拡大増殖させることができる。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は患者から得られた自家Ｔ細胞である。
たとえば、所望のＴ細胞集団またはＴ細胞亜集団は、増殖前のＴリンパ球集団をインビトロの培地に添加し、次いで、非分裂末梢血単核細胞（PBMC）などのフィーダー細胞を該培地に添加し（たとえば、添加後の細胞集団において、拡大培養開始時の最初の集団中の各Ｔリンパ球１個あたり、少なくとも５個、１０個、２０個、または４０個またはそれ以上のPBMCフィーダー細胞が含まれるような比率になるようにフィーダー細胞を加える）、該培地を（たとえばＴ細胞数を十分に拡大増殖させることができる時間にわたって）インキュベートすることによって拡大増殖させることができる。前記非分裂フィーダー細胞は、γ線が照射されたPBMCフィーダー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞分裂を防ぐため、3000〜3600radのγ線を前記PBMCに照射する。いくつかの実施形態において、前記PBMCの細胞分裂を防ぐため、3000rad、3100rad、3200rad、3300rad、3400rad、3500rad、もしくは3600radのγ線、またはこれらの数値のいずれかからなる２つの端点の間の任意の放射線値のγ線を前記PBMCに照射する。Ｔ細胞またはフィーダー細胞を培地に添加する順序は必要に応じて入れ替えてもよい。通常、Ｔリンパ球の増殖に適した温度などの条件下で培養物をインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度は、たとえば、通常、少なくとも25℃であり、少なくとも30℃が好ましく、37℃がより好ましい。いくつかの実施形態において、ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度は、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃もしくは37℃、またはこれらの数値のいずれかからなる２つの端点の間のその他の任意の温度である。
Ｔリンパ球を単離し、拡大増殖を行う前または拡大増殖を行った後に、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれ、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソーティングすることができる。
CD8+細胞は、標準的な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態において、CD8+細胞は、ナイーブCD8+細胞、セントラルメモリーCD8+細胞およびエフェクターメモリーCD8+細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を特定することによって、これらのCD8+細胞にさらにソーティングされる。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、CD8+末梢血リンパ球由来のCD62L+サブセットおよびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体で染色した後に、CD62L-CD8+画分およびCD62L+CD8+画分にソーティングされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーTCMの表現型マーカーの発現は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および／またはCD127を含み、グランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+および／またはCD8+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターTEは、CD62L、CCR7、CD28、および／またはCD127が陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンが陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127および／またはCD45RAが挙げられる。
CD4+ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞にソーティングされる。CD4+リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブCD4+Ｔリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+および／またはCD4+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L+および／またはCD45RO+である。いくつかの実施形態において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L-および／またはCD45RO-である。
哺乳動物細胞などの細胞および哺乳動物細胞集団などの細胞集団のいずれであっても、これらの細胞または細胞集団が２つの異なる遺伝子組換えイベントを起こしたか否かということに基づいて、拡大増殖させるために選択される。哺乳動物細胞などの細胞または哺乳動物細胞集団などの細胞集団が１種以下の遺伝子組換えイベントを起こした場合、リガンドを添加しても二量体化は起こらない。しかし、哺乳動物細胞などの細胞または哺乳動物細胞集団などの細胞集団が２種の遺伝子組換えイベントを起こした場合、リガンドを添加すると、CISC構成要素が二量体化し、続いてシグナル伝達カスケードが発生する。したがって、哺乳動物細胞などの細胞または哺乳動物細胞集団などの細胞集団は、リガンドとの接触に対する応答性に基づいて選択してもよい。いくつかの実施形態において、リガンドの添加量は、0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、もしくは100nM、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度であってもよい。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞または哺乳動物細胞集団などの細胞集団は、シグナル伝達経路の結果として発現されるマーカーに基づいて、二量体化CISCが陽性であってもよい。したがって、細胞集団が二量体化CISCについて陽性であるか否かは、表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体による染色を使用したフローサイトメトリーによって判定してもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるタンパク質配列または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる発現ベクターを含む遺伝子組換え細胞は、天然の胸腺Treg（tTreg）に類似した表現型を含む。本明細書において、このような遺伝子組換え細胞も「edTreg」と呼ぶ。いくつかの実施形態において、edTregは、ｉ）FOXP3、CD25、CTLA4、ICOSおよびLAG3のうちのいずれか１つ以上（２つ、３つ、４つもしくは５つ）の高発現および／またはii）CD127の低発現を特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、FOXP3、CD25、CTLA4、ICOSおよびLAG3の高発現と、CD127の低発現を特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、メモリー表現型を有する。いくつかの実施形態において、edTregは、CD45ROの高発現を特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、Heliosの低発現を特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、遺伝子組換えされていない対照細胞と比較して、刺激に対する炎症性サイトカインの応答が低下していることを特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、遺伝子組換えされていない対照細胞と比較して、刺激に対するIL-2、IFNγおよび／またはTNFαの応答が低下していることを特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、遺伝子組換えされていない対照細胞と比較して、刺激に対するIL-2、IFNγおよびTNFαの応答が低下していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるタンパク質配列または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる発現ベクターを含む遺伝子組換え細胞は、公知の技術、たとえば親和性結合などによって濃縮することができる。たとえば、LNGFRを発現する遺伝子組換え細胞は、抗LNGFR抗体またはその結合断片を結合させたビーズなどのLNGFR選択性材料に対する親和性結合により濃縮することができる。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞はedTregであり、移植片対宿主病（GVHD）のマウスモデルにedTregを投与すると、遺伝子組換えしていない対照細胞を投与した対照マウスモデルと比較して、マウスモデルにおけるGVHDの発症が遅延し、かつ／またはマウスモデルの生存率が増加することを特徴とする。いくつかの実施形態において、edTregは、腹腔内経路または静脈内経路によりマウスモデルに投与される。いくつかの実施形態において、edTregを少なくとも60%または少なくとも約60%（少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは少なくともそれ以上）含む細胞組成物がマウスモデルに投与される。いくつかの実施形態において、edTregを70%または約70%含む細胞組成物がマウスモデルに投与される。いくつかの実施形態において、edTregを90%または約90%含む細胞組成物がマウスモデルに投与される。
いくつかの実施形態において、前記細胞は生殖細胞ではない。
作製方法
遺伝子組換え細胞を作製する方法を提供する。この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行ってもよい。前記CD3および／またはCD28は、ビーズなどの固体担体上に担持されていてもよい。
いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。
いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。当業者であれば、コドンの最適化を理解することができ、コンピューターを使用した方法によって核酸を最適化してもよい。
いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。
いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。
いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。LNGFRは、細胞濃縮のマーカーとして使用してもよい。
μCISC、CISCγまたはFRBを有する細胞を組成物および方法において使用してもよく、これによって、ラパマイシンを介したCISCの細胞内シグナル伝達を利用することが可能になるとともに、FOXP3遺伝子を保有する宿主細胞の増殖および生存能力に対するラパマイシンまたはラパマイシン関連化合物の悪影響を緩和することができる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および第５の配列は前記細胞に導入され、第４の配列は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の配列は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の配列は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の配列は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の配列は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の配列は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の配列は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の配列は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の配列は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の配列は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の配列は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の配列は配列番号４７に示される配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。
いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。前記相同アームは、前記コンストラクトに別の遺伝子を付加するように構成されていてもよい。
いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、インプット細胞集団に対して前記方法を実施し、１個以上の細胞が改変されたアウトプット細胞集団を発生させる。いくつかの実施形態において、前記アウトプット細胞集団中の改変細胞は、該アウトプット細胞集団中の非改変細胞において発現されない表面マーカー（たとえばLNGFR）を発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、改変細胞を得るためにアウトプット細胞集団を濃縮する工程をさらに含む。改変細胞は、公知の技術、たとえば親和性結合などによって濃縮することができる。たとえば、LNGFRを発現する改変細胞は、抗LNGFR抗体を結合させたビーズなどのLNGFR選択性材料に対する親和性結合により濃縮することができる。改変細胞を濃縮することによって、次いで拡大増殖される改変細胞の収率および純度を高くすることができる。いくつかの実施形態において、改変細胞を得るためにアウトプット細胞集団を濃縮することによって、濃縮した細胞集団中に含まれる改変細胞（たとえばLNGFR+改変細胞）の割合が、少なくとも90%または少なくとも約90%となる（少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくともそれ以上となる）。
また、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法によって作製されたFOXP3発現用細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする遺伝子をコードする核酸を含むFOXP3発現用細胞を提供する。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする前記遺伝子は、FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態において、前記非FOXP3遺伝子座は、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CISCβ:FRB-IL2Rβ、DISC、CISC-FRB、μDISC、μCISC-FRB、FRB、LNGFRおよび／またはLNGFReを発現する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Treg表現型を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は医薬添加剤を含む。
いくつかの実施形態において、対象における疾患および／または状態を治療、緩和および／または抑制する方法であって、疾患および／または状態を有する対象に、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞または組成物を提供する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記対象に前記細胞を提供することによって、該対象の免疫応答が阻害または抑制される。いくつかの実施形態において、阻害または抑制される免疫応答は、Ｔ細胞を介した炎症反応である。
いくつかの実施形態において、前記疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患はＸ連鎖性（IPEX）症候群である。いくつかの実施形態において、前記状態は移植片対宿主病（GVHD）である。いくつかの実施形態において、前記状態は、固形臓器の移植に関連する状態である。
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法によって作製されたFOXP3発現用細胞を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする遺伝子をコードする核酸を含むFOXP3発現用細胞を提供する。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする前記遺伝子は、FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態において、前記非FOXP3遺伝子座は、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CISCβ:FRB-IL2Rβ、DISC、CISC-FRB、μDISC、μCISC-FRB、FRB、LNGFRおよび／またはLNGFReを発現する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Treg表現型を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法により作製される。いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、対象における疾患および／または状態を治療、緩和および／または抑制する方法であって、疾患および／または状態を有する対象に、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞または組成物を提供する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法により作製される。いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。いくつかの実施形態において、前記対象に前記細胞を提供することによって、該対象の免疫応答が阻害または抑制される。いくつかの実施形態において、阻害または抑制される免疫応答は、Ｔ細胞を介した炎症反応である。いくつかの実施形態において、前記疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患はＸ連鎖性（IPEX）症候群である。いくつかの実施形態において、前記状態は移植片対宿主病（GVHD）である。いくつかの実施形態において、前記対象は、固形臓器の移植を受けた対象である。
二量体化CISC構成要素を発現する細胞の作製方法
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、宿主細胞（たとえば哺乳動物細胞（たとえばリンパ球）にタンパク質配列または発現ベクターを導入することによって、薬物により調節されるサイトカインのシグナル伝達を誘導し、かつ／または二量体化CISC構成要素を発現する細胞を選択的に拡大増殖させることが望ましい場合がある。たとえば、二量体化CISCは、リガンドと接触すると、CISC構成要素が導入された細胞においてサイトカインのシグナル伝達を可能とし、細胞（哺乳動物細胞など）の内部でシグナルを伝達することができる。さらに、本明細書に記載の２つの特定の遺伝子組換えイベントを起こした細胞のみが選択されるように、細胞（哺乳動物細胞など）の選択的な拡大増殖を制御することができる。このような細胞の調製は、本開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術に従って行うことができる。
いくつかの実施形態において、CISCを有する細胞（哺乳動物細胞など）を作製する方法を提供し、この細胞は、二量体化CISCを発現する。この方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質配列または本明細書に記載の実施形態に記載の発現ベクターを細胞（哺乳動物細胞など）に送達する工程を含むことができる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質配列は、第１の配列および第２の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の配列は、第１の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、長さが最適化されていることが好ましい所定長のリンカー、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む第１のCISC構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、第２の配列は、第２の細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、長さが最適化されていることが好ましい所定長のリンカー、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む第２のCISC構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長もしくは15アミノ酸長またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、インターロイキン２のシグナル伝達ドメイン、たとえば、IL2RbドメインまたはIL2Rgドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞外結合ドメインは、ラパマイシンまたはラパログに結合する結合ドメインであり、たとえば、FKBPもしくはFRBまたはそれらの一部である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD8+細胞またはCD4+細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は神経幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はNK細胞である。
細胞の内部においてシグナルを活性化させる方法
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞の内部においてシグナルを活性化させる方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の細胞（哺乳動物細胞など）を提供する工程を含んでいてもよく、この細胞は、本明細書に記載のタンパク質配列または本明細書に記載の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の二量体化CISCをコードするタンパク質配列、または本明細書に記載の発現ベクターを発現させる工程さらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞（哺乳動物細胞など）をリガンドと接触させる工程を含み、これによって、第１のCISC構成要素と第２のCISC構成要素の二量体化が誘導され、その結果、細胞の内部へシグナルが伝達される。いくつかの実施形態において、前記リガンドはラパマイシンまたはラパログである。いくつかの実施形態において、リガンドは、IMID系薬物（たとえば、サリドマイド、ポマリドミドもしくはレナリドミドまたはこれらに関連する類似体）である。いくつかの実施形態において、二量体化を誘導するためリガンドの有効量として、0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、もしくは100nM、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度のリガンドが提供される。
いくつかの実施形態において、前記方法に使用されるリガンドは、ラパマイシンまたはラパログであり、たとえば、エベロリムス、CCI-779、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、C16-iRap、AP21967、ミコフェノール酸ナトリウム、塩酸ベニジピン、AP23573もしくはAP1903、またはこれらの代謝物、誘導体および／もしくはこれらの組み合わせが挙げられる。さらなる有用なラパログとして、たとえば、Ｃ７位、Ｃ４２位および／もしくはＣ２９位のメトキシの脱メチル化、除去もしくは置換；Ｃ１３位、Ｃ４３位および／もしくはＣ２８位のヒドロキシの除去、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４位、Ｃ２４位および／もしくはＣ３０位のケトンの還元、除去もしくは誘導体化；６員ピペコラート環の５員プロリル環による置換；および／またはシクロヘキシル環上の別の置換もしくはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換のうちの１つ以上の修飾をラパマイシンに対して行ったラパマイシンのバリアントが挙げられる。さらなる有用なラパログとして、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムスもしくはゾタロリムス、またはこれらの誘導体、代謝物および／もしくはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、リガンドは、IMID系薬物（たとえば、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドまたはこれらに関連する類似体）である。
いくつかの実施形態において、細胞（哺乳動物細胞など）の内部におけるシグナルの検出は、シグナル伝達経路の結果であるマーカーを検出する方法により達成することができる。したがって、たとえば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、またはその他のタンパク質検出方法もしくはタンパク質定量方法によって、細胞（哺乳動物細胞など）におけるAktまたはその他のシグナル伝達マーカーの量を測定することによって、シグナルを検出してもよい。検出用のマーカーとして、たとえば、JAK、Akt、STAT、NF-κ、MAPK、PI3K、JNK、ERKもしくはRas、または細胞のシグナル伝達イベントの指標となるその他の細胞シグナル伝達マーカーを挙げることができる。
いくつかの実施形態において、シグナルの伝達は、サイトカインのシグナル伝達に影響を与える。いくつかの実施形態において、シグナルの伝達は、IL2Rのシグナル伝達に影響を与える。いくつかの実施形態において、シグナルの伝達は、サイトカイン受容体の下流の標的のリン酸化に影響を与える。いくつかの実施形態において、シグナルを活性化する方法は、CISC発現細胞（哺乳動物細胞など）の増殖を誘導し、それに付随して非CISC発現細胞の増殖を抑制する。
細胞においてシグナル伝達が発生するには、サイトカイン受容体が二量体化やヘテロ二量体化するだけでなく、これらのサイトカイン受容体が、構造変化を起こすように適切な配置になければならない（Kim, M. J. et al. (2007). NMR Structural Studies of Interactions of a Small, Nonpeptidyl Tpo Mimic with the Thrombopoietin Receptor Extracellular Juxtamembrane and Transmembrane Domains, J. Biol. Chem., 282(19):14253-14261）。したがって、適切なシグナル伝達を発生させるためには、シグナル伝達ドメインが正しい立体構造配置で二量体化することが望ましく、その理由として、単に受容体が二量体化またはヘテロ二量体化するだけでは、受容体を活性化させることができないことが挙げられる。本明細書に記載の化学誘導シグナル伝達複合体は、下流のシグナル伝達イベントが起こるように正しい方向にあることが好ましい。
細胞集団の選択的拡大増殖方法
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞からなる集団を選択的に拡大増殖させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に記載の細胞（哺乳動物細胞など）を提供する工程を含んでいてもよく、この細胞は、本明細書に記載のタンパク質配列または本明細書に記載の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の二量体化CISCをコードするタンパク質配列、または本明細書に記載の発現ベクターを発現させる工程さらに含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞（哺乳動物細胞など）をリガンドと接触させる工程を含み、これによって、第１のCISC構成要素と第２のCISC構成要素の二量体化が誘導され、その結果、細胞の内部へシグナルが伝達される。いくつかの実施形態において、前記リガンドはラパマイシンまたはラパログである。
いくつかの実施形態において、二量体化を誘導するために提供されるリガンドの有効量は、0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、もしくは100nM、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度である。
いくつかの実施形態において、使用される前記リガンドは、ラパマイシンまたはラパログであり、たとえば、エベロリムス、CCI-779、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、C16-iRap、AP21967、ミコフェノール酸ナトリウム、塩酸ベニジピン、AP23573、AP1903、またはこれらの代謝物、誘導体および／もしくはこれらの組み合わせが挙げられる。さらなる有用なラパログとして、たとえば、Ｃ７位、Ｃ４２位および／もしくはＣ２９位のメトキシの脱メチル化、除去もしくは置換；Ｃ１３位、Ｃ４３位および／もしくはＣ２８位のヒドロキシの除去、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４位、Ｃ２４位および／もしくはＣ３０位のケトンの還元、除去もしくは誘導体化；６員ピペコラート環の５員プロリル環による置換；および／またはシクロヘキシル環上の別の置換もしくはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換のうちの１つ以上の修飾をラパマイシンに対して行ったラパマイシンのバリアントが挙げられる。さらなる有用なラパログとして、ノボリムス、ピメクロリムス、リダホロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムスもしくはゾタロリムス、またはこれらの誘導体、代謝物および／もしくはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、リガンドは、IMID系薬物（たとえば、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドまたはこれらに関連する類似体）である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞からなる集団の選択的な拡大増殖は、２つの異なる遺伝子組換えイベントが起こった場合にのみに起こる。これらの遺伝子組換えイベントの一方は、二量体化学誘導シグナル伝達複合体の一方の構成要素であり、他方の遺伝子組換えイベントは、二量体化学誘導シグナル伝達複合体の他方の構成要素である。これらの両方のイベントが細胞集団（哺乳動物細胞集団など）において起こると、化学誘導シグナル伝達複合体の構成要素がリガンドの存在下で二量体化し、活性な化学誘導シグナル伝達複合体が得られ、細胞の内部でシグナルが発生する。また、その他のシグナル伝達マーカーが検出されてもよいが、Aktの活性化とともにこれらのイベントが起こることによってのみ、細胞の十分な拡大増殖を達成することができ、この結果、所定の細胞集団（哺乳動物細胞集団など）において両方の遺伝子組換えイベントが起こった改変細胞集団の選択的な拡大増殖が可能となる。
各IL2R−CISC構造からレンチウイルス粒子を作製し、これを使用して初代ヒトＴ細胞に形質導入した。CD4+Ｔ細胞を60時間にわたり活性化した。次に、IL2、IL7およびIL15を添加した培地1mL中で100万個／ウェルの密度になるように24ウェルディッシュに細胞を播種した。ビーズの存在下または非存在下においてレンチウイルスによる形質導入を行うため、24ウェルディッシュにおいて、（培地0.5mL中）4μg/mLの硫酸プロタミンを加え、IL2R−CISCレンチウイルス15μLまたはMND-GFPコントロールレンチウイルス3μLを使用した。細胞を800×g、33℃で30分間スピノキュレーションし、4時間インキュベーション後、1.5mLの培地を加えた。形質導入したＴ細胞を、50ng/mLのIL2、5ng/mLのIL5および5ng/mLのIL17を含むサイトカインの存在下において37℃で48時間インキュベートした。GFPのシグナルを測定し、形質導入したＴ細胞のIL2R−CISCレベルを測定した。IL2R−CISCの形質導入効率は10〜30%であり、MND-GFPの形質導入効率は80%または約80%であった。
形質導入後、IL2を添加した培地中で細胞を２日間増殖させ、その後、半量に分割し、一方はIL2のみの存在下で増殖させ、他方は、以下の濃度のラパマイシンのみの存在下で増殖させた。ラパマイシン（1nM）またはIL2でＴ細胞を２日間処理した後、2mLの培地を入れた24ウェルディッシュに100万個／ウェルの密度で細胞を播種した。Ｔ細胞の生存能力を測定し、抗FRB抗体およびAPC標識二次抗体を使用して、GFP+集団における発現およびIL2R−CISCの発現を測定した。
別のラパマイシン類似体を使用して、本明細書に記載と同様の方法を実施してもよい。たとえば、AP21967を使用して本明細書に記載の方法を実施した。
IL2−CISCにより誘導されたシグナル伝達経路は、このシグナル伝達経路におけるシグナル伝達の大きさが、臨床的意義のある活性の誘導に十分であるか否かを測定することによって分析してもよい。
当業者であれば、本明細書に記載の構造および／またはコンストラクトは、本発明を限定するものではないことを理解できるであろう。したがって、本明細書に記載のV1コンストラクト、V2コンストラクトおよびV3コンストラクトに加えて、本明細書に記載の別の構造および／またはコンストラクト、および／またはさらなる構造を使用してもよい。簡潔に述べると、本明細書に記載の方法は以下の工程を含む。PBMC3フィーダー細胞を解凍し、抗CD3/CD28ビーズの存在下でCD4+細胞を単離した。ビーズを除去し、500μL中にV4、V5、V6またはV7を加え、800×gでスピノキュレーションを行った。スピノキュレーション後、1.5mL中TCM+サイトカインを加えた。次に、処理なしまたは100nMのAP21967、1nMのラパマイシン、もしくは50ng/mLのIL-2による処理を含む様々な条件で各コンストラクトを処理した。その後、各コンストラクトを有する細胞の拡大増殖を測定した。
さらに、遺伝子が標的化されたＴ細胞の濃縮および／または拡大増殖を目的として、MNDプロモーターおよびCISCの標的化ノックインを試験してもよい。簡潔に述べると、PBMCフィーダー細胞を解凍し、抗CD3/CD28ビーズの存在下でCD4+細胞を単離した。ビーズを除去し、Cas9／gRNAリボ核タンパク質（RNP）を加えた。次に、処理なしまたは10nMのAP21967、10nMのラパマイシン、もしくは10nMラパマイシン＋5ng/mLのIL-2による処理を含む様々な条件でコンストラクトを処理した。
治療的アプローチ
一態様において、FOXP3タンパク質に関連する障害もしくは健康状態を有する対象またはFOXP3タンパク質に関連する障害もしくは健康状態を有すると疑われる対象のゲノムを編集することによって該対象を治療するための遺伝子治療的アプローチを提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、前記障害または前記健康状態は、自己免疫疾患（たとえばIPEX症候群）または臓器移植に起因する障害（たとえばGVHD）である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子治療的アプローチにより、機能性FOXP3遺伝子をコードする配列を含む核酸を対象の関連する細胞種のゲノムに組み込み、これによって、前記障害または前記健康状態を根治することができる。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする配列を組み込む遺伝子治療的アプローチの対象となる細胞種は、リンパ球細胞、たとえばCD4+Ｔ細胞であり、この理由として、これらの細胞は対象においてTreg表現型を効率的に得られることが挙げられる。
別の一態様では、ゲノム工学ツールを使用して、FOXP3またはその機能性誘導体をコードするコード配列を細胞ゲノムの遺伝子座にノックインし、FOXP3の活性を回復させることにより、細胞のゲノムに永続的な変化を生じさせるエクスビボおよびインビボの細胞内での方法を提供する。このような方法では、CRISPR関連（CRISPR/Cas9、Cpf1など）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、細胞ゲノムから任意の配列を永続的に欠失、挿入、編集、修正または置換したり、外来性配列（たとえばFOXP3をコードする配列）を細胞のゲノム遺伝子座に挿入する。このようにして、本開示に記載された例示により、（対象の生涯にわたって代替療法の送達が必要となることなく）単一の治療でFOXP3の活性が回復される。
いくつかの実施形態において、エクスビボの細胞を用いた治療法は、対象から単離されたリンパ球細胞、たとえば、臍帯血に由来する自家CD4+Ｔ細胞を使用して実施される。次に、本明細書に記載のシステム、組成物および方法を使用して、細胞の染色体DNAが編集される。最後に、編集された細胞が前記対象に移植される。
エクスビボ細胞療法によるアプローチの利点の１つとして、投与前に治療薬の包括的な分析を実施できることがある。ヌクレアーゼを使用した治療法は常にある程度のオフターゲット効果が付随する。エクスビボで遺伝子修正を行うことにより、移植前に修正された細胞集団の特性を網羅的に確認することができる。本開示の態様は、修正された細胞のゲノム全体のシーケンシングを行い、オフターゲットな切断が存在する場合、このオフターゲットな切断が、対象へのリスクが最小限となるゲノム位置にあることを確認することを含む。さらに、クローン集団などの特定の細胞の集団は、移植前に単離することができる。
このような方法の別の一実施形態は、インビボでの治療法である。この方法では、本明細書に記載のシステム、組成物および方法を使用して、対象における細胞の染色体DNAが修正される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、リンパ球細胞であり、たとえばCD4+細胞、たとえばＴ細胞である。
インビボ遺伝子治療の利点の１つは、治療薬の製造と投与が容易なことである。同じ治療的アプローチおよび治療法を使用して、１つ以上の対象、たとえば、同一または類似の遺伝子型またはアレルを有する多数の対象を治療することができる。対照的に、エクスビボでの細胞療法では、通常、対象自身の細胞を使用し、対象自身の細胞を単離し、遺伝子操作した後、同じ対象に戻す。
いくつかの実施形態において、本開示による治療方法を必要とする対象は、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態の症状を有する対象である。たとえば、いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患（たとえばIPEX症候群）または臓器移植に起因する障害（たとえばGVHD）の症状を有する。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記疾患または前記状態を有することが疑われるヒトであってもよい。あるいは、前記対象は、前記疾患または前記状態のリスクがあると診断されたヒトであってもよい。いくつかの実施形態において、前記治療を必要とする対象は、内在性FOXP3遺伝子またはその調節配列に１つ以上の遺伝子異常（たとえば欠失、挿入および／または変異）を有することから、FOXP3の発現量または機能性が、正常な健常対象と比較して大幅に低下している対象である。
いくつかの実施形態において、対象において、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえば自己免疫疾患）を治療する方法であって、
（ａ）細胞ゲノム内のFOXP3遺伝子座を標的とするガイドRNA（gRNA）；
（ｂ）DNAエンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；および
（ｃ）FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を対象の細胞に提供する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記gRNAは、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかに示されるスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、対象において、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえば、IPEX症候群などの自己免疫疾患）を治療する方法であって、
（ａ）細胞の内在性FOXP3遺伝子座内のゲノム配列または該内在性FOXP3遺伝子座の近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含むgRNA；
（ｂ）DNAエンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；および
（ｃ）FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を対象の細胞に提供する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７および２７〜２９のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する該スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、または配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号２に示されるスペーサー配列、または配列番号２と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号５に示されるスペーサー配列、または配列番号５と比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ヒト細胞、たとえばヒトリンパ球細胞、たとえばヒトCD4+Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患（たとえばIPEX症候群）または移植片対宿主病（GVHD）を有するか、これらの疾患を有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患（たとえばIPEX症候群）または移植片対宿主病（GVHD）のリスクがあると診断された対象である。
いくつかの実施形態において、対象において、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえば自己免疫疾患）を治療する方法であって、本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかによって調製された遺伝子組換え細胞を前記対象に提供する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、内在性FOXP3プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、前記リンパ球における発現のためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、配列番号６８に示される配列と、少なくとも70%または少なくとも約70%の配列同一性を有し、たとえば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくともそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ球細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、対象から得た自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象から生体試料を得る工程をさらに含み、該生体試料はインプット用細胞を含み、このインプット用細胞から遺伝子組換え細胞を調製する。いくつかの実施形態において、前記インプット用細胞はリンパ球細胞である。
対象への細胞の移植
いくつかの実施形態において、本開示のエクスビボでの方法は、このような方法を必要とする対象にゲノム編集された細胞を移植することを含む。この移植工程は、当技術分野で公知の移植方法であれば、どのような方法を使用しても行うことができる。たとえば、遺伝子組換え細胞を、対象の血液中に直接注射することができ、あるいはその他の方法で対象に投与することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、「投与」を含むが、この用語は、「導入」および「移植」と同じ意味で使用することができ、本明細書に開示される方法は、所望の単一の効果または複数の効果が得られるように、導入された細胞の少なくとも一部を所望の部位に局在化させることができる方法または経路によって、遺伝子組換えされた治療用細胞を対象に投与することを含む。治療用細胞またはそれらから分化した子孫細胞は、移植された細胞の少なくとも一部またはその構成要素の少なくとも一部が生存し続けることが可能な対象の体内の所望の部位への送達が可能な好適な経路を介して投与することができる。対象に投与した後の細胞の生存能力は、数時間という短い時間（たとえば24時間〜数日間）から数年間さらには対象の一生涯（たとえば長期生着）であってもよい。
本明細書に記載の治療用細胞が予防目的で提供される場合、該治療用細胞は、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえばIPEX症候群などの自己免疫疾患）の何らかの症状が発症する前に対象に投与することができる。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子組換え幹細胞集団の予防的投与は、前記疾患または前記状態の症状の発症の予防に使用される。
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え幹細胞が治療目的で提供される場合、該遺伝子組換え幹細胞は、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえばIPEX症候群などの自己免疫疾患）の症状または徴候が発症した際に（またはその後に）、たとえば疾患や状態の発症時に提供される。
本明細書に記載の様々な実施形態において使用される治療用細胞（たとえばゲノム編集された幹細胞）の有効量は、少なくとも１０２個、少なくとも５×１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも５×１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも５×１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも２×１０５個、少なくとも３×１０５個、少なくとも４×１０５個、少なくとも５×１０５個、少なくとも６×１０５個、少なくとも７×１０５個、少なくとも８×１０５個、少なくとも９×１０５個、少なくとも１×１０６個、少なくとも２×１０６個、少なくとも３×１０６個、少なくとも４×１０６個、少なくとも５×１０６個、少なくとも６×１０６個、少なくとも７×１０６個、少なくとも８×１０６個、少なくとも９×１０６個、またはこれらの倍数量であってもよい。治療用細胞は、１人以上のドナーに由来するものであってもよく、自家由来のものであってもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、治療用細胞は、該治療用細胞の投与を必要とする対象に投与する前に培養により拡大増殖される。
いくつかの実施形態において、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえばIPEX症候群）を有する対象の細胞における機能性FOXP3の発現量の適度かつ漸進的な増加は、前記疾患または前記状態の１つ以上の症状の緩和、長期生存率の向上、および／またはその他の治療に関連する副作用の軽減に有益でありうる。このような細胞をヒト対象に投与すると、機能性FOXP3の産生量を増加させる治療用細胞が存在することになるため有益である。いくつかの実施形態において、対象に効果的な治療を行うことによって、治療された対象においてFOXP3の総量に対し、少なくとも1%、3%、5%、もしくは7%または少なくとも約1%、約3%、約5%、もしくは約7%の機能性FOXP3が生じる。いくつかの実施形態において、機能性FOXP3は、FOXP3の総量の少なくとも10%または少なくとも約10%を占める。いくつかの実施形態において、機能性FOXP3は、FOXP3の総量の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%、または少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約100%を占めるか、または最大でも20%、最大でも30%、最大でも40%、最大でも50%、最大でも60%、最大でも70%、最大でも80%、最大でも90%、もしくは最大でも100%を占める。同様に、機能性FOXP3の量が著しく上昇した細胞の亜集団を比較的少ない数で導入した場合であっても、様々な対象において有益である可能性があり、これは、状況によっては、正常化された細胞が病変細胞に対して選択的優位性を有することになるためである。しかしながら、機能性FOXP3の量が増加した中程度の数の治療用細胞であっても、対象における前記疾患または前記状態の１つ以上の態様の緩和に有益である可能性がある。いくつかの実施形態において、このような細胞が投与された対象における治療用細胞の10%もしくは約10%、20%もしくは約20%、30%もしくは約30%、40%もしくは約40%、50%もしくは約50%、60%もしくは約60%、70%もしくは約70%、80%もしくは約80%、90%もしくは約90%またはそれ以上は、機能性FOXP3の産生量が増加している。
実施形態において、特定の方法または経路によって治療用細胞組成物（たとえば本明細書に記載の細胞のいずれかによる複数の細胞を含む組成物）を対象に送達することにより、該細胞組成物の少なくとも一部を所望の部位に局在させることができる。細胞組成物は、対象において有効な治療となる適切な経路であれば、どのような経路で投与することもでき、たとえば、細胞組成物の投与によって、該組成物の少なくとも一部（たとえば少なくとも１×１０４個の細胞）が、対象体内の所望の部位に一定期間にわたり送達できる。投与方法として、注射、点滴、点滴注入および経口摂取が挙げられる。「注射」には、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、髄腔内注射、脳室内注射、関節包内注射、眼窩内注射、心臓内注射、皮内注射、腹腔内注射、経気管注射、皮下注射、表皮下注射、関節内注射、被膜下注射、クモ膜下注射、脊髄内注射、脳脊髄内注射および胸骨内注射ならびに点滴が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、投与経路は静脈内経路である。細胞の送達では、注射または点滴による投与を行うことができる。
一実施形態では、細胞は全身投与され、言い換えれば、治療用細胞集団は、標的部位や、標的組織または標的臓器に直接投与されるのではなく、対象の循環系に入り、代謝およびその他の同様のプロセスを受ける。
FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態（たとえばIPEX症候群）の治療用組成物を使用した治療の有効性は、熟練した臨床医によって決定することができる。しかしながら、疾患の徴候もしくは症状のいずれか１つまたはそのすべて（一例として、機能性FOXP3の量）が有益な形で変化した場合（たとえば少なくとも10%増加した場合）、または臨床的に認められたその他の症状もしくはマーカーが改善もしくは緩和された場合に、治療が有効であると見なされる。また、入院または医療的介入の必要性による評価から、個体の悪化が止まったことを判断することによっても有効性を測定することができる（たとえば、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、かつ／または本明細書に記載されている。治療は、個体または動物（一例としてヒトまたは哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない）における疾患のあらゆる治療を含み、（１）疾患の抑制、たとえば症状の進行の停止もしくは遅延、または（２）疾患の緩和、たとえば症状の退行の誘導、および（３）症状の発症の予防もしくは症状の発症の可能性の低下を含む。
組成物
一態様において、本開示は、本明細書で開示された方法を実施するための組成物を提供する。組成物は、ゲノム標的化核酸（たとえばgRNA）；部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）または該部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および本明細書で開示される方法による所望の遺伝子組換えを達成するために挿入されるポリヌクレオチド（たとえばドナー鋳型）のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施形態において、組成物は、ゲノム標的化核酸（たとえばgRNA）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（たとえばドナー鋳型）を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノムを標的とする核酸（たとえばgRNA）をコードするヌクレオチド配列、および（ii）部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）、または該部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノムを標的とする核酸（たとえばgRNA）をコードするヌクレオチド配列、および（ii）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（たとえばドナー鋳型）を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）、または該部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ii）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（たとえばドナー鋳型）を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノムを標的とする核酸（たとえばgRNA）をコードするヌクレオチド配列、（ii）部位指向性ポリペプチド（たとえばDNAエンドヌクレアーゼ）、または該部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（iii）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（たとえばドナー鋳型）を含む。
前記組成物のいずれかの実施形態のいくつかでは、該組成物は、単一分子ガイドを使用したゲノム標的化核酸を有する。前記組成物のいずれかの実施形態のいくつかでは、該組成物は、二分子ガイドを使用したゲノム標的化核酸を有する。前記組成物のいずれかの実施形態のいくつかでは、該組成物は、二分子ガイドまたは単一分子ガイドを２つ以上有する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、核酸を標的とする核酸をコードするベクターを有する。いくつかの実施形態において、前記ゲノム標的化核酸は、DNAエンドヌクレアーゼ、特にCas9である。
いくつかの実施形態において、組成物は、ゲノム編集、特にFOXP3またはその誘導体をコードする配列の細胞ゲノムへの挿入に使用することができる１つ以上のgRNAを含むことができる。前記１つ以上のgRNAは、内在性FOXP3遺伝子上のゲノム部位、内在性FOXP3遺伝子内のゲノム部位、または内在性FOXP3遺伝子の近傍のゲノム部位を標的とすることができる。したがって、いくつかの実施形態において、前記１つ以上のgRNAは、FOXP3遺伝子上のゲノム配列に相補的なスペーサー配列、FOXP3遺伝子内のゲノム配列に相補的なスペーサー配列、またはFOXP3遺伝子の近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を有することができる。
いくつかの実施形態において、組成物用のgRNAは、配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９に示されるスペーサー配列、ならびに配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９のいずれか１つと少なくとも50%または少なくとも約50%、少なくとも55%もしくは少なくとも約55%、少なくとも60%もしくは少なくとも約60%、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%、または少なくとも95%もしくは少なくとも約95%の同一性または相同性を有するバリアントのうちのいずれか１つから選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、キット用のgRNAのバリアントは、配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９のいずれか１つと少なくとも85%または少なくとも約85%の相同性を有するスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、組成物用のgRNAは、ゲノム中の標的部位に相補的なスペーサー配列を有する。いくつかの実施形態において、前記スペーサー配列は、15塩基長〜20塩基長である。いくつかの実施形態において、前記スペーサー配列とゲノム配列の間の相補性は、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも100%である。
いくつかの実施形態において、組成物は、DNAエンドヌクレアーゼもしくは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および／またはFOXP3もしくはその機能性誘導体をコードする核酸配列を有するドナー鋳型を有しうる。いくつかの実施形態において、FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列は、配列番号６８に示される配列と、少なくとも70%または少なくとも約70%の配列同一性を有し、たとえば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくともそれ以上、または少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくともそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼはCas9である。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、DNAまたはRNAである。
いくつかの実施形態において、キット用の核酸の１つ以上は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、gRNAは、AAVベクターにコードすることができる。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、AAVベクターにコードすることができる。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、AAVベクターにコードすることができる。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸を単一のAAVベクターにコードすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸とgRNA配列を単一のAAVベクターにコードすることができる。
いくつかの実施形態において、組成物は、リポソームまたは脂質ナノ粒子を有することができる。したがって、いくつかの実施形態において、前記組成物のどのような化合物（たとえば、DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸、gRNAおよびドナー鋳型）であっても、リポソームまたは脂質ナノ粒子に内包化して製剤化することができる。いくつかの実施形態において、そのような化合物の１つ以上は、共有結合または非共有結合を介してリポソームまたは脂質ナノ粒子と結合している。いくつかの実施形態において、前記化合物のいずれかは、別々または一緒にリポソームまたは脂質ナノ粒子に内包化することができる。したがって、いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコード化する核酸、gRNAおよびドナー鋳型のそれぞれは、別々にリポソームまたは脂質ナノ粒子に内包化して製剤化される。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼは、gRNAと一緒にリポソームまたは脂質ナノ粒子に内包化して製剤化される。いくつかの実施形態において、DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸、gRNAおよびドナー鋳型は、一緒にリポソームまたは脂質ナノ粒子に内包化して製剤化される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、１種以上のさらなる試薬をさらに有し、このようなさらなる試薬は、緩衝液、細胞にポリペプチドまたはポリヌクレオチドを導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロールベクター、コントロールRNAポリヌクレオチド、インビトロでDNAからポリペプチドを作製するための試薬、シーケンシング用アダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構築用緩衝液、希釈緩衝液などであってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、オンターゲットな結合の促進または増強、エンドヌクレアーゼによるDNAの切断、または標的化特異性の向上に使用される１つ以上の構成要素をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態において、組成物の構成要素のいずれかは、特定の投与方法および剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容される添加剤とともに製剤化される。実施形態において、ガイドRNA組成物は、通常、生理学的に適合性のあるpHを達成するように製剤化され、生理学的に適合性のあるpHは、製剤および投与経路に応じて、3〜11もしくは約3〜約11、または3〜7もしくは約3〜約7の範囲である。いくつかの実施形態において、前記pHは、pH5.0〜pH8の範囲またはpH約5.0〜pH約8の範囲に調整される。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の治療有効量と、１種以上の薬学的に許容される添加剤とを有する。場合によって、前記組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを有することができ、または細菌増殖の処置または予防に有用な第２の有効成分（たとえば、抗菌剤または抗微生物剤が挙げられるが、これらに限定されない）を含むことができ、または本開示の試薬の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、gRNAは、１種以上の別の核酸、たとえば、DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸および／またはドナー鋳型とともに製剤化される。別法として、DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー鋳型は、それぞれ別々にまたは別の核酸と組み合わせて、gRNA製剤について前述した方法で製剤化される。
好適な添加剤として、たとえば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性ウイルス粒子などの、代謝の進行が緩慢な巨大分子を含む担体分子が挙げられる。その他の典型的な添加剤として、酸化防止剤（たとえばアスコルビン酸が挙げられるが、これに限定されない）、キレート剤（たとえばEDTAが挙げられるが、これに限定されない）、炭水化物（たとえばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない）、ステアリン酸、液体（たとえば油、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない）、湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝物質などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、組成物の化合物のいずれか（たとえば、DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸、gRNAおよびドナー鋳型）は、化学的トランスフェクション（たとえばリポフェクション）またはエレクトロポレーションなどのトランスフェクションにより細胞に送達することができる。いくつかの実施形態において、細胞に提供する前に、DNAエンドヌクレアーゼをgRNAとあらかじめ複合体化させ、リボ核タンパク（RNP）複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、前記RNP複合体は、トランスフェクションにより細胞に送達される。このような実施形態において、前記ドナー鋳型は、トランスフェクションにより細胞に送達される。
いくつかの実施形態において、「組成物」は、エクスビボでの治療法で使用される治療用細胞を含む治療用組成物を指す。
実施形態において、治療用組成物は、細胞組成物と生理学的に許容される担体とを含み、有効成分として該組成物中に溶解または分散される本明細書に記載の少なくとも１種のさらなる生物活性剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、治療目的で哺乳動物またはヒト対象に投与する場合、免疫原性が所望される場合を除き、実質的に免疫原性を有さない。
通常、本明細書に記載の遺伝子組換え治療用細胞は、薬学的に許容される担体を含む懸濁液として投与される。当業者であれば、細胞組成物に使用される薬学的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存能力を実質的に阻害するような量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、防腐剤またはその他の薬剤を含まないことを理解できるであろう。細胞を含む製剤は、たとえば、細胞膜の完全性を維持させる浸透圧緩衝液を含んでいてもよく、場合によっては、投与時に細胞の生存能力を維持するか、細胞の生着を増強するための栄養素を含んでいてもよい。このような製剤および懸濁液は、当業者に知られており、かつ／または日常的な実験を使用して、本明細書に記載に従って前駆細胞との使用に適合させることができる。
いくつかの実施形態において、細胞組成物は、乳化操作によって細胞の生存能力に悪影響が及ばない限り、乳化することができ、あるいはリポソーム組成物として提供することができる。細胞およびその他の有効成分は、本明細書に記載の治療方法での使用に適した量で、薬学的に許容されかつ有効成分と適合性のある１種以上の添加剤と混合することができる。
細胞組成物に含まれるさらなる薬剤として、細胞組成物中の構成要素の薬学的に許容される塩が挙げられる。薬学的に許容される塩として、たとえば塩酸やリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）が挙げられる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄水酸化物などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
生理学的に許容される担体は当技術分野でよく知られている。典型的な液体担体は、有効成分および水以外の材料を含まない滅菌水溶液、または生理学的pH値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液もしくは生理食塩水、またその両方を含む滅菌水溶液（リン酸緩衝生理食塩水など）である。さらに、水性担体は、１種類以上の緩衝塩、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩、デキストロース、もしくはポリエチレングリコールまたはその他の溶質を含むことができる。また、液体組成物は、水に加えて別の液相を含んでいてもよく、あるいは水を除去して別の液相を含んでいてもよい。このような別の液相の例として、グリセリン、綿実油などの植物油、および水−油乳剤が挙げられる。特定の障害または状態の治療に有効な細胞組成物に使用される活性化合物の量は、その障害または状態の特性に応じて異なり、公知の臨床技術によって決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記細胞（哺乳動物細胞など）は、本発明の実施形態に記載のタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むCISCを有するCD4+Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、CISCはIL2R−CISCである。いくつかの実施形態において、前記組成物は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むCISCを有するCD8+Ｔ細胞を含む細胞製剤（哺乳動物細胞製剤など）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記CISC構成要素は、リガンドの存在下で好ましくは同時に二量体化する。いくつかの実施形態において、各細胞集団は互いに組み合わせて、あるいは別の種類の細胞と組み合わせることによって組成物を提供することができる。
いくつかの実施形態において、前記組成物中の細胞はCD4+細胞である。前記CD4+細胞は、ヘルパーＴリンパ球、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞またはバルクCD4+Ｔ細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヘルパーCD4+リンパ球は、ナイーブCD4+Ｔ細胞であり、該ナイーブCD4+Ｔ細胞は、CD45RO-Ｔ細胞、CD45RA+Ｔ細胞、および／またはCD62L+CD4+Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態において、前記組成物中の細胞はCD8+細胞である。前記CD8+細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞および／またはバルクCD8+Ｔ細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+Ｔ細胞、CD62L+Ｔ細胞および／またはCD8+Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記CD4+ヘルパーＴリンパ球はナイーブCD4+Ｔ細胞またはセントラルメモリーCD4+Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、前記組成物は前駆Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、第１の宿主細胞と第２の宿主細胞とを含み、該第１の宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球であり、前記第２の宿主細胞は前駆Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記前駆Ｔ細胞は造血幹細胞である。
いくつかの組成物において、前記細胞はNK細胞である。
いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD8+細胞またはCD4+細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、造血幹細胞またはNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は神経幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、キメラ抗原受容体をさらに含む。
キット
いくつかの実施形態は、前記組成物のいずれか、たとえば、ゲノム編集用の組成物または細胞組成物（たとえば治療用細胞組成物）と、１つ以上のさらなる構成要素を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、前記細胞、前記発現ベクターおよび前記タンパク質配列を含むキットおよびシステムを提供し、これらのキットおよびシステムについて本明細書で述べる。したがって、たとえば、本明細書に記載のタンパク質配列；本明細書に記載の発現ベクター；および／または本明細書に記載の細胞のうちの１つ以上を含むキットを提供する。また、細胞の内部へと選択的にシグナルを活性化させるシステムであって、本明細書に記載の細胞を含み、該細胞が、本明細書に記載の発現ベクターを含み、該発現ベクターが、本明細書に記載のタンパク質配列をコードする核酸を含むことを特徴とするシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、キットは、たとえばゲノム編集または細胞療法などの所望の目的のために、前記組成物と同時または連続して投与することができる１つ以上のさらなる治療剤を有していてもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、キットの各構成要素を使用して前記方法を実施するための説明書をさらに含んでいてもよい。前記方法を実施するための説明書は、通常、適切な記録媒体に記録される。たとえば、前記説明書は、紙やプラスチックなどの基材に印刷されていてもよい。前記説明書は、前記キットまたはその構成要素を入れた容器のラベル（たとえば包装または副包装に貼付されたラベル）に記載された添付文書として前記キット中に含まれていてもよい。また、前記説明書は、適切なコンピューター可読記憶媒体（たとえばCD-ROM、ディスケット、フラッシュドライブなど）上の電子記憶データファイルとして含まれていてもよい。場合によっては、実際の説明書がキットに含まれておらず、リモートソースから（インターネットなどを介して）説明書を取得するための手段を提供することができる。この実施形態の一例として、説明書を閲覧および／またはダウンロードすることが可能なウェブアドレスを含むキットが挙げられる。説明書と同様に、該説明書を入手するための前記手段は、適切な基材上に記録することができる。
代表的な実施形態
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列（たとえば配列番号８９に示される配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法によって作製されたFOXP3発現用細胞を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列（たとえば配列番号８９に示される配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする遺伝子をコードする核酸を含むFOXP3発現用細胞を提供する。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする前記遺伝子は、FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態において、前記非FOXP3遺伝子座は、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CISCβ:FRB-IL2Rβ、DISC、CISC-FRB、μDISC、μCISC-FRB、FRB、LNGFRおよび／またはLNGFReを発現する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Treg表現型を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法により作製される。いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列（たとえば配列番号８９に示される配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、FOXP3をコードする遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、FOXP3をコードする前記遺伝子は、FOXP3遺伝子座または非FOXP3遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態において、前記非FOXP3遺伝子座は、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CISCβ:FRB-IL2Rβ、DISC、CISC-FRB、μDISC、μCISC-FRB、FRB、LNGFRおよび／またはLNGFReを発現する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Treg表現型を含む。
いくつかの実施形態において、対象における疾患および／または状態を治療、緩和および／または抑制する方法であって、疾患および／または状態を有する対象に、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞または組成物を提供する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる方法により作製される。いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも１つの標的遺伝子座を含む第１の核酸を含む細胞を提供する工程；
CAS9タンパク質、または該CAS9タンパク質をコードする第２の核酸配列を提供する工程；
前記CAS9タンパク質または第２の核酸を前記細胞に導入する工程；
少なくとも１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする第３の核酸または該少なくとも１つのCRISPRガイド配列をコードする１組の核酸を導入する工程；および
遺伝子送達カセットを含む第４の核酸を前記細胞に導入する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記細胞を活性化する工程をさらに含み、該活性化は、該細胞に第２の核酸を導入する前に行われる。いくつかの実施形態において、前記活性化は、前記細胞をCD3および／またはCD28と接触させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座またはTCRa（TRAC）遺伝子座である。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、１つ以上のベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは一本鎖ベクターである。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、自己相補型ベクターと一本鎖ベクターの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質をコードする第２の核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのガイド配列は、配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および／または３４のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸、第３の核酸、前記１組の核酸および／または第４の核酸は、真核細胞（ヒト細胞など）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ヒトのコドンに最適化されたFOXP3 cDNA配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸配列は、配列番号６８または６９に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、MNDプロモーター、PGKプロモーターまたはE2Fプロモーターである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）のコード配列、μCISC、CISCγ、FRBおよび／またはLNGFRe（LNGFRエピトープのコード配列）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２の遺伝子送達カセットを含む第５の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、ベクターに組み込まれて提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、第５の核酸は、CISC、FRB、マーカータンパク質、μCISC、および／またはβCISCをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および／または第５の核酸は、P2A自己切断ペプチドをコードする配列（たとえば配列番号８９に示される配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第４の配列および／または第５の配列は、ポリＡ配列をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリＡ配列は、SV40ポリＡまたはFOXP3の３’UTRを含む。いくつかの実施形態において、第４の配列は、配列番号３７〜４２のいずれかに示される配列を含む。いくつかの実施形態において、第４の核酸および第５の核酸は前記細胞に導入され、第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３７に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４３に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号３８に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４４に示される配列を含むか；第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４６に示される配列を含むか；あるいは第４の核酸は配列番号４５に示される配列を含み、かつ第５の核酸は配列番号４７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、遺伝子座に特異的な配列を有する少なくとも１つの相同アームを含み、該相同アームの長さは、AAVベクターへの効率的なパッケージングが達成されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの相同アームの長さは、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kbもしくは0.8kb、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、LNGF、RQR8またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、前記方法は、FOXP3と共発現させるためのタンパク質またはサイトカインをコードする第６の核酸を前記細胞に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質または前記サイトカインは、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体またはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記マーカーの濃度を上昇させることによって前記細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3は、構成的に発現されるか、制御下で発現される。いくつかの実施形態において、前記疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患はＸ連鎖性（IPEX）症候群である。いくつかの実施形態において、前記状態は移植片対宿主病（GVHD）である。いくつかの実施形態において、前記対象は、固形臓器の移植を受けた対象である。
いくつかの実施形態は、対象における疾患および／または状態の治療、緩和および／または抑制において使用するための医薬品を含む。別の実施形態は、炎症性疾患または自己免疫疾患などのFOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態の抑制または治療において使用するための、本明細書に記載の方法のいずれか１つによってゲノム編集された遺伝子組換え細胞に関する。さらなる実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれか１つによってゲノム編集された遺伝子組換え細胞の、医薬品としての使用に関する。
いくつかの実施形態において、前記細胞は生殖細胞ではない。
実施例１：健常なドナーでは内在性FOXP3の発現によりin vitro抑制性機能が得られるが、IPEXドナーでは得られない
この実験は、FOXP3が機能的な場合のみ、FOXP3の構成的プロモーターを提供することでCD4+ Tconv細胞の抑制性機能が得られることを証明するものである。TALEN mRNAと、MND-GFPの両末端にFOXP3相同アームを有するAAVドナー鋳型とを用いて、IPEX患者の細胞に遺伝子組換えを施した。この遺伝子編集により、FOXP3遺伝子座にMNDプロモーターとGFPコード配列が導入され、GFPコード配列は内在性のFOXP3コード配列にインフレーム融合した。
この組換え細胞の構成的MNDプロモーターにより、下流に変異を有する内在性のFOXP3と融合したGFPが発現した。FOXP3が機能欠損変異を有しているため、FOXP3遺伝子の上流の構成的プロモーターのノックインでは、CD4+ Tconv細胞の抑制性機能は得られなかった。抑制性機能を得るには、機能的なFOXP3 cDNAの発現が必要であった。
FACSアッセイにより細胞を分析した。試験に供した細胞は、1名の健常なドナーと2名のIPEXを患うドナーから得た、内在性のFOXP3を発現するT細胞である。下表に示すように、Teff細胞およびmock編集した細胞（「Teff + mock編集」）のフローサイトメトリーでは、内在性のFOXP3が発現されるようにT細胞を編集した後（「Teff + edTreg」）と比べると、内在性のFOXP3を発現する細胞の割合（%）は少なかった。いずれの場合も、編集により内在性のFOXP3発現は増加したが、Teff機能の低下は、健常な対象でのみ見られた。
Figure 2021521849
FOXP3遺伝子において下流の変異を有するIPEX対象由来のT細胞から作製したedTreg細胞は、機能欠損変異を有するFOXP3タンパク質の発現によりGFPを発現したが、健常なドナーのT細胞から作製したedTreg細胞とは異なり、Teffの増殖を抑制しなかった。このことは、IPEXの治療には、FOXP3活性の回復も必要であることを示している。
実施例２：FOXP3を発現する組換え制御性T細胞の作製
移植片対宿主病（GVHD）および自己免疫疾患の治療および抑制に有望なドナー鋳型（AAVで送達）と、CRISPR/Cas9-sgRNA RNPとを用いて遺伝子編集を行い、FOXP3を発現する組換え制御性T細胞を作製した。制御性T細胞は、遺伝子編集の目的で対象から採取した。AAVベクターは、移植片対宿主病（GVHD）および自己免疫疾患の治療および抑制を目的とするドナー鋳型を送達するために使用した。標的遺伝子座は、FOXP3遺伝子座（シングルAAVコンストラクト）、AAVS1遺伝子座（シングルまたはデュアルAAVコンストラクト）およびTCR遺伝子座（シングルまたはデュアルAAVコンストラクト）から選択した。AAVドナー鋳型コンストラクトを使用して、シングルAAV鋳型でTregを編集した（下表のコンストラクトA、B、C、DおよびF）。さらに、AAVドナー鋳型コンストラクトを使用して、デュアルAAV鋳型でTregを編集した（コンストラクトA+G、A+H、B+G、B+H、I+J、およびI+Kを参照）。
Figure 2021521849
 上記表において、FOXP3cDNAは、FOXP3 mRNAの発現をコードする核酸配列（コドン最適化配列など）である。CISCβはFRB-IL2Rβである。CISCγはFKBP-IL2Rγである。DISCはCISC-FRBである。μDISCはμCISC-FRBである。FRBは、ラパマイシンのデコイとして機能するために細胞内で発現する。LNGFRは、低親和性神経成長因子受容体のコード配列である。LNGFReは、LNGFRエピトープのコード配列である。2Aは、P2Aの自己切断ペプチドをコードする核酸を示す。
コンストラクトバリアントには、遺伝子座特異的な相同アーム配列の長さ（例えば、0.25kb、0.3kb、0.45kb、0.6kb、または0.8kb）、選択マーカー（LNGFR、RQR8またはEGFRt）およびプロモーター（MND、PGKまたはE2F）の異なるもの、ならびにpolyA（pA）配列（SV40polyAなど）またはFOXP3の3'UTRが含まれる。
ヒトFOXP3標的RNPのオンターゲット切断効率およびオフターゲット切断効率
CRISPR-Cas9/sgRNA RNPは、新規のスペーサー配列を含む。スペーサー配列T1、T3、T4、T7、T9およびT18は、エキソン1のヒトFOXP3遺伝子座を標的とするように設計されている。オンターゲットおよびオフターゲット切断分析を行うために、本明細書に記載のスペーサー配列を含むCRISPR-Cas9/gRNA RNPをトランスフェクションしたCD4+ T細胞からゲノムDNAを抽出した。基準コントロールとして、mockトランスフェクションを行ったCD4+ T細胞のゲノムDNAも抽出した。
オンターゲット切断効率をコロニーシーケンシングにより求め、NHEJ（非相同末端連結）率として表示した。NHEJ率が高いほど切断効率が高いことを示す。簡潔に説明すると、フォワードおよびリバースPCRプライマーは、切断部位の約250〜300bp上流および約250〜300bp下流の位置で結合するよう設計した。PCR反応は、ゲノムDNAのDNA断片を増幅するために設計したプライマーセットを使用して行った。PCR増幅産物をアガロースゲルで分離して、抽出し、pJET PCRクローニングに供した。得られた細菌コロニーをコロニーダイレクトシーケンシングに供して、クローニングしたPCRフラグメントの配列を調べた。シーケンシングのすべての読取データを参照配列と比較して、DNA二本鎖切断のNHEJによる挿入または欠失の有無を確認した。NHEJが行われたクローンの割合（%）を算出した。
FOXP3遺伝子座のT1、T3、T4、T7、T9およびT18のガイド配列を有するCRISPR-CAS9/gRNAシステムで処理した後の成功した非相同末端連結の割合を下表に示す。ヒトFOXP3遺伝子座を標的とするスペーサー配列T1、T3、T4、T7、T9およびT18を含むRNPのオンターゲット切断効率は、71%〜100%と高値を示した。特に、T3、T4、T7、T9およびT18を含むRNPのオンターゲット切断効率は約90%〜100%であった。下表に示すように、ヒトFOXP3遺伝子座を標的とするガイドを含むRNPは切断効率が高く、ドナー核酸が遺伝子座に組み込まれた後、タンパク質が発現されることが示された。
Figure 2021521849
スペーサー配列T3、T4、T9およびT18を含むCRISPR-Cas9/gRNA RNPのオフターゲット分析（OTA）を行った。各ガイドに対して、CRISPR-Cas9ターゲットオンライン予測ツール（CCTop）で予測された上位5〜7つのオフターゲット部位における挿入欠失（挿入または欠失）の有無を調べた。各標的に対して用いるPCRプライマーセットは、オンターゲット分析と同様の方法で設計した。PCR増幅および精製を行った後、得られた増幅産物をシーケンシング反応に供した。シーケンシングの読取データを、TIDE法（Tracking Indels by DEcomposition）またはICE法（Inference of CRISPR Edits）で解析した。
T3スペーサー配列またはT9スペーサー配列を有するCas9/gRNAを含むRNPについては、予測されたオフターゲット部位における切断効率はいずれも4%以下であった（T3: DACT2、SLC2A6、FOXA1、EXTL1、CFAPa9またはchr10の遺伝子間領域;T9: PPP2R3B、TMCO4、RND1、chr11:11θr、THNCL1またはCOL5A1）。
ヒトAAVS1を標的とするRNPのオンターゲット切断効率
次に、健常なドナーのヒトCD4+ T細胞を用いて、ヒトCD4+ T細胞のAAVS1を標的とするCas9/gRNA（比1:2.5）を含むRNPのオンターゲット切断効率を調べた。
使用したガイドは、ヒトの19番染色体のPPP1R12C（プロテインホスファターゼ1の調節サブユニット12C）遺伝子内のAAVS1遺伝子座を標的とするように設計したものである。各ガイドのオンターゲット切断効率をコロニーシーケンシングにより求めた。下表に、挿入欠失を有するクローンの数と調べたクローンの総数、およびコロニーシーケンシングで測定した各ガイドのNHEJ率（%）を示す。使用したCRISPR-Cas9/gRNAのいずれのガイドも、ヒトAAVS1遺伝子座を標的とし、高い切断効率を有するものである。ヒトAAVS1部位へのターゲティングにおいて、高いオンターゲット切断効率およびAAVドナー鋳型を用いた際の高い相同組換え修復（HDR）率が示された。
Figure 2021521849
マウスFOXP3を標的とするRNPの、マウスCD4+ T細胞におけるオンターゲット切断効率
C57BL/6雄性マウスの脾臓およびリンパ節からマウスCD4+ T細胞を単離した。次に、単離した細胞をCD3/CD28 Dynabeadsで活性化させ、Cas9/gRNA RNPをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。Cas9とガイドRNAのモル比は1:2.5であった。エレクトロポレーションを行った直後に、培養培地を含むウェルに細胞を播種し、AAVによる形質導入を行った。gRNAとCas9タンパク質とのRNP複合体の作製には、マウスFOXP3エキソン4を標的とする、マウスのmT20、mT22またはmT23スペーサーを用いた。形質導入には、MND-GFPと相同アーム配列とを含むAAV5ドナー鋳型を使用した。
mT20、mT22またはmT23を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体をエレクトロポレーションにより導入したマウスCD4 T細胞において、マウスFOXP3ガイドRNPのオンターゲット切断効率をコロニーシーケンシングまたはICE分析により求めた。各サンプルから抽出したゲノムDNAを用いてPCR反応を行い、予想される切断部位周辺のFOXP3配列を増幅した。mock編集した場合を基準として、挿入および欠失（INDEL）の発生頻度を、コロニーシーケンシングまたはICE分析（Inference of CRISPR Edits）により求めた。平均INDEL率（%）は、独立して実施した3回の編集実験から求めた。mT20、mT22またはmT23を含むRNPの平均切断効率は、それぞれ92.2%、95.3%、93.3%であり、いずれも90%を超える値であった。
マウスFOXP3エキソン4を標的とするFOXP3特異的なTALENまたはCas9/gRNA RNPを、上記と同様にエレクトロポレーションによりマウスCD4 T細胞に導入し、次いで、AAVによる形質導入を行った。AAVドナー鋳型はMND-GFPを含み、ヌクレアーゼ切断部位の上流と下流に相同アーム配列を含む。3種類のRNPを使用して相同組換え修復（HDR）を行ったところ、いずれの場合もMND誘導性のGFP発現が誘導されることがフローサイトメトリーにより確認された。FACS分析は、編集が成功した結果としてのGFP発現を検出するために行った。下表に示すように、マウスFOXP3を標的とするmT20またはmT23を含むRNPとAAVとで処理した場合の方が、TALEN mRNAとAAVとで処理した場合より編集効率が高かった。緑色蛍光タンパク質（GFP）シグナルに対する比較として、青色蛍光タンパク質（BFP）をネガティブコントロールとして用いた。
Figure 2021521849
マウスFOXP3を標的とするAAVドナー鋳型のその他の実施形態
別のプロモーターエレメントとしてMNDプロモーター、0.7UCOE.MNDプロモーターまたはPGKプロモーターを含み、その下流に、内在性マウスFOXP3配列にインフレーム融合したGFPコード配列を含む、様々なマウスFOXP3特異的なAAVドナー鋳型を調製した（図1）。マウスCD4+ T細胞にCas9/gRNA-mT23 RNP（Cas9:gRNA比1:2.5）をエレクトロポレーションにより導入した後、AAVドナー鋳型を送達した。編集後2日目にフローサイトメトリーによりGFPおよびFOXP3のレベルを測定した。マウス脾細胞から単離した天然のTreg（nTreg）を用いて、edTregにおけるFOXP3発現レベルと天然のTregにおける内在性FOXP3レベルを比較した。
上記プロモーターコンストラクトの使用により、マウスFOXP3を発現させることができたが、その発現レベルはコンストラクトにより異なっていた（図3）。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
別のプロモーターエレメントとしてMNDプロモーター、sEF1aプロモーターまたはPGKプロモーターを含み、その下流に、内在性マウスFOXP3配列にインフレーム融合したLNFGRおよびP2Aのコード配列を含む、様々なマウスFOXP3特異的なAAVドナー鋳型を調製した（図5H）。マウスCD4+ T細胞にCas9/gRNA-mT23 RNP（Cas9:gRNA比1:2.5）をエレクトロポレーションにより導入した後、AAVドナー鋳型を送達した。編集後2日目にフローサイトメトリーによりLNGFRおよびFOXP3のレベルを測定した。
これらのデータから、多くのプロモーターが内在性FOXP3遺伝子座に首尾よく導入されることが分かる。また、edTreg産物における全体的なFOXP3レベルはプロモーターにより異なることが分かる。
非ヒト霊長動物CD4+ T細胞におけるFOXP3を標的とするRNPのオンターゲット切断効率
アカゲザルのCD4+ T細胞を、非ヒト霊長動物CD4+ T細胞単離キット（Miltenyi社）を用いて、末梢血またはアフェレーシス産物から単離した。エレクトロポレーションおよび/またはAAVによる形質導入を行う60時間前に、当研究室で作製したCD3/CD28結合ビーズとともにインキュベートして、T細胞を活性化させた。エレクトロポレーションのパラメータを検証するために、BFP mRNAをエレクトロポレーションにより導入し、2日後にBFPの発現を確認した。AAV血清型を判定するために、MND-GFP発現カセットを含むコンストラクトを様々な血清型のAAVにパッケージングして、これらを用いて活性化CD4+ T細胞の形質導入を行った。GFP発現をFACSで分析して、形質導入効率を確認した。
非ヒト霊長動物CD4+ T細胞の編集における、FOXP3を標的とするRNPの編集効率を調べた。CD4+ T細胞は、非ヒト霊長動物であるアカゲザルから得た。Cas9/gRNA RNPは、T3スペーサー配列（配列番号3）、T9スペーサー配列（配列番号5）またはR1スペーサー配列（配列番号7）を含む。いずれのCas9/sgRNA RNP複合体も、アカゲザルFOXP3遺伝子座のエキソン3を標的とする。各RNPは、アカゲザルCD4+ T細胞において高いオンターゲット切断効率を示し、TIDE（Tracking Indels by DEcomposition）、ICE（Interference of CRISPR Edit）またはコロニーシーケンシングにより求めたNHEJ率は約70%〜約90%であった。このことから、FOXP3の種間相同性により、非ヒト霊長動物でもヒトFOXP3を標的とするガイドの使用が可能であることを示唆された。
Figure 2021521849
実施例３：FOXP3をコードするコドン最適化cDNAの発現
FOXP3発現を導入するためのTALENによる編集
FOXP3活性を付与できることを証明するために、健常なヒト対象から得たCD4+細胞に、
（i）TALENをコードする核酸、
（ii）FOXP3コードするドナー鋳型およびAAV-MND-LNGFR-2A KI（コントロール）をコードする核酸を発現させるためのAAVベクター、または
（iii）AAV-MND-FOXP3cDNA-2LNGFR（実施例１におけるID: B）
をトランスフェクションした。下表に示すように、ヒトコドン最適化FOXP3 cDNAを発現する細胞は、FOXP3とLNGFRの両方の発現を示した。
Figure 2021521849
TALENによる編集とCas9/sgRNA RNPによる編集との比較
健常なヒト対象から得たCD4+細胞に、TALEN mRNA、Cas9/gRNA（T3）RNPまたはCas9/gRNA（T9）RNPをコードする核酸をトランスフェクションした。次に、細胞に、MND-GFP-KIを発現するウイルスベクター（PCT/US2016/059729に記載のもの。この文献は、参照によりその全体が明示的に援用される）、またはMND-GFP-FOXP3cDNA（表2に示す）を発現するウイルスベクターをトランスフェクションした。
MND-GFP KIは、T3 RNPを含むCas9/gRNA、およびT9 RNPを含むCas9/gRNAで切断される構造であったため、編集の試験には使用しなかった。
この結果により、TALENによる編集とCas9による編集で、同程度のHDR率が達成されることが示された。しかし、このデータは、相同アーム配列がTALEN切断部位からもCas9切断部位からも離れていることを示唆しており、そのため、ポジティブコントロールよりHDR効率が低くなっている。したがって、次に、相同アームの改変を試みた。これにより、首尾よくFOXP3活性を付与できることが証明された。
Figure 2021521849
実施例４：Cas9/sgRNA RNPの相同アームの改変
T3 sgRNAを含むRNPとT9 sgRNAを含むRNPの編集率との比較（各ガイドに特異的な改変相同アームを有するAAVドナー鋳型を使用）
健常なヒト対象から得たCD4+細胞に、Cas9/sgRNA-T3 RNPまたはCas9/sgRNA-T9 RNPをコードする核酸をトランスフェクションした。試験で使用するAAVドナー鋳型#3063および#3066には、実施例１のコンストラクトAが含まれている。コンストラクトAは、FOXP3cDNA-LNGFR誘導体であり、コード配列（5'→3'方向）は、ITR-HA-MNDプロモーター-FOXP3cDNA-2A-LNGFR-SV40polyA-HA-ITRである。
Figure 2021521849
AAVドナー鋳型#3063と#3066は、特にCas9/gRNA-T3とCas9/gRNA-T9に対応するように設計されているため、編集効率は、Cas9/gRNA-T3 + #3063とCas9/gRNA-T9 + #3066で比較した。
以下に示すように、T3 gRNAまたはT9 gRNAを含むRNPと0.6kbの相同アーム配列で誘導されたDNA切断は、いずれも同程度のHDR効率を示した。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
Figure 2021521849
実施例５：組換えT細胞の表現型解析
Treg reg 関連マーカー
mock編集したT細胞および編集したT細胞における編集後3日目のTreg関連マーカーのレベルを測定した。健常なヒト対象から得たCD4+細胞に、
（i）mock編集を行うか、または（ii）Cas9/sgRNA-T9 RNPで編集を行い、次いで、図面に示す0.6kbの相同アームを有するAAVドナー鋳型FOXP3 cDNA-LNGFRコンストラクト（実施例１のコンストラクトA、FOXP3cDNA-LNGFR）をトランスフェクションした。
下表に示すように、mock編集のコントロール細胞では有意なレベルでの低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）の発現は見られなかった。一方、0.6kbの相同アームを有するCas9/sgRNA-T9 RNP + AAVドナー鋳型コンストラクトAで編集した細胞では、LNGFRは、FOXP3や、ICOS、CD25、CD45RO、LAG3およびCTLA-4を含むその他のTreg関連マーカーとともに発現した。
Figure 2021521849
PMA/イオノマイシン刺激によるサイトカイン産生
次に、編集したT細胞の表現型解析を行った。コンストラクトAを保持する細胞は、PMA/イオノマイシン刺激によりサイトカインを産生した。
実施例６：様々な発現カセットを有するAAVドナー鋳型の評価
様々な発現カセットを有するAAVドナー鋳型の検証実験を行った。FOXP3 cDNA-P2A-GFPを含むベクターとFOXP3 cDNA-IRES-GFPを含むベクターを用いて、P2A（ブタテッショウウイルス-1 2A）とIRES（配列内リボソーム進入部位）を、マルチシストロン性発現の観点から比較した。さらに、FOXP3 cDNAと選択マーカーの相対的な配置（FOXP3-P2A-LNGFRとLNGFR-P2A-FOXP3）を比較するとともに、この手法を最終的に完成させるために、FOXP3の染色試薬と染色プロトコルの比較も行った。
以下のコンストラクト（5'→3'方向）を評価した。HAは相同アームを示す。
(0.25kb HA)-MND-FOXP3cDNA-2A-GFP-WPRE-pA-(0.25kb HA)
(0.25kb HA)-MND-FOXP3cDNA-IRES-GFP-WPRE-pA-(0.25kb HA)
(0.45kb HA)-MND-LNGFR-2A-FOXP3cDNA-WPRE-pA-(0.6kb HA)
(0.45kb HA)-MND-FOXP3cDNA-2A-LNGFR-WPRE-pA-(0.6kb HA)
健常なヒトドナーのPBMCから回収したT細胞を、Cas9/sgRNA-T9（1:2.5 Cas9:gRNA）RNPとAAVドナー鋳型とを用いて編集した。使用したAAVドナー鋳型は、FOXP3 cDNA-IRES-EGFP、FOXP3 cDNA-P2A-EGFP、LNGFR-P2A-FOXP3 cDNA、およびFOXP3 cDNA-P2A-LNGFRである。細胞をホルボール 12-ミリステート 13-アセテート（PMA）、イオノマイシンおよびGolgiStopで5時間刺激した。True-Nuclear転写因子バッファーセット（Biolegend社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いて、細胞の固定および膜透過処理を一晩行った。FACS分析により、細胞におけるeGFP発現（FOXP3 cDNA-IRES-EGFP、FOXP3 cDNA-P2A-EGFP）およびLNGFR+発現（LNGFR-P2A-FOXP3 cDNAおよびFOXP3 cDNA-P2A-LNGFR）を調べた。また、7日目および15日目に、細胞におけるCD127+発現、CD25+発現およびFOXP3発現も調べた。下表は、これらの実験の結果をまとめたものである。
Figure 2021521849
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Figure 2021521849
Figure 2021521849
Figure 2021521849
さらに、濃縮後7日目および14日目に、細胞の生存率およびGFP発現（FOXP3 cDNA-IRES-EGFP、FOXP3 cDNA-P2A-EGFP）を調べた。結果を下表にまとめた。
Figure 2021521849
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上記結果から分かるように、AAVドナー鋳型FOXP3 cDNA-P2A-LNGFRは、健常なヒトドナーのCD4+ T細胞の編集においてCas9/sgRNA-T9 RNPとともにトランスフェクションに用いた場合に、FOXP3 cDNA-IRES-LNGFRより、LNGFRのMFIが高値となっており、P2Aを含むコンストラクトは、IRESより優れていることが分かる。
LNGFR/FOXP3の染色に関しては、eBioscienceバッファーセットの方が、True-Nuclearバッファーセットより固定/膜透過処理において優れた結果が得られた。
ビーズ/カラムを用いた濃縮とセルソーティングを用いた濃縮には違いがある。ビーズ/カラムは、陽性集団（中レベルおよび高レベル）をすべて選択するという目的に用いることができる。また、ソーターは、特に高レベルの集団を選択することができる。これは、拡大培養、純度、表現型などの差に寄与すると考えられる。この点を利用して、次の実験ではLNGFR+によるソーティングとビーズ濃縮の比較を行う。
また、サイトカイン分析を目的としたPMA刺激により、CD4のエンドサイトーシスが誘導されることが示された。次のステップとして、LNGFR+細胞に対する様々な刺激プロトコルおよびサイトカイン染色の検証実験を行った。
実施例７：マウスFOXP3遺伝子座にMND-GFP-マウスFOXP3 cDNAを組み込むための遺伝子編集
マウスFOXP3遺伝子座にMND-GFP-マウスFOXP3cDNAを組み込むために、TALENを用いて遺伝子編集を行った。次のステップとして、セルソーティング後2日目に表現型解析を行った。表現型解析に使用した細胞は、mock編集した細胞、MND-GFPkiを発現する細胞、およびMND-GFPmFOXP3CDSを発現する細胞である。遺伝子編集でMND-GFP-マウスFOXP3cDNAをマウスFOXP3遺伝子座に組み込むことにより、マウスFOXP3cDNAの発現と、Treg様の表現型の発現、すなわちCD25とCTLA-4の高発現が確認された。
Figure 2021521849
実施例８：非ヒト霊長動物細胞の遺伝子編集
アカゲザルCD4+細胞を用いて、エレクトロポレーションにより、非ヒト霊長動物細胞への遺伝子編集を行った。3匹のアカゲザルのCD4+細胞へのエレクトロポレーションの概要を図4に示す。図4は、エレクトロポレーション後の細胞生存率およびBFP（青色蛍光タンパク質）発現能力を示した図である。BFP mRNAは、エレクトロポレーション条件の検証に用いた。% BFP+は、エレクトロポレーション効率を示す。1400V、20 msのパルスを合計2回印加するというエレクトロポレーション条件において、約20〜50%のBFP+細胞が得られ、細胞生存率もコントロールと比べて大きく損ねることはなかった。
下表に、非ヒト霊長動物のアカゲザル由来のT細胞に様々なAAVサブタイプを用いて形質導入を行った際の形質導入効率のデータを示す。MND-GFPコンストラクトを様々な血清型のAAV（AAV-2、AAV-2.5およびAAV-DJ）にパッケージングし、これらを用いて、アカゲザル#1および#2から単離した非ヒト霊長動物細胞への形質導入を行った。フロープロットは、形質導入後2日目に確認されたGFP発現を示す。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
実施例９：非FOXP3遺伝子座からのFOXP3をコードするmRNAの発現
TCRaに対するAAVドナー鋳型の設計
図6に、使用したTCRa遺伝子トラップコンストラクトの設計を示す。TCRaスペーサー配列（「ガイド#1」から「ガイド#4」、配列番号125〜128に対応）は、TCRaの最後のエキソン（エキソン6）を標的としており、COSMIDを使用して確認した。
Figure 2021521849
 Cas9/gRNA RNP内のガイド#1（配列番号125）は、FOXP3 cDNAおよび選択マーカーGFPの発現にMNDプロモーターを利用する。ガイド#2（配列番号126）およびガイド#3（配列番号127）はそれぞれ、FOXP3 cDNAおよびGFPマーカーの発現に内在性TCRa（TRAC）プロモーターを利用する。これらの3つのコンストラクトは、FOXP3遺伝子座以外の遺伝子座、特にTCRa遺伝子座から、FOXP3のmRNA発現が誘導されるように設計されている。これらのコンストラクトは、TCRa遺伝子トラップコンストラクトである。
1）5'HA(0.4kb)-pA-P2A-MND-FOXP3-GFP-wPRE-合成PA-3'HA(0.4kb)（コンストラクトの長さは4kb）
2）5'HA(0.4kb)-T2A-FOXP3-P2A-GFP-wPRE-合成PA-3'HA(0.4kb)（コンストラクトの長さは3.6kb）
3）5'HA(0.4kb)-T2A-FOXP3-P2A-GFP-wPRE-3'HA(0.4kb)（イントロン含まず）（コンストラクトの長さは3.5kb）
TCRa部位を標的とする細胞の編集
TCRaを標的とするサンプルは、63時間のT細胞ビーズ刺激レイアウト（NHEJ/HR）を利用した。各サンプルの編集効率は、編集前にCD3/CD28 Dynabeadsで63時間刺激した細胞を用いて調べた。
健常なヒトドナーのCD4+細胞を63時間活性化させた後、編集を行い、編集後7日目に細胞を分析した。Cas9/gRNA（1:1）と各AAVドナー鋳型を用いて行ったゲノム編集の結果を下表にまとめた。いずれの場合も、GFPマーカーの発現は効果的に導入された。
Figure 2021521849
AAVS1部位編集用のAAVドナー鋳型
AAVS1部位編集用のAAVドナー鋳型を使用した。ドナー鋳型の全体的な構造としては、両アレルの編集効率を確認するための、ITR-HA-MND-GFP-WPRE3-pA-HA-ITR、ITR-HA-MND-BFP-WPRE3-pA-HA-ITR（HA = 相同アーム）; FOXP3cDNA AAV鋳型で編集するための、ITR-HA-MND-FOXP3cDNA-2A-LNGFR-pA-HA-ITR; FOXP3cDNAおよびDISCを発現するための両アレル編集を利用するための、ITR-HA-MND-CISCβ-2A-FRB-2A-マーカー-pA-HA-ITRおよびITR-HA-MND-CISCγ-2A-FOXP3cDNA-2A-LNGFR-pA-HA-ITRが含まれる。
ガイドP1またはN2を含むCas9/gRNA RNPとAAVドナー鋳型であるITR-HA-MND-GFP-WPRE3-pA-HA-ITRを用いてAAVS1部位における編集効率を調べたところ、RNPとAAVドナー鋳型で編集後8日目のGFPhigh集団の割合が58〜72%の範囲であることが示された。
実施例１０：Cas9/gRNA RNPとAAVドナー鋳型を用いるT細胞遺伝子編集の例示的プロトコル
凍結ヒトPBMCを素早く解凍・洗浄し、ネガティブ選択キット（STEMCELL Technologies社EasySep CD4+ Enrichment Kit）を用いてCD4+ T細胞を回収した。CD4+細胞（ビーズを使用したネガティブ選択後の上清）を50万個/mLの密度でT細胞培養培地（20%FBS、1×GlutaMAX（2 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド）、55μM 2-メルカプトエタノールおよび50 ng/mL ヒトIL-2を含むRPMI 1640）に再懸濁し、TエキスパンダーCD3/CD28 Dynabeadsをビーズと細胞の比率が3:1になるように加えて細胞を活性化させた。細胞を37℃、5%CO2の条件で3日間培養した。CD3/CD28ビーズを加えてから72時間後にビーズを除去し、細胞を上記と同様に一晩培養した。
細胞を洗浄後、エレクトロポレーションバッファーP3（ロンザ社のシステム用）、バッファーT（Neonシステム用）、またはMaxCyteエレクトロポレーションバッファーに、各メーカーの推奨の方法に従って再懸濁し、適当なRNP mix（適当なエレクトロポレーションバッファーを用いて、SpyFi Cas9（Aldevron社、ファーゴ、ノースダコタ州、米国）とCAS9 RNP/T9をモル比1:2.5で混合）を加えた。エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションは、ロンザ 4Dを用いてプログラムコードDN-102またはEO-115で、Neonシステムを用いて1420V/10 ms/3パルスの条件で、またはMaxCyte社のシステムを用いて拡張T細胞1-OCプログラムで行った。次に、あらかじめ温めておいたT細胞培養培地に細胞を回収して、20%（v/v）のAAV6ドナー鋳型を加え、37℃で24時間インキュベーションを行った後、AAVを希釈するために1容量の培地を加えた。編集から約48時間に、HDR効率をフローサイトメトリーで調べた。編集から約72時間後に、LNGFRのマイクロビーズを介する磁気カラム選択を行った。次に、濃縮した細胞を適当なサイズのG-Rex（登録商標）フラスコに移し（メーカーのプロトコルに準拠、Wilson Wolf社、セントポール、ミネソタ州）、100 ng/mL IL-2を含むT細胞培養培地でさらに7日間培養した。また、細胞をG-Rex（登録商標）フラスコに播種する際に、100 nMラパマイシンで処理し、G-Rex（登録商標）フラスコで7日間拡大培養する間、2〜3日おきに培養培地の半量を交換した。細胞の分析を行った後、生存可能に保存するか、直ちに使用した。
実施例１１：例示的な遺伝子編集プロトコルを用いて編集した細胞の特性
例示的なプロトコルを用いた編集における編集率の評価
実施例１０に記載の例示的なプロトコルを用いて、5'末端と3'末端に0.6kbのFOXP3相同アームを有するAAVドナー鋳型で編集した場合の編集効率を、6名のドナーのT細胞を用いて、13回実験を行って評価した。2日目にフローサイトメトリーで評価した平均HDR率は、34%または約34%であった（下表を参照のこと）。
Figure 2021521849
編集した細胞における標準的な胸腺のT reg マーカーの細胞表面の発現
実施例１０に記載の例示的な編集プロトコルを用いて編集した細胞に対して、編集から3日後にフローサイトメトリーにより免疫表現型解析を行った。CD4、LNGFR、CD25、CD127、LAG3、CTLA-4およびCD45ROの染色を標準的な表面染色法により行った。その後、True-Nuclear転写因子キット（Biolegend社）を用いて、細胞の固定および膜透過処理を行い、その後、FOXP3抗体およびHelios抗体で染色した。LNGFR+細胞（編集に成功した細胞を意味する）は、天然胸腺のTreg（tTreg）と同様の表現型を有しており、FOXP3、CD25、CTLA4、ICOSおよびLAG3のレベルは高く、CD127のレベルは低かった。CD45RO染色により、編集した細胞がメモリ表現型と一致していることが示された。編集した細胞において、Heliosレベルのアップレギュレーションは見られなかった。
Figure 2021521849
また、細胞内サイトカイン標識アッセイを行った。抗原シグナルを模したPMA/イオノマイシンで細胞を活性化した後、細胞の固定および膜透過処理を行い、サイトカインを検出した。エフェクターT細胞では通常高くアップレギュレートされる炎症性サイトカインは、LNGFR+細胞ではアップレギュレートされず、LNGFR-細胞ではアップレギュレートされていた（図7）。この結果は、LNGFR+細胞がtTreg様の表現型を示すという結果と一致している。
確認されたサイトカイン抑制がFOXP3に起因するものであって、編集方法のその他の要因によるものではないことを確認するために、同じ編集方法で、FOXP3のコード配列に点突発変異を有するAAVドナー鋳型による編集も同時に行った。この変異（IPEX対象で発見された変異）により、FOXP3の機能を失わせるR397Wアミノ酸置換が起こった。FOXP3 R397W変異タンパク質は、実施例１０の例示的なプロトコルの遺伝子編集条件下で、野生型FOXP3と同等のレベルで発現した。例えば、FACSによるLNGFR+FOXP3+細胞の割合（%）は同程度であった（野生型49.2%; R397W変異体64.9%）。
しかし、FOXP3 R397W変異体を発現する編集したT細胞では、野生型FOXP3を発現する編集したT細胞の挙動とは異なり、分析した炎症性サイトカイン（IL-2およびTNFα、下表を参照のこと）の抑制は見られなかった。
Figure 2021521849
実施例１２：LNGFRによる濃縮およびLNGFRで濃縮された細胞の拡大培養
特定の用途（例えば臨床応用）のために、細胞表面のタグを用いて、編集した細胞を選択することができれば、編集されていない細胞（培養において増殖上有利である）の割合を減らす上で有用であると考えられる。これを検証するために、実施例１０に記載の例示的な編集プロトコルで編集を行ってから3日後に、（CD271）LNGFRマイクロビーズ（Miltenyi社）またはMACSelect LNGFRマイクロビーズ（Miltenyi社）をメーカー推奨のプロトコルに従って使用し、編集した細胞の濃縮を試みた。
フローサイトメトリーを用いて、濃縮を行う前、濃縮を行った後、およびG-Rex（登録商標）フラスコでさらなる拡大培養を行った後のLNGFR+細胞の濃縮をモニターした（下表を参照のこと）。7日間の拡大培養が終了した時点で、LNGFR+細胞は、細胞数が平均42倍または約42倍に増大し、最終的な細胞調製物の91%または約91%を占めていた。
Figure 2021521849
実施例１３：CD4+ T細胞の養子移入における免疫抑制の検証
炎症（CATI）マウスモデル
NOD-scid-IL2RγNull（NSG）マウスは免疫不全で、ヒトT細胞の移植が可能である。全身照射後にヒトCD4 T細胞を送達すると、マウスMHC-IIに依存する炎症反応が促進されることが報告されている（Covassin, L. et al.（2011）. Clin. Exp. Immunol. 166（2）:269-280）。炎症反応には、ヒトCD4 T細胞集団の活性化および増大や、炎症促進性ヒトサイトカイン（例えば、IL-2およびIFN-γ）の発現増加および遊離が含まれており、細胞が集中した組織、例えば、腸管、肺や皮膚などがダメージを受けることが報告されている。このモデルにおいて、自己胸腺の制御性T細胞（tTreg）がヒトCD4 Teff細胞の活性化を抑制できることが示されており、本明細書に記載の編集した制御性T細胞の免疫抑制性の特性を検証するためのモデルシステムが提供されていると考えられる。
CD4養子移入炎症（CATI）モデルを用いて、edTregを評価した。マウスの各個体に200radを照射した。NSGマウスに、4×106個の自己CD4+ Tエフェクター（Teff）細胞を移植した。移植した細胞の種類は下記の通りである：
i）Teffのみ（n=15）、
ii）Teff + mock編集した細胞（n=17）、または、
iii）Teff + 実施例１０に記載の例示的な編集プロトコルで編集したedTreg（n=16）。
移入後14日目に、mock編集群およびedTreg群からそれぞれ4匹のマウスを選んで末梢血を採取し、屠殺後、ヒトT細胞の存在を確認した。また、マウスに対して、人道的エンドポイント（体重の20%を超える減少）を適用した安楽死処置を行った。mock編集した細胞を移植した群では、edTregを移植したマウス群よりヒトCD4+ CD45RO+ 細胞の割合が高く、その数も多かった（mock編集細胞移植群65%、edTreg移植群約20%）（p = 0.0034）。edTreg群では、このCD4+CD45RO+ 細胞の約40%がLNGFR+ edTregであり、mock編集した細胞では0.08%であった（p = 0.0037）。2つのネガティブコントロール群（TeffのみおよびTeff + mock編集した細胞）のほとんどのマウスは、所定の人道的エンドポイント、総じて過度の体重損失により、移植後の最初の3週間以内に安楽死処置が施された。
edTregの移植により、未処置群およびmock編集細胞移植群と比べて、NSGマウスにおける炎症性のT細胞の病的状態の発現と重症化の大幅な遅延が見られた、（図8）。例えば、Teff + edTreg細胞を移植したマウスの75%（12匹/16匹/群）は50日間生存したが、その他の群（TeffのみおよびTeff + mock編集）のマウスで生存できたのはわずか約10%であった。
実施例１４：edT reg 細胞調製物を作製するためのAAVドナー鋳型の効率の向上
FOXP3、GFPおよびLNGFRの発現レベルに対するWPREエレメントの効果の評価
結果
FOXP3cDNA-P2A-GFPドナー鋳型およびFOXP3cDNA-P2A-LNGFRドナー鋳型を用いて、FOXP3発現に対する全長型WPREと切断型WPREの効果を評価した。
最初に、WPREがFOXP3 cDNA導入遺伝子の発現レベルを上昇させるかどうかを確認するために、まず、FOXP3cDNA-P2A-GFPドナー鋳型で編集した細胞で実験を行った。ヤマネズミ肝炎ウイルス（WHP）転写後調節エレメント（WPRE）により、多くの導入遺伝子でタンパク質の発現が増加することが示されていることから、edTregを作製するためのAAVドナーの設計にもWPREを組み入れた。使用したAAVドナー鋳型は、全長型または切断型のWPRE（WPRE6、WPRE3またはWPREr3）を含む。この実験では、FOXP3に特異的なTALENを用いてDNA二本鎖切断を導入し、続いてAAVを介してドナー鋳型を送達した。
この評価に用いたAAVドナー鋳型を、様々な形態のWPREと、対応するウイルス識別番号（ID）とともに、以下に示す。使用したコンストラクトは、ITR-(5'-HA)-MND-FOXP3cDNA-2A-GFP-WPRE-pA-(3'-HA)-ITRである。上記のHAはそれぞれ、5'-相同アームと3'-相同アームを表す。具体的なWPREエレメントに関しては、下記の表記で表す。「WPRE6」=全長型WPRE（約600 bp）、「WPRE3」=切断型WPRE（約300 bp）、「WPREr3」=WPRE3の逆相補鎖（約300 bp）。
Figure 2021521849
AAVドナー鋳型#3018は、FOXP3cDNA-P2A-GFP cDNAの5'末端側にMNDプロモーターを含み、FOXP3cDNA-P2A-GFP cDNAの3'末端側にWPREの全長型配列（WPRE6、約600bp）、続いてSV40-polyAシグナルを含む。AAVドナー鋳型#3017は、WPRE6が切断型WPRE配列（WPRE3、約300bp）で置き換えられている以外は#3018と同じであり、AAVドナー鋳型#3019は、WPRE3の逆相補鎖（WPREc3）が使用されていること以外は#3018と同じである。3つのAAVドナー鋳型はすべて、3'-末端および5'-末端に相同アームを有する。
3種類の条件すべてで、FOXP3+および/またはGFP+細胞が得られた。下表に、フローサイトメトリーで評価した編集後4日目の編集効率を示す。FOXP3発現は、3つのコンストラクトすべてで検出された。
Figure 2021521849
上記の各AAVドナー鋳型での処理後、すべての細胞集団のTreg関連マーカー（CD25、CD127およびCTLA-4）のレベルは、HDR編集した細胞集団（GFP+FOXP3+）のTreg表現型と一致していた。以上より、ドナー鋳型へのWPREの組み入れにより、コードされているFOXP3の発現が得られた。
次に、WPREエレメントがFOXP3 cDNA導入遺伝子の発現レベルにどの程度影響を与えるのかを確認するために、FOXP3cDNA-P2A-LNGFRドナー鋳型で編集した細胞で実験を行った。具体的には、FOXP3に特異的なTALENを用いてDNA二本鎖切断を導入し、続いてAAVを介してドナー鋳型を送達した。
この評価に用いたAAVドナー鋳型を、様々な形態のWPREと、対応するウイルス識別番号（ID）とともに、下表に示す。使用したコンストラクトは、ITR-(5'-HA)-MND-FOXP3cDNA-2A-LNGFR-WPRE-pA-(3'-HA)-ITRである。上記のHAはそれぞれ、5'-相同アームと3'-相同アームを表す。具体的なWPREエレメントに関しては、下記の表記で表す。「WPRE6」=全長型WPRE（約600 bp）、「WPRE3」=切断型WPRE（約300 bp）、「WPREr3」=WPRE3の逆相補鎖（約300 bp）。
Figure 2021521849
全体として、上記に示されているように、AAVドナー鋳型#3020、#3021、#3023、#3024および#3045は、FOXP3cDNA-P2A-LNGFRの5'末端側にMNDプロモーターを含み、FOXP3-GFP cDNAの3'末端側にWPRE（またはWPREなし）、続いてSV40-polyAシグナルを含む。各AAVドナー鋳型の5'末端と3'末端の相同アームの長さを下表に示す。
下表にまとめてあるように、評価したすべてのAAVドナー鋳型で同等レベルのFOXP3発現が得られた。
Figure 2021521849
これらの結果より、WPREエレメントを組み入れることは、高レベルのFOXP3発現には必要でないことが示された。WPREが存在しないAAVドナー鋳型#3045により、（LNGFR-/FOXP3+細胞とLNGFR+/FOXP3+細胞を合わせて）合計で10.2%の細胞でFOXP3の発現が誘導されており、WPRE配列を含むその他のAAVドナー鋳型と同様の結果が得られた。例えば、AAVドナー鋳型#3020、#3021および#3023では、それぞれ合計で10.5%、7.89%、および11.52%の細胞でFOXP3発現が誘導された。したがって、WPREエレメントは、これ以降の図面で使用するAAVドナー鋳型には組み入れていない。
方法
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）が、MND誘導性のFOXP3cDNA発現を安定化できるか否かを検証した。このエレメントは、プロモーターエレメントのサイレンシングを抑制し、マイナスの影響を低減する機能を有する。遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）は、一般的に、組み込まれた導入遺伝子周辺に転写的に活性化されたクロマチン構造を作るために用いられるものであり、プロモーターエレメントのサイレンシングを抑制し、マイナスの影響を低減する機能を有する。
編集した細胞におけるFOXP3発現の安定性を調べるために、UCOEバリアントを含むFOXP3特異的MND.GFPノックインAAVドナー鋳型またはUCOEバリアントを含まないFOXP3特異的MND.GFPノックインAAVドナー鋳型を、FOXP3を標的とするTALENとともに、ヒトFOXP3の遺伝子編集に使用した。使用したドナー鋳型は、図44Aに記載の通り、GFPカセットが、TALEN切断部位があるFOXP3のエキソンの一部でインフレーム融合するように設計されているため、編集に成功すれば、GFPが内在性FOXP3とインフレーム融合することになる。ドナー鋳型のGFPカセットは、MNDプロモーターの下流に位置しており、MNDプロモーターとGFPカセットが、フォワードまたはリバースの07UCOE配列の下流に位置している鋳型と、いずれの07UCOE配列も存在しない鋳型とがある。遺伝子編集から21日間、フローサイトメトリーによりGFP発現を追跡し、編集した細胞においてin vitroでサイレンシングが起こっているか否か、そして、UCOEバリアントの存在により、MND誘導性のGFP.FOXP3融合タンパク質発現が安定化しているか否かを確認した。図44Bに示すように、UCOEの有無にかかわらず、GFP/FOXP3は21日間安定していることが確認され、UCOEがドナー機能を効果的に保護したこと、そして、選択した調製物の今後の製造にUCOEが有用である可能性が示唆された。この結果より、UCOEエレメントを組み入れていてもいなくても、GFP/FOXP3がin vitroで長期に安定して発現することが明らかになった。この研究結果は、UCOEに保護されたドナーが効果的に機能することを示している。
MND誘導性のFOXP3cDNA発現の安定化における遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）の評価
結果
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）が、MND誘導性のFOXP3cDNA発現を安定化できるか否かを検証した。このエレメントは、プロモーターエレメントのサイレンシングを抑制し、マイナスの影響を低減する機能を有する。遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）は、一般的に、組み込まれた導入遺伝子周辺に転写的に活性化されたクロマチン構造を作るために用いられるものであり、プロモーターエレメントのサイレンシングを抑制し、マイナスの影響を低減する機能を有する。
編集した細胞におけるFOXP3発現の安定性を調べるために、UCOEバリアントを含むFOXP3特異的MND.GFPノックインAAVドナー鋳型またはUCOEバリアントを含まないFOXP3特異的MND.GFPノックインAAVドナー鋳型を、FOXP3を標的とするTALENとともに、ヒトFOXP3の遺伝子編集に使用した。使用したドナー鋳型は、図9に記載の通り、GFPカセットが、TALEN切断部位があるFOXP3のエキソンの一部でインフレーム融合するように設計されているため、編集に成功すれば、GFPが内在性FOXP3とインフレーム融合することになる。ドナー鋳型のGFPカセットは、MNDプロモーターの下流に位置しており、MNDプロモーターとGFPカセットが、フォワードまたはリバースの07UCOE配列の下流に位置している鋳型と、いずれの07UCOE配列も存在しない鋳型とがある。
遺伝子編集から21日間、フローサイトメトリーによりGFP発現を追跡し、編集した細胞においてin vitroでサイレンシングが起こっているか否か、そして、UCOEバリアントの存在により、MND誘導性のGFP.FOXP3融合タンパク質発現が安定化しているか否かを確認した。UCOEの有無にかかわらず、GFP/FOXP3は21日間安定していることが確認され、UCOE調節エレメントが効果的に機能したこと、そして、選択した調製物の今後の製造に有用である可能性が示唆された。この結果より、UCOEエレメントを組み入れていてもいなくても、GFP/FOXP3がin vitroで経時的に安定して発現することが明らかになった。この研究結果は、UCOE調節エレメントがFOXP3の発現を安定化するのに有用である可能性を示している。
方法
成人の健常なドナーから単離したCD4+T細胞を、50万〜100万個/mlの細胞濃度に調整し、抗CD3/CD28ビーズを用いて48時間活性化させた。ビーズを除去して一晩静置した後、Neonトランスフェクションシステムを使用して、ヒトFOXP3に特異的なTALEN mRNAをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。トランスフェクションの2時間後に、FOXP3cDNA-P2A-GFPもしくはFOXP3cDNA-P2A-LNGFRを含み、WPREバリアントを含むAAVドナー鋳型、またはFOXP3cDNA-P2A-GFPもしくはFOXP3cDNA-P2A-LNGFRを含み、WPREバリアントを含まないAAVドナー鋳型を細胞培養物に加え、30℃で24時間インキュベーションを行った。インキュベーションを行った後、AAVに関わる毒性を低減するために、新鮮な培地を培養物に加えてAAVを希釈した。HDR効率は、編集後2日目にフローサイトメトリーで測定したGFP+の割合（%）または LNGFR+の割合（%）に基づいて求めた。編集後4日目にFACS分析を行い、LNGFR発現およびFOXP3発現の有無を確認した。
選択マーカーLNGFRを発現するedT reg 細胞におけるFOXP3およびその他のT reg 関連マーカーの評価
結果
次に、cis連結した表面マーカーLNGFRを導入することで、抗LNGFR抗体を用いて、LNGFRを発現するedTreg調製物を精製することが可能であるかを調べた。
ここでは、上記の目的を達成するために設計した様々なAAVドナー鋳型を用いて検証実験を行った。使用したAAVドナー鋳型は、AAV #3066、#3098および#3117である。さらに詳述すると、AAVドナー鋳型は、FOXP3cDNAの3'末端（AAV #3066および#3098）またはその5'末端（AAV #3117）に、cis連結したLNGFRマーカーを含む。AAVドナー鋳型は、上記と同様に、コンストラクトAまたはコンストラクトBで示され、下記にまとめて示した（HA = 相同アーム）。
（A）ITR-HA-MND-FOXP3cDNA-2A-LNGFR-pA-HA-ITR
（B）ITR-HA-LNGFR-2A-FOXP3cDNA-pA-HA-ITR
Figure 2021521849
 これらのAAVドナー鋳型は、mockまたはCD4+細胞における内在性のFOXP3を標的とするRNPとともにトランスフェクションした。編集後6日目に細胞を回収し、免疫染色およびフローサイトメトリーによる分析を行った。
3つのコンストラクトの1つ（AAV #3066、#3098または#3117）と、内在性のFOXP3を標的とするRNP（またはRNPなし）をトランスフェクションした後のLNGFRを発現する細胞（LNGFR+）の割合（%）を下表にまとめた。下表は、トランスフェクション後6日目のLNGFR+細胞の割合（%）を示す。
Figure 2021521849
次に、RNPと3つのAAVドナー鋳型#3066、#3098および#3117の1つをCD4+細胞にトランスフェクションして得られたedTreg細胞（それぞれ、「3066edTreg」、「3098edTreg」または「3117edTreg」）において、Treg関連マーカーのレベルを調べた。下表にまとめてあるように、選択マーカーLNGFRを発現したedTreg細胞調製物における、FOXP3およびその他のTreg関連マーカー（CD4、CD25、CD127、CTLA-4、LAG3およびICOS）の評価を行った。
Figure 2021521849
これらの結果より、AAVドナー鋳型#3066および#3117に関して、LNGFR、FOXP3およびTreg関連マーカーの効率的な発現が示され、edTreg細胞調製物の精製に使用することを目的とした、cis連結した臨床的に関連のあるマーカーの導入が可能であることが明らかになった。したがって、これら2つの遺伝子カセットのいずれかを用いて、cis連結した表面マーカー（LNGFR）を導入し、edTreg調製物の精製に使用した。
方法
成人の健常なドナーから単離したCD4+T細胞を、50万〜100万個/mlの細胞濃度に調整し、抗CD3/CD28ビーズを用いて48時間活性化させた。ビーズを除去して一晩静置した後、Neonトランスフェクションシステムを使用して、ヒトFOXP3に特異的なTALEN mRNAをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。トランスフェクションの2時間後に、MND.GFP.Knock-inを含み、UCOEバリアントを含むAAVドナー鋳型、またはMND.GFP.Knock-inを含み、UCOEバリアントを含まないAAVドナー鋳型を細胞培養物に加え、30℃で24時間インキュベーションを行った。インキュベーションを行った後、AAVに関わる毒性を低減するために、新鮮な培地を培養物に加えてAAVを希釈した。編集後2日目にフローサイトメトリーによりHDR効率および初期のGFP発現レベルを調べた。さらに細胞の培養を継続して行い、2〜3日おきに培養培地を補充した。21日間の培養期間中、複数の時点で培養細胞の一部をサンプリングした。各時点で、フローサイトメトリー分析により、GFP導入遺伝子の割合および発現レベルをプロモーター活性の指標として調べた。
P2A自己切断ペプチドの前または後に位置するFOXP3 cDNAカセットを発現するedT reg 細胞におけるIL-2サイトカイン産生の評価
結果
次に、edTreg調製物がin vitroで機能的な活性を有しているか否か、そして、FOXP3 cDNAカセット内のP2A自己切断ペプチドの位置が機能に影響を及ぼすか否かを確認するために、edTreg調製物を用いて実験を行った。
P2A自己切断ペプチドの前または後に位置するFOXP3 cDNAカセットを発現するedTreg細胞（RNPと3つのAAVドナー鋳型#3066、#3098および#3117の1つをCD4+細胞にトランスフェクションして得られたedTreg細胞（それぞれ、edTreg3066、edTreg3098、およびedTreg3117））において、IL-2サイトカイン活性を評価した。細胞内のIL-2サイトカインは、編集後3日目に、mock編集した細胞またはedTreg細胞をホルボールミリステートアセテート（PMA）、イオノマイシンおよびモネンシン（GolgiStop、BD Biosciences社）で37℃で5時間処理した後、免疫染色およびフローサイトメトリーにより測定した。
下表の結果に示すように、edTreg細胞でLNGFR+ 細胞におけるIL-2サイトカインの低下が認められた。例えば、AAVドナー鋳型#3066を用いて作製したedTreg細胞（「3066edTreg」）の80%または約80%は、LNGFR-であり、IL-2を発現したが、LNFGR+ 3066edTreg細胞でIL-2を発現した割合は、50%または約50%に過ぎなかった。同様の差は、AAVドナー鋳型#3117（「3117edTreg」）を用いて作製したedTreg細胞でも認められ、LNGFR- 3117edTreg細胞の80%または約80%は、IL-2を発現したが、LNGFR+ 3117edTreg細胞でIL-2を発現した割合は、50%または約50%に過ぎなかった。
Figure 2021521849
一方、FOXP3の機能欠損のR397W変異を含むAAVドナー鋳型#3098（「3098edTreg」）を用いて作製したedTreg細胞は、LNGFR-細胞集団とLNGFR+細胞集団に差は認められず、いずれの集団も80%または約80%がIL-2を発現した。
方法
細胞を、20 ng/ml PMA/DMSO（MilliporeSigma社）、1μg/ml イオノマイシン（MilliporeSigma社）および1μg/ml モネンシン（GolgiStop、Life technologies社）を加えた培養培地に播種して37℃で5時間培養した。次に、処理した細胞に、CD4およびLNGFRを含む表面マーカーの染色を行い、続いて、BD Cytofix/Cytoperm（商標）固定/膜透過処理液キット（BDB554714、BD Biosciences社）を用いて固定および膜透過処理を行った。細胞内のサイトカインは、蛍光色素で標識した抗サイトカイン抗体を用いて染色し、FACSで分析を行った。
AAV FOXP3ドナー鋳型のSV40-polyAおよび3'-UTRエレメントの評価
結果
次に、edTregにおけるFOXP3 cDNAの発現を促進する能力について、SV40-polyAシグナル（「pA」）と、ヒトFOXP3由来の3'UTRエレメントとを比較した。この比較には、AAVドナー鋳型#3117および#3118を使用した。これらの全体的な構造（5'→3'方向）は以下に示す通りである。AAV #3117は、LNGFR-P2A-FOXP3 cDNAの5'末端側にMNDプロモーターを含み、SV40-polyAシグナルを含む。一方、AAV #3118は、LNGFR-P2A-FOXP3 cDNAの5'末端側にMNDプロモーターを含み、3'-UTRを含む。AAV #3117およびAAV #3118のいずれも、3'-末端および5'-末端に0.45kbの相同アーム（HA）を有する。
#3117: ITR-HA-MND-LNGFR-2A-FOXP3cDNA-pA-HA-ITR
#3118: ITR-HA-MND-LNGFR-2A-FOXP3cDNA-3'UTR-HA-ITR
2種類の編集条件におけるLNGFR+細胞の割合（%）は同程度であった。下表に、フローサイトメトリーで測定した、cis連結したLNGFRの発現に基づいて求めた編集後2日目の編集効率を示す。
Figure 2021521849
SV40-polyAでは、Tregマーカー陽性のLNGFR+細胞の割合（%）が高かったことから、SV40-polyAの方が、より安定したFOXP3cDNAの発現が得られることが分かった。LNGFR、ならびにTregマーカーであるCD4、CD25、CD127、CTLA-4、LAG3およびICOSの発現はいずれも、AAV #3117で処理した細胞集団と、AAV #3118で処理した細胞集団で同等のレベルであった。しかし、細胞集団全体におけるFOXP3+/LNGFR+細胞の割合は、AAV #3118処理より、#3117処理の方が高かった（#3117: 7.47%、#3118: 1.27%）。PMA/イオノマイシン/GolgiStopで5時間処理した後、細胞内のサイトカインの染色を行った。
さらに、編集後6日目に、細胞内のIL-2を調べた。AAVドナー鋳型#3117で処理したT細胞、およびAAVドナー鋳型#3118で処理したT細胞のいずれにおいても、LNGFR+細胞におけるIL-2抑制が見られた。しかし、AAV #3117で処理した場合、LNGFR-細胞集団と比較したLNGFR+細胞集団におけるIL-2+細胞の割合（%）の低下の程度は、AAV #3118より大きかった。AAV #3117のSV40-polyAは、3'-UTRを含むAAV #3118と同じ条件下で評価したところ、edTreg細胞におけるFOXP3 cDNAの安定した発現をより高いレベルで維持する能力を有することが示された。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
方法
Cas9/T9（比1:2.5）で構成されたRNPを細胞にトランスフェクションし、各AAVドナー鋳型をAAV形質導入により送達した。FACS分析は上記の通りである。
これらの実験の結果から、AAVドナー鋳型#3066（MND-FOXP3cDNA-P2A-LNGFRの両末端にFOXP3遺伝子に対する0.6kbの相同アームを有する）と、AAVドナー鋳型#3080（MND-LNGFR-P2Aの両末端にFOXP3遺伝子に対する0.6kbの相同アームを有する）は、Cas9/gRNA-T9（比1:2.5）RNPと組み合せてedTreg細胞の調製およびそれに続くin vivoにおける機能評価を行う上で、いずれも効果的な標的指向性を有するドナー鋳型であることが示された。
実施例１５：例示的なedT reg 細胞の調製
前編集CD4+ T細胞活性化および前編集拡大培養プロトコルの開発
edTregを作製する上で許容可能な、CD4+ T細胞の編集条件の決定を試みた。検証した条件には、以下の様々な活性化方法を含む：CD3/CD28 T活性化ビーズ、可溶性CD3/CD28抗体とCD3/CD28 Tエキスパンダービーズ、様々な細胞濃度（50万個と100万個/ml）、様々な活性化時間（48時間、60時間、72時間と84時間）、ビーズ除去から編集までの間に設ける様々な静置時間。
各試験条件で、細胞生存率（生存細胞の割合（%）、生細胞・死細胞の染色によって判定）、細胞の活性化（CD25+細胞の割合（%））、および編集前を基準とする細胞数の倍率変化を調べた。編集後2日目に、GFP+細胞の割合（%）として示されるHDR率（%）を編集効率として求めた。
上記のすべての因子を改良した条件として、ビーズと細胞の比率が3:1になるようにエキスパンダービーズを使用し、細胞密度は50万個/ml、刺激時間は72時間、編集前の静置時間を一晩とする条件が決定された。この条件を適用することにより、編集後2日目に、許容可能なレベルGFP発現が得られ、細胞生存率86%、 CD25+細胞の割合95%、2.3倍の細胞数の増大という結果が得られた。
AAV形質導入時の培養培地の検証実験
結果
次に、T細胞を編集してedTregを作製する際のAAV形質導入工程で使用する、許容可能な細胞培地の決定を試みた。AAV形質導入時に、5%、10%または20%のFBSを含む培養培地を用いて実験を行った。細胞を編集した後、20%FBSを含む培地で活性化させて拡大培養し、次いで、5%、10%または20%のFBSを含む培地で細胞を培養した後、AAVを加えた。複数のバッチで作製したAAVを実験で使用した。
Figure 2021521849
AAV形質導入は、12.5%または20%のFBSを含む培地で行った。SpyFi Cas9/gRNA-T9（1:2.5）RNPを、ロンザ社のnucleofectorまたはMaxCyte社のシステムを使用して、ヒトCD4+ T細胞に送達し、その後、AAV6ドナー鋳型#3066による形質導入を行った。編集から24時間後に、20%FBSを含む培地で細胞培養物を希釈した。編集後2日目に、細胞生存率（生細胞・死細胞の染色）およびHDR効率（LNGFR染色）をフローサイトメトリーで調べた。これらの実験の結果を下記に示す。AAV形質導入時に12.5%のFBSを使用することにより、生存率を落とすことなく、編集効率を向上させることができ、さらに、ロンザ社およびMaxCyte社のいずれのエレクトロポレーションシステムを使用しても、同様の編集効率が達成されることが証明された。
AAV形質導入時にFBS濃度を低下させることによって、編集効率が向上した。しかし、低濃度のFBSは細胞生存率にマイナスの影響を及ぼした。これらの実験から、AAV形質導入時に12.5%のFBSを使用することにより、編集後の生存率を落とすことなく、編集効率を向上させることができ、許容可能なレベルのedTregを作製できることが明らかとなった。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
ロンザ社ヌクレオフェクションによるedT reg の作製のための様々なエレクトロポレーション条件の検証
次に、CD4+T細胞を編集してedTregを作製するためのヌクレオフェクションプログラムとして、他のプログラムについて詳細な分析を行った。ロンザ EO-115プログラムまたはDN-102プログラムのいずれを使用した場合も、編集後の生存率が維持されるとともに、高いHDR編集効率が得られた。AAVドナー鋳型3066および3080を実験で使用した。
例示的なedT reg 細胞作製プロトコル
edTregを作製するための例示的なプロトコルを確立した。このプロトコルの試薬および詳細な培養条件の一覧を下表に示す。
Figure 2021521849
14日間の作製タイムラインおよびプロトコルを下表に示す。
Figure 2021521849
LNGFR（CD271）マイクロビーズと磁気カラム分離を利用する、HDRにより遺伝子編集したedT reg の効率的な濃縮
結果
次に、HDRにより遺伝子編集した、LNGFRを発現するedTregの効率的な濃縮手法の確立を試みた。
先の章に示したプロトコルに従い、AAV #3066コンストラクトを用いてCD4+ T細胞を編集した。編集後3日目に、編集により得られた、LNGFRマーカーを発現する3066edTreg（すなわちLNGFR+細胞）を、LNGFR（CD271）マイクロビーズと磁気カラム分離を利用して精製（濃縮）し、濃縮後7日間、細胞を拡大培養した。
マイクロビーズで精製後、edTreg細胞にLNGFR染色を行ったところ、mock編集した細胞でLNGFRを発現したのは0.07%であったのに対して、精製した細胞では99.2%がLNGFRを発現していた。6回の実験のLNGFR+ edTreg細胞調製物の平均純度は、98.6%であった。6回の実験データによる、拡大培養した細胞組成物中の3066edTregの平均数は、G-Rex（登録商標）（Wilson Wolf社、セントポール、ミネソタ州、米国）で7日間培養する間に平均で60倍に増大した。
さらに、下表に示すように、このLNGFR+細胞は、FOXP3と、CD4、CD25、CTLA-4、ICOSおよびLAG3を含むその他のTregマーカーとを発現しているが、IL-2、TNFαおよびIFNγの発現は、LNGFR-細胞より少なかった。
Figure 2021521849
我々が開発した手法に基づく編集・細胞拡大培養プロトコルにより、純度の高い大量のedTreg細胞調製物を得ることができた。我々が精製して拡大培養したedTreg調製物は、FOXP3およびLNGFRに加えて、CD25、CTLA-4およびICOSの高レベルの発現と、CD127の低レベルの発現を示し、Treg様の表現型と一致していた。また、FOXP3 cDNAの発現により、炎症促進性サイトカイン（IL-2、TNFαおよびIFNγ）の発現低下（PMA/イオノマイシン刺激に対する応答で評価）も見られた。
方法
ヒト初代CD4+ T細胞にAAV #3066ドナーコンストラクトで遺伝子編集を行い、3日後に、LNGFR（CD271）マイクロビーズ（Miltenyi社 #130-099-023）と磁気カラム分離（Miltenyi社 #130-042-401）を利用して、細胞を濃縮した。濃縮した細胞を、T細胞拡大培養培地（RPMI1640、20%FBS、HEPES、GlutaMAX、β-メルカプトエタノール、IL-2（100 ng/ml）および100 nMラパマイシン）中で、ビーズと細胞の比率が3:1になるようにCD3/CD28 T-エキスパンダービーズと混合した。G-Rex（登録商標）（6ウェル、Wilson Wolf社、セントポール、ミネソタ州、米国）に、細胞培養物を150万〜200万個/ウェルで播種して、7日間培養した。G-Rex（登録商標）で培養を開始してから3日目および5日目に、培地の半量を補充した。G-Rex（登録商標）で7日間の拡大培養を行った後、細胞数、純度および表現型を調べた。
実施例１６：比較実験のために拡大培養したT reg の作製
edTreg調製物の評価にあたり、実験のコントロールとして、tTreg（胸腺Treg）を用いた。なお、tTregは、nTreg（天然Treg）としても知られている。ex vivoにおけるtTregの拡大培養プロトコルはいくつか公開されているが、いずれも、単離、拡大培養条件および期間の観点で我々のedTregプロトコルとは大きく異なっている。
tT reg の拡大培養プロトコル
我々は、下記に示すtTreg拡大培養プロトコルを開発した。このtTreg拡大培養プロトコルは、edTregのin vitroでの培養および取扱に非常に適合したものである。tTregの拡大培養に用いる試薬および条件を下表にまとめた。
Figure 2021521849
14日間のtTregの作製タイムラインおよびプロトコルを下表に示す。
Figure 2021521849
edT reg に適合するプロトコルで作製したtT reg のin vitro特性解析
結果
tTreg細胞を作製するための、edTregに適合するこのプロトコルを用いて、まず、4名のドナー由来のtTregにおけるFOXP3発現を評価した。同時に、ポジティブコントロールとして、通常型CD4細胞（「Tconv」または「conv CD4」）、すなわち、CD4+CD25-細胞を用いて、拡大培養および染色/解析を行った。
Figure 2021521849
tTreg細胞およびTconv細胞におけるFOXP3発現を評価した。下表に、4回の実験の平均の純度および細胞数の増大をまとめた。細胞全体の平均77.5%が、FOXP3を発現している、すなわちtTreg細胞であり、Tconv細胞でFOXP3を発現しているのはわずか10%であった。
Figure 2021521849
方法
健常なドナーのPBMCから、天然のTreg細胞をTreg isolation kit（Stemcell社）を用いて単離し、次いで、ビーズと細胞の比率を3:1として、CD3/CD28 T-エキスパンダービーズで活性化させ、最初の拡大培養を行った。50万個/mlのTreg細胞を、ビーズの存在下で72時間培養した後、ビーズなしでさらに96時間培養した。次に、拡大培養培地を含むG-Rex 6ウェル培養容器に、tTreg細胞とCD3/CD28 T-エキスパンダービーズを、ビーズと細胞の比率が3:1になるように加えた。7日間の培養期間中、2〜3日おきに、G-Rex中の増殖培地を補充した。培養7日目に、細胞を磁気分離によりビーズから分離し、CryoStor CS10培地に加えて、液体窒素キャビネットで凍結保存した。
実施例１７：ヒトT細胞の他の標的遺伝子座の編集によるedT reg の作製
結果
ヒト初代T細胞の他の標的遺伝子座を編集した場合でもedTregを作製できるか否かを調べるために、FOXP3遺伝子座を編集した場合とAAVS1遺伝子座を編集した場合のFOXP3の発現レベルを比較した。編集後2日目に、FOXP3遺伝子座とAAVS1遺伝子座で、同様に高レベルのHDR編集が確認された。なお、未編集の細胞およびドナー鋳型のみトランスフェクションした細胞を比較対照とした。導入遺伝子マーカー（GFPまたはLNGFR）を発現する細胞の割合（%）を下表にまとめた。
Figure 2021521849
さらに、得られたデータから、代替の遺伝子座としてAAVS1を使用してFOXP3導入遺伝子を発現するedTregが得られることが示唆された。特に注目すべきは、いずれのドナー鋳型を用いた場合も、編集したFOXP3遺伝子座におけるMNDを介した導入遺伝子の発現が、AAVS1遺伝子座で観察された発現より高かったことである。この差は、edTreg調製物で異なるレベルのFOXP3発現を容易にする可能性があり、これらの遺伝子座で編集した細胞を代替使用できる可能性がある。
方法
Cas9/gRNA-T9 RNP複合体またはCas9/gRNA-N2 RNP複合体をエレクトロポレーションにより活性化CD4+ T細胞に導入して、FOXP3遺伝子座またはAAVS1遺伝子座にDNA二本鎖切断を導入した後、AAVを介してドナー鋳型を送達し、相同組換えによる修復を行った。ドナー鋳型は、両末端に遺伝子座特異的な相同アームを有する、MND-GFP.polyA遺伝子発現カセットまたはMND-FOXP3cDNA.P2A.LNGFR.polyA遺伝子発現カセットを含む。2日目に、フローサイトメトリーによりGFP+またはLNGFR+の割合（%）を測定し、編集効率を求めた。CD4細胞の活性化、編集およびFACSについては、実施例１５に記載の方法を用いた。
実施例１８：edT reg 調製物のin vitro機能特性解析
結果
edTreg作製後のドナーHDRカセットのオンターゲット組み込みを数値化するために、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）アッセイの開発を試みた。HEXプローブまたはFAMプローブと一緒にddPCRプライマーを設計し、AAVドナー鋳型#3066を用いて作製したedTregにおけるLNGFRの存在、またはHDR編集率を定量した。次いで、ddPCRで求めたHDR編集率を、細胞染色およびフローサイトメトリーで先に求めたHDR編集レベルと比較した。
ddPCRデータは、タンパク質発現を追跡するためのフローサイトメトリーにより求めたHDR編集率と直接相関する。このアッセイにより、edTreg調製物、例えば、関連するタンパク質マーカーを含まないedTreg調製物の分子特性解析が可能であり、かつ/またはedTreg調製物におけるFOXP3発現の追跡に細胞内染色を用いる必要がなくなる。このアッセイは、edTreg調製物の出荷判定基準（release criteria）を提供する上でも有用と考えられる。
方法
編集した細胞を、LNGFR抗体カラム分離（Miltenyi社）を利用して濃縮した。濃縮した調製物とフロースルー調製物を、それぞれG-Rex（登録商標）（Wilson Wolf社、セントポール、ミネソタ州、米国）で7日間拡大培養した。LNGFRで濃縮された細胞は、90%または約90%がLNGFR+であり、拡大培養したフロースルー細胞は、1%または約1%がLNGFR+であった。次いで、濃縮した細胞およびフロースルー細胞の一部を混合して、LNGFR+純度70%の細胞調製物を得た。細胞サンプルをddPCRとフローサイトメトリーで分析し、LNGFR+の割合（%）およびオンターゲット遺伝子組み込み率（%）を確認した。
ddPCRについては、各サンプルから単離したゲノムDNAをセットアップしてドロップレットを発生させ、下表に示すプライマー混合物を含む反応液でPCR増幅を行った。データ解析は、Quantソフトウェアを用いて行った。HDR率（%）は、コントロール濃度に対するインサート濃度の比である。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
実施例１９：edT reg 調製物のin vivo機能特性解析
次に、我々独自の作製プロトコルで得られたedTreg調製物について、in vivoにおける機能的活性を評価した。
様々な方法で行ったedT reg のin vivo機能の評価
結果
edTregを臨床的に関連のある表面マーカーを用いて効率的に精製できること、またedTregを効果的に拡大培養して凍結保存できることが分かった。得られた細胞調製物は、in vivoで効率的に機能して、マウスの異種移植片対宿主病（xenoGVHD）（CD4養子移入炎症（CATI）マウスモデルとしても知られている）を抑制した。なお、凍結保存したedTregを用いた場合と新たに作製したedTregを用いた場合で同様の結果が認められ、FACSで濃縮したLNGFR+細胞を用いた場合とカラム分離で濃縮したLNGFR+細胞を用いた場合でも同様の結果が認められ、LNGFRノックイン（KI）edTregを用いた場合とGFPノックインedTregを用いた場合でも同様の結果が認められた。よって、リンパ球細胞のゲノムを編集するこの方法が安定した方法であること、そして、特定のプロトコルに依存することなく効果的な細胞組成物を調製できることが証明された。
in vivo xenoGVHD実験に使用したedTreg細胞は、マーカーであるGFPまたはLNGFRと内在性のFOXP3とを発現し、GFPまたはLNGFRの発現は、新鮮な調製物と凍結/解凍した調製物で同等のようであった。凍結した細胞調製物と新鮮な細胞調製物のいずれを使用しても、50日後の生存率は60%〜100%であり、両者の間に大きな差は見られなかった。図10に、50日間のGVHDスコアを示す。
凍結保存したedTreg細胞調製物は、xenoGVHDの抑制において、新たに作製したedTregと同等の効果を示した。また、FACSまたはカラム分離によるLNGFR+ edTregの濃縮が、FACSで濃縮したGFP+ edTregと同様の効果があることや、図10に示すように、LNGFRノックイン（KI）edTregおよびGFPノックインedTregのいずれも、効果的にxenoGVHDを抑制することも示された。以上より、我々独自の方法で作製したedTregは、臨床的に関連のある表面マーカーを使用して効率的に精製することが可能であり、さらに拡大培養して凍結保存することが可能であると言える。このようにして得られた調製物は、このマウスモデルにおいて、in vivoで効率的に機能して、xenoGVHDの臨床的特徴を抑制することが証明された。
方法
凍結保存した細胞を「休ませる」必要がある条件において、細胞をCryoStor CS10凍結用培地（BioLife Solutions社）に500〜10000万個/mlになるように再懸濁し、凍結バイアルに1 mLずつ分注した。CoolCell（BioCision社）またはMr. Frosty（ThermoFisher社）などの凍結容器に入れたバイアルを、室温から-80℃のフリーザーに移し、-80℃のフリーザーで約4〜96時間かけて、約1℃/minの速度で温度を低下させた。その後、凍結バイアルを保存用の液体窒素キャビネットに移した。8〜10週齢の雄性NSG（NOD-scid IL2Rgamma-null、Jackson Laboratory）マウスに200cgyで全身照射し、その後、edTreg、mock編集した細胞、または、場合によりtTreg（8×106個/マウス）を静脈内投与した。いくつかの実験群では、マウスに照射のみ行った。実験対象の個体の体重を測定して、開始時の体重として記録した。注入後3日目に、凍結保存したPBMCから新たに単離した4×106個の自己CD4エフェクターT細胞を、実験群の各マウスの尾静脈に投与した。体重の変化は毎週2〜3回モニターし、GvHDスコアは、エフェクターT細胞注入後約50〜65日間にわたって毎週評価した。GvHDスコアは、体重変化、姿勢、活動、毛並みおよび皮膚の完全性に従って測定した。カテゴリーごとにスコアが0〜2の範囲で0.5刻みに設けられており、合計のスコアを記録した。体重減少が開始時の体重の20%を超える場合は、実験のエンドポイントとして、マウスに人道的に安楽死処置を行った。
xenoGVHDモデルにおけるedT reg のin vivo持続性
結果
edTregは、xenoGVHDマウスモデルにおいてin vivo持続性を示した。養子移入後90日目のマウスでLNGFR+FOXP3+ edTregが検出され、刺激後のLNGFR+細胞における炎症性サイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）の産生量は、以下に示すように、LNGFR- T細胞より少なかった。この結果により、edTregの機能および表現型がin vivoで長期に維持されることが証明された。FOXP3、CTLA-4、CD25およびCD127の染色結果と合わせて、LNGFRの染色結果も下表に示す。
Figure 2021521849
LNGFR+FOXP3+ edTregが養子移入後90日目のマウスで検出されたことから、edTregが持続して存在し、制御性T細胞の表現型を維持していることが示唆された。刺激後のLNGFR+細胞における炎症性サイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）の産生量は、LNGFR- T細胞より少なかった。
方法
xenoGVHDモデルへの細胞移入後90日目に、ヒトedTregおよびTeffを移入した3匹のマウスから脾臓を採取し、長期に生着しているedTregの存在および免疫表現型を調べた。hCD45RO+CD4+またはhCD3+CD4+として同定されたヒトCD4+ T集団におけるLNGFR、Tregマーカーおよび細胞内サイトカインをフローサイトメトリーにより調べた。刺激によりサイトカインを産生させるために、細胞をPMA/イオノマイシンおよびGolgiStopで37℃で5時間処理して、その後、各サイトカインの染色を行った。マウスから採取した脾臓をPBSバッファー中で優しく濾して、細胞懸濁液を準備した。脾細胞をACK（塩化アンモニウムカリウム）溶解バッファーで処理して赤血球を除去し、免疫染色を行った。細胞内マーカーは、True-Nuclear核内転写因子染色バッファーセットを用いて染色した。サイトカインの産生量を調べるために、細胞をPMA/イオノマイシンおよびGolgiStopを加えた培養培地で37℃で5時間培養し、BD cytofix/cytoperm固定/膜透過処理液キットを用いて免疫染色を行った。
実施例２０：IPEX対象のT細胞のゲノム編集
結果
IPEX対象のT細胞治療としてのedTregの可能性を評価するために、I363V FOXP3変異を有するIPEX対象のCD4+ T細胞、または健常なドナーの臍帯血もしくは健常なドナーPBMCに由来するコントロール細胞を、実施例１５に従って調製したSpyFi Cas9/gRNA T9（比1:2.5）RNPと、AAVドナー鋳型#3080またはAAVドナー鋳型#3066とを用いて編集した。先の章に記載した通り、AAVドナー鋳型#3066のコンストラクト構造は、ITR-(0.6kb HA for T9)-MND-FOXP3cDNA-P2A-LNGFR-pA-(0.6kb HA for T9)-ITRであり、AAVドナー鋳型#3080のコンストラクト構造は、ITR-(0.6kb HA for T9)-MND-LNGFR-P2A-FOXP3exon1-pA-(0.6kb HA for T9)-ITRである。
HDR編集による全長型FOXP3cDNAの発現により、IPEX対象由来のT細胞でTreg表現型を回復させることができ、この方法の、IPEXに対するT細胞治療としての可能性が証明された。
内在性のWT遺伝子座からの機能的なWT FOXP3 cDNAの発現またはWT FOXP3 cDNAの導入による機能的なWT FOXP3 cDNAの発現が、健常なドナー由来のT細胞においてTreg様の表現型を得るために必要であった。健常なドナー臍帯血またはPBMCに由来するCD4+ T細胞から作製したコントロールedTreg細胞では、LNGFR+細胞における炎症性サイトカインIL-2およびTNFαのレベルの低下が認められた。この効果は、全長型野生型のFOXP3をコードするAAVドナー鋳型#3066、およびFOXP3の第1コーディングエキソンのみを含むAAVドナー鋳型#3080により得られた。
IPEX対象由来のT細胞の場合、Treg表現型の回復には、ドナー鋳型にWT FOXP3 cDNAが組み入れられていることが必要であった。全長型野生型のFOXP3をコードするAAVドナー鋳型#3066は、IL2+LNGFR+細胞の割合（%）を低下させる効果があったが、AAVドナー鋳型#3080では、同様の効果は得られなかった。
また、IPEX edTreg細胞は、選択マーカーLNGFRを用いることにより、純度の高い集団に濃縮することができた（下表を参照のこと）。LNGFRで濃縮された、WT FOXP3 cDNAを発現するIPEX edTregは、コントロールedTreg細胞と同様の表現型およびサイトカインプロファイルを示した。
Figure 2021521849
Figure 2021521849
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方法
各AAVドナー鋳型を評価するために、I363V変異を有するIPEX対象の臍帯血からT細胞を単離した。同時に、健常な臍帯血からコントロール1（Ctrl 1）T細胞を単離し、健常な成人のPBMCからコントロール2（Ctrl 2）T細胞を単離した。それぞれのT細胞を、SpyFi Cas9/gRNA-T9（比1:2.5）RNPとAAVドナー鋳型#3066とを用いて、実施例１５に記載のプロトコルに従って処理した。編集後2日目に、各T細胞調製物のFACS分析を行った。
Figure 2021521849
実施例２１：in vitro抑制アッセイ
増殖色素を用いた2種類のin vitro抑制アッセイにより、実施例１０の例示的な編集プロトコルを用いて作製したedTregが、CD3/CD28刺激に応じてCD4 Teffの増殖を抑制するか否かを確認した。
方法1では、edTregまたはmock編集したT細胞に、mock照射または3000radで照射を行った。これとは別に、PBMCから単離した自己CD4+細胞由来のTeff、バルクCD4を調製し、TeffをCellTrace増殖色素で標識した。Teff細胞と編集したT細胞を、様々な比率で混合して、1:32の比率になるように抗CD3/CD28ビーズを加えて刺激を行った。96時間インキュベーションを行った後、Teffに残存するCellTrace色素をフローサイトメトリーで測定し、Teffの増殖を評価した。ネガティブコントロールは、ビーズで刺激を行わなかったTconvである。ポジティブコントロールは、1:32の比率になるようにビーズを加えて刺激のみ行ったTconvである。
方法2は、72時間インキュベーションを行った後に色素を希釈して増殖を確認すること以外は方法1と同様のプロトコルであった。さらに、方法2では、インプットedTregまたはmock編集した細胞への照射は行わなかった。
2種類の方法における抑制率（%）は、下記式により算出した。
抑制率（%）=（抑制処理なしの増殖率（%）- 抑制処理ありの増殖率（%））/（抑制処理なしの増殖率（%））×100
得られた結果より、SpyFi Cas9/gRNA-T9とAAVドナー鋳型#3066（MND-FOXP3 cDNA-P2A-LNGFRの両末端にFOXP3に対する0.6kbの相同アームを有する）により得られたedTregおよび#3080（MND-LNGFR-P2A-FOXP3 cDNAの両末端にFOXP3に対する0.6kbの相同アームを有する）により得られたedTregは、in vitroにおいてTeff増殖を抑制できることが分かった（図15〜17）。上記のアッセイでは、重要なネガティブコントロール（mock編集した細胞を含めること）も準備した。mock編集した細胞がIL-2と競合して抑制活性を示す可能性があるため、このコントロールは重要と考えられる。得られたデータから、edTregがmock編集した細胞と比べてはるかに高い抑制活性を示すことが証明された。図15〜17に、3つの異なるバッチのedTregを用いて、edTregによる抑制を調べたin vitroアッセイおよびin vivoアッセイの結果を示す。edTregによるTeff増殖抑制を評価する方法1のプロトコルのin vitro結果は、#3066より得られた同バッチのedTregのin vivo結果と一致していた。図16および17に示す、edTregによるTeff増殖抑制を評価する方法2のプロトコルのin vitro結果は、#3066より得られた同バッチのedTregのin vivo結果と一致していた。
実施例１３に記載のマウスCATIモデルで得られた、対応するin vivo結果を以下にまとめる。AAVドナー鋳型#3066により得られた3つのバッチのedTregにおいて、いずれのバッチのedTregも、マウスモデルにおいてTeff増殖を阻害し、その結果、edTregで処理したマウス群の生存率が上昇した。この3つのedTreg組成物は、in vitroおよびin vivoで免疫抑制機能を示し、機能的な免疫抑制活性は、同時に評価を行った天然のTregと同等であった（図16および図17を参照のこと）。
前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本明細書に開示された本発明の実施または本開示を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明の真の範囲および要旨において可能なあらゆる変更を包含する。
本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。参照によって援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および／または優先される。
配列
本開示において開示した配列に加えて、説明を目的として提供された本開示の代表的な様々な実施形態において言及または使用された以下の配列を提供する。配列番号１４１〜１６２はAAVドナー鋳型の配列を含む。

Figure 2021521849
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Claims (27)

  1. デオキシリボ核酸（DNA）エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
    リンパ球細胞のFOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座もしくはTCRa（TRAC）遺伝子座内の配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA（gRNA）、または該gRNAをコードする核酸；および
    FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
    を含むシステム。
  2. 前記gRNAが、
    ｉ）配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７、１５〜２０、２７〜２９、３３および３４のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；
    ii）配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；または
    iii）配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記FOXP3またはその機能性誘導体が、野生型ヒトFOXP3である、請求項１または２に記載のシステム。
  4. 前記DNAエンドヌクレアーゼがCasエンドヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
  5. 前記DNAエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
  6. 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸がmRNAである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
  7. 前記ドナー鋳型が、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
  8. 前記DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソームまたは脂質ナノ粒子への内包化により製剤化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
  9. 前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子が、前記gRNAをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
  10. リンパ球細胞のゲノムを編集する方法であって、
    （ａ）リンパ球細胞のFOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座もしくはTCRa（TRAC）遺伝子座内の配列に相補的なスペーサー配列を含むgRNA、または該gRNAをコードする核酸；
    （ｂ）DNAエンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；および
    （ｃ）FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
    をリンパ球細胞に提供する工程を含む方法。
  11. 前記gRNAが、
    ｉ）配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；
    ii）配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；または
    iii）配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント
    を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記FOXP3またはその機能性誘導体が、野生型ヒトFOXP3である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記DNAエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. Ｉ）前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されており；かつ／または
    II）前記FOXP3もしくはその機能性誘導体をコードする核酸配列が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、
    請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸がmRNAである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ドナー鋳型が、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにコードされている、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソームまたは脂質ナノ粒子への内包化により製剤化されている、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子が、前記gRNAをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAをあらかじめ複合体化させることにより形成されたリボ核タンパク（RNP）複合体を前記細胞に提供する工程を含む、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法によってゲノム編集された遺伝子組換えリンパ球細胞。
  21. 請求項２０に記載の遺伝子組換えリンパ球細胞を含む組成物。
  22. 対象において、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態を治療する方法であって、
    （ａ）リンパ球細胞のFOXP3遺伝子座、AAVS1遺伝子座もしくはTCRa（TRAC）遺伝子座内の配列に相補的なスペーサー配列を含むgRNA、または該gRNAをコードする核酸；
    （ｂ）DNAエンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸；および
    （ｃ）FOXP3またはその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
    を対象のリンパ球細胞に提供する工程を含む方法。
  23. 前記gRNAが、
    ｉ）配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７、１５〜２０および２７〜２９のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；
    ii）配列番号１〜７のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号１〜７のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント；または
    iii）配列番号２、３および５のいずれかに示されるスペーサー配列、もしくは配列番号２、３および５のいずれかと比較して３個以下のミスマッチを有する前記スペーサー配列のバリアント
    を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記FOXP3またはその機能性誘導体が、野生型FOXP3である、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記疾患または状態が、炎症性疾患または自己免疫疾患である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. IPEX症候群または移植片対宿主病（GVHD）などの、炎症性疾患または自己免疫疾患などのFOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態の抑制または治療において使用するための、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法によってゲノム編集された遺伝子組換えリンパ球細胞。
  27. 医薬品としての、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法によってゲノム編集された遺伝子組換えリンパ球細胞。
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