JPH08505778A - フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的核酸とのデュープレックスを形成し、次いでオリゴヌクレオチドと標的核酸との間で形成されたデュープレックスとトリプレックスを形成する新規なオリゴヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 フォールドバック・トリプレックス 形成性オリゴヌクレオチド 発明の背景 発明の技術分野 本発明は合成オリゴヌクレオチドに関する。より詳細には本発明は、遺伝子発 現調整に有用である合成オリゴヌクレオチドに関するものである。関連技術の要約 ザメクニクおよびステフェンソン、プロシーディング・ナショナル・アカデミ ー・サイエンス、ＵＳＡ第７５巻、第２８０〜２８４頁（１９７８）が最初に合 成オリゴヌクレオチドによるウィルス複製阻止を示して以来、治療剤としてのオ リゴヌクレオチドに大きい関心が寄せられている。近年、治療剤として並びに遺 伝子発現調整の作用剤としてオリゴヌクレオチドの開発が大きい進歩を遂げてい る。最大の開発はいわゆるアンチセンス オリゴヌクレオチドの使用であって、 標的 ｍＲＮＡに対しワトソン・クリック デュープレックスを形成する。アグ ローワル、トレンズ・イン・バイオテクノロジー、第１０巻、第１５２〜１５８ 頁（１９９２）は、抗ウィルス剤としてのアンチセンス オリゴヌクレオチドの 開発につき鋭意検討している。 同様に重要であるが若干開発程度の低いものはいわゆるアンチジーン（antige ne）オリゴヌクレオチド手法であって、オリゴヌクレオチドがフーグスティーン 塩基対形成を介し標的ＤＮＡデュープレックスとのトリプレックスを形成する。 チャングおよびペチット、プログレス・バイオフィジカル・モレキュラ・バイオ ロジー、第５８巻、第２２５〜２５７頁（１９９２）は、最近この手法における 開発につき検討している。トリプレックス形成がＤＮＡと各種のオリゴヌクレオ チドとの間で観察されている。クーニー等、サイエンス、第２４１巻、第４５６ 〜４５９頁（１９８８）は、ＤＮＡとオリゴデオキシヌクレオチド ホスホジエ ステルとの間のトリプレックス形成を教示している。ラチマー等、ヌクレイック ・アシッズ・リサーチ、第２２巻、第１５４９〜１５６１頁（１９８９）は、オ リゴデオキシヌクレオチド ホスホロチオエートを含むトリプレックス形成を開 示している。キブラー・ヘルツォグ等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第 １８巻、第３５４５〜３５５５頁（１９９０）は、短いオリゴデオキシヌクレオ チド メチルホスホネートを含むトリプレックス形成を開示している。トリプレ ックス形成を増進する各種の塩基改変も知られており、シトシンのＣ５−メチル 化［キソド等、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１９巻、第５６２５ 〜５６３１頁（１９９１）］、二環式シトシン類似体ＭＯＤＡの使用［ヤング等 、プロシーディング・ナショ ナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８８巻、第１００２３〜１０１００ 頁（１９９１）］、並びに合成α−アノマー ヌクレオチドの使用［プラセウス 等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ第８５巻 、第１３４９〜１３５３頁（１９８８）］を含む。ギオバナンゲリ等、ジャーナ ル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１１３巻、第７７７５〜７７７７頁 （１９９１）は、キャップされたオリゴヌクレオチドの５′末端に対するアクリ ジン挿入体の結合もトリプレックス安定性を向上させることを教示している。オ リゴヌクレオチド媒介のトリプレックス形成は、少なくともインビトロにて転写 の抑制をもたらしうる［クーニー等およびヤング等、上記参照］。 アンチセンスおよびアンチジーン（antigene）オリゴヌクレオチドの両手法は 、遺伝子発現の理解および遺伝子発現を含む病気もしくは症状の治療処置に有利 である遺伝子発現調整をその目標とする。これら目標を満たすのに充分適したオ リゴヌクレオチド化合物の２つの主たる特性は、高い特異性と結合時の遺伝子発 現を阻止する能力である。これら特性の向上が常に望ましい。したがって、ずっ と高い特異性およびより安定な複合体形成を示して現存する化合物よりも向上し た遺伝子発現の阻止能力をもたらす新規なオリゴヌクレオチド化合物につきニー ズが存在する。 発明の要点 本発明は、現存するオリゴヌクレオチドよりも高い特異性と一層安定な標的核 酸との複合体形成とを示す新規なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明による オリゴヌクレオチドはワトソン・クリック塩基対形成を介し一本鎖標的核酸にハ イブリダイズするデュープレックス形成性領域、およびデュープレックス形成性 領域と標的核酸との間で形成されたデュープレックスによりできる主たる溝（gr oove）、ここで標的核酸とフーグスティーン塩基対形成を介しトリプレックスを 形成するが、この主たる溝に適合するトリプレックス形成性領域とを有する。デ ュープレックス形成性領域とトリプレックス形成性領域とはリンカー領域により 結合され、このリンカー領域はデュープレックス形成性領域とトリプレックス形 成性領域との両者を標的核酸に結合させうるオリゴヌクレオチドループもしくは 任意の柔軟化学構造とすることができる。標的核酸と本発明によるオリゴヌクレ オチドとの間で形成される複合体はしたがって、アンチセンス手法のデュープレ ックス構造および遺伝子発現調整に対するアンチジーン手法のトリプレックス構 造との両者に類似する特性を有する。同じオリゴヌクレオチドがデュープレック ス形成機能とトリプレックス形成機能との両者を果たすので、この構造はフォー ルドバック・トリプレックスと呼ばれ、フォールドバック・トリプレックスを形 成すべく標的核酸に対し複合化する本発明によるオリゴヌクレオチドはフォール ドバック・トリプレックス形成 性オリゴヌクレオチドと呼ばれる。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドの特異性増大は 、標的核酸を２回読み取らねばならず、すなわち１回は最初にデュープレックス を形成すべくワトソン・クリック塩基対形成を介して読取り、さらにもう１回は トリプレックスを形成すべくフーグスティーン塩基対形成を介して読み取らねば ならないという事実から生ずる。フォールドバック複合体の安定性向上は、オリ ゴヌクレオチドと標的核酸との間で形成される水素結合の個数増加から生ずる。 本発明によるフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは、 種々異なるパラメータの下でデュープレックスおよびトリプレックス形成をイン ビトロで速度論的に研究するのに有用である。さらに、これらは組織培養もしく は動物モデルにおける遺伝子発現調整の研究にも有用である。最後に、本発明に よるフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは、アンチセ ンスおよびアンチジーン治療手法の両者の特性を有する新規な手法における治療 剤として有用である。 図面の簡単な説明 第１図は遺伝子発現調整に対するアンチセンスおよびアンチジーン手法を示し 、 第２図はトリプレックス形成に関与するワトソン・クリックおよびフーグステ ィーン水素結合パターンを有するＣ−Ｇ・Ｃ⁺およびＴ−Ａ・Ｔ塩基トリプレッ トを示 し、 第３図はワトソン・クリック（＝）およびフーグスティーン（：）塩基対形成 の両者により標的核酸に結合する本発明によるフォールドバック・トリプレック ス形成性オリゴヌクレオチドを示し（太線はトリプレックス形成性領域を示す） 、 第４図は４種の異なるフォールドバック・トリプレックスを示し、 第５図はＧテトラッドおよびＡテトラッドに関する水素結合パターンを示し、 第６図はフォールドバック・テトラプレックス形成から生ずる分子ノット（kn ot）を示し、 第７図は標的ＲＮＡもしくはＤＮＡと本発明によるフォールドバック・トリプ レックス形成性オリゴヌクレオチドとの間のフォールドバック・トリプレックス 形成を示す分光光度測定結果を示し、 第８図は標的ＤＮＡと本発明によるフォールドバック・トリプレックス形成性 オリゴヌクレオチドとの間のｐＨ５．０であるがｐＨ７．４でなくポリアミン（ スペルミン）の存在下におけるフォールドバック・トリプレックス形成を示す分 光光度測定結果を示し、 第９図は本発明によるフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレ オチドまたは対照デュープレックス形成性オリゴヌクレオチドに結合したＲＮＡ 標的分子に関するＲＮアーゼＨ加水分解パターンを示し、 第１０図は第９図に示したＲＮアーゼＨ加水分解パターンの略図であって、細 矢印はＲＮアーゼＨエンドヌクレアーゼ活性を示すのに対し太矢印はＲＮアーゼ Ｈエキソヌクレアーゼ活性の抑制部位を示し、 第１１図はフォールドバック・トリプレックス複合体の安定性向上および互い にハイブリダイズする様子を示すべく用いたオリゴヌクレオチドを示し、 第１２Ａ図はアンチセンス オリゴヌクレオチドと標的配列２３との種々異な る複合体の融解曲線を示し、 第１２Ｂ図は第１２Ａ図に示した曲線の第１具体例のプロットであり、 第１３図は標的配列２３の種々異なる複合体のＤＮアーゼＩ切断プロフイルを 示し、 第１４図は標的配列２３との複合体のＤＮアーゼＩ感受性および保護を示すオ ートラジオグラムであり、 第１５図は標的配列２３との複合体の移動性におけるシフトを示すオートラジ オグラムである。 好適実施態様の詳細な説明 本発明は、遺伝子発現調整に有用である合成オリゴヌクレオチドに関するもの である。本発明は、現存するオリゴヌクレオチドよりも高い特異性と一層安定な 標的核酸との複合体形成を示す合成オリゴヌクレオチドを提供する。 遺伝子発現調整に対する現存のオリゴヌクレオチド媒介手法はアンチセンス手 法およびアンチジーン手法であ って、これらを第１図に示す。アンチセンス手法においては、標的核酸が一本鎖 核酸であると共に遺伝子発現調整剤が相補的オリゴヌクレオチドである。相補的 オリゴヌクレオチドと標的核酸とは相補的塩基の間でワトソンークリック塩基対 形成によりデュープレックスを形成する。遺伝子発現の調整は恐らくＲＮＡのＲ ＮアーゼＨ分解、ＲＮＡに対するリボソーム作用の阻止またはＲＮＡもしくはＤ ＮＡに対する酵素作用の阻止を含む各種のメカニズムによって生ずる。これに対 しアンチジーン手法においては、標的核酸が二本鎖核酸であると共に遺伝子発現 調整剤は標的デュープレックスの主たる溝に入ってたとえば第２図に示すように 標的デュープレックスの一方の鎖とフーグスティーン塩基対を形成しうるオリゴ ヌクレオチドである。この相互作用がトリプレックス形成をもたらす。遺伝子発 現調整は恐らく転写の阻止によって生ずる。 本発明によるオリゴヌクレオチドはアンチセンス手法とアンチジーン手法との 両者の特徴を有する。本発明によるオリゴヌクレオチドのための標的核酸は、ア ンチセンス手法におけると同様に一本鎖核酸である。本発明によるオリゴヌクレ オチドはデュープレックス形成性領域を有し、この領域は標的核酸に対し相補的 であってアンチセンス手法におけると全く同様に相補的塩基対の間のワトソンー クリック塩基対形成を介し標的核酸とのデュープレックスを形成する。しかしな がら、本発明による オリゴヌクレオチドはトリプレックス形成性領域をも有し、この領域はオリゴヌ クレオチドのデュープレックス形成性領域のヌクレオチド配列と同一の配列であ るが反対の極性を有するヌクレオチド配列を有し、すなわち逆反復または半パリ ンドロームである。このトリプレックス形成性領域は、フーグスティーン塩基対 形成を介し標的核酸とオリゴヌクレオチドのデュープレックス形成性領域との間 で形成されたデュープレックスの主たる溝にて標的核酸と相互作用する。この相 互作用の結果がトリプレックスの形成である。本発明による２種のオリゴヌクレ オチドとその標的とにつき第３図に示したような複合体をフォールドバック・ト リプレックスと称する。要するに、フォールドバック・トリプレックスはオリゴ ヌクレオチドと標的核酸との間で形成された複合体であって、オリゴヌクレオチ ドが先ず最初に標的核酸とのデュープレックスを形成し、次いで同じオリゴヌク レオチド分子により、標的核酸とオリゴヌクレオチドとの間に形成されたデュー プレックスとトリプレックスを形成する。 本発明によるオリゴヌクレオチドは標的核酸とのフォールドバック・トリプレッ クスを形成しうるので、この種のオリゴヌクレオチドをここではフォールドバッ ク・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドとして分類する。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドがデュープレッ クスおよびトリプレックスの両者を形成するという事実はそれぞれ独立した証明 によっ て示される。先ず最初にシトシン含有のトリプレット形成性ストランドを含むフ ーグスティーン塩基対形成を可能にする条件下（ｐＨ５．０、ここではシトシン がプロトン化される）にて、フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌ クレオチドが標的核酸との複合体を形成し、これは熱変性に際しＡ₂₆₀の２つの 明瞭な増加を示す（各増加は変性現象を示す）。２つのＡ₂₆₀の増加は、トリプ レックスおよびデュープレックスの熱変性につき予想される温度近くで生ずる。 高い温度（第２）でのＡ₂₆₀の増加は、Ｇ＋Ｃ含有量を考慮してワトソン−クリ ック塩基対形成により形成された複合体の破壊につき予想される温度で生ずる。 低い温度（第１）でのＡ₂₆₀の増加は、熱力学的に安定性の低いフーグスティー ン塩基対形成により形成された複合体の破壊につき予想される。これに対しシト シン含有のトリプレックス形成性ストランドを含むフーグスティーン塩基対形成 を防止するように条件を変化させれば（ｐＨ７．４、ここではシトシンがプロト ン化されない）、高い温度でのＡ₂₆₀の増加のみが観察される。さらに、生理学 的濃度のポリアミン（３．０ｍＭのスペルミン、これはトリプレックス形成を安 定化させる）にて、２種のＡ₂₆₀の増加パターンが回復する。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドによるフォール ドバック・トリプレックス形成に関する独立した証明はＲＮアーゼＨ加水分解分 析から 得られる。デュープレックスがアンチセンス オリゴヌクレオチド ホスホジエ ステルと標的ＲＮＡとの間で形成されると（後記実施例２）、ＲＮＡは先ず最初 にＲＮアーゼＨエンドヌクレアーゼ活性により、次いでＲＮアーゼＨエキソヌク レアーゼ活性によりＲＮアーゼＨ切断に対し感受性となる。しかしながら、フォ ールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド ホスホジエステルを 使用すれば、トリプレックス形成に関与する領域はＲＮアーゼＨエンドヌクレア ーゼ活性を抑制もしくは減少させず、ＲＮアーゼＨエキソヌクレアーゼ活性を抑 制する。かくしてデュープレックスがアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはフ ォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドの専らデュープレッ クス形成性領域とその標的核酸との間で形成されてもＲＮアーゼＨエキソヌクレ アーゼ活性は阻止されないのに対し、トリプレックスが形成される全領域にてこ の活性が阻止される。このことは、ＲＮアーゼＨを活性化するフォールドバック ・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドが望ましければ、専らデュープレッ クス形成性であってＲＮアーゼＨを活性化するヌクレオチド（たとえばヌクレオ チド ホスホジエステルもしくはホスホロチオエート）を含有するオリゴヌクレ オチドの部分を残すことのみが必要となる。観察されるＲＮアーゼＨ加水分解の 結果は、トリプレックス形成はデュープレックスの主たる溝がＲＮアーゼＨエキ ソヌクレアーゼ活性に局部的 にアクセスできないようにするという知見と一致する。何故なら、トリプレック ス形成は主たる溝を占めるオリゴヌクレオチドストランドを含むフーグスティー ン塩基対形成から生ずるからである。同一の結果がフォールドバック・トリプレ ックス形成性オリゴヌクレオチド ホスホロチオエートもしくはキメラにつき得 られる筈である。何故なら、キメラ オリゴヌクレオチドにおけるオリゴヌクレ オチドホスホロチオエートは単独でもＲＮアーゼＨ活性をＲＮＡとのデュープレ ックスにおいて活性化することが知られているからである［米国特許第５，１４ ９，７９７号参照、その教示を参考のためここに引用する］。総合して、二相変 性およびトリプレックス形成性領域特異性のＲＮアーゼＨエキソヌクレアーゼ抑 制の観察は、フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドとそ の標的核酸との間のフォールドバック・トリプレックス形成を強力に裏付ける。 これら知見は総合して次のことを示唆する。これらは、フォールドバック・トリ プレックス形成性オリゴヌクレオチドが核酸デュープレックスの主たる溝と相互 作用する酵素活性（これはたとえばポリメラーゼ活性のような全ゆる処理酵素活 性を含むと思われる）を阻害しうることを示唆する。さらに、フォールドバック ・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドとその標的との間で形成されたジッ パーもしくはクランプ−状の複合体は通常のアンチセンス オリゴヌクレオチド とは異なりリボソームによっ て破壊することができない。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは一般に少なく とも３つの構造的特徴を有し、すなわちデュープレックス形成性領域とトリプレ ックス形成性領域とリンカー領域とを有する。完全なフォールドバック・トリプ レックス形成性オリゴヌクレオチドおよび特記しない限りここで説明する各種の 構造領域につき、構造上の特徴は限定はしないが５′対３′結合リボヌクレオシ ド、２′−置換リボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドのポ リマーを有し、ヌクレオチド間結合は天然ホスホジエステル結合もしくは人工結 合、たとえばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート 、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、スルホネート、カルバ メートおよび／またはホスホトリエステル結合とすることができる。さらに、こ の種のオリゴヌクレオチドは塩基および／または糖残基に改変を有するオリゴヌ クレオチド、並びにヌクレアーゼ耐性付与置換基もしくは嵩高置換基を３′およ び／または５′末端に有するものを包含する。フォールドバック・トリプレック ス形成性オリゴヌクレオチドの例を第１表に示す。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドのデュープレッ クス形成性領域は、標的核酸配列に対し充分な相補性を有して実験的もしくは生 理学的条件下で標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチ ド配列を有することを特徴とする。好ましくは、デュープレックス形成性領域は 約８〜５０個のヌクレオチドを有し、特に好ましくは約１２〜約３５個のヌクレ オチドを有する。標的核酸は実験目的には実質的に任意のヌクレオチド配列を有 することができる。しかしながらフォールドバック・トリプレックス形成性オリ ゴヌクレオチドの治療用途もしくは医療用途については、デュープレックス形成 性領域は好ましくは特定の病気状態もしくは生理学的条件で関与する核酸のヌク レオチド配列に対し生理学的条件下でハイブリダイズするのに充分な相補性を示 すヌクレオチド配列を有する。ＨＩＶ ｇａｇ−相補性配列をデュープレックス 形成性領域に有するフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチ ドの例を第１表に示す。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドのトリプレック ス形成性領域は、デュープレックス形成性領域の鏡像であるヌクレオチド配列を 有し、したがってデュープレックス形成性領域の全部もしくは１部を有するパリ ンドームを形成することを特徴とする。換言すれば、トリプレックス形成性領域 の塩基配列は同じフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド におけるデュープレックス形成性領域の全部もしくは１部の逆反復（すなわち、 標的配列の逆補体）であり、これには如何なる塩基改変をも考慮しない。トリプ レックス形成性領域は好ましくは少なくとも約８個の ヌクレオチドを有し、デュープレックス形成性領域の全長までの任意の長さとす ることができる。好適具体例において、トリプレックス形成性領域の塩基は５− ブロモデオキシウリジンおよび／または５−メチルーシトシンを包含し、そのそ れぞれは生理学的ｐＨにて或いはその近くでフーグスティーン塩基対形成を促進 する。二環式シトシン類似体ＭＯＤＡ、α−アノマーヌクレオチドおよび／また は末端アクリジン、他の末端挿入体、またはＤＮＡ切断もしくは改変剤、たとえ ばＥＤＴＡ−ＦｅＩＩおよびｃｃ−１０６５、或いは疎水性もしくは両親媒性基 、たとえばコレステロール、シクロデキストリンもしくはトリアミンをもトリプ レックス（もしくはデュープレックス）形成性領域に存在させて、トリプレック ス安定性もしくは標的核酸破壊を促進することができる。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドのリンカー領域 は、デュープレックス形成性領域とトリプレックス形成性領域とを接続する柔軟 領域である。リンカー領域は約３〜約１０個のヌクレオチドを有するオリゴヌク レオチドとすることができる。好適具体例において、リンカー領域は約５個のヌ クレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。或いはリンカー領域は或る種の 他の柔軟化学構造、たとえば約４〜２０個の炭素原子を有する置換もしくは非置 換のアルキルもしくはアリール基（たとえばイソプロピル、ｏ−キシリル）また はリボースもしくは１′，２′−ジデオキシリボー ス鎖とすることができる。好適具体例において、リンカー領域はヘキサエチレン グリコールである。少なくとも、リンカー領域は単一の共有結合である。フォー ルドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドの或る種の好適具体例を 下表１に示す。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドが標的一本鎖核 酸とのフォールドバック・トリ プレックスを形成しうる４種の異なる方法が存在し、これらはデュープレックス 形成性領域がループもしくはリンカー領域の５′対３′側に存在するかどうかに 依存し、さらにトリプレックス形成性領域の長さに依存する。これら４種の構成 を第４図に示す。第１表に示したオリゴヌクレオチドのうち、Ｎｏ．４およびＮ ｏ．１７はＡ型フォールドバック・トリプレックスを形成する（第４図に示す） のに対し、Ｎｏ．１〜３、５〜１６、１８および１９はＣ型フォールドバック・ トリプレックスを形成すると共にＮｏ．２０および２１はＤ型フォールドバック ・トリプレックスを形成する（両者を第４図に示す）。 ＤＮＡにはゆらぎがあるので［たとえばウセリーおよびシンデム、バイオケミ ストリー、第３２巻、第６２０６頁（１９９３）参照］、フォールドバック・ト リプレックス形成性オリゴヌクレオチドはＤＮＡとのトリプレックス形成するこ とができる［たとえばヘレンおよびツールメ、バイオヒミカ・エ・バイオフィジ カ・アクタ、第９９巻、第１００頁（１９９０）参照］。 癌細胞は正常細胞よりもずっと低いｐＨを有する。たとえばルッツ Ｆ．ティ ーツェ、モレキュラ・アスペクツ・オブ・ケモテラピー：プロシーディングス・ オブザ・セカンド・インターナショナル・シンポジウム・オン・モレキュラ・ア スペクツ・オブ・ケモテラピー、第５章［Ｅ．ボロウスキーおよびＤ．シュガー 編、ペルガモンプレス社（１９９０）］参照。したがって、癌細胞に おいてのみフォールドバック・トリプレックスを形成しうるフォールドバック・ トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドを設計することができる。癌細胞にお けるオリゴヌクレオチド活性は、より短いトリプレックス形成性領域を有すると 共に好ましくは低ｐＨでプロトン化してフーグスティーン結合を形成せねばなら ない多数のシトシンを含有するフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴ ヌクレオチドを設計することにより得ることができる。 標的配列、したがってフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレ オチドのデュープレックスおよびトリプレックス形成性領域の配列を慎重に選択 することにより、テトラプレックス（ａ／ｋ／ａ クワドラプレックス）構造に 関与するオリゴヌクレオチドを形成させることも可能である。この種のオリゴヌ クレオチドは、同じヌクレオチドがテトラプレックスを形成する異なる種類のフ ーグスティーン塩基対形成に標的核酸と共に関与するのでフォールドバック・テ トラプレックス形成性オリゴヌクレオチドとして知られる。より高次元のテトラ プレックス構造が４種の順次の異なるストランドおよび専ら分子間形成につき記 載されている［たとえばチンメルマン等、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジ ー、第９２巻、第１８１〜１９２頁（１９７５）；リー等、ヌクレイック・アシ ッズ・リサーチ、第８巻、第４３０５〜４３２０頁（１９８０）；センおよびギ ルバート、 ネイチャー、第３３４巻、第３６４〜３６６頁（１９８８）および第３４４巻、 第４１０〜４１４頁（１９９０）参照］。しかしながら、これらにより一本鎖標 的核酸と共にテトラプレックス構造を形成しうる構造を持ったオリゴヌクレオチ ドについては記載されていない。この種のオリゴヌクレオチドにおいて、標的核 酸とオリゴヌクレオチドとは４つの連続したＧ塩基もしくはＡ塩基を隣接するＧ 塩基と共に有して、テトラプレックス形成に必要なテトラッドの形成を可能にす る。Ｇテトラツドは、第５図に示すように中心軸の周囲に対称配置されたフーグ スティーン方式で結合した４つのＧ塩基の水素で構成される。分子モデルにより 予測されるように、Ａテトラッドは同様に第５図に示したようにフーグスティー ン方式で結合した４つのＡ塩基の水素で構成される。Ａ４テトラッドの中心にお ける６−ＮＨ₂基の配置は構造を不安定化させると共に、テトラプレックスＤＮ Ａにおける連続するＡ４テトラッドを阻害する。しかしながら、Ａ４テトラッド 形成は、Ｇ４テトラッドの０６カルボニル酸素とＡ４テトラッドのＮ６アミノプ ロトンとの間の好適な静電荷相互作用による安定化を介し隣接するＧ４テトラッ ドにより促進することができる。同様に、Ｃ⁺４およびＵ４テトラッドも存在す ることが知られている。 フォールドバック・テトラプレックスを形成しうる本発明によるフォールドバ ック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは、テトラプレックス構造（そ の生物 学的意義については最近或る種の関心を集めているものであるが）［たとえばブ ラックバーン、ネイチャー、第３５０巻、第５６９〜５７３頁（１９９１）参照 ］を研究するのに有用である。さらに、この種のオリゴヌクレオチドは一本鎖ｍ ＲＮＡまたはデュープレックスＲＮＡもしくはＤＮＡと相互作用して、第６図に ｍＲＮＡにつき示したように複合分子ノットを形成することができる。これら構 造はｍＲＮＡから蛋白質への翻訳、またはＲＮＡもしくはＤＮＡ複製もしくは転 写を強力に抑制すると共に、細胞培養遺伝子発現調整の研究および治療剤の両用 途に有用である。 本発明によるフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは 、オリゴヌクレオチド合成につき当業界で知られた任意の方法により合成するこ とができる。たとえば米国特許第５，０４７，５２４号（その教示を参考のため ここに引用する）はオリゴヌクレオチドのホスホルアミダイト合成を教示してい る。或いは米国特許第５，４９１，７４８号（その教示を参考のためここに引用 する）はオリゴヌクレオチド合成につき最適化したＨ−ホスホネート手法を教示 している。オリゴヌクレオチドでないリンカー領域を有するフォールドバック・ トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドにつき、これら手法により合成を行う こともできるが、ただし全てのヒドロキシル基を先ず最初にたとえばジメトキシ トリチル基のような適する保護基により保護し、存在する 全アミノ基をたとえばトリフルオロアセチル基のような適する保護基により保護 し、さらに１端部にたとえばβ−シアノエチル−ホスホルアミダイトまたはＨ− ホスホネート基のような適するカップリング基を結合させなければならない。 本発明によるフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは 種々の目的に有用である。第１に、これらは核酸トリプレックス形成のインビト ロ研究に有用である。フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオ チドにおいて、たとえばヌクレオチド間結合型、塩基改変、リンカー長さ、およ び柔軟性などの多くのパラメータを変化させて生物学上重要な過程となりうるト リプレックス形成および破壊の速度論的研究を行うことができる。さらに、フォ ールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドを慣用のアンチセンス オリゴヌクレオチドの代りに組織培養および動物モデルを用いて遺伝子発現を 研究することもできる。これらシステムにおいて、フォールドバック・トリプレ ックス形成性オリゴヌクレオチドの特異性および複合体安定性の増大が有利とな る。 最後に、フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドは、特 定遺伝子の発現を含む病気もしくは生理学的症状の治療剤として有用である。特 定のフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドが処置に有用 である病気もしくは症状は、デュープ レックス形成性領域が生理学的条件下でハイブリダイズするのに充分な相補性を 有するヌクレオチド配列に依存する。多くの場合、核酸配列はウィルス核酸配列 である。各種のウィルスを抑制するアンチセンス オリゴヌクレオチドの使用は 周知されており、アグローワル、チブテク、第１０巻、第１５２〜１５８頁（１ ９９２）で最近検討されている。アンチセンス抗ウィルスから知られた知見をデ ュープレックス形成性領域に適用することができる。有効なアンチセンス オリ ゴヌクレオチドにハイブリダイズするウィルス核酸配列が、ヒト免疫不全症ウィ ルス１型（米国特許第４，８０６，４６３号、その教示を参考のためここに引用 する）、単純疱疹ウィルス（米国特許第４，６８９，３２０号、その教示を参考 のためここに引用する）、インフルエンザウィルス（米国特許第５，１９４，４ ２８号、その教示を参考のためここに引用する）およびヒト乳頭腫ウィルス［ス トレー等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１９巻、第４１０９〜４１１ ４頁（１９９１）］を含め多くのウィルスにつき記載されている。これら核酸配 列にハイブリダイズする配列をフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴ ヌクレオチドのデュープレックス形成性領域につき使用することができ、他の任 意のウィルスからの核酸配列に対し相補的なヌクレオチド配列も同様に使用でき る。フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドを作製しうる 公知の核酸配列を持った他のウ ィルスは限定はしないが口蹄疫ウィルス［ロバートソン等、ジャーナル・バイロ ロジー、第５４巻、第６５１頁（１９８５）；ハリス等、ジャーナル・バイロロ ジー、第３６巻、第６５９頁（１９８０）参照］、黄熱病ウィルス［ライス等、 サイエンス、第２２９巻、第７２６頁（１９８５）参照］、水痘−帯状疱疹ウィ ルス［ダビソンおよびスコット、ジャーナル・ゼネラル・バイロロジー、第６７ 巻、第２２７９頁（１９８６）参照］、キュウリモザイクウィルス［リチャード 等、バイロロジー、第８９巻、第３９５頁（１９７８）参照］、Ｂ型肝炎ウィル ス［ラネーおよびマックラクレン、モレキュラ・バイロロジー・オブ・ヘパチチ スＢウィルス（ＣＲＣプレス社、１９９１）参照］、Ｃ型肝炎ウィルス［ミラー およびプルセル、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、Ｕ ＳＡ、第８７巻、第２０５７〜２０６１頁（１９９０）；プロシーディング・ナ ショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８９巻、第４９４２〜４９４６ 頁（１９９２）；ジャーナル・ゼネラル・バイロロジー、第７４巻、第６６１〜 ６６８頁（１９９３）参照］、並びにＲＳウィルス（respitory Syncitiol viru s）［コリンス、ザ・パラミクソ・ウィルス、第４章、第１０３〜１６２頁（ダ ビットＷ．キングスベリー編（１９９１）参照］を包含する。或いは、デュープ レックス形成性領域は病原生物の核酸配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有 することもできる。多くの病 原生物の核酸配列についてはマラリア生物、熱帯熱マラリア原虫（プラスモディ ウム・ファルシパルム、Plasmodium falciparum）、および多くの病原性細菌を 含め記載されている。この種の病原生物からの核酸配列にハイブリダイズするヌ クレオチド配列はフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド のデュープレックス形成性領域を形成することができる。フォールドバック・ト リプレックス形成性オリゴヌクレオチドを作製しうる公知の核酸配列を持った病 原真核性生物の例は限定はしないがトリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンス（ Trypanosoma brucei gambiense）およびリーシュマニア（Leishmania）［キャン プベル等、メイチャー、第３１１巻、第３５０頁（１９８４）参照］、肝蛭（フ ァスキオラ・ヘパチカ、Fasciola hepatica）［ズリタ等、プロシーディング・ ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８４巻、第２３４０頁（１９ ８７）参照］を包含する。抗真菌性のフォールドバック・トリプレックス形成性 オリゴヌクレオチドはたとえばキチン・シンセターゼ遺伝子からの核酸配列に対 し相補的であるヌクレオチド配列を持ったデュープレックス形成性領域を用いて 作製することができ、さらに抗細菌性のフォールドバック・トリプレックス形成 性オリゴヌクレオチドはたとえばアラニン・ラセマーゼ遺伝子を用いて作製する ことができる。さらに他の具体例において、フォールドバック・トリプレックス 形成性オリゴヌクレオチドのデュ ープレックス形成性領域は細胞遺伝子もしくは遺伝子転写物（その異常な発現も しくは生成物は病気状態をもたらす）に対し相補的なヌクレオチド配列を有する ことができる。これら数種の細胞遺伝子の核酸配列についてはプリオン蛋白質［ スタールおよびプルシナー、ＦＡＳＥＢジャーナル、第５巻、第２７９９〜２８ ０７頁（１９９１）］、アルツハイマー氏病に関連するアミロイド様蛋白質［米 国特許第５，０１５，５７０号、その教示を参考のためここに引用する］、並び に各種の周知のオンコジーンおよびプロトーオンコジーン、たとえばｃ−ｍｙｂ 、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌおよびｎ−ｒａｓを含め記載されている。さらに、主 として或いは専ら精子形成、精子移動性、卵子への精子の結合または精子生存性 に影響を及ぼす他の過程に関与する構造蛋白質もしくは酵素の合成を抑制するオ リゴヌクレオチドは男性の避妊薬として使用することができる。同様に、女性用 の避妊薬は排卵、受精、着床に関与する或いはこれら過程に関するホルモン生合 成に関与する蛋白質もしくは酵素を抑制するオリゴヌクレオチドとすることがで きる。高血圧はレニン／アンギオテンシン系におけるアンギオテンシン変換酵素 もしくは関連酵素の合成を抑制するオリゴヌクレオチドにより抑制することがで き、血小板凝集は心筋および脳循環障害、梗塞、アテローム性動脈硬化症、塞栓 および血栓で使用するトロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制して 調節することができ、動脈壁に おけるコレステロールの沈着は脂肪アシル補酵素Ａ、すなわちアテローム性動脈 硬化症におけるコレステロール アシル トランスフェラーゼの合成を抑制して 阻止することができ、コリンホスホトランスフェラーゼの合成阻止は低脂血症に おいて有用である。フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチ ドを用いて障害の悪作用を減少もしくは除去しうる多くの神経障害が存在する。 たとえばモノアミンオキシダーゼ合成の抑制をパーキンソン氏病に用いることが でき、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの抑制を用いて抑欝症を処置す ることができ、さらにインドールＮ−メチルトランスフェラーゼの抑制を分裂症 の処置に用いることができる。プロスタグランジンおよびロイコトリエンをもた らすアラキドン酸カスケードにおける選択酵素の抑制は血小板凝集、アレルギー 、炎症、疼痛および喘息の抑制に有用である。各種の抗癌剤に対する耐性の発現 をもたらすと共に化学療法に主として関与する多剤薬剤耐性（ｍｄｒ）遺伝子に より発現される蛋白の抑制は癌の処置に有利であることが判明した。これら遺伝 子からの核酸配列に対し相補的なヌクレオチド配列を本発明によるフォールドバ ック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドのデュープレックス形成性領域 につき使用することができ、同様に他の任意の細胞遺伝子もしくは遺伝子転写物 （その異常な発現もしくは生成物は病気状態をもたらす）に対し相補的なオリゴ ヌクレオチド配列とすること もできる。植物細胞における遺伝子発現のアンチセンス調整については米国特許 第５，１０７，０６５号（その教示を参考のためここに引用する）に記載されて いる。デュープレックス形成性領域のヌクレオチド配列は実質的に任意の遺伝子 に対しワトソンークリック塩基対を形成すべく適合させうるので、フォールドバ ック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドの治療範囲は極めて広範囲であ る。さらに或る種の病気につき特に興味がある。たとえばＡＩＤＳ、ＡＲＣ、口 腔内もしくは陰部疱疹、乳頭腫イボ、インフルエンザ、口蹄疫、黄熱病、水痘、 帯状ヘルペス、ＨＴＬＶ−白血病および肝炎を含め各種のウィルス病をフォール ドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドにより処置することができ る。真菌病のうち、フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチ ドにより処置しうるものはカンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス症 、ブラストミセス症、アスペルギルス症、スポロトリクス症、クロモマイコーシ ス、デマトフィトーシス（dematophytosis）およびコクシジオイデス症がある。 さらに、この方法を用いてリケッチャ病（たとえばチフス、ロッキー山紅斑熱） 、並びにトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）もしくは性病性リン パ肉芽腫（Lymphogranulomavenereum）によって生ずる性的感染病を処置するこ ともできる。アメーバ症、シャーガス病、トキソプラスマ症、肺炎、ジアルジア 鞭毛虫症、クリプトスポリジオシ ス（cryptosporidiosis）、トリコモナス症およびニューモシスチ・カリニ（Pne umocystis carini）肺炎を含む各種の寄生虫症もフォールドバック・トリプレッ クス形成性オリゴヌクレオチドにより処置することができる。さらに、たとえば 回虫症、フィラリヤ症、旋毛虫症、住血吸虫症および線虫もしくは条虫感染のよ うな寄生虫（蠕虫病）も処置することができる。マラリアは熱帯熱マラリア原虫 （P．falciparum）、三日熱マラリア原虫（P．vivax）、卵形マラリア原虫（P． orale）もしくは四日熱マラリア原虫（P．malariae）のいずれによって生じたか に拘らずフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドにより処 置することができる。上記感染症は全てこれら病気の感染作用物質が既知である ためフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドにより処置す ることができ、たとえば必須遺伝子のような感染作用物質の伝梁につき必須の核 酸配列である核酸配列に対しハイブリダイズするヌクレオチド配列を持った標的 形成性領域を有する本発明によるフォールドバック・トリプレックス形成性オリ ゴヌクレオチドを作製することができる。 以下、限定はしないが実施例により本発明の或る種の好適具体例につきさらに 説明する。 実施例１ フォールドバック・トリプレックス形成の分光光度測定 標的ＲＮＡもしくはＤＮＡとフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴ ヌクレオチド（それぞれ０．２Ａ₂₆₀単位）とを乾燥させ、次いで一緒に５００ μＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解させた。この溶液を ８０℃で３０分間加熱し、ゆっくり室温まで冷却し、次いで４℃にて約１２時間 インキュベートした。次いで溶液を８０〜９０℃まで０．５℃／分の速度で加熱 し、その間にＡ₂₆₀の測定を行った。Ａ₂₆₀の増加はヘリックスの破壊を示す。こ れら試験の結果を下表２に要約する。 ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液にて初期の試験を行い、ここではシトシン がプロトン化されてグアニンに対しフーグスティーン塩基対を形成することがで きる。これら試験において、オリゴヌクレオチド１および２（第１表参照）は２ つの明瞭なＡ₂₆₀の遷移を示して相補的ＲＮＡもしくはＤＮＡに結合した（第７ 図参照）。相補的ＤＮＡを有するオリゴヌクレオチド１は５９．５℃および６５ ．８℃にてＡ₂₆₀の遷移を示した。ヘキサエチレングリコールリンカーを有する オリゴヌクレオチド２は５８．８℃および６５．６℃にて相補的ＤＮＡに対し、 また５５．３℃および６４．３℃にて相補的ＲＮＡに対しＡ₂₆₀の遷移を示した 。これらの結果は、オリゴヌクレオチド１および２がフォールドバック・トリプ レックスを形成し、すなわちＲＮＡおよびＤＮＡとのデュープレックスおよびト リプレックスの両者を形成する ことを示し、デュープレックスはほぼ予想の温度にて破壊されると共にトリプレ ックスはより低温度にて早期に破壊される。 これら結果の解釈をさらに試験するため初期の試験と同一の条件下で他の実験 を行ったが、ただし酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨを７．４とした。これら条件下 で、高い温度のＡ、₂₆₀の遷移が観察されたが、低い温度のＡ₂₆₀の遷移は消失し た。このことは、ｐＨ５．０で観察された２種の遷移に関する説明としてデュー プレックスおよびトリプレックスの形成および破壊をさらに裏付ける。何故なら 、ｐＨ７．４にてシトシンはプロトン化させず、したがってトリプレックス形成 に必要なフーグスティーン水素結合を形成しえないからである（第２図参照）。 最後に、これらオリゴヌクレオチドが生理学的条件下で相補的ＲＮＡもしくは ＤＮＡとのフォールドバック・トリプレックスを形成しうるかどうかを試験する ため、初期試験と同一の条件下でオリゴヌクレオチド４（第１表参照）を用いて 実験を行ったが、ただし酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨを７．４にすると共に３． ０ｍＭのスペルミンを含有させた。これら条件下で、２つの明瞭なＡ₂₆₀の遷移 が回復した（第８図参照）。これらの結果は、これらオリゴヌクレオチドが実際 にミリモル量のポリアミンを含む生理学的条件下でフォールドバック・トリプレ ックスが形成されうることを示す。 実施例２ デュープレックスおよびフォールドバック・ トリプレックスのＲＮアーゼＨ加水分解分析 基質としてＲＮＡを用い酵素活性に対するフォールドバック・トリプレックス 形成の作用を検査するため、ＲＮアーゼＨ加水分解分析を行った。これら試験に つき、ＨＩＶ−１ ｇａｇ ＲＮＡ配列を有する３９リボヌクレオチド（ＲＮＡ ）を用いた。３９量体、すなわち を³²Ｐで５′末端標識し、次いで異なる濃度の専らデュープレックス形成性領域 （アンチセンス）またはフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレ オチド（ＤＮＡ）と共に３０μＬの２０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ ０ｍＭ ＭｇＣｌ₂／１００ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭスペルミ ン、５％ショ糖（ｗ／ｖ）および４０単位のＲＮアシン（プロメガ社）にて４℃ で１２時間インキュベートした。次いで７μＬのアリコートを対照として取出し 、１０μＬ（０．８単位）のイー・コリ（E．coli）ＲＮアーゼＨ（プロメガ社 ）を残りに添加し、ついでこれを室温でインキュベートした。所定量をＲＮアー ゼＨ処理の開始の１分間後、１０分間後および２０分間後に抜取った。対照およ び実験用アリコートを次いで２０％の変性ＰＡＧＥにより分析した。 第９図は、これら実験から得られたオートラジオグラムを示す。これらの結果 は、フォールドバック・トリプレックス形成がＲＮアーゼＨエンドヌクレアーゼ 活性を抑制しなかったがＲＮアーゼＨのエキソヌクレアーゼ活性を抑制したこと を示す。これらの結果を第１０図に示し、ここで太矢印は観察されたＲＮアーゼ Ｈエキソヌクレアーゼ抑制部位を示し、細矢印はＲＮアーゼＨエンドヌクレアー ゼ活性の部位を示す。ＲＮアーゼＨがその基質に対し作用する場合、これは最初 にＲＮＡにおけるエンドヌクレオ分解切断をオリゴヌクレオチドの５′末端 近くにてデュープレックスおよび一本鎖接合部で行い、次いでエキソヌクレオ分 解活性によりエンドヌクレオ分解切断部位からＲＮＡを分解する。専らデュープ レックス形成性の対照（オリゴ２２）において２個のみのバンドが第９図に見ら れ、一方はＲＮアーゼＨエンドヌクレオ分解活性（遅い移動バンド）からのもの であり、他方はＲＮアーゼＨエキソヌクレアーゼ活性（速く移動するバンド）か らのものである。中間移動するバンドは、抑制がない状態でのエキソヌクレアー ゼ活性に基づき観察されない。これに対し、フォールドバック・トリプレックス 形成性オリゴヌクレオチドを用いる場合は常に数個の中間バンドが存在する。こ れらバンドは、トリプレックス形成による主たる溝の阻止に基づき数箇所でのＲ ＮアーゼＨエキソヌクレアーゼ活性の抑制を示す。 実施例３ 原理的にフォールドバック・トリプレックス形成はアンチセンス オリゴヌク レオチドに対し２つの重要な性質を付与する。（１）フォールドバック・トリプ レックス複合体はデュープレックスおよび慣用のトリプレックスよりも高い安定 性を有し、（２）フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド は慣用のアンチセンスおよびアンチジーン（トリプレックス）オリゴヌクレオチ ドよりも高い特異性を示す。 フォールドバック・トリプレックスを形成しうる数種 のオリゴヌクレオチドを設計して上記２つの特性をさらに検査した（第１１図参 照）。標的としてはＨＩＶ−Ｉのｇａｇ ｍＲＮＡ領域からの１６塩基長ホモプ リントラックを選択し、これを３０塩基長の配列に含ませた（配列Ｎｏ．２３、 第１１図）。オリゴヌクレオチド配列Ｎｏ．２４および２５は、第１１図に示し たようにフォールドバック・トリプレックス形成により標的に結合すると思われ る。オリゴヌクレオチド２６は、デュープレックス形成によってのみ標的に結合 する。延長領域は、ミスマッチ配列であるためトリプレックスを形成しない。こ のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド２４および２５が予想通り、フォ ールドバック・トリプレックスを形成するかどうかを証明するための対照として 役立つ。オリゴヌクレオチド２７はデュープレックス形成により標的に結合する 。オリゴヌクレオチド２８は慣用のトリプレックス形成性配列である。 熱変性試験 熱融解試験を１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０および７．４）；９８ｍ Ｍ酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ５．０および６．５） の各緩衝液で行った。各アンチセンス オリゴヌクレオチド（配列Ｎｏ．２４〜 ２８）の０．２Ａ₂₆₀単位を等量の標的配列Ｎｏ．２３と混合し、高速減圧で乾 燥させた。乾燥したオリゴヌクレオチドを適する緩衝液に溶解させ、 ９５℃で１０分間加熱し、ゆっくり室温まで冷却し、次いで４℃に１晩放置した 。各試料の融解温度を、パーキン・エルマー・ラムダ２型分光光度計を熱制御器 に取付けて測定した。加熱速度は０．５℃／分とした。第１の誘導曲線から計算 されたＴ_m値を第３表に示す。９８ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭの塩化 マグネシウム（ｐＨ５．０の緩衝液）における典型的な融解曲線およびその最初 の誘導プロットを第１２図に示す。 Ｎｏ．２３と二本鎖構造のみを形成するオリゴヌクレオチド２７は酢酸ナトリ ウムおよび塩化マグネシウム （ｐＨ５．０の緩衝液）にて５１．３℃のＴ_mを示した。同じ条件下でオリゴヌ クレオチドＮｏ．２３、２７および２８により形成された慣用のトリプレックス は２つの明瞭な融解遷移を示し、一方は２０．５℃であり、他方は５２．１℃で ある。低温度の遷移は第３ストランドのオリゴヌクレオチド２８の解離に起因し 、また高温度遷移はオリゴヌクレオチド２３および２４のデュープレックスの変 性を示す。オリゴヌクレオチド２４および２５は独立してＮｏ．２３と共に同一 条件下でそれぞれ５８．８℃および５９．４℃のＴ_mを示した。他の明瞭な遷移 は慣用のトリプレックスの場合と同様に観察されなかった（第１２図参照）。ト リプレックス形成性領域におけるミスマッチのためデュープレックスのみを形成 する対照オリゴヌクレオチドＮｏ．２６は４８．２℃のＴ_mを有する。これは、 オーバーハング配列がデュープレックス構造の末端の剥離に寄与し、したがって 低いＴ_mをもたらすことを示唆する。同様に、オリゴヌクレオチド２４および２ ５の場合は、このオリゴヌクレオチドのトリプレックス形成性領域が結合しなけ れば、オリゴヌクレオチド２６の場合と同様に低いＴ_mが予想される。これは、 シトシンがプロトン化されずかつ完全なトリプレックス形成が可能でない条件で あるｐＨ７．４の緩衝液にて明瞭に観察できる（第３表）。これら条件下で、オ リゴヌクレオチド２３とオリゴヌクレオチド２４、２５および２６とにより形成 された複合体は独立して同様なＴ_m を有し、これらはオリゴヌクレオチド２７で得られるＴ_mよりも低い。これらの 結果は、全てを総合してフォールドバック・トリプレックスが適する条件下で形 成されると共に慣用のアンチセンス デュープレックスおよびアンチジーントリ プレックス構造よりも安定であることを明かに示す。フォールドバック・トリプ レックス形成は、形成される全ての複合体の安定性に寄与する。 実施例４ ＤＮアーゼＩ加水分解分析 実施例３で検討したと同じオリゴヌクレオチドを用い、２種の方法によりＤＮ アーゼＩ加水分解分析を行った。分光光度法： ＤＮアーゼＩは、マグネシウムイオンの存在下にデオキシリボ核酸を、たいし た配列選択性なしにモノヌクレオチドレベルまで加水分解するエンドヌクレアー ゼである。二本鎖ＤＮＡは完全な基質であり、一本鎖ＤＮＡも或る程度まで加水 分解される。ＤＮＡが短片およびモノマーまで加水分解されると、２６０ｎｍに おけるＤＮＡの吸光度が増大する。この実験において、ＤＮアーゼＩによる二本 鎖および一本鎖オリゴヌクレオチドの加水分解に基づく経時的な吸光度増加の程 度を測定した。ＤＮアーゼＩは三本鎖ＤＮＡ構造を加水分解しない。 上記したように試料を作製した。各試料を２０℃にて１０分間にわたり平衡化 させ、４単位のＤＮアーゼＩを 添加すると共に混合し、次いで２６０ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてパ ーキン・エルマー・ラムダ２型分光光度計で記録した。 第１３図は一本鎖、二本鎖および三本鎖構造の経時的な加水分解パターンを示 す。Ｎｏ．２４および２５とＮｏ．２３との複合体はＤＮアーゼＩの作用に対し 極めて耐性であり、一本鎖および二本鎖とは異なる構造を示す。しかしながら、 オリゴヌクレオチド２６（これはトリプレックスを形成しない）および２７（こ れはデュープレックスのみを形成する）は急速に加水分解される。一本鎖である 標的オリゴヌクレオチド２３も切断されるが、二本鎖よりも遅い速度である。オ リゴヌクレオチド２３、２７および２８で形成される慣用のトリプレックスはＤ ＮアーゼＩに対し耐性である。しかしながら、慣用のトリプレックスの低安定性 に基づき経時的な遅い切断が見られる。ゲル電気泳動法： ³²Ｐで５′末端標識されたオリゴヌクレオチド２３をこの目的に使用する。標 的配列２３を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより³²Ｐで５′末端標識した。 ３０００〜５０００ｃｐｍに相当する末端標識のオリゴヌクレオチドを適当な量 の同じ冷オリゴヌクレオチドに０．２Ａ₂₆₀単位の濃度まで添加し、等量のアン チセンス オリゴヌクレオチド（配列Ｎｏ．２４〜２８）を１００ｍＭの酢酸ナ トリウム（ｐＨ５．０）、１０ｍＭの塩化マ グネシウム緩衝液中で混合し、９５℃まで加熱し、冷却し、次いで熱変性試験の 項目に記載したように４℃で１晩放置した。次いで各試料を２単位のＤＮアーゼ Ｉにより２０℃にて１０分間処理し、加水分解生成物を７Ｍの尿素を含有する２ ０％変性ポリアクリルアミドゲルにて分析した。 ＤＮアーゼＩの存在下における異なる複合体の加水分解パターンを示すオート ラジオグラムを第１４図に示す。これから明かに見られるように、一本鎖構造の オリゴヌクレオチド２３と、Ｎｏ．２３によって形成されたオリゴヌクレオチド ２６とオリゴヌクレオチド２７の二本鎖構造のものは完全に切断される（それぞ れレーン６、２および１）。これに対し、オリゴヌクレオチド２４および２５で 形成されたフォールドバック・トリプレックス構造は極めて耐性であり（それぞ れレーン４および５）、慣用のトリプレックスは或る程度まで加水分解される（ レーン３）。これはフォールドバック・トリプレックスの形成および慣用のトリ プレックス構造よりも高い安定性をさらに示している。 実施例５ ゲル移動性シフト分析 実施例３で検討したと同じオリゴヌクレオチドを用い、ゲル移動性シフト分析 によりフォールドバック・トリプレックス形成をさらに検査した。原理的に、未 変性ゲル にてトリプレックス構造はその分子量に基づきデュープレックス構造よりも遅く 移動する。実施例４のゲル電気泳動の項目に記載したと同じ方法を用いたが、た だし緩衝液は塩化マグネシウムを含有せず、さらに試料をＤＮアーゼＩで処理し なかった。試料を、尿素を含有しない２０％未変性ポリアクリルアミドゲルで分 析した。典型的なオートラジオグラムを第１５図に示す。このオートラジオグラ ムはオリゴヌクレオチド２３単独（レーン１）およびオリゴヌクレオチド２７の 存在（レーン２）、オリゴヌクレオチド２７および２８の存在（レーン３）、オ リゴヌクレオチド２４の存在（レーン４）、オリゴヌクレオチド２５の存在（レ ーン５）およびオリゴヌクレオチド２６の存在（レーン６）を示す。オリゴヌク レオチド２４および２５の複合体は、実際に一本鎖、二本鎖および慣用のトリプ レックス構造よりも遅くゲル上で移動するフォールドバック・トリプレックスを 形成する。オリゴヌクレオチド２４および２５の複合体はオリゴヌクレオチド２ ６の複合体よりも若干速く移動したが、全複合体の分子量および電荷は同じであ る。これは、オリゴヌクレオチド２４および２５で形成された複合体の高次元か つ緻密な構造に起因する。これはフォールドバック・トリプレックスの形成をさ らに裏付ける。同様な結果がＲＮＡ標的でも得られる。 実施例６ フォールドバック・トリプレックス形成性 オリゴヌクレオチドの配列特異性 フォールドバック・トリプレックス オリゴヌクレオチドは標的配列を２回読 取り、すなわち最初に標的とのデュープレックスを形成する際および２回目は既 に形成されたデュープレックスにフォールドバックしてトリプレックスを形成す る際に読み取る。このため、これらオリゴヌクレオチドは慣用のアンチセンス（ 一本鎖標的とのデュープレックスのみを形成する）およびアンチジーン（これは 二本鎖標的とのトリプレックスを形成する）オリゴヌクレオチドよりも高い特異 性を示すと予想された。 フォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチドの配列特異性を 検査するため、この配列を同様に標的とするが数箇所にてミスマッチを有する数 種のオリゴヌクレオチドを合成し、これらをオリゴヌクレオチド２５および２７ での熱融解実験により試験した。その結果を、オリゴヌクレオチド２３、すなわ ち完全マッチした標的と比較して、標的におけるミスマッチに基づくＴ_mの変化 （ΔＴ_m）として第４表に示す。全ての場合、ΔＴ_mはデュープレックス形成性オ リゴヌクレオチド２７の場合よりもフォールドバック・トリプレックス形成性オ リゴヌクレオチド２５の場合に大であり、これはオリゴヌクレオチド２５が慣用 のアンチセンス オリゴヌクレオチド２７よりも高い特異性を標的に対し有する こ とを示す。 配列の説明 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：カンジマラ、エカンバー Ｒ．、 アグローワル、スジア （ｉｉ）発明の名称：フォールドバック・トリプレッ クス形成性オリゴヌクレオチド （ｉｉｉ）配列の数：２２ （ｉｖ）通信： （Ａ）宛先：アレグレッティ＆ウィトコフ・リミテ ッド社 （Ｂ）町名：１０サウス・ワッカー・ドライブ （Ｃ）都市名：ボストン （Ｄ）州名：マサチューセッツ （Ｅ）国名：Ｕ．Ｓ．Ａ． （Ｆ）ＺＩＰ：０２１０９ （ｖ）コンピュータ解読フォーム： （Ａ）メジア種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＳコンパティブル （Ｃ）操作システム：ＰＣ−Ｄ０Ｓ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエアー：パテント・イン・リリース Ｎｏ．１．０、バーションＮｏ．１．２５ （ｖｉ）出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人の情報： （Ａ）氏名：グリーンフィールド、Ｓ．ミカエル （Ｂ）登録番号：３７，１４２ （Ｃ）参照番号：９３，０００−Ａ （ｉｘ）電信情報： （Ａ）電話：６７１／３４５−９１００ （Ｂ）テレファックス： ６１７／３４５−９１１１ （Ｃ）テレックス：なし （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定（Hypothetical） ：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６の情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖型：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：なし （ｉｖ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年３月９日 【補正内容】 請求の範囲 １． 以下に示す配列から選択されるいずれかの配列を有するフォールドバック ・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド： ただし、Ｌ^*はヘキサエチレングリコールである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ 9454−4Ｃ ＡＥＤ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ 8615−4Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 標的核酸とのデュープレックスを形成するデュープレックス形成性領域と 、デュープレックス形成性領域と標的核酸との間で形成されたデュープレックス とトリプレックスを形成するトリプレックス形成性領域と、およびデュープレッ クス形成性領域とトリプレックス形成性領域とを接続するリンカー領域とを備え るフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド。 ２． デュープレックス形成性領域が約８〜約５０個のヌクレオチドを有する請 求項１に記載のフォールドバック・トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド。 ３． トリプレックス形成性領域がデュープレックス形成性領域の約８〜約５０ 個のヌクレオチドの逆反復である請求項２に記載のフォールドバック・トリプレ ックス形成性オリゴヌクレオチド。 ４． リンカー領域がオリゴヌクレオチド、約４〜約２０個の炭素原子を有する 置換もしくは未置換のアルキルもしくはアリール基および化学結合よりなる群か ら選択される化学置換基である請求項３に記載のフォールドバック・トリプレッ クス形成性オリゴヌクレオチド。 ５． オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のデュープレックスおよびデュープ レックスとオリゴヌクレオチドとの間で形成されたトリプレックスとを備えるフ ォールドバック・トリプレックス。 ６． 標的核酸が一本鎖ＲＮＡである請求項５に記載のフォールドバック・トリ プレックス。