DE69534864T2 - Ribozyme gegen eine HIV Tat Sequenz - Google Patents

Ribozyme gegen eine HIV Tat Sequenz Download PDF

Info

Publication number
DE69534864T2
DE69534864T2 DE69534864T DE69534864T DE69534864T2 DE 69534864 T2 DE69534864 T2 DE 69534864T2 DE 69534864 T DE69534864 T DE 69534864T DE 69534864 T DE69534864 T DE 69534864T DE 69534864 T2 DE69534864 T2 DE 69534864T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cell
hiv
sequence
ribozyme
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69534864T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69534864D1 (de
Inventor
Geoffrey P. Rose Bay Symonds
Lun-Quan Eastwood Sun
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gene Shears Pty Ltd
Original Assignee
Gene Shears Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/178,082 external-priority patent/US5712384A/en
Application filed by Gene Shears Pty Ltd filed Critical Gene Shears Pty Ltd
Publication of DE69534864D1 publication Critical patent/DE69534864D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69534864T2 publication Critical patent/DE69534864T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • Überall in dieser Patentanmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen durch Autor und Jahr innerhalb von Klammern Bezug genommen. Die vollständigen Literaturbezugsstellen sind alphabetisch nach dem experimentellen Abschnitt aufgelistet. Diese Veröffentlichungen beschreiben, in ihrer Gesamtheit, den Stand der Technik, welcher diese Erfindung angehört.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
  • RETROVIREN
  • Retroviren sind Viren mit RNA als ihrem genomischen Material. Sie verwenden Wirtszellen für ihre Replikation durch stabiles Integrieren einer cDNA-Kopie ihrer genomischen RNA in das Wirtszellgenom (Miller, 1992, und Brown, 1987). Das virale Genom besteht aus einer langen terminalen Wiederholungseinheit (LTR, Long Terminal Repeat) an jedem Ende (5' und 3') der proviralen cDNA-Form des Virus. Fortschreitend von 5' nach 3' besteht das LTR aus U3- und U5-Sequenzen, verknüpft durch eine kurze Sequenz, welche als R bezeichnet wird. Die Transkription beginnt innerhalb des 5'-LTR und endigt an einer Polyadenylierungsstelle innerhalb des 3'-LTR. Benachbart zu den LTRs sind kurze Sequenzen, notwendig zum Primen von Positiv- und Negativ-Strang-DNA-Synthese durch reverse Transkriptase. Splice-Donor- und -Akzeptor-Sequenzen sind ebenfalls innerhalb des Genoms vorhanden, und diese sind an der Herstellung von subgenomischen RNA-Spezies beteiligt. Direkt proximal zum 5'-LTR befindet sich eine Sequenz, die für die Einkapselung von viraler RNA zu Virionen notwendig ist. Diese wird als die Psi-Verpackungssequenz bezeichnet. Sie ist ein wesentliches und spezifisches Signal, welches gewährleistet, dass die virale RNA verpackt wird. Die Masse der viralen RNA besteht aus den replikativen Genen gag, pol und env, welche jeweilig Kernproteine (gag), die Enzyme Integrase, Protease und Reverse-Transkriptase (pol) bzw. Hüllproteine (env) codieren.
  • Eine retrovirale Infektion einer Zelle wird durch die Wechselwirkung viraler Glycoproteine mit zellulären Rezeptoren eingeleitet (A) (siehe 1). Im Anschluss an Adsorption und Freisetzung aus der Hülle bzw. Uncoating tritt die virale RNA in die Zielzelle ein und wird durch die Wirkung von reverser Transkriptase, einem Enzym, welches innerhalb des Virions mitgeführt wird, in cDNA umgewandelt (B). Die cDNA nimmt eine zirkuläre Form ein (C), wird zu doppelsträngiger cDNA umgewandelt und wird dann durch die Wirkung von Integrase in die genomische DNA der Wirtszelle integriert (D). Sobald sie integriert wurde, wird provirale cDNA von dem Promotor innerhalb des 5'-LTR transkribiert (E). Die transkribierte RNA wirkt entweder als mRNA und wird translatiert, um die viralen Proteine herzustellen (F), oder wird als werdende virale RNA belassen. Diese virale RNA enthält eine Psi-Verpackungssequenz, welche wesentlich für ihre Verpackung zu Virionen ist (G). Sobald das Virion hergestellt ist, wird es aus der Zelle durch Knospung aus der Plasmamembran freigesetzt (H). Im Allgemeinen verursachen Retroviren keine Lysis der Wirtszelle; HIV ist eine Ausnahme hierfür. Die provirale cDNA bleibt stabil in dem Wirtsgenom integriert und wird mit der Wirts-DNA repliziert, so dass Nachkommenzellen ebenfalls das Provirus erben. Potenzielle antivirale Mittel können auf jeden dieser replikativen Kontrollpunkte abzielen.
  • HUMANES IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS (HIV)
  • HIV gehört der Klasse der Retroviren an, und seine Replikation ist wie oben skizziert beschaffen. Der Eintritt von HIV in Zellen, einschließlich T-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen, wird im Allgemeinen bewirkt durch die Wechselwirkung des gp120-Hüllproteins von HIV mit einem CD4-Rezeptor auf der Zielzell-Oberfläche. Die Aminosäuresequenz von gp120 kann in verschiedenen Patienten (oder sogar demselben Patient) in hohem Maße variabel sein, was eine Impfstoff-Herstellung sehr schwierig macht (Brown, 1987, und Peterlin et al., 1988). Diese Variabilität scheint mit dem Krankheitsfortschritt assoziiert zu sein. Die hauptsächlichen Besonderheiten für HIV bestehen darin, dass i) es (wie für andere Mitglieder der Gruppe Lentivirus) eine Latenzphase besitzt, in welcher das Provirus im Anschluss an die Integration in das Wirtszellgenom inaktiv bleiben kann, und ii) es für T-Lymphozyten-Zielzellen cytopathisch ist. HIV beginnt die Replikation, nachdem Zellen, die das Provirus beherbergen, aktiviert werden. Der Stimulus (oder Stimuli) für die Zellaktivierung und die begleitende virale Replikation sind noch nicht in klarer Weise identifiziert worden (Brown, 1987, und Peterlin et al., 1988). Wie bei allen Retroviren werden gag-, pol- und env-Genprodukte zu strukturellen und enzymatischen Proteinen translatiert. Im Falle von HIV gibt es zusätzliche regulatorische Gene. Spezifisch werden tat- und rev-Genprodukte zu regulatorischen Proteinen translatiert und wirken als transkriptionelle Enhancer zum Induzieren hoher Spiegel an Genexpression. Nef ist ein anderes regulatorisches Gen, welches zum Modulieren viraler Replikationsspiegel dient (Jones, 1989, Greene, 1990, und Epstein, 1991).
  • HIV-Replikation ist am höchsten in aktivierten und proliferierenden Zellen; eine zelluläre Aktivierung führt zu der Bindung von nukleären Transkriptions- und zellulären Enhancer-Faktoren an das HIV-LTR, was zu erhöhten Transkriptionsspiegeln führt. Wie bei allen Retroviren, ist die Verpackungsregion (Psi) eine auf dem HIV-Genom vorhandene cis- wirkende RNA-Sequenz, die für die Einkapselung der genomischen RNA notwendig ist. Die Bildung eines Kerns, welcher gag-Proteine, pol-Enzyme und virale RNA beinhaltet, ist die letzte Stufe des HIV-Replikationszyklus. Dieser Kern erhält eine Membran und verlässt die Zelle durch Knospung über die Zellmembran (Peterlin et al., 1988, Jones, K. A., 1989, Greene, 1990, und Epstein, 1991).
  • Bis heute ist eine Anzahl von Mitteln für die Unterdrückung der HIV-Replikation untersucht worden. Es folgt eine Beschreibung bestimmter Mittel, mit denen auf die replikativen Stufen, die in 1 repräsentiert sind, abgezielt wurde.
  • (A) Virale Adsorption an die Zielzelle
  • Lösliches CD4 ist in einem Versuch eingesetzt worden, einen hohen Anteil der viralen Rezeptoren zu besetzen, so dass das Virus nicht in der Lage ist, an die Zellmembran zu binden. Allerdings hat sich dies bis heute nicht als eine erfolgreiche therapeutische Strategie erwiesen (Stevenson et al., 1992). Sulphatierte Polysaccharide haben eine Fähigkeit aufgezeigt, HIV-Infektion zu inhibieren, möglicherweise durch Unterbrechen der Zell-Virus-Verschmelzung (McClure et al., 1992). Antikörper gegen HIV selbst, die Wirtszellrezeptoren oder HIV-Hüllendeterminanten sowie CD4-konjugiertes Exotoxin (Stevenson et al., 1992) sind andere mögliche Verfahren zur Unterbrechung des viralen Eintritts in eine Zelle.
  • (B) Herstellung von cDNA durch Reverse Transkriptase
  • Chemikalien, wie Azidothymidintriphosphat (AZT) inhibieren festgestelltermaßen Reverse Transkriptase in vitro. AZT wird derzeitig sowohl routinemäßig an AIDS-Patienten als auch dann, wenn sie Knochenmarktransplantationen empfangen, verabreicht, Letzteres in einem Bestreben, das normale Mark vor zurückbleibendem HIV zu schützen (Miller, 1992).
  • (C) Translokation der cDNA aus dem Cytoplasma in den Zellkern
  • Es kann möglich sein, die cDNA-Translokation durch Zellkernporen oder Zellkerntransport selbst zu unterbrechen, aber dies hat sich noch nicht als erfolgreich herausgestellt.
  • (D) Integration der cDNA in das Wirtsgenom
  • Es kann ebenfalls möglich sein, die Integration der proviralen cDNA in das Wirtszellgenom zu blockieren (Stevenson et al., 1992). Bis heute gibt es keine Kandidaten-Verbindungen, welche sich als effektiv erwiesen haben.
  • (E) Provirale Transkription
  • 5,6-Dichlor-1-beta-D-ribofuranosyl-benzimidazol stört bekannterweise die transkriptionelle Elongation (Stevenson et al., 1992). Sinn-TAR-Analoge können ebenfalls die Transkription beeinflussen durch Bindung des tat-Proteins, wodurch dessen Fähigkeit, HIV zu aktivieren, inhibiert wird (Miller, 1992, und Sullenger et al., 1990).
  • (F) Translation von HIV-mRNA
  • Antisinn-RNA kann, durch Bindung an virale RNA, virale Replikation inhibieren (Sczakiel et al., 1992). Bindung an mRNA kann dazu dienen, Translation zu inhibieren; Bindung an die werdende virale RNA kann ebenfalls zum Inhibieren einer produktiven Verpackung von RNA zu Virionen wirken.
  • (G) Virale Verpackung und Produktion von reifen Virionen
  • Protease induziert eine spezifische Spaltung des HIV-Polyproteins. Diese Aktivität ist wesentlich für die Herstellung reifer, infektiöser Virionen. Von mehreren Verbindungen, wie α,α-Difluorketonen, ist festgestellt worden, HIV-Protease zu inhibieren, und sie haben einen gewissen Grad an antiviraler Aktivität in Gewebekultur aufgezeigt. Allerdings haben die meisten Protease-Inhibitoren eine kurze Serum-Halbwertszeit, rasche Klärung durch Galle und geringe orale Verfügbarkeit aufgezeigt (Debouck, 1992).
  • RIBOZYME
  • Ribozyme sind enzymatische RNAs, welche RNA spalten und einen 'Turnover' aufzeigen. In einigen Klassen von Ribozymen können sie, durch die Zufügung von komplementären Sequenzarmen, dazu in die Lage versetzt werden, mit einer spezifischen Ziel-RNA zu paaren und eine Spaltung an spezifischen Stellen entlang des Phosphodiester-Grundgerüsts von RNA zu induzieren (Haseloff et al., 1988; Rossi et al., 1992; Hampel, 1990; Ojwang, 1992). Das Hammerkopf-Ribozym ist klein, einfach und besitzt eine Fähigkeit, die ortsspezifische Spaltung aufrecht zu erhalten, wenn es in eine Vielzahl von flankierenden Sequenzmotiven eingebunden wird (Haseloff et al., 1988, Rossi et al., 1992). Diese Merkmale machen es besonders gut geeignet für eine Genunterdrückung.
  • RIBOZYME GEGEN DAS TAT-GEN VON HIV
  • Ribozyme, welche gegen Stellen im tat-Gen von HIV-1 gerichtet sind, wurden in der Literatur berichtet, spezifisch gegen die Stelle 1 (Crisell et al., 1993) und die Stelle 3 (Lo et al., 1992), wie veranschaulicht in der 13.
  • Ein Mehrfachribozym-Expressionsvektor, welcher unter anderem auf das tat-Gen von HIV-1 abzielt, wird ebenfalls in Ohkawa et al. (1993) offenbart. Allerdings weist keine dieser Veröffentlichungen nach, dass die spezifische Zielstelle an Nukleotid 5849 des tat-Gens von HIV-1 vorteilhafte Eigenschaften an Ribozyme, welche auf diese Stelle abzielen, vermittelt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
  • Diese Erfindung richtet sich auf eine Oligonukleotid-Verbindung, welche ein Ribozym umfasst, das auf die GUA-Zielstelle an Nukleotid 5849 des HIV-1-Isolats SF-2 oder eine entsprechende Zielstelle von anderen HIV-1-Isolaten abzielt, wobei es sich bei der Verbindung entweder handelt um:
    • – ein Einzel-Ribozym, oder
    • – ein Mehrfach-Ribozym, das auf verschiedene Stellen innerhalb von tat abzielt.
  • Diese Erfindung offenbart des Weiteren eine synthetische, nicht natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung, welche Nukleotide, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definieren, und Nukleotide, deren Sequenz in der Lage ist, mit einer vorbestimmten Zielsequenz innerhalb einer Verpackungssequenz eines RNA-Virus zu hybridisieren, umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der viralen Verpackungssequenz um eine Retrovirus-Verpackungssequenz und in einer Ausführungsform um die Psi-Verpackungssequenz von HIV-1. Bei dem RNA-Virus kann es sich um HIV-1, Felines Leukämie-Virus, Felines Immundefizienz-Virus oder eines der Viren, welche in Tabelle 6 aufgelistet sind, handeln. Die konservierte katalytische Region kann aus einem Hammerkopf-Ribozym, einem Haarnadel-Ribozym, einem Hepatitis-Delta-Ribozym, einem RNAse-P-Ribozym, einem Gruppe-I-Intron, einem Gruppe-II-Intron abgeleitet sein. Die Erfindung offenbart auch Mehrfach-Ribozyme und Kombinationen von Ribozymen und Antisinn, welche gegen das RNA-Virus zielgerichtet sind, und solche Kombinationen, welche ferner PolyTAR-, RRE- oder TAR-Köder einschließen. Vektoren oder Ribozyme mit oder ohne Antisinn und PolyTAR-, RRE- oder TAR-Köder werden ebenfalls beschrieben. Ferner werden Verfahren zur Anwendung ex vivo beschrieben.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1. Replikationszyklus eines typischen Retrovirus.
    • (A) Das Virus bindet an Zelloberflächenrezeptoren auf der Zielzelle, und die genomische RNA tritt im Anschluss an Verschmelzung und Freisetzung aus der Virenhülle in die Zielzelle ein.
    • (B) Eine reverse Transkription findet statt, welche zur Umwandlung von viraler RNA zu cDNA führt.
    • (C) cDNA tritt in den Zellkern ein und wird in eine zirkuläre Form umgewandelt.
    • (D) Die cDNA wird dann in das Wirtszellgenom integriert.
    • (E) Transkription des Provirus zur Herstellung von viraler RNA und mRNA.
    • (F) Die Translation produziert virale Proteine.
    • (G) Der virale Kern wird aus den viral codierten Proteinen gebildet, und virale RNA wird verpackt.
    • (H) Der Kern erhält eine Membran und verlässt die Zelle durch Knospung durch die Zellmembran.
  • 2. Ribozym-Zielstellen innerhalb der Psi-Verpackungsregion von Mo-MLV.
  • Die Mo-MLV 5'-Region repräsentiert ein BalI/BalI-Fragment (nt 212 bis nt 747) von pMLV-1 (definiert im Text). Pfeile gegen die Ribozym-Zielstellen an, welche alle GUC-Reste waren.
  • 3. Genom von Moloney-Maus-Leukämie-Virus
  • Das Genom von MoMLV besteht aus den replikativen Genen gag, pol und env und den 5'- und 3'-gelegenen langen terminalen Wiederholungseinheiten (LTRs). Die Psi-Verpackungsstelle ist für eine Verpackung der viralen RNA in das Virion notwendig.
  • 4. Anti-Mo-MLV- und Anti-HIV-Verpackungsstellen-Konstrukte.
  • Die standardmäßigen Expressionskonstrukte basierten auf pSV2neo und bestanden aus dem SV40-Promotor stromaufwärts des neor-Gens, wobei eines der entworfenen Ribozyme oder eine zur Psi-Verpackungssequenz komplementäre Antisinn-Sequenz (Anti-Psi) in die Sma-I-Stelle von neor inseriert war.
  • 5. Abzielen auf die HIV-Verpackungsstelle
  • Die Figur zeigt eine vereinfachte Ansicht des HIV-Genoms, wobei mit dem Ribozym 9 auf eine Sequenz innerhalb der Psi-Verpackungsstelle abgezielt wird.
  • 6. In vitro-Spaltung von in vitro erzeugter Mo-MLV-Verpackungsregion-RNA durch Ribozyme.
  • Spur 1 ist pBR322-Marker-DNA, welche mit HinfI verdaut wurde. Spur 2 ist das ungefähr 550 kb große Substrat. Die Spuren 3, 5, 7 und 9 waren das in vitro erzeugte Rz243, Rz274, Rz366 und Rz-M7 allein. Die folgenden Ribozyme wurden zu Zielsubstrat-RNA zugegeben: Spur 4 Rz243; Spur 6 Rz274; Spur 8 Rz366; Spur 10 Rz-M7. Die Spaltungsreaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37°C in 10 mM MgCl2, 50 mM Tris.Cl, pH 7,5, ausgeführt, nachdem die Proben bei 80°C 2 Minuten lang in 10 mM Tris.Cl, pH 7,5, erwärmt worden waren.
  • 7. Southern-Hybridisierung von DNA aus den mit Ribozym- oder Antisinn-Konstrukt transfizierten Zelllinien.
  • Genomische DNA (10 μg) aus 3T3-Mo-MLV-Zellen, welche mit den verschiedenen Konstrukten transfiziert wurden: Spur 1, pSV243; Spur 2, pSV274; Spur 3, pSV366; Spur 4, pSV-M7; Spur 5, pSVAs-Psi; und Spur 6, pSV2neo-Vektor allein, wurden mit HindIII/NruI verdaut, auf einem 0,6%igen Agarose-Gel aufgetrennt, auf Nitrozellulosefilter geblottet und mit der 32P-markierten neor-Gensonde hybridisiert. Pfeilspitzen geben die vorhergesagte Größe des neor-Gens allein (1,34 kb) und des neor-Gens plus den Einzel-Ribozymen (1,38 kb), plus einem Mehrfach-Rz (1,98 kb) oder plus Antisinn (1,89 kb) an.
  • 8. RNase-Protektions-Analyse zur Untersuchung der Expression von Ribozym/-Antisinn-Konstrukten.
  • 20 μg Gesamt-RNA aus einer Reihe von transfizierten Zellen wurde hinsichtlich der Expression der Ribozyme oder Antisinn-Konstrukte unter Verwendung von 32P-markierten Ribosonden analysiert. Spur 1: Größenmarker, endmarkierte DNA-Fragmente von pBR322, verdaut mit HinfI; Spur 2: Ribosonde von RzM7, hybridisiert mit Hefe-RNA und verdaut mit RNase; Spur 3: Ribosonde von RzM7, hybridisiert mit Hefe-RNA, ohne anschließenden RNase-Verdau; Spuren 4-8, Ribosonden von Rz243, Rz274, Rz366, RzM7 und As-Psi, hybridisiert mit RNA aus Zellen, welche jeweilig transfiziert waren mit pSV243, pSV274, pSV366, pSV-M7 und pSVAs-Psi, und verdaut mit RNase; Spuren 9-13: Ribosonden von RzM7, Rz243, Rz274, Rz366 und As-Psi allein. Ein Klon für jedes Konstrukt, welcher die beste Unterdrückung der Mo-MLV-Replikation zeigte, wurde in dem Assay verwendet.
  • 9. Autoradiographie eines Dot-Blots von viraler RNA, abgeleitet aus verschiedenen Mo-MLV-erzeugenden 3T3-Zellen.
  • Virale RNA-Präparationen bei den Verdünnungen 1:1, 1:5 und 1:10 wurden sondiert mit einer 32P-markierten, komplementär zur Mo-MLV-Psi-Verpackungsregion, wie früher beschrieben. Spur 1: Hefe-RNA; Spuren 2-7: RNA aus Überständen von 3T3-Mo-MLV-Zellen, welche transfiziert worden waren mit pSV243, pSV274, pSV366, pSV-M7, pSVAs-Psi und pSV2neo. Es kann ersehen werden, dass virale RNA-Spiegel durch die Ribozyme, welche zur Spaltung von RNA-Zielmolekülen in vitro wirksam sind, und durch den Antisinn gesenkt werden.
  • 10. p24-Spiegel in einem Langzeit-Assay
  • Die Histogramm-Grafik zeigt Daten für die HIV-Replikation, wie gemessen durch die p24-Spiegel an den Tagen 8, 13 und 22 für Ribozym 9 (Rz-9), das Ribozym-Konstrukt, welches auf die HIV-Verpackungsstelle zielgerichtet war. Vektor ist das Kontrollkonstrukt. Rz-2 und Rz-M sind zwei Ribozym-Konstrukte, die auf das tat-Gen von HIV abzielen. Rz-M ist ein Mehrfach-Ribozym, welches mehrere Ribozyme enthält, die gegen verschiedene Stellen innerhalb von tat zielgerichtet sind. Dies schließt die Stelle ein, welche von Rz-2 angezielt wird.
  • 11. Die Anti-HIV-1-tat-Ribozyme wurden gemäß den Sequenzdaten des HIV-1-Isolats SF2 aus Genebank (LOCUS: HIVSF2CG) entworfen. Zielstellen sind GUC (Rz 1), GUA (Rz 2), GUC (Rz 3) und CUC (Rz 4).
  • 12. Konservierte tat-Sequenz
  • 13. Vergleich von verschiedenen tat-Zielsequenzen
  • 14. Transfizierte klonale T-Zelllinien (Sup T1), welche Protektion bei Rz2 zeigen (a, d, f). Klonale Zelllinien, enthaltend Vektor (pSV2 neo, neo-a) und statistische Kontrollen (Ran a, b, c, d, e, f).
  • 15A-15C Schematische Wiedergabe der retroviralen Vektorkonstrukte und ihrer anschließenden Expression (nicht maßstabsgerecht dargestellt). 15A: Ribozymkonstrukt RRz2; 15B: Antisinn-Konstrukt RASH5; 15C: Polymeres-TAR-Konstrukt R20TAR. Die retroviralen Stammformvektoren sind in Klammern angegeben. Siehe Text für Einzelheiten.
  • 16A-16C Expression der retroviralen Konstrukte in den transduzierten PBLs. Die Expression von Ribozym (16A), Antisinn (16B) und 20TAR-RNA (16C) wurde mittels Northern-Analyse unter Verwendung der entsprechenden 32P-markierten Sonden untersucht. Siehe Text für Einzelheiten.
  • 17A-17C Inhibition von HIV-1-IIIB-Replikation in transduzierten PBLs. Die transduzierten und selektierten PBLs wurden herausgefordert und geassayt, wie beschrieben in Material und Methoden. Die Daten sind als die Mittelwerte aus fünf Spendern (17A, Ribozymkonstrukte, und 17B, Antisinn-Konstrukte) und zwei Spendern (17C, Polymeres-TAR-Konstrukte) aufgetragen.
  • 18A-18C Resistenz von transduzierten PBLs gegenüber Infektion durch ein klinisches Isolat 82H. Die PBLs wurden mit dem Ribozymkonstrukt (18A), Antisinn-Konstrukt (18B) und dem Polymeres-TAR-Konstrukt (18C) transduziert und mit 82H infiziert, wie es in Materialien und Methoden beschrieben ist. Die aufgetragenen Daten sind die Mittelwerte aus zwei Spendern.
  • 19 Proliferationsassays an den transduzierten PBLs. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) gezeigt. Nur PBL: untransduzierte PBLs; LXSN, R-20TAR, LNHL, RASH-5, LNL6 und RRz2: transduzierte PBLs mit den entsprechenden Retroviren.
  • 20 Die CEM-T4 T-Lymphozyten-Zelllinie wird mit Virus transduziert und einer G418-Selektion unterzogen. Die vereinigte Population enthält Zellen mit statistischen Integranten und variablen Konstrukt-Expressionsspiegeln, welche dann mit HIV-1 herausgefordert werden.
  • 21A-21B RzM ist ein gegen tat gerichtetes Mehrfach-Ribozym, und RRzpsi/M ist ein gemeinsames gegen die Verpackung gerichtetes Ribozym/Mehrfach-Ribozym gegen tat.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine synthetische nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung, welche Nukleotide, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definiert, und Nukleotide, deren Sequenz in der Lage zum Hybridisieren mit einer vorbestimmten Zielsequenz innerhalb einer Verpackungssequenz eines RNA-Virus ist, umfasst. Vorzugsweise ist die virale Verpackungssequenz eine Retrovirus-Verpackungssequenz, zum Beispiel ist die Verpackungssequenz die Psi-Verpackungssequenz von HIV-1.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem RNA-Virus um ein Felines Leukämie-Virus. In einer anderen Ausführungsform ist das RNA-Virus ein Felines Immundefizienzvirus.
  • Eine bevorzugte Verbindung hat die Struktur:
    Figure 00100001
    worin jedes X ein Nukleotid repräsentiert, welches gleich oder verschieden ist und an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin jedes von A, C, U und G für ein Ribonukleotid steht, welches an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base unmodifiziert oder modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin 3' AAG....AGUCX 5' die konservierte katalytische Region definiert;
    worin jedes von (X)nA und (X)n' die Nukleotide definiert, deren Sequenz in der Lage zum Hybridisieren mit der vorbestimmten Zielsequenz innerhalb der Verpackungssequenz des RNA-Virus ist;
    worin jedes * eine Basenpaarung zwischen den Nukleotiden repräsentiert, welche auf jeder Seite davon liegen;
    worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verknüpfung repräsentiert, die kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden bereitstellt, welche auf jeder Seite davon liegen; wobei jede der gestrichelten Linien unabhängig entweder eine chemische Verknüpfung, bereitstellend kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden, welche auf jeder Seite davon liegen, oder die Abwesenheit von jedweder solchen chemischen Verknüpfung repräsentiert;
    worin a für eine ganze Zahl steht, welche eine Anzahl an Nukleotiden definiert, mit der Maßgabe, dass a 0 oder 1 sein kann und falls 0, das A, welches 5' zu (X)a liegt, an das X gebunden ist, welches 3' zu (X)a liegt;
    worin jedes von m und m' für eine ganze Zahl steht, welcher größer oder gleich 1 ist; worin (X)b ein Oligonukleotid repräsentiert und b für eine ganze Zahl steht, welche größer oder gleich 2 ist.
  • Eine andere bevorzugte Verbindung der Erfindung hat die Struktur:
    Figure 00100002
    worin jedes X gleich oder verschieden ist und ein Ribonukleotid oder ein Desoxyribonukleotid repräsentiert, welches an seinem seiner Zucker, Phosphat oder Base modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin jedes von A, C, U und G ein Ribonukleotid repräsentieren, welches an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base unmodifiziert oder modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin 3' AAG....AGUCX 5' die konservierte katalytische Region definiert;
    worin jedes von (X)nA und (X)n' die Nukleotide definiert, deren Sequenz zur Hybridisierung mit der vorbestimmten Zielsequenz innerhalb der Verpackungssequenz eines RNA-Virus in der Lage ist;
    worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verknüpfung repräsentiert, bereitstellend kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden, welche auf jeder Seite davon liegen;
    wobei m für eine ganze Zahl von 2 bis 20 steht; und
    worin keine der Nukleotide (X)m an irgendein anderes Nukleotid innerhalb der Verbindung Watson-Crick-basengepaart sind.
  • Eine andere bevorzugte Verbindung der Erfindung besitzt die Struktur:
    Figure 00110001
    worin jedes X gleich oder verschieden ist und für ein Ribonukleotid oder ein Desoxyribonukleotid steht, welches an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin jedes von A, C, U und G ein Ribonukleotid repräsentiert, welches an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base unmodifiziert oder modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin 3' (X)P4....(X)P1 5' die konservierte katalytische Region definiert;
    worin jedes von (X)F4 und (X)F3 die Nukleotide definiert, deren Sequenz zum Hybridisieren mit der vorbestimmten Zielsequenz innerhalb der Verpackungssequenz eines RNA-Virus in der Lage ist;
    worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verknüpfung repräsentiert, welche kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden, die auf jeder Seite davon liegen, bereitstellt;
    wobei F3 für eine ganze Zahl steht, welche die Anzahl von Nukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass F3 größer oder gleich 3 ist;
    worin F4 für eine ganze Zahl steht, welche die Anzahl von Nukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass F4 sich auf 3 bis 5 beläuft;
    worin jedes von (X)P1 und (X)P4 ein Oligonukleotid repräsentiert, aufweisend eine vorbestimmte Sequenz, so dass (X)P4 mit 3-6 Basen von (X)P1 basenpaart;
    worin P1 für eine ganze Zahl steht, welche die Anzahl von Nukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass P1 sich auf 3 bis 6 beläuft und die Summe von P1 und F4 gleich 9 ist;
    worin jedes von (X)P2 und (X)P3 ein Oligonukleotid mit einer vorbestimmten Sequenz repräsentiert, so dass (X)P2 mit mindestens 3 Basen von (X)P3 basenpaart;
    worin jedes * eine Basenpaarung zwischen den auf jeder Seite davon liegenden Nukleotiden repräsentiert;
    worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verknüpfung repräsentiert, welche kovalente Bindungen zwischen den auf jeder Seite davon liegenden Nukleotiden bereitstellt;
    worin der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Verknüpfung, bereitstellend kovalente Bindungen zwischen den auf jeder Seite davon liegenden Nukleotiden, oder die Abwesenheit irgendeiner solchen chemischen Verknüpfung repräsentiert; und
    worin (X)L2 ein Oligonukleotid repräsentiert, welches vorhanden oder abwesend sein kann, mit der Maßgabe, dass L2 für eine ganze Zahl steht, welche größer oder gleich 3 ist, wenn (X)L2 vorhanden ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verbindung der Erfindung Nukleotide, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definiert, welche aus der konservierten Region von Hepatitis Delta-Virus sind.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verbindung der Erfindung Nukleotide, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definiert, welche die Sequenz NCCA an ihrem 3'-Terminus enthalten.
  • In einer anderen Ausführungsform offenbart die vorliegende Erfindung eine synthetische, nicht natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung, welche zwei oder mehr Domänen umfasst, welche gleich oder verschieden sein können, wobei jede Domäne Nukleotide umfasst, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definiert, und Nukleotide, deren Sequenz in der Lage zum Hybridisieren mit einer vorbestimmten Zielsequenz innerhalb einer Verpackungssequenz eines RNA-Virus ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verbindung der Erfindung ferner eine kovalent verknüpfte Antisinn-Nukleinsäureverbindung, welche zum Hybridisieren mit einer vorbestimmten Sequenz, welche gleich oder verschieden sein kann, innerhalb einer Verpackungssequenz des RNA-Virus in der Lage ist.
  • Vorzugsweise umfasst die Verbindung der Erfindung Nukleotide, fähig zum Hybridisieren mit der 243-, 274-, 366- oder 553-Zielsequenz im MoMLV, und Stelle 749 in der HIV-Psi-Verpackungsstelle.
  • Die Erfindung offenbart auch eine Verbindung, umfassend die zuvor erwähnte Verbindung und ferner umfassend mindestens eine zusätzliche synthetische nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung mit oder ohne einem kovalent verknüpften Antisinnmolekül, und zielgerichtet auf ein anderes Gen des RNA-Virus-Genoms. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das RNA-Virus HIV, und die andere Region des HIV-Genoms wird gewählt aus der Gruppe, welche aus einer langen terminalen Wiederholungseinheit, 5'-untranslatierten Region, Splice-Donor-Akzeptor-Stellen, Primerbindungsstellen, 3'-untranslatierten Region, gag-, pol-, Protease-, Integrase-, env-, tat-, rev-, nef-, vif-, vpr-, vpu-, vpx- oder tev-Region besteht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verbindung sind die Nukleotide fähig zum Hybridisieren mit den Zielstellen 243, 274, 366 oder 553 oder einer Kombination davon im MoMLV und der Stelle 749 in der HIV-Psi-Verpackungsstelle, und die Nukleotide der zusätzlichen Verbindung sind fähig zum Hybridisieren mit den Zielstellen 5792, 5849, 5886 oder 6042 oder einer Kombination davon in der HIV-tat-Region.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren eine Zusammensetzung, welche die Verbindung, wie oben beschrieben, in Assoziation mit einem pharmazeutisch, tiermedizinisch oder landwirtschaftlich annehmbaren Träger oder Exzipienten umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch eine Zusammensetzung, welche eine synthetische, nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung, wie beschrieben, mit oder ohne Antisinn, umfasst und ferner einen TAR-Köder, polyTAR oder einen RRE-Köder umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Verbindung, welches die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Ligieren einer Nukleotidsequenz, entsprechend der Verbindung, in einen Transfervektor, der aus DNA, RNA oder einer Kombination davon aufgebaut ist;
    • (b) Transkribieren der Nukleotidsequenz von Schritt (a) mit einer RNA-Polymerase; und
    • (c) Gewinnen der Verbindung.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung eines Transfervektors, welcher aus RNA oder DNA oder einer Kombination davon aufgebaut ist, enthaltend eine Nukleotidsequenz, welche bei einer Transkription zu der oben beschriebenen Verbindung führt.
  • Vorzugsweise umfasst ein solcher Transfervektor die langen terminalen Wiederholungseinheiten von HIV, einen Adenovirus-assoziierten Transfervektor, einen SV40-Promotor, Mo-MLV oder einen amphotropen Retrovirusvektor. Am stärksten bevorzugt umfasst der Transfervektor weiterhin eine Sequenz, welche die Oligonukleotid-Verbindung zu einer besonderen Region innerhalb der Zelle ex vivo lenkt.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren eine Zusammensetzung, welche den oben beschriebenen Transfervektor in Assoziation mit einem pharmazeutisch, tiermedizinisch oder landwirtschaftlich annehmbaren Träger oder Exzipienten umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein prokaryotische oder eukaryotische Zelle, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, bei welcher es sich um die oben beschriebene Verbindung handelt oder welche bei einer Transkription zu ihrer Entstehung führt.
  • Vorzugsweise ist die Zelle eine eukaryotische Zelle, am stärksten bevorzugt eine tierische Zelle.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der eukaryotischen Zelle um eine hämatopoietische Stammzelle, welche zur Entstehung von Vorläuferzellen, reiferen und vollständig reifen Zellen aller hämatopoietischen Zell-Abstammungslinien führt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die eukaryotische Zelle eine Vorläuferzelle, welche zur Entstehung von reifen Zellen aller hämatopoietischen Zell-Abstammungslinien führt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die eukaryotische Zelle eine festgelegte Vorläuferzelle, welche zu einer spezifischen hämatopoietischen Abstammungslinie führt.
  • Vorzugsweise ist die eukaryotische Zelle eine T-Lymphozyten-Vorläuferzelle. Eine andere bevorzugte eukaryotische Zelle ist ein unreifer T-Lymphozyt. Noch eine andere bevorzugte eukaryotische Zelle ist ein reifer T-Lymphozyt. In einer anderen Ausführungsform ist die eukaryotische Zelle eine myeloide Vorläuferzelle oder eine Monozyten/Makrophagen-Zelle.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren die Verwendung der obenstehend beschriebenen Verbindung zum Schützen von hämatopoietischen Stammzellen, Vorläuferzellen, festgelegten Vorläuferzellen, T-Lymphozyten-Vorläuferzellen, unreifen T-Lymphozyten, reifen T-Lymphozyten, myeloiden Vorläuferzellen oder Monozyten/Makrophagen-Zellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Einführung ex vivo des Transfervektors, wie oben beschrieben, in hämatopoietische Zellen, wodurch die Zellen resistent gegenüber HIV gemacht werden, so dass dadurch HIV in einem AIDS-Patienten unterdrückt wird. Für dieses Verfahren sind die Zellen autologe oder heterologe Zellen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens erfolgt die Einführung ex vivo, und die Zellen werden ohne Myeloablation transplantiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einführung ex vivo, und die Zellen werden mit einer Myeloablation transplantiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die ex vivo-Einbringung des oben beschriebenen Transfervektors in die Zellen des Individuums, wodurch dieses Individuum vor den Effekten hoher Spiegel des Virus und vor HIV-Infektion geschützt wird.
  • Spezifisch richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Oligonukleotid-Verbindung, welche ein Ribozym umfasst, das auf die GUA-Zielstelle an Nukleotid 5849 des HIV-1-Isolats SF-2 oder eine entsprechende Zielstelle von anderen HIV-1-Isolaten abzielt, wobei es sich bei der Verbindung entweder handelt um:
    • – ein Einzel-Ribozym, oder
    • – ein Mehrfach-Ribozym, das auf verschiedene Stellen innerhalb von tat abzielt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung von einem Konstrukt codiert, umfassend die Sequenz:
    Figure 00150001
    worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Verbindung von einem Konstrukt codiert, ferner umfassend die Sequenz
    GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG.
  • Die Erfindung offenbart eine synthetische, nicht natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung, welche Nukleotide, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definiert, und Nukleotide, deren Sequenz zum Hybridisieren mit einer vorbestimmten Zielsequenz innerhalb einer Verpackungssequenz eines RNA-Virus in der Lage ist, umfasst. Vorzugsweise ist die virale Verpackungssequenz eine Retrovirus-Verpackungssequenz, und in einer Ausführungsform die Psi-Verpackungssequenz von HIV-1. Das RNA-Virus kann HIV-1, Felines Leukämie-Virus, Felines Immundefizienzvirus oder eines der Viren sein, welche in den Tabellen 6-7 aufgelistet werden. Die konservierte katalytische Region kann aus einem Hammerkopf-Ribozym (siehe Haseloff et al., U.S.-Patent Nr. 5 245 678; Rossi et al., U.S.-Patent Nr. 5 249 796), einem Haarnadel-Ribozym (siehe Hampel et al., Europäische Anmeldung Nr. 89 117 424, eingereicht am 20. September 1989), einem Hepatitis-Delta-Ribozym (Goldberg et al., Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 91/04319 und WO 91/04324, veröffentlicht am 4. April 1991), einem RNAse P-Ribozym (siehe Altman et al., U.S.-Patent Nr. 5 168 053), einem Gruppe-I-Intron (siehe Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071) oder einem Gruppe-II-Intron (siehe Pyle, 1993) abgeleitet sein.
  • In einer Ausführungsform kann die Verbindung die Struktur (SEQ ID NR.: 1):
    Figure 00160001
    aufweisen, worin jedes X für ein Nukleotid steht, welches gleich oder verschieden ist und an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base modifiziert oder substituiert sein kann; worin jedes von A, C, U und G für ein Ribonukleotid steht, welches an seinem/seiner Zucker, Phosphat oder Base unmodifiziert oder modifiziert oder substituiert sein kann;
    worin 3'-AAG....AGUCX-5' die konservierte katalytische Region definiert; worin jedes von (X)nA und (X)n' die Nukleotide definiert, deren Sequenz in der Lage zum Hybridisieren mit der vorbestimmten Zielsequenz innerhalb der Verpackungssequenz des RNA-Virus ist;
    worin jedes * eine Basenpaarung zwischen den Nukleotiden repräsentiert, welche auf jeder Seite davon liegen; worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verknüpfung repräsentiert, die kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden, welche auf jeder Seite davon liegen, bereitstellt; wobei jede der gestrichelten Linien unabhängig entweder eine chemische Verknüpfung, bereitstellend kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden, welche auf jeder Seite davon liegen, oder die Abwesenheit von irgendeiner solchen chemischen Verknüpfung repräsentiert; worin a für eine ganze Zahl steht, welche eine Anzahl an Nukleotiden definiert, mit der Maßgabe, dass a 0 oder 1 sein kann, und falls 0, das A, welches 5' zu (X)a liegt, an das X gebunden ist, welches 3' zu (X)a liegt; worin jedes von m und m' für eine ganze Zahl steht, welcher größer oder gleich 1 ist; worin (X)b ein Oligonukleotid repräsentiert und b für eine ganze Zahl steht, welche größer oder gleich 2 ist.
  • Alternativ dazu kann die Verbindung die folgende Struktur aufweisen (SEQ ID NR.: 2
    Figure 00170001
    worin 3'-AAG....AGUCX-5' die konservierte katalytische Region definiert; worin m für eine ganze Zahl von 2 bis 20 steht; und worin keine der Nukleotide (X)m an irgendein anderes Nukleotid innerhalb der Verbindung Watson-Crick-basengepaart sind.
  • In einer anderen Ausführungsform besitzt die Verbindung von Patentanspruch 1 die Struktur (SEQ ID NR.: 3):
    Figure 00170002
    worin 3' (X)P4....(X)P1-5' die konservierte katalytische Region definiert, worin jedes von (X)F4 und (X)F3 die Nukleotide definiert, deren Sequenz zum Hybridisieren mit der vorbestimmten Zielsequenz innerhalb der Verpackungssequenz eines RNA-Virus in der Lage ist; worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verknüpfung repräsentiert, welche kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden, die auf jeder Seite davon liegen, bereitstellt; wobei F3 für eine ganze Zahl steht, welche die Anzahl von Nukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass F3 größer oder gleich 3 ist; worin F4 für eine ganze Zahl steht, welche die Anzahl von Nukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass F4 sich auf 3 bis 5 beläuft; worin jedes von (X)P1 und (X)P4 ein Oligonukleotid repräsentiert, aufweisend eine vorbestimmte Sequenz, so dass (X)P4 mit 3-6 Basen von (X)P1 basenpaart; worin P1 für eine ganze Zahl steht, welche die Anzahl von Nukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass P1 sich auf 3 bis 6 beläuft und die Summe von P1 und F4 gleich 9 ist; worin jedes von (X)P2 und (X)P3 ein Oligonukleotid mit einer vorbestimmten Sequenz repräsentiert, so dass (X)P2 mit mindestens 3 Basen von (X)P3 basenpaart; worin der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Verknüpfung, bereitstellend kovalente Bindungen zwischen den auf jeder Seite davon liegenden Nukleotiden, oder die Abwesenheit irgendeiner solchen chemischen Verknüpfung repräsentiert; und worin (X)L2 ein Oligonukleotid repräsentiert, welches vorhanden oder abwesend sein kann, mit der Maßgabe, dass L2 für eine ganze Zahl steht, welche größer oder gleich 3 ist, wenn (X)L2 vorhanden ist.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die Nukleotide, deren Sequenzen eine konservierte katalytische Region definieren, aus der konservierten Region des Hepatitis Delta-Virus. Alternativ dazu enthalten die Nukleotide, deren Sequenzen eine konservierte katalytische Region definieren, die Sequenz NCCA an ihrem 3'-Terminus.
  • Die Erfindung richtet sich auch auf Mehrfach-Verbindungen oder Ribozyme mit konservierten katalytischen Regionen, welche gleich oder unterschiedlich sein können, die auf vorbestimmte Zielsequenzen abzielen, welche gleich oder unterschiedlich sein können. In dieser Ausführungsform handelt es sich um eine synthetische nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung, welche zwei oder mehr Domänen umfasst, die gleich oder verschieden sein können, wobei jede Domäne Nukleotide, deren Sequenz eine konservierte katalytische Region definiert, und Nukleotide, deren Sequenz zum Hybridisieren mit einer vorbestimmten Zielsequenz innerhalb einer Verpackungssequenz eines RNA-Virus in der Lage ist, umfasst. Die Verbindungen können auch kovalent an eine Antisinn-Nukleinsäureverbindung verknüpft sein, fähig zum Hybridisieren mit einer vorbestimmten Sequenz, welche gleich oder verschieden von der Oligonukleotid-Verbindung sein kann, innerhalb einer Verpackungssequenz des RNA-Virus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleotide in der Lage, mit der Zielsequenz 243, 274, 366 oder 553 im MoMLV und der Stelle 749 in der HIV-Psi-Verpackungsstelle zu hybridisieren. Die Oligonukleotid-Verbindungen können ferner mindestens ein(e) zusätzliche(s) synthetische(s) nicht-natürlich vorkommende(s) Oligonukleotid-Verbindung oder Antisinn-Molekül kovalent verknüpft umfassen, welche(s) auf ein unterschiedliches Gen des RNA-Virus-Genoms abzielt. In dem Fall, bei welchem das RNA-Virus HIV ist, kann die unterschiedliche Region des HIV-Genoms aus der Gruppe gewählt werden, die aus einer langen terminalen Wiederholungseinheit, 5' untranslatierten Region, Splice-Donor-Akzeptor-Stellen, Primerbindungsstellen, 3' untranslatierten Region, gag-, pol-, Protease-, Integrase-, env-, tat-, rev-, nef-, vif-, vpr-, vpu-, vpx- oder tev-Region besteht.
  • Vorzugsweise ist die erste Oligonukleotid-Verbindung in der Lage mit den Zielstellen 243, 274, 366 oder 553 oder einer Kombination davon im MoLV und der Stelle 749 in der HIV-Psi-Verpackungsstelle zu hybridisieren, und die Nukleotide der zweiten zusätzlichen Verbindung sind in der Lage, mit den Zielstellen 5792, 5849, 5886 oder 6042 oder einer Kombination davon in der HIV-tat-Region zu hybridisieren. Zusätzliche Ziele können innerhalb des HIV-Genoms (Tabelle III) (SEQ ID NR.: 4-7) gefunden werden, insbesondere innerhalb der tat-Sequenz und innerhalb der Psi-Verpackungsregion (HIV-1 SF2)
    Figure 00190001
    Figure 00190002
    oder Tabelle III. Die hierin verwendeten, spezifischen Ribozymsequenzen sind Rz-2, Rz-M und Rz-ψ. Die Anti-HIV-Ribozym-Sequenzen Rz-2 (Einzel-Anti-tat)
    TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC
  • Rz-M (Mehrfach-Anti-tat)
    • CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGAGTCCG TGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAA
  • Rz-ψ (Einzel-Anti-HIV ψ)
    • GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG.
  • Die Spaltung von HIV-RNA durch Ribozyme ist eine potenziell nützliche Vorgehensweise. Sie hat therapeutische mehrere bedeutungsvolle Eigenschaften
    • i) Spezifität,
    • ii) die Fähigkeit, auf eine relativ große Zahl von potenziellen Stellen abzuzielen,
    • iii) Abwesenheit von Toxizität gegenüber Zellen,
    • iv) Turnover des Ribozym-Moleküls,
    • v) Vielfalt von anwendbaren Zuführungsverfahren und
    • vi) Potenzial für eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung: a) chemische Synthese (da es sich um ein kurzes Molekül handelt), b) biochemische Herstellung durch in vitro-Transkription und c) Promotor-gesteuerte in vivo-Herstellung aus integrierten Konstrukten.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet Anti-Verpackungsstelle(Psi)-Ribozyme zum Inhibieren von HIV-Replikation. Diese Aktivität würde auf den Ebenen A, E, F und G wirken. Eine Unterbrechung an dieser Stelle kann inhibierende Auswirkungen besitzen auf: i) den Eintritt des Virus in Zielzellen, ii) Produktion von viraler RNA, iii) die Translation von viraler mRNA zu viralen Proteinen, und iv) die Verpackung von viraler genomischer RNA zu Virionen.
  • PSI-VERPACKUNGSEQUENZ
  • Die Psi-Verpackungssequenz ist eine cis-wirkende virale genomische Sequenz, welche notwendig für die spezifische Einkapselung von viraler RNA zu Virionen ist (Aronoff et al., 1991). Es ist gezeigt worden, dass die Verpackung von RNA zu Virusteilchen eine hohe Spezifität aufzeigt, und diese scheint von der Psi-Stelle vermittelt zu werden. Die Lokalisierung der Psi-Verpackungsstelle für sowohl Mo-MLV als auch HIV-1 wurde durch funktionelle Deletion identifiziert, d. h. Entfernen bestimmter Sequenzen und Beobachten, ob der Prozess der Verpackung von viraler RNA fortgesetzt wird. Es wurde gezeigt, dass die Sequenz innerhalb der 5' untranslatierten Region des Retrovirus liegt und in RNAs abwesend ist, welche nicht verpackt werden. In Hinblick auf die vorliegende Erfindung, haben wir gefolgert, dass, damit die RNA leicht als eine solche erkannt wird, die zu verpacken ist, die Verpackungssequenz exponiert, zugänglich und fähig, erkannt zu werden, sein muss. Untersuchungen sowohl des Mo-MLV als auch des HIV-1-Verpackungssignals haben darauf hingewiesen, dass in jedem Fall eine konservierte stabile Sekundärstruktur vorliegt (Alford et al., 1992, und Harrison et al., 1992). Nach unserer Ansicht haben diese Merkmale die Psi-Verpackungsstelle zu einem attraktiven Ziel für Ribozym-Wirkung gemacht. Eine Studie unter Anwendung von Antisinn gegen die retrovirale Verpackungssequenz hat früher gezeigt, dass die Replikation von Moloney-Maus-Leukämie-Virus (Mo-MLV) in transgenen Tieren durch Störung der Psi-Sequenz inhibiert werden kann (Han et al., 1991).
  • MOLONEY-MAUS-LEUKÄMIE-VIRUS (Mo-MLV) UND HUMANES IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS (HIV-1)
  • Mo-MLV ist ein muriner Wildtyp-Retrovirus, welcher kein Onkogen trägt (3) (Teich et al, 1985). Es verursacht Leukämie in Mäusen mit einer langen Latenz aufgrund von insertionaler Mutagenese. Wir haben Mo-MLV als einen ersten Schritt zur Einschätzung von Beweisen für das Prinzip der Wirksamkeit von antiviralen Ribozymen verwendet. Mo-MLV ist ein typisches Retrovirus, in welchem Replikation entlang der in 1 skizzierten Linien vor sich geht und die Verpackung vermittels der Psi-Verpackungsstelle bewerkstelligt wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden Anti-Mo-MLV-Ribozyme, welche auf die Psi-Verpackungsstelle abzielen und innerhalb eines Expressionsvektors kloniert waren, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Virusproduktion in Gewebekultur zu reduzieren, getestet.
  • HIV-1, das aktive Prinzip bei erworbenem Immundefizienz-Syndrom (AIDS), induziert den Zelltod in T-Lymphozyten (McCune, 1991; Levy, 1993). Diese Zellen tragen entscheidend zur Immunantwort bei. In jedweder potenziellen Anti-HIV-Vorgehensweise ist es essenziell, die virale Replikation wesentlich zu reduzieren oder zu inhibieren, bevor das Immunsystem aufgrund des Verlustes dieser Zellen lahmgelegt wird. Es gibt derzeitig keine wirksame Heilung für AIDS. Durch Verringern des viralen Titers wird es jedoch erwartet, dass der Fortschritt der Krankheit verlangsamt wird und sogar aufgehalten werden kann. Die Entwicklung von Anti-HIV-Verpackungssequenz-Ribozymen scheint ein gangbares Verfahren zur wesentlichen Inhibierung oder sogar zum Aufhalten der Virusproduktion zu sein.
  • Anti-HIV-gag-Ribozyme sind früher entwickelt worden, von welchen gezeigt wurde, dass sie in der Lage sind, gag-RNA- und p24-Spiegel in Zellen, welche das Ribozym exprimieren, zu reduzieren (Sarver et al., 1990). Hammerkopf-Ribozyme sind entwickelt worden, um HIV-1-Integrase-RNA in E. coli zu spalten, um eine Translation des Integraseproteins zu blockieren (Sioud et al., 1991). Untersuchungen haben ebenfalls gezeigt, dass ein Ribozym, welches ebenfalls HIV-1-RNA in der U5, 5' untranslatierten Region, von HIV oder tat spaltet, T-Zellen vor HIV-1 schützen kann (Dropulic et al., 1992, Ojwang et al., 1992, Lo et al., 1992 und Weerasinghe et al., 1991).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Anti-HIV-Ribozyme, die auf die Psi-Verpackungsstelle abzielen, innerhalb des gleichen Expressionsvektors wie für das Anti-Mo-MLV-Konstrukt kloniert. Diese Konstrukte wurden ebenfalls hinsichtlich ihrer Fähigkeiten, die Virusproduktion in Gewebekultur zu reduzieren, getestet.
  • ZUFÜHRUNG VON EXPRESSIONSKONSTRUKTEN
  • Die hauptsächlichen Methoden, mittels derer die Expressionskonstrukte in Zielzellen eingeführt werden, sind Transfektion, einschließlich Elektroporation, Liposomen-vermittelter und retroviral vermittelter Gentransfer.
  • Definitionen
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Psi-Verpackungsstelle" auf eine Region direkt proximal zum 5'-LTR, welche bei der Einkapselung der viralen RNA zu Virionen beteiligt ist.
  • Wie hierin verwendet, sind "komplementäre Arme" die an das Kern-Hammerkopf-Ribozym angehefteten Sequenzen, welche eine Bindung an eine spezifische Region der Ziel-RNA erlauben.
  • Wie hierin verwendet, kann es sich bei einem "Ribozym" um einen Hammerkopf, eine Haarnadel, Hepatitis-Delta, RNAse P, ein Gruppe-I-Intron oder ein Gruppe-II-Intron handeln, welche zur Spaltung von Ziel-RNA in der Lage sind. Das Hammerkopf-Ribozym ist der Gegenstand der Veröffentlichung von Haseloff und Gerlach (Haseloff et al., 1988) und nachfolgender Fachartikel von einer Reihe von Laboratorien.
  • Beschreibung
  • Diese Erfindung betrifft die Behandlung von viralen Erkrankungen, speziell AIDS, in welchen das pathogene Agens RNA als sein genomisches Material aufweist und diese RNA zu Virionen verpackt wird. Die Herangehensweise besteht darin, die Replikation des Virus durch Zerstören der viralen RNA an der Psi-Verpackungsstelle, der Erkennungssequenz, welche für eine Verpackung der viralen genomischen RNA notwendig ist, zu inhibieren. Eine Unterbrechung an dieser Stelle besitzt inhibitorische Auswirkungen auf: i) den Eintritt des Virus in Zielzellen und die nachfolgende Integration des Provirus in das Wirtsgenom, ii) die Produktion von viraler RNA, iii) die Translation von viraler mRNA zu viralen Proteinen und iv) die Verpackung von viraler genomischer RNA zu Virionen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden bestimmte Expressionskonstrukte bereitgestellt, welche Nukleotidsequenzen von Interesse umfassen. In einem bevorzugten Expressionskonstrukt wird ein Ribozym-Expressionskonstrukt vorgesehen, welches bei Einbringung in eine Zelle, bei der es sich um eine mit Mo-MLV oder HIV-1 infizierte Zelle handeln kann, in der Lage zum Steuern der Transkription von RNA ist, die aufgrund von komplementären Armen, welche das Ribozym umgeben, an Mo-MLV- oder HIV-I-RNA binden kann. Diese komplementären Arme sind kurz, und es ist die Gegenwart von Ribozymsequenzen, welche zum Schneiden der RNA wirken, mittels derer man die Wirkung des RNA-Moleküls stört.
  • Die Erfindung ist auf mehreren Wegen getestet worden. Ein Satz von Experimenten zeigte eine direkte Korrelation zwischen Ribozym-vermittelter Spaltung der viralen Mo-MLV-Psi-Verpackungssequenz in vitro und der in vivo-Unterdrückung der Mo-MLV-Replikation. Es gab drei Hauptschritte, welche der Reihe nach befolgt wurden, um diese Schlussfolgerung zu erreichen –
    • i) Nachweisen der Ribozym-vermittelten in vitro-Spaltung
    • ii) Transfektion von Konstrukten, enthaltend die Ribzyme, in Mo-MLV-infizierte Zellen.
    • iii) verschiedene Assays zum Aufzeigen a) der Integration von Konstrukten, b) der Ribozym-Konstrukt-Expression, c) der Auswirkung der Ribozym-Konstrukt-Expression auf die Spiegel der Virus-Replikation.
  • Für HIV wurden ähnliche Schritte befolgt –
    • i) Entwurf und Konstruktion von Ribozym-Konstrukten,
    • ii) Transfektion von Ribozym-haltigen Konstrukten in eine humane T-Lymphozyten-Zelllinie,
    • iii) verschiedene Assays zum Aufzeigen a) der Integration von Konstrukten, b) der Ribozym-Konstrukt-Expression, c) der Auswirkung der Ribozym-Konstrukt-Expression auf die Spiegel der Virus-Replikation.
  • Die Erfindung wirkt als eine Viren-Unterdrückung sowohl zum i) Inhibieren des Vireneintritts in eine nicht-infizierte Zelle durch Zerschneiden der viralen RNA, wenn sie in die Zielzelle eintritt, als auch ii) Verringern der Spiegel an funktionellem Virus, welches die infizierte Zelle verlässt. In beiden Fällen wirkt sie zum Schneiden der viralen RNA – am Eintrittspunkt im ersten Fall und am Austrittspunkt im zweiten. Im letztgenannten Fall senkt das Schneiden die RNA-Spiegel durch Schneiden sowohl von viraler als auch mRNA. Das Schneiden spezifisch an der Psi-Verpackungsstelle dient auch zum Inhibieren der Verpackung der viralen RNA.
  • Mehrere Erwägungen wurden angewandt, um ein Ziel für die antivirale Ribozymwirkung zu wählen. Die für die vorliegende Erfindung angewandten Kriterien waren – i) Das Ziel muss funktionell bedeutsam sein. ii) Es muss ein hoher Grad an Sequenzkonservierung unter den verschiedenen HIV-1-Isolaten in der Zielregion bestehen. iii) Im Falle von Hammerkopf-Ribozymen ist die Ribozym-Zielsequenz, wie GUC oder GUA, vorzugsweise in der Sequenz vorhanden, oder die verwandten Triplets GUU, CUC etc. (Perriman et al., 1992). iv) Die Zielsequenz sollte leicht zugänglich sein, wobei ihr zum Beispiel eine umfangreiche Sekundärstruktur fehlen sollte (Rossi et al., 1992).
  • Die Psi-Verpackungssequenz erfüllte die obenstehenden Kriterien und wurde als ein Ziel für die Spaltung durch Ribozyme ausgewählt. Diese Stelle besitzt: i) eine essenzielle Funktion im retroviralen Replikationszyklus, ii) verhältnismäßige Zugänglichkeit, da sie eine Stelle auf der RNA ist, welche erkennt werden muss und für andere Komponenten zugänglich sein muss, damit eine Verpackung stattfindet, und iii) eine konservierte Natur unter verschiedenen Stämmen des gleichen Virus.
  • Es ist beobachtet worden, dass in verschiedenen Stämmen von sowohl Mo-MLV als auch HIV eine starke Konservierung der Sequenz und Struktur in der Psi-Verpackungsregion von jedem Virus besteht. Obgleich es keine offensichtliche Konservierung von Struktur oder Sequenz zwischen der Verpackungsstelle von HIV und Mo-MLV gibt, kann aufgrund der identischen Funktion der Psi-Stelle in jedem Virus berechtigtermaßen angenommen werden, dass es Ähnlichkeiten geben muss. Die Sekundärstruktur von viraler RNA wurde untersucht, und Stellen auf der Psi-Sequenz wurden gewählt, welche für eine Ribozymwirkung zugänglich zu sein schienen. Diese lagen in den Schleifen-Regionen, d.h. einzelsträngigen ungepaarten Basenregionen der RNA. Zuker's FOLDRNA-Programm wurde eingesetzt, um nicht-basengepaarte Regionen der Psi-Verpackungssequenz zu lokalisieren. Die Ribozyme wurden entworfen, um auf diese Stellen abzuzielen. Bei den gewählten Stellen war auch eine GUC-Basensequenz vorhanden.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Konstrukte wandten Ribozyme an, welche in die 3' untranslatierte Region des Neomycin-Resistenzgens (neor) inseriert waren. Das grundlegende Konstrukt ist in der 4 gezeigt. Ein derartiges Konstrukt gestattete die Überprüfung der Integration und Expression. Die Erstere wird durch Southern-Analyse detektiert, und die Letztere durch zelluläre Resistenz gegenüber G418-Toxizität und durch RNAse-Protektions-Assay. Ein weiterer Vorteil des angewandten Entwurfs bestand darin, dass die chimäre RNA mit einer kleinen Ribozymsequenz im 3'-Ende eines größeren neor-Gen-Botschafters dahingehend zu wirken schien, die Ribozyme innerhalb der Zellen stabil zu halten. Letzteres ist ein äußerst wichtiger Punkt, da ohne Stabilität der Effekt von Ribozymen minimal sein wird.
  • DISKUSSION
  • Die Erfindung liefert die Grundlage für ein Verfahren, durch welches Ribozyme angewandt werden könnten, um Tiere, einschließlich Menschen, vor von Retroviren verursachten Krankheiten zu schützen. Das Grundprinzip der Erfindung besteht darin, innerhalb eines größeren Gens Ribozyme gegen die Verpackungsstelle des Zielretrovirus einzubauen. Das Trägergen kann entweder selektierbar (wie im vorliegenden Fall) oder nicht-selektierbar sein. Der Expression des größeren Trägergens liefert ein stabileres chimäres Ribozym-RNA-Molekül. Das DNA-Konstrukt wird entweder in eine naive Zellpopulation transfiziert, um die Zellen zu schützen, oder kann in eine viral infizierte Zellpopulation eingeführt werden, um den Virentiter zu verringern. In einer weiteren Ausführungsform kann das Ribozym-Expressionskonstrukt auch durch retroviral vermittelten Gentransfer eingeführt werden, um die Effizienz der Einführung zu erhöhen. Eine dritte Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Retrovirus, das ein Anti-Verpackungsstellen-Ribozym trägt. Wenn der retrovirale Vektor auf MoMLV basiert, dann wird das auf die Verpackungsstelle von HIV abzielende Ribozym die MoMLV-Verpackungsstelle aufgrund der Sequenzdivergenz für die zwei Retroviren nicht spalten.
  • Therapeutisch könnte die Anwendung die Einführung der Konstrukte in T-Lymphozyten ex vivo oder in hämatopoietische Stammzellen ex vivo beinhalten. Eine bevorzugte Vorgehensweise bestünde darin, die Ribozymkonstrukte in Lymphozyten oder humane nicht-embryonale Stammzellen vermittels eines retroviralen Vektors, wie amphotropem Mo-MLV, einzubringen. Hämatopoietische Vorläufer- und echte humane nicht-embryonale Stammzellen sind vielversprechende Ziele für die Gentherapie, weil sie im Knochenmark vorhanden sind oder in das periphere Blut mobilisiert werden können. Vorläuferzellen können sowohl zu myeloiden als auch lymphoiden Zellen führen, und echte humane nicht-embryonale Stammzellen führen zu Zellen aller zellulärer Abstammungslinien. Eine Therapie könnte eine Bestrahlung zum Zerstören des HIV-infizierten hämatopoietischen Systems beinhalten, und die humanen nicht-embryonalen Stammzellen, welche das Ribozym enthalten, würden dann in den Patienten injiziert werden. Als ein Ergebnis könnten die Zellen des Patienten gegen HIV resistent gemacht werden.
  • Die Erfindung richtet sich auch auf Transfervektoren, aufgebaut aus RNA oder DNA oder einer Kombination davon, enthaltend eine Nukleotidsequenz, welche bei einer Transkription zu den oben beschriebenen Verbindungen führt. Bei dem Transfervektor kann es sich um die lange terminale Wiederholungseinheit von HIV, einen Adenovirus-assoziierten Transfervektor, einen SV40-Promotor, Mo-MLV oder einen amphotropen Retrovirus-Vektor handeln. Der Transfervektor kann ferner eine Sequenz umfassen, welche ex vivo die Oligonukleotid-Verbindung zu einer besonderen Region innerhalb der Zelle steuert. Beispiele der Lokalisierung zu einer besonderen Region einer Zelle schließen die Verwendung des Verpackungssignals ein (Sullenger et al., 1993). Die Erfindung richtet sich ebenfalls auf Zusammensetzungen, enthaltend die Verbindungen oder Transfervektoren, die obenstehend beschrieben wurden, in einem geeigneten Träger. Der Träger kann ein pharmazeutisch, tiermedizinisch oder landwirtschaftlich annehmbarer Träger oder Exzipient sein. Die Zusammensetzung kann ferner einen TAR-Köder, polyTAR oder einen RRE-Köder umfassen.
  • Für die Produktion der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten können die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung entweder prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein. Geeignete Promotoren sind induzierbar, reprimierbar oder, weiter bevorzugt, konstitutiv. Beispiele von geeigneten prokaryotischen Promotoren schließen Promotoren, fähig zur Erkennung der T4-Polymerasen (Malik, S., et al., J. Molec. Biol. 195: 471-480 (1987); Hu, M., et al., Gene 42: 21-30 (1986)), T3, Sp6 und T7 (Chamberlin, M., et al., Nature 288: 227-231 (1970); Bailey, J. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A. 80: 2814-2818 (1983); Davanloo, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 2035-2039 (1984)); die PR-und PL-Promotoren von Bacteriophage Lambda (The Bacteriophage Lambda, Hrsg.: Hershey, A.D., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1973); Lamda II, Hrsg.: Hendrix, R.W., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)); die trp, recA-, Hitzeschock- und lacZ-Promotoren von E. coli; den int-Promotor von Bacteriophage Lambda; den bla-Promotor des β-Lactamase-Gens von pBR322 und den CAT-Promotor des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens von pPR325 etc., wobei prokaryotische Promotoren übersichtsmäßig zusammengefasst werden von Glick, B.R., (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986)); Watson, J.D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)); den TK-Promotor von Herpes-Virus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); den SV40-"early"-Promotor (Benoist, C., et al., Nature London) 290: 304-310 (1981)) und den Hefe-gal4-Gen-Promotor (Johnston, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971-6975 (1982); Silver, P.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955 (1984)) ein.
  • Für die Herstellung von Vektoren zur Verwendung bei der Inhibierung von Retrovirus-Infektion in anfälligen eukaryotischen Zellen oder in ganzen Tieren müssen eukaryotische Promotoren verwendet werden, wie oben beschrieben. Bevorzugte Promotoren und zusätzliche regulatorische Elemente, wie Polyadenylierungssignale, sind diejenigen, welche eine Maximumexpression in dem Zelltyp ergeben sollten, welchen das zu inhibierende Retrovirus infiziert. So infizieren beispielsweise HIV-1, HIV-2, HTLV-1 und HTLV-2 sowie das Moloney-Maus-Leukämie-Virus sämtlich lymphoide Zellen, und um ein Ribozymkonstrukt allein oder in Kombination mit einer Antisinn-RNA, die zur Verpackungssequenz von einem (oder mehreren) dieser Viren komplementär ist, effizient zu exprimieren, werden eine Transkriptionssteuerungseinheit (Promotor und Polyadenylierungssignal) gewählt, welche eine effiziente Expression in hämatopoietischen, insbesondere lymphoiden Zellen (oder Geweben) vorsehen. Wie nachstehend beispielhaft angegeben, sind bevorzugte Promotoren der Cytomegalus-"immediate-early"-Promotor (32), der wahlweise in Verbindung mit den Wachstumshormon-Polyadenylierungssignalen (33) verwendet wird, und der Promotor des Moloney-MuLV-LTR, zur Verwendung mit einem lymphotropen Retrovirus. Ein wünschenswertes Merkmal des Moloney-MuLV-LTR-Promotors besteht darin, dass er den gleichen Gewebe-Tropismus besitzt, wie das Retrovirus. Der CMV-Promotor wird in Lymphozyten exprimiert. Andere Promotoren schließen VA1- und tRNA-Promotoren ein. Der Metallothionein-Promotor besitzt den Vorteil der Induzierbarkeit. Der SV40-"early"-Promotor zeigt eine Expression bei hohem Spiegel in vitro in Knochenmarkszellen.
  • Die Erfindung richtet sich ebenfalls auf Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, welche die folgenden Schritte umfassen: (a) Ligieren einer Nukleotidsequenz, entsprechend der Verbindung, in einen Transfervektor, welcher aus DNA, RNA oder einer Kombination davon aufgebaut ist; (b) Transkribieren der Nukleotidsequenz von Schritt (a) mit einer RNA-Polymerase; und (c) Gewinnen der Verbindung.
  • Die Erfindung richtet sich auch auf prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, umfassend eine Nukleotidsequenz, bei welcher es sich um die oben beschriebenen Verbindungen handelt, oder welche bei der Transkription zu deren Entstehung führt. Die Zelle kann eine Tierzelle, eine hämatopoietische Stammzelle, welche zu Vorläuferzellen, reiferen und vollständig reifen Zellen aller hämatopoietischen Zell-Abstammungslinien führt, eine Vorläuferzelle, welche zu reifen Zellen aller hämatopoietischen Zell-Abstammungslinien führt, eine festgelegte Vorläuferzelle, welche zu einer spezifischen hämatopoietischen Abstammungslinie führt, eine T-Lymphozyten-Vorläuferzelle, ein unreifer T-Lymphozyt, ein reifer T-Lymphozyt, eine myeloide Vorläuferzelle oder eine Monozyten/Makrophagen-Zelle sein.
  • Die Erfindung richtet sich des Weiteren auf die Verwendung der obenstehenden Verbindungen zum Schützen von hämatopoietischen Stammzellen, Vorläuferzellen, festgelegten Vorläuferzellen, T-Lymphozyten-Vorläuferzellen, unreifen T-Lymphozyten, reifen T-Lymphozyten, myeloiden Vorläuferzellen oder Monozyten/Makrophagen-Zellen; und des Weiteren die ex vivo-Einbringung des obenstehenden Transfervektors in hämatopoietische Zellen, wodurch die Zellen gegen HIV resistent gemacht werden, so dass dadurch HIV unterdrückt/behandelt wird oder ein Schutz dagegen bereitgestellt wird. Die Zellen sind autologe oder heterologe Zellen mit oder ohne Myeloablation. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden drei Einzel- und ein Mehrfach-Hammerkopf-Ribozym(e) entworfen zum Abzielen auf verschiedene Stellen innerhalb der Mo-MLV-Psi-Verpackungsstelle, und ein Ribozym wurde entworfen zum Abzielen auf eine Stelle innerhalb der HIV-Psi-Verpackungsstelle (siehe 2). Mo-MLV wurde als ein Beispiel eines Retrovirus gewählt, bei welchem die Wirkungsprinzipien zu bestimmen waren. Diese Prinzipien werden auch für andere Retroviren, einschließlich HIV, zutreffen. Das Testen wurde auch für HIV-1 durchgeführt.
  • In der vorliegenden Erfindung enthalten das nichtmenschliche Tier und Nachkommen davon wenigstens einige Zellen, welche die nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung exprimieren oder beibehalten. Bei dem transgenen nichtmenschlichen Tier enthalten alle seine Keim- und Soma-Zellen die nicht natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung in exprimierbarer Form, welche in das Tier oder einen Vorfahren davon bei einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, wie in den U.S.-Patenten Nr. 4 736 866, 5 175 383, 5 175 384 oder 5 175 385 beschrieben; siehe auch (Van Brunt, 1988; Hammer, 1985; Gordon et al, 1987; Pittius et al., 1988; Simons et al., 1987; Simons et al., 1988).
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren ein, um Zellen gegen virale Infektion resistent zu machen, welches das Behandeln der Zellen ex vivo mit der oben beschriebenen, nicht natürlich vorkommenden Oligonukleotid-Verbindung umfasst. Darüber hinaus schließen, wie hierin verwendet, die Begriffe Antisinn und Ribozyme auch Verbindungen mit modifizierten Nukleotiden, Desoxynukleotiden, Peptidnukleinsäuren etc. ein. Diese werden für eine ex vivo-Behandlung oder topische Behandlung verwendet werden.
  • Eine wirksame Menge der nicht natürlich vorkommenden Oligonukleotid-Verbindung der vorliegenden Erfindung wird im Allgemeinen etwa 1 nM bis 1 mM Konzentration in einer Dosierungsform, wie einer Creme für topische Anwendung, einer sterilen injizierbaren Zusammensetzung oder einer anderen Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, umfassen. In Hinsicht auf topische Formulierungen wird es im Allgemeinen bevorzugt, dass zwischen etwa 50 μM und etwa 500 μM an nicht-natürlich vorkommender Oligonukleotid-Verbindung eingesetzt werden. Verbindungen, die Nukleotidderivate umfassen, wobei die Derivate chemisch modifizierte Gruppen wie Phosphorthioat- oder Methylphosphonat-Derivate beinhalten können, können in nanomolaren Konzentrationen wirksam sein. Solche Konzentrationen können auch verwendet werden, um eine Toxizität zu vermeiden.
  • Therapeutische Strategien, welche die Behandlung einer Krankheit unter Verwendung von Verbindungen dieser Erfindung beinhalten, sind im Allgemeinen die gleichen wie diejenigen, welche bei Antisinn-Vorgehensweisen beteiligt sind, wie beschrieben in der Antisinn-Bibliographie von (Chrisley, 1991). Insbesondere können Konzentrationen an verwendeten Verbindungen, Verfahren und Vorgehensweisen zur Verabreichung und beteiligte Formulierungen die gleichen sein wie diejenigen, welche für Antisinn-Anwendungen eingesetzt werden.
  • Eine "wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge, welche einen gewünschten Effekt in einem Säugetier vorsieht, welches einen gegebenen Befund und Verabreichungsplan aufweist. Zusammensetzungen umfassen wirksame Mengen zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsstoffen, Solubilisatoren, Emulgatoren, Hilfsstoffen oder Trägern, welche für eine Therapie nützlich sind. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierungen und schließen Verdünnungsmittel von verschiedenem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetatphosphat), pH und Ionenstärke, Zusatzstoffe, wie Albumin oder Gelatine, zur Verhinderung von Absorption an Oberflächen, Detergenzien (z. B. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Gallensäure-Salze), Solubilisierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol), Füllstoffsubstanzen oder Tonizitäts-Modifizierer (z. B. Lactose, Mannitol), kovalente Anheftung von Polymeren, wie Polyethylenglycol, an die nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid verbindung, eine Komplexierung mit Metallionen oder eine Einbindung des Materials in oder auf teilchenförmigen Präparationen von polymeren Verbindungen, wie Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polyvinylpyrrolidon etc. oder in Liposomen, Mikroemulsionen, Micellen, unilamellaren oder multilamellaren Vesikeln, Erythrozyten-Ghosts oder Sphäroplasten ein. Derartige Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, Geschwindigkeit der in vivo-Freisetzung und die Geschwindigkeit der in vivo-Beseitigung des Oligonukleotids beeinflussen. Andere Bestandteile können wahlfrei zugesetzt werden, wie Antioxidationsmittel, z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulargewichtige Polypeptide (mit weniger als etwa zehn Resten), d.h. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Chelatierungsmittel wie EDTA; und Zuckeralkohole, wie Mannitol oder Sorbitol. Mögliche Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung schließen die Formulierung von lipophilen Depots (z. B. Fettsäuren, Wachse, Öle) ein. Ebenfalls eingeschlossen von der Erfindung werden teilchenförmige Zusammensetzungen, beschichtet mit Polymeren (z. B. Polyoxameren oder Polyoxaminen), und nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotidverbindung, gekoppelt an Antikörper, die gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtet sind, oder gekoppelt an Liganden von gewebespezifischen Rezeptoren. Ferner können spezifische Nukleotidsequenzen angefügt werden, um die nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung der Erfindung zu dem Zellkern, Plastiden, Zytoplasma oder zu spezifischen Typen von Zellen zu lenken. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung beinhalten teilchenförmige Formen, schützende Überzüge, Protease-Inhibitoren oder Permeationsverstärker für verschiedene Wege der Verabreichung, einschließlich dem parenteralen, pulmonären, nasalen und oralen Weg.
  • Geeignete topische Formulierungen schließen Gels, Cremes, Lösungen, Emulsionen, Kohlenhydratpolymere, biologisch abbaubare Matrizen davon; Dämpfe, Nebel, Aerosole oder andere Inhalationsmittel ein. Die nicht-natürlich vorkommende Oligonukleotid-Verbindung kann in einer Waffel, Wachs, Folie oder einem festen Träger, einschließlich Kaugummis eingekapselt sein. Permeationsverstärker zum Unterstützen des Transports zur Bewegung über die Epithelschicht sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Dimethylsulfoxid und Glycole ein.
  • Ribonukleotid- und Deoxyribonukleotid-Derivate oder Modifikationen sind im Fachgebiet gut bekannt und sind kompatibel mit kommerziell erhältlichen DNA-Synthesizern (siehe Saenger, 1984, insbesondere Seiten 159-200). Nukleotide umfassen eine Base, Zucker und eine Monophosphatgruppe. Folglich können Nukleotidderivate, -substitutionen oder -modifikationen auf der Ebene der Base, des Zuckers oder des Monophosphats vorgenommen werden.
  • Eine große Anzahl an modifizierten Basen werden in der Natur gefunden, und ein großer Bereich an modifizierten Basen ist synthetisch erzeugt worden (Saenger, 1984; und CRC Handbook of Biochemistry). Geeignete Basen werden Inosin, 5'-Methylcytosin, 5'-Bromuracil, Xanthin, Hypoxanthin und andere derartige Basen einschließen. Zum Beispiel können Aminogruppen und Ringstickstoffe alkyliert sein, wie eine Alkylierung von Ringstickstoffatomen oder Kohlenstoffatomen, wie N1 und N7 von Guanin und C5 von Cytosin; Substitution von Keto- durch Thioketogruppen; Sättigung von Kohlenstoff=Kohlenstoff-Doppelbindungen und Einführung einer C-Glycosyl-Bindung im Pseudouridin. Beispiele von Thioketo-Derivaten sind 6-Mercaptopurin und 6-Mercaptoguanin.
  • Basen können mit verschiedenen Gruppen, wie Halogen, Hydroxy, Amin, Alkyl, Azido, Nitro, Phenyl und dergleichen, substituiert sein. Basen können mit anderen chemischen Spezies substituiert sein, wie Aminosäure-Seitenketten oder Linkern, welche andere chemische Einheiten beinhalten können oder nicht, z. B. saure oder basische Gruppen. Zum Beispiel kann Guanin (G3) mit Tyrosin substituiert sein, und Cytosin (C1) oder Adenin (A11) können in ähnlicher Weise mit Histidin substituiert sein.
  • Der Zuckereinheit des Nukleotids kann ebenfalls gemäß gut bekannten Verfahren im Fachgebiet modifiziert werden (Saenger, 1984). Diese Erfindung überspannt verschiedene Modifikationen am Zuckerrest von Nukleotiden, solange derartige Modifikationen nicht die Spaltungsaktivität der Verbindung zunichte machen. Beispiele von modifizierten Zuckern schließen das Ersetzen der sekundären Hydroxylgruppen mit Halogen-, Amino- oder Azido-Gruppen; 2'-Methylierung; Konformationsvarianten, wie etwa dass das O2'-Hydroxyl cis-orientiert zur Glycosyl C1. -N-Bindung liegt, um Arabinonukleoside bereitzustellen, und Konformationsisomere am Kohlenstoff C1 zum Erhalten von α-Nukleosiden, und dergleichen, ein. Ferner können Nicht-Ribose-Zucker, wie etwa Hexosen wie Glukose, Pentosen wie Arabinose, verwendet werden.
  • Die Phosphatgruppe von Nukleosiden wird ebenfalls Derivatisierung oder Modifikationen unterzogen, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel ergibt die Ersetzung von Sauerstoff mit Stickstoff, Schwefel oder Kohlenstoffderivaten jeweilig Phosporamidate, Phosphorthioate, Phosphodithiolate und Phosphonate. Substitutionen von Sauerstoff mit Stickstoff, Schwefel von Kohlenstoffderivaten können an Verbrückungs- oder Nicht-Verbrückungs-Positionen vorgenommen werden. Aus Arbeiten unter Beteiligung von Antisinn-Oligonukleotiden ist es allgemein nachgewiesen worden, dass Phosphodiester- und Phosphorthioat-Derivate effizient in Zellen eintreten können (insbesondere, wenn sie von kurzer Länge sind), möglicherweise aufgrund der Assoziation mit einem zellulären Rezeptor. Methylphosphonate werden wahrscheinlich von Zellen dank ihrer elektrischen Neutralität aufgenommen.
  • Die Phosphatgruppe kann vollständig durch Peptid-Nukleinsäuren ersetzt werden (siehe Hanvey et al., 1992; Nielson, 1991; und Egholm, 1992). Andere Ersetzungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt, zum Beispiel Siloxan-Brücken, Carbonat-Brücken, Acetamidat-Brücken, Carbamat-Brücken, Thioether-Brücken etc. (Uhlmann und Peymann, 1990).
  • Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der beanspruchten Erfindung. Die Erfindung wird in den Abschnitten über "Experimentelle Einzelheiten", welche folgen, veranschaulicht. Diese Abschnitte werden dargestellt, um beim Verstehen der Erfindung zu helfen.
  • BEISPIEL 1
  • In vitro Ribozym-katalysierte Spaltung von Mo-MLV-Psi-Verpackungsequenzen.
  • Um zu zeigen, dass die Zielsequenzen tatsächlich spaltbar waren, wurden in vitro-Spaltungsreaktionen vor den Ribozym-Testen in Zellkultur durchgeführt.
  • Es wurden vier Stellen in der Mo-MLV-Verpackungsregion gemäß dem Vorhandensein von GUC-Basen und der potenziellen Zugänglichkeit der Stellen innerhalb der vorgeschlagenen RNA-Sekundärstruktur, abgeleitet aus Zuker's FOLDRNA-Programm (Zuker et al., 1981), ausgewählt. Die Stellen wurden 243, 274, 366 und 553 genannt, basierend auf ihrem Nukleotidabstand zum 5'-Ende des viralen Transkripts (2). Diese Nukleotidpositionen werden beschrieben in "RNA Tumor Viruses" (Coffin, 1985). Es wurden zwei Typen von Ribozym entworfen: drei Einzel-Ribozyme, welche individuell auf die Stellen 243, 274 und 366 abzielten, mit 12 Nukleotide langen Armen, und ein Mehrfach-Ribozym, das auf alle vier Stellen abzielte, mit dazwischenliegenden Armen der Länge von Sequenzen zwischen jeder der Zielstellen. Die Stellen und der Gesamtentwurf sind in der 2 gezeigt.
  • Die Einzel-Ribozyme wurden durch Klonierung eines künstlichen doppelsträngigen Inserts mit überhängenden PstI- und EcoRI-Enden in pGEM3Zf(+) konstruiert. Die resultierenden Plasmide waren pGEM243, pGEM274 und pGEM366. Das Mehrfach-Ribozym wurde durch eine Variation von standardmäßigen in vitro-Mutagenese-Protokollen (Warrilow et al., 1992) konstruiert. Dieses Plasmid wurde pGEM-M7 genannt. Eine erfolgreiche Klonierung und die Sequenz-Integrität wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Die Psi-Verpackungssequenz, im Bal I-Bal I-Fragment von Mo-MLV, abgeleitet aus pMLV-1 (Coffin, 1985), wurde in den Vektor pGEM3Zf(+) kloniert, und als ein Substrat für in vitro-Ribozym-Spaltung transkribiert. Eine "Run-off"-Transkriptionsmischung (50 μl) zum Erzeugen entweder von Ribozymen oder Substrat enthielt 1 μg linearisierte, mit Proteinase K behandelte, DNA-Matrize, 30 mM Dithiothreitol, 400 μM von jeden rNTPs, 40 mM Tris-Cl, pH 8,0, 2 mM Spermidin, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 μl [a-32P]-UTP (400-800 Ci/mMol, 10 mCi/ml), 1 Unit RNasin und 10 Units T7- oder SP6-RNA-Polymerase (Stratagene). Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden 10 Units RNase-freie DNase (Promega) zugegeben, und die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion wurden RNA-Transkripte durch Zusetzen von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen Ethanol gefällt. Für Spaltungsreaktionen wurden das Ribozym und Substrat (Molverhältnis 1 : 1) bei 80°C während 2 Minuten präinkubiert, gefolgt von 30 Minuten Inkubation bei 37°C in Gegenwart von 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, und 10 mM MgCl2. Die Reaktionen wurden gestoppt durch die Zugabe eines gleichen Volumens an Stop-Mix (8 M Harnstoff, 50 mM EDTA, 0,05 % Bromphenolblau und 0,05 % Xylencyanol) und auf einem denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgel analysiert, welches 8 M Harnstoff enthielt, gefolgt von Autoradiographie.
  • Konstruierte Ribozyme, die auf verschiedene Stellen der proviralen Mo-MLV-Verpackungssequenz abzielten, spalteten gezeigtermaßen die Ziel-RNA in vitro an den gewählten Stellen.
  • Für die Mehrheit der Ribozymkonstrukte führte eine Inkubation eines 32P-markierten Psi-Transkripts mit 32P-markierter Ribozym-RNA in einer ungefähr äquimolaren Menge zu einer effizienten Spaltung des Substrats unter milden physikalischen Bedingungen (37°C, 10 mM MgCl2 und 50 mM Tris.Cl, pH 7,5). Repräsentative Beispiele dieser Verdaus sind in der 6 gezeigt. Die Größe der gespaltenen Psi-Fragmente, erzeugt durch Rz274 und Rz366, waren konsistent mit der Lokalisierung von vorhergesagten Stellen für die Spaltung, was zu Banden von 62nt plus 473nt bzw. 154nt plus 381nt führte. Das Mehrfach-Ribozym (Rz-M7) erzeugte vier Fragmente (50nt, 92nt, 187nt und 240nt), wie vorhergesagt, sowie mehrere partiell gespaltene Fragmente (3). Für Rz243 gab es keine sichtbare Spaltung bei 37°C und eine schwache Spaltung, welche passend große Fragmente ergab, bei 50°C (Daten nicht gezeigt).
  • Mit der Ausnahme von Ribozym 243 zeigten diese Ergebnisse eine effiziente ortsspezifische Ribozym-vermittelte Spaltung.
  • BEISPIEL 2
  • Anti-Mo-MLV-Verpackungsstelle(Psi)-Konstrukte
  • Im Anschluss an die Demonstration einer effizienten in vitro-Spaltung wurden die konstruierten Ribozyme sowie eine lange Antisinn-Sequenz, komplementär zur Psi-Verpackungsregion, in die 3' untranslatierte Region des neor-Gens kloniert, welches an den "early"-Promotor von Simian Virus 40 (SV40) gekoppelt war (4). neor ist ein prokaryotisches Gen, welches ein Enzym codiert, das Neomycin oder das Neomycinanalog G418 phosphoryliert und dadurch inaktiviert. Letzteres ist toxisch für Säugerzellen, und die Expression eines exogenen neor-Gens ermöglicht das Zellüberleben. Dieses Konstrukt, mit dem SV40-Promotor, gekoppelt an das neor-Gen, liegt innerhalb eines Säuger-Expressionsvektors, pSV2neo, vor und wird diagrammartig in 4 gezeigt.
  • Die Ribozym-Inserts und eine Antisinn-Kontrolle wurden in eine SmaI-Stelle in der 3' untranslatierten Region von neor mittels glattendiger Ligation kloniert. Die resultierenden Vektoren wurden als pSV243, pSV274, pSV366, pSVM7 bzw. pSVas Psi (das Antisinn-Konstrukt) bezeichnet.
  • BEISPIEL 3
  • Transfektion von Konstrukten in 3T3-Mo-MLV herstellende Zelllinien.
  • Die verschiedenen pSV2neo-basierenden Konstrukte wurden unter Anwendung eines Calciumphosphat-Transfektionsprotokolls (Chen et al., 1987) in 3T3-Mo-MLV-Zellen transfiziert. Positive Kolonien waren diejenigen, welche sich nach 9-12 Tagen in Gegenwart von 500 μg/ml G418 bildeten. Für jedes Konstrukt wurden 4-7 Kolonien unter Verwendung von Klonierungszylindern isoliert. Diese Kolonien wurden wachsen gelassen, in flüssigem N2 aufbewahrt und dann für weitere Assays verwendet. Nach 10-14 Tagen Selektion in 500 μg/ml G418 wurden mehrere stabile klonale Zelllinien für jedes Konstrukt etabliert. Um die Integration von transfizierten DNA-Expressionskonstrukten zu bestätigen, wurde genomische DNA aus bestimmten der transfizierten Zelllinien hergestellt, und eine Southern-Analyse wurde ausgeführt. Die Restriktionsenzyme HindIII und NruI wurden verwendet, um genomische DNA zu verdauen und ein Fragment zu erzeugen, welches das neor-Gen plus Inserts (Ribozyme oder Antisinn) enthält. Das Vorliegen des Konstruktes konnte dann durch Verwendung einer neor-spezifischen Sonde bestimmt werden. Aus der in 7 gezeigten Southern-Analyse ist es deutlich, dass die sowohl mit Ribozym- als auch Antisinn-Konstrukten transfizierten und in G418 selektierten Zellen das neor-Gen plus die entsprechenden Ribozym- oder Antisinn-Sequenzen enthielten. Die Größen der HindIII-NruI-Fragmente, welche mit der neor-Sonde hybridisieren, beliefen sich festgestelltermaßen in jedem Fall auf die vorhergesagte Größe, nämlich 1,3 kb für das neor-Gen allein, 1,38 kb für neor plus dem Einzel-Ribozym; 1,98 kb für neor plus einem Mehrfach-Ribozym; 1,89 kb für neor plus der Antisinn-Sequenz.
  • Die Expression der Ribozym- oder Antisinn-Konstrukte wurde aufgrund von G418-Resistenz in den positiven Transfektanten vorhergesagt. Dies wurde in den transfizierten Zellen unter Anwendung von RNase-Protektions-Assay weiter untersucht. Gesamt-RNA wurde unter Anwendung eines Guanidiumthiocyanat-Vorgehens aus manchen der Zelllinien extrahiert, 20 μg Gesamt-RNA wurden dann mit den entsprechenden 32P-markierten Ribosonden (5 × 104 cpm) in einer Lösung hybridisiert, welche 80 % entionisiertes Formamid, 100 mM Natriumcitrat pH 6,4, 300 mM Natriumacetat pH 6,4, 1 mM EDTA enthielt, woran sich ein RNase-Verdau der hybridisierten RNAs (5 μg/ml RNase A und 10 Units/ml RNase T1) anschloss. Wenn das Ribozym nicht exprimiert wurde, dann wird die komplementäre Ribosonde nicht in der Lage sein, zu binden. Die RNA würde dann einzelsträngig bleiben und würde von RNase vollständig verdaut werden. Die Reaktionsmischung wurde dann mittels Elektrophorese aufgetrennt. Wie gezeigt in der 8, enthüllten die Assays, dass alle Ribozyme und Antisinn-Konstrukte wie erwartet exprimiert wurden. Die geschützten Fragmente belaufen sich auf 65 bp (Einzel-Ribozyme); 588 bp Mehrfach-Ribozyme und 524 bp (Antisinn).
  • BEISPIEL 4
  • Fähigkeit von Konstrukten zur Unterdrückung von Mo-MLV-Replikation.
  • Nach der Einrichtung von stabilen klonalen 3T3-Mo-MLV-Zelllinien, welche mit verschiedenen Konstrukten transfiziert waren, wurde ein XC-Plaque-Assay angewandt, um den Spiegel der Mo-MLV-Replikation auszuwerten. Der XC-Assay ist ein syncytialer Plaque-Assay für Mo-MLV, welcher auf der Beobachtung basiert, dass Mo-MLV-erzeugende Zellen eine Fusion von XC-Zellen verursachen können. Mo-MLV wurde wie beschrieben in (Gautsch et al., 1976) titriert, mit der Ausnahme, dass 8 μg/ml Polybrene (Sigma) während der Infektion vorhanden waren, um die virale Bindung an die Zielzellen zu verstärken. Überstände aus der Kultur von verschiedenen Mo-MLV-produzierenden Zelllinien wurden zu nicht-infizierten Maus-NIH3T3-Zellen zugegeben, welche mit 8 μg/ml Polybrene 1 h vor der Infektion vorbehandelt worden waren. Nach 20 h Inkubation in Wachstumsmedium wurden die infizierten NIH3T3-Zellen mit XC-Zellen in einer 2 × 2 mm2 großen Rasterfeld-Platte 3 bis 4 Tage lang cokultiviert. Die Platten wurden dann mit Methanol fixiert, mit 1 % Methylenblau plus 0,1 % Enzianviolett gefärbt und mittels Mikroskopie hinsichtlich Syncytium-Plaques durchrastert. Um zu gewährleisten, dass die Assays innerhalb des linearen Abschnitts der Dosis-Antwort-Kurve durchgeführt wurden, wurden 3,5 × 105 Zellen pro Platte mit zweifachen seriellen Verdünnungen des Virus infiziert und 24 h später zu einer gemischten Kultur mit XC-Zellen passagiert. Die Ergebnisse in der Tabelle 1 stammten aus drei unabhängigen Experimenten. 74 % bis 77 % Inhibition der Syncytium-Plaquebildung wurden aus den Zellen, welche Rz274, Rz366, Rz-M7 und As-Psi enthielten, in Bezug auf den pSV2neo-Vektor enthaltenden Zellen beobachtet, wohingegen keine offensichtliche Inhibition für Rz243-enthaltende Zellen gezeigt wurde. Diese Daten sind konsistent mit in vitro-Spaltungsergebnissen (6), in welchen Rz243 das Substrat unter den angewandten Bedingungen nicht effizient zu spalten schien.
  • Diese unterdrückenden Effekte wurden unter Anwendung von viralem RNA-Dot-Blotting bestätigt, bei welchem 1 ml Überstand aus einer 16-h-Kultur von Virus-produzierenden NIH3T3-Zellen durch Zentrifugieren (12 000 U/min., 10 min., 4°C) in einer Mikrozentrifuge geklärt wurde. Virale RNA wurde in 8 % PEG 8000 und 0,5 M NaCl präzipitiert. Nach der Phenol-Chloroform-Extraktion wurde RNA auf positiv geladene Nylonmembran (Zeta-Probe, Bio-Rad) in einer Alkali-Transferlösung (Reed et al., 1985) geblottet. Eine Hybridisierung wurde bei 42°C über Nacht in 50 % Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardt-Lösung, 0,5 % SDS, 100 mg/ml denaturierter Heringssperma-DNA und 32P-markierter Ribosonde, die vom T7-Promotor von pGEM-Psi transkribiert worden war, durchgeführt. Virale RNA wurde mittels Dot-Szintillations-Zählung quantifiziert. Virale RNA in den Überständen aus den Ribozym- oder Antisinn-transfizierten 3T3-Mo-MLV-Zellen wurde gemessen und mit derjenigen im Überstand von pSV2neo-transfizierten 3T3-Mo-MLV-Zellen verglichen. Wie aus 9 und Tabelle 2 ersehen werden kann (außer für Rz243-exprimierende Zellen), war die Menge an erzeugter viraler RNA aus allen Zelllinien, welche Ribozyme oder Antisinn exprimierten, im Wesentlichen um Mengen verringert, ähnlich zu denjenigen, die mittels Syncytial-Assay beobachtet wurden,.
  • Im Anschluss an die Transfektion dieser Ribozymkonstrukte in Mo-MLV-infizierte Zellen zeigten nur diejenigen Ribozyme, welche eine effiziente in vitro-Spaltung aufwiesen, die Fähigkeit, Mo-MLV-Replikation in vivo zu unterdrücken (um ungefähr 70-80 %). Diese Ergebnisse demonstrieren eine direkte Korrelation zwischen der in vitro-Spaltung und der Ribozym-vermittelten Virusunterdrückung in vivo.
  • Die vorangehenden Experimente wurden die Basis für weitere Untersuchungen von Ribozymen, welche zum Abzielen auf Stellen auf der HIV-Psi-Verpackungssequenz entworfen waren, um den viralen Titer zu verringern. Tabelle 1. Syncytium-Plaques, induziert von Mo-MLV, welches aus transfizierten Zellen freigesetzt wurde.
    Figure 00360001
    • * 10–2 Verdünnung des Überstands von Rz- oder As-Konstrukt-enthaltenden Zellen wurde bei der Infektion von NIH3T3-Zellen verwendet.
    • † Die Zahl ist ein Mittelwert der Plaque-Zählungen aus zwei klonalen Linien von jedem Konstrukt in drei unabhängigen Experimenten. Die Zahlen werden als der Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Replikat-Platten, welche die gleiche Verdünnung von infizierten Zellen erhielten, enthielten im Allgemeinen ähnliche Anzahlen an syncytialen Plaques.
    Tabelle 2. Ausmaß der Hybridisierung an virale RNA-Dot-Blots
    Figure 00360002
    • * cpm-Zähleinheiten wurden abgeleitet aus zwei Blots in 1:1-Verdünnungsreihe. Der virale RNA-Dot-Blot-Assay wurde durchgeführt, wie beschrieben in Materialien und Methoden. Im Anschluss an die Autoradiographie wurden die Filter, entsprechend jedem Dot bzw. Auftragspunkt, für eine Flüssigkeits-Szintillations-Zählung ausgeschnitten.
  • BEISPIEL 5
  • Das Anti-HIV-Verpackungsstellen-Konstrukt.
  • Eine GUA-Stelle wurde in der Psi-Verpackungsregion (Nuk. 735 bis Nuk. 765 vom 5'-Ende des HIV-Genoms) von HIV-1 (HIVSF2, Levy, 1984) für das Ribozym-Abzielen gewählt. Wie für die vorangehenden Konstrukte wurde das synthetische Ribozym-Insert in eine SmaI-Stelle in der 3' untranslatierten Region des neor-Gens des Vektors pSV2neo durch glattendige Ligation kloniert. Eine erfolgreiche Klonierung und die Sequenz-Integrität wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Dieses Konstrukt wurde als pSV-Rz-HIV-Psi bezeichnet. Die 4 zeigt ein Diagramm des Konstrukts.
  • BEISPIEL 6
  • Transfektion von pSV-Rz-HIV-Psi-Konstrukt in T-Lymphozyten
  • Das Anti-HIV-Verpackungsstellen-Konstrukt, pSV-Rz-HIV-Psi, wurde in Sup T-1-Zellen, eine humane T-Lymphom-Zelllinie, elektroporiert. Exponentiell wachsende Zellen wurden geerntet, und die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde durch Farbstoffausschluss gezählt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und bei einer Dichte von 1 × 107 lebensfähigen Zellen/ml in RPMI-Medien ohne FCS aber mit 10 mM Dextrose und 0,1 mM Dithiothreitol resuspendiert. 0,4 ml der Zellsuspension und 10 μg pSV-Rz-HIV-Psi-Plasmid-DNA wurden pro Elektroporation in 0,4cm-Küvetten (Bio-Rad) verwendet. Die Zell- und DNA-Mischung wurde einem einzelnen Puls von 960 μF, 200 V, aus einem "Gene Pulser" (Bio-Rad) unterzogen. Nach dem Schocken wurde die Küvette 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Zellen wurden dann in 10 ml RPMI-Medien mit 10 % FCS überführt und in einen Inkubator (5% CO2, 37°C) gebracht. 48 Stunden nach der Elektroporation wurden die Zellen in Medium, welches mit 800 μg/ml G418 ergänzt war, selektiert. 9-12 Tage später wurden positive Kolonien isoliert und als klonale Isolate herangezogen, welche in einem HIV-Protektions-Assay verwendet werden sollten.
  • BEISPIEL 7
  • Überprüfung des Vermögens von Ribozym-Expressionskonstrukten, Schutz gegen Herausforderung mit HIV zu vermitteln.
  • Zwei Assays, p24-Antigen und Syncytiumbildung, wurden durchgeführt, um die Effektivität des Anti-HIV-Psi-Ribozym-Konstrukts in Zellkultur zu überprüfen. Der HIV-1-p24-Antigen-Assay ist ein Enzym-Immunoassay, welcher einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen HIV-Kernantigen, aufbeschichtet auf Mikrovertiefungs-Streifen, verwendet. Der HIV-1- Syncytium-Assay basiert auf der Beobachtung, dass HIV-1 mit Ziel-T-Lymphozyten durch Verursachen einer Fusion wechselwirkt, welche zur Bildung von Syncytien, großen Zellen, die viele Zellkerne enthalten, führt. Die klonalen, Ribozymkonstrukt-exprimierenden Zellen, plus Kontrollen, wurden mit HIV-1 (SF2) bei einer m.o.i. (Multiplizität der Infektion) von 0,1 bis 1 infiziert. Nach 2 Stunden wurden die Zellen gewaschen, und 10 ml frische Medien wurden zugegeben. Alle 3-4 Tage wurde die Anzahl sowohl von Syncytien als auch lebensfähigen Zellen gezählt. Für eine Syncytiumbildung wurde eine um ungefähr zwei log höhere Dosis erfordert, um das gleiche Ergebnis wie in der Kontrolle zu zeigen, welche das Ribozym nicht einschloss (Tabelle 3). Darüber hinaus verursachte das Vorhandensein des Ribozyms eine Verzögerung in der Syncytiumbildung (Tabelle 4).
  • In einem anderen experimentellen Protokoll wurden die Zellen pelletiert, und ein Aliquot des Überstands wurde für den p24-Assay entnommen. Repräsentative Ergebnisse sind in der 10 gezeigt. In diesem Experiment bestand eine Inhibition von p24-Spiegeln am Tag 22 nach der Herausforderung. An den Tagen 8 und 13 nach der Infektion wurde eine mehr als 80%ige Inhibition der p24-Herstellung in Ribozym-exprimierenden Zellen, verglichen zu Zellen mit dem Vektor allein, beobachtet, wohingegen am Tag 22 ein ungefähr 60%iger Spiegel der Inhibition beobachtet wurde.
  • Diese Ergebnisse liefern Beweise, dass die HIV-Replikation durch die Zugabe eines Ribozyms gegen die Psi-Verpackungsstelle in T-Lymphozyten inhibiert werden kann. Tabelle 3. Syncytien-Bildung
    Figure 00380001
    • * HIV-1 (SF33) wurde im Infektionsvermögens-Assay verwendet (m.o.i. von 0,1-1).
  • Tabelle 4. Syncytien-Bildung von infizierten SupT1-Zellen
    Figure 00380002
  • Die Anzahl von Syncytien in jeder Kultur wurde in vier Niedrig-Vergrößerungs-Feldern ausgezählt und wurde gemittelt; -: keine Syncytien; +: 1-5 Syncytien; ++: 6-10 Syncytien; +++: mehr als 10 Syncytien. Bei der Scheinprobe handelt es sich um nicht-infizierte SupT1-Zellen.
  • BEISPIEL 8
  • Wir überprüften ebenfalls die Effektivität der anderen (zusätzlich zu den auf ψ abzielenden) Ribozym-Konstrukte. In unerwarteter Weise haben wir festgestellt, dass ein Einzel-Ribozym, welches auf eine Sequenz innerhalb des tat-Gens von HIV-1 abzielte (Rz2), ebenfalls wirksam zum Inhibieren der HIV-1-Replikation war. Wir untersuchten die Sequenzkonservierung dieser Region von tat, und stellten fest, dass sie unter verschiedenen HIV-1-Isolaten hochkonserviert ist (siehe 12). Dies sind die ersten Experimente mit dieser tat-Sequenz als einer HIV-1-Ribozym-Zielstelle. Die Berichte in der Literatur sind in der 13 erwähnt, wobei die angegebenen tat-Zielstellen von anderen Forschern angezielt worden waren; Stelle 1 (Crisell et al., 1993) und Stelle 3 (Lo et al., 1992, und Zhou et al., 1992).
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Lymphozyten des humanen peripheren Bluts (PBLs) wurden mit einer Anzahl von rekombinanten Retroviren transduziert, einschließlich RRz2, einem LNL6-basierten Virus mit einem Ribozym, das auf das HIV-tat-Gentranskript abzielt, inseriert innerhalb der 3'-Region des Neomycin-Resistenzgens (neor); RASH-5, einem LNHL-basierten Virus, enthaltend eine Antisinn-Sequenz zur 5'-Leader-Region von HIV-1 stromabwärts des humanen Cytomegalovirus(HCMV)-Promotors; und R20TAR, einem LXSN-basierten Virus mit 20 Tandemkopien der HIV-1-TAR-Sequenz, gesteuert von der langen terminalen Wiederholungseinheit (LTR) von Moloney-Maus-Leukämie-Virus. Nach G418-Selektion wurden die transduzierten PBLs mit dem HIV-1-Laborstamm IIB und einem primären klinischen Isolat herausgefordert. Die Ergebnisse zeigten, dass PBLs aus verschiedenen Spendern transduziert werden konnten, und dass dies Resistenz gegen HIV-1-Infektion vermittelte. Für jedes dieser Konstrukte wurde eine Reduktion von ungefähr 70 % hinsichtlich des p24-Antigen-Spiegels im Verhältnis zu den entsprechenden, mit Kontrollvektor transduzierten, PBLs beobachtet. Molekulare Analysen zeigten eine konstitutive Expression aller transduzierten Gene von dem retroviralen LTR aus – es wurde jedoch kein nachweisbares Transkript von dem internen HCMV-Promotor für das Antisinn-Konstrukt beobachtet. Transduktion von, und anschließende Transgen-Expression in, PBLs hatte keinen Einfluss auf die Oberflächenexpression von entweder CD4+/CD8+ (gemessen mittels Flusszytometrie) oder auf die Zellproliferation (untersucht durch [3H]-Thymidin-Aufnahme-Assay). Diese Ergebnisse zeigen die potenzielle Nützlichkeit dieser gentherapeutischen Anti-HIV-1-Mittel und verdeutlichen den vorklinischen Wert dieses PBL-Assay-Systems.
  • Das humane Immundefizienz-Virus (HIV) ist als das ätiologische Agens von erworbenen Immundefizienz-Syndrom (AIDS) und den damit verbundenen Erkrankungen identifiziert worden (Barre-Sinoussi, F., et al., 1983; Gallo, R.C., et al., 1984). Gegenwärtig gibt es keine angemessene Behandlung für diese Krankheit, und die Verwendung von genetischer Manipulation zum Inhibieren der HIV-Replikation scheint eine neuartige und vielversprechende Herangehensweise an die AIDS-Therapie zu sein. Mögliche gentherapeutische Herangehensweisen zum Eingreifen in Aspekte der HIV-1-Replikation schließen die Anwendung von Ribozym-Expression zum katalytischen Spalten und daher Inaktivieren von HIV-I-RNA; Antisinn-RNA-Expression zum Inhibieren der reversen Transkription, Prozessierung und Translation von HIV-RNA; Expression von Mutanten-HIV-Struktur- oder Regulationsgenen mit dominanter Repressions-Aktivität; und Expression von RNA-Ködern zum Inhibieren von HIV-1-Transkription, -Prozessierung und -Verpackung ein.
  • In bis heute veröffentlichten Berichten waren retrovirale Vektoren das gewählte Zuführungsverfahren für die Einbringung von Transgenen und gentherapeutischen Anti-HIV-1-Mitteln. Diese Vektoren sind in humanen hämatopoietischen T-lymphozytischen Zelllinien getestet worden, wie CEM, SupT1 und MOLT-4 (Sarver, N., et al., 1990; Weerashingee, M., et al., 1991; Yu, M., et al., 1993; Yamada, O., et al., 1994; Rhodes, A., und James, W., 1991; Sczakiel, G., et al., 1992; Lisziewicz, J., et al., 1991, 1993; Trono, D., et al., 1989; Malim, M.H., et al., 1992), welche mehrere wünschenswerte Merkmale aufweisen, einschließlich unbeschränktem Wachstumspotenzial für in-vitro-Assays, aber den Nachteil besitzen, transformierte Zellen zu sein. Deswegen ist es notwendig, die Effektivität von gentherapeutischen Anti-HIV-Mitteln in humanen primären Zellen, wie Lymphozyten des peripheren Bluts (PBLs) zu testen. Bei diesen Zellen ist es die CD4–-Subpopulation, welche die Schlüssel-Zielzelle für eine HIV-Infektion ist, und es ist diese Zellpopulation, welche hauptsächlich in AIDS-Patienten depletiert wird. Gegenwärtig gibt es jedoch keine Berichte, in welchen Primär-PBL-Assays für gentherapeutische Anti-HIV-Vorgehensweisen angewandt worden sind.
  • Wir haben eine umfassende Untersuchung an menschlichen PBLs durchgeführt, um i) Anti-HIV-Mittel, einschließlich Ribozym, Antisinn und RNA-TAR-Köder, zu testen, und ii) die Bedingungen für PBL-Transduktion, G418-Selektion und HIV-1-Herausforderung sowohl unter Verwendung von Laboratoriums- als auch klinischen HIV-1-Isolaten zu ermitteln. Diese Experimente zeigen, dass eine Transduktion von primären PBLs mit retroviralen Konstrukten, welche ein Ribozym, das auf das HIV-1-tat-Gen abzielt; eine Antisinn-Sequenz, die zur 5'-Leader-Region von HIV-1 komplementär ist; oder einen 20-TAR-RNA-Köder exprimieren, eine wesentliche Resistenz gegen HIV-1-Infektion vermittelte. Dieses Assay-System ist eine Verbesserung gegenüber früheren Assays von retroviralen Anti-HIV-Konstrukten und dient dazu, gegenwärtige T-Zelllinien-Assays zu ergänzen. Unter Verwendung dieses Systems haben wir signifikante Daten für die klinische Relevanz hinsichtlich HIV-Gentherapie erbracht.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Zelllinien: Verpackungszelllinien ψ2 (Mann, R., et al., 1983) und PA317 (ATCC CRL 9078) wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DME) kultiviert, welches 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt. PA317-Zellen wurden einer Selektion (5-7 Tage) alle sechs Wochen in HAT-Medium unterzogen. ψCRE und ψCRIP (Danos, O., und Mulligan, R.C., 1988) wurden in DME plus 10 % Rinder-Kälber-Serum (BCS) wachsen gelassen.
  • Retrovirale Vektorkonstruktionen: Ein chemisch synthetisiertes Hammerkopf-Ribozym, welches auf das HIV-1-tat-Gen-Transkript abzielte (nt 5865 bis nt 5882 von HIV-1 IIIB, GGAGCCAGTAGATCCTA), wurde in die SalI-Stelle des Vektors LNL6 (Bender, M. A., et al., 1987) innerhalb der 3' untranslatierten Region des Neomycin-Resistenzgens kloniert (15A). Dieses Konstrukt wurde RRz2 genannt. Für das Antisinn-Konstrukt wurde ein 550 bp großes BamHI-Fragment des HXB2-Klons, enthaltend einen Teil von R, US und den 5'-Bereich des gag-Gens (nt 78 bis nt 628), in einer Antisinn-Orientierung in eine BamHI-Stelle des LNHL-Vektors kloniert (15B), welcher aus dem Vektor pNHP-1 durch Entfernen der humanen HPRT-cDNA an der BamHI-Stelle abgeleitet worden war (Yee, J. K., et al., 1987). Das resultierende Antisinn-Konstrukt wurde RASH5 genannt. Das polymere-TAR-Konstrukt wurde hergestellt durch Inserieren eines 20TAR-Fragmentes (20 Tandem-Kopien) in XhoI- und BamHI-Stellen innerhalb des LXSN-Vektors (Miller, A. D., et al., 1989), und R20TAR genannt (15C). Die Sequenzintegrität und Orientierung der Konstrukte wurden entweder durch DNA-Sequenzierung oder Restriktionsenzym-Kartierung bestätigt.
  • Herstellung von amphotropen Retroviren: Die Retrovieren LNL6 und RRz2 wurden durch Trans-Infektion hergestellt, beinhaltend die Verpackungszelllinien ψ2 und PA317-Zellen. Ungefähr 80 % konfluente ψ2-Zellen wurden mit 10 μg der Konstrukt-DNA unter Verwendung von Calciumpräzipitation und Inkubieren in DME-Medium, enthaltend 10 % FBS (DME-Wachstumsmedium), während 14 Stunden transfiziert. Dieses Medium wurde dann entfernt, mit frischem DME-Wachstumsmedium ersetzt und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2, inkubiert. Ecotropischer viraler Überstand wurde dann von den transfizierten ψ2-Zellen abgesammelt und verwendet, um subkonfluente (60-80 %) PA317-Zellen in DME-Wachstumsmedium in Gegenwart von 4 μg/ml Polybrene zu infizieren. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C, 5 % CO2, wurden die infizierten PA317-Zellen trypsinisiert und 1:20 in DME-Wachstumsmedium, enthaltend 750 μg/ml G418, aufgeteilt. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage gewechselt, bis sich Kolonien bildeten. 10 bis 29 Klone von jedem der Konstrukte wurden abgenommen und für Assays hinsichtlich Virentiter (Assay hinsichtlich neomycinresistenter Kolonien) und hinsichtlich replikationskompetentem Retrovirus (RCR) (Miller, A.D., und Rosma, G. J., 1989) expandiert. Die Retroviren LNHL, RASH5, LXSN und R20TAR wurden durch Transfizieren von ψCRE- und Infizieren von ψCRIP-Zellen hergestellt. 20 bis 96 Klone jedes Konstrukts wurden für Titer- und RCR-Assays isoliert.
  • Transduktion von humanem PBLs: Periphere Blut-Mononuklearzellen (PBMCs) wurden aus Leukopacks von gesunden Spendern durch Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrifugation präpariert. CD4+-Zellen wurden durch Depletion von CD8+-Zellen unter Verwendung einer MicroCELLector-Flasche (Applied Immune Science) gemäß den Anweisungen des Herstellers angereichert. Die CD4+-angereicherten PBLs (5 × 105 Zellen/ml) wurden unter Verwendung von 5 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA, Sigma) oder 10 ng/ml des monoklonalen OKT3-Antikörpers (Janssen-Cilag) in RPMI-1640-Medium, welches ergänzt war mit 10 % FBS und 20 Units/ml humanem rekombinanten Interleukin 2 (RPMI-Wachstumsmedium), 48 bis 72 Stunden lang stimuliert. Die stimulierten PBLs wurden durch Exposition der Zellen an eine von Produer-Zellen freie retrovirale Stammlösung während 18 Stunden in Gegenwart von 4 μg/ml Polybrene transduziert (eine m.o.i. von 0,5 wurde angewandt). 48 Stunden nach der Transduktion wurden PBLs in RPMI-Wachstumsmedium, welches 300 bis 500 μg/ml G418 enthielt, während 10 bis 14 Tagen selektiert. Hieran schloss sich eine Erholungsperiode von einer Woche in frischem RPMI-Wachstumsmedium ohne G418 an, bevor die PBLs mit HIV-1 herausgefordert wurden.
  • HIV-1-Infektion: Die infektiösen Titer (TCID50) des HIV-1-Laboratoriumstammes IIIB und des klinischen Isolats 82H wurden auf menschlichen PBLs bestimmt, wie beschrieben (Johnson, V. A. et al., 1990). 5/105 transduzierte PBLs wurden mit 100 TCID50 HIV-Virus während 2 Stunden bei 37°C infiziert, gefolgt von zweimaligem Waschen der Zellen mit RPMI-1640 und Resuspendieren der Zellen in 5 ml RPMI-Wachstumsmedium. Alle 3 bis 4 Tage wurden Aliquots des Überstands für einen p24-Antigen-ELISA (Coulter) als Proben entnommen.
  • RNA-Analyse: Gesamt-Zell-RNA wurde unter Anwendung des Guanidium-Isothiocycanat-Verfahrens (Chrigwin, J.J., et al., 1979) aus transduzierten PBLs extrahiert. 15 μg RNA wurde auf einem 1 %igen Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert, auf eine Nylonmembran (Hybond-N) überführt und mit 32P-markierter neor-spezifischer Sonde, 550-bp-BamHI-Fragment von HIV-1 HXB2 oder 20-TAR-Fragment für die Detektion von neor-Ribozym-, Antisinn- bzw. TAR-Expression hybridisiert.
  • FACS-Analyse von transduzierten PBLs: 1 × 105 transduzierte PBLs wurden 20 Minuten lang bei 4°C mit CD4- oder CDS-spezifischen Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-konjugierten monoklonalen Antikörpern (Becton Dickinson) oder mit einem Kontrollantikörper (FITC-Maus-IgG1, Becton Dickinson) inkubiert. Nach zwei Waschungen in PBS wurden die Zellen auf einem Becton Dickinson FACScan analysiert.
  • Proliferations-Assay: PBLs wurden wie oben beschrieben transduziert. Im Anschluss an eine Selektion in G418 und Erholung in frischem RPMI-Wachstumsmedium wurde die Lebensfähigkeit durch Trypan-Blau-Ausschluss überprüft, und die Zellzahlen wurden auf 1 × 106 lebensfähige Zellen/ml eingestellt. Vertiefungen (Corning-24-Vertiefungs-Platten) in dreifacher Ausfertigung wurden mit 1 × 106 Zellen angeimpft, und 1 μCi 6-[3H]-Thymidin (5 Ci/mMol, Amersham) wurde in jede Vertiefung zugesetzt. Nach 48 Stunden in Kultur wurden die Zellen auf Glasfaserfilter unter Vakuum überführt, dreimal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 3 × 5 ml eiskalter 10%iger Trichloressigsäure (w/v) präzipitiert. Die Filter wurden mit Ethanol gespült und einer β-Scintillations-Zählung unterzogen. Eine statistische Analyse wurde unter Anwendung des t-Tests nach Student durchgeführt.
  • ERGEBNISSE
  • Erzeugung von amphotropen Retroviren bei hohem Titer, enthaltend verschiedene Transgene. Drei verschiedene Retroviren, welche die Transgene (Ribozym, Antisinn oder polymeres TAR) exprimierten, wurden basierend auf den unterschiedlichen Vektor-Grundgerüsten konstruiert. RRz2 wurde durch Inserieren eines Anti-HIV-tat-Ribozym-Gens in die 3' untranslatierte Region eines neor-Gens, gesteuert von der langen terminalen Wiederholungseinheit (LTR) von MoMLV, in dem LNL6-Vektor konstruiert (15A). Ein chimäres RNA-Transkript, welches sowohl die neor- als auch Ribozym-Gene enthält, wird von diesem Retrovirus erwartet. Im Retrovirus RASH5 (15B) könnte die Antisinn-Sequenz entweder vom viralen LTR oder vom internen humanen CMV-Promotor transkribiert werden. Beim R20TAR-Konstrukt wird polymeres-TAR vom viralen LTR aus exprimiert (15C). Die drei retroviralen Konstrukte und die entsprechenden Kontrollvektoren wurden verwendet, um amphotrope Producer-Zelllinien zu erzeugen. Die Virentiter lagen innerhalb des Bereichs von 105 bis 5 × 106 cfu/ml, wie gemessen mittels eines Standardprotokolls (Miller, A.D., und Rosma, G.J., et al., 1989). Im Allgemeinen wurden retrovirale Titer von > 106 cfu/ml in Transduktionsexperimenten verwendet. Alle viralen Stammlösungen wurden getestet und als frei von RCR bestätigt und bei –80°C aufbewahrt.
  • Retrovirale Transduktion von PBLs.
  • Um die Stimulation von PBLs für retrovirale Transduktion zu optimieren, wurden die Antworten von CD4+-angereicherten PBLs auf PHA oder den OKT3-Antikörper verglichen. Es wurde kein Unterschied innerhalb der Kulturen unter Verwendung von entweder PHA oder OKT3 hinsichtlich der Zellverdopplungszeit, Lebensfähigkeit und der Transduktionsfähigkeit beobachtet. In den vorliegenden Experimenten wurde der OK73-Antikörper verwendet, weil er für die Verwendung beim Menschen zugelassen worden ist. Die stimulierten PBLs wurden dann mit den amphotropen Retroviren unter Verwendung einer m.o.i. von 0,5 transduziert. Die Bestimmung der relativen Transduktionseffizienz basierte auf der Anzahl von Zellen, welche eine G418-Selektion überlebten. Die gesamte Transduktionseffizienz variierte festgestelltermaßen von 2-7%, abhängig von den Spenderblut-Packungen.
  • Es wurde gezeigt, dass die G418-Selektion der transduzierten PBLs ein entscheidender Schritt innerhalb der PBL-Assays ist. Um eine vollständige Selektion zu erzielen, wurde ein Zwei-Schritt-Vorgehen angewandt. Für jeden Ansatz von PBLs wurde ein Assay hinsichtlich der toxischen G418-Dosis angesetzt, und gleichzeitig wurde eine Grundlinien-G418-Konzentration von 300 μg/ml auf die transduzierten PBLs in den anfänglichen 7 bis 9 Tagen angewandt. Nach dieser anfänglichen Periode wurde die G418-Konzentration auf diejenige angepasst, welche innerhalb des Assays hinsichtlich der toxischen Dosis ermittelt worden war. Für die 10 getesteten Spender wurde es festgestellt, dass die toxische G418-Dosis im Bereich von 300 bis 500 μg/ml lag, wobei eine anfängliche Zellkonzentration von 105 Zellen/ml verwendet wurde. Nach Transduktion und Selektion wurden die PBLs dann in frischem Medium ohne G418 eine Woche lang kultiviert. Dieser Erholungsschritt ist wichtig, um die Zelllebensfähigkeit zu steigern und die Zellzahlen (es wurde eine 3- bis 5-fache Erhöhung relativ zu derjenigen gefunden, die mit G418 beobachtet wurde) für die anschließenden HIV-1-Herausforderungs-Assays zu erhöhen.
  • Expression der Transgene in den transduzierten PBLs.
  • Die Expression von Ribozym, Antisinn oder TAR-Sequenz in den transduzierten PBLs wurde ausgewertet. 16A-16C zeigt das repräsentative Muster der Northern-Analyse. In RRz2- und LNL6-transduzierten Zellen (16A) wurden sowohl gespleisste als auch ungespleisste Transkripte, welche neor-Ribozym oder neor-Botschaften enthielten, unter Verwendung einer neor-spezifischen Sonde detektiert (3,2 kb und 2,4 kb). Die vorherrschende RNA-Spezies war das ungespleisste Transkript. Wenn der Blot mit einer ribozymspezifischen Sonde hybridisiert wurde, wurde das gleiche Muster nur für RRz2-RNA beobachtet. In RASH5-transduzierten PBLs wurden zwei Transkripte von dem 5'-LTR (gespleisst und ungespleisst) unter Verwendung der 550-bp-Sonde detektiert und als die erwarteten Größen aufweisend (4,8 kb und 4,0 kb) bestätigt (16B). Allerdings wurde das kürzere Transkript, welches von dem internen CMV-Promotor erwartet wurde, nicht exprimiert, was anzeigt, dass der CMV-Promotor in diesem Konstrukt ausgeschaltet worden war. Der R20TAR-Vektor erzeugte ein ungespleisstes 4,6 kb großes Transkript von dem 5'-LTR aus, welches an die TAR-Sonde hybridisierte, wie erwartet (16C), aufgrund der Inaktivierung des Splice-Donors in LXSN.
  • Inhibition von HIV-1-Replikation in humanen PBLs.
  • Um die Relevanz des PBL-Assay-Systems für die Untersuchung von HIV-1-Gentherapie zu analysieren, wurden HIV-Herausforderungsexperimente an transduzierten PBLs sowohl unter Verwendung des Laboratoriums-Stammes (IIIB) als auch eines primären klinischen Isolats (82H) durchgeführt. Die Infektionen wurden in zweifacher Ausfertigung vorgenommen und mit drei bis fünf unabhängigen Ansätzen von PBLs wiederholt. HIV-1-Replikation wurde an verschiedenen Zeitpunkten durch Messen von p24-Antigenspiegeln im Kulturüberstand überwacht. In den Herausforderungsexperimenten unter Verwendung von HIV-1 IIIB-Stamm war die p24-Herstellung merklich reduziert (70 %) in den PBLs, welche Ribozym (17A), Antisinn (17B) und TAR-Köder (17C) exprimieren, und zwar in Beziehung zu PBLs, welche mit den entsprechenden Kontrollvektoren transduziert worden waren. Eine Inhibition zu einem geringeren Ausmaß (40 % im Vergleich zu 70 %) wurde auch in den transduzierten, aber nicht selektierten, PBLs beobachtet. Transduzierte und selektierte PBLs wurden des Weiteren hinsichtlich ihrer Beständigkeit gegen die Infektion von einem primären HIV-1-Isolat geprüft. Das primäre klinische Isolat 82H wurde direkt aus den PBMCs eines Patienten erhalten und ist als ein T-Zell-tropisches und Syncytien-induzierendes Isolat charakterisiert worden. Wie für IIIB, wurde die 82H-Replikation (geassayt durch p24-Antigen-ELISA) zu einem ähnlichen Spiegel, wie beobachtet in HIV-1 IIIB-infizierten PBLs, inhibiert (18A-18C). Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Transgene, welche durch retrovirale Vektoren in menschliche PBLs zugeführt wurden, die HIV-1-Replikation in primären hämatopoietischen Zellen inhibieren können.
  • Analyse von transduzierten PBLs.
  • Um potenzielle Effekte von Transduktion und Konstrukt-Expression auf die PBL-Proliferation zu untersuchen, wurden [3H]-Thymidin-Aufnahme-Assays an allen transformierten und selektierten PBLs durchgeführt. Wenn mit nicht-transduzierten normalen PBLs verglichen wurde, bestanden keine offensichtlichen schädlichen Effekte in mit Transgen- Konstrukt und Vektor transduzierten PBLs (P < 0,02); (19). Darüber hinaus zeigte eine FACS-Analyse, dass der CD4-Oberflächenmarker nach der Transduktion unverändert blieb (Tabelle 5). Dies zeigte, dass der in HIV-1-Herausforderungs-Assays beobachtete inhibierende Effekt nicht auf einer Verringerung der Anzahl von CD4-Rezeptoren auf den transduzierten PBLs beruhte. Tabelle 5. CD4/CD8-Oberflächenmarker auf PBLs, wie gemessen durch FACS-Analyse
    Figure 00460001
    • * PBLs wurden analysiert, wie beschrieben in Materialien und Methoden.
    • Gesamt-PBLs = untransduzierte insgesamte PBLs; CD4+-PBLs = untransduzierte CD4+-angereicherte PBLs; LNL6-PBLs = CD4+-angereicherte PBLs, welche mit LNL6-Virus transduziert waren; RRz2-PBLs = CD4+-angereicherte PBLs, welche mit RRz2-Virus transduziert waren.
  • Die 20 zeigt die Ergebnisse einer CEM-T4-T-Lymphozyten-Zelllinie, welche mit Virus transduziert und einer G418-Selektion unterzogen wurde. Die vereinigte Population enthält Zellen mit statistischen Integranten und variablen Konstrukt-Expressionsspiegeln, welche dann mit HIV-1 herausgefordert werden.
  • Die 21A-21B zeigen die Ergebnisse von RzM, Mehrfach-Ribozym, welches gegen tat gerichtet war, und RRzpsi/M, einem Ribozym, welches sowohl gegen die Verpackungsstelle als auch tat gerichtet war.
  • DISKUSSION
  • Damit eine Gentherapie letztendlich eingesetzt werden kann, um die Replikation von HIV-1 in vivo zu inhibieren, müssen derartige gentherapeutische Vorgehensweisen zuerst in experimentellen Systemen untersucht werden. Bis heute haben dieses experimentellen Systeme hauptsächlich die Verwendung von humanen T-lymphozytischen Zelllinien beteiligt, und es sind keine veröffentlichten Daten hinsichtlich primären PBLs verfügbar (Yu, M., et al., 1994). Um vorklinische Daten zu gewinnen, ist es bedeutsam, gentherapeutische Anti-HIV-1-Mittel in primären hämatopoietischen Zellen zu testen. Diese Zellen sind die Hauptziele für HIV-1-Infektion und -Replikation, und es bestehen signifikante Unterschiede in den Wachstumsmerkmalen, der Antwort auf in vitro-Manipulation und der Reaktivität gegenüber HIV-1-Infektion zwischen Zelllinien und PBLs. Es ist die CD4+-PBL-Population [welche] für die HIV-1-Gentherapie [relevant ist]. Aus diesen Gründen haben wir die vorliegende Untersuchung durchgeführt, um ein PBL-Assay-System einzurichten.
  • In dieser Untersuchung sind drei verschiedene retrovirale Vektoren, welche Ribozym-, Antisinn- oder TAR-Köder-Gene exprimieren, hinsichtlich ihrer antiviralen Wirksamkeit in humanen PBLs getestet worden. Obwohl sie in unterschiedlichen retroviralen Vektoren konstruiert wurden, wurde von allen gezeigt, bei einem ähnlichen Spiegel in HIV-1-Schutz-Assays ohne offensichtliche Zytotoxizität wirksam zu sein, wie gemessen durch 3H-Thymidin-Einbau-Assay und FACS-Analyse. Diese Beobachtungen zeigen die Eignung von PBLs als Ziel für eine HIV-1-Gentherapie.
  • Um PBLs entweder als ein Assay-System oder als therapeutische Zielzellen zu verwenden, sollten mehrere Punkte beachtet werden. Zuerst ist ein hoher Virentiter ein ausschlaggebender Faktor, um eine effiziente Transduktion von PBLs zu erzielen. Dies ist insbesondere der Fall für klinische Zwecke, wo es nicht erwünscht sein kann, transduzierte PBLs mit G418 zu selektieren. Wir haben sowohl selektierte als auch unselektierte PBLs, welche mit einem hohen Titer an therapeutischen Retroviren transduziert wurden (> 106 cfu/ml), getestet. Es wurde festgestellt, dass die unselektierten PBLs ebenfalls beständig gegenüber HIV-1-Infektion waren, obwohl das Ausmaß der Inhibition geringer war als jenes, welches bei den selektierten PBLs gefunden wurde, was nahelegt, dass es klinisch möglich ist, ex vivo transduzierte PBLs ohne G418-Selektion zu verwenden. Eine G418-Selektion kann jedoch ermöglichen, dass Virus bei niedrigem Titer für das in vitro-Testen von Gentherapeutika verwendet wird. Wir haben ein zweistufiges G418-Selektionsvorgehen entwickelt, durch das eine vollständige Selektion leicht erzielt werden kann. Diese Vorgehensweisen minimieren die Zeit einer in vitro-Kultur, weswegen sie dazu dienen, jedwede Modifikation an der T-Zell-Population zu reduzieren. In unseren Experimenten beeinflusste die kontinuierliche Kultur von PBLs in vitro während zwei Wochen die Oberflächenmarker (CD4+ und CD8+) nicht signifikant. Diese Zeitperiodenlänge (2 Wochen) kann für jedwede ex vivo-Manipulation von PBLs für therapeutische Zwecke ausreichend sein.
  • Der Entwurf des retroviralen Vektors ist ein weiterer bedeutender Aspekt für einen effizienten Gentransfer und die Expression. Obwohl kein direkter Vergleich zwischen den drei Vektorentwürfen angestellt werden kann, welche in dieser Untersuchung verwendet wurden, sind zwei Beobachtungen von Bedeutung. Zuerst wurden alle der Transgene, welche gesteuert wurden von dem viralen LTR (aber nicht von dem internen CMV-Promotor für ein Konstrukt), effizient in konstitutiver Weise in humanen primären hämatopoietischen Zellen exprimiert. Zum Zweiten scheint die Strategie, durch welche ein Ribozym-Gen in die 3' untranslatierte Region eines Gens, wie neor, im retroviralen Vektor inseriert wird, in PBLs so effizient zu sein, wie sie es in T-Zelllinien ist. Diese Beobachtungen können für zukünftige Verbesserungen im gentherapeutischen Entwurf nützlich sein. Als Schlussfolgerung kann die Transduktion von humanen primären PBLs und ein Schutz derselben vor HIV-1-Infektion ex vivo unter Verwendung der in dieser Beschreibung dargestellten Protokolle bewerkstelligt werden. Dies wird nicht nur ein nützliches System zur Untersuchung von gentherapeutischen Mitteln in vitro bereitstellen, sondern bildet auch die Basis für eine HIV-1-Gentherapie, welche auf CD4+-Lymphozyten abzielt.
  • Tabelle 6
  • Tier-Retroviren
    • AIDS-verwandtes Virus (ARV)
    • Vogel-Erythroblastose-Virus
    • Vogel-Leukose-Virus (oder lymphoides Leukose-Virus)
    • Vogel-Myeloblastose-Virus
    • Vogel-Reticuloendotheliose-Virus
    • Vogel-Sarkom-Virus
    • Endogenes Pavianvirus
    • Rinder-Leukämie-Virus
    • Rinder-Lentivirus
    • Rinder-Syncytial-Virus
    • Caprines Encephalitis-Arthritis-Virus (oder Ziegen-Leukoencephalitis-Virus)
    • Vogel-Myelocytomatose-Virus
    • Kornnattern-Retrovirus Hühner-Syncytial-Virus
    • Enten-Infektiöse-Anämie-Virus
    • Rotwild-Nieren-Virus
    • Equines Hautfibrosarkom-Virus
    • Equines Infektiöse Anämie-Virus
    • Esh-Sarkom-Virus
    • Felines Immundefizienz-Virus
    • Felines Leukämie-Virus
    • Felines Sarkom-Virus
    • Felines Syncytium-bildendes Virus
    • Fujinami-Sarkom-Virus
    • Gibbonaffen-Leukämievirus (oder Simian-Lymphoma-Virus oder Simian-Myelogene-Leukämie-Virus)
    • Goldfasan-Virus
    • Humanes Immundefizienz-Virus 1 (HIV 1)
    • Humanes Immundefizienz-Virus 2 (HIV 2)
    • Humanes T-Lymphotrophes Virus 1 (HTLV-1)
    • Humanes T-Lymphotrophes Virus 2 (HTLV-2)
    • Humanes T-Lymphotrophes Virus 3 (HTLV-3)
    • Lymphoproliferative-Erkrankung-Virus
    • Myeloblastose-assoziiertes Virus
    • Myelocytomatose-Virus
    • Nerz-Zellfokus-induzierendes-Virus
    • Myelocytomatose-Virus 13
    • Nerz-Leukämie-Virus
    • Maus-Mammary-Tumor-Virus
    • Mason-Pfizer-Affen-Virus
    • Maus-Sarkom-Virus
    • Myeloides Leukämie-Virus
    • Myelocytomatose-Virus
    • Progressive-Pneumonie-Virus
    • Ratten-Leukämie-Virus
    • Ratten-Sarkom-Virus
    • Rous-assoziiertes Virus 0
    • Rous-assoziiertes Virus 60
    • Rous-assoziiertes Virus 61
    • Reticuloendotheliose-assoziiertes Virus
    • Reticuloendotheliosevirus
    • Reticuloendotheliosevirus-Transformierend
    • Ringfasan-Virus
    • Rous-Sarkom-Virus
    • Simian-Foamy-Virus bzw. Affen-Spumaretrovirus
    • Affen-Immundefizienz-Virus
    • Milz-Fokusbildungs-Virus
    • Totenkopfäffchen-Retrovirus
    • Milz-Nekrose-Virus bzw. SNV
    • Schaf-Lungen-Adenomatose/Carcinom-Virus
    • Affen-Sarkom-assoziiertes-Virus (oder Wollaffen-Leukämie-Virus)
    • Affen-Sarkom-Virus (oder Wollaffenvirus)
  • Tabelle 7:
  • Tabelle von Verpackungssequenzen:
  • 1. Reticuloendotheliose-Virus (Rev)
    • Genom: Wilhelmsen et al., J. Virol. 52: 172-182 (1984). Basen 1-3149; Shimotohno et al., Nature 285: 550-554 (1980). Basen 3150-3607. Verpackungssequenz (ψ): 144-Base zwischen der Kpn I-Stelle bei 0,676 kbp und 0,820 kbp, relativ zum 51-Ende des Provirus. J. Embretson und H. Temin, J. Virol. 61(9): 2675-2683 (1987).
  • 2. Humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1)
    • Genom: Gallo et al., Science 224: 500-503 (1984) Verpackungssequenz (ψ): 19 Basenpaare zwischen dem 5'-LTR und dem gag-Gen-Initiationscodon. A. Lever, J. Virol. 63(9) 4085-4087 (1989).
  • 3. Moloney-Maus-Leukämie-Virus (Mo-MuLV)
    • Genom: Shinnick et al., Nature 293: 543-548 (1981). Verpackungssequenz (ψ): 350 Nukleotide zwischen der Splicestelle und der AUG-Stelle für codierende Sequenz des gag-Proteins. R. Mann, R. Mulligan und D. Baltimore, Cell 33: 153-159 (1983). Zweite Verpackungssequenz (ψ+): Nur in der 5'-Hälfte der U5-Region. J. Murphy und S. Goff, J. Virol. 63(1): 319-327 (1989).
  • 4. Vogel-Sarkom-Virus (ASV)
    • Genom: Neckameyer und – Wang, J. Virol. 53: 879-884 (1985). Verpackungssequenz (ψ): 150 Basenpaare zwischen 300 und 600 Basen vom linken (gag-pol) Ende des Provirus aus. P. Shank und M. Linial, J. Virol. 36(2): 450-456 (1980).
  • 5. Rous-Sarkom-Virus (RSV)
    • Genom: Schwartz et al., Cell 32: 853-869 (1983). Verpackungssequenz (ψ): 230 Basenpaare von der 120-Base (Beginn der PB-Stelle) bis 22-Base vor dem gag-Startcodon. S. Kawai und T. Koyama (1984), J. Virol. 51: 147-153.
  • 6. Rinder-Leukose-Virus (BLV)
    • Genom: Couez, et al., J. Virol. 49: 615-620 (1984), Basen 1-341; Rice et al., Virology 142: 357-377 (1985), Basen 1-4680; Sagata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 677-681 (1985), vollständiges BLV-Provirus. Verpackungssequenz (ψ): Die Anmelder der vorliegenden Erfindung sagen voraus, dass selbige zwischen dem Ende der Primerbindungsstelle ungefähr an Base 340 und dem Initiationscodon für gag ungefähr an Base 41-8 liegt.
  • LITERATUR-BEZUGSTELLEN
    • 1. Abramova, T.V. et al., (1991) Nucleos. Nucleot. 10, 419.
    • 2. Alford, R.L., Honda, S., Lawrence, C.B. und Belmont, J.W. (1991) Virology 183 611-619.
    • 3. Aronoff, R. und Linial, M. (1991) J. Virol. 65, 71-80.
    • 4. Babe, L.M., Pichuantes, S., und Clark, C.S. (1991) Biochemistry 30, 106.
    • 5. Harre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyer, M.T., Chamaret, S., Dauguet, C., Axler-Blin, C., Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbrum, W. & Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871.
    • 6. Bender, M.A., Palmer, T.D., Gelinas, R.E. & Miller, A.D. (1987) J Virol 61, 1639-1646.
    • 7. Brown, A.M.C. und Scott, M.R.D. (1987) In DNA Cloning, A Practical Approach, Band III, S. 189-212.
    • 8. Chang, P.S. et al., (1990), Clin. Biotechnol. 2, 23.
    • 9. Chatterjee, S., Johnson, P.R., und Wong, K.K. Jr. (1992) Science 258, 1485.
    • 10. Chen, C. und Okayama, H. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2749.
    • 11. Chirgwin, J.J., Przbyla, A.E., MacDonald, R.J. & Rutter, W.J. (1979) Biochemistry 18, 5295.
    • 12. Chrisley, L.A. (1991) Antisense Research and Development, 1:65-113.
    • 13. Coffin, J. (1985) In RNA Tumor Viruses, Hrsg. Weis, R., Teich, N., Varmus, .H. und Coffin, J. (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY), Band 2, S. 766-782.
    • 14. Crisell, P. et al. (1993) Nucl. Acids. Res. 21, 5251-5255.
    • 15. Curiel, T. et al. (1992) Hum. Gene Ther. 3, 147.
    • 16. Danos, O. & Mulligan, R.C. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 6460-6464.
    • 17. Debouck, C. 11992) Aida Research and Human Retroviruses 8, 153-164.
    • 18. Dropulic, B., Lin, N. H., Martin, M. A. und Jeang, R.-T. (1992) J. Virol. 66, 1432-1441.
    • 19. Egholm, (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895.
    • 20. Epstein, F.H. (1991) The New England J. Med. 324, 308-317.
    • 21. Freed, E., Delwart, E., Buchschacher, G. Jr., und Panganiban, A., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 70.
    • 22. Gautsch, J. W. und Meier, H. (1976) Virology 72, 509-513.
    • 23. Gallo, R. C., Salahuddin, S.Z, Popovic, M., Shearer, G.M., Kaplan, M., Haynes, B.F., Palker, T.J., Redfield, R., Oleske, J., Safai, B., White, G., Foster, P. & Markham, P.D. (1984) Science 224, 500-503.
    • 24. Goodchild, J. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5507.
    • 25. Gordon et al. (1987) Bio/Technology 5:1183.
    • 26. Greene, W.C. (1990) Annu. Rev. Immunol. 8, 453-475.
    • 27. Hammes et al. (1985) Nature 315:680.
    • 28. Hampel, A. et al. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 299-304.
    • 29. Han, L., Yun, J. S. und Wagner, T. E. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4313-4317.
    • 30. Hanvey et al., (1992) Science 258:1409-1548.
    • 31. Harrison, G.P. und Lever, A.M.L. (1992) J. Virol. 66, 4144-4153.
    • 32. Haseloff, J. und Gerlach, W.J. (1988) Nature (London) 334, 585-591.
    • 33. Johnson, V.A. & Byington, R.E. (1990) In Techniques in HIV Research, Hrsg. Aldovini, A. & Walker, B.D. (Stockton Press, New York) S. 71-76.
    • 34. Jones, K.A. (1989) The New Biologist 1, 127-135.
    • 35. Rotlin, R.M. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2211.
    • 36. Levy, J.A. (1984) Science 225, 840.
    • 37. Levy, J.A. (1993) Microbiological Rev. 57, 183-289.
    • 38. Lisziewicz, J., Rappaport, J. & Dhar, R. (1991) New Biol. 3, 82-89.
    • 39. Lisziewicz, J., Sun, D., Smythe, J., Lusso, P., Lori, F., Louie, A., Markham, P., Rossi, J., Reitz, M. & Gallo, R.C. (1993). Proc Natl Acad Sci USA 90, 8000-8004.
    • 40. Lo, R.M.S., Blasolo, M.A., Dehni, G., Palu, G. und Haseltine, W.A. (1992) J Virology 190, 176-183.
    • 41. Malim, M.H. et al., (1992) J. Exp. Med. 176, 1197.
    • 42. Malim, M.H., Bohnlein, S., Hauben, J., und Cullen, B.R. (1989) Cell 58, 205.
    • 43. Mann, R., Mulligan, R.C. & Baltimore, D. (1983) Cell 33, 153-159.
    • 44. Marshall, W.S. und Caruthers, M.H., (1993) Science 259, 1564.
    • 45. McClure, M.O., Moore, J.P., Blanc, D.F., Scotting, P., Cook, G.M.W., Keynes, R.J., Weber, J.N., Davies, D. und Weiss, R.A. (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8, 19-26.
    • 46. McCune, J.M. (1991) Cell 64, 351-363.
    • 47. Miller, A.D. & Rosman, G.J. (1989) Biotechniques 7, 980-990.
    • 48. Miller, D. (1992) Nature 357, 455-460.
    • 49. Miller, A.D. (1992) Current Topic in Microbiology and Immunology 158, 1-24.
    • 50. Nielson, (1991) Science 254:1497.
    • 51. Ojwang, J.O., Hampel, A., Looney, D.J., Wong-Staal, F. und Rappaport, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10802-10806.
    • 52. Perriman, R., Delves, A. und Gerlach, W.L. (1992) Gene 113, 157-163.
    • 53. Peterlin, B.M. und Luciw, P.A. (1988) Bio/Technology 6, 794-799.
    • 54. Pittius et al. (1988) PNAS 85:5874.
    • 55. Poznansky, M., Lever, A., Bergeron, L., Haseltine, W., und Sodroski, J. (1991) J. Virol. 65, 532.
    • 56. Pyle, A. M. (1993) Science 261, 709-714.
    • 57. Reed, R. C. und Mann, D. A. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 7207-7221.
    • 58. Rhodes, A. & James, W. (1991) AIDS 5, 145-151.
    • 59. Rossi, J.J., Elkins, D., Zaia, J.A. und Sullivan, S. (1992) In Aids Research and Human Retroviruses 8, 183-189.
    • 60. Rossi, J.J. und Sarver, N., (1992) Innovations in Antiviral Development and the Detection of Virus Infection, 95-109.
    • 61. Saenger, W. (1984) Principles of Nucleic Acid Structure (Springer, New York).
    • 62. Sarver, N., Cantin, E.M., Chang, P.S., Zaia, J.A., Ladne, P.A., Stephens, D.A. und Rossi, J.J. (1990) Science 247, 1222-1225.
    • 63. Sczakiel, G., Oppenländer, M., Rittner, K. und Pawlita, M. (1992) J. Virol. 66, 5576-5581.
    • 64. Simons et al. (1987) Nature 328:530.
    • 65. Simons et al. (1988) Bio/Technology 6:179.
    • 66. Sioud, M. und Drlica, K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7303-7309.
    • 67. Steffy, K.R. und Wong-Staal, F., (1993) J. Virol. 67, 1854.
    • 68. Stevenson, M., Bukrinsky, M. und Haggerty, S. (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8, 107-117.
    • 69. Sullenger, B.A., Gallardo, H.F., Ungers, G.E. und Gilboa, E. (1991) J. Virol. 65, 6811.
    • 70. Sullenger, B.A., Gallardo, H.F., Ungers, G.E. und Gilboa, E. (1990) Cell 63, 601-608.
    • 71. Sullenger, B.A. et al. (1993) Science 262, 1567-1569.
    • 72. Teich, N., Wyke, J., Mak, T., Bernstein, A. und Hardy, W. (1985) In RNA Tumor Viruses, Hrsg. Weiss, R., Teich, N., Varmus, H. and Coffin, J. (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) Band 1, S. 901-923.
    • 73. Trono, D., Feinberg, M., und Baltimore. D., (1989) Cell 59, 113.
    • 74. Uhlmann, E. und Peyman, A., (1990) Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Principle. Chemical Reviews 90:543-584.
    • 75. Van Brunt, J. Molecular Farming: Transgenic Animals as Bioreactors. Bio/Technology 6:1149-1154.
    • 76. Van der Krol, J., Mol, N., Stuitje, A.R., (1988) BioTechniques 6, 958.
    • 77. Warrilow, D., Takayama, Y. und Symonds, G. (1992) BioTechniques 13, 42-43.
    • 78. Weerasinghe, M., Liem, S.E., Asad, S., Read, S.E. und Joshi, S. (1991) J. Virol. 65, 5531-5534.
    • 79. Yamada, O., Yu, M., Yee, J. Kraus, G., Looney, D. & Wong-Staal, F. (1994) Gene Therapy 1, 38-45.
    • 80. Yee, J.K. et al. (1987) Proc Natl Acad Sci Usa 84, 5179-5201.
    • 81. Yu, M., Ojwang, J.O., Yamada, O., Hampel, A., Rappaport, J., Looney, D. & Wong-Staal, F. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6340-6344.
    • 82. Yu, M., Poeschla, E. & Wong-Staal, R. (1999) Gene Therapy 1, 13-26.
    • 83. Zhou, C. et al. (1992) Proc. Third International Symposium on Catalytic RNA (Ribozymes) and Targeted Gene Therapy for Treatment of HIV Infection.
    • 84. Zuker, M. und Stiegler, P. (1981) Nucleic Acid. Res. 9, 133-148.

Claims (27)

  1. Oligonukleotid-Verbindung, welche ein Ribozym umfasst, das auf die GUA-Zielstelle an Nukleotid 5849 des HIV-1-Isolats SF-2 oder eine entsprechende Zielstelle von anderen HIV-1-Isolaten abzielt, wobei es sich bei der Verbindung entweder handelt um: – ein Einzel-Ribozym oder – ein Mehrfach-Ribozym, das auf verschiedene Stellen innerhalb von tat abzielt.
  2. Verbindung von Anspruch 1, wobei das Ribozym ein Hammerkopf-Ribozym ist.
  3. Verbindung von Anspruch 1, welche von einem Konstrukt codiert wird, umfassend die Sequenz: TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC, worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht.
  4. Verbindung von Anspruch 1, welche von einem Konstrukt codiert wird, umfassend die Sequenz: CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAA, worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht.
  5. Verbindung von Anspruch 1, welche von einem Konstrukt codiert wird, ferner umfassend die Sequenz: GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG, worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht.
  6. Verbindung von Anspruch 1, wobei die verschiedenen Zielstellen innerhalb von tat an Nukleotid 5792, 5886 oder 6042 des HIV-1-Isolats SF-2 oder entsprechenden Zielstellen von anderen HIV-1-Isolaten liegen.
  7. Transfervektor, aufgebaut aus RNA oder DNA oder einer Kombination davon, welcher bei einer Transkription zu einer Verbindung von Anspruch 1 führt.
  8. Transfervektor von Anspruch 7, enthaltend einen eukaryotischen Promotor, welcher die Expression der Verbindung in einem eukaryotischen Zelltyp gestattet, der mit HIV infiziert werden kann.
  9. Transfervektor von Anspruch 8, wobei der Promotor ein SV40-Promotor ist.
  10. Zelle, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche eine Verbindung ist oder nach einer Transkription zu deren Entstehung führt, die ein Ribozym umfasst, das auf die GUA-Zielstelle an Nukleotid 5849 des HIV-1-Isolats SF-2 oder eine entsprechende Zielstelle von anderen HIV-1-Isolaten abzielt.
  11. Zelle von Anspruch 10, wobei die Verbindung eine Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.
  12. Zelle von Anspruch 11, wobei das Ribozym in der Lage ist, die HIV-1-Replikation in humanen primären hämatopoietischen Zellen zu inhibieren.
  13. Zelle von mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Nukleotidsequenz ein Teil eines Transfervektorkonstruktes ist.
  14. Zelle von Anspruch 13, wobei der Transfervektor ein Adenovirus-assoziierter Transfervektor, Mo-MLV oder ein amphotroper Retrovirusvektor ist.
  15. Zelle von Anspruch 13, wobei der Transfervektor ein retroviraler Vektor ist.
  16. Zelle von Anspruch 15, wobei die Nukleotidsequenz in der 3' untranslatierten Region eines Neomycin-Resistenzgens des retroviralen Transfervektors liegt.
  17. Zelle von Anspruch 16, wobei der Transfervektor von dem LNL6-Vektor abgeleitet ist.
  18. Zelle von Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz die Sequenz: TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC umfasst, worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht.
  19. Zelle von Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz die Sequenz: CGTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGAGTCCGTG AGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAA umfasst, worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht.
  20. Zelle von Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz ferner die Sequenz: GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG umfasst, worin jedes von T, G, A und C für ein Nukleotid steht.
  21. Zelle von mindestens einem der Ansprüche 10 bis 20, wobei die Zelle eine hämatopoietische Stammzelle, eine Vorläuferzelle, eine festgelegte Vorläuferzelle, eine T-Lymphozyten-Vorläuferzelle, ein unreifer T-Lymphozyt, ein reifer T-Lymphozyt eine myeloide Vorläuferzelle oder eine Monozyten/Makrophagen-Zelle ist.
  22. Zelle von Anspruch 21, wobei die Zelle eine Vorläuferzelle ist.
  23. Zelle von Anspruch 21, wobei die Zelle ein T-Lymphozyt ist.
  24. Zelle von Anspruch 21, wobei die Zelle eine humane primäre hämatopoietische Zelle ist.
  25. Zelle von mindestens einem der Ansprüche 10 bis 24, wobei die Zelle resistent gegen HIV-Infektion ist.
  26. Gegen HIV-Infektion resistente humane Zelle, umfassend einen viralen Vektor, der eine RNA-Verbindung herstellt, welche Nukleotide umfasst, deren Sequenz eine katalytische Region definiert, welche RNA-Spaltung katalysiert, und Nukleotide, deren Sequenz komplementäre Arme definiert, welche eine Bindung an die Nukleotidsequenz: 5' TGGAGCCAGTAGATCCTAAT 3' gestatten, wobei die RNA-Verbindung HIV-1-Replikation in der humanen Zelle inhibiert, wodurch die humane Zelle resistent gegen HIV-Infektion gemacht wird.
  27. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einen Transfervektor gemäß Anspruch 7, 8 oder 9 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
DE69534864T 1994-01-05 1995-01-05 Ribozyme gegen eine HIV Tat Sequenz Expired - Lifetime DE69534864T2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US178082 1994-01-05
US08/178,082 US5712384A (en) 1994-01-05 1994-01-05 Ribozymes targeting retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US08/310,259 US6114167A (en) 1994-01-05 1994-09-21 Ribozymes targeting the MoMLV PSI packaging sequence and the HIV tat sequence
US310259 1999-05-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69534864D1 DE69534864D1 (de) 2006-05-11
DE69534864T2 true DE69534864T2 (de) 2007-02-22

Family

ID=26873946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69534864T Expired - Lifetime DE69534864T2 (de) 1994-01-05 1995-01-05 Ribozyme gegen eine HIV Tat Sequenz

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP1298208B1 (de)
JP (1) JP3691849B2 (de)
CN (1) CN1267552C (de)
AT (1) ATE320487T1 (de)
AU (1) AU698730B2 (de)
CA (1) CA2180358A1 (de)
DE (1) DE69534864T2 (de)
DK (1) DK1298208T3 (de)
ES (1) ES2260376T3 (de)
IL (1) IL112261A (de)
NO (1) NO319376B1 (de)
NZ (1) NZ278432A (de)
PT (1) PT1298208E (de)
WO (1) WO1995018854A1 (de)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058636A1 (en) * 1994-09-21 2002-05-16 Geoffrey P. Symonds Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
AU702266B2 (en) * 1995-08-25 1999-02-18 Regents Of The University Of California, The Chimeric antiviral agents which incorporate Rev binding nucleic acids
US5888767A (en) 1996-11-27 1999-03-30 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of using a conditionally replicating viral vector to express a gene
JP2000503527A (ja) * 1995-11-28 2000-03-28 ザ ジョンズ ホプキンズ ユニヴァーシティ スクール オヴ メディシン 条件付き複製ウイルスベクターおよびその用途
US6776986B1 (en) 1996-06-06 2004-08-17 Novartis Ag Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
KR20010042069A (ko) 1998-03-20 2001-05-25 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 발현 조절방법
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP2314700A1 (de) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Zusammensetzung und Verfahren zur in vivo und in vitro Abschwächung der Genexpression mittels dobbelsträngiger RNA
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US20020132257A1 (en) 2001-01-31 2002-09-19 Tony Giordano Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
ES2358187T3 (es) 2001-07-10 2011-05-06 JOHNSON &amp; JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED Procedimientos para la modificación genética de las células progenitoras hematopoyéticas y utilizaciones de las células modificadas.
DK1414996T3 (da) 2001-07-10 2011-03-21 Johnson & Johnson Res Pty Ltd Fremgangsmåder til genetisk modifikation af hæmatopoetiske progenitorceller og anvendelser af modificerede celler
CN102841007A (zh) * 2012-09-05 2012-12-26 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种便于鸭精子计数的精液稀释液及其使用方法
CN113549641B (zh) * 2021-06-29 2023-12-22 复旦大学 一种核酶介导的多顺反子载体及其构建方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225337A (en) * 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Ribozyme compositions and methods for use
EP0578776A4 (de) * 1991-04-05 1995-04-12 Edison Animal Biotech Center Hemmung von retroviren mittels zu verpackungssequenzen komplementärer antisense-nukleinsäuren.
ATE312188T1 (de) * 1993-01-22 2005-12-15 Univ Research Corp Lokalisierung von therapeutischen mitteln
IL108719A0 (en) * 1993-02-25 1994-08-26 Ortho Pharma Corp Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them
WO1995004818A1 (en) * 1993-08-06 1995-02-16 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting human immunodeficiency virus replication

Also Published As

Publication number Publication date
DE69534864D1 (de) 2006-05-11
WO1995018854A1 (en) 1995-07-13
DK1298208T3 (da) 2006-07-24
NO962826D0 (no) 1996-07-04
EP0753062A1 (de) 1997-01-15
NO962826L (no) 1996-08-27
NO319376B1 (no) 2005-07-25
EP1298208B1 (de) 2006-03-15
JPH09508004A (ja) 1997-08-19
EP1298208A2 (de) 2003-04-02
AU1391295A (en) 1995-08-01
CN1267552C (zh) 2006-08-02
AU698730B2 (en) 1998-11-05
ATE320487T1 (de) 2006-04-15
IL112261A0 (en) 1995-03-30
JP3691849B2 (ja) 2005-09-07
IL112261A (en) 2005-08-31
CN1145638A (zh) 1997-03-19
EP0753062A4 (de) 1999-10-20
NZ278432A (en) 1998-06-26
EP1298208A3 (de) 2004-01-07
CA2180358A1 (en) 1995-07-13
ES2260376T3 (es) 2006-11-01
PT1298208E (pt) 2006-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6114167A (en) Ribozymes targeting the MoMLV PSI packaging sequence and the HIV tat sequence
DE69534864T2 (de) Ribozyme gegen eine HIV Tat Sequenz
DE69734589T2 (de) Antitumor antisense sequenzen gegen h1 und r2 verbindungen von ribonukleotide reductase
DE69431669T2 (de) Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet
DE69032841T2 (de) Rekombinante zellen für therapien von infektionen und hyperprolieferative störungen und deren herstellung
WO1990013641A1 (en) Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter
CH684094A5 (de) Rekombinante Retroviren.
DE69921609T2 (de) Ribozymale nukleinsäure die ccr5 oder cxcr4 schneiden
AU703964B2 (en) Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
DE69626681T2 (de) Konditionell-replizierende virale vektoren und ihre verwendung.
Cagnon et al. Protection of a T-cell line from human immunodeficiency virus replication by the stable expression of a short antisense RNA sequence carried by a shuttle RNA molecule
US6245560B1 (en) Vector with multiple target response elements affecting gene expression
DE60033517T2 (de) Invivo selektionsverfahren zur bestimmung von inhibierenden rna molekülen
DE69930862T2 (de) Expressionssysteme zur funktionellen expression von nukleinsäuren
AU697095B2 (en) Expression of viral decoy proteins under the control of a locus control region and uses thereof
KR100696410B1 (ko) 레트로바이러스 패키징 서열 발현 제작물을 표적으로 하는 리보자임 및 그러한 제작물을 가진 재조합 레트로바이러스
DE69333216T2 (de) Vektor, enthält ein bei ARN-Polymerase-III transcriptes Virus-Gen
DE69938044T2 (de) Neue post-transkriptionelle regulationselemente und deren verwendung
Sun et al. The use of ribozymes to inhibit HIV replication
Mergia et al. Inhibition of FIV replication by a ribozyme that targets the Rev response element
Chang et al. Murine models for the evaluation of anti-HIV strategies
Lee et al. Prospects for Gene Therapy of HIV Infections and AIDS
WO1996023876A1 (en) Expression system and method for inhibiting replication of human immunodeficiency virus (hiv)
SUN et al. trans-activation response elementconstructs
Fanning et al. Anti-HIV ribozymes in the inhibition of HIV

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition