CZ162498A3 - Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití - Google Patents

Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ162498A3
CZ162498A3 CZ981624A CZ162498A CZ162498A3 CZ 162498 A3 CZ162498 A3 CZ 162498A3 CZ 981624 A CZ981624 A CZ 981624A CZ 162498 A CZ162498 A CZ 162498A CZ 162498 A3 CZ162498 A3 CZ 162498A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
vector
wild
seq
nucleotide sequence
hiv
Prior art date
Application number
CZ981624A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ294170B6 (cs
Inventor
Boro Dropulic
Paula M. Pitha
Original Assignee
The Johns Hopkins University School Of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Johns Hopkins University School Of Medicine filed Critical The Johns Hopkins University School Of Medicine
Publication of CZ162498A3 publication Critical patent/CZ162498A3/cs
Publication of CZ294170B6 publication Critical patent/CZ294170B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

• · • ··· · • · ♦ · ·« ΐΐ/ΜΥ-ΙΫ
Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití Oblast techniky
Vynález se týká podmíněně se replikujícího virálního vektoru, způsobů získávání, modifikace, propagace a selektivního balení takového vektoru, izolovaných molekul se specifikovanými nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi relevantních pro takové vektory, farmaceutické kompozice a hostitelské buňky zahrnujících takový vektor a způsobů použití takového vektoru a hostitelské buňky.
Dosavadní stav techniky
Objev viru lidské imunodeficience (HIV) jako původce syndromu získané imunitní nedostatečnosti (AIDS) podpořil obrovský výzkum souvisejících mechanismů virového infekčního cyklu a virální patogenese. Studie těchto mechanismů vyvolaly výzkum stále rostoucího počtu cílů vývoje antivirálních prostředků, účinných nejen proti HIV, ale také proti jiným virům. Tyto antivirální prostředky, zejména jsou-li zaměřeny proti HIV, mohou být kategorizovány do dvou skupin podle charakteru působení. Jedná se o skupinu inhibitorů reversní transkriptázy, kompetitorů vstupu virů do buněk, vakcin a inhibitorů proteáz a o novější skupinu, která se zde označuje jako „genetické antivirální prostředky".
Obecně má každý typ antivirálního prostředku své vlastní přínosy a omezení a musí být hodnocen z hlediska požadavků konkrétní léčebné situace. Antivirální prostředky jako zidovudin (3' -azido-3'-deoxythymidin, známý též jako AZT), inhibitory proteáz apod. mohou být do buněk pacientova organismu vpraveny relativně snadno a byly intenzivně studovány. Tyto prostředky, které jsou zacíleny na jeden specifický faktor ve virálním infekčním cyklu, se ukázaly
2 • ·
• · • Μ · · • Μ · ·· · • ♦ • · # · ·· · · · • · · ·· ·· relativně neúčinné proti HIV. Primárně je to způsobeno skutečnosti, že kmeny HIV se rychle mění a získávají resistenci vůči prostředkům, které mají jediné místo působení (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)). Problémy genetických variací a rychlé mutace genomů HIV proto vyvolávají potřebu hledat nové antivirální strategie potírání infekcí HIV. Z tohoto hlediska jsou atraktivní genetické antivirální prostředky, protože působí intracelulárně na mnoha různých úrovních.
Genetické antivirální prostředky se liší od jiných terapeutických prostředků v tom, že jsou přenášeny jako molekulární prvky do cílové buňky, kde mohou buňku chránit před virální infekcí (Baltimore, Nátuře, 325, 395-396 (1988), a Dropulic a kol., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Genetickými antivirálními prostředky mohou být jakékoli genetické sekvence a zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, antisense molekuly, syntetické fragmenty RNA (RNA decoy), transdominantní mutanty, interferony, toxiny, imunogeny a ribozymy. Konkrétně ribozymy jsou genetické antivirální prostředky, které štěpí sekvenčeně specifickým způsobem cílové RNA, včetně RNA viru HIV. Specificita ribozymy zprostředkovaného štěpení cílové RNA naznačuje možné použití ribozymů jako terapeutických inhibitorů virální replikace, včetně replikace HIV. V anti-HIV strategii byly dosud použity různé typy ribozymů, například „hammerhead" a vlásenkové ribozymy (viz například patenty US č. 5,144.019, 5,180.818 a 5,272.262 a patentové přihlášky PCT č. WO 94/01549 a WO 93/23569). Jak „hammerhead", tak vlásenkové ribozymy mohou být konstruovány tak, aby štěpily jakoukoli cílovou RNA, která obsahuje sekvenci GUC (Haseloff a kol., Nátuře, 334, 595-591 (1988), Uhlenbeck, Nátuře, 334, 585 (1987), Hampel a kol., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990), a Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). Obecně řečeno mají 3 ·· ··· · • · ·· ι „hammerhead" ribozymy dva typy funkčních domén, a to konzervativní katalytickou doménu, lemovanou dvěma hybridizačními doménami. Hybridizační domény se vážou na sekvence obklopující sekvenci GUC a katalytická doména štěpí cílovou RNA, která je 3' vzhledem k sekvenci GUC (Uhlenbeck (1987), viz výše, Haseloff a kol. (1988), viz výše, a Symons (1992), viz výše). Četné studie potvrdily, že ribozymy mohou být alespoň částečně účinné při inhibici propagace HIV v buňkách tkáňových kultur (viz například Sarver a kol·., Science, 247, 1222-1225 (1990), Sarver a kol., NIH Res., 5, 63-67 (1993a), DropuliČ a kol., J. Virol., 66, 1432-1441 (1992), Dropulič a kol., Methods: Comp. Meth. Enzymol., 5, 43-49 (1993), Ojwang a kol., PNAS, 89, 10802-10806 (1992), Yu a kol., PNAS, 90, 6340-6344 (1993), a Weerasinghe a kol., J. Virol., 65, 5531-5534 (1991)). Konkrétně Sarver a kol. (1990, viz výše) demonstrovali, že „hammerhead" ribozymy, konstruované pro štěpení uvnitř přepisované oblasti genu gag HIV, tj . anti-gag ribozymy, mohou specificky štěpit RNA gag HIV in vitro. Navíc byly-li buněčné linie exprimující anti-gag ribozymy vystaveny působení HIV-1, byla pozorována 50- až 100-násobná inhibice replikace HIV. Podobně Weerasinghe a kol. (1991, viz výše) ukázali, že retrovirální vektory, kódující ribozymy určené ke štěpení uvnitř sekvence U5 RNA HIV-1, dodávají transdukovaným buňkám po následném působení HIV rezistenci vůči HIV. Přestože různé klony transdukovaných buněk demonstrovaly různou úroveň rezistence, jak bylo zjištěno podle promotorového sytému použitého k řízení exprese ribozymů, většina buněčných linií exprimujících ribozymy po omezené době v kultuře podlehla expresi HIV.
Ukázalo se, že transdukce buněk tkáňové kultury provirem, do jehož genu nef (který není nezbytný pro 4 ·· ♦· 4 ·· ♦· ♦ · • · · · • · ··· • ♦ · ·· ♦· replikaci viru v tkáňové kultuře) byl zaveden ribozym, jehož hybridizačni domény jsou specifické pro oblast U5 HIV, inhibuje replikaci viru v transdukovaných buňkách lOOnásobně v porovnáni s buňkami transdukovanými standardními proviry (viz například Dropulič a kol., (1992) a (1993), viz výše). Podobně bylo zjištěno, že vlásenkové ribozymy inhibují replikaci HIV v T-buňkách transdukovaných vektory obsahujícími vlásenkové ribozymy U5 a vystavenými působení HIV (Ojwang a kol. (1992), viz výše). Jiné studie ukázaly, že vektory obsahující ribozymy exprimované z promotoru tRNA také inhibují různé kmeny HIV (Yu a kol. (1993), viz výše).
Hlavní překážkou účinné genetické léčby AIDS je dodání ribozymů nebo jiných genetických antivirálních prostředků k buněčným cílům infekce HIV (například CD4 + T-buňkám a monocytickým makrofágům). Současné přístupy ve směrování na buňky hematopoetického systému (tj . primární cíle infekce HIV) vyžadují zavedení terapeutických genů do prekursorových vícefunkčních kmenových buněk, ze kterých diferenciací vznikají maturované T-buňky, nebo alternativně do samotných maturovaných CD4+ T lymfocytů. Směrování na kmenové buňky je však problematické, protože se tyto buňky in vitro obtížně kultivují a transdukují. Směrování na cirkulující T lymfocyty je také problematické, protože tyto buňky jsou tak široce rozptýleny, že je obtížné pomocí současných vektorových systémů dosáhnout všech cílových buněk. Navíc musejí být za buněčný cíl považovány makrofágy, protože jsou hlavním rezervoárem šíření viru do ostatních orgánů. Protože však jsou makrofágy terminálně diferencovány, a tudíž nepodléhají buněčnému dělení, nedají se snadno transdukovat běžně používanými vektory. Převládající současný přístup k léčbě HIV tedy používá replikačně defektní virální vektory a balící (tj. „pomocné") buněčné linie (viz například Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880-2886 (1993), Anderson, Science, 256, 808-813 (1992),
Miller, Nátuře, 357, 455-460 (1992), Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993), Friedman, Science, 24, 1275-1281 (1989), a
Cournoyer a kol., Ann. Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) k zavedení cizího genu, který specificky interferuje s replikací viru nebo který způsobuje smrt infikované buňky (přehled viz Buchschacher (1993), viz výše), do buněk náchylných k virové infekci (například infekci virem HIV) . Takové replikačně defektní virální vektory obsahují kromě příslušného cizího genu sekvence působící v poloze cis, nezbytné pro replikaci viru, avšak nikoli sekvence, které kódují podstatné virové proteiny. V důsledku toho je takový vektor neschopen ukončit virální replikační cyklus a k jeho propagaci je použita pomocná buněčná linie, která obsahuje a konstitutivně exprimuje virální geny v jeho genomu. Po zavedení replikačně defektního virálního vektoru do pomocné buněčné linie jsou pro vektor v poloze trans k dispozici proteiny potřebné pro vytvoření virální částice a jsou produkovány vektorové virální částice, schopné infikovat cílové buňky a exprimovat v nich gen, který interferuje s replikací viru nebo způsobuje smrt virálně infikované buňky.
Takové replikačně defektní retrovirální vektory zahrnují adenoviry a adeno-asociované viry, jakož i retrovirální vektory používané v klinických testech genové terapie HIV, a zvláště myší amfotropní retrovirální vektor známý jako Moloneyův virus myší leukemie (MuLV). Tyto defektní virální vektory se s různou mírou úspěchu používají k transdukci CD4+ buněk genetickými antivirálními prostředky, jako jsou anti-HIV ribozymy (Sarver a kol. (1990), viz výše, Weerasinghe a kol. (1991), viz výše, Dropulič a kol. (1993), viz výše, Ojwang a kol. (1992), viz výše, a Yu a kol. (1993), viz 6 • · • · • · 6 • · • · • · «· · · • · « • · Μ I · · · I · · · * I · $ II ·· výše) . Tyto vektory však mají pro aplikace v genové terapii HIV svá vlastní omezení. Například při léčbě HIV je zvláště důležitá vysoká frekvence transdukce, protože vektor musí transdukovat buď vzácné progenitorové hematopoetické kmenové buňky CD4+ nebo široce rozptýlené cílové CD4+ T-buňky, z nichž většina je během klinického „latentního" stadia nemoci již virem HIV infikována. Vektory MuLV se však obtížně získávají s vysokým titrem a tudíž vedou ke slabé transdukci. Kromě toho nebylo u progenitorových kmenových buněk CD4+ dosaženo dlouhodobé exprese transdukované DNA, zejména po diferenciaci na maturované T lymfocyty. Použití defektních virálních vektorů navíc vyžaduje strategie přenosu genů ex vivo (viz například patent US č. 5,399.346), které mohou být nákladné a nedostupné pro běžnou populaci.
Tyto nevýhody spojené s používáním v současnosti dostupných vektorů pro genetickou léčbu AIDS vedly výzkumné pracovníky k hledání nových virálních vektorů. Jedním takovým vektorem je samotný HIV. Vektory HIV byl použity pro studie infektivity (Page a kol., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) a pro zavádění genů (jako jsou sebevražedné geny) do CD4+ buněk, zejména do CD4+ buněk, infikovaných HIV (viz například Buchschacher a kol., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992), Richardson a kol., J. Virol., 67, 3997-4005 (1993), Carroll a kol., J. Virol., 68, 6047-6051 (1994), a Parolin a kol., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). Strategie těchto studií spočívá v použití vektorů HIV k zavádění genů do CD4+ T-buněk a monocytických buněk.
Tyto vektory jsou však dosud velice složité. Navíc je použití těchto vektorů doprovázeno nebezpečím vzniku standardního HIV intracelulární rekombinací. Bylo pozorováno, že kotransfekce/koinfekce defektních vektorových sekvencí a pomocného viru vede k rekombinací mezi homologními oblastmi virálních genomů (Inoue a kol., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Pozorovaná komplementace in vitro naznačuje, že in vivo by se mohl rekombinovat podobný replikačně defektni vektor HIV, a tak aktivovat již existující infekci HIV. Skutečnost, že retroviry balí dva genomy RNA do jednoho virionu, vedla výzkumné pracovníky k hypotéze, že retroviry nesou dvě virální RNA, aby obešly veškeré genetické defekty, způsobené komplementací a/nebo rekombinací (Inoue a kol. (1991), viz výše).
Kromě nebezpečí intracelulární rekombinace, vedoucí ke standardnímu HIV (tj . HIV divokého typu), je s vektory HIV spojeno riziko mutace in vivo, která zvyšuje patogenitu virálního vektoru. To vedlo Sarvera a kol. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)) ke spekulacím ohledně vývoje druhé generace rekombinantních vektorů HIV, které jsou replikačně kompetentní a přitom nepatogenní. Takové vektory, v porovnání s převážně používanými nereplikujícími vektory (tj . replikačně deficitními vektory) pokračují v replikaci v těle pacienta, a tak dochází k travclé soutěži se standardním HIV. Dosud však takové vektory nejsou k dispozici. V ideálním případě nastává nej lepší příležitost pro léčbu infikovaného jedince v době inokulace, než ještě virus hostitele infikuje. To je však obtížně proveditelné, poněvadž mnozí jedinci si neuvědomí, že byli infikováni HIV, dokud nenastane klinicky latentní fáze onemocnění. Proto nastává nejvážnější potřeba antivirální intervence během klinické latence. Terapie v tomto stadiu vyžaduje řešit problém, představovaný velkým počtem již infikovaných CD4+ lymfocytů, které obsahují virální genomy. Tento problém není jednoduchý, což dokazuje skutečnost, že infekce HIV zůstává dosud nevyléčitelná a dosud dostupnými terapiemi je léčitelná pouze 8 φφ *· φφ * · · * « ♦ · · • · ··· « · φ ·· *· • « φ · φ Φ 9 Φ Φ Φ Φ Φ Φ φ φ ΦΦ Φ Φ φ Φ Φ Φ Φ Φ Μ Φ· Φ· špatně. Účinná vakcina není na dohled a i když se zjistilo, že inhibitory reversní transkriptázy a proteázy brání replikaci HIV v tkáňové kultuře, vývoj resistence virů in vivo vedl k neúspěchu léčby. Genová terapie HIV tedy může být jen malým přínosem pro převážnou většinu jedinců infikovaných HIV, jejichž počet se odhaduje v roce 2000 na 40 milionů. S ohledem na tyto skutečnosti se zvyšuje význam vývoje dlouhodobých a trvalých imunologických odpovědí na určité patogeny, zejména viry, konkrétně například v kontextu AIDS a rakoviny. Byly uvažovány živé oslabené (live-attenuated, LA) vakciny s použitím replikačně kompetentních, ale nepatogenních virů (Daniel a kol., Science, 258, 1938-1941 (1992), a Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). Takové nepatogenní viry, které se liší od odpovídajících standardních virů delecí jednoho nebo více genů, buď (i) nemohou vyvolávat ochrannou imunitní odpověď, protože antigen nepřetrvává (protože virus LA se účinně nereplikuje) , nebo (ii) se virus LA replikuje, ale má jiný patogenní potenciál, což dokazuje schopnost viru LA vyvolávat onemocnění na mladých zvířecích modelech (Baba a kol., Science, 267, 1823-1825 (1995)). Z výše uvedených důvodů přetrvává potřeba alternativních možností profylaktického a terapeutického ošetření virálních infekcí, zejména v kontextu AIDS a rakoviny. Vynález takové alternativní metody poskytuje na základě podmíněně se replikujícího vektoru. Dále vynález poskytuje další způsoby, při nichž je možno takového vektoru použít.
Podstata vynálezu Předmětem vynálezu je podmíněně se replikující virový vektor, který je charakterizován schopností replikovat se 9 9 4 4 · • · • * ·· · · • i « · 1 t · • · ··· · • 4 · i · ♦ ♦ · * • · ♦ · • * · ·· « · 4 • · ·· * · I « • · pouze v hostitelské buňce, která umožňuje replikaci tohoto vektoru (tj. je pro jeho replikaci permisivní). V jednom provedení zahrnuje podmíněně se replikující vektor alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace dodává vektoru v replikačně permisivní hostitelské buňce selektivní výhodu oproti standardnímu kmeni viru odpovídajícího viru, z něhož byl vektor odvozen. V dalším provedení podmíněně replikujícího virálního vektoru tento vektor, kterým je přednostně retrovirus, zahrnuje alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace dodává hostitelské buňce, která je vektorem infikována, selektivní výhodu oproti buňce infikované standardním kmenem viru odpovídajícího viru, z něhož byl vektor odvozen. Dále je předmětem vynálezu farmaceutická kompozice, zahrnující podmíněně replikující virální vektor a farmaceuticky přijatelný nosič. Předmětem vynálezu je dále hostitelská buňka, zahrnující podmíněně se replikující virální vektor. Předmětem vynálezu je rovněž vektor, kde tento vektor, jde-li o DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16 a kde tento vektor, jde-li o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, stejně jako jsou předmětem vynálezu izolované a purifikované molekuly zde uvedených nukleových kyselin. Podobně je předmětem vynálezu způsob vytvoření vektoru s ribozymem, způsob modifikace vektoru a způsob propagace a selektivního balení podmíněně replikujícího vektoru bez použití balící buněčné linie. V dalším provedení je předmětem vynálezu způsob 10 10 • 9 99 9 9 9 9 9 9 99 999 9 9 9 9 9 99 «9 ♦ « * 9 9 ·9 9 9 9 9 9 * · 9 · 999 · · · «9 9 * * ·« 99 ♦♦· terapeutického a profylaktického ošetření buňky proti virové infekci. Takové způsoby mohou navíc podle potřeby zahrnovat použití pomocného expresního vektoru, cytotoxického léčiva, proteinů/faktorů nebo inhibitoru proteázy/reversní transkriptázy. Takový způsob může být použit například k inhibici replikace viru, k léčbě rakoviny, k přenosu genů in vivo nebo k expresi potřebného genu v hostitelské buňce. V dalším provedení je předmětem vynálezu způsob použití hostitelské buňky zahrnující podmíněně se replikující vektor k detekci interakce mezi léčivem/faktorem a proteinem. Takový způsob umožňuje charakterizaci proteinu a screening aktivity léčiv/faktorů vzhledem k danému proteinu.
Vynález popisuje způsob inhibice replikace kmene viru divokého typu. Způsob zahrnuje kontakt hostitele, který je schopný být infikován uvedeným kmenem viru divokého typu, upřednostňuje se aktuální infekce kmenem viru divokého typu, dále vektorem, který se pomnožuje pouze v hostiteli, jenž umožňuje replikaci vektoru (to znamená nepatogenního, podmíněně se replikujícího (cr) vektoru). Dále popisuje způsob konkurenční infekce hostitele takovým nepatogenním, podmíněně se replikujícím vektorem. Podmíněně se replikující vektor podle vynálezu obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která poskytuje selektivní výhodu při replikace a prodlužuje podmíněně se replikující vektor, což se srovnává s virem divokého typu, a/nebo nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která poskytuje selektivní výhodu při pomnožení virových partikulí v hostitelské buňce, která obsahuje podmíněně se replikující vektor, což se srovnává s hostitelskou buňkou obsahující virus divokého typu. V preferovaném provedení podle vynálezu vektor obsahuje sekvenci HIV a používá se při léčbě infekce HIV. Pak vektor nebo hostitelská buňka obsahující vektor zahrnuje nejméně 11 Μ * · • · I « • 1 · · • I ··· · « · · ·« ♦· • • · ♦ ♦ • « « • • • • • • * ·*· ·· « ·· • · • ·«· t • · ·♦ • · • · « ♦ jednu sekvenci nukleové kyseliny,, která (1) činí genom crHIV selektivně výhodným ve srovnáni s genomem standardního HIV při balení do progenu virionů (tzn. v buňkách, kde jsou oba obsaženy) a/nebo (2) činí hostitelskou buňku, která produkuje podmíněně replikující se vektor (virus), selektivně výhodnou při produkci crHIV virionů ve srovnání s hostitelskou buňkou, jež produkuje standardní virus. Jedna možnost (vynález však není na ni omezen) je vytvořit genomy crHIV selektivně výhodné při balení tím, že se vybaví jedním nebo více ribozymy, které jsou schopné štěpit standardní genom.
Standardní virus („Virus divokého typu") "Virus" podle vynálezu je infekční agens, které je tvořeno proteinem a nukleovou kyselinou a které používá genetickou výbavu hostitelské buňky k produkci virových produktů specifikovaných virovou nukleovou kyselinou. Termín "nukleová kyselina" označuje polymer RNA nebo DNA, který je jednořetězcový nebo dvouřetězcový, lineární nebo kruhový a může obsahovat syntetické, nepřirozené nebo modifikované nukleotidy, které jsou schopny být inkorporovány do polymerů DNA nebo RNA. DNA polynukleotid je s výhodou obsažen v sekvencích genomové DNA nebo cDNA.
Termín "kmen viru divokého typu" označuje kmen, který neobsahuje žádné umělé mutace podle vynálezu, tzn. že jde o jakýkoliv virus, který se může izolovat v přírodě. Alternativně představuje standardní kmen jakýkoli virus, který se kultivuje v laboratoři v nepřítomnosti dalších virů a je schopný produkovat genomy potomků nebo viriony, podobné těm izolovaným v přírodě. Například molekulární klon pNL4-3 HIV popsaný v následujících příkladech je kmen divokého typu, který je dostupný prostřednictvím National Institutes of Health z AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog (viz také Adachi a kol., J. Virol. 59, 284-291 (1986).
Způsob podle vynálezu se přednostně užívá při léčbě virových onemocnění, které vznikají na základě virové infekce. Požaduje se, aby virus (stejně jako vektor, jak se popisuje dále v textu) byl RNA virus, ale může být také DNA virem. RNA viry jsou diverzní skupina, která infikuje prokaryonty (například bakteriofágy) stejně jako řadu 12 12 9« 9 • 999 • · • ♦ · 99 99 99 9 9 9 9 9 # • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 999 99 9 9 99 99 • 9 ·
• · I 9 · « 9 eukaryont, savce a zvláště lidi. U většiny RNA virů jejich genetický materiál tvoři jednořetězcová RNA, ačkoli nejméně jedna čeleď má jako genetický materiál dvouřetězcovou RNA. RNA viry se rozděluji do třech hlavních skupin: viry s pozitivním řetězcem (to znamená, že genom přenesený virem je přeložen na protein a jejich deproteinizovaná nukleová kyselina je dostatečná k iniciaci infekce), viry s negativním řetězcem (to znamená, že genom přenesený virem je komplementární se smyslem message a musí se před translací přepsat virion-asociovanými enzymy) a viry s dvouřetězcovou RNA. Způsob podle vynálezu se s výhodou používá při aplikaci na viry s pozitivním řetězcem, s negativním řetězcem a viry s dvouřetězcovou RNA.
Mezi RNA viry podle vynálezu patří viry podobné Sindbis-virům (např. togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus a Potexvirus), viry podobné Picornavirům (např. Picornaviriade, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus a Potyvirus), viry s negativním řetězcem (například Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae a Arenaviridae, viry s dvouřetězcovou RNA (např. Reoviridae, Birnaviridae), viry podobné Flavivirům (např. Flaviviridae a Pestivirus), viry podobné Retrovirům (např. retroviridae), Coronaviridae a jiné skupiny virů mezi něž například patří Nodaviridae.
Preferovaným RNA virem podle vynálezu je virus čeledi Flaviviridae, upřednostňuje se virus rodu Filovirus a zvláště virus Marburg nebo Ebola. Virus čeledi Flaviviridae je virus rodu Flavivirus, jako je virus žluté horečky, virus dengue, virus západního Nilu, virus encefalitidy ze St. Louis, Japonský virus encefalitidy, virus encefalitidyúdolí Murray, Rocio virus, virus klíšťové encefalitidy a podobně. 13 ·· • · · • · · • · • · ·· ·· ··· · ·· ♦ ♦ · ♦ «1« t * ♦ · ♦ • * ·· • · * • · *·· « #· • · * ·*
Preferují se také viry čeledi Picornaviridae, upřednostňuje se virus hepatitidy A (HAV), virus hepatitidy B (HBV) nebo virus hepatitidy ani A ani B.
Dalším preferovaným virem je virus čeledi retroviridae (to jsou retriviry), zvláště virus rodu nebo podčeledi Oncóvirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae a Lentivirus. RNA virus podčeledi Oncóvirinae je lidský T-lymfotropní virus typu 1 nebo 2 (to je HTLV-1 nebo HTLV-2) nebo virus boviní leukémie (BLVj, virus sarkomu ptačí leukózy (např. Virus Rousova sarkomu (RSV), virus ptačí myeloblastózy (AMV), virus ptačí erytroblastózy (AEV) a Rous-asociovaný virus (RAV; RAV-0 až RAV-50), savčí virus C-typu (např. Moloneyův myšší virus leukémie (MuLV), myšší virus Harveyova sarkomu (HaMSV), Abelsonův myšší virus leukémie (A-MuLV), AKR-MuLV, kočičí virus leukémie (FeLV), virus opičího sarkomu, virus retikuloendoteliózy (REV), virus nekrózy sleziny (SNV)), virus B-typu (např. opičí virus nádoru prsní žlázy (MMTV)) a virus T-typu (např. Mason-Pfizerův opičí virus (MPMV) a "SAIDS" viry) . Mezi RNA virus podčeledi Lentivirus patří HIV-1 nebo HIV-2, kde HIV-1 se nazývá lymfadenopatie asociovaný virus 3 (HTLV-III) a virus syndromu získaného selhání imunity (ARV) nebo jiný virus příbuzný HIV-1 nebo HIV-2, který je spojován AIDS nebo nemocemi, které jsou podobné AIDS. Termíny "HIV" nebo "AIDS" nebo "lidský virus nedostatečné imunity" se používají obecně ve spojení s HIV viry a s HlV-příbuznými nebo spojovanými viry. RNA virus podčeledi Lentivirus je přednostně Visna/maedi virus (např. co infikuje ovce), kočičí virus nedostatečné imunity (FIV), boviní lentivirus, opičí virus nedostatečné imunity (SIV), koňský virus infekční anemie (EIAV) a kozí virus arthritis-encefalitis (CAEV). 14 ·· ·· • ♦ · ·· ·· • t • · ·· · ♦ * * • · • « • t I * · • · • « • · lil · • · · • «*· • · t · • ♦ » * • • » ·· ·· ·♦ • · • ·
Virus podle vynálezu může být také DNA virus. DNA virus je Epstein-Barrové virus, adenovirus, virus herpes simplex, papilomavirus, virus vakcinie a podobně. Řada těchto virů se klasifikuje jako patogeny spadající do "úrovně bezpečnosti A" (to je (WHO) Světová zdravotní organizace "Risk Group A"), které vyžadují pro všechny práce v laboratoři maximální kontrolní zařízení. Odborník je seznámen se všemi bezpčnostními nařízeními vztahující se na práci s těmito viry. "Hostitelská buňka" může být libovolná buňka, upřednostňuje se eukaryontní buňka. Hostitelská buňka je lymfocyt (jako je T-lymfocyt) nebo makrofág (jako je monocytický makrofág) nebo prekurzorem takových buněk, jako jsou hematopoietické kmenové buňky. Upřednostňuje se, aby buňky na svém povrchui obsahovaly CD4+ glykoprotein, to znamená, že jsou CD4+. Požaduje se, aby CD4+ T-lymfocyt, který se infikoval virem AIDS, nebyl ještě aktivován (to znamená, aby ještě nedošlo k expresi genu nef a dokonce více se preferuje, aby se exprese CD4 neoslabila, jak se popisuje dále v textu). Avšak hostitelská buňka je s výhodou buňka, která nemá CD4 markera je ještě schopna být infikována virem podle vynálezu. Taková buňika zahrnuje například astrocyt, fibroblast kůže, buňku střevního epitelu a podobně. Hostitelskou buňkou je s výhodou eukaryontní, vícebuněčné specie (např. opak jednobuněčné kvasinky) a dokonce více se upřednostňuje savčí, například lidská buňka. Buňka může být přítomna jako jedinec nebo jako součást větší sbírky buněk. Takvá "větší sbírka buněk" může obsahovat např. buněčnou kulturu (buď smíchanou nebo čistou), tkáň (např. epiteliální nebo jinou tkáň), orgán (např. srdce, plíce, játra, žlučník, močový měchýř, oči a jiné orgány), orgánový systém (např. cirkulační systém, respirační systém, trávicí systém, močový systém, nervový systém, kožní systém a jiný orgánový systém) nebo organizmus (např. pták, savec a podobně). Upřednostňuje 15 15 9 9 9 9 999 9 9 9 9 • *· 99 9 9 ·· · · 9 9 9 9 9 9· 9 9 • 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 • 9 9 999 99 • 9 9 9 99 • » t « * t • · « · ·· se, aby orgán/tkáně/buňky, které jsou cílem, byly cirkulační systém (např. zahrnující krevní cévy a krev), respirační systém (např. nos, faryng, laryng, trachea, bronchi, průdušnice, plíce a podobně), trávící systém (např. ústa, hltan, jícen, žaludek, střeva, slinné žlázy, pankreas, játra, žlučník a jiné), systém močových cest(jako např. ledviny, močovody, močový měchýř, močová trubice a podobně), nervový systém (např. mozek, míchu a speciální smyslové orgány, jako jsou oči) a kožní systém (např. kůže). Jako cílové buňky se dokonce více se upřednostňují buňky vybrané ze skupiny obsahující buňky srdce, krevních cév, plic, játer, žlučníku, močového měchýře a očí.
Vektor
Termín "vektor" je molekula nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), která slouží k přenosu sekvence cizorodé nukleové kyseliny (to je DNA nebo RNA) do hostitelské buňky. Existují tři běžné typy vektorů: plazmidy, fágy a viry. Jako vektor se upřednostňuje virus.
Vektor není kmen viru divokého typu, protože obsahuje mutace vytvořené člověkem. Pak vektor je odvozen genetickou manipulací od kmene viru divokého typu (to je delecí), aby obsahoval podmíněně se replikující virus, jak se dále popisuje v textu. Virový vektor v optimálním případě obsahuje kmen viru, který je stejného typu jako virus divokého typu, který způsobuje léčenou infekci. S výhodou se používá jeden ze dříve zmiňovaných virů divokého typu. Vektor se odvodil z viru RNA, více se upřednostňuje vektor odvozený z retroviru a optimální je vektor odvozený od HIV. Takový vektor odvozený z HIV je označován jako vektor "crHIV".
Také se upřednostňuje "chimérický vektor", např. kombinace virového vektoru s jinými sekvencemi, jako např. kombinace sekvencí HIV s jiným virem (který je odvozen 16
• · • · • · ♦ ♦♦ • · • t · * • · ·♦ ··* * · ♦ · · ·· ♦· virového kmene divokého typu, aby obsahoval podmíněně replikující se vektor). HIV sekvence mohou bát zvláště spojeny se sekvencemi modifikovaného (to znamená ne divokého typu) kmene adenoviru, adeno-asociovaného viru, vektor Sindbisova viru nebo anfotrofního myšího retrovirového vektoru.
Vektor může obsahovat buď DNA nebo RNA. Pro odvození viru se může použít buď DNA nebi RNA vektor. Podobně kopie cDNA se může vytvořit s virového RNA genomu. V jiném případě cDNA (nebo virová genomová DNA) se může přepisovat in vitro za produkce RNA. Tyto metody jsou v oboru dobře známy a také jsou popsány v následujících příkladech.
Termín "podmíněně se replikující virus" je replikačně defektní virus, který je defektní pouze za určitých podmínek. Virus si může doplnit svůj replikační cyklus v permisivní hostitelské buňce a nemůže se doplnit svůj replikační cyklus v restriktivní hostitelské buňce. Termín "permisivní hostitelská buňka" je hostitelská buňka infikovaná kmenem viru divokého typu. K takové infekci může dojít buď před nebo po infekci s podmíněně se replikujícím virem podle vynálezu. V jiném případě termín "permisivní hostitelská buňka" znamená buňku, která kóduje produkty virových genů divokého typu, jenž jsou nezbytné při replikaci viru. Podmíněně se replikující vektor podle vynálezu je virus (upřednostňuje se stejný typ viru, jako je léčená infekce), který se replikuje pouze při komplementaci kmene viru divokého typu nebo v případě, že virus divokého typu infikuje buňky obsahující genomy podmíněně se replikujícího vektoru. V preferovaném provedení vynálezu vektor obsahuje RNA virus (např. podmíněně se replikující HIV virus), který je začleněn ve formě DNA) . Toto preferované provedení vynálezu poskytuje strategii replikujícího se HIV-1 vektoru (crHIV), která nabízí nepatogenní crHIV-Ι vektorový genom se selktivní 17 « ··· · ··
#· *· • ♦ · · • · ♦ • « ♦· ·«· « · • · · ·« ·· výhodou ve srovnání patogenními HIV genomy divokého typu. crHIV RNA má v buňkách obsahujících genomy HIV divokého typu i crHIV selektivní výhodu při balení do viriónů, protože obsahují například ribozymy, které štěpí RNA divokého typu, ale ne RNA crHIV. Takové nepatogenní crHIV jsou schopny se dostat do neinfikovaných buněk, které jsou náchylné na infakci virem HIV (např. CD4+ buňky) za přítomnosti pomocného viru divokého typu. Tímto způsobem interferuje selektivní balení a rozšíření crHIV s replikací HIV divokého typu.
Genomy crHIV se zavedly do infikovaných nebo neinfikovaných buněk. Infikované buŇky poskytují genomu crHIV proteiny, které jsou nutné při tvoření kapsidu a produkci progenu virionů. Genomy crHIV se zavádějí do neinfikovaných buněk s výhodou přímo transdukcí (např. transdukcí zprostředkovanou DNA crHIV nebo použitím chimerového virového vektoru) nebo infekcí crHIV partikulí, které vznikají při transfekci infikovaných buněk HIV divokého typu. Samotné neinfikované buňky neprodukují partikule crHIV. Avšak mohou být superinfikovány virem divokého typu, který poskytuje proteiny požadované při při další produkci partikulí crHIV. V tomto smyslu podmíněně se replikující vektor podle vynálezu také funguje jako typ "virového transportního vektoru", které se mohou použít při crHIV infekci v několika cyklech (to znamená při existenci konkurenční infekce HIV divokého typu). Takový vektor, který poskytne zdroj viru pro více jak jeden cyklus virové replikace, je v kontrastu s jinými současně používanými vektory, jako jsou ty, které se používají s balícími buněčnými liniemi a které jsou vhodné pouze při replikaci v jednom cyklu.
Je-li to nutné (např. při použití vektoru in vitro) produkty genu viru divokého typu se mohou zavést do buňky, která je infikovaná podmíněně se replikujícím vektorem. Produkty genu viru divokého typu se mohou dodat ne pouze ko- 18 18 « · · · • · · · • · ··· · • · · ·♦ Μ • · * ·» ·♦ *· · · • · • « t · 1 « · • · • · « • ·«· • · • · · • ♦ * ··· ·· #·* ·· ·* ·* infekcí kmenem viru divokého typu (nebo cDNA nebo provirem RNA viru), ale také zavedením expresivního vektoru (např. pomocný expresivní vektor, který je schopen propůjčovat hostitelské buňce sekvence transkripce nebo translace (regulační nebo strukturální)), kde jsou subklónovány jejich geny nebo v jiném případě genové produkty se mohou dodávat exogenně, to je přidáním proteinovývh produktů do buňky. Exprese "pomocného vektoru" může být buněčně specifická nebo nezávislá na typu buňky a může být zavedena do hostitelské buňky v souladu s podmíněně se replikujícím virovým vektorem, přičemž buňka je schopna pokračovat v replikaci podmíněně se replikujícího virového vektoru.
Termín "komplementace" znamená negenovou interakci produktů genů viru z různých zdrojů v buňkách. Při smíšené infekci komplementace zahrnuje zvýšení výtěžku jednoho nebo obou virových parentálních genomů, zatímco genotypy parentálních genomů zůstávají nezměněny. Komplementace může být nealelická (to znamená intergenní, přičemž mutanty defektní v různých funkcích asistují jeden druhému při replikaci viru tím, že poskytují funkci, která je defektní v jiném viru) nebo alelová (to znamená intergenní, přičemž dva rodiče mají defekty v odlišných doménách multimérního proteinu).
Typy buněk, které mohou být transfekovány (transdukovány) DNA crHIV (to je lipozomy nebo použitím adenovirového vektoru nebo amfotropním retrovirovým vektorem) mohou být buď buňky infikované HIV nebo neinfikované' buňky. Buňky infikované HIV se mohou aktivovat nebo nemusí. Jestliže jsou aktivovány, budou bezprostředně přepisovat RNA HIV divokého typu a RNA crHIV, což vede k selektivnímu balení RNA crHIV do viriónů progenů. Jestliže buňky infikované HIV nejsou aktivovány DNA, crHIV v nich zůstanou až do okamžiku aktivace (např. stimulací mitogeny, antigeny a podobně), což 19 19 • ·· »« · · * • · · · ♦ · · · ♦ t · ·«· ··
«· «« ♦ · · · ♦ » · · t · ♦ ♦ · ·· vede k selektivnímu balení CRHIV RNA do virionů progenů. Aktivované a neaktivované neinfikované buňky, které jsou transfekovány crHIV DNA neprodukují viriony až do okamžiku, kdy se jsou superinfikovány HIV divokého typu a aktivovány stimulací, přičemž opět dochází k selektivnímu balení crHIV RNA do virionů progenů.
Superinfekce buněk obsahující genomy crHIV (např. jako výsledek transfekce nebo infekce) se objevuje, protože genomy crHIV nekódují virové proteiny, které blokují superinfekci (jako env a nef) .Výsledné viriony crHIV mohou infikovat neinfikované buňky, protože virové partikule obsahují molekulu reverzní transkriptázy, kterou nesou všechny partikule HIV tak, že mohou tvořit provirus DNA ze své genomové RNA. Tento proces se nazývá reverzní transkripce. Jestliže viriony crHIV infikují neinfikované buňky, podrobí se reverzní transkripci a produkují z jejich genomové RNA provirus. Pak tyto buňky jsou ekvivalentem k těm neinfikovaným buňkám, které jsou přímo transdukovány crHIV DNA. Tyto buňky nemohou produkovat crHIV partikule až do okamžiku, kdy se superinfikuji HIV divokého typu a aktivují se, pak opět dochází k selektivnímu balení crHIV RNA do virionů progenů. Je možné, že crHIV partikule by mohly také infikovat některé buňky, které jsou už infikované HIV (např. Yunoki et al. , Arch. Virol., 116, 143-158 (1991); Winslow et al. , Virol., 196, 849-854 (1993); Chen et al. , Nuc. Acids Res., 20, 4581-4589 (1992); a Kim et al., AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 875-882 (1993)). Aby však došlo k této skutečnosti, tyto buňky infikované HIV nesmí exprimovat proteiny, které zeslabují expresi CD4, protože to by bránilo virionům crHIV infikovat tyto buňky. Aktivované buňky infikované HIV obecně zeslabují expresi CD4. Buňky infikované HIV, které nejsou aktivovány jsou potencionálně náchylné k 20 20 ·· ·· • · · · • · ·· • ·· « · • · · ·· ·· • · · · ·· · · • · · · « ♦ · • « ··· · · w · ♦ ♦ « · · * *· ·· ··♦ ♦· superinfekci s crHIV a tak mohou být dalším zdrojem pro produkci crHIV partikulí.
Preferovaný crHIV vektor podle vynálezu obsahuje sekvence nutné pro transkripci RNA, vázání primeru tRNA, dimerizaci a balení a buď mu chybí sekvence obsahující proteiny, které blokují superinfekci HIV divokého typu (např. nef nebo env proteiny) nebo obsahuje takové sekvence, ale buď nejsou přepsány nebo nejsou přeloženy do funkčního proteinu tak, že jejich exprese se považuje za "latentní". Dokonce více se opřednostňuje, když vektor nemá oblast nebo sekvence kódující oblast HIV divokého typu z kódující sekvence gag a zahrnující gen nef. V optimálním případě však vektor neobsahuje element odezvy řev (RRE), který je klonován do vektoru v oblasti delece nebo některé jiné vhoné oblasti. Takovému preferovanému HIV vektoru, jak bylo uvedeno, "chybí oblast nebo sekvence kódující oblasti".
Způsob konstrukce vektoru je dobře znám v oboru. Jak se popisuje v příkladu 1, DNA RNA viru, jako je HIV, je štěpena použitím restrikčních enzymů za účelem excize kódujících sekvencí HIV z kódující oblasti gag do oblasti U3, které následuje po genu nef. Klonující kazeta zahrnující polylinker obsahující několik restrikčních míst je před ligací začleněna do oblasti delece, aby se získala vhodné restrikční místa pro klonování do vektoru. Fragment DNA obsahující RRE je subklónován do jednoho z těchto restrikčních míst. Výsledný vektor produkuje zkrácený transkript gag a neprodukuje protein Gag divokého typu nebo jiné proteiny HIV divokého typu. Není však nezbytné, aby vektor exprimoval dokonce zkrácený protein gag, protože iniciační sekvence translace gag se mohou mutovat, aby se předešlo jejich translaci. Při stejném přístupu se mohou sekvence crHIV spojit s jinými sekvencemi, jako jsou sekvence viru nebo jiného vektoru za vzniku chimérického vektoru. Sekvence crHIV se 21 • · · · • · · i * « ··· « • · · *· «· • f 9 ·· · • • · • • · • t · • ·· · ·· ·· ·· • « · • ··
Mi I t
·* I *· »· mohou ligovat k sekvencím Sindbisova viru, AAV, adenoviru nebo amfotrofního retroviru, jmenuje se zde pouze několik takových virů, které se mohou použít pro zavedení sekvencí crHIV. Vektor se může zavést do buňky buď použitím mechanizmu spojeného viru (např. receptorem zprostředkovanou endocytózou v případě adenoviru) nebo jiným způsobem, např. lipozomy.
Podle vynálezu se upřednostňuje vektor (to je podmíněně se replikující virus, který s výhodou je vektor crHIV) obsahující nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny (to znamená její přítomnost, transkripce nebo translace), která udílí selektivní výhodu. Existují dva typy takových sekvencí nukleových kyselin, které se mohou použít při inkluzi do vektoru: (1) sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost optimálně poskytuje selektivní výhodu při replikaci viru a rozšíření vektoru obsahujícího takové sekvence do kmenu viru divokého typu (to je s výhodou kmen divokého typu, ze kterého je vektor odvozen a který neobsahuje tuto sekvenci) a (2) sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost optimálně udílí buňkám infikovaným vektorem, který obsahuje sekvenci, selektivní výhodu ve srovnání s buňkami infikovanými kmenem viru divokého typu (to znamená, že se upřednostňuje kmen divokého typu, ze kterého se odvodil vektor (a také např. pomocný expresivní vektor, který podporuje replikaci vektoru a/nebo funkci v neinfikované hostitelské buňce), a který neobsahuje tuto sekvenci), např. podporuje přežití buňky, podporuje produkci vektorových partikula a/nebo propagaci, podporuje produkci vektorových virionů crHIV z buněk produkujících vektor crHIV, indukuje apoptozu, umožňuje produkci proteinu nebo podporuje imunologickou funkci nebo cílení tak, aby se dosáhlo požadovaného profylaktického, terapeutického nebo biologického výstupu. Každá z těchto sekvencí nebo velké množství každé z těchto sekvencí, to znamená sekvence, která sama nebo v kombinaci s jiným 22 ·· ·· • ·· ·· ·· • · • · ·· · · • · • · • · • · • · ·· • · ··· · • · · • ··· • + • · • • · · • • · ·· ·· ··· ·· *· ·· faktorem(y) podporuje propagaci vektoru a/nebo podporuje určitou funkci hostitelské buňky, což umožňuje vhodný profylaktický, terapeutický a/nebo biologický výstup, může být zahrnuto do vektoru, buď v nepřítomnosti nebo v přítomnosti jiné sekvence, to znamená, že vektor může obsahovat "nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny" a "nejméně jednu přidanou sekvenci nukleové kyseliny".
Termín "nukleová kyselina" byl popsán už dříve. "Sekvence nukleové kyseliny" zvláště obsahuje libovolný gen nebo kódující sekvenci (to je DNA nebo RNA) potencionálně libovolné velikosti (to znamená samozřejmě limitované balením, což určuje vektor), které udílí selektivní výhodu, jaks e popisuje dále v textu. "Gen" je sekvence nukleové kyseliny kódující protein nebo nascentní molekulu mRNA (s ohledem na skutečnost, zda sekvence se přepisuje a/nebo překládá). Zatímco gen obsahuje kódující sekvence stejně jako nekódující skevence (např. regulační sekvence) "kódující sekvence nezahrnuje žádnou nekódující DNA. 1. Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost udílí v hostitelské buňce selektivní výhodu vektoru, který obsahuje takovou sekvenci, před kmenem viru divokého typu.
Sekvence nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu vektoru v hostitelské buňce před kmenem viru divokého typu, je s výhodou libovolná sekvence, která umožňuje, na rozdíl od partikulí propagovaných z viru divokého typu selektivní, produkci nebo balení virových partikulí propagovaných z vektoru. Takové sekvence zahrnují, ale nejsou omezeny na sekvenci, která umožňuje zvýšení počtu vektorových genomů, jenž se produkují intracelulárně, což se srovnává s genomy divokého typu, a antivirovou sekvenci nukleové kyseliny.
·» ·· • · · • · · ··» · · • · · «· »· 23
První kategorie sekvencí nukleových. kyselin, které udílí v hostitelské buňce selektivní výhodu vektoru, který obsahuje sekvenci, ve srovnání s kmenem viru divokého typu jsou sekvence, jako je promotor. "Promotor" je sekvence, která řídí navázání RNA polymerázy, přičemž podporuje syntézu RNA, a a která může obsahovat jeden nebo více zesilovačů. "Zesilovače" jsou cis-působící elementy, které stimulují nebo inhibují transkripci přilehlých genů. Zesilovač, který inhibuje transkripci se také nazývá "tlumič". Zesilovač pro sekvenčně specifické DNA vázající proteiny, které se nachází pouze v promotoru (také se nazývají "promotorové elementy"), se liší podle míst vázajících DNA, přičemž zesilovač může fungovat v každé orientaci a na vzdálenost až několika párů kilobází (kb), dokonce z místa, které leží downstream od přepisované oblasti.
Upřednostňuje se, aby se promotor (např. dlouhé terminální repetice (LTR)) podmíněně se replikujícího vektoru HIV modifikoval tak, že vektor způsobuje lepší odezvu na jisté cytokiny, než kmen HIV divokého typu. Například modifikovaný HIV promotor je schopný demonstrovat v přítomnosti interleukinu-2 zvýšenou transkripční aktivitu. Inkorporace tohoto promotoru do vektoru a zavedení vektoru do buněk infikovaných HIV divokého typu s výhodou vede ke zvýšené produkci virionů progenu z genomu vektoru a jejich balení ve srovnání s genomem HIV divokého typu. Jiné cytokiny a/nebo chemokiny (např. nádorový nekrotický faktor a, RANTES a podobně) se mohou podobně použít k podpoře selektivního balení virionů kódovaných vektorem.
Druhá kategorie sekvence nukleové kyseliny, která udílí v hostitelské buňce selektivní výhodu vektoru, který obsahuje sekvenci, ve srovnání s kmenem viru divokého typu, zahrnuje jako preferovanou sekvenci nukleové kyseliny antivirovou sekvenci nukleové kyseliny. "Antivirová agens se rozdělují do 24 ·· ·· • · · · • t · · • · ··· • · · ·· ·!· • ·· • · · · • · · • · · · • · · • · · Μ ·· ·· • · · • ·· ··* · · • · · ·· ·· kategorii na základě způsobu působeni, např. inhibitory reverzní transkriptázy, kompetitory vstupu viru do buňky, vakcíny, proteázové inhibitory a genetická antivirová činidla. "Genetická antivirová činidla" jsou molekuly DNA nebo RNA, které jsou přenášeny do buněk a působí na své intracelulární cíle buď přímo (to znamená, že jsou zavedeny intracelulárně) nebo po jejich konverzi buď na RNA nebo protein (Dropulic'et al., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Genová antivirová sekvence je také preferovanou sekvencí nukleové kyseliny. Genová antivirová agens zahrnují například antisense molekuly, syntetické fragmenty RNA (RNA decoy), transdominantní mutany, interferony, toxiny, imunogeny a ribozymy. Genovým antivirovým agens je antisense molekula, imonogen a ribozym. Preferovanou sekvencí nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu vektoru před kmenem viru divokého typu, je v podstatě genové antivirové agens vybrané ze skupiny zahrnující antisense molekulu, imunogen a ribozym.
Termín "antisense molekula" je molekula, která zrcadluje krátký segment genu, jehož exprese má být blokována. Antisense molekula určená proti HIV hybridizuje s RNA HIV divokého typu, což umožňuje její preferenční degradaci buněčnými nukleázami. Antisense molekuly jsou s výhodou DNA oligonukleotídy, jejichž délka by měla být okolo 20 až 200 párů baží, upřednostňuje se okolo 20 až 50 párů bazía v optimálním případě méně než 25 párů baží. Antisense molekula může být exprimována z crHIV RNA, která se preferenčně váže ne genomovou RNA divokého typu, přičemž udílí crHIV RNA selektivní výhodu při balení do virionů progenů. "Imunogen" je jednořetězcová protilátka (scAb) směrovaná na virový strukturální protein. Imunogen je přenesen jako nukleová kyselina a exprimuje se intracelulárně. Imunogen může také být libovolný antigen, povrchový protein (zahrnuje 25 ·» 25 ·» • · · • ♦·
♦ ♦ • · · « • · ··· • · · «· ·· ty rozdělené do tříd) nebo protilátka, která umožňuje selektci vektoru a/nebo hostitelské buňky. U preferovaného vektoru sekvence nukleové kyseliny obsahuje scAb, která se váže na Rev protein HIV divokého typu. To s výhodou bráni maturaci Rev proteinu, což vede k jeho utajeni v endoplazmatickém retikulu. Proteiny Rev exportují HIV RNA neupravenou sestřihem do cytoplazmy prostřednictvím navázáním na RRE a pak oligomerizaci na okolní RNA HIV. HIV RNA, která tvoří komplex s Rev jsou exportovány do cytoplazmy a obchází buněčnou úpravu sestřihem. V případě, že se Rev divokého typu neváže na RRE divokého typu, se HIV RNA divokého typu neexportují do cytoplazmy a nejsou uzavřeny do kapsidu virionů progenů. V optimálním případě vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny scAb dále obsahuje modifikovanou RRE sekvenci a kóduje mutovaný Rev protein, který rozeznává modifikovaný RRE, ale nerozeznává RRE divokého typu. V buňkách, které obsahjí HIV divokého typu a vektor obsahující sekvenci sekvenci nukleové kyseliny scAb, je vektor s výhodou balen do virionů. Podobná strategie se s výhodou použije tam, kde proteiny matrice HIV divokého typu nebo nukleokapsidu (nebo libovolného proteinu, který se podílí na interakcích protein/RNA, které ovlivňují vznik kapsidu virové RNA) jsou cílem scAb. "Ribozym" je antisense molekula s katalytickou aktivitou, to znamená, že místo vázání RNA a inhibice translace ribozymy se váží na RNA a působí místně specifické štěpení navázané molekuly RNA. Obecně existují čtyři skupiny ribozymů: intervenující sekvence Tetrahymena skupina I, RNáza P a ribozym "hammerhead" a vlásenkový (hairpin) ribozym. Další katalytické motivy však existují také v jiných molekulách RNA, např. virus hepatitidy delta a ribozomální RNA v mitochondriích hub. 26
• · · · · • · · ·· • · ··· · · • · · · ·« ·· • · ··
Preferované ribozymy jsou ty, kde katalytická doména štěpí 3'-nukleotid NUH sekvence, kde N může být nukleotid (to znamená G, A, U nebo C) a H může být buď A, C nebo U. Protože sekvence, která se štěpí nejúčiněji takovými ribozymy, je místo GUC, upřednostňuje se, aby sekvence NUH obsahovala místo GUC.
Takový ribozym štěpí v oblasti kmene viru divokého typu nebo jeho transkripty, ale neštěpí v oblasti vektoru nebo jeho transkripy. Ribozym štěpí virus nebo jeho transkripty ve smyslu, že takový virus nebo vektor může být buď RNA nebo DNA, jak se popisuje dříve v textu. Termín štěpení "v oblasti" míní štěpení v cílové oblasti, to znamená s výhodou oblast viru, která je nezbytná při propagaci viru. Vektor se modifikuje tak, že tato určitá cílená oblast (to znamená jeli celá přítomna ve vektoru) není štěpena ribozymem. Ribozym může štěpit vektor tak dlouho, pokud se štěpení neobjeví v oblasti, která je nutná při propagaci viru, např. crHIV partikulí. V optimálním případě ribozym je kódován sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3 (to je CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) a SEQ ID NO: 4 (to je ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC). Zatímco SEQ ID NO: 3 obsahuje ribozym, který směřuje do místa +115 (to je počet baží downstream od počátku transkripce) oblasti U5 HIV divokého typu, SEQ ID NO: 4 obsahuje ribozym, který je cílen do místa +133 oblasti U5 HIV divokého typu.
Takový ribozym je schopný štěpit genom HIV divokého typu (nebo jeho transkripty), ale ne genom vektoru (nebo jeho transkripty), protože sekvence vektoru U5 jsou modifikovány místně specifickou in vitro mutagenezí, která je dobře známa v oboru a je popsána v příkaldu 1. Upřednostňované sekvence vektoru se modifikují tak, že vektor obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2 (to je 27 « ♦· ♦· • · · · • · · · • · ··· · ♦ · ·· ·· • # o · · · · • ♦ · · * • » · I ·#♦ · • · · · · « · · 1« ·· GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC), SEQ ID NO:5, (to je GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC), SEQ ID NO: 6 (to je GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAACTAGAGATC), SEQ ID NO:14, kde alespoň jeden N je mutován, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16. Jestliže se vektor vyskytuje ve formě RNA, obsahuje s výhodou sekvenci kódovanou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:14, kde alespoň jeden N je mutován, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO:16. Naopak HIV divokého typu obsahuje U5 sekvenci kódovanou sekvencí SEQ ID N0:1 (to je GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Modifikace in toto a srovnání se sekvencí U5 divokého typu (ve formě DNA) jsou zobrazeny na obrázku č. 2.
Mohou se použít buď samotné ribozymy cílené do dalších oblastí virového genomu, zvláště do genomu HIV, nebo mohou být v kombinaci. Ribozym může například štěpit další sekvence RNA nutné při replikaci viru, např. oblast reverzní transkriptázy, proteázy nebo transaktivátoru proteinu, Rev nebo je-li to nezbytné již popsané sekvence. Vektpdr obsahuje více rybozymů, které jsou například cíleny do více míst. V takových případech analogové sekvence ve vektoru se modifikují místně řízenou mutagenezí nebo některými jinými způsoby, které jsou známy v oboru, přičemž vzniká vektor, který je rezistentní ke štěpení takového ribozymu.
Jestliže vektorem je HIV, upřednostňuje se, aby vektor neobsahoval gen tat a jeho 5'místo sestřihu obsahuje trojnásobnou anti-Tat ribozymovou kazetu, kde katalytická doména každého ribozymu trojnásobné ribozymové kazety štěpí různé místo v molekule nukleové kyseliny HIV divokého typu, zvláště v odlišném místě v genu tat. Upřednostňuje se, aby katalytická doména každého ribozymu štěpila nukleotidovou sekvenci v oblasti samotné molekuly nukleové kyseliny HIV 28 ·· ·♦ • · · · « · « · • · ··· · « · · ·· ·· ♦ «· # · ♦ · 4 9 · • « · «♦# ··
·· ·· divokého typu, pro který neexistuje ve vektoru protějšek citlivý vůči ribozymu. 2. Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost udílí selektivní výhodu buňkám, které jsou infikovány vektorem obsahujícím tuto sekvenci, před buňkami infikovanými kmenem viru divokého typu
Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost udílí selektivní výhodu buňkám, které jsou infikovány vektorem obsahující tuto sekvenci, před buňkami infikovanými kmenem viru divokého typu (to znamená, že nemají danou sekvenci), je s výhodou libovolná sekvence, která umožňuje buňce obsahující vektor přežít a propagovat virové partikule (to znamená crHIV virových partikulí) ve srovnání s buňkou obsahující virus divokého typu. Takové sekvence zahrnují například libovolnou sekvenci, která umožňuje buňce nebo vektoru, který je obsažený v buňce, uniknout poškození, dále sekvence, které podporují přežití buňky, sekvence, které indukují apoptózu, sekvence, které umožňují produkci proteinu nebo sekvence, které podporují imunitní funkci nebo cílení.
Upřednostňuje se například, aby taková sekvence nukleové kyseliny obsažená ve vektoru kódovala geny pro rezistenci na několik léků (např. Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 956-962 (1986); Ueda et al., J. Biol. Chem. , 262, 505-508 (1987); a Ueda et al., PNAS, 84, 3004-3008 (1987)). Jestliže se přidá cytotoxická látka (např. jako se užívá při chemoterapii v případě zhoubného bujení) buňka obsahující vektor přežívá, zatímco buňka, která obsahuje virus divokého typu, jako je HIV, odumírá. Takové cytotoxické látky zahrnují např. aktinomycin D, sulfát vinblastinu, sulfát vinkristinu, daunomycin, adriamycin, VP-16 a AMSA. V jiném případě je nutné, aby sekvence nukleové kyseliny obsahovala sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvenci (nebo sekvenci, která kóduje) mutované (to je mutant) 29 proteázy a sekevnci (nebo sekvenci, která kóduje) mutovanou (to je mutant) reverzní transkriptázy. Mutovaná reverzní transkriptáza je přednostně připravena tak, že je rezistentní k inhibitorům nukleisidové a nenukleosidové reverzní transkriptázy a mutovaná proteáza je připravena tak, aby byla rezistentní k běžně používaným inhibitorům proteázy.
Aplikace těchto inhibitorů proteáz nebo reverzních transkriptáz na hostitele v konjugaci s vektorem se používá při selekci buněk, které produkují vektor, narozdíl od buně, jenž produkují virus divokého typu. Podobně se tento přístup modifikuje za účelem použití s libovolným lékem, který inhibuje virovou replikaci tak, že se virus může mutovat, aby unikl inhibici. Za účelem léčby HIV sekvence nukleové kyseliny selektivně inkorporovaná do vektoru s výhodou obsahuje mutované sekvence HIV. V optimálním případě tyto sekvence však nepředcházejí superinfekci HIV divokého typu.
Upřednostňovaný vektor je jeden z těch, které jsou popsány shora v textu a zvláště preferované vektory crHIV jsou zobrazeny na obrázcích č. 1B až 1E, což jsou crHIV-1.1, crHIV-1.11, crHIV-1.12 a crHIV-1.111 (Dropulic'et al., PNAS, 93, 11103-11108 (1996)). Také se preferuje vektor popsaný v příkladu 11, to znamená cr2HIV.
Vektor cr2HIV přednostně neobsahuje gen tat a místo sestřihu z genomu HIV divokého typu. Na místě genu tat a jeho místě sestřihu vektor cr2HIV obsahuje trojnásobnou Tat ribozymovou kazetu, kde katalytická doména každého ribozymu trojnásobné ribozymové kazety štěpí různé místo v molekule nukleové kyseliny HIV divokého typu. Upřednostňuje se, aby katalytická doména každého ribozymu trojnásobné ribozymové kazety štěpila odlišné místo v genu tat v molekule nukleové kyseliny HIV divokého typu. Výhodnější je, aby katalytická doména každého ribozymu štěpila nukleotidovou sekvenci v oblasti molekuly nukleové kyseliny HIV divokého typu, pro 30 30 »« ·· • t · ψ ·· ·♦ * · · « « · ♦ · ··
·· ·* ♦ · · · « · · · • · ··· · • · · ·· ·· ketrou neexistuje ve vektoru protějšek rezistentní k ribozymu. V optimálním případě je vektor komptatibilní s buňlou, do které se vnáší, např. je schopen v buňce zajistit expresi sekvencí nukleové kyseliny kódovaných vektorem. Vektor obsahuje počátek replikace, který je funkční v buňce. V případě, že sekvence nukleové kyseliny se transformuje do formy DNA kódující sekvence (např. verzus formě celého genu, který obsahuje svůj vlastní promotor), pak v optimálním případě vektor také obsahuje promotor, který je schopný řídit expresi kódující sekvence a je operativně spojen s kódující sekvencí. Kódující sekvence je "operabilně spojena" s promotorem (např. v případě, že kódující sekvence a promotor dohromady tvoří nativní nebo rekombinantní gen), kdy promotor je schopný řídit transkripci kódující sekvence. V rekombinantním vektoru podle vynálezu jsou správně umístěny všechny signály transkripce (např. iniciační a terminační signály), translace (např. vstupní nebo vazebné místo na ribozomu a podobně) a signály zpracování (např. donoravá nebo akceptorová místa sestřihu, jsou-li nezbytná, a polyadenylační signály) tak, že libovolný gen nebo kódující sekvence je správně přepisována (a/nebo překládána, je-li to nutné) v buňce, do které je vektor vnesen. Provádí se manipulace s takovými signály, aby se zajistila správná exprese v hostitelských buňkách.
Vektor přednostně také obsahuje některé prostředky, pomocí kterých je možné identifikovat a vybrat vektor nebo jeho obsaženou subklónovanou sekvenci. Identifikace a/nebo selekce vektoru je provedena za použití různých přístupů, které jsou v oboru dobře známy. Vektory, které například obsahují určité geny nebo kódující sekvence se s výhodou identifikují hybridizací, přítomností nebo absencí funkcí genů, které se nazývají "signální" a jsou kódovány signálními 31
Μ ♦· • · · ♦ • · t·
geny přítomnými na vektoru a/nebo expresí určitých sekvencí. V případě prvního přístupu přítomnost určité sekvence ve vektoru se detekuje hybridizací (např. DNA-DNA hybridizací) za použití sond obsahujících sekvence, které jsou homologní s relevantní sekvencí. V případě druhého přístupu rekombinantní systém hostitel/vektor se identifikoval a vybral na základě přítomnosti nebo absence jistých funkcí signálního genu, jako je rezistence na antibiotika, aktivita tymidinové kinázy a podobně, které jsou dány přítomností určitých genů, jenž kódují tyto funkce, ve vektoru. V případě třetího přístupu vektory se identifikovaly na základě testování určitého genového produktu, který je kódován vektorem. Takové testy jsou založeny na fyzikálních, imunologických nebo funkčních vlastnostech produktu genu.
Vynález také poskytuje vektor, který v případě, že jde o DNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16 a který v případě, že jde o RNA, obsahuje nukleotidovou skevenci kódovanou nukleotidovou sekvencí ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16.
Vynález dále popisuje způsob přípravy vektoru s ribozymem, který je odvozen od HIV divokého typu a který je schopný se replikovat pouze v hostitelské buňce, která je permisivní pro replikaci uvedeného vektoru. Ribozym, který je obsažen ve vektoru nebo je jím kódován, štěpí nukleovou kyselinu HIV divokého typu, ale neštěpí samotný vektor a jeho transkripty, jestliže existují. Způsob zahrnuje získání vektoru, který je odvozen HIV divokého typu a který je schopný se replikovat pouze v hostitelské buňce, která je permisivní pro replikaci uvedeného vektoru, a začleněni sekvence nukleové kyseliny do vektoru, přičemž sekvence nukleové kyseliny obsahuje nebo kóduje ribozym, jehož • « • · ♦ • · · φ *· • ·
• · t« • « f · « « Μ ··· · * * * · 31a katalytická doména štěpí nukleovou kyselinu HIV divokého 32 32 *
* # ·· **
·♦ · • I ·· · ·« ·· • # t · • · · · • · ··· · typu, ale neštěpí samotný vektor nebo jeho transkripty v případě, že existují. U takových metod nukleotidové sekvence obsahující nebo kódující sekvenci U5 HIV divokého typu může být z vektoru deletována a nahrazena nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, v případě, že vektor je DNA, a nukleotidovou sekvencí kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, jestliže vektor je RNA. Upřednostňuje se, aby se vektor replikoval v hostitelské buňce, která umožňuje replikaci uvedeného vektoru, více než jednou.
Vynález dále popisuje způsob modifikace vektoru. Způsob zahrnuje získání vektoru a zavedení nukleotidové sekvence do vektoru, která je vybrána ze skupiny obsahující DNA sekvence SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, v případě, že vektor je DNA, a nukleotidové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, v případě, že vektorem je RNA. Dále vynález popisuje způsob propagace a selektivního balení podmíněně se replikujícího vektoru, kdy se nepoužívá balící buněčná linie. Způsob zahrnuje kontakt podmíněně se replikujícího vektoru s buňkou, která je schopna se infikovat dalším vektorem, jde o vektor stejného typu, jako je podmíněně se replikující vektor, a liší se od podmíněně se replikujícího vektoru tím, že s ohledem na kompetentnost replikace se chová jako divoký typ; pak následuje kontakt buňky s dalším vektorem; a kultivace buňky za podmínek, které přispívají propagaci podmíněně se replikujícího vektoru.
Vynález také popisuje molekulu izolované a čištěné nukleové kyseliny vybrané ze skupiny zahrnující molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny • * ·· * • I · · *· • · # * ψ • · ·♦* · · « · · * ·· ·· ··· ·· *♦ • · ♦ * · · « · * * *♦ • · « ··♦♦ · • « * « · «« ·* #· 32a obsahující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16 a molekulu 33 33 • *
t · · 1« ·· ·· ♦· • · · ·
·· · • » * · RNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnujici SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16.
Způsob použiti
Vektory popsané shora v textu jsou přednostně zavedeny do hostitelské buňky za účelem profylaxe a léčby virové infekce, jednoduchého udržováni vektoru a z dalších důvodů. Vynález popisuje hostitelskou buňku, která obsahuje vektor podle vynálezu. Izolace hostitelských buněk a/nebo udržování takových buněk nebo buněčných linií, které se v kultuře od nich odvodily, se stávají rutinou a jsou dobře známy v oboru.
Popsaný vektor se používá při profylaxi a léčbě virové infekci, upřednostňuje se infekce způsobená virem divokého typu, svýhodou jde o RNA virus divokého typu, dokonce ještě výhodnější je retrovirus divokého typu a v optimálním případě je infekce způsobena HIV divokého typu.
Způsob zahrnuje kontakt hostitelské buňky, která je schopna být infikována virem divokého typu, s podmmíněně replikujícím se vektorem, který je schopen se replikovat pouze v hostitelské buňce permisivní pro replikaci vektoru, jehož přítomnost, transkripce nebo translace inhibuje replikaci kmene viru divokého typu v hostitelské buňce. Vektor se replikuje více než jednou a obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která (to znamená její přítomnost, transkripce nebo translace) udili vektoru v hostitelské buňce selektivní výhodu před kmenem viru divokého typu, který je v optimálním případě kmen, ze kterého je vektor odvozen.
Na základě tohoto způsobu sekvence nukleové kyseliny s výhodou zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která obsahuje nebo kóduje genové antivirové agens, které negativně působí na replikaci a/nebo expresi viru, jenž je jiný než uvedený vektor. Genové antivirové agens je vybráno ze skupiny 34
• t · t« ·· « · * lít I ♦ · • · · ♦ * * • ·
zahrnující antisense molekulu, ribozym a imunogen. V optimálním případě genové antivirové agens je ribozym, jehož katalytická doména s výhodou štěpí 3'nukleotidovou NUH sekvenci (to je zvláště sekvenci GUC). V optimálním případě je ribozym kódován nejméně z části sekvencí, vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4. Ribozym štěpí v oblasti kmene viru divokého typu nebo jeho transkripty, neštěpí v oblasti vektoru nebo jeho transkriptů. Tato skutečnost je způsobena tím, že kmen viru divokého typu obsahuje sekvenci kódovanou SEQ ID N0:1, zatímco vektor, jestliže je ve formě DNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou za skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, a jestliže je ve formě RNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16.
Tento způsob se také používá v případě, že vektor obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která (to znamená její přítomnost, transkripce nebo translace) udílí v hostitelské buňce infikované vektorem selektivní výhodu před buňkou infikovanou kmenem viru divokého typu, který je v optimálním případě kmen, ze kterého je vektor odvozen. V tomto ohledu vektor může obsahovat nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu hostitelské buňce infikované virem a nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu vektoru před kmenem viru divokého typu, který odpovídá viru, ze kterého byl vektor odvozen.
Způsob se s výhodou používá tam, kde sekvence nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující rezistenci na více léků. V jiném případě se způsob používá tam, kde sekvence nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou (mutant) proteázu a nukleotidovou sekvenci 35 • · • · · • · t • · • * • t ·♦ ·♦· 9 ·· • 9 ·· • ♦ • · t · · t · ♦ · M • · · • · ·«» f ft · »· ·· • t kódující mutovanou (mutant) reverzní transkriptázu, jako v případě, když virová infekce, která má být profylakticky nebo terapeuticky léčena je způsobena retrovirem.
Způsob dále s výhodou zahrnuje aplikaci agens vybraného ze skupiny zahrnující cytotoxickou látku, inhibitor proteázy a inhibitor reverzní transkryptázy (to je vedle aplikace vektoru) na hostitelskou buňku.
Vektor se může použit v souladu se způsobem popsaným shora v textu, ne pouze při léčbě virové infekce, ale také při ochraně potencionální hostitelské buňky před virovou infekcí, to znamená způsob profylaxe virové infekce nebo "vakcinace" proti viru, jakým je RNA virus, zvláště retrovirus, jako je HIV. Způsob v podstatě inhibuje replikaci kmene viru divokého typu před tím, než se hostitelská buňka dostane do kontaktu s kmenem viru divokého typu. S ohledem na to vektor může obsahovat nebo kódovat proteiny, které blokují superinfekci virem divokého typu. Způsob zahrnuje kontakt hostitelské buňky s podmíněně se replikujícím vektorem, jak se popisuje shora v textu, a "pomocný expresivní vektor," to je virový genom, který podporuje replikaci "vektoru" v neinfikovaném hostiteli. Podmíněně se replikující vektor obsahuje selektivní výhodu při balení a/nebo propagaci. Navíc vektor například může obsahovat sekvenci, která zvyšuje počet buněk, které přežijí, podporuje produkci viru, indukuje apoptózu, umožňuje produkci viru a/nebo podporuje imunitní funkci a/nebo cílení. Konstrukce "pomocného expresivního vektoru" je libovolný expresivní vektor, který doplňuje neschopnost "vektoru" se replikovat. Takové pomocné expresivní vektory jsou běžné a pro odborníky je jednoduché je vytvořit. Pomocný expresivní vektor se buď balí do virionů, podobně jako vektor, nebo se exprimuje bez nutnosti balení. Protože "vektor" má selektivní výhodu pro balení a/nebo propagaci, tento systém umožňuje bezpečný zpsůob pro 36 36 • ♦ ♦ · • Μ · «♦ ·· ·· ♦ * · « I · ·« dosažení vysoké replikace viru bez možných patogenních účinků, ke kterým může potencionálně dojít při použití živého oslabeného viru. Navíc vektor se může smísit s nespifickým adjuvans za účelem zvýšení imunogenicity. Taková adjuvans jsou v oboru známa a zahrnují například Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans, emulze obsahující komponentý stěn bakteriálních a mykobakteriálních buněk a podobně. V případě, že se vektor používá v souladu se shora popsaným způsobem při profylaxi virové infekce, vektor může kódovat antigen proteinu, který není kódován virem divokého typu, jako je mutantní virový protein nebo nevirový protein. Vektorem kódovaný antigen může například být bakteriálního původ nebo může pocházet z kancirogenních buněk. Dále "vektor" také může kódovat gen MHC za účelem vhodné prezentace antigenu v hostitelském imunitním systému. Pak se takový vektor může použít k vyvolání perzistentní imunní odezvy proti souboru potencionálních patogenů a/nebo endogenních proteinů (např. nádorově specifickému antigenu), které jsou selektivně exprimovány v abnormálních buňkách.
Navíc expresivní vektor "pomocného viru" se může zkonstruovat tak, že je exprimován pouze ve specifických typech buněk (např. kmenové buňky, profesionální buňky, ve kterých je přítomen antigen a nádorové buňky) adicí nebo vypuštěním specifického genového elementu/faktoru (buď ve vektoru nebo v expresivní konstrukci pomocného viru) , což umožňuje buněčně specifickému vektoru replikaci a rozšíření. Takový vektor se stále rozšiřuje komplementací s konstrukcí pomocného viru, je buněčně specifický v závislosti na jistém genovém elementu/faktoru je-li přidán do vektoru nebo je-li z něho vypuštěn nebo na konstrukci pomocného vektoru. Tento způsob se může užívat samostatně nebo v kombinaci s další shora uvedenou strategií. 37 ·« ** 4 · · ♦ • · · · « · ··· 9 • · * • ·· • · · · • · · • · · * • · ♦ #·9 Μ
• · · 9 · ♦ ·· · • I «· • · « ·♦ ·«
Např. podmíněně se replikující vektor HIV se replikuje specificky v makrofágách, spíše než v T-buňkách. Vektor, který obsahuje Tat-defektní HIV (vektor kóduje další proteiny HIV, ale ty nejsou expreimovány, protože není přítomen transaktivátor transkripce Tat), může kódovat ribozym, který štěpí HIV divokého typu, ale ne podmíněně se replikující HIV RNA. Pomocný expresivní vektor tohoto vektoru může kódovat gen tat exprimovaný z promotoru, který je specifický pro makrofága. Pak crHIV se bude podmíněně replikovat pouze v makrofágových buňkách,protože není schopen se replikovat v T-buňkách nebo v jiném typu buněk. V jiném případě může být gen tat operabilně spojen s nádorově specifickým promotorem; pak crHIV se bude replokovat pouze v nádorových buňkách CD4 a ne v normálních CD4 buňkách. Genový elemer.t/faktor může také být modifikace promotorové sekvence vektoru, který je exprimován pouze ve specifických buněčných typech a ne v jiných typech buněk v souladu s expresivní konstrukcí "pomocného viru". V jiném provedení pomocná expresivní konstrukce nebo vektorová konstrukce obalových proteinů (jestliže taková konstrukce je upravena tak, že obsahuje obalové proteiny) se může modifikovat tak, že virion s vektorem bude specificky infikovat jisné buněčné typy (např. nádorové buňky), zatímco není schopen infikovat jiné typy buněk (např. normálních buněk). V ještě dalším provedení adenovirus, kterému chybí jeden nebo více klíčových faktorů pro replikaci, může být komplementován použitím pomocné konstrukce, která poskytuje takové faktory spojené k nádorově specifickému promotoru. Faktory, které mohou doplňovat replikaci adenoviru, se budou exprimovat pouze v nádorových buňkách, přičemž umožňují replikaci viru v nádorových buňkách (exprese proteinů je nutná pro usmrcení buňky), ale ne v normálních buňkách. 38
38 »· ··· · ·· » ·· ·· ·· ·· · * • · • * • « · • · ·· • · ♦ · ♦ ·· • · ♦ ♦ ♦ • • · ··« *« M ·« • · · ♦ · · • · • · ♦ ♦
Vynález dále popisuje také způsob léčby zhoubného bujení a zvláště léčbu leukémie T-buněk. "Léčba zhoubného bujení" podle vynálezu zahrnuje aplikaci hostiteli dále modifikovaného vektoru, který je zde pospán, za účelem způsobení léčebné odezvy. Taková odezva může být odhadnuta například monitorováním utlumení růstu nádoru a/nebo regrese nádoru. "Růst nádoru" znamená zvětšování velikosti nádoru a/nebo počet nádorů. "Zhoubné bujení" podle vynálezu je charakterizováno abnormální proliferací buněk a absencí kontaktní inhibice, která je prokázána tvořením nádoru. Termín znamená zhoubné bujení lokalizované v nádorech stejně jako zhoubné bujení, které není lokalozované v nádorech, např. se jedná o karcinomové buňky, které se šíří z lokality nádoru invazí nebo se systematicky rozšiřují tvorbou metastáz. V teoretickém případě podle vynálezu se libovolný typ nádoru může podrobit léčbě podle vynálezu. Zhoubné bujení musí být virového původu.
Shora popsané vektory se mohou přímo použít při genové terapii in vivo. Současné strategie genové terapie trpí tím, že do velkého procenta buněk nelze zprostředkovat zavedení genu; Infekce je dosažena pouze u určitého procenta buněk. To je zvláště důležité při strategii předcházení nádorů, kde je nutná transdukce genu do celé nádorové populace. Jestliže se přidá "vektor" v souladu s "pomocným vektorem" transdukované buňky budou bezprostředně produkovat virové partikule, které mohou infikovat okolní buňky a tak umožňují dosažení úplné transdukce a vysoké účinnosti transdukce. U jednoho provedení vynálezu lidský retrovirus (kterým může být HIV nebo retrotranspozonový element) se může s "pomocnou" konstrukcí zavést do tkáně (nebo do buněk in vitro) . Buňky obsahující vektor a pomocný vektor budou bezprostředně produkovat virus a budou balit vektordo virionů. Tyto viriony 39 39 ·· • ♦ · • · ♦ • · • · ··· ·· ·· ·· * · · « 9 9 99 ·· · · «
9 9 I ·· Μ budou schopny zprostředkovat transdukci okolních buněk s vysokou účinností (protože kontakt buňka-buňka je nejúčinnější způsob transdukce buněk). Transdukované buňky mohou nebo nemusí zemřít, což závisí na skutečnosti zda kombinace vektor/"pomocník" vede k cytolytické infekci. V případě, že se použije retrotranspozon, "pomocník" nemusí obsahovat strukturální proteiny, protože normální nebo nádorové buňky mohou obsahovat protein/faktor nezbytný při kapsidaci virionů. V takovém případě pomocník může pouze být transaktivátorový protein, který aktivuje transkripci faktorů nutných při retrotranspozonové kapsidaci. V případě HIV mohou být při kapsidaci genomu HIV do progenových virionů pro infakci/transdukci buněk nutné další faktory.
Shora popsané vektory se také mohou použít při "counter-chemical" a "counter-biological" konflitní strategii. Například podmíněně se replikující vektor se může zavést do jednotlivých právě infikovaných buněk s vysoce patogenním virem nebo bakterií nebo chemickým činidlem (např. toxin). Vektor interferuje s replikací patogenního viru, jak se popisuje shora v textu. Podmíněně se replikující vektor se také může použít při antibakteriální nebo antichemické strategii v souladu s expresí pomocného vektoru ("pomocníka").
Podmíněně se replikující vektor například může vylučovat protilátky proti bakteriím a toxinům po té, co pomocník umožní jejich expresi a propagaci. "Pomocník" se může řídit (což není nezbytné) indukovatelným promotorem, který umožní jeho expresi při aktivaci pomocí bakterií, cytokinu (při odezvě na bakteriální infekci), antibiotika (pomocí promotorového systému indukovatelného tetracyklinem (Paulus et al., J. Virol., 70, 62-67 (1996)) nebo chemikálií (např. samotným toxínem). Pak podmíněně replikující se vektor se nebude pouze selektivně množit za pomoci "pomocníka" jako 40 40 • »· ·· * * • # · • t · • · · *·· ·· 99 *· • · · · « · ··
• ···· I • · · 99 99 odezva na vyskytující se patogen nebo toxin (což je výsledek aktivace pomocníka) , ale také bude vylučovat protilátky proti patogenu nebo toxinu za účelem inhibice patogenních účinků nádorového antigenu, patogenu nebo chemikálie (např. toxinu). Pak libovolný protein, faktor nebo genetický element, který se může přepsat na buď mRNA a/nebo protein se může vložit do podmíněně se replikujícího vektoru za účelem inhbice patogenní odezvy, což je v souladu s "pomocníkem", který podporuje jeho selektivní propagaci a expresi (jde o selektivní propagaci nebo expresi, protože produkty pomocníka se exprimují podmíněně (např. (a) indukovatelný promotorý systém, což znamená, že faktor v nádorové buňce aktivuje produkci pomocného faktoru, sekvenci odezvy na toxin, která exprimuje pomocný faktor nebo promotor odezvy na cytokin indukuje produkci pomocného faktoru, (b) pomocná RNA/protein/faktor se selektivně stabilizuje pouze v určitých buňkách) a (c) nepřímá indukce genu třetí třídy, která ovlivňuje produkci pomocného virového proteinu, cílení, strukturu nebo jinou biofunkci). Takové strategie se mohou používat u transgenních rostlin a zvířat při jejich ochraně před patogeny. Taková strategie se podobně může použít v transgenních systémech za účelem produkce heterologních proteinů/faktorů. V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy buněčné linie za účelem testování léku/faktoru pro určení například části proteinu/faktoru, která je důležitá pro určitou funkci. Vektor se může připravit za účelem exprese mutagenizovaného proteinu v danné buněčné linii. RNA kódující mutagenizovaný protein se však může připravit tak, že je rezistentní na ribozym, například inzercí tiché bodové mutace. Exprese proteinu divokého typu se však inhibuje v buněčné linii. Mohou se konstruovat vektory, které exprimují ribozym k proteinu, jenž je středem zájmu, za účelem exprese 41 • ·· ·♦ Μ ·· • · · • · · • ··· · • · • · · • · · • · · ··« · · • · · · I · ·« • · · · · · • · « ·· ·« mutovaného testovacího proteinu. V případě, že vektor se transdukuje do buněk, štěpí se většina nativní RNA kódující normální protein, zatímco se exprimije mutovaný testovací protein. Tato metoda se používá společně se současně vyvinutou zaváděcí a selekční metodou, jako rychlá a velmi účinná metoda stanovení funkcí danného proteinu a interakcí danného faktoru/léku s proteinem.
Existuje řada použití způsobu a vektorů podle vynálezu in vitro. Vektory se například mohou použít při zjištění jistých niancí virové replikace a ribozymové funkce. Podobně vektory obsahující ribozym se mohou použít jako diagnostika, například pro stanovení mutace přítomné v nemocných buňkách nebo při stanovení genového posunu. Výhody vynálezu Výhody použití crHIV strategie při genové terapii AIDS a jiných virů jsou zřejmé. Vyřešil se například problém cílení vektoru do buněk infikovaných HIV. Po in vivo transfekci crHIV do buněk infikovaných CD4+, se crHIV zabalily do progenových virionů za použití endogenních infekčních obalových proteinů HIV. RNA crHIV se drží uvnitř progenových viriónů a infikuje buněčné typy, které jsou normálně infikovatelné pouze určitým kmenem HIV, vznikají nepatogenní virióny. Takto se obchází problémy s cílovými buňkami, jako jsou mikroglie mozku, které jsou hlavním zásobníkem infekce HIV centrálního nervového systému. S crHIV vektory, které infikují neinfikované buňky CD4+, je spojena slabá toxicita, protože crHIV vektory nekódují žádné virové proteiny. Výsledkem soutěže crHIV a HIV divokého typu je produkce nepatogenních partikulí, které vedou ke snížení množství viru. Snížení množství patogenního HIV-1 nemusí pouze zvýšit čas přežití infikovaných jedinců, ale také může snížit rychlost transmise do neinfikovaných jedinců, protože 42 ·« «4 · » Λ · * ·· · • · · · · · • · ·*· · I · « · t · ♦ ·· ** 4«· »4 ·· • • · • · • • · • · • * ·· · • * • • • · »1 partikule crHIV se také mohou šířit systematicky (to znamená jako infekční HIV). Snížení množství patogenního HIV-1 v krvi může být zvláště důležité u těhotných jednotlivců infikovaných HIV, protože produkce crHIV může také snížit přenos HIV-1 z infikovaných matek na plod v děloze.
Směs plazmidová DNA/lipid, která se může použít při zavedení vektoru crHIV do hostitelských buněk, by měl být stabilní a jeho produkce by měla být laciná, což umožňuje obejit vysoké náklady na in vivo strategie. Způsob podle vynálezu je samozřejmě flexibilní a může se také použít, jeli to nutné, při ex vivo zavedení genu. Bez ohledu na to schopnost přístupu zprostředkovaného lipozomy otevírá možnost léčby obecné populace, což není možné ve spojení se současnou strategií genové terapie. Vektory crHIV se mohou upravit tak, že obsahují několik ribozymů, které se mohou připravit pro různé cíle na genomu HIV. To redukuje možnost mutace infakčních HIV a úniku účinku anti-HIV ribozymů. Dále strategie podmíněně se replikujících kompetentních virů se může použít při léčbě jiných virových infekcí, zvláště těch, kde je vysoká frekvence přeměny viru. Zvláště užitečným rysem vektorů crHIV je, že se mohou použít post-transkripčně pro expresi genového antivirového agens, např. ribozymů. Tak infekce buněk, které nejsou infikovány vektory crHIV mají nízkou toxicitu, protože slabá exprese je řízena promotorem HIV dlouhé terminální repetice (LTR) za nepřítomnosti proteinu Tat. Vysoká úroveň exprese crHIV a jeho podstatná antivirová aktivita se vyskytuje pouze, když protein Tat se objevuje na základě komplementace s HIV divokého typu. Vektory crHIV nejsou připraveny za účelem ochránit buňky před infekcí HIV, ale snížit zatížení HIV divokého typu pomocí akumulace nepatogenních partikulí crHIV. Věří se, že ribozymy se mohou použít, jak potvrzují následující příklady, tak, že poskytují genomy crHIV se 43 ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·* ·· »·· ·· • · • · • · · * · ·· ·· ·· • · · · • · *· ··· · · • · · «· ·· selektivní výhodou vzhledem k dvoum použitelným vlastnostem: (1) mají vysoký stupeň specifity a (2) mají reletivní účinnost v závislosti na jejich schopnosti ko-lokalizace s cílovou RNA (Cech, Science, 236, 1532-1539 (1987)). Specifita ribozymů se prokazuje jejich specifickou hybridizací s komplementárně cílovými sekvencemi, které obsahují místo XUY. Ribozymy jsou relativně účinné, protože s vysokou účinností štěpí cílové RNA, pouze je-li účinně ko-lokalizován s cílovou RNA. V případě smíšené infekce HIV/crHIV musí dojít ke ko-lokalizaci RNA crHIV, která obsahuje ribozym, s RNA HIV divokého typu, protože genomy RNA HIV dimerizují přes tím, než jsou zabaleny do progenových viriónů. Štěpení negenomových RNA HIV divokého typu je nutné při produkci virových proteinů, je pravděpodobně méně účinné, než štěpení genomové RNA HIV divokého typu, když negenomová RNA HIV není dimerizována. Na základě zde popsaných experimentů se zjistilo, že selektivní výhoda, kterou způsobuje RNA crHIV, je zprostředkována selektivním balením crHIV do virových partikulí. Tyto výsledky naznačují, že k nejúčinějŠímu štěpení dochází uvnitř buňky během dimerizace, což vede k selektivnímu poškození RNA HIV nukleázami hostitele. To umožňuje s výhodou balení RNA crHIV do virových partikulí.
Aplikace vektorů crHIV při terapii HIV nemusí zahrnovat pouze selekci genomu crHIV, ale také buněčnou selekci buněk, které produkují partikule crHIV. V jiném případě buňky produkující HIV divokého typu budou produkovat partikule HIV divokého typu, přičemž buňky produkující partikule crHIV mají selektivní výhodu, a rychle převládají. Selektivní výhoda může být pro crHIV exprimující buňky zajištěna začleněním genu do crHIV genomů (např. gen rezistence na více léků), kterou propůjčují buňky exprimující crHIV (v přítomnosti léku) spolu s výhodou přežití pro všechny buňky, které exprimují HIV divokého typu. Za těchto podmínek buňky 44 exprimujíci HIV divokého typu progresivně umírají, ale stále produkují nějaký HIV divokého typu, zatímco buňky exprimující crHIV, které selektivně produkují crHIV přežívají. Infekce buněk, které obsahují crHIV, se zbývajícím HIV divokého typu povede dále k produkci virových partikulí, jenž obsahují crHIV. Tak posun virového genomu může vést ke kumulativní infekci buněk CD4+ s genomem crHIV, přičemž se mění rovnováha viru v hostiteli z genomů patogenního HIV divokého typu na nepatogenní crHIV. Taková strategie může vést k odstranění HIV divokého typu, po té coje rovnováha genomů HIV selektivně posunuta směrem k crHIV. Replikace viru se zastaví, protože crHIV se může pouze replikovat v přítomnosti pomocných genomů HIV divokého typu. Proto za takových mutantně restriktivních podmínek, je možné připravit vektory crHIV, které ne pouze snižují množství viru HIV divokého typu, ale také vytěsní virus z hostitele infikovaného HIV.
Způsoby aplikace
Vektor je podle vynálezu zaveden do hostitelské buňky pro účely genové terapie virové infekce způsobem, který byl už dříve popsán. Způsob zavedení zahrnuje kontakt hostitele, který je schopný být infikován virem s vektorem podle vynálezu. S výhodou takový kontakt zahrnuje libovolné způsoby, kterými se vektor zavádí do hostitelské buňky; způsob nezávisí na jakémkoli určitém způsobu zavedení a není tak konstruovaný. Způsoby zavedení jsou v oboru dobře známy a jsou zde také uvedeny.
Zavedení se uskutečňuje např. buď in vitro (např. způsob genové terapie ex vivo) nebo in vivo, což zahrnuje použití elektroporace, transformace, transdukce, konjugace triparentální párování, transfekce, infekce, membránová fúze s kationickými lipidy, vysokorychlostní bombardování mikroprojektyly potaženými DNA, inkubace se sraženinou 45 fosforečnanu vápenatého a DNA, přímá mikroinjektáž do jednotlivých buněk a podobně. Jiné metody jsou také dostupné a jsou v oboru dobře známy.
Vektory a ribozymy jsou s výhodou zaváděny způsobem kationických lipidů, například lipozomů. Takové lipozomy jsou běžně dostupné (např. Lipofectin®, Lipofectamine™ a podobně, z firmy Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Pode vynálezu se mohou použít lipozomy, které mají zvýšenou kapacitu přenosu a/nebo sníženou toxicitu in vivo (např. jak se popisuje v patentové přihlášce PCT WO 95/21259). V případě použití lipozomů se může postupovat podle doporučení uvedené v patentové přihlášce PCT WO 93/23569. Obecně taková formulace je pohlcena většinou lymfocytů během 8 hodin při teplotě 37°C. Po jedné hodině od intravenozní aplikace se ve slezině detekovalo více jak 50% injekcí zavedené dávky. Pro zavádění se dále mohou použít hydrogely a polyméry s řízeným uvolňováním.
Forma vektoru zavedená do hostitelské buňky může být různá, což závisí na skutečnosti, zda vektor se zavádí in vitro nebo in vivo. Nukleová kyselina se může uzavřít do kruhu, může mít zlom, může být linearizovaná, což závisí na vektoru, jestli je udržován vně genomu (to znamená jako autonomně se replikující vektor), zda je integrován jako provirus nebo profág, přechodně transfekován, přechodně infikován, jako při použití replikačně deficitního nebo podmíněně se replikujícího viru nebo stabilně zavedeného do hostitelského genomu pomocí zdvojené nebo jednoduché rekombinace mezi páry chromozomů Před zavedením do hostitele vektor podle vynálezu se může přidat do různých kompozic za účelem použití při léčbě a profylaxi. Vektor se může přidat do farmaceutických kompozic v kombinaci s vhodným faramceuticky přijatelnými nosiči nebo 46 • · • · · • · ··· « ·· é
··» · I • · · • · · · • · · · • * • · · ředidly a mohou se připravit tak, aby byli vhodné při aplikaci na lidech nebo na zvířatech.
Kompozice, která se používá při metodách podle vynálezu, může obsahovat jeden nebo více dříve zmiňovaných vektorů, s výhodou v kombinaci s faramceuticky přijatelným nosičem. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou v oboru dobře známy stejně jako metody aplikace. Volba nosiče závisí s části na určitém vektoru, na způsobu aplikace kompozice. Je vhodné, aby existovalo více cest aplikace kompozice a ačkoli se může použít více jak jeden způsob aplikace, mohou se lišit v délce trvání reakce a v účinnosti reakce. Existuje řada vhodných formulací kompozice podle vynálezu.
Kompozice obsahující vektor podle vynálezu samotná nebo v kombinaci s jinými antivirovými látkami, se může připravit do formulace, která je vhodná pro parentální aplikaci, s výhodou pro intraperitonální aplikaci. Taková formulace může zahrnovat vodné a nevodné, izotonické sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty a rozpouštědla, která činí formulaci izotonickou s krví recipienta, dále jsou to vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendující činidla, rozpouštědla, zahušťovadla, stabilizátory a konzervační činidla. Formulace se vyskytovat ve formě jednotkové dávky nebo v multidávkách v uzavřených kontejnerech, jako jsou ampule a lahvičky a mohou se skladovat v lyofilizované formě, což vyžaduje bezprostředně před aplikací pouze přidání sterilního kapalného nosiče, například vody, vhodného pro aplikaci injekcí. Roztoky a suspenze, které se mohou zavést injekcí, se mohou připravit ze sterilních prášků, granulí a tablet.
Formulace vhodná pro orální aplikaci může obsahovat: kapalné rotoky, kde účinné množství látky je rozpuštěno v rozpouštědle, jako je voda, fyziologický roztok nebo ovocný 47 • · • · • · 47 • · • · • · • · • · • » • ·
·· · • · · · • · éM » • · · ·· ·· džus; kapsule, váčky nebo tablety, kde každá obsahuje předem určené množství aktivní látky, jako je pevná látka nebo granule; roztoky nebo suspenze ve vodném roztoku; a emulze oleje ve vodě. Tabletové formy mohou zahrnovat jednu nebo více látek ze skupiny obsahující laktózu, manitol, kukuřičný škrob, bramborový škrob, mikrokrystalickou celulózu, arabskou gumu, želatinu, koloidní oxid křemičitý, kroskarmelózu sodíku, talek, sterát magnézia, stearovou kyselinu a jiné ekcipinety, barviva, rozpouštědla, pufrujicí činidla, zvlhčovadla, konzervační činidla, aromatizační činidla a farmaceuticky kompatibilní nosiče.
Mohou se připravit aerosolové formulace, které se inhalují. Aerosolové formulace se balí do tlakované přijatelné hnací látky, jako je dichloriddifluorometan, propan, dusík a podobně.
Formulace vhodná k orální aplikaci může zahrnovat formy pastilek, které mohou obsahovat aktivní látku s aromatickou příchutí, obvykle je to sacharóza a arabská guma nebo tragakant; pastilky obsahují aktivní látku v inertní bázi, jako je želatina a glycerin nebo sacharóza a arabská guma; a ústní vody obsahují aktivní látku ve vhodném kapalném nosiči; krémy, emulze, gely a podobně obsahují mimo aktivní látky nosiče, které jsou dobře známy v oboru.
Formulace vhodné pro povrchovou aplikaci se používají ve formě krémů, mastí nebo roztoků.
Formulace vhodné pro rektální aplikaci mohou být ve formě čípků s vhodnou baží, která obsahuje například kakaové máslo nebo salicylát. Formulace vhodná při vaginální aplikaci může být ve formě pesaru, tampónu, krému, gelu, pasty, pěny nebo spreje. Tyto formy mimo aktivní látky obsahují nosiče, které jsou v oboru dobře známy. Podobně aktivní látka se může kombinovat s lubrikantem, jenž se použije jako potah na kondom. 48 ·· ·· · ·· Μ ·· • · ♦ * · · ♦ · « · · · • · · · · · · * · ·· • · ··· · · · · · ··« · · «· · #·· ··· ·· ·· ····· · · «« Dávka, která se aplikuje zvířeti, zvláště pak člověku, v souladu s vynálezem, by měla být dostatečná k vyvolání terapeutické odezvy u infikovaných jedinců ve významném časovém úseku. Dávka se určí na základě účinnosti určitého vektory při léčbě, vážnosti fáze onemocnění, hmotnosti těla a věku infikovaného jedince. Velikost dávky se také určí na základě výskytu nežádoucích vedlejších účinků, které doprovázejí použití určitého používaného vektoru. Je nutné vždy, je-li to možné minimalizovat nežádoucí vedlejší účinky. Dávka může být ve formě jednotkové dávky, jako jsou kapsule nebo tablety. Termín "forma jednotkové dávky" jsou fyzikálně nespojité jednotky vhodné jako komplexní dávka pro lidské a zvířecí objekty, přičemž každá jednotka obsahuje předem určené množství vektoru samotného nebo v kombinaci s jinými antivirovými činidly. Uvedené množství je spočítáno tak, aby bylo dostatečné k dosažení požadovaného účinku ve spojení s faramceuticky přijatelným ředidlem, nosičem nebo jiným ekcipientem. Specifikace forem jednotkové dávky závisí na použití určité látky nebo více látek a na účinku, který má být dosažen, stejně jako na dynamice rozkladu každé účinné látky v hostiteli. Aplikovaná dávka by měla být v "množství, které má antivirový účinek" nebo v množství, jenž je nezbytné pro dosažení "účinné hladiny" u jednotlivého pacienta.
Protože "účinná hladina" se preferuje jeko konečný výsledek dávkováni, aktuální dávka a časové intervaly dávky se mohou měnit v závislosti na rozdílech faramkokinetiky, distribuce léku a metabolizmu u jednotlivců. "Účinná hladina" se může definovat například jako hladina v krvi nebo v tkáni pacienta, která odpovídá koncentraci jednoho nebo více vektorů podle vynálezu, jenž inhibuje virus, jako je HIV, v testu, kterým se testuje klinická antivirová aktivita chemických látek. "Účinná hladina" látek podle vynálezu může také kolísat, jestliže se kompozice podle vynálezu používají 49 v kombinaci s zidovudinem nebo s jinými antivirovými látkami nebo s jejich kombinacemi.
Odborník, aby dosáhl "účinné hladiny" látky u jednotlivého pacienta, může pro určitou formulaci látky snadno určit vhodnou dávku, interval a způsob aplikace. Odborník také může snadno určit a použít vhodný indikátor "účinné hladiny" látek podle vynálezu přímou (např. chemickou analýzou) nebo nepřímou (např. pomocí náhradního indikátoru virové infekce, jako je p24 nebo reverzní transkriptáza při léčbě AIDS nebo onemocnění podobnému AIDS) analýzou patřičných vzorků pacienta (např. to jsou krev a/nebo tkáně).
Ke stanovení účinné hladiny u pacienta, která je vhodná pro léčení AIDS nebo onemocnění podobné AIDS, se s výhodou používají zvířecí modely. Zvířecí modely nacházejí široké použití při určování účinnosti protokolů genové terapie in vivo proti HIV (Sarver et al., AIDS Res. And Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)). Tyto modely zahrnují myši, opice a kočky. Dokonce ačkoli tato zvířata nejsou přirozeně náchylná k infekci virem HIV, chimérické myší modely (např. SCID, bg/nu/xid, BALB/c bez kostní dřeně), které obsahují lidské periferní krevní mononukleární buňky (PBMC), lymfatické uzliny nebo fetální tkáň jater/thymu se mohou infikovat virem HIV a mohou se použít jako modely při patogenezi HIV a genové terapii. Podobně se může použít virus opičí imunodeficience (SIV)/opičí model, stejně jako virus kočičí imunodeficience (FIV)/kočičí model.
Preferuje se množství vektoru, které je dostatečné k dosažení koncentrace v tkáni přibližně 50 až 300 mg/kg tělesné váhy za den, zvláště okolo 100 až 200 mgúkg tělesné váhy za den. U jistého způsobu aplikace, například povrchové, vaginální nebo aplikace do očí, se preferuje vícenásobná denní dávka. Počet dávek bude kolísat v závislosti na způsobu zavedení a aplikaci určitého vektoru. 50 Při léčbě některých jedinců infikovaných virem může být nutné použiti režimu "mega-dávky", kde se aplikuje velká dávka vektoru a umožni se působeni této dávky po určitý časový úsek a pak se jedinci aplikuje vhodné činidlo, které deaktivuje aktivní látku(y). Za použití způsobu podle vynálezu je léčba (to je to znamená replikace vektoru v kompetici s virem, který se léčí) nezbytně limitována. Řečeno jinak, když se sníží množství například viru HIV, sníží se tako množství vektoru produkujícího viriony závislého na HIV. V případě léčby AIDS může farmaceutická kompozice ve spojení s vektorem podle vynálezu obsahovat jiná farmaka. Uvedená jiná farmaka se mohou použít tradičním způsobem (např. jako agens při léčbě infekce HIV) nebo při selekci virů crHIV in vivo. Taková selekce, jak se zde popisuje, bude podporovat rozšíření podmíněně se replikujícího HIV a umožní podmíněně se replikujícímu HIV účinněji konkurovat HIV divokého typu, který bude nezbytně omezovat patogenitu HIV divokého typu. Uvažuje se, že je možné použít antiretrovirové agens, jako je s výhodou zidovudin. Další reprezentativní příklady těchto farmak, které se mohou použít vedle těch popsaných shora v textu, zahrnují antivirové látky, imunomodulátory, imunostimulátory, antibiotika a jiní agens a režimy léčby (což zahrnuje ty látky, které se používají v alternativní medicíně) a mohou se používat při léčbě AIDS. Antivirové látky zahrnují například ddl, ddC, gancylclovir, fluorizované dideoxynukleotidy, nonnukleosidové analogové látky, jako je nevirapine (Shih et al., PNAS, 88, 9878-9882 (1991)), deriváty TIBO, jako R82913 (White et al., Antiviral Research, 16, 257-266 (1991)) a BI-RJ-70 (Shih et al., Am. J. Med., 90 (Suppl. 4A), 8S-17S (1991)). Imunomodulátory a imunostimulátory zahrnují například různé interleukiny, CD4, cytokiny, přípravky protilátek, krevní transfúze a transfúze 51
• · ·· • II • · ·· • • • · • · · I • · • • • • • · • I I • · • · • • Ml · • 1 · · II 1 • • • • • lil • • • ·· II « · · II • · II buněk. Protilátky zahrnují například činidla proti houbám, antibakteriální činidla a agens proti Pneumocystis carinii.
Aplikace látky inhibující virus s jiným antiretrovirovým agens a zvláště se znmými inhibitory RT, jako je ddC, zidovudin, ddl, ddA nebo jiné inhibitory, které působí proti dalším HIV proteinům, jako je anti-TAT agens, bude obecně inhibovat většinu nebo všechny replikační stádia životního cyklu viru. Publikovaly se dávky ddC a zidovudinu používané při léčbě AIDS a ARC. Virostatické rozmezí v případě ddC je obecně mezi 0,05 μΜ do 1,0 μΜ. Rozmezí okolo 0,005 až 0,25 mg/kg tělesné váhy působí u většiny pacientů virostaticky. Rozmezí dávky v případě orální aplikace je větší, například 0,001 až 0,25 mg/kg. Aplikuje se jedna nebo více dávek v časových intervalech 2, 4, 6, 8 a 12 hodin. V případě ddC se přednostňuje, aby se dávka 0,01 mg na kg tělesné váhy podávala každých 8 hodin. Při kombinované terapii se další antivirová látka dá aplikovat například ve stejný čas jako vektor podle vynálezu nebo dávkování se může rozložit podle potřeby. Vektor se také může kombinovat do kompozice. Jestliže se látky používají v kombinaci, pak dávka každé může být nižší, než kdyby se užívaly samostatně. Přehled obrázků na výkrese
Obr. 1A až 1E představují schematické znázornění struktury virálního genomu, přítomného ve standardním HIV (obr. 1A) , crHIV-1.1 (obr. 1B) , crHIV-1.11 (obr. 1C) , c.rHIV-1.12 (obr. ID) a crHIV-1.111 (obr. 1E). Význam symbolů: cr -podmíněně replikující; U5 - kódující sekvence U5; Rz -ribozym; Ψ - balící signál; gag, pol, resp. env - kódující sekvence pro proteiny, které tvoří jádro viru, reversní transkriptázu, resp. obálku; tat, rev, rre a nef - další virální geny; prázdné čtverečky - virální repetice s dlouhým 52
·· ·* • · t · • ♦ ·· ·♦ ♦ · · • * · Μ ·· terminálem. Křížky ve standardní kódující oblasti U5 označují přibližné oblasti, v nichž štěpí ribozymy podle vynálezu v RNA standardní U5, ale ne v RNA U5 modifikovaného crHIV (tj, „mU5").
Obr. 2 znázorňuje sekvence DNA U5 RNA HIV (SEQ ID N0:1) (A) a modifikovanou U5 RNA crHIV (SEQ ID NO:2) (B) . Čísla označují počet bázi downstream od počátku transkripce.
Obrázek č. 3 je graf znázorňující aktivitu reverzní transkriptázy (cpm/μΐ) na čase (dny po kontrasfekci) inhibice replikace HIV divokého typu zprostředkovanou crHIV v Jurkartových buňkách, které jsou ko-transfektovány HIV divokého typu a crHIV-1.1 (prázdné čtverce), HIV divokého typu a crHIV-1.11 (čtverce s křížkem), HIV divokého typu a crHIV-1.12 (tečkované čtverce) a HIV divokého typu a kontrolní plazmid pGEM-3Z (plné čtverce).
Obrázek č. 4 je graf znázorňující aktivitu inhibice replikace HIV divokého typu zprostředkovanou crHIV v Jurkartových buňkách, které jsou ko-transfektovány HIV divokého typu a crHIV-1.1 (prázdné čtverce), HIV divokého typu a crHIV-1.11 (čtverce s křížkem), HIV divokého typu a crHIV-1.111 (tečkované čtverce) a HIV divokého typu a kontrolní plazmid pGEM-3Z (plné čtverce).
Obrázky č. 5A až 5C jsou schématická znázornění primerů a sond použitých při detekci transkriptů U5 RNA z HIV divokého typu (obrázek č. 5A), crHIV-1.1 (obrázek č. 5B) a cr HIV -1.111 (obrázek č. 5C) . Vysvětlení zkratek: U5, kódující sekvence U5; Ψ, balící signál; gag, pol a env, kódující sekvence proteinů, které tvoří virové jádro, reverzní transkriptázu a obal; prázdné čtverce, virová dlouhá terminální repetice; tat, rev kódující sekvence; plné čtverce; a PE, VI, V2, V3, R1 a R2 jsou primery použité v případě viru divokého typu a/nebo podmíněně replikujících se virů. Křížky u U5 kódující oblasti divokého typu označují 99 99 9 99 99 99 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 999 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 99 999 99 99 99 53-55 přibližné oblast, ve které ribozymy podle vynálezu štěpí U5 RNA divokého typu, ale nezměnily U5 RNA crHIV (to znamená "mU5"). Příklady provedení vynálezu Příklad 1 Příklad popisuje konstrukci podmíněně se replikujících kompetentních vektorů podle vynálezu. Tento příklad zvláště popisuje konstrukci podmíněně se replikujících vektorů založených na viru HIV, což jsou crHIV vektory.
Jeden z nejdůležitějších aspektů patogeneze HIV-1 je produkce genetických variant viru. Rychlá produkce variant viru HIV in vivo indikuje, že virus je v souladu s teorií Darwinova genetického modelování (např. Coffin, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176, 143-164 (1992); a Coffin, Science, 267, 483-489 (1995)). Uvedené varianty jsou výsledkem nepřesnosti molekuly reverzní transkriptázy HIV-1, která tvoří mutace v nově přepisovaných provirech z virové genomové RNA. Proto za podmínek in vivo se objevuje podstatný stupeň genové variace, což vede k produkci mnoha virových variant. Stále převládá HIV divokého typu, protože za takových neomezených podmínek má největší selektivní výhodu. V přítomnosti inhibitoru, jako je například zidovudin, bude vybrána virová varianta, která má vyšší selektivní výhodu ve srovnání s kmenem divokého typu a bude v podstatě převládat (Coffin et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176, 143-164 (1992); a Coffin, Science, 267, 483-489 (1995)). Na tomto 56 ·· t· · ♦♦ ·· ·· ···· ♦ · ♦ · · · · ♦ φ · · · φ φ · · φ ·Φ • φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ · φ • · φ φφφ φ φ φ φφ φφ φφφ φφ ·· φφ základě vynález poskytuje strategii podmíněně se replikujícího virového vektoru, která poskytuje nepatogenní genomy HIV-1 se selektivní výhodou před patogenním HIV-1 divokého typu.
Tyto nepatogenní podmíněně se replikující vektory HIV (crHIV) jsou defektní HIV, které se podrobují replikaci a balení pouze v Buňkách, které jsou infikovány virem HIV divokého typu. Genomy crHIV soutěží s HIV divokého typu a snižují jeho patogenitu. Účinek snížení zatížení v hostiteli infikovaném virem HIV divokého typu by mělo vést ke zvýšení naděje na přežití. Tím by se také měla snížit schopnost infikovaného hostitele přenést virus HIV divokého typu na neinfikované jedince. V případě úspěšné kompetice crHIV s HIV-1 divokého typu se jeví důležitými dva faktory: (1) selektivní výhoda genomů crHIV před genomy HIV divokého typu a (2) selektivní výhoda buněk exprimujících crHIV předbuňkami, které exprimují HIV divokého typu (to je selektivní výhoda při produkci viriónů crHIV z buněk exprimujících crHIV před buňkami, jenž exprimují HIV divokého typu).
Podmíněně se replikující vektory crHIV způsobují skutečnost, že obsahují sekvence nutné při expresi RNA, dimerizaci a balení, ale neexprimují funkční HIV-1 proteiny (to znamená divokého typu). Vektory crHIV získaly selektivní výhodu začleněním ribozymové kazety, která štěpí v oblasti U5 genomu viru HIV divokého typu, ale neštěpí U5 RNA crHIV.
Ribozymy přítomné ve vektoru neštěpí RNA crHIV, protože oblast U5 RNA crHIV se modifikovala substitucí konzervativní báze (substituce baží se vyskytují v dalších kmenech viru HIV) , což brání ribozymům se účinně navázat a štěpit tato místa. crHIV nejsou patogenní, protože nekódují proteiny, které odpovídají za odumření buněk CD4+. V případě, že se buňky infikované HIV (jenž se transfekovaly vektorem crHIV) 57 aktivovaly, jsou schopny doplnit genomovou nedostatečnost crHIV, což vede k produkci progenových virionů crHIV.
Genomy crHIV se konstruovaly z infekčního klonu HIV pNL4-3 v plné délce (Adachi et al. , J. Virol., 59-, 284-291 (1986)). Všechny reakce klonování, manipulace RNA, DNA a proteinů proběhly za použití metod, které jsou dobře známy v oboru a které se popisují například v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)). Enzymy a reakční činidla, která se používají při těchto reakcích se získala z komerčně dostupných zdrojů (např. New England Biolabs, lne., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, Ca; a Boehringer Mannheim, lne., Indianapolis, IN) a při jejich použití se postupovala podle doporučení výrobce. Vektor se udržoval a pomnožoval za použití způsobů, které jsou dobře známy v oboru a popisují se v předchozím textu (např. Dropulic'et al., (1992) a Dropulic'et al.-, (1993), citace uvedeny shora v textu). "pNL4-3 se štěpil restrikčními enzymy Pst I (které štěpí gen gragr, v pozici + 1 000 od počátku transkripce) a Xho I (které štěpí gen nef, v pozici + 8 400od počátku transkripce) a polylinkr, který obsahuje začleněná vhodná restrikční místa. Fragment Bgl II až Bam HI o velikosti 0,86 kb, který obsahuje element odezvy rev (RRE), se klonoval do restrikčního místa Bam HI, které je přítomno v polylinkru. Tyto manipulace vedou k deleci genomu HIV divokého typu z oblasti kódující gragr až do kódující oblasti U3 (tímto způsobem se také deletuje gen nef). Zatímco vektor je schopen produkovat zkrácený transkript gragr, funkční protein Gag v plné délce není produkován vektorem. Protože podle vynálezu funkce proteinu Gag divokého typu nejsou nezbytné, mohou se sekvence gag mutovat za účelem prevence translace proteinu Gag. 58 ·· ·· • ·· ·· ·· • · • · *· · · • · • ♦ ♦ · • · « « · • · ·· • ♦ »·« t ♦ * · ♦ ··* • ♦ ♦ # • • · · • • ♦ ·· »· «♦« ·· ·♦ ··
Ribozymová kazeta obsahující buď jeden nebo více ribozymů, jak se zde popisuje, se začlenila do restrikčního místa Sal I downstream od restrikčního místa Bam HI. Pro uskutečnění tohoto záměru se syntetizovaly komplementární deoxyoligonukleotidy kódující ribozymové sekvence, spojily se a pak se klonovaly do restrikčního místa Sal I. Ribozymy, které se používají při konstrukci vektorů crHIV byly "hammerhead" ribozymy. Uvedené ribozymy obsahují katalytickou doménu s 22 páry baží a dvě hybridizační domény, kdy každá obsahuje 9 párů baží. Ribozymy směřovaly do míst +115 nebo +133 (což odpovídá počtu párů baží downstream od počátku transkripce) RNA sekvence U5. Hybridizační domény a katalytická doména (podtrženo) ribozymů směřující do míst +115 nebo +133 jsou následující: CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA ("+115 ribozym") (SEQ ID NO: 3) ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC ("+133 ribozym") (SEQ ID NO: 4)
Ribozymová kazeta obsahuje buď jeden, dva nebo tři ribozymy umístěné v tandemu. Vektory obsahují buď jeden (to je vektor "crHIV-1.111", obrázek č. 1B) nebo tři (to je vektor "crHIV-1.1", obrázek č. 1E) ribozymy na stejném místě oblasti U5 RNA HIV v pozici +115. Vektory obsahující dva ribozymy směřují buď do stejného místa do pozice +115 (to je vektor " crHIV-1.11, obrázek č. 1C) nebo do odlišných míst s pozicemi +115 a +133 oblasti U5 RNA HIV; (to je vektor "crHIV-1 .12, obrázek č. ID) . Tyto vektory se zde obecně nazývaj í jako vektory "crHIV". Při dokončení konstrukce vektorů se místo, které je rozeznáváno "hammerhead" ribozymy vyskytující se v oblasti U5 genomu crHIV, podrobilo mutaci a tím se vektory crHIV stávají rezistentní k štěpení ribozymy (to znamená, že se projevují jako RNA). Pro dosažení této mutace zavedením modifikovaných 59 59
• · ·· ·· • · · · • · ·« ··· · · • · · ·· »· míst do vektoru se použil dvouřetězcový oligonukleotid (to je AAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAG ATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC (SEQ ID NO: 13) obsahující substituce bází znázorněné na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 2). Substituce baží se provedly v místech hybridizace a štěpení ribozymu v pozici 115 a 133 párů baží. Jak je uvedeno na obrázku č. 2, mutace se zavedly do pozic 113, 114, 132, 134 a 142 párů baží. Tyto místa se mohou modifikovat, aby obsahovala mutace (to je GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, kde N může být libovolný mutantní nukleotid (SEQ ID N0:14)). Upřednostňuje se však, aby se sekvence mutovaly tak, že v místě +113 došlo například k substituci A nahrazuje G (to znamená, že sekvence obsahuje GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC (SEQ ID NO: 15)), U (to znamená T v případě sekvence DNA) je nahrazeno C v pozici +114 (SEQ ID NO: 5) a U (to znamená T v případě sekvence DNA) je nahrazeno C v místě +132 (SEQ ID NO: 6), a A je nahrazeno G v místě +134 (tak že sekvence obsahuje GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC (SEQ ID NO: 16)) a U (to znamená T v případě sekvence DNA) je nahrazeno A v místě +142, přičemž uvedené mutace mohou být provedeny samostatně nebo v kombinaci. Jestliže není přítomna mutace v oblasti U5, U (to znamená T v případě sekvence DNA) je zaměněno za C v místě +114 (SEQ ID NO: 5) a/nebo v místě +132 (SEQ ID NO: 6) v oblasti U5 RNA crHIV, což brání jejímu štěpení ribozymy (Uhlenbeck, Nátuře, 334, 585 (1987)). Inzertovaná substituce baží se nachází v různých jiných kmenech HIV (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), což naznačuje, že tyto substituce nesnižují replikační kapacitu genomu HIV. 60 ·· ·· • · · ·· ·· • · f · ·· · · • · • t • · • · • · · • · ·· t t ·«· t • ♦ · • #·· « · * · • • » · • • · ·· ·· · ψ Φ ·· ··
Zde uvedený způsob se může použít ke konstrukci jiných podmíněně se replikujících vektorů, které například obsahují různé virové genomy (např. různé RNA viry) nebo obsahují různá genová antivirová agens. Podmíněně se replikující vektor se může dále modifikovat a tak poskytují buňkám hostitele, kam je vektor zaveden, selektivní výhodu před buňkami hostitele, které obsahují virus divokého typu. Takový vektor může být například modifikován tak, že dále kóduje rezistenci na více léků, nebo mutovanou proteázu nebo reverzní transkriptázu. Příklad 2
Tento příklad popisuje rezistenci podmíněně se replikujících vektorů, zvláště vektorů crHIV, k štěpení ribozymem.
Za účelem potvrzení rezistence vektorů crHIV ke štěpení ribozymem se provedla in vitro transkripce. Ribozymální sekvence se klonovala do restrikčního místa Xho I plazmidu pBluescript KSII (Stratagene, La Jolla, CA). Fragment Bgl II o velikosti 0,21 párů kilobazí (kb) obsahující mutovanou oblast crHIV U5 byla podobně vystřižena z vektoru crHIV a vložila se do restrikčního místa Bam HI plazmidu pBluescritp KSII. Výsledné vektory modifikovaného pBluescript KSII se linearizovaly před in vivo transkripcí restrikčním enzymem Bss HII. Jako kontrola se použil podobný plazmid exprimující U5 RNA HIV divokého typu (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)). Před in vitro transkripcí se linearizoval restrikčním enzymem EcoR I.
Radioaktivně značená RNA oblasti U5 viru HIV a ribozymová RNA vznikají transkripcí vektorů in vitro, jak se popisuje v publikaci (Dropulic'et al., (1992), citace uvedena shora v textu). Radioaktivně značené transkripty se inkubovaly dohromady (pří cílovém molárním poměru ribozymu 61 •« · t · Μ ·· ·· ···· ·· · · · » « · ···· · · · ··«· » · ··« · · · · · ··· « « • « · ··· ··· ·· ·· ··· · · ·« Μ 1:2) v lx koncentrovaném transkripčním pufru, který obsahuje 40 mM tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 2 mM Spermidin a 10 mM NaCl. Vzorky se zahřály na teplotu 65°C a pak se 5 minut před přidáním stop pufru, který obsahuje 95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% bromfenolovou modř a 0,05% xylen cyanol FF, zchladily na teplotu 37°C. Produkty se pak rozdělily elektorforézou na denaturujícím polyakrylamidovém gelu (PAGE) a detekovaly se na autoradiograficky. V případě, že se U5-HIV RNA divokého typu inkubovala dohromady s transkriptem, který obsahuje jeden ribozym v místě +115, bylo možno ihned pozorovat štěpení. Při takovém štěpení vznikají produkty PI a P2. Štěpení je také možno pozorovat v případě, že RNA HIV divokého typu se inkubovala RNA, které obsahují dva ribozymy, které jsou směrovány do stejného místa nebo do různých míst. Jestliže se transkript, který obsahuje ribozym směrovaný do dvou různých míst, inkuboval s RNA viru HIV divokého typu, vznikají produkty Pl, P2 a P3. Produkt P3 vzniká při štěpení v místě +133.
Jestliže se modifikovaná RNA crHIV obsahující oblast U5 inkubovala buď s jedním ribozymem směrovaným do místa +115 nebo se dvěmi ribozymy směrovanými buď do místa +115 nebo do místa +133, produkty štěpení nebyly detekovány. Pak tyto výsledky potvrzují, že crHIV U5 RNA je rezistentní ke štěpení ribozymem, zatímco U5 RNA viru HIV divokého typu jsou štěpeny anti-U5 ribozymy. Výsledky však potvrzují, že přístup podle vynálezu se může použít pro vybavení podmíněně se replikujících vektorů (zahrnující vektory jiné než jsou vektory crHIV) selektivní výhodou při replikaci tím, že se do 62 ·· e« v ·· ♦· ·· ···· ·· ♦ · ···· ···· · · · · · ·· • · ··· · · · · · ··· · · « · · · · · · · · ·· ·· ·♦♦ ♦ · *· ι· hostitelské buňky zavede uvedený vektor na rozdíl od kmene viru divokého typu. Přiklad 3
Tento příklad popisuje schopnost podmíněně se replikujících vektorů obsahujících ribozym, vnitrobuněčně štěpit RNA viru divokého typu. Tento příklad zvláště popisuje schopnost vektorů crHIV intracelulárně štěpit RNA viru HIV divokého typu. Účinnost inhibice viru HIV divokého typu, která je zprostředkována vektorem crHIV se testovala ko-transfekcí genomů do Jurkatových buněk. Transfekce proběhla proběhla následujícícm způsobem. Přibližně 106 Jurkatových buněk se promylo v Opti-MEM médiu (Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) a pak se buňky ko-transfekovaly přibližně 0,6 ug DNA viru HIV divokého typu (to je pNL4-3) a přibližně 1,8 ug DNA crHIV. Za účelem zajištění skutečnosti, že všechny buňky transfekované HIV divokého typu také obsahují proviry crHIV, se použil virus HIV divokého typu a provirus crHIV v molárním poměru 1:3. DNA se smísily v lipofektinovém roztoku (Life Technologies) po dobu 30 minut a pak se inkubovaly s Jurkatovými buňkami po dobu přibližně 3 až 6 hodin, po té se přidalo celé médium RPMI 1640, které obsahuje 10 % fetální boviní sérum (FBS). Supernatanty obsahující virus se odebraly každé 2 až 4 dny a množství viru se určilo testováním aktiviry reverzní transkriptízy v buněčných supernatantech, jak dříve popisuje (Dropulič et al., (1992), citace uvedena shora). Účinek genomů crHIV na replikaci viru HIV divokého typu je zobrazen na obr. č. 3. Jestliže virus HIV divokého typu se ko-transfekoval crHIV-1.1, růst viru se opozdil (obr. č. 3, prázdné čtverce) vzhledem k buňkám ko-transfekovaných HIV divokého typu a kontrolním virem (obr. č. 3, plné čtverce), 63 99 99 • 9* 99 99 • 9 • 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 99 • 9 99# · 9 9 9 9 99 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 9 99 99 999 99 99 • 9 ale nebyl inhibován. Protože anti-U5 ribozymy mohou inhibovat replikaci HIV in vivo za ko-lokalizovaných podmínek (např. (Dropulič et al., (1992), citace uvedena shora), virový růst se zdá být výsledkem buď: (a) preferenčního balení RNA viru HIV divokého typu do progenových viriónů, (b) produkce RNA HIV divokého typu, které jsou rezistentní ke štěpení ribozymem nebo (c) akumulace nefunkčních ribozymů v RNA crHIV. Původ zastavení růstu viru se testoval ko-transfekcí HIV divokého typu vektory crHIV, které obsahují dva ribozymy. Jestliže preferenční balení viru HIV divokého typu je zodpovědné za růst viru, pak kultury obsahující crHIV s dvěma ribozymy by měly vykazovat stejnou kinetiku růstu jako kultury, které obsahují crHIV s jedním ribozymem. Jestliže však růst viru pramení z RNA viru HIV divokého typu, pak se stává rezistentní k působení ribozymů (to je výsledek nepřesnosti virové reverzní transkriptázy) , pak kinetiky růstu viru by měly vykazovat větší spoždění u kultur, které obsahují crHIV-1.12 (to znamená, že jsou směrovány proti dvěma místům viru), na rozdíl od kultur, které obsahují crHIV-1.11 (to znamená, že jsou směrovány proti jednomu místu viru). V jiném případě, je-li pozorované zpoždění virového růstu srovnatelné se zpožděním v kulturách, které obsahují různé crHIV s dvěma ribozymy, pak část jednotlivě exprimovaných ribozymů není in vivo funkční.
Jak je možné spatřit na obr. č. 3, kultury obsahující crHIV-1.11 (obr. č. 3, prázdné čtverce s křížkem) nebo crHIV-1.12 (obr. č. 3, tečkované čtverce) vykazují větší zpoždění na začátku růstu viru, než crHIV-1.1, které obsahovaly jediný přepsaný ribozym ((obr. č. 3, prázdné čtverce). Zpoždění na počátku růstu viru mezi crHIV-1.11 a crHIV-1.12 byl podobný, což indikuje správnost třetí možnosti, to znamená, že jednoduše transkribované ribozymy jsou kineticky méně účinné 64 ·· ·· • ·* ·· ·· • • • · ·· · • • · • · • • • · • · • • · ·· • ♦ *·* * • · • • ··· • • • ' * • • · • • • ·· ·· ·· ·· ·· při štěpení cílové RNA, než jsou dva ribozymy. To naznačuje, že jistá část intracelulárně přepisovaných ribozymů může tvořit nefunkční, pravděpodobně chybně zabalené konformace, protože experimenty ko-transfekce se provedly při molárním přebytku genomů crHIV , které obsahují ribozym.
Zjistilo se, že více ribozymů má schopnost uvolnit tuto kinetickou limitaci tak, že vykazují vyšší pravděpodobnost funkčnosti ribozymů ve spojitosti s RNA viru HIV divokého typu. Při uvedených experimentech se Jurkatovy buňky ko-transfekovaly virem HIV divokého typu a crHIV-1.111, který obsahuje tři ribozymy směrované do místa +115. Jak je možné vidět na obrázku č. 3 (tečkované čtverce), neexistuje žádný důkaz růstu viru za použití tří ribozymů, dokonce ani po 22 dnech kultivace. Tyto výsledky jsou podstatné vzhledem ke skutečnosti, že normální primární T buňky často během krátkého časového úseku po infekci HIV odumírají (např. během týdne).
Tyto výsledky potvrzují, že podmíněně se replikující vektory, které obsahují ribozym, jako jsou vektory crHIV a zvláště pak ty, které obsahují více ribozymů se mohou použít intracelulárně ke kompetici s genomem viru divokého typu, jako je HIV. Příklad 4
Tento příklad popisuje zkoumání mechanizmu, který podporuje schopnost podmíněně se replikujících vektorů, které obsahují ribozym, zvláště vektorů crHIV intracelulárně štěpit RNA viru divokého typu. Při těchto experimentech se testoval za použití metody polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí (RT-PCR) buněčný supernatant RNA z kultur ko-transfekovaných virem HIV divokého typu a crHIV-1.111. RT-PCR se uskutečnila za použití primerů zobrazených na obrázcích č. 5A až 5C. Jmenovitě 65
« ·· ·· ·· • · · · · · · · • · · · · ·· ·· ·· ··· · · • · · · · · «·· ·· ·· ·· ribozymová RNA se detekovala za použití priraerů R1 a R2, RNA HIV divokého typu se detekovala za použiti primerů VI a V3 a RNA crHIV se detekovala za použití primerů V2 a V3. Každý z primerů R1 (TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG (SEQ ID NO: 7) a R2 (TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC (SEQ ID NO: 8) obsahuje restrikční místo Sal I a amplifikuje anti-U5 ribozymovou RNA tak, že se váže na ribozymové hybridizačni sekvence. V buňkách, které exprimují crHIV-1.111, se objevuje produkty amplifikace jednoho, dvou nebo tří ribozymů. Každý z primerů VI (GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCC (SEQ ID NO:9)) a V2 (GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG (SEQ ID NO:10)) obsahuje restrikční místa Bam El a Hin dlll a amplifikují RNA viru HIV divokého typu. Vedle dříve uvedeného primerů VI primer V3 (CGGATCCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG (SEQ ID NO: 11)) obsahuje restrikční místo Bam HI a jiná restrikční místa. Tato sada primerů amplifikuje RNA crHIV od crHIV specifické sekvence polylinkru.
Za účelem provést RT-PCR se izolovaly virióny a vnitrobuněčná RNA za použití Trizolu™ (Life Technologies). Intracelulární virové RNA se izolovaly přímo z mikrocentrifugovaných buněčných peletů. Virionová RNA se izolovala ze supernatantů kultury, z které se nejdříve odstranily buňky a buněčný odpad mikrocentrifugací při 12 000 x g po dobu 5 minut. Do supernatantu bez buněk se přidal Trizol™ a směsi se inkubovaly po dobu 5 minut a pak se přidal chloroform a došlo k separaci fází. Vodná fáze se přenesla do nové zkumavky a RNA se precipitovala izopropanolem za použití glykogenu. Po rekonstituci peletu RNA se RNA reverzně transkribovala a amplifikovala se PCR za použití radioaktivně značených primerů.
Reverzní transkripce proběhla po dobu 1 hodiny při teplotě 42°C v pufru, který obsahuje 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM dNTP a 20 jednotek (U) 66 • ♦· ·· · · ·· • · · · #· inhibitoru Rnasy, ke které se přidalo 25 U MuLV reverzní transkriptázy. Po ukončení reverzní transkripce se reverzní transkriptáza deaktivovala teplem při teplotě 65°C po dobu 10 minut. Celá směs se pak přidala přímo do PCR pufru tak, aby vznikla směs, která obsahuje konečnou koncentraci 10 mM Tris-HC1, pH 8,3, 50 mM KC1 a 1,5 mM MgCl2. Směs se amplifikovala ve 30 cyklech za použití 2,5 U enzymu Taq. Radioaktivně značené produkty PCR se pak rozdělily v denaturační PAGE a detekovaly se autoradiograficky.
Ribozymová RNA crHIV-1.111 se objevuje v supernatantech buněk po více než 20-ti dnech po ko-transfekci HIV-1 divokého typu a provirovými genomy crHIV-1.111. To je zřejmé z existence produktů PCR RNA jednoho, dvou nebo tří ribozymů. Takové produkty není možné vidět při amplifikaci RNA z virionů, které produkují kultury transfekované virem HIV divokého typu. Během této doby buňky vypadají normálně, neobjevují se zjevná znamení cytotoxicity indukované crHIV. To potvrzuje, že crHIV je balen do virových partikul! dokonce, ačkoli se nepozorovala žádná aktivita reverzní transkriptázy. To však naznačuje, že crHIV se může vnitrobuněčně komplementovat funkcemi genu HIV.
Tyto výsledky indikují, že crHIV inhibuje replikaci viru HIV divokého typu inhibicí rozšíření viru HIV divokého typu. Výsledky dále indikují, že další podmíněně se replikující vektory například jiné virové vektory a/nebo vektory obsahující jiná genová antivirová agens se mohou podobně použít k inhibici replikace a rozšíření viru divokého typu. Příklad 5
Tento příklad popisuje další zkoumání mechanizmu, který podporuje aktivitu podmíněně se replikujících vektorů, které 67 • · • · · • · · • · • · # • · · I» • · • · • ·- • · · • · • ·
obsahuji ribozym, zvláště vektorů crHIV, intracelulárně štěpit RNA viru divokého typu.
Jeden možný mechanizmus je, že RNA viru HIV divokého typu a crHIV jsou baleny do progenových virionů a v těchto malých virových objemech se objevuje účinné štěpeni způsobené ko-lokalizaci ribozymu a cílovými RNA. V jiném případě se může objevit selektivní balení RNA crHIV do progenových virionů, protože ke štěpení RNA viru HIV divokého typu převážně dochází intracelulárně a ne ve virionech HIV. Tyto mechanizmy se zde zkoumají.
Způsoby kterými crHIV-1.111 inhiboval roznesení HIV divokého typu se zkoumaly v buněčných kulturách, které se transfekovaly samotným virem divokého typu nebo ko-transfekovaly HIV divokého typu a crHIV-1.111, pomocí RT-PCR virových RNA spojených s viriony a s buňkami. RNA crHIV se nacházely pouze v progenových virionech, které vznikají po ko-transfekci. Kontrolní kultury Transfekované HIV divokého typu produkují viriony, které obsahují pouze RNA viru HIV divokého typu. RNA viru HIV divokého typu a RNA crHIV-1.111 se prokázaly v ko-transfekovaných kulturách. Ačkoli jak RNA viru HIV divokého typu a RNA crHIV se syntetizují intracelulárně, jsou selektivně baleny do progenových virionů. To naznačuje, že crHIV-1.111 inhibuje rozšíření viru HIV divokého typu tím, že dochází ke selektivnímu štěpení genomové RNA viru HIV divokého typu před kapsidizací, zatímco umožňuje translaci některých sub-genomových RNA divokého typu na proteiny nutné při produkci viričnů.
Za účelem testování, zda genomové RNA divokého typu jsou selektivně štěpeny RNA crHIV, se typy intracelulárních RNA přítomných v kulturách Jurkatových buněk získaných přibližně 20 dnů po ko-transfekci analyzovaly northernovou hybridizací. 68 ·· ·· ·♦ • · · · · • · · ·· • · ·*· « · ♦ · · · ·· ·· ··
Sonda, která se použila při analýze northernovým přenosem, jak je zobrazeno na obrázku č. 5, se izolovala z Bgl II fragmentu o velikosti 0,21 kb, který pochází z oblasti U5 pNL4-3.
Kultury transfekované HIV divokého typu exprimují všechny druhy RNA viru HIV divokého typu, to znamená genomové a subgenomové typy RNA. Kultury ko-transfekované crHIV-1.111 nevykazují expresi podstatného množství genomové (9,7 kb) RNA viru divokého typu. V ko-transfekovaných kulturách se pozorovala RNA s nízkou molekulovou hmotností (odrážející přítomnost subgenomové RNA viru HIV divokého typu). Šmouha u RNA viru HIV v těchto vzorcích naznačuje, že v těchto RNA o nízké molekulové váze mohou být přítomny některé degradované genomové RNA viru HIV. Šmouha u RNA viru HIV divokého typu získaná z kontrolních buněk HIV divokého typu je způsobena degradací RNA, která se vyskytuje z podstatné CPE a pozoruje se v pozdních stádiích infekce virem HIV.
Tyto výsledky potvrzují, že genomové RNA viru HIV divokého typu jsou selektivně štěpeny a degradovány v buňkách, které obsahují genomy viru HIV divokého typu a crHIV-1.111, umožňující selektivní balení RNA crHIV do viriónů. Tyto výsledky indikují, že podobně lze využít tento způsob i pro jiné viry, zvláště pro další RNA viry. Příklad 6
Tento příklad popisuje zkoumání schopnosti podmíněně se replikujících vektorů, které obsahují ribozym, zvláště vektorů crHIV, projít celým virovým replikačním cyklem v přítomnosti pomocného viru divokého typu. 69 o · · · • · · · · · • · · ·· ··
Za účelem potvrzení, že genomy crHIV procházejí za přítomnosti pomocného genomu viru HIV divokého typu celým virovým replikačním cyklem, se zkoumala produkce virových partikulí, které obsahují genomy crHIV, za různých podmínek. První se zkoumala produkce virových partikulí, které obsahují genomy crHIV v aktivovaných ACH2 buňkách (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland). Tyto buňky obsahují buněčnou linii latentně infikovanou HIV-1. Dále se zkoumala schopnost libovolných crHIV partikulí odvozených z těchto kultur, infikovat neinfikované Jurkatovy buňky a produkovat DNA crHIV. Při těchto experimentech se přibližně 106 buněk ACH2 transfekovalo s přibližně 2,5 ug vektorové DNA. Buňky se stimulovaly 50 nM 12-O-tetradekanoylforbol 13-acetátem (TPA) přibližně 24 hodin po transfekci. RNA se izolovala z byněčných supernatantů přibližně 72 hodin po transfekci. RT-PCR se provedla za použití primerů R1 a R2, jak se popisuje v příkladu 4. Ribozymová RNA crHIV byla detekována ve virionech produkovaných aktivovanými buňkami ACH2 po transfekci crHIV-1.11, ale ne po transfekci kontrolním plazmidem pGEM 3Z (Promega, Madison, WI) . Proto transfekce vektorů crHIV do infikovaných buněk CD4+ vede k produkci virových partikulí, které obsahují RNA crHIV. Dále se tesovala schopnost crHIV viriónů odvozených z těchto kultur infikovat Jurkatovy buňky a produkovat crHIV proviry. Takové proviry se detekovaly izolací buněčné DNA za použití Trizolu™, štěpením DNA restrikčním enzymem Eco RI a pak amplifikací ribozomální DNA pomocí PCR, za použití R1 a R2 primerů, jak se popisuje v příkladu 4. DNA crHIV byla produkována v Jurkatových buňkách po infekci buněčných supernatantů získaných z buněk ACH2 transfekovaných crHIV. Právě v tomto případě se pozorovala specifická 70 70 «· · «· «Μ • * amplifikace ribozymálni DNA crHIV. Buňky infikované samotnými stimulovanými supernatanty buněk ACH2 (to je při absenci jakékoli infekce buněk ACH2 s crHIV-1.111) nevykazuji žádné produkty ribozymálni DNA.
Protože se vektory crHIV rozšiřuji pouze v přítomnosti genomů pomocných virů HIV divokého typu, testovala se schopnost neinfikovaných buněk, které obsahují genomy crHIV přežít infekci virem HIV divokého typu. Při těchto experimentech nejdříve proběhla transfekce buněk crHIV-1.11 (to je reprezentant vektorů crHIV) a pak se buňky superinfikovaly HIV divokého typu (to je pNL4-3). Přibližně 106 Jurkatových buněk se transfekovalo přibližně 2,5 ug DNA crHIV. Buňky se před infekcí virem HIV divokého typu nechaly růst po dobu přibližně 72 hodin. Jurkatovy buňky transfekované crHIV-1.11 se inkubovaly s pNL4-3 (2 x 105 TCID5o jednotek na 106 buněk) po dobu 2 hodin při teplotě 37°C, promyly se třikrát v Opti-MEM® I redukovaném médiu se sérem a pak se resuspendovaly v úplném médiu (RPMI 1640 s 10% FBS) . RNA se izolovala z buněčných supernatantů, jak se popisuje v příkladu 4 přibližně 5 dnů po infekci. Při testu TCID50 se nanesly na plotny s 96 otvory supernatanty obsahující HIV, přičemž maximální ředění bylo pětinásobné. Do naředěných virových suspenzí se přidalo přibližně 104 buněk MT4 (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland; a Harada et al., Science, 229, 563-566 (1985)) a výsledné suspenze se inkubovaly po dobu 7-mi dní, až došlo k úplnému virovému růstu. Buňky MT4 jsou modifikované T-buňky, které obsahují gen Tax z HTLV-1, což je transaktivátor genu, který je analogem genu Tat v HIV-1. V supernatantech se pak testovala aktivita reverzní transkriptázy a vyhodnocovaly se, jak se popisuje v publikaci (Dropulic'et al., (1992), citace uvedena shora). Způsobem 71 71 Μ ·· • · · · t · ·· ·· · ♦ * • · · ·· ·· ·· · ·· • · · · ·· · · • · · · · · · • · ··· · · · · • t · · · · ·· ·· *·· ·· podle Reed a Muench (popsáno v publikaci Tech. In HIV Res., Johnson et al., eds., Stockton Press, 71-76 (1990)) se stanovila infekční dávka (TCID50) vhodná pro tkáňové kultury.
Superinfekce Jurkatových buněk transfekovaných virem HIV divokého typu vedla k tomu, že virové partikule obsahují genomy crHIV. Genomy crHIV jsou po superinfekci virem HIV divokého typu zabaleny do virových partikulí. Během této doby se buňky jeví být normální bez podstatných znaků cytotoxicity.
Tyto výsledky potvrzují, že genomy crHIV jsou schpny projít celý, replikačním cyklem po komplementaci pomocným virem HIV divokého typu. Tyto výsledky také potvrzují, že jiné virové genomy jsou podobně schopny projít úplným replikačním cyklem po komplementaci odpovídajícím virem divokého typu. Příklad 7
Tento příklad popisuje podstatu zmizení produkce viru, což se popisuje v předchozím příkladu.
Podstata ztráty produkce viru z kultur, které se transfekovaly virem HIV divokého typu nebo se ko- transfekovaly virem HIV divokého typu a crHIV-1.11, se testovala analýzou RNA viriónů za použití RT-PCR, jak se popisuje dříve v textu. Viry produkované v kulturách v ránných stádiích virového růstu (u kultury transfekované virem HIV divokého typu je to den +11, u kultury ko-transfekované crHIV-1.11 je to den +19) obsahovaly převážně crHIV RNA. Kultury z pozdních stádií růstu (u kultury transfekované virem HIV divokého typu je to den +17, u kultury ko-transfekované crHIV-1.11 je to den +23) obsahovaly převážně RNA viru HIV divokého typu.
Produkce viru buňkami, které jsou ko-transfektované virem HIV divokého typu a proviry crHIV-1.11, pravděpodobně je výsledkem růstu viru HIV divokého typu, který unikl intracelulárni restrikci ribozymem. Genomy crHIV stále obsahují podstatnou část celého genomu viru HIV dokonce i v kulturách při pozdních fázích virového růstu. To naznačuje, že ačkoli převládají genomy viru HIV divokého typu, genomy crHIV se rozšířily v kultuře i vzhledem k nižším účinnostem ve srovnání s genomy HIV divokého typu.
To potvrzuje, že vektory crHIV stejně jako další podmíněně se replikující vektory, se mohou při replikaci viru účinně utkat s genomy viru divokého typu. Příklad 8 Příklad dále popisuje podstatu zmizení produkce viru, což se popisuje v předchozím příkladu. Měřením infekčních titrů viru HIV divokého typu sloužilo ke studii účinku balení crHIV RNA do viriónů během zmizení produkce viru. S virovými supernatanty z kultur, které se nacházely v exponencionální fázi růstu viru, (u kultur viru divokého typu je to +14 den, u kultur crHIV-1.1 to je +16 den, u kultur crHIV-1.11 nebo crHIV-1.12 je to den +20) se provedly testy limitujícího ředění TCID50. Vzorky se před testem normalizovaly za použití aktivity reverzní transkriptázy. Infekční dávka supernatantů z kultur HIV divokého typu, crHIV-1.1, crHIV-1.11 a crHIV-1.12 byla 1,3 x 104 TCIDso/ml, 5,4 x 103 TCID50/ml, 3,8 x 103 TCID50/ml a 3,8 x 103 TCID5o/ml. Balení RNA crHIV do virionů během zmizení produkce viru vede ke snížení počtu produkovaných infekčních partikulí HIV divokého typu. 73 ♦ · ·♦ ·· ·· · · t·· «·
Dále se zkoumalo, zda snížení infekčního titru viru HIV divokého typu je výsledek štěpení RNA viru HIV divokého typu ve viriónech. Produkty štěpení RNA z viriónů, které se nacházejí v supernatantech ko-transfekovaných buněk se určovaly extenzí primeru. Použil se primer PE (o sekvenci GGTTAAGCTTGTCGCCGCCCCTCGCCTCTTG (SEQ ID NO: 12)), který je zobrazený na obr. č. 6 a který obsahuje restrikční místo Hin dlll. Extenze primeru přes místo štěpení probíhala po dobu 2 hodin při teplotě 42°C v pufru, který zahrnuje 50 mM Tris-HC1, pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM dNTP a 20 U inhibitoru Rnasy. Do pufru se přidalo 25 U MuLV reverzní transkriptázy. Virová RNA se izolovala z koncentrovaných viriónů získaných z kultur ko-transfekovaných crHIV. Buňky a buněčný odpad se odstranil centrifugací při 2 000 x g po dobu 15 minut při teplotě 4°C. Virus se pak koncentroval ultracentrifugací při 30 OOOx g po dobu 4 hodin a teplotě 4°C. Virové RNA se izolovaly z virového peletu za použití přípravku Trizol™, jak se popisuje dříve v textu.
Virové RNA se izolovaly supernatantů kultur transfekovaných virem HIV divokého typu a ko-transfektovaných crHIV-1.11 během pozdních fází virového růstu (u kultur transfekované virem HIV divokého typu je to den +17, u kultury ko-transfekované crHIV-1.11 je to den +23). Viriony v této kultuře obsahují jak genomovou RNA viru HIV divokého typu, tak i genomovou RNA crHIV. cDNA v plné délce se pozorovala jak u kultury transfekované virem HIV divokého typu tak i u kultur ko-transfekovaných crHIV-1.11. Na základě analýzy primer-extenze se nezjistila žádná menší cDNA,která by byla výsledkem štěpení oblasti U5 RNA. Snížení infekčních titrů viru HIV divokého typu není způsobeno intravirovým štěpením RNA HIV divokého typu, ale 74 74
* · » · « · • · ··· « • « · »» «· vzhledem k jejich numerickému posunuti štěpením crHIV RNA v progenových viriónech.
Tyto výsledky indikují, že zde popsaný způsob se může použít pro přesun genomů divokého typu, jako jsou genomy HIV a jiné genomy, z progenových viriónů, za použití podmíněně se replikujících vektorů podle vynálezu. Příklad 9
Tento příklad ukazuje, že vektory crHIV mohou inhibovat replikaci viru HIV divokého typu po styku s plazmidem nebo rekombinantním virem crHIV-1.111.
Jurkatovy buňky se infikovaly virem HIV (klon pN14-3) a pak se stimulovaly buď (1) plazmidovou DNA, která obsahuje konstrukci crHIV-1.111 nebo (2) rekombinantním virem crHIV-1.111 z baleným do buněk 293, to je mutantní crHIV-l.M (Nadlini et al., Science, 272, 263-267 (1996)). Buňky se podrobily transfekci zprostředkovanou lipidy DLS (Thierry et al., PNAS, 92, 9742 -9746 (1995)) nebo zavedení zprostředkované crHIV. Replikace viru se měřila za použití testu reverzní transkriptázy 12 dní po původní transfekci virem HIV. Kultury divokého typu, které slouží jako kontroly, vykazují normální růst viru HIV divokého typu. Když se buňky infikovaly virem HIV divokého typu transfekovaly se mutantním crHIV-l.M prostřednictví DLS, přičemž růst viru HIV divokého typu nebyl ovlivněn. Naopak, jestliže buňky infikované virem HIV divokého typu se stimulovaly crHIV-1.111, který kóduje anti-HIV ribozym, transfekci zprostředkovanou DLS, pak růst viru HIV divokého typu (to je replikace) byl podstatně inhibován. Jestliže se mutantní crHIV-l.M stimuloval virem HIV divokého typu, pak replikace viru HIV divokého typu nebyla ovlivněna. Naopak, jestliže se virus HIV divokého typu stimuloval crHIV-1.111, pak replikace viru HIV divokého typu byla podstatně inhibována. Data ukazují, že vektory crHIV se 75 • » ♦ ♦ « ·♦ ·· *♦ • · • · «« » · • « ♦ · • · • · • · · • · ·* • · • · · • ·· # • ♦ • · • • • ♦ • · ·· ·· · «· ·· můžou použít pro podstatnou inhibici intracelulární replikace viru HIV divokého typu. Příklad 10
Tento příklad popisuje použití podmíněně se replikujících vektorů při léčbě zhoubného bujení.
Podmíněně se replikující virové vektory, které se používají při léčbě zhoubného bujení, se mohou konstruovat tak, aby jejich schopnost replikovat se v normálních buňkách byla nedostatečná, protože jim chybí virový protein, který je nutný při jejich replikaci. Jestliže však tento vektor infikuje rakovinové buňky, buňky jsou schopny produkovat faktor (např. upřednostňuje se stejný mutovaný buněčný protein, který podporuje odlišný růst rokovinových buněk), který umožňuje replikaci defektního vektoru vhodného pro léčbu zhoubného bujení. Tento způsob se liší od způsobu, který se používá při léčbě virové infekce tím, že nedochází k selektivnímu balení virového vektoru, místo toho dochází k lyži buněk karcinomu, která je způsobena virionů získanýzh z progenových vektorů do buňky. Způsob se však podobá metodě, která se používá při virových infekcích, kde se může použít expresivní vektor pomocného viru, aby došlo k selektivnímu pomnožení podmíněně se replikujícího viru v rakovinových buňkách. Vektor a/nebo expresivní vektor pomocného viruse vytvořil tak, že je odpovědný nádorovým specifickým faktorům, přičemž umožňuje selektivně rozšířit vektor do nádorových buněk. Nádorově specifické faktory, které se využívají při této metodě léčby zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které působí na úrovni: (1) vstupu viru do buněk (např. přítomnost nádorově specifického receptoru, který umožňuje virovému vektoru selektivně vstoupit do buněk karcinomu, ale nikoli do normálních buněk); (2) virové transkripce (např. mutovaný 76 76 • ·· ·· f · • · t • · · • · • · • · · • ··· • • · t • • • · · · · ·· « · ·· • · · • · · • · • * protein rakovinových buněk umožni selektivní transkripci RNA vektoru, který se používá při léčbě zhoubného bujení, v rakovinových buňkách); a (3) maturace viru a uvolnění (např. mutované proteiny rakovinnových buněk umožňují podmíněně se replikujícím vektorům, které se používají při léčbě zhoubného bujení selektivně dozrát např. asociací mutovaných celulárních proteinů s virovými proteiny nebo genomem, což vede k podpoře maturace viru a jeho uvolnění). Mutované proteiny, které se vyskytují v rakovinových buňkách, mohou reagovat s virovými proteiny (nebo s genomovou RNA nebo DNA) v mnoha stádiích virového replikačního cyklu. Tyto interakce se mohou manipulovat, aby vznikly podmíněně se replikující vektory vhodné pro léčbu rakoviny, které jsou defektivní v normálních buňkách a které se mohou replikovat v rakovinových buňkách. "Tato metoda se může zvláště použít při léčbě leukémie T-buněk. Leukémie T-buněk je vážná forma zhoubného bujení s nízkou prognózou úspěšné léčby. Řada leukemických T-buněk jsou CD4+. Pak při konstrukci podmíněně se replikujících vektorů, které se aplikují při léčbě leukemie T-buněk, se používá virus HIV divokého typu jako kostra vektoru. Protože virus HIV vstupuje do buněk prostřednictvím CD4 glykoproteinu, tento vektor bude působit na úrovni vstupu vektoru do buněk.
Vektor se může pozměnit tak, aby byl vhodný pro léčbu rakoviny tím, že se například zavede do viru HIV divokého typu delece. Genom viru HIV se může mutovat tím, že se připraví v jeho DNA formě a uskuteční se jeho místně specifická mutageneze, jak se popisuje shora v textu. Způsob se může podobně použít při komplementaci nedostatečnosti viru jinými mutacemi, které způsobují potlačení nádorů , nebo negativními onkogeny nebo se mohou využívat jiné nádorově specifické faktory, které interagují s virovými proteiny. 77 ·· ·♦ • · « · • tl · • · • ♦ • *
• · ♦
Například se může deletovat gen tat, který kóduje protein důležitý při replikaci viru HIV. Jestliže není přítomen Tat, pak virus HIV nemůže déle pozitivně regulovat jeho expresi, která je absolutně podstatná při propagaci viru HIV. Protein Tat funguje tak, že se váže na strukturu kmenové smyčky TAR RNA, která je spojena s promotorem viru HIV a je schopna zvýšit expresi HIV víc jak 100 krát. Pak jestliže není přítomen Tat, vektor založený na viru HIV nebude exprimovat proteiny HIV a nebude se pomnožovat v normálních (ne v rakovinových) T-buňkách a nebude je usmrcovat.
Leukemické T-buňky však obsahují funkčně pozměněnou molekulu, která je buď mutovaná, nadměrně se exprimuje nebo je latentní. Toto pozměněné stádium molekulární funkce se nevyskytuje u normálních buněk. V jeho nemutovaném stádiu (ale ne v jeho mutovaném stádiu), se tato molekula podílí na řízení buněčné proliferace a/nebo apoptózy (programové usmrcení buněk). Změny spojené s mutovanými stádii se mohou použít ke specifické podpoře propagace podmíněně se replikujícího virového vektoru. K tomu může dojít za přítomnosti nebo nepřítomnosti pomocného virového expresivního vektoru. Defekt v Tat se může komplementovat pomocným expresivním vektorem, který se řídí nádorově specifickým promotorem, kde promotor pochází z genu v leukemických buňkách, jehož exprese je nadměrná. Takový vektor se může pouze replikovat v leukemických T-buňkách a ne v normálních buňkách. Virová exprese a propagace v leukemických T-buňkách povede k lyži a odumření buněk. Vektor může také nést další elementy, které podpoří odumření buněk (např. sekvence kódující toxin, cytokin nebo antigen, aby podpořily imunitní cílení).
Další metody a strategie se mohou při konstrukci podmíněně se replikujících vektorů vhodných při léčbě rakoviny použít podobným způsobem. 78 78
··· ♦ • · · · * • · · · · • * ·*· · * • « ·# · · · • · · t Přiklad 11
Tento příklad popisuje vývoj druhé generace konstrukcí crHIV (cr2HIV), které vykazují lepší vlastnosti propagace, než vektory crHIV-1.111.
Vektory druhé generace jsou schopny zvýšit produkci partikul! crHIV u buněk produkujících crHIV. Zvýšená produkce crHIV partikulí umožňuje jejich rozšíření a brání v kulturách nadměrnému růstu viru HIV divokého typu. Tím, že vektory neobsahují sekvence kódující proteiny, které blokují superinfekci virem HIV divokého typu, vektory obsahují všechny sekvence nativního viru HIV divokého typu, ale nekódují gen Tat. Na místě genu Tat je ztrojená anti-Tat ribozymová kazeta (SEQ ID NO: 18) , řízená do třech různých míst na genu Tat. Také se deletovalo místo sestřihu Tat genu tak, že ribozymy Tat budou selektivně štěpit genomové RNA viru HIV divokého typu a RNA viru HIV divokého typu nebude upravena setřihem. RNA viru HIV divokého typu doplňuje defekt v genu Tat a umožňuje replikaci crHIV. Na rozdíl od dříve uvedených vektorů, které nekódují proteiny jiné než bílkovinné genové antivirové agens, jako je imunogen, vektory druhé generace kódují a exprimují tyto proteiny pouze v přítomnosti Tat. V buňce, která obsahuje oba genomy jak viru HIV divokého typu tak i crHIV, genomy crHIV se nebudou pouze selektivně balit, ale bude se zde produkovat mnohem více viriónů ve srovnání s buňkami, které obsahují crHIV-1.111, protože strukturální proteiny se produkují ne pouze z viru HIV divokého typu, ale také z genomů crHIV. Vektor má v podstatě selektivní výhodu při pomnožení, protože neprodukuje virióny pouze z templátů HIV divokého typu, ale také z templátů crHIV.
Vektory druhé generace se také charakterizují tím, že obsahují nebo kódují rizbozymy, jejichž katalytická domény směřují do oblastí, které jsou jiné, než ty ve vektoru 79 ·· ♦♦ ♦ ♦ · · • · · · • · ··· · • · · » ·· ·· ·· ·· · · • · • · • · · • · ·· • · * • ··· • · • · · • • · ··· ·· ·· ·· samotném. Narozdíl od crHIV-1.111, které obsahují nebo kódují ribozymy cílené do oblasti U5 vedoucí sekvence viru HIV, která nutně vyžaduje inkorporaci modifikovaných sekvenci U5 do vedoucí sekvence vektoru crHIV, ribozymy druhé generace vektorů směřují do oblastí, které nejsou ve vektoru samotném, přičemž eliminují potřebu modifikovat sekvenci vektoru. To redukuje možnost, že rezistentní virus HIV se může tvořit rekombinací viru HIV divokého typu s modifikovanými sekvencemi crHIV U5. Pak rekombinace viru HIV divokého typu se sekvencemi crHIV neposkytují žádnou výhodu pro virus HIV divokého typu; začlenění ribozymových sekvencí do viru HIV divokého typu bude mít pouze negativní účinek.
Vektory druhé generace jsou dále charakterizovány začleněním řady různých ribozymů, kdy každý z nich je cílen do odlišného místa, aby se snížila možnost tvorby ribozym rezistentních mutantů viru HIV divokého typu.
Vektorový systém pro účely bezpečnosti, podmíněně se replikující vakciny, konstrukce "pomocného vektoru" se může zdokonalit přidáním genových elementů/faktorů, které umožňují specifickou replikaci crHIV a rozšiřují se bezpečným způsobem. Jedno provedení vynálezu je zavedení ribozymů do pomocného vektoru, aby se předešlo jejich genové rekombinaci s vektorem, za účelem produkce viru divokého typu. Pak shora uvedený vektor cr2HIV se může doplnit Tat pomocným expresivním vektorem, aby umožnil jeho rozšíření. Tím, že se zavedou anti-HIV ribozymy do pomocného expresivního vektoru, minimalizuje se šance pro rekombinaci, protože střet vektoru s RNA pomocného vektoru povede k jejich vzájemnému rozštěpení a destrukci. Proto pomocný expresivní vektor se může modifikovat řadou způsobů tak, aby se dosáhlo určité profylaktické nebo terapeutické strategie. Vektory cr2HIV se mohou využít jako vakciny proti viru HIV, protože (1) se replikují a pak trvale stimulují imunitní odezvu hostitele a « * • · ·· I · ·»· • * • · »·· · • · * · ·· ·« * 80 (2) umožňují hostiteli rozeznat různé epitopy, protože jsou odvozeny od viru HIV a nesou antigenní změny. ·· ·· * ·· • · · · ·· » · ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · »c ·· 81
Změněný
SEKVENČNÍ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1 GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC 39 (2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2 39
GTGTGCCCAC CTGTTGTGTG ACTCTGGCAG CTAGAGAAC 82
f • · ·· ·♦ • ♦ ♦ t * · ·· ··* ♦ ♦ • · ♦ #· ·· Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 40 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3 CACACAACCAC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACGGGCACA 40 (2) Údaje k SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 40 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4 ATCTCTAGTC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACCAGAGTC 40 (2) Údaje k SEQ*ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5 39
GTGTGCCCGC CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC 83 83 • 9 ·* • ·· 99 »· • · • · • · · • • · 9 · 9 9 9 • · ·· • 9 ··· · • · · • ··· · • • · • • · · • · • ·· ··· 99 ·· ·· (2) Údaje k SEQ ID NO: 6 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6 GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGCAA CTAGAGATC 39 (2) Údaje k SEQ ID NO: 7 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 27 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7 TGTGACGTCG ACCACACAAC ACTGATG 27 (2) Údaje k SEQ ID NO: 8 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 33 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8 33
TGTGACGTCG ACTCTAGATG TGCCCGTTTC GGC 84 ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · »· ·· • ·· ♦ · · · • t · • · t · • « · ··· ·· ·♦ • · I • · ··· · • · ·· ·· « ·· ·# (2) Údaje k SEQ ID NO: 9 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 31 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9 GGTTAAGCTT GAATTAGCCC TTCCAGTCCC C 31 (2) Údaje k SEQ ID NO: 10 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 31 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10 GGTTGGATCC GGGTGGCAAG TGGTCAAAAA G 31 (2) Údaje k SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 38 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11 38
CGGATCCACG CGTGTCGACG AGCTCCCATG GTGATCAG 85 (2) Údaje k SEQ ID NO: 12 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 31 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12 GGTTAAGCTT GTCGCCGCCC CTCGCCTCCTT G 31 (2) Údaje k SEQ ID NO: 13 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 112 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13 AAGCTTGCCT TGAGTGCTCA AAGTAGTGTG TGCCCACCTG TTGTGTGACT 50 CTGGCAGCTA GAGATCCCAC AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT 100 AGCAGTGGCG CC 112 (2) Údaje k SEQ ID NO: 14 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14 86
• · • · • · · Μ ·· • · · · • · ·· • · · ·· « · ··♦ # · 39
GTGTGCCCNN CTGTTGTGTG ACTCTGGNAN CTAGAGANC (2) Údaje k SEQ ID NO: 15 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15 GTGTGCCCAT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC 39 (2) Údaje k SEQ ID NO: 16 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 39 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16 39
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAG CTAGAGATC 87 • · *·· ·· ·· ♦♦ • · · • ·♦ ♦ « · · · « · · «· ♦· (2) Údaje k SEQ ID NO: 17 (i) Charakteristika sekvence: (A) délka: 152 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17 GATCGAATTC CTGCTATGTT CTGATGAGTC CGAAAGGACG AAACACCCAT 50 TTCCCGGGTT TAGGATCCTG ATGAGCGGAA AGCCGCGAAA CTGGCTCCGG 100 CCGTTTTAGG CTCTGATGAG CTGGAAACAG CGAAACTTCC TGGTCGACGA 150
TC 152

Claims (40)

  1. 88 Ju i6Vr~7g (o(Q Změněné PATENTOVÉ NÁROKY 1. Podmíněně se replikující virový vektor, charakterizovaný schopností se replikovat pouze v hostitelské buňce, která dovoluje replikaci uvedeného vektoru, přičemž uvedený vektor zahrnuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace způsobuje, že uvedený vektor, který je rezistentní k přítomnosti, transkripci nebo translaci nejméně jedné uvedené sekvence nukleové kyseliny, se selektivně balí do progenových virionů v porovnání s (i) kmenem viru divokého typu, který odpovídá viru, ze kterého se uvedený vektor získal a je citlivý na přítomnost, transkripci nebo translaci nejméně jedné uvedené sekvence nukleové kyseliny nebo (ii) pomocníkem replikace virového vektoru, který je citlivý na přítomnost, transkripci nebo translaci nejméně jedné uvedené sekvence nukleové kyseliny v případě, že (i) kmen viru divokého typu nebo (i) uvedený pomocník replikace virového vektoru se nachází v uvedené hostitelské buňce.
  2. 2. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde uvedená nejméně jedna sekvence nukleové kyseliny zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která obsahuje nebo kóduje, v kterémžto případě exprimuje, genové antivirové agens, které nepříznivě ovlivňuje replikaci, expresi nebo replikaci a expresi (i) kmene viru divokého typu nebo (ii) pomocníka replikace virového vektoru, ale ne samotný uvedený virový vektor. 89 89
    ♦ ·· • · · ♦ * ♦ ♦ ♦ · · ·· ♦ ·♦ • · ·· · ♦ 1 • ♦ « ·· ··
  3. 3. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 2, kde uvedené genové antivirové agens je vybráno ze skupiny, která zahrnuje antisense molekulu, ribozym a imunogen.
  4. 4. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde uvedený vektor je odvozen od viru lidské imunodeficience.
  5. 5. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde uvedený vektor je odvozen od Togaviridae.
  6. 6. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde katalytická doména uvedeného ribozymu štěpí nukleotidovou sekvenci NUH.
  7. 7. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde uvedený ribozym je kódován sekvencí vybranou za skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4.
  8. 8. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde uvedený kmen viru divokého typu zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódovanou SEQ ID NO: 1 a uvedený vektor, jestliže jde o DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde nejméně jeden N je mutován, 15 a 16, a uvedený vektor, jestliže jde o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde nejméně jeden N je mutován, 15 a 16.
  9. 9. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 8, kde tento vektor v případě, že jde o DNA, zahrnuje SEQ ID NO: 3a nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5 a 15, a v případě, že jde o RNA, zahrnuje 90
    » ·· ·· • · · I · · · • · · · · • # ·· ···· • » · · · ·«· ·· ·· nukleotidovou sekvenci kódovanou SEQ ID NO: 3a nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5 a 15.
  10. 10. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 8, kde uvedený vektor, v případě, že jde o DNA, zahrnuje SEQ ID NO: 4 a nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6 a 16 a v případě, že jde o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódovanou SEQ ID NO: 4a nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6 a 16.
  11. 11. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku I, kde uvedený vektor je odvozen z viru lidské imunodeficience a nenese gen tat ani své místo sestřihu z genomu viru lidské imunodeficience divokého typu.
  12. 12. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku II, kde místo uvedeného genu tat a jeho místa sestřihu tento vektor zahrnuje trojitou anti-Tat ribozymovou kazetu, kde katalytická doména každého ribozymu trojité ribozymové kazety štěpí různé místo na molekule nukleové kyseliny viru lidské imunodeficience.
  13. 13. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 12, kde uvedená molekula nukleové kyseliny viru lidské imunodeficience divokého typu zahrnuje tat a katalytická doména každého ribozymu trojité ribozymové kazety štěpí různé místo v tat.
  14. 14. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 12, kde katalytická doména každého ribozymu štěpí nukleotidovou sekvenci v oblasti molekuly nukleové kyseliny 91 91 «· ·♦ • · · • ·· • · · · · • · · ·· é· »· Μ · ·· • · · · ·· · · # · · · * · · • # ··· · · · · • » · · · · ··> ·· · · · * · viru lidské imunodeficience divokého typu, přičemž v samotném vektoru neexistuje žádný jeho analog citlivý na ribozym.
  15. 15. Podmíněně se replikující virový vektor, podle nároku 1, kde tento vektor dále zahrnuje nejméně jednu další sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace poskytuje hostitelské buňce, která je infikována uvedeným vektorem, selektivní výhodu ve srovnání s buňkou infikovanou (i) kmenem viru divokého typu nebo (ii) pomocníkem replikace virového vektoru.
  16. 16. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 15, kde uvedená nejméně jedna další sekvence nukleové kyseliny zahrnuje sekvenci kódující rezistenci proti více lékům.
  17. 17. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 16, kde uvedená nejméně jedna další sekvence nukleové kyseliny zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou proteázu a nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou reverzní transkriptázu.
  18. 18. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 17, kde tento vektor je podmíněně se replikující vektor viru lidské imunodeficience, který zahrnuje ribozymovou kazetu obsahující jeden, dva nebo tři ribozymy, přičemž každý z nich je nezávisle cílen do místa +115 nebo +133 U5 HIV RNA.
  19. 19. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde uvedená nejméně jedna sekvence nukleové kyseliny způsobuje, že do progenových virionů se selektivně balí podstatně více uvedeného vektoru ve srovnání s (i) uvedeným 92 kmenem viru divokého typu nebo (ii) uvedeným pomocníkem replikace virového vektoru.
  20. 20. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 19, kde uvedená nejméně jedna sekvence nukleové kyseliny způsobuje selektivní balení uvedeného vektoru do progenových virionů na úkor (i) uvedeného kmene viru divokého typu nebo (ii) uvedeného pomocníka replikace virového vektoru.
  21. 21. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje vektor podle nároku 1 nebo 15 a nosič pro tento vektor.
  22. 22. Hostitelská buňka, zahrnující vektor podle nároku 1 nebo 15.
  23. 23. Způsob přípravy vektoru, vyznačuj ící se tím, že (a) se získá vektor, který je odvozen z kmene viru divokého typu a který je schopen se replikovat pouze v hostitelské buňce, jež dovoluje replikaci uvedeného vektoru; a (b) do vektoru podle bodu (a) se začlení sekvence nukleové kyseliny, která zahrnuje nebo kóduje, v kterémžto případě také exprimuje, antivirové agens, a tím nebo navíc k tomu úpravu vektoru podle bodu (a), aby vektor byl rezistentní k uvedenému antivirovému agens, přičemž inkorporace sekvence nukleové kyseliny do vektoru a modifikace vektoru pro dosažení rezistence k antivirovému agens způsobuje, že uvedený vektor se selektivně balí do progenových virionů ve srovnání s (i) kmenem viru divokého typu, jenž odpovídá viru, ze kterého byl 93 93 • · • · • • # • • · • · • · • ♦ • » ψ* ·· » « odvozen uvedený vektor a který je citlivý na uvedené antivirové agens, nebo ve srovnání s (ii) pomocníkem replikace virového vektoru, který je citlivý k uvedenému antivirovému agens v případě, že (i) uvedený kmen viru divokého typu nebo (ii) uvedený pomocník replikace virového vektoru se nachází v hostitelské buňce.
  24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se tím, že uvedené antivirové agens je genové antivirové agens vybrané ze skupiny zahrnující antisense molekulu, ribozym a imunogen.
  25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící se tím, že uvedený vektor je vektor viru lidské imunodeficience.
  26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačuj ící se tím, že krok (b) zahrnuje: (i) zavedení nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4 do vektoru podle odstavce (a) v případě, že jde o DNA, nebo, jestliže jde o RNA, zavede se nukleotidová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4; a (ii) upravení vektoru podle odstavce (a) tak, že v případě, jde-li o DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:14, ve které nejméně jede N je mutován, nebo jde-li o RNA, nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO:14, ve které nejméně jeden N je mutován.
  27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačuj ící se tím, že krok (b) zahrnuje: 94 ·· *f • · · · • · * · • · ··· · • · · ·* ·· • ·· ♦ ♦ ♦ · • · · · • · · ·«♦ ·· • t ♦ · ► * · * I · ·· ·· « · i • · < • Ψ ·· (i) zavedení nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 3 do vektoru podle odstavce (a) v případě, že jde o DNA, a jestliže jde o RNA, zavede se nukleotidová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3; a (ii) upravení vektoru podle odstavce (a) tak, že v případě, jde-li o DNA, zahrhnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, a 15, nebo jde-li o RNA, nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, a 15.
  28. 28. Způsob podle nároku 26, vyznačuj ící se tím, že krok (b) zahrnuje: (i) zavedení nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 4 do vektoru podle odstavce (a) v případě, že jde o DNA, a jestliže jde o RNA, zavede se nukleotidová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 4; a (ii) upravení vektoru podle odstavce (a) tak, že v případě, jde-li o DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6, a 16, nebo jde-li o RNA, nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6, a 16.
  29. 29. Způsob modifikace vektoru, vyznačuj ící se tím, že (a) se získá vektor; a (b) se do vektoru podle bodu (a) začlení nukleotidová sekvence odpovídající SEQ ID NO: 14, ve které nejméně jeden N je mutován, v případě, že vektor je DNA, a nukleotidová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí odpovídající SEQ ID NO: 14, ve které nejméně jeden N je mutován, v případě, že vektor je RNA. 95 * · ♦ * ·· Μ Μ • · · · • · # ·
    • · · • * · ··♦ *♦
  30. 30. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedená nukleotidová sekvence je vybraná ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16 v případě, že vektor je DNA, a nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16 v případě, že vektor je RNA.
  31. 31. Způsob propagace a selektivního balení podmíněně se replikujícího vektoru bez použití balící buněčné linie, vyznačující se tím, že (a) podmíněně se replikující vektor se uvádí do styku s buňkou schopnou se infikovat dalším vektorem, který je stejného typu jako podmíněně se replikující vektor a liší se od něho tím, že je schopný se replikovat jako divoký typ; (b) buňka podle odstavce (a) se uvádí do styku s uvedeným dalším vektorem podle odstavce (a); a (c) buňka podle odstavce (b) se kultivuje za podmínek, vedoucích k propagaci uvedeného podmíněně se replikujícího vektoru.
  32. 32. Izolovaná a čištěná molekula nukleové kyseliny vybraná ze skupiny, která zahrnuje molekulu DNA zahrnující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny, která zahrnuje SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16, a molekulu RNA, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny, která zahrnuje SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16.
  33. 33. Způsob inhibice replikace kmene viru divokého typu v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje konuakt hostitelské buňky, která je schopna se 96 • · ♦ * · 4 · · • · t · ♦ * 4Μ ♦ * ·« φ Φ · Φ Φ · · Φ Φ Φ Φ Φ · · ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ· • Φ · t 9 4 99 49« · « 9 9 4 44 49 infikovat kmenem viru divokého typu, s vektorem podle libovolného z nároků 1, 14 a 15, jehož přítomnost, transkripce nebo translace inhibuje replikaci kmene viru divokého typu v hostitelské buňce.
  34. 34. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že navíc zahrnuje kontakt hostitelské buňky s agens vybraným ze skupiny, která zahrnuje cytotoxické léčivo, inhibitor proteázy a inhibitor reverzní transkriptázy.
  35. 35. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že uvedený virus způsobuje zhoubné bujení.
  36. 36. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že uvedená hostitelská buňka zatím nepřišla do kontaktu s uvedeným kmenem viru divokého typu, přičemž uvedený způsob dále zahrnuje kontakt uvedené hostitelské buňky s pomocným expresivním vektorem, přičemž uvedený pomocný expresivní vektor doplňuje schopnost replikace uvedeného podmíněně se replikujícího virového vektoru.
  37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačuj ící se tím, že uvedený pomocný expresivní vektor doplňuje uvedený podmíněně se replikující virový vektor buněčně specifickým způsobem.
  38. 38. Způsob exprese požadovaného genu v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) kontakt uvedené hostitelské buňky s podmíněně se replikujícím virovým vektorem podle nároku 1 nebo 15, přičemž uvedený virový vektor dále obsahuje
    ·· • · ♦ 9 t · • · • # ·♦ ·· ♦ ·· ♦ ♦ ♦ · • · · ♦ ♦ * « • t ♦ ··+ ·« ·♦ ·· » ♦ · ♦ » · #t *t« · · 9« * 9# *9 97 požadovaný gen a je schopný jej exprimovat v uvedené hostitelské buňce, a pomocníkem; a (b) expresi požadovaného genu v uvedené hostitelské buňce.
  39. 39. Způsob podle nároku 38, vyznačuj ící se tím, že uvedená exprese uvedeného požadovaného genu v uvedené hostitelské buňce inhibuje replikaci viru divokého typu v uvedené hostitelské buňce.
  40. 40. Způsob detekce interakce mezi léčivem/faktorem a proteinem, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) kontakt léčiva/faktoru s hostitelskou buňkou podle nároku 1, v niž vektor kóduje a exprimuje protein; a (b) detekci interakce mezi léčivem/faktorem a proteinem.
CZ19981624A 1995-11-28 1996-11-27 Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití CZ294170B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56345995A 1995-11-28 1995-11-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ162498A3 true CZ162498A3 (cs) 1998-12-16
CZ294170B6 CZ294170B6 (cs) 2004-10-13

Family

ID=24250568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19981624A CZ294170B6 (cs) 1995-11-28 1996-11-27 Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP1380650B1 (cs)
JP (2) JP2000503527A (cs)
KR (1) KR100537458B1 (cs)
CN (3) CN1651577A (cs)
AT (2) ATE234362T1 (cs)
AU (3) AU1124997A (cs)
BR (1) BR9612574A (cs)
CA (1) CA2236868C (cs)
CZ (1) CZ294170B6 (cs)
DE (2) DE69638120D1 (cs)
DK (1) DK0871757T3 (cs)
ES (1) ES2188802T3 (cs)
HK (1) HK1060152A1 (cs)
IL (2) IL124636A0 (cs)
NO (1) NO329619B1 (cs)
NZ (1) NZ324157A (cs)
PT (1) PT871757E (cs)
RU (1) RU2270250C2 (cs)
WO (1) WO1997020060A1 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002508338A (ja) * 1997-12-12 2002-03-19 ナルディニ，ルイジ レンチウィルスベクターの治療使用
GB9803351D0 (en) * 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
GB9906177D0 (en) 1999-03-17 1999-05-12 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
RU2301260C2 (ru) * 2000-09-22 2007-06-20 Вирэкссис Корпорейшн Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение
US20030026791A1 (en) * 2001-03-27 2003-02-06 Laurent Humeau Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors
WO2012051211A2 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
CA2977687C (en) * 2015-02-24 2024-02-13 Hwai Wen Chang Conditionally active proteins
CN104711294A (zh) * 2015-04-02 2015-06-17 扬州大学 一种基于禽网状内皮组织增生症病毒ltr的真核表达线性化载体的构建方法及应用
GB2543730A (en) * 2015-05-26 2017-05-03 Andrzejewski Slawomir Use of replication competent vector to eradicate viral latency presented on human immunodeficiency virus

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225337A (en) * 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Ribozyme compositions and methods for use
IL108719A0 (en) * 1993-02-25 1994-08-26 Ortho Pharma Corp Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them
CA2163129A1 (en) * 1993-05-17 1994-11-24 Flossie Wong-Staal Ribozyme gene therapy for hiv infection and aids
ATE320487T1 (de) * 1994-01-05 2006-04-15 Gene Shears Pty Ltd Ribozyme gegen eine hiv tat sequenz
AU2419595A (en) * 1994-05-10 1995-11-29 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Recombinant human immunodeficiency virus vector and process for producing the same
TW438601B (en) * 1994-05-18 2001-06-07 Janssen Pharmaceutica Nv New mucoadhesive emulsion compositions and a process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR100537458B1 (ko) 2008-09-08
KR19990071728A (ko) 1999-09-27
RU2270250C2 (ru) 2006-02-20
EP1380650A1 (en) 2004-01-14
CA2236868C (en) 2014-01-21
CA2236868A1 (en) 1997-06-05
CN1207775A (zh) 1999-02-10
CN100390291C (zh) 2008-05-28
IL124636A (en) 2009-12-24
AU1000001A (en) 2001-05-17
ATE455858T1 (de) 2010-02-15
DE69626681D1 (de) 2003-04-17
AU767620B2 (en) 2003-11-20
NO329619B1 (no) 2010-11-22
EP0871757A1 (en) 1998-10-21
IL124636A0 (en) 1998-12-06
CN1940076A (zh) 2007-04-04
AU1124997A (en) 1998-06-19
NO982418L (no) 1998-07-27
AU2004200663B2 (en) 2007-07-05
JP4384146B2 (ja) 2009-12-16
ES2188802T3 (es) 2003-07-01
BR9612574A (pt) 2000-04-25
WO1997020060A1 (en) 1997-06-05
DK0871757T3 (da) 2003-07-14
NZ324157A (en) 2000-10-27
JP2000503527A (ja) 2000-03-28
JP2007014341A (ja) 2007-01-25
AU2004200663A1 (en) 2004-04-08
EP0871757B1 (en) 2003-03-12
ATE234362T1 (de) 2003-03-15
CZ294170B6 (cs) 2004-10-13
HK1060152A1 (en) 2004-07-30
NO982418D0 (no) 1998-05-27
DE69638120D1 (de) 2010-03-11
EP1380650B1 (en) 2010-01-20
PT871757E (pt) 2003-08-29
DE69626681T2 (de) 2004-02-12
CN1651577A (zh) 2005-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6410257B1 (en) Methods to assay gene function with viral vectors
JP4384146B2 (ja) 条件付き複製ウイルスベクターおよびその用途
RU2301260C2 (ru) Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение
US5885806A (en) Methods to prepare conditionally replicating viral vectors
US20030026791A1 (en) Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections
AU2001293075B2 (en) Conditionally replicating viral vectors and their use
AU2002258639A1 (en) Improved conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections
AU2001293075A1 (en) Conditionally replicating viral vectors and their use

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20161127