NO329619B1

NO329619B1 - Betinget replikerende virale vektorer, fremgangsmate for fremstilling, sammensetninger og deres anvendelse

Info

Publication number: NO329619B1
Application number: NO19982418A
Authority: NO
Inventors: Boro Dropulic; Paula M Pitha
Original assignee: Univ Johns Hopkins Med
Priority date: 1995-11-28
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 2010-11-22
Also published as: KR100537458B1; KR19990071728A; RU2270250C2; EP1380650A1; CA2236868C; CA2236868A1; CN1207775A; CN100390291C; IL124636A; AU1000001A; ATE455858T1; DE69626681D1; CZ162498A3; AU767620B2; EP0871757A1; IL124636A0; CN1940076A; AU1124997A; NO982418L; AU2004200663B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en betinget replikerende viral vektor, fremgangsmåte for fremstilling, modifisering, formering og selektiv pakking av en slik vektor, isolerte molekyler av spesifiserte nukleotid og aminosyresekvenser relevant til slike vektorer, en farmasøytisk sammensetning og en vertscelle som omfatter en slik vektor, og fremgangsmåte for å anvende en slik vektor og en vertscelle.

Oppdagelsen av humant immunsviktvirus (HIV) som en årsak til ervervet immunsviktsyndom (AIDS) har bidratt til mye forskning på de underliggende mekanismene ved den virale infeksjonssyklus og viral patogenese. Studier av disse mekanismene har gitt forskerne et stadig økende mål for utvikling av antivirale midler som er effektive ikke bare mot HIV, men også mot andre virus. Disse antivirale midlene, særlig de som er rettet mot HIV, kan kategoriseres i grupper avhengig av virkningsmåte. Slike grupper innbefatter hemmere av revers transkriptase, konkurrenter av viral inngang i cellene, vaksiner og proteasehemmere, så vel som en nyere gruppe som her blir referert til som «genetiske antivirale midler».

Hver type antiviralt middel har generelt sine egne fordeler og begrensninger og vurderes på bakgrunn av det som kreves av den spesielle behandlingssituasjonen. Antivirale midler slik som zidovudin (3'-azido-3'-deoksythyrnidin, også kjent som AZT), proteasehemmere og lignende kan, relativt enkelt leveres inn i cellene i pasientens kropp og har vært underlagt omfattende studier. Målretting av en spesifikk faktor i den virale infeksjonssyklus har vist seg relativt ineffektive mot HIV. Dette skyldes primært det faktum at stammer av HIV endres raskt og blir resistente til midler som har et enkelt effektsted (Richman, AIDS Res. And Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)). Problemene med genetisk variasjon og rask mutasjon i HIV genomene, gjør at man må finne nye antivirale strategier til å behandle HIV infeksjoner. I denne sammenheng er genetisk antivirale midler attraktive, siden de fungerer på mange forskjellig intracellulære nivåer.

Genetisk antivirale midler adskiller seg fra andre terapeutiske midler ved at de overføres som molekylære elementer inn i en målcelle, der de beskytter cellen mot viral infeksjon (Baltimore, Nature, 325, 395-396 (1988); og Dropulic et al., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Genetiske antivirale midler kan være en hvilken som helst genetisk sekvens og innbefatte men er ubegrenset til, antisens molekyler, RNA decoy, transdominante mutanter, interferoner, toksiner, immunoger og ribozymer. Særlig er ribozymer genetiske antivirale midler som kløyver mål RNA, inkludert HIV RNA, på en sekvens-spesifikk måte. Spesifisiteten til ribozym-formidlet kløyving av mål RNA antyder en mulig anvendelse av ribozymer som terapeutiske hemmere av viral replikasjon, inkludert HIV replikasjon. Forskjellig ribozymtyper, slik som hammerhode og hårnålsribozymer har blitt anvendt i anti-HIV strategier (se f.eks. US-patent n.r 5.144.019, 5.180.818 og 5.272.262, og PCT-patentsøknad NO. WO 94/01549 og WO 93/23569). Både hammerhode og hårnålsribozymer kan utformes slik at de kløyver en hvilket som helst mål RNA som inneholder en GUC sekvens (Haseloff et al., Nature, 334, 585-591 (1988); Uhlenbeck, Nature, 334, 585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990); og Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). Generelt kan man si at hammerhoderibozymer har to typer funksjonelle domener, en konservert katalytisk domene flankert av to hybridiseringsdomener. Hybridiseringsdomenene bindes til sekvenser som omgir GUC sekvensen og det katalytiske domene kløyver RNA mål 3' til GUC sekvensen (Uhlenbeck (1987), over; Haselhoff et al. (1988), over: og Symons (1992), over).

Et antall studier har bekreftet av ribozymer kan i det minste være delvis effektive i å hemme formering av HIV i vevsdyrkede celler (se f.eks. Sarver et al., Science, 247, 1222-1225 (1990); Sarver et al., NIH Res., 5, 63-67 (1993a); Dropulic' et al., Methods: Comp. Meth. Enzymol., 5, 43-49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 89, 10802-10806

(1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340-6344 (1993); og Weerasinghe et al., J. Virol. 65, 5531-5534 (1991). Sarver et al. ((1990), over) har vist at hammerhoderibozymer utformet til å kløyve innenfor transkribert region av HIV gag genet, dvs. anti-gag ribozymer, spesifikt kunne kløyve HIV gag RNA in vitro. Når cellelinjer som uttrykker anti-gag ribozymer ble utfordret med HIV-gen, ble det videre observert en 50- til 100-ganger hemming av HIV replikasjon. Tilsvarende har Weerashinghe et al. ((1991), over) vist at retrovirale vektorer som kode for ribozymer utformet til å kløyve i U5 sekvensene HIV-1 RNA gir HIV resistens til omsatte celler ved etterfølgende utfordring med HIV. Selv om forskjellige kloner av omsatte celler demonstrerte forskjellige nivåer av resistens til utfordringen slik den ble bestemt ved promotersystem som ble anvendt til å drive ribozymekspresjon, bukket de fleste ribozym-uttrykkene cellelinjene under for

HIV ekspresjon etter en begrenset tid i kultur.

Transduksjon av vevsdyrkingsceller med et provirus inn i nef genet (som ikke er essensielt for viral replikasjon i vevskultur) i hvilket det ble innført et ribozym, hybridisenngsdomene av denne var spesifikk for U5 region hos HIV, har vist å hemme viral replikasjon i de omsatte cellene 100 ganger sammenlignet med celler omsatt med vill-type provirus (se teks. Dropublic et al. (1992) og (1993), over). Hårnålsribozymer har på tilsvarende måte blitt vist å hemme HIV replikasjon i T-celler omsatt med vektorer inneholdende U5 hårnålribozymer og utfordret med HIV (Ojwang et al. (1992), over). Andre studier har vist at vektorer inneholdende ribozymer uttrykt fra rRNA promoter også hemmet tallrike HIV stammer (Yu et al. (1993), over).

Levering av ribozymer eller andre genetiske antivirale midler til cellulære mål av HIV infeksjon (f.eks. CD4+ T-celler og monocytiske makrofager) har vært et hovedhinder mot effektiv genetisk terapeutisk behandling av AIDS. Nåværende tilnærminger for målretting av celler i det hematopoetiske system (dvs. de primære målene for HIV infeksjon) søker etter innføring av terapeutiske gener inn i forløper pluripotente stamceller, som ved differensiering, gir opphav til moden T-celle, eller alternativ inn i modne CD4+ T-lymfocytter i seg selv. Målretting av stamceller er problematisk, siden cellene er vanskelig å dyrke og omsette in vitro. Målretting av sirkulerende T-lymfocytter er også problematisk, siden disse cellene er spredt fordelt slik at det er vanskelig å nå alle målcellene ved å anvende nåværende vektoravleveringssystemer. Makrofager må betraktes som et cellulært mål, siden de er hovedreservoaret for viral spredning til andre organer. Siden makrofager er terminalt differensierte, og derfor ikke gjennomgår celledeling, blir de ikke raskt omsatt med vanlige anvendte vektorer.

Den dominerende nåværende tilnærmingen til HIV behandling gjør således bruk av rephkasjons-defektive virale vektorer og innpakninger (dvs. «hjelpere») cellelinjer (se f.eks. Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880-2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808-813 (1992); Miller, Nature, 357, 455-460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926-931

(1993); Friedman, Science, 244,1275-1281 (1989); og Cournoyer et al., Ann. Rev. Immunol., 11,297-329 (1993)) for å innføre i cellene som er utsatt for viral infeksjon (slik som HIV infeksjon) et fremmed gen som spesifikt interfererer med viral infeksjon, eller som sørger for død av en infisert celle (oversikt av Buchschacher (1993), over). Slike replikasjons-defekte virale vektorer innholder i tillegg til det fremmede genet av interesse, cis -virkende sekvenser som er nødvendig for oral replikasjon men ikke sekvenser som koder for essensielle virale proteiner. En slik vektor har som en konsekvens av dette ikke mulighet til å komplettere den virale replikative syklus, og en hjelpercellehnje som inneholder og konstitutivt uttrykker virale gener i sitt genom, blir benyttet for å formere dem. Etter innføring av en replikasjonsdefekt viral vektor i en hjelpercellelinje, blir proteiner som er nødvendig for viral partikkeldannelse tilveiebrakt til vektoren i trans og vektorvirale partikler som har evne til å infisere målceller og uttrykke genet deri, interfererer med viral replikasjon eller forårsaker at en viral infisert celle dør, blir produsert. Slike replikas)ons-defekte retrovirale vektorer omfatter adenovirus og adeno-assosierte virus, så vel som de retrovirale vektorene som benyttes innenfor kliniske prøver av HIV genetterapi og særlig musamfotropisk retroviral vektor kjent som Moloney gnager leukemi virus (MuLV). Disse defekte virale vektorene har blitt anvendt til å omsette CD4+ celler med genetisk antivirale midler, som anti-HIV ribozymer, med varierende grad av suksess (Sarver et al., (1990), over; Weerasmghe et al. (1991), over; Dropulic' et al., (1993), over; Ojwang et al. (1992), over; og Yu et al. (1993), over). Disse vektorene er begrenset for HIV genterapianvendelse. En høy transduksjonsfrekvens er særlig viktig i behandling av HIV, der vektoren må omsette enten sjeldne CD34+ progenitor hematopoetiske stamceller eller de vidt spredde mål CD4+ T-cellene, de fleste av disse under klinisk «latent» trinn av sykdommen, er allerede infisert med HIV. MuLV vektorer er imidlertid vanskelig å oppnå i høy titer, og derfor resulterer i dårlig transduksjon. Langtids ekspresjon av omsatt DNA har ikke blitt oppnådd i CD34+ progenitorstamceller, særlig etter differensiering til moden T-lymfocytter. Anvendelse av defekte virale vektorer krever i tillegg ex vivo gen overføringsstrategier (se f.eks. US-patent NO. 5.399.346), og dette kan være kostbart og ikke tilgjengelig for den generelle del av befolkningen.

Disse manglene er forbundet med anvendelse av for tiden tilgjengelige vektorer for genetisk terapeutisk behandling av AIDS har ført forskerne mot å søke på nye virale vektorer. En slik vektor er HIV selv. HIV vektorer har blitt benyttet for infeksjonsstudier (Page et al., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) og for innføring av gener (slik som suicidgener) inn i CD4+ celle, særlig CD4+ HIV-infiserte celler (se f.eks. Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992); Richardson et al., J. Virol. 67, 3997-4005 81993); Carroll et al., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). Strategien til disse studiene er å anvende HIV vektorer for å innføre genene inn i CD4+ T-celler og monocyttiske celler.

Så langt er imidlertid disse vektorene ekstremt komplekse. Anvendelse av disse vektorene er ledsaget av en risiko for å generere vill-type HIV via intracellulær rekombinasjon. Kotransfeksjon/koinfeksjon av defekte vektorsekvenser og hjelpervirus har blitt observert og resulterer i rekombinasjon mellom homologe regioner av virale genomer (Inoue et al., PNAS, 88,2278-282 (1991)). Observert komplementering in vitro indikerer at en lignende replikasjons-defekt HIV vektor kunne rekombinere in vivo, og således forsterke en allerede eksisterende HIV infeksjon. Det faktum at retrovirus pakker to RNA genomer inn i et virus, har ledet forskerne til å anta at retrovirus bærer to retrovirale RNA for å omgå enhver genetisk defekt forårsaket av komplementering og/eller rekombinasjon (Inoue et al. (1991), over).

I tillegg til risko for intracellulær rekombinasjon, og derved resultere i vill-type HIV, har HIV vektorer vært forbundet med risiko for mutasjon in vivo, og dette øker patogenisiteten ved den virale vektoren. Dette har ført Sarver et al. (AJDS Res. And Hum. Retrovir., 9,483-487 (1993b)) til å spekulere vedrørende utvikling av andre generasjonsrekombinante HIV vektorer, som er rephkasjons-kompetente, ennå ikke patogene. Slike vektorer, sammenlignet med de dominerende anvendte ikke replikerende vektorene (replikasjons-manglende vektorer) fortsetter å replikere i en pasient, og skaffer således tilveie konstant konkurranse med vill-type HIV. Slike vektorer er imidlertid så langt ikke tilgjengelige.

Den beste mulighet til å behandle et infisert individ forekommer ideelt ved tidspunktet for inokulering, før viruset til og med infiserer verten. Dette er imidlertid vanskelig å gjennomføre så lenge mange individer ikke innser at de har blitt infisert med HIV inntil den kliniske latente fasen ved sykdom. Trinnet der antiviral intervensjon er det mest sårt tiltrengt er under klinisk latenthet. Terapi ved dette trinnet krever at utfordringen som presenteres av et stort antall allerede infiserte CD4+ lymfocytter, som innehar virale genomer, blir konfrontert. Dette er ingen triviell utfordring, slik det fremkom ved det faktum at til dags dato er HIV ikke helbredelig og blir ikke tilfredsstillende behandlet ved terapiene som for tiden er tilgjengelig. En effektiv vaksine synes ikke å komme, og selv om hemmere av revers transkriptase og protease har vært vist å forhindre HIV replikasjon i vevskultur, har utvikling av viral resistens in vivo ført til behandlingssvikt. HIV genterapi har liten fordel for hovedmengden av HIV-infiserte individer, der antallet forutsees å nå mer enn 40 millioner i år 2000.

I lys av det ovenfor nevnte er det stadig viktig å utvikle langtids og vedvarende immunologiske responser til visse patogener, særlig virus, særlig i sammenheng med AIDS og cancer for eksempel. Levende-attenuerte (LA) vaksiner, ved å anvende replikasjons-kompetente, men ikke-patogene virus har vært vurdert (Daniel et al., Science, 258,1938-1941 (1992); og Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 81994)). Slike ikke-patogene virus, som adskiller seg fra tilsvarende vill-type virus ved en delesjon i en eller flere gener, enten (i) kan ikke utløse en beskyttende immunorespons fordi antigenet ikke vedvarer (fordi LA-virus ikke replikerer effektivt); eller (ii) LA-virus replikerer, men har annet patogent potensiale, slik det blir vist ved evnen til LA-virus å forårsake sykdom i unge dyremodeller (Baba et al., Science, 267, 1823-1825 (1995)).

Av forannevnte årsaker foreligger det derfor et behov for alternative profylaktiske og terapeutiske behandlingsmetoder av viral infeksjon, særlig i forbindelse med AIDS og cancer. Foreliggende oppfinnelse skaffer tilveie slike alternative metoder ved å tilveiebringe en betinget replikerende vektor. Oppfinnelsen skaffer også tilveie ytterligere metoder der en slik vektor kan benyttes. Disse og andre mål og fordeler ved foreliggende oppfinnelse, så vel som ytterligere oppfinneriske trekk, vil fremgå tydelig av beskrivelsen av oppfinnelsen slik den her er angitt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter betinget replikerende retroviral vektor, kjennetegnet ved at den omfatter:

a) en nukleinsyre som koder for et betinget replikerende retroviralt genom; og

b) en nukleinsyre som koder for en virusrephkasjonsinhiberende sekvens, der det

betingede replikerende retrovirale genom omfatter en retroviral 5' lang-terminal

gjenstagelse (LTR) og en 3' LTR, og minst en LTR som kontrollerer den transkrip-sjonene aktivitet til den virusrephkasjonsinhiberende sekvensen, og der replikasjon av det betinget replikerende retrovirale genom bare kan foregå i nærvær av et villtype virus eller et hjelpervirus.

Oppfinnelsen omfatter også en sammensetning omfattende en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22 og en bærer.

Videre omfattes vertscelle, som tilveiebringer en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22.

Omfattet er også en fremgangsmåte for å fremstille en betinget replikerende retroviral vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 22, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) oppnåelse av en nukleinsyre som koder for et betinget replikerende viralt genom, (b) oppnåelse av en nukleinsyre som koder for en virusrephkasjonsinhiberende sekvens, og

(c) innføring av nukleinsyren ifølge (a) og (b) i en vektor.

Videre omfattes en fremgangsmåte for å modifisere en retroviral vektor, kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) oppnåelse av en vektor; og

(b) innføring i vektoren ifølge (a)

en nukleotidsekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 14, der minst et nukleotid N er mutert, dersom vektoren omfatter DNA, eller

en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens som tilsvarer SEQ UD NO: 14, der minst en N er mutert, dersom vektoren omfatter RNA, og

der replikasjon av det retrovirale genom kan foregå i nærvær av et villtype virus eller et hjelpevirus.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for å formere og selektivt pakke en betinget replikering av retroviral vektor uten å anvende en innpakningscellelinje, som omfatter: (a) bringe en celle i kontakt med en betinget replikerende retroviral vektor ifølge

krav 1;

(b) bringe cellen i kontakt med et villtype retrovirus; og

(c) dyrke cellen under betingelser som fremmer formering av den betingede replikerende retrovirale vektor.

Videre er en in vitro eller ex vivo fremgangsmåte for å inhibere replikasjon av et villtype retrovirus i en vertscelle omfattet, og kjennetegnes ved, at fremgangsmåten omfatter det å bringe vertscellen, som er i stand til å bli infisert med det humane HIV villtypevirus, i kontakt med en betinget replikerende retroviral vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22, der tilstedeværelsen, transkripsjon eller translasjon av denne inhiberer replikasjon av viUtypeviruset i vertscellen eller meddeler en selektiv fordel for replikasjon av det betingede replikerende retrovirale vektorgenomet i forhold til replikasjon av villtype retrovirale genomet.

Oppfinnelsen omfatter videre en in vitro eller ex vivo fremgangsmåte for å uttrykke et gen av interesse i en vertscelle, som omfatter: (a) det å bringe nevnte vertscelle i kontakt med (i) en betinget replikerende viral vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22, der nevnte betingede replikerende retrovirale vektor ytterligere omfatter en nukleotidsekvens omfattende genet av interesse og den betingede replikerende retrovirale vektor er i stand til å uttrykke genet i nevnte vertscelle, og (ii) en hjelpercelle; og

(b) uttrykke genet av interesse i nevnte vertscelle.

Videre omfattes en in vitro eller ex vivo fremgangsmåte for å påvise interaksjon mellom et medikament eller en faktor og et protein, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter: (a) det å bringe medikamentet eller faktoren i kontakt med en vertscelle ifølge krav 25, der den betingede replikerende retrovirale vektor koder for å uttrykke proteinet; og (b) påvisning av interaksjonen mellom medikamentet eller faktoren og proteinet, der interaksjonen påvises ved å påvise binding eller kontakt mellom medikamentet eller faktoren og proteinet, eller interaksjonen påvises ved å påvise aktivering eller inhibisjon av en aktivitet til proteinet.

Omfattet av oppfinnelsen er også betinget replikerende retroviral vektor for anvendelse som et medikament, der den betingede replikerende retrovirale vektor omfatter en vektor vist ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22.

Til slutt omfatter foreliggende oppfinnelse en

anvendelse av en betinget replikerende retroviral vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22 for fremstilling av et medikament for å inhibere replikasjon av et villtype retrovirus i en celle.

I en utførelsesform omfatter den betinget replikerende virale vektoren minst en nukleinsyresekvens, tilstedeværelse, transkripsjon og translasjon av denne tilfører vektoren i en rephkasjons-tillatt vertscelle en selektiv fordel i forhold til en vill-type stamme av virus som tilsvarer virus fra hvilken vektoren var avledet.

I en annen utførelsesform av den betinget replikerende virale vektoren, omfatter vektoren som fortrinnsvis er et retrovirus, minst en nukleinsyresekvens, tilstedeværelse, transkripsjon eller translasjon hvilken tilfører en vertscelle som er infisert med vektoren, men en selektiv fordel i forhold til en celle infisert med en vill-type stamme av virus som tilsvarer virus fra hvilken vektoren var avledet.

I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, blir det beskrevet en fremgangsmåte for terapeutisk og profylaktisk behandling av en vertscelle for en viral infeksjon. Slike metoder kan i tillegg omfatte anvendelse av en hjelpeekspressjonvektor, et cytotoksisk medikament, proteiner/faktorer eller en protease/revers transkriptasehemmer ettersom det passer. Fremgangsmåten kan bli anvendt f.eks. for å hemme replikasjon av et virus, behandle cancer, in vivo genoverføring, eller for å uttrykke en interessant gen i en vertscelle.

I en annen utførelsesform blir det skaffet tilveie en fremgangsmåte for å anvende en vertscelle som omfatter en betinget replikerende vektor for å påvise interaksjon mellom et medikament/faktor og et protein. En slik fremgangsmåte muliggjør proteinkarakterisering og screening av medikamentet/faktorer for aktivitet med hensyn på et gitt protein.

Figurene IA - 1E er skjematisk oppsett av strukturen til viralt genom tilstede i vill-type HIV (Fig. IA), crHIV-1.1 (Fig. IB), crHIV-1.11 (Fig. 1C), crHIV-1.12 (Fig. ID), og crHlV-1.111 (Fig. 1E).

Betegnelser: cr, betinget, replikerende; U5, U5 kodende sekvens; Rz, ribozym; pakkesignal; gag, pol og env, kodende sekvens for proteiner som danner hhv. viral kjerne, revers transskriptase og kappe; tat, rev, rre, og nef, ytterligere virale gener; åpne bokser, virale lang-terminale gjentagelser. Kryssene i vill-type U5 kodende region, viser de tilnærmede områdene hvori ribozymene ifølge oppfinnelsen kløyves i vill-type U5 RNA, men ikke modifisert crHIV U5 RNA (dvs., «mU5»). Figur 2 viser DNA sekvenser av vill-type HIV U5 RNA [SEQ ID NO:l] (A) og modifisert crHIV U5 RNA [SEQ ID NO:2] (B). Tallene refererer til antall baser nedstrøms fra start av transkripsjon. Figur 3 er et autoradiografi som viser utsatthet for in vitro ribozymkløyving av vill-type U5 RNA (brønner 1-7) sammenlignet med ingen kløyving av crHIV U5 RNA (brønner 8-14): vill-type HIV U5 RNA transkript (brønn 1); ribozym RNA inneholdende et enkelt ribozym målrettet til +115 sete (dvs. tilsvarende antall basepar nedstrøms fra start av transkripsjon) (brønner 2 & 9); vill-type HIV U5 RNA inkubert med et enkelt ribozym målrettet til sete +115 resulterende i kløyvingsprodukter Pl og P2 (brønn 3); ribozym RNA inneholdende et dobbelt ribozym målrettet til +115 sete (brønner 4 & 11); vill-type HIV RNA inkubert med et dobbelt ribozym målrettet til +115 sete (brønn 5); ribozym RNA inneholdende et dobbelt ribozym målrettet til +115 seter og +133 (brønner 6 & 13); vill-type HIV RNA inkubert med et dobbelt ribozym målrettet til +115 seter og +133 (brønn 7); crHIV U5 RNA transkript (brønn 8) og crHIV U5 RNA inkubert med enten et enkelt eller et dobbelt ribozym målrettet til sete +115 (brønner 10, 12 og 14), som ikke viste noe kløyving. Stjernene indikerer der ribozymkløyvingsproduktene ville løses, dersom de var tilstede. Figur 4 er en graf som viser revers transkriptaseaktivitet (cpm/ul) versus tid (dager etter co-transfeksjon) for crHIV-formidlet hemming av vill-type HIV replikasjon i Jurkat celler ko-transfektert med vill-type HIV og crHIV-1.1 (åpne bokser), med vill-type HIV og crHIV-1.11 (åpne bokser med kryss), med vill-type HIV og crHIV-1.12 (stiplede bokser), og med vill-type HIV og kontrollplasmid pGEM-3Z (fylte bokser). Figur 5 er en graf som viser revers transkriptaseaktivitet (cpm/ul) versus tid (dager etter co-transfeksjon) for crHIV-formidlet hemming av vill-type HIV replikasjon i Jurkat celler ko-transfektert med vill-type HIV og crHIV-1.1 (åpne bokser), med vill-type HIV og crHIV-1.11 (åpne bokser med kryss), med vill-type HIV og crHIV-1.111 (stiplede bokser), og med vill-type HIV og plasmid pGEM-3Z (fylte bokser). Figurene 6A - 6C er skjematiske figurer av primere og prober benyttet for å påvise U5 RNA transkripter fra vill-type HIV (fig. 6A), crHIV-1.1 (Fig. 6B), og crHIV-1.111 (Fig. 6C). Betegnelser: U5, U5 kodende sekvens; pakkesignal; gag, pol og env, de kodende sekvensene for proteiner som danner hhv. viral kjerne, revers transskriptase og kappe; åpne bokser, virale lang-terminale gjentagelser; fylte bokser, tat og rev kodende sekvenser; og PE, VI, V2, V3, RI og R2, primere benyttet for vill-type og/eller betinget replikerende virus. Kryss i vill-typen U5 kodende region viser tilnærmet region hvori ribozymene ifølge oppfinnelsen kløyves i vill-type U5 RNA, men ikke modifisert crHIV U5 RNA (dvs., «mU5»). Figur 7 er et autoradiografi som viser RT-PCR amplifisering ved å anvende RI og R2 primere av ribozym RNA fra virus produsert fra dag +20 kulturer av Jurkat celler ko-transfektert med vill-type HIV og cr-HTV 1.111 (brønn 4), eller transfektert bare vill-type HIV (brønn 2). Brønner 1 og 3 omfatter RT-PCR negative kontroller, der RNA ble feil revers-transkriptert i fravær av revers transkriptase. Figur 8 er et autoradiografi som viser virus (brønner 1-4) og intracellulær (brønner 5-8) RT-PCR amplifisering ved å anvende VI, V2 og V3 primere av viral RNA fra dag +20 kulturer av Jurkat celler ko-transfektert med vill-type HIV og crHIV-1.111 (brønner 4 og 8), eller transfektert med vill-type HIV (brønner 2 og 6) alene. Brønner 1, 3, 5 og 7 omfatter RT-PCR negative kontroller. Figur 9 er et autoradiografi som viser et «Northern blot» analyse av intracellulær HIV RNA fra dag +20 kulturer av Jurkat celler ko-tranfektert med vill-type HIV og cr-HIV 1.111 (brønn 4), eller transfektert med vill-type HIV alene (brønn3). Kvaliteten på RNA preparatene og mengdene som ble benyttet er vist for vill-type HIV RNA (brønn 3) og crHIV-1.111 RNA (brønn 4). Figurene 1 OA - 10C er autoradiografier som viser replikasjon av crHIV i nærvær av vill-type HIV hjelper. Fig . 10A: Produksjon av virus som inneholder crHIV-1.111 RNA i stimulerte ACH2 celler transfektert med crHIV-1.111 (brønn 4) eller med pGEM 3Z (brønn 2). Brønner 1 og 3 omfatter RT-PCR negative kontroller. Fig. 10B: Produksjon av crHIV-1.11 ribozym DNA etter infeksjon av Jurkat celler med supernatanter av stimulerte ACH2 celler som tidligere var (brønn 2) eller ikke var (brønn 1) transfektert med crHIV-1.11. Fig. 10C: Produksjon av virus som inneholder crHIV-1.11 RNA i Jurkat celler som første ble transfektert med crHIV-1.11 og deretter ble superinfisert med pNL4-3 virus (brønn 2). Det er også vist virusproduksjon i celler som først ble transfektert med pGEM 3Z kontrollplasmid og deretter superinfisert med pNL4-3 virus (brønn 2). Brønn 1 og 3 omfatter RT-PCR negative kontroller. Figur 11 er et autoradiografi som viser RT-PCR ved å anvende viral-spesifikke primere (VI, V2 & V3) av virusassosiert RNA under tidlige (brønner 1-4) og sene (brønn 5-8) trinn av viral vekst, og virus fra kulturer ko-transfektert med vill-type HIV RNA og crHIV-1.11 (hhv. brønner 4 og 8), eller transfektert med vill-type HIV alene (hhv. brønner 2 og 6). Brønner 1, 3, 5 og 7 omfatter RT-PCR negative kontroller. Figur 12 er et autoradiografi som viser primerutvidelse ved å anvende PE primer av virus-assosiert RNA fra crHIV-1.11 kulturer ved senere trinn av viral vekst i celler transfektert med vill-type HIV alene (brønn 1), eller et ko-transfektert med både vill-type HIV og crHIV-1.11 (brønn 2).

Foreliggende oppfinnelse skaffer tilveie en fremgangsmåte for hemming av replikasjon av vill-type stamme av et virus. Fremgangsmåten omfatter at man bringer en vert, som har evne til å bli infisert med en slik vill-type stamme av virus, og fortrinnsvis virkelig blir infisert med en slik virus-type stamme av virus, i kontakt med en vektor som er formert bare i en vert som tillater replikasjon av vektoren (dvs. en ikke-patogen, betinget replikerende (cr) vektor).

Som ytterligere her beskrevet, er et spesielt mål med fremgangsmåten å etablere en konkurrerende infeksjon i verten med en slik ikke-patogen, betinget replikerende vektor. En betinget replikerende vektor ifølge oppfinnelsen omfatter minst en nukleinsyresekvens som tilfører en selektiv fordel for replikasjon og spredning til den betinget replikerende vektoren sammenlignet med en vill-type virus, og/eller minst en nukleinsyresekvens som tilfører en selektiv fordel for formering av virale partikler til en vertscelle som inneholder en betinget replikerende vektor sammenlignet med en vertscelle som inneholder en vill-type virus.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, omfatter vektoren en HIV sekvens og blir benyttet for behandling av HIV infeksjoner. Vektoren eller en vertscelle som inneholder vektoren, omfatter minst en nukleinsyresekvens som (1) skaffer tilveie crHIV genom med en selektiv fordel over et vill-type HIV genom for pakking inne i etterkommende virus (dvs. i celler der de begge er), og/eller (2) skaffe tilveie en vertscelle som produserer en betinget replikerende vektor (virus) med en selektiv fordel for produksjon av et crHIV virus, sammenlignet med en vertscelle som produserer en vill-type virus. En metode (til hvilken oppfinnelsen ikke er begrenset) er å tilføre crHTV genomer med en selektiv fordel for pakking ved å skaffe dem tilveie med en eller flere ribozymer som har evne til kløyving av vill-type HIV genom.

Vill-type virus

Tfølge oppfinnelsen er et «virus» et infeksjonsholdig middel som består av protein og nukleinsyre, og som anvender en vertscelles genetiske maskineri for å produsere virale produkter spesifikt for viral nukleinsyre. En «nukleinsyre» refererer til en polymer av DNA eller RNA som er enkel eller dobbelt-trådet, lineær eller sirkulær, og eventuelt inneholder syntetiske, ikke-naturlige eller modifiserte nukleotider, som har evne til å bli inkorporert inn i DNA eller RNA polymerer. Et DNA polynukleotid er fortrinnsvis omfattet av genomisk eller cDNA sekvenser.

En «vill-type stamme av et virus» er en stamme som ikke omfatter noen av de menneske-lagede mutasjonene som her er beskrevet, dvs. et hvilken som helst virus som kan isoleres fra naturen. Alternativt er en vill-type stamme en hvilken som helst virus som har blitt dyrket i et laboratorie, men som fremdeles i fravær av annet virus, har evne til å produsere avkomgenomer, eller virioner lik de som er isolert fra naturen. PNL4-3 HIV molekylært klon som er beskrevet i følgende eksempler er f.eks. en vill-type stamme.

Fremgangsmåten i oppfinnelsen kan benyttes til å behandle virale sykdommer som er resultat av viral infeksjon. Det er ønskelig at et virus (så vel som vektor, slik det blir diskutert under) er et RNA virus, men den kan også være et DNA virus. RNA virus er en uensartet gruppe som infiserer prokaryote (f.eks. bakteriofagene) så vel som mange eukaryote, inkluderte pattedyrceller og særlig mennesker. De fleste RNA virus har enkeltrådet RNA og som sitt genetiske materiale, selv om minst en familie har dobbelt-trådet RNA som det genetiske materialet. RNA virus er delt i tre grupper: positiv-trådet virus (de der genomet overført med virus blir translatert til protein, og hvis deproteinisert nukleinsyre er tilstrekkelig til å starte infeksjon), negativ-trådet virus (de der genomet overført av virus er komplementær til "the message sense", og må bli transkribert med virus-assosierte enzymer før translasjon kan forekomme), og dobbelt-trådet RNA virus. Fremgangsmåten i oppfinnelsen blir fortrinnsvis benyttet til å behandle positiv-trådet virus, negativ-trådet virus og dobbelt-trådet RNA virus.

Slik det benyttes her omfatter en RNA virus Sindbis-lignende virus (f.eks. Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus og Potexvirus), Picornavirus-lignende virus (f.eks. Picornaviridae, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus og Potyvirus), minus-trådet virus (f.eks. Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae og Arenaviridae), dobbelt-trådet virus (f.eks. Reoviridae og Birnaviridae), Flavivirus-lignende virus (f.eks. Flaviviridae og Pestivirus), Retrovirus-lignende virus (f.eks. Retroviridae), Coronaviridae, og andre virale grupper som innbefatter men ikke er begrenset til Nodavindae.

Et foretrukket RNA virus kan være et virus fra familien Flaviviridae, fortrinnsvis et virus fra slekten Filovirus, og særlig et Marburg eller Ebola virus. Et virus fra familien Flaviviridae, er et virus fra slekten Flavivirus, slik som gulfebervirus, denguevirus, West Nile virus, St. Louis encefalittvirus, japansk encefalittvirus, Murray Valley encefalittvirus, Rociovirus, tykk-båret encefalittvirus og lignende.

Også foretrukket er et virus fra familien Picornaviridae, fortrinnsvis en hepatitt A virus (HAV), hepatitt B virus (HBV), eller en ikke-A eller en ikke-B hepatittvirus.

Andre foretrakkede RNA virus kan være virus av familien Retroviridae (dvs. et retrovirus), særlig et virus fra slekten eller underfamilien Oncovirinae, Spumavinnae, Spumavirus, Lentivirinae og Lentivirus. Et RNA virus fra underfamilien Oncovirinae er ønskelig en human T-lymfotropisk virustype 1 eller 2 (dvs. HTLV-1 eller HTLV-2) eller bovinleukemivirus (BLV), et avian leukosis-sarcoma virus (f.eks. Rous sarcomavirus (RSV), avian myeloblastoseviras (AMV), avian erytroblastosevirus (AEV) og Rous-assosiert virus (RAV; RAV-0 til RAV-50), en pattedyr C-type virus (f.eks. Moloney munn leukemivirus (MuLV), Harvey munn sarcoma virus (HaMSV), Abelson murin leukemivirus (A-MuLV), AKR-MuLV, felin leukemivirus (FeLV), simian sarcomavirus, reticuloendoteliosevirus (REV), miltnecrosevirus (SNV), en B-type virus (f.eks. muspattedyrtmorvirus (MMTV)), og en D-type virus (f.eks. Mason-Pfizer apevirus (MPMV) og «SAJDS» virus). Et RNA virus av underfamilien Lentivirus er fortrinnsvis en human immunsviktvirus type 1 eller 2 (dvs. HIV-1 eller HIV-2, der HTV-1 tidligere ble kalt lymfadenopati assosiert virus 3 (HTLV-UI) og ervervet lmmunsviktsyndrom (AIDS)-besl ektet virus (ARV)), eller et annen virus relatert til HIV-1 eller HIV-2 som har blitt identifisert og assosiert med AIDS eller AIDS-lignende sykdom. Acronymet «HIV» eller begrepene «ATDS virus» eller «human immunsviktvirus» blir her benyttet til å referere til disse HIV-virusene, og HIV-beslektede og -assosierte virus generelt. Et RNA virus av underfamilien Lentivirus er fortrinnsvis et Visna/maedi virus (f.eks. slik som infisert sau), et kattimmunsviktvirus (FIV), bovin lentivirus, simian immunsviktvirus (SIV), og hestinfeksjonsanemivirus (EIAV), og et kaprin artritt-encefalittvirus (CAEV).

Et virus ifølge oppfinnelsen er også ønskelig et DNA virus. DNA virus er fortrinnsvis et Epstein-Barr virus, et adenovirus, et herpes simplex virus, et papillomavirus, et vaccinia virus og lignende.

Mange av disse virus er klassifisert som «Biosafety Level 4» (dvs. World Health Organization (WHO) «Risk Group 4») patogener for hvilken maksimale oppbevaringsfasiliteter er nødvendig for alt laboratoriearbeid. En lege med kunnskap innenfor fagområdet er imidlertid kjent med og har evne til å ta de nødvendige sikkerhetsregler for disse virus.

En «vertscelle» kan være en hvilken som helst celle, og er fortrinnsvis en eukaryotisk celle. Vertscellen er en lymfocytt (slik som en T-lymfocytt) eller makrofag (slik som en monocyttisk makrofag), eller er en forløper for en av disse cellene, slik som hematopoetisk stamcelle. Cellene omfatter et CD4+ glykoprotein på celleoverflaten, dvs. er CD4+. Det er imidlertid ønskelig med en CD4+ T-lymfocytt som har blitt infisert med AIDS-virus, og ikke ennå har blitt aktivert (dvs. ekspresjon av nef har fortrinnsvis ikke ennå forekommet, og mer å foretrekke, CD4 genekspresjon har ikke blitt nedregulert slik det er ytterligere beskrevet i det etterfølgende). En vertscelle er fortrinnsvis en celle som mangler CD4 markør, og har evne til å bli infisert med et virus ifølge oppfinnelsen. En slik celle innbefatter men er ikke begrenset til, en astrocyt, en hudfibroblast, en tarmepitelcelle og lignende. Vertscellen er fortrinnsvis fra en eukaryotisk, mangecellet art (dvs. i motsetning til en unicellulær gjærcelle), og mer å foretrekke er den et pattedyr, f.eks. human celle. En celle kan være tilstede som en enkel enhet, kan være en del av en større samling av celler. En slik «større samling av celler» kan omfatte f.eks. en cellekultur (enten blandet eller ren), et vev (f.eks. epitel eller annet vev), et organ (f.eks. hjerte, lunge, lever, galleblære, urinblære, øye og andre organer), et organsystem (f.eks. sirkulasjonssystem, respiratorisk system, gastrointestinalt system, urinsystem, nervesystem, integumentært system eller annet organsystem), eller en organisme (f.eks. en fulg, pattedyr eller lignende). Organer/vevene/cellene som er målet er fra det sirkulatoriske system (f.eks. som innbefatter men er ikke begrenset til hjerte, blodkar og blod), respiratorisk system (f.eks. nese, svelg, larynx, trachea, bronki, bronkioler, lunger og lignende), gastrointestinalsystemet (som innbefatter munn, svelg, esofagus, mage, tarmer, spyttkjertler, pancreas, lever, galleblære og andre), urinsystem (slik som nyrer, urinledere, urinblære, uretra og lignende), nervesystem (som innbefatter men er ikke begrenset til hjerne og ryggrad, og spesielle sanseorganer som øyne) og integumentert system (f.eks. hud). Mer å foretrekke er at målcellene blir valgt fra gruppen bestående av hjerte, blodkar, lunge, lever, galleblære, urinblære og øyeceller.

Vektor

En «vektor» er et nukleinsyremolekyl (typisk DNA eller RNA) som tjener til å overføre en passasjernukleinsyresekvens (dvs. DNA eller RNA) inn i en vertscelle. Tre vanlige typer vektorer innbefatter plasmider, fag og virus. Vektoren er fortrinnsvis et virus.

Vektoren er ikke en vill-type stamme av et virus, så lenge den omfatter menneskelagde mutasjoner. Vektoren er således typisk avledet fra en vill-type viral stamme ved genetisk manipulasjon (f.eks. ved delesjon) for å omfatte en betinget replikerende vektor, som videre beskrevet her. Den virale vektoren omfatter optimalt en stamme av virus som er av samme type som vill-type virus og forårsaker at infeksjoner blir behandlet, som fortrinnsvis er en av de forannevnte vill-typevirus. Vektoren er således fortrinnsvis avledet fra en RNA virus, mer å foretrekke er det at vektoren er avledet fra en retrovirus, og optimalt at vektoren er avledet fra en human immunsviktvirus. En slik vektor avledet fra en human immunsviktvirus blir generelt referert til her som en

«crHIV» vektor.

En vektor er fortrinnsvis også en «kimerisk vektor», f.eks. en kombinasjon av en viral vektor med andre sekvenser, slik som f.eks. en kombinasjon av HIV sekvenser med annen virus (som fortrinnsvis er avledet fra en vill-type viral stamme til å omfatte en betinget replikerende vektor). HIV sekvenser kan særlig fortrinnsvis være bundet med sekvenser av en modifisert (dvs. ikke-vill-type) stamme av adenovirus, adeno-assosiert virus, en Sindbis virusvektor, eller en amfotropmurin retroviral vektor.

Slik det er innbefattet her kan en vektor omfatte enten DNA eller RNA. Enten en DNA eller RNA vektor kan f.eks. bli anvendt til å utlede viruset. En cDNA kopi kan på tilsvarende måte bli laget av et viralt RNA genom. Alternativt kan en cDNA (eller viral genomisk DNA) bh transkribert in vitro for å produsere RNA. Disse teknikkene er velkjent innenfor fagområdet, og ble også beskrevet i følgende eksempler.

Et «betinget replikerende virus» er et replikasjons-defekt virus, som er defekt bare under visse betingelser. Spesielt kan virus fullføre sin replikative syklus i en tillatt vertscelle, og kan ikke fullføre sin replikative syklus i en restriktiv vertscelle. En «tillatt vertscelle» er en vertscelle infisert med en vill-type stamme av viruset. En slik infeksjon kan forekomme enten før eller etter infeksjon med et betinget replikerende virus ifølge oppfinnelsen. En «tillatt vertscelle» er alternativt en som koder for vill-type virale genprodukter som er nødvendig for viral replikasjon. En betinget replikerende vektor ifølge oppfinnelsen er således et virus (som fortrinnsvis er av samme virustype som infeksjonen som blir behandlet) som bare replikerer ved komplementering med en vill-type stamme virus når vill-typevirus infiserer celler som inneholder betinget replikerende vektorgenomer.

I en foretrukket utførelsesform omfatter en vektor et RNA virus (f.eks. en betinget replikerende HIV virus), som blir innført i form av DNA. Denne foretrukkende utførelsesformen skaffer tilveie en replikerende HIV-gen (crHIV) vektor som gir ikke-patogen crHIV-1 vektorgenomer en selektiv fordel i forhold til patogene vill-type HIV-genomer. 1 celler som inneholder både vill-type HIV og crHIV-genomer, har crHTV RNA en selektiv fordel for pakking i virus, fordi de inneholder, f.eks. ribozymer som kløyver vill-type RNA, men ikke crHIV RNA. Slike ikke-patogene crHIV har evne til spre seg til uinfiserte celler som er utsatt for HIV-infeksjon (f.eks. CD4+ celler) i nærvær av vill-type hjelpervirus. På denne måte kan selektiv pakking og spredning av crHIV interferere med vill-type HIV replikasjon.

Spesielt blir crHIV genomer innført inn i infiserte celler eller uinfiserte celler. Infiserte celler tilfører crHIV genomet proteiner som er nødvendig for innkapsling og produksjon av etterkommende viruspartikler. crHIV genomer blir innført i uinfiserte celler fortrinnsvis enten direkte ved transduksjon (f.eks. kan dette bli gjort, ved liposom-formidlet transduksjon av crHIV DNA, eller ved å anvende en kimær viral vektor), eller ved infeksjon av crHIV partikler som er resultat av transfeksjon av vill-type HIV-infiserte celler. Uinfiserte celler kan på sin side ikke produsere crHIV partikler. De kan imidlertid bli superinfiserte med vill-type virus, som tilfører proteiner som er nødvendig for videre produksjon av crHIV partikler. I denne sammenheng fungerer også en betinget replikerende vektor ifølge oppfinnelsen også som en type av «viral avleveringsvektor» som skaffer tilveie måter ved hvilken mange runder av crHIV infeksjon (dvs. i nærvær av ledsagende infeksjon med vill-type HIV) kan følge. En slik vektor som skaffer tilveie en viruskilde for mer enn en runde av viral replikasjon, står i i motsetning til andre for tiden benyttede vektorer, slik som de som er anvendt med pakking av cellerlinjer, og som bare skaffer tilveie en enkel runde av replikasjon.

Om ønskelig (f.eks. for å forenkle anvendelse av vektoren in vitro), kan vill-type viral genprodukter bli ko-supplert til en celle infisert med en betinget replikerende vektor. Vill-type virale genprodukter kan bh tilført ikke bare ved ko-infeksjon med en vill-type viral stamme (eller en cDNA eller provirus av en RNA virus), men også ved tilførsel av disse til en celle i form av deres gener subklonet i en ekspresjonsvektor, f.eks. en hjelperekspresjonsvektor («hjelper»), som har evne til å gi en vertscelle transkripsjon eller translasjon av sekvensen (regulatorisk eller strukturelle), eller alternativt kan genproduktene bli tilført eksogent, dvs. ved tilsetning av proteinprodukter til cellen. Med hensyn på «hjelperen» kan dens ekspresjon være cellespesifikk eller ikke-spesifikk og den kan bli innført i en vertscelle sammen med en betinget replikerende viral vektor som definert her, og dermed muliggjøre kontinuerlig replikasjon av den betinget replikerende virale vektoren.

Slik den ble anvendt her refererer «komplementering» til ikke-genetisk interaksjon av virale genprodukter fra forskjellige kilder i cellene. Med en blandet infeksjon, omfatter komplementering en forøkning i det virale utbyttet av en eller begge parentale genomer, mens genotypene av de parentale genomene forblir uendret. Komplementering kan være ikke-allelisk (dvs. intergenisk, der mutantene som er defekte i forskjellige funksjoner hjelper hverandre i viral replikasjon ved tilførsel av funksjonen som er defekt i den andre virus) eller alleliske (dvs. intrageniske, der de to opphavene har defekter i forskjellige domener av et multimert protein).

Celletypene som transfekteres (eller transduseres) med crHIV DNA (dvs. ved liposomer eller ved å anvende en adenoviral vektor eller en amfotrop retroviral vektor) kan være enten HTV-infiserte eller uinfiserte celler. HIV infiserte celler kan være aktiverte eller uaktiverte. Dersom de er aktiverte vil de umiddelbart transkribere vill-type HIV RNA eller crHIV RNA, og resultere i selektiv pakking av crHIV RNA inn i etterkommende viruspartikler. Dersom HlV-infiserte celler ikke er aktiverte, vil crHIV DNA hvile i dem inntil de blir aktiverte (f.eks. gjennom stimulering ved mitogener, antigener og lignende), og igjen resultere i selektiv pakking av crHIV RNA inn i de etterkommende viruspartiklene. Både aktiverte og uaktiverte uinfiserte celler som blir transfektert med crHIV DNA vil ikke fremstille viruspartikler inntil de blir superinfiserte med vill-type HIV og aktivert ved stimulering, og igjen resultere i selektiv pakking av crHIV RNA inn i etterfølgende viruspartikler.

Superinfeksjon av celler som inneholder crHIV genomer (f.eks. som et resultat av transfeksjon eller infeksjon) forekommer fordi crHIV genomer ikke koder viralproteiner som blokkerer superinfeksjon (shk som env og nef). De resulterende crHIV viruspartiklene kan infisere uinfiserte celler fordi viruspartiklene inneholder revers transkriptasemolekyler, som alle HIV partiklene bærer, slik at de kan skape et DNA provirus fra sitt genomiske RNA. Denne prosessen bhr kalt revers transkripsjon. Med en gang crHIV viruspartiklene infiserer uinfiserte celler, kan de gjennomgå revers transknpsjon og produsere et provirus fra sitt genomiske RNA. Disse cellene er således ekvivalent til de uinfiserte cellene som blir direkte transdusert med crHIV DNA. De kan ikke produsere crHIV partikler inntil disse cellene blir superinfisert med vill-type HIV og blir aktiverte, da vil igjen cellene til pakking av crHIV RNA i etterkommende viruspartikler forekomme. Det er mulig at crHIV partikler også kan infisere noen celler som allerede er infisert med HIV (se f.eks. Yunoki et al., Arch. Virol., 116,143-158

(1991); Winslow et al., Virol., 196, 849-854 (1993); Chen et al., Nuc. Acids Res., 20, 4581-4589 (1992); og Kim et al., AIDS Res. & Hum. Retrovir., 9, 875-882 (1993)). For at dette skal forekomme må imidlertid disse HIV-infiserte cellene ikke uttrykke proteiner som ned-regulerer CD4 ekspresjon, fordi dette vil forhindre crHIV viruspartikler mot å infisere disse cellene. Aktiverte HIV-infiserte celler ned-regulerer generelt CD4 ekspresjon. HIV-infiserte celler som ikke er aktivert er potensielt utsatt for crHIV superinfeksjon, og kan således være en annen kilde for crHIV partikkelproduksjon. Med en foretrukket crHIV vektor ifølge oppfinnelsen, omfatter vektoren sekvenser som er nødvendig for RNA transkripsjon, tRNA primerbinding, dimerisering og pakking, og mangler enten sekvenser som kodede proteiner som blokkerer superinfeksjon med vill-type HIV (f.eks. nef eller env proteiner) eller omfatter slike sekvenser, men de blir enten ikke transkribert eller ikke-translatert til funksjonelle protein, slik at deres ekspresjon antas å være «stille». Det er foretrekkbart er at vektoren mangler region eller mer å foretrekkbart er at vektoren mangler område eller sekvenser som kode for område av vill-type HIV fra innenfor gag kodende sekvens til å inkludert nef genet. Imidlertid omfatter vektoren optimalt rev responsivt element (RRE), som klones inn i vektoren i området for del esj on eller annet hensiktsmessig område. En slik foretrukket HIV vektor sies å «mangle område eller sekvenser som koder for område» så lenge denne vektoren kan bli administrert i sin RNA manifestasjon, eller alternativt som DNA som tidligere beskrevet.

Vektorkonstruksjon er velkjent innenfor fagområdet. F.eks. og som beskrevet i eksempel 1, blir DNA manifestasjonen av RNA virus, slik som HIV, kløyvd ved å anvende restriksjonsenzymer for å kutte ut HIV kodende sekvenser fra gag kodende region til innenfor U3 regionen, etterfulgt av nef genet. En kloningskassett omfattet av en polylinker som inneholder multiple restriksjonsseter blir innsatt i den deleterte regionen forut for ligering for å skaffe tilveie hensiktsmessig restriksjonsseter for kloning inn i vektoren. Et DNA fragment som inneholder RRE blir subklonet inn i en av disse cellene. Resulterende vektor produserer et avkuttet gag transkript, og produserer ikke vill-type Gag protein, eller noen andre vill-type HIV proteiner. Det er videre ikke nødvendig at vektoren uttrykker det avkortede gag proteinet så lenge gag translasjonsinitiseringssekvensen kan muteres for å hindre translasjon.

Ved å anvende samme måte kan crHIV sekvensene bli bundet til andre sekvenser, slik som de av et virus eller annen vektor, for å danne en kimær vektor. crHIV sekvensene kan f.eks. bli ligert til de av Sindbis virus, AAV, adenovirus eller amfotrop retrovirus for å navngi noen slike virus, noen få virus kan anvendes for å skaffes tilveie avlevering av crHIV sekvensene. Med en slik kimær vektor, kan vektoren innføres i cellen enten ved å anvende sammenbindingsvirusmekanismer for celleinngang (f.eks. reseptor-formidlet endocytose for adenovirus) eller andre måter, f.eks. liposomer.

Ifølge oppfinnelsen, omfatter fortrinnsvis en vektor (dvs. en betinget replikerende virus som fortrinnsvis er en crHIV vektor) minst en nukleinsyresekvens, besittelse (dvs. tilstedeværelse, transkripsjon eller translasjon) av denne gir en selektiv fordel. Det er to typer av slike nukleinsyresekvenser som er omfattet for inkludering i vektoren: (1) en nukleinsyresekvens, besittelse av denne gir optimalt en selektiv fordel for viral repliksjon og spredning til en vektor som omfatter en slik sekvens i forhold til en vill-type stamme av virus (dvs. fortrinnsvis en vill-type stamme fra hvilken vektoren ble avledet, og som ikke omfatter sekvensen), og (2) en nukleinsyresekvens, besittelse av denne gir optimalt en selektiv fordel til celler infisert med en vektor som omfatter sekvensen sammenlignet med celler infisert med en vill-type stamme av virus (dvs. fortrinnsvis en vill-type stamme fra hvilken vektoren ble avledet (og også f.eks. en hjelpe-ekspresjonsvektor som fremmer vektorreplikasjon og/eller fungerer i en uinfisert vertscelle), og som ikke omfatter sekvensen), f.eks. forbedring av celleoverlevelse, forbedring av vektorpartikkelproduksjon og/eller formering, forbedring av produksjon av crHIV vektorviruspartikler fra crHIV vektorproduserende celle, inkludert apoptose, forenkling av proteinproduksjon eller forbedring av immunologisk funksjon eller målretting, for å oppnå et ønsket profylaktisk, terapeutisk eller biologisk resultat. Hver av disse sekvensene, eller et antall av hver av disse sekvensene, dvs. en sekvens som alene eller i kombinasjon med andre faktorer, fremmer formering av vektoren og/eller fremmer en spesiell vertscellefunksjon for å muliggjøre en gunstig profylaktisk, terapeutisk og/eller biologisk resultat, kan bli inkludert i vektoren, enten i fravær eller tilstedeværelse av en annen sekvens, dvs. vektoren kan omfatte «minst en nukleinsyresekvens» og «minst en ytterligere nukleinsyresekvens».

En «nukleinsyre» er som tidligere beskrevet. En «nukleinsyresekvens» omfatter særlig en hvilken som helst gen eller kodende sekvens (dvs. DNA eller RNA) av potensielt en hvilken som helst størrelse (dvs. begrenset til en hvilken som helst pakkebegrensing som er gitt av vektoren), besittelse av denne gir en selektiv fordel, som ytterligere definert her. Et «gen» er en hvilken som helst nukleinsyresekvens som koder for protein eller et mRNA molekyl (uavhengig av om sekvensen er transkribert og/eller translatert). Mens et gen omfatter kodende sekvenser såvel som ikke kodende sekvenser (f.eks. regulatoriske sekvenser), vil en «kodende sekvens» ikke innbefatte noen ikke-kodende

DNA.

1. Nukleinsyresekvens, besittelse av denne gir en selektiv fordel i en vertscelle til en vektor som omfatter en slik sekvens i forhold til en vill-type stamme av virus.

En nukleinsyresekvens, som bidrar til en selektiv fordel til en vektor i en vertscelle i forhold til en vill-type stamme av virus, er fortrinnsvis en hvilken som helst sekvens som tillater at virale partikler formerer seg fra vektoren som skal bh selektivt produsert eller pakket sammenlignet med virale partikler formert fra vill-type virus. Slike sekvenser innbefatter men er ikke begrenset til, en sekvens som resulterer i en økning i antall vektorgenomer produsert intracellulært sammenlignet med vill-type genomet, og en antiviral nukleinsyresekvens. Den første kategorien av nukleinsyresekvenser som bidrar til en selektiv fordel i en vertscelle til en vektor som inneholder sekvensen sammenlignet med en vill-type stamme av virus, er sekvenser slik som en promoter. En «promoter» en sekvens som dirigerer binding av RNA-polymerase og dermed fremmer RNA syntese, og som kan omfatte en eller flere enhancere. «Enhancere» er cis-virkende elementer som stimulerer eller hemmer transkripsjon av tilgrensende gener. En enhancer som hemmer transkripsjon ble også betegnet som en «silencer». Enhancere adskiller seg fra DNA -bindende seter for sekvens-spesifikk DNA bindende proteiner som bare finnes i promotere som også blir betegnet «promoterelementer» ved at enhancerene kan fungere i en hvilken som helst orientering, og over avstander opptil flere kilobaser (kb), selv fra en posisjon nedstrøms for en transkribert region.

Promoteren (f.eks. lang-terminal gjentagelse (LTR)) til en betinget replikerende HIV vektor blir fortrinnsvis modifisert slik at vektoren er mer responsiv til visse cytokiner enn vill-type HIV stammen. En modifisert HIV promoter er f.eks. tilgjengelig som demonsterer øket transkripsjonen aktivitet i nærvær av interleukin-2. Inkorporering av denne promoter i en vektor og innføring av vektoren i vill-type, HIV-infiserte celler resulterer fortrinnsvis i en øket produksjon og pakking av etterkommende viruspartikler fra vektorgenomet sammenlignet med vill-type HIV genomet. Andre cytokiner og/eller chemokiner (f.eks. inkluderende men ikke begrenset til tumornecrose faktor a, RANTES og lignende) kan på tilsvarende måte benyttes for å fremme selektiv pakking av viruspartikler som er kodet av vektoren.

Den andre kategorien av en nukleinsyresekvens som bidrar til en selektiv fordel til en vektor som inneholder sekvensen sammenlignet med vill-type stamme av en virus innbefatter, som foretrukket nukleinsyresekvens, en antiviral nukleinsyresekvens. «Antivirale midler» blir kategorisert på bakgrunn av deres virkningsmåte, f.eks. hemmere av revers transkriptase, konkurrenter og viral inngang i celler, vaksiner, proteasehemmere og genetiske antivirale midler. «Genetiske antivirale midler» er DNA eller RNA molekyler som ble overført i celler og påvirker deres intracellulære mål enten direkte (dvs. som innført intracellulært) eller etter deres omdanning til enten RNA eller protein (oversikt av DropuliO et al. (1994) , over). En genetisk antiviral sekvens er også en foretrukket nukleinsyresekvens. Genetisk antivirale midler innbefatter men er ikke begrenset til, antisensmolekyl, RNA etterligninger, transdominante mutanter, toksiner, immunogener og ribozymer. Det er ønskelig at et genetisk antiviralt middel er et antisensmolekyl, et immunogen, og et ribozym. En foretrukket nukleinsyresekvens som gir en selektiv fordel til en vektor i forhold til en vill-type stamme av virus er således den av et genetisk antiviralt middel valgt fra gruppen bestående av et antisensmolekyl, et immunogen og et ribozym.

Et «antisensmolekyl» er et molekyl som speiler et kort segment av et gen hvis ekspresjon skal bli blokkert. Et antisensmolekyl rettet mot HIV hybridiserer til vill-type HIV RNA, og tillater dens fordelaktige degradering av cellulære nukleaser. Antisensmolekyler er fortrinnsvis DNA oligonukleotider, om ønskelig ca. 20 til 200 basepar i lengde, fortrinnsvis ca. 20 til ca. 50 basepar i lengde, og eventuelt mindre enn 25 basepar i lengde. Et antisensmolekyl kan bli uttrykt fra crHIV RNA som fortrinnsvis bindes til genomisk vill-type RNA, for dermed å skaffe tilveie crHIV RNA med en selektiv fordel for pakking i etterkommende viruspartikler.

Et «immunogen» er et enkel-kjedet antistoff (scAb) rettet mot et viralt strukturelt protein. Et immunogen blir overført som nukleinsyre og uttrykt intracellulært. Et immunogen kan også på tilsvarende måte være et hvilket som helst antigen, overflaterprotein (inkludert de som er klasse-begrenset) eller antistoff, som forenkler vektor og/eller vertscelleseleksjon. I en foretrukket vektor omfatter nukleinsyresekvensen en scAb som bindes til vill-type HIV Rev protein. Dette forhindrer fortrinnsvis modning av Rev proteinet ved å resultere i gjenholding i det endoplasmatiske retikulum. Rev proteinet eksporterer spesifikt uspaltet HIV RNA til cytoplasma ved binding til RRE og deretter oligomerisering for å omgi HIV RNA. HIV RNA som utgjør et kompleks med Rev, ble eksportert til cytoplasma og omgikk cellens spleismgsmaskineri. Dersom vill-type Rev ikke binder til vill-type RRE, blir vill-type HIV RNA ikke eksportert inn i cytoplasma, og vil ikke ikke bli inkapslet inn i etterfølgende viruspartikler.

Vektoren som inneholder scAb nukleinsyresekvensen omfatter videre optimalt en modifisert RRE sekvens, og koder for et mutert Rev protein som gjenkjenner modifisert, men ikke vill-type RRE. I celler som inneholder vill-type HIV og en vektor som omfatter scAb nukleinsyresekvensen, blir vektoren således fortrinnsvis pakket inn i viruspartiklene. En tilsvarende strategi blir fortrinnsvis benyttet der proteinene av vill-type HIV matriks eller nukleokapsel (dvs. et hvilket som helst protein som er involvert i protein/RNA interaksjoner som påvirker inkapsling av viral RNA) er målene for scAb.

Et «ribozym» er et antisensmolekyl med katalytisk aktivitet, dvs. i stedet for binding av RNA og hemming av translasjon, binder ribozymer RNA og gjennomfører sete-spesifikk kløyving av det bundne RNA molekylet. Det er generelt fire ribozymgrupper: Tetrahymena gruppe I intervenerende sekvens, RNase P, og hammerhode og hårnålsribozymer. Ytterligere katalytiske motiver eksisterer også i andre RNA molekyler, f.eks. hepatitt delta virus og ribosomal RNA i soppmitochondrier.

En foretrukket ribozym er et ribozym hvori den katalytiske domenen kløyver en 3'-nukleotid NUH sekvens [SEQ ID NO:3], der N er et hvilket som helst nukleotid (dvs. G, A, U eller C), og H kan være en av A, C eller U. Fordi sekvensen som blir kløyvet mest effektivt med slike ribozymer er et GUC sete, omfatter fortrinnsvis NUH sekvensen et GUC sete.

Et slikt ribozym kløyver mest i et område til vill-type stammen av virus eller dens transkripter, men kløyver ikke i et område hos en vektor eller dens transkripter. Ribozymer kløyver vektoren eller dens transkripter i den betydning at et slikt virus eller vektor enten kan være RNA eller DNA, som tidligere beskrevet. Med kløyving «i et område» menes kløyving i et målrettet område, dvs. fortrinnsvis et område av virus som er nødvendig for viral formering. Vektoren har ønskelig blitt modifisert slik at dens spesielle område er målrettet (dvs. dersom tilstede i vektoren i det hele tatt) eller kløyvet av ribozym. Ribozymet kan kløyve vektoren, så lenge kløyvingen ikke forekommer i et område som er nødvendig for formering av virale, f.eks. crHIV partikler.

Ribozymet blir optimalt kodet av en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID

Mens SEQ ID NO: 4 omfatter et ribozym som er målrettet til +115 sete (dvs. på bakgrunn av antall baser nedstrøms for start av transkripsjon) av vill-type HIV U5 regionen, SEQ JD NO: 5 omfatter et ribozym som er målrettet til +133 sete av vill-type HIV U5 området.

Et slikt ribozym har evne til å kløyve i vill-type HIV genom (eller dens transkripter) men ikke vektorgenomet (eller dens transkripter) fordi vektoren U5 sekvensene blir modifisert ved in vitro sete-rettet mutagenese, slik som er kjent innenfor fagområdet og beskrevet i eksempel 1. Vektorsekvensene blir fortrinnsvis særlig modifisert slik at vektoren omfatter en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2 (dvs.

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, og SEQ ID NO: 18.1 form av RNA omfatter vektoren fortrinnsvis en sekvens kodet av en sekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 og SEQ ID NO: 18.1 motsetning til dette omfatter vill-type HIV U5 sekvensen kodet av sekvens fra SEQ ID NO: 1 (dvs. GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Modifikasjonene in toto og sammenlignet med vill-type U5 sekvensen (i form av DNA) er angitt i figur 2.

Andre ribozymer målrettet til andre områder av en viral, og særlig et HTV genom kan videre bli benyttet, enten alene eller i kombinasjon. Ribozymet kan f.eks. kløyve i andre RNA sekvenser som er nødvendig for viral replikasjon, f.eks. i revers transkriptase, protease eller transaktivatorprotein, med Rev eller i andre nødvendige sekvenser slik som det er blitt beskrevet. En vektor omfatter fortrinnsvis multiple ribozymer, f.eks. målrettet til mange seter. I slike tilfeller blir de analoge sekvensene i vektoren modifisert ved sete-rettet mutagenese, eller på annen måte slik som kjent innenfor fagområdet, for å avlede en vektor som er resistent til slik ribozymkløyving.

Når vektoren er et humant immunsviktvirus, mangler fortrinnsvis vektoren tat genet og dens 5' spleisesete, og i stedet for dette, omfatter en trippel anti-Tat ribozymkassett, der den katalytiske domenet av hvert ribozym av den triple ribozymkassetten kløyver et ulikt sete på vill-type human immunsvikt viral nukleinsyremolekyl, særlig ved et ulikt sete i tat. Den katalytiske domene av hvert ribozym kløyver en proteinsekvens i et område av et nukleinsyremolekyl av vill-type human immunsviktvirus for hvilken det ikke er noen ribozym-resistens motpart i vektoren selv. 2. Nukleinsyresekvens, besittelse av denne bidrar til en selektiv fordel til celler infisert med en vektor som omfatter sekvensen sammenlignet med celler infisert med en vill-type stamme av virus.

En nukleinsyresekvens som gir en selektiv fordel til en celle som inneholder en vektor som omfatter sekvensen over en celle som inneholder en vill-type stamme av virus (dvs. som mangler sekvensen) er fortrinnsvis en hvilken som helst sekvens som tillater en celle å inneholde vektoren for å overleve og formere virale partikler (dvs. crHIV virale partikler) sammenlignet med en celle som inneholder vill-type virus. En slik sekvens innbefatter men er ikke begrenset til, en hvilken som helst sekvens som tillater at cellen, eller vektoren som er i cellen, å unnslippe ødeleggelse, sekvenser som fremmer celleoverlevelse, sekvenser som induserer apoptose, sekvenser som forenkler proteinproduksjon eller sekvenser som fremmer immunfunksjon eller målretting.

Fortrinnsvis en nukleinsyresekvens som er inneholdt i vektoren som koder for gener for multimedikament resistens (se f.eks. Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 956-962 81986); Ueda et al., J. Biol. Chem., 262, 505-508 81987); og Ueda et al., PNAS, 84, 3004-3008 (1987)). I nærvær av tilsatt cytotoksisk medikament (f.eks. som anvendt for cancerkjemoterapi), tillater en celle som inneholder vektoren å overleve, mens en celle som inneholder vill-type virus, slik som HIV, gjør det ikke. Slike cytotoksiske medikamenter innbefatter men er ikke begrenset til, actinomycin D, vinblastin sulfat, vincristin sulfat, daunomycin, adriamycin, VP-16 og AMS A. Alternativt omfatter en slik nukleinsyresekvens fortrinnsvis en sekvens valgt fra gruppen bestående av en sekvens av (eller en sekvens som kode for) en mutert (dvs. mutant) protease, og en sekvens av (eller en sekvens som kode for) en mutert (dvs. mutant) revers transkriptase. En mutert revers transkriptase blir fortrinnsvis laget slik at den er resistent mot nukleosid og ikke-nukleosid revers transkriptasehemmere, og en mutert protease blir laget slik at den resistent til de vanlige benyttede proteasehemmerne.

Administrering av disse protease eller revers transkriptasehemmerne til en vert i forbindelse med vektoren blir benyttet for å selektere for celler som produserer vektoren i motsetning til celler som produserer vill-type virus. Denne tilnærmelsen blir på tilsvarende måte modifisert ved anvendelse med et hvilket som helst medikament som hemmer viral replikasjon, slik at virus kan muteres for å unngå inhiberingen. For behandling av HIV, omfatter den selektive nukleinsyresekvensen inkorporert i vektoren fortrinnsvis muterte HIV sekvenser. Disse sekvensene forhindrer imidlertid optimalt ikke superinfeksjon med vill-type HIV.

Vektoren er en av de som er angitt over, og særlig de foretrukkende crHIV vektorene som er vist i figurene IB - 1E, dvs. hhv. crHIV -1.1, cr-HIV -1.11, crHIV -1.12, og crHIV -1.111, hhv. (Dropulic' et al., PNAS, 93,11103-11108 (1996). Foretrukket er også en vektor som er beskrevet i eksempel 11, dvs. cr2HTV.

cr2HIV vektoren mangler fortrinnsvis tat genet og dens spleisesete fra genomet til et vill-type human immunsvikt virus. I stedet for tat genet og dens spleisesete, omfatter cr2HIV vektoren en trippel anti-Tat ribozymkassett, der det katalytiske domenet av hvert ribozym i trippelribozymkassett kløyver på et ulikt sted på en vill-type HIV nukleinsyremolekyl. Katalytisk domene av hvert ribozym av den triple ribozymkassetten kløyver fortrinnsvis i et ulikt sete i tat på vill-type HIV nukleinsyremolekylet. Det er mer å foretrekkbart at den katalytiske domene av hvert ribozym kløyver en nukleotidsekvens i et område av en nukleinsyre av vill-type HIV for hvilken det ikke er noen nbozym-resistent motpart i vektoren selv.

En vektor er optimalt kompatibel med cellen som den skal bli innført i, f.eks. har evne til å gjennomføre ekspresjon på cellen av vektor-kodet nukleinsyresekvenser. Det er ønskelig at vektoren omfatter en start av replikasjonsfunksjonen i cellen. Når en nukleinsyresekvens blir overført i form av dens DNA kodende sekvens (v.eks. versus i form av et komplett gen som omfatter sin egen promoter), inneholder vektoren optimalt en promoter som har evne til å drive ekspresjon av den kodende sekvensen og som er operativt bundet til den kodende sekvensen. En kodende sekvens er «operativt bundet» til en promoter (f.eks. når både kodende sekvens og promoter sammen utgjør et nativt eller rekombinant gen) når promoteren har evne til å dirigere transkripsjon av kodende sekvens.

I en rekombinant vektor av foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis all riktig transkripsjon (f.eks. initiering og termineringssignaler), translasjon (f.eks. nbosominngang eller bindingssete og lignende) og prosesseringssignaler (f.eks. spleisedonor og akseptorseter om nødvendig og polyadenyleirngssignaler) arrangert korrekt i vektoren, slik at et hvilket som helst gen eller kodende sekvens blir riktig transkribert (og/eller translatert om ønskelig) i cellene, inn i hvilken vektoren blir innført. Manipulering av slike signaler for å sikre passende ekspresjon i vertsceller er innenfor kunnskap og ekspertise til en person med ordinær kunnskap innenfor fagområdet.

Vektoren omfatter også noen midler der vektoren eller dens subklonede sekvens blir identifisert og selektert. Vektoridentifikasjon og/eller seleksjon blir gjennomført ved å anvende et antall måter som er kjent innenfor fagområdet. Vektorer som inneholder spesielle gener eller kodende sekvenser blir fortrinnsvis identifisert ved hybridisering, tilstedeværelse eller fravær av såkalte «markør» genprodukter som er kodet av markørgener som er tilstede i vektorene, og/eller ekspresjon av spesielle sekvenser. I første tilnærmelse blir tilstedeværelse av en spesiell sekvens i en vektor detektert ved hybridisering (ved DNA-DNA hybridisering) ved å anvende prober som omfatter sekvenser som er homologe til den relevante sekvensen. I den andre tilnærmelsen blir rekombinant vektor/vertsystem identifisert og selektert basert på tilstedeværelse eller fravær av visse markørgenfunksjoner slik som resistens til antibiotika, thymidin kinaseaktivitet og lignende, forårsaket av de spesielle genene som koder for disse funksjoner som er tilstede på vektoren. I den tredje tilnærmelsen blir vektorene identifisert ved analysering av et spesielt genprodukt som er kodet av vektoren. Slike analyser er basert på fysikalske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper ved genproduktet.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie en vektor, som dersom det er DNA, omfatter en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 og 18 og, som dersom det er RNA, omfatter en nukleotidsekvens som er kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ JD NO: 2,4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 og 18.

Foreliggende oppfinnelse skaffer videre tilveie en fremgangsmåte for konstruksjon av en vektor, som er avledet fra en vill-type human immunsviktvirus og som har evne til replikering bare i en vertscelle som tillater applikasjon av denne vektoren, med et ribozym. Ribozymet som er omfattet innenfor eller kodet av vektoren, kløyver en nukleinsyre tyl et vill-type human immunsviktvirus men ikke vektoren selv, og dens transkripter om noen. Fremgangsmåten omfatter oppnåelse av en vektor, som er avledet fra et vill-type human immunsviktvirus og som har evne til kun replikering i en vertscelle som tillater replikasjon av denne vektoren, og inkorporering inn i vektoren av nukleinsyresekvens som, omfatter kode for et ribozym, den katalytiske domenet av denne kløyver en nukleinsyre til et vill-type human immunsviktvirus men ikke vektoren selv, eller dens transkripter om noen. I en slik metode kan nukleotidsekvensen som omfatter eller som kode for U5 sekvensen av vill-type human immunsviktvirus bli utelatt fra vektoren og erstattet med en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ JD NO: 2, 6, 7, 15, 16, 17 og 18, dersom vektoren er DNA, og en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ JD NO: 2, 6, 7,15, 16,17 og 18, dersom vektoren er RNA. Vektoren replikerer fortrinnsvis i en vertscelle som tillater replikasjon av denne vektoren mer enn en gang.

Det ble også i foreliggende oppfinnelse beskrevet en fremgangsmåte for modifisering av en vektor. Fremgangsmåten omfatter at man oppnår en vektor og innfører inn i vektoren en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av DNA sekvensene fra SEQ JD NO: 2,4, 5, 6, 7,15,16,17 og 18, dersom vektoren er DNA, og en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ JD NO: 2,4, 6, 7,15,16,17 og 18, dersom vektoren er RNA.

Videre blir det i foreliggende oppfinnelse beskrevet en fremgangsmåte for formering og selektiv pakking av en betinget replikerende vektor uten anvendelse av en pakkecellelinje. Fremgangsmåten omfatter at man bringer den betinget replikerende vektoren i kontakt med en celle som har evne til å bli infisert av en annen vektor, som er av samme type som vektoren som den betinget replikerende vektoren og som adskiller seg fra den betinget replikerende vektoren ved å være vill-type for replikasjonskompetent; etterfølgende kontaktbetingelse av cellen med den andre vektoren; og deretter dyrking av celler under betingelser som leder til formering av den betinget replikerende vektoren.

Det ble også skaffet tilveie et isolert og renset nukleinsyremolekyl valgt fra gruppen bestående av et DNA molekyl som omfatter en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2,4, 6, 7,15,16,17 og 18, og et RNA molekyl som omfatter en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2,4, 6, 7, 15, 16, 17 og 18.

Fremgangsmåte ved anvendelse

Ovenfor-beskrevne vektorer blir fortrinnsvis innført i en vertscelle for profylaktisk og terapeutisk behandling av viralinfeksjon, for å forenkling av vektoropprettholdelse, såvel som av andre årsaker. Foreliggende oppfinnelse skaffer tilveie en vertscelle som omfatter en vektor ifølge oppfinnelsen. Isolering av vertscellene, og/eller vedlikehold av slike celler eller cellerlinjer avledet fra disse i kultur, har blitt rutinearbeid, og for en person med kunnskap innenfor fagområdet er dette velkjent.

Spesielt blir en vektor som beskrevet over fortrinnsvis benyttet i profylakse og terapeutisk behandling av en viral infeksjon, fortrinnsvis slik der infeksjonen er fra en vill-type virus, fortrinnsvis en vill-type RNA virus, mer å foretrekke fra en vill-type retrovirus, og optimalt fra en vill-type HIV.

Fremgangsmåten omfatter at man bringer en vertscelle, som har evne til å bli infisert med en vill-type virus, i kontakt med en betinget replikerende vektor, som har evne til å replikere kun i en vertscelle som tillater replikering av vektoren, tilstedeværelse av transkripsjon eller translasjon av denne, hemmer replikasjon av vill-type stammen av virus i vertscellen. Det er ønskelig at vektoren replikerer mer enn en gang og omfatter minst en nukleinsyresekvens, besittelse av dette (dvs. tilstedeværelse, transkripsjon eller translasjon) innebærer en selektiv fordel i en vertscelle til vektoren i forhold til en vill-type stamme av virus, som optimalt er stammen fra hvilken vektoren ble avledet.

I henhold til denne metoden omfatter nukleinsyresekvensen fortrinnsvis en nukleotidsekvens, som omfatter eller kodes av et genetisk viralt middel, som negativt påvirker replikasjon og/eller ekspresjon av en virus som er forskjellig fra denne vektoren. Det genetiske antivirale midlet blir om ønskelig valgt fra gruppen bestående av et antisensmolekyl, et ribozym og et immunogen. Det genetiske antivirale midlet er optimalt et ribozym, fortrinnsvis en katalytisk domene som kløyves ved 3' nukleotid NUH sekvens (f.eks. særlig en GUC sekvens; SEQ ID NO: 3). Ribozymet blir eventuelt kodet, idet minste delvis, av en sekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 4 og SEQ ID NO: 5. Ribozymet kløyver i et område av vill-type stamme av virus eller dens transkripter, men kløyver ikke i området av vektoren eller dens transkripter. Dette er fordi at vill-type stamme virus omfatter en sekvens kodet av SEQ ID NO: 1, mens vektoren, dersom det er DNA, omfatter en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 6, 7,15,16,17 og 18 og, dersom det er RNA, omfatter en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 6, 7,15, 16, 17 og 18.

Fremgangsmåten gjennomføres der vektoren omfatter minst en nukleinsyresekvens, besittelse av denne (dvs. tilstedeværelse, transkripsjon eller translasjon) innebærer en selektiv fordel til en vertscelle infisert med vektoren i forhold til en celle infisert med en vill-type stamme av virus, som optimalt er stammen av virus fra hvilken vektoren ble avledet. Med hensyn på dette, kan vektoren omfatte minst en nukleinsyresekvens, som gir en selektiv fordel til en vertscelle infisert med virus og i det minste nukleinsyresekvens, som gir en selektiv fordel til vektoren i forhold til en vill-type stamme av et virus som tilsvarer virus fra hvilken vektoren ble avledet.

Fremgangsmåten blir således fortrinnsvis gjennomført der nukleinsyresekvensen omfatter en nukleotidsekvens som koder for en multimedikamentresistens. Denne metoden blir alternativt gjennomført der nukleinsyresekvensen omfatter en nukleotidsekvens som kode for en mutert (mutant) protease og en nukleotidsekvens som kode for en mutert (mutant) revers transkriptase, slik som når den virale infeksjon som blir profylaktisk eller terapeutisk behandlet, er et retrovirus.

Fremgangsmåten omfatter videre administrering til en vertscelle et middel som valgt fra gruppen som består av et cytotoksisk medikament, en proteasehemmer og en revers transknptasehemmer (dvs. i tillegg til administrering av vektoren).

En vektor kan således bli benyttet ifølge ovenfor beskrevne metode ikke bare til å behandle terapeutisk en viral infeksjon men for å beskytte en potensiell vertscelle mot viral infeksjon, dvs. en metode for profylaktisk behandling av en viral infeksjon eller en «vaksinasjon» mot en virus som er interessant, slik som en RNA virus, særlig en retrovirus som HIV. Fremgangsmåten hemmer hovedsakelig replikasjon av en vill-type stamme av virus før vertscellen kommer i kontakt med vill-type stammen av virus. Med hensyn på dette kan vektoren omfatte eller kode for proteiner som blokkerer superinfeksjon med en vill-type virus. Metoden omfatter at man bringer vertscellen i kontakt med en betinget replikerende vektor som beskrevet over, og en «hjelper-ekspresjonsvektor», dvs. et viralt genom som fremmer replikasjon av «vektoren» i en uinfisert vert. Den betingede replikerende vektoren omfatter en selektiv fordel for pakking og/eller formering. Vektoren kan f.eks. videre inneholde en sekvens som forbedrer celleoverlevelse, fremmer viral produksjon, induserer apoptose, forenkler proteinproduksjon og/eller fremmer immunfunksjon og/eller målretting. «Hjelpe-ekspresjonsvektor» konstruksjonen er en hvilken som helst ekspresjonsvektor som komplementerer for den manglende evnen til «vektoren» å replikere. Slike hjelpe-ekspresjonsvektorer er vanlige og blir konstruert på enkel måte av personer med kunnskap innenfor fagområdet. Hjelpe-ekspresjonsvektoren kan enten være pakket i viruspartikler, som vektoren eller uttrykt uten et pakkekrav. Siden «vektoren» har en selektiv fordel for pakking og/eller formering, skaffer dette systemet tilveie en sikker måte å oppnå høy replikasjon av virus uten mulige patogene effekter som et levende attenuert virus potensielt kunne forårsake. I tillegg kan vektoren blandes med ikke-spesifikke adjuvanter for å øke immunogenitet. Slike adjuvanter er kjent innenfor fagområdet, innbefatter men er ikke begrenset til Freund's fullstendig eller ufullstendig adjuvant, emulsjoner omfattet av bakterielle og mycobakterielle celleveggkomponenter og lignende.

Når en vektor benyttes i henhold til ovenfor beskrevne metode som en profylaktisk behandling av viral infeksjon, kan vektoren kode for et antigen til et protein som ikke blir kodet av et vill-type virus, slik som et mutant viralt protein eller et ikke-viralt protein. Antigenet som er kodet for av vektoren kan for eksempel være av bakteriell opprinnelse eller cancerholdig celleopprinnelse. Videre kan «vektoren» også kode for et MHC gen for riktig presentasjon av antigen til vertens immunsystem. Slike vektorer kan således anvendes for å forenkle en vedvarende immunologisk respons mot forskjellige rekker av potensielle patogener og/eller endogene proteiner (f.eks. tumor-spesifikk antigen) som blir selektivt uttrykt i unormale celler.

«Hjelper-virus» (også referert til her som «hjelper») ekspresjonsvektor kan videre bli konstruert til kun å uttrykkes i spesifikke celletyper (f.eks. stamcelle, profesjonell antigenpresenterende celler og tumorceller) ved tilsetning eller utelatelse av en spesifikk genetisk element/faktor (enten i vektoren eller hjelpe-virusekspresjonskonstruksjonen, som tillater celle-spesifikk vektorreplikasjon og spredning. Vektoren sprer seg fremdeles ved komplementering med hjelpe-viruskonstruksjon, men denne spredningen er celle-spesifikk, avhengig av om en viss genetisk element/faktor blir tilsatt eller utelatt

fra vektor eller hjelpe-virusekspresjonskonstruksjon. Dette kan bli gjort alene eller i kombinasjon med andre av de ovenfor-nevnte strategiene.

En betinget replikerende HIV vektor kan f.eks. utformes til å replikere spesifikt i makrofager, heller en i T-celler. Vektoren som vil utgjøre en Tat-defekt HIV (vektoren koder for andre HIV proteiner men de blir ikke uttrykt på grunn av fravær av Tat transkripsjonen transaktivator), kan kode for et ribozym som kløyver vill-type HIV men ikke betinget replikering av HIV RNA. Hjelpe-ekspresjonsvektoren for denen vektoren kan kode et Tat-gen uttrykt av en makrofag-spesifikk promoter. crHIV vil bare replikeres betinget i makrofagceller, mens den har evne til å replikere i T-celler eller andre celletyper.

Tat genet kan være operativt bundet til en tumor-spesifikk promoter; crHIV vil således bare replikere i tumor CD4 celler og ikke normale CD4 celler. Det genetiske element/faktor kan også være en modifikasjon av en promotersekvens av en vektor slik som den blir uttrykt bare i spesifikke celletyper og ikke i andre celletyper i sammenheng med «hjelpe-virus» ekspresjonskonstruksjon.

I en annen utførelsesform blir hjelpe-ekspresjonskonstruksjonen eller vektorkonstruksjonskappeproteiner (dersom slike konstruksjoner blir laget til å inneholde kappeproteiner) bli modifisert slik at vektor-viruspartikkelen spesifikt vil infisere visse celletyper (f.eks. tumorceller), mens den ikke har evne til å infisere andre celletyper (f.eks. normale celler). I en annen utførelsesform kan en adenovirus som mangler en eller flere nøkkelfaktorer for replikasjon, bli komplementert ved å anvende en hjelperkonstruksjon, som tilveiebringer slike faktorer bundet til en tumorspesifikk promoter. Faktorene som komplementerer replikasjon av adenavirus vil således bli uttrykt i tumorceller, og dermed tillate viral replikasjon i tumorceller (med ekspresjon av proteiner som er nødvendig for celledreping), men ikke i normale celler.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie en fremgangsmåte for å behandle cancer, og særlig behandling av T-celle leukemi. "Behandling av cancer" ifølge oppfinnelsen omfatter administrering til en vert av en ytterligere modifisert vektor som angitt her med et formål å gjennomføre en terapeutisk respons. En slik respons kan bli vurdert f.eks. ved overvåking av attenuering av tumorvekst og/eller tumorregresjon. "Tumorvekst" innbefatter en økning i tumorstørrelse og/eller antall tumorer. "Tumorregresjon" innbefatter en reduksjon tumormasse.

"Cancer" ifølge oppfinnelsen innbefatter cancer som er karakterisert ved unormal cellulær proliferasjon og fravær av kontakthemming, som kan være tydelig ved tumordannelse. Begrepet innbefatter cancerlokalisering i tumorer, såvel som cancer ikke lokalisert i tumorer slik som f.eks. de cancerceller som er ekspanderer fra en tumor lokalt ved invasjon, eller systematisk ved metastase. Teoretisk kan en hvilken som helst cancertype være målrettet for behandling ifølge oppfinnelsen. Canceren har imidlertid fortrinnsvis viral opprinnelse. Ovenfor-beskrevne vektorer kan endelig bli direkte anvendt for in vivo genterapi. Noen strategier for genterapi lider fordi de ikke kan formidle genavlevering til en stor prosentdel av cellene; bare en viss prosentdel av cellene blir infisert. Dette er særlig viktig i anti-tumorstrategier der gentransduksjon av hele tumorpopulasjonen er avgjørende. Ved tilsetting av "vektoren" sammen med en

"hjelper", vil umiddelbart de omsatte cellene produsere virale partikler som kan infisere naboliggende celler og således muliggjøre høy og mulig komplett transduksjonseffekt. I en utførelsesform av oppfinnelsen, kan en human retrovirus (som kan være HIV eller et retrotransposonelemenf) bli avlevert inn i vev (eller celler in vitro) med en "hjelper" konstruksjon. Celler som umiddelbart inneholder vektoren og hjelperen vil produsere virus og pakke vektoren betinget i viruspartiklene. Disse viruspartiklene vil ha evne til å formidle høyeffekttransduksjon av naboceller (siden celle-cellekontakt er den mest effektive måten å omsette celler). De umiddelbart omsatte cellene kan enten dø eller ikke, avhengig av om vektor/hjelperkombinasjon resulterer i en cytolytisk infeksjon. I det tilfellet med et retrotransposon, trenger hjelperen ikke å inneholde strukturelle proteiner, siden normale celler eller tumorceller kan inneholde protein/faktorer som er nødvendig for innkapsling i viruspartiklene. I dette tilfellet kan hjelperen i større grad være, men ikke begrenset til et transaktivatorprotein som aktiverer transkripsjon av vektorene som er nødvendig for retrotransposon innkapsling. I det tilfellet med HIV, kan andre faktorer, men ikke nødvendigvis, være nødvendig for innkapsling av HIV genomet, inn i de etterkommende viruspartiklene for infeksjon/transduksjon av celler.

Ovenfor beskrevne vektorer kan også anvendes i mot-biologisk og mot-kjemiske krigføringsstrategier. En betinget replikerende vektor kan f.eks. bli avlevert inn i en individ infisert med et svært patogent virus eller bakterie eller et kjemisk middel (f.eks. toksin). Vektoren vil interferere med replikasjon av det patogene virus som beskrevet tidligere. Betinget replikerende vektor kan også bli anvendt for anti-bakteriell eller anti-kjemiske strategier i forbindelse med hjelpe-ekspresjonsvektor ("hjelper").

En betinget replikerende vektor kan f.eks. skille ut anti-baktenelle eller anti-toksin antistoffer etter at en "hjelper" tillater dens ekspresjon og formering, "hjelperen" kan, men ikke nødvendigvis, være drevet av en induserbar promoter som tillater dens ekspresjon ved aktivering med en bakterie, en cytokin (som respons til bakteriell infeksjon), et antibiotisk middel (som med tetracyklininduserbare promotersystemer (Paulus et al., J. Virol., 70, 62-67 (1996)) eller et kjemikalie (f.eks. toksinet selv). Den betinget replikerende vektoren vil således ikke bare selektivt formeres ved hjelp av "hjelpere" som respons til forekommende patogen eller toksin (som et resultat av aktivering av hjelperen) men også skille ut anti-patogen for anti-toksin antistoffer for å hemmme de patologiske effektene av tumorantigen, patogen eller kjemikalie (f.eks. toksin). Et hvilket som helst protein, faktor eller genetisk element som kan transkriberes inn i enten mRNA og/eller protein kan innsettes i en betinget replikerende vektor for å hemme patogen respons — i sammenheng med en "hjelper", som fremmer dens selektive formering og ekspresjon (selektiv fordi produktene av hjelperen er uttrykt betinget (f.eks. men ikke begrenset til, (a) et induserbart promotersystem ~ en faktor i en tumorcelle aktiverer produksjon av en hjelpefaktor, en toksin responsiv sekvens som uttrykker en hjelperfaktor, eller en cytokin responsiv promoter som induserer produksjon av en hjelperfaktor, (b) en hjelper RNA/protein/faktor blir selektivt stabilisert i visse celler og ikke i andre), og (c) indirekte induksjon av en tredje parts gen som påvirker hjelperviral proteinproduksjon, være anstand, målretting, struktur eller annen biofunksjon). Slike strategier kan bli anvendt i transgene planter og dyr for å beskytte mot patogenet. Slike strategier kan på tilsvarende måte bli anvendt i transgene systemer for å produsere heterologe proteiner/faktorer av verdi.

I en annen utførelsesform av fremgangsmåten i oppfinnelsen, kan en cellelinje utvikles for screening av et medikament/faktor for å bestemme f.eks. som en del av et protein/faktor er viktig for en spesiell funksjon. En vektor kan bli skapt ved å uttrykke en mutagenisert protein av interesse i en gitt cellelinje. RNA som koder for demutagenisert protein, blir imidlertid gjort resistent til ribozymer ved innsetting av stille muteringspunkter for eksempel. Vill-type proteinekspresjon blir imidlertid hemmet i cellelinjen. Vektorer som uttrykker et ribozym til proteinet som er interessant kan også bli konstruert slik at det uttrykker mutant testprotein. Når vektoren blir transdusert inn i cellene, blir de fleste native RNA som koder for det normale proteinet kløyvet, mens mutanttestproteinet blir uttrykt. Denne metoden ble anvendt med de nylig utviklede avleverings- og seleksjonsteknikkene som er en rask og kraftfull teknikk for å bestemme hvordan en gitt proteinfunksjon og hvordan en gitt faktor/medikament reagerer med proteinet. Det er også tallrike anvendelser av fremgangsmåten og vektoren i foreliggende oppfinnelse in vitro. F.eks. kan vektorene benyttes til å bestemme visse nyanser av viral replikasjon og ribozymfunksjon. Ribozym-inneholdende vektorer kan på tilsvarende måte anvendes som diagnostiske verktøy, f.eks. for å bestemme mutasjoner som er tilstede i syke celler, eller for å undersøke genetisk drift. Den forannevnte diskusjon er ikke på noen måte altomfattende med hensyn på anvendelse av foreliggende oppfinnelse.

Fordeler ved oppfinnelsen

Fordeler ved å anvende en crHIV strategi for genetisk terapeutisk behandling av AIDS og andre virus er betydelig. Problemet med målretting av vektoren av cellene infisert med HIV blir f.eks. løst. Etter in vivo transfeksjon av crHIV inn i infiserte CD4+ celler, blir crHIV pakket inn i etterkommende viruspartikler ved å anvende endogene infeksjonsholdige HIV kappeproteiner. crHIV RNA fester seg langs innsiden av etterkommende viruspartikler og infiserer celletyper som normalt er infiserbare med denne spesielle stamme av HIV, som produserer ikke-patogene viruspartikler. Dette innebærer vanskeligheter med målceller, slik som mikroglia av hjernen, som er et hovedreservoar for HIV infeksjon av sentralnervesystemet. Det antas å være lite toksisitet forbundet med crHIV vektorer som infiserer uinfiserte CD4+ celler, siden ingen virale proteiner blir kodet av crHIV vektorene. Resultatene av crHIV vektor kompetanse med vill-type HIV resulterer i produksjon av ikke-patogene partikler, og dette resulterer igjen i nedsatte virale belastninger. Nedsatt patogen HIV-1 belastninger kan ikke bare øke overlevelsestiden av infiserte individer, men kan også minske overføring til uinfiserte individer, siden crHIV partiklene også kan spre seg systematisk (dvs. som infeksjonsholdig HIV). Nedsatt patogen HIV-1 belastning i blodet kan være særlig viktig i gravide HIV-infiserte individer, siden produksjon av crHIV også kan minske overføring av HIV-1 fra den infiserte moren til deres foster in utero.

Plasmid DNA/hpidblandingen som kan benyttes for innføring av crHTV vektoren inn i vertscellene må være stabil og billig å produsere, for å unngå kostbare ex vivo strategier. Fremgangsmåten i oppfinnelsen er naturligvis fleksibel, så lenge den også benyttes for ex vivo genavlevering, skulle dette være ønskelig. Tilgjengelighet av liposom-formidlet måte åpner for mulighet for behandling av den generelle populasjon

~ hvilket ofte ikke er enkelt med nåværende genterapeutiske strategier. crHIV vektorer kan også bli fremstilt slik at de inneholder flere ribozymer, som kan lages til forskjellige mål på HIV-genomet. Dette reduserer mulighet for at infeksjonsholdig HIV kan mutere og komme seg unna effektene fra ani -HIV ribozymene. Den betinget replikerende komponente virusstrategien kan bli anvendt til å behandle andre virale infekjsoner, særlig de der viral turnover er høy.

Et særlig nyttig trekk hos crHIV vektorene er at de kan bli benyttet til å uttrykke genetiske antivirale midler, f.eks. et ribozym, post-transkripsjonalt. Infeksjon av uinfiserte celler med crHIV vektorer resulterer i lav toksisitet på grunn av lite ekspresjon foregår fra HIV lang-terminal gjentagelse (LTR) promoter i fravær av Tat-proteinet. Høye nivåer av crHTV-ekspresjon, og dens konsekvente antivirale aktivitet, forekommer bare når Tat-proteinet er tilveiebrakt ved komplementering med vill-type HIV. crHIV vektorene er således ikke utformet til å beskytte cellene med HIV-infeksjon, men for å senke samlet vill-type HIV viral belastning gjennom selektiv akkumulering av ikke-patogen crHIV partikler.

Selv om man ikke tilstreber og er bundet av noen spesiell teori vedrørende operasjonen eller funksjonering av oppfinnelsen, antas det at ribozymene kan bli benyttet slik det bekreftes i de følgende eksemplene for å skaffe tilveie crHIV genomer med en selektiv fordel på grunn av to nyttige egenskaper: (1) de har en høy grad av spesifisitet, og (2) de har en relativ effekt, avhengig av deres evne til å ko-lokalisere med mål RNA (Cech, Science, 236, 1532-1539 (1987)). Spesifisiteten av ribozymene blir gitt av deres spesifikke hybridisering til komplementære målsekvenser som inneholder XUY-sete. Ribozymer er relativt effektive på grunn av at de kløyver mål RNA med høy effekt bare når de effektivt ko-lokahseres med mål RNA. I en blandet HIV/crHTV infeksjon, må ko-lokalisenng av ribozym-inneholdende crHIV RNA med vill-type HIV RNA forekomme, siden HIV RNA genomer dimeriserer forut for pakking inn i etterfølgende viruspartikler. Kløyving av ikke-genomiske typer av vill-type HIV RNA, nødvendig for produksjon av virale proteiner, er sannsynligvis mindre effektiv enn den fra genomisk vill-type HIV RNA så lenge ikke-genomiske HIV RNA ikke dimeriserer. Det ble oppdaget i eksperimentene som her er beskrevet at den selektive fordelen som er gitt til crHIV RNA skyldes selektiv pakking av crHIV inn i virale partikler. Disse resultatene antyder at den mest effektive kløyving foregår intracellulært under dimeri sering, resulterer i selektiv destruksjon av vill-type HIV RNA av vertnuklease. Dette muliggjør preferansepakking av crHIV inn i virale partikler.

Anvendelse av crHIV vektorer for HIV terapi kan involvere ikke bare genomisk seleksjon av crHIV, men også cellulær seleksjon av celler som produserer crHIV partikler. Celler som ellers produserer vill-type HIV vil produsere vill-type HIV partikler ved en selektiv fordel i forhold til celler som produserer crHIV partikler, og vil raskt dominere. En selektiv fordel kan gis crHIV uttrykkende celler ved sette inn et gen i crHIV genomer (f.eks. multimedikament resistensgen) som gir crHIV uttrykkende celler

(i nærvær av medikament) med overlevelsesfordel i forhold til celler som uttrykker vill-type HIV. Under disse betingelser vil vill-type HlV-uttrykkende celler gradvis dø, men fremdeles produsere noe vill-type HIV, mens crHIV-uttrykkende celler som selektivt produserer crHIV overlever. Infeksjon av crHIV-inneholdende celler med gjenværende vill-type HIV vil resultere i ytterligere produksjon av crHIV inneholdende virale partikler. Et viralt genomisk shift kan resultere i kumulativ infeksjon av CD4+ celler

med crHIV genomer, for dermed å endre den virale balansen av verten fra patogen vill-type HIV til ikke-patogen crHIV genomet. En slik strategi kan resultere i klargjøring av vill-type HIV, med en gang balansen av HTV genomet selektivt skifter fra vill-type HIV til crHIV. Viral replikasjon avtar eventuelt, siden crHIV bare kan replikere i nærvær av vill-type HIV hjelpegenomer. Under slike gjensidig restriktive betingelser, kan det

derfor være mulig å fremstille crHIV vektorer som ikke bare minsker vill-type HIV virale belastninger, men klarerer også virus fra HlV-infisert vert.

Admini streringsmåter

Ifølge oppfinnelsen blir en vektor innført i en vertscelle som har behov for genterapi mot viral infeksjon som tidligere beskrevet. Innføringsmåter omfatter at man bringer en vert som har evne til å bli infisert med en virus i kontakt med en vektor ifølge oppfinnelsen. En slik kontakt omfatter fortrinnsvis en hvilken som helst måte som vektoren blir innført i vertscellen; fremgangsmåten er ikke avhengig av noen spesiell innføringsmåte og er ikke konstruert slik. Innføringsmåter er velkjente innenfor fagområdet, og blir også eksemplifisert her.

Innføringen kan bli gjennomført f.eks. enten in vitro (f.eks. i en ex vivo type metode av genterapi) eller in vivo, som også innbefatter anvendelse av elektroporering, transformasjon, transduksjon, konjugasjon eller triparenteral parring, transfeksjon, infeksjon, membransammensmelting med katoniske lipider, høy-hastighets-bombardering med DNA-belagte mikroprojektiler, inkubering med kalsiumfosfat-DNA precipitat, direkte mikroinjeksjon inn i enkle celler og lignende. Andre metoder er også tilgjengelig og er kjent innenfor fagområdet.

Vektorene eller ribozymene blir imidlertid fortrinnsvis innført ved hjelp av kationiske

lipider, f.eks. liposomer. Slike liposomer er kommersielt tilgjengelige (f.eks. lipofectin, lipofectamin og lignende, levert av Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Liposomer som har øket overføringsevne og/eller redusert kapasitet in vivo (som f.eks. som oppsummert PCT patentsøknad NO. WO 95/21259) kan benyttes i foreliggende

oppfinnelse. For liposomadministrering kan anbefalingene som er identifisert i PCT patentsøknad NO. WO 95/21259 bli fulgt. Med slik administrering blir formuleringen generelt tatt opp av hoveddelen av lymfocyttene i løpet av 8 timer ved 37°C, idet mer enn 50% av den injiserte dosen blir påvist i milten en time etter intravenøs administrering. Andre avleveringsbærere innbefatter hydrogeler og regulerte-firgjørings-polymerer.

Formen på vektoren som er innført i en vertscelle kan variere, avhengig delvis av om vektoren blir innført in vitro eller in vivo. Nukleinsyren kan f.eks. være lukket sirkulær, "nicked" eller lineænsert, avhengig om vektoren skal opprettholdes ekstragenomisk (dvs. som en autonom replikerende vektor), integrert som en provirus eller profag, forbigående transfektert, forbigående infisert som med anvendelse av en replikasjons-manglende eller betinget replikerende virus, eller stabilt innført i vertsgenomet gjennom dobbel eller enkel kryssover rekombinasjonshendelser.

Før innføring i vertscellen kan en vektor fra foreliggende oppfinnelse formuleres til forskjellige sammensetninger for anvendelse i terapeutiske og profylaktiske behandlingsmetoder. Spesielt kan vektoren bli laget til en farmasøytisk sammensetning i kombinasjon med passende farmasøytisk akseptable bærere eller fortynningsmidler, og bli formulert for enten humane eller veterinære anvendelser.

En sammensetning for anvendelse i fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, kan omfatte en eller flere av de forannevnte vektorene, fortrinnsvis i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer. Farmasøytisk akseptable bærere er velkjente for personer med kunnskap innenfor fagområdet, og det samme er egnede metoder for administrering. Valg av bærer vil bli bestemt, delvis av den spesielle vektor, så vel som av den spesielle metoden som ble anvendt til å administrere sammensetningen. En person med kunnskap innenfor fagområdet vil også erkjenne at forskjellige administreirngsveier av en sammensetning er tilgjengelig, og selv om mer enn en vei kan bli anvendt for administrering, kan en spesiell vei tilveiebringe en mer umiddelbart og mer effektiv reaksjon enn en annen vei. Det er således en lang rekke egnede formuleringer av sammensetningen i foreliggende oppfinnelse.

En sammensetning som er omfattet av en vektor av foreliggende oppfinnelse, alene eller i kombinasjon med andre antivirale forbindelser, kan lages til en formulering som er egnet for parenteral administrering, fortrinnsvis intraperitoneal administrering. En slik formulering kan innbefatte vandige og ikke-vandige, isotone sterile injeksjons-oppløsninger, som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske midler, og oppløsninger som gjør formuleringen isoton med blodet hos den tilsiktede mottaker, og de vandige og ikke-vandige sterile suspensjonene som kan innbefatte suspenderings-midler, stabilisatorer, tykningsmidler, stabilisatorer og preservativer. Formuleringene kan presenteres i enhetsdose eller multidoseforseglede beholdere, slik som ampuller og glass, og kan bli lagret i en frysetørket (lyofilisert) tilstand som bare krever tilsetning av steriltbærervann, f.eks. vann for injeksjoner, umiddelbart forut forbruk. Improviserte, injiserbare oppløsninger og suspensjoner kan bli fremstilt fra sterile pulvere, granuler og

tabletter som beskrevet her.

En formulering som er egnet for oral administrering kan bestå av flytende oppløsninger, slik som en effektiv mengde av forbindelsen oppløst i fortynningsmidlet, slik som vann, saltvann eller fruktjuice; kapsler, poser eller tabletter, hver inneholdende en forhåndsbestemt mengde av aktiv bestanddel, som fast eller som granuler; oppløsninger eller suspensjoner i en vandig væske; og olje-i-vann emulsjoner eller vann-i-oljeemulsjoner. Tablettformene kan innbefatte en eller flere av laktose, mannitol, maisstivelse, potetstivelse, mikrokrystallinsk cellulose, acacia, gelatin, kolloidal silisiumdioksid, kroscarmellose, natrium, talk, magnesiumstearat, stearinsyre og andre eksipienter, fargestoffer, fortynningsmidler, bufringsmidler, fuktningsmidler, preservativer, smaksmidler og farmakologisk kompatible bærere.

En aerosolformulering som er egnet for administrering via inhalering kan også fremstilles. Aerosolformuleringen kan bli anbrakt i et trykkpålagt akseptabelt drivmiddel, slik som diklordifluormetan, propan, nitrogen og lignende.

En formulering som er egnet for oral administrering kan innbefatte pastillformer, som kan omfatte den aktive bestanddelen i et smaksstoff, vanligvis sukrose og acacia eller tragakant; pastiller som omfatter den aktive bestanddelen i en inert base som gelatin og glyserin, eller sukrose og acacia; og munnvask som omfatter den aktive bestanddelen i en egnet flytende bærer; så vel som kremer, emulsjoner, geler og lignende som inneholder i tillegg til den aktive bestanddelen, slike bærere er kjent innen fagområdet.

En formulering som er egnet for topisk påføring kan være i form av kremer, salver eller lotioner.

En formulering for rektal administrering kan presenteres som en suppositor med en egnet base som omfatter f.eks. kokosmør eller et salicylat. En formulering som er egnet for vaginal administrering kan bli presentert som et pessar, tampong, krem, gel, pasta, skum eller sprayformel som inneholder i tillegg til den aktive bestanddelen, slike bærere som er kjent innenfor fagområdet å være passende. Den aktive bestanddelen kan på tilsvarende måte kombineres med et smøremiddel som et belegg eller en kondom.

Dose administrert til et dyr, særlig et menneske i sammenheng med foreliggende oppfinnelse bør være tilstrekkelig til å gjennomføre en effektiv respons i det infiserte individ i løpet av en rimelig tidsperiode. Dosen vil bli bestemt av tendens for den spesielle vektoren som benyttes for behandling, alvorlighet ved sykdomstilstand, såvel som kroppsvekt og alder hos det infiserte individ. Størrelsen av dosen vil også kunne bestemmes ved eksistens av negative sideeffekter som kan ledsages av anvendelse av den spesielle vektoren som benyttes. Det er alltid ønskelig, når det er mulig å beholde de negative sideeffektene på et minimum.

Doseringen kan være i enhetsdoseirngsform, slik som tablett eller kapsel. Begrepet "enhetsdoseringsform" slik det her blir anvendt refererer til fysisk adskilte enheter som er egnet som enhetsdoseringer for humane eller animalske subjekter, hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av en vektor, alene eller i kombinasjon med andre antivirale midler, beregnet i en mengde som er tilstrekkelig til å gi den ønskede effekten i forbindelse med et farmasøytisk akseptabelt fortynmngsmiddel, bærer eller transportør. Spesifikasjonene for enhetsdoseirngsformene fra foreliggende oppfinnelse avhenger av den spesielle forbindelsen eller forbindelsene som benyttes og effekten som skal bli oppnådd, så vel som farmakodynamikk forbundet med hver forbindelse hos verten. Dosen som skal administreres bør være en "antiviral effektiv mengde" eller en mengde som er nødvendig for å oppnå et "effektivt nivå" i den individuelle pasient.

Siden "effektivt nivå" ble anvendt som et foretrukket sluttpunkt for dosering, kan virkelig dose og skjema variere, avhengig av mellomindividuelle forskjeller i farmakokinetikk, medikamentfordeling og metabolisme. "Effektivt nivå" kan bli definert f.eks. som blod eller vevsnivå som er ønsket hos pasienten som tilsvarer en konsentrasjon på en eller flere vektor(er) ifølge oppfinnelsen, som hemmer en virus slik som HIV i en analyse som forutsier klinisk antiviralaktivitet av de kjemiske forbindelser. "Effektivt nivå" av forbindelsen i foreliggende oppfinnelse, kan også variere når sammensetningene av foreliggende oppfinnelse skal bli anvendt i kombinasjon med zidovudin eller andre kjente antivirale forbindelser eller kombinasjoner av disse.

En person med kunnskap innenfor fagområdet kan på enkelte måter bestemme passende dose, skjema og administreringsmetode for nøyaktig formulering av sammensetningen som ble anvendt, for å oppnå det ønskede "effektive nivå" hos den individuelle pasient. En person med kunnskap innenfor dette området kan også raskt bestemme og anvende en passende indikator på "effektivt nivå" av forbindelsen i foreliggende oppfinnelse ved en direkte (f.eks. analytisk kjemisk analyse) eller indirekte (f.eks. med surrogatindika-torer av viral infeksjon, slik som p24 eller revers transkriptase for behandling av AIDS eller ATDS-lignende sykdom) analyse av passende pasientprøver (f.eks. blod og/eller annet vev).

Med hensyn på å bestemme det effektive nivå hos en pasient for behandling av AIDS eller AIDS-lignende sykdom, er særlig egnede dyremodeller tilgjengelig og disse har blitt implementert for evaluering av in vivo effekt mot HIV av forskjellig genterapiprotokoller (Salver et al. (1993b), supra). Disse modellene innbefatter mus, aper og katter. Selv om disse dyrene ikke er naturlig utsatt for HIV-sykdom, kan kimære musemodeller (f.eks. SCID, bg/nu/xid, benmargablatert BALB/c) rekonstituert med humanperifer blodmononukleære celler (PBMCs), lymfenoder eller føtalt lever/tymysvev være infisert med HIV, og benyttet som modeller for HIV-patogenese og genterapi. Simian- immunsviktvirus (SIV)/apemodell kan på tilsvarende måte benyttes, og det samme kan felin-immunsviktvirus (FIV)/kattemodell.

Mengden av vektorer som er tilstrekkelige for å oppnå en vevskonsentrasjon av administrert ribozym (eller vektor) av fra 50 til ca 300 mg/kg kroppsvekt pr dag er generelt foretrukket, særlig fra ca 100 til ca 200 mg/kg kroppsvekt pr dag. I visse anvendelser, f.eks. topisk, okulær eller vaginale anvendelser, er doseringer flere ganger om dagen foretrukket. Antall doser vil variere avhengig av avleveringsmåter og den spesielle vektoren som ble administrert.

I behandling av noen virale infiserte individer, kan det være ønskelig å utnytte et "mega-doserings" system, der en stor dose av en vektor ble administrert, forbindelsen får anledning til å virke i noe tid, og deretter blir et egnet reagens administrert til individet for å innaktivere den aktive forbindelsen(e). I fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er behandling (dvs replikasjon av vektoren i konkurranse med viruset som blir behandlet) nødvendigvis begrenset. Når nivået f.eks. av HIV avtar, vil nivå av vektor avhengig av HIV for produksjon av viruspartikler også avta.

Den farmasøytiske sammensetning kan inneholde andre farmasøytiske midler, i kombinasjon med en vektor ifølge oppfinnelsen, når den blir anvendt til terapeutisk å behandle AIDS. Disse andre farmasøytiske midlene kan anvendes på deres tradisjonelle måte (dvs som midler til å behandle HIV-infeksjon), såvel som mer spesifikt i fremgangsmåten for seleksjon av crHIV-virus in vivo. Slik seleksjon som beskrevet her vil fremme betinget replikerende HIV-spredning, og tillate betinget replikerende HIV mer effektivt å konkurrere med vill-type HIV, som nødvendigvis vil begrense vill-type HIV patogenisitet. Det er innbefattet at et anti-retroviralt middel særlig kan benyttes, slik som fortrinnsvis zidovudin. Ytterligere representative eksempler på disse andre farmasøytiske midlene ble anvendt i tillegg til de som tidligere er beskrevet, innbefatter anti-virale forbindelser, immunmodulatorer, immunstimulanter, antibiotiske midler og andre midler og behandlingssystemer (inkludert de som er anerkjent som alternativ medisin) som kan benyttes til å behandle AIDS. Anti-virale forbindelser innbefattende men ikke begrenset til ddl, ddC, gancylklovir, fluorinert dideoksynukleotider, nonnukleoside analog-forbindelser slik som neverafin (Shih et al., PNAS. 88, 9878-9882 (1991)), TIBO-derivater som R82913 (White et al., Antiviral Research. 16.257-266 (1991)), og BI-RJ-70 (Shih et al-., Am. J. Med.. 90 (Suppl. 4A), 8S.17S (1991)). Immunmodulatorer og immunstimulanter innbefatter men er ikke begrenset til forskjellige interleukiner, CD4, cytokiner, antistoffpreparater, blodtransfusjoner og celletransfusjoner. Antibiotiske midler innbefatter men er ikke begrenset til anti-soppmidler, anti-bakterielle midler og anti-Pneumocystis carinii-midler.

Administrasjon av den virus-hemmende forbindelsen med andre anti-retrovirale midler og særlig med kjente RT-hemmere, slik som ddC, zidovudin, ddl, dd A eller andre hemmere som virker mot andre HIV-proteiner, slik som anti-TAT midler, vil generelt hemme de fleste eller alle replikative trinn av viral virussyklus. Doseringene av ddC og zidovudin anvendt i AJDs eller ARC pasienter har vært publisert. Et virusstatisk område av ddC er generelt mellom 0,05 \ jM og 1,0 uM. Et område på ca 0,005-0,25 mg/kg kroppsvekt er virusstatisk i de fleste pasienter. Doseringsområdene for oral administrering er noe bredere, f.eks. 0,001 til 0,25 mg/kg gitt i ett eller flere doseringer ved intervaller på 2, 4, 6, 8 og 12; etc, time. 0,01 mg/kg kroppsvekt ddC blir fortrinnsvis gitt hver åttende time. Når den gis i kombinert terapi, kan den andre anti-virale forbindelsen, f.eks bh gitt ved samme tidspunkt som en vektor ifølge oppfinnelsen, eller doseringen kan bli forskjøvet som ønsket. Vektoren kan også bli kombinert i en sammensetning. Dosene av hver kan være mindre, når den blir anvendt i kombinasjon enn når en av dem blir anvendt alene.

Eksempel 1.

Dette eksemplet beskriver konstruksjon av betinget replikasjonskompetente vektorer ifølge oppfinnelsen. Dette eksemplet beskriver særlig konstruksjon av betinget replikerende vektorer basert på HIV, dvs crHIV-vektorer.

En av de mest dominerende trekk ved HIV-1 patogenese er produksjon av genetiske varianter av virus. Den raske produksjon av HIV varianter in vivo viser at virus kan betraktes innenfor rammen av Darwinistisk genetisk modellering (se, f.eks. Coffin, Curr. Top Microbiol. Immunol.. 176.143-164 (1992); og Coffin, Science. 267.483-489

(1995)). Variantene er et resultat av egenskapene til HIV-1

reverstranskriptasemolekyler, som skaper mutasjoner i nylig transkriberte provirus fra viralt genomisk RNA. Under in vivo betingelser uten noen signifikante flaskehalser og mange replikative sykluser, vil derfor en vesentlig grad av genetisk variasjon forekomme med produksjon av mange virale varianter. Vill-type HIV dominerer fremdeles, siden under slike ubegrensede betingelser, har den høyeste selektive fordel. I nærvær av en hemmer, f.eks. zidovudin vil en viral variant bli valgt som gir en høyere selektiv fordel enn vill-type stammen, og som en konsekvens vil dominere (Coffin

(1992) og (1995), supra). Basert på dette tilveiebringer foreligger oppfinnelse en betinget replikerende viral vektorstrategi som innebærer ikke-patogen HIV-1 genomer med en selektiv fordel over patogen vill-type HIV-1.

Disse ikke-patogene betinget replikerende HTVer (crHIV) vektorene er defekte HIV som gjennomgår replikasjon og pakking bare i celler som er infisert med vill-type HIV. crHIV genomer konkurrerer med og senker den patogene vill-type HIV virale belastning. Effekt av nedsatt vill-type HVI virale belastninger i en infisert vert vil føre til en øket forventet levetid. Det skulle også minske evnen til den infiserte verten å overføre vill-type HIV til uinfiserte individer. For vellykket konkurranse av crHIVet med vill-type HIV-1, synes to faktorer å være viktige: (1) en selektiv fordel av crHIV genomer over vill-type HIV genomer, og (2) en selektiv fordel av crHIV-uttrykkende celler over celleutrykkende vill-type HIV (dvs en selektiv fordel for produksjon av crHIV viruspartikler fra crHIV-uttrykkende celler over celler som uttrykker vill-type

HIV).

CrHIV vektorene replikerer betinget p.g.a. det faktum at de inneholder sekvensene som er nødvendig for RNA ekspresjon, dimerisering og pakking, men uttrykker ikke funksjonelle HIV-1 proteiner (dvs vill-type). En selektiv fordel ble gitt crHIV vektorene ved innsetning av en ribozymkassett som kløyver i U5 region av vill-type HIV genomet, men ikke crHIV U5 RNA.

Ribozymer som er tilstede i vektorene kløyver ikke crHIV RNA fordi U5 region av crHIV RNA har blitt modifisert ved konservert basesubstitusjon (basesubstitusjon som er tilstede i andre HIV stammer) for å hindre ribozymene mot effektiv binding og kløyving av disse setene. CrHIV er ikke-patogene fordi de ikke koder for proteiner som antas å være ansvarlige for CD4+ celledød. Når HIV-infiserte celler (som har blitt overført med crHIV vektoren) blir aktivert, har cellene evne til å komplementere crHIV genomiske mangler, og resulterer i produksjon av crHIV etterkommende viruspartikler.

CrHIV genomer ble generelt konstruert fra full-lengde infeksjonsholdig HIV klon,

pNL4-3 (Adachi et al., J. Virol.. 59. 284-291 (1986)). Alle kloningsreaksjoner og DNA, RNA og proteinmanipuleringer ble gjennomført ved å anvende metoder som er velkjent innenfor fagområdet, og som har blitt beskrevet innfor fagområdet, f.eks. Maniatis et al., Molecular Clonin<g>: A Laboratorv Manual. 2. utg. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY

(1982)). Enzymer og reagenser benyttet i disse reaksjonene ble oppnådd fra kommersielle leverandører (f.eks. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA; og Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) og ble anvendt i henhold til produsentens anbefalinger. Vektoropprettholdelse og formering ble gjort ved å anvende teknikker som er vanlig kjent, og som har blitt beskrevet tidligere (f.eks. Dropulic' et al. (1992), over; og Dropulic' et al. (1993), over).

PNL4-3 ble kløyvet med enzymene Pst I (som kløyver i gag, ved ca posisjon +100 fra start av transkripsjon) og Xho I (som kløyver i nef, ved ca posisjon +8400 fra transkripsjonsstart), og en polyhnker inneholdende hensiktsmessige restriksjonsseter ble innsatt. Et 0,86 g Bgl II og Barn HI fragment inneholdende rev responsivt element (RRE) ble klonet inn i et Barn HI sete som er tilstede i polylinkeren. Disse manipulasjonene resulterte i delesjon av HIV vill-type genom fra gag kodende region til U5 kodende region (dvs således utelater nef gen). Mens vektorene har evnen til å produsere et avkuttet gag transkript, blir et full-lengde funksjonelt gag protein ikke produsert av vektoren. Fordi vill-type gag funksjoner er nødvendig ifølge oppfinnelsen, kan gag sekvensene bli mutert for å hindre gag protein mot å bli translatert.

En ribozymkassett inneholdende enten enkle eller multiple ribozymer som blir beskrevet her ble satt inn i et Sal I sete nedstrøms for Barn HI sete. For å gjennomføre dette ble komplementære deoksyoligonukleotoder som koder for ribozymsekvensene syntetisert, herdet og deretter klonet inn i Sal I setet. Ribozymene som benyttes for konstruksjon av crHIv vektorene var hammerhodeirbozymer. Disse ribozymene inneholdt en katalytisk domene omfattet av 22 basepar, og to hybridiseirngsdomener omfattet av 9 basepar hver. Ribozymene ble målrettet enten til +115 eller +133 sete (dvs tilsvarende antall basepar nedstrøms fra start av transkripsjon) av U5 RNA sekvensen. Hybndiseringsdomenene og katalytisk domene (understreket) av ribozymer målrettet til

-115 sete og +133 sete er som følger:

Ribozymkassetten var omfattet av enten et enkelt, dobbelt eller trippel ribozym(er) plassert i tandem. Vektorene inneholdende enten enkel (dvs "crHIV-1.1" vektor, Figur IB) eller trippel (dvs "crHIV-1-1" vektor, Figur 1E) ribozymer ble målrettet til samme sete av U5 HIV RNA, ved posison +115. Vektorer inneholdende doble ribozymer ble målrettet enten til samme sete ved posisjon +115 (dvs "crHIV-1-11" vektor, Figur 1C), eller til forskjellige seter i posisjoner +115 og +133 av U5 HIV RNA; crHIV-1.12 (dvs "crHTV-1.12" vektor, Figur ID). Disse vektorene blir referert til her generelt som "crHIV" vektorer.

For å fullføre konstruksjonen av vektorene, ble crHIV vektorene gjort resistente til ribozymkløyving (dvs i deres manifestasjon som RNA) ved mutering av et sete gjenkjent av hammerhoderibozymer som forekommer i U5 region av crHIV genom. For åutføre dette ble en dobbel-trådet oligonukleotid (dvs,

AGTGGCGCC [SEK ID NO: 14]) som inneholder basesubstitusjoner vist i Figur 2 [SEQ ID NO:2] anvendt for å innføre modifiserte seter inn i vektoren. Spesifikt ble basesubstitusjonene konstruert inn i ribozymhybridisering og kløyvingssetene ved basepar 115 og 133. Som illustrert i Figur 2; ble mutasjonene innført i basepar 113,114, 132, 134 og 142. Disse setene kan blir modifisert til å omfatte en hvilken som helst mutasjon (dvs, GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, der N kan være et hvilket som helst nukleotid [SEQ ID NO: 15]. Sekvensene blir imidlertid fortrinnsvis mutert slik at det for eksempel er en G til A substitusjon i sete +113 (dvs slik at sekvensen omfatterGTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC [SEQ JD NO: 16]), en U til C (dvs T på basis av DNA sekvensen) substitusjon ved sete +114, [SEQ JD NO:6] en U til C substitusjon (dvs T på basis av DNA sekvensen i sete +132 [SEQ JD NO:7], en A til G substitusjon i sete +134 (dvs slik at sekvensen omfatter

GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC [SEQ JD NO: 17] og

en U til A substitusjon (dvs T på basis av DNA sekvensen) i sete +142 (dvs slik at sekvensen omfatter GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAATAGAGAAC [SEQ JD NO: 18]), hvilke mutasjoner kan enten gjøres alene, eller i kombinasjon. I fravær av andre U5 mutasjoner, vil U (dvs T på basis av DNA sekvensen) til C substitusjon i sete +114 [SEQ ID NO: 6] og/eller sete + 132 [SEQ JD NO:7] i crHIV U5 RNA forhindre spalting av ribozymer (Uhlenbech (1987). Den innsatte basesubstitusjonene er tilstede i forskjellige andre stammer av HIV (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), som viser at disse substitusjonene ikke senker den replikative evnen til HIV genomet.

Fremgangsmåten som her er angitt kan benyttes for å konstruere andre betinget replikerende vektorer, f.eks. som omfattet av forskjellige virale genomer (f.eks. forskjellige RNA virus), eller omfattet av forskjellige genetiske anti-virale midler. En betinget replikerende vektor kan videre bli modifisert til å gi til en vertscelle, i hvilken vektoren er innført, en selektiv fordel over en vertscelle som inneholder vill-type virus. En slik vektor kan f.eks. bh modifisert for ytterligere å kode for multimedikamentresistens, eller en mutert protease eller revers transkriptase.

Eksempel 2.

Dette eksempel beskriver resistens til ribozymkløyving av betinget replikerende vektorer, og særlig crHIV vektorer.

For å bekrefte resistens til ribozymkløyving av crHIV vektorene, ble in vitro transkripsjon gjennomført. For å utføre dette ble ribozymsekvenser klonet inn i Xho I sete av pBluiscript KSI (Stratagene, La Jolla, CA). Et 021 kilobasepar (kg) Bgl U fragment inneholdende den muterte chrHIV U5 regionen ble på tilsvarende måte snittet ut fra crHIV vektoren og innsatt i Barn HI sete av pBluescript KSH Resultrende modifiserte pBluescript KSJI vektorer ble lineærisert med Bss HJI forut for in vitro transkripsjon. Et tilsvarende plasmid som uttrykker vill-type HIV U5 RNA (beskrevet i Myers et al (1994), over) ble benyttet som en kontroll. Den var lineærisert med Eco RI forut for in vitro transkripsjon.

Radiomerkede U5 HIV RNA og ribozym RNA ble produsert ved in vitro transkripsjon av vektorene, som tidligere beskrevet (Dropulic' et al- (1992), over). Radiomerkede transkriptorer ble inkubert sammen (ved et mål til ribozymmolart forhold på 1:2) i IX transkripsjonsbuffer inneholdende 40 MM TrisHCl, pH 7,5, 6 mM MgCk, 2mM Spermidine og 10 mM NaCl. Prøvene ble oppvarmet til 65°C og deretter avkjølt til 37°C i 5 minutter forut for tilsetning av stoppbufferoppløsning inneholdende 95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% bromfenol blå og 0,05% xylen cyanol FF. Produktene ble deretter løst ved denaturering av polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), og detektert ved autoradiografi.

Slik man kan se i Figur 3, når vill-type U5-HIV RNA (Figur 3, brønn 1) ble inkubert med et transkript inneholdende et enkelt ribozym i sete +115 (Figur 3, brønn 2), ble det rask observert kløyving (Figur 3, brønn 3). Slik kløyving resulterer i produktene Pl og P2. Kløyving kan også sees når vill-type HIV RNA ble inkubert med RNA inneholdende doble ribozymer til en av de samme setene (Figur 3, brønn 4 og 5), eller til forskjellige seter (Figur 3, brønn 6 og 7). Når et ribozym-inneholdende transkript rettet til to forskjellige seter ble inkubert med vill-type HIV RNA, ble produktene Pl, P2 og P3 produsert. P3 er resultat av kløyving i +133 sete.

Som sammenligning når modifisert U5-ineholdende crHIV RNA (Figur 3, brønn 1) ble inkubert med enten en enkel ribozym rettet til +115 sete, eller dobbel ribozym rettet til enten +115 sete eller +133 sete, ble det ikke påvist kløyvingsproduktet (Figur 3, brønner 10, 12 og 14). Disse resultatene bekrefter at crHIV RNA således er resistente mot nbozymkkløyving, mens vill-type HIV-U5 RNA ble kløyvet av anti-U5 ribozymer. Resultatene bekrefter at tilnærmelsen i foreliggende oppfinnelse kan benyttes for å gi betinget replikerende vektorer (inkludert vektorer forskjellig fra crHIV vektorer) en selektiv fordel for replikasjon når de blir innført i en vertscelle sammenlignet med en vill-type stamme av virus.

Eksempel 3.

Dette eksemplet beskriver evnen til ribozym-inneholdende betinget replikerende vektorer å kløyve vill-type viral RNA intracellulært. Særlig beskriver dette eksemplet evne til crHIV vektorer å kløyve vill-type HIV RNA intracellulært.

Effektiviteten av crHIV vektor-formidlet hemming av vill-type HIV ble testet ved ko-transfektering av genomer inn i Jurkat celler. Transfeksjon ble gjennomført ved vasking av ca 106 Jurkat celler i Opti-MEM medium (Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) og deretter ko-transfektering av cellene med ca 0,6 p-g vill-type HIV DNA (dvs pNL4-3) og ca 1,8 ug crHIV DNA. Et molart forhold av vill-type HIV til crHIV provirus på ca 1:3 ble anvendt for å sikre at alle cellene transfektert med vill-type HIV også inneholdt crHIV provirus. DNA ble blandet i lipofektinoppløsning (Life Technologies) i 30 minutter og deretter inkubert med Jurkat celler i ca 3 til 6 timer, og etter dette ble komplett RPMI1640 medium inneholdende 10% fetalt bovinserum (FBS) tilsatt. Virusinneholdende supernatanter ble høstet hver 2 til 4 dag, og virusnivåer ble analysert ved revers transkriptaseaktivitet i cellesupernatanter, som tidligere beskrevet (Dropulic' et al (1992), over).

Effekt av crHIV genomer på vill-type HIV replikasjon er vist i Figur 4. Når vill-type HIV ble ko-transfektert med crHIV-1.1, ble viral vekst forsinket (Figur 4, åpne bokser) relativt til celle ko-transfektert med vill-type HIV og en kontrollvirus (Firgur 4, fylte bokser), men ble ikke hemmet. Siden anti-U5 ribozymer kan hemme HIV replikasjon in vivo under ko-lokaliserte betingelser (f.eks. Dropulic' et al. (1992), over), kunne viral vekst sees å være et resultat av enten: (a) preferansepakking for vill-type HIV RNA inn i etterkommende viruspartikler, (b) produksjon av vill-type HIV RNA som er resistent til ribozymkløyving, eller (c) en akkumulering av ikke funksjonelle ribozymer i crHIV RNA. Egenskapen til "rømt" viral vekst ble testet med ko-transfekterende vill-type HIV med crHIV vektorer som inneholder doble ribozymer. Dersom preferansepakking av vill-type HIV er ansvarlig for viral vekst, vil kulturer inneholdende doble ribozym crHIV ha lignende vekstkinetikk som kulturer som inneholder enkle ribozym crHIV. Dersom imidlertid viral vekst er resultat av vill-type HIV RNA som har blitt resistent til ribozymvirkning (dvs som et resultat av viral revers transkriptaseutroskap), da vil kinetikken til viral vekst vise en større forsinkelse for kulturer som inneholder crHIV-1.12 (dvs rettet mot to virale seter) sammenlignet med kulturer inneholdende crHIV-1.11 (dvs rettet mot et enkelt viralt sete). Dersom man alternativt kan se en forsinkelse i viral vekst som har vært sammenlignbar med kulturer inneholdende forskjellige dobbelte ribozym-inneholdende crHIV, vil dette antyde at en andel av enkelt uttrykte ribozymer er ikke-funksjonelle in vivo.

Slik man kan se i Figur 4 viste kulturer som inneholder crHIV-1.11 (Figur 4, åpne kryssede bokser) eller crHIV-1.12 (Figur 4, stiplede bokser) viste en høyere forsinkelse i igangsetting av viral vekst enn crHIV-1.1, som inneholdt et enkelt transkribert ribozym (Figur 4, åpne bokser). Forsinkelsen med igangsetting av viral vekst mellom crHIV-1.11 og crHIV-1.12 var lignende, og dette viser korrigering av tredje muligheter, dvs at enkelt transkriberte ribozymer er kinetisk mindre effektive i kløyvingsmål RNA enn doble ribozymer. Dette antyder at en viss andel av intracellulære transkribente ribozymer kan dannes i en ikke-funksjonell, mulig feilfoldet, konformasjon, siden ko-transfeksjons-eksperimentet ble gjennomført i et molart overskudd av ribozym-inneholdende crHIV genomer.

Evnen til multiple ribozymer å bedre denne kinetiske begrensningen ved tilveiebringelse av en større sannsynlighet for funksjonelle ribozymer å assosiere med vill-type HIV RNA ble utforsket. For disse eksperimenter ble Jurkat celler ko-transfektert med vill-type HIV og crHIV-1.111, som inneholder et trippelt ribozym til sete +115. Slik man kan fra Figur 5 (stiplede bokser), er det ingen evidens på viral vekst ved anvendelse av et trippel ripozym, selv etter 22 dager i kultur. Disse resultatene er særlig signifikante i lys av det faktum at normale primære T-celler ofte dør kort etter (dvs ca en uke) etter infeksjon med HIV.

Disse resultatene bekrefter at ribozym-inneholdende betinget replikerende vektorer, slik som crHIV vektorene og særlig de som inneholder multiple ribozymer, kan bli benyttet for å konkurere innenfra cellulært med et vill-type viralt genom slik som HIV.

Eksempel 4.

Dette eksempler beskriver en undersøkelse av mekanismen som er underliggende for evnen til ribozym-inneholdende betinget replikerende vektorer, særlig crHIV vektorer til å kløyve vill-type viral RNA intracellulært.

For disse eksperimenter blir cellesupernatant RNA fra vill-type HIV og crHIV-1.111 ko-transfekterte kulturer undersøkt ved anvendelse av revers transkriptasepolymerase-kjedereaksjon (RT-PCR), som her blir beskrevet. RT-PCR ble utført for å anvende primere som er vist i Figurene 6A-C. Ribozym RNA ble detektert ved å anvende primere RI og R2, vill-type HIV RNA ble detektert ved å anvende primere VI og V3, og crHIV RNA ble detektert ved å anvende primere V2 og V3. Primere RI

(TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG [SEQ ID NO:8] og R2

(TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC [SEQ ID NO:9] omfatter hver et Sal I restriksjonssete, og amplifiserer anti-U5 ribozym RNA ved binding til ribozym-hybridiseringssekvenser. I crHIV-1.11 uttrykkende celler enkle, doble eller triple ribozym amplifiseringsprodukter kan sees. Primere VI

(GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCC [SEQ ID NO:10])og V2

(GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG [SEQ ID NO:l 1]) omfatter hver Barn HI eller Hin dUI restriksjonsseter, og amplifiserer vill-type HIV RNA. Sammen med forannevnte VI primer, omfatter V3

(CGGATCCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG [SEQ ID NO: 12])

primer Barn HI og andre restriksjonsseter. Dette primersettet forsterkes i crHIV RNA fra en crHTV-spesifik polylinkersekvens.

For å gjennomføre RT-PCR, ble virus og intracellulær RNA isolert ved å anvende Trizol™ (Life Technologies). Intracellulær viral RNA ble isolert direkte fra mikrosentirfugerte cellepelleter. Virus RNA ble isolert fra dyrkningssupernatanter som først ble klargjor for celler og debris ved mikrosentirfugering av 12.000 x g i 5 minutter. Tirzol™ ble tilsatt de cellefrie supernatantene, og blandinger ble inkubert i 5 minutter forut for tilsetning av kloroform for faseseparasjon. Den vandige fasen ble overført til et friskt rør, og RNA ble utfelt med isopropanol ved å anvende glykogen. Etter rekonstituering av RNA pellet, ble viral RNA revers-transkribert og deretter forsterket ved hjelp av PCR ved å anvende radiomerkede primere.

Revers-transkripsjon ble gjennomført i en time ved 42°C i første-tråd buffere inneholdende 50 mM Tns-HCl, pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM dNTPs, og 20 enheter (U) RNase hemmer, til hvilket 25 U av MuLV revers-transkriptase ble tilsatt. Etter revers-transkripsjon var fullført ble revers-transkriptase-varme inaktivert ved 65°C i 10 miutter. Hele blandingen ble deretter tilsatt direkte til PCR buffer for å omfatte en blanding inneholdende en sluttkonsentrasjon på 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1 og 1,5 mM MgCl2. Blandingen ble forsterket i 30 sykluser ved å anvende 2,5 TJ av Taq enzym. Radiomerkede PCR produkter ble deretter løst ved denaturerende PAGE, og påvist ved autoradiografi.

Slik man kan se i Figur 7 (brønn 4), eksisterer crHIV-1.11 ribozym rNA i supernatantene av cellene mer enn tyve dager etter ko-transfeksjon med vill-type HIV-1 og crHIV-1.11 provirale genomer. Dette fremgår tydelig ved eksistens av enkle, doble eller triple ribozym RNA PCR produkter. Til sammenligning kan man ikke se slike produkter i virus produsert av kontroll vill-type, HTV-transfekterte kulturer (brønn 2). Under denne perioden syntes cellene å være normale, uten noen tilsynelatende tegn på crHIV-indusert cytotoksisitet. Dette bekrefter at crHIV er pakket i urale partikler selv om ingen revers transkriptaseaktivitet ble observert. Dette viser at crHIV kan bli komplementert intracellulært med HIV genfunksjoner.

Disse resultatene viser at crHIV hemmer vill-type HIV replikasjon ved hemming av vill-type HIV spredning. Resultatet viser videre at andre betinget replikerende vektorer, f.eks. andre virale vektorer og/eller vektorer som inneholder andre genetiske antiviraler kan på tilsvarende måte benyttes til å hemme vill-type viral replikasjon og spredning.

Eksempel 5.

Dette eksemplet beskriver en ytterligere undersøkelse av mekanismen som er underliggende for evnen til ribozym-inneholdende, betinget replikerende vektorer, særlig crHIV vektorer, til å kløyve vill-type, viral RNA intracellulært.

En mulig mekanisme er at både vill-type HIV og crHIV RNA er pakket inn i etterkommende viruspartikler, og effektivt kløyving forekommer i dette lille virale volumet på grunn av ko-lokalisering av ribozym og mål RNA. Alternativt kan selektiv pakking av crHIV RNA inn i etterkommende viruspartikler forekomme, fordi kløyving av vill-type HIV RNA hovedsakelig forekommer intracellulært, og ikke i HIV virus. Disse mekanismene er her undersøkt. Måter der crHIV-1.111 hemmet vill-type HIV spredning ble undersøkt ved RT-PCR av virus- og celle-forbundet viral RNA, i cellekulturer transfektert med vill-type HIV alene (Figur 8, brønner 2 og 6), eller ko-transfektert vill-type HIV og crHIV-1.111 (Figur 8, brønn4og 8). CrHIV. 1.111 RNA var utelukkende tilstede i etterkommende viruspartikler produsert etter ko-transfeksjon (Figur 8, brønn 4). Til sammenligning produserte kontroll, vill-type, HlV-transfekterte kulturer viruspartikler som bare inneholdt vill-type HIV RNA (Figur 8, brønn 2). Både vill-type HIV og crHIV-1.111 RNA var intracellulært tydelig i ko-transfekterte kulturer (Figur 8, brønn 8). Selv om både vill-type HIV og crHIV RNA derfor blir syntetisert intra-cellulært, blir crHIV RNA selektivt pakket i etterfølgende viruspartikler. Dette antyder at crHIV-1.111 hemmet vill-type HIV spredning ved selektiv kløyving av genomisk vill-type HIV RNA forut for innkapsling, mens den tillot noe sub-genomisk vill-type RNA å bli translatert inn i proteiner for virusproduksjon.

For å teste om genomisk vill-type RNA selektivt blir kløyvet av crHIV RNA, ble typene av intracellulær RNA tilstede i Jurkat cellekulturer oppnådd ca 20 dager etter ko-transfeksjon undersøkt ved Northern hybridisering. Proben som ble benyttet for Northern blot-analyse, som angitt i Figur 6 ble isolert fra en 0,21 kg Bgl JI fragment fra U5 region av pNL4-3.

Resultatene av disse eksperimentene er vist i Figur 9. Kulturer transfektert med vill-type HIV utvikler alle vill-type HIV RNA arter, dvs genomisk og subgenomiske RNA arter (Figur 9, brønn 1). Sammenlignet med dette vil crHIV-1.111 ko-transfekterte kulturer ikke uttrykke signifikante mengder av genomisk (9,7 kg), vill-type HIV RNA (Figur 9, brønn 2). RNA med lav molekylvekt (reflekterer tilstedeværelse av subgenomisk vill-type HIV RNA) ble observert i ko-transfekterte kulturer (Figure 9, brønn2). HVI RNA smøring i disse prøvene viser at noe nedbrutt genomisk HIV RNA kan være tilstede i disse lavmolekylvekts RNA. Til sammenligning skyldes smøring av vill-type HIV RNA fra kontroll, vill-type HIV celler (Figur9, brønn 1) RNA nedbryting som foregår fra signifikant CPE observert ved sent trinn av HIV infeksjon.

Disse resultatene bekrefter at genomisk, vill-type HIV RNA selektivt blir kløyvet og nedbrutt i celler som inneholder vill-type HIV og crHIV-1.111 genomer, og tillater selektiv crHIV RNA pakking i viruspartikler. Disse resultatene indikerer videre at metoden kan på tilsvarende måte bli benyttet med andre virus, særlig med andre RNA virus.

Eksempel 6.

Dette eksemplet beskriver en undersøkelse av evnene til ribozym-inneholdende, betinget replikerende vektorer, særlig crHIV vektorer, til å gjennomgå komplett viral replikativ syklus i nærvær av vill-type hjelpervirus.

For å bekrefte at crHIV genomer gjennomgår komplett viral replikativ syklus i nærvær

av en hjelper vill-type HIV genom, ble produksjon av viruspartikler inneholdende crHIV genomer undersøkt under flere betingelser. Først ble produksjon av virale partikler som inneholder crHIV genomer undersøkt i aktiverte ACH2 celler (AJDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland). Disse cellene omfatter en latent HIV-1 infisert

cellelinje. Deretter ble evnen til en hvilken som helst crHIV partikkel avledet fra disse kulturene til å infisere uinfiserte Jurkat celler og produsere crHIV DNA undersøkt.

For disse eksperimentene ble ca IO<6> ACH2 celler transfektert med ca 2,5 fag av vektor DNA. Cellene ble stimulert med 50 nM 12-O-tetradekanoylforbol 13-acetat (TPA) ca 24 timer etter transfeksjon. RNA ble isolert fra cellesupernatanter ca 72 timer etter transfeksjon. Rt-PCR ble gjennomført ved å anvene RI og R2 primere som beskrevet i eksempel 4. Slik man kan se i Figur 10A ble crHIV ribozym RNA detektert i virus produsert av aktiverte ACH2 celler etter transfeksjon med crHIV-1.11 (brønn 4), men ikke etter transfeksjon med pGEM 3Z kontrollplasmid (Promega, Madison, WI) (brønn 2). Transfeksjon av crHIV vektorer inn i infiserte CD4+ celler resulterer i produksjon av virale partikler som inneholder crHTV RNA.

Evnen til crHIV virus avledet fra disse kulturene å infisere uinfiserte Jurkat celler og produsere crHIV provirus ble undersøkt deretter. Slik provirus ble påvist ved isolering av cellulær DNA ved å anvende Trizol<IM>, kløyving av DNA med Eco RI, og deretter forsterker ribozymal DNA med PCR, ved å anvende RI og R2 primere som beskrevet i Eksempel 4. Figur 1 OB illustrerer produksjon av crHIV DNA i Jurkat celler etter infeksjon av cellesupernatanter avledet fra crHIV-transfektert ACH2 celler. I dette tilfellet ble spesifik amplifisering av crHIV-1.11 ribozymal DNA sett (Figur 10B, brønn 2). Sammenlignet med dette viste celle infisert med stimulerte ACH2 cellesupernatanter alene (dvs i fravær av enhver infeksjon av ACH2 celler med crHIV-1.111) ingen ribozymal DNA produkter (Figur 10C, brønn 1).

Siden crHIV vektorer bare sprer seg i nærvær av vill-type hjelper HIV genomer, ble evnen til uinfiserte celler som inneholder crHIV genomer som skal bli reddet etter infeksjon med vill-type HIV undersøkt. Disse eksperimentene ble gjennomført ved først å transfektere celler med crHIV-1.11 (dvs som representanter på crHIV vektorer), og deretter superinfisert med vill-type HIV (dvs pNL4-3). Ca 106 Jurkat celler ble transfektert med ca 2,5 fxg av crHIV DNA. Cellene fikk anledning til å vokse i ca 72 timer forut for infeksjon med vill-type HIV forrådsvirus. CrHIV-1.11 transfekterte Jurkat celler ble inkubert med forråds pNL4.3 (2 x 105 TCJD50 enheter pr 106 celler) i ca 2 timer ved 37°C, vasket tre ganger i Opti-MEM® I redusert serummedium, og deretter suspendert på nytt i komplett medium (RPMI 1640 med 10% FBS). RNA ble isolert fra cellesupernatanter som beskrevet i Eksempel 4 ca 5 dager etter infeksjon. For TCID50 analyse, ble supernatanter inneholdende HIV pletert ut på 96-brønners plater med 5-gangers begrenset fortynning. Ca IO<4> MT4 celler (AIDS Regent Reference Program, Rockville, Maryland; and Harada et al., Science. 229. 563-566 (195)) ble tilsatt til de fortynnede virale suspensjonene og de resulterende suspensjonene ble inkubert i 7 dager inntil fullstendig viral vekst hadde forekommet. MT4 celler er modifiserte T-celler som inneholder Tax-genet fra HTLV-1, som er et transaktivatorgen som er analogt til Tat i HIV-1. Supernatantene ble deretter analysert for revers transkriptaseaktivitet og vurdert som tidligere beskrevet (Dropulic' et al. (1992), over). Vevsdyrkingsinfeksjons-holdige doser (TCID5) ble bestemt ved metoden til Reed og Muench ( In: Tech, in HIV Res.. Johnson et al., eds., Stockton Press, 71-76 (1990)).

Superinfeksjon av crHTV-transfekterte Jurkat celler med vill-type HIV resulterte i crHIV genomer som blir reddet inn i virale partikler (Figur 10C, brønn 4). CrHIV genomene blir pakket 1 virale partikler etter superinfeksjon med vill-type HIV. Under denne perioden syntes cellene å være normale, uten noen signifikante tegn på cytotoksisitet.

Disse resultatene bekrefter at crHIV genomer har evnen til å gjennomgå full replekativ syklus etter komplemetering med vill-type HIV hjelpervirus. Disse resultatene bekrefter også at andre virale genomer sannsynligvis har evnen til å gjennomgå full replikativ syklus etter komplementering med tilsvarende vill-type virus.

Eksempel 7.

Dette eksemplet beskriver egenskapene til viral vekst som følge av unnsluppede "escaped" virus, rapportert i de tidligere eksemplene.

Egenskapene ved viral vekst fra kulturer transfektert med vill-type HIV, eller ko-transfektert med vill-type HIV og crHJV-1.11, ble undersøkt ved analysering av virus RNA ved å anvende RT-PCR som tidligere beskrevet. Virus produsert av kulturer i tidligere trinn av viral vekst (dvs vill-type HIV transfektert kultur ved dag +11, crHTV-1.11 ko-transfektert kultur ved dag +19) inneholdt dominerende crHIV RNA (Figur 11; vill-type HIV transfektert kultur, brønn 2, crHIV-1.11 ko-transfektert kultur, brønn 4). Sammenlignet med dette inneholdt kulturer fra senere trinn av forskjellig vekst (dvs vill-type HIV transfektert kultur ved dag +17, crHIV-1.11 ko-transfektert kultur ved dag +23) hovedsakelig vill-type HIV RNA (Figur 11; vill-type HIV transfektert kultur, brønn 6, crHIV-1.11 ko-transfektert kultur, brønn 8). Dersom viral vekst fra celler ko-transfektert med vill-type HIV og crHIV-1.11 provirus (Figur 11, brønner 4 og 8) opphørte å resultere fra vekst fra vill-type HIV som var reddet fra intracellulær ribozym restriksjon. CrHIV genomer omfattet fremdeles en betydelig mengde av total HIV genomer selv i kulturer ved senere trinn av viral vekst (Figur 11, brønner 4 og 8) Dette viser at selv om vill-type HIV genomer dominerte, var ikke desto mindre crHIV genomer, spredt gjennom kulturen, til tross for en lavere effekt enn vill-type HIV genomene.

Dette bekrefter at crHIV vektorer, såvel som ytterligere betinget replikerende vektorer, kan effektivt konkurrere med vill-type virale genomer for viral replikasjon.

Eksempel 8.

Effekt av crHIV RNA pakking inn i viruspartikler under viralvekst hvor virus unnslipper, ble studert ved å måle infeksjonsholdig vill-type HIV titere. Begrenset fortynning av TCID50 analyser (som beskrevet i Eksempel 6) ble gjennomført på viral supernatanter fra kulturer ved eksponensielt trinn av viral vekst (dvs vill-type HIV kulturer ved dag +14, crHIV-1.1 kulturer ved dag +16, crHIV-1.11 eller crHIV-1.12 kulturer ved dag +20). Prøvene ble normalisert forut for analysering ved å anvende revers transkriptaseaktivitet. Supernatanter fra vill-type HIV, crHIV-1.1, crHIV-1.11 og crHIV-1.12 kulturer hadde infeksjonsdoser på henholdsvis 1,3 x 104 TQD5o/ml, 5,4 x 103 TCIDso/ml, 3,8 x 103 TCID5o/ml. Pakking av crHIV RNA inn i viruspartikler under redningsviral vekst resulterer i nedgang i antall infeksjons-vill-type HIV partikler som blir fremstilt.

Det ble ikke undersøkt om nedgang i infeksjons-vill-type HIV titer var et resultat av kløyving av vill-type HIV RNA med de reddede viruspartiklene. RNA kløyvingsprodukter fra virus tilstede i supernatantene av ko-transfekterte celler ble analysert ved primerutvidelse. PE primere

(GGTTAAGCTTGTCGCCGCCCCTCGCCTCTTG [SEQ ID NO: 13]) identifisert i

Figur 6 og som omfatter et Hin dUI restriksjonssete ble benyttet. Primerekstensjon over kløyvingssetet ble gjennomført i to timer ved 42°C i første-tråd buffer omfattende 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM Kcl, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM dNTPs, og 20 U av RNA hemmer til hvilket 25 U av MuLV revers transkriptase ble tilsatt. Viral RNA ble isolert fra konsentrerte viruspreparater avledet fra crHIV ko-transfekterte kulturer.

Celler og debris ble fjernet ved sentrifugering ved 2.000 x g i 15 minutter ved 4°C. Virus ble deretter konsentrert ved ultrasentrifugering ved 30.000 x g i fire timer ved 4°C. Viral RNA ble deretter isolert fra viral pellet ved å anvende Trizol™ som tidligere beskrevet.

Virla RNA ble isolert fra vill-type, HIV-transfektert og crHIV-1.11 ko-transfektert kultur supernatanter under senere trinn av viral vekst (dvs vill-type HIV transfekterte kulturer ved dag +17, crHIV-1.11 ko-transfekterte kulturer ved dag +23). Som vist i Figur 12 inneholdt viruspartiklene disse kulturene både vill-type HIV og crHIV genomisk RNA. Full-lengde, primer-utvidet cDNA ble observert i både vill-type HIV transfektert (Figur 12, brønn 1) og crHIV-l.il ko-transfektert (Figur 12, brønn 2) kulturer. Ingen mindre cDNA som kunne vært resultat av U5 RNA kløyving ble påvist, til tross for omfattende primer-ekstensjonsanalyse. Nedgang i infeksjonsholdig vill-type HIV titere skyldes ikke intraviral kløyving av vill-type HIV RNA, men deres nummeriske erstatning av crHIV RNA i etterfølgende virus.

Resultatene viser at fremgangsmåten som her er beskrevet kan benyttes for å erstatte vill-type genomet, slik som HIV genomer og andre genomer fra etterkommende virus, ved å anvende betinget replikerende vektorer ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 9.

Dette eksemplet viser at crHIV vektorer kan hemme vill-type HIV replikasjon etter utfordring med plasmid eller rekombinant crHIV-1.11 virus.

Jurkat celler ble infisert med "stock"fflV (klon pNL4-3) og ble utfordret med enten (1) plasmid DNA inneholdende crHIV-1.11 konstruksjon eller (2) rekombinant crHVI-1.111 virus pakket i 293 celler, dvs mutant crHIV-1 .M (Nalini et al., Science, 272. 263-267 (1996)). Cellene ble utsatt for DLS lipidformidlet transfeksjon (Thierry et al., PNAS. 92 9742-9746 (1995)) eller crHIV-formidlet avlevering. Viral replikasjon ble målt ved å anvende revers transkriptaseanalyse 12 dager etter opprinnelig infeksjon med HIV. Vill-type positiv kontrollkulturer viste normale nivåer av vill-type HIV vekst. Når cellene infisert med vill-type HIV ble utfordret med mutant crHIV-l.M via DLS-formidlet transfeksjon, var vill-type HIV viralvekst upåvirket. I motsetning til dette når celleinfisert med vill-type HIV ble utfordret med crHIV-1.111, som kode for et anti-HIV ribozym, via DLS-formidlet transfeksjon, ble vill-type HIV viralvekst (dvs replikasjon) i betydelig grad hemmet. Når mutant crHIV-l.M ble utfordret med vill-type HIV, var vill-type HTV replikasjon upåvirket. Når vill-type HIV ble utfordret med crHIV-1.111 ble vill-type HIV replikasjon i betydelig grad hemmet. Data viser at crHIV vektorer kan bli anvendt til å hemme i betydelig grad vill-type HIV replikasjon intracellulært.

Eksempel 10.

Dette eksemplet beskriver anvendelse av betinget replikerende vektorer i terapeutisk behandling av cancer.

Den betinget replikerende, cancer-behandlede virale vektoren, kan konstrueres til å være defekt i sin evne til å replikere i normale celler fordi den mangler en viral protein nødvendig for dens replikasjon. Når denne vektoren imidlertid infiserer en cancerholdig celle, vil de unike egenskapene ved den cancerholdige cellen skaffe tilveie en faktor (f.eks. fortrinnsvis samme muterte cellulærprotein som fremmer avvikende vekst av cancerceller) som forenkler replikasjon av den defekte cancerbehandlings-vektoren. Denne metoden adskiller seg fra fremgansmåten som benyttes for behandling av viral infeksjon så lenge som den selektive pakkingen av den virale vektoren ikke forekommer, og i steden er det en preferanse for lyseririg av cancerceller p.g.a. pakking av etterkommende vektor-avledede viruspartikler i cellen. Fremgangsmåten er tilsvarende som fremgangsmåten som benyttes for virale infeksjoner ved at den kan anvende en hjelper-virus ekspresjonsvektor for selektivt å formere den betinget replikerende vektoren i cancercellene. Vektor og/eller hjelper-virus ekspresjonsvektor kan bli laget slik at den er responsiv til tumor-spesifike faktorer, for derved å forenkle vektorspredning selektivt i tumorcellene.

Tumor-spesifike faktorer som kan utnyttes i fremgangsmåten ved behandling, innbefattende men ikke begrenset til hvis den virker på nivå: (1) ved viral inngang i cellene (f.eks. tilstedeværende av en tumor-spesifik reseptor som vil tillate at en viral vektor selektivt kommer inn i en cancerholdig celle, men ikke en normal celle); (2) viral transkripsjon (f.eks. et mutant cancerholdig celleprotein som tillater at en cancer-behandlingsvektor transkriberer selektivt sitt RNA i cancerceller, i motsetning til normale celler; og (3) viral modning og frigjøring (f.eks. mutante cancerholdig cellulære proteiner som tillater betinget replikerende cancer-behandlingsvektoren selektiv å modne, f.eks. ved assosiasjon av mutante cellulære proteiner med virale proteiner eller genom, og resulterende fremming av viral modning og frigjøring).

Det mutante proteinet som eksisterer i cancerholdige celler kan reagere med virale proteiner (eller genomisk RNA eller DNA) ved mange trinn av virale replikasjonscykler. Disse interaksjonenen kan bli manipulert for å skape betinget replikerende cancer-behandlingsvektorer, som er defekte i normale celler og kan replikere i cancerholdige celler.

Særlig kan denne metoden benyttes for behandling av T-celle leukemi. T-celle leukemier er en alvorlig form av cancer med dårlig prognose. Mange av de leukemiske T-cellene er CD4<+>. En avnti-T-celle leukemibehandlende, betinget replikerende vektor kan konstrueres ved å anvende vill-type HIV som den bærende vektor. Så lenge HIV tilsynelatende entrer cellene via CD4 glykoprotein, vil denne vektoren virke ved nivå av viral inngang i cellene.

Vektoren kan lages til en cancer-behandlingsvektor ved innføring av delesjon(er) inn i vill-type HIV, for eksempel. HIV genomet kan muteres ved å produsere dette i sin DNA form og gjennomføring av sete-spesifik mutagenese, som tidligere beskrevet. Fremgangsmåten kan tilsvarende bli benyttet ved komplementering av virale mangler med andre tumore supressormutasjoner, eller negativ onkogene, eller ved utnyttelse av andre tumor-spesifike faktorer som reagerer med virale proteiner. Tat genet, som koder for protein som er viktig for HIV replikasjon kan bli utelatt. I fravær av Tat, kan HIV ikke lenger oppregulere sin ekspresjon, hvilket er absolutt vesentlig for HIV utvikling. Tat protein fungerer ved binding til TAR RNA stamme-løkkestrukturen, som er forbundet med HIV promotorer, og som har evnen til oppregulering av HIV ekspresjon ved mer enn 100 ganger. Uten Tat vil HlV-basert vektor ikke uttrykke HIV proteiner, og vil ikke formere og drepe normale (dvs ikke-cancerholdig) T-celler.

Leukemiske T-celler omfatter typisk et funskjonelt endret molekyl som enten er mutert, overuttrykt eller "silenced". Denne endrede tilstand av den molekylære funksjonen er ikke forbundet med normale celler. I sin ikke-muterte tilstand (men ikke dens muterte tilstand), fungerer dette molekylet i regulering av celle proliferasjon og/eller aptose (programmert celledød). Endringene forbundet med den mutert tilstand kan anvendes til å fremme spesifikk formering av en betinget replikerende viral vektor. Dette kan gjøres i nærvær eller fravær av en hjelper-virus ekspresjonsvektor. Defekten i Tat kan for eksempel blir komplementert ved en hjelper-ekspresjonsvektor som er drevet av en tumor-spesifik promoter, der promoteren er fra et gen i leukemiske celler som er overuttrykket. En slik vektor kan bare replikere i leukemiske T-celler og ikke i normale celler. Viral ekspresjon og formering i leukemi T-celler vil resultere i lysering og død av celler med kommende viralproduksjon. Vektoren kan også bære ytterligere elementer for å fremme celledreping (f.eks. en sekvens som koder for et toksin, et cytokin eller et antigen for å fremme immunmålretting).

Andre metoder og strategier kan tilsvarende bli benyttet i konstruksjon av ytterligere betinget replikerende cancer-behandlingsvektorer.

Eksempel 11.

Dette eksemplet beskriver utvikling av andregenerasjon crHIv konstruksjoner (cr2HIV), som har bedre formeringsegenskaper enn crHIV-l. 111 vektorene.

Andregenerasjonsvektorene muliggjør øket produksjon av crHIV partikler fra crHIV-produserende celler. Produksjon av flere crHIV partikler forenkler deres spredning og forhindrer vill-type HIV utvekst i kulturer. Manglende sekvenser som koder proteiner som blokkerer superinfeksjon med vill-type HIV, inneholder vektorene alle sekvenser av nativ, vill-type HIV men koder ikke for Tat genet. I steden for Tat genet er en trippel anti-Tat ribozym kassett ([SEQ ID NO: 19]) laget til tre forskjellige seter på Tat genet. Tat splittesetet ble utelatt slik at Tat nbosymene selektivt vil kløyve genomisk vill-type HIV RAN og ikke kløyve vill-type HIV RNA, som komplementer for defekten i Tat og forenkler crHIV replikasjon. I motsetning til tidligere vektorer som ikke koder proteiner andre enn kanskje et proteinholdig genetisk antiviralt middel, slik som et immunogen, koder andregenerasjonsvektorer, men ikke bare, for disse proteinene i nærvær av Tat. I en celle som inneholder både vill-type HIV og crHIV genomer, vil crHIV genomene ikke bare bli selektivt pakket, men mange flere viruspartikler vil bli fremstilt enn fra crHIV-1.111 celler, siden strukturelle proteiner blir produsert ikke bare fra vill-type HIV, men fra crHIV genomer. Vektoren blir således gitt en selektiv fordel for formering, siden ikke bare produsering av viruspartikler fra vill-type HIV templater men også fra crHIV templater.

Andregenerasjonsvektorene er også kjennetegnet ved at de omfatter eller koder for ribozymet, de katalytiske domenene av disse måleregionene er forskjellige enn de i vektoren selv. I motsetning til crHIV-1.111, som omfatter eller koder for ribozymer målrettet til U5 region av HIV ledersekvensen, som nødvendiggjør inkorporering av modifisert U5 sekvens inn i lederen av crHIV vektoren, er ribozymene i andre-generasjosnvektorer målrettede regioner som ikke er i vektoren selv, og dermed eliminerer behov for å modifisere sekvensen av vektoren. Dette reduserer muligheten for at resistent HIV kan dannes ved rekombinasjon av vill-type HIV med modifisert crHIV U5 sekvenser. Rekombinasjon av vill-type HTV med crHIV sekvenser vil ikke tilveiebringe noen fordel til vill-type HIV; inkorporering av ribozymsekvenser inn i vill-type HIV vil bare være skadelig for vill-type HIV.

Andregenerasjonsvektorer er videre kjennetegnet ved inkorporering av et antall forskjellige ribozymer, hver av disse er målrettt til et forskjellig sete, for å redusere mulighet av vill-type HIV for dannelse av ribozym-resistente mutanter.

I en ytterliger forbedring av vektorsystemet av sikkerhetsårsaker, kan betinget replikerende vaksine, "hjelper-vektor" konstruksjon bli ytterligere forbedret ved tilsetning av genetiske elementer/faktorer som spesifikt forenkler crHIV replikasjon og spredning på en sikker måte. En utførelsesform er innføring av ribozymer inn i hjelper-vektoren for å hindre dens genetiske rekombinasjon med vektoren for å produsere vill-type virus. Ovenfor nevnte cr2HIV vektor kan således bli komplementert med en Tat hjelper-ekspresjonsvektor for å forenkle dens spredning. Ved innsetning av anti-HIV ribozymer inn i hjelper-ekspresjonsvektoren, er sjansen for rekombinasjon minimalisert fordi et møte av vektoren med hjelper-vektor RNA vil resultere i deres gjensidige oppveielse og destruksjon. Hjelper-ekspresjonsvektoren kan derfor bli modifisert på et antall måter for å hjelpe til i en spesiell profylaktisk eller terapeutisk strategi. Cr2HTV vektorene kan således utnyttes som vaksiner mot HIV siden de (1) replikerer og således stimulerer vertens immunrespons og (2) tillater at verten gjenkjenner forskjellige epitoper, siden de er avledet fra HIV og endrer antigenisk.

Claims

1. Betinget replikerende retroviral vektor, karakterisert v e d at den omfatter: a) en nukleinsyre som koder for et betinget replikerende retroviralt genom; og b) en nukleinsyre som koder for en virusreplikasjonsinhiberende sekvens, der det betingede replikerende retrovirale genom omfatter en retroviral 5' lang-terminal gjenstagelse (LTR) og en 3' LTR, og minst en LTR som kontrollerer den transkrip-sjonene aktivitet til den virusreplikasjonsinhiberende sekvensen, og der replikasjon av det betinget replikerende retrovirale genom bare kan foregå i nærvær av et villtype virus eller et hjelpervirus.

2. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den virusreplikasjonsinhiberende sekvens koder for et genetisk antiviralt middel omfattende et RNA-lokkemiddel eller en transdominant mutant.

3. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den virusreplikasjonsinhiberende sekvens koder for et genetisk antiviralt middel omfattende et antisensmolekyl, et ribozym og/eller et immunogen.

4. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at vektoren er avledet fra et human immunsviktsvirus type 1.

5. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at vektoren er avledet fra et human immunsviktsvirus type 2.

6. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at vektoren er avledet fra en Togaviridae.

7. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at et katalytisk domene på nevnte ribozym spalter en nukleotidsekvens med den generelle triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helst nukleotid og H kan være A, U eller C.

8. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte ribozym kodes av en sekvens utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4.

9. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at villtype viruset omfatter en nukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 1, eller den betingede replikerende retrovirale vektor omfatter en nukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 eller 14, og minst et nukleotid N er mutert, eller den betingede replikerende retrovirale vektor omfatter en nukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 15 eller SEQ ID NO: 16.

10. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 9, karakterisert ved at vektoren, dersom den er DNA, omfatter en generell triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helt nukleotid og H kan være A, U eller C (SEC TD NO: 3), og en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5 og 15, eller at vektoren, dersom den er RNA, omfatter nukleotidsekvensen omfattende en generell triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helst nukleotid og H kan være A, U eller C (SEC ID NO: 3), og en nukleotidsekvens kodet av et nukleotid valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5 og 15.

11. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 9, karakterisert ved at vektoren, dersom den er DNA, omfatter en nukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 4 og en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 6 og 16, eller nevnte vektor, dersom den er RNA, omfatter nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 4 og en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 6 og 16.

12. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at vektoren mangler tat-genet og dens spleisesete fra genomet til en villtypestamme av humant immunsviktvirus.

13. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 12, karakterisert ved at, i stedet for tat-genet og dens spleisesete, omfatter vektoren en trippel anti-Tat ribozymkassett, der den katalytiske domenen av hvert ribozym av den triple ribozymkassett spalter et forskjellig sete på et villtype humant immunsvikt viralt nukleinsyremolekyl.

14. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 13, karakterisert ved at villtype humant immunsvikt viralt nukleinsyremolekyl omfatter tat og det katalytiske domenet til hvert ribozym av den triple ribozymkassetten spalter ved et ulikt sete i tat.

15. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at det katalytiske domenet til hvert ribozym spalter en nukleotidsekvens i et område av et nukleinsyremolekyl til villtype humant immunsviktvirus for hvilket det ikke er noen nbozym-sensitiv motpart i den betingede replikerende retrovirale vektor selv.

16. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at vektoren ytterligere omfatter minst en ytterligere nukleinsyresekvens, der tilstedeværelsen, transkripsjonen eller translasjonen av denne medfører til en vertscelle som er infisert med vektoren, en selektiv fordel i forhold til en celle infisert med (i) en villtypestamme av viruset eller (ii) en hjelper for replikasjon av den virale vektor.

17. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 16, karakterisert ved at minst en ytterligere nukleinsyresekvens omfatter en sekvens som koder for en multimedikamentresistens.

18. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 17, karakterisert ved at vektoren er avledet fra en Togaviridae.

19. Betinget replikerende retro viral vektor ifølge krav 16, karakterisert ved at minst en ytterligere nukleinsyresekvens omfatter en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av en nukleotidsekvens som koder for en mutant protease og en nukleotidsekvens som koder for en mutant revers transkriptase.

20. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at vektoren omfatter en ribozymkassett som omfatter minst et, to eller tre ribozymer, der minst to av disse eller hvert er uavhengig målsøkende til setet +115 eller sete +133 av U5 HIV RNA.

21. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 16, karakterisert ved at den minst ene nukleotidsekvens medfører at vesentlig mer av vektorgenomet enn: (i) villtypevirusgenomet; eller (ii) hjelpekonstruksjonen for replikasjon av en viral vektor, pakkes selektivt inn i et avkomvirion.

22. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 16, karakterisert ved at minst en nukleotidsekvens som medfører at nevnte betingede replikerende retrovirale vektor blir selektivt pakket inn i avkomsvirion med unntak av (i) nevnte villtypevirus eller (ii) nevnte hjelper for replikasjon av en viral vektor.

23. Sammensetning omfattende en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22 og en bærer.

24. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22.

25. Fremgangsmåte for å fremstille en betinget replikerende retroviral vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 22, karakterisert ved at den omfatter: (a) oppnåelse av en nukleinsyre som koder for et betinget replikerende viralt genom, (b) oppnåelse av en nukleinsyre som koder for en virusreplikasjonsinhiberende sekvens, og (c) innføring av nukleinsyren ifølge (a) og (b) i en vektor.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at den virale replikasjonsinhiberende sekvens omfatter et genetisk antiviralt middel utvalgt fra gruppen bestående av et RNA-lokkemiddel, en transdominant mutant, et antisens molekyl, et ribozym og et immunogen.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at vektoren er en human immunsvikt HIV-1 viral vektor.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at vektoren er avledet fra Togaviridae.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at trinnet (c) omfatter: (i) å innføre i vektoren: en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av en generell triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helst nukleotid og H kan være A, U eller C (SEQ DD NO: 3) og SEC ID NO: 4, eller en nukleotidsekvens omfattende en generell triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helst nukleotid og H kan være A, U eller C (SEQ ID NO: 3) eller SEC ID NO: 4; og (ii) å modifisere vektoren: til å omfatte en nukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 14, der minst en N er mutert, eller en nukleotidsekvens som kodes av en nukleotidsekvens vist i SEQ ID NO: 14, der minst en N er mutert.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at trinn (c) omfatter: (i) å innføre i vektoren: en generell triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helst nukleotid og H kan være A, U eller C (SEQ ID NO: 3), eller nukleotidsekvensen kodet av en generell triplettsekvens NUH, der N er et hvilket som helst nukleotid og H kan være A, U eller C (SEQ ID NO: 3), og (ii) å modifisere vektoren: til å omfatte en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5 og 15, eller til å omfatte en nukleotidsekvens kodet av nukleotidsekvensen utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5 og 15.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at trinn (c) omfatter: (i) innføring av nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 4 i vektoren; og (ii) modifisering av vektoren: til å omfatte en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5, 6 og 16, eller en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 6 og 16.

32. Fremgangsmåte for å modifisere en retroviral vektor, karakterisert ved at den omfatter: (c) oppnåelse av en vektor; og (d) innføring i vektoren ifølge (a) en nukleotidsekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 14, der minst et nukleotid N er mutert, dersom vektoren omfatter DNA, eller en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 14, der minst en N er mutert, dersom vektoren omfatter RNA, og der replikasjon av det retrovirale genom kan foregå i nærvær av et villtype virus eller et hjelpevirus.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at nukleotidsekvensen er valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5, 6,15 og 16, dersom vektoren omfatter DNA, eller en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 og 16, dersom vektoren omfatter RNA.

34. Fremgangsmåte for å formere og selektivt pakke en betinget replikering av retroviral vektor uten å anvende en innpakningscellelinje, karakterisert v e d at den omfatter: (d) bringe en celle i kontakt med en betinget replikerende retroviral vektor ifølge krav 1; (e) bringe cellen i kontakt med et villtype retrovirus; og (f) dyrke cellen under betingelser som fremmer formering av den betingede replikerende retrovirale vektor.

35. In vitro eller ex vivo fremgangsmåte for å inhibere replikasjon av et villtype retrovirus i en vertscelle, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter det å bringe vertscellen, som er i stand til å bli infisert med det humane HIV villtypevirus, i kontakt med en betinget replikerende retroviral vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22, der tilstedeværelsen, transkripsjon eller translasjon av denne inhiberer replikasjon av villtypeviruset i vertscellen eller meddeler en selektiv fordel for replikasjon av det betingede replikerende retrovirale vektorgenomet i forhold til replikasjon av villtype retrovirale genomet.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert ved at den ytterligere omfatter det å bringe vertscellen i kontakt med en substans utvalgt fra gruppen bestående av et cytotoksisk medikament, en proteaseinhibitor og en revers transknptaseinhibitor.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert ved at retroviruset omfatter et HIV-1- eller et HIV-2-virus.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert ved at fremgangsmåten ytterligere omfatter det å bringe nevnte vertscelle i kontakt med en hjelperekspresjonsvektor, der hjelperekspresjonsvektoren komplementerer nevnte betingede replikerende virale vektor for dens manglende evne til å replikere.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at hjelperekspresjonsvektoren komplementerer nevnte betingede replikerende virale vektor på en cellespesifikk måte.

40. In vitro eller ex vivo fremgangsmåte for å uttrykke et gen av interesse i en vertscelle, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) det å bringe nevnte vertscelle i kontakt med (i) en betinget replikerende viral vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22, der nevnte betingede replikerende retrovirale vektor ytterligere omfatter en nukleotidsekvens omfattende genet av interesse og den betingede replikerende retrovirale vektor er i stand til å uttrykke genet i nevnte vertscelle, og (ii) en hjelpercelle; og (b) uttrykke genet av interesse i nevnte vertscelle.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at ekspresjon av nevnte gen av interesse i vertscellen inhiberer replikasjon av et humant HIV villtype virus i vertscellen eller meddeler en selektiv fordel for replikasjon av det betingede replikerende retrovirale vektorgenom i forhold til replikasjon av det villtype humane HIV virusgenomet.

42. In vitro eller ex vivo fremgangsmåte for å påvise interaksjon mellom et medikament eller en faktor og et protein, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (c) det å bringe medikamentet eller faktoren i kontakt med en vertscelle ifølge krav 25, der den betingede replikerende retrovirale vektor koder for å uttrykke proteinet; og (d) påvisning av interaksjonen mellom medikamentet eller faktoren og proteinet, der interaksjonen påvises ved å påvise binding eller kontakt mellom medikamentet eller faktoren og proteinet, eller interaksjonen påvises ved å påvise aktivering eller inhibisjon av en aktivitet til proteinet.

43. Anvendelse av en betinget replikerende retroviral vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22 for fremstilling av et medikament for å inhibere replikasjon av et villtype retrovirus i en celle.

44. Betinget replikerende retroviral vektor for anvendelse som et medikament, der den betingede replikerende retrovirale vektor omfatter en vektor vist ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22.

45. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 22 for anvendelse som et medikament, der den betingede replikerende retrovirale vektor er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 25.

46. Betinget replikerende retroviral vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 22 for anvendelse som et medikament, der den betingede replikerende retrovirale vektor er fremstilt ved fremgangsmåten omfattende: (a) oppnåelse av en vektor; og (b) innføring i vektoren ifølge (a) av en nukleotidsekvens tilsvarende SEQ ID NO: 14, der minst et nukleotid N er mutert, dersom vektoren omfatter DNA, eller en nukleotidsekvens kodet av en nukleotidsekvens tilsvarende SEQ ID NO: 14, der minst en N er mutert, dersom vektoren omfatter RNA, og der replikasjon av det retrovirale genom kan foregå i nærvær av et villtype virus eller et hjelpervirus.