ES2296410T3 - Linea celular de empaquetamiento de retrovirus anfotropicos, proceso para su produccion y uso de la misma. - Google Patents
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- C12N2740/13052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Abstract
La línea celular de empaquetamiento de retrovirus anfotrópicos con el número de depósito de DSM 2235 que contiene los genes gag, pol y env funcionales integrados en el genoma, en el que la expresión de los genes gag y pol se regula independientemente de la expresión de los genes env, en la que el genoma de dicha línea celular contiene uno o dos genes env en estado funcional activo.
Description
Línea celular de empaquetamiento de retrovirus
anfotrópicos, proceso para su producción y uso de la misma.
La invención se refiere a una línea celular de
empaquetamiento de retrovirus anfotrópicos mejorada, un proceso
para su producción, así como su uso especialmente en terapia génica
in vitro e in vivo. Se pueden conseguir títulos
virales elevados con vectores retrovirales, que se producen por tal
línea celular de empaquetamiento.
Los vectores retrovirales se utilizan
extensamente para transferir genes foráneos a las células de
mamíferos y humanos. Sin embargo, por razones de seguridad, tales
vectores retrovirales no deberían ser de replicación competente.
Por esta razón las líneas celulares de empaquetamiento se utilizan
para producir vectores retrovirales que no pueden producir virus de
tipo salvaje, ya que contienen secuencias de empaquetamiento no
funcionales. Tales líneas celulares de empaquetamiento se conocen y
se han descrito desde hace tiempo: \Psi2 (Mann et al.,
Cell 33 (1983) 153-156), \Psi
\Psi-Am (Cone and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.
EUA 81 (1994) 6349-6353), PA12 (Miller et
al., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 431-437),
GP+E-86 (Markowitz et al., J. Virol. 62
(1988) 1120-1124), PA317 (Miller and Buttimore, Mol.
Cell Biol.6 (1986) 2895-2902) y GP+env Am12
(Markowitz et al., Virology 167 (1988)
400-406), véase también "Handbuch der molekularen
Medizin", Vol. 1 Ed. D. Ganten y K. Ruckpaul, Springer
Publishers, Heidelberg 1997, R. Rüger, capítulo 2.1,
197-241.
Sin embargo, todas estas líneas celulares de
empaquetamiento, excepto la GP+env Am12 (a la que se hace referencia
como Am12 posteriormente), conducen hasta cierto punto a la
formación de virus de tipo salvaje (Bosselman et al., Mol.
Cell Biol. 7 (1987) 1797-1804). Por el contrario, la
Am12 en la que las funciones virales gag y pol se introducen en la
célula en un plásmido y env se introduce en la célula en otro
plásmido, es una línea celular de empaquetamiento segura. Por lo
tanto, estas funciones se integran en diferentes loci del genoma de
la célula de empaquetamiento. Para que se formen virus de tipo
salvaje a partir de la Am12 deben producirse tres recombinaciones
que reparen el genoma original intacto. Esto aparentemente es casi
imposible y tampoco se ha observado con anterioridad.
Para evitar los problemas causados por la
recombinación homóloga en las líneas celulares de empaquetamiento
se han realizado también intentos, por ejemplo, para conseguir
expresar gag/pol y env mediante diferentes promotores (Meyers et
al., Arch. Virol. 119 (1991) 257-264; Dougherty
et al., J. Virol. 63 (1989) 3209-3212) y
para utilizar líneas celulares de empaquetamiento basadas en el
virus de la necrosis esplénica (VNE) (Martínez y Dornburg, Virology
208 (1995) 234-241).
Sin embargo, una desventaja de las conocidas
líneas celulares de empaquetamiento es que los títulos de los
vectores virales, en el caso de los vectores retrovirales, que se
producen de esta manera son muy bajos y oscilan entre 10^{2} y un
máximo de 10^{6} unidades formadoras de colonias (UFC)/mL de
sobrenadante del cultivo celular.
La finalidad de la invención es proporcionar
líneas celulares de empaquetamiento retroviral seguras que puedan
producir vectores virales con una eficiencia de transducción
elevada.
La invención se refiere a una línea celular de
empaquetamiento de retrovirus anfotrópicos número de depósito de
DSM 2235 que contiene los genes funcionales gag, pol y env
integrados en el genoma, en el que la expresión de los genes gag y
pol se regula independientemente de la expresión de los genes env,
que se caracteriza porque el genoma de dicha línea celular contiene
uno o dos genes env en estado funcional.
Otro tema de importancia de la invención es un
proceso para la producción de un vector retroviral que se
caracteriza porque una línea celular de empaquetamiento de
retrovirus anfotrópicos, de acuerdo con la invención, se transfecta
con un vector viral (genoma vector) que contiene uno o varios genes
que son heterólogos respecto al virus, pero que contiene genes
retrovirales estructurales en estado funcional inactivo, en el que
la línea celular se cultiva y el vector retroviral se aísla del
sobrenadante del cultivo.
Otro tema de importancia de la invención es un
proceso para la producción de una línea celular de empaquetamiento
de retrovirus anfotrópicos con número de depósito de DSM 2235, que
se caracteriza porque un plásmido auxiliar que contiene env y un
gen selector y un plásmido auxiliar que contiene gag/pol y un gen
selector se transfectan en una célula eucariota. Las células
transfectadas se identifican en base al gen selector y se aíslan y
se seleccionan aquellas células que contienen uno o dos genes env
en estado funcional activo.
Un vector retroviral de replicación incompetente
puede producirse mediante el método de acuerdo con la inven-
ción.
ción.
Ha resultado que el número de env integrados en
el genoma de una línea celular de empaquetamiento tiene una
influencia decisiva sobre la eficiencia de transducción de los
vectores virales que se producen de este modo. Este hecho es el más
sorprendente desde lo que se conocía gracias a Martínez y Dornburg,
Virology 208 (1995) 234-241, que el grado de la
expresión de env en una línea celular de empaquetamiento no tendría
una influencia sobre la eficiencia de transducción. Las líneas
celulares de empaquetamiento examinadas por Martínez y Dornburg
difieren respecto a la expresión de env solamente en la fortaleza de
las secuencias del promotor que regulan la expresión
de env.
de env.
En un modo de realización preferido la línea
celular de empaquetamiento, de acuerdo con la invención, contiene
dos env integrados y un gag/pol integrado. De acuerdo con la
invención, el empleo de la línea celular de empaquetamiento
consigue un título de vectores retrovirales de 2 x 10^{6} hasta
10^{7} o superior, preferiblemente al menos 10^{7} unidades
formadoras de colonias/mL del sobrenadante del cultivo celular y/o
preferiblemente una eficiencia de transducción de como mínimo el
50% en células MOLT-4 (ATCC CRL 1582) mediante la
determinación cuantitativa con el método de centrifugación al cabo
de tres días.
La regulación independiente de la expresión
génica de gag/pol y env se consigue normalmente mediante la
ubicación de al menos una secuencia reguladora de la expresión y/o
una señal de parada entre gag/pol y env.
Líneas celulares de partida como líneas
celulares de empaquetamiento son, por ejemplo, la 3T3 y la D17. Los
vectores de partida adecuados se basan en, por ejemplo, el VLM,
VLMuMo. Los expertos en la materia son conocedores de tales líneas
celulares de empaquetamiento y vectores de partida adecuados y se
describen por ejemplo por R. Rüger (1997) en "Handbuch der
molekularen Medizin".
De acuerdo con la invención, se prefiere
particularmente la línea celular HSR BM01 como línea celular de
empaquetamiento. Boehringer Mannheim GmbH depositó esta línea
celular en el "DeutscheSammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH" (DSM), Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig
con el número DSM de acceso 2235 de acuerdo con el Contrato de
Budapest el 09.12.1995.
Otro tema de importancia de la invención es un
proceso para la producción de una línea celular de empaquetamiento
de retrovirus anfotrópicos de acuerdo con la invención.
Una línea celular de retrovirus anfotrópicos con
el genoma dividido se puede producir, por ejemplo, como se describe
en Markowitz et al., Virology 167 (1988)
400-406. Se utilizan dos plásmidos con este
propósito, que codifican para las denominadas secuencias auxiliares
f (gag, pol y env).
Con objeto de seleccionar líneas celulares de
acuerdo con la invención, debe determinarse el número de env y
gag/pol integrados. Esto se realiza apropiadamente mediante la
digestión del DNA genómico con enzimas de restricción que no
escinden las secuencias gag/pol o las secuencias env y mediante la
determinación de la cantidad de fragmentos que contienen secuencias
específicas gag/pol o env.
La invención, cuyo alcance de protección resulta
de las reivindicaciones de la patente, se ilustra además mediante
los ejemplos y las publicaciones siguientes. Los métodos descritos
deben entenderse como ejemplos que todavía describan el tema de
importancia de la invención, incluso después de introducir
modificaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Un plásmido auxiliar transporta los genes
virales estructurales gag/pol del virus de la leucemia murina de
Moloney (VLMuMo) p. ej. bajo la regulación de las 5'LTR del VLMuMo.
Estos genes estructurales gag/pol junto con las 5'LTR pueden
obtenerse del DNA proviral del VLMuMo mediante digestión con enzimas
de restricción. En este proceso es importante debido a razones de
seguridad para inactivar las denominadas secuencias de
empaquetamiento \Psi. Esto se puede conseguir, por ejemplo,
mediante una deleción que se introduce mediante la ayuda de una
digestión con enzimas de restricción. Además es ventajoso tener un
marcador para su selección, como p. ej. el gen gpt en el plásmido
auxiliar, el producto génico del cual confiere resistencia al
fármaco selector ácido micofenólico. La resistencia al ácido
micofenólico permite una rápida selección de clones que han admitido
el plásmido deseado (plásmido auxiliar que contiene gag/pol). Un
plásmido auxiliar correspondiente puede construirse como se
describe, por ejemplo, por Markowitz et al., J. Virol. 62
(1988) 1120-1124.
Otro plásmido auxiliar transporta el gen viral
estructural env del clon 4070A (4070A) del virus anfotrópico de la
leucemia murina (Chattopadhyay et al., J. Virol. 39 (1981)
777-791) p. ej. bajo el control de las 5'LTR del
VLMuMo. Para ello, se aísla un fragmento del DNA proviral del 4070A
que contiene el gen env y el sitio aceptor 3'. Este fragmento se
clona en el interior de un plásmido que contiene las 5'LTR del
VLMuMo así como el sitio donador 5'. Es posible producir un
plásmido auxiliar correspondiente como se describe, por ejemplo, en
Markowitz et al., Virology 167 (1988)
400-406.
Las células NIH 3T3 (núm. de acceso CRL 1658) se
transfectan en primer lugar con el plásmido auxiliar gag/pol, por
ejemplo. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la
electroporación. Las células transfectadas pueden aislarse gracias
a un medio selectivo adecuado, ya que el gen gpt está presente en el
plásmido que contiene gag/pol. Un medio selectivo adecuado
contiene, por ejemplo, hipoxantina (15 \mug/mL), xantina (250
\mug/mL) y ácido micofenólico
(25 \mug/mL) (medio HXM). La expresión de la transcriptasa inversa (TI) se puede evaluar posteriormente en los clones resistentes como se describe, por ejemplo, por Markowitz et al., J. Virol. 62 (1988) 1120-1124. Un clon que se expresa en un grado particularmente elevado se selecciona para realizar la transfección posterior con el plásmido auxiliar que contiene env.
(25 \mug/mL) (medio HXM). La expresión de la transcriptasa inversa (TI) se puede evaluar posteriormente en los clones resistentes como se describe, por ejemplo, por Markowitz et al., J. Virol. 62 (1988) 1120-1124. Un clon que se expresa en un grado particularmente elevado se selecciona para realizar la transfección posterior con el plásmido auxiliar que contiene env.
El plásmido auxiliar que contiene env puede
transfectarse posteriormente, por ejemplo, en un clon resistente a
ácido micofenólico transfectado con gag/pol con elevada actividad
TI, mediante electroporación. Con objeto de identificar simplemente
las células transfectadas con éxito es útil
co-transfectar, por ejemplo, otro plásmido junto
con el plásmido auxiliar que contenga un gen resistente. Este puede
ser por ejemplo un plásmido que confiera resistencia a la
higromicina, como por ejemplo el plásmido pRSHhyg (Murphy, A.J.
(1987) Tesis doctoral, Universidad de Columbia, EUA). Los clones
transfectados con éxito pueden seleccionarse simplemente utilizando
un medio selectivo adecuado que contenga por ejemplo 200 \mug/mL
de higromicina B. La expresión de env puede evaluarse
posteriormente en los clones resistentes a higromicina mediante el
análisis de precipitación radioinmunológico utilizando un antisuero
env como se describe, por ejemplo, en Markowitz et al.,
Virology 167 (1988) 400-406.
La cantidad de copias del plásmido auxiliar que
contiene env integradas en el genoma se seleccionó como parámetro
para la elección de un determinado subclón de una línea celular de
empaquetamiento. Martínez y Dornburg, Virology 208 (1995)
234-241 han demostrado que en contraste con lo que
sucede con gag/pol, una expresión de env elevada no influye en el
título viral; el título de clones con una expresión de gag/pol
mayor, pero sin una mayor expresión de env se correlacionaban con
la eficiencia de la infección que se produjo. Esta fue la base para
la asunción de que la proporción entre los productos génicos gag/pol
y env pueden ser muy importantes en la eficiencia de las células de
empaquetamiento y posiblemente las células de empaquetamiento con
una expresión de env menor puedan generar sobrenadantes virales con
una eficiencia de transducción mayor.
La cantidad de copias integradas del plásmido
auxiliar que contiene env en el genoma de los clones examinados
individualmente se determinó mediante la digestión con enzimas de
restricción y el análisis de transferencia Southern. Este DNA
genómico se aisló a partir de varios subclones y se digirió con el
uso de enzimas de restricción p. ej. la enzima PstI. Esta enzima no
escinde en la secuencia env y escinde una sola vez en toda la
secuencia del plásmido. Ya que cada segundo sitio de restricción
correspondiente que conduce al respectivo fragmento de restricción
se sitúa al azar en el genoma, de esta manera es posible determinar
la cantidad de env integrados.
El DNA digerido se separó en un gel de agarosa y
se transfirió a una membrana de nilón mediante transferencia
capilar. Los fragmentos que contenían las secuencias env específicas
se detectaron con el uso de una sonda de DNA marcada con
digoxigenina específica de env. Se localizaron los subclones con
diferentes cantidades de env integrados. Por ejemplo, el tamaño de
las bandas que se obtuvieron después de la digestión con la enzima
de restricción PstI fueron 17,5 kb, 13,3 kb y 3,4 kb para la línea
celular de empaquetamiento GP+env Am12 y 13,3 kb y 3,4 kb para la
línea celular de empaquetamiento HSR BM01.
Cada subclon se transfectó con dos env
integrados (HSR BM01) o con tres env integrados (GP+env Am12) que
contenían el constructo retroviral pL1, con la finalidad de
producir líneas celulares productoras de virus (líneas productoras).
El constructo pL1 transporta el cDNA en una forma acortada del
receptor de baja afinidad del factor de crecimiento nervioso humano
(h\DeltaLNGFR (producido de forma análoga a WO 95/06723)) en la
que el dominio citoplásmico se elimina y que está bajo el control
del LTR 5' viral. El producto génico del cDNA del h\DeltaLNGFR,
una proteína de membrana, puede detectarse en las células gracias a
un anticuerpo monoclonal específico del h\DeltaLNGFR (AcM). Los
clones productores de virus se aislaron a partir de la HSR BM01
(HSRBM-L1), así como a partir de la GP+env Am12
(clon C11-C4) mediante técnicas de
inmunofluorescencia y de citometría de flujo.
Las células indicadoras (NIH/3T3; ATCC Núm. CRL
1658) se transdujeron con los sobrenadantes que contenían
partículas virales procedentes de los dos clones
HSRBM-L1 o C11-C4. Un método de
tinción citoquímico basado en el AcM
anti-h\DeltaLNGFR permite la determinación de la
cantidad de unidades formadoras de colonias (título) del retrovirus
que codifica el \DeltaLNGFR. Mientras que el sobrenadante de la
línea productora C11-C4 (3 copias de env) basado en
las células de empaquetamiento GP+env Am12 poseían un título de 6,3
x 10^{5} unidades formadoras de colonias, el sobrenadante de la
línea productora HSRBM-L1 (dos copias de env) basado
en la HSR BM01 tenía un título de 1,25 x 10^{7}.
Las líneas celulares Jurkat, MOLT4, Raji y K 562
se cultivan en RPMI/FCS al 10% en condiciones de cultivo celular
normales y se transducen en densidades celulares que oscilan entre 3
x 10^{5} células/mL y 9 x 10^{5} células/ml. Las distintas
líneas celulares productoras que contienen un vector retroviral
idéntico se cultivan en DMEM/FCS al 10% en condiciones de cultivo
celular normales. Las células se siembran en una concentración de 1
x 10^{4} células/cm^{2}. Al cabo de tres días se desecha el
sobrenadante y se añade medio de cultivo nuevo. El sobrenadante se
recoge 24 horas después. El sobrenadante se filtra a través de un
filtro de 0,22 \mum. Se determina el título de los diferentes
sobrenadantes y se ajusta de tal modo que las cantidades
equivalentes en volumen contienen una cantidad equivalente de
partículas virales. El título del sobrenadante retroviral se
determinó mediante el método de valoración por tinción inmunológica
con NIH3T3 como células diana.
Protocolo
1
Se resuspenden 5 x 10^{5} células en 1 mL de
sobrenadante retroviral. La transducción se lleva a cabo en una
placa de 24 pocillos. Tras la centrifugación (1000 g, 30ºC, 90 min.)
las células se lavan y se resuspenden en 1 mL de medio de cultivo
nuevo. Las células se incuban durante toda la noche y se añade 1 mL
de medio de cultivo nuevo. Tres días después de la transducción,
las células se recogen y se tiñen con un anticuerpo
anti-LNGFR marcado con FITC. El porcentaje de
células que expresan el LNGFR se determina mediante la citometría de
flujo. En este proceso se excluyen del análisis las células muertas
mediante la tinción con yoduro de propidio. El análisis por
citometría de flujo se realiza con un aparato FACScan.
Protocolo
2
El procedimiento en el protocolo 2 se realizó de
acuerdo con el protocolo 1, aunque sin realizar una centrifugación.
Las células se incubaron durante dos horas a 37ºC con el
sobrenadante retroviral.
La Tabla 1 muestra la expresión del LNGFR en
varias líneas celulares tres días después de la transducción de
acuerdo con el protocolo 1. La Tabla 2 muestra la expresión del
LNGFR en varias líneas celulares tres días después de la
transducción de acuerdo con el protocolo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Bosselman et al., Mol. Cell
Biol. 7 (1987) 1797-1804.
Chattopadhyay et al., J.
Virol. 39 (1981) 777-791.
Cone and Mulligan, Proc. Natl.
Acad. Sci. EUA 81 (1994) 6349-6353.
Dougherty et al., J. Virol.
63 (1989) 3209-3212.
Handbuch der molekularen Medizin, Volume I, Ed.
D. Ganten and K. Ruckpaul, Springer Verlag
Heidelberg 1997, R. Rüger, Capítulo 2.1,
197-241.
Mann et al., Cell 33
(1983) 153-156.
Markowitz et al., J. Virol.
62 (1988) 1120-1124.
Markowitz et al., Virology
167 (1988) 400-406.
Martínez y Dornburg,
Virology 208 (1995) 234-241.
Meyers et al., Arch. Virol.
119 (1991) 257-264.
Miller and Buttimore, Mol. Cell
Biol. 6 (1986) 2895-2902.
Miller et al., Mol. Cell
Biol. 5 (1985) 431-437.
Murphy, A.J. (1987), Tesis
Doctoral, Universidad de Columbia, EUA.
Claims (5)
1. La línea celular de empaquetamiento de
retrovirus anfotrópicos con el número de depósito de DSM 2235 que
contiene los genes gag, pol y env funcionales integrados en el
genoma, en el que la expresión de los genes gag y pol se regula
independientemente de la expresión de los genes env, en la que el
genoma de dicha línea celular contiene uno o dos genes env en
estado funcional activo.
2. La línea celular de empaquetamiento, como se
reclama en la reivindicación 1, que contiene dos env integrados y
un gag/pol integrado.
3. La línea celular de empaquetamiento, como se
reclama en las reivindicaciones 1 o 2, en la que se consigue como
mínimo un título de 2 x 10^{6} a 10^{7} unidades formadoras de
colonias/mL de sobrenadante del cultivo celular al empaquetar un
vector retroviral.
4. El proceso para la producción de una línea
celular de empaquetamiento de retrovirus anfotrópicos con el número
de depósito de DSM 2235, en la que un plásmido auxiliar que contiene
env y un gen selector y un plásmido auxiliar que contiene gag/pol y
un gen selector se transfectan en una célula eucariota. Las células
transfectadas son idénticas respecto al gen selector y se aíslan y
se seleccionan aquellas células que contienen uno o dos genes env
en estado funcional activo.
5. El proceso para la producción de un vector
retroviral, en el que una línea celular de empaquetamiento como se
reclama en las reivindicaciones 1 a 3 se transfecta con un genoma
vector que contiene uno o varios genes heterólogos con relación al
virus, pero que contiene genes retrovirales estructurales en estado
funcional inactivo. La línea celular se cultiva y el vector
retroviral se aísla del sobrenadante del cultivo.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| EP98109135 | 1998-05-20 | ||
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