EP1019518B1 - Selbstdeletierende vektoren für die krebstherapie - Google Patents

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EP1019518B1
EP1019518B1 EP99926413A EP99926413A EP1019518B1 EP 1019518 B1 EP1019518 B1 EP 1019518B1 EP 99926413 A EP99926413 A EP 99926413A EP 99926413 A EP99926413 A EP 99926413A EP 1019518 B1 EP1019518 B1 EP 1019518B1
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EP
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vector according
recombinant vector
recombinase
sequence
transcription
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Harald Prof.Dr. Universitätsklinikum VON MELCHNER
Christoph Universitätskli. Frankfurt EBENSPERGER
Thomas Universitätsklinik. Frankfurt ANDRE
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Frankgen Biotechnologie AG
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Frankgen Biotechnologie AG
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    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant vector, a pharmaceutical composition containing the vector according to the invention, the use of the vector according to the invention for the manufacture of a medicament for cancer therapy and transduced eukaryotic cells.
  • Treatment of benign or malignant tumors has been predominantly either invasive, i. by surgical removal of the tumor, or conservative, e.g. by administration of cytostatics or irradiation of the affected organs, or by a combination of the mentioned methods. Due to steadily improving surgical techniques and a tremendous development in the field of cytostatic drugs, considerable success has already been achieved with these therapeutic options.
  • the chances of success in the treatment of a tumor by the aforementioned therapeutic approaches are very different and uncertain.
  • each of the three approaches has serious disadvantages.
  • the surgical removal of a tumor and possibly its division in healthy tissue means a significant impairment of the patient due to the procedure itself.
  • the treatment with cytostatics and the irradiation of tumors can be limited only in exceptional cases to the actual target cells, so that it is almost inevitable to treat healthy cells or healthy tissue with.
  • a treatment with cytostatics means the inhibition of mitoses, which leads for example as an unpleasant side effect on hair loss.
  • Both cytostatic treatment and radiation therapy may mean that children without childbearing or conceivable age can be renounced.
  • adenoviral vectors are also only conditionally suitable for use in gene therapy.
  • the vector according to the invention enables targeted and selective elimination of tumor cells by introducing into the cells a suicide gene which is promptly eliminated in healthy cells by the expression of the recombinase, while it can be activated in tumor cells with inactive transcription factors and by (i) expression of the suicide protein, (ii) transcription of antisense RNA, or (iii) cell death by production of cytopathogenic virus.
  • vector means a linear or circular nucleic acid molecule which may consist of both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid.
  • Suitable vectors for gene therapy which can serve as starting material for the vectors of the invention are known in the art.
  • Preferred vectors are vectors derived from viral or retroviral genomes, since these can be packaged in viruses and can easily be introduced into cells by transduction. Non-viral vectors are also conceivable but require further transfection. Suitable vectors would be e.g. fully synthetic vectors or vectors that are transduced by attenuated bacteria.
  • Replication competence means the ability of a vector to replicate in host cells. Have very broad replication competence with respect to mammalian cells, eg adenovirus, retroviruses such as mouse leukemia virus MuLV, in particular Moloney murine leukemia virus (MoMuLV).
  • the invention generally encompasses replication-competent vectors in eukaryotic cells. If the vectors are retroviruses, infectious retroviruses are preferred.
  • Transcription cassettes are nucleic acid units which, in addition to the sequence coding for a protein, contain the required regulatory regions, eg promoter or minimal promoter with transcription factor binding site and polyadenylation sequences. The first transcription cassette may be 5 'or 3' relative to the second transcription cassette.
  • a "minimal promoter” is a natural or synthetic promoter or enhancer that can activate gene expression only in the presence of a specific transcription factor. It contains at least one natural or synthetic transcription factor binding site.
  • a "transcription factor binding site” is a natural or synthetic nucleic acid sequence to which a transcription factor required to activate a minimal promoter can bind.
  • a "recombinase” is a natural or synthetic enzyme that recognizes, cuts and recombines specific target sequences. Examples of these are the Cre recombinase from the P1 coliphage (Sternberg and Hamilton, 1981) and the Flp recombinase from S. cerevisiae (Broach and Hicks, 1980).
  • a "target sequence” is a natural or synthetic sequence that can be specifically recognized by a recombinase. Examples of these are the loxP sequences from the P1 coliphage (Gu et al., 1993, Sauer and Henderson, 1988, Sternberg and Hamilton, 1991) and the FRT sequences from S. cerevisiae (Broach and Hicks, 1980; Golic and Lindquist, 1989; O'Gorman et al., 1991).
  • a "suicide gene” is a nucleic acid sequence that leads to cell death by transcription and optionally expression.
  • it is present as part of a transcription cassette, ie in conjunction with a promoter and optionally a polyadenylation sequence.
  • the suicide gene be partially or fully complementary to an essential gene.
  • the transcriptionally generated suicide gene mRNA is able to hybridize with the mRNA of the essential cellular gene. Consequences of mRNA hybridization are translation arrest of the essential cellular gene and / or RNase H activation with subsequent cell death.
  • the essential cellular gene may be selected from cyclins and ati-apoptotic proteins such as e.g. Bcl-2.
  • the suicide gene is a cytopathogenic virus, e.g. Semliki Forest Virus that kills the cell.
  • the suicide gene may further comprise a nucleic acid sequence encoding a suicide protein.
  • a "suicide protein” is a natural or artificial polypeptide product that results, directly or indirectly, in cell death.
  • the indirect effect is based e.g. upon interacting with a non-toxic prodrug so that it is converted to a toxic agent capable of causing the death of a cell.
  • the suicide protein may be an antigen, e.g. Influenza hemagglutinin or foreign MHC antigens.
  • the immediate effect in this case is based on the stimulation of an immune response directed against the tumor cell.
  • the recombinase encoded by the first transcription cassette can only be expressed in cells with an intact transcription factor.
  • the binding of the transcription factor to the transcription factor binding site associated with the minimal promoter is suppressed.
  • the minimal promoter requires activation by the transcription factor, there is no transcription and thus no expression of the gene encoded by the first transcription cassette, ie the recombinase.
  • the coding sequence the second transcriptional cassette, ie the suicide gene because the promoter operably linked to this gene is independent of activation by a transcription factor.
  • the now expressed suicide protein after being in contact with a prodrug, will metabolize it and thereby contribute to the production of a toxic agent. This metabolism product subsequently leads to the death of the affected cell.
  • a cell-type specific antisense RNA or virus could directly lead to cell death.
  • the transcription factor mentioned may be any transcription factor with a defect that results in a limitation or complete elimination of transactivator capability.
  • a well-known example of a transcription factor whose DNA-binding domain is relatively frequently altered in tumor cells so that DNA binding and consequently also transactivation no longer takes place is the mentioned factor p53.
  • p53 binding consensus sequences were found in a number of promoters and characterized. Among other things, p53 regulates the expression of p21 (WAF1) (el-Deiry et al., 1994), bax (Miyashita and Reed, 1995), and IGF-BP3 (Buckbinder et al., 1995).
  • WAF1 el-Deiry et al.
  • bax el-Deiry et al., 1994
  • IGF-BP3 Buckbinder et al., 1995.
  • PG motif CCTGCCTGGACTTGCCTG
  • PG n this motif in conjunction with a minimal promoter (MP) makes the expression of a reporter gene p53 inducible. Such induction is not possible with mutant p53.
  • PG n -CMVMin-CAT chloramphenicol acetyl transferase
  • pg13-SV40Min-SEAP secreted alkaline phosphatase
  • flanking sequences consist essentially of the recombinase target sequences. These may be natural or synthetic sequences recognized by a natural or recombinant recombinase.
  • the vector according to the invention is derived from a retrovirus.
  • Retroviruses are RNA viruses whose replication involves a DNA intermediate.
  • the viral RNA genome is flanked by short repeated sequences (Repeats, R) and non-repeated sequences (Unique Sequences, U5 and U3), which include DNA synthesis, integration of the viral genome into the host genome, transcription and RNA processing Taxes. Between these control regions are coding sequences for the major structural proteins of the virus particle, namely gag and env , and for other particle-packed enzymes (pol, protease, reverse transcriptase and integrase). Shortly after infection, viral RNA is translated from reverse transcriptase to DNA. Prior to integration, the terminal sequences of the viral genome are duplicated so that the retroviral genome is flanked by long terminal repeats (LTRs), respectively a U3 range, R and a U5 range included. The linear molecules are then integrated into the genome.
  • LTRs long terminal repeats
  • provirus Integration of the reverse transcribed virus genome into the host genome is called a provirus.
  • the provirus is replicated along with the cellular host DNA and transcribed as a cellular gene.
  • Proviral transcription is driven by promoter and enhancer sequences located in the U3 region of the 5 'LTR.
  • Polyadenylated transcripts begin at the junction between U3 and R in the 5 'LTR and terminate in the R of the 3' LTR containing the polyadenylation signal.
  • the retroviral genome can be exchanged for foreign DNA without affecting its ability to replicate in cells expressing the proteins necessary for reverse transcription, integration and particle formation.
  • vector DNA is transfected into cell lines containing either complete retroviral genomes or helper viruses. Helper viruses can not assemble into particles due to a deletion between U5 and gag . As a result, only recombinant transcripts are packaged and released from the cells into virus particles. Because of these technical possibilities, retroviral vectors are preferred as vectors for gene therapy.
  • the 5 'and / or 3' flanking sequences include full or partial LTR regions.
  • the at least one recombinase target sequence is preferably located in the U3 or U5 region of the 5 'and / or 3' LTRs. If the recombinase target sequence is outside the LTR, at least 2 recombinase target sequences are required. However, the transcription cassettes are preferably outside the LTRs. In the case of non-retroviral vectors, at least two recombinase target sequences are provided.
  • the first transcription cassette contains i.a. a sequence coding for a recombinase. It is preferably classified in the same direction of transcription as the possibly underlying virus genome.
  • the recombinase any natural or synthetic protein having recombinase activity can be used.
  • the recombinase encoded by the first transcriptional cassette is the recombinase Cre.
  • the Cre recombinase was originally identified in coliphage P1 and is well characterized.
  • the recombinase targeting sequence for recombinase Cre is the loxP sequence.
  • Artificial recombinase target sequences recognized by recombinase Cre may also be used.
  • Flp is used as the recombinase.
  • Flp is originally from S. cerevisiae . It recognizes preferably FRT sequences from S. cerevisiae . Again, these target sequences could be replaced by artificial target sequences recognized by the recombinase Flp.
  • any promoter dependent on a transcription factor can be used.
  • Preferred embodiments contemplate the use of ⁇ CMV (Gossen & Bujard, 1992) or ⁇ MMTV (Hoffmann et al., 1997). These promoters are truncated cytomegalovirus or mouse mammary tumor virus promoters that are dependent on transactivation by transcription factors.
  • the suicide gene encoded by the second transcriptional cassette is, in a preferred embodiment, a thymidine kinase gene.
  • thymidine kinase gene is thymidine kinase from herpes simplex virus (HSV-TK).
  • HSV-TK converts added ganciclovir into a toxic metabolism product.
  • suicidal proteins any proteins known to produce a toxic agent upon metabolism from a non-toxic prodrug can be provided.
  • Another example of such a suicide protein is cytosine deaminase.
  • the suicide gene in a further preferred embodiment is partially or fully complementary to an essential cellular gene.
  • the mRNA generated by transcription of the suicide gene is able to hybridize with the mRNA of the essential cellular gene (antisense mechanism). Consequences of mRNA hybridization are translation arrest and / or RNase H activation, which prevents the expression of the essential cellular gene and leads to cell death.
  • Essential cellular genes, e.g. of the primary metabolism are known to the person skilled in the art.
  • the suicide gene is able to produce a cytopathogenic virus by expression.
  • Cytopathogenic viruses known to those skilled in the art produce degenerative changes in the infected cells, e.g. Formation of giant cells, syncytia, inclusion bodies, vacuoles and granules, changes in the nucleus and lysis of the cells.
  • An exemplary cytopathogenic virus is Semliki Forest Virus.
  • the second transcription cassette is preferably arranged in the same direction of transcription as the virus genome and the first transcription cassette, wherein the first transcription cassette 5 'or 3' may be arranged relative to the second transcription cassette. In the opposite arrangement, which is also possible, a further polyadenylation sequence must be provided for the second transcription cassette.
  • Any strong eukaryotic promoter can be used as a promoter for the suicide gene.
  • Preferred promoters are, for example, the Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) LTR promoter. The skilled worker is aware of other promoters.
  • the vectors according to the invention also contain a selection marker cassette.
  • selection marker cassettes can be inserted into a U3 region. This can be used as evidence for the integration done will be used.
  • a selection marker cassette shown in the examples is SV40Puro. However, any other selection marker system that has been transcribed and translated into eukaryotes and known to those skilled in the art can also be used.
  • the invention further relates to pharmaceutical compositions containing the vector according to any one of claims 1 to 14 or 16. These pharmaceutical compositions are useful for the therapy of tumors characterized by the deficiency of a transcription factor.
  • the vector is packaged in the therapeutic composition in a virus particle.
  • the vectors according to the invention are preferably replication-competent in the pharmaceutical compositions. Most preferably, they are infectious, so that they are able to infect other cells.
  • the vector of the invention can be used to treat tumor patients.
  • it is intended by administration of the vector of the invention and subsequent administration of a precursor substance metabolizable by the suicide protein, e.g. Ganciclovir, targeted to kill tumor cells.
  • a precursor substance metabolizable by the suicide protein e.g. Ganciclovir
  • Another object of the invention is a transduced eukaryotic cell, which can be obtained by infecting a tumor cell having a deficient transcription factor with a recombinant vector according to any one of claims 1 to 14 or 16.
  • FIG. 1 is a diagrammatic representation of FIG. 1:
  • P promoter
  • MP minimal promoter
  • pA polyadenylation sequence
  • lx loxP target sequence for the sequence-specific recombinase Cre.
  • FIG. 2 is a diagrammatic representation of FIG. 1
  • FIG. 3 is a diagrammatic representation of FIG. 3
  • HSV-TK herpes simplex virus 2 thymidine kinase gene
  • pg13 p53-binding consensus sequence
  • CMV cytomegalovirus promoter
  • MMTV mouse mammary tumor virus promoter
  • lx loxP target sequence for the sequence-specific recombinase Cre
  • SV40 Simian virus 40 promoter
  • Puro puromycin resistance gene.
  • FIG. 4 is a diagrammatic representation of FIG. 4
  • HSV-TK herpes simplex virus 2 thymidine kinase gene
  • pg13 p53 binding consensus sequence
  • CMV cytomegalovirus promoter
  • MMTV mouse mammary tumor virus promoter
  • lx loxP target sequence for sequence-specific recombinase Cre
  • SV40 simian virus 40 promoter
  • Puro Puromycin resistance gene.
  • FIG. 5 is a diagrammatic representation of FIG. 5
  • SV SV40 promoter
  • x loxP target sequence for the sequence-specific recombinase Cre
  • Puro puromycin resistance gene
  • LacZ ⁇ -galactosidase gene
  • pA polyadenylation sequence.
  • FIG. 6 is a diagrammatic representation of FIG. 6
  • FIG. 7 is a diagrammatic representation of FIG. 7
  • the reporter construct pSVpaX1 (Buchholz et al., 1996) consists of the LacZ gene, which codes for an easily detectable protein ( ⁇ -galactosidase).
  • the LacZ gene is transcribed from an SV40 promoter only after Cre-mediated recombination ( Figure 5).
  • a puromycin phosphotransferase resistance gene flanked by two loxP sites.
  • the SV40 promoter transcribes the resistance gene in the unrecombined state and allows selection for the reporter construct.
  • the puromycin phophotransferase sequences are removed between the loxP sites and the LacZ gene is placed under the control of the SV40 promoter.
  • the cells transfected with pSVpaX1 were selected for 7 days with 0.5 mg / ml puromycin (Sigma). The obtained transformants showed no background staining after incubation with X-gal. Transfection with the Cre expression plasmid pMC-Cre resulted in a distinct LacZ-positive phenotype of the transfected cells.
  • Cre expression plasmids were transiently transfected with and without the p53 expression plasmid pSBC2-p53 into the p53 - / - reporter cell line Saos2 / pSVpax1. Transfection was by a standard protocol using Ca-phosphate coprecipitation (Pear et al., 1993).
  • Figure 6 clearly shows in both cases that p53 significantly stimulated the Cre-mediated recombination of the reporter plasmid pSVpax1 and, as a consequence thereof, the expression of ⁇ -galactosidase.
  • the minimal pmm motor pg13SV40 was exchanged for the minimal promoters pg13 ⁇ CMV and pg13 ⁇ MMTV as follows:
  • transformed mouse fibroblasts were infected with the same retroviruses as described in example 3 and isolated clones containing provirus.
  • the fibroblasts were p53 - / - -1AR.A9 cells derived from p53 knock-out mice (Lowe et al., 1994) and conventional NIH3T3 cells expressing low levels of wild-type p53 , While 100% of all puromycin-resistant 1AR.A9 clones died in GC due to lack of recombination, 57% of NIH3T3 cell clones survived ( Figure 7, Table 1).

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, eine den erfindungsgemäßen Vektor enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung, die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors zur Herstellung eines Arzneimittels für die Krebstherapie und transduzierte eukaryontische Zellen.
  • Die Therapie von benignen oder malignen Tumoren erfolgt bisher überwiegend entweder invasiv, d.h. durch chirurgische Entfernung des Tumors, oder konservativ, z.B. durch Verabreichung von Cytostatika oder Bestrahlen der betroffenen Organe, oder durch eine Kombination der erwähnten Methoden. Aufgrund sich stetig verbessernder Operationstechniken und einer enormen Entwicklung auf dem Gebiet der Cytostatika werden mit diesen Therapiemöglichkeiten bereits beachtliche Erfolge erzielt.
  • Dennoch sind die Erfolgsaussichten bei der Behandlung eines Tumors durch die erwähnten therapeutischen Ansätze sehr unterschiedlich und unsicher. Darüber hinaus ist jeder der drei Ansätze mit gravierenden Nachteilen verbunden. So bedeutet die operative Entfernung eines Tumors und gegebenenfalls dessen Umschneidung im gesunden Gewebe eine erhebliche Beeinträchtigung des Patienten aufgrund des Eingriffs selber. Die Behandlung mit Cytostatika sowie die Bestrahlung von Tumoren läßt sich nur in Ausnahmefällen auf die eigentlichen Zielzellen beschränken, so daß es nahezu unumgänglich ist, gesunde Zellen bzw. gesundes Gewebe mit zu behandeln. Eine Behandlung mit Cytostatika bedeutet die Inhibition von Mitosen, was z.B. als unangenehme Begleiterscheinung zum Haarausfall führt. Sowohl die cytostatische Behandlung als auch eine Strahlentherapie können bei Patienten im gebär- bzw. zeugungsfähigen Alter den Verzicht auf Kinder bedeuten.
  • Aufgrund der-zuvor erwähnten Beeinträchtigungen ist bereits versucht worden, Therapeutika, insbesondere Cytostatika, zielgerichtet zu Tumorzellen zu transportieren und sie von ihnen internalisieren zu lassen. Ein Beispiel dafür ist der Versuch, Cytostatika an Antikörper zu koppeln, die an tumorzellspezifische Antigene binden. Trotz der theoretischen Attraktivität dieses Vorschlags ist er jedoch mit erheblichen Schwierigkeiten, z.B. bei der Beschaffung ausreichender Mengen von Antikörpern, sowie mit ebenfalls erheblichen Risiken, wie z.B. einer immunologischen Reaktion auf das zugeführte Fremdprotein, verbunden.
  • Ein weiterer Ansatz beruht auf der Kenntnis der Rolle von Transkriptionsfaktoren bei der Tumorentstehung. Es ist allgemein bekannt, daß einige nukleäre Transkriptionsfaktoren der Überwachung der Integrität des zellulären Genomes dienen Wird die genomische DNA beschädigt, so induzieren diese Transkriptionsfaktoren entweder einen zur Reparatur notwendigen Zellzyklusarrest oder, bei irreparablen Schäden, die Apoptose. Dadurch besitzen diese Transkriptionsfaktoren eine wichtige Tumorsuppressorfunktion. Eine große Anzahl von Arbeiten der letzten Jahre hat sich mit dem Transkriptionsfaktor p53 beschäftigt, insbesondere mit dem Zusammenhang von gestörter p53-Funktion mit der Entstehung von Krebs (Levine, 1997). Der Phänotyp von p53-/--Mäusen, erzeugt mittels "Gene-Targeting", belegt diesen Zusammenhang: Das Fehlen des Proteins führt zum verstärkten Auftreten spontaner Tumoren (Donehower et al., 1992). Darüber hinaus konnte mit Hilfe dieser Mäuse gezeigt werden, daß p53 bei der Induktion von Apoptose eine Schlüsselrolle spielt (Lowe et al., 1994).
  • Bei herkömlichen Tumortherapien, wie einer Bestrahlung oder Chemotherapie, spielt gerade diese p53-vermittelte Apoptose-Induktion eine wichtige Rolle (Lowe et al., 1993). Aufgrund der damit verbundenen Resistenz gegenüber Cytostatika oder Bestrahlungstherapie haben Krebsarten mit mutiertem p53 (p53mut) meistens eine schlechte Prognose.
    Beim Menschen treten Mutationen von oder Deletionen in p53 in 50-80% aller Krebsarten auf (Levine et al., 1991). Sie betreffen immer die DNA-Birrdungsdomäne und haben den Verlust der p53-Transaktivatorfunktion zur Folge.
  • Der genetische Unterschied zwischen p53-Molekülen in normalen und transformierten Zellen wurde kürzlich zur selektiven Eliminierung von Tumorzellen ausgenutzt. Eine Adenovirus-Mutante, die sich nur in p53-defizienten Zellen vermehren kann, zerstörte im Nacktmausexperiment selektiv und effizient transplantierte humane p53mut - Tumoren (Bischoff et al., 1996). Beim Menschen könnte sich allerdings eine bereits vorhandene Immunität gegenüber Adenoviren als großes Problem herausstellen. Weil der Großteil der Bevölkerung bereits durch vorangegangene Adenovirus-Infektionen immunisiert ist, ist es denkbar, daß die Mehrzahl der zur Therapie vorgesehenen Patienten das therapeutische Virus eliminieren wird, ehe es sein erwünschtes Killing-Potential entfalten kann. Aus diesem Grunde sind adenovirale Vektoren auch nur bedingt zum Einsatz in der Gentherapie geeignet.
  • Ausgehend von diesem Stand der Technik war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Wege bereitzustellen, um Tumorzellen gezielt bekämpfen zu können.
  • Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch einen rekombinanten Vektor, umfassend:
    • (a) mindestens eine erste Transkriptionskassette, enthaltend eine für eine Rekombinase kodierende Sequenz, einen damit funktionell verbundenen Minimalpromotor MP, eine Transkriptionsfaktorbindestelle und gegebenenfalls eine Polyadenylierungssequenz, wobei der Minimalpromotor MP von der Aktivierung durch einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren abhängig ist;
    • (b) mindestens eine zweite Transkriptionskassette, enthaltend ein Suizidgen, einen damit funktionell verbundenen Promotor P und gegebenenfalls eine Polyadenylierungssequenz;
    • (c) eine 5'-flankierende Sequenz und/oder eine 3'-flankierende Sequenz, wobei die 5'- und/oder 3'-flankierende Sequenz eine Rekombinase-Targetsequenz enthält.
  • Der erfindungsgemäße Vektor ermöglicht die gezielte und selektive Elimination von Tumorzellen dadurch, daß durch den Vektor ein Suizidgen in die Zellen eingeführt wird, das in gesunden Zellen durch die Expression der Rekombinase umgehend eliminiert wird, während es in Tumorzellen mit inaktiven Transkriptionsfaktoren aktiviert werden kann und durch (i) Expression des Suizidproteins, (ii) Transkription von antisense-RNA oder (iii) durch Produktion von cytopathogenem Virus zum Zelltod führt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Vektor" ein lineares oder zirkuläres Nukleinsäuremolekül, das sowohl aus Desoxyribonukleinsäure als auch aus Ribonukleinsäure bestehen kann. Für die Gentherapie geeignete Vektoren, die als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäßen Vektoren dienen können, sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugte Vektoren sind dabei von viralen oder retroviralen Genomen abgeleitete Vektoren, da diese sich in Viren verpacken lassen und durch Transduktion leicht in Zellen eingebracht werden können. Vektoren auf nicht-viraler Grundlage sind ebenfalls denkbar, erfordern jedoch weitere Maßnahmen zur Transfektion. Geeignete Vektoren wären z.B. vollsynthetische Vektoren oder Vektoren, die durch attenuierte Bakterien transduziert werden.
  • "Replikationskompetenz" bedeutet die Fähigkeit eines Vektors, in Wirtszellen replizieren zu können. Sehr breite Replikationskompetenz in Bezug auf Säuger-zellen besitzen, z.B. Adenovirus, Retroviren wie z.B. Maus-Leukämievirus MuLV, insbesondere Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV). Von der Erfindung umfaßt werden allgemein in eukaryontischen Zellen replikationskompetente Vektoren. Sind die Vektoren Retroviren, so werden infektöse Retroviren bevorzugt. "Transkriptionskassetten" sind Nukleinsäureeinheiten, die neben der für ein Protein kodierenden Sequenz die erforderlichen regulatorischen Bereiche, z.B. Promotor oder Minimalpromotor mit Transkriptionsfaktorbindestelle und Polyadenylierungssequenzen, enthalten. Die erste Transkriptionskassette kann 5' oder 3' relativ zur zweiten Transkriptionskassette liegen.
  • Ein "Minimalpromotor" ist ein natürlicher oder synthetischer Promotor oder Enhancer, der nur in Gegenwart eines spezifischen Transkriptionsfaktors die Genexpression aktivieren kann. Er enthält mindestens eine natürliche oder synthetische Transkriptionsfaktorbindestelle.
  • Eine "Transkriptionsfaktorbindestelle" ist eine natürliche oder synthetische Nukleinsäuresequenz, an die ein zur Aktivierung eines Minimalpromotors erforderlicher Transkriptionsfaktor binden kann.
  • Eine "Rekombinase" ist ein natürliches oder synthetisches Enzym, das spezifische Targetsequenzen erkennt, schneidet und miteinander rekombiniert. Beispiele hierfür sind die Cre-Rekombinase aus dem P1-Coliphagen (Sternberg und Hamilton, 1981) und die Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae (Broach und Hicks, 1980).
  • Eine "Targetsequenz" ist eine natürliche oder synthetische Sequenz, die von einer Rekombinase spezifisch erkannt werden kann. Beispiele hierfür sind die loxP-Sequenzen aus dem P1-Coliphagen (Gu et al., 1993; Sauer und Henderson, 1988; Sternberg und Hamilton, 1991) und die FRT-Sequenzen aus S. cerevisiae (Broach und Hicks, 1980; Golic und Lindquist, 1989; O'Gorman et al., 1991).
  • Ein "Suizidgen" ist eine Nukleinsäuresequenz, die durch Transkription und gegebenenfalls Expression zum Zelltod führt. Im erfindungsgemäßen Vektor ist es als Teil einer Transkriptionskassette, d.h. in Verbindung mit einem Promotor und gegebenenfalls einer Polyadenylierungssequenz, vorhanden.
  • Es ist in einem Aspekt der Erfindung beabsichtigt, daß das Suizidgen teilweise oder vollständig komplementär zu einem essentiellen Gen ist. Die durch Transkription erzeugte mRNA des Suizidgens ist fähig, mit der mRNA des essentiellen zellulären Gens zu hybridisieren. Folgen der mRNA-Hybridisierung sind Translationsarrest des essentiellen zellulären Gens und/oder RNase H-Aktivierung mit nachfolgendem Zelltod. Das essentielle zelluläre Gen kann ausgewählt sein aus Cyclinen und ati-apoptotischen Proteinen wie z.B. Bcl-2.
  • Ein weiterer erfindungsgemäß beabsichtigter Wirkmechanismus des Suizidgens besteht darin, daß das Suizidgen ein cytopathogenes Virus wie z.B. Semliki Forest Virus kodiert, das die Zelle abtötet. Das Suizidgen kann weiterhin eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die ein Suizidprotein kodiert.
  • Ein "Suizidprotein" ist ein natürliches oder artifizielles Polypeptidprodukt, das unmittelbar oder mittelbar zum Zelltod führt. Die mittelbare Wirkung beruht z.B. auf der Wechselwirkung mit einem nicht toxischen Wirkstoffvorläufer, so daß dieser in einen toxischen Wirkstoff konvertiert wird, der den Tod einer Zelle herbeizuführen in der Lage ist. Das Suizidprotein kann ein Antigen sein wie z.B. Influenza-Hämagglutinin oder Fremd-MHC-Antigene. Die unmittelbare Wirkung beruht in diesem Fall auf der Stimulierung einer gegen die Tumorzelle gerichteten Immunantwort.
  • Mit den erfindungsgemäßen Vektoren ist es erstmals möglich, Tumorzellen mit defektem Transkriptionsfaktor gezielt und direkt zu eliminieren. Grundlage für die Selektivität des erfindungsgemäßen Vektors ist, daß die von der ersten Transkriptionskassette kodierte Rekombinase nur in Zellen mit intaktem Transkriptionsfaktor exprimiert werden kann. In Tumorzellen mit defektem Transkriptionsfaktor unterbleibt die Bindung des Transkriptionsfaktors an die mit dem Minimalpromotor assoziierte Transkriptionsfaktorbindestelle. Da der Minimalpromotor der Aktivierung durch den Transkriptionsfaktor bedarf, findet keine Transkription und damit auch keine Expression des von der ersten Transkriptionskassette kodierten Genes, d.h. der Rekombinase, statt. Im Gegensatz dazu kann die kodierende Sequenz der zweiten Transkriptionskassette, d.h. das Suizidgen, transkribiert werden, da der mit diesem Gen funktionell verbundene Promotor von einer Aktivierung durch einen Transkriptionsfaktor unabhängig ist. Das nunmehr exprimierte Suizidprotein wird, nachdem es in Kontakt mit einem Wirkstoffvorläufer gekommen ist, diesen metabolisieren und damit zur Produktion eines toxischen Wirkstoffs beitragen. Dieses Metabolismusprodukt führt nachfolgend zum Tod der jeweils betroffenen Zelle. Alternativ könnte unmittelbar eine zelltypspezifische antisense-RNA oder ein Virus zum Zelltod führen.
  • In gesunden Zellen dagegen, d.h. in Zellen mit intaktem Transkriptionsfaktor, kann dieser an die Transkriptionsfaktorbindestelle binden, so daß das von der ersten Transkriptionskassette kodierte Protein, d.h. die Rekombinase, exprimiert wird. Aufgrund der z.B. a priori vom Vektor mitgebrachten Rekombinase-Targetsequenzen, die den Bereich der Transkriptionskassetten flankieren, wird der zwischen den Targetsequenzen liegende Bereich mit der ersten und der zweiten Transkriptionskassette sofort deletiert. Im Fall von retroviralen Vektoren wird durch die Integration eine Verdoppelung des LTR's und somit eine Verdoppelung der Rekombinase-Targetsequenz(en) herbeigeführt. Der zwischen den Targetsequenzen liegende Bereich wird ebenfalls deletiert. Zurück bleibt im Fall einer gesunden Zelle lediglich eine Kopie der Targetsequenz gegebenenfalls zusammen mit dem LTR pro vormaliger Integrationsstelle des Vektors.
  • Bei dem angesprochenen Transkriptionsfaktor kann es sich um jeden Transkriptionsfaktor mit einem Defekt handeln, der eine Einschränkung oder vollständige Beseitigung der Transaktivatorfähigkeit zur Folge hat. Ein bekanntes Beispiel für einen Transkriptionsfaktor, dessen DNA-bindende Domäne in Tumorzellen relativ häufig so verändert ist, daß eine DNA-Bindung und folglich auch eine Transaktivierung nicht mehr stattfindet, ist der erwähnte Faktor p53.
  • In humanen Tumoren befinden sich die p53-Mutationen immer in der DNA-Bindungsdomäne. Dies führt häufig zu einem Verlust des DNA Bindungsvermögens und damit der Transaktivatorfunktion des Proteins. p53 bindende Konsensussequenzen wurden in einer Reihe von Promotoren gefunden und charakterisiert. p53 reguliert darüber unter anderem die Expression von p21 (WAF1) (el-Deiry et al. 1994), bax (Miyashita and Reed, 1995) und IGF-BP3 (Buckbinder et al. 1995). Eine derartige p53-bindende Konsensussequenz ist z.B. das PG-Motiv (CCTGCCTGGACTTGCCTG) (el-Deiry et al, 1992). Die Erfinder und andere haben gezeigt, daß dieses Motiv (PGn) in Zusammenhang mit einem Minimalpromotor (MP) die Expression eines Reportergens p53-induzierbar macht. Eine derartige Induktion ist mit mutiertem p53 nicht möglich. Dies wurde unter anderem für die Kombinationen PGn-CMVMin-CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase) (Kern et al., 1992) und pg13-SV40Min-SEAP (Sekretierte-Alkalische-Phosphatase) gezeigt. Die p53-bindende Konsensussequenz pg13 ist für die Zwecke der Erfindung bevorzugt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung bestehen die flankierenden Sequenzen im wesentlichen aus den Rekombinase-Targetsequenzen. Bei diesen kann es sich um natürliche oder synthetische Sequenzen handeln, die von einer natürlichen oder rekombinanten Rekombinase erkannt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungform ist der erfindungsgemäße Vektor von einem Retrovirus abgeleitet. Retroviren sind RNA-Viren, deren Replikation ein DNA-Intermediat involviert. Das virale RNA-Genom wird von kurzen wiederholten Sequenzen (Repeats, R) und nicht wiederholten Sequenzen (Unique Sequences, U5 und U3) flankiert, die die DNA-Synthese, die Integration des Virusgenoms in das Wirtsgenom, die Transkription und die RNA-Prozessierung steuern. Zwischen diesen Kontrollbereichen befinden sich kodierende Sequenzen für die wichtigsten Strukturproteine des Viruspartikels, nämlich gag und env, und für weitere im Partikel verpackte Enzyme (pol, Protease, reverse Transkriptase und Integrase). Kurz nach der Infektion wird die virale RNA von der reversen Transkriptase in DNA übersetzt. Vor der Integration werden die endständigen Sequenzen des viralen Genomes verdoppelt, so daß das retrovirale Genom von langen endständigen wiederholten Sequenzen (Long Terminal Repeats, LTR) flankiert wird, die jeweils einen U3-Bereich, R und einen U5-Bereich enthalten. Die linearen Moleküle werden dann in das Genom integriert.
  • Nach Integration des revers transkribierten Virusgenoms in das Wirtsgenom spricht man von einem Provirus. Das Provirus wird zusammen mit der zellulären Wirts-DNA repliziert und wie ein zelluläres Gen transkribiert. Die Provirustranskription wird durch Promotor- und Enhancersequenzen gesteuert, die sich im U3-Bereich des 5'-LTR befinden. Polyadenylierte Transkripte beginnen an dem Übergang zwischen U3 und R im 5'-LTR und enden im R des 3'-LTR, welcher das Polyadenylierungssignal enthält.
  • Vorausgesetzt, daß bestimmte Kontrollsequenzen innerhalb der LTRs erhalten bleiben, kann das retrovirale Genom gegen Fremd-DNA ausgetauscht werden, ohne seine Fähigkeit zur Replikation in Zellen, die die für die reverse Transkription, Integration und Partikelbildung notwendigen Proteine exprimieren, zu beeinträchtigen. Um die für die Replikationsmaschinerie erforderlichen Enzyme bereitzustellen, wird Vektor-DNA in Zellinien transfiziert, die entweder vollständige retrovirale Genome oder Helferviren enthalten. Die Helferviren können sich dabei in Folge einer Deletion zwischen U5 und gag nicht zu Partikeln zusammenlagern. Infolgedessen werden nur rekombinante Transkripte verpackt und von den Zellen in Viruspartikeln freigesetzt. Aufgrund dieser technischen Möglichkeiten sind retrovirale Vektoren als Vektoren für die Gentherapie bevorzugt.
  • Im Fall eines von Retroviren abgeleiteten Vektors umfassen die 5'- und/oder 3'-flankierenden Sequenzen vollständige oder partielle LTR-Bereiche. Die mindestens eine Rekombinase-Targetsequenz befindet sich dabei bevorzugt im U3- oder U5-Bereich des 5'- und/oder 3'-LTRs. Liegt die Rekombinase-Targetsequenz außerhalb des LTR, so sind mindestens 2 Rekombinase-Targetsequenzen erforderlich. Die Transkriptionskassetten jedoch befinden sich bevorzugt außerhalb der LTR's. Im Fall nicht retroviraler Vektoren werden mindestens zwei Rekombinase-Targetsequenzen zur Verfügung gestellt.
  • Die erste Transkriptionskassette enthält u.a. eine für eine Rekombinase kodierende Sequenz. Sie wird bevorzugt in gleicher Transkriptionsrichtung wie das gegebenenfalls zugrundeliegende Virusgenorm eingeordnet.
  • Als Rekombinase kann jedes natürliche oder synthetische Protein mit Rekombinaseaktivität verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die von der ersten Transkriptionskassette kodierte Rekombinase die Rekombinase Cre. Die Cre-Rekombinase wurde ursprünglich im Coliphagen P1 identifiziert und ist sehr gut charakterisiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Rekombinase-Targetsequenz für die Rekombinase Cre die loxP-Sequenz. Artifizielle Rekombinase-Targetsequenzen, die von der Rekombinase Cre erkannt werden, können ebenfalls verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform wird als Rekombinase Flp eingesetzt. Flp stammt ursprünglich aus S. cerevisiae. Sie erkennt bevorzugt FRT-Sequenzen aus S. cerevisiae. Diese Targetsequenzen könnten wiederum durch artifizielle Targetsequenzen, die von der Rekombinase Flp erkannt werden, ersetzt werden.
  • Als Minimalpromotor kann jeder von einem Transkriptionsfaktor abhängige Promotor verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen sehen die Verwendung von ΔCMV (Gossen & Bujard, 1992) oder ΔMMTV (Hoffmann et al., 1997) vor. Bei diesen Promotoren handelt es sich um trunkierte Cytomegalie- bzw. Maus-Mammatumorvirus-Promotoren, die von einer Transaktivierung durch Transkriptionsfaktoren abhängig sind.
  • Das von der zweiten Transkriptionskassette kodierte Suizidgen ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein Thymidinkinasegen. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist dabei Thymidinkinase aus Herpes-Simplex-Virus (HSV-TK). HSV-TK setzt z.B. zugefügtes Ganciclovir zu einem toxischen Metabolismusprodukt um. Als Suizidproteine können jedoch alle Proteine vorgesehen werden, von denen bekannt ist, daß sie nach Metabolisierung aus einem nicht toxischen Vorläuferwirkstoff einen toxischen Wirkstoff erzeugen. Ein weiteres Beispiel eines solchen Suizidproteines ist die Cytosindesaminase.
  • Das Suizidgen ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform teilweise oder vollständig komplementär zu einem essentiellen zellulären Gen. Die durch Transkription des Suizidgens erzeugte mRNA ist fähig, mit der mRNA des essentiellen zellulären Gens zu hybridisieren (antisense-Mechanismus). Folgen der mRNA-Hybridisierung sind Translationsarrest und/oder RNase H-Aktivierung, welches die Expression des essentiellen zellulären Gens verhindert und zum Zelltod führt. Essentielle zelluläre Gene wie z.B. des Primärstoffwechsels sind dem Fachmann bekannt.
  • Das Suizidgen ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform in der Lage, durch Expression ein cytopathogenes Virus herzustellen. Dem Fachmann bekannte cytopathogene Viren erzeugen in den infizierten Zellen degenerative Veränderungen wie z.B. Bildung von Riesenzellen, Syncytien, Einschlußkörpern, Vakuolen und Granula, Veränderungen des Zellkerns und Lyse der Zellen. Ein beispielhaftes cytopathogenes Virus ist das Semliki Forest Virus.
  • Die zweite Transkriptionskassette wird bevorzugt in gleicher Transkriptionsrichtung wie das Virusgenom und die erste Transkriptionskassette angeordnet, wobei die erste Transkriptionskassette 5'oder 3' relativ zur zweiten Transkriptionskassette angeordnet sein kann. Bei entgegengesetzter Anordnung, die auch möglich ist, muß für die zweite Transkriptionskassette eine weitere Polyadenylierungssequenz vorgesehen werden.
  • Als Promotor für das Suizidgen kann jeder beliebige starke eukaryontische Promotor eingesetzt werden. Bevorzugte Promotoren sind beispielsweise der LTR-Promotor des Moloney-Maus-Leukämievirus (MoMuLV). Dem Fachmann sind weitere Promotoren bekannt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren außerdem eine Selektionsmarkerkassette. Selektionsmarkerkassetten können z.B. in eine U3-Region inseriert werden. Diese kann als Nachweis für die erfolgte Integration verwendet werden. Eine in den Beispielen dargestellte Selektionsmarkerkassette ist SV40Puro. Jedes andere in Eukaryonten transkribierte und translatierte, dem Fachmann bekannte Selektionsmarkersystem kann jedoch ebenso verwendet werden.
  • Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16 enthalten. Diese pharmazeutischen Zusammnensetzungen sind nützlich für die Therapie von Tumoren, die sich durch die Defizienz eines Transkriptionsfaktors auszeichnen. In bevorzugten Ausführungsformen liegt der Vektor in der therapeutischen Zusammensetzung in einem Viruspartikel verpackt vor.
  • Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Vektoren in den pharmazeutischen Zusammensetzungen replikationskompetent. Besonders bevorzugt sind sie infektös, so daß sie in der Lage sind, weitere Zellen zu infizieren.
  • Der erfindungsgemäße Vektor kann verwendet werden, um Tumorpatienten zu behandeln. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es beabsichtigt, durch Verabreichen des erfindungsgemäßen Vektors und anschließende Gabe einer durch das Suizidprotein metabolisierbaren Vorläufersubstanz, z.B. Ganciclovir, gezielt Tumorzellen abzutöten.
  • Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine transduzierte eukaryontische Zelle, die durch Infizieren einer Tumorzelle, die einen defizienten Transkriptionsfaktor aufweist, mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16 erhalten werden kann.
  • Die folgenden Figuren und die Beispiele erläutern die Erfindung.
    • Kurze Beschreibung der Figuren Figur 1:
  • Vektorkonzept und Funktionsprinzip zur selektiven Eliminierung von Tumorzellen. P= Promotor, MP = Minimalpromotor, pA = Polyadenylierungssequenz, lx = loxP Targetsequenz für die sequenzspezifische Rekombinase Cre.
    • Figur 2:
  • Selbstdeletierende retrovirale Vektoren und Funktionsprinzip zur selektiven Eliminierung von Tumorzellen. Nach Integration des Provirus befinden sich Suizidgen und Cre-Rekombinase zwischen zwei loxP Stellen. In normalen Zellen wird die Expression der Cre-Rekombinase aktiviert und der Großteil der integrierten Sequenzen eliminiert. In Krebszellen hingegen liegt der Transkriptionsfaktor mutiert vor und kann die Transkription der Rekombinase nicht aktivieren. Als Folge davon exprimieren nur infizierte Krebszellen das Suizidgen. Auf diese Weise werden nur Tumorzellen gegenüber dem entsprechenden Wirkstoff empfindlich. U3RU5 = retrovirale Kontrollregion mit Promotor, MP = Minimalpromotor, lx = loxP Targetsequenz für die sequenzspezifische Rekombinase Cre.
    • Figur 3:
  • Selbstdeletierende retrovirale Vektoren zur selektiven Eliminierung von Tumorzellen durch Ganciclovir. HSV-TK = Herpes simplex virus 2 Thymidin-kinasegen, pg13 = p53-bindende Konsensussequenz, CMV = Cytomegalievirus-Promotor, MMTV = Maus-Mammatumorvirus-Promotor, lx = loxP Targetsequenz für die sequenzspezifische Rekombinase Cre, SV40 = Simian virus 40-Promotor, Puro = Puromycinresistenzgen.
    • Figur 4:
  • Unterschiedliches Verhalten der selbstdeletierenden Retroviren in normalen und Tumorzellen. Nach Verdopplung der U3-Region des LTR nach Integration der Proviren liegt der Großteil der Konstrukte zwischen zwei loxP Stellen. p53 abhängige Transkription des Cre-Enzyms führt zur selektiven Rekombination in normalen Zellen. In Tumorzellen liegt p53 mutiert und damit nicht funktionell vor. Eine Cre-vermittelte Rekombination ist dadurch nicht möglich und das gesamte Provirus bleibt erhalten. Als Folge davon wird HSV-TK exprimiert und macht die Tumorzellen empfindlich auf Ganciclovir. Normale Zellen reagieren aufgrund der fehlenden HSV-TK nicht auf Ganciclovir. HSV-TK = Herpes simplex virus 2 Thymidin-kinasegen, pg13 = p53-bindende Konsensussequenz, CMV = Cytomegalievirus Promotor, MMTV = Maus-Mammatumorvirus-Promotor, lx = loxP Targetsequenz für die sequenzspezifische Rekombinase Cre, SV40 = Simian virus 40 Promotor, Puro = Puromycinresistenzgen.
    • Figur 5:
  • Cre-Reporterplasmid pSVpax1. Cre-vermittelte Rekombination führt zur Transkription des LacZ-Gens vom SV40 Promotor. SV = SV40 Promotor, x = loxP Targetsequenz für die sequenzspezifische Rekombinase Cre, Puro = Puromycinresistenzgen, LacZ = β-Galaktosidasegen, pA = Polyadenylierungssequenz.
    • Figur 6:
  • Transfektion der p53-abhängigen Cre-Expressionsplasmide in die Reporter-Zellinie Saos2/pSVpax1: A: Transfektion von ppg13ΔCMVCrepA allein (-p53) bzw. mit pSBC2-p53 (+p53). B: Kotransfektion von ppg13ΔMMTVCrepA allein (-p53) bzw mit pSBC2-p53 (+p53).
    • Figur 7:
  • PCR zum Nachweis der Cre-Rekombinase. Genomische DNA wurde mit Cre-spezifischen Primern amplifiziert. Als Kontrolle der Provirusintergration dienten SV40-spezifische Primer.
    • BEISPIELE Beispiel 1 Herstellung einer Saos2-Reporterzellinie zum Nachweis von Cre-vermittelter Rekombination
  • Um eine Zellinie zu erhalten, mit der die Aktivität der Cre-Rekombinase nachgewiesen werden kann, wurden humane, p53-defiziente Saos2-Osteosarkomzellen mit dem Reporterkonstrukt pSVpaX1 mittels Ca-Phosphat-Kopräzipitations-Methode (Pear et al., 1993) stabil transfiziert.
  • Das Reporterkonstrukt pSVpaX1 (Buchholz et al., 1996) besteht aus dem LacZ-Gen, das für ein leicht detektierbares Protein (β-Galaktosidase) kodiert. Das LacZ-Gen wird erst nach Cre-vermittelter Rekombination von einem SV40-Promotor transkribiert (Figur 5).
  • Zwischen den kodierenden Sequenzen des SV40-Promotors und des LacZ-Gens befindet sich ein Puromycin-Phosphotransferase-Resistenzgen, das von zwei loxP Stellen flankiert wird. Der SV40-Promotor transkribiert im nicht-rekombinierten Zustand das Resistenzgen und ermöglicht die Selektion auf das Reporterkonstrukt. In Anwesenheit von Cre-Rekombinase werden die Puromycin-Phophotransferase-Sequenzen zwischen den loxP-Stellen entfernt und das LacZ-Gen unter die Kontrolle des SV40-Promotors gebracht. Durch Detektiön der β-Galaktosidase-Expression in den Zellen (X-Gal Färbung) ist somit ein einfacher Nachweis der Cre-Rekombinase Aktivität möglich.
  • Die mit pSVpaX1 transfizierten Zellen wurden für 7 Tage mit 0.5 mg/ml Puromycin (Sigma) selektiert. Die erhaltenen Transformanten zeigten keinerlei Hintergrund-Färbung nach Inkubation mit X-Gal. Die Transfektion mit dem Cre-Expressionsplasmid pMC-Cre führte zu einem deutlichen LacZ-positiven Phänotyp der transfizierten Zellen.
    • Beispiel 2 Herstellung von p53-abhängigen Cre-Expressionsplasmiden
  • Die p53-Abhängigkeit zeigten wir für zwei verschiedene Minimalpromotoren mit Hilfe von Cre-Expressionsplasmiden. Diese Minimalpromotoren bestehen aus dem p53-bindenden pg13-Motiv (Kern et al., 1992), gekoppelt zum einen an einen verkürzten Cytomegalie-Virus (ΔCMV)-Promotor (Gossen and Bujard, 1992), zum anderen an einen verkürzten murinen Mammatumor-Virus (ΔMMTV)-Promotor (Hoffmann et al., 1997). Die Klonierung der beiden Expressionsplasmide geschah auf folgendem Weg:
    • 1. Verdau von pBluescript (pBS) mit dem Restriktionsenzym Clal und dem Klenow-Enzym und von pU3Cre (Russ et al., 1996) mit Nhel und Klenow-Enzym. Ligation des Cre-Fragmentes mit dem linearisierten Vektor ergab pBSCre.
    • 2. Verdau von pBSCre und von pGLpg13Seap (C. Rinderele, Asta Medica AG) mit Sacl und EcoRI. Das pg13-Fragment wurde als Sacl/EcoRI-Fragment aus pGlpg13Seap 5' von Cre in pBSCre kloniert. Dies ergab ppg13Cre.
    • 3. Verdau von ppg13Cre mit HindIII und Klenow-Enzym. Ligationen: 1. mit dem synthetischen ΔCMV-Promotor Stück (GGC CGG CCT ATA AGC AGA GCT CGT TTA GTG GCC) ergab ppg13ΔCMVCre. 2. mit einem PCR-Fragment des ΔMMTV-Promotors (Primer 5': CCT ATG TTA TTT TGG AAC TTA TCC, Primer 3': AGG GCC CTG TTC GGG CGC C) ergab ppg13ΔMMTVCre.
    • 4. Verdau der beiden Konstrukte (ppg13ΔCMVCre und ppg13ΔCMVCre) mit Sall und Klenow-Enzym und von ppg13Seap mit BamHI, Sall und Klenow-Enzym. Ligation des ausgeschnittenen Poly-Adenylierungs-Signals (pA) resultierte in den zwei folgenden p53-abhängigen Cre-Expressionsplasmiden:
      • _ ppg13ΔCMVCrepA
      • _ ppg13ΔMMTVCrepA.
  • Zum Nachweis der p53-abhängigen Cre-vermittelten Rekombination wurden die Cre-Expressionsplasmide transient mit und ohne das p53-Expressionsplasmid pSBC2-p53 in die p53-/-- Reporter-Zellinie Saos2/pSVpax1 transfiziert. Die Transfektion geschah nach einem Standardprotokoll mittels Ca-Phosphat Kopräzipitation (Pear et al., 1993).
  • Nach 48 Stunden wurden die Zellen zum Nachweis von β-Galaktosidase mit X-Gal gefärbt. Figur 6 zeigt in beiden Fällen deutlich, daß p53 die Cre-vermittelte Rekombination des Reporterplasmids pSVpax1 und als Folge davon die Expression von β-Galaktosidase signifikant stimulierte.
  • Die Ergebnisse belegen, daß die beiden erzeugten Minimalpromotoren pg13ΔCMV und pg13ΔMMTV eine p53-abhängige Expression der Cre Rekombinase ermöglichen.
    • Beispiel 3 Klonierung von p53-regulierten selbstdeletierenden retroviralen Vektoren
  • Der Klonierungsweg zu den p53-abhängigen selbstdeletierenden Konstrukten ist im folgenden kurz dargestellt:
    • 1. Verdau von pBS und von pGLpg13Seap mit HindIII. Ligation des Vektors mit dem pg13SV40 Fragment ergab ppg13SV40.
    • 2. Verdau von pU3TK (Russ et al. 1996b) mit Nhel und Klenow-Enzym und von ppg13SV40 mit Sall und Klenow-Enzym. Ligation der Thymidinkinase (TK)-Kassette mit dem Vektor ergab pHSVTKpgSV40.
    • 3. Verdau von pU3Cre mit Nhel und Klenow-Enzym und von pTKpg13SV40 mit Xbal und Klenow-Enzym. Ligation von Cre mit dem Vektor ergab pHSVTKpgSV40Cre.
    • 4. Verdau von pTKpg13SV40Cre mit Notl, Klenow-Enzym, danach mit Xhol, und von pBABEpuro (Russ et al. 1996b) mit Clal, Klenow-Enzym und danach mit Sall. Ligation der TKpg13SV40Cre-Kassette mit dem pBABE-Fragment ergab pHSVTKpgSV40CreU3RU5.
    • 5. Die lxSV40puro-Kassette aus dem Konstrukt pggSV40CrelxSV40Puro (Russ et al., 1996a) wurde mit BamHI und Clal ausgeschnitten und in die entsprechenden Restriktionsstellen von pBS ligiert. Das ergab pBSlxSV40Puro.
    • 6. Verdau von pHSVTKpgSV40CreU3RU5 mit Nhel und pBSlxSV40Puro mit Spel und Xbal. Ligation der lxSV40Puro-Kassette mit dem retroviralen Vektor ergab pHSVTKpgSV40CreU3lxSV40Puro.
  • Der Minimalpmmotor pg13SV40 wurde wie folgt gegen die Minimalpromotoren pg13ΔCMV bzw. pg13ΔMMTV ausgetauscht:
  • Verdau des Plasmides pHSVTKpgSV40CreU31×SV40Puro mit BstBI und partieller Verdau mit EcoRI. Verdau der Expressionsplasmide ppg13ΔCMVCrepA bzw. ppg13ΔMMTVCrepA mit denselben Restriktionsenzymen. Ligation der entsprechenden Fragmente ergab die beiden folgenden p53-regulierten selbstdeletierenden Konstrukte (Figur 3):
    • _ pHSVTKpgΔCMVCreU3IxSV40Puro
    • _ pHSVTKpgΔMMTVCreU3IxSV40Puro.
  • Zum Nachweis, daß die Cre/loxP vermittelte Rekombination auch in den retroviralen Vektoren pHSVTKpgΔCMVCreU3lxSV40Puro und pHSVTKpgΔMMTVCre-U3lxSV40Puro p53-abhängig bleibt, wurden die Plasmide transient in Phoenix Zellen transfiziert und in retrovirale Partikel verpackt (Pear et al. in press und Internet Web page). Mit den dadurch erzeugten virushaltigen Zellkultur-Überständen infizierten wir Saos2-Zellen, welche kein p53 enthalten. Nach Selektion in Puromycin (5 µg/ml) konnten wir Provirus-enthaltende Einzelklone isolieren. Zum Nachweis einer möglicherweise undichten Cre-Expression in Abwesenheit von p53 wurden einzelne Klone in 20 µM Ganciclovir (GC, Syntex) gehalten. Tabelle 1 zeigt, daß in Abhängigkeit vom jeweiligen Minimalpromotor 56% bzw. 83% der Provirus-exprimierenden Klone in GC starben. In sämtlichen GC sensitiven Klonen konnte Cre DNA mittels spezifischer PCR nachgewiesen werden (Figur 7). Dies bedeutet, daß in der Mehrzahl der infizierten Saos2 Klone keine Rekombination stattgefunden hat. In weiteren Versuchen wurden GC sensitive Klone mit dem Wildtyp-p53 Expressionsplasmid (pSBC2-p53) transient transfiziert. GC überlebende Zellen wurden wieder mittels PCR auf Rekombination untersucht. Wie in Figur 7 beispielhaft dargestellt, enthielten die GC resistenten Zellen keine Cre-Rekombinase mehr. Diese Ergebnisse belegen eindeutig, daß Wildtyp-p53 in der Lage ist, die zwischen den proviralen LTRs positionierten Sequenzen aus dem Genom zu eliminieren, indem es die Transkription der Cre-Rekombinase aktiviert.
    • Beispiel 4 Selektive Abtötung von p53 -/- -Zellen durch selbstdeletierende retrovirale Vektoren
  • Zur Beantwortung der Frage, ob endogenes p53 ebenfalls in der Lage ist, die Cre Expression der Vektoren zu aktivieren, wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, transformierte Mausfibroblasten mit den gleichen Retroviren infiziert und Provirus enthaltende Klone isoliert. Bei den Fibroblasten handelte es sich zum einen um p53-/--1AR.A9 Zellen, welche aus p53 knock-out Mäusen stammen (Lowe et al., 1994), zum anderen um konventionelle NIH3T3 Zellen, die geringe Mengen Wildtyp-p53 exprimieren. Während 100% aller Puromycin-resistenten 1AR.A9-Klone aufgrund fehlender Rekombination in GC starben, überlebten 57% der NIH3T3 Zellklone (Figur 7, Tabelle 1). DNA - Untersuchungen zeigten, daß diesem Phänotyp eine Cre-vermittelte Rekombination zugrunde lag, welche den Großteil des Provirus einschließlich der HSVTK eliminierte (Figur 4). Tabelle 1: p53-abhängige Ganciclovir-Resistenz in Virus-infizierten Zellen*
    Zellen 1AR.A9 NIH3T3 Saos 2
    Minimal-promoter ΔCMV ΔMMTV ΔCMV ΔMMTV ΔCMV ΔMMTV
    Überlebende Klone 0/5 (0%) 0/10 (0%) nt 4/7 (57%) 9/16 (56%) 15/18 (83%)
    *Puromycin-resistente Klone wurden in Gegenwart von Ganciclovir (20 mM) gezüchtet und die Anzahl der überlebenden Klone nach 7-tägiger Inkubation bestimmt.
    nt: nicht untersucht
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Claims (20)

  1. Rekombinanter Vektor, umfassend:
    (a) mindestens eine erste Transkriptionskassette, enthaltend eine für eine Rekombinase kodierende Sequenz, einen damit funktionell verbundenen Minimalpromotor MP, eine Transkriptionsfaktorbindestelle und gegebenenfalls eine Polyadenylierungssequenz, wobei der Minimalpromotor MP von der Aktivierung durch einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren abhängig ist;
    (b) mindestens eine zweite Transkriptionskassette, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die durch Transkription und gegebenenfalls Expression zum Zelltod führt (Suizidgen), einen damit funktionell verbundenen Promotor P und gegebenenfalls eine Polyadenylierungssequenz;
    (c) eine 5'-flankierende Sequenz und/oder eine 3'-flankierende Sequenz, wobei die 5'- und/oder 3'-flankierende Sequenz eine Rekombinase-Targetsequenz enthält.
  2. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 1, wobei die Transkriptionsfaktorbindestelle den Transkriptionsfaktor p53 bindet.
  3. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die 5'- und/oder die 3'-flankierende Sequenz im wesentlichen aus Rekombinase-Targetsequenzen bestehen.
  4. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Vektor ein retroviraler Vektor ist.
  5. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, wobei die 5'- und/oder 3'-flankierenden Sequenzen vollständige oder partielle retrovirale LTR-Bereiche enthalten und mindestens eine Rekombinase-Targetsequenz in den U3- und/oder U5-Bereich des 5'- und/oder 3'-LTR eingebettet ist.
  6. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Rekombinase Cre ist.
  7. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Rekombinase Flp ist.
  8. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 6, wobei die Rekombinase-Targetsequenz loxP ist.
  9. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 7, wobei die Rekombinase-Targetsequenz FRT ist.
  10. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Minimalpromotor MP ΔCMV oder ΔMMTV ist.
  11. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Suizidgen ein Thymidinkinasegen ist.
  12. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Suizidgen für eine Cytosindesaminase kodiert.
  13. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Promotor P der MoMULV-LTR-Promotor ist.
  14. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Vektor mindestens eine Selektionsmarkerkassette enthält.
  15. Rekombinanter Vektor nach der Anspruch 14, wobei die Selektionsmarkerkassette SV40Puro ist.
  16. Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Suizidgen (i) ein Suizidprotein kodiert, (ii) teilweise oder vollständig komplementär zu einem essentiellen zellulären Gen ist oder (iii) ein cytopathogenes Virus kodiert.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16.
  18. Der Vektor nach einem des Ansprüche 1 bis 14 oder 16 zur Verwendung als Arzneimittel.
  19. Transduzierte eukaryontische Zelle, erhältlich durch Infizieren einer Tumorzelle, die einen defizienten Transkriptionsfaktor aufweist, mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16.
  20. Verwendung eines Vektores nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Krebstherapie.
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