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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft verbesserte retrovirale Vektoren
zur Gentherapie. Insbesondere betrifft diese Erfindung sichere und
effiziente retrovirale Expressionsvektoren, worin alle retroviralen
Gene, d.h. gag, env und pol, vollständig deletiert sind, worin
ein heterologes Intron, ein heterologer Splice-Akzeptor und/oder
eine nicht-kodierende Sequenz an einer Position stromaufwärts einer
Klonierungsstelle für
ein Fremdgen einfügt
sind/ist, worin ein heterologer interner Promotor oder eine interne
ribosomale Eintrittsstelle (nachfolgend als IRES = internal ribosomal
entry site bezeichnet) in eine Position stromabwärts der Klonierungstelle eingefügt ist und
worin die U3-Sequenz des 5'-LTR
(long terminal repeat = lange endständige Sequenzwiederholung)
in vollständiger
Länge oder
ein starker heterologer Promotor die Expression des Fremdgens kontrolliert.
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HINTERGRUND
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Retrovirale
Vektoren sind häufiger
als alle anderen Vektoren zur Gentherapie verwendet worden, wobei
sie in mehr als 50% der weltweit zugelassenen klinischen Anwendungen
eingesetzt werden (Wiley – Journal
of Gene Medicine Website; http.//www.wiley.co.uk/gentherapy). Obwohl
vorwiegend Vektoren auf der Basis des murinen Leukämievirus
(hier nachfolgend als "MLV" bezeichnet) benutzt
werden, gibt es immer noch viele Probleme mit retroviralen Vektoren
bei der klinischen Verwendung. Das schwerwiegendste Problem ist
ihre Sicherheit; der retrovirale Vektor ist einer der viralen Vektoren
und kann daher in den Zellen in ein replikationsfähiges Retrovirus
(hierin nachfolgend als "RCR" (replication competent
retroviaus) bezeichnet) umgewandelt werden. Vor allem war die RCR-Bildung
durch homologe Rekombination Gegenstand ernster Besorgnis.
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Alle
verfügbaren
retroviralen Vektoren enthalten erhebliche, lange virale Kodierungssequenzen.
Da diese Sequenzen auch im Genom der bei der Verpackung beteiligten
Zellen vorhanden sind, aus denen die verpackten Vektoren freigesetzt
werden, ist diskutiert worden, dass homologe Rekombination zwischen
den homologen Sequenzen in dem für
die Verpackung zuständigen
Genom und dem Vektor auftreten könnte,
was wie von Miller et al. (Miller et al, Human Gene Ther. 1, 5,
1990) berichtet, zur Bildung von RCR führen könnte.
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Zwei
Typen von retroviralen Vektoren auf der Basis von MLV, die LN-Vektorserie
und der MFG-Vektor, sind am häufigsten
zur Gentherapie (Miller und Roseman, Biotechniques, 7, 980–990, 1989;
Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539–3543, 1993)
eingesetzt worden. Während
die Expression eines Fremdgens in der LN-Vektorserie durch einen
heterologen internen Promotor oder durch die LTR kontrolliert wird, steht
das Transkriptionsniveau beim MFG-Vektor unter der Kontrolle der
LTR und das Fremdgen wird entweder in Form von genomischer RNA oder
dem Splice-Vorgang unterworfener subgenomischer RNA exprimiert.
Die häufig
als die erste Generation retroviraler Vektoren betrachtete LN-Vektorserie
enthält
die 420 bp der für
gag kodierenden Sequenz. Obwohl von diesem Bereich angenommen wurde,
dass er eine wichtige Rolle bei der viralen Verpackung spielt, wurde
offenbart, dass der gag-Bereich unter einigen Bedingungen ohne schwerwiegende
Auswirkung auf die virale Verpackung und den Titer deletiert werden
kann (Kim et al., J. Virol. 71, 994–1004, 1998).
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Im
Vergleich zur LN-Vektorserie ist der MFG-Vektor dafür bekannt,
stabilere und höhere
Niveaus der Genexpression anzutreiben und in den meisten von Menschen
und Mäusen
abstammenden Zelllinien höhere Virus-Titer
zu produzieren (Byun et al., Gene Ther. 3, 780–788, 1996). Jedoch enthält der MFG-Vektor
sogar mehrere virale kodierende Sequenzen, nämlich 420 bp für gag, 377
bp für
pol und 99 bp für
env, wodurch die gesteigerte Möglichkeit
zur Erzeugung von RCR mit sogar noch größerer Häufigkeit als bei der LN-Vektorserie gegeben
ist.
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Um
diese mit konventionellen retroviralen Vektoren verbundenen Nachteile
zu überwinden,
wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung ein retroviraler
Vektor (Korea Patent Application Nr. 97-48095, veröffentlicht
als KR246096) konstruiert, der mehrere, nachfolgend ausgeführte Eigenschaften
hat:
- • Transkripte
des klonierten Gens wurden effizient der Splice-Reaktion unterzogen,
was höhere
Expressionsniveaus des Gens ergibt
- • gag-
und env-Sequenzen wurden vollständig
deletiert
- • kein
Verlust an Virus-Titer
- • IRES
wurde zur gleichzeitigen Expression von zwei oder mehreren Genen
in einem Vektor verwendet
- • eine
multiple Klonierungsstelle wurde zur Erleichterung der Klonierung
eines Fremdgens in den Vektor eingefügt
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Da
die gag- und env-Sequenzen aus den retroviralen Vektoren vollständig deletiert
wurden, wurde die Sicherheit der Vektoren im Vergleich zu den anderen
retroviralen Vektoren erhöht.
Jedoch enthält
dieser Vektor immer noch sowohl die für pol-kodierende, den Splice-Akzeptor beherbergende
377 bp Sequenz als auch deren stromabwärts gelegene 284 bp Leader-Sequenz
für env
(wird transkribiert, aber nicht translatiert), weil die Deletion
der pol-Sequenz zu anormalem oder ineffizientem Splicen führen würde. Da
die 377 bp für
die pol-Sequenz ebenfalls im Genom der zur Verpackung verwendeten
Zelllinien vorhanden ist, besteht immer noch die zur RCR-Bildung führende Möglichkeit
einer homologen Rekombination in dem Vektor.
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In ähnlicher
Weise offenbart WO 98/12338 ebenfalls einen retroviralen Vektor,
in dem die gag- und env-Sequenzen deletiert sind.
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Zur
Entwicklung neuer retroviraler Vektoren sowohl mit erhöhter Effizienz
der Genexpression als auch mit erhöhter Sicherheit haben wir Vektoren
konstruiert, die keinerlei retrovirale, kodierende Sequenzen enthalten.
Diese Erfindung wird durch das Konstruieren retroviraler Vektoren
durchgeführt,
worin zum Ausschluss der Möglichkeit
einer RCR-Bildung durch homologe Rekombination in Verpackungs-Zelllinien das von MLV-stammende
pol-Gen vollständig
deletiert ist, worin zur Maximierung der Effizienz der Gentranskription
ein heterologes Intron, ein Splice-Akzeptor und/oder eine nicht-kodierende
Sequenz in die Position stromabwärts von
der Klonierungsstelle für
ein Fremdgen eingefügt
werden, worin entweder ein 5'-LTR
oder ein Promotor für ein
wichtiges sehr frühes
Gen (MIEP: Promotor des ie1-Gens) des humanen Cytomegalovirus (nachfolgend als "HCMV" bezeichnet) als
cis-Element zur Regulation der Expression von Fremdgenen verwendet
wird und worin eine IRES in die Position stromabwärts der
Klonierungsstelle eingefügt
wird, was die gleichzeitige Expression von zwei oder mehr Fremdgenen
gestattet.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist eine erfindungsgemäße Aufgabe,
sichere retrovirale Vektoren bereitzustellen, worin das/die Fremdgen(e)
auf höherem
Niveau transkribiert wird/werden und so wirksam in der Gentherapie
eingesetzt werden kann/können.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die vorangehende Aufgabe leicht erreicht.
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Die
Erfindung stellt einen Vektor auf der Basis des murinen Leukämievirus
bereit, worin die für
gag, env und pol kodierenden Bereiche von MLV vollständig deletiert
sind.
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In
einer Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen retroviralen
Vektoren auf MLV-Basis ein heterologes Intron und/oder einen heterologen
Splice-Akzeptor enthalten, der/die in die stromaufwärts der
Klonierungsstelle für
das Fremdgen gelegene Position eingefügt wird/werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen retroviralen
Vektoren auf MLV-Basis eine heterologe, nicht-kodierende, in die
Position stromaufwärts
der Klonierungsstelle für
das Fremdgen eingefügte
Sequenz enthalten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann in den erfindungsgemäßen retroviralen
Vektoren die Gesamtlängen-U3-Sequenz
(–419
bis –1
bp) des MLV 5'-LTR
durch einen heterologen Promotor ersetzt werden.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen retroviralen
Vektoren auf MLV-Basis einen heterologen Promotor in der Position
stromabwärts
von der Klonierungsstelle für
ein Fremdgen enthalten.
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Diese
Erfindung stellt ebenfalls mit den erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren auf
MLV-Basis transformierten E. coli-Stämme bereit.
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Weitere
Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden hierin nachfolgend
in Erscheinung treten.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
das Verfahren, bei dem der für
pol kodierende Bereich aus dem MON-Vektor zur Konstruktion des ΔSA-Vektors
deletiert und dann das CAT-Gen in den ΔSA-Vektor zur Herstellung des ΔSA-CAT-Vektors
eingefügt
wird,
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2 stellt
schematisch den Aufbau von das Intron und/oder Exon des HCMV ie1
(UL123)-Gens enthaltenden retroviralen Vektoren dar,
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3a zeigt
das Verfahren, bei dem eine SV-40 Minimal-Promotor-neo-Kassette
gegen eine IRES-neo-Kassette zum Erhalt des MSN-Vektors ausgetauscht
wird und dann durch Einfügen
des den SV40-Minimal-Promotor enthaltenden Fragments und des MLV
3'-LTRs in pUC18
der SN-3LTR-Vektor konstruiert wird,
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3b zeigt
das Verfahren, bei dem ein den Promotor für die wichtigen sehr frühen Gene
von HCMV enthaltender, chimärer
LTR in den SN-3LTR-Vektor eingefügt
wird,
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4a zeigt
das Verfahren, bei dem zur Konstruktion des DON1.2-Vektors ein das
Exon 1, das Intron A und das partielle Exon 2 des
HCMV ie1 (UL123)-Gens enthaltendes DNA-Fragment in den pCM-Vektor
und dann das bakterielle CAT-Gen in den DON1.2 zur Herstellung von
DON1.2-CAT eingefügt
wird,
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4b zeigt
das Verfahren, bei dem ein das partielle Intron A und das partielle
Exon 2 von HCMV ie1 (UL123) enthaltendes DNA-Fragment zur
Herstellung des DON2-Vektors
in den pCM-Vektor und dann das bakterielle CAT-Gen in den DON2 zur
Herstellung von DON2-CAT eingefügt
wird,
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4c zeigt
das Verfahren, bei dem zur Konstruktion des DONSA1-Vektors der Splice-Akzeptor
des Maus-Immunglobulingens und das Exon 1 des HCMV ie1
(UL123)-Gens in den pCM-Vektor und dann das bakterielle CAT-Gen
in den DONSA1 zur Herstellung von DONSA1-CAT eingefügt wird,
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5 stellt
schematisch den Aufbau von die Introns und Exons humaner Gene enthaltender
retroviraler Vektoren dar,
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6 zeigt
das Verfahren, bei dem zur Bereitstellung des p53LTR-Vektors ein
die MLV 5'- und
3'-LTRs enthaltendes
DNA-Fragment herstellt und in pUC18 eingefügt wird und dann der MIN-Vektor
durch Einfügen der
aus pCBIN isolierten IRES-neo-Kassette
in p53LTR konstruiert wird,
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7a zeigt
das Verfahren der MIN-AI-Konstruktion, bei dem ein das humane (β-Aktin-Gen enthaltendes
genomisches PCR-Produkt erhalten und dann ein das partielle Intron 1,
den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des humanen
Aktin-Gens enthaltendes
DNA-Fragment in den MIN-Vektor eingefügt wird,
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7b zeigt
das Verfahren der MIN-EI-Konstruktion, bei dem ein das humane EF1α-Gen enthaltendes
genomisches DNA-Fragment erhalten und dann ein das partielle Intron 1,
den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des humanen
EF1α-Gens
enthaltendes DNA-Fragment in den MIN-Vektor eingefügt wird,
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7c zeigt
das Verfahren der MIN-GI-Konstruktion, bei dem ein das partielle
Intron 1, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des
humanen GAPDH-Gens enthaltendes DNA-Fragment durch genomische PCR
erhalten und dann in den MIN-Vektor
eingefügt
wird,
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7d zeigt
das Verfahren der MIN2-Konstruktion, bei dem ein das partielle Intron
A, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des HCMV
ie1 (UL123)-Gens enthaltendes DNA-Fragment in den MIN-Vektor eingefügt wird.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung stellt sowohl sichere als auch effiziente
retrovirale Vektoren bereit, die von Vektoren auf MLV-Basis abstammen,
insbesondere von MON und MIN. In den erfindungsgemäßen Vektoren werden
die retroviralen Gene (für
gag, env und pol kodierende Sequenzen) vollständig deletiert, ein heterologes
Intron, ein Splice-Akzeptor und/oder eine nicht-kodierende Sequenz
wird/werden in die Position stromaufwärts der Klonierungsstelle für ein Fremdgen
eingefügt,
ein starker heterologer Promotor ist im 5'-LTR enthalten und ein heterologer Promotor
oder eine IRES wird in der Position stromabwärts der Klonierungsstelle positioniert.
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Insbesondere
kann, da bei den erfindungsgemäßen Vektoren
die für
pol kodierende Sequenz vollständig
deletiert ist, die Möglichkeit
der homologen Rekombination ausgeschlossen werden, die bei den herkömmlichen
retroviralen Vektoren ein Nachteil gewesen ist.
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Die
Deletion der Pol-Sequenz führt
zur Verminderung des Genexpressionsniveaus. Um die reduzierte Expressionseffizienz
und den reduzierten Virus-Titer wiederherzustellen, werden wie folgt
verschiedene erfindungsgemäße retrovirale
Vektoren bereitgestellt:
- • Diese Erfindung stellt retrovirale
Vektoren bereit, worin ein heterologes Intron und/oder ein heterologer Splice-Akzeptor
in die Position stromaufwärts
der Klonierungsstelle für
ein Fremdgen eingefügt
wird, um den deletierten Splice-Akzeptor
zu komplementieren, der sich mit der 3'-Position der für pol kodierenden Sequenz überlappt.
Alle Introns und/oder Splice-Akzeptoren bekannter viraler und zellulärer Gene
können zu
diesem Zweck verwendet werden, vorzugsweise die Introns und/oder
Splice-Akzeptoren des HCMV ie1 (UL123)-Gens, des Gens für den Elongationsfaktors 1α (nachfolgend
als "EF1α" bezeichnet), des
Gens für die
Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (nachfolgend als "GADPH" bezeichnet), des β-Aktin-Gens etc.
- • Diese
Erfindung stellt außerdem
retrovirale Vektoren bereit, worin eine heterologe, nicht-kodierende
Sequenz in die Position stromaufwärts der Klonierungsstelle eingefügt wird.
Die nicht-kodierende Sequenz wird zur Förderung der Translationseffizienz
verwendet und ist als eine transkribierte DNA-Sequenz definiert, die nicht zu einem
Protein translatiert wird, einschließlich Intron und nicht translatiertem
Exon. Vorzugsweise ist die nicht-kodierende Sequenz aus der Gruppe
umfassend die nicht-kodierenden Sequenzen des HCMV ie1 (UL123)-Gens,
des EF1α-Gens,
des GAPDH-Gens und des β-Aktin-Gens ausgewählt. Das Einfügen einer
heterologen, nicht-kodierenden Sequenz ermöglicht sowohl das effiziente
Splicen des Fremdgentranskripts als auch die effiziente Translation
subgenomischer RNA.
- • Zusätzlich stellt
diese Erfindung Vektoren bereit, die einen heterologen internen
Promotor oder eine IRES in der Position stromabwärts der Klonierungsstelle beherbergen.
- • Schließlich stellt
diese Erfindung retrovirale Vektoren bereit, worin entweder eine
Gesamtlängen-U3-Sequenz
des 5'-LTR oder
ein starker heterologer Promotor enthalten ist.
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Nachfolgend wird die vorliegende
Erfindung im Detail beschrieben.
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1. Die Deletion der für pol kodierenden
Sequenz: ΔSA-Konstruktion
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Zur
Entwicklung retroviraler Vektoren mit verbesserter Sicherheit, d.
h. retrovirale Vektoren ohne homologe Rekombinationsaktivität, wurde
zur Konstruktion der Deletionsmutanten-Vektor ΔSA die für pol kodierende Sequenz einschließlich eines
Splice-Akzeptors aus dem MON-Vektor deletiert (koreanische Patentanmeldung
Nr. 97-48095). Zusätzlich
wurde der ΔSA-CAT
durch Einfügen
eines bakteriellen CAT-Gens
(Chloramphenicolacetyltransferase) als Reportergen (s. 1)
konstruiert. Anschließend
wurden mit dem ΔSA-CAT transfizierte
oder transduzierte Zelllinien hergestellt und dem CAT-Assay unterzogen.
Der CAT-Assay offenbarte, dass der Virus-Titer der Deletionsmutante
der des Ausgangsvektors MON-CAT vergleichbar, aber die Genexpression
reduziert war (s. Tabelle 1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass
die das pol-Gen enthaltenden Splice-Akzeptoren bei der Regulation
der Fremdgenexpression in einem Vektor beteiligt sind.
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Wie
nach den Ergebnissen erwartet, wird das Expressionsniveau eines
Fremdgens erhöht
sein, wenn ein heterologer Splice-Akzeptor und/oder ein Intron in
die Position stromaufwärts
von der Klonierungstelle für ein
Fremdgen eingefügt
wird, so dass es die gleichzeitig mit dem pol-Gen deletierte Splice-Stelle
komplementiert. Jedoch steigt das Verhältnis von subgenomischer RNA
zu genomischer RNA an, falls das Splicen zu viel Raum einnimmt,
was trotz des hohen Genexpressionsniveaus zu einer Abnahme des Virus-Titers
führt.
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Um
die idealen retroviralen Vektoren zu konstruieren, sollten die Vektoren
deshalb so konzipiert sein, dass die Niveaus von Transkription,
Splicen und Translation bei transfizierten oder transduzierten Zelllinien ausgeglichen
sein können.
Mit anderen Worten sind die Vektoren vorzuziehen, bei denen ein
Fremdgen im Überfluss
transkribiert wird und die Menge an genomischer RNA mit der Menge
an subgenomischer RNA ausgeglichen ist, so dass genügend genomische
DNA zur Verpackung in Viruspartikel produziert werden kann und dass
die subgenomische RNA zu der durch das Fremdgen kodierten Menge
an Protein translatiert werden kann. In dieser Erfindung werden
retrovirale Vektoren bereitgestellt, bei denen verschiedene, von
viralen oder zellulären
Genen stammende, nicht-kodierende Sequenzen in einen Deletionsmutanten-Vektor
eingefügt
werden, und es wird dann untersucht, ob diese Einfügung sich
auf die Virus-Titer und Genexpressionsniveaus auswirkt.
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2. Die Insertion einer
heterologen DNA-Sequenz verstärkt
die Effizienz des Splicens und der Translation: Konstruktion von
DON1.2, DON2 und DONSA1
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Um
das Gleichgewicht des Splice- und des Genexpressionsausmaßes zu halten
und auch die Gesamtausbeute an viraler RNA zu erhöhen, wurden
retrovirale Vektoren konstruiert, bei denen der U3-Bereich des MLV
5'-LTR durch einen
starken Promotor, den HCMV-Promotor für die wichtigen sehr frühen Gene,
ersetzt und worin eine heterologe nicht-kodierende Sequenz eingefügt wurde.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wurde/n das nicht translatierte Exon und/oder Intron des HCMV ie1
(UL123)-Gens als die heterologe, in die Position stromaufwärts von
der Klonierungsstelle des Vektors (s. 2) eingefügte nicht-kodierende
Sequenz verwendet. Es ist bekannt, dass die in einen Expressionsvektor eingefügten Exon-
und/oder Intron-Sequenzen des HCMV ie1 (UL123)-Gens die Translationseffizienz
verstärken.
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Insbesondere
wurde der pCM-Vektor wie folgt hergestellt: alle retroviralen kodierenden
Sequenzen wurden entfernt; die Gesamtlänge der U3-Sequenz des 5'-LTR wurde unter
Beibehaltung des von MLV stammenden 3'-LTR-Bereiches durch den HCMV-Promotor
für die
wichtigen sehr frühen
Gene ersetzt und die SV40-Promotor-Neo-Kassette wurde als heterologer interner
Promotor verwendet. Anschließend wurden
die DON1.2-, DON2- und DONSA1-Vektoren durch Einfügen des
Exons 1, Introns A und/oder Exons 2 des HCMV ie1
(UL123)-Gens in den pCM-Vektor konstruiert (s. 3a, 3b und 4a bis 4c).
Dann wurden die DON.1.2-CAT-, DON2-CAT- und DONSAI-CAT-Vektoren
durch Einfügen
des CAT-Reportergens hergestellt. Mit diesen Vektoren transfizierte
oder transduzierte Zelllinien wurden einem CAT-Assay unterzogen.
Durch die Ergebnisse des CAT-Assays wurde bestätigt, dass alle drei Vektoren
eine viel höhere
Effizienz beim Splicen und bei der Genexpression zeigten als der
Kontroll-Vektor L-CAT-SN (s. Tabelle 2).
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3. Insertion zellulärer DNA-Sequenzen,
die das Splicen und die Genexpression fördern: Konstruktion von MIN-AI,
MIN-EI- und MIN-GI
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wurden retrovirale Vektoren weiterhin so erdacht, dass das Gleichgewicht
von Splice- und Genexpressionsausmaß zu einer höheren Effizienz
sowohl beim Virus-Titer als auch bei der Genexpression führen kann.
Bei diesen Vektoren wurden Exon- und/oder Intronsequenzen von menschlichen
Genen in die Position stromaufwärts
der Klonierungsstelle für
ein Fremdgen bei den retroviralen Vektoren eingefügt (s. 5).
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Um
diese Vektoren zu konstruieren, wurde der MIN-Vektor hergestellt,
worin der gesamte für
retrovirale Sequenzen kodierende Bereich deletiert worden war, die
von MLV stammenden 5'-
und 3'-LTRs wurden beibehalten
und die EMCV IRES-neo-Kassette
wurde als heterologer interner Promotor eingesetzt. Speziell der
MIN-Vektor wurde durch die folgenden Schritte hergestellt: Amplifizierung
eines die 3'- und
5'-LTR-Bereiche enthaltenden
MLV-Fragments, Einfügen
dieses Fragments in den pUC18-Vektor und Einfügen der IRES-neo-Kassette in
den rekombinanten Vektor (s. 6). Ein
das partielle Intron und das partielle Exon 2 des menschlichen β-Aktin-,
EF1 α- oder
GAPDH-Gens enthaltendes DNA-Fragment wurde zur Konstruktion der
MIN-AI-, MIN-EI- bzw. MIN-GI-Vektoren stromaufwärts der Klonierungstelle des
MIN-Vektors eingefügt (s. 7a bis 7c).
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Um
den ein zelluläres
Gen als Splice-Akzeptor verwendenden Vektor (z.B. MIN-AI etc.) mit
einem ein virales Gen verwendenden Vektor (z.B. DON1.2 usw.) zu
vergleichen, wurde ein weiterer, auf MLV-basierender MIN2-Vektor
hergestellt. Speziell wurde eine das partielle Intron A und das
partielle Exon 2 des HCMV ie1 (UL123)-Gens enthaltende
DNA-Sequenz in den MIN-Vektor eingefügt (s. 7d).
Diese Insertion ist identisch zu der beim DON2-Vektor.
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Dann
wurden MIN-CAT-, MIN-AICAT-, MIN-EICAT-, MIN-GICAT- und MIN-2CAT-Vektoren durch Insertion
des CAT-Reportergens in den entsprechenden Vektor hergestellt. Mit
diesen Vektoren transfizierte oder tranduzierte Zelllinien wurden
in einen CAT-Assay eingebracht. Das Ergebnis des CAT-Assays zeigte,
dass die Virus-Titer
aller erfindungsgemäßen Vektoren ähnlich zu
den der Kontrollvektoren LXSN und MFG sind, während die Genexpressionsniveaus
in den mit MIN-2 und MIN-EI transfizierten oder transduzierten Zelllinen
sehr viel höher
sind als in den die Kontrollvektoren enthaltenden Zelllinien (s.
Tabelle 3).
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BEISPIELE
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Praktische
und derzeit bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind anschaulich in den folgenden Beispielen
gezeigt.
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Es
wird jedoch begrüßt, dass
der Fachmann unter Berücksichtigung
dieser Offenlegung Modifikationen und Verbesserungen innerhalb des
Geistes und des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung vornehmen
kann.
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Beispiel 1: Deletion des
pol-Gens aus dem MON-Vektor
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(1–1) ΔSA-Konstruktion
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Zur
Herstellung der Sequenz stromabwärts
vom 5'-LTR, der
die für
pol kodierende Sequenz fehlt, wurde eine PCR (Polymeraseketten-Reaktion)
durchgeführt,
worin der MON-Vektor (Koreanische Patentanmeldung Nr.: 97-48095)
als Matrize und zwei einzelsträngige,
durch SEQ 1D Nr. 1 (HHIR-Primer) und Nr. 2 (R523Bam-Primer) beschriebene
synthetische Oligonukleotide als Primer eingesetzt wurden. Die amplifizierten
DNA-Fragmente entsprechen der Nukleotidsequenz des MLV von 5'-LTR bis +523 bp (s. 1).
In diesen Fall bedeutet +1 die Transkriptionsstartstelle des MLV-Genoms
und die Sequenz von +212 bis +523 ist eine zur Verpackung genomischer
RNA erforderliche, nicht-kodierende Sequenz.
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Das
PCR-Produkt wurde in pCRII (Invitrogen, CA, USA) subkloniert und
das HindIII-BamHI-Fragment aus
dem resultierenden Vektor gewonnen. Ein partielles HindIII-BamHI-Fragment des
MON-Vektors wurde zur Konstruktion des ΔSA-Vektors durch das HindIII-BamHI-Fragment
des PCR-Produktes ersetzt. Dieser ΔSA-Vektor wird als das elementare
Rückgrat
der retroviralen Vektoren verwendet, die die 5'- und 3'-LTRs
von MLV enthalten und die 5' nicht-kodierende
Sequenz den Splice-Akzeptor, die IRES-neo-Kassette und den Polypurin-Trakt
umfasst, wobei alle kodierenden retroviralen Sequenzen deletiert
wurden (s. 1).
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(1–2) ΔSA-CAT-Konstruktion
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Um
die Auswirkungen der obigen genetischen Manipulationen auf die Expression
von Fremdgenen und die Verpackung der retroviralen genomischen RNA
zu untersuchen, wurde ein bakterielles CAT-Gen als Reportergen eingesetzt.
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Das
CAT-Gen wurde durch PCR erhalten, bei der der pCAT3-Basis-Vektor
(Promega, WI, USA) als Matrize und zwei als SEQ 1D Nr. 3 (CATATGN-Primer)
und Nr. 4 (CATSTOP-Primer) beschriebene, synthetische Oligonukleotide
als Primer verwendet wurden. Das PCR-Produkt wurde in pCRII (Invitrogen,
CA, USA) eingefügt
und das das CAT-Gen enthaltende BamHI-Fragment des resultierenden
Vektors zur Herstellung von pC3.1-CAT in pC3.1 (Invitrogen, CA,
USA) eingefügt.
Der ΔSA-CAT-Vektor wurde durch
Insertion des CAT-Gens (Klenow behandeltes XbaI-HindIII-Fragment
von pC3.1-CAT) in die HpaI-Stelle des ΔSA-Vektors konstruiert (s. 1).
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(1–3) CAT-Assay
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ΔSA-CAT und
der Kontrollvektor (MON-CAT) wurden zusammen mit Gag-Pol- und Env-Verpackungs-Vektoren
in 293T-Zellen (DuBridge et al., Mol. Cell. Biol. 7, 379–387, 1987)
transfiziert. Nachdem die transfizierten Zellen während 48
h in Kultur gehalten worden waren, wurden die Proteine aus dem Cytosol
zur Messung der CAT-Aktivität
als Indikator für
die Fremdgen-Expression extrahiert. Inzwischen wurden die durch Filtration
des Kulturmediums durch 0,45 μm
Filter erhaltenen zellfreien viralen Überstände zur Transduktion von NIH3T3-Zellen
(ATCC CRL 1658) verwendet. Das Niveau der CAT-Aktivität wurde
unter Verwendung des Proteinextrakts 48 h nach der Transduktion
bestimmt.
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Der
CAT-Assay wurde wie folgt durchgeführt: zuerst wurden die Zellen
geerntet, mit 1 ml PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen
und dann in 0,25 M Tris-Puffer (pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen wurden
durch 6malige wiederholte Gefrier(in Trockeneis)/Auftau(im 37°C Wasserbad)-Zyklen
lysiert. Nachdem der resultierende Zellextrakt während 7 min zur Inaktivierung
der Deacetylase auf 60°C
erwärmt
worden war, wurde er bei 12000 rpm während 10 min zentrifugiert
und der Überstand
aufgehoben. Der Proteinspiegel im Extrakt wurde nach dem Bradford-Verfahren quantifiziert.
Der normalisierte Extrakt wurde mit 1 μl14C-Chloramphenicol
(60 mCi/mMol, 0,1 mCi/ml), 2 μl
Acetyl-Coenzym A (40 mM) und einem geeigneten Volumen 0,25 M Tris
(pH 7,5) gemischt. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei 37°C während einer
geeigneten Reaktionszeit inkubiert. Nach der Reaktion wurde das
Chloramphenicol mit Ethylacetat extrahiert und unter reduziertem
Druck eingeengt. Das Pellet wurde in 15 μl Ethylacetat resuspendiert
und auf Dünnschichtchromatographie-Platten aufgebracht.
Nachdem die Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie-Entwicklungslösung (95%
Chloroform, 5% Methanol) durchgeführt worden war, wurden die
Platten getrocknet und einem Röntgenfilm
oder einem Phosphat-Analysator exponiert, so dass das Acetylierungsniveau des
Chloramphenicols gemessen werden konnte. Die CAT-Aktivität in einer
Probe konnte aus dem Verhältnis der
Radioaktivität
des acetylierten Chloramphenicols zu Gesamt-Chloramphenicol berechnet
werden.
-
Tabelle
1 zeigt, dass die CAT-Aktivität
in mit ΔSA-CAT
transfizierten 293T-Zell-Linien,
denen das pol-Gen fehlt, niedriger war als in der mit MON-CAT transfizierten
Kontrollzelllinie. Dies legt nahe, dass die für pol-kodierende Sequenz an
der Regulation der Genexpression beteiligt ist. Zusätzlich zeigt
die CAT-Aktivität in
der transduzierten Zelllinie ein zu dem der transfizierten Zelllinie ähnliches
Muster, was impliziert, dass die Verpackungseffizienz im Verhältnis zur
Genexpressionseffizienz steht.
-
Tabelle
1: Wirkung der pol-Deletion auf das Genexpressionsniveau
-
Beispiel 2: Insertion
des Promotors und Exons und/oder Introns des HCMV ie1 (UL123)-Gens
-
Um
das Gleichgewicht zwischen dem Splice- und dem Translationsausmaß zu wahren
sowie auch die Gesamtausbeute an viraler RNA zu erhöhen, wurden
von MON-abstammende, die drei folgenden Vektoren umfassende retrovirale
Vektoren konstruiert:
- • der DON1.2-Vektor, bei dem
die Gesamtlänge
der U3-Sequenz des MLV 5'-LTRs
durch den HCMV-Promotor für
die wichtigen sehr frühen
Gene ersetzt wurde und der MLV-Splice-Akzeptor durch ein das Exon-1, das
Intron A und das partielle Exon 2 (das direkt vor dem Startkodon
endet) enthaltendes DNA-Fragment ersetzt wurde,
- • der
DON2-Vektor, bei dem die Gesamtlänge
der U3-Sequenz des MLV 5'-LTR durch den HCMV-Promotor für die wichtigsten
unmittelbar frühen
Gene ersetzt wurde und der MLV-Splice-Akzeptor durch ein das partielle
Intron A und das partielle Exon 2 des HCMV ie1 (UL123)-Gens
enthaltendes DNA-Fragment ersetzt wurde, und
- • der
DONSA1-Vektor, bei dem die Gesamtlänge der U3-Sequenz des MLV
5'-LTR durch den
HCMV-Promotor für
die wichtigsten unmittelbar frühen
Gene ersetzt wurde und der MLV-Splice-Akzeptor durch ein den Splice-Akzeptor des Mausimmunglobulin-Gen
enthaltendes DNA-Fragment ersetzt wurde.
-
Das
detaillierte Verfahren zur Konstruktion dieser Vektoren wird nachfolgend
beschrieben (s. 3a, 3b und 4a bis 4c).
-
(2–1) SN-2LTR-Konstruktion
-
In
drei verschiedene Vektoren wurde die SV40-Promotor-neo-Kassette
in die Position stromabwärts der
Klonierungsstelle für
ein Fremdgen eingefügt
(s. 2). Um diese verschiedenen Vektoren zu konstruieren,
wurde ein die SV40-Promotor-neo-Kassette
enthaltender Vektor wie folgt hergestellt (s. 3a und 3b).
-
Zur
Herstellung eines Vektors, bei dem das neo-Gen unter der Kontrolle
des SV40-Promotors
exprimiert wird, wird die SV40-Promotor-neo-Kassette durch PCR hergestellt.
In der PCR wird pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) als Matrize und zwei
synthetische, als SEQ-ID Nr. 5 (SV40-5 Primer) und Nr. 6 (Neo-3-Primer)
bezeichnete Oligonukleotide werden als Primer eingesetzt.
-
Nachdem
die SV40-Promotor-neo-Kassette in pCRII (Invitrogen, CA, USA) subkloniert
worden war, wurde das BamHI-XhoI-Fragment des resultierenden Vektors
in die BamHI/XhoI-Schnittstelle von MON eingefügt. Der resultierende Vektor
MSN wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut und
das die SV40- Promotor-neo-Kassette
enthaltende BamHI-Fragment und der 3'-LTR wurden mit dem BamHI-EcoRI-Fragment
von pUC18 zur Konstruktion des SN-3LTR-Vektors ligiert (s. 3a).
-
(2–2) pCM-Konstruktion
-
PCR
wurde zur Herstellung eines retroviralen Vektors durchgeführt, bei
dem der 5'-LTR durch einen starken
heterologen Promotor ersetzt wurde. Als PCR-Matrize wurde ein retroviraler
MCC-CAT-Vektor (Koreanische Patentanmeldung Nr. 97-48095) enthaltend
einen chimären
LTR eingesetzt, bei dem die Gesamtlänge der U3-Sequenz (–419 bis –1 bp) des MLV 5'-LTR durch die Gesamtlänge des
Promotors für
die wichtigen sehr frühen
HCMV-Gene ersetzt wurde. Die PCR-Primer waren zwei synthetische,
als SEQ-ID Nr. 1 (HHIR-Primer) und Nr. 2 (R523Bam-Primer) bezeichnete
Oligonukleotide. Die PCR-Produkte enthielten die DNA-Sequenz des
chimären
5'-LTR von +523
bp und wurden in pCRII (Invitrogen, CA, USA) subkloniert. Das HindIII-BamHI-Fragment
der subklonierten Sequenz wurde in die HindIII-BamHI-Schnittstelle des
SN-3LTR-Vektors (erhalten in Beispiel 2–1) zur Herstellung des pCM-Vektors
(s. 3b) eingefügt.
In dem pCM wurden genau wie im ΔSA-Vektor
aus Beispiel 1–1
alle retroviralen, kodierenden Sequenzen deletiert, während der
5'-LTR und die IRES-neo-Kassette
des ΔSA-Vektors
durch einen chimären
LTR bzw. eine SV40-neo-Kassette ersetzt wurde. Der pCM-Vektor wurde
wie in Beispiel 2–3
bis 2–5
gezeigt als Ausgangsmaterial für
die DON1.2-, DON2- und DONSA1-Vektoren benutzt.
-
(2–3) DON1.2- und DON1.2-CAT-Konstruktion
-
Um
das das Exon 1, das Intron A und das Exon 2 (bis
zum Startkodon) des HCMV ie1 (UL123)-Gens enthaltende DNA-Fragment
zu erhalten, wurde PCR durchgeführt.
Die Matrize bei der PCR war der die DNA-Sequenz des Promotors für die wichtigen
sehr frühen
Gene von HCMV bis zum Exon 5 enthaltende Vektor pEQ276
(Biegalke et al., Virology, 183, 381–385, 1991). Zwei PCR-Primer
wurden als SEQ-ID- Nr. 7 (R15-Primer, hybridisiert mit dem Exon 1)
bzw. Nr. 8 (CMVexon2.3 Primer, hybri disiert mit dem Exon 2)
bezeichnet. Ein 1 kb DNA-Fragment wurde in der PCR amplifiziert
und enthielt das Exon 1, das Intron A und das partielle
Exon 2 (das direkt vor dem Startkodon endet) des HCMV ie1
(UL123)-Gens.
-
Das
PCR-Produkt wurde in den pZero-stumpfendigen Vektor (Invitrogen,
CA, USA) zur Herstellung des pZero 1.2-Vektors eingefügt. Das
EcoRI-Fragment von pZero1.2 wurde dann zur Erzeugung stumpfer Enden
mit dem Klenow-Enzym behandelt. Der in Beispiel 2–2 erhaltene
pCM-Vektor wurde mit BamHI-Enzym verdaut und mit dem Klenow-Enzym
behandelt. Zwei DNA-Fragmente mit stumpfen Enden wurden zur Konstruktion
des DON1.2-Vektors ligiert. Zusätzlich
wurde der DON1.2-CAT-Vektor durch die Einfügung eines CAT-Gens in das
Klenow-behandelte HindIII-Fragment von DON1.2 konstruiert (s. 4a).
-
(2–4) DON2- und DON2-CAT-Konstruktion
-
Das
den 112-bp-3'-Bereich
von Intron A und den 5'-Bereich
von Exon 2 (von +837 bis +964, direkt bis zum Startkodon)
enthaltende HpaI-EcoRI-Fragment von pZero1.2 aus Beispiel 2–3 wurde
hergestellt. Dann wurde dieses DNA-Fragment zur Erzeugung stumpfer
Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt. Außerdem wurde der in Beispiel
2–2 erhaltene
pCM-Vektor mit dem BamHI-Enzym verdaut und mit dem Klenow-Enzym behandelt.
Die obigen zwei DNA-Fragmente mit stumpfen Enden wurden zur Konstruktion
des DON2-Vektors ligiert. Zusätzlich
wurde der DON2-CAT-Vektor
durch Einfügen
eines CAT-Gens in das Klenow-behandelte HindIII-Fragment von DON2
konstruiert (s. 4b).
-
(2–5) DONSA1- und DONSA1-CAT-Konstruktion
-
Zur
Herstellung des Splice-Akzeptors des Maus-Immunglobulin-Gens wurden
einzelsträngige,
durch SEQ ID-Nr. 9 (SA oberes Oligomer) bzw. Nr. 10 (SA unteres
Oligomer) bezeichnete Oligonukleotide synthetisiert. Die Annealing-Reaktion
der beiden Oligomere ergab Splice-Akzeptorfragmente mit kohäsiven Enden. Der
pGEM4-SA- Vektor
wurde durch Einfügen
des Fragments in die BamHI-Schnittstelle des pGEM4-Vektors (Promega,
WI, USA) hergestellt (s. 4c).
-
Zur
Amplifizierung vom Exon 1 des HCMV ie1 (UL123)-Gens wurde
PCR durchgeführt,
wobei der pEQ276-Vektor aus Beispiel 2–3 als Matrize und zwei synthetische,
als SEQ 1D Nr. 7 (R15-Primer) bzw. Nr. 11 (Exon 13-Primer) bezeichnete
Oligonukleotide als Primer eingesetzt wurden.
-
Das
amplifizierte Exon 1-Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstelle des
pZero-blunt-Vektors
(Invitrogen, SA, USA) subkloniert, wodurch der pZero-exon1-Vektor
entstand. Dann wurde das EcoRI-Fragment von pZero-exon1 in die EcoRI-Schnittstelle
von pGEM4-SA zur Herstellung des pGEM-SA-Exon1-Vektors subkloniert.
-
Das
XbaI-BamHI-Fragment von pGEM4-SA-Exon1 wurde zur Herstellung stumpfer
Enden Klenow-behandelt und dann mit dem Klenow-behandelten BamHI-Fragment
von pCM (erhalten in Beispiel 2–2)
ligiert, wodurch der DONSA1-Vektor konstruiert wurde.
-
Zusätzlich wurde
der DONSA1-CAT-Vektor durch die Insertion des CAT-Gens in die Npal-Schnittstelle von
DONSA1 (s. 4c) konstruiert.
-
(2–6) CAT-Assay
-
Die
DON1.2-CAT-, DON2-CAT-, DONSA1-CAT- und L-CAT-SN-Vektoren wurden
in die Verpackungszelllinie FlyAl3 (Cosset et al., J. Virol., 69,
7430–7436,
1995) transfiziert. Nachdem die transfizierten Zelllinien während 48
h kultiviert worden waren, wurde zur Transduktion von NIH3T3-Zellen
zellfreier viraler Überstand hergestellt.
Die transduzierten Linien wurden 48 h kultiviert. Die CAT-Aktivitäten in den
transfizierten oder transduzierten Linien wurden gemäß dem Verfahren
aus Beispiel 1–3
bestimmt, wodurch die relativen Genexpressionsniveaus analysiert
wurden.
-
Wie
in Tabelle 2 gezeigt, wurden ausgeprägt höhere Niveaus der CAT-Aktivität in mit
DON1.2-CAT oder DON2-CAT transfizierten Zelllinien beobachtet als
in der Kontrollzelllinie (transfiziert mit L-CAT-SN). Zusätzlich zeigten
die mit DON1.2-CAT- oder DON2-CAT-Vektoren stabil transduzierten
NIH3T3-Zellen 5- bis 10-fach höhere
CAT-Aktivität als die
Kontrollzellen es taten. Im Fall von mit DONSA1-CAT transfizierten
oder transduzierten Zelllinien wurde eine etwas höhere Aktivität beobachtet
als in der Kontrolle. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Splice-
und Genexpressions-Effizienz gesteigert werden kann, wenn in einem
Expressionsvektor eine heterologe, nicht-kodierende, beim Splicen
beteiligte Sequenz in die Position stromaufwärts des Fremdgens eingefügt wird.
-
Mit
DON2 und DONSA1 transfomierte E. coli-Stämme wurden als TOP10-DON2 bzw.
Top10-DONSA1 bezeichnet. Sie wurden beim koreanischen Zentrum zur
Kultur von Mikroorganismen am 5. Juni 1998 (Akzessions-Nr. KCCM-10128
bzw. KCCM-10127)
hinterlegt.
-
Tabelle
2: Auswirkung der Insertion einer heterologen Sequenz auf das Genexpressionsniveau
-
Beispiel 3: Insertion
des Introns und/oder Exons eines humanen Gens
-
In
diesem Beispiel wurden die von MIN abstammenden retroviralen Vektoren
MIN-AI, MIN-EI, MIN-GI und MIN-2 so konstruiert, dass das Ausmaß der Transkription,
des Splicens und der Translation eines Fremdgens in eukaryontischen
Zellen ausgeglichen werden kann. Es sind weder im MIN-Vektor noch
im ΔSA-Vektor virale Sequenzen
enthalten, jedoch enthält
MIN die IRES-neo-Kassette anstelle der SV40-Promotor-neo-Kassette (s. 5).
Die Eigenschaften der obigen vier Vektoren sind wie folgt:
- • Ein
das Intron, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des
humanen β-Aktin-Gens
enthaltendes DNA-Fragment wurde in die Position stromaufwärts des
Fremdgens in den MIN-AI-Vektor eingefügt.
- • Ein
das Intron, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des
humanen EF1 α-Gens
enthaltendes DNA-Fragment wurde in die Position stromaufwärts des
Fremdgens in den MIN-EI-Vektor eingefügt.
- • Ein
das Intron, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des
humanen GAPDH-Gens enthaltendes DNA-Fragment wurde in die Position
stromaufwärts
des Fremdgens in den MIN-GI Vektor eingefügt.
-
Außer diesen
Konstrukten wurde ein Vektor hergestellt, in den eine heterologe,
virale Sequenz eingefügt
war. Insbesondere wurde ein MIN-2-Vektor hergestellt, bei dem ein
das Intron, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des
HCMV ie1 (UL123)-Gens
enthaltendes DNA-Fragment in die Position stromaufwärts der
Klonierungstelle in den MIN-Vektor eingefügt wurde.
-
Der
MIN-Vektor und die von MIN-abstammenden MIN-AI-, MIN-EI-, Min-GI-
und Min-2-Vektoren wurden wie folgt konstruiert:
-
(3–1) MIN-Konstruktion
-
Um
den MLV-3'-LTR-Bereich
zu erhalten, wurde eine PCR durchgeführt, in der pMLV (Shinnick
et al., Nature, 293, 543–548,
1981) als Matrize und zwei synthetische, als SEQ ID-Nr. 12 (3LTR5-Primer)
und Nr. 13 (3LTR3-Primer) bezeichnete Oligonukleotide als Primer
verwendet wurden.
-
Die
amplifizierten PCR-Produkte enthielten den 3'-untranslatierten Bereich, den Polypurin-Track
und den 3'-LTR des
MLV-Genoms. Das in den pCRII-Vektor (Invitrogen, CA, USA) subklonierte
PCR-Produkt wurde mit den Enzymen BamHI und EcoRI verdaut und das
resultierende Fragment zur Herstellung des p3STR-Vektors (s. 6)
in die BamHI-EcoRI-Schnittstelle von pUC18 eingefügt.
-
Andererseits
wurde zur Herstellung der den retroviralen 5'-LTR und den Splice-Donor enthaltenden nicht-kodierenden
Sequenz die PCR durchgeführt,
worin pMLV als Matrize und zwei synthetische, als SEQ 1D Nr. 1 (HHIR-Primer)
und Nr. 14 (5LTR3-Primer) bezeichnete Oligonukleotide als Primer
verwendet wurden. Das amplifizierte PCR-Produkt enthielt die Nukleotid-Sequenz
von 5'-LTR bis +623
bp (direkt bis zur für gag-kodierenden
Sequenz) des MLV-Genoms. Nachdem das PCR-Produkt in den pCRII-Vektor subkloniert worden
war, wurde das HindIII-BamHI-Fragment
des Vektors in die HindIII-BamHI-Schnittstelle von p3LTR zur Herstellung
des p53LTR-Vektors eingefügt
(s. 6).
-
Schließlich wurde
die IRES/neo-Kasette von pCBIN (Koreanische Patentanmeldung Nr.
97-48095) durch BamHI-XhoI-Verdau isoliert und dann zur Herstellung
des MIN-Vektors
(s. 6) in die BamHI-XhoI-Schnittstelle des p53LTR-Vektors
eingefügt.
-
Der
MIN-CAT-Vektor wurde ebenfalls durch Einfügen eines CAT-Gens in die BamHI-Schnittstelle des MIN-Vektors
konstruiert, um so die Expressionseffizienz des MIN-Vektors zu analysieren.
-
(3–2) MIN-AI-Konstruktion
-
Zur
Herstellung menschlicher Nukleotidsequenzen zur Einfügung in
den MIN-Vektor wurde genomische DNA aus humanen Zellen extrahiert.
Zuerst wurden periphere mononukleare Blutzellen durch Ficoll-Paque-Gradientenzentrifugation
vom Humanblut abgetrennt. Nach ein- oder zweimaligem Waschen mit anschließendem Sammeln
wurden die Zellen mit TES (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,7%
SDS) lysiert. Proteinase K (400 μg/ml)
wurde zu dem Zell-Lysat gegeben und das Lysat bei 50–55°C während 1
bis 2 h inkubiert, gefolgt von Phenol/Chlorform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation.
-
Die
isolierte genomische DNA wurde als Matrize in der PCR eingesetzt,
bei der ein den Promotor, das Exon 1, das Intron und das
partielle Exon 2 des humanen β-Aktin-Gens enthaltendes DNA-Fragment ampliziert wurde.
Die PCR-Primer waren zwei synthetische, als SEQ ID-Nr. 15 (β-Aktin 5
Primer) und Nr. 16 (β-Aktin
3 Primer) bezeichnete Oligonukleotide. Das PCR-Produkt wurde in
den pCRII-Vektor subkloniert und dann das Mlul-Nhel-Fragment des
Vektors in die Mlul-Nhel-Schnittstelle des pC3.1-Vektors (Invitrogen,
CA, USA) zur Herstellung von pβactin
eingefügt.
-
Das
Klenow-behandelte BgII-BamHI-Fragment von pβactin (entspricht dem humanen β-Aktin-Gen
von +717 ~ +849) wurde in die mit T4-Polymerase behandelte ApaI/BamHI-Schnittstelle
des MIN-Vektors eingefügt (s. 7a).
Der resultierende Vektor wurde als MIN-AI bezeichnet.
-
Zusätzlich wurde
der MIN-AICAT-Vektor durch Einfügen
eines CAT-Gens in die BamHI-Schnittstelle des MIN-AI-Vektors zur
Analyse der Expressionseffizienz von MIN-AI hergestellt.
-
(3–3) MIN-EI-Konstruktion
-
Es
wurde eine genomische PCR zum Erhalt der nicht-kodierenden Sequenz
des humanen EF1α-Gens durchgeführt. Die
in Beispiel 3–2
isolierte genomische DNA wurde bei der PCR als Matrize und zwei
synthetische, als SEQ 1D Nr. 17 (EF1α-5-Primer) und Nr. 18 (EF1α-3-Primer)
bezeichnete Oligonukleotide wurden als Primer eingesetzt. Das erhaltene
PCR-Produkt enthielt den Promotor, das Exon 1, das Intron
und partielle Exon 2 des humanen EF1α-Gens. Das PCR-Produkt wurde
in den pCRII-Vektor subkloniert und dann das Mlul-Nhel-Fragment
des Vektors zur Herstellung von pEF1α in die Mlul-Nhel-Schnittstelle
des pC3.1-Vektors (Invitrogen, CA, USA) subkloniert.
-
Das
Klenow-behandelte XhoI-BamHI-Fragment von pEF1α (entsprechend dem humanen pEF1α-Gen von
+ 772 ~ + 1008) wurde in die mit T4-Polymerase behandelte ApaI-BamHI-Schnittstelle
des MIN-Vektors eingefügt
(s. 7b). Der resultierende Vektor wurde als MIN-EI
bezeichnet.
-
Zusätzlich wurde
zur Analyse der Expressionseffizienz durch Insertion der CAT-Kassette in die BamHI-Schnittstelle
des MIN-EI-Vektors der MIN-EICAT-Vektor konstruiert. Der MIN-EICAT-Vektor
wurde in den E. coli Stamm Top10 eingebracht und der transformierte
E. coli Stamm als MIN-EICAT(Top10) bezeichnet und am 2. Juni 1999
beim Koreanischen Institut zur Kultur von Mikroorganismen hinterlegt
(Akzessions-Nr. KCCM-10163).
-
(3–4) MIN-GI-Konstruktion
-
Es
wurde eine genomische PCR zum Erhalt der nicht-kodierenden Sequenz
des menschlichen GAPDH-Gens durchgeführt. Die in Beispiel 3–2 isolierte
genomische DNA wurde in der PCR als Matrize und zwei synthetische,
als SEQ 1D Nr. 19 (Gint 5 Primer) und Nr. 20 (Gint 3 Primer) bezeichnete
Oligonukleotide wurden als PCR-Primer
eingesetzt. Das PCR-Produkt enthielt das partielle Intron und das
partielle Exon 2 des menschlichen GADPH-Gens entsprechend
dem menschlichen GADPH-Gen
von +185 ~ +317. Das PCR-Produkt wurde in den pCRII-Vektor subkloniert
und dann das Mlul-BamHI-Fragment des Vektors in die Mlul-BamHI-Schnittstelle
des MIN-Vektors eingefügt.
Der resultierende Vektor wurde als MIN-GI bezeichnet (s. 7c).
-
Zusätzlich wurde
zur Analyse der Genexpressionseffizienz des MIN-GI-Vektors der MIN-GICAT-Vektor durch
Einfügen
des CAT-Gens in die BamHI-Schnittstelle des MIN-GI-Vektors konstruiert.
-
(3–5) MIN-2-Konstruktion
-
Das
das Intron, den Splice-Akzeptor und das partielle Exon 2 des
HCMV ie1 (UL123)-Gens enthaltende Mlul-BamHI-Fragment von DON2 (entsprechend
dem HCMV ie1-Gen von +837 ~ +964) wurde isoliert. Dieses Mlul-BamHI-Fragment
wurde in die Mlul-BamHI-Schnittstelle des MIN-Vektors eingefügt (s. 7d).
Der resultierende Vektor wurde als MIN-2 bezeichnet.
-
Zusätzlich wurde
zur Analyse der Expressionseffizienz des MIN-2-Vektors der MIN-2CAT-Vektor durch Einfügen des
CAT-Gens in die BamHI-Schnittstelle von MIN-2 konstruiert. Das MIN-2CAT-Konstrukt
wurde in den E. coli Stamm Top10 eingebracht. Der transformierte
E. coli Stamm wurde als MIN-2CAT(Top10) bezeichnet und am 2. Juni
1999 beim Koreanischen Institut für die Kultur von Mikroorganismen
hinterlegt (Akzessions-Nummer KCCM-10164).
-
(3–6) CAT-Assay
-
Zur
Untersuchung der Genexpressionseffizienz und der Verpackungsfähigkeit
der vier obigen Vektoren wurden die Vektoren in den CAT-Assay eingebracht,
worin die jeweiligen Formen mit integriertem CAT-Gen der gut bekannten
retroviralen Vektoren MFG und LXSN (Miller et al., Biotechniques
7, 980–990,
1989; Ohashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11332–11336,
1992) als Kontrollvektoren eingesetzt wurden. Die Verpackungszelllinie
Phoenix (Kinsella und Nolan, Hum. Gene. Ther. 7, 1405–1413) wurde
mit diesen Vektoren transfiziert und dann während 48 h kultiviert. Inzwischen
wurden die durch Filtration des Kulturmediums durch 0,45 μm-Filter
erhaltenen zellfreien viralen Überstände zur
Transduktion von NIH3T3-Zellen (ATCC CRL 1658) verwendet. Das Niveau
der CAT-Aktivität
wurde unter Verwendung des Proteinextrakts an Tag 2 nach Transduktion
bestimmt. Die CAT-Aktivität
wurde in transfizierten oder transduzierten Zelllinien mit jedem
Vektor gemessen (s. die Spalten "transient
transfiziert" und "transduziert, transient" in Tabelle 3) sowie
auch in antibiotika-resistenten Zellpopulationen (s. die Spalte "transduziert, stabil" in Tabelle 3). Zusätzlich wurde
die CAT-Aktivität
in der stabilen, während
4 Wochen (s. die Spalte "transduziert,
stabil (4 Wochen)" in
Tabelle 3) subkultivierten stabilen Zellpopulation gemessen. Die
Genexpressionsniveaus und die Virus-Titer wurden in den transfizierten
Zelllinien durch die in transfizierten oder transduzierten Zelllinien
mit jedem Vektor gemessenen CAT-Aktivitäten bestimmt.
-
Wie
in Tabelle 3 gezeigt, zeigen mit Ausnahme des LXSN-Vektors alle
retroviralen Vektoren höhere CAT-Aktitväten als
der MIN-Vektor. Jedoch variierten die CAT-Aktivitäten in Abhängigkeit von der eingefügten heterologen
Sequenz. Insbesondere produzierten MIN-EI und MIN-2 auffallend hohe
Genexpressionsniveaus. Es war recht bemerkenswert, dass die mit
MIN-EI oder MIN-2 stabil transduzierten Zellen sogar noch nach 4 Wochen
in Subkultur beträchtlich
höhere
Genexpressionsniveaus hatten.
-
Tabelle
3: Auswirkung der heterologen Sequenzen auf die Effizienz retroviraler
Vektoren
-
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
-
Wie
oben offenbart und verifiziert, stellt diese Erfindung retrovirale
Vektoren bereit, die viele Vorteile in der Gentherapie usw. haben.
Die erfindungsgemäßen Vektoren
haben die folgenden Eigenschaften:
- 1. Da alle
retroviralen kodierenden Sequenzen (gag-, env- und pol-Sequenzen)
deletiert sind, kann die Möglichkeit,
dass ein replikationskompetentes Retrovirus durch homologe Rekombination
erzeugt wird, vollständig
ausgeschlossen werden.
- 2. Da ein heterologes Intron, ein heterologer Splice-Akzeptor
und/oder eine nicht-kodierende Sequenz stromaufwärts der Klonierungsstelle für ein Fremdgen
eingefügt
ist, kann das Fremdgen in den Vektoren sowohl stabil als auch effizient
exprimiert werden.
- 3. Da der U3-Bereich im 5'-LTR
durch einen heterologen Promotor ersetzt wurde, der die Transkription
speziell in humanen Zellen intensiv antreibt, können die mit diesen Vektoren
transfizierten, von humanen Zellen abstammenden Verpackungszelllinien
höhere
RNA-Niveaus produzieren und damit erhöhte Virus-Titer zeigen.
- 4. Eine IRES oder ein heterologer Promotor wird gleichzeitig
zur Expression von zwei oder mehr Fremdgenen in den Vektoren verwendet.
In diesem Fall kann ein minimaler Promotor als eingefügter Promotor
verwendet werden, um eine Interferenz der heterologen internen Promotoren
zu vermindern und um ein Fremdgen größeren Ausmaßes zu klonieren.
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