EP1195439A2 - Retrovirale Vektoren mit Fremdsequenzinsertion zwischen retroviraler Primerbindungsstelle und retroviralem Spleissdonor - Google Patents

Retrovirale Vektoren mit Fremdsequenzinsertion zwischen retroviraler Primerbindungsstelle und retroviralem Spleissdonor Download PDF

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EP1195439A2
EP1195439A2 EP01120793A EP01120793A EP1195439A2 EP 1195439 A2 EP1195439 A2 EP 1195439A2 EP 01120793 A EP01120793 A EP 01120793A EP 01120793 A EP01120793 A EP 01120793A EP 1195439 A2 EP1195439 A2 EP 1195439A2
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EP
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retroviral
sequences
vector
vector according
ltr
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Christopher Prof. Dr. Baum
Daniel Schaumann
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Heinrich Pette Institute of Leibniz Institute for Experimental Virology
Original Assignee
Heinrich Pette Institute of Leibniz Institute for Experimental Virology
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Definitions

  • the invention relates to retroviral gene transfer vectors, where between the retroviral primer binding site (PBS) and the retroviral splice donor (SD) introduced foreign sequences are.
  • PBS retroviral primer binding site
  • SD retroviral splice donor
  • Retroviral vectors have the structure shown schematically in FIG. 1, with foreign sequences being built in either downstream of the splice acceptor signal (SA) downstream of the splice donor signal (SD) or within the terminal sequence repetitions ( long terminal repeat, LTR) of the retroviral vector.
  • SA splice acceptor signal
  • SD splice donor signal
  • LTR long terminal repeat
  • Any DNA sequence is to be regarded as a foreign sequence in the sense of the invention values that are not in a natural, evolutionary way, but was inserted using targeted molecular genetic methods.
  • Vector Becomes the enhancer / promoter from the U3 region of the LTR removed (Yu et al., 1986), one modified in this way Vector is characterized by increased biosafety as the Vector sequence when infected with replication-competent retroviruses cannot be mobilized. The risk of activation downstream cellular sequences are diminished. Across from conventional constructs is the inventive Vector by an at least equivalent efficiency of Gene expression.
  • the vectors according to the invention contain a foreign sequence [FS1] which is upstream of the retroviral splice donor signal (SD) - which is still before the packaging signal (see FIGS. 1 and 2) - and is inserted downstream of the retroviral primer binding site (PBS).
  • a second foreign sequence can be inserted downstream of the splice donor or packaging signal, as in conventional retroviral vectors (foreign sequence 2, FS2) (Hildinger et al., 1999; Deffaud and Darlix, 2000).
  • [FS2] is preferably inserted between [SA] and [PP], the presence of [SA] not being a necessary prerequisite for the vectors according to the invention.
  • the terminal sequence repeat ( LTR) of the retroviral vector can also contain such foreign sequences (FS3).
  • the vector as foreign sequence as defined above can either contain only [FS1] or [FS1] in combination with [FS2] and / or [FS3].
  • the foreign sequence [FS2] is preferably composed of the group from cDNA sequences (e.g. coding for enhanced green fluorescent protein), enhancer and / or promoter sequences, sequences for internal ribosome entry points (IRES), sequences for Matrix attachment regions (MAR, e.g. from the human interferon ⁇ gene) and / or sequences for RNA processing signals (e.g. Post-transcriptional regulatory element of Woodchuck hepatitis virus) selected.
  • cDNA sequences e.g. coding for enhanced green fluorescent protein
  • enhancer and / or promoter sequences sequences for internal ribosome entry points (IRES)
  • MAR Matrix attachment regions
  • RNA processing signals e.g. Post-transcriptional regulatory element of Woodchuck hepatitis virus
  • the foreign sequence [FS3] is preferably composed of the group from cloning sites for deletion of the LTR enhancer promoter, Enhancer and / or promoter sequences, cDNA sequences, Sequences for matrix attachment regions (MAR, e.g. from human Interferon- ⁇ gene) and / or sequences for RNA processing signals (e.g. Woodchuck's post-transcriptional regulatory element hepatitis virus) selected.
  • MAR e.g. from human Interferon- ⁇ gene
  • RNA processing signals e.g. Woodchuck's post-transcriptional regulatory element hepatitis virus
  • the retroviral transgene is constituted accordingly the structure shown in Fig. 1, wherein the LTR sequences for the U3 region of the vector from the 3'-LTR of the plasmid derive the R and U5 sequences, however, from the 5 'LTR of the plasmid.
  • the proviral plasmid of the vector SMICIP2s is called pSMICIP2s (eGFP); the sequence of this plasmid is as follows reproduced in the sequence listing. A sample of this plasmid was on August 31, 2000 at the German Collection of Microorganisms and cell cultures (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig filed under No. DSM 13711.
  • infectious Titer and expression properties in the transduced target cells achieve, the conventional vectors without [FS1] at least are comparable.
  • SMICIP2s (eGFP) Sequence combination has been shown to be a retroviral Vector one located internally between the LTR sequences Enhancer / promoter with downstream intron in the 5'-untranslated Region can contain, with the insertion of the foreign sequences in the sense orientation of the retroviral RNA.
  • the invention relates also a vector in which the retroviral splice donor signal (SD) and / or the retroviral splice acceptor signal (SA) through Mutation is / are inactivated.
  • SD retroviral splice donor signal
  • SA retroviral splice acceptor signal
  • the retrovirus used for the vector construction according to the invention is from the group consisting of mouse leukemia viruses and bird retroviruses (including spleen necrosis virus), spuma viruses (including human foamy virus), B-type retroviruses (including Mouse mammary tumor virus), D-type retroviruses (including Mason-Pfizer monkey virus) or lentiviruses (including human immunodeficiency virus I) selected.
  • retro viruses all show a genetically conserved structure regarding the Sequence PBS followed by SD and packaging signal and they are therefore for the inventive insertion of the [FS1], with or downstream intron, suitable.
  • the present invention also relates to an infectious Virus particle, the retroviral vector according to the invention contains.
  • the vector can be introduced into a host cell the desired when cultivated under suitable conditions Protein expressed.
  • the invention therefore also relates to Host cells with the vector according to the invention or with the called infectious virus particles are infected. Both Host cells are preferably lymphatic, hematopoietic or mesenchymal cells.
  • the retroviral vector of the present invention can be universal be used. Possible areas of application are Gene therapy, the cloning of genes or the expression and / or Overexpression of proteins or RNA. It is also suitable the vector especially for the transfection of lymphatic, haematopoietic or mesenchymal cells.
  • the present invention further relates to a method for Obtaining proteins by using a host cell cultivated in a suitable medium under conditions which are necessary for Expression of the foreign sequences [FS1], [FS2] and / or Proteins encoded [FS3] are necessary, the so produced Separates protein from the cells and the medium.
  • the retroviral vector can also be used in gene therapy used or for the manufacture of a pharmaceutical preparation be used for gene therapy, the vector being more suitable Form is present to be introduced into the target cells.
  • the invention further relates to a pharmaceutical preparation which contains a aforementioned vector together with pharmaceutically acceptable auxiliaries and carriers.
  • This preparation is used for the transfection of corresponding target cells in vitro and in vivo.
  • lymphatic, hematopoietic or mesenchymal cells transfected with the vector ( in vitro ) can also be viewed and administered as a pharmaceutical preparation.
  • the molecular biological construction of the retroviral vector occurred at the level of bacterial plasmids that were proviral Sequences included.
  • the initial construct used here is derived from the plasmid pSF ⁇ 91 (Hildinger et al., 1999; Fig. 3) which detects the 3'-LTR from the spleen focus-forming virus (SFFVp), the 5'-U3 from the MPSV and the 5'-untranslated region (leader) of the murine embryonic stem cell virus (MESV) contains.
  • pSF ⁇ 91 contains a modified leader region that is in the presence distinguishes two splice signals, namely the splice donor (SD) and the splice acceptor (SA; Fig. 3).
  • the constructs used additionally have a Sal I restriction site downstream of the -PBS at base position 1030 (FIG. 3, arrow).
  • the cDNA of the enhanced green flourescent protein (eGFP) and an 800 bp fragment of the core matrix attachment region from the human ⁇ -interferon gene locus were introduced into these plasmids. Furthermore, the cis -active elements of the U3 region in the 3'-LTR were deleted and the eGFP cDNA was placed under the transcriptional control of the U3 region of the SFFVp, which was inserted 5'-wards from the SD in the leader region.
  • eGFP enhanced green flourescent protein
  • the insertion of the eGFP cDNA from the plasmid pMP110 (eGFP) (Schambach et al., 2000) into pSF ⁇ 91 was carried out via the restriction sites of Not I and Bam HI at the 5 'end of the leader region (FIG. 4).
  • the plasmid pSF ⁇ 91 (eGFP) was formed.
  • the primers M13reverse (reverse strand synthesis) and U3EcoRI (forward strand synthesis) were used for the amplification of the other fragment. They hybridize sequence-specifically at the 3'-end of the U3 region (U3EcoRI) and downstream from the 3'-LTR (M13reverse; FIG. 5A).
  • U3EcoRI which has an Eco RI restriction site at the 5 'end, inserted an Eco RI site at the 5' end of the amplificate. Restriction of the amplificate with Xho I gave rise to a 170 bp fragment which, in addition to the 3 ′ end of the U3 region, contained the R and U5 regions (FIG. 5B).
  • the two cut amplicons were successively inserted into the cloning vector pBluescript SK II via the restriction sites Bam HI and Eco RV or Eco RV and Xho I, in order to then be cut out as a fragment using the restriction enzymes Bam HI and Xho I.
  • the oligonucleotides U3NheI and U3EcoRI each end at the 5 'end with the base triplet ATC, so that when the amplified products were blunt-end linked, an Eco RV interface was formed (FIG. 5; sequence: GATATC).
  • the oligonucleotide primers used for the PCR were manufactured by Gibco BRL.
  • the region downstream of the eGFP cDNA was cut out of the plasmid pSF ⁇ 91 (eGFP) with Bam HI and Xho I and replaced by the mutually linked PCR fragments (FIG. 5C).
  • the resulting plasmids pSIN91 (eGFP) and pSIN110 (eGFP) do not contain any enhancer or promoter elements in the U3 region of the 3'-LTR.
  • the promoter was inserted in the leader region in front of the SD site via the Sal I restriction site (FIG. 6).
  • the promoter fragment was first amplified by PCR with the sequence-specific primers XhoEagSF65 and SalEagSF63, which are located at the 5 'end of the 3'-SFFVp-LTR (XhoEagSF65) or in the region approximately 30 bp downstream from the 5' end of the R region (SalEagSF63) hybridize (Fig. 6A).
  • the amplificate therefore also included the first 27 nucleotides of the R region, which contain the cap signal and are therefore indispensable for optimal translation of the mRNA (Cupelli and Lenz, 1991).
  • the oligonucleotides used for the PCR have recognition sites for the restriction endonucleases Xho I and Eag I (XhoEagSF65) or Sal I and Eag I (SalEagSF63) at their 5'-end, so that the amplificate has precisely these interfaces at the 5'- or 3 'end.
  • XhoEagSF65 restriction endonucleases
  • SalI and Eag I SalI and Eag I
  • the MAR was inserted into the vector in the sense orientation to the promoter, which was verified by restriction cleavage with the endonuclease SstI, which cuts the MAR into two fragments of different sizes. It is therefore in the same orientation to the promoter as in the human interferon- ⁇ gene locus (Mielke et al., 1990).
  • the proviral plasmid pSMICIP2s (eGFP), whose Plasmid map is shown in Fig. 8.
  • a sample of this plasmid was on August 31, 2000 at the German Collection of Microorganisms and cell cultures (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig deposited under the number DSM 13711.
  • Replication-defective retroviral vectors are produced in cell culture in safety-modified packaging cells.
  • a common packaging cell is PHOENIX-ampho, which releases replication-defective mouse retroviruses with amphotropic coat protein (Kinsella and Nolan, 1996).
  • Virus supernatants with an infectious titer between 10 5 and 10 6 particles per ml of cell culture supernatant can be harvested up to 96 hours after transfection of the proviral vector plasmids.
  • a second plasmid is co-transfected, which encodes the coat protein of the vesicular stomatitis virus (VSV-G).
  • VSV-G vesicular stomatitis virus
  • the titer of the vectors SMICIP2s (eGFP) (titer 223800 ⁇ 45400 / ml) and SINoMI-EGFP (titer 237500 ⁇ 55000 / ml) are of the same order of magnitude as the titer of the conventional vector SF110-EGFP (titer 134700 ⁇ 76700 / ml ).
  • the vectors SINoM (43500 ⁇ 13000 / ml) and SINoMS (31800 ⁇ 64000 / ml) achieve lower titers.
  • the expression of the transferred genes is an important criterion for assessing the quality of retroviral vectors.
  • it is beneficial, even crucial for some, to place an intron in the 5'-untranslated region (Buchmann and Berg, 1988; Hildinger et al., 1999).
  • the intron must be retained in the packaging cell when the retroviral RNA is expressed, since otherwise it is no longer contained in the transferred retroviral genome.
  • the intron can be preserved, for example, by inserting splice donor and splice acceptor signals on the flanks of ⁇ (Hildinger et al., 1999). So far, this has only been practiced with vectors which carry enhancer-promoter sequences in the LTRs.
  • Such vectors have the potential disadvantage that transcriptional activation of downstream cellular sequences can occur if the enhancer-promoter is activated in the 3'-LTR. It is therefore desirable to implement the principle of the intron-containing transgene in the context of a vector whose enhancer-promoter region has been deleted in the LTR (so-called self-inactivating vector, Yu et al., 1986). Such a construction was first implemented in the vectors SMICIP2s (eGFP) and SINoM-EGFP according to the invention.
  • mice fibroblasts from the SC1 line and mouse lymphocytes from the EL4 line were transduced using the same amounts of infectious virus particles.
  • the expression level of EGFP was determined after 48 hours in the flow cytometer. At least 10,000 independent events were measured per recording.
  • the mean expression level was determined on the basis of the mean (mean fluorescence in arbitrary units) from at least two independent experiments.
  • the vector SMICIP2s mediates the highest expression of all the vectors tested (average fluorescence 682 ⁇ 19).
  • SINoM-EGFP the variant without MAR
  • SINoMS-EGFP the variant without intron and MAR
  • achieves an even lower expression 183 ⁇ 11
  • SF110-EGFP 185 ⁇ 2
  • the control vector SINoMI-EGFP corresponds to the classic structure of a self-inactivating vector, since the promoter is located directly in front of the cDNA without an intron; this vector is also inferior in expression to the SMICIP2s (eGFP) vector (315 + 21).
  • the vectors according to the invention also mediate in EL4 cells the enhancer promoter as foreign sequence 1 [FS1] and downstream Intron the highest expression, however, shows up here no promotional influence of the MAR region; the vector SINoM-EGFP mediates the highest expression (713 ⁇ 19), followed by SMI-CIP2s (eGFP) (600 ⁇ 14).
  • SINoMS-EGFP the variant without intron and MAR, achieved a significantly lower expression (391 ⁇ 2), but is even better than the conventional vector, SF110-EGFP (185 ⁇ 2).
  • the control SINoMI-EGFP (391 ⁇ 2) is also evident again inferior to the vectors SMICIP2s (eGFP) and SINoM-EGFP.
  • RNA secondary structure of the packaging signal for Moloney murine leukemia virus Virology 183 , 611-619.
  • CD34 splice-variant an attractive marker for selection of gene-modified cells. Mol. Ther. 5 , 448-456.
  • HILDINGER M., ABEL, KL, OSTERTAG, W., and BAUM, C. (1999). Design of 5 'untranslated sequences in retroviral vectors developed for medical use. J. Virol. 73 , 4083-4089.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung sind retrovirale Gentransfervektören, bei denen zwischen der retroviralen Primerbindungsstelle (PBS) und dem retroviralen Spleißdonor (SD) Fremdsequenzen eingeführt sind. Durch diese Modifikation wird die Effizienz der Genexpression verbessert, und die Vektoren zeichnen sich durch eine erhöhte Anwendungssicherheit aus. <IMAGE>

Description

Gegenstand der Erfindung sind retrovirale Gentransfervektoren, bei denen zwischen der retroviralen Primerbindungsstelle (PBS) und dem retroviralen Spleißdonor (SD) Fremdsequenzen eingeführt sind. Durch diese Modifikation wird die Effizienz der Genexpression verbessert, und die Vektoren zeichnen sich durch eine erhöhte Anwendungssicherheit aus.
Herkömmliche retrovirale Vektoren haben den in Fig. 1 schematisch gezeigten Aufbau, wobei Fremdsequenzen entweder stromabwärts des Spleißakzeptorsignals (SA) stromabwärts des Spleißdonorsignals (SD) oder innerhalb der endständigen Sequenzwiederholungen (long terminal repeat, LTR) des retroviralen Vektors eingebaut sind.
Es besteht ein Bedarf an Vektoren, die sich durch eine verbesserte Genexpression und hohe biologische Sicherheit auszeichnen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die retroviralen Vektoren der Patentansprüche 1 bis 8 gelöst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß retrovirale Vektoren mit dem allgemeinen Aufbau
Figure 00020001
bei denen
[LTR]
die endständige Sequenzwiederholung (long terminal repeat, LTR) des retroviralen Vektors ist,
[PBS]
die retrovirale Primerbindungsstelle ist,
[SD]
das retrovirale Spleißdonorsignal ist,
[Ψ]
das retrovirale Verpackungssignal ist,
[SA]
das retrovirale Spleißakzeptorsignal ist,
und
[PP]
ein Polypurintrakt (PP-Trakt) ist,
gegenüber dem Stand der Technik wesentliche Vorteile aufweisen, wenn zwischen der retroviralen Primerbindungsstelle (PBS) und dem retroviralen Spleißdonor (SD) eine Fremdsequenz [FS1] insertiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus Enhancer-PromotorSequenzen (z.B. vom Maus-spleen-focus-forming virus), Enhancer-Sequenzen (auch ohne Promotor), cDNA-Sequenzen (die für ein zu exprimierendes Protein kodieren), Sequenzen für Chromatin-Modifikation, wie z.B. Matrix-Anheftungsregionen (MAR, z.B. vom humanen Interferon-β-Gen), und/oder Sequenzen für RNA-Prozessierungssignale (z.B. posttranskriptionelles Regulatorelement des Woodchuck hepatitis virus) ausgewählt ist.
Als Fremdsequenz im Sinne der Erfindung ist jede DNA-Sequenz zu werten, die nicht auf natürlichem, evolutionärem Weg, sondern über gezielte molekulargenetische Methoden eingefügt wurde.
Wird zugleich der Enhancer/Promoter aus der U3-Region des LTR entfernt (Yu et al., 1986), zeichnet sich ein derart modifizierter Vektor durch erhöhte biologische Sicherheit aus, da die Vektorsequenz bei Infektion mit replikationskompetenten Retroviren nicht mobilisiert werden kann. Das Risiko der Aktivierung stromabwärts gelegener zellulärer Sequenzen ist gemindert. Gegenüber herkömmlichen Konstrukten zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor durch eine mindestens gleichwertige Effizienz der Genexpression aus.
Die beschriebene Modifikation gegenüber Vektoren im Stand der Technik besteht darin, daß die erfindungsgemäßen Vektoren eine Fremdsequenz [FS1] enthalten, die stromaufwärts des retroviralen Spleißdonorsignals (SD) - das sich noch vor dem Verpackungssignal befindet (vgl. Fig. 1 und 2) - und stromabwärts der retroviralen Primerbindungsstelle (PBS) eingefügt ist. Stromabwärts des Spleißdonors oder Verpackungssignals kann, wie in herkömmlichen retroviralen Vektoren, eine zweite Fremdsequenz eingefügt werden (Fremdsequenz 2, FS2) (Hildinger et al., 1999; Deffaud und Darlix, 2000). Die Insertion von [FS2] erfolgt vorzugsweise zwischen [SA] und [PP], wobei die Präsenz des [SA] keine notwendige Voraussetzung für die erfindungsgemäßen Vektoren ist. Die endständige Sequenzwiederholung (long terminal repeat, LTR) des retroviralen Vektors kann ebenfalls derartige Fremdsequenzen (FS3) enthalten. Erfindungsgemäß kann der Vektor als Fremdsequenz nach obiger Definition entweder nur [FS1] oder aber [FS1] in Kombination mit [FS2] und/oder [FS3] enthalten.
Die Fremdsequenz [FS2] wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus cDNA-Sequenzen (z.B. kodierend für enhanced green fluorescent protein), Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen, Sequenzen für interne Ribosomeneintrittstellen (IRES), Sequenzen für Matrix-Anheftungsregionen (MAR, z.B. vom humanen Interferon-β-Gen) und/oder Sequenzen für RNA-Prozessierungssignale (z.B. posttranskriptionelles Regulatorelement des Woodchuck hepatitis virus) ausgewählt.
Die Fremdsequenz [FS3] wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Klonierungsstellen zur Deletion des LTR-Enhancer-Promotors, Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen, cDNA-Sequenzen, Sequenzen für Matrix-Anheftungsregionen (MAR, z.B. vom humanen Interferon-β-Gen) und/oder Sequenzen für RNA-Prozessierungssignale (z.B. posttranskriptionelles Regulatorelement des Woodchuck hepatitis virus) ausgewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Vektor folgende Fremdsequenzen:
  • [FS1]: Fragment aus dem LTR des Maus-spleen-focus-forming-Retrovirus (SFFVp), das den retroviralen Enhancer-Promotor und die ersten 27 Basenpaare der 5'-untranslatierten Region des Retrovirus enthält (Baum et al., 1995).
  • [FS2]: Kodierende Sequenzen (cDNA) des enhanced green fluorescent proteins (EGFP; Yang et al., 1996) mit 3' anschließendem, nicht-kodierenden Genfragment des humanen Interferon-β-Gens, das eine Matrix-Anheftungsregion (MAR) enthält (Schübeler et al., 1996).
  • [FS3]: Künstliche Klonierungsstelle zur Deletion des LTR-Enhancer-Promotors (vgl. Yu et al., 1986).
Dieser Vektor, genannt SMICIP2s(eGFP), enthält 5' des Verpackungssignals den retroviralen Spleißdonor und 3' des Verpakkungssignals eine Spleißakzeptorsequenz (SA). Zu diesem Vektor (SMICIP2s(eGFP)) existieren zwei bevorzugte Varianten und zwei Kontrollvektoren:
  • Variante 1: wie SMICIP2s(eGFP), jedoch fehlen die MAR-Sequenzen (Vektor SINoM-EGFP);
  • Variante 2: wie Variante 1, jedoch fehlen zusätzlich die Spleißdonor- bzw. Spleißakzeptorsequenzen (Vektor SINoMS-EGFP);
  • Kontrollvektor 1: der Enhancer-Promotor in der Fremdsequenz 1 wurde deletiert und stattdessen vor die EGFP-CDNA in die Fremdsequenz 2 eingefügt (Vektor SINoMI-EGFP) - repräsentiert herkömmliche Vektoren mit selbstinaktivierendem LTR (Yu et al., 1986);
  • Kontrollvektor 2: repräsentiert den herkömmlichen Vektortypus mit intaktem LTR (Fig. 1B) ohne Fremdsequenz 1 (Vektor SF110-EGFP; Hildinger et al., 1999).
Diese Vektoren wurden als provirale Plasmide auf der Grundlage von pUC19 in E.coli kloniert. Die Plasmide enthalten in der 5'-LTR den Enhancer-Promotor (U3-Region) des MPSV-Retrovirus. Diese Sequenz liegt stromaufwärts der Cap-Stelle und findet sich daher nach Transfektion in eukaryontische Verpackungszellen im retroviralen Transkript nicht wieder. In retroviral transduzierten Zielzellen konstituiert sich das retrovirale Transgen entsprechend dem in Fig. 1 gezeigten Aufbau, wobei sich die LTR-Sequenzen bezüglich der U3-Region des Vektors aus dem 3'-LTR des Plasmids herleiten, die R- und U5-Sequenzen hingegen aus dem 5' LTR des Plasmids. Das provirale Plasmid des Vektors SMICIP2s(eGFP) heißt pSMICIP2s(eGFP); die Sequenz dieses Plasmids ist nachfolgend im Sequenzprotokoll wiedergegeben. Eine Probe dieses Plasmids wurde am 31. August 2000 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Nr. DSM 13711 hinterlegt.
Der Vektor SMICIP2s(eGFP) zeichnet sich dadurch aus, daß
  • 1) ein starker retroviraler Enhancer/Promoter des SFFVp-Retrovirus (Baum et al., 1995) zwischen PBS und SD eingefügt wurde (=FS1),
  • 2) als [FS2] stromabwärts des [SA] und stromaufwärts des [PP] die EGFP cDNA mit anschließender MAR-Sequenz des menschlichen Interferon-beta-Genes (Schübeler et al., 1996) verwendet wurde, und
  • 3) als [FS3] eine Restriktionsstelle vorliegt, die den Enhancer/Promoter der U3-Region des LTRs ersetzt.
    • In dieser beispielhaften Kombination lassen sich infektiöse Titer und Expressionseigenschaften in den transduzierten Zielzellen erzielen, die herkömmlichen Vektoren ohne [FS1] mindestens vergleichbar sind. Dabei sind die sicherheitsrelevanten Merkmale des neuartigen Vektors den herkömmlichen Konstrukten überlegen. Erstmals ist es in der im Vektor SMICIP2s(eGFP) vorliegenden Sequenzkombination gezeigt worden, daß ein retroviraler Vektor einen intern zwischen den LTR-Sequenzen gelegenen Enhancer/Promoter mit nachgeschaltetem Intron in der 5'-untranslatierten Region enthalten kann, wobei die Insertion der Fremdsequenzen in der sense-Orientierung der retroviralen RNA erfolgt.
    Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ferner einen Vektor, bei dem das retrovirale Spleißdonorsignal (SD) und/oder das retrovirale Spleißakzeptorsignal (SA) durch Mutation inaktiviert ist/sind.
    Das zur erfindungsgemäßen Vektorkonstruktion verwendete Retrovirus ist aus der Gruppe bestehend aus Mausleukämieviren, Vogelretroviren (einschließlich spleen necrosis virus), Spumaviren (einschließlich humanes Foamyvirus), B-Typ-Retroviren (einschließlich Maus-Mammatumorvirus), D-Typ-Retroviren (einschließlich Mason-Pfizer-Affenvirus) oder Lentiviren (einschließlich human immunodeficiency virus I) ausgewählt. Diese Retroviren zeigen alle einen genetisch konservierten Aufbau bezüglich der Abfolge PBS gefolgt von SD und Verpackungssignal, und sie sind daher für die erfindungsgemäße Insertion der [FS1], mit oder nachgeschaltetem Intron, geeignet.
    Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein infektiöses Viruspartikel, das den erfindungsgemäßen retroviralen Vektor enthält.
    Zur Expression der von [FS1], [FS2] und/oder [FS3] kodierten Proteine kann der Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden, die bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen das gewünschte Protein exprimiert. Gegenstand der Erfindung sind somit ferner Wirtszellen, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor bzw. mit den genannten infektiösen Viruspartikeln infiziert sind. Bei den Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um lymphatische, hämatopoetische oder mesenchymale Zellen.
    Der retrovirale Vektor der vorliegenden Erfindung kann universell eingesetzt werden. Mögliche Anwendungsgebiete sind die Gentherapie, die Klonierung von Genen oder die Expression und/oder Überexpression von Proteinen oder RNA. Ferner eignet sich der Vektor besonders zur Transfektion lymphatischer, hämatopoetischer oder mesenchymaler Zellen.
    Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Proteinen, bei dem man eine vorgenannte Wirtszelle in einem geeigneten Medium unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression der von den Fremdsequenzen [FS1], [FS2] und/oder [FS3] kodierten Proteinen notwendig sind, wobei man das so erzeugte Protein von den Zellen und dem Medium abtrennt.
    Im Rahmen der Gentherapie kann der retrovirale Vektor ebenfalls eingesetzt bzw. zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Gentherapie verwendet werden, wobei der Vektor in geeigneter Form vorliegt, um in die Zielzellen eingeführt zu werden.
    Gegenstand der Erfindung ist ferner ein pharmazeutisches Präparat, das einen vorgenannten Vektor zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen enthält. Dieses Präparat dient der Transfektion entsprechender Zielzellen in vitro und in vivo. Im Rahmen des gentherapeutischen Regimes können auch mit dem Vektor (in vitro) transfizierte lymphatische, hämatopoetische oder mesenchymale Zellen als pharmazeutisches Präparat angesehen und appliziert werden.
    Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente haben gezeigt, daß die Fremdsequenz 1 (FS1) unter Erhalt der genetischen Stabilität des retroviralen Vektors eingefügt werden kann. Durch die erfindungsgemäße Insertion der Fremdsequenz 1 ergibt sich eine Vielfalt neuartiger Gestaltungsmöglichkeiten retroviraler Vektoren. Im folgenden sind einige Beispiele aufgeführt, wie der erfindungsgemäße Einbau einer FS1 zwischen PBS und SD die Gestaltungsmöglichkeiten retroviraler Vektoren erweitert.
    • Bei Erhalt des Enhancer/Promotors im LTR kann als FS1 eine cDNA eingefügt werden. Die FS2 kann dann eine zweite Expressionskassette enthalten. Dabei kann die Verknüpfung der Expression mit FS2 entweder durch einen internen Promotor oder eine interne Ribosomeneintrittstelle vor der cDNA in FS2 geschehen kann. Damit wird die Möglichkeit der gleichzeitigen Expression mehrerer cDNAs von einem Vektor verbessert.
    • Es ist auch möglich, in der FS1 eine reine Enhancersequenz einzusetzen, die entweder auf einen Promotor im LTR (FS3) oder auf einen internen Promotor in FS2 expressionsfördernd wirkt.
    • Die Einfügung einer Matrix-Anheftungsregion in der FS1 kann sich förderlich auf die Expression eines Vektors auswirken, der einen internen Promotor mit nachfolgender cDNA in der FS2 oder eine Kombination von Promotor und cDNA als FS3 im LTR trägt.
    • Liegt ein Vektor vor, der einen Promotor mitsamt nachfolgender cDNA als FS3 im LTR trägt, kann der Einbau eines RNA-Prozessierungssignals (z.B. posttranskriptionelles Regulatorelement des Woodchuck hepatitis virus) in der FS2 expressionsfördernd wirken, ähnlich wie für konventionelle Vektoren gezeigt (Zufferey et al., 1999).
    Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, Figuren und einem Sequenzprotokoll erläutert.
    BEISPIELE Beispiel 1: Herstellung eines erfindungsgemäßen Vektors: 1. Ausgangskonstrukt
    Die molekularbiologische Konstruktion des retroviralen Vektors vollzog sich auf der Ebene bakterieller Plasmide, die die proviralen Sequenzen enthalten. Das hier verwendete Ausgangskonstrukt leitet sich vom Plasmid pSFβ91 ab (Hildinger et al., 1999; Fig. 3), das den 3'-LTR aus dem spleen focus-forming virus (SFFVp), die 5'-U3 vom MPSV und die 5'-untranslatierte Region (leader) des murine embryonic stem cell virus (MESV) enthält. pSFβ 91 enthält eine modifizierte leader-Region, die sich in der Anwesenheit zweier Spleißsignale auszeichnet, namentlich den Spleißdonor (SD) und den Spleißakzeptor (SA; Fig. 3).
    Am 3'-Ende der leader-Region befinden sich Erkennungsstellen für die Restriktions-Endonucleasen NotI, EcoRI, BamHI und HindIII. Gegenüber diesen Plasmiden von Hildinger et al. (1999) besitzen die verwendeten Konstrukte zusätzlich eine SalI-Restriktionsstelle downstream von der -PBS an der Basenposition 1030 (Fig. 3, Pfeil).
    Im folgenden wurden in diese Plasmide die cDNA des enhanced green flourescent protein (eGFP) und ein 800 bp-großes Fragment der Kernmatrix-Anheftungsregion aus dem humanen β-Interferon Gen-Locus eingeführt. Desweiteren wurden die cis-aktiven Elemente der U3-Region im 3'-LTR deletiert und die eGFP-cDNA unter die transkriptionelle Kontrolle der U3-Region des SFFVp gestellt, die in der leader-Region 5'-wärts vom SD inseriert wurde.
    2. Einsetzen der eGFP-cDNA
    Das Einsetzen der eGFP-cDNA aus dem Plasmid pMP110(eGFP) (Schambach et al., 2000) in pSFβ91 erfolgte über die Restriktionsstellen von NotI und BamHI am 5'-Ende der leader-Region (Fig. 4). Es entstand das Plasmid pSFβ91(eGFP).
    3. Deletion der cis-aktiven Elemente der U3-Region im 3'-LTR
    Für die Deletion der cis-aktiven Elemente in der U3-Region des 3'-LTR wurden über PCR zwei Fragmente aus dem Plasmid pSFβ91(eGFP) amplifiziert (Fig. 5A). Das eine Fragment stellt den Bereich zwischen dem 5'-Ende des 5'-LTR und dem 5'-Ende der 3'-LTRs dar. Als Primer für die Vorwärtsstrang-Synthese diente das Oligonucleotid M13forward, für die Synthese des Rückwärtsstranges das Oligonucleotid U3NheI. U3NheI besitzt am 5'-Ende eine Restriktionsschnittstelle für NheI, so daß das Amplifikat ebenfalls diese Schnittstelle am 3'-Ende aufwies. Nach Restriktion des Amplifikats mit dem Enzym BamHI blieb ein 80 bp-großes Fragment übrig, daß das 5'-Ende der U3-Region und den PP umfaßte (Fig. 5B, +PBS).
    Für die Amplifikation des anderen Fragments dienten die Primer M13reverse (Rückwärtsstrang-Synthese) und U3EcoRI (Vorwärtsstrang-Synthese). Sie hybridisieren sequenzspezifisch am 3'-Ende der U3-Region (U3EcoRI) und downstream vom 3'-LTR (M13reverse; Fig. 5A). Durch U3EcoRI, der eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende besitzt, wurde am 5'-Ende des Amplifikats eine EcoRI-Schnittstelle eingefügt. Durch Restriktion des Amplifikats mit XhoI entstand ein 170 bp-großes Fragment, das neben dem 3'-Ende der U3-Region die R- und die U5-Region enthielt (Fig. 5B).
    Die beiden geschnittenen Amplifikate wurden nacheinander über die Restriktionsschnittstellen BamHI und EcoRV bzw. EcoRV und XhoI in den Klonierungsvektor pBluescript SK II eingesetzt, um dann mit Hilfe der Restriktionsenzyme BamHI und XhoI als ein Fragment ausgeschnitten zu werden. Die Oligonucleotide U3NheI und U3EcoRI enden am 5'-Ende jeweils mit dem Basentriplett ATC, so daß bei der bei der blunt end-Verknüpfung beider geschnittenen Amplifikate eine EcoRV-Schnittstelle entstand (Fig. 5; Sequenz: GATATC).
    Durchführung der PCR:
    Ansatz:
    10 ng DNA
    1 µl Pfu Turbo™-Polymerase (1 U/µl) (Hersteller: Stratagene, La Jolla, US)
    100 pmol Primer 1
    100 pmol Primer 2
    5 µl dNTP-Mix (je 10 mM) (Hersteller: Qiagen, Hilden, DE)
    5 µl 10 x Cloned-Pfu-Puffer (100 mM KCl; 100 mM (NH4)2SO4; 200 mM Tris-HCl, pH 8.5; 20 mM MgSO4; 1% w/v Triton X-100; 1 mg/ml BSA) (Stratagene) ad. 50 µl Aqua dest.
    Es wurde am Thermo-Cycler (Biometra, Göttingen) folgendes Programm gewählt:
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    Als Negativ-Kontrollen für die PCR diente ein Ansatz mit nur je einem der beiden Primer und ein Ansatz ohne Primer. Für die Positiv-Kontrolle wurde ein definiertes Plasmid mit speziellen Primern eingesetzt, das bei erfolgreicher Durchführung der PCR ein Amplifikationsprodukt bekannter Größe liefert.
    Die für die PCR verwendeten Oligonukleotid-Primer wurden von der Firma Gibco BRL hergestellt.
    Figure 00120002
    Aus dem Plasmid pSFβ91(eGFP) wurde mit BamHI und XhoI der Bereich downstream von der eGFP-cDNA ausgeschnitten und durch die miteinander verknüpften PCR-Fragmente ersetzt (Fig. 5C). Die entstandenen Plasmide pSIN91(eGFP) bzw. pSIN110(eGFP) enthalten in der U3-Region des 3'-LTR keine Enhancer- oder Promotor-Elemente.
    4. Insertion des Promotors
    Nachdem im 3'-LTR die cis-aktiven Sequenzen deletiert worden sind, erfolgte die Insertion des Promotors in der leader-Region vor die SD-Stelle über die SalI-Restriktionsschnittstelle (Fig. 6). Das Promotorfragment wurde zunächst über PCR mit den sequenzspezifischen Primern XhoEagSF65 und SalEagSF63 amplifiziert, die am 5'-Ende des 3'-SFFVp-LTRs (XhoEagSF65) bzw. in dem Bereich ca. 30 bp downstream vom 5'-Ende der R-Region (SalEagSF63) hybridisieren (Fig. 6A). Das Amplifikat umfaßte deshalb neben der gesamten U3-Region auch die ersten 27 Nucleotide der R-Region, die das Cap-Signal enthalten und daher für eine optimale Translation der mRNA unverzichtbar sind (Cupelli und Lenz, 1991).
    Die für die PCR verwendeten Oligonukleotide weisen an ihrem 5'-Ende Erkennungsstellen für die Restriktions-Endonukleasen XhoI und EagI (XhoEagSF65) bzw. SalI und EagI (SalEagSF63) auf, so daß das Amplifikat eben diese Schnittstellen am 5'- bzw. 3'-Ende trug. Um das PCR-Produkt über die SalI-Restriktionsstelle in den Vektor zu inserieren, wurde es zuvor mit XhoI und SalI geschnitten (Fig. 6B). Aufgrund der Komplementarität der Basenüberhänge von XhoI und SalI nach einer Restriktion ist dieses Vorgehen möglich. Durch das Primerdesign wurde erreicht, daß nach der Ligation nur auf jeweils einer Seite eine SalI-Restriktionsstelle wiederhergestellt wurde (Fig. 6C) und bei zukünftigen Klonierungen für die Insertion weiterer Fragmente wiederverwendet werden kann, ohne dabei den Promotor wieder auszuschneiden.
    5. Insertion der Kernmatrix-Anheftungsregion (MAR)
    Ein ca. 800 bp-großes Fragment der Kernmatrixanheftungs-Region aus dem humanen Interferon-β Gen-Locus wurde aus dem Plasmid pTZE20 (Mielke et al., 1990) mit Hilfe der Restriktions-Endonucleasen XmnI und EcoRI ausgeschnitten. Mittels der Klenow-Polymerase wurde der vier Nucleotid-große Basenüberhang der EcoRI-Schnittstelle zu einem glatten Ende aufgefüllt, so daß das Restriktionsfragment an beiden Flanken blunt ends besaß. Die MAR wurde direkt am 3'-Ende der eGFP-cDNA über die HindIII-Schnittstelle eingesetzt, deren Basenüberhänge nach dem Schnitt ebenfalls mit der Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli zu glatten Enden aufgefüllt wurden (Fig. 7). Die MAR wurde dabei in sense-Orientierung zum Promotor in den Vektor inseriert, was durch eine Restriktionsspaltung mit der Endonuklease SstI verifiziert wurde, die die MAR in zwei unterschiedlich große Fragmente schneidet. Sie liegt damit in derselben Orientierung zum Promotor wie im humanen Interferon-β Gen-Locus (Mielke et al., 1990).
    Es wurde das provirale Plasmid pSMICIP2s(eGFP), erhalten, dessen Plasmidkarte in Fig. 8 gezeigt ist. Eine Probe dieses Plasmids wurde am 31. August 2000 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Nr. DSM 13711 hinterlegt.
    Beispiel 2: Evaluierung der Verpackungseffizienz und Expressionseigenschaften:
    Folgende Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die erfindungsgemäße Insertion der Fremdsequenz 1 [FS1]
  • A) unter Erhalt der Verpackungseffizienz möglich ist und
  • B) eine Verbesserung der Expressionseigenschaften erlaubt.
    • A) Erhalt der Verpackungseffizienz
    Hintergrund: Replikationsdefekte retrovirale Vektoren werden in der Zellkultur in sicherheitsmodifizierten Verpackungszellen hergestellt. Eine gängige Verpackungszelle ist PHOENIX-ampho, die replikationsdefekte Mausretroviren mit amphotropem Hüllprotein freisetzt (Kinsella and Nolan, 1996). Bis zu 96 Stunden nach Transfektion der proviralen Vektorplasmide können Virusüberstände mit einem infektiösen Titer zwischen 105 und 106 Partikeln pro ml Zellkulturüberstand geerntet werden. Wie zuvor beschrieben (Fehse et al., 2000), wird ein zweites Plasmid kotransfiziert, das für das Hüllprotein des Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV-G) kodiert. So können gemischte Virushüllen mit erweitertem Wirtsbereich erzeugt werden, wodurch die nachfolgende Transduktion verschiedener Zellarten erleichtert wird. Diese Modifikation hat keinen Einfluss auf die genetischen Eigenschaften des übertragenen Vektors (Laer et al., 1998). Entscheidend für den Erhalt der Verpackungseffizienz sind die Größe und die genetische Stabilität des Vektorgenoms sowie das Fehlen einer Interferenz mit der Funktion von Ψ. Nach dem Stand der Forschung war unbekannt, ob Fremdsequenzen in der hochkonservierten Region zwischen PBS und SD eingefügt werden können, ohne die für die Verpackung notwendige RNA-Sekundärstruktur zu beeinträchtigen (Alford et al., 1991).
    Vorgehen: Die o.g. Plasmide wurden mit der Calciumphosphat-Transfektionsmethode zusammen mit einem VSV-G-Protein-kodierenden Plasmid in einen gleichmäßigen Rasen von PHOENIXampho-Zellen eingebracht. Innerhalb der nächsten 96 Stunden wurden fraktioniert Zellkulturüberstände abgenommen, filtriert (0.22 µm) und in Aliquots bei -70° konserviert. Der Gehalt an infektiösen Viruspartikeln wurde durch retrovirale Transduktion von mesenchymalen Mausfibroblasten der Linie SC1 bestimmt, indem eine konstante Zielzellzahl mit steigenden Mengen an virushaltigem Überstand versetzt wurde (Fehse et al., 2000). Die Fraktion der erfolgreich retroviral transduzierten Zellen wurde nach 48 Stunden über die Expression von EGFP im Durchflußzytometer bestimmt. Der maximale Virustiter wurde über den Mittelwert der besten fünf Ergebnisse ermittelt.
    Ergebnis: Die Titer der Vektoren SMICIP2s(eGFP) (Titer 223800 ± 45400 / ml) und SINoMI-EGFP (Titer 237500 ± 55000 / ml) liegen in derselben Größenordnung wie der Titer des herkömmlichen Vektors SF110-EGFP (Titer 134700 ± 76700 / ml). Niedrigere Titer erzielen die Vektoren SINoM (43500 ± 13000 / ml) und SINoMS (31800 ± 64000 / ml).
    Bewertung: Diese Experimente zeigen, dass der Einfluss der Fremdsequenz 1 [FS1] auf den Titer kontextabhängig ist, d.h. auch vom Aufbau der [FS2] und [FS3] abhängt. In Kombination mit der MAR in der Fremdsequenz 2 [FS2] lassen sich Standardtiter erzielen. Kontrollexperimente zeigen, dass die MAR-Sequenzen per se den Titer nicht heben. Daher ist die Erzielung ausreichender Virustiter mit dem erfindungsgemäßen Vektoraufbau auch in anderen Sequenzkombinationen möglich.
    B) Expressionseigenschaften
    Hintergrund: Die Expression der übertragenen Gene ist ein wichtiges Kriterium für die Beurteilung der Qualität retroviraler Vektoren. Für die Expression vieler Transgene ist es förderlich, für einige sogar entscheidend, ein Intron in der 5'-untranslatierten Region zu platzieren (Buchmann und Berg, 1988; Hildinger et al., 1999). Das Intron muss allerdings bei der Expression der retroviralen RNA in der Verapckungszelle erhalten bleiben, da es sonst im übertragenen retroviralen Genom nicht mehr enthalten ist. Der Erhalt des Introns kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass Spleißdonor- und Spleißakzeptorsignale an den Flanken von Ψ eingefügt werden (Hildinger et al., 1999). Dies wurde bislang nur mit Vektoren praktiziert, die Enhancer-Promotorsequenzen in den LTRs tragen. Solche Vektoren haben den potentiellen Nachteil, dass es zur transkriptionellen Aktivierung stromabwärts gelegener zellulärer Sequenzen kommen kann, sofern der Enhancer-Promotor im 3'-LTR aktiviert wird. Daher ist es wünschenswert, das Prinzip des Intron-haltigen Transgens im Kontext eines Vektors umzusetzen, dessen Enhancer-Promotorbereich im LTR deletiert wurde (sog. selbstinaktivierender Vektor, Yu et al., 1986). Eine solche Konstruktion wurde erstmals in den erfindungsgemäßen Vektoren SMICIP2s(eGFP) und SINoM-EGFP realisiert.
    Vorgehen: Zur Untersuchung der Expressionseigenschaften des SMCIP2s-EGFP Vektors wurden Mausfibroblasten der Linie SC1 und Mauslymphozyten der Linie EL4 unter Verwendung jeweils gleicher Mengen infektiöser Viruspartikel transduziert. Die Expressionshöhe von EGFP wurde nach 48 Stunden im Durchflußzytometer bestimmt. Pro Aufzeichnung wurden mind. 10000 unabhängige Ereignisse gemessen. Das mittlere Expressionsniveau wurde anhand des Mittelwertes (mittlere Fluroeszenz in willkürlichen Einheiten) aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten ermittelt.
    Ergebnis: In SC1-Zellen vermittelt der Vektor SMICIP2s(eGFP) von allen getesteten Vektoren die höchste Expression (mittlere Fluoresenzenz 682 ± 19). SINoM-EGFP, die Variante ohne MAR, liegt niedriger (475 ± 21). SINoMS-EGFP, die Variante ohne Intron und MAR, erreicht eine noch geringere Expression (183 ± 11) und ist diesbezüglich identisch mit dem herkömmlichen Vektor, SF110-EGFP (185 ± 2). Der Kontrollvektor SINoMI-EGFP entspricht dem klassischen Aufbau eines selbstinaktiverenden Vektors, da der Promotor ohne Intron direkt vor der cDNA liegt; dieser Vektor ist bezüglich der Expression dem Vektor SMICIP2s(eGFP) ebenfalls unterlegen (315 + 21).
    Auch in EL4-Zellen vermitteln die erfindungsgemäßen Vektoren mit dem Enhancer-Promotor als Fremdsequenz 1 [FS1] und nachgeschalteten Intron die höchste Expression, allerdings zeigt sich hier kein fördernder Einfluss der MAR-Region; der Vektor SINoM-EGFP vermittelt die höchste Expression (713 ± 19), gefolgt von SMI-CIP2s(eGFP) (600 ± 14). SINoMS-EGFP, die Variante ohne Intron und MAR, erreicht eine deutlich geringere Expression (391 ± 2), ist aber noch besser als der herkömmliche Vektor, SF110-EGFP (185 ± 2). Auch die Kontrolle SINoMI-EGFP (391 ± 2) zeigt sich erneut als den Vektoren SMICIP2s(eGFP) und SINoM-EGFP unterlegen.
    Bewertung: Diese Experimente zeigen, dass die erfindungsgemäße Insertion von Fremdsequenzen zwischen PBS und SD genutzt werden kann, um die Expressionseigenschaften retroviraler Vektoren zu verbessern. Die gewählte Konfiguration des Enhancer-Promotors unmittelbar stromaufwärts des retroviralen Introns kombiniert die sicherheitsrelevanten Vorteile eines selbstinaktivierenden Vektors (mit deletierten Enhancer-Promotorsequenzen des LTRs) mit den expressionsfördernden Eigenschaften eines Intron-haltigen Vektors. Der Expressionsgewinn um den Faktor 2 bis 3 gegenüber herkömmlichen Vektortypen zeigt sich in beiden Zellinien. Die Präsenz der MAR-Region hingegen war nur in den untersuchten Fibroblasten förderlich, was auf eine ausgeprägtere Differenzierungsabhängigkeit dieses Elementes hindeutet. Diese Befunde unterstreichen, dass der durch den neuartigen Vektoraufbau erzielte Expressionsgewinn nicht von der Präsenz einer MAR abhängt.
    C) Zusammenfassende Bewertung:
    Der erfindungsgemäß gewählte Vektoraufbau erweitert die Möglichkeiten der Konstruktion retroviraler Gentransfervektoren. Es wurde experimentell gezeigt, dass
    • eine Fremdgeninsertion zwischen der retroviralen PBS und dem Verpackungssignal möglich ist
    • Vektoren mit diesem Aufbau in ausreichenden Titern produziert werden können
    • in einer bevorzugten Ausführung die erfindungsgemäße Fremdsequenzinsertion genutzt werden kann, um Vektoren mit verbesserten Expressionseigenschaften und vorteilhaften, die biologische Sicherheit des Gentransfers potentiell fördernden Eigenschaften zu erzeugen.
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    Figure 00210001
    Figure 00220001
    Figure 00230001
    Figure 00240001
    Figure 00250001
    Figure 00260001

    Claims (18)

    1. Retroviraler Vektor mit dem allgemeinen Aufbau
      Figure 00270001
      bei dem
      [LTR]
      die endständige Sequenzwiederholung (long terminal repeat, LTR) des retroviralen Vektors ist,
      [PBS]
      die retrovirale Primerbindungsstelle ist,
      [SD]
      das retrovirale Spleißdonorsignal ist,
      [Ψ]
      das retrovirale Verpackungssignal ist,
      [SA]
      das retrovirale Spleißakzeptorsignal ist,
      und
      [PP]
      ein Polypurintrakt (PP-Trakt) ist,
      dadurch gekennzeichnet, daß
      der Vektor zwischen der retroviralen Primerbindungsstelle (PBS) und dem retroviralen Spleißdonor (SD) eine weitere Fremdsequenz [FS1] enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Enhancer-Promotor-Sequenzen, Enhancer-Sequenzen, cDNA-Sequenzen, Sequenzen für Chromatin-Modifikation, und/oder Sequenzen für RNA-Prozessierungssignale ausgewählt ist.
    2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner eine zwischen [SA] und [PP] insertierte Fremdsequenz 2 [FS2] enthält, die aus der Gruppe bestehend aus cDNA-Sequenzen, Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen, Sequenzen für Interne Ribosomeneintrittstellen (IRES), Sequenzen für Chromatin-Modifikation und/oder Sequenzen für RNA-Prozessierungssignale ausgewählt ist.
    3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die endständige Sequenzwiederholung (LTR) eine Fremdsequenz beinhaltet, die aus der Gruppe bestehend aus Klonierungsstellen zur Deletion des LTR-Enhancer-Promotors, Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen, cDNA-Sequenzen, Sequenzen für Chromatin-Modifikation und/oder Sequenzen für RNA-Prozessierungssignale ausgewählt ist.
    4. Vektor nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das retrovirale Spleißdonorsignal (SD) und/oder das retrovirale Spleißakzeptorsignal (SA) durch Mutation inaktiviert ist/sind.
    5. Vektor nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Retrovirus aus der Gruppe bestehend aus Mausleukämieviren, Vogelretroviren, Spumaviren, B-Typ-Retroviren, D-Typ-Retroviren oder Lentiviren ausgewählt ist.
    6. Vektor ensprechend DSM 13711.
    7. Infektiöses Viruspartikel, dadurch gekennzeichnet, daß das Partikel den retroviralen Vektor nach den Ansprüchen 1 bis 6 enthält.
    8. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem retroviralen Vektor nach den Ansprüchen 1 bis 6 transfiziert ist.
    9. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem infektiösen Viruspartikel nach Anspruch 7 infiziert ist.
    10. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor entsprechend DSM 13711 transfiziert ist.
    11. Wirtszelle nach den Ansprüchen 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine hämatopoetische, mesenchymale oder lymphatische Zelle ist.
    12. Verwendung des retroviralen Vektors nach den Ansprüchen 1 bis 6 in der Gentherapie.
    13. Verwendung des retroviralen Vektors nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Klonierung von Genen.
    14. Verwendung des retroviralen Vektors nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Expression und/ oder Überexpression von Proteinen oder RNA.
    15. Verwendung des retroviralen Vektors nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Transfektion hämatopoetischer, mesenchymaler oder lymphatischer Zellen.
    16. Verfahren zur Gewinnung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Wirtszelle nach den Ansprüchen 8 bis 11 in einem geeigneten Medium unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression der von den Fremdsequenzen [FS1], [FS2] und/oder [FS3] kodierten Proteine notwendig sind, wobei man das so erzeugte Protein von den Zellen und dem Medium abtrennt.
    17. Verwendung des retroviralen Vektors nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Gentherapie, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor in geeigneter Form vorliegt, um in die Zielzellen eingeführt zu werden.
    18. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Vektor nach den Ansprüchen 1 bis 6 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen enthält.
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