JP3864049B2 - ウイルスコード配列を含有していない高い効率を有するレトロウイルスベクター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子治療のための改善されたレトロウイルスベクターに関する。詳しくは、本発明はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌコード塩基配列を完全に欠失しているＭＬＶベースのレトロウイルスベクターに関する。本発明は、安全で且つ有効なレトロウイルス発現ベクターに関し、この発現ベクターでは、レトロウイルス遺伝子、すなわちｇａｇ．ｅｎｖおよびｐｏｌの全てが完全に欠失していて；非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード塩基配列が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され；非相同性内部プロモーターまたは内部リボソームエントリー部位（以下「ＩＲＥＳ」と称する）がクローニング部位の下流位置に挿入され；そして５’ＬＴＲ（ロングタームリピート）または強力な非相同性プロモーターのフルレングスＵ３配列が外来遺伝子の発現を調節する。
【０００２】
【発明の背景・従来の技術】
レトロウイルスベクターはその他のベクターよりもさらに頻繁に遺伝子療法に使用されていて、世界的に承認された臨床プロトコールの５０％を超えて使用されている（Wiley-Journal of Gene Medicine Website ; http://www.wiley, co.uk/genetherapy）。マウス白血病ウイルス（以下「ＭＬＶ」と称する）ベースのベクターが主に使用されているが、臨床上の使用においてレトロウイルスベクターにはなお多くの問題がある。最も重大な問題はそれらの安全性であり、レトロウイルスベクターはウイルスベクターの一種であり、そのために細胞中で複製受容能のあるレトロウイルス（以下「ＲＣＲ」と称する）に変換されることがある。結局、相同組換えによるＲＣＲ生成は重大な関心事であった。
【０００３】
全ての利用可能なレトロウイルスベクターは顕著に長いウイルスコード配列を含有している。これらの配列はパッケージングされたベクターが放出されるパッケージングされた細胞のゲノム中にも存在しているので、パッケージングされたゲノム中の同一ヌクレオチド配列とベクターとの間に相同組換えが生じてＲＣＲの生成が結果として生じ得ることが提案されていて、このことはMiller等(Miller等、Human Gene Ther., 1:5, 1990)によって報告されている。
【０００４】
ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターの二種類のタイプ、すなわちＬＮシリーズベクターおよびＭＦＧベクターが遺伝子療法に最も頻繁に使用されている(MillerおよびRoseman, Biotechnigues, 7: 980-990,1989 ; Dranoff等、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90 : 3539-3543,1993)。ＬＮシリーズベクター中の外来遺伝子の発現は非相同性内部プロモーターまたはＬＴＲによって調節されるが、ＭＦＧベクター中の転写レベルはＬＴＲのコントロール下にあり、そして外来遺伝子はゲノムＲＮＡまたはスプライシングされたサブゲノムＲＮＡの形態で発現される。しばしば第一世代レトロウイルスベクターと考えられているＬＮシリーズベクターは４２０−ｂｐ ｇａｇコード配列を含有している。この領域はウイルスパッケージングに重要な役割を果しているものと考えられているが、ある条件下ではｇａｇ領域はウイルスパッケージングおよび力価に対して顕著な効果を示すことなく欠失できることが開示されている(Kim等，J. Virol., 71 : 994-1004, 1998)。
【０００５】
ＬＮシリーズベクターと比較して、ＭＦＧベクターは遺伝子発現レベルをさらに安定化し、かつ高め、そしてヒト−またはマウス−由来細胞系の大部分でより高いウイルス力価を生じることが知られている(Byun等，Gene Ther., 3 : 780-788, 1996)。しかしながら、ＭＦＧベクターはさらに多くのウイルス配列、ｇａｇに対する４２０−ｂｐ．ｐｏｌに対する３７７−ｂｐ，およびｅｎｖに対する９９−ｂｐを含有し、ＬＮシリーズベクターよりも高い頻度でＲＣＲを生成する可能性が生じる。
【０００６】
通常のレトロウイルスベクターに関連するこれらの不利な点を克服するべく、本発明者等はレトロウイルスベクターを構築した（韓国特許出願第９７−４８０９５号）。このベクターは以下に述べるいくつかの特徴を有していた：
【０００７】
・クローニングされた遺伝子転写産物は有効にスプライシングされ、より高い発現レベルの遺伝子を生成した。
・ｇａｇおよびｅｎｖ配列はウイルス力価を失うことなく完全に欠失していた。
・ＩＲＥＳをベクターでの二種またはそれ以上の遺伝子の同時発現のために使用した。
・マルチクローニング部位をベクター中に挿入して外来遺伝子のクローニングを容易にした。
【０００８】
ｇａｇおよびｅｎｖ配列がレトロウイルスベクターから欠失していたため、ベクターの安全性がその他のレトロウイルスベクターと比較して増大した。しかし、このベクターはスプライスアクセプター配列を係留する３７７−ｂｐ ｐｏｌコード配列およびｅｎｖのための２８４−ｂｐリーダー（転写されるが、翻訳されない）を含むその下流配列をなお含有している。その理由はｐｏｌ配列の欠失は異常な、または非能率的なスプライシングをもたらすからである。ｐｏｌ配列のための３７７−ｂｐはまたパッケージングラインのゲノム中にも存在しているので、ＲＣＲ生成を生じる非相同性組換えの可能性がベクターになお残っている。
【０００９】
遺伝子発現の効率が上昇し、かつ安全性が増大した新規なレトロウイルスベクターを開発するために、本発明者等はいずれのウイルスコード配列をも含有していないレトロウイルスベクターを構築した。本発明は、ＭＬＶ由来ｐｏｌ遺伝子が完全に欠失し、パッケージング細胞系での非相同性組み換えによるＲＣＲ生成の可能性を排除し；非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード領域が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され、遺伝子発現の効率を最大とし；５′ＬＴＲまたはヒトサイトロメガロウイルス（以下「ＨＣＭＶ」と称する）主要前初期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＭＩＥＰ：ｉｅｌ遺伝子のプロモーター）を外来遺伝子発現調節のためのシス−エレメントとして使用され；そして非相同性内部プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に挿入され、二種またはそれ以上の外来遺伝子の同時発現が可能となるレトロウイルスベクターを構築することにより達成される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、より高いレベルで外来遺伝子が発現され、それ故に遺伝子療法に有効に使用し得る安全なレトロウイルスベクターを提供するにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上述した目的は容易に達成される。
本発明は、ＭＬＶ−コードｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌ配列が完全に欠失しているＭＬＶベースのレトロウイルスベクターを提供する。
【００１２】
一つの特徴によれば、本発明のＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは、外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されている非相同性イントロンおよび（または）非相同性スプライスアクセプターを含有し得る。
【００１３】
別の特徴によれば、本発明のＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは、外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同性非コード配列を含有し得る。
さらに他の特徴によれば、ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）を本発明のＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベクター中で非相同性プロモーターで置換することができる。
【００１４】
さらにその他の特徴によれば、本発明のＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベクターは外来遺伝子のためのクローニング部位の下流位置に非相同性プロモーターを含有することができる。
本発明によればまた本発明のＭＬＶ−ベースレトロウイルスで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）菌株が提供される。
本発明のこれ以上の特徴は以下に明らかとなる。
【００１５】
【発明の実施の態様】
本発明はＭＬＶベースのベクター、特にＭＯＮまたはＭＩＮから誘導される安全でかつ効率のよいレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターにおいて、レトロウイルス遺伝子（ｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌコード配列）は完全に欠失し；非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード配列が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され；強力な非相同性プロモーターが５′ＬＴＲに含有され；そして非相同性プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に配置されている。
【００１６】
特に、本発明のベクターにおいて、スプライスアクセプターを含むｐｏｌコード配列が完全に欠失しているので、通常のレトロウイルスベクターの不利な点とされている相同性組換えの可能性を排除することができる。
【００１７】
欠失ｐｏｌ配列は遺伝子発現レベルの低下をもたらす。低下した発現効率およびウイルス力価を回復するために、以下の如く様々なレトロウイルスベクターが本発明で提供される：
【００１８】
・本発明は、ｐｏｌコード配列の３′部分とオーバーラップしている欠失スプライスアクセプターを補完するために、非相同性イントロンおよび（または）スプライスアクセプターが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されているレトロウイルスベクターを提供する。既知のウイルスまたは細胞遺伝子のイントロンおよび（または）スプライスアクセプターはいずれもがこの目的に使用することができ、好ましくはＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子、延長因子１α（以下「ＥＦ１α」と称する）遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＡＰＤＨ」と称する）遺伝子、β−アクチン遺伝子等である。
【００１９】
・本発明はまた、非相同性非コード配列がクローニング部位の上流位置に挿入されているレトロウイルスベクターを提供する。非コード配列は、翻訳効率を増進するのに使用され、そしてイントロンおよび非翻訳エキソンを包含するタンパク質に翻訳されない転写ＤＮＡ配列と定義される。好ましくは、非コード配列はＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子、ＥＦ１α遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子からなる群から選択される。非相同性非コード配列の挿入により、外来遺伝子転写のスプライシングの効率化およびサブゲノムＲＮＡの有効な翻訳が可能となる。
【００２０】
・加えて、本発明は非相同性内部プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に係留されているレトロウイルスベクターを提供する。
【００２１】
・最後に、本発明は５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列または強力な非相同性プロモーターが含まれているレトロウイルスベクターを提供する。
本発明を以下に詳述する。
【００２２】
１．ｐｏｌコード配列の欠失：ΔＳＡ構築
安全性が改善されたレトロウイルスベクター、すなわち相同性組換え活性を有していないレトロウイルスベクターを開発するために、ＭＯＮベクター（韓国特許出願第９７−４８０９５号）からスプライシング受容体を包含するｐｏｌコード配列を欠失させ、欠失変異体ベクターΔＳＡを構築した。さらに、レポーター遺伝子として細菌性ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の挿入によりΔＳＡ−ＣＡＴベクターを構築した（図１参照）。次に、ΔＳＡ−ＣＡＴでトランスフェクションまたは形質導入した細胞系を調製し、そしてＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイにより、欠失変異体のウイルス力価は親ベクターＭＯＮ−ＣＡＴの力価と匹敵し得るが、遺伝子発現が低下したことが明らかになった（表１参照）。これらの結果は、スプライスアクセプターを含むｐｏｌ遺伝子がベクター中の外来遺伝子発現の調節に関連していることを提示している。
【００２３】
これらの結果から予想されるとおり、非相同性スプライスアクセプターおよび（または）イントロンが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入してｐｏｌ遺伝子に付随して欠失されるスプライシング部位を補完するようにすると、外来遺伝子の発現レベルが上昇する。しかし、スプライシングが余りに多く起こると、サブゲノムＲＮＡ対ゲノムＲＮＡの比が増加し、高レベルの遺伝子発現にもかかわらずウイルス力価の低下をもたらす。
【００２４】
従って、理想的なレトロウイルスベクターを構築するには、転写、スプライシングおよび翻訳の率がトランスフェクションまたは形質導入された細胞系で釣合がとれているようにベクターをデザインしなければならない。換言するに、外来遺伝子が豊富に転写され、そしてゲノムＲＮＡの量がサブゲノムＲＮＡの量と釣合がとれ、そのためにゲノムＲＮＡがウイルス粒子中にパッケージされるように十分に生成され、またサブゲノムＲＮＡが外来遺伝子にコードされている多くのタンパク質中に翻訳され得るようなベクターが好ましい。本発明では、ウイルスまたは細胞遺伝子から由来する様々な非コード配列が欠失変異体ベクターに挿入されているレトロウイルスベクターが提供され、それでこの挿入がウイルス力価および遺伝子発現レベルに効果を有するかどうかを検討する。
【００２５】
２．スプライシングおよび翻訳効率を増進する非相同性ＤＮＡ配列の挿入：
ＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１構築
スプライシング率および遺伝子発現率の釣合を保持し、またウイルスＲＮＡの全収率を上昇させるために、ＭＬＶ５′ＬＴＲのＵ３領域が強力なプロモーター、ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換され、そして非相同性非コード配列が挿入されたレトロウイルスベクターが構築された。
【００２６】
好ましい態様では、ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の非翻訳エキソンおよびイントロンがベクターのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同性非コード配列として使用されていた（図２参照）。ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソンおよび（または）イントロン配列は発現ベクターに挿入されると翻訳効率を増進することが知られている。
【００２７】
特に、ｐＣＭベクターは以下の如くして調製した：レトロウイルスコード配列の全てを欠失させ；５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し、ＭＬＶ誘導３′ＬＴＲを保持し；そして非相同性内部プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター−ネオカセットを用いた。次に、ｐＣＭベクターにＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび（または）エキソン２を挿入することによりＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１ベクターを構築した（図３ａ、図３ｂおよび図４ａ〜４ｃを参照）。
次に、ＣＡＴレポーター遺伝子の挿入により、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴ、ＤＯＮ２−ＣＡＴおよびＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴベクターを調製した。これらのベクターでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系をＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイの結果から、三種のベクターのいずれもがコントロールベクターＬ−ＣＡＴ−ＳＮよりも一層高いスプライシング効率および遺伝子発現を示すことが確認された（表２を参照）。
【００２８】
３．スプライシングおよび遺伝子発現を促進し得る細胞ＤＮＡ配列の挿入：ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩおよびＭＩＮ−ＧＩ構築
別の好ましい態様において、レトロウイルスベクターをさらに工夫して、スプライシング率と遺伝子発現率との釣合からウイルス力価および遺伝子発現双方の効率を一層高くするようにした。これらのベクターにおいて、ヒト遺伝子のエキソンおよび（または）イントロン配列をレトロウイルスベクター中の外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入した（図５を参照）。
【００２９】
これらのベクターを構築するために、ＭＩＮベクターを調製した。このベクターでは、レトロウイルスコード領域がすべて欠失され；ＭＬＶ−由来５′および３′ＬＴＲが保持され；そしてＥＭＣＶ ＩＲＥＳ−ネオカセットを非相同性内部プロモーターとして使用した。特に、ＭＩＮベクターを次の工程によって調製した：ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲ領域を含むＤＮＡフラグメントを増幅し、このフラグメントをｐＵＣ１８ベクターに挿入し、そして組換えベクターにＩＲＥＳ−ネオカセットを挿入する（図６を参照）。ヒトβ−アクチン、ＥＦ１αまたはＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターのクローニング部位の上流位置に挿入して、ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩまたはＭＩＮ−ＧＩベクターをそれぞれ構築した。（図７ａ〜７ｃ参照）。
【００３０】
スプライスアクセプターとして細胞遺伝子（例えば、ＭＩＮ−ＡＩ等）を用いるベクターをウイルス遺伝子（例えば、ＤＯＮ１．２等）を用いるベクターと比較するために、別のＭＬＶ−ベースのベクターＭＩＮ−２を調製した。具体的には、ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含むＤＮＡ配列をＭＩＮベクターに挿入する（図７ｄを参照）。この挿入断片はＤＯＮ２ベクターのそれと同一である。
【００３１】
次に、ＭＩＮ−ＣＡＴ、ＭＩＮ−ＡＩＣＡＴ、ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ、ＭＩＮ−ＧＩＣＡＴおよびＭＩＮ−２ＣＡＴベクターを相当するベクターにＣＡＴレポーター遺伝子を挿入することにより調製した。これらのベクターでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系をＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイの結果から、本発明の全てのベクターのウイルス力価はコントロールベクターＬＸＳＮおよびＭＦＧの力価と同じであり、一方ＭＩＮ−２およびＭＩＮ−ＥＩでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系での遺伝子発現はコントロールベクターを含む細胞系よりも一層高いことが明らかとなった（表３を参照）。
【００３２】
【実施例】
本発明の実際の、現在好ましい態様を以下の実施例に示す如く例示する。
しかし、当業者は、この記載を考慮して、本発明の精神および範囲内で変形および改良とすることができることが明らかである。
【００３３】
実施例１：ＭＯＮベクターからのｐｏｌ遺伝子の欠失
（１−１）ΔＳＡ構築
ｐｏｌコード配列を欠如している５′ＬＴＲ下流配列を調製するために、ＰＲＣ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ここでは、ＭＯＮベクター（韓国特許第９７−４８０９５号）を鋳型として使用し、また配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号２（Ｒ５２３Ｂａｍプライマー）によって表わされる２種の一本鎖合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＤＮＡフラグメントはＭＬＶ５′ＬＴＲ〜＋５２３ｂｐのヌクレオチド配列に相当した（図１を参照）。この場合、＋１はＭＬＶゲノムの転写開始部位を表わし、また＋２１２〜＋５２３ｂｐの配列はゲノムＲＮＡをパッケージするのに必要な非コード領域である。
【００３４】
ＰＣＲ生成物をＰＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ＣＡ．ＵＳＡ）にサブクローニングし、次に得られたベクターからＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。ＭＯＮベクターの部分ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＰＣＲ生成物のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントで置換してΔＳＡベクターを構築した。このΔＳＡベクターを、ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲ、およびスプライスアクセプター、ＩＲＥＳ−ネオカセットおよびポリプリントラックからなる非コード配列を含有するレトロウイルスベクターの基本バックボーンとして使用し、レトロウイルスコード配列は全て欠失している（図１を参照）。
【００３５】
（１−２）ΔＳＡ−ＣＡＴ構築
外来遺伝子発現およびレトロウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに対する上述の遺伝子操作の効果を検討するために、細菌ＣＡＴ遺伝子をレポーター遺伝子として使用した。
【００３６】
ＣＡＴ遺伝子をＰＣＲにより入手し、ここではｐＣＡＴ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を鋳型として使用し、また配列番号３（ＣＡＴＡＴＥＮプライマー）および配列番号４（ＣＡＴＳＴＯＰプライマー）によって表わされた２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物をｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入し、そしてＣＡＴ遺伝子を含む得られたベクターのＢａｍＨＩフラグメントをｐＣ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を導入して、ｐＣ３．１−ＣＡＴを調製した。ΔＳＡ−ＣＡＴベクターをΔＳＡベクターのＨｐａＩ部位にＣＡＴ遺伝子（Ｃ３．１−ＣＡＴのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）−処理ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント）を挿入することにより構築した（図１を参照）。
【００３７】
（１−３）ＣＡＴアッセイ
ΔＳＡ−ＣＡＴおよびコントロールベクター（ＭＯＮ−ＣＡＴ）を、Ｇａｇ−ＰｏｌおよびＥｎパッケージングベクターと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした（ＤｕＢｒｉｄｇｅ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３７９−３８７，１９８７）。トランスフェクションした細胞を４８時間培養した後、サイトソルタンパク質を抽出してＣＡＴ活性、すなわち、外来遺伝子発現レベルの指標を測定した。一方、培地を０．４５−μｍフィルターで濾過して得られた細胞を含まないウイルス上澄液を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）を形質導入した。ＣＡＴ活性のレベルは形質導入後４８時間のタンパク質抽出液を用いて測定した。
【００３８】
ＣＡＴアッセイは以下の如くして実施した：まず、細胞を収集し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１ｍｌで洗い、次に０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝剤に再懸濁した。細胞を凍結（ドライアイス中）−解凍（３７℃水浴中）サイクルを６回くり返して溶解した。得られた細胞抽出液を７分間６０℃に加熱してデアセチラーゼを不活性化した後、抽出液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上澄液をとり出した。抽出液中のタンパク質レベルをブラッドフォード法によって定量した。標準化した抽出液を14Ｃ−クロラムフェニコール（６０ｍＣｉ／ミリモル、０．１ｍＣｉ／ｍｌ）１μｌ、アセチル補酵素Ａ２μｌ（４０ｍＭ）および０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の適切な量と混合した。この反応混合物を適当な反応時間３７℃でインキュベートした。反応後、クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出し、そして減圧濃縮した。ペレットを酢酸エチル１５μｌに再懸濁し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートに充填した。ＴＬＣ展開溶剤（９５％クロロホルム：５％メタノール）を用いてＴＬＣを実施した後、ＴＬＣプレートを乾燥し、次にＸ線フィルムに曝すか、またはホスホイメージアナライザー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ）にかけ、その結果としてクロラムフェニコールのアセチル化レベルを測定した。試料中のＣＡＴ活性は、アセチル化クロラムフェニコール対全クロラムフェニコールの放射能比から算出することができた。
【００３９】
表１は、ΔＳＡ−ＣＡＴ欠如ｐｏｌ遺伝子でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞系でのＣＡＴ活性はＭＯＮ−ＣＡＴでトランスフェクションされたコントロール系よりも低いことを示している。これは、ｐｏｌコード配列が遺伝子発現の調節に関連していることを示唆している。加えて、形質導入された系でのＣＡＴ活性はトランスフェクションされた系と類似のパターンを示し、パッケージング効率は遺伝子発現効率に関係していることを意味している。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例２：プロモーターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソンおよび（または）イントロンの挿入
スプライシング率と翻訳率との釣合を保ち、またウイルスＲＮＡの全収率を増進させるために、以下の３種のベクターからなるＭＯＮ由来のレトロウイルスベクターを構築した：
【００４２】
・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し；そしてＭＬＶスプライスアクセプターをＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２（開始コドンの直前に末端をもつ）を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮ１．２ベクター、
【００４３】
・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し；そしてＭＬＶスプライスアクセプターをＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮ２ベクター、および
【００４４】
・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し；そしてＭＬＶスプライスアクセプターをマウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮＳＡ１ベクター。
これらのベクターを構築する詳しい方法を以下に記載する（図３ａ，図３ｂおよび図４ａ〜４ｃを参照）。
【００４５】
（２−１）ＳＮ−３ＬＴＲの構築
３種の変異体ベクターにおいて、ＳＶ４０プロモーターネオカセットを外来遺伝子のためのクローニング部位の下流位置に挿入する（図２を参照）。これらの変異体ベクターを構築するために、ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットを含むベクターを以下の如くして調製した（図３ａおよび３ｂを参照）。
【００４６】
ＳＶ４０プロモーターのコントロール下にネオ遺伝子を発現するベクターを調製するために、ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットをＰＲＣにより生成した。ＰＣＲにおいて、ｐＣ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を鋳型として使用し、また配列番号５（ＳＶ４０−５プライマー）および配列番号６（Ｎｅｏ−３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＲＣプライマーとして用いた。
【００４７】
ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットをｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）でサブクローニングした後、得られたベクターのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＭＯＮのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたベクターＭＳＮをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、そしてＳＶ４０プロモーター−ネオカセットおよび３′ＬＴＲを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳＮ−３ＬＴＲベクターを構築するようにｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと結合させた（図３ａを参照）。
【００４８】
（２−２）ｐＣＭ構築
５′ＬＴＲを強力な非相同性プロモーターで置換したレトロウイルスベクターを調製するためにＰＣＲを実施した。ＰＣＲでの鋳型として、ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）をフルレングスＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換したキメラＬＴＲを含むレトロウイルスベクターＭＣＣ−ＣＡＴ（韓国特許願第９７−４８０９５号）を使用した。ＰＣＲプライマーは配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号２（Ｒ５２３Ｂａｍプライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ生成物はキメラ５′ＬＴＲ〜＋５２３ｂｐのＤＮＡ配列を含有し、そしてｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングした。サブクローニングした配列のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＳＮ−３ＬＴＲベクター（実施例２−１で得られたもの）のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＣＭベクターを調製した（図３ｂを参照）。
【００４９】
ｐＣＭにおいて、レトロウイルスコード配列の全部が実施例１−１のΔＳＡベクターのとおりに欠失され、一方ΔＳＡベクターの５′ＬＴＲおよびＩＲＥＳ−ネオカセットはキメラＬＴＲおよびＳＶ４０プロモーター−ネオカセットでそれぞれ置換されていた。ｐＣＭベクターを実施例２−３〜２−５に示すようにＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１ベクターのための出発物質として使用した。
【００５０】
（２−３）ＤＯＮ１．２およびＤＯＮ１．２−ＣＡＴ構築
ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよびエキソン２（コドン開始まで）を含むＤＮＡフラグメントを得るために、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲでの鋳型は、ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターからエキソン５までのＤＮＡ配列を含有するｐＥＱ２７６ベクター（Biegalbe等，Virology, 183 : 381-385, 1991）であった。２種のＰＣＲプライマーが配列番号７（ＲＩ５プライマー、エキソン１でハイブリッド形成された）および配列番号８（ＣＭＶｅｘｏｎ２．３プライマー、エキソン２でハイブリッド形成された）にそれぞれ記載されていた。１−ｋｂ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅し、そしてＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２（開始コドン直前に末端を有する）を含有していた。
【００５１】
ＰＣＲ生成物をｐＺｅｒｏ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入してｐＺｅｒｏ１．２ベクターを調製した。次に、ｐＺｅｒｏ１．２のＥｃｏＲＩフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。実施例２−２で得られたｐＣＭベクターをＢａｍＨＩ酵素で消化し、そしてクレノウ酵素で処理した。平滑末端を有する２種のＤＮＡフラグメントを結合させてＤＯＮ１．２ベクターを構築した。さらに、ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ１．２のクレノウ処理ＨｉｎｄIIIフラグメントに挿入することにより、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴベクターを構築した。
【００５２】
（２−４）ＤＯＮ２およびＤＯＮ２−ＣＡＴ構築
実施例２−３のｐＺｅｒｏ１．２のＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを調製した。このものはイントロンＡの１１２−ｂｐ３′領域およびエキソン２の５′領域（＋８３７〜＋９６４，開始コドン直前）を含有していた。次に、このＤＮＡフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。一方で、実施例２−２で得られたｐＣＭベクターをＢａｍＨＩ酵素で消化し、そしてクレノウ酵素で処置した。平滑末端を有する上述の２種のＤＮＡフラグメントを結合させてＤＯＮ２ベクターを構築した。さらには、ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ２のクレノウ処理ＨｉｎｄIIIフラグメントに挿入することにより、ＤＯＮ２−ＣＡＴベクターを構築した（図４ｂを参照）。
【００５３】
（２−５）ＤＯＮＳＡ１およびＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴ構築
マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを調製するために、一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。これらはそれぞれ配列番号９（ＳＡトップオリゴマー）および配列番号１０（ＳＡボトムオリゴマー）によって表わされた。２種のオリゴマーのアニーリング反応により付着末端を有するスプライスアクセプターが生成した。ｐＧＥＭ４−ＳＡベクターはフラグメントをｐＧＥＭ４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ部位に挿入することによって調製した（図４ｃを参照）。
【００５４】
ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１を増幅するために、ＰＣＲを実施した。ここでは、実施例２−３のｐＥＱ２７６ベクターを鋳型として使用し、またそれぞれ配列番号７（ＲＩ５プライマー）および配列番号１１（エキソン１３プライマー）により表わされた２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
【００５５】
増幅したエキソン１フラグメントをｐＺｅｒｏ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＺｅｒｏ−エキソン１ベクターを生成させた。次に、ｐＺｅｒｏ−エキソン１のＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＭ４−ＳＡのＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングしてｐＧＥＭ−ＳＡ−エキソン１ベクターを調製した。
【００５６】
ｐＧＥＭ４−ＳＡ−エキソン１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクレノウで処理して平滑末端とし、次にｐＣＭのクレノウ処理ＢａｍＨＩフラグメント（実施例２−２で得られたもの）と結合させて、ＤＯＮＳＡ１ベクターを構築した。
【００５７】
さらには、ＤＯＮＳＡ１のＨｐａＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することにより、ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴベクターを構築した（図４ｃを参照）。
【００５８】
（２−６）ＣＡＴアッセイ
ＤＯＮ１．２−ＣＡＴ、ＤＯＮ２−ＣＡＴ、ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴおよびＬ−ＣＡＴ−ＳＮベクターをパッケージング系ＦｌｙＡ１３（Cosset等，J. Virol., 69 : 7430-7436, 1995）にトランスフェクションした。トランスフェクションした系を４８時間培養した後、細胞を含まないウイルス上澄液を調製してＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入した。形質導入した系を４８時間培養した。トランスフェクションまたは形質導入した系でのＣＡＴ活性を実施例１−３の方法に従って測定し、これにより相対遺伝子発現レベルを分析した。
【００５９】
表２に示すように、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴまたはＤＯＮ２−ＣＡＴでトランスフェクションされたＦｌｙＡ１３系でコントロール系（Ｌ−ＣＡＴ−ＳＮでトランスフェクションされた）より著しくより高いレベルのＣＡＴ活性が観察された。さらに、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴまたはＤＯＮ２−ＣＡＴベクターで安定に形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞はコントロール系よりも５−乃至１０−倍高いＣＡＴ活性を示した。ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系の場合、コントロールよりも少し高いＣＡＴ活性が観察された。これらの結果は、スプライシングに関連する非相同性非コード領域を発現ベクター中の外来遺伝子の上流位置に挿入すると、スプライシング効率および遺伝子発現効率が上昇し得ることを示唆していた。
【００６０】
ＤＯＮおよびＤＯＮＳＡ１ベクターで形質転換された大腸菌菌株をそれぞれＴＯＰ１０−ＤＯＮ２およびＴＯＰ１０−ＤＯＮＳＡ１と称した。これらは１９９８年６月５日付けで韓国微生物カルチャーセンター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に寄託されていた（それぞれ受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２８およびＫＣＣＭ−１０１２７）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
実施例３：ヒト遺伝子のイントロンおよび（または）エキソンの挿入
この実施例では、ＭＩＮ−由来レトロウイルスベクター、ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩ、ＭＩＮ−ＧＩおよびＭＩＮ−２を構築し、その結果外来遺伝子の転写、スプライシングおよび翻訳の率が真核細胞で釣合がとれるようになった。ウイルス配列はＭＩＮベクターおよびΔＳＡベクターに全く含まれていないが、ＭＩＮはＳＶプロモーター−ネオカセットの代わりにＩＲＥＳ−ネオカセットを含有している（図５参照）。上述した４種のベクターの特徴は以下に述べるとおりである：
【００６３】
・ヒトβ−アクチン遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＡＩベクター中外来遺伝子の上流位置に挿入した。
【００６４】
・ヒトＥＦ１α遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＥＩベクター中外来遺伝子の上流位置に挿入した。
【００６５】
・ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＧＩベクター中外来遺伝子の上流位置に挿入した。
【００６６】
これらの構築体以外に、非相同性ウイルス配列を挿入したベクターを調製した。特に、ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターのクローニング部位の上流位置に挿入したＭＩＮ−２ベクターを調製した。
【００６７】
ＭＩＮおよびＭＩＮ由来ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩ、ＭＩＮ−ＧＩおよびＭＩＮ−２ベクターを以下の如くして構築した。
（３−１）ＭＩＮの構築
ＭＬＶ３′ＬＴＲ領域を得るために、ＰＣＲを実施し、ここではｐＭＬＶ（Shinneck等、Nature，293 : 543-548, 1981）を鋳型として使用し、また配列番号１２（３ＬＴＲ５プライマー）および配列番号１３（３ＬＴＲ３プライマー）で表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＰＲＣ生成物は３′非翻訳領域、ポリプリントラックおよびＭＬＶゲノムの３′ＬＴＲを含有していた。ｐＣＲIIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングしたＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で消化し、そして得られたフラグメントをｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した（図６を参照）。
【００６８】
一方、レトロウイルス５′ＬＴＲおよびスプライスドナーを含む非コード配列を得るために、ＰＣＲを実施し、ここではｐＭＬＶを鋳型として使用し、そして配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号１４（５ＬＴＲ３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＰＣＲ生成物はＭＬＶゲノムの５′ＬＴＲから＋６２３ｂｐまで（ｇａｇコード配列の直前）のヌクレオチドを含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングした後、ベクターのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをｐ３ＬＴＲのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐ５３ＬＴＲベクターを調製した（図６を参照）。
【００６９】
最後に、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化によりｐＣＢＩＮ（韓国特許願第９７−４８０９５号）からＩＲＥＳ／ネオカセットを単離し、次にｐ５３ＬＴＲベクターのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入してＭＩＮベクターを構築した（図６を参照）。
ＭＩＮ−ＣＡＴベクターを、ＭＩＮベクターの発現効率を分析するために、ＭＩＮベクターのＢａｍＨＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することによっても構築した。
【００７０】
（３−２）ＭＩＮ−ＡＩの構築
ＭＩＮベクターに挿入されるヒトヌクレオチド配列を調製するために、ゲノムＤＮＡをヒトの細胞から抽出した。まず、フィコール−パキュー勾配遠心分離により、ヒトの血液から末梢血液単核細胞を分離した。一度または二度洗浄し、再び採集した後、細胞をＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．７％ＳＤＳ）で溶解した。細胞溶解物にプロティナーゼＫ（４００μｇ／ｍｌ）を加え、そして溶解物を５０−５５℃で１−２時間インキュベートし、次にフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【００７１】
単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用し、ここでヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター、エキソン１、イントロンおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲプライマーは配列番号１５（β−アクチン５プライマー）および配列番号１６（β−アクチン３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、そして次にベクターのＭｌｕＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＣ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入してｐβアクチンを調製した。
【００７２】
ｐβアクチンのクレノウ処理ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヒトβ−アクチン遺伝子の＋７１７〜＋８４９に相当）をＭＩＮベクターのＴ４−ポリメラーゼ処理ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ａを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−ＡＩと称した。
さらに、ＭＩＮ−ＡＩの発現効率を分析するためにＭＩ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することにより、ＭＩＮ−ＡＩＣＡＴベクターを構築した。
【００７３】
（３−３）ＭＩＮ−ＥＩの構築
ヒトＥＦ１α遺伝子の非コード配列を得るために、ゲノムＰＣＲを実施した。実施例３−２で単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用し、また配列番号１７（ＥＦ１α５プライマー）および配列番号１８（ＥＦ１α３プライマー）で表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物はヒトＥＦ１α遺伝子のプロモーター、エキソン１、イントロンおよび部分エキソン２を含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、次にベクターのＭｌｕＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＣ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入してｐＥＦ１αを調製した。
【００７４】
ｐＥＦ１αのクレノウ処理ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヒトＥＦ１α遺伝子の＋７７２〜＋１００８に相当）をＭＩＮベクターのＴ４−ポリメラーゼ処理ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ｂを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−ＥＩと称した。
【００７５】
さらに、ＭＩＮ−ＥＩベクターの発現効率を分析するために、（ＡＴカセットをＭＩＮ−ＥＩベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴベクターを構築した。ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０に導入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ形質転換細胞をＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）と称し、そして１９９９年６月２日付けで韓国微生物カルチャーセンターに寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６３）。
【００７６】
（３−４）ＭＩＮ−ＧＩの構築
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の非コード配列を得るために、ゲノムＰＣＲを実施した。実施例３−２で単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲでの鋳型として使用し、また配列番号１９（Ｇｉｎｔ５プライマー）および配列番号２０（Ｇｉｎｔ３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物は、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の＋１８５〜＋３１７に相当するヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン２を含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、次にベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭＩＮベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたベクターをＭＩＮ−ＧＩと称した（図７ｃを参照）。
【００７７】
さらに、ＭＩＮ−ＧＩベクターの発現効率を分析するために、（ＡＴ遺伝子とＭＩＮ−ＧＩベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−ＧＩＣＡＴベクターを構築した。
【００７８】
（３−５）ＭＩＮ−２の構築
ＤＯＮ２のＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ＨＣＭＶ ｉｅｌ遺伝子の＋８３７〜＋９６４に相当）を調製し、これはＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有していた。このＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭＩＮベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ｄを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−２と称した。
【００７９】
さらに、ＭＩＮ−２ベクターの発現効率を分析するために、ＣＡＴ遺伝子をＭＩＮ−２のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−２ＣＡＴベクターを構築した。ＭＩＮ−２ＣＡＴを大腸菌菌株Ｔｏｐ１０に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換細胞をＭＩＮ−２ＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）と称し、そして１９９９年６月２日付けで韓国微生物カルチャーセンターに寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６４）。
【００８０】
（３−６）ＣＡＴアッセイ
上述の４種のベクターの外来遺伝子発現効率およびパッケージング能力を検討するために、ベクターをＣＡＴアッセイに付し、ここではＣＡＴ挿入形態の周知のレトロウイルスベクター、ＭＦＧおよびＬＸＳＮ、をコントロールベクターとして使用した（Miller等、Biotechniques, 7 : 980-990, 1981 ; Ohashi等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 11332-11336, 1992）。パッケージング系Phoenix(KinsellaおよびNolan, Hum. Gene. Ther. 7 : 1405-1413）をこれらのベクターでトランスフェクションし、次に４８時間培養した。一方、培養した培地を０．４５μｍフィルターで濾過することによって得られた細胞を含まないウイルス上澄液をＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）を形質導入するのに用いた。ＣＡＴ活性のレベルを形質導入後２日にタンパク質抽出液を用いて測定した。ＣＡＴ活性を各ベクターでトランスフェクションまたは形質導入した細胞系（表３での「一過性トランスフェクション」および「形質導入、一過性」の欄を参照）、および抗生物質耐性細胞集団（表３での「形質導入、安定」の欄を参照）で測定した。さらに、ＣＡＴ活性を４週間継代培養した安定な細胞集団で測定した（表３での「形質導入安定（４週間）」の欄を参照）。トランスフェクションした細胞系での遺伝子発現レベルおよびウイルス力価を各ベクターでトランスフェクションまたは形質導入した系で測定したＣＡＴ活性から測定した。
【００８１】
表３に示すように、全てのレトロウイルスベクターは、ＬＸＳＮベクターを除いて、ＭＩＮベクターよりも高いＣＡＴ活性を示した。しかし、ＣＡＴ活性は挿入された非相同性配列に基づいて変化した。特に、ＭＩＮ−ＥＩおよびＭＩＮ−２は著しく高いレベルの遺伝子発現を生じた。ＭＩＮ−ＥＩまたはＭＩＮ−２で安定に形質導入された細胞は４週間継代培養した後でも一層高い遺伝子発現レベルを生じたことは極めて注目すべきことであった。
【００８２】
【表３】
【００８３】
【発明の効果】
前文に開示し、実証した如く、本発明は遺伝子療法等に多くの利点を有するレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは以下のような効果を有している：
【００８４】
１．レトロウイルスコード配列（ｇａｇ．ｅｎｖおよびｐｏｌ配列）が全て欠失しているので、相同性組換えにより複製能力をもつレトロウイルスが生じる可能性を完全に排除することができる。
【００８５】
２．非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード領域が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されているので、ベクター中の外来遺伝子を安定して、効率よく発現させることができる。
【００８６】
３．５′ＬＴＲ中のＵ３領域が特にヒト細胞で転写を強く誘起する非相同性プロモーターで置換されているので、ベクターでトランスフェクションされたヒト細胞由来のパッケージング系は一層高いレベルのＲＮＡを生成し、それでウイルス力価の増大を示している。
【００８７】
４．ＩＲＥＳまたは非相同性プロモーターを用いてベクター中で２種またはそれ以上の外来遺伝子を同時に発現させる。この場合、最小プロモーターを、非相同性内部プロモーターの干渉を減少させ、そして外来遺伝子を一層大きなサイズでクローニングするために、挿入非相同性プロモーターとして使用することができる。
【００８８】
上記の記載で開示した概念および特定の態様を本発明の同一の目的を実施するためのその他の態様を変形または設計するための基礎として容易に利用し得ることは当業者に明白である。このような均等の態様は付属の請求の範囲に記載の発明の精神および範囲を逸脱するものではないことも当業者に明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐｏｌコード領域をＭＯＮベクターから欠失させてΔＳＡベクターを構築し、次にＣＡＴ遺伝子をΔＳＡベクターに挿入してΔＳＡ−ＣＡＴベクターを生成する手順を示す図。
【図２】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のイントロンおよび（または）エキソンを含有するレトロウイルスベクターの構造を図式で示す図。
【図３ａ】 ＳＶ４０最小プロモーター−ネオカセットでＩＲＥＳ−ネオカセットを置換してＭＳＮベクターを得て、次にＳＮ−３ＬＴＲベクターがＳＶ４０最小プロモーターおよびＭＬＶ３′ＬＴＲを含むフラグメントをｐＵＣ１８に挿入することにより構築される手順を示す図。
【図３ｂ】 ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターを含有するキメラＬＴＲをＳＮ−３ＬＴＲベクターに挿入する手順を示す図。
【図４ａ】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮ１．２ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ１．２に挿入してＤＯＮ１．２−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。
【図４ｂ】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮ２ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ２に挿入してＤＯＮ２−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。
【図４ｃ】 マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１をｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮＳＡ１ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮＳＡ１に挿入してＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。
【図５】 ヒト遺伝子のイントロンおよびエキソンを含有するレトロウイルスベクターの構造を図式で示す図。
【図６】 ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲを含有するＤＮＡフラグメントを調製し、そしてｐＵＣ１８に挿入してｐ５３ＬＴＲベクターとし、次にｐＣＢＩＮから単離したＩＲＥＳ−ネオカセットをｐ５３ＬＴＲに挿入することによりＭＩＮベクターを構築する手順を示す図。
【図７ａ】 ヒトβ−アクチン遺伝子含有ゲノムＰＣＲ生成物が得られ、次にヒトＥＦ１α遺伝子の部分イントロン１、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターに挿入する手順を示す図。
【図７ｂ】 ヒトＥＦ１α遺伝子を含有するゲノムＰＣＲ生成物が得られ、次にヒトＥＦ１α遺伝子の部分イントロン１、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターに挿入するＭＩＮ−ＥＩ構築の手順を示す図。
【図７ｃ】 ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロン１、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントがゲノムＰＣＲによって得られ、次にＭＩＮベクターに挿入されるＭＩＮ−ＧＩ構築の手順を示す図。
【図７ｄ】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡ、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントがＭＩＮベクターに挿入されるＭＩＮ−２構築の手順を示す図。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子治療のための改善されたレトロウイルスベクターに関する。詳しくは、本発明はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌコード塩基配列を完全に欠失しているＭＬＶベースのレトロウイルスベクターに関する。本発明は、安全で且つ有効なレトロウイルス発現ベクターに関し、この発現ベクターでは、レトロウイルス遺伝子、すなわちｇａｇ．ｅｎｖおよびｐｏｌの全てが完全に欠失していて；非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード塩基配列が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され；非相同性内部プロモーターまたは内部リボソームエントリー部位（以下「ＩＲＥＳ」と称する）がクローニング部位の下流位置に挿入され；そして５’ＬＴＲ（ロングタームリピート）または強力な非相同性プロモーターのフルレングスＵ３配列が外来遺伝子の発現を調節する。
【０００２】
【発明の背景・従来の技術】
レトロウイルスベクターはその他のベクターよりもさらに頻繁に遺伝子療法に使用されていて、世界的に承認された臨床プロトコールの５０％を超えて使用されている（Wiley-Journal of Gene Medicine Website ; http://www.wiley, co.uk/genetherapy）。マウス白血病ウイルス（以下「ＭＬＶ」と称する）ベースのベクターが主に使用されているが、臨床上の使用においてレトロウイルスベクターにはなお多くの問題がある。最も重大な問題はそれらの安全性であり、レトロウイルスベクターはウイルスベクターの一種であり、そのために細胞中で複製受容能のあるレトロウイルス（以下「ＲＣＲ」と称する）に変換されることがある。結局、相同組換えによるＲＣＲ生成は重大な関心事であった。
【０００３】
全ての利用可能なレトロウイルスベクターは顕著に長いウイルスコード配列を含有している。これらの配列はパッケージングされたベクターが放出されるパッケージングされた細胞のゲノム中にも存在しているので、パッケージングされたゲノム中の同一ヌクレオチド配列とベクターとの間に相同組換えが生じてＲＣＲの生成が結果として生じ得ることが提案されていて、このことはMiller等(Miller等、Human Gene Ther., 1:5, 1990)によって報告されている。
【０００４】
ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターの二種類のタイプ、すなわちＬＮシリーズベクターおよびＭＦＧベクターが遺伝子療法に最も頻繁に使用されている(MillerおよびRoseman, Biotechnigues, 7: 980-990,1989 ; Dranoff等、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90 : 3539-3543,1993)。ＬＮシリーズベクター中の外来遺伝子の発現は非相同性内部プロモーターまたはＬＴＲによって調節されるが、ＭＦＧベクター中の転写レベルはＬＴＲのコントロール下にあり、そして外来遺伝子はゲノムＲＮＡまたはスプライシングされたサブゲノムＲＮＡの形態で発現される。しばしば第一世代レトロウイルスベクターと考えられているＬＮシリーズベクターは４２０−ｂｐ ｇａｇコード配列を含有している。この領域はウイルスパッケージングに重要な役割を果しているものと考えられているが、ある条件下ではｇａｇ領域はウイルスパッケージングおよび力価に対して顕著な効果を示すことなく欠失できることが開示されている(Kim等，J. Virol., 71 : 994-1004, 1998)。
【０００５】
ＬＮシリーズベクターと比較して、ＭＦＧベクターは遺伝子発現レベルをさらに安定化し、かつ高め、そしてヒト−またはマウス−由来細胞系の大部分でより高いウイルス力価を生じることが知られている(Byun等，Gene Ther., 3 : 780-788, 1996)。しかしながら、ＭＦＧベクターはさらに多くのウイルス配列、ｇａｇに対する４２０−ｂｐ．ｐｏｌに対する３７７−ｂｐ，およびｅｎｖに対する９９−ｂｐを含有し、ＬＮシリーズベクターよりも高い頻度でＲＣＲを生成する可能性が生じる。
【０００６】
通常のレトロウイルスベクターに関連するこれらの不利な点を克服するべく、本発明者等はレトロウイルスベクターを構築した（韓国特許出願第９７−４８０９５号）。このベクターは以下に述べるいくつかの特徴を有していた：
【０００７】
・クローニングされた遺伝子転写産物は有効にスプライシングされ、より高い発現レベルの遺伝子を生成した。
・ｇａｇおよびｅｎｖ配列はウイルス力価を失うことなく完全に欠失していた。
・ＩＲＥＳをベクターでの二種またはそれ以上の遺伝子の同時発現のために使用した。
・マルチクローニング部位をベクター中に挿入して外来遺伝子のクローニングを容易にした。
【０００８】
ｇａｇおよびｅｎｖ配列がレトロウイルスベクターから欠失していたため、ベクターの安全性がその他のレトロウイルスベクターと比較して増大した。しかし、このベクターはスプライスアクセプター配列を係留する３７７−ｂｐ ｐｏｌコード配列およびｅｎｖのための２８４−ｂｐリーダー（転写されるが、翻訳されない）を含むその下流配列をなお含有している。その理由はｐｏｌ配列の欠失は異常な、または非能率的なスプライシングをもたらすからである。ｐｏｌ配列のための３７７−ｂｐはまたパッケージングラインのゲノム中にも存在しているので、ＲＣＲ生成を生じる非相同性組換えの可能性がベクターになお残っている。
【０００９】
遺伝子発現の効率が上昇し、かつ安全性が増大した新規なレトロウイルスベクターを開発するために、本発明者等はいずれのウイルスコード配列をも含有していないレトロウイルスベクターを構築した。本発明は、ＭＬＶ由来ｐｏｌ遺伝子が完全に欠失し、パッケージング細胞系での非相同性組み換えによるＲＣＲ生成の可能性を排除し；非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード領域が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され、遺伝子発現の効率を最大とし；５′ＬＴＲまたはヒトサイトロメガロウイルス（以下「ＨＣＭＶ」と称する）主要前初期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＭＩＥＰ：ｉｅｌ遺伝子のプロモーター）を外来遺伝子発現調節のためのシス−エレメントとして使用され；そして非相同性内部プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に挿入され、二種またはそれ以上の外来遺伝子の同時発現が可能となるレトロウイルスベクターを構築することにより達成される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、より高いレベルで外来遺伝子が発現され、それ故に遺伝子療法に有効に使用し得る安全なレトロウイルスベクターを提供するにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上述した目的は容易に達成される。
本発明は、ＭＬＶ−コードｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌ配列が完全に欠失しているＭＬＶベースのレトロウイルスベクターを提供する。
【００１２】
一つの特徴によれば、本発明のＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは、外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されている非相同性イントロンおよび（または）非相同性スプライスアクセプターを含有し得る。
【００１３】
別の特徴によれば、本発明のＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは、外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同性非コード配列を含有し得る。
さらに他の特徴によれば、ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）を本発明のＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベクター中で非相同性プロモーターで置換することができる。
【００１４】
さらにその他の特徴によれば、本発明のＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベクターは外来遺伝子のためのクローニング部位の下流位置に非相同性プロモーターを含有することができる。
本発明によればまた本発明のＭＬＶ−ベースレトロウイルスで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）菌株が提供される。
本発明のこれ以上の特徴は以下に明らかとなる。
【００１５】
【発明の実施の態様】
本発明はＭＬＶベースのベクター、特にＭＯＮまたはＭＩＮから誘導される安全でかつ効率のよいレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターにおいて、レトロウイルス遺伝子（ｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌコード配列）は完全に欠失し；非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード配列が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され；強力な非相同性プロモーターが５′ＬＴＲに含有され；そして非相同性プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に配置されている。
【００１６】
特に、本発明のベクターにおいて、スプライスアクセプターを含むｐｏｌコード配列が完全に欠失しているので、通常のレトロウイルスベクターの不利な点とされている相同性組換えの可能性を排除することができる。
【００１７】
欠失ｐｏｌ配列は遺伝子発現レベルの低下をもたらす。低下した発現効率およびウイルス力価を回復するために、以下の如く様々なレトロウイルスベクターが本発明で提供される：
【００１８】
・本発明は、ｐｏｌコード配列の３′部分とオーバーラップしている欠失スプライスアクセプターを補完するために、非相同性イントロンおよび（または）スプライスアクセプターが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されているレトロウイルスベクターを提供する。既知のウイルスまたは細胞遺伝子のイントロンおよび（または）スプライスアクセプターはいずれもがこの目的に使用することができ、好ましくはＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子、延長因子１α（以下「ＥＦ１α」と称する）遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＡＰＤＨ」と称する）遺伝子、β−アクチン遺伝子等である。
【００１９】
・本発明はまた、非相同性非コード配列がクローニング部位の上流位置に挿入されているレトロウイルスベクターを提供する。非コード配列は、翻訳効率を増進するのに使用され、そしてイントロンおよび非翻訳エキソンを包含するタンパク質に翻訳されない転写ＤＮＡ配列と定義される。好ましくは、非コード配列はＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子、ＥＦ１α遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子からなる群から選択される。非相同性非コード配列の挿入により、外来遺伝子転写のスプライシングの効率化およびサブゲノムＲＮＡの有効な翻訳が可能となる。
【００２０】
・加えて、本発明は非相同性内部プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に係留されているレトロウイルスベクターを提供する。
【００２１】
・最後に、本発明は５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列または強力な非相同性プロモーターが含まれているレトロウイルスベクターを提供する。
本発明を以下に詳述する。
【００２２】
１．ｐｏｌコード配列の欠失：ΔＳＡ構築
安全性が改善されたレトロウイルスベクター、すなわち相同性組換え活性を有していないレトロウイルスベクターを開発するために、ＭＯＮベクター（韓国特許出願第９７−４８０９５号）からスプライシング受容体を包含するｐｏｌコード配列を欠失させ、欠失変異体ベクターΔＳＡを構築した。さらに、レポーター遺伝子として細菌性ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の挿入によりΔＳＡ−ＣＡＴベクターを構築した（図１参照）。次に、ΔＳＡ−ＣＡＴでトランスフェクションまたは形質導入した細胞系を調製し、そしてＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイにより、欠失変異体のウイルス力価は親ベクターＭＯＮ−ＣＡＴの力価と匹敵し得るが、遺伝子発現が低下したことが明らかになった（表１参照）。これらの結果は、スプライスアクセプターを含むｐｏｌ遺伝子がベクター中の外来遺伝子発現の調節に関連していることを提示している。
【００２３】
これらの結果から予想されるとおり、非相同性スプライスアクセプターおよび（または）イントロンが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入してｐｏｌ遺伝子に付随して欠失されるスプライシング部位を補完するようにすると、外来遺伝子の発現レベルが上昇する。しかし、スプライシングが余りに多く起こると、サブゲノムＲＮＡ対ゲノムＲＮＡの比が増加し、高レベルの遺伝子発現にもかかわらずウイルス力価の低下をもたらす。
【００２４】
従って、理想的なレトロウイルスベクターを構築するには、転写、スプライシングおよび翻訳の率がトランスフェクションまたは形質導入された細胞系で釣合がとれているようにベクターをデザインしなければならない。換言するに、外来遺伝子が豊富に転写され、そしてゲノムＲＮＡの量がサブゲノムＲＮＡの量と釣合がとれ、そのためにゲノムＲＮＡがウイルス粒子中にパッケージされるように十分に生成され、またサブゲノムＲＮＡが外来遺伝子にコードされている多くのタンパク質中に翻訳され得るようなベクターが好ましい。本発明では、ウイルスまたは細胞遺伝子から由来する様々な非コード配列が欠失変異体ベクターに挿入されているレトロウイルスベクターが提供され、それでこの挿入がウイルス力価および遺伝子発現レベルに効果を有するかどうかを検討する。
【００２５】
２．スプライシングおよび翻訳効率を増進する非相同性ＤＮＡ配列の挿入：
ＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１構築
スプライシング率および遺伝子発現率の釣合を保持し、またウイルスＲＮＡの全収率を上昇させるために、ＭＬＶ５′ＬＴＲのＵ３領域が強力なプロモーター、ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換され、そして非相同性非コード配列が挿入されたレトロウイルスベクターが構築された。
【００２６】
好ましい態様では、ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の非翻訳エキソンおよびイントロンがベクターのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同性非コード配列として使用されていた（図２参照）。ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソンおよび（または）イントロン配列は発現ベクターに挿入されると翻訳効率を増進することが知られている。
【００２７】
特に、ｐＣＭベクターは以下の如くして調製した：レトロウイルスコード配列の全てを欠失させ；５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し、ＭＬＶ誘導３′ＬＴＲを保持し；そして非相同性内部プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター−ネオカセットを用いた。次に、ｐＣＭベクターにＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび（または）エキソン２を挿入することによりＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１ベクターを構築した（図３ａ、図３ｂおよび図４ａ〜４ｃを参照）。
次に、ＣＡＴレポーター遺伝子の挿入により、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴ、ＤＯＮ２−ＣＡＴおよびＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴベクターを調製した。これらのベクターでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系をＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイの結果から、三種のベクターのいずれもがコントロールベクターＬ−ＣＡＴ−ＳＮよりも一層高いスプライシング効率および遺伝子発現を示すことが確認された（表２を参照）。
【００２８】
３．スプライシングおよび遺伝子発現を促進し得る細胞ＤＮＡ配列の挿入：ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩおよびＭＩＮ−ＧＩ構築
別の好ましい態様において、レトロウイルスベクターをさらに工夫して、スプライシング率と遺伝子発現率との釣合からウイルス力価および遺伝子発現双方の効率を一層高くするようにした。これらのベクターにおいて、ヒト遺伝子のエキソンおよび（または）イントロン配列をレトロウイルスベクター中の外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入した（図５を参照）。
【００２９】
これらのベクターを構築するために、ＭＩＮベクターを調製した。このベクターでは、レトロウイルスコード領域がすべて欠失され；ＭＬＶ−由来５′および３′ＬＴＲが保持され；そしてＥＭＣＶ ＩＲＥＳ−ネオカセットを非相同性内部プロモーターとして使用した。特に、ＭＩＮベクターを次の工程によって調製した：ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲ領域を含むＤＮＡフラグメントを増幅し、このフラグメントをｐＵＣ１８ベクターに挿入し、そして組換えベクターにＩＲＥＳ−ネオカセットを挿入する（図６を参照）。ヒトβ−アクチン、ＥＦ１αまたはＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターのクローニング部位の上流位置に挿入して、ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩまたはＭＩＮ−ＧＩベクターをそれぞれ構築した。（図７ａ〜７ｃ参照）。
【００３０】
スプライスアクセプターとして細胞遺伝子（例えば、ＭＩＮ−ＡＩ等）を用いるベクターをウイルス遺伝子（例えば、ＤＯＮ１．２等）を用いるベクターと比較するために、別のＭＬＶ−ベースのベクターＭＩＮ−２を調製した。具体的には、ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含むＤＮＡ配列をＭＩＮベクターに挿入する（図７ｄを参照）。この挿入断片はＤＯＮ２ベクターのそれと同一である。
【００３１】
次に、ＭＩＮ−ＣＡＴ、ＭＩＮ−ＡＩＣＡＴ、ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ、ＭＩＮ−ＧＩＣＡＴおよびＭＩＮ−２ＣＡＴベクターを相当するベクターにＣＡＴレポーター遺伝子を挿入することにより調製した。これらのベクターでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系をＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイの結果から、本発明の全てのベクターのウイルス力価はコントロールベクターＬＸＳＮおよびＭＦＧの力価と同じであり、一方ＭＩＮ−２およびＭＩＮ−ＥＩでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系での遺伝子発現はコントロールベクターを含む細胞系よりも一層高いことが明らかとなった（表３を参照）。
【００３２】
【実施例】
本発明の実際の、現在好ましい態様を以下の実施例に示す如く例示する。
しかし、当業者は、この記載を考慮して、本発明の精神および範囲内で変形および改良とすることができることが明らかである。
【００３３】
実施例１：ＭＯＮベクターからのｐｏｌ遺伝子の欠失
（１−１）ΔＳＡ構築
ｐｏｌコード配列を欠如している５′ＬＴＲ下流配列を調製するために、ＰＲＣ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ここでは、ＭＯＮベクター（韓国特許第９７−４８０９５号）を鋳型として使用し、また配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号２（Ｒ５２３Ｂａｍプライマー）によって表わされる２種の一本鎖合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＤＮＡフラグメントはＭＬＶ５′ＬＴＲ〜＋５２３ｂｐのヌクレオチド配列に相当した（図１を参照）。この場合、＋１はＭＬＶゲノムの転写開始部位を表わし、また＋２１２〜＋５２３ｂｐの配列はゲノムＲＮＡをパッケージするのに必要な非コード領域である。
【００３４】
ＰＣＲ生成物をＰＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ＣＡ．ＵＳＡ）にサブクローニングし、次に得られたベクターからＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。ＭＯＮベクターの部分ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＰＣＲ生成物のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントで置換してΔＳＡベクターを構築した。このΔＳＡベクターを、ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲ、およびスプライスアクセプター、ＩＲＥＳ−ネオカセットおよびポリプリントラックからなる非コード配列を含有するレトロウイルスベクターの基本バックボーンとして使用し、レトロウイルスコード配列は全て欠失している（図１を参照）。
【００３５】
（１−２）ΔＳＡ−ＣＡＴ構築
外来遺伝子発現およびレトロウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに対する上述の遺伝子操作の効果を検討するために、細菌ＣＡＴ遺伝子をレポーター遺伝子として使用した。
【００３６】
ＣＡＴ遺伝子をＰＣＲにより入手し、ここではｐＣＡＴ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を鋳型として使用し、また配列番号３（ＣＡＴＡＴＥＮプライマー）および配列番号４（ＣＡＴＳＴＯＰプライマー）によって表わされた２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物をｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入し、そしてＣＡＴ遺伝子を含む得られたベクターのＢａｍＨＩフラグメントをｐＣ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を導入して、ｐＣ３．１−ＣＡＴを調製した。ΔＳＡ−ＣＡＴベクターをΔＳＡベクターのＨｐａＩ部位にＣＡＴ遺伝子（Ｃ３．１−ＣＡＴのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）−処理ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント）を挿入することにより構築した（図１を参照）。
【００３７】
（１−３）ＣＡＴアッセイ
ΔＳＡ−ＣＡＴおよびコントロールベクター（ＭＯＮ−ＣＡＴ）を、Ｇａｇ−ＰｏｌおよびＥｎパッケージングベクターと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした（ＤｕＢｒｉｄｇｅ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３７９−３８７，１９８７）。トランスフェクションした細胞を４８時間培養した後、サイトソルタンパク質を抽出してＣＡＴ活性、すなわち、外来遺伝子発現レベルの指標を測定した。一方、培地を０．４５−μｍフィルターで濾過して得られた細胞を含まないウイルス上澄液を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）を形質導入した。ＣＡＴ活性のレベルは形質導入後４８時間のタンパク質抽出液を用いて測定した。
【００３８】
ＣＡＴアッセイは以下の如くして実施した：まず、細胞を収集し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１ｍｌで洗い、次に０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝剤に再懸濁した。細胞を凍結（ドライアイス中）−解凍（３７℃水浴中）サイクルを６回くり返して溶解した。得られた細胞抽出液を７分間６０℃に加熱してデアセチラーゼを不活性化した後、抽出液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上澄液をとり出した。抽出液中のタンパク質レベルをブラッドフォード法によって定量した。標準化した抽出液を14Ｃ−クロラムフェニコール（６０ｍＣｉ／ミリモル、０．１ｍＣｉ／ｍｌ）１μｌ、アセチル補酵素Ａ２μｌ（４０ｍＭ）および０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の適切な量と混合した。この反応混合物を適当な反応時間３７℃でインキュベートした。反応後、クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出し、そして減圧濃縮した。ペレットを酢酸エチル１５μｌに再懸濁し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートに充填した。ＴＬＣ展開溶剤（９５％クロロホルム：５％メタノール）を用いてＴＬＣを実施した後、ＴＬＣプレートを乾燥し、次にＸ線フィルムに曝すか、またはホスホイメージアナライザー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ）にかけ、その結果としてクロラムフェニコールのアセチル化レベルを測定した。試料中のＣＡＴ活性は、アセチル化クロラムフェニコール対全クロラムフェニコールの放射能比から算出することができた。
【００３９】
表１は、ΔＳＡ−ＣＡＴ欠如ｐｏｌ遺伝子でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞系でのＣＡＴ活性はＭＯＮ−ＣＡＴでトランスフェクションされたコントロール系よりも低いことを示している。これは、ｐｏｌコード配列が遺伝子発現の調節に関連していることを示唆している。加えて、形質導入された系でのＣＡＴ活性はトランスフェクションされた系と類似のパターンを示し、パッケージング効率は遺伝子発現効率に関係していることを意味している。
【００４０】
【表１】
実施例２：プロモーターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソンおよび（または）イントロンの挿入
スプライシング率と翻訳率との釣合を保ち、またウイルスＲＮＡの全収率を増進させるために、以下の３種のベクターからなるＭＯＮ由来のレトロウイルスベクターを構築した：
【００４２】
・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し；そしてＭＬＶスプライスアクセプターをＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２（開始コドンの直前に末端をもつ）を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮ１．２ベクター、
【００４３】
・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し；そしてＭＬＶスプライスアクセプターをＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮ２ベクター、および
【００４４】
・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換し；そしてＭＬＶスプライスアクセプターをマウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮＳＡ１ベクター。
これらのベクターを構築する詳しい方法を以下に記載する（図３ａ，図３ｂおよび図４ａ〜４ｃを参照）。
【００４５】
（２−１）ＳＮ−３ＬＴＲの構築
３種の変異体ベクターにおいて、ＳＶ４０プロモーターネオカセットを外来遺伝子のためのクローニング部位の下流位置に挿入する（図２を参照）。これらの変異体ベクターを構築するために、ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットを含むベクターを以下の如くして調製した（図３ａおよび３ｂを参照）。
【００４６】
ＳＶ４０プロモーターのコントロール下にネオ遺伝子を発現するベクターを調製するために、ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットをＰＲＣにより生成した。ＰＣＲにおいて、ｐＣ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を鋳型として使用し、また配列番号５（ＳＶ４０−５プライマー）および配列番号６（Ｎｅｏ−３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＲＣプライマーとして用いた。
【００４７】
ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットをｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）でサブクローニングした後、得られたベクターのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＭＯＮのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたベクターＭＳＮをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、そしてＳＶ４０プロモーター−ネオカセットおよび３′ＬＴＲを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳＮ−３ＬＴＲベクターを構築するようにｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと結合させた（図３ａを参照）。
【００４８】
（２−２）ｐＣＭ構築
５′ＬＴＲを強力な非相同性プロモーターで置換したレトロウイルスベクターを調製するためにＰＣＲを実施した。ＰＣＲでの鋳型として、ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）をフルレングスＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換したキメラＬＴＲを含むレトロウイルスベクターＭＣＣ−ＣＡＴ（韓国特許願第９７−４８０９５号）を使用した。ＰＣＲプライマーは配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号２（Ｒ５２３Ｂａｍプライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ生成物はキメラ５′ＬＴＲ〜＋５２３ｂｐのＤＮＡ配列を含有し、そしてｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングした。サブクローニングした配列のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＳＮ−３ＬＴＲベクター（実施例２−１で得られたもの）のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＣＭベクターを調製した（図３ｂを参照）。
【００４９】
ｐＣＭにおいて、レトロウイルスコード配列の全部が実施例１−１のΔＳＡベクターのとおりに欠失され、一方ΔＳＡベクターの５′ＬＴＲおよびＩＲＥＳ−ネオカセットはキメラＬＴＲおよびＳＶ４０プロモーター−ネオカセットでそれぞれ置換されていた。ｐＣＭベクターを実施例２−３〜２−５に示すようにＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１ベクターのための出発物質として使用した。
【００５０】
（２−３）ＤＯＮ１．２およびＤＯＮ１．２−ＣＡＴ構築
ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよびエキソン２（コドン開始まで）を含むＤＮＡフラグメントを得るために、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲでの鋳型は、ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターからエキソン５までのＤＮＡ配列を含有するｐＥＱ２７６ベクター（Biegalbe等，Virology, 183 : 381-385, 1991）であった。２種のＰＣＲプライマーが配列番号７（ＲＩ５プライマー、エキソン１でハイブリッド形成された）および配列番号８（ＣＭＶｅｘｏｎ２．３プライマー、エキソン２でハイブリッド形成された）にそれぞれ記載されていた。１−ｋｂ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅し、そしてＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２（開始コドン直前に末端を有する）を含有していた。
【００５１】
ＰＣＲ生成物をｐＺｅｒｏ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入してｐＺｅｒｏ１．２ベクターを調製した。次に、ｐＺｅｒｏ１．２のＥｃｏＲＩフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。実施例２−２で得られたｐＣＭベクターをＢａｍＨＩ酵素で消化し、そしてクレノウ酵素で処理した。平滑末端を有する２種のＤＮＡフラグメントを結合させてＤＯＮ１．２ベクターを構築した。さらに、ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ１．２のクレノウ処理ＨｉｎｄIIIフラグメントに挿入することにより、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴベクターを構築した。
【００５２】
（２−４）ＤＯＮ２およびＤＯＮ２−ＣＡＴ構築
実施例２−３のｐＺｅｒｏ１．２のＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを調製した。このものはイントロンＡの１１２−ｂｐ３′領域およびエキソン２の５′領域（＋８３７〜＋９６４，開始コドン直前）を含有していた。次に、このＤＮＡフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。一方で、実施例２−２で得られたｐＣＭベクターをＢａｍＨＩ酵素で消化し、そしてクレノウ酵素で処置した。平滑末端を有する上述の２種のＤＮＡフラグメントを結合させてＤＯＮ２ベクターを構築した。さらには、ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ２のクレノウ処理ＨｉｎｄIIIフラグメントに挿入することにより、ＤＯＮ２−ＣＡＴベクターを構築した（図４ｂを参照）。
【００５３】
（２−５）ＤＯＮＳＡ１およびＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴ構築
マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを調製するために、一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。これらはそれぞれ配列番号９（ＳＡトップオリゴマー）および配列番号１０（ＳＡボトムオリゴマー）によって表わされた。２種のオリゴマーのアニーリング反応により付着末端を有するスプライスアクセプターが生成した。ｐＧＥＭ４−ＳＡベクターはフラグメントをｐＧＥＭ４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ部位に挿入することによって調製した（図４ｃを参照）。
【００５４】
ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１を増幅するために、ＰＣＲを実施した。ここでは、実施例２−３のｐＥＱ２７６ベクターを鋳型として使用し、またそれぞれ配列番号７（ＲＩ５プライマー）および配列番号１１（エキソン１３プライマー）により表わされた２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
【００５５】
増幅したエキソン１フラグメントをｐＺｅｒｏ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＺｅｒｏ−エキソン１ベクターを生成させた。次に、ｐＺｅｒｏ−エキソン１のＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＭ４−ＳＡのＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングしてｐＧＥＭ−ＳＡ−エキソン１ベクターを調製した。
【００５６】
ｐＧＥＭ４−ＳＡ−エキソン１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクレノウで処理して平滑末端とし、次にｐＣＭのクレノウ処理ＢａｍＨＩフラグメント（実施例２−２で得られたもの）と結合させて、ＤＯＮＳＡ１ベクターを構築した。
【００５７】
さらには、ＤＯＮＳＡ１のＨｐａＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することにより、ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴベクターを構築した（図４ｃを参照）。
【００５８】
（２−６）ＣＡＴアッセイ
ＤＯＮ１．２−ＣＡＴ、ＤＯＮ２−ＣＡＴ、ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴおよびＬ−ＣＡＴ−ＳＮベクターをパッケージング系ＦｌｙＡ１３（Cosset等，J. Virol., 69 : 7430-7436, 1995）にトランスフェクションした。トランスフェクションした系を４８時間培養した後、細胞を含まないウイルス上澄液を調製してＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入した。形質導入した系を４８時間培養した。トランスフェクションまたは形質導入した系でのＣＡＴ活性を実施例１−３の方法に従って測定し、これにより相対遺伝子発現レベルを分析した。
【００５９】
表２に示すように、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴまたはＤＯＮ２−ＣＡＴでトランスフェクションされたＦｌｙＡ１３系でコントロール系（Ｌ−ＣＡＴ−ＳＮでトランスフェクションされた）より著しくより高いレベルのＣＡＴ活性が観察された。さらに、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴまたはＤＯＮ２−ＣＡＴベクターで安定に形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞はコントロール系よりも５−乃至１０−倍高いＣＡＴ活性を示した。ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴでトランスフェクションまたは形質導入された細胞系の場合、コントロールよりも少し高いＣＡＴ活性が観察された。これらの結果は、スプライシングに関連する非相同性非コード領域を発現ベクター中の外来遺伝子の上流位置に挿入すると、スプライシング効率および遺伝子発現効率が上昇し得ることを示唆していた。
【００６０】
ＤＯＮおよびＤＯＮＳＡ１ベクターで形質転換された大腸菌菌株をそれぞれＴＯＰ１０−ＤＯＮ２およびＴＯＰ１０−ＤＯＮＳＡ１と称した。これらは１９９８年６月５日付けで韓国微生物カルチャーセンター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に寄託されていた（それぞれ受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２８およびＫＣＣＭ−１０１２７）。
【００６１】
【表２】
実施例３：ヒト遺伝子のイントロンおよび（または）エキソンの挿入
この実施例では、ＭＩＮ−由来レトロウイルスベクター、ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩ、ＭＩＮ−ＧＩおよびＭＩＮ−２を構築し、その結果外来遺伝子の転写、スプライシングおよび翻訳の率が真核細胞で釣合がとれるようになった。ウイルス配列はＭＩＮベクターおよびΔＳＡベクターに全く含まれていないが、ＭＩＮはＳＶプロモーター−ネオカセットの代わりにＩＲＥＳ−ネオカセットを含有している（図５参照）。上述した４種のベクターの特徴は以下に述べるとおりである：
【００６３】
・ヒトβ−アクチン遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＡＩベクター中外来遺伝子の上流位置に挿入した。
【００６４】
・ヒトＥＦ１α遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＥＩベクター中外来遺伝子の上流位置に挿入した。
【００６５】
・ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＧＩベクター中外来遺伝子の上流位置に挿入した。
【００６６】
これらの構築体以外に、非相同性ウイルス配列を挿入したベクターを調製した。特に、ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターのクローニング部位の上流位置に挿入したＭＩＮ−２ベクターを調製した。
【００６７】
ＭＩＮおよびＭＩＮ由来ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩ、ＭＩＮ−ＧＩおよびＭＩＮ−２ベクターを以下の如くして構築した。
（３−１）ＭＩＮの構築
ＭＬＶ３′ＬＴＲ領域を得るために、ＰＣＲを実施し、ここではｐＭＬＶ（Shinneck等、Nature，293 : 543-548, 1981）を鋳型として使用し、また配列番号１２（３ＬＴＲ５プライマー）および配列番号１３（３ＬＴＲ３プライマー）で表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＰＲＣ生成物は３′非翻訳領域、ポリプリントラックおよびＭＬＶゲノムの３′ＬＴＲを含有していた。ｐＣＲIIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングしたＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で消化し、そして得られたフラグメントをｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した（図６を参照）。
【００６８】
一方、レトロウイルス５′ＬＴＲおよびスプライスドナーを含む非コード配列を得るために、ＰＣＲを実施し、ここではｐＭＬＶを鋳型として使用し、そして配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号１４（５ＬＴＲ３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＰＣＲ生成物はＭＬＶゲノムの５′ＬＴＲから＋６２３ｂｐまで（ｇａｇコード配列の直前）のヌクレオチドを含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングした後、ベクターのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをｐ３ＬＴＲのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐ５３ＬＴＲベクターを調製した（図６を参照）。
【００６９】
最後に、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化によりｐＣＢＩＮ（韓国特許願第９７−４８０９５号）からＩＲＥＳ／ネオカセットを単離し、次にｐ５３ＬＴＲベクターのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入してＭＩＮベクターを構築した（図６を参照）。
ＭＩＮ−ＣＡＴベクターを、ＭＩＮベクターの発現効率を分析するために、ＭＩＮベクターのＢａｍＨＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することによっても構築した。
【００７０】
（３−２）ＭＩＮ−ＡＩの構築
ＭＩＮベクターに挿入されるヒトヌクレオチド配列を調製するために、ゲノムＤＮＡをヒトの細胞から抽出した。まず、フィコール−パキュー勾配遠心分離により、ヒトの血液から末梢血液単核細胞を分離した。一度または二度洗浄し、再び採集した後、細胞をＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．７％ＳＤＳ）で溶解した。細胞溶解物にプロティナーゼＫ（４００μｇ／ｍｌ）を加え、そして溶解物を５０−５５℃で１−２時間インキュベートし、次にフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【００７１】
単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用し、ここでヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター、エキソン１、イントロンおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲプライマーは配列番号１５（β−アクチン５プライマー）および配列番号１６（β−アクチン３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、そして次にベクターのＭｌｕＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＣ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入してｐβアクチンを調製した。
【００７２】
ｐβアクチンのクレノウ処理ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヒトβ−アクチン遺伝子の＋７１７〜＋８４９に相当）をＭＩＮベクターのＴ４−ポリメラーゼ処理ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ａを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−ＡＩと称した。
さらに、ＭＩＮ−ＡＩの発現効率を分析するためにＭＩ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することにより、ＭＩＮ−ＡＩＣＡＴベクターを構築した。
【００７３】
（３−３）ＭＩＮ−ＥＩの構築
ヒトＥＦ１α遺伝子の非コード配列を得るために、ゲノムＰＣＲを実施した。実施例３−２で単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用し、また配列番号１７（ＥＦ１α５プライマー）および配列番号１８（ＥＦ１α３プライマー）で表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物はヒトＥＦ１α遺伝子のプロモーター、エキソン１、イントロンおよび部分エキソン２を含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、次にベクターのＭｌｕＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＣ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入してｐＥＦ１αを調製した。
【００７４】
ｐＥＦ１αのクレノウ処理ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヒトＥＦ１α遺伝子の＋７７２〜＋１００８に相当）をＭＩＮベクターのＴ４−ポリメラーゼ処理ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ｂを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−ＥＩと称した。
【００７５】
さらに、ＭＩＮ−ＥＩベクターの発現効率を分析するために、（ＡＴカセットをＭＩＮ−ＥＩベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴベクターを構築した。ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０に導入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ形質転換細胞をＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）と称し、そして１９９９年６月２日付けで韓国微生物カルチャーセンターに寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６３）。
【００７６】
（３−４）ＭＩＮ−ＧＩの構築
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の非コード配列を得るために、ゲノムＰＣＲを実施した。実施例３−２で単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲでの鋳型として使用し、また配列番号１９（Ｇｉｎｔ５プライマー）および配列番号２０（Ｇｉｎｔ３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物は、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の＋１８５〜＋３１７に相当するヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン２を含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、次にベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭＩＮベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたベクターをＭＩＮ−ＧＩと称した（図７ｃを参照）。
【００７７】
さらに、ＭＩＮ−ＧＩベクターの発現効率を分析するために、（ＡＴ遺伝子とＭＩＮ−ＧＩベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−ＧＩＣＡＴベクターを構築した。
【００７８】
（３−５）ＭＩＮ−２の構築
ＤＯＮ２のＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ＨＣＭＶ ｉｅｌ遺伝子の＋８３７〜＋９６４に相当）を調製し、これはＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のイントロン、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有していた。このＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭＩＮベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ｄを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−２と称した。
【００７９】
さらに、ＭＩＮ−２ベクターの発現効率を分析するために、ＣＡＴ遺伝子をＭＩＮ−２のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−２ＣＡＴベクターを構築した。ＭＩＮ−２ＣＡＴを大腸菌菌株Ｔｏｐ１０に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換細胞をＭＩＮ−２ＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）と称し、そして１９９９年６月２日付けで韓国微生物カルチャーセンターに寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６４）。
【００８０】
（３−６）ＣＡＴアッセイ
上述の４種のベクターの外来遺伝子発現効率およびパッケージング能力を検討するために、ベクターをＣＡＴアッセイに付し、ここではＣＡＴ挿入形態の周知のレトロウイルスベクター、ＭＦＧおよびＬＸＳＮ、をコントロールベクターとして使用した（Miller等、Biotechniques, 7 : 980-990, 1981 ; Ohashi等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 11332-11336, 1992）。パッケージング系Phoenix(KinsellaおよびNolan, Hum. Gene. Ther. 7 : 1405-1413）をこれらのベクターでトランスフェクションし、次に４８時間培養した。一方、培養した培地を０．４５μｍフィルターで濾過することによって得られた細胞を含まないウイルス上澄液をＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）を形質導入するのに用いた。ＣＡＴ活性のレベルを形質導入後２日にタンパク質抽出液を用いて測定した。ＣＡＴ活性を各ベクターでトランスフェクションまたは形質導入した細胞系（表３での「一過性トランスフェクション」および「形質導入、一過性」の欄を参照）、および抗生物質耐性細胞集団（表３での「形質導入、安定」の欄を参照）で測定した。さらに、ＣＡＴ活性を４週間継代培養した安定な細胞集団で測定した（表３での「形質導入安定（４週間）」の欄を参照）。トランスフェクションした細胞系での遺伝子発現レベルおよびウイルス力価を各ベクターでトランスフェクションまたは形質導入した系で測定したＣＡＴ活性から測定した。
【００８１】
表３に示すように、全てのレトロウイルスベクターは、ＬＸＳＮベクターを除いて、ＭＩＮベクターよりも高いＣＡＴ活性を示した。しかし、ＣＡＴ活性は挿入された非相同性配列に基づいて変化した。特に、ＭＩＮ−ＥＩおよびＭＩＮ−２は著しく高いレベルの遺伝子発現を生じた。ＭＩＮ−ＥＩまたはＭＩＮ−２で安定に形質導入された細胞は４週間継代培養した後でも一層高い遺伝子発現レベルを生じたことは極めて注目すべきことであった。
【００８２】
【表３】
【発明の効果】
前文に開示し、実証した如く、本発明は遺伝子療法等に多くの利点を有するレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは以下のような効果を有している：
【００８４】
１．レトロウイルスコード配列（ｇａｇ．ｅｎｖおよびｐｏｌ配列）が全て欠失しているので、相同性組換えにより複製能力をもつレトロウイルスが生じる可能性を完全に排除することができる。
【００８５】
２．非相同性イントロン、スプライスアクセプターおよび（または）非コード領域が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されているので、ベクター中の外来遺伝子を安定して、効率よく発現させることができる。
【００８６】
３．５′ＬＴＲ中のＵ３領域が特にヒト細胞で転写を強く誘起する非相同性プロモーターで置換されているので、ベクターでトランスフェクションされたヒト細胞由来のパッケージング系は一層高いレベルのＲＮＡを生成し、それでウイルス力価の増大を示している。
【００８７】
４．ＩＲＥＳまたは非相同性プロモーターを用いてベクター中で２種またはそれ以上の外来遺伝子を同時に発現させる。この場合、最小プロモーターを、非相同性内部プロモーターの干渉を減少させ、そして外来遺伝子を一層大きなサイズでクローニングするために、挿入非相同性プロモーターとして使用することができる。
【００８８】
上記の記載で開示した概念および特定の態様を本発明の同一の目的を実施するためのその他の態様を変形または設計するための基礎として容易に利用し得ることは当業者に明白である。このような均等の態様は付属の請求の範囲に記載の発明の精神および範囲を逸脱するものではないことも当業者に明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐｏｌコード領域をＭＯＮベクターから欠失させてΔＳＡベクターを構築し、次にＣＡＴ遺伝子をΔＳＡベクターに挿入してΔＳＡ−ＣＡＴベクターを生成する手順を示す図。
【図２】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のイントロンおよび（または）エキソンを含有するレトロウイルスベクターの構造を図式で示す図。
【図３ａ】 ＳＶ４０最小プロモーター−ネオカセットでＩＲＥＳ−ネオカセットを置換してＭＳＮベクターを得て、次にＳＮ−３ＬＴＲベクターがＳＶ４０最小プロモーターおよびＭＬＶ３′ＬＴＲを含むフラグメントをｐＵＣ１８に挿入することにより構築される手順を示す図。
【図３ｂ】 ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターを含有するキメラＬＴＲをＳＮ−３ＬＴＲベクターに挿入する手順を示す図。
【図４ａ】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮ１．２ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ１．２に挿入してＤＯＮ１．２−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。
【図４ｂ】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮ２ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ２に挿入してＤＯＮ２−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。
【図４ｃ】 マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１をｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮＳＡ１ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮＳＡ１に挿入してＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。
【図５】 ヒト遺伝子のイントロンおよびエキソンを含有するレトロウイルスベクターの構造を図式で示す図。
【図６】 ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲを含有するＤＮＡフラグメントを調製し、そしてｐＵＣ１８に挿入してｐ５３ＬＴＲベクターとし、次にｐＣＢＩＮから単離したＩＲＥＳ−ネオカセットをｐ５３ＬＴＲに挿入することによりＭＩＮベクターを構築する手順を示す図。
【図７ａ】 ヒトβ−アクチン遺伝子含有ゲノムＰＣＲ生成物が得られ、次にヒトＥＦ１α遺伝子の部分イントロン１、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターに挿入する手順を示す図。
【図７ｂ】 ヒトＥＦ１α遺伝子を含有するゲノムＰＣＲ生成物が得られ、次にヒトＥＦ１α遺伝子の部分イントロン１、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターに挿入するＭＩＮ−ＥＩ構築の手順を示す図。
【図７ｃ】 ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロン１、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントがゲノムＰＣＲによって得られ、次にＭＩＮベクターに挿入されるＭＩＮ−ＧＩ構築の手順を示す図。
【図７ｄ】 ＨＣＭＶ ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡ、スプライスアクセプターおよび部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントがＭＩＮベクターに挿入されるＭＩＮ−２構築の手順を示す図。
【配列表】
Claims (16)
- マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌコード塩基配列を完全に欠失しているＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 外来遺伝子の挿入位置及びその上流位置に挿入された非相同性非コード塩基配列を含む請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 非相同性非コード塩基配列が、イントロン、スプライスアクセプターおよびエキソン２の開始コドン直前までの塩基配列からなる群から選ばれる２種以上の非コード塩基配列を含む請求項２記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 非相同性非コード塩基配列がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ） ｉｅｌ遺伝子、延長因子ｌα遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、β−アクチン遺伝子およびマウス免疫グロブリン遺伝子の非コード塩基配列からなる群から選ばれる請求項２記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- ＭＬＶ５’ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）が非相同性プロモーターで置換されている請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 非相同性プロモーターがＨＣＭＶ主要前初期プロモーターである請求項５記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同性プロモーターを含有する請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 非相同性プロモーターがＳＶ４０最小プロモーターである請求項７記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- ベクターが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流にマウス免疫グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターおよびＨＣＭＶ ｉｅｌ遺伝子のエキソン１を含み、ＭＬＶ５’ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）がＨＣＭＶ ｉｅｌプロモーターで置換され，外来遺伝子のためのクローニング部位の下流にＳＶ４０最小プロモターが挿入されているレトロウイルスベクターである請求項２記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- ベクターが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流にＨＣＭＶ ｉｅｌ遺伝子のイントロンＡ領域の３’末端方向１１２ｂｐとエキソン２の解読開始コドン直前までの塩基配列を含み、ＭＬＶの５’ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）がＨＣＭＶ ｉｅｌプロモーターで置換され，外来遺伝子のためのクローニング部位の下流にＳＶ４０最小プロモターが挿入されているレトロウイルスベクターである請求項２記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- ベクターが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流にヒト延長因子１α遺伝子のイントロン領域の３’末端部位からエキソン２の解読開始コドン直前までの塩基配列（＋７７２〜＋１００８ｂｐ）を含むレトロウイルスベクターである請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- ベクターが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流にＨＣＭＶｉｅｌ遺伝子のイントロンＡ領域の３’末端方向１１２ｂｐとエキソン２の解読開始コドン直前までの塩基配列（＋８３７〜＋９６４ｂｐ）を含むレトロウイルスベクターである請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
- 請求項９記載のベクターで形質転換された大腸菌株Ｔｏｐ１０−ＤＯＮＳＡ１（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２７）。
- 請求項１０記載のベクターで形質転換された大腸菌株Ｔｏｐ１０−ＤＯＮ２（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２８）。
- 請求項１１記載のベクターのクローニング部位に細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌株ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６３）。
- 請求項１２記載のベクターのクローニング部位に細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌株ＭＩＮ−２ＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６４）。
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