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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Erzeugung effizienter Packzellinien für lentivirale Vektoren wird
durch die Cytotoxizität
einiger der Produkte der gag- und pol-Gene gestört. Daher ist die induzierbare
Expression von gag und pol gewünscht,
so daß optimale
Klone, die gag und pol bei Bedarf bei hohen Niveaus exprimieren,
ohne gag/pol-Expression ausgewählt
werden können.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Ein
Verfahren zur Auswahl von Zellen, die gag und pol exprimieren und
folglich als Verpackungszellen verwendbar sind, wird durch Verbinden eines
auswählbaren
Markers mit der gag/pol-Expressionskassette eines Verpackungsvektors
in einer solchen Weise erhalten, daß der Marker durch denselben
Promotor, der die Expression der gag/pol-Gene kontrolliert, obwohl
die Expression der gag/pol-Gene unterdrückt wird, exprimiert wird.
Eine effiziente Expression des Markers sagt eine effiziente Expression der
gag/pol-Gene auf Induktion voraus.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt
einen rekombinanten Vektor dar, welcher die vorliegende Erfindung
veranschaulicht. Die gag/pol-Sequenzen sind von Donor- und Akzeptor-Spleißstellen
flankiert. Ebenso in den Donor- und Akzeptor-Spleißstellen
enthalten ist ein RRE (Rev responsives Element).
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2 stellt
den Mechanismus dar, durch den ein Vektor, enthaltend ein RRE, induzierbare
Expression nur des Markergens bereitstellen würde, wobei im Falle des exemplarischen
rekombinanten Vektors aus 1 der Marker
CD4 ist. Ohne Rev findet das Spleißen zwischen der Donor- und
Akzeptor-Spleißstelle
statt, wobei da durch die gag/pol-Sequenz eliminiert wird. Nur CD4
wird exprimiert. Liegt Rev vor, findet kein Spleißen statt,
und die gag/pol-Gene werden exprimiert.
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3 ist
ein Diagramm, das die Mengen von p24, einem Produkt des gag-Gens,
im Kulturmedium darstellt, wenn Zellen, enthaltend einen Vektor
der vorliegenden Erfindung, in Gegenwart von oder ohne Rev gezüchtet werden.
Zwei verschiedene Vektoren wurden verwendet, MDH spl CD4 und MD
L g/p RRE. In beiden Vektoren werden die gag/pol-Gene durch Donor-
und Akzeptor-Spleißstellen
eingerahmt, und folglich wird p24 exprimiert, wenn Rev in der Kultur vorliegt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung macht sich den Spleiß-Kontroll-Mechanismus
von HIV und anderen Lentiviren, die die Expression der späteren viralen
Gene, gag/pol und env, regulieren, mittels eines cis-acting RNA-Elements,
RRE, und eines trans-acting Regulatorproteins, Rev, zunutze. Durch
die strategische Plazierung der Spleiß-Kontroll-Elemente erlaubt eine Verschiebung in
einem gag/pol-Expressionskonstrukt die Expression eines downstream
auswählbaren Markergens
im basalen Zustand und der upstream gag/pol-Gene nur auf Induktion.
Da beide Gene durch denselben konstitutiven Promoter aktiviert werden,
ermöglicht
der Verschiebungsvorgang eine gag/pol-Induktion zu einem Expressionsniveau,
das mit dem des auswählbaren
Markers in Zusammenhang steht.
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Drei
Merkmale bewirken die Verschiebung: 1) die gag/pol-Gene sind in
einer Donor-Spleißstelle und
einer oder mehreren Akzeptor-Spleißstellen enthalten, wobei die
Sequenzen der Akzeptorstellen nicht mit der optimalen Consensus-Akzeptor-Spleißsequenz
upstream des Markergens übereinstimmen (Lewin, „Genes", John Wiley & Sons, NY); 2)
die gag/pol-Gene enthalten Sequenzen, welche die Expression von
gag/pol antagonisieren (Schneider et al., J. Virol. 71: 4892–4903, 1997;
Schwartz et al., J. Virol. 66: 7176–7182, 1992); und 3) die gag/pol-Gene sind
in cis-Stellung mit dem RRE-Element verbunden und sind von der Rev
kodierenden Sequenz getrennt.
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Ein
Promoter, der sowohl die Expression des gag/pol- als auch des Markergens
kontrolliert, liegt operabel dazu, im allgemeinen upstream von den gag/pol-Sequenzen.
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Das
RRE/Rev-Regulatorsystem ist in Lentiviren zu finden und folglich
kann das von HIV-1 oder irgendein anderes Lentivirus verwendet werden.
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Die
ersten beiden Merkmale werden kombiniert, um die gag/pol-Expression
im basalen Zustand zu unterdrücken.
Das dritte Merkmal ermöglicht
die Rev-abhängige
Stimulation, d. h., Induktion, des Exports nicht gespleißter RNA
und daraus folgend Expression der gag/pol-Gene.
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In
bezug auf die Spleißstellen
wird eine Kombination einer effizienten Donor-Spleißstelle,
wie die des 5'-Haupt-Spleißdonors
von HIV, und einer oder mehrerer Akzeptor-Spleißstellen, wobei die Akzeptor-Spleißstellen
nicht exakt mit dem optimalen Consensus übereinstimmen, verwendet. Folglich
sind Akzeptor-Spleißstellen
von Interesse die, die ein Fachmann als nicht so effizient, stark
oder gut erkennen würde.
Trotzdem sind die Akzeptor-Spleißstellen funktionell, wenn
auch bei einer suboptimalen Effizienzrate. Die suboptimalen Spleißstellen
scheinen eine effizientere Expression von nicht gespleißten Transkripten
durch das Rev-RRE-System zu erlauben. Ein Beispiel einer solchen
suboptimalen Akzeptor-Spleißstelle
ist das des dritten Exons der HIV-1 tat- und rev-Gene.
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Nicht
lentivirale Donor- und Akzeptor-Spleißstellen können in der Praxis der vorliegenden
Erfindung ebenso verwendet werden, solange das Spleißen und
folglich die Expression der gag/pol-Gene durch die Gegenwart eines
trans-acting Faktors wie Rev kontrolliert wird.
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Die
intrinsische Instabilität
der lentiviralen gag/pol kodierenden Sequenzen und insbesondere der
in dem Intron enthaltenen Sequenzen, wirkt der Expression nicht
gespleißter
Transkripte, die aufgrund der suboptimalen Natur der Spleißstellen
akkumulieren können,
im basalen Zustand entgegen. Jede Sequenz, von der bekannt ist,
daß sie
mit der Instabilität
von Transkripten in Verbindung steht, kann in der Praxis der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Instabilitätssequenzen, wie die in der
gag/pol-Sequenz identifizierten, beschrieben in Schneider et al.
und Schwartz et al., supra, sind jedoch nicht unbedingt für die Durchführung der
Verschiebung erforderlich.
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Jede
Zahl möglicher
auswählbarer
Marker kann verwendet werden. Marker, die ohne weiteres detektierbar
sind, sind wünschenswert.
Beispielsweise kann der Marker ein Zelloberflächenmolekül, welches antigen ist, wie
ein CD-Molekül
oder Lymphozytenantigen, oder ein Licht emittierendes Molekül, wie grünes fluoreszierendes
Protein, sein. Ein Fachmann kann frei einen auswählbaren Marker von Interesse aus
den in der Technik bekannten auswählen.
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Die
Verfahren zum Klonen der verschiedenen Elemente der vorliegenden
Erfindung in einen Vektor von Interesse sind in der Technik bekannt.
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Als
ein Mittel zum Einführen
noch eines anderen Grades an Regulation, kann auch die Expression
von trans-acting Spleißregulatorelementen
im Falle von HIV-1 Rev induziert werden. In Gegenwart eines separaten
induzierbaren Rev Expressionskonstrukts ist die Expression der gag/pol-Gene
induzierbar. Beispielsweise kann die Expression von Rev unter Verwendung
des Tetracyclin-abhängigen
Regulatorsystems von Ory et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11400–11406,
1996) induziert werden, wobei Rev neben einem tet-Operator subkloniert
wird. In Gegenwart von tet wird Rev nicht exprimiert. Wird tet jedoch aus
dem Medium entfernt, tritt Rev-Expression auf.
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Andere
bekannte regulatorische Elemente können, wie in der Technik bekannt,
verwendet werden. Folglich kann ein geeigneter und bekannter Promotor
funktionell in dem Konstrukt plaziert werden, um die Expression
der gag/pol- und Markergene zu regulieren. Andere regulatorische
Elemente, wie eine Polyadenylierungsstelle, können gegebenenfalls verwendet
werden.
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Überdies
können
zahlreiche Modifikationen an jedem Element, das in den Vektoren
von Interesse enthalten ist, vorgenommen werden, um unerwünschte Aktivitäten zu entfernen
oder die gewünschten
Aktivitäten
zu steigern. Der Fachmann kann sich auf die bekannten Aktivitäten der
in Betracht gezogenen Elemente verlassen und kann bekannte Verfahrens
durchführen,
um die gewünschten Veränderungen
zu bewirken, beispielsweise Deletion von Sequenzen durch selektive
Subklonierung, Inaktivierung eines Gens durch ortsgerichtete Mutagenese
und so weiter.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Auswahl optimaler Verpackungsklone
für Vektoren, wie
von Lentiviren abgeleitete, und insbesondere von HIV abgeleitete
Vektoren. Unter Verwendung eines Oberflächenmarkers für die verbundene
Auswahl kann eine Population stabiler starker Expressoren bei der
Transfektion der Konstrukte sortiert und anschließend so
oft wie nötig
sortiert werden, um die Leistung zu halten. In den zuvor beschriebenen
verbundenen Auswahlsystemen ist die Expression des Markergens mit
der Expression des gewünschten Gens
gekoppelt und kann nicht in umgekehrter Richtung durchgeführt werden.
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Das
gegenständliche
Verfahren kann auch für
die Auswahl von Verpackungsklonen für lentivirale Vektoren, die
andere als HIV-1 sind, entweder unter Verwendung des HIV-1 Rev-RRE-Systems
oder homologer Elemente anderer Lentiviren verwendet werden, solange
die homologen Regulatorelemente funktionell äquivalent arbeiten, um ein
auswählbares Spleißen der
gag/pol-Sequenz in Gegenwart eines inducer-Moleküls, das sich in trans-Stellung
zu der Kodierungssequenz von Interesse befindet, zu erzielen.
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Die
Erfindung wird nun in den folgenden nicht einschränkenden
Beispielen weiter veranschaulicht.
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BEISPIELE
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Ein
Verpackungsvektor, pMDH L g/p RRE Spl CD4 (1) wurde
so konstruiert, daß er
folgendes enthielt: Immediate/Early-Enhancer/Promotor des humanen
Cytomegalovirus (CMV); 5'-Haupt-Donor-Spleißstelle
von HIV; HIV gag/pol kodierende Bereiche mit optimierter Translationsinitiationssequenz, die
der Kozak-Consensus-Sequenz
angepaßt
ist (Dull et al. J. Virol. 72: 8463–8471, 1998); HIV RRE-Element;
HIV Akzeptor-Spleißstellen
des dritten Exons von tat und rev; einen humanen CD4 kodierenden
Bereich und Ratteninsulin-Polyadenylierungssequenz.
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Der
lentivirale Verpackungsvektor pMDH L g/p RRE Spl CD4 erlaubt die
Auswahl von starker Expression des Oberflächenmarkers CD4 mit einer sehr geringen
Expression der HIV-1 gag/pol-Gene. Aufgrund der Verbindung des CD4-Markers
mit den gag/pol-Genen korreliert die starke Expression von CD4 mit
hochinduzierbarer Expression von gag/pol. Fehlt HIV Rev, ergibt
das Spleißen
der gag/pol-Sequenzen zwischen dem HIV-Spleißdonor und den -Akzeptoren
eine effiziente Expression von CD4 ohne nennenswerte Expression
von gag und pol (2A). Fehlt Rev, erlaubt
der RRE-vermittelte Export einer nicht gespleißten gag/pol-Message die Expression
der gag/pol-Proteine (2B).
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Das
pMDH L g/p RRE Spl CD4-Plasmid wurde in 293T (Dull et al., supra)
mit oder ohne Rev-Expressionsplasmid (Dull et al., supra) und mit
einer Kombination aus anderen Plasmiden, die für die Erzeugung lentiviraler
Vektorgabe eines auswählbaren Markers,
dem grünen
fluoreszierenden Protein (GFP), notwenig sind, transfektiert.
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Etwa
4 × 106 293T-Zellen wurden pro 10-cm-Schale in
der Nacht vor der Transfektion plattiert. CaPO4 Co-transfektion
der folgenden Plasmide wurde durchgeführt: pMDH L g/p RRE Spl CD4,
7 μg (von
HIV abgeleitetes gag/pol-Expressionsplasmid); pRSV Rev, 2,5 μg; pCMV tat,
1 μg; pMD
VSVG env, 3,5 μg
und pRRLhPGKGFPSIN-18, 10 μg
(ein selbst-inaktivierender von HIV abgeleiteter Übertragungsvektor,
der eine ein grünes
fluoreszierendes Protein kodierende Sequenz, verbunden mit einem PGK-Promotor,
trägt).
Identische Transfektionen wurden ebenso ohne das pRSV Rev-Plasmid
und mit dem Parentalverpackungsvektor pMD L g/p RRE anstelle von
pMDH L g/p RRE Spl CD4 durchgeführt. Zwanzig
Stunden nach der Transfektion wurde frisches Medium zugegeben, und
24 Stunden später wurde
konditioniertes Medium für
die Messung des Gehalts des HIV gag Produktes, p24, durch Immunocapture
(Dupont) und zur Bestimmung der Transduktion geerntet. Die transfektierten
Zellen wurden geerntet, mit Phykoerythrin-markierten Anti-CD4-Antikörpern inkubiert
und durch FACS in bezug auf Phykoerythrin und den fluoreszierenden
Stoff GFP analysiert.
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Die
Transfektionsprodukte wurden in bezug auf Expression von sowohl
CD4 als auch GFP mit und ohne HIV Rev analysiert. In beiden Fällen war die überwältigende Mehrheit
der Zellen zweifach positiv für
CD4 und GFP. Wie erwartet, war das durchschnittliche Expressionsniveau
von CD4 in Zellen, die Rev nicht exprimieren, höher. Die Expression basaler
Niveaus von CD4 in Gegenwart von Rev ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß Rev das
Spleißen RRE-enthaltender
Transkripte nicht vollständig
verhindert.
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Ähnliche
Transfektionen wurden auch mit dem Parentalverpackungsvektor pMD
L g/p RRE anstelle von pMDH L g/p RRE Spl CD4 durchgeführt. Der
Vektor pMD L g/p RRE exprimiert gag/pol von HIV in einer Rev-abhängigen Weise
downstream eines konstitutiv gespleißten Introns, das aus dem B-Globingen
stammt. Mit dem pMD L g/p RRE-Verpackungsvektor und Rev co-transfektierte
Zellen exprimierten gag/pol, wohingegen ohne Rev kein gag/pol detektiert
wurde.
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Die
Expression der gag/pol-Gene in den transfektierten 293T-Zellen wurde
durch Messen des Gehalts des gag-Genproduktes, p24, in dem konditionierten
Medium durch Immunocapture (DuPont) analysiert. 3 zeigt
die p24-Konzentration in den konditionierten Medien von Zellen,
transfektiert mit Verpackungsvektoren sowohl in Gegenwart von als auch
ohne HIV Rev. Die Rev-Abhängigkeit
der gag/pol-Expression
für beide
Plasmide ist offensichtlich. Das Plasmid, welches die CD4 kodierende
Sequenz enthält,
exprimiert einen sehr hohen Grad an p24-Protein in Gegenwart von
Rev, ähnlich
dem mit dem Kontrollplasmid erhaltenen.
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Die
Erzeugung eines funktionalen Vektors wurde unter Verwendung des
293T-konditionierten Mediums
für die
Transduktion des GFP-Gens in HeLa-Zellen analysiert. HeLa-Zellen
wurden 10 μl
Medium, konditioniert durch Zellen, die mit dem pMDH L g/p RRE Spl
CD4-Verpackungsvektor oder dem pMD L g/p RRE-Verpackungsvektor in
Gegenwart von (a) und ohne (b) HIV Rev transfektiert wurden, ausgesetzt.
Transduktionsexperimente wurden durchgeführt, indem 5 × 104 Zellen/Loch in der Nacht vor der Infektion
in 6-Lochplatten plattiert wurden. Am nächsten Tag wurde das gefrorene
293T-konditionierte Medium aufgetaut und 1:10, 1:100, 1:1000 verdünnt, und
1 ml jeder Verdünnung
wurde verwendet, um die Zellen zu infizieren. Zwanzig Stunden nach
der Infektion wurde frisches Medium zuge geben, und 24 Stunden später wurden
die Zellen durch FACS in bezug auf GFP-Expression analysiert.
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Die
Rev-Abhängigkeit
der Transduktion war bei beiden Plasmiden offensichtlich. Nur wenn
Rev in Vektorerzeugerzellen exprimiert wird, exprimieren die Target-HeLa-Zellen GFP. Überdies
ist die Infektiosität
(Transduktionseinheiten/ng p24) eines Vektors, erzeugt durch ein
Plasmid, ähnlich,
was angibt, daß das
CD4-verbundene Plasmid genauso effizient arbeitet, wie das Kontrollplasmid.