JP2002530057A - レンチウイルスベクターに対する効率的なパッケージング細胞を産生するための選択システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高レベルのｇａｇ／ｐｏｌを発現するパッケージング細胞を選択するための方法を提供する。ｇａｇおよびｐｏｌを発現し、そして従って、パッケージング細胞として有用な細胞を選択する方法は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現は抑制されるが、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を制御する同じプロモーターによってマーカーが発現されるような方法において、選択可能なマーカーを、パッケージングベクターのｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットに連結することによって得られる。マーカーの効率的な発現は、誘導におけるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の効率的な発現を予測する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） レンチウイルスベクターに対する効率的なパッケージング細胞株の産生は、ｇ
ａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子のいくつかの産物の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘ
ｉｃｉｔｙ）によって妨害される。従って、ｇａｇおよびｐｏｌの誘導性発現を
有し、その結果、必要な場合に、高レベルでｇａｇおよびｐｏｌを発現する最適
クローンが、ｇａｇ／ｐｏｌ発現の非存在下で選択され得ることが望ましい。

【０００２】 （発明の要旨） ｇａｇおよびｐｏｌを発現し、そして従って、パッケージング細胞として有用
な細胞を選択する方法は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現は抑制されるが、ｇａｇ
／ｐｏｌ遺伝子の発現を制御する同じプロモーターによってマーカーが発現され
るような方法において、選択可能なマーカーを、パッケージングベクターのｇａ
ｇ／ｐｏｌ発現カセットに連結することによって得られる。マーカーの効率的な
発現は、誘導におけるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の効率的な発現を予測する。

【０００３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、シス作用性ＲＮＡエレメントであるＲＲＥ、およびトランス作用性
調節タンパク質であるＲｅｖによって、後期ウイルス遺伝子であるｇａｇ／ｐｏ
ｌおよびｅｎｖの発現を調節する、ＨＩＶおよび他のレンチウイルスのスプライ
シング制御メカニズムを利用する。スプライス制御エレメントの戦略的配置によ
って、ｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物におけるスイッチが、基底状態における下流の
選択マーカー遺伝子の発現、および誘導したときのみの上流のｇａｇ／ｐｏｌ遺
伝子の発現を可能にする。両方の遺伝子が、同じ構成的なプロモーターによって
駆動されるため、スイッチの作動が、選択マーカーの発現レベルに関連する発現
レベルまでのｇａｇ／ｐｏｌの誘導を可能にする。

【０００４】 ３つの特徴が、スイッチを作動させる：１）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が、スプラ
イスドナー部位および１つ以上のスプライスアクセプター部位内で含まれ、ここ
でこのアクセプター部位の配列は、マーカー遺伝子の上流の、最適なコンセンサ
ススプライスアクセプター配列と一致しないこと（Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ」
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；２）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が
、ｇａｇ／ｐｏｌの発現を拮抗する配列を含むこと（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３、１９９７；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６６：７１７６−７１８２、１９９２）；および３）ｇａｇ／ｐ
ｏｌ遺伝子が、シスにおいてＲＲＥエレメントに連結され、ならびにＲｅｖコー
ド配列から隔てられていること。

【０００５】 ｇａｇ／ｐｏｌおよびマーカー遺伝子の両方の発現を制御するプロモーターが
、作動可能にそれらの遺伝子に（一般的にｇａｇ／ｐｏｌ配列から上流に）配置
される。

【０００６】 ＲＲＥ／Ｒｅｖ調節システムは、レンチウイルスにおいて見出され、そして従
って、ＨＩＶ−１のＲＲＥ／Ｒｅｖ調節システムまたは任意の他のレンチウイル
スのＲＲＥ／Ｒｅｖ調節システムが、用いられ得る。また、本明細書中で記載さ
れる通り、ｇａｇ／ｐｏｌの発現を制御する選択的スプライシングをもたらす、
任意の他のトランス補完制御システムが、本発明の実施において用いられ得る。

【０００７】 最初の２つの特徴は組合わさって、基底状態におけるｇａｇ／ｐｏｌ発現を抑
制する。３番目の特徴は、スプライシングされていないＲＮＡの輸送のＲｅｖ依
存性刺激（すなわち、誘導）、およびその後のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を可
能にする。

【０００８】 スプライス部位に関しては、効率的なスプライスドナー部位（例えば、ＨＩＶ
の５’主要スプライスドナーのスプライスドナー部位）と１つ以上のスプライス
アクセプター部位との組み合わせが用いられ、ここで、このスプライスアクセプ
ター部位は、最適なコンセンサスに正確には一致しない。従って、目的のスプラ
イスアクセプターは、当業者が、効率的でも、強力でも良好でもないと認識する
ものである。それにもかかわらず、最適未満の速度の効率ではあるが、スプライ
スアクセプター部位は作動可能である。最適未満のスプライス部位が、Ｒｅｖ−
ＲＲＥシステムによる、スプライシングされていない転写物からの、より効率的
な発現を可能にするようである。このような最適未満のスプライスアクセプター
部位の一例は、ＨＩＶ−１ ｔａｔ遺伝子およびＨＩＶ−１ ｒｅｖ遺伝子の３
番目のエキソンのスプライスアクセプター部位である。

【０００９】 非レンチウイルススプライスドナー部位および非レンチウイルススプライスア
クセプター部位もまた、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子のスプライシング、従って発現が
、トランス作用性因子（例えば、Ｒｅｖ）の存在によって制御される限りは、本
発明の実施において用いられ得る。

【００１０】 レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌコード配列（特にイントロンに含まれる配列）
の内因性の不安定性が、スプライス部位の最適未満の性質に起因して、蓄積し得
るスプライシングされていない転写物からの、基底状態における発現を相殺する
。転写物の不安定性に関連することが公知である任意の配列が、本発明の実施に
おいて用いられ得る。しかし、不安定性配列（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、
およびＳｃｈｗａｒｔｚら、前出、において記載され、同定される、ｇａｇ／ｐ
ｏｌ配列における、不安定性配列）は、スイッチの作動を厳密には必要としない
かもしれない。

【００１１】 多くの可能性のある選択マーカーのいずれもが、用いられ得る。容易に検出可
能なマーカーが、望ましい。例えば、マーカーは、抗原性である細胞表面分子（
例えば、ＣＤ分子またはリンパ球抗原）、あるいは発光分子（例えば、緑色蛍光
タンパク質）であり得る。当業者は、当該分野において公知のものから、目的の
選択マーカーを自由に選択できる。

【００１２】 本発明の種々のエレメントを目的のベクターにクローニングするための方法は
、当該分野において公知である。

【００１３】 さらに別のレベルの調節を導入する手段として、トランス作用性スプライス調
節エレメント（ＨＩＶ−１の場合はＲｅｖ）の発現は、同様に誘導性であり得る
。別の誘導性のＲｅｖ発現構築物の存在下においては、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の
発現が誘導性になる。例えば、Ｒｅｖの発現は、Ｏｒｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１４００−１１４０６、１９９６）の、テトラサ
イクリン依存性調節システムを用いて誘導性であり得、ここでＲｅｖが、ｔｅｔ
オペレーターに隣接してサブクローン化される。ｔｅｔの存在下において、Ｒｅ
ｖは発現されない。しかし、ｔｅｔが培地で使用中止とされる場合に、Ｒｅｖの
発現が生じる。

【００１４】 他の公知の調節エレメントが、当該分野において公知であるように用いられ得
る。従って、適切かつ公知のプロモーターが、構築物において作動可能に配置さ
れ得、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびマーカー遺伝子の発現を調節する。他の調節
エレメント（例えば、ポリアデニル化部位）が、所望の通りに用いられ得る。

【００１５】 さらに、種々の改変が、目的のベクターに含まれる任意の１つのエレメントに
対してなされ得、所望でない活性を取り除くか、または所望の活性を増強する。
当業者は、意図されたエレメントの公知の活性に依存し得、そして公知の技術を
実施して、所望の変化（例えば、選択的サブクローニングによる配列欠失、部位
特異的変異誘発による遺伝子の不活化など）をもたらし得る。

【００１６】 本発明の利点は、ベクター（例えば、レンチウイルス由来ベクター、特に、Ｈ
ＩＶ由来ベクター）に対して最適なパッケージングクローンの選択である。連鎖
選択（ｌｉｎｋｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）についての表面マーカーを用いて、
安定な、高レベルの発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）の集団が、構築物のトランス
フェクトによって選別され得、その後性能を維持することが必要とされる毎に選
別され得る。以前に記載された連鎖選択システムにおいて、マーカー遺伝子の発
現が、所望の遺伝子の発現と対になっており、そして逆方向においては作動され
得ない。

【００１７】 本方法はまた、相同調節エレメントが、目的のコード配列に対してトランスに
位置するインデューサー分子の存在下において機能的に同等に作動して、ｇａｇ
／ｐｏｌ配列の選択可能なスプライシングが得られる限りは、ＨＩＶ−１ Ｒｅ
ｖ−ＲＲＥシステム、または他のレンチウイルスの相同エレメントのいずれかを
用いて、ＨＩＶ−１以外のレンチウイルスベクターのためのパッケージングクロ
ーンを選択するために用いられ得る。

【００１８】 さて本発明は、以下の非制限的な実施例において例示される。

【００１９】 （実施例） パッケージングベクターであるｐＭＤＨ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ Ｓｐｌ ＣＤ
４（図１）を、以下を含むように構築した：ヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）の前／初期 エンハンサー／プロモーター；ＨＩＶ主要５’スプライスドナ
ー；Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に一致する最適化された翻訳開始配列を有する
、ＨＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌコード領域（Ｄｕｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８
４６３−８４７１、１９９８）；ＨＩＶ ＲＲＥエレメント；ｔａｔおよびｒｅ
ｖの３番目のエキソン由来のＨＩＶスプライスアクセプター部位；ヒトＣＤ４コ
ード領域；ならびにラットインスリンポリアデニル化配列。

【００２０】 レンチウイルスパッケージングベクターであるｐＭＤＨ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ
Ｓｐｌ ＣＤ４が、ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の非常に低い発現を伴
った、表面マーカーＣＤ４の高レベルの発現の選択を可能にする。ｇａｇ／ｐｏ
ｌ遺伝子へのＣＤ４マーカーの結合に起因して、ＣＤ４の高発現は、ｇａｇ／ｐ
ｏｌの高い誘導性発現に相関する。ＨＩＶ Ｒｅｖの非存在下において、ＨＩＶ
スプライスドナーとＨＩＶスプライスアクセプターとの間のｇａｇ／ｐｏｌ配列
のスプライシングが、ｇａｇおよびｐｏｌの検出可能な発現を伴わずに、ＣＤ４
の効率的な発現をもたらす（図２Ａ）。Ｒｅｖの存在下において、スプライシン
グされていないｇａｇ／ｐｏｌメッセージのＲＲＥ媒介性輸送が、ｇａｇ ｐｏ
ｌタンパク質の発現を可能にする（図２Ｂ）。

【００２１】 ｐＭＤＨ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ Ｓｐｌ ＣＤ４プラスミドを、Ｒｅｖ発現プ
ラスミド（Ｄｕｌｌら、前出）を用いて、または用いずに、および選択マーカー
である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレンチウイルスベクター送達を引き起こ
すために必要とされる他のプラスミドの組み合わせを用いて、２９３Ｔ（Ｄｕｌ
ｌら、前出）にトランスフェクトした。

【００２２】 １０センチ皿あたり約４×１０⁶個の２９３Ｔ細胞を、トランスフェクトの前
の夜に、プレーティングした。以下のプラスミドのＣａＰＯ₄同時トランスフェ
クションを行った：ｐＭＤＨ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ Ｓｐｌ ＣＤ４、７μｇ（
ＨＩＶ由来ｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド）；ｐＲＳＶ Ｒｅｖ、２．５μｇ；
ｐＣＭＶ ｔａｔ、１μｇ；ｐＭＤ ＶＳＶＧ ｅｎｖ、３．５μｇ；およびｐ
ＲＲＬｈＰＧＫＧＦＰＳＩＮ−１８、１０μｇ（ＰＧＫプロモーターに連結され
た緑色蛍光タンパク質コード配列を保有する自己不活化ＨＩＶ由来移入ベクター
）。同一のトランスフェクションをまた、ｐＲＳＶ Ｒｅｖプラスミドを用いず
に、およびｐＭＤＨ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ Ｓｐｌ ＣＤ４の代わりに親のパッ
ケージングベクターｐＭＤ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥを用いて行った。トランスフェ
クションから２０時間後、新鮮な培地を添加し、そして２４時間後、馴化培地を
、免疫捕獲（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）（Ｄｕｐｏｎｔ）によってＨＩＶ
ｇａｇ産物であるｐ２４の含有量を測定するため、および形質導入をアッセイす
るために、収集した。トランスフェクトされた細胞を収集し、フィコエリトリン
で標識された抗ＣＤ４抗体とともにインキュベートし、そしてフィコエリトリン
およびＧＦＰ蛍光について、ＦＡＣＳによって分析した。

【００２３】 トランスフェクト体を、ＨＩＶ Ｒｅｖを伴うおよび伴わない、ＣＤ４および
ＧＦＰの両方の発現について分析した。両方の場合において、細胞の大部分が、
ＣＤ４およびＧＦＰに対して二重にポジティブであった。期待されるように、Ｃ
Ｄ４の平均発現レベルが、Ｒｅｖを発現しない細胞において、より高かった。Ｒ
ｅｖの存在下における、基底レベルのＣＤ４の発現は、Ｒｅｖは、ＲＲＥ含有転
写物のスプライシングを完全には妨げない、という事実に起因する。

【００２４】 同様のトランスフェクションをまた、ｐＭＤＨ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ Ｓｐｌ
ＣＤ４の代わりに親のパッケージングベクターｐＭＤ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥを
用いて行った。ベクターｐＭＤ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥは、βグロビン遺伝子由来
の構成的にスプライシングされたイントロンの下流で、Ｒｅｖ依存性様式で、Ｈ
ＩＶのｇａｇ／ｐｏｌを発現する。ｐＭＤ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥパッケージング
ベクターおよびＲｅｖを用いて同時トランスフェクトされた細胞は、ｇａｇ／ｐ
ｏｌを発現したが、一方、Ｒｅｖの非存在下において、ｇａｇ／ｐｏｌは、検出
されなかった。

【００２５】 トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を
、免疫捕獲（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）（ＤｕＰｏｎｔ）によって、馴化培
地における、ｇａｇ遺伝子産物であるｐ２４の含有量を測定することによって分
析した。図３は、ＨＩＶ Ｒｅｖの存在下およびＨＩＶ Ｒｅｖの非存在下にお
いて、両方のパッケージングベクターを用いてトランスフェクトされた細胞の馴
化培地における、ｐ２４濃度を示す。両方のプラスミドに対するｇａｇ／ｐｏｌ
発現のＲｅｖ依存性が、明らかである。ＣＤ４コード配列を含むプラスミドは、
Ｒｅｖの存在下において、非常に高レベルのｐ２４タンパク質を発現し、これは
、コントロールプラスミドを用いて得られたものと類似する。

【００２６】 機能的ベクターの産生を、２９３Ｔ馴化培地を用いてＨｅＬａ細胞へＧＦＰ遺
伝子を形質導入することにより分析した。ＨｅＬａ細胞を、ｐＭＤＨ Ｌ ｇ／
ｐ ＲＲＥ Ｓｐｌ ＣＤ４パッケージングベクターを用いてトランスフェクト
された細胞、またはＨＩＶ Ｒｅｖの存在下（ａ）および非存在下（ｂ）におい
て、ｐＭＤ Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥパッケージングベクターを用いてトランスフェ
クトされた細胞によって馴化された、１０μｌの培地に曝露した。形質導入実験
を、感染の前の夜に、６ウェルプレート中に、１ウェルあたり５×１０⁴個の細
胞をプレーティングすることによって行った。翌日、凍結２９３Ｔ馴化培地を解
凍し、そして１：１０、１：１００、１：１０００に希釈し、そして各々の希釈
物の１ｍｌを用いて、細胞を感染させた。感染から２０時間後、新鮮な培地を添
加し、そして２４時間後、細胞を、ＧＦＰ発現について、ＦＡＣＳによって分析
した。

【００２７】 形質導入のＲｅｖ依存性は、両方のプラスミドについて明らかであった。Ｒｅ
ｖが、ベクタープロデューサー細胞において発現される場合においてのみ、標的
ＨｅＬａ細胞は、ＧＦＰを発現する。さらに、いずれかのプラスミドによって産
生されたベクターの感染性（１ｎｇのｐ２４あたりの形質導入単位）は類似して
おり、このことは、ＣＤ４連結プラスミドが、コントロールプラスミドと同じく
らい効率的に作動することを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明を例示する組換えベクターを示す。ｇａｇ／ｐｏｌ配列が、ス
プライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位に隣接する。ＲＲＥ（Ｒ
ｅｖ応答性エレメント）もまた、スプライスドナー部位およびスプライスアクセ
プター部位内に含まれる。

【図２】 図２は、図１の例示的な組換えベクターの場合において、ＲＲＥを含むベクタ
ーが、マーカー遺伝子のみの誘導可能な発現を提供するメカニズムを示し、この
マーカーはＣＤ４である。Ｒｅｖの非存在下において、スプライシングは、スプ
ライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間で生じ、それによって、
ｇａｇ／ｐｏｌ配列を排除する。ＣＤ４のみが発現される。Ｒｅｖが存在する場
合、スプライシングは生じず、そしてｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が発現される。

【図３】 図３は、本発明のベクターを含む細胞が、Ｒｅｖの存在下または非存在下にお
いて増殖する場合の、培養培地におけるｐ２４（ｇａｇ遺伝子の産物）の量を示
すグラフである。２つの異なるベクター（ＭＤＨ ｓｐｌ ＣＤ４およびＭＤ
Ｌ ｇ／ｐ ＲＲＥ）が用いられた。両方のベクターにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌ
遺伝子は、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位によって囲
まれ、従って、Ｒｅｖが培養物中に存在する場合に、ｐ２４が発現される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ナルディニ， ルイジ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティー， レイクサイド ドライブ 342， セル ジェネシス， インコーポレイテッド Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA03 DA02 EA02 FA20 GA11 4B065 AA95X AA95Y AB01 BA01 CA46

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸構築物であって、５’から３’方向で、作動可能に連結
   した、以下： （１）プロモーター； （２）スプライスドナー部位； （３）ｇａｇ／ｐｏｌコード配列； （４）Ｒｅｖ応答性エレメントまたはその機能的等価物； （５）スプライスアクセプター部位；および （６）選択可能なマーカーコード配列 を含む、核酸構築物。
2. 【請求項２】 組成物であって、以下： （ａ）第一発現カセットであって、５’から３’方向で、作動可能に連結した
   、以下： （１）プロモーター； （２）スプライスドナー部位； （３）ｇａｇ／ｐｏｌコード配列； （４）Ｒｅｖ応答性エレメントまたはその機能的等価物； （５）スプライスアクセプター部位；および （６）選択可能なマーカーコード配列、 を含む、第一発現カセット；ならびに （ｂ）第二発現カセットであって、５’から３’方向で作動可能な結合におい
   て、以下： （１）プロモーター；および （２）該第一発現カセットのエレメント（４）に結合する因子をコードする
   核酸であって、該因子はこのように結合しているとき、ｍＲＮＡが該第一発現カ
   セットから転写される場合に、該第一発現カセットの該部位（２）および該部位
   （５）でのスプライシングを調節する、核酸、 を含む、第二発現カセット、 を含む、組成物。