DE69619683T2

DE69619683T2 - Expression von heterologen genen in menschlichen brustzellen, einschliesslich menschliche brustkarzionomzellen unter der kontrolle von regulatorischen sequenzen von wap oder mmtv

Info

Publication number: DE69619683T2
Application number: DE69619683T
Authority: DE
Inventors: H. Guenzburg; Michael Saller; Brian Salmons
Original assignee: AUSTRIAN NORDIC BIOTHERAPEUTIC; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschung De
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2002-09-26
Anticipated expiration: 2016-09-07
Also published as: AU6987696A; WO1997009440A1; ATE214101T1; US20050019307A1; ES2174103T3; EP0848757A1; DK0848757T3; EP0848757B1; JPH11511979A; DE69619683D1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Nager-WAP (Whey Acidic Protein) und der MMTV(Maus-Mamma-Tumor-Virus)-regulatorischen Sequenzen zur zielgerichteten Expression damit verbundener heterologer Gene, insbesondere therapeutischer Gene in humanen Mammazellen, einschließlich humanen Mamma-Karzinom-Zellen.

Hintergrund der Erfindung

Das Mammakarzinom ist der häufigste Tumor in Frauen (Miller und Bulbrook, 1986). Bis jetzt beinhaltet die konventionelle Therapie die chirurgische Entfernung des Primärtumors, gefolgt von einer Chemo- oder Bestrahlungstherapie. In Abhängigkeit der Tumorentwicklung ist die Rückfallrate relativ hoch und führt in den meisten Fällen zum Tod.
Ein Hauptproblem ist die Entfernung aller Metastasen und Mikrometastasen. Sowohl diese Tatsache als auch die ernsthaften Nebenwirkungen für den Patienten, die von der konventionellen Behandlung verursacht werden, begünstigen die Entwicklung eines Gentherapieansatzes (für eine Übersicht über das Gebiet der Gentherapie siehe Anderson, 1992). Ein gentherapeutischer Ansatz wirft jedoch das Problem auf, wie das therapeutische Gen zielgerichtet in Tumorzellen exprimiert werden soll. Deshalb ist ein Kontrollelement notwendig, um sicherzustellen, dass das therapeutische Gen nur in den Tumorzellen exprimiert wird.
Vektorkonstrukte, die verschiedene Typen von brustdrüsenspezifischen regulatorischen Elementen enthalten, wurden in Mäusen ausgetestet, in denen die Expression eines Markergens, das von regulatorischen Elementen in hormonell stimulierten Brustdrüsen gesteuert wurde, erreicht werden konnte (WO-A1-6907748). Ein regulatorisches Element, von dem gezeigt wurde, dass es zur Expression in trächtigen und milchbildenden Maus-Brustdrüsen führt, ist ein kleiner Bereich des Nager-WAP-Promotors (Kolb et al., 1994). Dieses Gen wird nur in trächtigen und milchbildenden Brustdrüsen von Nagern exprimiert und besitzt kein humanes Homolog (Henninghausen, 1992). Es ist von daher nicht vorhersehbar, dass dieses regulatorische Element überhaupt funktionieren wird, um die Expression in menschlichen Brustzellen zu steuern und/oder um die Expression in humanen Mamma-Karzinom-Zellen zu ermöglichen.
Es war somit unerwartet, dass die Erfinder der vorliegenden Erfindung ermittelten, dass die WAP-regulatorische Sequenz in der Lage ist, die Expression eines damit verbundenen heterologen Gens in primären humanen Zellen einschließlich Mamma-Karzinom-Zellen zu steuern.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfasst daher das Folgende, und zwar allein oder in Kombination:
DNA-Konstrukt, enthaltend wenigstens ein therapeutisches Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms;
ein wie oben definiertes DNA-Konstrukt, wobei die regulatorische Sequenz die proximalen 445 bp des WAP-Promotors einschließlich der Transkriptionsinitiationsstelle enthält;
ein wie oben definiertes DNA-Konstrukt, wobei die regulatorische Sequenz das 320 bp XhoI/XbaI-Fragment der WAP-Promotorregion enthält;
ein wie oben definiertes DNA-Konstrukt, wobei die regulatorische Sequenz die U3- Region von MMTV ist;
ein wie oben definiertes DNA-Konstrukt, wobei die regulatorische Sequenz das 0,6 Kb PstI-MMTV-Promotorfragment enthält;
ein wie oben definiertes DNA-Konstrukt, bei dem es sich um einen rekombinanten Vektor, ausgewählt aus viralen und Plasmidvektoren, handelt;
ein wie oben definierter rekombinanter Vektor, wobei der virale Vektor aus RNA- und DNA viralen Vektoren und der Plasmidvektor aus eukaryonten Expressionsvektoren ausgewählt ist;
ein wie oben definierter rekombinanter Vektor, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor, ein rekombinanter Adenovirusvektor, ein rekombinanter Adeno-assoziierter Virusvektor oder ein rekombinanter Herpesvirusvektor ist;
ein wie oben definierter rekombinanter Vektor, wobei der retrovirale Vektor eine 5'LTR- Region der Struktur U3-R-U5, wenigstens eine kodierende Sequenz, die für ein therapeutisches Gen kodiert, und eine 3'LTR-Region, die einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R-Bereich und dem US-Bereich, umfasst, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker ersetzt wurde, der die WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, umfasst und wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle oder WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen steht;
ein wie oben definiertes Konstrukt, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus Antitumorgenen und Cytokingenen zur Behandlung des humanen Mammakarzinoms;
ein wie oben definiertes Konstrukt, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Proteine, wie Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Guaninphosporibosyltransferase (gpt), Cytochrom P 450, kodieren, Zellzyklus-regulatorischen Genen, die für Proteine, wie SDI, kodieren, Tumorsupressorgenen, die für Proteine, wie p53, kodieren, Antiproliferationsgenen, die für Proteine, wie Melittin, Cecropin, kodieren oder Cytokinen, wie IL-2;
rekombinantes retrovirales Partikel, hergestellt durch Kultivieren einer Verpackungszelllinie, die ein wie oben definiertes retrovirales Vektorkonstrukt und ein oder mehrere Konstrukt(e), die für die Proteine kodieren, die benötigt werden, damit das Genom des retroviralen Vektors verpackt wird, enthält, zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms;
retrovirales Provirus, das ein Konstrukt enthält, das wenigstens ein therapeutisches Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält und das in das humane Genom integriert ist;
ein wie oben definiertes retrovirales Provirus, umfassend einen 5'LTR-Bereich, umfassend einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R- und U5- Bereich, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker, der die WAP- oder MMTVregulatorischen Sequenzen enthält, ersetzt wurde; wenigstens eine kodierende Sequenz, die für ein therapeutisches Gen kodiert, und einen 3'LTR-Bereich, umfassend einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R- und U5-Bereich, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker, der die WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, ersetzt wurde, wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen steht;
Zelllinie, enthaltend ein wie oben definiertes Konstrukt für die Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms;
eine wie oben definierte Zelllinie, nämlich eine Verpackungszelllinie, die ein wie oben definiertes retrovirales Vektorkonstrukt und ein oder mehrere Konstrukt(e), die für die Proteine kodieren, die benötigt werden, damit der retrovirale Vektor verpackt wird, enthält;
humane Zelllinie, die ein wie oben definiertes retrovirales Provirus enthält;
in einer Kapsel eingeschlossene Zellen, umfassend einen Kern, der die wie oben definierten Zellen enthält, und eine poröse Kapselwand, die den Kern umgibt, wobei die poröse Kapselwand für das therapeutische Polypeptid oder die viralen Partikel, das/die von den Zellen produziert wird/werden, permeabel ist, zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms;
wie oben definierte, in einer Kapsel eingeschlossene Zellen, wobei die poröse Kapselwand aus einem Polyelektrolytkomplex besteht, der von Polyelektrolyten entgegengesetzter Ladung gebildet wird;
Verwendung eines wie oben definierten Konstrukts zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms;
wie oben definierte Verwendung eines rekombinanten viralen Partikels zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mammazellen, einschließlich des Mammakarzinoms;
wie oben definierte Verwendung von Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms;
pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms, enthaltend ein wie oben definiertes DNA-Konstrukt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel;
pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms, enthaltend ein wie oben definiertes rekombinantes retrovirales Partikel und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel;
pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms, enthaltend eine wie oben definierte Zelllinie und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel;
Verwendung der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen zur Expression damit verbundener therapeutischer Gene in humanen Mammazellen, einschließlich humaner Mamma- Karzinom-Zellen;
die wie oben definierte Verwendung, wobei die regulatorische Sequenz die proximalen 445 bp des WAP-Promotors, einschließlich der Transkriptionsinitiationsstelle umfasst;
die wie oben definierte Verwendung, wobei die regulatorische Sequenz das 320 bp XhoI/XbaI-Fragment der WAP-Promotorregion enthält;
die wie oben definierte Verwendung, wobei die regulatorische Sequenz die U3-Region des MMTV ist;
die wie oben definierte Verwendung, wobei die regulatorische Sequenz das 0,6 Kb PstI- MMTV-Promotorfragment enthält;
die wie oben definierte Verwendung, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus Antitumorgenen und Cytokingenen;
die wie oben definierte Verwendung, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Proteine, wie Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Guaninphosphoribosyltransferase (gpt), Cytochrom P 450, kodieren, Zellzyklus-regulatorischen Genen, die für Proteine, wie SDI, kodieren, Tumorsupressorgenen, die für Proteine, wie p53, kodieren, Antiproliferationsgenen, die für Proteine, wie z. B. Melittin, Cecropin, kodieren oder Cytokinen, wie IL-2;
die wie oben definierte Verwendung, wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV-regulatorischen Sequenzen Teil eines rekombinanten Vektors, ausgewählt aus viralen oder Plasmidvektoren, ist;
die wie oben definierte Verwendung, wobei der virale Vektor ausgewählt ist aus RNA- und DNA viralen Vektoren und der Plasmidvektor ausgewählt ist aus eukaryonten Expressionsvektoren;
die wie oben definierte Verwendung, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist; die wie oben definierte Verwendung, wobei der retrovirale Vektor eine 5'LTR-Region der Struktur U3-R-U5; wenigstens eine kodierende Sequenz, die für ein therapeutisches Gen kodiert; und eine 3'LTR-Region, die für einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R-Bereich und dem U5-Bereich, umfasst; wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker ersetzt wurde, der die WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, umfasst und wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen steht;
Verfahren zur Behandlung des humanen Mammakarzinoms, umfassend die Verabreichung eines wie oben definierten Konstrukts in einen Menschen, der der Behandlung bedarf;
Verfahren zur Behandlung des humanen Mammakarzinoms, umfassend die Verabreichung eines wie oben definierten viralen Partikels in einen Menschen, der der Behandlung bedarf;
Verfahren zur Behandlung des humanen Mammakarzinoms, umfassend die Verabreichung der wie oben definierten Zellen in einen Menschen, der der Behandlung bedarf; und
Verfahren zur Behandlung des humanen Mammakarzinoms, umfassend das Implantieren der wie oben definierten eingekapselten Zellen in den Tumor oder nahe dem Tumor in einen Menschen, der der Behandlung bedarf.
Das therapeutische Gen ist vorzugsweise ausgewählt aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe bestehend aus Antitumorgenen und Cytokingenen.
Die therapeutischen Gene sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Proteine, wie z. B. Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Guaninphosphoribosyltransferase (gpt), Cytochrom P 450, kodieren, Zellzyklusregulatorischen Genen, wie z. B. SDI, oder Tumorsupressorgenen, die für Proteine, wie p53, kodieren, oder Antiproliferationsgenen, die für Proteine, wie z. B. Melittin, Cecropin, kodieren, oder Cytokinen, wie z. B. IL-2.
Die Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase, die Cytosindesaminase, die Guaninphosphoribosyltransferase (gpt) und Cytochrom P 450 können bei der Krebsbehandlung in Kombination mit einem Prodrug (Vorläufer-Arzneimittel), das durch dieses Enzyme in seine toxische Form umgewandelt wird, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte können auch ein Markergen tragen. Die Markergene sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von Markergenen, die für Proteine, wie z. B. β-Galactosidase, Neomycin, Alkoholdehydrogenase, Luziferase, Puromycin, Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), Hygromycin, sekretierte alkalische Phosphatase oder grün- oder blau-fluoreszierende Proteine, kodieren.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise gefunden, dass die WAP- und MMTV- regulatorischen Sequenzen in der Lage sind, die Expression eines damit verbundenen heterologen Gens in primären humanen Mammazellen, einschließlich humaner Mamma-Karzinom-Zellen, zu steuern.
Es ist gut bekannt, dass die Whey Acidic Protein(WAP)-Genexpression auf trächtige oder milchbildende Brustdrüsen von Nagetieren gerichtet ist (Günzburg et al., 1991, Henninghausen, 1992). Die WAP-Genexpression wird sowohl durch hormonabhängige als auch hormonunabhängige Mechanismen gesteuert. Ein negatives regulatorisches Element (NRE) im WAP-Promotor interagiert mit einem NRE-Bindungsfaktor, NBF, der in allen Zellen vorhanden ist, die nicht in der Lage sind, WAP zu exprimieren (Kolb et al. 1995). Es scheint, dass der Bereich des WAP-Promotors, der dazu benötigt wird, damit die Mammadrüsenspezifität vermittelt wird, ein 320 bp XhoI/XbaI-Restriktionsfragment (-413 bis -93) (Kolb et al., 1995) ist. Zusätzlich zeigen bestimmte Exprimente, dass die Bindungsstellen für NBF auf einem 0,6 Kb PstI- MMTV-Promotorfragment vorhanden sind (in Salmons et al., 1985, beschrieben) und bei der Regulation der Brustdrüsenspezifität der Expression von MMTV eine Rolle spielen (Kolb et al., 1995).
Die Tatsache, dass sowohl WAP als auch MMTV vom Nagersystem abgeleitet sind, kann zu einem wichtigen Sicherheitsmerkmal werden, da die Verwendung von humanen regulatorischen Sequenzen in einem retroviralen Vektor die homologe Rekombination zwischen den Sequenzen, die im Vektor enthalten sind, und den entsprechenden zellulären Sequenzen erleichtern könnte, was zu einer Genominstabilität führen könnte.
Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte, die ein therapeutisches Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthalten, können in Zellen unter Verwendung eines jeglichen bekannten Verfahrens zur Einführung von Genen in Zellen eingeführt werden, einschließlich durch Calciumphosphat-Präzipitation (Graham et al., 1973, Wigler et al., 1979), durch Elektroporation (Neumann et al., 1982), durch Mikroinjektion (Graessman et al., 1983), mit Hilfe von Liposomen (Straubinger et al., 1983), mit Hilfe von Sphäroblasten (Schaffner, 1980) oder mit anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte, die ein therapeutisches Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV-regulatorischen Sequenzen enthalten, werden vorzugsweise in Zellen unter Verwendung eines rekombinanten viralen Vektors eingeführt. Derartige Vektoren sind dem Fachmann bekannt und enthalten retrovirale Vektore, rekombinante Adenoviren und rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (Günzburg und Salmons, 1995) wie auch Herpesvirus-Vektoren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße DNA- Konstrukt ein modizierter retroviraler Vektor, der verwendet wird, um das therapeutische Gen in Zellen einzuführen, vorzugsweise in vivo. Der große Vorteil eines retroviralen Systems ist, dass Retroviren lediglich sich teilende Zellen infizieren können (insbesondere sich schnell teilende Zellen, wie z. B. Tumorzellen) und dass die Viruspartikel im Blutstrom ähnlich den metastasierenden Tumorzellen verbreitet werden, wodurch es möglich wird, Mikrometastasen zu eliminieren, lange bevor sie durch konventionelle Verfahren nachweisbar sind.
Retrovirale Vektoren bestehend aus zwei Komponenten:
1) der retrovirale Vektor selbst ist ein modifiziertes Retrovirus (Vektorplasmid), bei dem die Gene, die für die viralen Proteine kodieren, durch therapeutische Gene und/oder Markergene, die in die Zielzelle eingeführt werden sollen, ersetzt wurden. Da der Austausch der Gene, die für die viralen Proteine kodieren, in effektiver Weise das Virus inaktivieren, muss es durch einen zweiten Bestandteil des Systems, der dem modifizierten Retrovirus die fehlenden viralen Proteine bereitstellt, komplementiert werden.
Der zweite Bestandteil ist:
2) eine Zelllinie, die große Mengen der viralen Proteine bildet, der jedoch die Fähigkeit fehlt, replikationskompetentes Virus zu erzeugen. Diese Zelllinie ist als Verpackungszelllinie bekannt und besteht aus einer Zelllinie, die mit einem oder mehreren Plasmiden, die die Gene tragen, die es möglich machen, dass der modifizierte retrovirale Vektor verpackt wird, transfiziert wurde.
Um den verpackten Vektor zu erzeugen, wird das Vektorplasmid in die Verpackungszelllinie transfiziert. Unter diesen Bedingungen wird das modifizierte retrovirale Genom, einschließlich der insertierten therapeutischen und Markergenen, vom Vektorplasmid transkribiert und in die modifizierten retroviralen Partikel (rekombinante Viruspartikel) verpackt. Dieses rekombinante Virus wird dann verwendet, um Zielzellen zu infizieren, in denen das Vektorgenom und jegliche im Vektor enthaltenen Markergene oder therapeutischen Gene in die DNA der Zielzelle integrieren. Eine Zelle, die mit einem derartigen rekombinanten Viruspartikel infiziert wurde, kann kein neues Vektorvirus bilden, da in diesen Zellen keine viralen Proteine vorhanden sind. Die DNA des Vektors, der die therapeutischen Gene und Markergene enthält, wird jedoch in die DNA der Zelle als Provirus integriert und kann nun in den infizierten Zellen exprimiert werden.
Die WO-A1-9607748 beschreibt das Prinzip und die Konstruktion eines neuen Typs eines retroviralen Vektors, den ProCon-Vektor:
Das retrovirale Genom besteht aus einem RNA-Molekül der Struktur R-U5-gag-pol-env- U3-R. Im Zuge der reversen Transkription wird der U5-Bereich verdoppelt und an das rechte Ende des erzeugten DNA-Molekül gebracht, wohingegen der U3-Bereich verdoppelt wird und an das linke Ende des erzeugten DNA-Moleküls gebracht wird. Die entstandene terminale Struktur U3-R-U5 wird LTR (Lange Terminale Repetition) genannt und ist somit an beiden Enden der DNA-Struktur oder des Provirus identisch und wiederholt (Varmus, 1988). Der U3-Bereich am linken Ende des Provirus enthält den Promotor, der verwendet wird, um die Expression zu steuern, nachdem die Infektion stattgefunden hat. Dieser Promotor steuert die Synthese eines RNA-Transkripts, das an der Grenze zwischen dem linken U3- und R-Bereich initiiert und das an der Grenze zwischen dem rechten R- und U5-Bereich terminiert wird. Diese RNA wird in retrovirale Partikel verpackt und in die zu infizierende Zielzelle transportiert. In der Zielzelle wird das RNA-Genom revers transkribiert, wie oben beschrieben.
Beim ProCon-Vektorplasmid ist die rechte (3') U3-Region verändert, die normale linke (5') U3-Struktur ist jedoch beibehalten; der Vektor kann in normaler Weise unter Verwendung des normalen retroviralen Promotors, der sich im linken (5') U3-Bereich befindet, nach seiner Einführung in Verpackungszellen, in RNA transkribiert werden. Die erzeugte RNA wird jedoch lediglich die veränderte rechte (3') U3-Struktur enthalten. In der infizierten Zielzelle wird nach der reversen Transkription diese veränderte U3-Struktur in beiden langen terminalen Repetitionen an beiden Enden der retroviralen Struktur vorhanden sein.
Enthält der veränderte Bereich anstelle des U3-Bereichs einen Polylinker, dann kann jeder Promotor, einschließlich der Promotoren, die eine gewebsspezifische Expression steuern, wie z. B. die WAP-regulatorischen Sequenzen, in einfacher Weise eingeführt werden. Dieser Promotor kann dann ausschließlich in den Zielzellen für die Expression von damit verbundenen Genen, die in dem retroviralen Vektor enthalten sind, verwendet werden. Zusätzlich können zum Zwecke eines "Gentargetings" durch homologe Rekombination DNA-Segmente, die zu einer oder mehreren zellulären Sequenzen homolog sind, in den Polylinker insertiert werden.
Die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren müssen nicht vom ProCon-Typ sein, sondern es kann sich dabei um jeden konventionellen retroviralen Vektor handeln, der therapeutische Gene unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält.
Derartige Vektoren beinhalten Selbst-Inaktivierende-Vektoren (SIN), bei denen die retroviralen Promotoren in der Zielzelle funktionell inaktiviert werden (WO-A1-94/29437). Weitere Modifikationen dieser Vektoren beinhalten die Insertion von Promotorgenkassetten in die LTR- Region, um Vektoren vom Doppelkopientyp ("double copy vectors") zu erzeugen (WO-A1- 89/11539). Bei beiden Vektortypen sind die heterologen Promotoren, die entweder im Vektorkernbereich oder im LTR-Bereich insertiert sind, direkt mit dem therapeutischen Gen verbunden.
Der erfindungsgemäße Vektor ist vorzugsweise ein retroviraler Vektor, wobei die WAP- oder MMTV-Promotoren als interne Promotoren verwendet werden, d. h. z. B. LTR-neo-WAP- tk-LTR; der erfindungsgemäß am meisten bevorzugte Vektor ist jedoch vom ProCon-Typ.
Der retrovirale Vektor basiert vorzugsweise entweder auf einem BAG-Vektor (Price et al., 1987) oder einem LXSN-Vektor (Miller und Rosman, 1989) oder Derivaten davon.
Retrovirale Partikel können durch Einführen eines viralen Vektorkonstrukts in eine Verpackungszelle eingeführt werden, die die Elemente enthält, die dem Vektorkonstrukt fehlen (z. B. gag, pol und env) und die für die Produktion infektiöser Retroviren notwendig sind.
Die Verpackungszelllinie kann ausgewählt sein aus einem Element der Gruppe bestehend aus psi-2 (Mann et al., 1983), pri-Crip (Danos und Mulligan, 1988), psi-AM (Cone und Mulligan, 1984); GP+E-86 (Markowitz et al., 1988a), PA317 (Miller und Buttimore, 1986), GP+envAM-12 (Markowitz et al., 1988b), Bosc 23, Bing (Pear et al., 1993) oder FLYA13, FLYRD18 (Casset et al., 1995) oder irgendeiner dieser Zellen, die mit rekombinanten Konstrukten transfiziert sind, die die Expression von Oberflächenproteinen anderer umhüllter Viren ermöglichen. Solche pseudotypisierten retroviralen Partikel sind in der PCT/EP96/01348 beschrieben.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Verpackungszelllinie aus humanen Zellen, z. B. HT1080-Zellen (WO-A1-96/21014), 293 (Graham et al., 1977) oder Nerzzelllinien hergestellt, wodurch es möglich wird, rekombinante Retroviren zu produzieren, die eine Inaktivierung durch humanes Serum überleben.
Erfindungsgemäß wird der Begriff "Polylinker" für eine kurze Reihe artifiziell synthetisierter DNA verwendet, die nur einmal vorkommende Restriktionsspaltstellen enthält, was die einfache Insertion eines jeglichen Promotors oder DNA-Segments erlaubt.
Der Begriff "heterolog" wird für jegliche Kombination von DNA-Sequenzen verwendet, die nicht normalerweise in engem Kontakt in der Natur vorkommen.

Konservierung und Verabreichung viraler Partikel

Gereinigtes oder konzentriertes rekombinantes Retrovirus kann dadurch konserviert werden, dass zuerst eine ausreichende Menge eines Formulierungspuffers dem Medium zugesetzt wird, das das rekombinante Retrovirus enthält, um eine wässrige Suspension zu erzeugen. Der Formulierungspuffer ist eine wässrige Lösung, die ein Saccharid, ein strukturelles Additiv mit hohem Molekulargewicht und einen Pufferbestandteil in Wasser enthält. Die wässrige Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten.
Das rekombinante Retrovirus kann auch in einer gereinigten Form konserviert werden. Insbesondere wird vor dem Zusatz des Formulierungspuffers das oben beschriebene Rohprodukt, nämlich das rekombinante Retrovirus, dadurch geklärt, dass es über einen Filter geleitet wird; es wird dann z. B. durch ein Cross-flow-Konzentrierungssystem konzentriert (Filtron Technology Corp., Nortborough, MA). Gemäß einer Ausführungsform wird dem Konzentrat DNase zugesetzt, um exogene DNA zu spalten. Das Produkt dieser Spaltungsreaktion wird dann diafiltriert, um überschüssige Medienbestandteile zu entfernen und um das rekombinante Retrovirus in einer wünschenswerteren gepufferten Lösung bereitzustellen. Das Diafiltrat wird dann über eine Sephadex S-500 Gelsäule geleitet und das gereinigte rekombinante Retrovirus wird eluiert. Eine ausreichende Menge eines Formulierungspuffers wird diesem Eluat zugesetzt, um eine gewünschte Endkonzentration der Bestandteile zu erreichen und um das rekombinante Retrovirus in minimalster Weise zu verdünnen, und die wässrige Lösung wird dann vorzugsweise bei -70ºC gelagert oder aber sofort getrocknet. Wie oben festgehalten, ist der Formulierungspuffer eine wässrige Lösung, die ein Saccharid, ein strukturelles Additiv mit hohem Molekulargewicht und einen Pufferbestandteil in Wasser enthält. Die wässrige Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten.
Das Rohprodukt, nämlich das rekombinante Retrovirus, kann auch durch Ionenaustauschsäulenchromatographie gereinigt werden. Im Allgemeinen wird das Rohprodukt, nämlich das rekombinante Retrovirus, durch Leiten über einen Filter geklärt und das Filtrat wird auf eine Säule aufgebracht, die eine hochgradig sulfonierte Cellulosematrix enthält. Das rekombinante Retrovirus wird von der Säule in gereinigter Form durch Verwendung eines Hochsalzpuffers eluiert. Der Hochsalzpuffer wird dann gegen einen wünschenswerteren Puffer dadurch ausgetauscht, dass das Eluat über eine Molekülausschlusssäule geleitet wird. Eine ausreichende Menge eines Formulierungspuffers wird dann wie oben diskutiert dem gereinigten rekombinanten Retrovirus zugesetzt und die wässrige Suspension wird entweder sofort getrocknet oder vorzugsweise bei -70ºC gelagert.
Die wässrige Suspension in roher oder gereinigter Form kann durch Lyophilisierung oder Eindampfen bei Raumtemperatur getrocknet werden. Insbesondere beinhaltet die Lyophilisierung die Schritte der Abkühlung der wässrigen Suspension unterhalb der Glasübergangstemperatur oder unterhalb der Temperatur des eutektischen Punkts der wässrigen Suspension und das Entfernen von Wasser aus der abgekühlten Suspension durch Sublimieren unter Bildung eines lyophilisierten Retrovirus. Sobald das Lyophilisieren abgeschlossen ist, ist das rekombinante Retrovirus stabil und kann wie unten detaillierter diskutiert bei -20ºC bis 25ºC gelagert werden.
Bei dem Eindampfungsverfahren wird Wasser aus der wässrigen Lösung bei Raumtemperatur durch Eindampfen entfernt. Wasser kann auch durch Sprühtrocknung entfernt werden.
Die wässrige Lösung, die wie zuvor beschrieben zur Formulierung verwendet wird, enthält ein Saccharid, ein strukturelles Additiv mit hohem Molekulargewicht, einen Pufferbestandteil und Wasser. Die Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten. Die Kombination dieser Bestandteile bewirkt die Konservierung der Aktivität des rekombinanten Retrovirus während des Frierens und Lyophilisierens oder während des Trocknens mittels Evaporation.
Das strukturelle Additiv mit hohem Molekulargewicht ist hilfreich, die virale Aggregation während des Frierens zu verhindern und stellt einen strukturellen Träger im lyophilisierten oder getrockneten Zustand dar. Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden strukturelle Additive als strukturelle Additive mit "hohem Molekulargewicht" bezeichnet, wenn ihr Molekulargewicht größer als 5000 ist. Ein bevorzugtes strukturelles Additiv mit hohem Molekulargewicht ist humanes Serumalbumin.
Falls vorhanden, wirken die Aminosäuren dahingehend, die virale Infektiosität während des Kühlens und Tauens der wässrigen Lösung weiter zu konservieren. Weiterhin wirken Aminosäuren dahingehend, dass sie die virale Infektiosität während des Sublimierens der gekühlten wässrigen Lösung und während des lyophilisierten Zustands weiter konservieren.
Der Pufferbestandteil wirkt dahingehend, dass die Lösung durch Aufrechterhalten eines relativ konstanten pH-Wertes gepuffert wird. Es kann in Abhängigkeit des gewünschten pH- Bereichs, der vorzugsweise zwischen 7,0 und 7,8 liegt, eine Verschiedenheit von Puffern verwendet werden.
Wässrige Lösungen zur Formulierung rekombinanten Retroviren sind im Detail in der WO-A2-96/121014 beschrieben.
Zusätzlich ist es bevorzugt, dass die wässrige Lösung ein neutrales Salz enthält, das verwendet wird, um das letztlich formulierte rekombinante Retrovirus auf eine geeignete isoosmotische Salzkonzentration einzustellen.
Lyophilisiertes oder dehydriertes Retrovirus kann unter Verwendung einer Verschiedenheit von Substanzen rekonstituiert werden, vorzugsweise wird jedoch unter Verwendung von Wasser rekonstituiert. In bestimmten Fällen kann auch eine verdünnte Salzlösung verwendet werden, die die Endformulierung auf eine Isotonizität einstellt. Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, wässrige Lösungen zu verwenden, von denen bekannt ist, dass sie die Aktivität des rekonstituierten Provirus steigern. Derartige Bestandteile beinhalten Cytokine, wie z. B. IL-2, Polykatione, wie z. B. Protaminsulfat, oder andere Bestandteile, die die Transduktionseffizienz des rekonstituierten Retrovirus steigern. Lyophilisierte oder dehydratisierte rekombinante Retroviren können mit jeglichem geeigneten Volumen an Wasser oder des Rekonstitutionsmittels, das eine wesentliche und vorzugsweise vollständige Solubilisierung der lyophilisierten oder dehydratisierten Probe ermöglicht, rekonstituiert werden.
Rekombinante retrovirale Partikel können in eine Vielzahl von Orten, einschließlich z. B. Stellen wie Organe oder Tumorstellen, verabreicht werden. Gemäß anderer Ausführungsformen kann das rekombinante Retrovirus oral, intravenös, bukkal/sublingual, intraperitoneal oder subkutan verabreicht werden. Die Tagesdosis hängt von der genauen Verabreichungsart, der Verabreichungsform und der Indikation, für die die Verabreichung gemacht wurde, dem betreffenden Patienten und dem Körpergewicht des Patienten und weiterhin von den Präferenzen und der Erfahrung des behandelnden Arztes ab.
Die hier beschriebenen Verabreichungswege können einfach durch direkte Verabreichung unter Verwendung einer Nadel, eines Katheters oder einer ähnlichen Einrichtung bewerktstelligt werden. Gemäß bestimmter Ausführungsformen der Erfindung können insbesondere eine oder mehrere Dosierungen direkt verabreicht werden.
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine erfindungsgemäße Zelllinie, die entweder ein therapeutisches Polypeptid oder virale Partikel, die das therapeutische Gen unter transkriptionellen Kontrolle der WAP- oder MMTV-regulatorischen Sequenzen enthalten, billdet, in eine poröse Membran eingekapselt, die für das gebildete therapeutische Polypeptid oder die gebildeten viralen Partikel permeabel ist (siehe Stange et al., 1993, Dautzenberg et al., 1993, Merten et al., 1991 und U.K. Patentanmeldung 2 135 954).
Die erfindungsgemäßen eingekapselten Zellen können z. B. durch Suspension der Zellen in einer wässrigen Lösung eines Polyelektrolytes (z. B. ausgewählt aus Sulfatgruppenenthaltenden Polysacchariden oder Polysaccharidderivaten oder Sulfonatgruppen-enthaltenden synthetischen Polymeren) hergestellt werden, wonach die Suspension in der Form vorgebildeter Partikel in ein Präzipitationsbad eingeführt wird, das eine wässrige Lösung eines Polyelektrolyten entgegengesetzter Ladung enthält (wie z. B. ein Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen).
Sulfatgruppen-enthaltende Polysaccharide oder Polysaccharidderivate beinhalten Cellulosesulfat, Celluloseacetatsulfat, Carboxymethylcellulosesulfat, Dextransulfat oder Stärkesulfat in Form eines Salzes, insbesondere eines Natriumsalzes. Das Sulfonatgruppen-enthaltende synthetische Polymer kann ein Polystyrolsulfonatsalz sein, vorzugsweise ein Natriumsalz.
Polymere mit quaternären Ammoniumgruppen beinhalten Polydimethyldiallylammonium oder Polyvinylbenzyltrimethylammonium in der Form eines Salzes davon, vorzugsweise eines Chloridsalzes.
Solche Kapseln werden vorzugsweise durch Suspension der erfindungsgemäßen Zellen in einer Lösung, enthaltend 0,5 bis 50%, vorzugsweise 2 bis 5%, Natriumcellulosesulfat und 5% fötales Kälberserum, in PBS hergestellt. Diese Suspension wird dann durch ein Dispensierungssystem (z. B. ein Luftdüsensystem oder ein piezoelektronisches System) unter Rühren in ein Präzipitationsbad, enthaltend 0,5% bis 50%, vorzugsweise 2 bis 10%, oder am meisten bevorzugt 3% Polydimethyl-diallylammoniumchlorid in PBS eingetropft. Die Kapselbildung findet innerhalb von Millisekunden statt und die Kapsel-enthaltenden Zellen werden in dem Präzipitationsbad während 30 Sekunden bis 5 Minuten gehalten und dann gewaschen. Die Geschwindigkeit dieses Verfahrens stellt sicher, dass die Zellen nicht übermäßig während des ganzen Verfahrens gestresst werden (Stange et al., 1993).
Die eingekapselten Zellen können in normalem Zellkulturmedium kultiviert werden (dessen Art von den eingekapselten Zellen abhängt) und zwar unter Standardbedingungen in Bezug auf die Feuchtigkeit, die Temperatur und die CO&sub2;-Konzentration. Während dieser Kulturperiode kann die Bildung therapeutischer Polypeptide und viraler Partikel von den Kapseln in das Zellkulturmedium gezeigt werden. Die Bildung viraler Partikel kann unter Verwendung der RT-PCR- Technologie oder durch Transfer von zellfreien (0,45 um Filtrat) Überstand auf Zielzellen, gefolgt von dem Nachweis der viralen Infektion mittels eines Assays für die Aktivität von Markerproteinen, die von den Genen kodiert werden, die im viralen Vektorkonstrukt enthalten sind, das im viralen Vektor enthalten ist, gezeigt werden. Ist das Markergen, das im viralen Vektor enthalten ist, ein Gen, das eine Resistenz gegenüber einem spezifischen Bestandteil in der Zielzelle verleiht, oder ein Produkt, das einfach in der Zelle nachgewiesen werden kann, z. B. ein grün oder blau fluoreszierendes Protein, kann der durch das System gebildete Virustiter sichergestellt werden.
Nach einem geeigneten Kulturzeitraum (normalerweise nicht weniger als 1 Stunde und nicht mehr als 30 Tage) können die Zellen-enthaltenden Kapseln entweder chirurgisch direkt oder durch Injektion unter Verwendung einer Spritze in verschiedene Bereiche des Körpers einschließlich der Brust implantiert werden.

Zeichnungen

Fig. 1: Primer A, B und C, die für die Deletion des U3-Bereichs von MLV und für die Insertion des SacII-Mlu-Polylinkers an dessen Stelle verwendet wurden.
Fig. 2: Herstellung des Plamids pSmaU3del.
Fig. 3: Herstellung der Plasmide pBAGNU3del und pCON6
Fig. 4: Herstellung des Plasmids pMMTV-BAG.
Fig. 5: Die Primer D und E, die für die Amplifikation der U3-Region des MMTV verwendet werden.
Fig. 6: Plasmid pMMTV-BAG.
Fig. 7: Primer F und G, die für die Amplifikation einer Sequenz, enthaltend die proximalen 445 bp des WAP-Promotors und die ersten 143 bp des humanen Wachstumshormons, verwendet werden.
Fig. 8: Herstellung des Plasmids pWAP-BAG.
Fig. 9: Plasmid pWAP-BAG.
Fig. 10: β-Gal-Expression von Vektorkonstrukten nach Injektion von primären humanen Brustdrüsenzellen.
Die folgenden Beispiele werden die Erfindung weiter darstellen. Das Beispiel dient jedoch in keinster Weise dazu, den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu beschränken, da offensichtliche Modifikationen offensichtlich werden und dem Fachmann weitere Modifikationen und Substitutionen sofort offensichtlich werden.
Die rekombinanten DNA-Verfahren, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind und die im Detail z. B. in "Molecular Cloning" (Sambrook et al., 1989) und in "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal, 1984) beschrieben sind.

Beispiel 1

Deletion des U3-Bereichs und Insertion eines Polylinkers

In dem als BAG bekannten murinen Leukämievirus(MLV)-retroviralen Vektor (Price et al., 1987) wird das β-Galactosidasegen durch den ubiquitären (d. h. nicht gewebsspezifischen) MLV-Promotor im U3-Bereich des LTR gesteuert. Erfindungsgemäß wurde ein BAG- Vektorderivat konstruiert, in dem der MLV-Promotor (U3), der im 3'LTR lokalisiert ist, mit Ausnahme der invertierten Repetitionen durch PCR deletiert und durch einen Polylinker ersetzt wurde. Der BAG-Vektor, dem der U3-Bereich fehlt, wird nach Einführen in eine Verpackungszelllinie vom MLV-Promotor (U3) im 5'LTR exprimiert. Als Folge der Umstrukturierungen, die nach der Infektion von Zielzellen im retroviralen Genom während seines Lebenzyklusses stattfinden, wird der Polylinker an beiden Enden des retroviralen Genoms, wie in der WO-A1- 96/07748 beschrieben, verdoppelt. Dadurch kann ein retroviraler Vektor konstruiert werden, bei dem die Expression des β-Galactosidasegens von BAG durch jeglichen heterologen Promotor, der in den Polylinker insertiert wurde, kontrolliert wird.
Als Matrize für die PCR wurde pBAGN verwendet, ein Plasmid, das ein Derivat des BAG-Konstruktes ist und das lediglich einen LTR enthält und das durch eine NheI-Spaltung des ursprünglichen pBAG, gefolgt von einer Selbstligation des 7018bp-Fragments, erzeugt wurde.
Das 3'-Ende des Primers A ist komplementär zum R-Bereich des LTR (Fig. 1). Die 5'- Extension enthält einen künstlichen (art.) Polylinker und eine künstliche invertierte Repetition (IR(art.)). Der Primer B ist komplementär zum U5-Bereich des LTR (Fig. 1). Nach 35 Zyklen mit einer Annealing-Temperatur von 47ºC und einer Extension bei 60ºC wurde ein 140bp- Produkt erhalten, das als Matrize für die zweite PCR verwendet wurde. Bei dieser Reaktion wurde eine ClaI-Spaltstelle und eine künstliche (+)PBS dem 5'Ende der IR-Region unter Verwendung des Primers C (Fig. 1) in Kombination mit dem Primer B zugefügt. Die Hybridisierung wurde bei 53ºC durchgeführt und die Extension bei 72ºC. Nach 35 Zyklen wurden ein 163bp-Produkt erhalten, das mit ClaI und SmaI gespalten wurde und mit einem 2722bp- ClaI/SmaI-Fragment von pSmaI ligiert wurde (Fig. 2). Das entstandene Plasmid pSmaU3del (2792bp) wurde durch eine SmaI-Spaltung linearisiert und mit einem 3677bp-SmaI-Fragment von pBAGN (Fig. 3) ligiert, um das Plasmid pBAGNU3del (6469bp) zu erzeugen. Die Deletion der U3-Region wurde durch Sequenzierung von der ClaI-Stelle in die U5-Region unter Verwendung von pSmaU3del als Matrize bestätigt.
Ein ClaI/SpeI(322bp)-Fragment, das die U3-deletierte LTR enthält, wurde mit einem ClaI/NheI-Fragment von pBAGNB (erzeugt durch Selbstligation eines 3946bp-Fragments von pBAGN) ligiert, um das Plasmid pCON6 (4097bp) (Fig. 3) zu erzeugen. Dieses Plasmid, das einen vollständigen U3-minus retroviralen Vektor enthält, wurde als Basis für die weitere Klonierung verwendet.
Gemäß dem oben dargestellten Grundprinzip wurden die folgenden spezifischen Promotoren in den Polylinkerbereich des modifizierten BAG-Vektors insertiert.

Beispiel 2

Klonierung von pMMTVgal

Der Maus-Mamma-Tumor-Virus(MMTV)-U3-Bereich (mtv-2) ohne die invertierten Repetitionen enthält einen Bereich, der die Regulierbarkeit durch Glucocorticoidhormone vermittelt, und einen Bereich, der ein Element enthält, das die Expression auf Brustdrüsen richtet.
Der U3-Bereich von MMTV wurde durch PCR unter Verwendung des Plasmids pBG102 (ein Plasmid, das den 3'LTR von mtv 2 enthält) als Matrize mit den Primern D und E amplifiziert. Das 3'-Ende des Primers D ist komplementär zum 5'-Ende des MMTV-U3- Bereichs und enthält eine SacII-Stelle in seiner 5'-Extension (Fig. 5). Das 3-Ende des Primers E ist komplementär zum 3'-Ende des MMTV-U3-Bereichs und besitzt eine MluI-Stelle in seiner 5'-Extension (Fig. 5). Nach 35 Zyklen bei einer Hybridisierungstemperatur von 49ºC und einer Extensionstemperatur von 72ºC wurde ein 1229bp-Produkt erhalten; dieses wurde mit SacII und MluI gespalten und mit dem SacII/MluI-gespaltenen Vektor pCON6 ligiert. Das entstandene Plasmid p125.6 (530Sbp) (Fig. 4) wurde mit XbaI und HindIII gespalten und das 4187bp- Fragment wurde mit dem 4190bp-Fragment von pBAGN, das das β-Galactosidasegen enthält, ligiert, um das Plasmid pMMTV-BAG (8377bp) (Fig. 4) zu erzeugen, bei dem nach der Transfektion das β-Galactosidasegen unter der transkriptionellen Kontrolle des MLV-Promotors und nach der Infektion unter der transkriptionellen Kontrolle des MMTV-Promotors steht (Fig. 6).

Beispiel 3

Klonierung des Whey Acidic Protein(WAP)-Promotorbereichs, der die proximalen 445 bp des WAP-Promotors einschließlich der Transkriptionsinitiationsstelle enthält.

Ein Plasmid, pWAPBAG, das das β-Galactosidasegen unter der transkriptionellen Kontrolle der proximalen 445 Basenpaare des WAP-Promotors enthält, wurde durch Amplifikation einer Sequenz, umfassend die proximalen 445 bp des WAP-Promotors und die ersten 143 bp des humanen Wachstumshormons (HGH), hergestellt. Die Sequenzen wurden von pWAP2- HGH (Günzburg et al., 1991) durch PCR unter Verwendung der Primer F und G (Fig. 7) amplifiziert. Beide Primer enthielten die SacII- und MluI-Erkennungsstellen als terminale Sequenzen. Das amplifizierte 606 bp-Produkt und pCON6 wurden mit SacII und MluI gespalten und das 4094 bp-Fragment des Vektors wie auch das PCR-Produkt wurden miteinander ligiert, um pWAP.6 zu erzeugen. Das β-Galactosidase(β-gal)-Gen von E. coli wurde in den entstandenen Vektor pWAP.6 (4687 bp) (Fig. 8) kloniert: pWAP.6 wie auch pBAGN wurden mit BamHI gespalten und das linearisierte Vektorfragment und das 3072 bp β-gal-Fragment von pBAGN wurden miteinander ligiert. Das entstandene Plasmid war pWAPBAG (Fig. 9), ein ProCon- Vektor, bei dem die 3' 445 bp, die das WAP-NRE enthalten, wie auch die 5' 143 bp der HGH- kodierenden Sequenz anstelle des U3-Bereichs in den 3'LTR insertiert wurden.

Beispiel 4

Die Kontrolle der β-Galactosidasegen-Expression unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP- und MMTV-Promotoren, die in den Polylinker insertiert wurden, wurde durch Infektionsuntersuchungen unter Verwendung der konstruierten MMTV- und WAP-retroviralen Vektoren durch Infektion der verschiedenen Zellen validiert.
Zur Herstellung von retroviralen Vektorpartikeln wurden die MMTV- und WAP- ProCon-Vektoren in die Verpackungszelllinie PA317 (Miller und Buttimore, 1986) transfiziert. Nach der Selektion auf Neomycinresistenz, die von dem Vektor kodiert wird, wurden stabile Populationen und Klone der rekombinanten ProCon-Virus-produzierenden Zellen erhalten. Virusenthaltender Überstand aus diesen Populationen wurde verwendet, um explantiertes normales primäres humanes Mammagewebe, das aus Brustverkleinerungsoperationen erhalten wurde, zu infizieren. Da bekannt ist, dass die WAP- und MMTV-Promotoren auf Schwangerschaftshormone reagieren, wurde das Gewebe in Gegenwart von 10&supmin;&sup6; M Dexamethason, Insulin (1 ug/ml), EGF (5 ng/ml) und Cortison (0,1 g/ml) kultiviert. Die Expression des Markergens wurde durch einen quantitativen β-gal-Assay bestimmt, der auf dem Nachweis von β- Galactosidaseaktivität durch Chemilumineszens basiert.
β-gal-Assay:
Der Spiegel der β-Galactosidaseaktivität wurde unter Verwendung des Tropix Kits gemäß den Angaben des Herstellers bestimmt. Die Zellen wurden trypsiniert, zweimal mit PBS gewaschen und lysiert. Die Proteinkonzentration wurde mittels eines modifizierten Lowry- Verfahrens (BioRad DC-Proteinassay) bestimmt. Für den β-gal-Assay wurden 5 und 10 ug Protein verwendet. Der Kit verwendet ein Substrat, das von dem Enzym gespalten wird, und somit ist die Menge der Enzymaktivität proportional zur Menge des gebildeten Lichts. Die Expression wurde durch Messung der Chemilumineszens in einem Berthold AutoLumat 953 (EG+G Berthold) quantifiziert.
Der Nachweis infizierter Zellen durch histochemische Färbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Cepko, 1989). Kurz zusammengefasst, wurden die Zellen mit gekühltem PBS gewaschen und dann mit einer 2% Paraformaldehyd-Lösung während 20 min fixiert. Nach extensivem Waschen mit PBS wurden die Zellen für wenigstens 2 Stunden bei 37ºC in einer Lösung inkubiert, die das Substrat X-gal enthält (20mM K&sub3;FeCN&sub6;, 20mM K&sub4;FeCN&sub6;·3H&sub2;O, 2mM MgCl&sub2; und 1mg/ml X-gal).
In allen Experimenten wurde der ursprüngliche, nicht gewebsspezifische BAG-Vektor als Positivkontrolle verwendet. Nach Infektion von normalen primären humanen Brustdrüsenzellen mit BAG, WAPBAG und MMTVBAG zeigten Proben β-Galactosidaseexpression (Fig. 10) in drei unabhängigen Experimenten. Es wurde somit zum ersten Mal gezeigt, dass die WAP- regulatorischen Elemente wie auch die MMTV-U3-Region die Expression eines Gens in einem MLV-retroviralen Vektor in primären humanen Brustdrüsenzellen steuern kann.

Beispiel 5

Cytochrom P450 katalysiert die Hydroxylierung der allgemein verwendeten Krebs- Prodrugs Cyclophosphamid (CPA) und Ifosfamid in deren aktive toxische Formen. Normalerweise ist die Expression des endogenen Cytochrom P450-Gens des Patienten auf die Leber begrenzt und die Antitumorwirkungen von systemisch verabreichtem CPA hängen von der nachfolgenden systemischen Verteilung der toxischen Arzneimittelmetaboliten aus der Leber ab. Dies führte zu Toxizitätsproblemen, da das aktivierte Arzneimittel nicht nur auf den Tumor, sondern auch auf normales Patientengewebe, wie z. B. Knochenmark und Niere, einwirkt.
Ein therapeutischer Ansatz, bei dem das Cytochrom P450-Gen selektiv direkt in Tumorzellen eingeführt wird und in diesen Zellen überexprimiert wird, würde dieses Problem überwinden. Toxische Metaboliten, die von den transduzierten Tumorzellen gebildet werden, wirken auf die umgebenden nicht-transduzierten Tumorzellen in einer Konzentrationgradientenabhängigen Weise. Ein zusätzlicher Vorteil des Cytochrom P450/CPA-Systems ist das Fehlen einer Abhängigkeit von der Zellreplikation für cytotoxische Effekte auf die umgebenden Zellen. Dies deshalb, weil einer der erzeugten aktiven Metaboliten Zwischenstrang-Quervernetzungen unabhängig von der Zellzyklusphase erzeugt. Diese Zwischenstrang-Quervernetzungen führen später während der DNA-Synthese zum Zelltod.
Konstruktion eines retroviralen Vektors, der das Ratten-Cytochrom P450-Gen unter der Kontrolle der WAP-regulatorischen Sequenz enthält:
Um das Ratten-Cytochrom P450 2B1-Gen zu erhalten, wurden Zellen der Ratten- Hepatazom-Zelllinie HTC mit Lösung D (4M Guanidiniumthiocyanat, 25mM Natriumcitrat pH 7, 0,5% Natrium-N-Laurylsarcosin, 0,1M 2-Mercaptoethanol) lysiert und Gesamt-RNA wurde dadurch extrahiert, dass 1/15 Volumen 3M Natriumacetat, in gleichen Volumina wassergesättigtem Phenol und 1/5 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (49 : 1) zugesetzt wurden und das gesamte Gemisch heftig gemischt wurde. Nach 15 Minuten auf Eis wurde der Extrakt 20 min bei 4ºC bei 10.000 g zentrifugiert. Die RNA in der wässrigen Phase wurde mit 1 Volumenteil Isopropanol während 30 min bei -20ºC präzipitiert und bei 4ºC bei 10.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 70% Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur während 15 min belassen. Nach 5 min Zentrifugation bei 4ºC und 10.000 g wurde das Pellet in einem Vakuumtrockner getrocknet und in 0,5% SDS-Lösung aufgelöst.
Die extrahierte RNA wurde unter Verwendung des Protokolls für die cDNA-Synthese revers transkribiert (Pharmacia). Die entstandene DNA wurde als Matrize für die PCR verwendet. Die Primer wurden so gestaltet, dass sie eine BamHI-Spaltstelle (unterstrichen) im linksgerichteten Primer (z. B. 5'-AAGCCGGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3') und eine BamHI- Spaltstelle (untestrichen) im rechtsgerichteten Primer (z. B. 5'- CGATTAGGATCCCTGCCTCA-3') enthielten. Beide Primer wiesen zusätzliche Basen am 5'- Ende für eine erhöhte Effizienz der Spaltung durch das relevante Restriktionsenzym auf. Das 1562 bp-Produkt wurde mit BamHI gespalten und das enthaltene Fragment, das das Gen für P450 enthält, wurde in das BamHI-gespaltene Plasmid pWAP.6 ligiert (Beispiel 3).
Einen Tag vor der Lipofektion werden 3 · 10&sup5; retrovirale Verpackungszellen in 6 cm-Petri- oder -Kultur-Schalen ausgesät. Am Tag der Infektion werden 2 ug des Vektors, der für Cytochrom P450 unter transkriptioneller Kontrolle der WAP-regulatorischen Sequenz kodiert, mit 100 ul serumfreiem Medium gemischt. Parallel dazu werden 15 ul Lipofectamin (Gibco BRL) mit 100 ul serumfreiem Medium gemischt. Die Plasmid-enthaltende Lösung wird dem Lipofectamingemisch zugesetzt und es wird während 45 min inkubiert. Nach 35 min werden die Zellen einmal mit 2 ml serumfreiem Medium gewaschen. 800 ul serumfreies Medium werden dem Lipofektionsgemisch zugesetzt und das entstandene Gemisch von 1 ml wird auf die vorbereiteten Zellen gegeben. Nach 6 Stunden wird 1 ml Dulbeccos-modifiziertes Eagle-Medium, enthaltend 10% FCS, zugesetzt. Am nächsten Tag werden die Zellen trypsiniert und 1 : 10 verdünnt und auf einer 100 mm-Schale ausgesät. Nach 24 h wird das Medium durch Medium ersetzt, das das Neomycinanalogon G418 enthält. Einzelne Zellklone oder Zellpopulationen werden isoliert und im Hinblick auf die Expression von Cytochrom P450 analysiert.

Einkapseln von Zellen und Implantieren eingekapselter Zellen

Die Retrovirus-Vektor-produzierenden Verpackungszellen werden in 1 ml 0,5 bis 50%, jedoch vorzugsweise 2 bis 5%, anionische Polymer(z. B. Natriumcellulosesulfat)-Lösung, die zusätzlich 5% fötales Kälberserum enthält, suspendiert. Diese Suspension wird dann durch ein Dispensierungssystems (z. B. ein A-Jet-System oder ein piezoelektrisches System) in ein Präzipitationsbad, das ein gerührtes 0,5% bis 50% polymeres Polykation (z. B. Polydimethyldiallylammonium) enthält, eingetropft. Die Kapselbildung findet innerhalb von Millisekunden statt und die kapselenthaltenden Zellen werden im Präzipitationsbad während 30 Sekunden bis 5 Minuten gehalten und dann gewaschen. Die Geschwindigkeit dieses Verfahrens stellt sicher, dass die Zellen nicht in unzumutbarer Weise während des gesamten Verfahrens belastet werden (Stange et al., 1993).
Die Kapseln, die virale Partikel bilden, werden in einen Brusttumor implantiert oder um den Brusttumor herum in Kapseln implantiert, wobei eine kontinuierliche Freisetzung von Virus sichergestellt wird.
Alternativ dazu könnte das Virus durch multiple direkte Injektionen in den Brusttumor eingeführt werden. Die systemische oder lokale Verabreichung von Cyclophosphamid oder Ifosfamid wird zur lokalen Konversion dieser Komponenten in ihre toxischen Formen führen, was zu einer Zerstörung von Tumorzellen führt.

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Claims

1. DNA-Konstrukt, enthaltend wenigstens ein therapeutisches Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mammakarzinomes.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die regulatorische Sequenz die proximalen 445 Bp des WAP-Promotors einschließlich der Transkriptionsinitiationsstelle enthält.

3. DNA-Konstrukt nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die regulatorische Sequenz das 320 Bp XhoI/XbaI Fragment der WAP-Promotorregion enthält.

4. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die regulatorische Sequenz die U3-Region von MMTV ist.

5. DNA-Konstrukt nach den Ansprüchen 1 und 4, wobei die regulatorische Sequenz das 0,6 kb PstI MMTV-Promotorfragment enthält.

6. DNA-Konstrukt nach den Ansprüchen I bis 5, bei dem es sich um einen rekombinanten Vektor, ausgewählt aus viralen und Plasmid-Vektoren, handelt.

7. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 6, wobei der virale Vektor aus RNA und DNA viralen Vektoren und der Plasmidvektor aus eukaryontischen Expressionsvektoren ausgewählt ist.

8. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 7, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor, ein rekombinanter Adenovirusvektor, ein rekombinanter Adeno-Assoziierter-Virusvektor oder ein rekombinanter Herpesvirusvektor ist.

9. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8, wobei der retrovirale Vektor eine 5'LTR Region der Struktur U3-R-U5, wenigstens eine kodierende Sequenz, die für ein therapeutisches Gen kodiert, und eine 3'LTR Region, die einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R-Bereich und dem US-Bereich, umfaßt, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker ersetzt wurde, der die WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, umfaßt, und wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen steht.

10. Konstrukt nach den Ansprüchen 1 bis 9, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus anti-Tumorgenen und Zytokingenen, zur Behandlung des humanen Mamma-Karzinoms.

11. Konstrukt nach Anspruch 10, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Proteine, wie Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Guaninphosphoribosyltransferase (gpt), Cytochrom P 450 kodieren, Zellzyklus-regulatorischen Genen, die für Proteine wie SDI kodieren, Tumorsuppressorgenen, die für Proteine wie p53 kodieren, Antiproliferationsgenen, die für Proteine wie Melittin, Cecropin kodieren, oder Cytokinen wie IL-2.

12. Rekombinantes retrovirales Partikel, hergestellt durch Kultivieren einer Verpackungszellinie, die ein retrovirales Vektorkonstrukt nach den Ansprüchen 8 bis 9 und ein oder mehrere Konstrukt(e), die für die Proteine kodieren, die benötigt werden, damit das Genom des retroviralen Vektors verpackt wird, enthält, zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen humaner Mammazellen, einschließlich des humanen Mammakarzinoms.

13. Retrovirales Provirus, das ein Konstrukt enthält, das wenigstens ein therapeutisches Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, und das in das humane Genom integriert ist.

14. Retrovirales Provirus nach Anspruch 13, umfassend einen 5'LTR Bereich, umfassend einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R- und US-Bereich, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker, der die WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, ersetzt wurde; wenigstens eine kodierende Sequenz, die für ein therapeutisches Gen kodiert; und einen 3'LTR Bereich, umfassend einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R- und U5-Bereich, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker, der die WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, ersetzt wurde, wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP und MMTV regulatorischen Sequenzen steht.

15. Zellinie enthaltend ein Konstrukt nach den Ansprüchen 1 bis 11 zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms.

16. Zellinie nach Anspruch 15, nämlich eine Verpackungszellinie, die ein retrovirales Vektorkonstrukt nach den Ansprüchen 8 bis 9 und ein oder mehrere Konstrukt(e), die für die Proteine kodieren, die benötigt werden, damit der retrovirale Vektor verpackt wird, enthält.

17. Humane Zellinie, die ein retrovirales Provirus nach den Ansprüchen 13 bis 14 enthält.

18. In einer Kapsel eingeschlossene Zellen, umfassend einen Kern, der Zellen nach den Ansprüchen 15 bis 17 enthält, und eine poröse Kapselwand, die den Kern umgibt, wobei die poröse Kapselwand für das therapeutische Polypeptid oder die viralen Partikel, das/die von den Zellen produziert wird/werden, permeabel ist, zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms.

19. In einer Kapsel eingeschlossene Zellen nach Anspruch 18, wobei die poröse Kapselwand aus einem Polyelektrolyt-Komplex besteht, der von Polyelektrolyten entgegengesetzter Ladung gebildet wird.

20. Verwendung eines Konstruktes nach den Ansprüchen 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms.

21. Verwendung eines rekombinanten viralen Partikels nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma- Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms.

22. Verwendung von Zellen nach den Ansprüchen 15 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung oder Erkrankung humaner Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms, enthaltend ein DNA-Konstrukt nach den Ansprüchen 1 bis 11 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms, enthaltend ein rekombinantes retrovirales Partikel nach Anspruch 12 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen von humanen Mamma-Zellen, einschließlich des humanen Mamma-Karzinoms, enthaltend eine Zellinie nach den Ansprüchen 15 bis 17 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.

26. Verwendung der WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen für die in vitro- Expression damit verbundener therapeutischer Gene in humanen Mammazellen, einschließlich humaner Mammakarzinomzellen.

27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die regulatorische Sequenz die proximalen 445 Bp des WAP-Promotors einschließlich der Transkriptionsinitiationsstelle umfaßt.

28. Verwendung nach den Ansprüchen 26 bis 27, wobei die regulatorische Sequenz das 320 Bp XhoI/XbaI-Fragment der WAP-Promotor-Region enthält.

29. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die regulatorische Sequenz der U3-Bereich von MMTV ist.

30. Verwendung nach den Ansprüchen 26 und 29, wobei die regulatorische Sequenz das 0,6 kb PstI MMTV-Promotorfragment enthält.

31. Verwendung nach den Ansprüchen 26 bis 30, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus Antitumorgenen und Zytokingenen.

32. Verwendung nach Anspruch 31, wobei das therapeutische Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Proteine, wie Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Guaninphosphoribosyltransferase (gpt), Cytochrom P 450 kodieren, Zellzyklus-regulatorischen Genen, die für Proteine wie SDI kodieren, Tumorsuppressorgenen, die für Proteine wie p53 kodieren, Antiproliferationsgenen, die für Proteine wie Melittin, Cecropin kodieren, oder Cytokinen wie IL-2.

33. Verwendung nach den Ansprüchen 26 bis 32, wobei das therapeutische Gen unter transkriptioneller Kontrolle der WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen Teil eines rekombinanten Vektors, ausgewählt aus viralen und Plasmid-Vektoren, ist.

34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei der virale Vektor ausgewählt ist aus RNA und DNA viralen Vektoren und der Plasmidvektor ausgewählt ist aus eukaryontischen Expressionsvektoren.

35. Verwendung nach Anspruch 34, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist.

36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei der retrovirale Vektor eine 5'LTR Region der Struktur U3-R-U5, wenigstens eine kodierende Sequenz, die für ein therapeutisches Gen kodiert, und eine 3'LTR Region, die einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Bereich, gefolgt von dem R-Bereich und dem US-Bereich, umfaßt, wobei der deletierte Bereich durch einen Polylinker ersetzt wurde, der die WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen enthält, umfaßt, und wobei das therapeutische Gen unter der transkriptionellen Kontrolle der WAP oder MMTV regulatorischen Sequenzen steht.