ES2253775T3 - Celulas encapsuladas que expresan el citocromo p450 para activacion de profarmacos. - Google Patents
Celulas encapsuladas que expresan el citocromo p450 para activacion de profarmacos.Info
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Abstract
VECTOR RETROVIRAL DE REPLICACION DEFECTUOSA QUE TRANSPORTA UN GEN CITOCROMO P450 BAJO CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE ELEMENTOS O PROMOTORES REGULADORES ESPECIFICOS DE CELULAS - BLANCO, O PROMOTORES INDUCIBLES POR RAYOS X.
Description
Células encapsuladas que expresan el citocromo
P450 para activación de profármacos.
La presente invención se refiere a vectores
retrovíricos deficientes en replicación que codifican un gen del
citocromo P450, que son capaces de convertir profármacos de cáncer
inocuos en metabolitos citotóxicos. Adicionalmente, la presente
invención se refiere al uso de tales vectores retrovíricos para la
preparación de medicamentos para el tratamiento de diversos
cánceres, o la ablación de tumores.
Los fármacos anti-cáncer
utilizados para tratar tumores se aplican en la mayoría de los casos
sistémicamente y se propagan a través de todo el cuerpo del
paciente. La alta dosis sistémica de dichos fármacos requerida para
el tratamiento del cáncer va asociada a efectos secundarios
desagradables para el paciente.
En un intento de soslayar este problema, se han
utilizado profármacos del cáncer que tienen que metabolizarse o
activarse en el cuerpo antes de llegar a ser citotóxicos.
Lamentablemente, los tumores humanos que contienen niveles
adecuadamente altos de las enzimas activadoras son raros. El sitio
principal para activación de los profármacos es el hígado y para
asegurar que un tumor, en un sitio distante, reciba una dosis
suficiente del fármaco activado, la cantidad de profármaco activado
producida en el hígado tiene que ser muy alta y de nuevo esto
conduce a efectos secundarios tóxicos para el paciente.
Una estrategia por la cual podrían soslayarse
estos problemas de alta concentración sistémica de fármacos
activados sería proporcionar medios para la activación del
profármaco directamente en o cerca del sitio del tumor. Esta
estrategia requeriría que las células tumorales, o las células que
se encuentran en el sitio de un tumor se transforman genéticamente
para producir cantidades elevadas de las enzimas requeridas para
metabolizar los profármacos del cáncer. Los vectores retrovíricos
son idealmente adecuados para el suministro estable de genes a las
células, dado que el retrovirus es capaz de integrar el DNA
procedente de su genoma en el genoma de la célula hospedadora y por
consiguiente todas las células hijas de una célula infectada serán
portadoras del vector retrovírico que lleva el gen terapéutico. Una
ventaja adicional es que la mayoría de los retrovirus infectan
solamente las células que se dividen y son por consiguiente
vehículos ideales de suministro de genes a las células
tumorales.
Una diversidad de genes citotóxicos transportados
por vectores retrovíricos se han ensayado ya. Estos genes codifican
enzimas que convierten sustancias que son farmacodinámica y
toxicológicamente inertes incluso a niveles de dosis elevados pero
que pueden convertirse in vivo en metabolitos muy activos
(Connors, T.A. (1995), Gene Therapy
2:702-709).
En la quimioterapia del cáncer, se han encontrado
profármacos diseñados adecuadamente que son eficaces en el
tratamiento de tumores animales que poseen niveles altos de una
enzima activadora (Connors, T. y Whisson, M. (1966), Nature
210:866-867 y Cobb, L. et al (1969),
Biochemical Pharmacology 18:1519-1527). Los
resultados clínicos fueron, sin embargo, desalentadores, dado que se
encontró que los cánceres humanos que contenían niveles
adecuadamente altos de enzimas activadoras eran raros (Connors T.
(1986) Xenobiotica 16:975-988). La terapia con
profármacos enzimáticos dirigidos por virus (VDEPT) y la terapia con
profármacos enzimáticos dirigida por genes más general (GDEPT) están
relacionadas en el sentido de que las mismas están enfocadas también
a destruir las células tumorales por la activación de un profármaco
específico del tumor. Sin embargo, en este caso, el gen que codifica
la enzima, o
bien está direccionado específicamente a las células malignas o se encuentra bajo el control de un promotor específico.
bien está direccionado específicamente a las células malignas o se encuentra bajo el control de un promotor específico.
Hasta ahora, la mayoría de los esfuerzos
dirigidos hacia la terapia con profármacos se han concentrado en el
uso de la timidina-quinasa del Virus del Herpes
Símplex Humano (HSV-tk) como gen suicida. Aunque la
enzima HSV-tk en combinación con el profármaco
ganciclovir (GCV) se ha recomendado como un sistema satisfactorio
para GDEPT (Culver, K. et al., (1992), Science
256:1550-1552, Ram, Z. et al., (1993), Cáncer
Research 53:83-88 y Chen, S., Shine, H. et
al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci.
91:3054-3057) hay varias consideraciones teóricas
que sugerirían que esta no es en absoluto la combinación óptima. En
primer lugar, es un agente específico de fase S sin efecto alguno
sobre las células en reposo. Esto es debido a que el monofosfato de
GCV es de vida corta y tiene que estar presente cuando las células
entran en la fase S para producir un efecto tóxico. La
HSV-tk fosforila GCV a la forma de monofosfato (una
reacción que no puede ser realizada por las enzimas de mamífero) la
cual es fosforilada luego por enzimas celulares a la forma
trifosfato e incorporada en el DNA. En segundo lugar, el fármaco
activo es un trifosfato y no debería esperarse que se difunda
libremente para causar un efecto de espectador. Sin embargo, se ha
observado un efecto de espectador tanto in vitro como in
vivo, aunque parece estar implicada cooperación metabólica y, en
el último caso, parte del efecto puede ser un efecto indirecto que
implique un componente inmune (Bi W., Parysek, L. et al.,
(1993), Human Gene Therapy 4:725-731, Vile R. y
Hart, I. (1993), Cáncer Research 53:3860-3864 y
Freeman S., Abboud, C. et al., (1993), Cáncer Research
53:5274-5283). Una desventaja es que el efecto de
espectador depende de un contacto célula-célula.
Esto puede ser debido a la presencia de uniones con laguna formadas
por contacto íntimo entre las células que han sufrido transducción y
las células circundantes que hacen posible la transferencia de
ganciclovir fosforilado.
Recientemente, se han publicado resultados
interesantes con células que han sufrido transfección con el gen
codificante de la forma 2B1 del citocromo P450 de rata y se han
tratado luego con ciclofosfamida (Chen, S., Shine, H. et al.,
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3054-3057).
La presente invención, entre otras cosas,
comprende lo siguiente, solo o en combinación:
Una cápsula que encapsula una célula que expresa
un gen de citocromo P450 transferido en dicha célula, comprendiendo
dicha cápsula una membrana porosa que circunda dicha célula que
expresa el citocromo P450, siendo dicha membrana porosa permeable a
las moléculas de profármaco que penetran en la cápsula,
convirtiéndose dichas moléculas de profármaco en el metabolito
activo por el citocromo P450 expresado por dicha célula;
la cápsula indicada anteriormente, en la cual el
material de cápsula comprende un complejo formado a partir de
sulfato de celulosa y cloruro de polidimetildialilamonio;
la cápsula indicada anteriormente, en la cual
dicha célula productora del citocromo P450 es una línea de células
estable que expresa constitutivamente el citocromo P450;
la cápsula indicada anteriormente para uso en el
tratamiento de una enfermedad cancerosa;
la cápsula indicada anteriormente, en la cual una
cantidad terapéuticamente eficaz de la cápsula y, simultáneamente o
al cabo de cierto lapso de tiempo, de un profármaco que es activado
por el citocromo P450, se administran a un individuo;
la cápsula indicada anteriormente, en la cual la
cápsula se administra por inyección y/o por implantación en las
células diana y/o en el sitio de las mismas, y el profármaco se
administra sistémica y/o localmente;
la cápsula indicada anteriormente, en la cual las
células diana son células de tumores de mama y/o tumores
pancreáticos;
la cápsula indicada anteriormente, en la cual el
profármaco es ciclofosfamida y/o ifosfamida;
una composición farmacéutica que comprende la
cápsula indicada anteriormente;
la composición farmacéutica indicada
anteriormente, que comprende adicionalmente un profármaco, que es
activado por el citocromo P450;
la composición farmacéutica indicada
anteriormente, en la cual las cápsulas y el profármaco están
formuladas en formas diferentes;
la composición farmacéutica indicada
anteriormente, que comprende la cápsula en la forma adecuada para
inyección y/o implantación en los órganos diana y/o cerca de dicho
órgano diana, y el profármaco en la forma adecuada para
administración sistémica y/o local;
la composición farmacéutica indicada
anteriormente, que comprende las cápsulas en la forma adecuada para
la implantación en y/o próximas al tejido de cáncer de mama o tejido
de cáncer pancreático;
la composición farmacéutica indicada
anteriormente, que comprende ciclofosfamida y/o ifosfamida como
profármaco;
la cápsula indicada anteriormente y un
profármaco, que es activado por el citocromo P450, para uso en el
tratamiento de una enfermedad cancerosa;
uso de la cápsula indicada anteriormente para
producir una composición farmacéutica útil para la ablación de
células tumorales;
uso de la cápsula indicada anteriormente y un
profármaco, que es activado por el citocromo P450, para producir una
composición farmacéutica.
Los citocromos P450 forman un extenso grupo de
mono-oxigenasas que catalizan la oxidación de una
amplia gama de sustratos. Los mismos son producidos por algunas
bacterias, levaduras, y por organismos superiores, donde aquéllos
juegan un papel en la destoxificación de productos xenobióticos,
reacciones de bioactivación, y metabolismo de diversos compuestos
endógenos.
El citocromo P450 cataliza la hidroxilación de
los profármacos del cáncer utilizados comúnmente ciclofosfamida
(CPA) e ifosfamida a sus formas tóxicas activas. Normalmente, la
expresión del gen del citocromo P450 endógeno del paciente está
limitada al hígado, y los efectos anti-tumorales de
las CPAs aplicadas sistémicamente dependen de la distribución
sistémica subsiguiente de los metabolitos tóxicos del fármaco desde
el hígado. Esto ha conducido a problemas de toxicidad, dado que el
fármaco activado afecta no sólo al tumor, sino que afecta también a
otros tejidos normales del paciente tales como la médula ósea y el
riñón.
Un enfoque terapéutico, en el cual el gen del
citocromo P450 se introduce selectivamente de modo directo en
células tumorales, y se sobreexpresa en estas células, podría
soslayar este problema. Los metabolitos tóxicos producidos por las
células tumorales que han sufrido transducción afectan a las células
tumorales circundantes no transducidas de manera dependiente de un
gradiente de concentración. Una ventaja adicional del sistema
citocromo P450/CPA es la falta de dependencia de la replicación
celular para los efectos citotóxicos en las células circundantes.
Esto es debido a que uno de los metabolitos activos generados causa
reticulaciones intercatenarias con indiferencia de la fase del ciclo
celular. Posteriormente, durante la síntesis del DNA, estas
reticulaciones intercatenarias dan como resultado la muerte
celular.
Los vectores retrovíricos son los vehículos de
transferencia génica utilizados más comúnmente para las pruebas
clínicas que se han realizado hasta la fecha. La mayoría de estas
pruebas han emprendido, sin embargo, un enfoque ex vivo en el
cual las células del paciente se han aislado, modificado en cultivo
y reintroducido luego en el paciente.
Para el tratamiento de los cánceres, sería
factible aislar las células de un paciente (sean células tumorales o
células normales), infectarlas in vitro con una partícula
retrovírica recombinante que sea portadora del gen a codificante del
citocromo P450, y devolverlas luego al paciente en la proximidad del
tumor. Este enfoque, sin embargo, es extremadamente intensivo en
trabajo, debido a que cada célula del paciente tendría que aislarse,
cultivarse, transducirse con el constructor génico y devolverse con
éxito sin infección por agentes adventicios. El coste y el tiempo
implicados en un enfoque de este tipo limitan su utilidad
práctica.
Alternativamente, podría contemplarse un enfoque
alogénico, en el cual un solo tipo de células se infectan con una
partícula retrovírica recombinante portadora de un gen codificante
de P450, y se utilizan luego para terapia de muchos pacientes
diferentes. Un enfoque de este tipo es mucho más factible,
suponiendo que puedan resolverse los problemas de rechazo
inmunológico. La mayoría de los tumores, sin embargo, no son
adecuados para terapia génica ex vivo.
Idealmente, el gen codificante del citocromo P450
debería introducirse in vivo en las células tumorales, o en
células que se encuentran próximas al tumor.
El suministro de genes in vivo introduce
una diversidad de nuevos problemas. En primer lugar, y sobre todo,
tienen que abordarse las consideraciones de seguridad.
Un problema principal en relación con eventual la
terapia génica in vivo, tanto desde un punto de vista de la
seguridad como desde un punto de vista puramente práctico, es el
direccionamiento de la expresión. Está claro que los genes
terapéuticos transportados por vectores no deberían expresarse de
modo indiscriminado en todos los tejidos y células, sino sólo en la
célula diana requerida. Esto es especialmente importante cuando los
genes a transferir son genes activadores de tales profármacos
diseñados para producir la ablación de células tumorales
específicas. La ablación de otras células distintas de las células
diana sería con toda evidencia absolutamente indeseable.
La integración esencialmente aleatoria de la
forma provírica del genoma del retrovirus en el genoma de las
células infectadas ha planteado un problema ético importante debido
a que dicha integración aleatoria puede conducir a la activación de
proto-oncogenes y conducir así al desarrollo de un
nuevo cáncer. La mayoría de los investigadores estarían de acuerdo
de que la probabilidad de que un retrovirus deficiente en
replicación, tal como los que se utilizan actualmente, se integre en
o cerca un gen celular que esté implicado en el control de la
proliferación celular es infinitesimalmente pequeña. Sin embargo, se
admite también generalmente que la expansión explosiva de una
población de retrovirus competentes en replicación a partir de un
suceso de infección simple, podría proporcionar con el tiempo
suficientes sucesos de integración para hacer que dicha integración
fenotípica se convirtiera en una posibilidad muy real.
Los sistemas de vectores retrovíricos se
optimizan para minimizar la probabilidad de que estén presentes
virus competentes en replicación. Sin embargo, está bien documentado
que los sucesos de recombinación entre componentes del sistema
vector retrovírico pueden conducir a la generación de virus
competentes en replicación potencialmente patógenos, y se han
construido cierto número de generaciones de sistemas de vectores
para minimizar este riesgo de recombinación (Salmons, B. y Günzburg,
W.H. (1993), Human Gene Therapy
4(2):129-41).
Los sistemas de vectores retrovíricos están
constituidos por dos componentes:
1. El vector retrovírico propiamente dicho es un
retrovirus modificado (plásmido vector) en el cual los genes
codificantes de las proteínas víricas se han reemplazado por genes
terapéuticos. Dado que el reemplazamiento de los genes codificantes
de las proteínas víricas inutiliza eficazmente el virus, éste tiene
que ser restablecido por el segundo componente del sistema, que
proporciona las proteínas víricas desaparecidas al retrovirus
modificado.
El segundo componente es:
2. Una línea de células que introduce grandes
cantidades de las proteínas víricas, pero que sin embargo carece de
la capacidad para producir virus competentes en replicación. Esta
línea de células se conoce como la línea de células de
empaquetamiento y está constituida por una línea de células
transfectada con uno o más plásmidos que llevan los genes que
permiten el empaquetamiento del vector retrovírico modificado.
Para generar una partícula retrovírica
recombinante, el vector retrovírico se transfecta en la línea de
células de empaquetamiento. En estas condiciones, el genoma del
retrovirus modificado que incluye el gen terapéutico insertado se
transcribe desde el vector retrovírico y se empaqueta en las
partículas retrovíricas modificadas. Estas partículas retrovíricas
recombinantes se utilizan luego para infectar células tumorales,
durante lo cual el genoma del vector y cualquier gen citotóxico
llega a integrarse en el DNA de la célula diana. Una célula
infectada con una partícula vírica recombinante de este tipo no
puede producir nuevo virus vector, dado que no están presentes en
absoluto proteínas víricas en estas células, pero el DNA del vector
portador del agente terapéutico se integra en el DNA de la célula y
puede expresarse ahora en la célula infectada.
Se han descrito previamente cierto número de
sistemas vectores retrovíricos, que deberían permitir el
direccionamiento de los genes citotóxicos transportados (Salmons, B.
y Günzburg, W.H. (1993), Human Gene Therapy
4(2):129-41). La mayoría de estos enfoques
implican, o bien limitación del suceso de infección a tipos de
células predefinidos, o bien la utilización de promotores
heterólogos para dirigir la expresión de los genes terapéuticos
heterólogos enlazados a tipos específicos de células tumorales. Se
utilizan promotores heterólogos que deberían dirigir la expresión
de los genes enlazados únicamente al tipo de célula en el cual este
promotor es normalmente activo o/y controlable adicionalmente. Estos
promotores han sido insertados previamente, en combinación con el
gen terapéutico, en el cuerpo de los vectores retrovíricos, en lugar
de los genes gag, pol o env.
La Repetición del Terminal Largo (LTR) del
retrovirus que flanquea estos genes lleva el promotor retrovírico,
que es generalmente inespecífico en el sentido de que puede dirigir
la expresión en muchos tipos de células diferentes (Majors, J.
(1990), en ``Retroviruses - Strategies of Replication (Swanstrom, R.
y Vogt, P.K.,
compila-dores):Springer-Verlag,
Berlín:49-92). Se ha informado de la interferencia
de promotores entre el promotor LTR y promotores heterólogos
internos, tales como los promotores específicos de tejidos, arriba
descritos. Adicionalmente, se sabe que las LTR retrovíricas albergan
intensificadores fuertes que pueden, sea independientemente o en
asociación con el promotor retrovírico, influir en la expresión de
genes celulares cerca del sitio de integración del retrovirus. Se ha
demostrado que este mecanismo contribuye a la tumorigenicidad en
animales (van Lohuizen, M. y Berns, A. (1990), Biochim. Biophys.
Acta. 1032:213-235). Estas dos observaciones han
estimulado el desarrollo de Vectores
Auto-Desactivantes (SIN) en los cuales los
promotores retrovíricos se desactivan funcionalmente en la célula
diana (documento WO 94/29437). Modificaciones ulteriores de estos
vectores incluyen la inserción de casetes de genes promotores dentro
de la región LTR para crear vectores de copias dobles (documento WO
89/11539). Sin embargo, en ambos tipos de vectores citados
últimamente los promotores heterólogos insertados, sea en el cuerpo
del vector, o en la región LTR, están enlazados directamente al gen
terapéutico.
El vector SIN descrito anteriormente y arriba
mencionado, que lleva una LTR 3' delecionada (documento WO 94/29437)
utiliza adicionalmente un promotor heterólogo tal como el de
Citomegalovirus (CMV), en lugar del promotor 5'LTR retrovírico
(5'LTR exenta de U3) para dirigir la expresión del constructo vector
en la línea de células de empaquetamiento. Se incluye también en la
3'LTR una señal de poliadenilación heteróloga (documento WO
94/29437).
El objeto de la presente invención es la
construcción de un vector retrovírico seguro, que alberga un gen del
citocromo P450 como principio terapéutico. Este nuevo vector lleva
elementos constitutivos heterólogos, inducibles o promotores y/o
reguladores específicos de tejidos en la 3'LTR que, después de la
infección, se duplican y se translocan a la 5'LTR en la célula diana
así, en la célula infectada, el promotor introducido controla la
expresión del gen del citocromo P450, que se inserta en el cuerpo
del vector. Este vector no sufre auto-desactivación
- sino en lugar de ello intercambio de promotores, lo que da lugar
al nombre de vector ProCon con el significado de vectores de
Conversión de Promoto-
res. Los principios y ventajas del sistema ProCon se describen con mayor detalle en el documento WO 9607748.
res. Los principios y ventajas del sistema ProCon se describen con mayor detalle en el documento WO 9607748.
Dado que la Conversión de Promotores no da como
resultado Auto-Desactivación, el vector retrovírico
será transcripcionalmente activo en la célula diana. Adicionalmente,
ambas LTR's estarán constituidas en gran proporción por secuencias
heterológas promotor/intensi-ficador en la célula
diana. Esto reducirá la probabilidad de que el vector integrado en
la célula diana se vea sometido a la misma desactivación durante
períodos largos como ha sido descrito para los vectores
convencionales (Xu, L., Yee, J.K. et al., (1989), Virology
171:331-341) y reducirá también la probabilidad de
recombinación con secuencias retrovíricas endógenas para generar
virus competentes en replicación potencialmente patógenos,
aumentando la seguridad del sistema.
De acuerdo con la invención, la 5'LTR del
constructo vector retrovírico no se modifica, y la expresión del
vector vírico en las células de empaquetamiento está dirigida por
el promotor U3 retrovírico normal. La poliadenilación normal del
retrovirus está permitida, y no se incluye señal alguna de
poliadenilación heteróloga en la 3'LTR. Esto es importante para el
desarrollo de estrategias de terapia génica in vivo, dado que
la regulación fisiológica normal del virus, a través del promotor
vírico normal, y que implica también posiblemente el control vírico
normal de la poliadenilación, prevalecerá durante periodos largos
in vivo mientras que las células de empaquetamiento están
produciendo virus recombinante.
Para conseguir los objetos que anteceden y otros,
la invención proporciona un vector retrovírico que está sometido a
conversión de promotores, que comprende una región 5'LTR de la
estructura U3-R-U5; una o más
secuencias codificantes seleccionadas del grupo de genes conocidos
como genes del citocromo P450; y una región 3'LTR que comprende una
región U3 total o parcialmente delecionada en donde dicha región U3
delecionada está reemplazada por un promotor heterólogo, seguido por
la región R y U5.
Dicho promotor puede o bien ser constitutivo como
el promotor/intensificador precoz inmediato de Citomegalovirus
(CMV), inducible por ejemplo por hormonas glucocorticoides (v.g. el
promotor MMTV) o específico de las células diana.
Los elementos reguladores específicos de las
células diana y los promotores se seleccionan de uno o más elementos
de cualquier gen, pero en esta realización pueden ser de promotores
que incluyen elementos reguladores y promotores de la anhidrasa
carbónica II y \beta-glucoquinasa, elementos
reguladores y promotores específicos de linfocitos que incluyen
anhidrasa carbónica II y \beta-glucoquinasa,
elementos reguladores específicos de linfocitos de la Proteína Ácida
de Lactosuero (WAP), Virus del Tumor Mamario del Ratón (MMTV),
elementos reguladores y promotores específicos de
\beta-lactoglobulina y caseína, elementos
reguladores y promotores específicos de páncreas que incluyen
elementos reguladores y promotores específicos linfocíticos de
inmunoglobulina y MMTV, y elementos reguladores y promotores
específicos de MMTV que confieren sensibilidad a hormonas
glucocorticoides o que dirigen la expresión a la glándula mamaria.
Otros promotores incluyen por ejemplo los promotores CD4, CD34, e
IL2. Dichos elementos reguladores y promotores regulan
preferiblemente la expresión de dicho vector retrovírico.
Parece ser que la región del promotor WAP que se
requiere para mediar la especificidad para la glándula mamaria es un
fragmento de restricción XhoI/XbaI de 320 pb (-413 a -93) (Kolb,
A.F., Günzburg, W.H., Albang, R., Brem, G., Erfle, V., y Salmons, B.
(1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 217,
1045-1052). Adicionalmente, ciertos experimentos
indican que un fragmento promotor de MMTV PstI de 0,6 Kb (Salmons,
B., Groner, B., Calberg Baca, C.M., y Ponta, H. (1985), Virology
144:101-114) puede jugar un papel en la regulación
de la especificidad para la glándula mamaria de la expresión
exhibida por MMTV (Kolb, A.F., Günzburg, W.H., Albang, R., Brem, G.
Erfle, V., y Salmons, B. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 217,
1045-1052).
Las regiones LTR se seleccionan a partir de al
menos un elemento del grupo constituido por LTRs del Virus de la
Leucemia Murina (MLV), El Virus del Tumor Mamario de Ratón (MMTV),
el Virus del Sarcoma Murino (MSV), el Virus de la Inmunodeficiencia
de los Simios (SIV), el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV),
el Virus de la Leucemia de las Células T Humanas (HTLV), el Virus de
la Inmunodeficiencia de los Felinos (FIV), el Virus de la Leucemia
de los Felinos (FELV), el Virus de la Leucemia Bovina (BLV) y el
Virus Mason-Pfizer del Mono (MPMV).
El vector retrovírico está basado preferiblemente
en un vector LXSN (Miller, A.D. y Rosman, G.J. (1989), Biotechniques
7:980-990), pBAG (Price, J., Turner, D. et
al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:156-160) o un híbrido de ambos.
La secuencia codificante del gen terapéutico
puede ser cualquier gen del citocromo P450 pero, muy
preferiblemente, es la forma 2B1 del citocromo P450 de rata,
definida por Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y., et
al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79:2793-2797.
Se proporciona un sistema vector retrovírico que
comprende un vector retrovírico como se describe arriba como primer
componente y una línea de células de empaquetamiento que alberga al
menos un constructo retrovírico o retrovírico recombinante que
codifica las proteínas requeridas para el empaquetamiento de dicho
vector retrovírico.
La línea de células de empaquetamiento se
selecciona preferiblemente de un elemento del grupo constituido por
\Psi-2, \Psi-Crypt,
\Psi-AM, GP+E-86, PA317 y
GP+envAM-12, o por cualquiera de éstos
supertransfectados con constructos recombinantes que permiten la
expresión de proteínas de la superficie de otros virus con
envoltura.
La invención describe mRNA resultante de un
vector retrovírico.
En la línea de células de empaquetamiento, la
expresión del vector retrovírico está regulada por el promotor
retrovírico normal no selectivo contenido en la región U3. Sin
embargo, tan pronto como el vector entra en la célula diana se
produce la conversión del promotor, y el gen P450 es expresado a
partir de un promotor de elección específico del tejido o inducible
insertado en el vector ProCon. No sólo puede incluirse en el sistema
virtualmente cualquier promotor específico del tejido, que
proporcione el direccionamiento selectivo de una gran diversidad de
tipos de células diferentes sino que, adicionalmente, después del
suceso de conversión, la estructura y las propiedades del vector
retrovírico ya no se asemejan a las de un virus. Esto, por supuesto,
tiene consecuencias extremadamente importantes desde el punto de
vista de la seguridad.
Estos sistemas de vectores se utilizarán para
generar virus recombinante que puede utilizarse para infectar
células tumorales o normales sea in vitro o in
vivo.
Los retrovirus recombinantes que se han
purificado o concentrado pueden preservarse por adición primeramente
de una cantidad suficiente de un tampón de formulación al medio que
contiene el retrovirus recombinante a fin de formar una suspensión
acuosa. El tampón de formulación es una solución acuosa que contiene
un sacárido, un aditivo estructural de peso molecular alto, y un
componente tampón en agua. La solución acuosa puede contener también
uno o más aminoácidos.
El retrovirus recombinante puede preservarse
también en una forma purificada. Más específicamente, antes de la
adición del tampón de formulación, el retrovirus recombinante bruto
arriba descrito puede clarificarse haciéndolo pasar a través de un
filtro y concentrarse luego, por ejemplo por un sistema de
concentración de flujo transversal (Filtron Technology Corp.,
Nortborough, MA). En una realización, se añade DNasa al concentrado
para digerir el DNA exógeno. El material digerido se somete luego a
diafiltración para eliminar los componentes del medio en exceso y
establecer el retrovirus recombinante en una solución tamponada más
deseable. El producto diafiltrado se pasa luego a través de una
columna de gel S-500 Sephadex y se eluye un
retrovirus recombinante purificado. Se añade a este material eluido
una cantidad suficiente de tampón de formulación para alcanzar una
concentración final deseada de los constituyentes y diluir
mínimamente el retrovirus recombinante, y la suspensión acuosa se
guarda luego, preferiblemente a -70ºC o se seca inmediatamente. Como
se ha indicado arriba, el tampón de formulación es una solución
acuosa que contiene un sacárido, un aditivo estructural de peso
molecular alto, y un componente tampón en agua. La solución acuosa
puede contener también uno o más aminoácidos.
El retrovirus recombinante bruto puede
purificarse también por cromatografía en columna de intercambio
iónico. En general, el retrovirus recombinante bruto se clarifica
haciéndolo pasar a través de un filtro y el filtrado se carga en una
columna que contiene una matriz de celulosa fuertemente sulfonada.
El retrovirus recombinante se eluye de la columna en forma
purificada utilizando un tampón con alta concentración de sal. El
tampón con alta concentración de sal se cambia luego por un tampón
más deseable haciendo pasar el material eluido a través de una
columna de exclusión molecular. Se añade luego una cantidad
suficiente de tampón de formulación como se ha expuesto
anteriormente, al retrovirus recombinante purificado y la suspensión
acuosa se seca inmediatamente o se guarda, preferiblemente a
-70ºC.
La suspensión acuosa en forma bruta o purificada
puede secarse por liofilización o evaporación a la temperatura
ambiente. Específicamente, la liofilización implica los pasos de
enfriamiento de la suspensión acuosa por debajo de la temperatura de
transición vítrea o por debajo de la temperatura del punto eutértico
de la suspensión acuosa, y eliminación de agua de la suspensión
enfriada por sublimación para formar un retrovirus liofilizado. Una
vez liofilizado, el retrovirus recombinante es estable y puede
guardarse a -20ºC hasta 25ºC, como se expone con mayor detalle más
adelante.
En el método de evaporación, se elimina el agua
de la suspensión acuosa a la temperatura ambiente por evaporación.
Puede eliminarse también el agua mediante secado por
pulverización.
Las soluciones acuosas utilizadas para la
formulación, como se ha descrito previamente, se componen de un
sacárido, un aditivo estructural de peso molecular alto, un
componente tampón, y agua. La solución puede incluir también uno o
más aminoácidos. La combinación de estos componentes actúa para
preservar la actividad del retrovirus recombinante después de
congelación y liofilización, o secado por evaporación.
El aditivo estructural de peso molecular alto
ayuda a prevenir la agregación del virus durante la congelación y
proporciona soporte estructural en el estado liofilizado o secado.
Dentro del contexto de la presente invención, se considera que los
aditivos estructurales son de "peso molecular alto" si tienen
un p.m. mayor que 5000. Un aditivo estructural de peso molecular
alto preferido es seroalbúmina humana. Los aminoácidos, en caso de
estar presentes, actúan para preservar ulteriormente la infectividad
vírica después de enfriamiento y descongelación de la suspensión
acuosa. Adicionalmente, los aminoácidos actúan para preservar
ulteriormente la infectividad vírica durante la sublimación de la
suspensión acuosa enfriada y mientras se encuentra en el estado
liofilizado.
El componente tampón actúa para tamponar la
solución por mantenimiento de un pH relativamente constante. Puede
utilizarse una diversidad de tampones, dependiendo del intervalo de
pH deseado, preferiblemente entre 7,0 y 7,8.
Soluciones acuosas para la formulación de
retrovirus recombinantes se describen en detalle en el documento
WO-A2-96121014.
Adicionalmente, es preferible que la solución
acuosa contenga una sal neutra que se utiliza para ajustar el
retrovirus recombinante final formulado a una concentración de sal
iso-osmótica apropiada.
Los retrovirus liofilizados o deshidratados
pueden reconstituirse utilizando una diversidad de sustancias, pero
se reconstituyen preferiblemente utilizando agua. En ciertos casos,
pueden utilizarse también soluciones diluidas de sal que llevan la
formulación final a isotonicidad. Adicionalmente, puede ser
ventajoso utilizar soluciones acuosas que contienen componentes
conocidos que mejoran la actividad del retrovirus reconstituido.
Tales componentes incluyen citoquinas, tales como
IL-2, policationes, tales como sulfato de protamina,
u otros componentes que mejoran la eficiencia de transducción del
retrovirus reconstituido. Los retrovirus recombinantes liofilizados
o deshidratados pueden reconstituirse con cualquier volumen
conveniente de agua o los agentes de reconstitución que permiten una
solubilización sustancial, y preferiblemente total, de la muestra
liofilizada o deshidratada.
Las partículas retrovíricas recombinantes pueden
administrarse a una gran diversidad de localizaciones que incluyen,
por ejemplo, sitios tales como un órgano o un sitio de un tumor. El
retrovirus recombinante puede administrarse por vía oral,
intravenosa, bucal/sublingual, intraperitoneal, o subcutánea. La
dosis diaria depende del modo exacto de administración, la forma en
que se administra, la indicación hacia la cual está dirigida la
administración, el individuo implicado y el peso corporal del
individuo implicado y, además, de la preferencia y experiencia del
médico encargado del tratamiento.
Las rutas de administración descritas en esta
memoria pueden ponerse en práctica simplemente por administración
directa utilizando una aguja, un catéter o dispositivo afín. En
particular, pueden administrarse directamente una o más dosis.
Se encapsularán e implantarán células normales
infectadas, sean de origen humano, o procedentes de otras especies,
proporcionando una pequeña factoría de conversión de profármacos que
puede situarse cerca de o en la masa tumoral.
La efectividad a largo plazo de este método
depende de (1) la protección de las células del sistema inmunitario
del hospedador, que normalmente eliminarían las células productoras
de virus o infectadas, especialmente si las células son de una
especie diferente como es usualmente el caso para las células
productoras del vector retrovírico, y (2) de la supervivencia de las
células in situ durante periodos prolongados, lo cual puede
requerir vascularización.
La microencapsulación de células se ha
investigado ya con fibroblastos de ratón transformados con el gen de
la hormona del crecimiento humana: Las células recombinantes se
encapsularon con una membrana de
alginato-poli-L-lisina-alginato.
Estudios in vitro a largo plazo demostraron que existía una
fase de aumento continuado en la secreción de la hormona de
crecimiento humana, seguida por una fase de estabilización. Estudios
in vivo con ratones Balb-c trasplantados con
las células recombinantes encapsuladas revelaron niveles detectables
en suero de la hormona del crecimiento humana durante toda la
duración del estudio (115 días) (Tai, I.T. y Sun, A. M. (1993),
FASEB J. 7:1061-1069).
Investigaciones ulteriores se dirigieron a
estudios de factibilidad de la tecnología de microencapsulación para
la evaluación de fármacos anti-virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) in vivo. El concepto
concerniente al ensayo anti-HIV implica la
micro-encapsulación de células diana humanas
T-linfoblastoides infectadas o no infectadas con
HIV, seguida por implantación de las microcápsulas en ratones
atímicos, tratamiento de los animales con el fármaco, y retirada de
las microcápsulas para evaluación de la viabilidad de las células
diana. Un efecto antivírico positivo de la sustancia de ensayo se
indica por el crecimiento o la supervivencia de las células
infectadas con el virus en las microcápsulas. Se examinaron varias
líneas de células sensibles a HIV en cuanto a crecimiento en las
microcápsulas in vitro e in vivo. El análisis de las
cápsulas y las células humanas contenidas en ellas reveló la
invasión de células inmunitarias de ratón y otros efectos adversos
que no pudieron ser contrarrestados por ninguna de las numerosas
modificaciones técnicas intentadas. Se llegó a la conclusión de que
la tecnología de la microencapsulación celular no es factible para
protocolos de ensayo de fármacos in vivo debido a reacciones
inmunógenas (McMahon, J. et al. (1990), J. Natl. Cáncer Inst.
82:1761-1765).
De acuerdo con la presente invención, se ha
encontrado que la producción continuada de un virus vector a partir
de células de empaquetamiento implantadas puede conseguirse por la
encapsulación apropiada, en microcápsulas con membranas
semipermeables, de las células de empaquetamiento productoras del
virus antes de la implantación. Adicionalmente, se ha encontrado que
tales cápsulas llegan a injertarse satisfactoriamente en el
hospedador, se vascularizan, y no provocan una respuesta inmunitaria
o inflamatoria del hospedador. Estos descubrimientos, junto con la
semipermeabilidad de la membrana de la cápsula, permiten la
activación de profármacos in vivo.
Se ha desarrollado una tecnología de
encapsulación que permite la encapsulación de células de
empaquetamiento productoras de virus, y de células infectadas con
virus o normales en un material basado en celulosa. Utilizando esta
técnica, hasta 10^{10}, pero preferiblemente
10^{5}-10^{7} células se encapsulan en un
complejo de electrólitos (v.g. de alginato y polilisina o, más
preferiblemente sulfato de celulosa y cloruro de
polidimetil-dialilamonio) u otras estructuras
porosas (tales como poliamidas o polisulfonas). Las cápsulas
resultantes pueden tener un diámetro variable entre 0,01 y 5 mm,
pero preferiblemente 0,1 y 1 mm. Por consiguiente pueden fabricarse
cápsulas que contengan un número variable de células. Las cápsulas
son semipermeables, con poros lo bastante grandes para permitir que
los virus o moléculas de profármaco pasen a su través, pero lo
bastante pequeños para impedir que las células del sistema
inmunitario accedan a las células, reduciendo con ello
significativamente una respuesta inmunológica a estas células. Las
cápsulas y las células encapsuladas se cultivan en un medio normal
de cultivo de células (cuya naturaleza depende de la línea de
células encapsulada) en condiciones estándar de humedad, temperatura
y concentración de CO_{2}.
Después de un periodo de cultivo adecuado
(normalmente no inferior a 1 hora y que no excede de 30 días), las
cápsulas que contienen las células pueden implantarse
quirúrgicamente, sea de manera directa o por inyección utilizando
una jeringuilla en diversas áreas.
En diferentes momentos después de la implantación
de las células encapsuladas, el hospedador puede tratarse con
ciclofosfamida o ifosfamida, sea local o sistémicamente. Las células
infectadas con el virus que expresa el citocromo P450 convertirán
estos profármacos en los metabolitos activos que causaran
alquilación y reticulación del DNA. Asimismo, las células portadoras
y que expresan el gen del citocromo P450 (tales como células
infectadas encapsuladas, o células de empaquetamiento encapsuladas)
catalizarán también esta conversión. En una realización de esta
invención, estas células encapsuladas infectadas o de
empaquetamiento serán células que se dividen lentamente, o células
que han sido tratadas con mitomicina C, dosis de radiación bajas, u
otros medios para prevenir la replicación celular, y para prevenir
así que las propias células se vean afectadas por los efectos
citotóxicos de los profármacos.
Los ejemplos que siguen ilustraran adicionalmente
la invención. Sin embargo, estos ejemplos no tienen por objeto
limitar en absoluto el alcance de la presente invención.
Ejemplo
1
Este ejemplo describe la construcción de un
vector de expresión retrovírico para infección intratumoral que
contiene el gen para el citocromo P450 2B1 de rata.
Se construyó el vector de expresión pLX2B1,
representado en la Figura 1, por ligación de fragmentos obtenidos a
partir de los plásmidos pLX125 y pSW1 (Kedzie, K.M., Escobar, G.Y.,
Grimm, S.W., He, Y.A., Pepperl, D.J., Regan, J.W., Stevens, J.C., y
Halpert. J.R. (1991), J. Biol. Chem.
266(33):2215-2). pLX125 se preparó como se
describe en el documento PCT/EP96/04447).
El plásmido pLX125 se linealizó con HpaI, y los
extremos romos resultantes se desfosforilaron utilizando fosfatasa
de intestino de ternero. Se purificó el DNA por separación en un gel
de agarosa al 1%, escisión y preparación utilizando el protocolo
Qiaquick (Qiagen). Después de precipitación con etanol, se
resuspendió el DNA en agua.
El vector de clonación pSW1 se digirió con SmaI y
HincII para dar dos fragmentos con extremos romos. La mezcla de
digestión se separó en un gel de agarosa al 1%. El fragmento más
corto (1,5 kb) que contenía el cDNA del citocromo P450 de rata 2B1
(Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y. et al
(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2793-2797) se
escindió y se eluyó utilizando el protocolo de extracción de DNA
Qiaquick, se precipitó con etanol y se resuspendió en agua.
Se mezclaron 7,6 fMoles de pLX125 y 24 fMoles del
fragmento SmaI/HindII de pSW1 y se ligaron durante 3 días a 12ºC
utilizando ligasa T4 (Boehringer). La ligasa se desactivó a 65ºC
durante 10 min y el DNA se precipitó en butanol con un volumen 10
veces mayor de butanol. El DNA precipitado se resuspendió en agua y
se sometió a electroporación en bacterias DH10B (Gibco). Se
seleccionaron colonias resistentes a ampicilina, se preparó DNA y se
ingirió el ensayo con SspBI/SalI, BamHI/SspBI, PvuI y BamHI. El
plásmido correcto final se designó pLX2B1 (véase Fig 1).
Un día antes de la lipofección, se sembraron 3 x
10^{6} células de empaquetamiento de retrovirus PA317 (Miller,
A.D. y Buttimore, C. (1986), Mol. Cell. Biol.
6:2895-2902) en cápsulas Petri o cápsulas de cultivo
de 10 cm. El día de la infección se mezclaron 4 \mug de pLX2B1 con
300 \mul de medio exento de suero. En paralelo, se mezclaron 45
\mul de Lipofectamina (Gibco BRL) con 300 \mul de medio exento
de suero. La solución que contenía el plásmido se añadió a la mezcla
de Lipofectamina y se incubó durante 45 min. Después de 35 min, las
células se lavaron una sola vez con 6 ml de medio exento de suero.
Se añadieron 2,4 ml de medio exento de suero a la mezcla de
lipofección y el 1 ml resultante se puso sobre las células
preparadas. Después de 5 horas se añadieron 3,5 ml de Medio Eagles
Modificado de Dulbecco, que contenía 20% de FCS. Al día siguiente,
se tripsinizaron las células, se diluyeron en relación 1:20 y se
sembraron en una cápsula de 100 mm. Después de 24 h, se reemplazó el
medio con medio que contenía el análogo de neomicina G418. Se
aislaron poblaciones de células y se analizaron en cuanto a la
expresión de citocromo P450.
Se utilizó el sobrenadante de estas poblaciones
de células para infectar células diana CK. 1 ml de sobrenadante que
contenía virus procedente de 5 x 10^{6} células se filtró a través
de un filtro de 0,45 \mum y se añadió a 1 x 10^{6} células CK
diana en presencia de 8 \mug/ml de polibreno. Después de 4 horas,
se añadió ml de Medio Eagles Modificado de Dulbecco con 10% de Suero
de Ternero Fetal.
Las células se tripsinizaron al día siguiente, se
diluyeron y se pusieron 24 horas después en medio de selección que
contenía adicionalmente 400 \mug/ml de G418. Después de 2 semanas,
se aislaron colonias resistentes a G418 y se ensayaron en cuanto a
actividad de citocromo P450 2B1. Se extendieron 2 x 10^{4} células
en placas en una cápsula de 3 cm y se expusieron a una concentración
de ifosfamida que variaba entre 0 y 5 mM. Se observó una
sensibilidad mayor de las células infectadas con el retrovirus del
citocromo P450 2B1 en comparación con las células de control, no
infectadas.
Las células de empaquetamiento que producían el
vector retrovírico obtenidas se encapsulan como se describe en el
Ejemplo 2 del documento WO 97/01357.
Las cápsulas obtenidas se introducen por cirugía
"bocallave" cerca o en el interior de tumores trasplantados o
espontáneos de ratones BALB/c o GR. Se insertan aproximadamente seis
cápsulas de 1 mm de diámetro en cada sitio de operación. El sitio de
cirugía se cierra mediante sutura. Los ratones se tratan luego
localmente con ciclofosfamida o ifosfamida, por inyección
intratumoral directa de 100 \mul o 20 mg/ml o concentraciones
sistémicas de 130 mg CPA/kg de peso corporal por vía intraperitoneal
y 40-60 mg de IFO/kg de peso corporal por vía
intraperitoneal durante hasta un máximo de 10 semanas. Durante este
período, se observan diariamente el tamaño del tumor y el aspecto
macroscópico. Se sacrifican luego los ratones, se retira el tejido
que contiene las cápsulas insertadas y el tumor, y se preparan
secciones histológicas para microscopía óptica y electrónica. Estas
secciones muestran claramente el injerto satisfactorio de las
cápsulas, vascularización, y ausencia de signos de la presencia de
linfocitos indicativa de una respuesta inmunológica celular. Estas
secciones muestran también la ausencia de indicios de muerte celular
o necrosis dentro de la cápsula. En contraste, el tumor mostraba
necrosis y, macroscópicamente, se apreciaba una reducción clara de
tamaño durante el periodo de ensayo.
Ejemplo
2
Este ejemplo describe la construcción de una
línea de células estable que expresa constitutivamente el citocromo
P450 de rata 2B1.
Se construyó el vector de expresión pc3/2B1 por
ligación de fragmentos obtenidos a partir del plásmido pcDNA3
(Invitrogen) y pSW1 (Kedzie, K.M., Escobar, G.Y., Grimm, S.W., He,
Y.A., Pepperl, D.J., Regan, J.W., Stevens, J.C., y Halpert., J.R.
(1991), J. Biol. Chem. 266(33): 2215-21).
El plásmido pcDNA3 se digirió con XhoI/XbaI, y
los fragmentos de extremos cohesivos resultantes se desfosforilaron
utilizando fosfatasa de intestino de ternero. El DNA de la cadena
principal del vector se purificó por separación en un gel de agarosa
al 1%, escisión y preparación utilizando el protocolo Qiaquick
(Qiagen). Después de precipitación con etanol, el DNA se resuspendió
en agua.
El vector de clonación pSW1 se digirió con XhoI y
XbaI para dar dos fragmentos. La mezcla de digestión se separó en un
gel de agarosa al 1%. El fragmento más corto (1,5 kb) que contenía
el cDNA del citocromo P450 de rata 2B1
(Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y. et al
(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2793-2797) se
escindió y se eluyó utilizando el protocolo de extracción de DNA
Qiaquick, se precipitó con etanol y se resuspendió en agua.
Se mezclaron 8,3 fMoles de la cadena principal de
pcDNA3 y 24,8 fMoles del fragmento XhoI/XbaI de pSW1 y se ligaron
durante 1 día a 12ºC utilizando ligasa T4 (Boehringer). La ligasa se
desactivó a 65ºC durante 10 min y el DNA se precipitó en butanol
empleando un volumen de butanol 10 veces mayor. El DNA precipitado
se resuspendió en agua y se sometió a electroporación en bacterias
DH10B (Gibco). Se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina,
se preparó el DNA y se digirió el ensayo con EcoRI, BamHI, EcoRV y
XhoI. El plásmido correcto final se designó pc3/2B1.
Antes del día de la transfección se sembraron 3 x
10^{6} células de riñón de gato en cápsulas de 100 mm. El día de
la transfección se mezclaron 4 \mug de pc3/2B1 con 100 \mul de
medio exento de suero. En paralelo, se mezclaron 15 \mul de
Lipofectamina con 100 \mul de medio exento de suero. La solución
que contenía el plásmido se añadió a la mezcla de Lipofectamina y se
incubó durante 45 min. Después de 35 min, se lavaron las células una
sola vez con 2 ml de medio exento de suero. Se añadieron 800 \mul
de medio exento de suero a la mezcla de lipofección y el 1 ml
resultante se puso sobre las células preparadas. Después de 6 horas,
se añadió 1 ml de DMEM (Glutamax) con 10% de FCS. Al día siguiente,
se tripsinizaron las células, se diluyeron por un factor de 10 y se
sembraron en una cápsula de 100 mm. Después de 24 h, se reemplazó el
medio contra medio de neomicina. Después de 14 días, los clones
resistentes a neomicina se aislaron y se ensayaron en cuanto a
presencia y actividad del vector.
Las células de riñón de gato que expresaban el
citocromo P450 mostraron una sensibilidad 10 veces mayor a
ifosfamida o ciclofosfamida en comparación con las células de tipo
salvaje.
Pudo demostrarse un efecto de espectador en las
células de tipo salvaje de riñón de gato pero también en las células
Rin5 derivadas de tumor pancreático. Esto se demostró por
co-cultivo de los clones de células de riñón de gato
P450 2B1 con células de tipo salvaje de riñón de gato no productoras
o células derivadas de tumor pancreático de rata Rin5 y adición de
ifosfamida. Las células no productoras CK y Rin son destruidas por
los metabolitos tóxicos de la ifosfamida que son producidos y
liberados por las células de riñón de gato que contienen el
citocromo P450 2B1. Estudios de titulación que utilizaron un clon de
células de riñón de gato con el citocromo P450 2B1 demostraron que
una cantidad tan pequeña como 0,25 mM de ifosfamida causa efectos
tóxicos específicos sobre estas células, y 1-2 mM da
como resultado la muerte de todas las células. Por el análisis
mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa se demostró que los
clones de células de riñón de gato con el citocromo P450 2B1 habían
adquirido el DNA del constructo génico P450 2B1. El análisis
bioquímico ulterior de los clones utilizando la desalquilación
enzimática de 7-pentoxiresorufina por el citocromo
P450 2B1 reveló que las células modificadas genéticamente son
productoras del citocromo P450 2B1.
Se produjeron cápsulas que contenían estas
células como se describe en el Ejemplo 1 y se implantaron en ratones
cerca del sitio del tumor. Después de tratamiento con ciclofosfamida
o ifosfamida, se evaluó la eficacia del tratamiento como se ha
descrito arriba.
Un vector de expresión retrovírico que contiene
el gen codificante del citocromo P450 de rata-2B1
puede prepararse también como se describe más adelante en el Ejemplo
4.
\newpage
Ejemplo
3
Se digirió en primer lugar parcialmente el
plásmido pLX125 con la enzima de restricción XhoI para producir un
vector que está linealizado en la posición 3547. Este plásmido
lineal se digirió ulteriormente con la enzima de restricción SspBI
para separar un fragmento corto dentro del polienlazador de pLX125.
En un gel preparativo, el fragmento del vector cortado correctamente
aparecía como la banda mayor. Utilizando el protocolo Quiaex
(Qiagen), el DNA de esta banda se eluyó del gel y se purificó.
Para producir el gen del citocromo P450 de rata
2B1, se lisaron células de la línea de células de hepatoma de rata
HTC con solución D (tiocianato de guanidio 4M, citrato de sodio 25
mM de pH 7, 0,5% de
N-laurilsarcosina-sodio, 0,1 M de
2-mercaptoetanol) y se extrajo el RNA total por
adición de 1/15 volúmenes de acetato de sodio 3 M, en el mismo
volumen de fenol saturado con agua y se añadieron 1/5 volúmenes de
cloroformo/alcohol isoamílico (49:1), y la mixtura total se mezcló
enérgicamente. Después de 15 min en hielo, el extracto se centrifugó
durante 20 min a 4ºC a 10.000 g. El RNA contenido en la fase acuosa
se precipitó con un volumen de isopropanol durante 30 min a -20ºC y
se centrifugó a 10.000 g a 4ºC. El sedimento se lavó en etanol al
70% y se dejó a la temperatura ambiente durante 15 min. Después de 5
min de centrifugación a 4ºC y 10.000 g, se secó el sedimento en un
secador de vacío y se redisolvió en solución SDS al 0,5%.
El RNA extraído se sometió a transcripción
inversa utilizando el protocolo para síntesis de cDNA (Pharmacia).
El cDNA resultante se utilizó como molde para una PCR. Los
iniciadores se diseñaron de tal modo que contenían un sitio de
restricción SspBI (subrayado) en el iniciador del lado izquierdo
(5'-AAGCCTGTACACTGGAGAGCATGCAC-3')
y un sitio XhoI (subrayado) en el iniciador del lado derecho
(5'-CGATTACTCGAGACCTGGCTGCCTCA-3').
Ambos iniciadores tenían bases adicionales en el extremo 5' para
mayor eficiencia de escisión por la enzima de restricción relevante.
El producto de 1562 pb se digirió con XhoI y SspBI para producir
tres fragmentos.
Este fragmento más largo (1545 pb), que contenía
el gen correspondiente al citocromo P450, se ligó en el plásmido
pLX125 digerido con XhoI/SspBI.
Una línea de células estable que expresa
constitutivamente la forma 2B1 del citocromo P450 de rata, puede
prepararse también como se describe más adelante en el Ejemplo
5.
Ejemplo
4
Para producir el mRNA de la forma 2B1 del
citocromo P450 de rata, se sacrificó una rata hembra de cuatro
semanas de edad, se extrajo el hígado y se congeló inmediatamente en
nitrógeno líquido. El hígado congelado se puso en un tampón GTC
filtrado en condiciones estériles (isotiocianato de guanidinio 6M,
citrato de sodio 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M,
N-laurilsarcosil-sodio al 0,5%) y se
homogeneizó a la temperatura ambiente. Para la separación del RNA,
el extracto hepático se puso sobre una capa amortiguadora de cloruro
de cesio (cloruro de cesio 5,7 M, EDTA 0,1 M) y se centrifugó en un
rotor oscilante a 20ºC y 32.000 rpm durante una noche. Después de
la separación completa del sobrenadante, el RNA reducido a un
sedimento se redisolvió en Tris 10 mM de pH 7,5 enfriado en hielo, y
se precipitó durante una noche a -20ºC con 1/15 volúmenes de acetato
de sodio 3 M y 2,5 volúmenes de etanol. El RNA se separó por
centrifugación durante 40 min a 8.000 rpm y 4ºC, y el pelet secado
se resuspendió en agua estéril.
El RNA extraído se sometió a transcripción
inversa utilizando el protocolo para síntesis de cDNA (Pharmacia).
El cDNA resultante se utilizó como molde para la PCR siguiente. Los
iniciadores se diseñaron de modo que contuvieran un sitio de
restricción EcoRI en el iniciador del lado izquierdo
(5'-CGTGCGGAATTCGGCGGATTCAGCAT-3') y
un sitio EcoRVI en el iniciador del lado derecho
(5'-ATAACGGATATCACCTGGCTGCCTCA-3').
Ambos iniciadores tenían bases adicionales en el extremo 5' para
mayor eficiencia de la enzima de corte. El fragmento amplificado de
1588 pb se digirió con EcoRI y EcoRV para producir tres
fragmentos.
Este fragmento más largo (1572 pb), que contenía
el gen para el citocromo P450 2B1, se ligó al plásmido pcDNA3
digerido con EcoRI/EcoRV (Invitrogen).
Ejemplo
5
El RNA extraído preparado en el Ejemplo 4 se
sometió a transcripción inversa utilizando el protocolo para
síntesis de cDNA (Pharmacia). El cDNA resultante se utiliza como
molde para una PCR. Los iniciadores se diseñan de modo que contengan
un sitio de restricción BamHI (subrayado) en el iniciador del lado
izquierdo, (v.g.
5'-AAGCC
GGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3') y un sitio BamHI (subrayado) en el iniciador del lado derecho (v.g. 5'-CGA
TTAGGATCCCTGCCTCA-3'). Ambos iniciadores tienen bases adicionales en el extremo 5' para mayor eficiencia de escisión por la enzima de restricción relevante. El producto de 1562 pb se digiere con BamHI y el fragmento obtenido que contiene el gen para el citocromo P450 se liga en el plásmido pWAP.6 digerido con BamHI (véase la solicitud PCT No. PCT/EP96/03922).
GGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3') y un sitio BamHI (subrayado) en el iniciador del lado derecho (v.g. 5'-CGA
TTAGGATCCCTGCCTCA-3'). Ambos iniciadores tienen bases adicionales en el extremo 5' para mayor eficiencia de escisión por la enzima de restricción relevante. El producto de 1562 pb se digiere con BamHI y el fragmento obtenido que contiene el gen para el citocromo P450 se liga en el plásmido pWAP.6 digerido con BamHI (véase la solicitud PCT No. PCT/EP96/03922).
Claims (17)
1. Una cápsula que encapsula una célula que
expresa un gen del citocromo P450 trasferido a dicha célula,
comprendiendo dicha cápsula una membrana porosa que rodea dicha
célula que expresa el citocromo P450, siendo dicha membrana porosa
permeable a las moléculas de profármaco que atraviesan la cápsula,
convirtiéndose dichas moléculas de profármaco en el metabolito
activo por el citocromo P450 expresado por dicha célula.
2. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 1,
en la cual el material de la cápsula comprende un complejo formado a
partir de sulfato de celulosa y cloruro de
polidimetildialilamonio.
3. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en la cual dicha célula productora del citocromo P450 es una
línea de células estable que expresa constitutivamente el citocromo
P450.
4. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 anteriores para uso en el tratamiento de una
enfermedad cancerosa.
5. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 4,
en la cual una cantidad terapéuticamente eficaz de la cápsula y,
simultáneamente o al cabo de cierto lapso de tiempo, de un
profármaco que es activado por el citocromo P450, se administran a
un individuo.
6. La cápsula de acuerdo con la reivindicación 5,
en la cual la cápsula se administra por inyección y/o por
implantación en las células diana y/o en el sitio de las mismas, y
el profármaco se administra sistémica y/o localmente.
7. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 anteriores, en la cual las células diana son
células de tumores de mama y/o tumores pancreáticos.
8. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7 anteriores, en la cual el profármaco es
ciclofosfamida y/o ifosfamida.
9. Una composición farmacéutica que comprende la
cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 9, que comprende adicionalmente un profármaco, que es
activado por citocromo P450.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 10, en la cual las cápsulas y el profármaco se
formulan en formas diferentes.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 11 que comprende la cápsula en la forma adecuada para
inyección y/o implantación en los órganos diana y/o próxima a dicho
órgano diana, y el profármaco en la forma adecuada para
administración sistémica y/o local.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con
las reivindicaciones 10 a 12 que comprende las cápsulas en la forma
adecuada para la implantación en y/o cerca del tejido de cáncer de
mama o tejido de cáncer pancreático.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con
las reivindicaciones 10 a 13 que comprende ciclofosfamida y/o
ifosfamida como profármaco.
15. La cápsula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 anteriores y un profármaco, que es activado
por el citocromo P450, para uso en el tratamiento de una enfermedad
cancerosa.
16. Uso de la cápsula de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8 para producir una composición
farmacéutica útil para la ablación de células tumorales.
17. Uso de la cápsula de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8 anteriores y un profármaco, que es
activado por el citocromo P450, para producir una composición
farmacéutica.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK352/96 | 1996-03-27 | ||
| DK35296 | 1996-03-27 |
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| Publication Number | Publication Date |
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