CN113106091B - 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用 - Google Patents

一种植物叶片高表达双向启动子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113106091B
CN113106091B CN202110239438.5A CN202110239438A CN113106091B CN 113106091 B CN113106091 B CN 113106091B CN 202110239438 A CN202110239438 A CN 202110239438A CN 113106091 B CN113106091 B CN 113106091B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
bidirectional promoter
promoter
expression
egfp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110239438.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113106091A (zh
Inventor
俞志明
吴玉环
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Normal University
Original Assignee
Hangzhou Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Normal University filed Critical Hangzhou Normal University
Priority to CN202110239438.5A priority Critical patent/CN113106091B/zh
Publication of CN113106091A publication Critical patent/CN113106091A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113106091B publication Critical patent/CN113106091B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C12N2830/205—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron bidirectional
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

一种植物叶片高表达双向启动子及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明一方面提供了一种双向启动子，其特征在于该双向启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明另一方面提供了该双向启动子作为植物叶片高表达双向启动子的应用。本发明的双向启动子，可实现对两边连入基因的高效表达，为涉及需要同时两个载体参与的工作提供了便捷，并可以提高工作效率。

Description

一种植物叶片高表达双向启动子及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物叶片高表达双向启动子及其应用。
背景技术
启动子是紧邻基因转录起始位点上游(即5’端)的一段DNA序列，包含基因时空表达的所有信息。启动子内含有转录因子识别元件及RNA聚合酶II结合位点(Xieet al.,2001)。
根据启动子的表达特点，可分为三类：组成型表达(An et al.,1996)，组织特异表达(Holtorf et al.,1995)和诱导表达(Muthusamy et al.,2017；Osterwalder et al.,2001)。
此外，在植物病毒(Alok et al.2019)，大肠杆菌(Pettis et al.,1988)，农杆菌(Schmülling et al.,1989)，酵母(Neil et al.,2009；Xu et al.,2009)，拟南芥(Dhadiet al.,2009；Liu et al.,2015；Mitra et al.,2009)，水稻(Dhadi et al.,2009)，小鼠(Lennard and Fried,1991；Whitehouse et al.,2004；Zanotto et al.,2007)及人类(Trinklein et al.,2004；Wright et al.,1995)等原核或真核生物基因组中，还普遍存在一类特殊的启动子—双向启动子。这段启动子序列将两个基因以头对头的方式分隔，并能同时转录这两个基因(Baron et al.,1995)。在目前已经报道的双向启动子中，两个基因均分别位于基因组互补的DNA双链上(Liu et al.,2015)。
基于双向启动子两向表达的特点，在拟南芥中(AT1G29920基因与AT1G29930基因同用的双向启动子)驱动GFP及GUS两种报告基因同时表达(Mitra et al.,2009)。利用水稻双向启动子OsBiP1(bidirectionalpromoter)同时驱动CRISPR/Cas9基因编辑系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedprotein 9)两个sgRNA(singleguide)表达，对靶基因的编辑效率分别在75.9-93.3％之间(Ren et al.,2019)。植物抵御害虫是一个复杂的基因调控过程，拟南芥被节肢动物啃食会同时表达AT5G10300和AT5G10290两个基因，这两个基因间也共用一个双向启动子。通过对两个基因表达量分析，发现正义链的基因表达强度要高于反义链的基因(Arnaiz et al.,2019)。
随着合成生物学及植物代谢调控网络研究的深入，可通过基因工程方法对某一个优良性状进行定向改造。比如创制一种在水稻胚乳中富含强抗氧化活性成分花青素(Anthocyanin)的“紫晶米”(Zhu et al.,2017；Zhu and Qian,2017)。花青素的合成是一个复杂的调控网络，涉及众多基因(SsCHS，SsCHI，SsF3H，SsF3’H，SsF3H，SsDFR，SsANS等)。该研究采用七个不同的胚乳特异启动子来分别驱动花青素合成相关基因的表达，再将这些片段整合到两个终载体后进行转基因(Zhu et al.,2017)。
病毒介导基因沉默技术(VIGS,Virus-induced gene silencing)是植物基因功能研究的一种快捷方法。基于TRV病毒(tobacco rattle virus,TRV)构建的VIGS载体被广泛用于植物-病毒互作机制以及基因功能的研究(Liu and Page,2008；Liu et al.,2002；Ratcliff et al.,2001；Senthil-Kumar and Mysore,2014；Tian et al.,2014)。TRV介导的VIGS技术需将TRV病毒基因组拆分成两部分并分别构建载体—pTRV1及pTRV2；目标基因的靶序列需亚克隆至pTRV2载体内。pTRV1及含有靶序列的pTRV2载体分别导入农杆菌后，需要按照农杆菌的细菌数比例为1:1混合，再接种到植物叶片内，才能使病毒系统感染植株，并产生内源靶基因的沉默效果(Liu et al.,2002；Wang et al.,2006)。
双分子荧光互补(BiFC:Bimolecular fluorescence complementation)是验证蛋白质在生物体内互作的重要技术，通常的做法是将荧光蛋白拆分成两个不能发荧光的独立部分，并分别与待验证的两个互作蛋白的基因构建融合载体，转化农杆菌后，按照细菌数比例1:1混合，再接种到植物叶片内。当两个目标蛋白互作后，会将两个荧光蛋白的片段拉近，并组装成完整的荧光蛋白，因此可以根据是否产生荧光来判断两个蛋白质的互作关系(Mehlhorn et al.,2018)。
蛋白质在细胞内的特定场所行使其生物学功能，为了明确蛋白质具体的分布，需要通过已知亚细胞定位蛋白作为基准，采用荧光蛋白共定位的方法来验证目标蛋白的定位情况。通过不同荧光信号的叠加，可以判断目标蛋白的亚细胞定位情况。采用基因融合GFP的方法，以玉米Ubiquitin 1启动子驱动表达细胞核，细胞质，细胞膜，内质网，高尔基体，过氧化物酶体，液泡膜等定位蛋白质(Wu et al.,2016)。构建OsAPX5及OsAPX6蛋白融合DsRed红色荧光蛋白载体，与已知线粒体定位的GFP融合蛋白荧光共定位发现，绿色荧光与红色荧光叠加产生了黄色荧光，说明这两个蛋白也是线粒体定位的(Wu et al.,2016)。在拟南芥中，构建了高尔基体，液泡膜，过氧化物酶体，线粒体，质体，质膜及内质网等细胞器定位蛋白的四种荧光融合蛋白(绿色，青色，黄色及红色荧光)系统供选择(Nelsonetal.,2007)。
以上技术都存在不足：
生物合成技术：需要给每个导入基因配置一个启动子，而采用双向启动子，可以减少一半工作量。
病毒介导的基因沉默：pTRV1与pTRV2，需要构建两个农杆菌。实验工作量增加，且还需要控制农杆菌的浓度比例。
BiFC蛋白质互作实验：需要将荧光蛋白分成两半，导入到两个不同的载体中，并不保证每个细胞都能成功同时导入两个基因。
亚细胞定位：用已知的荧光定位蛋白(marker)和目标蛋白融合的荧光蛋白共定位，经常出现一个细胞内只表达一种蛋白，同时表达两种蛋白的细胞数量偏少。虽然有时会用细胞器特异染料来代替细胞器定位荧光蛋白，比如线粒体定位可以采用MitoTracker染料(Chazotte,2011)，但价格较昂贵。
以上技术都涉及了两个不同载体同时转化的操作步骤，因此会导致效率不高，工作量加大的情况。如通过双向启动子将两个部分整合到一个载体内，则可以极大得提高工作效率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种植物叶片高表达双向启动子及其应用的技术方案。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
本发明一方面提供了一种双向启动子，其特征在于该双向启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
本发明另一方面提供了该双向启动子作为植物叶片高表达双向启动子的应用。
本发明另一方面提供了该双向启动子在驱动目的基因在植物体内转录的应用。
本发明另一方面提供了该双向启动子在培育转基因植物中的应用。
进一步，本发明还提供了含有核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的双向启动子的重组载体。
进一步，本发明还提供了含有核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的双向启动子的转基因细胞系及植株。
进一步，本发明还提供了含有核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的双向启动子的重组微生物。
更进一步，本发明还提供了重组载体、转基因细胞系以及重组微生物及植株在驱动目的基因在植物体内转录的应用。
更进一步，本发明还提供了重组载体、转基因细胞系以及重组微生物在培育转基因植物中的应用。
本发明的双向启动子，可实现对两边连入基因的高效表达，为涉及需要同时两个载体参与的工作提供了便捷，并可以提高工作效率。
附图说明
图1为AT1G52220与AT1G52230物理定位图；
图2为AT1G52220及AT1G52230基因半定量检测；
图3为AT1G52220及AT1G52230定量PCR表达结果；
图4为eGFP/mCherry双荧光载体构建示意图；
图5为AT1G52220/AT1G52230双向启动子驱动eGFP及mCherry在烟草叶片表皮细胞中同时表达。图5A.FITC通道显示的eGFP荧光信号；5B.TRITC通道显示的mCherry荧光信号；5C.FITC和TRITC通道叠加的效果；5D.可见光TD通道下的烟草叶片表皮细胞；
图6为AT3G10850与AT3G10860物理定位图；
图7为AT3G10850与AT3G10860基因半定量检测；
图8为AT3G10850与AT3G10860定量PCR表达结果；
图9为AT3G10850/AT3G10860双向启动子驱动eGFP及mCherry在烟草叶片表皮细胞中同时表达。图9A.FITC通道显示的eGFP荧光信号；图9B.TRITC通道显示的mCherry荧光信号；图9C.FITC和TRITC通道叠加的效果；图9D.可见光TD通道下的烟草叶片表皮细胞。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：通过拟南芥叶片部位的转录组数据，分析并获得在叶片中高表达的AT1G52220与AT1G52230双向启动子。
提取9个实验组4周龄的拟南芥Col-0叶片总RNA，通过加接头构建cDNA文库，通过RNA-seq获得9组转录组测序数据。从9组数据中，选取FPKM(Fragments Per Kilobase oftranscript per Million mapped reads，在每1百万个读长中，每1K个外显子碱基上的片段个数)值均大于100的基因中，发现AT1G52220(355.09,397.26,347.28,419.03,335.92,347.72,360.91,348.58,322.53)及AT1G52230(1252.82,1573.08,1050.41,1448.60,1247.58,1235.70,1195.09,1087.52,985.07)为邻近基因。以稳定表达的内参基因AT4G05320(UBQ10,Ubiquitin 10)，AT1G13320(PP2AA3,PROTEIN PHOSPHATASE 2A SUBUNITA3)作基准，来评估目标基因的表达量高低(Wangetal.,2014)。在9组数据中，两个基因的FPKM值分别为：AT4G05320(61.47,51.62,60.16,35.21,36.90,43.61,58.23,53.25,52.27)，AT1G13320(23.75,24.60,25.44,25.17,25.37,22.37,21.10,24.38,26.70)。
通过TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)对AT1G52220及AT1G52230启动子分析发现，该两个基因共用一个双向启动子，如图1所示。从图1中可以得到，AT1G52220与AT1G52230基因起始密码子ATG之间的共用双向启动子序列长度为296bp。
实施例2：RT-PCR及qRT-PCR验证
利用植物RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，植物总RNA提取试剂盒，DP432)，提取拟南芥Col-0叶片总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA(天根生化科技有限公司，FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂，KR118-02)，进行RT-PCR(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链反应)及real-timeqRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription-PCR，实时定量逆转录聚合酶链反应)检测。
RT-PCR扩增反应体系为20μl：cDNA模板：统一将上样量调成300ng；RT-F(10μM)：0.2μl；RT-R(10μM)：0.2μl；2×Super PfxMasterMix：10μl(康为世纪，CW2965)；ddH2O：补充至20μl总体积。
引物序列如下：
AT1G52220(150bp)-RT-F：
5’-ACTCGAAACCCTAGCAGCAT-3’；
AT1G52220(150bp)-RT-R：
5’-ACCAGCAAAACCCAAACCAA-3’；
AT1G52230(157bp)-RT-F：
5’-TGGCGTCTTTTGCAACCATC-3’；
AT1G52230(157bp)-RT-R：
5’-CCATACTTAGCCACCACAGC-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-F：
5’-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-R：
5’-AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT-3’；
反应程序为：1.94℃变性3min；循环步骤(2-4)：2.94℃变性30sec；3.58℃退火30sec；4.72℃延伸40sec；内参基因为25个循环，靶基因为30个循环；5.72℃延伸5min；反应结束。
同时，也进行real-timeqRT-PCR检测。
反应体系为20μl：2×UltraSYBR Mixture(康为世纪，CW0957)：10μl；cDNA模板：300ng；qRT-F(10μM)：1μl；qRT-R(10μM)：1μl；ddH2O：加至总体积20μl。
引物序列如下：
AT1G52220-qRT(185bp)-F：
5’-TGCCACTTAGGAAATGCCAC-3’；
AT1G52220-qRT(185bp)-R：
5’-ACAATGGCGAAGGCAAAGTT-3’；
AT1G52230-qRT(154bp)-F：
5’-TGGCGTCTTTTGCAACCATC-3’；
AT1G52230-qRT(154bp)-R：
5’-TACTTAGCCACCACAGCACC-3’；
AT1G13320-qRT(51bp)-F：
5’-TAACGTGGCCAAAATGATGC-3’；
AT1G13320-qRT(51bp)-R：
5’-GTTCTCCACAACCGCTTGGT-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-F：
5’-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-R：
5’-AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT-3’；
反应程序为：1.95℃10min；40个循环(2-4)：2.95℃15s；3.58℃15s；4.72℃15s；循环结束；5.95℃15s；6.60℃1min；反应结束。
结果，如图2和3所示。
图2A从左到右，分别是DL2000分子量marker(从上到下的条带，分别表示2,000bp，1,000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，AT1G52220基因RT-PCR条带(AT1G52220(150bp)-RT-F：5’-ACTCGAAACCCTAGCAGCAT-3’；AT1G52220(150bp)-RT-R：5’-ACCAGCAAAACCCAAACCAA-3’；30个循环)，AT1G52230基因RT-PCR条带(AT1G52230(157bp)-RT-F：5’-TGGCGTCTTTTGCAACCATC-3’；AT1G52230(157bp)-RT-R：5’-CCATACTTAGCCACCACAGC-3’；30个循环)。AT1G52220基因及AT1G52230基因都有高表达。
图2B从左到右，分别是DL2000分子量marker，AT4G05320基因RT-PCR条带(AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-F：5’-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG-3’；AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-R：5’-AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT-3’；25个循环)，同样也是AT4G05320基因RT-PCR条带(25个循环)。
图3显示，以AT1G13320基因作为内参，AT1G52220基因与AT1G52230基因的表达量与AT4G05320基因的表达量相比可知，AT1G52220表达量大于AT1G52230的表达量。
由图1启动子的物理定位及图4的载体示意图可以得知，AT1G52220基因启动子驱动mCherry的转录，而AT1G52230基因启动子则驱动eGFP的转录。
实施例3：合成荧光蛋白基因空载体
为了进一步验证双向启动子在植物体内的活性，先构建含有eGFP及mCherry基因的空载体，如图3所示：eGFP基因及mCherry基因以头对头的方式分别分布在互补链上，且被多克隆位点(MCSs)所隔开，eGFP基因的3’端为Nos转录终止子序列，mCherry基因的3’端为35S转录终止子序列。
具体合成步骤为：
首先，人工合成含有多克隆位点的eGFP-MCS-mCherry片段，序列信息如下：
Figure BDA0002961563610000091
Figure BDA0002961563610000101
Figure BDA0002961563610000111
大写字母下划线分别表示EcoR I(5’端)及Hind III(3’端)酶切识别位点，阴影部分序列表示多克隆位点区域(从5’至3’端，对应的限制性内切酶分别为：Srf I-Apa I-AfeI-Spe I-Avr II-BamH I-Kpn I-Asc I-Bsu36 I-Xba I-Sal I-Nru I-Swa I-Pac I-SacI)，加框的序列表示为mCherry及eGFP的起始密码子，删除线表示eGFP和mCherry的终止密码子。
采用酶切-连接法(EcoRI及Hind III)，将合成的eGFP-MCS-mCherry片段连入pCAMBIA1300空载体内，得到pCAMBIA1300-eGFP-mCherry载体。
实施例4：AT1G52220/AT1G52230双向启动子合成序列(896bp)
拟南芥启动子的平均长度为500bp(
Figure BDA0002961563610000113
2014)，而AT1G52220/AT1G52230共有的双向启动子只有296bp，为了尽可能保证启动子的有效性，延长这段双向启动子序列，而为了保证这段序列中不产生基因转录本，将序列中出现的起始密码子ATG全部突变成CTG。
AT1G52220/AT1G52230双向启动子序列(896bp)如下所示(如SEQ ID No.1所示)：
Figure BDA0002961563610000112
Figure BDA0002961563610000121
序列中小写下划线为ATG突变成CTG，方框内序列表示AT1G52220/AT1G52230基因的起始密码子突变成CTG。启动子中的点突变会影响基因表达水平(Bucheletal.,1999；
Figure BDA0002961563610000122
2014)，也会影响基因表达模式(Yinetal.,1997)。因此，还需要验证人工改造后的双向启动子是否在植物体内还具有高效表达。
取10μg人工直接合成的promoterAT1G52220/30片段与1μg的实施例4得到的pCAMBIA1300-eGFP-mCherry空载体质粒分别用BamH I(NEB,#R3136S)及Kpn I(NEB,#R3142S)双酶切，37℃酶切3小时。割胶回收酶切反应产物，用T4 DNA连接酶(TAKARA，2011B)16℃连接12小时(线性化载体与启动子片段摩尔比为1:8)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含Kan抗性的LB平板，37℃倒置放置培养过夜。挑取克隆，进行PCR鉴定(检测引物为：PromoterAT1G52220/30-(245bp)-F:5’-ACGTGGCATTTCCTAAGTGG-3’；PromoterAT1G52220/30-(245bp)-R:5’-GGCAAGAGAGCTACCTCCAA-3’)，反应程序为：1.94℃变性3min；循环步骤(2-4)：2.94℃变性30sec；3.58℃退火30sec；4.72℃延伸30sec；35个循环；5.72℃延伸5min；反应结束。
获得的阳性克隆测序验证正确后，得到pCAMBIA1300-eGFP-mCherry-promoterAT1G52220/30载体。将100ng质粒通过电击转化系统(Gene Pulser XcellTM,BioRad)，在2400V电压下，将pCAMBIA1300-eGFP-mCherry-promoterAT1G52220/30质粒导入GV3101农杆菌感受态细胞内。
实施例5：烟草叶片瞬时表达
将含有pCAMBIA1300-eGFP-mCherry-promoterAT1G52220/30质粒的GV3101农杆菌进行扩繁，培养至OD600＝0.8～1.0后，4000rpm离心2min，收集菌体，加入等体积的无菌水后涡旋振荡至菌体分布均匀，用无针头的1ml注射器注射至1个月龄舒展完好的烟草叶片背面。接种3天后，Confocal观察荧光，结果如图5所示。
由图5A可见，在FITC通道中，可见绿色荧光信号，说明启动子驱动了eGFP基因的转录，并表达了eGFP蛋白；在TRITC通道中(图5B)，可见红色荧光信号，说明启动子也驱动了mCherry基因的转录，并表达了mCherry蛋白。在图5C中可见，黄色荧光的即为eGFP及mCherry蛋白叠加后的效果。
由此得知，在烟草叶片内AT1G52220/30双向启动子仍然有效，并从5’到3’方向上驱动eGFP的表达，从3’到5’方向上驱动mCherry基因的表达。
实施例6：通过拟南芥叶片部位的转录组数据，分析并获得在叶片中高表达的AT3G10850与AT3G10860双向启动子。
提取9个实验组4周龄的拟南芥Col-0叶片总RNA，通过加接头构建cDNA文库，通过RNA-seq获得9组转录组测序数据。从9组数据中，选取FPKM(Fragments Per Kilobase oftranscript per Million mapped reads，在每1百万个读长中，每1K个外显子碱基上的片段个数)值均大于100的基因中，发现AT3G10850(128.07,129.25,130.46,126.06,120.61,123.94,118.88,126.41,141.18)及AT3G10860(234.78,151.80,269.46,173.41,202.35,207.98,208.61,189.97,259.48)为邻近基因。以稳定表达的内参基因AT4G05320，AT1G13320作基准，来评估目标基因的表达量高低(Wangetal.,2014)。在9组数据中，两个基因的FPKM值分别为：AT4G05320(61.47,51.62,60.16,35.21,36.90,43.61,58.23,53.25,52.27)，AT1G13320(23.75,24.60,25.44,25.17,25.37,22.37,21.10,24.38,26.70)。
通过TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)对AT3G10850及AT3G10860启动子分析发现，该两个基因共用一个双向启动子，如图6所示，AT3G10850与AT3G10860基因起始密码子ATG之间的共用双向启动子序列长度为292bp。
实施例7：RT-PCR及qRT-PCR验证
利用植物RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，植物总RNA提取试剂盒，DP432)，提取拟南芥Col-0叶片总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA(天根生化科技有限公司，FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂，KR118-02)，进行RT-PCR(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链反应)及real-timeqRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription-PCR，实时定量逆转录聚合酶链反应)检测。
RT-PCR扩增反应体系为20μl：cDNA模板：统一将上样量调成300ng；RT-F(10μM)：0.2μl；RT-R(10μM)：0.2μl；2×Super PfxMasterMix：10μl(康为世纪，CW2965)；ddH2O：补充至20μl总体积。
引物序列如下：
AT3G10850-RT(228bp)-F：5’-GGCTGAGAAGCACCAAGCTA-3’；
AT3G10850-RT(228bp)-R：5’-CCCTTGGTGTGACAAGGAGT-3’；
AT3G10860-RT(146bp)-F：5’-ACCGGTCTCTGGAAGGATCT-3’；
AT3G10860-RT(146bp)-R：5’-AATCTGTGCTCAAGCTTCTCC-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-F：5’-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-R：5’-AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT-3’；
反应程序为：1.94℃变性3min；循环步骤(2-4)：2.94℃变性30sec；3.58℃退火30sec；4.72℃延伸40sec；内参基因为25个循环，靶基因为30个循环；5.72℃延伸5min；反应结束。
同时，也进行real-timeqRT-PCR检测。
反应体系为20μl：2×UltraSYBR Mixture(康为世纪，CW0957)：10μl；cDNA模板：300ng；qRT-F(10μM)：1μl；qRT-R(10μM)：1μl；ddH2O：加至总体积20μl。
引物序列如下：
AT3G10850-qRT(161bp)-F：5’-TTCCGGAGGAGAAGGACGAT-3’；
AT3G10850-qRT(161bp)-R：5’-CTTCTCAGCCGATGCGATCA-3’；
AT3G10860-qRT(129bp)-F：5’-CCGGAACACTAGCTGTATCATCA-3’；
AT3G10860-qRT(129bp)-R：5’-AATTGAACCGGATGACCGGC-3’；
AT1G13320-qRT(51bp)-F：5’-TAACGTGGCCAAAATGATGC-3’；
AT1G13320-qRT(51bp)-R：5’-GTTCTCCACAACCGCTTGGT-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-F：5’-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG-3’；
AT4G05320-(q)RT(Ubq10,61bp)-R：5’-AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT-3’；
反应程序为：95℃10min；40个循环(2-4)：95℃15s；58℃15s；72℃15s；循环结束；95℃15s；6.60℃1min；反应结束。
图7A从左到右，分别是DL2000分子量marker(从上到下的条带，分别表示2,000bp，1,000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，AT3G10850基因RT-PCR条带(30个循环)，AT3G10860基因RT-PCR条带(30个循环)。AT3G10850基因及AT3G10860基因都有高表达。图7B从左到右，分别是DL2000分子量marker，AT4G05320基因RT-PCR条带(25个循环)，同样也是AT4G05320基因RT-PCR条带(25个循环)。
图8显示，以AT1G13320基因作为内参，AT3G10850基因与AT3G10860基因的表达量与AT4G05320基因的表达量相比可知，AT3G10860表达量大于AT3G10850的表达量。
从两基因共用一个启动子的分析图(图6)及载体示意图(图4)可知，AT3G10850基因启动子驱动mCherry的转录，而AT3G10860启动子则驱动eGFP的转录。
实施例8：AT3G10850/AT3G10860双向启动子合成序列(892bp)
拟南芥启动子的平均长度为500bp(
Figure BDA0002961563610000162
2014)，而AT3G10850/AT3G10860共有的双向启动子只有292bp，为了尽可能保证启动子的有效性，延长这段双向启动子序列，而为了保证这段序列中不产生基因转录本，将序列中出现的起始密码子ATG全部突变成CTG。
AT3G10850/AT3G10860双向启动子序列(892bp)如下所示(如SEQ ID No.2所示)：
Figure BDA0002961563610000161
Figure BDA0002961563610000171
序列中小写下划线为ATG突变成CTG，方框内序列表示AT3G10850/AT3G10860基因的起始密码子突变成CTG。启动子中的点突变会影响基因表达水平(Bucheletal.,1999；
Figure BDA0002961563610000172
2014)，也会影响基因表达模式(Yinetal.,1997)。因此，还需要验证人工改造后的双向启动子在植物体内是否还具有高效表达。
取10μg人工直接合成的promoterAT3G10850/60片段与1μg实施例4得到的pCAMBIA1300-eGFP-mCherry空载体质粒分别用BamH I(NEB,#R3136S)及Kpn I(NEB,#R3142S)双酶切，37℃酶切3小时。割胶回收酶切反应产物，用T4 DNA连接酶(TAKARA，2011B)16℃连接12小时后(线性化载体与启动子片段摩尔比为1:8)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含Kan抗性(50mg/L)的LB平板，37℃倒置放置培养过夜。挑取克隆，进行PCR鉴定(检测引物为：PromoterAT3G10850/60-(216bp)-F:5’-TCTTGCAGACAAGGAACGTG-3’；PromoterAT3G10850/60-(216bp)-R:5’-TCCGATTCCGGTTCAGTTAC-3’)，反应程序为：94℃变性3min；循环步骤：94℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸30sec；35个循环；72℃延伸5min；反应结束。
获得的阳性克隆测序验证正确后，得到pCAMBIA1300-eGFP-mCherry-promoterAT3G10850/60载体。将100ng质粒，通过电击转化系统(Gene Pulser XcellTM,BioRad)，在2400V电压下，将pCAMBIA1300-eGFP-mCherry-promoterAT3G10850/60质粒导入GV3101农杆菌感受态细胞内。
实施例9：烟草叶片瞬时表达
将含有pCAMBIA1300-eGFP-mCherry-promoterAT3G10850/60质粒的GV3101农杆菌进行扩繁，培养至OD600＝0.8～1.0后，4000rpm离心2min，收集菌体，加入等体积的无菌水后涡旋振荡至菌体分布均匀，用无针头的1ml注射器注射至1个月龄舒展完好的烟草叶片背面。接种3天后，Confocal观察荧光，结果如图9所示。
由图9A可见，在FITC通道中，可见绿色荧光信号，说明启动子驱动了eGFP基因的转录，并表达了eGFP蛋白；在TRITC通道中(图9B)，可见红色荧光信号，说明启动子也驱动了mCherry基因的转录，并表达了mCherry蛋白。在图9C中可见，黄色荧光的即为eGFP及mCherry蛋白叠加后的效果。
由此得知，在烟草叶片内AT3G10850/AT3G10860双向启动子仍然有效。并从5’到3’方向上驱动eGFP的表达，从3’到5’方向上驱动mCherry基因的表达。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 896
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
aatcaaaact aaggcagata tgtaactgag aacagagtct aatgtagggt ttatagagat 60
ttagggactc acaacagtct gaatcgtact aacaacgtcg agatcagtcg atgaatctga 120
gctttctcca ctagctttca ccagcagact gatgctgcta gggtttcgag taagagataa 180
tggagaaaga tcagtcgtac ctcgagttag agaaaatggg agtttttgaa tcgatgtgag 240
attggatttt ctctgtgtga gtaacaatgg cgaaggcaaa gttgcagaaa ttgaagccag 300
tctttaaaaa aataaaaaga acagaacaaa aaaattgaaa ctttagagat tttgattcga 360
ttttggagac agagacgaag aaatttttgg ttatggatta gagatagcct tatcttttta 420
taatccacgt ggcatttcct aagtggcata tcaaatctca aagatgacaa cccaattcgc 480
cacgtggcag aacaagatct atcaaatgag tgaagaagat tctccactat acaaattaca 540
tcaatccact cacttacttt ggcaacaaac aaacaacaac aaagagagaa attaacctgg 600
cgtcttttgc aaccatcgcc gccgtacaac cttctgccgc cgtgaaagga cttggaggta 660
gctctcttgc cggagctaag ctcttcatca aaccttctcg ccaaagcttc aaaaccaaat 720
ccaccaggta aagtttaaag ctttgaaatt tggaatcttg gattgacatt gctgaggatt 780
ggtattaaag aaaggctgtt acttttgatt gtttgtgtag agctggtgct gtggtggcta 840
agtctggaga caaaagtgta tactttgatt tagaagattt gggtaacaca acagga 896
<210> 2
<211> 892
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 2
accagtgaca gagagagaag tgaggtttac ttaccagtga tgatgcgtag tgagtacgaa 60
cttgatctta gcttggtgct tctcagccga tgcgatcacc ttctccggat caactgaatc 120
cacaaccgcc gcgtctccgg tgctctcagc gattatcctg tttttttttt acgaagaaag 180
aatcctaaac tgatgatgaa ccgagtcaga ttaagaagca acgaaattga agtaggatat 240
caaaatggct cacagataag agtagttgtc ttgcagacaa ggaacgtgga agatcttcag 300
cgtctcctta gatcgatcgt ccttctcctc cggaacacta gctgtatcat catcatcatt 360
tatgtctgga ctagtgattt atctatttcg gtttactcaa accggatcga accgaaacaa 420
atcaggataa attttgcagc cggtcatccg gttcaattgt aattgtaact gaaccggaat 480
cggataaaaa acataagctt cgttgagaat tgtttatttt aggttttggg ggagattcgt 540
tctcgtactg tggattgttg ttgttgggat tatctgggaa gagaaaaaga aactggggaa 600
gcagccggtg aaattgaagg cggtggttta cgcactttct ccgtttcagc agaagatcct 660
gaccggtctc tggaaggatc tgccggagaa gatccaccac aaggtctctg agaattggat 720
cagcgccact cttctcgtta cccctgtcgt tggaacctac tggtactcta tctctctttc 780
tatctctctc atcaatcgat tggtaaagga acctttggat cgagttccga tctggttgat 840
tgttcttcga tctgtgtcat cggtcttgtg cggcgcatct ggatataggg tt 892

Claims (9)

1.一种双向启动子，其特征在于该双向启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示。
2.如权利要求1所述的双向启动子作为植物叶片高表达双向启动子的应用。
3.如权利要求1所述的双向启动子在驱动目的基因在植物体内转录的应用。
4.如权利要求1所述的双向启动子在培育转基因植物中的应用。
5.含有权利要求1所述的双向启动子的重组载体。
6.含有权利要求1所述的双向启动子的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述的双向启动子的重组微生物。
8.如权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的转基因细胞系以及权利要求7所述的重组微生物在驱动目的基因在植物体内转录的应用。
9.如权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的转基因细胞系以及权利要求7所述的重组微生物在培育转基因植物中的应用。
CN202110239438.5A 2021-03-04 2021-03-04 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用 Active CN113106091B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110239438.5A CN113106091B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110239438.5A CN113106091B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113106091A CN113106091A (zh) 2021-07-13
CN113106091B true CN113106091B (zh) 2022-08-16

Family

ID=76709839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110239438.5A Active CN113106091B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113106091B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2298745T3 (es) * 2003-04-24 2008-05-16 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Promotores bidireccionales de sintesis y utilizacion de los mismos.
CN108441516A (zh) * 2018-03-27 2018-08-24 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用
CN111893118B (zh) * 2020-07-31 2022-10-21 四川大学 一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113106091A (zh) 2021-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108130342B (zh) 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法
EP2484772A1 (en) Methods for dynamic vector assembly of DNA cloning vector plasmids
CA2564039A1 (en) Methods for assembling multiple expression constructs
CN109266650B (zh) 一种诱导型启动子、其重组载体、转化体以及诱导基因表达的方法及其应用
CN113106091B (zh) 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用
CN112980847A (zh) 一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI3及其克隆与应用
CN107435044B (zh) 水稻雄蕊特异表达的启动子及其应用
CN113061606B (zh) 植物叶片高表达双向启动子及其应用
CN113061607B (zh) 一种植物叶片高表达at2g34420/at2g34430双向启动子及其应用
CN111593050B (zh) 一种参与番茄红素生物合成的蛋白激酶的应用
CN108424911B (zh) 种子特异性双向启动子及其应用
CN109504680B (zh) 盐胁迫诱导型启动子及其引物、表达载体和应用
CN109355291B (zh) 一种植物胚乳特异性表达启动子pOsEnS93的鉴定和应用
CN113512547A (zh) 一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1及其克隆与应用
CN108165552B (zh) 一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用
US11390877B2 (en) Blue-grained genes in wheat and application thereof
CN107099531B (zh) 一种花药特异表达启动子pv4及其应用
Masood et al. Cloning and expression analysis of dhordein hybrid promoter isolated from barley (Hordeum vulgare L.)
CN110129357A (zh) 一种无标签用于基因编辑的试剂组合及其应用
CN107446926B (zh) 盐生草HgNHX基因启动子序列及其应用
CN116254267B (zh) 橡胶草乳管特异性表达启动子及其应用
CN114908111B (zh) 连续克隆长dna片段的方法和系统
RU2762830C1 (ru) Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, для геномного редактирования однодольных зерновых культур на основе двойного отбора растений
CN109913450B (zh) 水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP3及其应用
CN109913449B (zh) 水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP4及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210713

Assignee: Hangzhou kangban CHONGHUI Technology Co.,Ltd.

Assignor: Hangzhou Normal University

Contract record no.: X2023980035581

Denomination of invention: A plant leaf highly expressed bidirectional promoter and its application

Granted publication date: 20220816

License type: Common License

Record date: 20230516

Application publication date: 20210713

Assignee: Hangzhou Matrix Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Assignor: Hangzhou Normal University

Contract record no.: X2023980035555

Denomination of invention: A plant leaf highly expressed bidirectional promoter and its application

Granted publication date: 20220816

License type: Common License

Record date: 20230516

Application publication date: 20210713

Assignee: Zhejiang Hengxin Pharmaceutical Co.,Ltd.

Assignor: Hangzhou Normal University

Contract record no.: X2023980035560

Denomination of invention: A plant leaf highly expressed bidirectional promoter and its application

Granted publication date: 20220816

License type: Common License

Record date: 20230516

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210713

Assignee: Hangzhou Jiyan Precision Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Hangzhou Normal University

Contract record no.: X2023980035755

Denomination of invention: A plant leaf highly expressed bidirectional promoter and its application

Granted publication date: 20220816

License type: Common License

Record date: 20230520

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract