CN111593050B

CN111593050B - 一种参与番茄红素生物合成的蛋白激酶的应用

Info

Publication number: CN111593050B
Application number: CN202010382706.4A
Authority: CN
Inventors: 周忠静; 邓志平; 谭金娟
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-05-08
Also published as: CN111593050A

Abstract

本发明属于核酸技术领域，具体涉及到一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的序列，包含该序列的载体和宿主细胞。本发明还涉及一种提高番茄红素和/或β‑胡萝卜素含量的方法、SlSnRK2.6基因在调控番茄红素和/或β‑胡萝卜素的含量中的应用以及一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的试剂盒。通过本发明，成功地构建了其中SlSnRK2.6基因沉默的转基因番茄，所述转基因番茄的果实中番茄红素和β‑胡萝卜素含量升高。由此可见，SlSnRK2.6基因在番茄红素合成中具有重要调控作用。

Description

一种参与番茄红素生物合成的蛋白激酶的应用

技术领域

本发明涉及核酸技术领域，具体涉及对蛋白激酶SlSnRK2.6的调控及其应用。

背景技术

植物激素脱落酸(Abscisic acid，ABA)在植物的生长发育和适应应激反应的过程中具有重要的作用，其生物合成和信号转导途径已有很多研究报道(Cutler et al.,2010)。在番茄果实发育过程中，针对ABA生物合成和信号转导过程中的关键因子，已有许多研究报道(Ji et al.,2014；Kai et al.,2019；Sun et al.,2012；Sun et al.,2011；Zhanget al.,2018)。蔗糖非发酵相关的蛋白激酶(Sucrose non-fermenting-1-Relatedprotein Kinase,SnRK)是一类丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,通过磷酸化修饰靶蛋白来调控多种信号途径的相互联系,在植物生长发育和胁迫应激反应中起着至关重要的作用(Yang et al.,2019)。

番茄红素是番茄果实中主要的类胡萝卜素成分之一，具有抗氧化、提高人体免疫力等多种生理功能。随着人类生活水平的提高，针对提高番茄红素育种的番茄育种工作正积极的展开。调节番茄红素合成途径中的关键酶有八氢番茄红素合成酶(PhytoeneSynthase，PSY)和八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase，PDS)。随着分子生物学技术的发展，对番茄红素生物合成途径研究比较多，分子机制已得到详细的阐述。

番茄红素的生物合成途径已有广泛的研究，但是其各合成基因的详细表达调控分子机制还不甚清楚，关键基因的网络调控分子机理还需进一步完善。

因此，本领域亟需一种可以促进番茄红素生物合成的方案，从而提高番茄红素的含量。

发明内容

如上所述，番茄红素的生物合成途径已有广泛的研究，但是其各合成基因的详细表达调控分子机制还不甚清楚，关键基因的网络调控分子机理还需进一步完善。为此，本发明人通过RNA干扰的方法，首次构建了SlSnRK2.6基因的干扰载体，并将其转化番茄果实Mico-Tom，得到了番茄SlSnRK2.6基因沉默的转基因植株，并对其进行了功能研究。结果发现，SlSnRK2.6基因在番茄红素合成中具有重要调控作用。基于该发现，本发明人完成了本发明。

因此，在本发明的第一方面，提供了一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的序列，所述序列包含SEQ ID NO:1所示的序列。

在本发明的第二方面，提供了一种载体，其特征在于，所述载体包含本发明第一方面的序列。

在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含本发明第二方面的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种提高番茄红素和/或β-胡萝卜素含量的方法，所述方法抑制或者降低SlSnRK2.6基因的表达。

在本发明的第五方面，提供了一种SlSnRK2.6基因在调控番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量中的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的试剂盒，包括：a)本发明第二方面的载体、或者第三方面的宿主细胞；以及b)干扰SlSnRK2.6基因表达的使用说明。

由于SlSnRK2.6基因的表达与植物中番茄红素和β-胡萝卜素的含量有关，因此可以将其用于构建转基因番茄，所述转基因番茄可提高番茄红素含量和β-胡萝卜素含量。

附图说明

下面对本发明的附图进行简单介绍。

图1示出克隆的PCR产物片段的电泳图；

图2示出35S::SlSnRK2.6::RNAi克隆载体的图谱；

图3示出pENTR::SlSnRK2.6载体菌液PCR电泳图；

图4示出35S::SlSnRK2.6::RNAi干扰表达载体的图谱；

图5示出35S::SlSnRK2.6::RNAi干扰载体菌液PCR电泳图；

图6示出转基因苗进行PCR验证的电泳图；

图7示出35S::SlSnRK2.6::RNAi转基因番茄果实的颜色；

图8示出35S::SlSnRK2.6::RNAi转基因番茄在BR+9时期果实中番茄红素和β-胡萝卜素的含量(初提物)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具体描述的实施方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求书来进行限定。

因此，在本发明的第一方面，提供了一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的序列，所述序列包含SEQ ID NO:1所示的序列。在此，SEQ ID NO:1的序列如下：

ACTTGGTGCTGGGAATTTTGGAGTAGCAAGGTTAGTTAAGGATAAGAAGACAAAGGAGCTTTTAGCTGTCAAATATATAGAAAGAGGGAAAAAGATTGATGAGAATGTGCAGAGAGAAATTATAAATCATAGATCGTTGAGGCATCCGAACATTGTCAGGTTTAAAGAGGTCCTGGTAACTCCGTCGCATTTGGCAATTGTTATGGAGTACGCAGCAGGTG

SlSnRK2.6基因是番茄中一个蔗糖非发酵相关的蛋白激酶，与拟南芥中的SnRK2.6高度同源，在番茄中对应的基因编号为Solyc08g077780。据研究报道，SlSnRK2.6基因参与植物渗透胁迫和ABA信号转导途径调控，在番茄果实中有表达，但详细调控番茄果实发育的分子机制不清楚。本领域技术人员可知，该基因可以具有SEQ ID NO.2所示出的核苷酸序列：

ATGGAGGAAAAATATGAGCTTTTGAAGGAACTTGGTGCTGGGAATTTTGGAGTAGCAAGGTTAGTTAAGGATAAGAAGACAAAGGAGCTTTTAGCTGTCAAATATATAGAAAGAGGGAAAAAGATTGATGAGAATGTGCAGAGAGAAATTATAAATCATAGATCGTTGAGGCATCCGAACATTGTCAGGTTTAAAGAGGTCCTGGTAACTCCGTCGCATTTGGCAATTGTTATGGAGTACGCAGCAGGTGGAGAACTTTTTGGTAGAATATGCAGTGCTGGCAGATTTAGTGAAGACGAGGCTCGCTTCTTCTTCCAACAGCTTATATCCGGTGTCAGCTACTGTCATACCATGGAAATTTGTCACAGGGACTTGAAACTTGAAAACACTCTTCTTGATGGAAGTCCTTCACCGCGTCTAAAAATATGCGATTTTGGTTATTCCAAGTCTGGTTTACTGCATTCACAACCAAAGTCGACTGTGGGAACTCCTGCTTACATTGCCCCTGAGGTCCTGTCACGAAAGGAATATGATGGGAAGATCGCAGACGTGTGGTCATGTGGAGTGACACTATATGTAATGTTAGTAGGAGCATACCCTTTTGAGGATCCTGAAGATCCGAAAAACTTCAGGAAAACCATTGGGAGAATAATGAGCGCCCAACACTCCATACCCGATTATGTACGAGTCACACCAGATTGCAGGAACCTCCTTTCGCGAATCTTTGTTGCAAATCCCTCTAAGAGGATAACTATTCCTGAGATAAAGAAACATCCTTGGTTCTTAAAGAATCTACCAAAAGAGCTGATGGATGTTGAGCACGCGAGATTCGAAGAAGCTTCAGAGCAACTACAACAAAGTGTTGAAGAAATCATGAAGATGATACAAGAAGCTAAAGTACCTGGAGTAGTGTCAAAATCTGAAGGGAAAGATCCTGCAGGGACAGCAGAACAAGATGATTTAGAGGAAGACCTCGAATCGGAAATCGACAGCAGCAATGACTTTGCTGTTTATGTCTGA

SlSnRK2.6基因编码的蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，如下：

MEEKYELLKELGAGNFGVARLVKDKKTKELLAVKYIERGKKIDENVQREIINHRSLRHPNIVRFKEVLVTPSHLAIVMEYAAGGELFGRICSAGRFSEDEARFFFQQLISGVSYCHTMEICHRDLKLENTLLDGSPSPRLKICDFGYSKSGLLHSQPKSTVGTPAYIAPEVLSRKEYDGKIADVWSCGVTLYVMLVGAYPFEDPEDPKNFRKTIGRIMSAQHSIPDYVRVTPDCRNLLSRIFVANPSKRITIPEIKKHPWFLKNLPKELMDVEHARFEEASEQLQQSVEEIMKMIQEAKVPGVVSKSEGKDPAGTAEQDDLEEDLESEIDSSNDFAVYV

如上所述，本发明人发现，在用其中SlSnRK2.6基因的干扰载体转化番茄果实Mico-Tom所得到的转基因植株中，番茄红素和β-胡萝卜素的含量均显著提高。由此可见，干扰SlSnRK2.6基因的表达能显著提高植株中番茄红素和β-胡萝卜素的含量。

在这里，本发明人采用的SEQ ID NO:1所示的序列来构建SlSnRK2.6基因的干扰载体，进而用于转化番茄果实获得转基因植株。但是可以理解，本发明的最主要发明点在于发现了SlSnRK2.6基因参与到番茄红素和β-胡萝卜素的合成中，并由此完成了本发明。因此，尽管本发明人采用了SEQ ID NO:1来进行SlSnRK2.6基因表达的干扰，但是任何其他能够干扰SlSnRK2.6基因表达的序列也都在本发明的范围内。

另外，还需要理解，在本文中，所谓“干扰”是指使SlSnRK2.6基因的表达下调(如敲低)或者被彻底抑制(如沉默或敲除)。当然，优选地，所述SlSnRK2.6基因的表达被彻底抑制，从而使得转基因植株中的番茄红素和β-胡萝卜素的含量增加。

在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第一方面的序列。

所谓“载体”是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。理想的载体需要具备以下几个条件：(1)在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；(2)有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；(3)含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失；(4)有一定的标记基因，便于进行筛选；(5)载体DNA分子大小应合适，以便操作。

按照来源，载体可以分为质粒载体、噬菌体载体、或者动物或植物病毒载体等。按照功能，载体可以分为克隆载体、表达载体、干扰载体等。这些载体的概念在本领域都是熟知的，本领域技术人员可以根据现有技术进行构建和利用。

因此，在一个实施方案中，所述载体为质粒载体、噬菌体载体、或植物病毒载体；优选地，所述载体为质粒载体。在另一个实施方案中，所述载体为克隆载体如pENTR或者干扰载体如pK7GWIWG2(II)。

在构建好载体之后，需要将其引入到合适的宿主细胞中，以实现目的基因的表达。

在所述载体为质粒载体的情况下，所述宿主细胞可以为大肠杆菌细胞。当将质粒载体引入到大肠杆菌细胞内时，目的基因便会在其中表达。

在所述载体为干扰载体的情况下，所述宿主细胞可以是农杆菌细胞如根癌农杆菌细胞。在将所述干扰载体引入农杆菌细胞内后，进一步地利用农杆菌介导法可以将携带所述干扰载体的农杆菌引入植物细胞内，并使插入片段在其中表达，由此干扰目的基因(在本发明中为SlSnRK2.6基因)的表达。

因此，在一个实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

如上所述，由于SlSnRK2.6基因与番茄红素和β-胡萝卜素的生物合成相关，因此调控SlSnRK2.6基因的表达会影响到番茄红素和β-胡萝卜素的含量。在本文中，可以通过本领域已知的任何技术(如基因沉默、基因敲低或敲除等)来抑制或者降低SlSnRK2.6基因的表达，以提高番茄红素和β-胡萝卜素的含量。

因此，在一个实施方案中，可以利用SEQ ID NO:1所示的序列来干扰(抑制或降低)SlSnRK2.6基因的表达，从而提高番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量。

在另一个实施方案中，可以利用本发明的包含SEQ ID NO:1的载体来使SEQ IDNO:1所示的序列干扰(抑制或者降低)SlSnRK2.6基因的表达，从而提高番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量。

在又一个实施方案中，可以利用本发明的包含SEQ ID NO:1的宿主细胞(例如农杆菌细胞)来干扰(抑制或者降低)SlSnRK2.6基因的表达，从而提高番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量。

可以理解，尽管本文具体示出了SEQ ID NO:1序列以及包含该序列的载体或者宿主细胞，但是任何其他可以干扰SlSnRK2.6基因表达的序列、载体或者宿主细胞均在本发明的范围内。

如上所述，由于SlSnRK2.6基因与番茄红素和β-胡萝卜素的生物合成相关，因此调控SlSnRK2.6基因的表达会影响到番茄红素和β-胡萝卜素的含量。具体地，可以通过本领域已知的任何技术(如基因沉默、基因敲低或敲除等)来抑制或者降低SlSnRK2.6基因的表达，以提高番茄红素和β-胡萝卜素的含量。例如，可以通过SEQ ID NO:1或者包含该序列的载体或宿主细胞来抑制或者降低SlSnRK2.6基因的表达，以提高番茄红素和β-胡萝卜素的含量，但是本发明不限于此，任何可以抑制或者降低SlSnRK2.6基因表达的序列、载体或宿主细胞、或者任何其他手段均可以使用，藉此来提高番茄红素和β-胡萝卜素的含量。

在本发明的第六方面，提供了一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的试剂盒，包括：a)本发明第二方面的载体、或者本发明第三方面的宿主细胞；以及b)干扰SlSnRK2.6基因表达的使用说明。

由于SlSnRK2.6基因的表达与植物中番茄红素和β-胡萝卜素的含量有关，更具体地，抑制或者降低SlSnRK2.6基因的表达会提高植物中番茄红素和β-胡萝卜素的含量。因此，可以构建SlSnRK2.6基因表达被抑制或者降低(例如通过基因敲除、基因敲低或者干扰载体的使用)的转基因番茄，所述转基因番茄能够提高番茄红素含量和β-类胡萝卜素含量。

下面将结合实施例和附图对本发明进行详细阐释。需注意，以下实施例仅出于阐述本发明之目的提供，无意于限制本发明的范围；本发明的范围由随附权利要求书确定。

实施例

实施例1.构建SlSnRK2.6基因RNAi干扰载体

载体构建使用Invitrogen公司的

Cloning试剂盒，并按照说明书的说明进行操作。通过对SlSnRK2.6基因全长序列(SEQ ID NO:2)的分析，选取一段长221bp的序列(SEQ ID NO:1)作为干扰用目的片段，设计引物如下：

SlSnRK2.6::RNAi-L:5’-ACTTGGTGCTGGGAATTTTG-3’(SEQ ID NO:4)

SlSnRK2.6::RNAi-R:5’-CACCTGCTGCGTACTCCATA-3’(SEQ ID NO:5)

以番茄果实的cDNA为模板，通过PCR扩增得到序列片段。PCR扩增体系为25μl，包括：

高保真酶2×High-Fidelity Master Mix：12.5μl

SlSnRK2.6::RNAi-L：1μl

SlSnRK2.6::RNAi-R：1μl

cDNA模板：1μl

灭菌水：9.5μl

PCR扩增程序为：95℃5分钟；35个循环：95℃，45秒钟，56℃，30秒钟，72℃，30秒钟；72℃，10分钟。

然后将所得PCR扩增产物用1.5％琼脂糖进行电泳。图1示出了克隆的PCR产物片段的电泳图，其中左边的泳道为全式金Trans2K PlusII DNA Marker，泳道1为PCR扩增产物。从该图中可以看出，扩增得到了特异性好的PCR产物条带，该条带为克隆的用于基因干扰的221bp片段，即SEQ ID NO:1。该条带特异的PCR产物可以直接利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。

接着，将该基因特异的PCR产物(SEQ ID NO:1)首先插入到克隆载体pENTR中，克隆载体pENTR的图谱见图2。详细的实验方法根据

Cloning试剂盒，并按照说明书的说明进行操作，得到35S::SlSnRK2.6::RNAi克隆载体pENTR::SlSnRK2.6，并利用菌液PCR进行鉴定，结果示于图3，图中，最左边的泳道是全式金Trans2KPlusII DNA Marker，泳道1-6为菌液PCR产物。选取条带较亮的单菌落，提取质粒，由此得到RNAi的克隆质粒pENTR::SlSnRK2.6。

然后将得到的RNAi的克隆质粒pENTR::SlSnRK2.6通过Gateway LR反应交换重组到RNAi载体pK7GWIWG2(II)(图4)中。RNAi载体pK7GWIWG2(II)的构建方法具体如下：将LR反应体系(0.5μl克隆的质粒pENTR::SlSnRK2.6、1μl原始质粒pK7GWIWG2(II)、1μl 1×TEbuffer)放冰上2分钟，之后加入0.5μl LR反应的酶(Proteinase K)，25℃过夜。第二天，在LR反应体系中加入0.3μl Proteinase K，于37℃放置10分钟，然后终止反应，将所有LR反应的产物转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR鉴定。具体地，挑取单菌落，并以挑取的单菌落为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为20μl，包括：

PCR扩增酶2×TS INGKE：10μl

Kana-L：1μl

SlSnRK2.6::RNAi-R：1μl

菌液：1μl

灭菌水：7μl

PCR扩增程序为：94℃5分钟；35个循环：94℃45秒钟，55℃30秒钟，72℃2分钟；72℃10分钟。

然后将PCR扩增产物用1％琼脂糖进行电泳。图5示出了所得电泳图，其中最左边的泳道为全式金Trans2K PlusII DNA Marker，泳道1-3为菌液PCR产物。由此可见，本发明人成功地构建了SlSnRK2.6基因RNAi干扰载体。选取条带较亮的单菌落，提取质粒，由此得到RNAi载体pK7GWIWG2(II)。

实施例2.转基因番茄的构建与检测

将实施例1中构建好的双元载体即SlSnRK2.6基因RNAi干扰载体通过番茄子叶侵染农杆菌，诱导愈伤，并进行抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗。对在抗生素-卡那霉素(50mg/L)的培养基上生长的转基因苗进行筛选，同时利用引物进行PCR扩增，以进一步验证所述转基因苗是否是转基因株系。

PCR扩增所用引物为抗生素Kan LP/RP，详细如下：

Kan-LP：AAGAACTCGTCAAGAAGGCGA(SEQ ID NO:6)

Kan-RP：GCACGCAGGTTCTCCGGCCGC(SEQ ID NO:7)

PCR扩增体系为20μl，包括：

PCR扩增酶2×TS INGKE：10μl

Kan-LP：1μl

Kan-RP：1μl

DNA模板：1μl

灭菌水：7μl

PCR扩增程序为：94℃5分钟；35个循环：94℃45秒钟，55℃30秒钟，72℃1分钟；72℃10分钟。

然后将扩增产物用1％琼脂糖进行电泳，以对转基因苗进行PCR验证。图6示出了对转基因苗进行PCR验证的电泳图，其中最左边的泳道为DL2000 DNA Marker，泳道1-6分别表示对提取的转基因植株DNA进行PCR扩增而得到的PCR产物。由该图可知，本发明人成功地得到了RNAi转基因苗。

实施例3.转基因番茄中番茄红素和β-胡萝卜素含量分析

取野生型(Micro-Tom)和35S::SlSnRK2.6::RNAi转基因株系不同发育时期的果实进行观察。图7示出了不同发育时期的对照和转基因株系的果实照片，从照片中可以明显看出，随着果实的发育，转基因株系果实明显比对照(Micro-Tom)株果实的颜色更红。

同时，我们又取一定量果实组织(果实外果皮)进行研磨，利用丙酮/正己烷提取1小时，并利用分光光度计法测定初提物中番茄红素和β-胡萝卜素的含量(参见NAGATA andYAMASHITA,1992)。

图8示出了35S::SlSnRK2.6::RNAi转基因番茄在BR+9时期果实中番茄红素和β-胡萝卜素相对于对照的含量变化。从该图可以看出，转基因株系中番茄红素和β-胡萝卜素的含量均明显高于对照(P＜0.05)。该结果表明，基因SlSnRK2.6参与番茄红素和β-类胡萝卜素的生物合成过程，在其表达干扰的情况下，番茄果实中番茄红素和β-类胡萝卜素的含量显著提高。

在本说明书中，每当提及“示例性实施方案”、“优选实施方案”、“一个实施方案”等时意味着针对该实施方案描述的具体的特征、结构或特点包括在本发明的至少一个实施方案中。这些用词在本说明书中不同地方的出现不一定都指代同一实施方案。此外，当针对任一实施方案/实施方案描述具体的特征、结构或特点时，应当认为本领域技术人员也能够在所有所述实施方案中的其它实施方案中实现这种特征、结构或特点。

以上详细描述了本发明的实施方案。然而，本发明的方面不限于上述实施方案。在不脱离本发明的范围的情况下，各种改型和替换均可以应用到上述实施方案中。

参考文献：

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Sun,L.,Sun,Y.,Zhang，M.，Wang，L.，Ren,J.,Cui,M.,Wang，Y.，Ji，K.，Li,P.,Li,Q.,et al.(2012).Suppression of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,whichencodes a key enzyme in abscisic acid biosynthesis,alters fruit texture intransgenic tomato.Plant physiology 158,283-298.

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Yang,G.,Yu,Z.,Gao,L.,and Zheng,C.(2019).SnRK2s at the Crossroads ofGrowth and Stress Responses.Trends Plant Sci 24,672-676.

Zhang,Y.，Li，Q.，Jiang，L.,Kai,W.,Liang,B.，Wang，J.,Du,Y.,Zhai,X.,Wang,J.,Zhang,Y.,et al.(2018).Suppressing Type 2C Protein Phosphatases AltersFruit Ripening and the Stress Response in Tomato.Plant&cell physiology 59,142-154.

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种参与番茄红素生物合成的蛋白激酶的应用

<130> CF170567S

<141> 2020-05-08

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

acttggtgct gggaattttg gagtagcaag gttagttaag gataagaaga caaaggagct 60

tttagctgtc aaatatatag aaagagggaa aaagattgat gagaatgtgc agagagaaat 120

tataaatcat agatcgttga ggcatccgaa cattgtcagg tttaaagagg tcctggtaac 180

tccgtcgcat ttggcaattg ttatggagta cgcagcaggt g 221

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

atggaggaaa aatatgagct tttgaaggaa cttggtgctg ggaattttgg agtagcaagg 60

ttagttaagg ataagaagac aaaggagctt ttagctgtca aatatataga aagagggaaa 120

aagattgatg agaatgtgca gagagaaatt ataaatcata gatcgttgag gcatccgaac 180

attgtcaggt ttaaagaggt cctggtaact ccgtcgcatt tggcaattgt tatggagtac 240

gcagcaggtg gagaactttt tggtagaata tgcagtgctg gcagatttag tgaagacgag 300

gctcgcttct tcttccaaca gcttatatcc ggtgtcagct actgtcatac catggaaatt 360

tgtcacaggg acttgaaact tgaaaacact cttcttgatg gaagtccttc accgcgtcta 420

aaaatatgcg attttggtta ttccaagtct ggtttactgc attcacaacc aaagtcgact 480

gtgggaactc ctgcttacat tgcccctgag gtcctgtcac gaaaggaata tgatgggaag 540

atcgcagacg tgtggtcatg tggagtgaca ctatatgtaa tgttagtagg agcataccct 600

tttgaggatc ctgaagatcc gaaaaacttc aggaaaacca ttgggagaat aatgagcgcc 660

caacactcca tacccgatta tgtacgagtc acaccagatt gcaggaacct cctttcgcga 720

atctttgttg caaatccctc taagaggata actattcctg agataaagaa acatccttgg 780

ttcttaaaga atctaccaaa agagctgatg gatgttgagc acgcgagatt cgaagaagct 840

tcagagcaac tacaacaaag tgttgaagaa atcatgaaga tgatacaaga agctaaagta 900

cctggagtag tgtcaaaatc tgaagggaaa gatcctgcag ggacagcaga acaagatgat 960

ttagaggaag acctcgaatc ggaaatcgac agcagcaatg actttgctgt ttatgtctga 1020

<210> 3

<211> 339

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

Met Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Leu Lys Glu Leu Gly Ala Gly Asn Phe

1 5 10 15

Gly Val Ala Arg Leu Val Lys Asp Lys Lys Thr Lys Glu Leu Leu Ala

20 25 30

Val Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Lys Lys Ile Asp Glu Asn Val Gln Arg

35 40 45

Glu Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Val Arg Phe

50 55 60

Lys Glu Val Leu Val Thr Pro Ser His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Gly Gly Glu Leu Phe Gly Arg Ile Cys Ser Ala Gly Arg Phe

85 90 95

Ser Glu Asp Glu Ala Arg Phe Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly Val

100 105 110

Ser Tyr Cys His Thr Met Glu Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu

115 120 125

Asn Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ser Pro Arg Leu Lys Ile Cys Asp

130 135 140

Phe Gly Tyr Ser Lys Ser Gly Leu Leu His Ser Gln Pro Lys Ser Thr

145 150 155 160

Val Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Lys Glu

165 170 175

Tyr Asp Gly Lys Ile Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr

180 185 190

Val Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Glu Asp Pro Lys

195 200 205

Asn Phe Arg Lys Thr Ile Gly Arg Ile Met Ser Ala Gln His Ser Ile

210 215 220

Pro Asp Tyr Val Arg Val Thr Pro Asp Cys Arg Asn Leu Leu Ser Arg

225 230 235 240

Ile Phe Val Ala Asn Pro Ser Lys Arg Ile Thr Ile Pro Glu Ile Lys

245 250 255

Lys His Pro Trp Phe Leu Lys Asn Leu Pro Lys Glu Leu Met Asp Val

260 265 270

Glu His Ala Arg Phe Glu Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Gln Ser Val

275 280 285

Glu Glu Ile Met Lys Met Ile Gln Glu Ala Lys Val Pro Gly Val Val

290 295 300

Ser Lys Ser Glu Gly Lys Asp Pro Ala Gly Thr Ala Glu Gln Asp Asp

305 310 315 320

Leu Glu Glu Asp Leu Glu Ser Glu Ile Asp Ser Ser Asn Asp Phe Ala

325 330 335

Val Tyr Val

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

acttggtgct gggaattttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

cacctgctgc gtactccata 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aagaactcgt caagaaggcg a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gcacgcaggt tctccggccg c 21

Claims

1.一种用于干扰SlSnRK2.6基因表达的序列，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO:1所示的序列。

2.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的序列。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为质粒载体、噬菌体载体、或植物病毒载体。

4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为克隆载体或者干扰载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为pENTR或者pK7GWIWG2(II)。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求2-5任一项所述的载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

8.一种提高番茄红素和/或β-胡萝卜素含量的方法，所述方法抑制或者降低SEQ IDNO:2所示的SlSnRK2.6基因的表达。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括：使用权利要求1所述的序列、权利要求2-5任一项所述的载体或者权利要求6或7所述的宿主细胞来抑制或者降低SlSnRK2.6基因的表达。

10.SEQ ID NO:2所示的SlSnRK2.6基因在调控番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其中通过在降低或者抑制SlSnRK2.6基因的表达来提高番茄红素和/或β-胡萝卜素的含量。

12.一种用于干扰SEQ ID NO:2所示的SlSnRK2.6基因表达的试剂盒，包括：

a.权利要求2-5任一项所述的载体、或者权利要求6或7所述的宿主细胞；以及

b.干扰SlSnRK2.6基因表达的使用说明。