DE102008063606A1 - Ein-Vektor Tet-System und dessen Verwendung - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ein-Vektor Tet-System und dessen Verwendung. Die vorliegende Erfindung gehört zum Bereich der Molekularbiologie und betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine erste Expressionskassette für einen durch Tetracyclin steuerbaren Transaktivator und eine zweite Expressionskassette, dessen Produkt von Interesse eine kodierende Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle von neuartigen Regulationseinheiten steht, die mittels des Transaktivators regulierbar sind. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts in der Zell- und Gentherapie und in der Herstellung eines Produkts von Interesse, sowie eine Zelle oder eine Zellpopulation, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes von Interesse unter Verwendung der Zelle oder der Zellpopulation.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ein-Vektor Tet-System und dessen Verwendung. Die vorliegende Erfindung gehört zum Bereich der Molekularbiologie und betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine erste Expressionskassette für einen durch Tetracyclin steuerbaren Transaktivator und eine zweite Expressionskassette, dessen Produkt von Interesse eine kodierende Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle von neuartigen Regulationseinheiten steht, die mittels des Transaktivators regulierbar sind. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts in der Zell- und Gentherapie und in der Herstellung eines Produkts von Interesse, sowie eine Zelle oder eine Zellpopulation, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes von Interesse unter Verwendung der Zelle oder der Zellpopulation.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Regulation der Genexpression eines therapeutischen Gens, z. B. durch die natürliche temporäre Kontrolle eines Gens im Verlauf der Zelldifferenzierung, aber auch durch die Menge des erzeugten Genproduktes des therapeutischen Gens, ist unter Umständen maßgeblich für den Erfolg einer Gentherapie. Ebenso kann die Expression eines therapeutischen Gens nur zu einem bestimmten Zeitpunkt erwünscht sein, z. B. wenn das therapeutische Gen einen Selektionsvorteil bietet. Beispielsweise könnte ein therapeutisches Gen einer Patientenzelle helfen, eine Chemotherapie leichter zu überstehen, wodurch es möglich wird, die Frequenz der Therapiezyklen oder die Dosis des Chemotherapeutikums zu erhöhen.
  • Für die Gentherapie haben sich virale Vektorsysteme als sehr geeignet erwiesen, da diese therapeutische Gene mit hoher Effizienz in primäre humane Zellen übertragen können. Im Falle der Nutzung retroviraler Systeme (Lentiviren oder c-Typ Retroviren) wird/werden nach Integration des Vektorgenoms in eine Zielzelle (Transduktion) das/die transferierte(n) Gen(e) auch über längere Zeit dort mit hoher Effizienz exprimiert, wie erste Erfahrungen mit Langzeitbeobachtungen am Menschen (X-SCID) belegen.
  • Die Expression eines therapeutischen Gens wurde in diesen ersten klinischen Untersuchungen von dem viralen (LTR) Promotor gesteuert, den man derzeit verantwortlich für die Entstehung von Leukämien nach Integration des Vektors an bestimmten Stellen im Genom der Zielzelle in einigen dieser Patienten macht. Neuere Vektorsysteme, so genannte „selbstinaktivierende Vektoren” (SIN), verzichten auf eine LTR-gesteuerte Expression und verwenden stattdessen interne Promotoren für die Expression der Transgene. Regulierte Promotoren finden in Folge von grundsätzlichen Problemen in klinischen Studien derzeit noch keine Verwendung.
  • Diese Probleme lassen sich in zwei Gruppen einteilen: (i) FUNKTIONALITÄT- hier ist das Expressionsniveau und im Besonderen auch die „Dichtigkeit” im Sinne der Hintergrundexpression des Systems von Bedeutung. (ii) STRUKTUR- für gentherapeutische Anwendungen ist es wünschenswert, beide zur Regulation eines Transgens erforderlichen Komponenten, den Transaktivator und die Kassette zur regulierten Expression des Gens, auf einem Vektor zu platzieren, da einerseits mehrfache Transduktionen aus technischen Gründen mit humanen primären Zellen nur bedingt möglich sind und andererseits das gleichzeitige Einführen von zwei Vektoren zwangsläufig zur Aufspaltung der transduzierten Zellpopulation führt.
  • Die vorliegende Erfindung befasst sich sowohl mit den strukturellen als auch den funktionalen Gegebenheiten eines solchen regulierten Vektors, der auch als Ein-Vektor-System bezeichnet wird.
  • Ein grundsätzliche Problem ist, dass der Transaktivator in der Zielzelle in ausreichender Menge vorliegen muss, um die Expression des therapeutischen Gens durch Binden an so genannte Operator-Sequenzen am regulierten Promotor induzieren zu können (1a). Die Expression des Transaktivators kann entweder durch ubiquitär aktive oder zelltypspezifische Promotoren bewerkstelligt werden, wobei zu beachten ist, dass ein hohes Maß der Expression nicht nur nicht erforderlich, sondern im Gegenteil, eher schädlich ist. Im Stand der Technik ist dieser Effekt auch unter dem Begriff „Squelching” bekannt. Die bislang publizierten, mittels des Tetracyclin(Tet)-regulierten Transaktivators hoch induzierbaren Minimalpromotoren (z. B. Ptet-1, Ptight) sind im Allgemeinen auf der Ebene von Zellklonen, d. h., selektierten Zellen einer Transgen-positiven Population, bereits gut regulierbar. In der Gentherapie sind dagegen Einzelzell-Klonierungen nicht möglich, da in der Regel das zusätzliche Einführen eines selektierbaren Markers nicht erwünscht ist, da dies das Risiko einer Immunantwort gegen die transduzierten Zellen erhöhen könnte. Andererseits ist die Zeitspanne für die erforderliche in vitro Kultivierung der Zellen für viele Anwendungen zu lang und birgt neben weiteren hohen Kosten auch die Gefahr unerwünschter Zelldifferenzierung oder, z. B. im Falle von Stammzell-basierten Ansätzen, den Verlust der Fähigkeit zur Repopulation des Knochenmarks. In anderen Anwendungen, wie z. B. der Modifizierung von Blutstammzellen oder Zellen des Lymphsystems, ist Klonalität ebenfalls unerwünscht, da man in diesen Fällen mit der Selektion eines einzigen Ideotyps den Erfolg der gesamten Therapie in Frage stellt.
  • Demzufolge sollte das (virale) Ein-Vektor-System nach Infektion einer Zellpopulation günstige regulative Eigenschaften auf alle transduzierten Zellen übertragen. Die Art des Vektors (Plasmid, oder integrierender und nicht-integrierender viraler Vektor) ist dabei zweitrangig. Im vorliegenden Falle wurde aus Gründen der Vereinfachung mit einem integrierenden retroviralen Vektor der Beweis des Wirkprinzips gezeigt.
  • Die Herstellung von einem viralen Ein-Vektor-System basiert im Stand der Technik im Wesentlichen auf drei unterschiedlichen Ansätzen.
  • Ansatz 1:
  • Die Transaktivator Expression wurde an die Expression des induzierbaren Transgens in Form eines autoregulierten Zyklus gekoppelt. Dies wurde durch den Aufbau einer bi-cistronischen Einheit erreicht, in der eine interne Ribosomeneintrittstelle (IRES, internal ribosomal entry site) zwischen dem Transgen (5') und dem Transaktivator (3') eingesetzt wurde (Hoffmann et al., 1996; Paulus et al., 1996; Lindemann et al., 1997; Markusic et al., 2005). Dieses System wurde ausschließlich in integrierenden Vektoren eingesetzt. Der große Nachteil dieses Ansatzes ist, dass nach Integration des Vektors in die Zielzelle die Expression des Transgens nur in solchen Zellen induzierbar ist, die eine konstante, wenn auch minimale, Hintergrundexpression aufweisen, damit eine geringe basale Menge des Transaktivators zur Induktion des Systems gebildet werden kann. Die erreichten Regulationsfaktoren (Expressionslevel des Transgens vor und nach Induktion) waren auf Populationsebene nicht höher als ca. 100–300fach und bewegen sich insgesamt lediglich auf sehr niedrigem Expressionsniveau.
  • Ansatz 2:
  • Dieser Ansatz behandelt die Integration von voneinander unabhängigen Expressionskassetten des Transaktivators und des Transgens auf viralen Vektoren. Im Falle adenoviraler Vektoren stellt dies kein Problem dar, weil hier die natürlichen Gegebenheiten (E1 und E3 Deletion) zur Integration der beiden Tet-Komponenten ausgenutzt werden können (Mzuguchi and Haykawa, 2002; Dumortier et al., 2005; Berenjian and Akusjärvi, 2006). Die auf dem Genom weit entfernt liegenden Bereiche sorgen für eine ausreichende Separierung der beiden Einheiten, weshalb die Regulationsfaktoren auf der Ebene von Zellpopulationen auf bis zu einem Faktor von 1000 verbessert werden konnte.
  • Im Falle retroviraler Vektoren wurde der Integration der konstitutiven Kassette zur Expression des Transaktivators besondere Aufmerksamkeit gewidmet. Diese wurde beispielsweise in dem Bereich der „long terminal repeat” (LTR) platziert, und liegt somit im Provirus dupliziert vor (Markusic et al, 2005). In einem anderen Fall wurde die Tetregulierte Kassette in die LTR und die konstitutive Expressionseinheit für den Transaktivator intern eingebaut (Yu et al., 1996; Vigna et al 2002). Auch die unidirektionale Anordnung der Kassetten mit unterschiedlichen Promotoren, unter Anderem auch unter Verwendung der viralen LTR, wurde zur Expression des Transaktivators eingeführt (Lida et al., 1996; Hwang et al, 1996; Reiser et al., 2000). Das Ergebnis all dieser Untersuchungen war, dass die Regulationsfaktoren des Tet-regulierbaren Transgens ca. 30–350fach über den Hintergrund gesteigert werden konnten.
  • Ansatz 3:
  • Die Entwicklung bi-direktionaler Vektoren erlaubt die Expression beider Komponenten in entgegen gesetzter Richtung innerhalb des viralen Genoms (Gascon et al., 2007; Vigna et al., 2005; Chtarto et al., 2003). Der Nachteil hierbei ist die räumliche Nähe zwischen dem konstitutiven und dem Tet-regulierten Promotor, was letztlich durch gegenseitige Wechselwirkung zu erhöhter Hintergrundexpression und damit trotz eines guten Expressionsniveaus nur zu Regulationsfaktoren von ca. 100fach gegenüber der Hintergrundexpression führt. Durch zusätzliche Integration eines ebenfalls konstitutiv exprimierenden Tet-abhängigen Repressors zum konstitutiv exprimierten Tet-abhängigen Transaktivator konnte eine Verbesserungen des Regulationsfaktors auf einen Wert von bis zu 1000 erreicht werden (Yao et al., 2006). Letzteres ist aber nur bei sehr großen viralen Genomen möglich und hat den Nachteil, dass eine weitere Komponente in allen Zielzellen im richtigen Verhältnis vorhanden sein muss.
  • Insgesamt basieren alle bisher konstruierten Ein-Vektor-Systeme auf dem von Gossen und Bujard entwickelten Ptet-1 Promotor, der einen CMV Minimalpromotor gekoppelt an 7 Tet-Operatoren als regulatorische Einheit enthält, wobei die Zentren der Tet-Operatoren in einem Abstand von 42 bp vorliegen. Daneben werden verschiedene, konstitutive Promotoren (inkl. der viralen LTR) zur Expression des Tet-abhängigen Transaktivators benutzt. In den verschiedenen Systemen werden sowohl der authentische (stTA-2), als auch der reverse (s-rtTA-2, M2) Transaktivator eingesetzt. Die besten bisher auf Populationsebene publizierten Regulationsfaktoren betragen ca. 300fach mit retroviralen, und ca. 1000fach mit nicht-integrierenden Vektoren.
  • Mit der vorliegenden Erfindung kann eine neue Größenordnung der regulierten Genexpression erreicht werden. Der Einbau neuer regulatorischer Einheiten gekoppelt an ein hochempfindliches Reportergen ermöglicht neben einer ausgesprochen starken Induktion der Genexpression auch eine deutliche Verringerung des unregulierten Hintergrundes. Daraus resultiert eine signifikante Steigerung der Regulation von 3–4 Größenordnungen für integrierende Vektoren. Es ist zu erwarten, dass im Falle nicht-integrierender Vektoren diese regulatorischen Eigenschaften sogar noch verbessert sind, da diese nicht, wie etwa bei integrierenden Retroviren, dem direkten Einfluss des den chromosomalen Locus umgebenden Chromatins ausgesetzt sind.
  • In Verbindung mit dem reversen Transaktivator (M2) oder dem authentischen Transaktivator (stTA-2) und einem konstitutiven, ubiquitären oder Zelltyp-spezifischen Promotor mit moderatem Expressionsniveau, können daher Ein-Vektor-Systeme konzipiert werden, die ausreichende Regulation und auch Expression für gentherapeutische Anwendungen zur Verfügung stellen. Insbesondere die hierin beschriebene T6-, aber auch die T8-regulatorische Einheit ist prädestiniert für diese Anwendungen.
  • Die grundsätzliche Frage, welches Vektorprinzip (integrierend oder nicht) angewendet wird, sowie die Wahl des Transaktivators (Tet-on (reverser Typ) oder Tet-off) ist nur für das jeweilige Experiment oder den jeweiligen Therapieansatz von Bedeutung, jedoch nicht für die qualitativen Eigenschaften des Ein-Vektor-Systems. Mit zunehmender Authentizität der Promotoren, d. h. abnehmender Empfindlichkeit gegenüber chromosomalen Einflüssen, ist die Verwendung bestimmter viraler Sequenzen, wie z. B., der pol/env Region der C-Typ Retroviren, obsolet geworden. Dies bedeutet, dass die neuen regulatorischen Einheiten unter Umständen auch eine Vereinfachung der Vektoren ermöglichen, welches einen nicht unwichtigen Umstand in Hinblick auf die Sicherheit gentherapeutischer Verfahren darstellt.
  • Ein Ziel der Erfindung ist es daher, ein Ein-Vektor Tet-System mit verbesserten Regulationseigenschaften bereitzustellen. Durch solche verbesserten Regulationseigenschaften kann dieses Ein-Vektor Tet-System in der wissenschaftlichen Forschung bei der Verwendung zur regulierten Expression eines Produktes von Interesse, sowie in der Gentherapie oder der Generierung von Zellen oder Zelllinien mit bestimmten Eigenschaften, wie z. B. für die Herstellung von Proteinen genutzt werden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges, tet-reguliertes Ein-Vektor-System bereit und ermöglicht dessen Einsatz in gentherapeutischen Anwendungen. Dabei spielt der Ursprung der Vektoren keine maßgebliche Rolle. Die verbesserte Regulation auf Zellpopulationsebene ist primär auf die Verwendung neuer regulatorischer Einheiten zurückzuführen. Es werden hierin Beispiele auf Basis von C-Typ Retroviren und Lentiviren gezeigt.
  • Folglich wird in einem ersten Aspekt der Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt bereitgestellt, umfassend
    • (a) eine erste Expressionskassette, umfassend in funktionsfähiger Verknüpfung (i) einen konstitutiv exprimierenden Promotor, und (ii) eine erste Komponente eines Transaktivatorsystems, die einen Transaktivator kodiert, der durch Tetracyclin (Tet) oder ein Analogon davon steuerbar ist; und
    • (b) eine zweite Expressionskassette, umfassend in funktionsfähiger Verknüpfung, (i) einen zweiten Promotor, wobei der zweite Promotor ein Minimalpromotor ist, der die Expression einer Nukleinsäuresequenz steuert, die ein Produkt von Interesse kodiert, und (ii) eine zweite Komponente des Transaktivatorsystems, umfassend mindestens zwei Tet-Operator-Sequenzen, die in einem Abstand angeordnet sind, welcher 33 bis 39 bp zwischen dem Zentrum der ersten Tet-Operator-Sequenz und dem Zentrum der darauf folgenden Tet-Operator-Sequenz(en) beträgt, wobei die zweite Komponente mittels des Transaktivators die Aktivität des zweiten Promotors reguliert.
  • Der Begriff „Nukleinsäurekonstrukt” beschreibt ein Konstrukt, das aus einer Abfolge von Nukleinsäuresequenzen besteht. Der Begriff „Nukleinsäuren” umfasst hierbei Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren, sowie natürlich vorkommende Nukleinsäuren, als auch nicht natürlich vorkommende Nukleinsäuren. Natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt.
  • Eine Expressionskassette umfasst im Allgemeinen eine Promotorsequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verknüpft ist, die ein Genprodukt kodiert, und ein Polyadenylierungssignal. Wenn zwei Expressionskassetten in einer uni-direktionalen Weise angeordnet sind, kann die Polyadenylierungssequenz der 3'-gelegenen Expressionskassette von beiden Expressionskassetten genutzt werden, so dass ein Polyadenylierungssignal in der 5'-gelegenen Expressionskassette zur erfolgreichen Expression nicht erforderlich ist.
  • Die einzelnen Sequenzen der Expressionskassette sind „in funktionsfähiger Verknüpfung”, wenn die einzelnen Bestandteile der Expressionskassette so angeordnet sind, dass sie zusammen die vorgesehene Aufgabe, nämlich die Expression der Nukleinsäure, die ein gewünschtes Produkt kodiert, erfüllen.
  • Der konstitutiv exprimierende Promtor kann ein beliebiger Promotor sein, wobei jedoch bei der Auswahl berücksichtigt werden sollte, dass die Regulationsfähigkeit des Transaktivatorsystems durch die Verwendung konstitutiver Promotoren eingeschränkt wird, da diese aufgrund der räumlichen Nähe zum Minimalpromotor der zweiten Expressionskassette, mit diesem interagieren können. Aus diesem Grund sind in einem Ein-Vektor-System so genannte „housekeeping”-Promotoren als konstitutiv exprimierende Promotoren bevorzugt, da diese in der Regel im Vergleich zu den induzierbaren Promotoren der zweiten Expressionskassette einer anderen Expressionskontrolle unterliegen. So enthalten diese „housekeeping” Promotoren beispielsweise keine TATA-Box oder ähnliche, für starke Promotoren charakteristische Elemente. Bevorzugterweise ist der konstitutiv exprimierende Promotor relativ schwach im Verhältnis zu beispielsweise viralen Promotoren. Dies ist insbesondere von Bedeutung, wenn das Nukleinsäurekonstrukt ein retroviraler Vektor ist und der konstitutiv exprimierende Promotor Bestandteil einer Expressionskassette, die sich in Antisense-Orientierung zum viralen (+)-Strang befindet, da der mittels des konstitutiv exprimierenden Promotors entstehende (–)-RNA-Strang die Menge infektiöser Virenpartikel im Verlauf der Produktion des Vektors drastisch reduzieren kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der konstitutiv exprimierende Promotor ubiquitär aktiv oder zelltypspezifisch. Der Begriff „zelltypspezifisch” ist hierbei so zu verstehen, dass der Promotor ausschließlich in einer Zelle eines bestimmten Zelltyps oder eines bestimmten Gewebes oder alternativ nur in einer Zelle einer bestimmten Entwicklungsstufe, bzw. während einer bestimmten Entwicklungsstufe, eine Expression des Transaktivators bewirkt. Im Gegensatz hierzu ist die Expression eines ubiquitär aktiven Promotors nicht auf einen bestimmten Zelltyp, Gewebe oder auf eine bestimmte Entwicklungsstufe beschränkt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der konstitutiv exprimierende Promotor der Promotor der humanen Phosphoglyceratkinase (hPGK), wobei der Promotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5336–5873 der SEQ ID NO: 1 ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausfürungsform umfasst der konstitutiv exprimierende Promotor eine Nukleinsäuresequenz, die zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5336–5873 der SEQ ID NO: 1 ist.
  • Eine Nukleinsäuresequenz ist „mindestens X% identisch” mit einer anderen Nukleinsäuresequenz, wenn die Sequenzidentität zwischen den beiden verglichenen Sequenzen mindestens X% beträgt in Bezug auf die volle Länge der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung oder der dazu komplementären Sequenz. Sequenzvergleiche können unter Verwendung von öffentlich zugänglichen Computer-Homologieprogrammen und den darin vorgegebenen Voreinstellungen, wie dem „BLAST”-Programm, welches auf der NCBI Internetseite auf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi bereitgestellt ist, durchgeführt werden. Weitere Verfahren zum Berechnen von Sequenzidentitäten sind dem Fachmann wohlbekannt.
  • Es ist jedoch beabsichtigt, dass nur solche Nukleinsäuresequenzen mit X% Sequenzidentität umfasst sind, die die Funktion der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz (100% Identität) aufweisen. Um festzustellen, ob eine Nukleinsäuresequenz mit X% Identität die Funktion der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz (100% Identität) aufweist, kann der Fachmann den folgenden Test durchführen: Eine Ht1080 Zellpopulation wird jeweils separat mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, das die fragliche Nukleinsäuresequenz mit X% Identität umfasst, und dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, das die zu der fraglichen Nukleinsäuresequenz entsprechende ursprüngliche Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei für beide Nukleinsäurekonstrukte das Produkt von Interesse Luciferase ist, transduziert. Die transduzierten Zellen werden mittels Fluoreszenz-basiertem Sortieren der Zellen (flourescence activated cell sorting, FACS) angereichert, welches z. B. durch die GFP-Aktivität des verwendeten dualen Reportergens lmg* ermöglicht wird, so dass die Reinheit der Population ≥ 90% beträgt. Alternativ zur Verwendung von lmg* kann z. B. auch ein Fusionsgen mit spezifischer Proteaseschnittstelle (2A), für die posttranslationale Trennung des Luciferase und eGFP Gens, verwendet werden, oder eine Nukleinsäuresequenz verwendet werden, die eine bicistronische RNA kodiert, die eine durch IRES (internal ribosomal entry site) vermittelte Translation eines unabhängigen zweiten Gens, das 3' zum ersten Gen liegt, erlaubt. Die Zellpopulationen werden jeweils in zwei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen transferiert (1 × 105/Vertiefung), wobei jeweils die Zellen in einer der Vertiefungen so gehalten werden, dass die Expression des Produktes von Interesse in dem Nukleinsäurekonstrukt, das die ursprüngliche Nukleinsäuresequenz umfasst, induziert ist, und jeweils die Zellen der zweiten Vertiefung so gehalten werden, dass die Expression des Produktes von Interesse in dem Nukleinsäurekonstrukt, das die ursprüngliche Nukleinsäuresequenz umfasst, nicht induziert ist. Die Zellen werden für 96 Stunden kultiviert, anschließend gegebenenfalls mittels PBS/EDTA von der Platte abgelöst und bei 4°C und 350 × g zentrifugiert. Nach Abnahme des Zellüberstandes werden die Zellpellets in 25 mM TRIS-phosphate, pH 7,8; 2 mM Na2-EDTA, 5% Glycerin, 1% Triton X-100, 20 mM DTT lysiert und bei –20°C eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Proben für 2 min bei 4°C zentrifugiert (14.000 × g) und vom Überstand werden je nach Aktivität, zwischen 0,1–10 μl mit 250 μl Messpuffer (25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO4, frisch versetzt mit 5 mM rATP) gemischt. Die Messung über einen Zeitraum von 10 Sekunden wird in einem Lumat (Berthold LB9507, Applied Biosystems) durch Zugabe des Substrates (Luciferin, 125 μM) gestartet. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wird der Proteingehalt der Probe nach Bradford bestimmt. Die Proteinbestimmung nach Bradford ist im Stand der Technik eine wohlbekannte Methode und dem Fachmann bekannt. Die Berechnung der Regulationsfaktoren erfolgt durch Quotientenbildung der Luziferase Aktivität des induzierten durch die des nicht-induzierten Zustands.
  • Eine Nukleinsäuresequenz mit X% Identität weist die Funktion der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz (100% Identität) auf, wenn der wie oben bestimmte Regulationsfaktor unter Verwendung des Nukleinsäurekonstruktes mit der Nukleinsäuresequenz mit X% Identität im Vergleich zu dem Nukleinsäurekonstrukt mit der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz mindestens 40%, bevorzugt mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 70%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, und am stärksten bevorzugt mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder mindestens 100% beträgt.
  • Das Transaktivatorsystem ist ein durch Tetracyclin oder ein Analogon dessen steuerbares System, das die Expression einer Nukleinsäure reguliert, die ein Produkt von Interesse kodiert. Diese durch Tetracyclin steuerbaren Transaktivatorsysteme bestehen aus zwei Komponenten, einer Nukleinsäure, die einen Transaktivator kodiert, der durch Tetracyclin oder einem Analogon dessen steuerbar ist, und aus einer Nukleinsäuresequenz, die eine Tet-Operator-Sequenz umfasst, die mittels des Transaktivators die Aktivität eines Minimalpromotors regulieren kann. Dem Fachmann sind zwei Arten von Tetracyclinsteuerbaren Transaktivatorsystemen bekannt. In dem so genannten „Tet-off”-System umfasst der Transaktivator ein Fusionsprotein aus dem aus Escherichia coli abgeleiteten Tetracyclin-Repressor (Tet-R) und einem aus dem Herpes-simplex-Virus abgeleiteten VP16-Protein. Dieses Fusionsprotein, auch tTA-Protein genannt, bindet an die so genannten Tet-Operatoren, wodurch ein Minimalpromotor in der Nähe des Tet-Operators zur Transkription des funktionsfähig mit dem Minimalpromotor verknüpften Gen aktiviert wird. Tetracyclin oder dessen Analogon bindet an tTA, was zu einem Abdiffundieren des Fusionsproteins von dem Tet-Operator führt, wodurch eine weitere Transaktivierung des Zielgens verhindert wird. In dem so genannten „Tet-on”-System sind Punktmutationen in dem tTA-Protein enthalten, welche zu einer Umkehrung der Funktion des Proteins führen. Das aus diesen Mutationen resultierende reverse tTA-Protein (rtTA) ist in Abwesenheit von Tetracyclin oder eines Analogons hiervon nicht fähig, an eine Tet-Operator-Sequenz zu binden. Dies erfolgt erst nach Bindung von Tetracyclin oder des Analogons, wodurch die Transaktivierung des Minimalpromotors erfolgt.
  • Je nach Verwendung des Transaktivators kann somit die Expression eines Genprodukts in Gegenwart von Tetracyclin oder eines Analogons davon aktiviert oder deaktiviert werden. Dementsprechend ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Transaktivator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus stTA-2 (kodiert durch SEQ ID NO: 37), rtTA-3 und M2 (kodiert durch Nukleotide 5883–6637 der SEQ ID NO: 1). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Transaktivator M2. Diese Transaktivatoren als solche sind dem Fachmann wohlbekannt.
  • Tetracycline stellen eine wohlbekannte Gruppe von Antibiotika dar, die von verschiedenen Streptomyceten über einen Polyketidweg synthetisiert werden. In ihrer Wirkung als Antibiotikum führen sie zu einer Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese an deren Ribosom. Neben den natürlichen Tetracyclinen, wie z. B. Anhydrotetracyclin, Tetracyclin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin und Demiclocyclin, gehören zu dieser Gruppe auch partialsynthetische Analoga, die aus anderen Tetracyclinen, wie z. B. Oxytetracyclin, hergestellt werden. Weitere Beispiele für solche semisynthetische Tetracycline sind Doxycyclin, Lymecyclin, Meclocyclin, Metacyclin, Minocyclin, Rolitetracyclin und Tigecyclin. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Tetracyclin (siehe Formel I) oder Doxycyclin (siehe Formel II) zum Steuern des Transaktivators verwendet.
  • Figure 00110001
  • Die Auswahl des Tetracyclins oder dessen Analogon richtet sich unter Anderem nach dem verwendeten Transaktivator. So wird bei Verwendung der vorangehend beschriebenen M2 oder rtTA-3 Transaktivatoren bevorzugt Doxycyclin verwendet, hingegen bei Verwendung des stTA-2 Transaktivators bevorzugt Tetracyclin oder Doxycyclin. In einer Ausführungsform ist daher der Transaktivator M2 oder rtTA-3 durch Doxycyclin steuerbar oder der Transaktivator stTA-2 durch Tetracyclin oder Doxycyclin steuerbar. Es kann jedoch auch ein beliebiger anderer Stoff aus der Gruppe der Tetracycline, oder eine beliebige andere biologische oder chemische Verbindung, die die Funktion des Tetracyclin oder eines Analogons davon nachahmt, verwendet werden, so lange dieser Stoff fähig ist, die Aktivität des Minimalpromotors mittels der erfindungsgemäßen Operatorsequenz und des Transaktivators zu regulieren.
  • Hierzu kann der Fachmann folgenden Test durchführen: Eine Voraussetzung für die Fähigkeit eines Stoffes oder eines Analogons, die Aktivität des Minimalpromotors mittels der erfindungsgemäßen Operatorsequenz und des Transaktivators zu regulieren, ist die Bindung des Stoffes oder Analogons an den Transaktivator. Diese Voraussetzung ist dann erfüllt, wenn die Assoziationskonstante der Bindung des Stoffes oder des Analogons an den Transaktivator größer oder gleich der Assoziationskonstante mindestens einer Verbindung ist, von der bekannt ist, dass diese Verbindung die Aktivität des Minimalpromotors mittels des Transaktivators regulieren kann. Eine solche Verbindung kann z. B. Tetracyclin oder Doxycyclin sein. Die Assoziationskonstante des Stoffes oder des Analogons lässt sich z. B. bestimmen nach der Methode von Degenkolb et al. (1991), Antimicrob. Agents Chemother., 35, 1591–1595. Dem Fachmann werden aber auch weitere Methoden zur Bestimmung einer Assoziationskonstante für die Bindung des Stoffes oder Analogons an den Transaktivator bekannt sein. Anschließend wird eine Ht1080 Zellpopulation mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, welches Luciferase als das Produkt von Interesse umfasst, transduziert. Die transduzierten Ht1080 Zellen werden mittels Fluoreszenz-basiertem Sortieren der Zellen (flourescence activated cell sorting, FACS) angereichert, welches z. B. durch die GFP-Aktivität des verwendeten dualen Reportergens lmg* ermöglicht wird, so dass die Reinheit der Population ≥ 90% beträgt. Alternativ zur Verwendung von lmg* kann z. B. auch ein Fusionsgen mit spezifischer Proteaseschnittstelle (2A), für die posttranslationale Trennung des Luciferase und eGFP Gens, verwendet werden, oder eine Nukleinsäuresequenz verwendet werden, die eine bicistronische RNA kodiert, die eine durch IRES (internal ribosomal entry site) vermittelte Translation eines unabhängigen zweiten Gens, das 3' zum ersten Gen liegt, erlaubt. Die Zellpopulation wird anschließend auf zwei Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen transferiert (1 × 105/Vertiefung), wobei jeweils die Zellen einer Vertiefung in Gegenwart einer Konzentration des Stoffes oder des Analogons gehalten werden, die der Konzentration entspricht, bei welcher die bekannte Verbindung die Expression des Produktes von Interesse induzieren würde, und die Zellen der anderen Vertiefung in Gegenwart einer Konzentration des Stoffes oder Analogons gehalten werden, die der Konzentration entspricht, bei welcher die bekannte Verbindung die Expression des Produktes nicht induzieren würde. Eine dieser Konzentrationen sollte jedoch 0 mg/ml betragen. Die Zellen werden für 96 Stunden kultiviert und anschließend gegebenenfalls mittels PBS/EDTA von der Platte abgelöst und bei 4°C und 350 × g zentrifugiert. Nach Abnahme des Zellüberstandes werden die Zellpellets in 25 mM TRIS-phosphate, pH 7,8; 2 mM Na2-EDTA, 5% Glycerin, 1% Triton X-100, 20 mM DTT lysiert und bei –20°C eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Proben für 2 min bei 4°C zentrifugiert (14.000 × g) und vom Überstand werden je nach Aktivität, zwischen 0,1–10 μl mit 250 μl Messpuffer (25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO4, frisch versetzt mit 5 mM rATP) gemischt. Die Messung über einen Zeitraum von 10 Sekunden wird in einem Lumat (Berthold LB9507, Applied Biosystems) durch Zugabe des Substrates (Luciferin, 125 μM) gestartet. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wird der Proteingehalt der Probe nach Bradford bestimmt. Die Proteinbestimmung nach Bradford ist dem Fachmann bekannt. Anschließend wird durch Quotientenbildung der Luziferase Aktivität des induzierten durch die des nicht-induzierten Zustands der Regulationsfaktor bestimmt. Ist der Regulationsfaktor > 100, so ist der Stoff oder das Analogon fähig, die Aktivität des Minimalpromotors mittels der erfindungsgemäßen Operatorsequenz und des Transaktivators zu regulieren.
  • Ein Minimalpromotor wird hier definiert als ein Promotor, der idealerweise keine oder nur eine sehr geringe Aktivität aufweist, d. h. dass die in funktionsfähiger Verknüpfung stehende Nukleinsäuresequenz durch den Minimalpromotor ausschließlich in sehr geringer Weise transkribiert wird (Hintergrundexpression), so dass das Zellwachstum der mit dem den Minimalpromotor umfassenden Nukleinsäurekonstrukt transfizierten Zelle beeinträchtigt ist, oder eine Anreicherung des Produktes von Interesse während des nicht induzierten Zustandes stattfindet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Minimalpromotor ausgewählt aus
    • (a) einem von einem CMV-Minimalpromotor abgeleiteten Minimalpromotor, der eine TATA-Box und eine Bindestelle für einen allgemeinen Transkriptionsfaktor umfasst und in dem der 5' untranslatierte Bereich durch eine Region des Turnip Yellow Mosaik Pflanzenvirus (TYMV) ersetzt ist, wobei die Bindestelle für den allgemeinen Transkriptionsfaktor vorzugsweise eine Transkriptionsfaktor II B-Bindestelle ist; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 4952 bis 5075 der SEQ ID NO: 2 ist; oder
    • (b) einem auf dem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) abgeleiteten Minimalpromotor mit verkürztem 5'-Bereich, in dem bestimmte cis-Elemente eleminiert wurden und der eine Bindestelle für einen allgemeinen Transkriptionsfaktor umfasst, wobei die Bindestelle für den allgemeinen Transkriptionsfaktor vorzugsweise eine Transkriptionsfaktor II B-Bindestelle ist; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5064 bis 5226 der SEQ ID NO: 7 ist; oder
    • (c) einem Promotor, in dem die CMV-Sequenzen des Promotors nach (a) gegen MMTV-Sequenzen ausgetauscht wurden; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5064 bis 5176 der SEQ ID NO: 8 ist; oder
    • (d) einem aus einem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV)-Minimalpromotor abgeleiteten Minimalpromotor; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 4952 bis 5161 der SEQ ID NO: 3 ist; oder
    • (e) einem auf dem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) abgeleiteten Minimalpromotor mit verkürztem 5'-Bereich, in dem bestimmte cis-Elemente eleminiert wurden, insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5064 bis 5222 der SEQ ID NO: 6 ist; oder
    • (f) einem von einem CMV-Minimalpromotor abgeleiteten Minimalpromotor, der eine TATA-Box und eine Bindestelle für einen allgemeinen Transkriptionsfaktor umfasst, wobei die Bindestelle für den allgemeinen Transkriptionsfaktor vorzugsweise eine Transkriptionsfaktor-II-B-Bindestelle ist; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 4952 bis 5077 der SEQ ID NO: 1 ist.
  • Der Begriff „TATA-Box” bezeichnet ein DNA-Sequenzmotif, welches in der Promotorregion von vielen eukaryotischen Genen gefunden wird. Es handelt sich um eine Bindestelle für Transkriptionsfaktoren, insbesondere dem TATA-Bindeprotein (TBP), welches im Verlauf der Transkription die DNA für die Transkriptionsmaschinerie zugänglich macht. Es wird allgemein angenommen, dass der allgemeine Transkriptionsfaktor TF-II D an die TATA-Box bindet, gefolgt von TF-II A und TF-II B. Die RNA-Polymerase kann diesen Multiproteinkomplex erkennen und bindet an ihn, zusammen mit weiteren zahlreichen Transkriptionsfaktoren, wie TF-II F, TF-II E und TF-II H. Hierdurch wird die Transkription initiiert und die Polymerase wandert entlang des DNA-Stranges, wobei TF-II D und TF-II A gebunden an die TATA-Box zurückbleiben. Diese können dann die Bindung von weiteren RNA-Polymerasemolekülen vermitteln. Die Konsensussequenz der TATA-Box ist dem Fachmann wohlbekannt. Es kann auch eine Variante der TATA-Box verwendet werden, in der ein oder zwei Basen gegenüber der Konsensussequenz ausgetauscht sind. Erfahrungsgemäß führt dies jedoch zu einer reduzierten Expression des Genproduktes. Allgemeine Transkriptionsfaktoren sind solche Transkriptionsfaktoren, die für jede Transkription notwendig sind. Sie übernehmen verschiedene Aufgaben und binden dabei entweder direkt an die DNA, an die RNA-Polymerase oder an andere Proteine des Transkriptions-Initiationskomplexes. Allgemeine Transkriptionsfaktoren sind ubiquitär, d. h. in allen Zellen eines Organismus gleichmäßig vorhanden und haben an einer spezifischen Genregulation keinen Anteil.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein Polypeptid, eine funktionelle RNA, ein Ribozym oder ein attenuiertes Virus. Das Polypeptid kann ein beliebiges Polypeptid sein, ein zelltoxisches, ein nicht-zelltoxisches, ein Protein, Enzym, oder Antikörper, sowie ein Antikörperfragment. Das Polypeptid kann auch ein Fusionsprotein sein und/oder einen Peptidrest enthalten, der eine spätere einfache Rückgewinnung erlaubt. Funktionelle RNAs sind kleine Ribonukleinsäuresequenzen, die durch Interaktion mit einer mRNA die Translation dieser mRNA verhindern können. Beispiele für funktionelle RNAs sind Small interfering RNAs (siRNAs), microRNA (miRNA) oder shRNA. siRNAs sind 21 bis 28 Nukleotide lange RNAs, die von der RNAse III Dicer aus langen doppelsträngigen RNAs herausgeschnitten werden. Auch andere kleine einzelsträngige RNAs, die in der RNA-Interferenz (RNAi) benutzt werden, werden im Allgemeinen als siRNAs bezeichnet. siRNAs umfassen die Untergruppen tasiRNA (transacting siRNA), ra-siRNA (repeat-associated siRNA), scn-RNA (small-scan-RNA) und shRNA (small hairpin RNA). shRNAs liegen beispielsweise in Form einer Haarnadelstruktur vor und werden erst durch zelluläre Enzyme in siRNAs gespalten. siRNAs können eingesetzt werden, um durch RNA-Interferenz die Expression von spezifischen Zielgenen zu verringern. So können siRNAs in isolierte Zellen eingebracht werden, um einen Abbau der mRNA eines Zielgens innerhalb einer Zelle zu bewirken. Ist die Expression der siRNA, wie in dem vorliegenden Fall, induzierbar, so spricht man auch von einem konditionierten Knock-Out. Antisense-RNA und siRNAs finden zunehmend Verbreitung in der Medizin und Pharmakologie und werden aktuell intensiv auf ihre Beteiligung an verschiedenen Zellvorgängen (Apoptose, Genregulation, Prionen, etc.) und Krankheiten wie Krebs erforscht. Im Gegensatz zu siRNAs führt die Bindung von miRNA an einen RNA-Strang nicht zu dessen Abbau, sondern bewirkt aufgrund ihrer unterschiedlichen Bindungseigenschaften eine Repression der Translation. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die wie Enzyme chemische Reaktionen katalysieren. Attenuierte Viren sind vermehrungsunfähige, und daher in ihrer Virulenz abgeschwächte Viren. Sie werden unter anderem zur Herstellung von Impfstoffen, z. B. für Poliomyelitis, Masern, Mumps, Röteln und Gelbfieber verwendet.
  • Der Begriff „Tet-Operator-Sequenz” ist hierin definiert ein Sequenzmotiv zu umfassen, welches die palindromische Sequenz der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO. 9 umfasst. Das Zentrum einer Tet-Operator-Sequenz ist hierin als die Base definiert, welche exakt in der Mitte der palindromischen Sequenz der Tet-Operatorsequenz liegt. Für SEQ ID NO. 9 ist dies die Base an Position 10. Die zweite Komponente des Transaktivatorsystems umfasst mindestens zwei Tet-Operator-Sequenzen, d. h. die zweite Komponente kann auch 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Tet-Operator-Sequenzen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Komponente des Transaktivatorsystems 7 Tet-Operator-Sequenzen.
  • Ohne sich auf eine Theorie zu beschränken, wird davon ausgegangen, dass ein Abstand von 36 bp zwischen dem Zentrum der ersten Tet-Operator-Sequenz und dem Zentrum der darauf folgenden Tet-Operator-Sequenz zu einer verbesserten Expression der regulierten Nukleinsäuresequenz führt. Es wird angenommen, dass dieser Abstand der Tet-Operator-Sequenzen zueinander dazu führt, dass im Vergleich zu herkömmlichen Tet-Operatormultimeren, in denen die Tet-Operator-Zentren in einem Abstand von 42 bp vorliegen (wie z. B. in Ptet-1), eine größere Anzahl von Transaktivatoren in räumlicher Nähe zu dem Minimalpromotor binden können. Diese erhöhte Transaktivatordichte kann durch deren Bindung in trans auf der DNA-Helix erklärt werden, da der Zentrumsabstand der Operatoren von 36 bp zueinander, zu alternierenden Bindungstellen auf der DNA-Helix führt. Ähnliche Untersuchungen sind beschrieben durch: Agha-Mohammadi et al., 2004. J. Gene Med. 6, 817–828.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind daher die mindestens zwei Tet-Operator-Sequenzen jeweils in einem Abstand angeordnet, welcher 33–39 Basenpaare, vorzugsweise 34–38 Basenpaare, vorzugsweise 35–37 Basenpaare, und am meisten bevorzugt 36 Basenpaare zwischen dem Zentrum der ersten Tet-Operator-Sequenz und dem Zentrum der jeweils darauf folgenden Tet-Operator-Sequenz beträgt. Der Abstand zwischen den Zentren der einzelnen Tet-Operator-Sequenzen kann immer der gleiche sein, oder variieren. Der Abstand zwischen dem Zentrum der ersten Tet-Operator-Sequenz und dem Zentrum der jeweils darauf folgenden Tet-Operator-Sequenz muss jedoch jeweils 33–39 bp, vorzugsweise 34–38 bp, weiter bevorzugt 35–37 bp, insbesondere 36 bp betragen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Komponente des Transaktivatorsystems 7 Tet-Operator-Sequenzen; wobei vorzugsweise die zweite Komponente des Transaktivatorsystems eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5084–5329 der SEQ ID NO. 1 ist.
  • Weiterhin kann das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche post-transkriptionelle Verstärker-/Regulatorelemente umfassen. Beispiele hierfür sind das „SRV-1 Constitutive Transport Element” (cte), welches den nukleo/zytosolischen Transport der unprozessierten RNA optimiert, das Woodchuck-Hepatitis-Virus-post-transkriptionelles regulatorisches Element (W-PRE), das vermutlich die Stabilität der Transkripte erhöht und damit zu einer Steigerung der Translationseffizienz beiträgt. Retrovirale Vektoren enthalten zusätzlich long terminal repeats und können zusätzlich virale Verpackungsregionen umfassen, z. B. psi, oder psi/psi+, oder psi/psi+/pol-env.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erste und die zweite Expressionskassette uni-direktional oder bidirektional zueinander angeordnet.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäurekonstrukt ein integrierender oder ein nicht integrierender Vektor. Im Falle eines nicht integrierenden Vektors ist dieser in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein replizierender oder ein nicht-replizierender Vektor. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der integrierende Vektor ein Transposon.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor ein retroviraler Vektor; vorzugsweise ein C-Typ, oder ein lentiviraler Vektor, insbesondere ein Vektor auf Basis des Mouse Moloney Leukemia Virus (MLV) oder des Humanen Immundefizienz Virus (HIV). Weitere Beispiele für retrovirale Vektoren sind Vektoren auf Basis von nativen Varianten des MLV, wie z. B. MPSV, PCMV, MESV, SFFV oder FESV, sowie hybride Vektoren, die Elemente der einzelnen Viren kombinieren. Beispiele für humane Retroviren sind z. B. HIV-1 und HIV-2.
  • Retrovirale Vektoren werden in der Gentechnik verwendet, um genetisches Material in Zielzellen zu schleusen. Verglichen mit traditionellen Methoden erlaubt eine Transduktion mit retroviralen Vektoren, dass nahezu 100% der Zellen das genetische Material erhalten, ohne dass die Lebensfähigkeit der Zellen nennenswert eingeschränkt wird. Die von Viren abgeleiteten retroviralen Vektoren sind zudem in der Lage, in das Genom der Zielzelle zu integrieren, so dass sie den Tochterzellen vererbt werden können. Zur Gattung der c-Typ Retroviren, auch Gammaretroviren genannt, gehört das MLV. Lentiviren sind eine Gattung innerhalb der Retroviren. Sie können im Gegensatz zu Gammaretroviren, die nur sich teilende Zellen infizieren können, auch ruhende Zellen infizieren und haben daher ein potenziell breiteres Anwendungsspektrum. Weil retrovirale Vektoren das Risiko bergen, durch die starken Enhancer-Elemente in ihren LTRs potenzielle Onkongene in der Nähe ihres Integrationsortes zu aktivieren, wurden sogenannte SIN-Vektoren (von self inactivating) entwickelt, in denen diese Enhancer im 3'-LTR-Bereich deletiert wurden. Nach der Reversen Transkription und der Integration des Provirus in das Wirtsgenom fehlen diese auch im 5'-LTR-Bereich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der retrovirale Vektor ein selbstinaktivierender Vektor (SIN-Vektor).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäurekonstrukt ein Plasmid. Plasmide sind kleine, in der Regel zirkuläre DNA-Moleküle, die in Zellen vorkommen können, aber im Allgemeinen extrachromosomal vorliegen. Enthält das Plasmid einen Replikationsursprung, der in der Zelle funktionsfähig ist, so kann das Plasmid unabhängig von der chromosomalen DNA repliziert und von Zelle zu Zelle vererbt werden. Je nach Art des Replikationsursprungs können Plasmide in geringer (low copy) oder sehr hoher Kopienzahl (high copy) vorliegen. Bestimmte Plasmide, Episome, können auch in die chromosomale DNA der Wirtszelle integrieren und dort zusammen mit dem Wirtsgenom mit jeder Zellteilung repliziert werden
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Nukleinsäurekonstrukt einen Regulationsfaktor auf Ebene einer Zellpopulation von 1000-fach bis 11000-fach, insbesondere von 1500-fach bis 11000-fach, 2000-fach bis 11000-fach, 2500-fach bis 11000-fach, 3000-fach bis 11000-fach, 3500-fach bis 11000-fach, 4000-fach bis 11000-fach, 5000-fach bis 11000-fach, 6000-fach bis 11000-fach, 7000fach bis 11000-fach, 8000-fach bis 11000-fach, 9000-fach bis 11000-fach, oder mindestens 11000-fach auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Nukleinsäurekonstrukt einen Regulationsfaktor auf Ebene einer Zellpopulation von 1000-fach bis 2000-fach, 1000-fach bis 3000-fach, 1000-fach bis 3500fach, 1000-fach bis 4000-fach, 1000-fach bis 5000-fach, 1000-fach bis 6000-fach, 1000-fach bis 7000-fach, 3000-fach bis 8000-fach, 4000-fach bis 9000-fach, 5000-fach bis 10000-fach, oder 6000-fach bis 11000-fach auf.
  • Der Begriff „auf Ebene einer Zellpopulation” bedeutet hier, dass der Regulationsfaktor für eine Zellpopulation bestimmt wird, die das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt umfasst, wobei die Zellpopulation nicht durch Einzelzellklonierung gewonnen wurde. Das Expressionsniveau und der Regulationsfaktor können wie nachstehend beschrieben bestimmt werden. Der Regulationsfaktor ist dabei definiert als der Quotient der Menge an Genprodukt nach Induktion geteilt durch die Menge an Genprodukt vor Induktion, wobei dieser Quotient wie folgt bestimmt werden kann: Eine Ht1080 Zellpopulation wird mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, welches Luciferase als das Produkt von Interesse umfasst, transduziert. Die transduzierten Ht1080 Zellen werden mittels Fluoreszenz-basiertem Sortieren der Zellen (flourescence activated cell sorting, FACS) angereichert, welches z. B. durch die GFP-Aktivität des verwendeten dualen Reportergens lmg* ermöglicht wird, so dass die Reinheit der Population ≥ 90% beträgt. Alternativ zur Verwendung von lmg* kann z. B. auch ein Fusionsgen mit spezifischer Proteaseschnittstelle (2A), für die posttranslationale Trennung des Luciferase und eGFP Gens, verwendet werden, oder eine Nukleinsäuresequenz verwendet werden, die eine bicistronische RNA kodiert, die eine durch IRES (internal ribosomal entry site) vermittelte Translation eines unabhängigen zweiten Gens, das 3' zum ersten Gen liegt, erlaubt. Die Zellpopulation wird anschließend auf zwei Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen transferiert (1 × 105/Vertiefung), wobei jeweils die Zellen einer Vertiefung so gehalten werden, dass die Expression des Produktes von Interesse induziert ist, und die Zellen der anderen Vertiefung so gehalten werden, dass die Expression des Produktes von Interesse nicht induziert ist. Die Zellen werden für 96 Stunden kultiviert und anschließend gegebenenfalls mittels PBS/EDTA von der Platte abgelöst und bei 4°C und 350 × g zentrifugiert. Nach Abnahme des Zellüberstandes werden die Zellpellets in 25 mM TRIS-phosphate, pH 7,8; 2 mM Na2-EDTA, 5% Glycerin, 1% Triton X-100, 20 mM DTT lysiert und bei –20°C eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Proben für 2 min bei 4°C zentrifugiert (14.000 × g) und vom Überstand werden je nach Aktivität, zwischen 0,1–10 μl mit 250 μl Messpuffer (25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO4, frisch versetzt mit 5 mM rATP) gemischt. Die Messung über einen Zeitraum von 10 Sekunden wird in einem Lumat (Berthold LB9507, Applied Biosystems) durch Zugabe des Substrates (Luciferin, 125 μM) gestartet. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wird der Proteingehalt der Probe nach Bradford bestimmt. Die Proteinbestimmung nach Bradford ist im Stand der Technik eine wohlbekannte Methode und dem Fachmann bekannt. Die Berechnung der Regulationsfaktoren erfolgt durch Division der Luziferase Aktivität des induzierten durch die des nicht-induzierten Zustands.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Nukleinsäurekonstrukt auf Ebene einer Zellpopulation ein Expressionsniveau von mindestens 0,1–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 0,5–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 1,0–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 1,5–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 2,0–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 2,5–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 3,0–7,0 × 106 rlu/μg Protein, insbesondere mindestens 3,5–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 3,6–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 3,7–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 3,8–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 3,9–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 4,0–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 4,1–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 4,5–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 5,0–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 5,5–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 6,0–7,0 × 106 rlu/μg Protein, mindestens 6,5–9,0 × 106 rlu/μg Protein, oder mindestens 7,0–9,0 × 106 rlu/μg Protein, wenn das Produkt von Interesse Luciferase ist.
  • Ein zweiter Aspekt der Erfindung beschreibt die Verwendung des oben beschriebenen Nukleinsäurekonstrukts in der Zell- und Gentherapie. Als Gentherapie bezeichnet man das Einfügen von Genen in eine Zelle eines Individuums zur Behandlung von genetischen Defekten, verursacht z. B. durch Erbkrankheiten. Durch die Expression des Produkts von Interesse kann somit ein genetischer Defekt, Über- oder Unterexpression eines Genproduktes, des Individuums kompensiert werden. Prinzipiell ergeben sich zwei Arten der Gentherapie. Eine Möglichkeit besteht darin, dem Körper Zellen zu entnehmen, welche anschließend mit dem Nukleinsäurekonstrukt des ersten Aspektes transfiziert/transduziert werden, um sie anschließend wieder in den Körper einzubringen (ex vivo). Hierbei spricht man auch von Zelltherapie. Andererseits kann das Nukleinsäurekonstrukt des ersten Aspektes verwendet werden, um Zellen direkt im Körper zu transfizieren/transduzieren (in vivo). Insbesondere ist hierbei jedoch darauf zu achten, dass eine Gentherapie nicht an menschlichen Keimbahn-Zellen oder menschlichen embryonalen Stammzellen durchgeführt wird, um eine Vererbung der künstlich eingeführten genetischen Information an Nachkommen zu unterbinden.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des beschriebenen Nukleinsäurekonstrukts zur Herstellung eines Produkts von Interesse, insbesondere eines Polypeptids, einer funktionellen RNA, einem Ribozym oder eines attenuierten Virus. Dieser Aspekt ist insbesondere für die klinische Forschung und für die Grundlagenforschung von Bedeutung. Daneben ist das Nukleinsäurekonstrukt auch für industrielle Verfahren von Bedeutung, insbesondere für Screeningverfahren und für Wirkstoffanalysen im Kleinmaßstab, als auch im Hochdurchsatzverfahren.
  • Weiterhin wird eine Zelle oder eine Zellpopulation offenbart, die das beschriebene Nukleinsäurekonstrukt umfasst. Die Zelle kann eine beliebige isolierte Zelle sein, insbesondere jedoch keine humane embryonale Zelle und keine Keimbahnzelle.
  • Die Zelle oder Zellpopulation kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle, insbesondere eine Säugerzelle sein. Die Zellpopulation, die die Zelle umfasst, kann durch Transfektion oder Transduktion mit dem beschriebenen Nukleinsäurekonstrukt erhalten werden, gegebenenfalls indem transfizierte oder transduzierte Zellen anschließend angereichert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellpopulation nicht durch Einzelzellklonierung gewonnen, sondern durch Anreicherung von transduzierten Zellen aus einem Zellbatch. Das Einführen des Nukleinsäurekonstrukts kann unter Verwendung eines Virus oder durch Transfektion erfolgen, einschließlich z. B. durch chemische Transfektionsmedien, wie Lipofektamin, FuGene, etc., durch Elektroporation, Calciumphosphat-Copräzipitation und durch direkte Diffusion von DNA. Entsprechend der Auswahl des Vektors kann das Nukleinsäurekonstrukt stabil integriert, transient, oder episomal in der Zelle oder Zellpopulation vorliegen. So kann das Nukleinsäurekonstrukt in der Zelle oder den Zellen der Zellpopulation intrachromosomal, als auch extrachromosomal vorliegen. Wenn das Nukleinsäurekonstrukt extrachromosomal vorliegt, kann dieses replizierend oder nicht-replizierend sein.
  • Vorzugsweise umfassen mindestens 20% aller Zellen der Zellpopulation das Nukleinsäurekonstrukt. Insbesondere bevorzugt umfassen mindestens 30%, mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 45%, mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% der Zellen das beschriebene Nukleinsäurekonstrukt. Es gibt zahlreiche, dem Fachmann wohlbekannte Verfahren zum Bestimmen, ob eine Zelle ein gewünschtes Nukleinsäurekonstrukt beinhaltet. Das Nukleinsäurekonstrukt kann zum Beispiel einen Fluoreszenzmarker enthalten, oder transduzierte Zellen könnten durch Verwendung eines mit einem Fluoreszenzmarker gekoppelten Antikörpers, der gegen ein Polypeptid gerichtet ist, das für das Vorhandensein des Nukleinsäurekonstruktes in der Zelle signifikant ist, nachgewiesen werden. Der prozentuale Anteil transduzierter Zellen innerhalb einer Zellpopulation lässt sich so beispielsweise mittels durchflusscytometrischer Methoden, oder durch Auszählen der Zellen bestimmen. Das Nukleinsäurekonstrukt könnte auch eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die das Enzym beta-Galaktosidase kodiert. In diesem Fall könnte das Konstrukt durch kommerziell erhältliche Tests nachgewiesen werden, z. B. durch Beta-Gal Histochemical Staining Kit (in situ, X-Gal), M1R2600, Mirus Corp.; oder ONPG BGal Assay Kit, GO10001 (405–420 nm), OzBiosciences; oder CRPG BGal Assay Kit, GO10001 (570–595 nm), OzBiosciences.
  • In einem letzten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes von Interesse, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Bereitstellen einer Zelle oder Zellpopulation, wie vorstehend beschrieben, in einem Medium, das für die Expression des Produktes förderlich ist, und eine definierte erste Konzentration an Tetracylin (Tet) oder eines Analogons davon enthält;
    • (ii) Kultivieren der Zelle oder Zellpopulation in Gegenwart einer definierten zweiten Konzentration an Tet oder eines Analogons davon im Medium, so dass die Herstellung des Produkts induziert wird; und
    • (iii) Rückgewinnen des Produkts.
  • Die Zelle kann bei einer geeigneten Temperatur und einer geeigneten Atmosphäre (typischerweise 37°C, 5% CO2), gegebenenfalls in einem Zellinkubator gemäß Methoden und Verfahren kultiviert werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die Kulturbedingungen für den jeweiligen Zelltyp variieren können. Rezepturen für Medien können sich im pH, in der Glucosekonzentration und dem Vorhandensein von Wachstumsfaktoren und anderen Nährstoffen unterscheiden. Medien für die Zellkultur sind im Handel erhältlich oder können gemäß Zusammensetzungen, die z. B. von der American Tissue Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, zubereitet werden. Bei der Herstellung der Medien ist insbesondere darauf zu achten, dass die einzelnen Bestandteile frei von Tetracyclin oder dessen Analogon sind, insbesondere wenn tierische Produkte, wie z. B. Seren, Bestandteil des Mediums sind. Die definierte erste Konzentration an Tetracyclin oder eines Analogons davon und die definierte zweite Konzentration an Tetracyclin oder eines Analogons davon im Medium sind abhängig von dem verwendeten Transaktivatorsystem.
  • Wird ein „Tet-on”-System verwendet, so ist die erste Konzentration an Tetracyclin oder des Analogons davon möglichst null oder in einer vernachlässigbaren Menge vorhanden, so dass das Produkt von Interesse nicht, oder nur auf Niveau der Hintergrundexpression exprimiert wird. Vorzugsweise ist kein Tetracyclin oder Analogon davon in dem Medium enthalten. Anschließend wird die Zelle oder Zellpopulation in Gegenwart einer definierten zweiten Konzentration an Tet oder eines Analogons davon im Medium kultiviert, wobei die zweite Konzentration an Tet oder eines Analogons davon so zu wählen ist, dass die Herstellung des Produkts mittels des Transaktivators induziert wird. Anschließend, in einem dritten Schritt, kann das Produkt rückgewonnen werden. Geeignete Konzentrationen zur Induktion können den nachfolgenden Beispielen entnommen werden (siehe insbesondere die Beispiele 4 und 5) und sind auch im Stand der Technik bekannt. Ob eine Konzentration von Tet oder eines Analogons davon ausreichend ist, um die Expression eines gewünschten Produktes zu induzieren, kann durch Vortests unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen an Tet, oder eines Analogons davon, durch Bestimmung des Regulationsfaktor, wie vorangehend beschrieben, bestimmt werden. Ist der Regulationsfaktor größer als 100, so hat eine Induktion stattgefunden.
  • Wird als Transaktivatorsystem ein „Tet-off”-System verwendet, so ist die erste definierte Konzentration an Tetracyclin oder des Analogons davon so hoch zu wählen, dass das Produkt von Interesse nicht, oder nur auf Niveau der Hintergrundexpression exprimiert wird. Geeignete Konzentrationen der ersten definierten Konzentration können aus den nachfolgenden Beispielen abgeleitet werden (siehe insbesondere Beispiele 4 und 5) und sind im Stand der Technik wohlbekannt. Zur Induktion wird das Tetracyclin oder ein Analogon hiervon, aus dem Medium, z. B. durch Pelletieren der Zellen und Überführen in ein neues Medium, welches kein Tetracyclin oder Analogon davon enthält, induziert. Anschließend erfolgt ebenfalls das Rückgewinnen des Produktes in einem dritten Verfahrensschritt.
  • Die Rückgewinnung des Produktes kann aus den Zellen, dem Medium, oder aus beidem erfolgen. Verfahren zum Rückgewinnen eines Produktes von Interesse sind zahlreich und dem Fachmann wohlbekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein Polypeptid, eine funktionelle RNA, ein Ribozym oder ein attenuiertes Virus.
  • Die oben beschriebenen Ausführungsformen können entweder allein oder in Kombination mit anderen Ausführungsformen verwendet werden. Diese und andere Einzelheiten, sowie weitere besondere Ausführungsformen und Vorzüge der Erfindung werden aus den folgenden Beispielen, den Patentansprüchen und den Zeichnungen offensichtlich werden.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 Schema der Tet-regulierten Expression und initiale Testung verschiedener regulatorischer Einheiten in retroviralem Vektorhintergrund.
  • 2 Konstruktionsvergleich von Varianten des Ein-Vektor-System.
  • 3 Qualitativer Vergleich verschiedener regulatorischer Einheiten im MLV-basierten Ein-Vektor-System pMOV-1.
  • 4 Vergleich unterschiedlicher Konstruktionsprinzipien des Ein-Vektor-Systems.
  • 5 Qualitativer Vergleich verschiedener regulatorischer Einheiten im MLV-basierten Ein-Vektor-System pMOV.1-TXsc.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Konstruktion der viralen Vektoren
  • A) Aufbau des viralen Vektors
  • B) Aufbau der tet-regulierten Expressionseinheit
  • C) Aufbau der konstitutiven Expressionseinheit für den Transaktivator
  • A) Der Aufbau der retroviralen Vektoren folgt einem streng systematischen Konzept. Bestimmte Schnittstellen wurden für bestimmte virale und nicht virale Elemete benutzt, unabhängig von der endgültigen Zusammensetzung der Vektoren. Als Basis für die hier beispielhaft verwendeten retroviralen Vektoren wurde der pS2f-c(LMCG)p Vektor verwendet (Löw et al., 2006).
  • Der virale 5'-Promotor (Synthese des viralen Genoms zur Produktion des Vektors) ist bei den retroviralen Konstrukten jeweils als 5'-Avr II und 3'-Nar I Fragment kloniert. Darauf folgt die virale Verpackungsregion, die unterschiedlich ausgeprägt sein kann (entweder nur psi, oder psi/psi+, oder psi/psi+/pol-env) und als 5'-Nar I und 3'-Bgl II Fragment integriert ist.
  • Auf diese notwendigen viralen Komponenten folgt bei den bi-direktionalen Konstrukten (pMOV.1 und pHOV.1) das für die antisense Expression benötigte Polyadenylierungssignal. Im vorliegenden Beispiel wurde entweder SV40pA (Simian Virus 40 polyadenylation signal) oder hGHpA (human Growth Hormone polyadenylation signal) als Bgl II/Bam HI fragment in die Bgl II Schnittstelle des Vektors integriert.
  • Im Falle der uni-direktionalen Vektoren (pMOV.2) wurde an dieser Stelle die Tetregulierte Expressionseinheit (Promotor und Transgen) eingebaut, dessen Aufbau in einem separaten Subklonierungsplasmid erfolgt (siehe B); aus technischen Gründen ist es nicht möglich alle erforderlichen Schnittstellen für die Klonierung auf dem finalen Vektorkonstruktionsplasmid freizuhalten).
  • Ebenfalls in antisense Orientierung wurde das cte-Element (constitutive Iransport element, SRV-1, Simian Retrovirus 1) als Bgl II/Bam HI fragment in die BamHI Schnittstelle integriert. Die resultierende Bam HI Schnittstelle markiert zunächst die Grenze zur regulierten Einheit, welche in einem separaten Klonierungsplasmid fertig gestellt wurde (siehe B); aus technischen Gründen ist es nicht möglich alle erforderlichen Schnittstellen für die Klonierung auf dem finalen Vektorkonstruktionsplasmid freizuhalten).
  • Aus dem gleichen Grund markiert eine Not I Schnittstelle die Grenze zur konstitutiven Expressionseinheit, auf die in 3'-Richtung wieder invariable Teile des Vektors folgen.
  • Hier wurde zunächst das pre-Element (W-PRE: aus Woodchuck Hepatitis Virus – posttranscriptional regulatory element) als Not I/Eag I Fragment integriert, welches in verschiedenen Formen genutzt werden kann. Bevorzugt ist hier die verkürzte Variante, mit deletiertem „atg” des X-Proteins des Hepatitis Virus.
  • Für die Konstruktion der bi-direktionalen Vektoren wurde ein multiple Klonierungsstelle (MCS) zwischen die 5'-liegende Bam HI und die 3'-gelegene Not I Schnittstellen integriert, um die gerichtete Klonierung der regulierten Expressionskassette und der konstitutiven Transaktivator Kassette zu ermöglichen. Diese MCS enthält in 5' zu 3'Orientierung die Schnittstellen: Not I-Xho I-Eco RI-Bam HI.
  • Auf das pre-Element folgt die 3'-Region des viralen Vektors, die neben dem Polypurin Trakt (PPT) die 3'-LTR (Long Terminal Repeat) enthält. Jedoch wurde die U3-Region der 3'-LTR fast vollständig deletiert, und neben der für die spätere Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom notwendige 5'-Begrenzung (border, –448/–412), wurde lediglich der Bereich um die PAPA-box (–70/–1) beibehalten. In letztere wurden Punktmutationen zur Inaktivierung der TATA-box (TFIID-Bindungstelle) eingefügt.
  • Die Deletion der Enhacer Region und die Inaktivierung der TATA-box führen zur Generierung eines so genannten SIN-Vektors (Selbst IN aktivierend).
  • B) Der Aufbau der Tet-regulierten Expressionseinheit erfolgt in einem aufgrund seiner vorhandenen Schnittstellen zur Subklonierung geeigneten Plasmid, dem pBluescript SK II+ Vektor (Stratagene). Mittels vorhandener Primerbindungsstellen innerhalb des Plasmides wird die Sequenzierung der Integrate ermöglicht.
  • Zur Synthese des Tet-Operators wurden die durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gereinigten Oligonukleotide TOH-1 bis TOH-6 verwendet (siehe nachstehende Tabelle).
  • Tabelle 1: Liste der Oligonukleotidpaare. Die nachstehend angegebenen SEQ ID NOs unterhalb der jeweiligen Kästen beschreiben jeweils die untere und obere Nukleotidsequenz.
    Figure 00260001
  • Hierzu wurden zunächst jeweils die Nukleotid-Paare TOH-2/TOH-3 und TOH-4/TOH-5 ligiert und die resultierenden DNA-Fragmente nochmals durch PAGE aufgereinigt. Die beiden gereinigten DNA-Fragmente wurden anschließend wiederum miteinander ligiert. Das resultierende Fragment (TOH-2.3.4.5) wird ebenfalls durch PAGE gereinigt. Nach einem weiteren Ligationsschritt von TOH-2.3.4.5 mit TOH-1, gefolgt von einem Reinigungsschritt durch PAGE, und einer letzten Ligation mit dem Oligonukleotid TOH-6 führt dies zu dem Endprodukt, dem TO7 Fragment. Durch die bereitgestellte 5' Xho I-Schnittstelle und der 3' Nco I Schnittstelle wurde das Fragment direkt in ein pBluescript SKII+ Plasmid 5'- zu einem bereits vorhanden GFP Reportergen einkloniert. Das resultierende Plasmid wurde SK-TO7.g genannt. Dieser Subklon diente als Basis für die Aufnahme und den Transfer der regulierbaren Promotoren als Xho I/Nco I fragmente, oder auch nur der minimal Promotoren als Hin dIII/Nco I fragmente.
  • Die Tet-regulierten Promotoren wurden jeweils mittels Xho I/Nco I in das SK II+ Plasmid integriert, in welches zuvor wiederum das duale Reportergen (lmg*) über Nco I/Not I integriert wurde.
  • Aus diesen Plasmiden (SK-TO7.C*-Img* (T2), SK-TO7.3-lmg* (P6) und SK-TO7.5-lmg* (T8)) wird der tet-regulierte Promotor zusammen mit dem dualen Reportergen als Xho I/Not I Fragment freigesetzt und in die vorbereiteten viralen Vektoren eingesetzt. Dazu wird die MCS der Vektoren mit den gleichen Restriktionsenzymen geöffnet. Diese Schnittstellen bleiben als singuläre Schnittstellen erhalten und erlauben so den gerichteten Austausch der Promotoren (T2, T6, oder T8).
  • Der Ptet-T1 Promotor enthält den CMV Minimalpromotor (–53/+75), wie beschrieben in Gossen und Bujard, 1992, und wurde über Hind III/Sal I aus einem Subklon in das mit den gleichen Enzymen verdauten SK II+ Plasmid integriert. Die weiteren einzelnen Promotor Module wurden durch ortsspezifische Mutagenese mittels PCR generiert.
  • Der Ptet-T2 Promotor wurde durch ortsspezifische Mutagenese des SK-Ptet-P1 Konstruktes erhalten. Hierzu wurden mutierte Oligonukleotide (CMV-mutTB, SEQ ID NO: 22 und SEQ ID NO: 23) entworfen, die das „ag” Dinukleotid oberhalb der TATA-Box durch „c” ersetzt, was zu der Einführung einer TFIIB Bindestelle führt, und durch Austausch des „t” an Position –25 zu „a” in einer TATA-Box Konsensussequenz resultiert.
  • Der Ptet-T6 Promotor wurde durch überlappende PCR mit Hilfe der Oligonukleotide TO7.3s (SEQ ID NO: 24) und TO7.3as (SEQ ID NO: 25) und dem PO7.2 Promotorfragment als Templat erhalten. Das TO7.2 Fragment wurde wiederum durch Mutagenese mittels überlappender Oligonucleotide (TO7.2s (SEQ ID NO: 28) und TO7.2as (SEQ ID NO: 29) und dem SK-TO7.g Plasmid als Template erhalten.
  • Der Ptet-T8 Promotor wurde über PCR durch Vervielfältigung des Minimalpromotors mit Hilfe der MMTV-5' (–89) (SEQ ID NO: 26) und MMTV-3' (+122) (SEQ ID NO: 27) Oligonukleotide sowie dem pΔMtetO-luc Konstrukt als Template (Hoffmann et al., 1997) hergestellt. Das resultierende PCR Produkt enthält die für die in das SK II+ Konstrukt direkte Einklonierung notwendigen Restriktionsschnittstellen.
  • Der T9 Promotor wurde mittels PCR durch Vervielfältigung des gesamten Promotors unter Verwendung der Oligonukleotide MMTV-5' (–37) (SEQ ID NO: 30) und MMTV-3' (+122) (SEQ ID NO: 27), sowie dem wie vorstehend beschrieben hergestellten T8 Promotor-PCR Fragment als Template generiert. Das hierbei resultierende PCR Fragment wurde in das pBluescript SK II+ Plasmid kloniert, sequenziert, und anschließend über Hind III/Sal I in das SK-TO7.g Plasmid umkloniert. Das sich hieraus ergebende Plasmid wurde TO7.6 genannt. Der Ptet-T9 Promotor lässt sich aus diesem Konstrukt als Xho I/Sal I oder Xho I/Nco I Fragment herausschneiden.
  • Der T10 Minimalpromotor wurde ebenfalls mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide TO7.7s (SEQ ID NO: 31) und TO7.7as (SEQ ID NO: 32), sowie dem wie vorstehend beschrieben hergestellten T9 Promotor-PCR Fragment als Template generiert. Hierbei wurden durch das 5' Oligonukleotid eine TFIIB und eine TATA Konsensussequenz eingeführt. Die im weiteren Verlauf verwendeten Sal I und Nco I Restriktionsschnittstelle wurde mittels des 3' Oligonukleotids eingeführt. Das resultierende PCR Fragment wurde in das pBluescript SK II+ Plasmid kloniert, sequenziert, und anschließend über Hind III/Sal I in das SK-TO7.g Plasmid umkloniert. Das sich hieraus ergebende Plasmid wurde TO7.7 genannt. Der Ptet-T10 Promotor lässt sich aus diesem Konstrukt als Xho I/Sal I oder Xho I/Nco I Fragment herausschneiden.
  • Der T11 Minimalpromotor wurde durch Oligonukleotid-basierter Synthese mit Hilfe von überlappenden Oligonukleotiden und PCR hergestellt. Hierzu wurde den Oligonukleotiden TO7.8-s1 (SEQ ID NO: 33) und TO7.8-as1 (SEQ ID NO: 34) erlaubt sich aneinander anzulagern und anschließend die Enden des resultierenden Doppelstranges mittels T4-Polymerase zu einem „blunt-end” geglättet. Analog wurde mit den Oligonukleotiden TO7.8-s2 (SEQ ID NO: 35) und TO7.8-as2 (SEQ ID NO: 36) verfahren. Beide Doppelstränge wurden anschließend durch Polyacrylamidgelektrophorese gereinigt. Im nächsten Schritt wurden die beiden Oligonukleotide in einer äquimolaren Menge (jeweils 1 pmol) miteinander vermischt und mittels PCR vervielfältigt. Der hierdurch resultierende Minimalpromotor T11 wurde über Hind III/Sal I in das SK-TO7.g Plasmid umkloniert und sequenziert. Das sich hieraus ergebende Plasmid wurde TO7.8 genannt. Der Ptet-T11 Promotor lässt sich aus diesem Konstrukt als Xho I/Sal I oder Xho I/Nco I Fragment herausschneiden.
  • Zur Integration in sense Orientierung (pMOV.2) wird das original S2f-c(LMCG) Vektor-tragende Plasmid verwendet, dass die Integration als Xho I/Not I Fragment erlaubt.
  • C) Der Aufbau der konstitutiven Expressionseinheit für den Transaktivator (entweder authentisch, dann tTA-2 (Induktion der Genexpression in Abwesenheit von Doxycycline) oder revers, dann M2 (Induktion der Genexpression in Anwesenheit von Doxycycline)) erfolgte ebenfalls in einem SKII+ basierten Plasmid.
  • Das parentale Plasmid war SK-hPGK, d. h., ein in den SKII+ Vektor klonierter humaner Phosphoglyceratkinase Promotor, der 3' über eine Eco RI und eine Bam HI Schnittstelle verfügte. In diese Restriktionsschnittstellen wurden die Transaktivatoren tTA oder M2 aus Plasmiden des Bujard Labors, pUHD 154-1 und pUHrt 63-1 kloniert. Die konstitutive Expressionseinheit wurde dann über Xho I/Bam HI in das virale Konstrukt überführt, in das bereits die regulierte Einheit integriert war.
  • Zur Integration in sense Orientierung (pMOV.2) wird das originale S2f-c(LMCG) Vektor-tragende Plasmid verwendet, in das bereits die tet-regulierte Expressionseinheit integriert worden war. Die Integration erfolgt dann als CIa I(blunt)/Bam HI in den Not I/Bam HI geschnittenen Vektor.
  • Beispiel 2
  • 1A) zeigt das Prinzip der Tet-regulierten Genexpression (nach: Gossen und Bujard, 1992). Der Tetracyclin-abhängige Transaktivator (tTA) wird mittels konstitutiver Expression kontinuierlich bereitgestellt. Nach Translation liegt tTA in der aktiven Form vor und kann als Dimer an die tet-Operatoren der regulatorischen Einheit binden. Nach der Bindung wird die Synthese des Gens (Luciferase) am Minimalpromotor (C) induziert. Zugabe von Doxycyclin (Dox), und dessen Bindung an tTA, führt zu dessen Konformationsänderung, und nachfolgend zu dessen Dissoziation von den tet-Operatoren.
  • Dadurch wird die Synthese des induzierbaren Gens gestoppt. Zu beachten ist, dass reverse Transaktivatoren („TET-on”), wie S2 oder M2 (Urlinger et al., 2000) genau umgekehrt arbeiten, d. h., sie werden zunächst in der inaktiven Form synthetisiert und durch Dox Zugabe aktiviert.
  • In 1B) ist der grundsätzlicher Aufbau der regulatorischen Einheiten im retroviralen Testvektor dargestellt (zur Nomenklatur der viralen Bestandteile, siehe 2). Ptet-1 gibt das originale System wieder, d. h., die Zentren der tet-Operatoren sind 42 bp voneinander getrennt, der CMV-Minimalpromotor reicht von –53/+75 relativ zum Transkriptionsstart. T1–T11 sind regulatorische Einheiten, die einen 36 bp Abstand zwischen den Operatorzentren aufweisen. Dabei ist T1 der identische Promotor wie in Ptet-1. Für die Synthese von T2 wurden in diesen Minimalpromotor die Konsensussequenzen einer TFIIB- und einer TFIID-Bindungsstelle (TATA-box) eingeführt, während das Initiatorelement (INI) in allen CMV basierten Vektoren enthalten ist. Für T6 wurde zudem der 5'-untranslatierte Bereich des T2 Minimalpromotors durch eine entsprechende Region aus dem Turnip Yellow Mosaik Pflanzenvirus (TYMV) ersetzt. Zusätzliche Promotoren für das Ein-Vektor System sind für T8 bis T11 gezeigt. Diese basieren auf dem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV). Ausgehend von einem Minimalpromotor (T8, –88/+122), wurde dessen 5'-Region gekürzt (T9, –37/+122), bzw in die verkürzte Variante noch die TFIIB Bindungsttelle (T10) eingeführt. Der mit T11 bezeichnete Promotor entspricht weitestgehend dem T6 Promotor, allerdings wurden hier alle CMV-Sequenzen durch Sequenzen aus MMTV ersetzt.
  • 1C) zeigt die Luciferase Aktivität des lmg* Reportergens im „on und off” Zustand des Systems, gemessen nach Transduktion einer tTA-produzierenden HeLa Zelllinie (HtTA-1; Gossen and Bujard, 1992) mit dem pES.1 Testvektor. Die transduzierten Zellen wurde mittels der GFP-Aktivität des lmg* Reportergens durch Fluoreszenz Aktivierte Zell-Sortierung (FACS) angereichert (> 95%) und die entstandene Population im abgeschalteten Zustand (+100 ng/ml Dox) bzw. induzierten Zustand (–Dox) vermessen. Der Regulationsfaktor für die einzelnen regulatorischen Einheiten entspricht dem Quotient der induzierten Aktivität („on”) und nicht regulierbaren Hintergrundaktivität („off”).
  • Beispiel 3
  • 2A) zeigt den retroviralen, bi-direktionalen Vektor pMOV-1TX, der auf dem Maus Moloney Leukemia Virus (MLV) basiert. Gezeigt ist der prinzipielle Aufbau des Provirus mit einem beispielhaft eingesetzten Promotor (pMOV.1-T2). In beiden long terminal repeats (5'-, 3'-LTR) wurde der enhancer/promoter Bereich aus der U3-Region deletiert (ΔU3), d. h. nach Integration wird keine virale genomische RNA mehr gebildet. Die angrenzenden Bereiche der LTR, die R- und U5-Region, sind essentiell für die Polyadenylierung und die Synthese des Vektors und daher unverändert. Am 5'-Ende ist die sogenannte psi-region (Ψ) vorhanden, die essentiell für die Verpackung des Genoms ins virale Capsid ist und zusätzlich die ersten 400 bp des gag-Gens (Ψ+), die eine verbesserte Vektorausbeute während der Produktion gewährleisten. Als Terminationsstelle (pAn) für die antisense orientierte (relativ zur viralen Expression) regulierbare Einheit (Promotor und das lmg* Transgen ist die humane Wachstumshormon Polyadenylierungsstelle (human Growth Hormon, hGH), gekoppelt an das SRV-1 konstitutive Transportelement (cte), welche den nukleo/cytosolischen Transport unprozessierter mRNA optimiert. Weitere Promotoren sind der T6 oder auch T8 Promotor (siehe 1). Der konstitutive humane PGK Promotor treibt die Synthese des (reversen) Doxycycline-abhängigen M2 Transaktivators. Das 3'-dazu integrierte Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) ist ein Translationsenhancer und scheint zudem für die Produktion der Vektoren von Bedeutung zu sein.
  • 2B) zeigt den retroviralen, bi-direktionalen Vektor pHOV-1, der auf dem Humanen Immundefizienz Virus Typ 2 (HIV-2) basiert. Die prinzipielle Struktur der Expressionskassetten ist identisch. Für diesen Vektor spezifische Elemente sind: (i) das rev-response element (RRE), welches essentiell für die Minimierung des Splicing während der Genomsynthese und die Optimierung des nukleo/cytosolischen Transport der unprozessierten mRNA ist; (ii) die zentrale Poly-Purinstelle (cPPT), die für die Synthese des viralen Genoms und im Verlauf der Infektion von großer Bedeutung ist.
  • Der in 2C) gezeigte Vektor pMOV-2 ist ebenfalls ein retroviraler, aber unidirektionaler Vektor, der auf dem Maus Moloney Leukemia Virus (MLV) basiert. Die Elemente sind identisch, der wesentliche Unterschied zu pMOV-1 ist die in sense orientierte, regulierte Expressionskassette. Damit entfällt die zusätzliche pA/cte Sequenz von pMOV-1, weil beide Transkripte an der pAn-Stelle in der viralen 3'-LTR terminiert werden.
  • Der Vektor pMOV-1TXsc, wie gezeigt in 2D) ist bis auf einige Details identisch mit der pMOX-1TX Serie viraler Vektoren. Die Unterschiede sind: (i) der Austausch der hGH Polyadenylierungsstelle gegen eine Terminationsstelle (pAn) aus dem Simian Virus 40 (SV40pA) und (ii) der Integration des MLV pol/env Fragments (p/e) mit nativen splice acceptor (SA) für die, relativ zur viralen Expressionsrichtung in antisense orientierten regulierbaren Einheit. Außerdem wurde eine verkürzte Version des WPRE elements eingesetzt. Beispielhaft ist hier der T6-Promotor dargestellt (pMOV.1-T6sc), der alternativ aber durch die Promotoren T8–T11 ersetzt werden kann.
  • Beispiel 4
  • Ht1080 Zellen wurden mit pMOV-1(T2), pMOV-1(T6) und pMOV-1(T8) Vektoren infiziert (3a)). Die transduzierten Zellpopulationen (ca. 1–5%) wurden mittels FACS angereichert (> 95%) und die spezifische Luziferaseaktivität im induzierten („on”, 500 ng Dox/ml) bzw. nicht-induzierten Zutsand („off”) vermessen. Die Werte zeigen eindeutig, dass durch die Verwendung der T6, bzw. T8 regulatorischen Einheiten die nicht regulierbare Hintergrundaktivität des Systems im abgeschalteten Zustaand („off”) um mehr als eine Größenordnung reduziert wird. Dagegen fällt die Abnahme der induzierten Aktivität mit 30 und 50% als Folge der Verwendung der T6, bzw. T8 Einheiten relativ gering aus.
  • Die regulatorischen Eigenschaften des Ein-Vektor-Systems verbessern sich eindeutig durch die Verwendung der T6, bzw. T8 Promotoren (3B)). Die dargestellten Regulationsfaktoren entsprechen dem Quotienten der induzierten/nicht-induzierten spezifischen Luciferaseakti-vität der in (A) gezeigten transduzierten Ht1080 Populationen.
  • Beispiel 5
  • Ht1080 Zellen wurden mit pMOV-1(T6), pMOV-2(T6) und pHOV-1(T6) Vektoren (zu den Vektoren siehe 2A, B und C) infiziert (4A)). Die transduzierten Zellpopulationen (ca. 1–5%) wurden mittels FACS angereichert (> 95%) und die spezifische Luziferaseaktivität im induzierten („on”, 500 ng Dox/ml) bzw. nicht-induzierten Zutsand („off”) vermessen. Die Werte zeigen, dass in Abhängigkeit des Vektordesigns (pMOV-1/-2) bei Verwendung der gleichen (T6) regulatorischen Einheit deutliche Unterschiede hinsichtlich der Induktion sowie der nicht regulierbaren Hintergrundaktivität auftreten. Die Verwendung des lentiviralen Vektors pHOV-1 führt dagegen zu einer mit dem pMOV-1 Vektor vergleichbaren Luciferaseaktivität.
  • Die regulatorischen Eigenschaften des Ein-Vektor-Systems sind stark abhängig von der Struktur im Sinne der Organisation der regulatorischen/konstitutiven Expressionseinheiten innerhalb der Vektoren. Aus den Ergebnissen in 4B) geht hervor, dass unter regulatorischen Gesichtspunkten die bi-direktionale Expression vorteilhaft ist. Die dargestellten Regulationsfaktoren entsprechen dem Quotienten der induzierten/nicht-induzierten spezifischen Luciferaseaktivität der in (A) gezeigten transduzierten Ht1080 Populationen.
  • Beispiel 6
  • Ht1080 Zellen wurden mit pMOV.1-T6sc, -T8sc, -T9sc, T10sc und -T11sc Vektoren (zu den Vektoren siehe 2D) infiziert (5A)). Die transduzierten Zellpopulationen (ca. 1–5%) wurden mittels FACS angereichert (> 95%) und die spezifische Luziferaseaktivität im induzierten („on”, 500 ng Dox/ml) bzw. nicht-induzierten Zutsand („off”) vermessen. Die Werte zeigen eindeutig, dass, mit Ausnahme der T9 regulatorischen Einheit, die Induktion der Luziferase Aktivität für alle regulatorischen Einheiten nahezu identisch ist. Die Aktivität nimmt ausgehend von ca. 1,3 × 107 rlu/μg Protein für T10 > T6 > T8 > T11 >> T9 auf ca. 1,7 × 106 rlu/μg Protein ab. Die messbaren Unterschiede zeigen sich im Wesentlichen nur durch die nicht regulierte Hintergrundaktivität, die für die T9-Promotorvariante am niedrigsten ist. Die Hintergrundaktivität steigt ausgehend von ca. 1200 rlu/μg Protein für T9 > T8 > T11 > T10 > T6 bis auf ca. 9200 rlu/μg Protein.
  • Die regulatorischen Eigenschaften des Ein-Vektor-Systems basierend auf dem pMOV.1-TXsc Vektor ergeben sich entsprechend aus den für die einzelnen Promotoren gefundenen „on/off” Werten (siehe 5B) sowie 3). Damit zeigt sich bei Verwendung des pMOV.1-TXsc System, dass die besten regulatorischen Eigenschaften von T8 > T10 > T11 erreicht werden.
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Claims (20)

  1. Nukleinsäurekonstrukt, umfassend (a) eine erste Expressionskassette, umfassend in funktionsfähiger Verknüpfung, (i) einen konstitutiv exprimierenden Promotor, und (ii) eine erste Komponente eines Transaktivatorsystems, die einen Transaktivator kodiert, der durch Tetracyclin (Tet) oder ein Analogon davon steuerbar ist; und (b) eine zweite Expressionskassette, umfassend in funktionsfähiger Verknüpfung, (i) einen zweiten Promotor, wobei der zweite Promotor ein Minimalpromotor ist, der die Expression einer Nukleinsäuresequenz steuert, die ein Produkt von Interesse kodiert, und (ii) eine zweite Komponente des Transaktivatorsystems, umfassend mindestens zwei Tet-Operator-Sequenzen, die in einem Abstand angeordnet sind, welcher 33 bis 39 bp zwischen dem Zentrum der ersten Tet-Operator-Sequenz und dem Zentrum der darauf folgenden Tet-Operator-Sequenz(en) beträgt, wobei die zweite Komponente mittels des Transaktivators die Aktivität des zweiten Promotors reguliert.
  2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, wobei der Minimalpromotor ausgewählt ist aus (a) einem von einem CMV-Minimalpromotor abgeleiteten Minimalpromotor, der eine TATA-Box und eine Bindestelle für einen allgemeinen Transkriptionsfaktor umfasst und in dem der 5' untranslatierte Bereich durch eine Region des Turnip Yellow Mosaik Pflanzenvirus (TYMV) ersetzt ist, wobei die Bindestelle für den allgemeinen Transkriptionsfaktor vorzugsweise eine Transkriptionsfaktor II B-Bindestelle ist; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 4952 bis 5075 der SEQ ID NO: 2 ist; oder (b) einem auf dem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) abgeleiteten Minimalpromotor mit verkürztem 5'-Bereich, in dem bestimmte cis-Elemente eleminiert wurden und der eine Bindestelle für einen allgemeinen Transkriptionsfaktor umfasst, wobei die Bindestelle für den allgemeinen Transkriptionsfaktor vorzugsweise eine Transkriptionsfaktor II B-Bindestelle ist; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5064 bis 5226 der SEQ ID NO: 7 ist; oder (c) einem Promotor, in dem die CMV-Sequenzen des Promotors nach (a) gegen MMTV-Sequenzen ausgetauscht wurden; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5064 bis 5176 der SEQ ID NO: 8 ist; oder (d) einem aus einem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV)-Minimalpromotor abgeleiteten Minimalpromotor; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 4952 bis 5161 der SEQ ID NO: 3 ist; oder (e) einem auf dem Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) abgeleiteten Minimalpromotor mit verkürztem 5'-Bereich, in dem bestimmte cis-Elemente eleminiert wurden, insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5064 bis 5222 der SEQ ID NO: 6 ist; oder (f) einem von einem CMV-Minimalpromotor abgeleiteten Minimalpromotor, der eine TATA-Box und eine Bindestelle für einen allgemeinen Transkriptionsfaktor umfasst, wobei die Bindestelle für den allgemeinen Transkriptionsfaktor vorzugsweise eine Transkriptionsfaktor-II-B-Bindestelle ist; insbesondere wobei der Minimalpromotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, 95 mindestens %, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder zu 100% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 4952 bis 5077 der SEQ ID NO: 1 ist.
  3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei der konstitutiv exprimierende Promotor ubiquitär aktiv oder zelltypspezifisch ist.
  4. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der konstitutiv exprimierende Promotor der Promotor der humanen Phosphoglyceratkinase (hPGK) ist, wobei der Promotor vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5336 bis 5873 der SEQ ID NO: 1 ist.
  5. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei der Transaktivator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus M2, kodiert durch Nukleotide 5883–6637 der SEQ ID NO: 1, stTA-2, kodiert durch SEQ ID NO: 37, und rtTA-3; insbesondere wobei der Transaktivator M2 ist.
  6. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 5, wobei der Transaktivator M2 oder rtTA-3 durch Doxycyclin steuerbar ist oder wobei der Transaktivator stTA-2 durch Tetracyclin oder Doxycyclin steuerbar ist.
  7. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei das Produkt ein Polypeptid, eine funktionelle RNA, ein Ribozym oder ein attenuiertes Virus ist.
  8. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die zweite Komponente des Transaktivatorsystems sieben Tet-Operator-Sequenzen umfasst; vorzugsweise wobei die zweite Komponente des Transaktivatorsystems eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70% identisch mit der Nukleinsäuresequenz von Positionen 5084 bis 5329 der SEQ ID NO: 1 ist.
  9. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste und die zweite Expressionskassette uni-direktional oder bi-direktional zueinander angeordnet sind.
  10. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein integrierender oder ein nicht-integrierender Vektor ist, insbesondere wobei der nicht-integrierende Vektor replizierend oder nicht-replizierend ist, oder wobei insbesondere der integrierende Vektor ein Transposon ist.
  11. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei der Vektor ein retroviraler Vektor ist; vorzugsweise ein c-Typ- oder ein Lenti-viraler Vektor ist, insbesondere ein Vektor auf Basis des Maus Moloney Leukemia Virus (MLV) oder des Humanen Immundefizienz Virus (HIV) ist.
  12. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11, wobei der retrovirale Vektor ein selbstinaktivierender Vektor (SIN-Vektor) ist.
  13. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein Plasmid ist.
  14. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäurekonstrukt einen Regulationsfaktor auf Ebene einer Zellpopulation von 1000-fach bis 11000-fach aufweist.
  15. Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäurekonstrukt auf Ebene einer Zellpopulation ein Expressionsniveau von mindestens 0,1–7,0 × 106 rlu/μg Protein aufweist, wenn das Produkt von Interesse Luciferase ist.
  16. Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche 1–15 zur Verwendung in der Zell- und Gentherapie.
  17. Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts gemäß einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche 1–15 in der Herstellung eines Produktes von Interesse, insbesondere eines Polypeptids, einer funktionellen RNA, einem Ribozym oder eines attenuierten Virus.
  18. Zelle oder Zellpopulation, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15.
  19. Verfahren zur Herstellung eines Produktes von Interesse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer Zelle oder Zellpopulation gemäß Anspruch 18 in einem Medium, dass für die Expression des Produktes förderlich ist, und eine definierte erste Konzentration an Tetracylin (Tet) oder eines Analogons davon enthält; (ii) Kultivieren der Zelle oder Zellpopulation in Gegenwart einer definierten zweiten Konzentration an Tet oder des Analogons davon im Medium, so dass die Herstellung des Produkts induziert wird; und (iii) Rückgewinnen des Produkts.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Produkt ein Polypeptid, eine funktionelle RNA, ein Ribozym oder ein attenuiertes Virus ist.
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