JP2000508895A - 哺乳動物系における外来遺伝子の発現を調節するためのホルモン媒介方法と、それに関連した産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明により、哺乳動物対象における外来遺伝子の発現を、修飾エクジソン受容体を用いて調節するための種々な方法が提供される。修飾エクジソン受容体と、同修飾エクジソン受容体を含有するホモマー及びヘテロダイマー受容体と、本発明の修飾エクジソン受容体をコードする核酸と、修飾エクジソン応答要素と、本発明の修飾エクジソン受容体をコードする核酸を含有する遺伝子転移ベクターと、組換え細胞と、トランスジェニック動物をも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物系における外来遺伝子の発現を調節するためのナルモン媒介方法と、 それに関連した産物 発明の分野 本発明は組換えＤＮＡテクノロジーの分野における方法と、それに関連した産 物とに関する。さらに詳しくは、本発明は哺乳動物系における外来遺伝子の発現 を調節する方法と産物とに関する。 発明の背景 ステロイド／甲状腺ホルモン受容体は、細胞の成り行きと機能との変化の媒介 に重要な役割を果たす、リガンド依存性転写因子のスーパーファミリーを含む（ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：８８９〜８９５（１９８８） ）。これらの受容体は、ホルモン応答要素（ＨＲＥ）と呼ばれる特異的エンハン サー配列を含有する標的遺伝子に、細胞外ホルモンシグナルをトランスデュース する（Ｅｖａｎｓ，（１９８８）；ＧｒｅｅｎとＣｈａｍｂｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ．４：３０９〜３１４（１９８８）；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｒ． ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２０９〜２５２（１９８５））。各受 容体はそれ自身のＨＲＥを認識し、このことは各ホルモンシグナルによって特有 の応答が誘発されることを保証する。関連転写因子の集積とそれらのコグネイト 応答要素とは共に、遺伝子発現を調節する唯一の機会を与える。 受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの各メンバーのＤＮＡ結合ド メインは６６〜６８アミノ酸を有する。９システインを含む、これらのうちの２ ０アミノ酸はファミリー全体に保存される。この受容体スーパーファミリーのメ ンバーのモジュール構造(modular structure)は、機能的キメラ也を作製するた めの受容体間の相同的ドメインの交換を可能にする。この方策を用いて、ＤＮＡ 結合ドメインがＨＲＥの特異的認識の唯一の原因であることがｉｎ ｖｉｖｏで （ＧｒｅｅｎｔｏＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７５〜７８（１９８ ７） ；Ｇｉｑｕｅｒｅ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：６２４〜６２９（１９８７）；Ｐ ｅｔｋｏｖｉｃｈ等，３３０：４４４〜４５０（１９８７）；Ｋｕｍａｒ等，Ｃ ｅｌｌ ，５１：９４１〜９５１（１９８７）；Ｕｍｅｓｏｎｏ等，ＮａＴｕｒｅ ，３３６：２６２〜２６５（１９８８）；ＴｈｏｍｐｓｏｎとＥｖａｎｓ，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．８６：３４９４〜３４９８（ １９８９））及びｉｎ ｖｉｔｒｏで（ＫｕｍａｒとＣｈａｍｂｏｎ，Ｃｅｌｌ ，５５：１４５〜１５６（１９８８））実証されている。Ｘｅｎｏｐｕｓ転写因 子ＩＩＩＡの提案された構造との類似性（Ｍｉｌｌｅｒ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，４ ：１６０９〜１６１４（１９８５））によって、不変システインは、ＤＮＡ結合 機能を仲介する２個の“ジンク・フィンガー”を形成すると考えられる（Ｈｏｌ ｌｅｎｂｅｒｇとＥｖａｎｓ，Ｃｅｌｌ，５５：８９９〜９０６（１９８８）） 。Ｚｎ（ＩＩ）配位におけるこれらのシステインの関与は、広帯域Ｘ線吸収微細 構造（Ｆｒｅｅｄｍａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４３〜５４６（１９８８ ））と、点突然変異誘発実験によるＤＮＡ結合（ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇとＥｖａ ｎｓ，（１９８８）；Ｓｅｖｅｒｎｅ等，ＥＭＢＯ Ｊ．７：２５０３〜２５０ ８（１９８８））とによって支持される。 ＨＲＥは実際に構造的に、機能的にではなく、明確に関連する。グルココルチ コイド受容体応答要素（ＧＲＥ）と、エストロゲン受容体応答要素（ＥＲＥ）と 、甲状腺ホルモン受容体応答要素（ＴＲＥ）とは詳細に特徴づけられている。こ れらの特定の応答嬰素はヘキサマーの“ハーフサイト(half-site)”のパリンド ローム対を有することが判明している（Ｅｖａｎｓ，（１９８８）；Ｇｒｅｅｎ とＣｈａｍｂｏｎ，（１９８８））。プソイド−(pseudo-)又は共通応答要素の 最適化によって、ハーフサイトにつき２個のヌクレオチドのみがＧＲＥとＥＲＥ との間で異なる（Ｋｌｏｃｋ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：７３４〜７３６（１９ ８７））。他方では、ＥＲＥとＴＲＥとは同じハーフサイトを有するが、２つの ハーフサイトの間のヌクレオチドスペーサーの数は異なる（Ｇｌａｓｓ等，Ｃｅ ｌｌ ，５４：３１３〜３２３（１９８８））。 パリンドローム配列モチーフを有する応答要素とは対照的に、下記ホルモン受 容体は典型的に、直接反復（ＤＲ）配列モチーフで２個のハーフサイトを有する 応答要素：ＲＸＲ、ＲＡＲ、ＣＯＵＰ−ＴＦ、ＰＰＡＲ等を認識する（例えば、 Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ等，Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ：Ｂｉｏｌｏｇy，Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第２版 ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓ ｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４，第８章）。したがって、少なくと も３種類の独特の手段を用いて、ＨＲＥ多様性(diversity)：（１）特定のハー フサイトに対する結合部位特異性；（２）２つのハーフサイト間のヌクレオチド 間隔；及び（３）ハーフサイトの相互に対する配向を得る。 昆虫系では、ステロイドホルモンのエクジソンはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅ ｌａｎｏｇａｓｔｅｒ における変態を誘発して、数分間のホルモン添加中に例え ば染色体パフのようなゲノム効果を実証する。昆虫におけるこの応答を媒介する のは、機能的エクジソン受容体、エクジソン受容体（ＥｃＲ）のヘテロダイマー 及びｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ遺伝子（ＵＳＰ）の産物である（Ｙａｏ等，（ １９９３），Ｎａｔｕｒｅ，３６６，４７６〜４７９；及びＹａｏ等，（１９９ ２），Ｃｅｌｌ，７１，６３〜７１）。培養した哺乳動物細胞におけるＥｃＲ、 ＵＳＰ、エクジソン応答レポーターの同時トランスフェクションと、エクジソン 又は合成類似体ムリステロンＡによる処理とによって、昆虫エクジステロイドに 対する反応性(responsiveness)を再現することができる。 遺伝子工学の分野では、遺伝子発現の正確な制御は、発達及び他の生理的プロ セスを研究し、操作し、制御するための非常に貴重なツールである。例えば、哺 乳動物系における制御された遺伝子発現の用途は、誘導遺伝子ターゲッティング 、有害な遺伝子と催奇性遺伝子との過剰発現、アンチセンスＲＮＡ発現、及び遺 伝子療法を包含する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０，１４６８〜１４７４）。培養した細胞に対しては、グルココルチコイド と他のステロイドが、所望の遺伝子の発現を誘導するために用いられている。 哺乳動物系における遺伝子発現を制御するための他の手段としては、誘導テト ラサイクリン調節系が考案されて、トランスジェニックマウスにおいて、この抗 生物質の不存在下では遺伝子活性が誘導され、その存在下では遺伝子活性が後退 するように用いられている（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ等（１９９２），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．８９，５５４７〜５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ等（１ ９９３），ＴＩＢＳ，１８，４７１〜４７５；Ｆｕｒｔｈ等（１９９４），Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．９１，９３０２〜９３０６；Ｓｈｏｃｋｅ ｔｔ等（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２，６５２２ 〜６５２６を参照のこと）。しかし、この系の欠点は、テトラサイクリンの連続 処理が発現を後退させ、骨からのこの抗生物質のクリアランスを遅滞させて、こ のことが迅速かつ正確な誘導を妨害することを包含する。この系は、誘導アクチ ベーターとして逆に作用する突然変異体テトラサイクリンリプレッサーが最近同 定されたことによって改良されているが、発達中に、正確かつ効果的な“オン− オフ”切り換えが重要である場合に、テトラサイクリンの薬物動態がその使用を 妨げる可能性がある（Ｇｏｓｓｅｎ等（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８， １７６６〜１７６９）。 したがって、当該技術分野では、哺乳動物対象における外来遺伝子の発現を正 確に調節するための改良方法が必要とされている。 発明の簡単な説明 本発明によると、哺乳動物対象における外来遺伝子の発現を調節するための種 々な方法を提供する。本発明の方法は、例えば、患者の多様な細胞中に組換えタ ンパク質を投与するためのｉｎ ｖｉｖｏ治療法のような、外来遺伝子の誘導ｉ ｎ ｖｉｖｏ 発現が望ましい、非常に多様な用途に有用である。 先行技術のテトラサイクリンに基づく方策とは異なり、哺乳動物細胞にエクジ ソンの反応性を移すことは、天然発生したステロイド誘導系を利用することであ る。エクジステロイド利用の利点は、これらの化合物の親油性（脳を含めた、あ らゆる組織中へのそれらの効果的な浸透を生じる）、短い半減期（正確でかつ効 果的な誘導を可能にする）、及び蓄積を防止し、クリアランスを促進する有利な 薬物動態を包含する。 本発明の他の実施態様によると、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミ リーの少なくとも１種のサイレントパートナーを、本発明の修飾エクジソン受容 体と共に含む、ホモダイマー種又はヘテロダイマー種の形状で存在しうる修飾エ クジソン受容体を提供する。本発明の修飾エクジソン受容体は、例えば、哺乳動 物対象における外来遺伝子の発現を調節する方法に有用である。 本発明の他の実施態様によると、本発明の修飾エクジソン受容体をコードする 核酸、修飾エクジソン受容体応答要素、遺伝子伝達ベクター、組換え細胞、及び 本発明の修飾エクジソン受容体をコードする核酸を含有するトランスジェニック 動物を提供する。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｄは、ＵＳＰ又はＲＸＲと異なる修飾ＥｃＲとの種々な組合せを用 いるエクジソン反応性の最適化を示す。図１Ａでは、図面の両側の数値は同じス ケールであり、理解しやすいようにＧＥｃＲ／ＲＸＲ値を繰り返す。暗色バーと 帯状バーとは、それぞれ、ホルモンを含まない又は１μＭムリステロンＡを含む レポーター活性を表す。 図１Ｂは、エクジソン応答要素（ＥｃＲＥ）とハイブリッドエクジソン／グル ココルチコイド応答要素（Ｅ／ＧＲＥ）応答レポーターとに対するＦＸＲとＶｐ ＥｃＲ活性を示す。ＶｐＥｃＲ、ＶｇＥｃＲと、受容体を有さない対照トランス フェクションとを１μＭムリステロンＡによって処理した。ＦＸＲトランスフェ クションは５０μＭ ＪｕｖｅｎｉｌｅホルモンＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）によって 処理した。暗色バーと帯状バーとは、それぞれ、ホルモンを含まない又は１μＭ ムリステロンＡ／５０μＭ ＪｕｖｅｎｉｌｅホルモンＩＩＩを含むレポーター 活性を表す。 図１Ｃは、Ｅ／ＧＲＥとＧＲＥとが非オーバーラップ応答要素である。暗色バ ーと帯状バーとは、それぞれ、ホルモンを含まない又は１μＭムリステロンＡ／ １μＭ デキサメタゾンを含むレポーター活性を表す。 図１Ｄは、修飾エクジソン受容体の概略図を示す。ＧＥｃＲは、ＧＲのＮ末端 トランス活性化ドメインと、ＥｃＲのＤＮＡ−及びリガンド−結合ドメインとを 含有するキメラ受容体である。ＶｐＥｃＲは、Ｖｐ１６の活性化ドメインに融合 したＥｃＲのＮ末端切頭である。ＶｇＥｃＲは、ＤＮＡ結合ドメインのＰボック ス内の下記点突然変異：Ｅ２８２Ｇ、Ｇ２８３Ｓ及びＧ２８６Ｖを除いて、Ｖｐ ＥｃＲと同じである。図において、ＤＢＤ＝ＤＮＡ結合ドメイン及びＬＢＤ＝リ ガンド結合ドメイン。 図２は、本発明のエクジソン誘導遺伝子発現系の概略図である。ＲＸＲと修飾 ＥｃＲとの発現後、２種類の受容体はホルモンの存在下でエクジソン応答要素含 有プロモーターをヘテロダイマー化し、トランス活性化することができる。エク ジソン応答要素を、任意の外来ｃＤＮＡの発現を推進することができる最小プロ モーター(即ち、エンハンサーレス(enhancerless)プロモーター)の上流に配置す る。 図３Ａは、ムリステロンによるＮ１３細胞の用量依存性活性化を示す。Ｎ１３ 細胞を種々な濃度のムリステロンによって３６時間増殖させ、次に、標準ＯＮＰ Ｇ分析によるβ−ガラクトシダーゼ活性（オープン方形）又はルシフェラーゼ活 性（クローズド円）に関して分析した。図３Ｂは、ホルモンによって処理したＮ １３細胞のルシフェラーゼ活性の時間経過を示す。Ｎ１３細胞は１μＭムリステ ロンの存在下で別々の穴で増殖させ、種々な時点において回収し、実施例３に述 べるようにルシフェラーゼ活性に関して分析した。 図４は、実施例４に述べるような、マウスにおけるムリステロン活性を示す。 発明の詳細な説明 本発明によると、（ｉ）エクジソン応答要素の制御下で外来遺伝子を含むＤＮ Ａ構築体と、（ii）そのためのリガンドの存在下と、そのためのサイレントパー トナーとして作用しうる受容体のさらなる存在下で、前記エクジソン応答要素と 結合する修飾エクジソン受容体とを含有する哺乳動物対象における前記外来遺伝 子の発現を調節する方法であって、 前記修飾エクジソン受容体のためのリガンドの有効量を前記対象に投与するこ とを含み、前記リガンドが前記対象の細胞中に通常存在せず、前記リガンドが前 記対象に対して有害でない、上記方法を提供する。 したがって、本発明によると、昆虫脱皮ホルモン、エクジソンを哺乳動物系に おける遺伝子発現の調節性インデューサーとして有利に利用する、即ち、バック グラウンド発現レベルは誘導のために必要な条件の不存在下で実質的に零である 。本発明の修飾エクジンン受容体（好ましくは、変化したＤＮＡ結合特異性を有 する）と共に新規な修飾エクジソン応答要素を含有する最適化プロモーターは、 きわめて有力で、特異的な誘導哺乳動物発現系を提供することが判明している。 本発明の発現系の低い基底活性は、転写因子と有害(toxic)遺伝子の発現のため に有利に適する。本発明の誘導発現系の優れた用量反応性と誘導速度特性は、所 望の遺伝子の誘導の程度と期間の両方の正確な制御を可能にする。 本発明の方法は外来非哺乳動物インデューサーによって調節遺伝子発現を生じ るので、本発明の方法は多様なｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの哺乳動物 発現系に有利に用いることができる。例えば、本発明の方法によると、トランス ジェニック哺乳動物におけるｃｒｅ組換え酵素の誘導発現は、当業者が成人の又 は発達中の胚の特異的な誘導遺伝子ターゲッティングを一時的に達成することを 可能にする（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ等（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，１３ ５１〜１３５５）。 本明細書で用いるかぎり、“調節する(modulate)”及び“調節(modulating)” なる用語は、一定のリガンド／受容体錯体が外来遺伝子の転写のトランス活性化 をおこなう能力を、リガンドの不存在下での前記受容体のこのような能力を基準 にして、意味する。受容体のトランス活性化活性に対する錯体形成の実際の効果 はリガンド／受容体錯体の一部である特異的受容体種と、リガンド／受容体錯体 が相互作用する応答要素とに依存して変化する。 本明細書で用いるかぎり、遺伝子に関する場合、“前記哺乳動物対象に外来性 ”なるフレーズ又は単に“外来性(exogenous)”とは、遺伝子産物が発現が望ま しい特定の細胞において天然には発現されない、任意の遺伝子を意味する。例え ば、外来遺伝子は、対象中にＤＮＡ又はＲＮＡとして導入される、天然若しくは 合成の野生型遺伝子及び治療的遺伝子であることができる。問題の遺伝子をター ゲット細胞に導入することができる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途のために）、又は問 題の遺伝子を対象中に直接導入することができる、或いは問題の遺伝子を形質転 換済み細胞の転移によって対象中に間接的に導入することができる。 “野生型”遺伝子は、特定の種類の細胞に対してネイティブである遺伝子であ る。このような遺伝子は過剰発現されることが好ましくないか、又は生物学的に 有意なレベルで発現されることはできない。したがって、例えば、ヒトインシュ リンをコードする合成遺伝子又は天然遺伝子は酵母細胞に対する外来遺伝物質で あると考えられ（酵母細胞は天然にはインシュリン遺伝子を含有しないので）、 ヒト皮膚線維芽細胞中に挿入されたヒトインシュリン遺伝子は、ヒト皮膚線維芽 細胞は生物学的に有意なレベルでヒトインシュリンを発現しないが、ヒトインシ ュリンをコードする遺伝物質を含有するので、この細胞に対して野生型であると 考えられる。 本発明の実施に用いるために考えられる野生型遺伝子は、遺伝子産物：その実 質的な不存在が前記対象における非標準状態の発生を生じる遺伝子産物、又はそ の実質的な過剰が前記対象における非標準状態の発生を生じる遺伝子産物等をコ ードする遺伝子を包含する。 本明細書で用いるかぎり、“治療的遺伝子”なるフレーズは、このような遺伝 子が発現される宿主細胞に有利な機能を与える遺伝子を意味する。治療的遺伝子 は宿主細胞中に天然には見いだされない遺伝子である。例えば、野生型ヒトイン シュリンをコードする合成又は天然遺伝子は、生物学的に有意なレベルで機能的 に活性なヒトインシュリンを発現することができないヒト宿主において発現され るように皮膚線維芽細胞中に挿入されたときに治療的であると考えられる。本明 細書に述べる方法によると、治療的遺伝子は対応する治療的タンパク質の治療有 効量を与えるレベルで発現される。 本発明の実施に用いるために考えられる治療的遺伝子は、遺伝子産物：それが 発現される細胞に有害である遺伝子産物；又は宿主細胞に有利な性質（例えば、 薬物耐性等）を与える遺伝子産物等をコードする遺伝子を包含する。 多様なタンパク質をコードする、非常に多くのゲノム及びｃＤＮＡ核酸配列は 当該技術分野において周知である。本発明の実施に有用な外来遺伝物質は、問題 の生物学的に活性なタンパク質、例えば前記細胞から放出されうる分泌タンパク 質をコードする遺伝子；基質(substrate)を有害物質から有用物質へ又は不活性 物質から有用物質へ代謝することができる酵素；調節タンパク質；細胞表面受容 体等をコードする遺伝子を包含する。有用な遺伝子は、例えばヒトＶＩＩＩ因子 及びＩＸ因子のような血液凝固因子をコードする遺伝子；例えばインシュリン、 副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出因子（ＬＨＲＨ）、α及びβ−精巣イ ンヒビン並びにヒト成長ホルモンのような、ホルモンをコードする遺伝子；例え ば、その不存在が異常な状態の発生を生じる酵素のようなタンパク質をコードす る遺伝子；例えば、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 （ＧＭ−ＣＳＴ）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮ Ｆ）及びエリトロポエチン（ＥＰＯ）のような、サイトカイン又はリンホカイン をコードする遺伝子；例えばα₁−アンチトリプシンのような阻害剤物質をコー ドする遺伝子；例えば、ジフテリア及びコレラ毒素をコードする遺伝子のような 、薬物として機能する物質をコードする遺伝子；等を包含する。 典型的に、所望のタンパク質の核酸配列情報は例えばＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢ Ｌ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＰＩＲのような、多くの公共アクセスデータベー スの１つ又は多くの生物学関連冊子刊行物に存在を確認することができる。した がって、当業者は実際にあらゆる公知遺伝子に関する核酸配列情報へのアクセス を有する。当業者は公共寄託所又は配列を公開している機関から直接、対応核酸 分子を入手することができる。任意に、所望のタンパク質をコードする核酸配列 が確認されたならば、当業者はルーチン方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）増幅）を用いて、適当な核酸ライブラリーから所望の核酸分子を単離す ることができる。したがって、問題のタンパク質をコードする全ての既知核酸は 、本明細書に述べる方法及び産物に用いるために入手可能である。 本明細書で用いるかぎり、“哺乳動物(mammal)”又は“哺乳動物の(mammalian )”なる用語はヒト；家畜化された動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、イ ヌ、ネコ等；飼育場動物、例えば、ニワトリ、ウシ、ブタ及びヒツジ等；並びに 動物園的に重要な動物、例えば、サル及びヒヒ；等を意味する。 本発明の実施に用いるために考えられる修飾エクジソン受容体は、エクジソン リガンド結合ドメインと；ＤＮＡ結合タンパク質から得られるＤＮＡ結合ドメイ ンと；転写因子の活性化ドメインとを含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン又は前記活 性化ドメインの少なくとも一方はネイティブエクジソン受容体から得られないも のとする、但し、前記活性化ドメインがグルココルチコイド受容体に由来する場 合には、前記ＤＮＡ結合ドメインはグルココルチコイド受容体にも又は大腸菌Ｌ ｅｘＡタンパク質にも由来しない。本発明によると、修飾エクジソン受容体は好 ましくは哺乳動物の発現系において、エクジソン応答要素を有する転写調節領域 からの遺伝子発現をトランス活性化するように機能する。 本発明の修飾エクジソン受容体の製造に用いるために考えられるエクジソンリ ガンド結合ドメインは典型的にネイティブエクジソン受容体のカルボキシ末端部 分に由来し、エクジステロイドを結合することができる（Ｋｏｅｌｌｅ等，Ｃｅ ｌｌ ，６７：５９〜７７；及びＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ等，ＰＮＡＳ，Ｕ ＳＡ ，８９：６３１４〜６３１８，１９９２）。エクジソンリガンド結合ドメイ ンは、いずれの配向でも、本発明の修飾エクジソン受容体内の種々な位置に配置 することができる。例えば、エクジソンリガンド結合ドメインは修飾受容体のア ミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか又はそれらの間に位置決めされるこ とができる。本発明の好ましい実施態様では、エクジソンリガンド結合ドメイン は修飾受容体のカルボキシ末端に位置決めされる（図１Ｄを参照）。 本発明の修飾エクジソン受容体の作製に用いるために考えられるＤＮA結合ド メインは典型的に、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）から得られる。 “ＤＮＡ結合ドメイン”なる用語は、当該技術分野では、ＤＮＡに結合すること ができるアミノ酸配列を意味すると理解される。本明細書で用いるかぎり、“Ｄ ＮＡ結合ドメイン”なる用語は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答要素と結合す るように機能するかぎり、ＤＮＡ結合タンパク質の全長までの、ＤＮＡ結合タン パク質の最小ペプチド配列を包含する。 このようなＤＮＡ結合ドメインは、天然ＤＮＡ認識配列を結合する能力を維持 することによって、他の機能的タンパク質ドメインと共に異種構造的に(heterol ogously)機能することが知られている（例えば、ＢｒｅｎｔとＰｔａｓｈｎｅ， １９８５，Ｃｅｌｌ，４３：７２９〜７３６を参照のこと）。例えば、ホルモン 受容体は、キメラタンパク質中で機能する、相互交換可能なＤＮＡ結合ドメイン を有することが知られている（例えば、米国特許第４，９８１，７８４号を参照 のこと）。したがって、本発明の修飾エクジソン受容体のリガンド結合ドメイン と同様に、ＤＮＡ結合ドメインはカルボキシ末端若しくはアミノ末端のいずれか に位置決めされることができる、又はＤＮＡ結合ドメインはリガンド結合ドメイ ンと活性化ドメインとの間に位置決めされることができる。本発明の好ましい実 施態様では、ＤＮＡ結合ドメインはリガンド結合ドメインと活性化ドメインとの 間に内部に位置決めされる。 本発明に用いるために考えられる“ＤＮＡ結合タンパク質（単数又は複数種類 ）”は、ＤＮＡを直接結合して、転写の開始又は抑制を促進することができる、 周知の種類のタンパク質に属する。本発明に用いるために考えられる具体的なＤ ＮＡ結合タンパク質は転写調節タンパク質（例えば、転写因子等；Ｃｏｎａｗａ ｙとＣｏｎａｗａｙ，１９９４，“転写の機構と調節”，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓ ｓ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ ，３巻，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）を包含する。 このようなＤＮＡ結合ドメインの供給源として本発明に用いるために考えられ る転写因子は、例えばホメオボックスタンパク質、ジンク・フィンガータンパク 質、ホルモン受容体、ヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質、ヘリックス ・ループ・ヘリックスタンパク質、塩基性Ｚｉｐタンパク質（ｂＺｉｐ）、β− リボンタンパク質等を包含する。例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．，“ＤＮＡ結 合ドメインの構造分類学”，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：７１５〜７１９を参照のこ と。本発明に用いるために適したホメオボックスＤＮＡ結合タンパク質は、例え ば、ＨＯＸ、ＳＴＦ−１（Ｌｅｏｎａｒｄ等，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．， ７：１２７５〜１２８３）、Ａｎｔｐ、Ｍａｔ α−２、ＩＮＶ等を包含する。 Ｓｃｏｔｔ等（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９８ ９：２５〜４８をも参照のこと。ＳＴＦ−１ホメオドメインを含有する７６アミ ノ酸フラグメント（Ｌｅｏｎａｒｄ等，１９９３，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．，７：１ ２７ ５〜１２８３に述べられたアミノ酸１４０〜２１５に相当）が野生型ＳＴＦ−１ と同様に緊密にＤＮＡを結合することが判明している。本発明に用いるために適 したジンク・フィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、Ｚｉｆ２６８、ＧＬＩ、ＸＦ ｉｎ等を包含する。ＫｌｕｇとＲｈｏｄｅｓ（１９８７），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ，１２：４６４；ＪａｃｏｂｓとＭｉｃｈａｅｌｓ（１９ ９０），Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．，２：５８３；及びＪａｃｏｂｓ（１９９２），Ｅ ＭＢＯ Ｊ ．，１１：４５０７〜４５１７をも参照のこと。 好ましくは、本発明に用いるＤＮＡ結合ドメインは受容体のステロイド／甲状 腺スーパーファミリーのメンバーから得られる。本明細書で用いるかぎり、“受 容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバー（単数又は複数）”（ “核内受容体”又は“細胞内受容体”としても知られる）なるフレーズは、それ らに対する特異的リガンドがまだ同定されていない、受容体のステロイド／甲状 腺スーパーファミリーの同定済みメンバーを含めた、リガンド依存性転写因子と して作用するホルモン結合タンパク質を意味する（以下では、“オーファン受容 体”と呼ぶ）。 受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの具体的なメンバー（それら の種々なアイソフォームを含める）は、例えばグルココルチコイド受容体（ＧＲ ）、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロ ゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ビタミンＤ₃受容体 （ＶＤＲ）等のようなステロイド受容体；さらに、例えばレチノイン酸受容体の 種々なアイソフォーム（例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ又はＲＡＲγ）、レチノイ ドＸ受容体の種々なアイソフォーム（例えば、ＲＸＲα、ＲＸＲβ又はＲＸＲγ ）等のようなレチノイド受容体（例えば、米国特許第４，９８１，７８４号；第 ５，１７１，６７１号及び第５，０７１，７７３号を参照）；例えばＴＲα、Ｔ Ｒβ等のような甲状腺受容体（ＴＲ）；例えばエクジソン受容体等のような、昆 虫由来受容体；並びにそれらの構造と性質によって、上記で定義したようなスー パーファミリーのメンバーであると考えられる、他の遺伝子産物（それらの種々 なアイソフォームも含む）を包含する。ＤＮＡ結合ドメインの供給源として本発 明に 用いるために考えられるオーファン受容体の例は、ＨＮＦ４［例えば、Ｓｌａｄ ｅｋ等，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏpｍｅｎｔ ４：２３５３〜２３６５（ １９９０）を参照］、受容体のＣＯＵＰファミリー［例えば、Ｍｉｙａｊｉｍａ 等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１１０５７〜１１ ０７４（１９８８）と、Ｗａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：１６３〜１６６（ １９８９）を参照］、例えばＭｌｏｄｚｉｋがＣｅｌｌ，６０：２１１〜２２４ に、及びＬａｄｉａｓ等がＳｃｉｅｎｃｅ，２５１：５６１〜５６５（１９９１ ）に述べているような、ＣＯＵＰ様受容体とＣＯＵＰ同族体、ペルオキシソーム プロリフェレーター(proliferator)活性化受容体（ＰＰＡＲ；例えば、Ｉｓｓ ｅｍａｎｎとＧｒｅｅｎ，上記文献を参照）、昆虫由来ｋｎｉｒｐとｋｎｉｒｐ 関連受容体、等を包含する。 受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの全てのメンバーのＤＮＡ結 合ドメインは関連しており、６６〜６８アミノ酸残基から成り、９システインを 含めた、約２０の不変アミノ酸残基を有する。スーパーファミリーのメンバーは 、これらの２０不変アミノ酸残基を含有するタンパク質として特徴づけることが できる。スーパーファミリーのメンバーのＤＮＡ結合ドメインの高度に保存され たアミノ酸は次の通りである： 式中、ＸはＤＮＡ結合ドメイン内の非保存アミノ酸を示す；星印はほぼ全般的に 保存されるアミノ酸残基を意味する、但し、幾つかの同定済みホルモン受容体中 で変化が見いだされたアミノ酸残基を除く；括弧内に囲まれた残基は任意の残基 である（したがって、ＤＮＡ結合ドメインは長さにおいて少なくとも６６アミノ 酸であるが、幾つかの付加的残基を含有することができる）。 新しいターゲット認識配列を認識するための既存ＤＮＡ結合ドメインの修飾も 本発明において考えられる。例えば、本発明によると、受容体のステロイド／甲 状腺スーパーファミリーのメンバーのＤＮＡ結合ドメインの“Ｐ−ボックス”配 列の修飾が、他のキメラホルモン受容体中に存在しない特有の利点を提供するこ とが判明している。例えば、天然生成Ｐ−ボックスアミノ酸配列とは異なるホル モン応答要素ハーフサイトに選択的に結合するためのＰ−ボックスアミノ酸配列 の修飾は、遺伝子発現の好ましくないバックグラウンドレベルを減ずることがで きる。したがって、本発明の受容体と方法は、特定の対象における外来遺伝子発 現の選択性を高めるという利益を提供する。 本発明で用いるかぎり、“Ｐ−ボックスアミノ酸配列”なるフレーズは、例え ば、ＤＮＡ結合ドメインの約アミノ酸１９〜２３（即ち、配列番号：１のアミノ 酸１９〜２３；例えば、Ｕｍｅｓｏｎｏ等（１９８９），Ｃｅｌｌ，５７：１１ ３９〜１１４６，図２を参照のこと）における第１ジンク・フィンガーとリンカ ー領域との接合点において典型的に生ずるホルモン受容体のＤＮＡ結合ドメイン の近位要素領域を意味する。Ｕｍｅｓｏｎｏ等（１９８９）上記文献は、表１に おいて、多様なホルモン受容体ＤＮＡ結合ドメインの種々な天然生成Ｐ−ボック スアミノ酸配列を示している。 本発明の１実施態様では、ホルモン受容体ＤＮＡ結合ドメインのＰ−ボックス 配列を修飾して、天然生成Ｐ−ボックスアミノ酸配列とは異なるＰ−ボックスア ミノ酸配列を得る。本発明の好ましい実施態様では、修飾Ｐ−ボックスアミノ酸 配列は天然生成Ｐ−ボックスアミノ酸配列とは３アミノ酸だけ異なる。 好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインによって認識されるハーフサイトヌクレオチ ド配列のみが変化し、ＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つのハーフサイ ト間の間隔は変化されないように、Ｐ−ボックスアミノ酸配列を修飾する。例え ば、エクジソン受容体のＤＮＡ結合ドメインを本発明の修飾エクジソン受容体に 用いる場合には、Ｐ−ボックスをアミノ酸配列ＥＧＣＫＧ（配列番号：２；ハー フサイト−ＡＧＧＴＣＡ−を認識する）から、アミノ酸配列ＧＳＣＫＶ（配列番 号：３；ハーフサイト−ＡＧＡＡＣＡ−を認識する）に修飾することができる。 現在好ましい実施態様では、本発明の修飾エクジソン受容体のＤＮＡ結合ドメイ ンがエクジソン受容体に由来する場合は、Ｐ−ボックスアミノ酸配列を修飾して 、ＧＳＣＫＶ（配列番号：３）にする。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化方法を適用して、既存ＤＮＡ結合ドメインを修飾し、改 良することができることも判明している（例えば、Ｄｅｖｌｉｎ等，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ，２４９：４０４〜４０６と；ｓｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ，１９９ ０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６〜３９０を参照のこと）。 本発明の修飾エクジソン受容体の作製に用いるために考えられる活性化ドメイ ンは典型的に転写因子に由来し、適当なＤＮＡ結合ドメインと適当なリガンド結 合ドメインとに結合するときに、遺伝子発現を活性化するように機能するアミノ 酸の連続した配列(contiguous sequence)を含む。本発明の修飾エクジソン受容 体の作製に用いるために考えられるリガンドとＤＮＡ結合ドメインとに関して、 活性化ドメインをカルボキシ末端に、又はアミノ末端に、又はリガンド結合ドメ インとＤＮＡ結合ドメインとの間に位置付けることができる。本発明の好ましい 実施態様では、活性化ドメインを修飾エクジソン受容体のアミノ末端に位置付け る。 適当な活性化ドメインは多様な供給源から、例えば、受容体のステロイド／甲 状腺スーパーファミリーのメンバーのＮ末端領域、例えばＶＰ１６又はＧＡＬ４ 活性化ドメインのような転写因子活性化ドメイン、等から得ることができる。本 発明の実施に用いるために考えられる、現在最も好ましい修飾エクジソン受容体 はＶｇＥｃＲ（配列番号：５）、ＶｐＥｃＲ（配列番号：７）又はＧＥｃＲ（配 列番号：９）であり、ＶｇＥｃＲ（配列番号：５）が特に好ましい。これらの修 飾エクジソン受容体の作製は以下の実施例１に述べる。 本発明の修飾エクジソン受容体タンパク質は、キメラタンパク質をコードする 核酸構築体を適当な宿主細胞に実施例１に述べるように発現させることによって 製造することができる。発現構築体を適当な宿主細胞中に導入することによって 所望のタンパク質を製造する組換え方法は、当該技術分野において周知である。 本発明の修飾エクジソン受容体はタンパク質自体の直接導入によって、又は受容 体をコードするＤＮＡ構築体（単数又は複数）を対象中に若しくは対象から得ら れる細胞中に導入することによって（この場合に、細胞は形質転換され、その後 に対象に戻される）、特定の対象中に導入することができる。 好ましい実施態様では、本発明の修飾エクジソン受容体は組織特異性プロモー ターの制御下で発現される。当業者に容易に理解されるように、“組織特異性” なる用語は、それからの特定のプロモーターが一定遺伝子の発現を駆動する組織 における実質的に排他的な転写開始を意味する。 本発明の１態様によると、本発明の修飾エクジソン受容体は本発明の修飾エク ジソン受容体と、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの少なくとも １つのサイレントパートナーとを含むヘテロダイマー種として存在する。好まし くは、サイレントパートナーは哺乳動物由来受容体であり、ＲＸＲが特に好まし い。 本発明において考えられるサイレントパートナーは、本発明の修飾エクジソン 受容体と共にヘテロダイマー種を形成することができる、受容体のステロイド／ 甲状腺スーパーファミリーのメンバーであり、この場合にサイレントパートナー はリガンドの結合に直接は関与しない（即ち、ヘテロダイマーの修飾エクジソン 受容体コーパートナー(co-partner)のみがリガンドを結合する）。サイレントパ ートナーは対象の細胞に対して内因性でありうるか、又は受容体をコードするＤ ＮＡ構築体（単数又は複数）を対象中に導入することによって対象に供給される ことができる。本発明に用いるために好ましいサイレントパートナーはＲＸＲで ある。本発明の方法の特定の実施態様では、外来ＲＸＲを前記哺乳動物対象に供 給する。 ヘテロダイマー受容体（単数又は複数種類）の形成は、受容体のステロイド／ 甲状腺スーパーファミリーのメンバー（単数又は複数）が前記受容体のためのリ ガンドの存在下での発現制御下に維持された遺伝子の転写をトランス活性化する 能力を調節することができる。例えば、修飾エクジソン受容体と他の哺乳動物ホ ルモン受容体とのヘテロダイマー形成は、修飾エクジソン受容体がエクジソン応 答要素の存在下でトランス活性化の活性を誘導する能力を促進する。 本発明の他の態様によると、本発明の修飾エクジソン受容体は複数個（即ち、 少なくとも２個）の本発明の修飾エクジソン受容体を含むホモダイマー種として 存在する。 本発明に用いるために考えられるリガンドは、細胞の内部で、本発明の修飾エ クジソン受容体に結合し、それによってリガンド／受容体錯体を作製する化合物 であり、次にこの錯体が適当な応答要素に結合することができる。本明細書で相 互交換可能に用いられる、“エクジソン”と“エクジステロイド”なる用語は、 本明細書では一般的な意味で用いられ、適当な結合とトランス活性化活性を有す るリガンドのファミリーを意味する［例えば、Ｃｈｅｒｂａｓ等，Ｂｉｏｓｙｎ ｔｈｅｓｉｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｈｏｒｍｏｎｅｓ （Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ とＭ．Ｐｏｒｃｈｅｔ編集），３０５〜３２２；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ ｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照のこと］。それ故、エクジソンはエクジソン応答要素の 制御下に維持される遺伝子のために遺伝子転写を調節するように作用する化合物 である。 ２０−ヒドロキシ−エクジソン（β−エクジソンとしても知られる）は主要な 天然生成エクジソンである。非置換エクジソン（α−エクジソンとしても知られ る）は末梢組織においてβ−エクジソンに転化される。天然生成エクジソンの類 似体も本発明の範囲内で考えられる。一般にエクジステロイドと呼ばれる、この ようなエクジソン類似体はポナステロンＡ、２６−ヨードポナステロンＡ、ムリ ステロンＡ、イノコステロン、２６−メシルイノコステロン等を包含する。上記 エクジソンが毒性でも、催奇性でもなく、哺乳動物の生理学に影響するとも知ら れていないことが既に報告されているので、これらのエクジソンは本発明の方法 による培養細胞及びトランスジェニック哺乳動物においてインデューサーとして 用いるための理想的な候補である。 本発明の実施に用いるために考えられるリガンドは、対象の細胞に通常は存在 しないと特徴づけられ、このことはリガンドが対象にとって外因性であることを 意味する。例えば、エクジステロイドは天然には哺乳動物系に存在しない。した がって、本発明の方法によると、エクジステロイドを対象に投与しないかぎり及 びエクジステロイドを対象に投与するまでは、所望の遺伝子の発現は実質的に生 じない。 本発明の実施に用いるために考えられるリガンドの有効量は、遺伝子発現産物 の所望のレベルを達成するために必要なリガンド（即ち、エクジステロイド）の 量である。リガンドは、当該技術分野において周知である多様な方法で投与する ことができる。例えば、このようなリガンドは局部的、経口的、静脈内的、腹腔 内的、血管内的等で投与することができる。 本発明の実施（対象における外来遺伝子発現の調節に関する）に用いるために 考えられるエクジソン応答要素は、ネイティブ並びに修飾されたエクジソン応答 要素を包含する。本発明の修飾エクジソン受容体はホモダイマーとしても、ヘテ ロダイマー（そのためのサイレントパートナーと共に）としても機能することが できるので、ホモダイマー又はヘテロダイマーとしての本発明の修飾エクジソン 受容体に反応性である任意の応答要素は、本明細書に述べる本発明の方法に用い るために考えられる。本発明の好ましい実施態様では、本発明の修飾エクジソン 応答要素は、ファルネソイドホルモン受容体に結合することがもはやできないよ うに改変される(engineered)（哺乳動物ファルネソイドホルモン受容体はネイテ ィブのエクジソン受容体応答要素に結合することができるので）。本発明の修飾 エクジソン受容体は外来遺伝子の低いバックグラウンド発現レベルを生じ、哺乳 動物系に用いた場合に、遺伝子発現系の選択性を高める。 本発明に用いるために考えられるエクジソン応答要素は、特定のホルモン受容 体に関連して、例えばエクジソン又はムリステロンＡのような、適当なリガンド に応じて転写活性化のために必要とされる、短いシス作用性配列（即ち、約１２ 〜２０ｂｐを有する）である。これらの応答要素と、さもなくばエクジソン非応 答性の調節配列との結合は、このような調節配列をエクジソン応答性にする。エ クジソン応答要素配列は、位置−及び配向−独立的に機能する。 ネイティブのエクジソン応答要素は既に述べられている、例えば、Ｙａｏ等，Ｃｅｌｌ ，７１：６３〜７２，１９９２を参照のこと。本発明によるエクジソン 応答要素は、０〜５ヌクレオチドのスペーサーによって分離された、２個のハー フサイト（相互にダイレクト・リピート又は逆位反復配向のいずれかで）を含む 。本明細書で用いるかぎり、“ハーフサイト”なる用語は、受容体のステロイド ／甲状腺スーパーファミリーの特定のメンバーによって結合される、連続した６ ヌクレオチド配列を意味する。各ハーフサイトは典型的に、０から約５ヌクレオ チドまでのスペーサーによって分離される。典型的に、相当するスペーサーを有 する２個のハーフサイトはホルモン応答要素を構成する。ホルモン応答要素は種 々な転写調節領域に多重コピーとして組み入れられることができる。 本発明による好ましい修飾エクジソン応答要素は、任意の順序で、０〜５ヌク レオチドのスペーサーによって分離された第１ハーフサイトと第２ハーフサイト とを含み、 第１ハーフサイトと第２ハーフサイトとは相互に対して逆位であり； 前記第１ハーフサイトは配列： −ＲＧＢＮＮＭ−（又はその補体） ［式中、各ＲはＡ又はＧから独立的に選択され；各ＢはＧ、Ｃ又はＴから独立的 に選択され；各ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧから独立的に選択され；各ＭはＡ又はＣか ら独立的に選択される］ を有する、但し、ヌクレオチドの各−ＲＧＢＮＮＭ−群のうちの少なくとも４ヌ クレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−の匹敵する位置のヌクレオチドと同じであり 前記第２ハーフサイトはグルココルチコイド受容体サブファミリー応答要素か ら得られる。 上記−RＧＢＮＮＭ−配列の補体は、 −ＹＣＶＮＮＫ− ［式中、各ＹはＴ又はＣから独立的に選択され；各ＶはＣ、Ｇ又はＡから独立的 に選択され；各NはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧから独立的に選択され；各ＫはＴ又はＧか ら独立的に選択される］ を有する。 本発明の修飾エクジソン応答要素に用いるための、−ＲＧＢＮＮＭ−モチーフ を有する具体的な第１ハーフサイトは、例えば、−ＡＧＧＧＣＡ−、−ＡＧＴＴ ＣＡ−、ＡＧＧＴＡＡ−、−ＡＧＧＴＣＡ−、−ＧＧＴＴＣＡ−、−ＧＧＧＴＴ Ａ−、−ＧＧＧＴＧＡ−、−ＡＧＧＴＧＡ−、又は−ＧＧＧＴＣＡ−から選択さ れるハーフサイトを包含する。特に好ましい第１ハーフサイトは−ＡＧＴＧＣＡ −である。 本発明の実施に用いるために考えられるグルココルチコイド受容体サブファミ リー応答要素は、典型的に、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、プロ ゲステロン又はアンドロゲン受容体によって結合されるハーフサイトを有する応 答要素である。グルココルチコイド受容体サブファミリー応答要素からの適当な ハーフサイトは下記配列（いずれかの配向における）： −ＲＧＮＮＣＡ− （又は、例えば−ＹＣＮＮＧＴ−のようなその補体）［式中、Ｒ、Ｙ及びＮは上 記で定義した通りである］ から選択されることができる。本発明の修飾エクジソン応答要素に用いるための −ＲＧＮＮＣＡ−モチーフを有する具体的なハーフサイトは、−ＡＧＡＡＣＡ− 、−ＧＧＡＡＣＡ−、−ＡＧＴＴＣＡ−、−ＡＧＧＴＣＡ−、−ＧＧＡＡＣＡ− 、−ＧＧＴＴＣＡ−、−ＧＧＧＴＣＡ−、−ＧＧＧＴＣＡ−、−ＡＧＧＴＣＡ− 、−ＧＧＧＴＣＡ−等並びにこれらの補体を包含する。−ＲＧＮＮＣＡ−モチー フを有する特に好ましいハーフサイトは、−ＡＧＡＡＣＡ−と−ＧＧＡＡＣＡ− を包含し、−ＡＧＡＡＣＡ−が特に好ましい。 上記修飾エクジソン応答要素を用いて、本発明のヘテロダイマー受容体を結合 する場合に、第２ハーフサイトは第１ハーフサイトに対して逆位である。例えば 、５’−３’方向の本発明のエクジソン応答要素の一重鎖を表示する場合に、下 記の一般的モチーフを用いることができる： ＲＧＢＮＮＭ−（Ｎ）_x−ＴＧＮＮＣＹ（配列番号：１０） 式中、ｘは０から約５までの整数であり、ｘ＝１が特に好ましい。上記応答要素 モチーフ（配列番号：１０）の代替え配向として、本発明の応答要素は５’−３ ’方向で下記のように表示することができる： ＲＧＢＮＮＭ−（Ｎ）_x−ＫＮＮＶＣＹ（配列番号：１１） 式中、ｘは０から約５までの整数であり、ｘ＝１が特に好ましい。 本発明の好ましい実施態様では、第１ハーフサイトはエクジソン応答要素から 得られ、第２ハーフサイトはグルココルチコイド応答要素、ミネラルコルチコイ ド応答要素、プロゲステロン応答要素又はアンドロゲン応答要素から選択される ホルモン応答要素から得られる。本発明の特に好ましい実施態様では、第１ハー フサイトはエクジソン応答要素から得られ、第２ハーフサイトはグルココルチコ イド応答要素から得られる。 本発明の修飾エクジソン応答要素の特に好ましい実施態様では、第１ハーフサ イトはＡＧＴＧＣＡであり、前記第２ハーフサイトはＴＧＴＴＣＴである。本発 明の方法に用いるために、現在最も好ましい修飾エクジソン応答要素は、 ＡＧＴＧＣＡ−Ｎ−ＴＧＴＴＣＴ（配列番号：１２） である。 本発明の他の態様では、本発明の修飾エクジソン受容体がホモダイマーとして 存在する場合に、用いる応答要素は好ましくは、下記のように、ダイレクト・リ ピート・モチーフ（上記逆位反復モチーフの代わりに）を有する： ＲＧＢＮＮＭ−（Ｎ）_x’−ＲＧＢＮＮＭ（配列番号：１３） 式中、Ｒ、Ｂ、Ｎ及びＭは既に定義した通りであり、ｘ’は０から約５までの整 数であり、ｘ’＝３が特に好ましい。 本発明の修飾エクジソン応答要素は構成的活性(constitutive activity)を実 質的に有さないとして特徴づけられる、このことは、哺乳動物発現系に導入され たときに、本発明の修飾エクジソン応答要素によって開始される遺伝子発現のバ ックグラウンドレベルが実質的に存在しないことを意味する。哺乳動物のファル ネソイドホルモン受容体はネイティブのエクジソン応答要素に結合して、それか らの遺伝子発現をトランス活性化しうることが判明しているので、本発明のある 一定の実施態様では（例えば、ファルネソイド媒介バックグラウンド発現を回避 することが望ましい場合に）、修飾エクジソン応答要素が用いられる。 現在好ましい本発明の修飾エクジソン応答要素は、ファルネソイドＸ受容体（ ＦＸＲ）に対する結合アフィニティを実質的に有さないとしてさらに特徴づけら れる、即ち、本発明の応答要素はＦＸＲを結合する（これによって、発現の好ま しくないバックグラウンドレベルを生じると考えられる）ことができない。した がって、好ましい本発明の修飾エクジソン応答要素は、好ましくは、実質的に零 の基底発現レベルを誘導する。 本発明の実施に用いる応答要素は外来遺伝子産物（単数又は複数種類）の発現 の適当なプロモーターに機能的に結合する。本明細書で用いるかぎり、“プロモ ーター”なる用語は、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ合成を開始させる酵素によっ て認識される特異的ヌクレオチド配列を意味する。この配列は、適当な条件下で 転写が特異的に開始されうる部位である。適当なプロモーターに機能的に結合し た外来遺伝子が適当な宿主の細胞中に導入される場合には、宿主細胞中に通常は 存在しないエクジステロイド化合物の存在によって、外来遺伝子の発現が制御さ れる。 本発明の他の実施態様によると、 （ｉ）エクジソン応答要素の制御下にある外来遺伝子を含むＤＮＡ構築体と； （ii）誘導プロモーターの制御下にある修飾エクジソン受容体をコードするＤ ＮＡであって、前記修飾エクジソン受容体が、そのためのリガンドの存在下と、 そのためのサイレントパートナーとして作用し得る受容体のさらなる存在下で前 記エクジソン応答要素に結合する上記ＤＮＡと； （iii）前記修飾エクジソン受容体のためのリガンドと を含有する哺乳動物対象における外来遺伝子の発現を誘導する方法であって、前 記対象を前記修飾エクジソン受容体の発現を誘導するために適した条件にさらす ことを含む方法を提供する。 本発明の実施に用いるために考えられる誘導プロモーターは、誘導条件が存在 しないかぎり、ｍＲＮＡを転写させるように機能しない転写調節領域である。適 当な誘導プロモーターの例は、ＩＰＴＧに反応するＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペレ ーター（Ｎａｋａｍｕｒａ等，Ｃｅｌｌ，１８：１１０９〜１１１７，１９７９ を参照）；重金属（例えば、亜鉛）誘導に反応するメタロチオネインプロモータ ー金属−調節−要素（Ｅｖａｎｓ等，米国特許第４，８７０，００９号参照）； ＩＰＴＧに反応するファージＴ７ｌａｃプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，Ｍｅ ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ ．，１８５：６０〜８９，１９９０；及び米国特許＃４， ９５２，４９６参照）、熱ショックプロモーター、等に対応するＤＮＡ配列を包 含する。 本発明の他の実施態様によると、エクジソン応答要素の制御下で外来遺伝子を 含むＤＮＡ構築体を含有する哺乳動物対象において前記外来遺伝子の発現を誘導 する方法であって、前記対象に修飾エクジソン受容体と、前記修飾エクジソン受 容体のためのリガンドとを導入することを含み、 前記受容体が、そのためのリガンドと共に、任意に、そのためのサイレントパ ートナーとして作用し得る受容体のさらなる存在下で、前記エクジソン応答要素 に結合して、それからの転写を活性化する上記方法を提供する。 本発明の他の実施態様によると、宿主生物に有害な組換え産物の発現方法であ って、 適当な宿主細胞を、 （ｉ）エクジソン応答要素の制御下で前記組換え産物をコードするＤＮＡ構築 体と； （ii）修飾エクジソン受容体をコードするＤＮＡと によって形質転換する工程と； 前記宿主細胞を適当な培地中で増殖させる工程と； 前記宿主細胞中に前記修飾エクジソン受容体のためのリガンド（単数又は複数 ）と、任意に、前記修飾エクジソン受容体に対してサイレントパートナーとして 作用しうる受容体とを導入することによって、前記組換え産物の発現を誘導する 工程と を含む上記方法を提供する。 本発明による発現のために考えられる宿主生物に有害な組換え産物は、生物に 有害な影響を与えるように機能する任意の遺伝子産物を包含する。例えば、類ジ フテリア毒素(diptheroid toxin)のような毒素の誘導発現は、誘導性の組織特異 的なアブレーション(ablation)を可能にする（Ｒｏｓｓ等（１９９３），Ｇｅｎ ｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ，７，１３１８〜１３２４）。したがっ て、このような産物を発現する細胞においてアポトーシスを誘導することが知ら れる非常に多くの遺伝子産物が、本発明に用いるために考えられる（例えば、Ａ ｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌ ｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９１を参照）。 本発明の実施に用いるために考えられる、適当な培地は、本発明の修飾エクジ ソン受容体と共に、エクジソン応答要素に結合することができるリガンド（単数 又は複数）の実質的な不存在下での任意の増殖及び／又は維持(maintenance)培 地を包含する。 本発明の他の実施態様によると、本発明の修飾エクジソン受容体をコードする 核酸を提供する。本発明の核酸は、当業者に公知の種々な発現ベクターに組み入 れることができる。修飾エクジソン受容体をコードする好ましい核酸は配列番号 ：４、６及び８に表示され、配列番号：４が特に好ましい。 本発明の他の実施態様によると、本発明の構築体を適当な宿主細胞中に導入す るために有用な遺伝子転移ベクターを提供する。このような遺伝子転移ベクター は、最小プロモーター（即ち、エンハンサーを有さないプロモーター領域）と、 本発明の修飾エクジソン応答要素とを有する転写調節領域を含み、前記調節領域 は外来遺伝子を含有するＤＮＡと機能的に結合し、前記修飾エクジソン応答要素 は多重コピーとして存在する。応答要素のコピー数は当業者によって容易に変え ることができる。例えば、転写調節領域は特定の応答要素の１から約５０コピー まで、好ましくは２から約２５コピーまで、より好ましくは約１０〜１５コピー を含有することができ、約４〜６コピーが特に好ましい。 本発明に用いるために考えられる遺伝子転移ベクター（“発現ベクター”とも 呼ばれる）は、外来核酸をその発現及び／又は複製のために細胞中に移送するた めに用いられる組換え核酸分子である。発現ベクターは環状でも線状でもよく、 多様な核酸構築体をそのなかに組み入れることができる。発現ベクターは典型的 に、適当な宿主細胞への導入時に挿入ＤＮＡの発現を生じるプラスミドの形状に なる。 本明細書で用いるかぎり、“転写調節領域”なるフレーズは、ｍＲＮＡ転写の 開始を制御する、遺伝子又は発現構築体の領域を意味する。本明細書で用いるた めに考えられる調節領域は典型的に、エクジソン応答要素と共に少なくとも最小 プロモーターを含む。最小プロモーターは、エンハンサー領域（例えば、ホルモ ン応答要素）と結合すると、リガンド／受容体錯体に応じてｍＲＮＡ転写を開始 させるように機能する。しかし、必要なインデューサー（リガンド）が存在しな いかぎり、転写は生じない。 本明細書で用いるかぎり、“機能的に結合する”なるフレーズはＤＮＡと、例 えばプロモーター、エンハンサー、転写と翻訳の停止部位、及び他のシグナル配 列のような、調節及びエフェクター配列との機能的関係を意味する。例えば、プ ロモーターへのＤＮＡの機能的結合は、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特 異的に認識し、結合し、転写させるＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターか ら開始されるように、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的かつ機能的な関係を 意味する。 好ましくは、転写調節領域はさらに偏在転写因子の結合部位を含む。このよう な結合部位は好ましくはプロモーターと本発明の修飾エクジソン応答要素との間 に位置付けられる。本発明に用いるための適当な偏在転写因子は当該技術分野で 周知であり、例えば、Ｓｐｌを包含する。 本発明の実施に用いるために適した発現ベクターは当業者に周知であり、真核 細胞及び／又は原核細胞中に複製可能であるもの並びにエピソームに留まるもの 及び宿主細胞ゲノムに合体するものを包含する。発現ベクターは典型的にさらに 、他の機能的に重要な核酸を配列、例えば抗生物質耐性タンパク質をコードする 発現構築体等を含有する。 典型的な真核発現ベクターは、例えばｐＳＶ−２ ｇｐｔ系（Ｍｕｌｌｉｇａ ｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９７９，２７７：１０８〜１１４）；ｐＢｌｕｅｓＳｋ ｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって述べられている発現クローニングベクター（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ，１９８５，２２８：８１０〜８１５）等のような、真核構築体を 包含する。これらのプラスミドベクターの各々は、本発明の問題のキメラタンパ ク質の発現を促進することができる。 プロモーターは、調節の性質に依存して、構成的又は誘導的に調節されること ができる、又は組織特異性でありうる（例えば、Ｔ細胞、内皮細胞、平滑筋細胞 等においてのみ発現）。本発明の実施に用いるために考えられる典型的なプロモ ーターはＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモー ター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導プロモーター、モロニー マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター、延長因子１α（ＥＦ１α）プ ロモーター、アルブミンプロモーター、ＡＰＯ Ａｌプロモーター、サイクリッ クＡＭＰ依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ケラチンプロモー ター、ＣＤ３プロモーター、免疫グロブリンＬ鎖又はＨ鎖プロモーター、ノイロ フィラメントプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、Ｌ７プ ロモーター、ＣＤ２プロモーター、ミオシンＬ鎖キナーゼプロモーター、ＨＯＸ 遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、ＭＹＦ５プロモーター、ホスホグリ セロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｓｔｆ１プロモーター、低密度リポタン パク質（ＬＤＬ）プロモーター等を包含する。 形質導入組換え細胞（即ち、組換え異種核酸(recombinant heterologous nucl eic acid)を含有する細胞）を得るために宿主細胞中に本発明の核酸構築体を含 有する発現ベクターを導入（形質導入）するために適した手段は当該技術分野に おいて周知である（検討のために、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ，２４４：１２７５〜１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ，２６０：９２６〜９３２を参照のこと、これらの各々はそれらの全体で本 明細書に援用される）。典型的な形質導入方法は、例えば、ウイルスベクターを 用いる感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号と第４，６５０，７６４ 号を参照）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４，３９９， ２１６号と第４，６３４，６６５号）、デキストランスルフェート・トランスフ ェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション（米国特許第４，３９ ４，４４８号と第４，６１９，７９４号を参照）、サイトフェクション、粒子ビ ーズ衝撃等を包含する。異種核酸は任意に、その染色体外（即ち、エピソーマル ）維持を可能にする配列を含むことができる、又は異種核酸は、宿主のゲノムに 合体するドナー核酸であることができる。 特定の実施態様では、前記遺伝子転移ベクターはウイルスベクター、好ましく はレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは、２つのレトロウ イルス ＬＴＲの間に存在する異種遺伝子をコードする発現構築体を有する遺伝 子転移プラスミドである。レトロウイルスベクターは典型的に、レトロウイルス ベクターが、又は鋳型としてレトロウイルスベクターを用いて転写されたＲＮＡ が適当なパッケージング細胞系統のウイルスビリオン中にパッケージされるのを 可能にする、適当なパッケージングシグナルを含有する（例えば、米国特許第４ ，６５０，７６４号参照）。 本発明に用いるために適当なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第 ５，３９９，３４６号と第５，２５２，４７９号；ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０７ ５７３、ＷＯ９０／０６９９７、ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９２／０５２６６ 、及びＷＯ９２／１４８２９に述べられており、これらは本明細書に援用され、 このようなレトロウイルスベクターを用いて、ヒト細胞中に核酸を効果的に導入 す る方法を説明している。他のレトロウイルスベクターは、例えば、マウス乳癌ウ イルスベクター（例えば、Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄ等、１９８８，ＰＮＡＳ，Ｕ ＳＡ ，８５：９６４５５〜９６５９）等を包含する。 複製ウイルスを本質的に含まないレトロウイルスベクター粒子を産生するヘル パー細胞を形成するための種々な方法も、当該技術分野で周知である。例えば、 米国特許第４，６５０，７６４号；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ ｅｒａｐｙ ，１：５〜１４（１９９０）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等，Ｊｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ，６１（４）：１１２０〜１１２４（１９８８）； Ｗａｔａｎａｂｅ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ ，３（１２）：２２４１〜２２４９（１９８３）；Ｄａｎｏｓ等，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，８５：６４６０〜６４６４（１９８８） ；及びＢｏｓｓｅｌｍａｎ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，７（５）：１７９７〜１８０６（１９８７）を参照のこと、 これらは、複製ウイルスを包含するウイルスベクターを製造する見込みを最小に した、ウイルスベクターとヘルパー細胞の製造方法を開示する。 本発明の方法の実施に適した組換えレトロウイルスは、レトロウイルスビリオ ンを製造するための周知の方法を用いて製造される。例えば、米国特許第4，６ ５０，７６４号；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１： ５〜１４（１９９０）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ ，６１（４）：１１２０〜１１２４（１９８８）；Ｗａｔａｎａｂｅ 等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３（１ ２）：２２４１〜２２４９（１９８３）；Ｄａｎｏｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，８５：６４６０〜６４６４（１９８８）；及びＢｏｓｓｅ ｌｍａｎ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，７（５）：１７９７〜１８０６（１９８７）を参照のこと。 本発明の他の実施態様によると、本発明の修飾エクジソン受容体をコードする 核酸を含有する組換え細胞を提供する。本発明の発現ベクターを導入するための 典型的な真核細胞は、例えば、ＣＶ−１細胞、Ｐ１９細胞及びＮＴ２／Ｄ１細胞 （ヒト胚癌に由来する）、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター 卵巣細胞（ＣＨＯ）、一次ヒト線維芽細胞、ヒト胎児腎細胞(embryonic kidney cell)、アフリカグリーンモンキー細胞、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ受け入れ＃Ｃ ＲＬ１５７３；米国特許第５，０２４，９３９号）、ＬｔＫ細胞（ＡＴＣＣ受け 入れ＃ＣＣＬ１．３）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ受け入れ＃ＣＲＬ１６５１） 、ＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞；例えば，Ｕｒｌａｕｂ等，（１９８６ ）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５）、培養一次組織、培養腫 瘍細胞等を包含する。現在好ましい細胞はＣＶ−１と２９３細胞を包含する。 本発明の他の実施態様によると、本発明の修飾エクジソン受容体をコードする 核酸を含有するトランスジェニック哺乳動物を提供する。本明細書で用いるかぎ り、“トランスジェニック哺乳動物”なるフレーズは、本発明の修飾エクジソン 応答要素の転写制御下で組換え修飾エクジソン受容体導入遺伝子及び／又は外来 遺伝子を含有する遺伝可能な発現構築体を１つ以上含有する哺乳動物を意味する 。好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物はまた、修飾エクジソン受 容体のサイレントパートナーとして機能する、受容体のステロイド／甲状腺スー パーファミリーのメンバー（例えば、ＲＸＲ）を含有する遺伝可能な発現構築体 を１つ以上含有する。 特定の核酸構築体を用いるトランスジェニック哺乳動物の作製方法は当該技術 分野において周知である。本発明のトランスジェニック哺乳動物を作製する場合 には、２種類のトランスジェニック系統を発生させることが好ましい。第１系統 は例えばＲＸＲと修飾ＥｃＲ（例えば、ＶｐＥｃＲ）を発現する。受容体の発現 を導く組織特異的プロモーター（例えば、Ｔ細胞特異的）の選択によって組織特 異性が与えられる。第２系統は外因性ｃＤＮＡの発現を制御するエクジソン応答 プロモーターを含有する。 本発明の好ましい実施態様では、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、本 発明の修飾エクジソン応答要素の転写制御下で修飾エクジソン受容体をコードす る核酸、外因性ＲＸＲ、及び外来遺伝子を含有する発現構築体を１つ以上含有す る。エクジソン誘導プロモーター（即ち、本発明の修飾エクジソン応答要素）を 含有し、修飾エクジソン受容体とＲＸＲとを発現するトランスジェニックマウス では、ムリステロン処理が遺伝子発現を活性化することができることが判明して いる。したがって、修飾エクジソン受容体とＲＸＲとの組織特異的発現と、適時 のホルモン処理とによって、空間的、用量的及び時間的特異性を有する誘導遺伝 子発現を達成することができる。 本発明の他の実施態様によると、本発明による修飾エクジソン受容体を含有す るトランスジェニック哺乳動物において外来遺伝子の発現を誘導する方法であっ て、 前記修飾エクジソン受容体に反応するエクジソン応答要素の転写制御下で外来 遺伝子をコードするＤＮＡ構築体を前記哺乳動物に導入する工程と； 前記哺乳動物に、前記外来遺伝子の発現を誘導するための有効量で、前記修飾 エクジソン受容体のリガンドを投与する工程と を含む上記方法を提供する。 上述したように、修飾エクジソン受容体は受容体のステロイド／甲状腺ホルモ ンスーパーファミリーのサイレントパートナーの存在下でホモダイマー又は任意 にヘテロダイマーを形成し、形成された特定のホモダイマー又はヘテロダイマー に反応する応答要素を有する発現ベクターからの転写を活性化するように機能す る。 本発明の他の実施態様によると、哺乳動物対象において２種類の異なる遺伝子 を誘導する方法であって、本発明のエクジソン誘導系を用いて、第１外来遺伝子 を活性化する工程と；テトラサイクリン誘導系を用いて第２遺伝子を活性化する 工程とを有する方法を提供する。２種類の異なる遺伝子を誘導するための本発明 の方法は、２種類の外来遺伝子の時間的、空間的及び用量的制御を可能にするの で、特に有利である。 テトラサイクリン誘導系は当該技術分野において周知である［例えば、Ｇｏｓ ｓｅｎ等，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：５５４ ７〜５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ等，（１９９３）ＴＩＢＳ，１８，４７１〜４７５ ；Ｆｕｒｔｈ等，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１： ９３０２〜９３０６；及びＳｈｏｃｋｅｔｔ等，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃi ．９２：６５２２〜６５２６を参照のこと］。 本明細書に引用した全ての米国及び外国の特許公報、テキストブック及びジャ ーナル刊行物はそれらの全体において本明細書に援用される。次に、本発明を下 記の非限定的実施例を参照することによって、さらに詳細に説明する。実施例１ 修飾エクジソン受容体の作製 プラスミド作製 プラスミド ＣＭＸ−ＥｃＲ、ＣＭＸ−ＵＳＰ、ＣＭＸ−ＦＸＲ、ＣＭＸ−ｈ ＲＸＲａ、ＥｃＲＥｘ５−△ＭＴＶ−Ｌｕｃ、ＣＭＸ−ＧＥｃＲ、ＭＭＴＶ−ｌ ｕｃ及びＣＭＸ−ＧＲは既に開示されている［Ｙａｏ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６６ ：４７６〜４７９（１９９３）と、Ｆｏｒｍａｎ等，Ｃｅｌｌ，８１：６８７〜 ６９３（１９９５）］。 プラスミドＣＭＸ−ＶｐＥｃＲはｐｓｋ−ＥｃＲのＥｃｏＲＩフラグメントと ＣＭＸ−Ｖｐ１６とのライゲーションによって構築した。 プラスミドＣＭＸ−ＶｇＥｃＲを、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎ ｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と、突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（ 配列番号：１４）： とを用いたＣＭＸ−ＶｐＥｃＲの位置指定突然変異誘発によって発生させた。 ＶｐＥｃＲからＶｇＥｃＲへの突然変異誘発は、エクジソン受容体のＤＮＡ結 合ドメインのＰ−ボックス領域を変化させて、ＧＲの同領域に類似させた［Ｕｍ ｅｓｏｎｏとＥｖａｎｓ，Ｃｅｌｌ，５７：１１３９〜１１４６（１９８９）］ 。エクジソン受容体のＤＮＡ結合ドメインの下記アミノ酸は変化した：Ｅ２８２ Ｇ、Ｇ２８３Ｓ、及びＧ２８６Ｖ（Ｅ＝グルタメート、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリ ン、Ｖ＝バリン）。 ＨＳＰ−ＥｃＲＥを含有するアニーリング済みオリゴヌクレオチド２種類をオ リゴマー化することによって、レポーター構築体ＥｃＲＥｘ４−△ＨＳＰ−β− ｇａｌを構築した（Ｙａｏ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７６〜４７９（１９９ ３））。 下記アニーリング済みオリゴヌクレオチドをＥｃＲＥｘ４−ＨＳＰ−β−ｇａ ｌのＡｓｐ７１８部位にライゲートすることによって、ＥｃＲＥｘ４−Ｓｐｌｘ ３−△ＨＳＰ−β−ｇａｌを構築した：（配列番号：１５）：及び（配列番号：１６） △ＨＳＰは、そのエンハンサーが欠失した、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックプ ロモーターから誘導される最小プロモーターである。 構築体Ｅ／ＧＲＥｘ４−△ＭＴＶ−Ｌｕｃを発生させるために、下記オリゴヌ クレオチド（配列番号：１７）： と（配列番号：１８）： をアニーリングし、マルチマー化し(multimerized)、△ＭＴＶ−ＬｕｃのＨｉｎ ｄＩＩＩ部位にライゲートした。得られたレポーターは本発明の修飾エクジソン 応答要素Ｅ／ＧＲＥの４コピーを含有した。 プラスミドｐＲＣ−ＥＳＨβを作製するために、ＥｃＲＥｘ４−Ｓｐｌｘ３− △ＨＳＰ−β−ｇａｌを含有するＢｇｌＩＩＩ／（ＸｈｏＩ）フラグメントを、 ネオマイシン耐性遺伝子を含有する、ＢｇｌＩＩＩ／（ＮｏｔＩ）消化ｐＲＣ− ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にサブクローン化 した。細胞培養と一過性トランスフェクション ： ＣＶ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中に維持した。ＤＯ ＴＡＰトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） を用いて、一過性トランスフェクションをおこなった。レポーターとしてβ−ガ ラクトシダーゼを用いたトランスフェクションを、Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ蛍 光アッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）又は標準液体ＯＮＰＧアッ セイ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって分析した。ＣＭＸ−ルシ フェラーゼの同時トランスフェクションによって、値を標準化した。レポーター としてルシフェラーゼを用いたトランスフェクションはルシフェリンとＡＴＰを 用いる標準方法によって分析した。これらの値をＣＭＸ−β−ガラクトシダーゼ の同時トランスフェクションによって標準化した。ホルモン処理した細胞は、他 に指示しないかぎり、エタノール、５０μＭ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｈｏｒｍｏｎ ｅＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、１μＭムリステロンＡ（Ｚａｍｂｏｎ，Ｂｒｅｓｓｏ ，ＩＴ）又は１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）によって処理した。 本発明のエクジソン誘導系の感度を最大にするために、エクジソン受容体を修 飾した。エクジソン受容体のＮ末端トランス活性化ドメインをグルココルチコイ ド受容体の対応ドメインによって置換して、修飾エクジソン受容体ＧＥｃＲを得 た（図１Ｄ参照）。ＣＶ−１細胞を、上述したように修飾エクジソン受容体をコ ードするプラスミドＣＭＸ−ＧＥｃＲによってトランスフェクションした。トラ ンスフェクション後に、細胞をエタノール又は１μＭムリステロンＡによって処 理した。このハイブリッド修飾エクジソン受容体は一過性トランスフェクション アッセイにおいてムリステロン応答性を３倍〜１１倍に高めた（図１Ａ）。エク ジソン受容体（ＵＳＰ）の天然ヘテロダイマーパートナーを、その哺乳動物同族 体(homologue)、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）によって置換すると、より強力 なリガンド依存性ヘテロダイマーが得られ、３４倍の誘導が生じた（図１Ａ）。 しかし、ＲＸＲと、ＶｐＥｃＲ、ＶＰ１６活性化ドメインに達するエクジソン 受容体のＮ末端切頭とを組合せると、さらに強力なヘテロダイマーが得られ、２ １２倍の誘導が生じた（図１Ａと１Ｄ）。高い構成的活性を示す、大抵の核内受 容体／ＶＰ１６融合タンパク質とは異なって、ＶｐＥｃＲは非常に低い基底活性 を維持しながら、リガンド依存性の超誘導を生じる（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ等，Ｍ ｏｌ．Ｅｎｃｏｄ ．８：２７４〜２８５（１９９４）と、Ｐｅｒｌｍａｎ等，Ｇ ｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ ．７：１４１１〜１４２２（１９９３））。 さらに、レポーターベクターを、最小プロモーターとエクジソン応答要素との 間の偏在(ubiquitous)転写因子Ｓｐ１の共通(consensus)結合部位に挿入するこ とによっても修飾した（ｋａｍｉｎｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ ．８８：８５１０〜８５１４（１９９１）とＳｔｒａｈｌｅ等，ＥＮＢＯ，７ ：３３８９〜３３９５（１９８８））。エクジソン応答プロモーターにＳｐ１部 位を添加すると、絶対活性は５倍に増加した（図１Ａ）。 実施例２ 新規なエクジソン応答要素の構築 哺乳動物転写因子が、１個のヌクレオチドによって間隔を置いた、配列ＡＧＧ ＴＣＡの２個の逆位ハーフサイトから成るエクジソン応答要素と同様に、天然エ ンハンサー要素を有するとは判明していないが、このような可能性は排除されが たい。最近クローン化されたファルネソイドＸ受容体は（ＧＲ）は、ファルネソ イドの非常に高い濃度に応じて、エクジソン応答要素を含有するある種の合成プ ロモーターを非常に弱く活性化する可能性がある（Ｆｏｒｍａｎ等，Ｃｅｌｌ， ８１：６８７〜６９３（１９９５））。 ＦＸＲ含有細胞及びトランスジェニックマウスでは、内因性受容体による遺伝 子発現の活性化がレポータータンパク質の好ましくないバックグラウンドレベル を生じる。この問題を回避するために、３個のヌクレオチドによって間隔を置い た、配列ＡＧＡＡＣＡの逆位反復にホモダイマーとして結合する、ＧＲのＤＮＡ 結合特異性を模倣するように、ＶｐＥｃＲのＤＮＡ結合特異性を変化させた。こ の結合特異性の変化は、ＤＮＡ配列認識のために重要であると既に判明している 領域である、ＤＮＡ結合ドメインのＰ−ボックス中のＶｐＥｃＲの３アミノ酸残 基の突然変異によって達成した（ＵｍｅｓｏｎｏとＥｖａｎｓ，Ｃｅｌｌ，５７ ：１１３９〜１１４６（１９８９））。この新規なハイブリッド修飾エクジソン 受容体を本明細書ではＶｇＥｃＲと表示する、これは、本明細書でＥ／ＧＲＥと 表示する新規なハイブリッド応答要素（配列番号：１２）に反応性である、この ハイブリッド応答要素は１個のヌクレオチドによって間隔を置いた、２種類の異 なるハーフサイトモチーフ、ＲＧＢＮＮＭとＲＧＮＮＣＡを含有する（図１Ｂ） 。この新規な応答要素はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）と、ＲＸＲ、Ｅ ｃＲ、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、甲状腺ホルモン受容体（Ｔ３Ｒ）等のよ うな、ＩＩ型核内受容体との間のハイブリッドである。ＦＸＲは野生型エクジソ ン応答要素を含有するプロモーターを活性化することができるが、Ｅ／ＧＲＥを 含有するプロモーターを活性化することができない（図１Ｂ、対数スケールに注 意）。Ｅ／ＧＲＥレポーターはＧＲによって活性化されず、ＶｇＥｃＲはデキサ メタゾン応答性プロモーターを活性化しない（図１Ｃ）。 実施例３ 安定な細胞系統におけるエクジソン応答性の分析 修飾エクジソン受容体ＶｐＥｃＲ、ヘテロダイマーパートナー（ＲＸＲ）及び エクジソン誘導レポーターを含有する、安定な細胞系統を形成した（図２）。２ ９３細胞を下記線状プラスミドｐＲＣ−ＥＳＨβ、ＥｃＲＥｘ５−△ＭＴＶ−Ｌ ｕｃ、ＣＭＶ−ＶｐＥｃＲ及びＣＭＸ−ｈＲＸＲａによってトランスフェクショ ンした。翌日、細胞を１：１０に分けて、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ ）による選択の１日前に回収した。選択の１４日後に、１４の個別クローンを単 離して、０．５ｍｇ／ｍｌの存在下で、別々に成長させた。１４のＧ４１８耐性 クローンのうち、１０クローンは異なる度合いのムリステロン応答性を元した。 これらの細胞系統の１つであるＮ１３を１μＭムリステロンの存在下又は不存 在下で２０時間成長させた。次に、細胞溶解物をβ−ガラクトシダーゼ活性とル シフェラーゼ活性とに関して、実施例１に述べたように分析した。これらの安定 な細胞系統に対してＸ−ｇａｌ染色をおこなった。細胞をＰＢＳ中１０％ホルム アルデヒドによって短時間固定し、Ｘ−Ｇａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ ｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって２〜６時間染色した。１μＭムリステロン による処理の２４時間後に、１００％の細胞が染色の３時間後に暗青色に変色し た。したがって、修飾エクジソン受容体ＶｐＥｃＲ、ヘテロダイマーパートナー （ＲＸＲ）及び修飾エクジソン応答要素によって制御されるレポーター遺伝子構 築体を含有する哺乳動物細胞は、リガンド、例えば、エクジソンに応じて、外来 遺伝子を効果的に発現するように機能する。 Ｎ１３細胞を種々な濃度のムリステロンによって３６時間成長させ、次にβ− ガラクトシダーゼ活性に関して分析する（周知のＯＮＰＧアッセイを用いる）、 又はルシフェラーゼ活性に関して細胞を分析することによって、用量−反応分析 をおこなった。Ｎ１３細胞中に安定に組み込まれたβ−ガラクトシダーゼレポー ターとルシフェラーゼレポーターとの用量反応曲線は、３桁の大きさにアプロー チした誘導性が１０μＭムリステロンの最終濃度で達せられうることを示した（ 図３Ａ）。１００ｎＭ程度の低いムリステロン濃度によって１００倍の誘導が得 られた（図３Ａ）。 最後に、ムリステロン媒介誘導の動力学を測定した。Ｎ１３細胞を１μＭムリ ステロンの存在下の別々の穴において成長させ、種々な時点で回収し、ルシフェ ラーゼ活性に関して分析した。３時間では１００倍の誘導、８時間では１０００ 倍に誘導、処理の２０時間後には２０，０００倍の最大誘導が観察された（図３ Ｂ）。ＣＭＸ−ＶｇＥｃＲレポーターとＥ／ＧＲＥレポーターを含有する安定な 系統においても同様な結果が観察された。 実施例４ ムリステロンの生物学的利用能と活性 ムリステロンをマウスにおける可能なホルモンとして用いるために、その毒性 と生物学的利用能とを調べた。毒性研究に関しては、成熟マウスにゴマ油中に懸 濁させた２０ｍｇのムリステロンＡを腹腔内注入した。次に、マウスを約２か月 間観察した。催奇性研究に関しては、妊娠マウスにゴマ油中に懸濁させた２０ｍ ｇのムリステロンＡを注入して、母親と子の両方を３か月間観察した。結果は、 ムリステロンがマウスへの注入時にその活性を維持すること、及びムリステロン が毒性でも、催奇性でもなく、血清結合タンパク質によって不活化されないこと を示す。ムリステロン（エクジソン）の不活性な性質の他に、ＶｐＥｃＲとＲＸ Ｒの過度発現も有害でないように思われる。 ムリステロン生物学的利用能研究に関しては、成熟マウスに、１０ｍｇのムリ ステロンを含む又は含まないゴマ油を腹腔内注入し、その後に血清回収のために 殺した。１２時間後に、マウスから採血し、全血の短時間の遠心分離によって、 血清を単離した。トランスフェクション分析をおこなって、ムリステロン活性に 関して調べるために、マウスに注入したゴマ油からの血清を分割して、半分には １０μＭの最終濃度までムリステロンを補充した。３バッチのマウス血清をＤＭ ＥＭ中で１：１０に希釈し、ＣＭＸ−ＧＥｃＲ、ＣＭＸ−ｈＲＸＲａ及びＥｃＲ Ｅｘ５−ＤＭＴＶ−ＬｕｃによってトランスフェクジョンしたＣＶ−１細胞上に 加えた。 結果は図４に示すが、結果はムリステロン処理マウスからの血清が１μＭムリ ステロンを補充した非処理マウス血清から観察された活性に匹敵するルシフェラ ーゼ活性を生じたことを実証する。結果は、単一部位注入物質が広範囲に循環さ れ、血清タンパク質との結台による活性低下は殆ど又は全く無いことを実証する 。 実施例５ トランスジェニックマウスにおけるムリステロン依存性遺伝子発現 トランスジェニックマウスを作製するために、次のＤＮＡ構築体を形成して、 受精卵に注入した：ＣＤ３−ＶｐＥｃＲ，ＣＤ３−ＲＸＲ、ＥＳＨβ（Ｌｅｅ等 ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１０１３〜１０２５（１９９２））。２つの別 々の系統のトランスジェニックマウスを作製して、エクジソン誘導レポーター、 ＥＳＨβか、又はＶｐＥｃＲとＲＸＲのＴ細胞特異性発現構築体のいずれかをそ れぞれ与えた。前者はレポーターマウスと表示し、後者は受容体マウスと名付け 、二重トランスジェニックマウスをレポーター／受容体マウスと呼ぶ。構築体Ｃ Ｄ ３−ＶｐＥｃＲとＣＤ３−ＲＸＲとを混合して、同時注入し、ＥＳＨβは単独で 注入した。一次遺伝子型決定(primary genotyping)をサザンブロット分析によっ ておこない、トランスジェニックマウスのトランスミッションをドットブロット 分析(dot blot analysis)によっておこなった。受容体マウスはこれらのマウス から採取したＲＮＡのノーザンブロット分析によってＶｐＥｃＲとＲＸＲの発現 に関して分析した。ノーザンブロット分析のために、対照としての、胸腺及び種 々な組織から得た総ＲＮＡ１５μｇを変性ゲル上で処理し、ニトロセルロース膜 上にブロットした。ブロットを放射性標識β−ｇａｌ特異的プローブによって調 べ、フィルム上に２日間暴露させた。これらの受容体マウスは健康であり、繁殖 力を有し、目視検査によって正常に思われた。さらに、メンデルの遺伝学によっ て予想されるように、導入遺伝子は子孫(offspring)に移された。このデータは Ｔ細胞におけるＶｐＥｃＲとＲＸＲの過度発現が有害でないことを示唆する。 受容体発現マウスにレポーターマウス（ＥＳＨβ含有）を交配して、二重トラ ンスジェニック受容体／レポーターマウスを作製した。成熟受容体／レポーター トランスジェニックマウス（遺伝子型＝ＣＤ３−ＶｐＥｃＲ；ＣＤ３−ＲＸＲ； ＥＳＨβ）に、１０ｍｇのムリステロンを含む又は含まないゴマ油を腹腔内注入 した。その後に、ノーザンブロット分析を二重トランスジェニック系統に対して 、胸腺、脳及び肝臓を含む種々な組織から処理後４８時間に単離したＲＮＡを用 いておこない、エクジソン誘導プロモーターの特異的誘導に関して試験した。用 いたプローブはエクジソン誘導プロモーターの活性に関して特異的であった。オ ートラジオグラフを３６時間暴露させた。ノーザンブロット分析の結果は、Ｖｐ ＥｃＲとＲＸＲのＴ細胞特異的発現構築体と、エクジソン誘導プロモーターＥＳ Ｈβを含有するトランスジェニックマウスのムリステロン処理が胸腺におけるエ クジソン誘導プロモーターからの顕著な誘導を生じ、その不存在下では低い基底 レベルが観察されることを実証する。 本発明をそのある一定の好ましい実施態様に関して詳細に説明したが、説明し 、特許請求する発明の要旨及び範囲内に改良及び変更が含まれることは理解され るであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ノー，デビッド アメリカ合衆国92109 カリフォルニア州 サン ディエゴ，クラウン ポイント ド ライブ 4072

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）エクジソン応答要素の制御下で外来遺伝子を含むＤＮＡ構築体と 、 （ii）そのためのリガンドの存在下と、任意に、そのためのサイレント パートナーとして作用しうる受容体のさらなる存在下で、前記エ クジソン応答要素と結合する修飾エクジソン受容体と を含有する哺乳動物対象における前記外来遺伝子の発現を調節する方法であって 、 前記修飾エクジソン受容体のためのリガンドの有効量を前記対象に投与するこ とを含み、前記リガンドが前記対象の細胞中に通常存在せず、前記リガンドが前 記対象に対して有害でない上記方法。 ２．前記エクジソン応答要素が、０〜５ヌクレオチドのスペーサーによって 分離された、第１ハーフサイトと第２ハーフサイトとを任意の順序で含む修飾応 答要素であり、 前記第１ハーフサイトが配列： −ＲＧＢＮＮＭ− を有し、式中、各Ｒは独立的にＡ又はＧから選択され；各Ｂは独立的にＧ、Ｃ又 はＴから選択され；各Ｎは独立的にＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧから選択され；各Ｍは独 立的にＡ又はＣから選択される、但し、ヌクレオチドの各−ＲＧＢＮＮＭ−群の うちの少なくとも４ヌクレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−の匹敵する位置のヌク レオチドと同じであり； 前記第２ハーフサイトがグルココルチコイド受容体サブファミリー応答要素か ら得られる、請求項１記載の方法。 ３．前記第１ハーフサイトがエクジソン応答要素から得られ、前記第２ハー フサイトがグルココルチコイド応答要素、ミネラルコルチコイド応答要素、プロ ゲステロン応答要素、又はアンドロゲン応答要素から選択されるホルモン応答要 素から得られる、請求項２記載の方法。 ４．前記応答要素がファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）に対して結合アフィ ニティを実質的に有さない、請求項２記載の方法。 ５．前記第１ハーフサイトがエクジソン応答要素から得られ、前記第２ハー フサイトがグルココルチコイド応答要素から得られる、請求項２記載の方法。 ６．前記第１ハーフサイトがＡＧＴＧＣＡであり、前記第２ハーフサイトが ＴＧＴＴＣＴである、請求項５記載の方法。 ７．前記応答要素が配列ＡＧＴＧＣＡ−Ｎ−ＴＧＴＴＣＴを有する、請求項 ６記載の方法。 ８．前記修飾エクジソン受容体が、 エクジソンリガンド結合ドメインと、 ＤＮＡ結合タンパク質から得られるＤＮＡ結合ドメインと、 転写因子の活性化ドメインと を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン又は前記活性化ドメインの少なくとも一方はネ イティブエクジソン受容体から得られない、 但し、前記活性化ドメインがグルココルチコイド受容体に由来する場合は、前記 ＤＮＡ結合ドメインはグルココルチコイド受容体又はＥ．ｃｏｌｉ ＬｅｘＡタ ンパク質に由来しない、請求項２記載の方法。 ９．前記修飾エクジソン受容体が哺乳動物細胞において構成的活性を実質的 に有さないことをさらに特徴とする、請求項８記載の方法。 １０．前記修飾エクジソン受容体のＤＮＡ結合ドメインが、受容体のステロ イド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーのメンバーに由来する、請求項９記載 の方法。 １１．受容体のステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーの前記メン バーがＥｃＲ、ビタミンＤ₃受容体、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ、ＲＸＲα 、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ、ＴＲα、ＴＲβ、又はＥＲから選択される、請求項１０ 記載の方法。 １２．修飾エクジソン受容体のＤＮＡ結合ドメインが、天然生成ＤＮＡ結合 ドメインのＰ−ボックスアミノ酸配列とは異なるＰ−ボックスアミノ酸配列を有 することを特徴とする、請求項１１記載の方法。 １３．前記修飾Ｐ−ボックスアミノ酸配列が前記天然生成Ｐ−ボックスアミ ノ酸配列とは異なるホルモン応答要素ハーフサイトに優先的に結合する、請求項 １２記載の方法。 １４．前記修飾エクジソン受容体のＤＮＡ結合ドメインがＥｃＲに由来し、 Ｐ−ボックスアミノ酸配列がＧＳＣＫＶ（配列番号：３）である、請求項１３記 載の方法。 １５．前記活性化ドメインが受容体のステロイド／甲状腺ホルモンスーパー ファミリーのメンバーから得られる、請求項８記載の方法。 １６．前記活性化ドメインがグルココルチコイド受容体活性化ドメイン、Ｖ Ｐ１６活性化ドメイン、又はＧＡＬ４活性化ドメインから選択される、請求項８ 記載の方法。 １７．前記修飾エクジソン受容体がＶｐＥｃＲ、ＶｇＥｃＲ又はＧＥｃＲか ら選択される、請求項１記載の方法。 １８．前記修飾エクジソン受容体が配列番号：５に記載されたアミノ酸配列 を有するＶｇＥｃＲである、請求項１７記載の方法。 １９．サイレントパートナーとして作用しうる前記受容体がＲＸＲである、 請求項１記載の方法。 ２０．前記ＲＸＲが前記哺乳動物対象にとって外因性である、請求項１９記 載の方法。 ２１．前記外来遺伝子が野生型遺伝子及び／又は治療的遺伝子である、請求 項１記載の方法。 ２２．前記野生型遺伝子が、 その実質的な不存在が前記対象における非正常状態の発生をもたらす、又はそ の実質的な過剰が前記対象における非正常状態の発生をもたらすような産物をコ ードする遺伝子から選択される、請求項２１記載の方法。 ２３．前記治療的遺伝子が、 産物が発現される細胞にとって有害であるか、又は 前記対象に有利な性質を与えるような 産物をコードする遺伝子から選択される、請求項２１記載の方法。 ２４．（ｉ）エクジソン応答要素の制御下で外来遺伝子を含むＤＮＡ構築体 と、 （ii）誘導プロモーターの制御下で修飾エクジソン受容体をコードす るＤＮＡであって、前記修飾エクジソン受容体がそのためのリ ガンドの存在下と、任意に、そのためのサイレントパートナー として作用しうる受容体のさらなる存在下で、前記エクジソン 応答要素と結合する、上記ＤＮＡと、 （iii）前記修飾エクジソン受容体のためのリガンドと を含有する哺乳動物対象における前記外来遺伝子の発現を誘導する方法であって 、 前記対象を、前記修飾エクジソン受容体の発現を誘導するために適した条件に さらすことを含む上記方法。 ２５．エクジソン応答要素の制御下で外来遺伝子を含有するＤＮＡ構築体を 含有する哺乳動物対象における外来遺伝子の発現を誘導する方法であって、前記 対象に、 修飾エクジソン受容体と、 前記修飾エクジソン受容体のためのリガンドと を導入することを含み、前記受容体がそのためのリガンドの存在下と、任意に、 そのためのサイレントパートナーとして作用しうる受容体のさらなる存在下で、 前記エクジソン応答要素と結合して、それからの転写を活性化する、上記方法。 ２６．宿主生物に不利な組換え産物を発現させる方法であって、 適当な宿主細胞を、 （ｉ）エクジソン応答要素の制御下で前記組換え産物をコードするＤＮＡ構築 体と、 （ii）修飾エクジソン受容体をコードするＤＮＡと によって形質転換させる工程と； 適当な培地中で、前記宿主細胞を成長させる工程と； 前記宿主細胞中に前記修飾エクジソン受容体のためのリガンド（単数又は複数 ）と、任意に、前記修飾エクジソン受容体のためのサイレントパートナーとして 作 用しうる受容体とを導入することによって、前記組換え産物の発現を誘導する工 程と を含む上記方法。 ２７．エクジソンリガンド結合ドメインと、ＤＮＡ結合タンパク質から得 られるＤＮＡ結合ドメインと、転写因子の活性化ドメインとを含む修飾エクジソ ン受容体であって、 前記ＤＮＡ結合ドメイン又は前記活性化ドメインの少なくとも一方はネイティ ブエクジソン受容体から得られない、 但し、前記活性化ドメインがグルココルチコイド受容体に由来する場合は、前記 ＤＮＡ結合ドメインはグルココルチコイド受容体又はＥ．ｃｏｌｉ ＬｅｘＡタ ンパク質に由来しない上記修飾エクジソン受容体。 ２８．請求項２７記載の修飾エクジソン受容体をコードする核酸。 ２９．複数の請求項２７記載の修飾エクジソン受容体を含むホモマー受容体 。 ３０．請求項２７記載の修飾エクジソン受容体と、受容体のステロイド／甲 状腺スーパーファミリーの少なくとも１つのサイレントパートナーとを含むヘテ ロダイマー受容体。 ３１．前記サイレントパートナーが哺乳動物由来受容体である、請求項３０ 記載のヘテロダイマー受容体。 ３２．前記哺乳動物由来受容体がＲＸＲである、請求項３１記載のヘテロダ イマー受容体。 ３３．１〜５ヌクレオチドのスペーサーによって分離された、第１ハーフサ イトと第２ハーフサイトとを任意の順序で含む修飾エクジソン受容体応答要素で あって、 前記第１ハーフサイトが配列： −ＲＧＢＮＮＭ− を有し、式中、各Ｒは独立的にＡ又はＧから選択され；各Ｂは独立的にＧ、Ｃ又 はＴから選択され；各Ｎは独立的にＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧから選択され；各Ｍは独 立的にＡ又はＣから選択される、但し、ヌクレオチドの各−ＲＧＢＮＮＭ−群の うちの少なくとも４ヌクレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−の匹敵する位置のヌク レオチドと同じである； 前記第２ハーフサイトがグルココルチコイド受容体サブファミリー応答要素か ら得られる上記修飾エクジソン受容体応答要素。 ３４．最小プロモーターを有する転写調節領域と、請求項３３記載の修飾エ クジソン応答要素とを含む遺伝子転移ベクターであって、 前記調節領域が外来遺伝子を含有するＤＮＡと機能的に結合して、前記修飾エ クジソン応答要素が１〜約６コピーまでで存在する上記遺伝子転移ベクター。 ３５．前記調節領域が偏在転写因子の結合部位をさらに含む、請求項３４記 載のベクター。 ３６．前記結合部位が前記プロモーターと前記合成エクジソン応答要素との 間に位置付けられる、請求項３５記載のベクター。 ３７．前記偏在転写因子がＳｐ１である、請求項３６記載のベクター。 ３８．前記プロモーターが組織特異的である、請求項３４記載のベクター。 ３９．請求項２８記載の修飾エクジソン受容体をコードする核酸を含有する 組換え細胞。 ４０．請求項２８記載の修飾エクジソン受容体をコードする核酸を含有する トランスジェニック哺乳動物。 ４１．請求項４０記載のトランスジェニック哺乳動物における外来遺伝子の 発現を誘導する方法であって、 前記修飾エクジソン受容体に反応するエクジソン応答要素の転写制御下で外来 遺伝子をコードするＤＮＡ構築体を前記哺乳動物に導入する工程と； 前記哺乳動物に、前記外来遺伝子の発現を誘導するための有効量の、前記修飾 エクジソン受容体のリガンドを投与する工程と を含む上記方法。 ４２．前記修飾エクジソン受容体が、受容体のステロイド／甲状腺ホルモン スーパーファミリーのサイレントパートナーと共にヘテロダイマーを形成する、 請求項４１記載の方法。