DE60033048T2

DE60033048T2 - Rekombinanter sendaivirus-vektor für die einführung von fremdgenen ins epithel der atemwege

Info

Publication number: DE60033048T2
Application number: DE60033048T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Kyushu University Yonemitsu; Mamoru Dnavec Research Inc. Hasegawa; WFW Imperial College School Medicine Eric ALTON
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2020-11-03
Also published as: ATE351915T1; WO2001032898A2; KR20020057990A; EP1228232A2; CA2389743C; HK1047137A1; WO2001032898A3; AU1055101A; CN1252274C; DE60033048D1; CN1409767A; EP1228232B1; DK1228232T3; HK1047137B; KR100772276B1; CA2389743A1; ES2280254T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend einen rekombinanten Sendaivirusvektor, die zur Einführung exogener Gene in Atemwegsepithelien und als Verfahren zur Einführung exogener Gene unter Gebrauch des Vektors geeignet ist.
Stand der Technik
Seit der Einführung molekularer Klonierungstechniken wurde eine wachsende Anzahl an Genen mit Mutationen identifiziert und isoliert, die für bedeutende menschliche Krankheiten verantwortlich sind. Die in menschlichen Patienten fehlenden oder mutierten Gene können mittels ex vivo-Verfahren ersetzt werden, welche eine Transformation von Zellen in vitro mit nackter DNA, mit in Liposomen eingekapselter DNA, geeigneten Integrationsvektoren, gefolgt von der Einführung in ein Wirtsorgan, einschließen („ex vivo"-Gentherapie).
Die Gentherapie erlaubt die Übertragung eines gewünschten Gens auf eine Versuchsperson mit anschließend einhergehender in vivo-Expression. Die Genübertragung kann durchgeführt werden, indem die Zellen und das Gewebe der Versuchsperson ex vivo transfiziert werden, und das transformierte Material wieder auf den Wirt übertragen wird. Alternativ können die Gene dem Empfänger direkt verabreicht werden.
Der Artikel von Nabel et al., Science (1990) 249: 1285–1288, betrifft die intraarterielle Transfektion von Schweinen in vivo mit Liposomen, die ein β-Gal-Expressionsplasmid enthalten. Ortsspezifische Genexpression wurde in Arterienwänden entdeckt. Es gibt einige Nachteile bei der ex vivo-Therapie. Wenn beispielsweise nur differenzierte, replizierende Zellen infiziert werden, geht die neu eingeführte Genfunktion verloren, sobald jene Zellen reifen und sterben. Außerdem können ex vivo-Verfahrensweisen nur zur Transfektion einer begrenzten Anzahl von Zellen genutzt werden, jedoch nicht zur Transfektion von Zellen, die nicht zuvor dem Körper entnommen wurden.
Wie vorstehend beschrieben ist es für die Gentherapie sehr wichtig, ein einzuführendes Gen, Zielzellen, in denen das eingeführte Gen exprimiert werden soll, für das Zielgewebe geeignete Genübertragungsmethoden, und einen Verabreichungsweg passend auszusuchen.
Zystische Fibrose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erbkrankheit, die einen angeborenen Fehler im Stoffwechsel verursacht. CF-Patienten finden sich häufig in den Vereinigten Staaten und in Europa, und eins von 2000 bis 2500 Kindern leidet an dieser Krankheit. Als wesentliches Merkmal gilt eine abnorme äußere Sekretion von zähen Schleimen, die sich in Organen wie der Lunge, den Respirationstrakten, der Bauchspeicheldrüse, der Leber und dem Dünndarm ansammeln. Die gängige Therapie bei CF ist auf Lungentransplantation und eine antibiotische Behandlung der Lungeninfektionskrankheiten fokussiert, was besonders verhängnisvoll ist. Das ursächliche Gen für CF, das zystische Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeits-Regulator-Gen (CFTR-Gen), wurde ermittelt (Riordan, J. R. et al., Science 245: 1066–1073, 1989) und man geht von der Entwicklung einer Gentherapie für CF aus, bei der ein Vektor, der das normale CFTR-Gen trägt, in die Atemwegsepithelien eingeführt wird. Bei der Gentherapie für CF sollte das exogene Gen in vivo eingeführt werden, da eine ex vivo-Behandlung der Lunge und der oberen Atemwege nicht durchgeführt werden kann.
Es wurden mehrere Versuche unternommen, der Lunge Vektoren zu verabreichen. Hazinski et al. (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1991) 4: 206–209) beschreiben eine liposomal vermittelte Genübertragung von DNA auf die gesunde Nagetierlunge. Kationische Liposomen wurden mit drei Fusionsgenkonstrukten komplexiert, bestehend aus 1) dem mit dem Rous-Sarcomavirus-(RSV)-Promotor verknüpfen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen; 2) dem mit dem Maus-Milchdrüsen-Tumor-Virus-(MMTV)-Promotor verknüpften CAT-Gen; und 3) einem Cytomegalovirus-β-Galaktosidase (CMV-β-Gal)-Fusionsgen. Die Liposomen/DNA- Komplexe wurden in die Halsluftröhren von Ratten instilliert und es wurde ein detektierbarer Spiegel an Genexpression beobachtet.
Brigham et al. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298: 278–281) beschreiben die in vivo-Transfektion von murinen Lungen mit dem CAT-Gen unter Benutzung eines liposomalen Vehikels. Die Transfektion wurde mittels einer intravenösen, intratrachealen oder intraperitonealen Injektion ausgeführt. Sowohl die intravenöse als auch die intratracheale Verabreichung führten zur Expression des CAT-Gens in der Lunge. Für die intraperitoneale Verabreichung gilt dies allerdings nicht.
Canonico et al. (Clin. Res. (1991) 39: 219A) beschreiben die durch den CMV Promotor gesteuerte Expression des menschlichen α-1-Antitrypsin-Gens in gezüchteten Epithelzellen der Rinderlunge. Das Gen wurde den Zellen in Kultur unter Verwendung von kationischen Liposomen zugefügt. Die Versuchsdurchführenden entdeckten ebenfalls die Anwesenheit von α-1-Antitrypsin in Gewebeschnitten der Lunge von neuseeländischen weißen Kaninchen nach der Verabreichung von mit Liposomen komplexierten Genkonstrukten.
Weiterhin offenbart das U.S. Patent No. 5,958,893 ein Verfahren zur Einführung eines Gens, das einen verkürzten CFTR codiert, wobei übliche verfügbare Vektoren wie Adenovirusvektoren oder kationische Liposomen verwendet werden.
Es wurde allerdings gezeigt, dass die Effizienz der Genübertragung mittels Adenovirus auf Atemwegsepithelien gering ist; die geringe Aufnahmerate der apikalen Plasmamembran für adenovirale Partikel könnte ein Grund für die ineffiziente Genübertragung sein und die Abwesenheit von αβγ3-Integrinen und den CAR-Rezeptoren, den Rezeptoren für Adenoviren, in der apikalen Oberfläche der Atemwegsepithelzellen (Goldman, M. et al., Gene Ther. 3: 811–818, 1996, Boucher, R. C., J. Clin. Invest 103: 441–445, 1999). Wie berichtet, verhindert im Fall von kationischen Liposomen der Schleim ihre Aufnahme, wobei die Effizienz der Genübertragung durch die Entfernung des Schleims verbessert wurde. (Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534–546, 1999, Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270: 18997–19007, 1995, Fasbender, A. et al., Gene Ther. 4: 1173–1180, 1997).
Bis heute ist kein Bericht über Vektorsysteme und Genübertragungverfahren erhältlich, die eine effiziente Einführung von exogenen Genen in die Atemwegsepithelien ermöglichen. Somit besteht der Wunsch zur Entwicklung von Vektoren zur effizienten Genübertragung auf die Atemwegsepithelien.
Das zur Familie der Paramyxoviridae gehörende Sendaivirus ist als Vektor für die Genübertragung sehr nützllich und seine Entwicklung ist im Gang (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578–598, 1997, WO97/16538, WO97/16539). Das Sendaivirus zeigt eine geringe Toxizität und es exprimiert in ihn eingeführte Gene äußerst stark.
Dieses Virus ist auch sehr sicher, weil ein in den Virusvektor insertiertes Gen niemals in das Wirtschromosom aufgenommen wird. Es wurde berichtet, dass sich die Transfektionseigenschaft eines Sendaivirus Vektors von der eines Adenovirus unterscheidet (Goldman, M. et al., Gene Ther. 3: 811–818, 1996, Boucher, R. C., J. Clin. Invest 103: 441–445, 1999). Beispielsweise infiziert das Adenovirus eher geschädigte als ungeschädigte Regionen (Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534–546, 1999, Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270: 18997–19007, 1995, Fasbender, A. et al., Gene Ther. 4: 1173–1180, 1997). Diese Berichte legen nahe, dass das Sendaivirus den Defekt des Adenovirus komplementieren kann.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung, die einen Vektor umfasst, der für die Einführung exogener Gene in die Atemwegsepithelien und für eine Methode, die zur Einführung exogener Gene unter Gebrauch des Vektors geeignet ist.
Die Erfinder untersuchten in vitro und in vivo die Effizienz der Genübertragung mittels eines rekombinanten Sendaivirusvektors, Adenovirusvektors und eines kationischen Lipidkomplexes auf die von verschiedenen Tieren stammenden Atemwegsepithelzellen, wobei jeder exogene Gene enthielt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Sendaivirusvektor die exogenen Gene sehr viel effizienter in die Atemwegsepithelzellen einführt als der Adenovirusvektor und der kationische Lipidkomplex.
Die Erfinder fanden auch, dass der rekombinante Sendaivirusvektor die exogenen Gene nicht nur auf die permissiven Atemwege der Maus, sondern auch auf die nicht-permissiven Atemwegsepithelzellen von großen Tieren wie dem Frettchen und Schaf und dem Menschen einführt. Weiterhin wurde gefunden, dass der Sendaivirusvektor sowohl Schleimdrüsen als auch apikale Oberflächen von Epithelzellen infiziert. Diese Befunde vervollständigen die vorliegende Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Einführung exogener Gene in Atemwegsepithelien bereit, umfassend einen rekombinanten Sendaivirusvektor, welcher ein exogenes Gen trägt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Zusammensetzung bereit, die für ein Verfahren zur Einführung exogener Gene in Atemwegsepithelien geeignet ist. Das Verfahren umfasst das In-kontakt-Bringen einer Zusammensetzung, umfassend einen rekombinanten Sendaivirusvektor, der ein exogenes Gen trägt, mit von Schleim bedeckten Atemwegsepithelien.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in weiteren Einzelheiten dargestellt.
Der hierin benutzte Begriff „rekombinanter Sendaivirusvektor" meint ein Rekonstitutionsprodukt aus Virus und virusähnlichen Partikeln der rekombinanten Sendaivirus-cDNA, und er umfasst rekombinante Sendaivirus-RNA und einen Sendaiviruskörper, der Infektiosität besitzt. Der hierin benutzte Ausdruck „Infektiosität" meint die Fähigkeit eines Virus seine Nukleinsäuren etc. mittels seiner Haftfähigkeit an die Zellen und Eindringfähigkeit in die Zellen über unterschiedliche Mechanismen in die Zellen zu übertragen, beinhaltend die Fusion der viralen Membran und Wirtszellmembran. Der rekombinante Sendaivirusvektor kann ein Ribonukleoprotein (RNP) sein.
Der hierin benutzte Begriff „Gen" umfasst RNA und cDNA.
Der Begriff „Atemwegsepithelzellen" meint sowohl pseudostratifizierte, mit Cilien ausgestattete Epithelzellen, als auch Goblet- und Clarazellen, die sich auf der inneren Oberfläche der Atemwege von Nase, Nachen, Luftröhre oder jedem leitenden Atemweg befinden, oder auf Zellen, die sich auf den alveolären Gasaustauschoberflächen, inklusive der Typ-I- und Typ-II-Pneumocyten in der Lunge befinden.
Der rekombinante Sendaivirusvektor der vorliegenden Erfindung trägt ein rekombinantes Sendaivirusgen. Das ursprüngliche Sendaivirusgenom besteht in folgender Reihenfolge aus einer kurzen 3'-Leader-Region, einem Nucleocapsid-(N)-Gen, einem Phospho-(P)-Gen, einem Matrix-(M)-Gen, einem Fusions-(F)-Gen, einem Hämaglutinin-Neuraminidase-(HN)-Gen, einem großen-(L)-Gen und einer kurzen 5'-Trailer-Region.
Das zur Herstellung des rekombinanten Sendaivirusvektor als Startmaterial benutzte Sendaivirusgen kann solange durch Deletion oder Substitution modifiziert werden als der rekonstituierte, rekombinante Sendaivirusvektor die Atemwegsepithelzellen infizieren kann und die exogenen Gene, die der Vektor enthält, in den infizierten Zellen exprimiert werden können. Zum Beispiel können unvollständige Viren wie DI-Partikel verwendet werden (J. Virol. 68: 8413–8417, 1994).
Zur Verwendung in der Gentherapie, hat der vorzugsweise rekombinante Sendaivirusvektor Infektiosität, ist aber hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Dissemination defizient. Die Fähigkeit zur Dissemination kann durch eine Deletion von wenigstens einem dieser Gene, dem F-Gen, dem NH-Gen oder dem M-Gen, eliminiert werden. Solch ein Vektor beinhaltet beispielsweise das Gen des Sendaivirus-Z-Stammes, dem nur für das F-Gen defizient ist. Zusätzliche Beispiele sind pSeV18⁺b (+) (Yu, D. et al., Genes to Cells 2: 457–466, 1997) und pSeV (+) (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578–587, 1997).
Das rekombinante Sendaivirusgen kann, wie vorstehend beschrieben, durch Insertion eines exogenen Gens in das Sendaivirusgen erhalten werden. Es kann ein beliebiges exogenes Gen benutzt werden, so lange es ein Protein codiert, das in den Zielatemwegsepithelzellen exprimiert werden soll. Zur Gentherapie von CF kann das CFTR-Gen (Riordan, J. R. et al., Science 245: 1066–1073, 1989), ein ursächliches Gen für CF, verwendet werden. Das exogene Gen umfasst Gene, die natürlich vorkommende Proteine codieren und Gene, die durch Deletion, Substitution oder Insertion der vorstehendenen Gene modifiziert wurden und die Proteine codieren, die den natürlich vorkommenden funktionell gleichwertig sind. Zum Beispiel offenbart das U.S. Patent No. 5,958,893 ein modifiziertes CFTR-Gen. Zu Beispielen anderer exogener Gene zählen Gene, die α-1-Antitrypsin (Long et al., Biochem 23: 4828–4837, 1984) DNase, Superoxid Dismutase (SOD), Katalase etc. codieren.
Der ein exogenes Gen tragende rekombinante Sendaivirusvektor kann zum Beispiel, wie nachstehend beschrieben, gemäß den Methoden von Kato, A. et al. (EMBO J. 16: 578–587, 1997) und Yu, D. et al. (Genes to Cells 2: 457–466, 1997), hergestellt werden.
Zunächst wird eine DNA-Probe hergestellt, die eine cDNA-Basen-Sequenz des gewünschten Gens enthält. Vorzugsweise kann die DNA-Probe als ein einzelnes Plasmid in einer Konzentration von 25 ng/μl oder höher elektrophoretisch erkannt werden. NotI-Erkennungsstellen in der Ziel-cDNA-Sequenz sollten, falls sie vorhanden sind, im Voraus entfernt werden. Synthetische "forward-" und "reverse-" (antisense Strang)-DNA-Sequenzen werden als Primer-Paar mit einer NotI-Restriktionsenzymspaltstellensequenz hergestellt; die nachstehend erwähnte Terminationssequenz der Transkription (E), die intervenierende Sequenz (I) und die Startsequenz (S) der Transkription; und ein Teil der Zielgensequenz, um das gewünschte Genfragment aus der Probe zu amplifizieren und zu gewinnen.
Als eine synthetische forward-DNA-Sequenz werden optional zwei oder mehr oligo-DNAs von dem 5'-Ende ausgesucht, vorzugsweise vier Basen, die keine aus der NotI-Erkennungsregion abgeleiteter Sequenzen wie GCG und GCC enthalten. Stärker bevorzugt wird ACTT mit einer an das 3'-Ende angefügten NotI-Erkennungssequenz gcggccgc, und optional neun Basen mit oder ohne ein Mehrfaches an sechs Basen als eine Spacersequenz. Weiterhin wird dem 3'-Ende eine Sequenz, die den 25 Basen des ORF entspricht, vom Start-Codon ATG der gewünschten cDNA, inklusive ATG, zugefügt. In diesem Fall werden ungefähr 25 Basen von der gewünschten cDNA ausgesucht, so dass das 3'-Ende der synthetischen forward-oligo-DNAs G oder C sein sollte.
Als eine synthetische reverse-DNA-Sequenz werden optional zwei oder mehr oligo-DNAs vom 5'-Ende ausgesucht, vorzugsweise vier Basen, die keine aus der NotI-Erkennungsregion abgeleiteten Sequenzen wie GCG und GCC enthalten. Stärker bevorzugt wird ATCC mit einer an das 3'-Ende angefügten NotI-Erkennungssequenz gcggccgc und oligo-DNAs eines Insertionsfragments, um die Länge einzustellen. Die Länge dieser oligo-DNAs ist so gestaltet, dass die Gesamtzahl der komplementären Basenstränge der cDNA und der EIS-Basen, die von dem Sendaivirus-Genom stammen, inklusive der NotI-Erkennungsregion gcggccgc, ein Mehrfaches von sechs wird (die sogenannte „6er-Regel"; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891–899, 1998, Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822–4830, 1993). Das 3'-Ende der synthetischen reverse-oligo-DNAs wird hergestellt, indem zum 3'-Ende des Insertionsfragments die komplementäre Strangsequenz der S-Sequenz des Sendaivirus, vorzugsweise 5'-CTTTCACCCT-3', die I-Sequenz, vorzugsweise 5'-AAG-3', und die komplementäre Strangsequenz der E-Sequenz, vorzugsweise 5'-TTTTTCTTACTACGG-3', eine komplementäre Sequenz, die entweder mit G oder C endet, und 25 Basen entspricht, welche von einem Stop-Codon der gewünschten cDNA-Sequenz zurückgezählt werden, hinzugefügt werden.
Als gängiges Verfahren kann die ExTaq-Polymerase (Takara Shuzo Co.) für die PCR verwendet werden. Bevorzugt wird Vent Polymerase (NEB) verwendet und es wird ein amplifiziertes Zielfragment mit NotI verdaut, um es in die NotI-Region des Plasmidvektors pBluescript einsetzen zu können. Eine Basensequenz des resultierenden PCR-Produkts wird mithilfe eines Sequenzierers bestätigt, welcher Plasmide mit einer korrekten Sequenz aussucht. Das selektierte Plasmid wird in die NotI-Region der genomischen Plasmid-cDNA des Sendaivirus eingesetzt, als da sind pSeV18+b(+) (Yu, D. et al., Genes to Cells 2: 457–466, 1997) oder pSeV (+) (Kato, A. et al., EMBO J. 16; 578–587, 1997), die mit NotI gespalten wurden, um so rekombinante Sendaivirus-cDNA zu erhalten, in die exogene cDNA eingesetzt ist. Alternativ kann die rekombinante Sendaivirus-cDNA durch direkte Einführung in die NotI-Region ohne die Benutzung des Plasmidvektors pBluescript erhalten werden. Ein rekombinanter Virusvektor kann durch Transkription der rekombinanten Sendaivirus-cDNA erhalten werden, die, wie vorstehend erwähnt, in vitro oder in Zellen zur Rekonstitution des Virus, hergestellt wird. Ein Virus kann mithilfe des gängigen Verfahrens (WO97/16538, WO97/16539) aus cDNA rekonstituiert werden. Die Rekonstitution aus cDNA kann folgendermaßen durchgeführt werden.
Die von Affennieren stammende Zelllinie LLCMK2 wird bis zu 70–80% Konfluenz (1 × 10⁶ Zellen) in Minimum Essential Medium (MEM), das 10% fötales Kälberserum und Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin) enthält, auf einer Plastikplatte mit 6 Vertiefungen gezüchtet. Die Zellen werden dann mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vTF7-3 infiziert, das die T7-Polymerase exprimiert und durch UV-Bestrahlung (Fuerst, T. R. et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 83: 8122–8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569–579, 1996) auf 2 PFU/Zelle inaktiviert ist. Eine Stunde nach der Infektion werden die Zellen weiter mit 60 bis 2 μg, stärker bevorzugt mit 3 bis 5 μg der vorstehend erwähnten rekombinanten Sendaivirus-cDNA und dem Plasmid, das virale Proteine exprimiert, die transessentiell zur Synthese des gesamten Virusgenoms (24 bis 0.5 μg pGEM-N, 12 bis 0.25 μg pGEM-P, und 24 bis 0.5 μg pGEM-L, stärker bevorzugt 1 μg pGEM-N, 0,5 μg pGEM-P und 1 μg pGEM-L) dienen, mithilfe des Transfektionsverfahrens wie z.B. dem Lipofektionsverfahren unter Benutzung von Superfect (Qiagen Inc.) cotransfiziert. Die transfizierten Zellen werden in serumfreiem MEM gezüchtet, dass 100 μg/ml Rifampicin (Sigma) und Cytosinarabinosid (AraC) enthält, stärker bevorzugt 40 μg/ml Cytosinarabinosid (AraC), um so eine optimale Konzentration dieser Wirkstoffe festzulegen, um so die Cytotoxizität des Vaccinia-Virus zu minimieren und die Virusausbeute zu maximieren (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569–579). 48 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen gewonnen und durch dreimaliges wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufgebrochen. Dann werden sie in den chorioallantoischen Hohlraum eines 10 Tage alten bebrüteten Hühnereis injiziert. Nach drei Tagen wird die chorioallantoische Flüssigkeit gewonnen und der Virustiter mithilfe der Hämagglutinin-Aktivitätsmessung (HA) bestimmt. HA kann über die „Endpunkt-Verdünnungsmethode" (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569–579) bestimmt werden. Die Proben, bei denen kein HA gefunden wird, werden nochmals in die bebrüteten Hühnereier injiziert. Der Titer der zu gewinnenden Sendaiviren beträgt normalerweise 10⁸ bis 10⁹ PFU/ml und derjenige von den Vaccinia-Viren vTF7-3 ist zusammengenommen 10³ bis 10⁴ PFU/ml oder niedriger. Die Proben werden mit einem Faktor von 10⁶ verdünnt und zur Beseitigung von Vaccinia-Viren wiederum in Hühnereiern vervielfacht. Die nach der zweiten oder dritten Passage in bebrüteten Hühnereiern erhaltenen rekombinanten Viren werden zum Erhalt von rekombinanten Virusvektoren, in denen die gewünschte cDNA eingesetzt wird, gelagert. Das plaque-bildende Potential der aufbewahrten Viren beträgt normalerweise 10⁹ PFU/ml oder 10.240 HA Einheiten/ml, und dieser Wert wird eingehalten solange das Virus bei –80°C gelagert wird.
Die zur Rekonstitution benutzten Wirtszellen unterliegen solange keiner Einschränkung als sich die rekombinante Sendaivirus-cDNA in den Zellen rekonstituieren kann. Die als Wirte benutzten Zelllinien schließen gezüchtete Zellen wie die von Affennieren stammenden CV-1 Zellen und die von Hamsternieren stammenden BHK-Zellen sowie LLCMK2 Zellen und Zellen menschlichen Ursprungs ein.
Das rekonstituierte rekombinante Sendaivirus kann an haftende Moleküle, Liganden, Rezeptoren etc. auf seiner Hüllenoberfläche gebunden werden, um so die Haftung an spezifische Zellen zu erleichtern.
Die vorstehend erwähnte, den Virusvektor enthaltende chorioallantoische Flüssigkeit kann als die den rekombinanten Sendaivirusvektor der vorliegenden Erfindung umfassende Zusammensetzung benutzt werden.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges, physiologisch verträgliches Medium so wie deionisiertes Wasser, Wasser mit 5% Dextrose und dergleichen enthalten. Andere Hilfsmittel wie Stabilisatoren, Biocide, etc. können in die Zusammensetzung aufgenommen werden. Die Zusammensetzung, umfassend den rekombinanten Sendaivirusvektor, kann in lyophilisierter Darreichungsform sein. Solch eine Zusammensetzung kann weiterhin zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Hilfsmitteln Stabilisatoren wie Albumin, Prionex^TM (Pentapharm, Japan), und dergleichen, enthalten.
Das in dem rekombinanten Sendaivirus enthaltene exogene Gen kann in Atemwegsepithelzellen eingeführt werden, indem die mit Schleim bedeckten Atemwegsepithelzellen in Kontakt mit der Zusammensetzung, umfassend den Sendaivirusvektor, gebracht werden. Wenn kationischen Lipide für die Genübertragung auf die Atemwegsepithelzellen benutzt werden, ist der Atemwegsschleim eine ernsthafte Barriere für die über kationische Lipide vermittelte Genübertragung und der Schleim muss zur Einführung exogener Gene entfernt werden. Im Gegensatz dazu kann die den Sendaivirusvektor der vorliegenden Erfindung umfassende Zusammensetzung die exogenen Gene leicht einführen, indem sie nur in Kontakt mit den mit Schleim belegten Atemwegsepithelzellen gebracht wird.
Die für ein Verfahren zur Einführung exogener Gene geeignete Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann für die Gentherapie genutzt werden, indem exogene Gene exprimiert werden, von denen erwartet wird, dass sie die Erkrankung der Atemwegsepithelzellen behandeln, oder dass endogene Gene die in den Zellen defizienten Proteine codieren. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung dieser Erfindung, die den Virusvektor mit dem CTFR-Gen enthält, für die Therapie von CF nützlich sein. Die Gentherapie kann durchgeführt werden, indem die den Virusvektor enthaltende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung den Atemwegsepithelzellen der erkrankten Regionen in vivo oder ex vivo zugesetzt wird, um den exogenen Genen eine Expression in den Zellen zu ermöglichen. Die in vivo-Genübertragung kann durch lokale Anwendung wie der Einträufelung oder der Inhalation mittels Verneblern für die Nasenhöhle oder die Lunge ausgeführt werden. Beispiele von Verneblern schließen solche ein, die kommerziell erhältlich sind und solche, die typischerweise bei der Behandlung von Asthma benutzt werden.
Die Virusvektor-enthaltende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die für die Herstellung eines Arzneimittels geeignet ist, kann bei allen Säugetieren, Mensch, Maus, Kaninchen, Schaf, Rind, Affe etc. eingeschlossen, angewendet werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Effizienz der in vivo-Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und eines kationischen Lipidkomplexes in die Mauslunge und -nase. Fehlerbalken zeigen die SEM.
2 zeigt die Auswirkung der Kontaktzeit auf die Effizienz der Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung (A) und eines kationischen Lipidkomplexes (B) auf die Mausnase, ausgewertet bei nasaler Einträufelung (kurzer Kontakt) und Perfusion (langer Kontakt). Fehlerbalken zeigen die SEM.
3 zeigt die Effizienz der Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und des Adenovirusvektors auf die Mausnase, ausgewertet bei nasaler Einträufelung. Fehlerbalken zeigen die SEM.
4 zeigt mikroskopische Fotographien, die mittels einer X-Gal-Färbung die β-Gal-Genexpression in Mausbronchien, -luftröhre und -nase aufzeigen, herbeigeführt durch die nasale Einträufelung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und des Adenovirusvektors.
5 zeigt mikroskopische Fotographien, die mittels einer X-Gal-Färbung die β-Gal-Genexpression in Mausluftröhre und -nase aufzeigen, herbeigeführt durch die nasale Einträufelung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und des Adenovirusvektors. NC weist auf sekretorische Zellen ohne Cilien und BC auf Basalzellen hin.
6 zeigt die Genexpression von β-Gal in der Frettchenlunge, herbeigeführt durch die nasale Einträufelung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung. R1 weist auf den unteren rechten Lappen und L1 auf den oberen linken Lappen hin.
7 zeigt mikroskopische Fotographien, die die Genexpression von β-Gal in der Frettchenlunge aufzeigen, herbeigeführt durch die nasale Einträufelung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung. Fotographie a ist für den oberen linken Lappen, b für den mittleren rechten Lappen, c für die submucosalen Drüsen und d für die Kontrolle. Weiterhin weist Lm auf die Bronchialhöhle und sm auf die submucosalen Drüsen hin.
8 zeigt die Effizienz der Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und eines kationischen Lipidkomplexes auf menschliche nasale Epithelzellen, die von gesunden menschlichen Spendern gewonnen wurden. Fehlerbalken zeigen die SEM.
9 zeigt die Effizienz der Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und eines kationischen Lipidkomplexes auf tracheale Schafzellen. F weist auf frische Zellen und MD auf entschleimte Zellen hin. Fehlerbalken zeigen die SEM.
10 zeigt die Effizienz der Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und eines kationischen Lipidkomplexes auf mit Mucin versetzte tracheale Schafzellen. F weist auf frische Zellen hin und tracheale Schafzellen. F weist auf frische Zellen und MD auf entschleimte Zellen hin. Fehlerbalken zeigen die SEM.
11 zeigt die Effizienz der Genübertragung des rekombinanten Sendaivirusvektors der vorliegenden Erfindung und des Adenovirusvektors auf die Randbereiche und die mittleren Bereiche der trachealen Schafzellen. Fehlerbalken zeigen die SEM.
12 zeigt mikroskopische Fotographien, die Signale von GFP zeigen, die durch den rekombinanten Sendaivirusvektor der vorliegenden Erfindung und den Adenovirusvektor in tracheale Schafzellen eingeführt wurden.
13 zeigt schematisch eine übliche Gesamtzell-Konfiguration.
14 zeigt den Zeitverlauf von Forskolin-induziertem Einwärtsstrom von –60 mV in COS7-Zellen, exprimierend Probe-1 SeV/CFTR. Das Membranpotential wurde auf einem Potential von –60 mV gehalten. Die vertikale Auslenkung zeigt die Rechteckimpulse (Dauer 1 s) in 15 s Intervallen von –100 mV bis +60 mV an. Die gestrichelte Linie zeigt die Nullstromlinie an.
15 zeigt die Auswirkung von Forskolin auf den Membranstrom in COS7-Zellen, exprimierend Probe-1 SeV/CFTR. Das Membranpotential wurde bei einem Strom von –60 mV gehalten. Die gestrichelte Linie zeigt den Nullstrompegel an. Gibenclamid (300 μM) hemmte die Forskolin-induzierten C1-Ströme.
16 zeigt in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 μM Forskolin erhaltene Strom-Spannungsbeziehungen. Die Amplitude des Membranstroms wurde als mittlerer Wert der letzten 100 ms des Befehlsimpulses (1 s Dauer) gemessen. Die Linie wurde mithilfe der Methode der kleinsten Quadrate angepasst.
17 zeigt den Nettomembranstrom, der durch Subtraktion des Membranstroms vor der Forskolingabe von demjenigen, der während der Verabreichung von 10 μM Forskolin in COS7-Zellen, exprimierend Probe-1 SeV/CFTR, erhalten wird. Das Membranpotential wurde auf einem Potential von –60 mV gehalten. Die gestrichelte Linie zeigt den Nullstrompegel an.
Die beste Art zur Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Hinblick auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, wird aber nicht als hierauf begrenzt aufgefasst.
Beispiel 1
Konstruktion und Rekonstruktion des rekombinanten Sendaivirusvektors
Ein rekombinantes Sendaivirus wurde gemäß der bekannten Methode (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578–598, 1997, Hasan, M. K. et al., J. Gen. Verol. 78: 2813–2810, 1997) konstruiert. Zunächst wurden 18 Bp der Spacersequenz (5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3') mit der NotI-Restriktionsstelle in den proximalen Bereich zwischen Leadersequenz und dem 5'-Ende der Sequenz, codierend ein N-Protein der klonierten genomischen SeV-cDNA, pSeV (+), zum Erhalt des Plasmids pSeV18⁺b (+) inseriert, das ebenfalls eine selbstspaltende Ribozym-Stelle des antigenomischen Stranges des Hepatitis-delta-Virus enthält. Die gesamte cDNA von E.coli-lacZ, die das nukleäre Lokalisierungssignal, Luciferase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), und E.coli-lacZ enthält, wurde mithilfe der Polymerasekettenreaktion amplifziert. Dazu wurden Primer mit der NotI-Region und neuen Sätzen von SeVE- und S-Signalsequenzmarkierungen für exogene Gene benutzt, und die Amplifikate wurden in die NotI-Region des klonierten Genoms eingesetzt. Die gesamte Länge der Matrizen-SeV-Genome mit den exogenen Genen wurde zu einem Vielfachen von sechs Nukleotiden angeordnet. Das Matrizen-SeV-Genom mit dem exogenen Gen und Plasmide, die N-, P- und L-Proteine (pGEM-N, pGEM-P, pGEM-L) codieren, wurden mit kommerziell erhältlichen kationischen Lipiden GL-67-DOPE-PEG (Genzyme Co. Ltd.) komplexiert und wurden mit Vaccinia-Virus vT7-3 (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 8122–8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569–579, 1996) in LLCMK2-Zellen cotransfiziert. 40 Stunden später wurden die Zellen durch drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen aufgebrochen, und dann werden sie in den chorioallantoischen Hohlraum eines 10 Tage alten bebrüteten Hühnereis injiziert. Dann wurde das Virus gewonnen und das Vaccinia-Virus wurde durch eine zweite Passage in den Eiern entfernt. Der Virustiter wurde mithilfe des Nämagglutinationsassays unter Verwendung von roten Blutkörperchen aus Hühnerblut bestimmt (HA) (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569–579, 1996) und die Viren-enthaltende choriallantoische Flüssigkeit wurde bis zu ihrem Gebrauch als Zusammensetzung, umfassend den Sendaivirusvektor der vorliegenden Erfindung, bei –80°C eingefroren.
Beispiel 2
In vivo-Genübertragung auf die Mausnase und -lunge durch nasale Einträufelung oder nasale Perfusion
2-1 Vergleich des Sendaivirusvektors mit kationischem Lipid
pCMV-Luciferase wurde konstruiert, indem das HindIII-BamHI Fragment des pGL3-Kontroll-Vektors (Promega) in die Multiclonierungsstelle von pcDNA3 (Invitrogen) insertiert wurde, die unter der Kontrolle eines menschlichen "immediate early" Cytomegalovirus-(CMV-IE)-Promotor steht. pCMV-Luciferase wurde dann mit GL-67-DOPE-PEG (Genzyme Co. Ltd.) komplexiert, um so GL-67-pCMV-luc zu erhalten.
Um die Effizienz der Genübertragung der Vektoren auf die Lunge und die Auswirkung der Kontaktzeit auf die Effizienz der Genübertragung zu untersuchen, wurden die Vektoren mittels nasaler Einträufelung und nasaler Perfusion in die Nasenhöhle verabreicht. Zunächst wurde männlichen balb/c Mäuse (6–8 Wochen) intranasal 100 μl Sendaivirusvektor in verschiedenen Konzentrationen eingeträufelt, der die in Beispiel 1 mittels der bekannten Methode (Yonemitsu, Y. et al., Gene Ther. 4: 631–638, 1997) hergestellte Luciferase (SeV-luc) oder GL-67-pCMV-luc (80 μg DNA/Maus) enthält.
Die nasale Perfusion wurde mittels eines intranasal eingeführten 5 mm Katheters durchgeführt und es wurden jeweils 150 μl Vektorlösung mit einer Rate von 5 bis 6 μl/Minute unter Verwendung einer Peristaltikpumpe (Modell P-1, Pharmacia Biotech) perfundiert. Zwei Tage nach der Genübertragung wurden die Mäuse unter einer ausreichenden Narkose durch intraperitoneale Injektion einer Überdosis Pentobarbitar getötet, und Nasenmuscheln, Luftröhre und Lunge wurden entnommen und einem Luciferase-Assay unterzogen.
Als Kontrolle wurde das in Beispiel 1 verwendete pSeV18b+ derselben vorstehend beschriebenen Genübertragung unterzogen. Dieses Plasmid wurde als Kontrolle für die folgenden Beispiele verwendet.
Der Luciferase-Assay wurde wie folgt gemäß der bekannten Methode (Yonemitsu, Y. et al., Gene Ther. 4: 631–638, 1997) ausgeführt. Zunächst wurden die Gewebe mit PBS gewaschen und mit Scheren in dem 1× Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail zerkleinert, dann 10 Minuten mit 13.000 rpm bei 4°C zentrifugiert und 30 μl des Überstandes wurden 100 μl Luciferase-Assay-Puffer (Promega) zugesetzt. Die Lichtintensität wurde mit einem Turner TD20e-Luminometer (Turner Co.) mit 10 Sekunden Integration gleich nach einer Präinkubation für 10 Sekunden bei 20°C gemessen. Unter dieser Bedingung ist 1 pg der rekombinanten Luciferase (Promega) äquivalent zu 2,56 × 10¹ RLU. Die Proteinkonzentration wurde mittels des Bradford-Verfahrens unter Gebrauch eines kommerziell erhältlichen Proteinbestimmungssystems (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hertfordshire, UK) anhand einer zu Rinderserumalbumin korrespondierenden Standardkurve bestimmt. Die Daten wurden als RLU/mg Protein angegeben, und jede Probe wurde mehr als zweimal gemessen.
Die 1 (Lunge) und 2 (Nase) zeigen einen Vergleich der Genübertragungseffizienz zwischen SeV-luc und GL-67-p-CMV-luc. Wie in 1 gezeigt, wiesen die SeV-luc transfizierten Lungen dosisabhängig eine mehr als 1.000-fach höhere Luciferase-Aktivität auf als die von GL-67-pCMV-luc. Die Expression des Luciferasegens von SeV zeigte sich ungefähr 1.000 mal höher als diejenige von GL-67-pCMV-luc ohne signifikante Differenz zwischen verschiedenen Kontaktzeiten. Diese Ergebnisse deuten an, dass der SeV-Vektor die Genübertragung auf die Mauslunge und -nase effizient ermöglicht, und dies nur wenn der Vektor mit den Atemwegsepithelien in Kontakt tritt.
2-2. Sendaivirusvektor verglichen mit dem Adenovirusvektor
SeV-luc oder der Adenovirusvektor, beinhaltend das Luciferase-Gen AdCMV-Luciferase (Ade-luc) (Kendall, J. M. et al., Cell Calcium 19: 133–142, 1996) wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 intranasal eingeträufelt, und dann wurden Nasenmuscheln, Luftröhre und Lunge entnommen und einem Luciferase-Assay unterzogen. Sendaivirusvektor und Adenovirusvektor, beide das lacZ-Gen mit nukleären Lokalisationssignal des Simian Virus "largeT antigen" (SeV-NLS-lacZ und AdCMV-nls-lacZ) tragend, wurden hergestellt, und in derselben Weise wie in 2-1 beschrieben, nasal eingeträufelt. Bronchien, Luftröhre und Nasenmuscheln wurden gewonnen. Jedes Gewebe wurde mit eisgekühltem 2%igen Paraformaldehyd mit 0,25% Glutaraldehyd in 0,1 M PBS 10 Minuten lang fixiert, danach folgte eine X-Gal-Färbung (Lösung: 5 mM Eisenkaliumcyanid, 5 mM Eisencyanid, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galacto-Pyranosid) drei Stunden lang bei Raumtemperatur mittels rotierendem Schüttler. Das mit X-Gal gefärbte Gewebe wurde erneut fixiert und auf Paraffin befestigt, und 5 μm große Ausschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop untersucht. Die Ergebnisse sind in den 3, 4 und 5 gezeigt.
Wie in 3 gezeigt, weisen die SeV-luc-transfizierten Zellen eine 5.000fach höhere Genübertragung auf als diejenige von Ade-luc. X-Gal-positive Epithelzellen waren in den Bronchiolen mit ähnlicher Frequenz für beide Vektorinokulationen verstreut (4). Auf der anderen Seite wurden X-Gal-positive Zellen häufig in mit SeV-NLS-lacZ behandelten Tieren beobachtet, während blaue Zellen in der Luftröhre oder Nase von mit AdCMV-nls-lacZ behandelten Mäusen selten waren. Wie in 5 gezeigt, werden blaue Anfärbungen nicht nur in cilienenthaltenen Zylinderepithelzellen, sondern auch in sekretorischen Zellen ohne Cilien (NC) gesehen. Im Gegensatz dazu wurden keine blauen Signale in Basalzellen (BC) detektiert.
Diese Ergebnisse offenbaren, dass der Sendaivirusvektor die Genübertragung auf die Atemwegsepithelzellen, in die Adenovirusvektoren keine Gene einführen können, erleichtert.
Beispiel 3
Genübertragung auf die Lunge eines Frettchens
Frettchen (500–600 g Gewicht) wurden anästhesiert und es wurden 3 ml gereinigter SeV-LacZ in BSS mit entweder 3 × 10⁸ oder 3 × 10⁹ PFU/ml (n = 3 in jeder Gruppe), wie im Beispiel 2, intranasal eingeträufelt. Kontrollen (n = 2) erhielten 3 ml SeV-Luc (10⁹ PFU/ml). 48 Stunden nach der Infektion wurden die Frettchen getötet. Die Luftröhre wurde in situ mit einer Kanüle versehen und die Lungen wurden mit einer eiskalten Fixierlösung (2% Formalin, 0.2% Glutaraldehyd, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA in PBS, pH 7.3) aufgeblasen. Die Luftröhre und die Lungen wurden als Ganzes herausgeschnitten und einer X-Gal-Färbung, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterzogen. Jede Lunge wurde in sieben Teile aufgegliedert: Luftröhre, vier rechte Lappen (oberer (R1), mittlere (R2, R3), und unterer (R4)) und zwei linke Lappen (oberer (L1) und unterer (L2)). Die β-Gal-positiven Zellen in den Atemwegsepithelien und submucosalen Drüsen wurden mikroskopisch über Punktzählung unter Benutzung von Gitternetzlinsen quantifiziert. 10 × 20 Vergrößerungsfelder pro Atemweg wurden bestimmt, um den Prozentanteil von blauen Zellen/Atemweg zu erhalten und es wurden 3 bis 8 Atemwege zufällig aus verschiedenen Bereichen eines Lappens (proximal, mittig, distal) zur Bestimmung jedes Lappens genommen. Für die submucosalen Drüsen wurden 10 bis 28 Felder (wenigstens 4 Drüsen beinhaltend)/Lappen bestimmt. Der Fehler der Messwiederholung (ERM), ausgedrückt als Variationskoeffizient (CV), war 18%. Der CV zwischen den Tieren war für die Tiere, die 10⁸ PFU/ml erhielten, zwischen 24 und 43% und er war zwischen 8 und 14% für die Tiere, die 10⁹ PFU/ml erhielten.
Die Atemwegsepithelien (6A und 7a und b) und die submucosalen Drüsen (6B und 7c) wurden im Hinblick auf die β-Galaktosidase-Aktivität dosisabhängig dargestellt. Submucosale Drüsen sind die überwiegenden Bereiche der CFTR Expression. In der Kontrolle wurde keine Aktivität gefunden (7d).
Beispiel 4
Genübertragung auf nasale Epithelzellen von menschlichen gesunden Spendern
Nasale Epithelzellen wurden von menschlichen gesunden Spendern durch Abstreifen gewonnen (6: männlich und 3: weiblich). Nach 2maliger Waschung mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, pH 7.2) wurden die Zellen in dem Kulturmedium ("Dulbecco's modified Eagle's medium"; DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum resuspendiert. Sie werden in zwei oder drei Gruppen gespalten und in jede Vertiefung der Kulturplatte mit 96 Vertiefungen platziert. Die Lebensfähigkeit der nasalen Zellen wurde mittels Phasen-Kontrast-mikroskopischer Beobachtung des Flimmerschlagens und durch das mikroskopische Zählen der Anzahl Trypan-Blau-positiver Zellen bestätigt. Vektorlösungen (SeV-luc und GL-67-pCMV-luc) wurden jeder Vertiefung zugefügt. 24 Stunden später wurden die Zellen gewonnen, 3mal mit PBS gewaschen und einem Luciferase-Assay, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterzogen. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
SeV-luc transfizierte Zellen zeigten eine ungefähr 1.000mal höhere Luciferase-Aktivität als die mit GL-67-pCMV-luc transfizierten Zellen.
Beispiel 5
Genübertragung auf das Luftröhrenepithel vom Schaf
5-1. Einfluss von Schleim auf die Genübertragung
Der Einfluss von Schleim auf die Effizienz der Genübertragung jedes Vektors wurde unter Gebrauch des trachealen Schaf-Strip-Modells untersucht, welches gemäß einer bekannten Methode hergestellt wurde (Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534–546, 1999). Nach der Tötung wurde die Epithelschicht der herausgeschnittenen Schafluftröhre von Muskel und Adventitia freigelegt, und in 0,5 cm² große quadratische Stücke geschnitten, mit der anschließenden Bestätigung des Flimmerschlagens mit dem Phasenkontrastmikroskop. In einigen Geweben erfolgte die Schleimentfernung gemäß der bekannten Methode (Kitson, C. et al., Gene Ther. 6: 534–546, 1999). Diese Gewebe wurden in die Luft/Flüssigkeit-Zwischenphase platziert. Zehn μl SeV-luc- oder GL-67-luc-Vektorlösung wurden zur Ausführung der Transfektion auf die apikole Oberfläche gegeben. Nach 48 Stunden wurden die Stücke, wie in Beispiel 2 beschrieben, einem Luciferase-Assay unterzogen. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Wie in 9 gezeigt, beeinflusste der Schleim die von SeV vermittelte Genübertragung nicht merklich verglichen mit der von GL-67-luc vermittelten Genübertragung.
5-2. Einfluss der Schleimviskosität auf die Genübertragung
Die Verfahrensweise von 5-1 wurde wiederholt, außer dass verschiedene Konzentrationen von Schleim der Rinderspeicheldrüse kurz vor der Genübertragung zugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
Wie 10 zeigt, wurde die Genübertragung von GL-67-luc durch den Zusatz von Mucin gehemmt. Die Luciferase-Aktivität der mit Mucin versetzten Proben war von derjenigen der frischen Proben nicht signifikant verschieden, was nahelegt, dass eine Barriere-Aktivität des Mucins einen Einfluss, die Viskosität des Schleims jedoch keinen Einfluss auf die kationisch-vermittelte Genübertragung hat. Auf der anderen Seite beeinflussen seröse Mucinbestandteile die Effizienz der SeV-Infektion nicht, während die Schleimviskosität die SeV-vermittelte Genübertragung schwach beeinflusst.
5-3. Ortsspezifische Transfektionseffizienz
Die Luftröhrenepithelien des Schafs wurden in der gleichen Weise wie unter 5-1 beschrieben mit SeV-luc oder AdCMV-luc transfiziert. Nach der Genübertragung wurde der Rand des Gewebes präpariert und geschnitten, und es wurde die Luciferase-Aktivität des Randanteils und des mittleren Teils getrennt gemessen. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Das vorstehend Geschriebene Genübertragungsverfahren wurde unter Verwendung von SeV-GFP und einem hohen Titer am Adenovirus Serotyp-5, GFP tragend und gesteuert von dem CMV-IE Promotor, AdCMV-GFP (Krame) Biotech International LTd.), an Stelle von SeV-luc und AdCMV-luc wiederholt. Zwei Tage nach der Genübertragung wurden Signale des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) unter dem Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
Wie in 11 und 12 gezeigt, zeigte AdCMV-luc eine höhere Expression in den verletzten Rändern, während eine relativ geringe Expression in den mittleren Bereichen der unverletzten Mitte des Schafluftrörengewebes vorhanden war. Im Gegensatz dazu zeigte SeV-luc-behandeltes Gewebe keinen signifikanten Unterschied in der Genübertragung zwischen Randbereichen und mittleren Bereichen.
Beispiel 6
Kontraktion von SeV/CFTR und elektophysiologische Charakterisierung
Ein rekombinanter, CTFR, das ursächliche Gen für CF, exprimierender Sendaivirusvektor, wurde konstruiert. Das CFTR-Gen (Riordan, J. R. et al., Science 245: 1066–1073, 1989) wurde mittels PCR unter Verwendung eines Primer-Sets, beinhaltend E- und S-Signalsequenzen, amplifiziert. Das verwendete Primer-Set ist wie folgt
"Forward"-Primer:
"Backward"-Primer:
Das amplifizierte Fragment wurde in die NotI-Stelle von pSeV18⁺b(+) eingefügt, und die Rekonstitution des Virus wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt.
COS7-Zellen wurden mit dem hergestellten CFTR-exprimierenden Sendaivirus (Probe-1 SeV/CFTR) infiziert, und die erhaltenen infizierten Zellen wurden mit der "Whole-Cell-Patch-Clamp"-Technik untersucht. 13 zeigt eine Zusammenfassung der "Whole-Cell-Patch-Clamp"-Technik. Eine Glaspipette, enthaltend eine Pipettenlösung, wurde mit einer Zelle in einer Badlösung in Kontakt gebracht und um die Zellmembranen zu entfernen wurde negativer Druck aufgebaut. Dazu beinhaltet die Pipettenlösung 145 mM NMDG⁺, 148,4 mM Cl^–, 6,7 mM Mg²⁺, 5 mM ATP, 10 mM Glucose, 0,1 mM EGTA, und 10 mM HEPES (mit Tris titriert, pH 7,4), und die Badlösung enthält 141 mM Na⁺, 152,4 mM Cl^–, 152,4 mM H₂PO₄ ^–, 5 mM K⁺, 1,7 mM Mg²⁺, 2 mM Ca²⁺, 10 mM Glucose, 0,1 mM EGTA, und 10 mM HEPES (mit Tris titriert, pH 7,4). Die Auswirkungen von Forskolin auf den Membranstrom in den COS7-Zellen, die Probe-1 SeV/CFTR exprimieren, wurden durch Gesamtzell-Aufzeichnung untersucht (14). Als Ergebnis wurde ein von der Forskolinkonzentration abhängiger Einwärtsstrom beobachtet (absteigendes Abfallen der Spur), welcher durch Glibenclamid (Chloridkanalblocker) unterdrückt (Aufwärtstransition) wurde. Der Einwärtsstrom wurde reproduziert, indem nach einem einzigen Waschschritt wiederum Forskolin zugesetzt wurde, und er wurde wiederum durch Glibenclamid unterdrückt, was bestätigte, dass die beobachtete Stromveränderung eine spezifische wirkstoffabhängige Antwort war.
Als nächstes wurde die Zeitabhängigkeit jeder wirkstoffinduzierten Reaktion untersucht (15). Forskolin induzierte einen Cl^–-Strom in COS7-Zellen, die Probe-1 SeV/CFTR exprimieren, und es wurde eine zeitunabhängige, für Chloridkanäle charakteristische Reaktion beobachtet. Glibenclamid (300 μM) hemmte die Forskolin-induzierten Cl^–-Ströme.
16 zeigt die abgeleiteten Strom-Spannungsbeziehungen in COS7-Zellen, die Probe-1 SeV/CFTR exprimieren, die auf vorstehenden Daten unter Anwesenheit und Abwesenheit von Forskolin beruhen. Die Linien kreuzen sich im Ursprungspunkt, wenn kein endogener Cl-Strom vorhanden ist. In der erhaltenen Graphik kreuzten sich die Linien zwischen 10 und 20 mV. Dies legt nahe, dass nicht der durch CFTR (Forskolin-unabhängig) herbeigeführte Cl-Strom in diesen COS7-Zellen fließt. 17 zeigt den Unterschied im Membranstrom in Anwesenheit und Abwesenheit von Forskolin (Nettomembranstrom), der durch Subtraktion des vor der Verabreichung von Forskolin aufgezeichneten Stroms von dem während der Verabreichung von Forskolin aufgezeichneten Strom erhalten wird.
Industrielle Verwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten Sendaivirusvektor zur Einführung exogener Gene in Atemwegsepithelien bereit, in die übliche, für die Genübertragung benutzte Vektoren ihre Gene nicht effizient einführen können, und eine Zusammensetzung, geeignet für ein Verfahren zur Einführung exogener Gene unter Verwendung des Vektors. Der rekombinante Sendaivirusvektor der vorliegenden Erfindung ermöglicht durch kurze Kontaktierung des Vektors mit den Zellen eine effiziente Genübertragung auf native mit Schleim beschichtete Atemwegsepithelzellen. Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann Atemwegsepithelzellen von Säugetieren, die größer als Mäuse sind, infizieren, was nahe legt, dass der Vektor der vorliegenden Erfindung eine effektive Gentherapie ermöglicht, wenn eine Genübertragung auf Atemwegsepithelzellen benötigt wird.
SEQUENZLISTE

Claims

Zusammensetzung zur Einführung exogener Gene in Atemwegsepithelien, umfassend einen rekombinanten Sendaivirusvektor, welcher ein exogenes Gen in seinem Genom enthält, wobei das exogene Gen das Gen des zystische Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeits-Regulators (CFTR) oder dessen Deletions-, Substitutions- oder Insertions-Derivat ist, welches ein Protein codiert, das funktionell äquivalent zu CFTR ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Sendaivirusvektor nicht mindestens eines der Gene F, HN und M enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung zusätzlich eine chorioallantoische Flüssigkeit aus Hühnerei umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von zystischer Fibrose ist.
Verwendung eines rekombinanten Sendaivirusvektors, welcher ein exogenes Gen in seinem Genom enthält, zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Gentherapie mittels Einführung eines exogenen Gens in Atemwegsepithelien.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Sendaivirusvektor nicht mindestens eines der Gene F, HN und M enthält.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Zusammensetzung zusätzlich chorioallantoische Flüssigkeit aus Hühnerei umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von zystischer Fibrose.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das exogene Gen das Gen des zystische Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeits-Regulators (CFTR) oder dessen Derivat ist, welches ein Protein codiert, das funktionell äquivalent zu CFTR ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Atemwegsepithelien in der Nase, im Rachen, in der Luftröhre oder jedem leitenden Atemweg oder jeder Gasaustauschoberfläche in der Lunge anwesend sind.