DE60118771T2

DE60118771T2 - Paramyxovirus-vektor zum gentransfer ins kardiovaskuläre system

Info

Publication number: DE60118771T2
Application number: DE60118771T
Authority: DE
Inventors: Imp. College School of Medicine Uta GRIESENBACH; Imp. College School of Medicine Stefano FERRARI; Imp. College School of Medicine Duncan M. GEDDES; Imp. College School of Medicine Eric WFW ALTON; DNAVEC Research Inc. Mamoru Tukuba-shi HASEGAWA; Xiaogang Alhambra HOU
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2021-11-09
Also published as: EP1662003A2; ATE323149T1; HK1070100A1; WO2002038726A2; EP1662003A3; CN1555417B; DE60118771D1; CN1555417A; EP1334174B1; US20040101965A1; DK1334174T3; AU2002212733A1; EP1334174A2; KR20030074617A; CA2428073C; ES2260301T3; CA2428073A1; WO2002038726A3; JP2002142770A; KR100852078B1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Paramyxovirus-Vektors, umfassend ein Fremdgen, das ein sekretorisches Protein codiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Entzündungserkrankung, wobei der Paramyxovirus-Vektor intramuskulär zu verabreichen ist.
Hintergrund
In letzter Zeit wird die Gentherapie in einer Vielzahl von Erkrankungen untersucht. Dies ist ein Behandlungsverfahren, bei dem ein Gen, das eine therapeutische Wirkung hat, exogen in Patienten eingebracht und in vivo exprimiert wird. Beispiele von Vektoren, die in der Gentherapie verwendet werden, sind zum Beispiel DNA selbst, DNA, die in Liposomen enthalten ist, oder Virus-Vektoren. Diese Vektoren können entweder direkt verabreicht (in vivo-Gentherapie) oder verwendet werden, um Zellen zu transformieren, die in der Folge in Patienten eingebracht werden (ex vivo-Gentherapie).
Zum Beispiel schließen Erkrankungen, die durch Gentherapie behandelt werden können, Lungenfibrosen wie die cystische Fibrose (CF) ein. CF ist eine autosomal-rezessiv Erbkrankheit, die kongenitale metabolische Störungen verursacht. CF tritt häufig bei Kaukasiern in einer Frequenz von einem pro 2000 bis 2500 Kindern auf. In CF-Patienten akkumulieren muköse Sekrete in vielen Geweben einschließlich der Lungen, des Atmungstrakts, des Pankreas, der Leber und des Dünndarms aufgrund von exokrinen Abnormalitäten. Die Kontrolle von Lungeninfektionen durch Antibiotika und Lungentransplantationen stellt die Hauptbehandlung bei diesen CF-Patienten dar, für die Lungeninfektionen besonders verhängnisvoll sind. In den Lungen von CF-Patienten werden die Gewebe des Atmungstrakts progressiv durch chronische Entzündung zerstört. In solchen Geweben wird angenommen, dass das Gleichgewicht zwischen der pro-inflammatorischen Cytokin- und der anti-inflammatorischen Cytokin-Produktion zusammengebrochen ist.
Ein wirksamer Weg, eine Gentherapie im obigen Fall durchzuführen, ist, einen Vektor an die Stelle der Erkrankung zu verabreichen und das therapeutische Gen lokal zu exprimieren. Es ist auch möglich, das Genprodukt auf den ganzen Körper durch das kardiovaskuläre System zu übertragen. Insbesondere, wenn es schwierig ist, den Vektor für die Gentherapie lokal zu verabreichen, oder wenn eine Möglichkeit besteht, dass unerwünschte Nebenwirkungen verursacht werden, kann es eine wirksame Behandlungsstrategie sein, das therapeutische Gen im ganzen kardiovaskulären System zu exprimieren, besonders im Fall von Genen, die biologisch aktive Substanzen codieren, die eine kurze Halbwertszeit im Blut haben (wie die Cytokine). In diesem Zusammenhang wird vorgeschlagen, dass Muskeln geeignete „Fabriken" zum Herstellen von sekretorischen Proteinen sind, von denen erwartet wird, dass sie durch die Blutbahn übertragen werden und an einer entlegenen Stelle wirken. Bis jetzt haben Untersuchungen von Gen-Transfektionen in die Muskel hauptsächlich nackte DNA und Adeno-assoziierte Viren (AAV) verwendet. Diese Vektoren erzielen jedoch keinen ausreichenden Expressionsspiegel. Daher ist es wünschenswert, einen neuen Vektor zu entwickeln, der die Sekretion eines transfizierten Genprodukts in einem hohen Spiegel im kardiovaskulären System ermöglicht.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, einen Paramyxovirus-Vektor für den Gentransfer in das kardiovaskuläre System und Verwendungen davon zu liefern.
Das Sendai-Virus, das zu der Paramyxoviridae-Familie gehört, ist vor kurzem verwendet worden, um Vektoren für den Gentransfer zu entwickeln (Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578–598; WO97/16538 und WO97/16539). Der Sendai-Virus-Vektor hat eine niedrige Toxizität, und die Menge an Protein, die von dem transfizierten Gen exprimiert wird, ist extrem hoch. Zusätzlich zeichnet er sich durch Sicherheit aus, da das Gen innerhalb des Vektors nicht in das Wirtsgenom integriert wird. Die hier genannten Erfinder dachten, dass das rekombinante Sendai-Virus (SeV) verwendet werden könnte, um transfizierte Genprodukte wirksam im kardiovaskulären System zu exprimieren. Die Erfinder konstruieren einen neuen Sendai-Virus-Vektor zum Exprimieren des anti-inflammatorischen Cytokins Interleukin-10 (IL-10) (SeV-IL10) und führten Untersuchungen durch, in denen sie ihn verwendeten.
Wenn er in vitro in COS7-Zellen transfiziert wurde, steigerte SeV-IL10 16 h nach der Transfektion dosisabhängig die Sekretion von IL-10. Der Sekretionsspiegel von IL-10 mit dem höchsten Titer von SeV-IL10 (10⁶ PBE/Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen) war um zwei Größenordungen höher als jener, der durch Liposomen-vermittelte Transfektion eines Plasmids, das IL-10 codiert, erreicht wurde. Daher führten die Erfinder in vivo-Transfektionsexperimente unter Verwendung des SeV-IL10-Vektors durch.
SeV-IL10 wurde lokal durch intranasale Tropfen in den Atmungstrakt der Maus verabreicht. Zwei Tage später wurde der Spiegel von IL-10, das in das Lungen-Homogenat und die broncho-alveoläre Spülflüssigkeit (BALF) sezerniert wurde, gemessen und mit jenem verglichen, der durch Plasmid-DNA-Transfektion, die durch Liposomen vermittelt wurde, erzielt wurde. Der Spiegel der IL-10-Sekretion, der durch SeV-IL10-Verabreichung erhalten wurde, war in den Lungen-Homogenaten um zwei Größenordungen höher als jener, der durch Plasmid-Transfektion erzielt wurde (SeV-IL10: 21457 ± 5112 pg/mg Protein; Plasmid: 310 ± 54 pg/mg Protein), und er war in BALF um drei Größenordungen höher (SeV-IL10: 153366 ± 41823 pg/ml; Plasmid: 71 ± 63 pg/ml). Der IL-10-Spiegel im Blut wurde weiter untersucht. In der Maus, der SeV-IL10 gegeben wurde, wurde eine signifikante Menge an IL-10 sezerniert.
Darüber hinaus wurde SeV-IL10 in einen Skelettmuskel injiziert, was eine geeignete Stelle für die Produktion von sekretorischen Proteinen ist, und die Wirkung wurde untersucht. Der SeV-IL10-Vektor (4 × 10⁸ PBE/Muskel) wurde in den vorderen Tibialis-Muskel injiziert, und der IL-10-Expressionsspiegel wurde zwei Tage später untersucht. Der Expressionsspiegel im Muskel-Homogenat war um eine bis zwei Größenordnungen höher als jener im Fall einer Plasmid-DNA-Injektion (50 μg DNA) (SeV-IL10: 1067 ± 32 pg/mg Protein; Plasmid: 50,9 ± 11 pg/mg Protein). IL-10 wurde im Serum durch Plasmid-Injektion nicht nachgewiesen, wohingegen ein signifikanter Anstieg im Serum-IL-10-Spiegel zwei Tage nach der Injektion des SeV-IL10-Vektors erreicht wurde (SeV-IL10: 393 ± 132 pg/ml; SeV-βgal: 0,31 ± 0,26 pg/ml).
Zusammengefasst war die Wirksamkeit des Gentransfers in die Lungen und Muskel unter Verwendung des rekombinanten SeV sehr hoch, was nahe legt, dass der SeV-Vektor die Produkte von transfizierten Genen in hohen Spiegeln im kardiovaskulären System exprimieren kann. Der hierin offenbarte Vektor ist nützlich als ein Vektor für die Gentherapie gegen eine Vielzahl von Erkrankungen, die durch das Transferieren von Genen in das kardiovaskuläre System heilbar sind. Insbesondere ermöglicht der Vektor die Anwendung der Gentherapie bei Lungenentzündung in CF-Patienten.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den wirksamen Transfer von Genen durch die intramuskuläre Verabreichung von rekombinantem SeV. Der Expressionsspiegel eines transfizierten Gens erreicht zwei Tage nach der Injektion einen hohen Spiegel. Dieser Spiegel ist signifikant höher als jener, der unter Verwendung von Plasmid-DNA oder AAV erhalten wird. Die SeV-vermittelte Produktion von therapeutischen Genprodukten ist unter klinischen Bedingungen, bei denen schnell ein hoher Spiegel der Genexpression benötigt wird, extrem wirksam. Wenn es schwer ist, die Möglichkeit auszuschließen, dass der Vektor selbst eine inflammatorische Wirkung haben kann, ist es vorteilhaft, die Vektoren in einen Muskel weit weg von der Stelle der Erkrankung zu verabreichen, um im Vergleich zu der direkten Verabreichung an die Stelle eine Verschlechterung der Entzündung zu verhindern. Dementsprechend wird erwartet, dass die intramuskuläre Verabreichung des Vektors der Erfindung eine wirksamere Behandlung ermöglicht. Darüber hinaus würde die Verwendung von SeV, dem eine Replikationsfähigkeit fehlt, entzündliche Reaktionen und Antikörper-Antworten, die beobachtet werden, wenn Vektoren verwendet werden, die sich replizieren können, reduzieren.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Paramyxovirus-Vektors für den Gentransfer in das kardiovaskuläre System, wie unten beschrieben:

(1) die Verwendung eines Paramyxovirus-Vektors, umfassend ein Fremdgen, das ein sekretorisches Protein codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Entzündungskrankheit, wobei der Paramyxovirus-Vektor intramuskulär zu verabreichen ist;
(2) die Verwendung gemäß (1), wobei das sekretorische Protein ein anti-inflammatorisches Cytokin ist;
(3) die Verwendung gemäß (2), wobei das anti-inflammatorische Cytokin IL-10 ist;
(4) die Verwendung gemäß (1), (2) oder 3, wobei das Paramyxovirus ein Sendai-Virus ist; und
(5) die Verwendung gemäß (1), wobei die Entzündungserkrankung Lungenfibrose ist.

Hierin wird ein „Paramyxovirus-Vektor" als ein Vektor (oder Träger) definiert, der vom Paramyxovirus abgeleitet ist und der für den Gentransfer in Wirtszellen verwendet wird. Der hierin offenbarte Paramyxovirus-Vektor kann ein Ribonucleoprotein (RNP) oder ein Viruspartikel, das eine Infektiosität aufweist, sein. Hier wird „Infektiosität" als die Fähigkeit des rekombinanten Paramyxovirus-Vektors definiert, durch seine Zelladhäsions- und Membranfusionsfähigkeiten ein Gen, das in dem Vektor enthalten ist, an Zellen, an die der Vektor angehaftet ist, zu übertragen. Der hierin offenbarte Paramyxovirus-Vektor trägt ein Fremdgen in einer expressionsfähigen Weise. Der Paramyxovirus-Vektor kann eine Replikationsfähigkeit aufweisen oder kann ein defekter Vektor ohne die Replikationsfähigkeit sein. Hierin wird „Replikationsfähigkeit" als die Fähigkeit des Virus-Vektors definiert, sich zu replizieren und infektiöse Viruspartikel in Wirtszellen, die mit den Virus-Vektoren infiziert sind, zu produzieren.
Hierin wird ein „rekombinanter" Paramyxovirus-Vektor als einer, der durch Genmanipulation konstruiert wurde, oder seine amplifizierten Produkte definiert. Zum Beispiel können rekombinante Paramyxovirus-Vektoren durch Wiederherstellung einer rekombinanten Paramyxovirus-cDNA erzeugt werden.
Hierin wird ein Paramyxovirus als ein Virus der Paramyxoviridae-Familie oder ein Derivat davon definiert. Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel auf Paramyxoviren wie das Sendai-Virus, das Newcastle-Erkrankungs-Virus, das Mumpsvirus, das Masernvirus, das Respiratorische Syncytial-Virus, das Rinderpestvirus, das Staupevirus, das Affen-Parainfluenzavirus (SV5), das menschliche Typ I-, II- und III-Parainfluenzavirus der Paramyxoviridae angewendet werden. Das hierin offenbarte Virus kann vorzugsweise ein Virus der Gattung Paramyxovirus oder ein Derivat davon sein. Viren der Gattung Paramyxovirus, auf die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, schließen das menschliche Parainfluenzavirus Typ 1 (HPIV-1), das menschliche Parainfluenzavirus Typ 3 (HPIV-3), das Rinder-Parainfluenzavirus Typ 3 (BPIV-3), das Sendai-Virus (auch Maus-Parainfluenzavirus Typ 1 genannt), das Affen-Parainfluenzavirus Typ 10 (SPIV-10) und viele andere Viren der Gattung Paramyxovirus ein. Das Paramyxovirus ist am meisten bevorzugt ein Sendai-Virus. Diese Viren können Wildtyp-Stämme, mutierte Stämme, von einem Labor stammende Stämme, künstlich konstruierte Stämme oder dergleichen sein. Unvollständige Viren wie das DI-Partikel (Willenbrink W. und Neubert W. J., J. Virol., 1994, 68, 8413–8417), synthetisierte Oligonucleotide und so weiter können als Material zum Herstellen des hierin offenbarten Virus-Vektors verwendet werden.
Gene, die die Proteine eines Paramyxovirus codieren, schließen die NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene ein. Hier repräsentieren die „NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene" jene, die das Nucleocapsidprotein, das Phosphoprotein, das Matrixprotein, das Fusionsprotein, die Hämagglutinin-Neuraminidase beziehungsweise das große Protein codieren. Gene von jedem Virus der Unterfamilie Paramyxovirus werden im Allgemeinen wie folgt beschrieben. Im Allgemeinen kann das NP-Gen auch als „N-Gen" bezeichnet werden.
Zum Beispiel sind die Zugangsnummern in der Nucleotidsequenz-Datenbank von jedem Gen des Sendai-Virus, das als ein Respirovirus der Paramyxoviridae klassifiziert ist, M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046 und X17218 für das NP-Gen; M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007 und X17008 für das P-Gen; D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056 für das M-Gen; D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 und X02131 für das F-Gen; D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131 für das HN-Gen; und D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 und X58886 für das L-Gen.
Hier wird ein „Gen" als eine genetische Substanz definiert, die Nucleinsäuren wie RNA und DNA einschließt. Im Allgemeinen kann ein Gen ein Protein codieren oder nicht. Zum Beispiel kann ein Gen ein Gen sein, das eine funktionelle RNA wie Ribozym, Antisense-RNA usw. codiert. Gene können natürlich abgeleitete oder künstlich gestaltete Sequenzen haben. Hierin wird „Gentransfer" als ein Gen- vermittelter Transfer definiert, und „Gentransfer in das kardiovaskuläre System" schließt das Transferieren der Produkte der Gene in das System ein. Ein „sekretorisches Protein" ist als ein Protein definiert, das außerhalb von Zellen sezerniert wird. Das Protein muss nicht notwendigerweise ein offensichtliches Sekretionssignal haben, so lange es nach außen sezerniert werden kann. Das sekretorische Protein kann ein natürlich abgeleitetes oder künstlich gestaltetes Protein sein. Es ist möglich, ein erwünschtes Protein durch Anfügen eines sekretorischen Signals nach außen zu sezernieren. Ein künstlich gestaltetes Protein kann zum Beispiel ein Fusionsprotein mit einem anderen Protein, einem dominant-negativen Protein, das eine lösliche Form eines Rezeptors einschließt, oder einem Membran-gebundenen dominant-negativen Rezeptor, einer Deletionsform eines Zell-Adhäsionsmoleküls und einer löslichen Form eines Zell-Oberflächenmoleküls sein. Hierin schließt „DNA" eine einzelsträngige DNA oder eine doppelsträngige DNA ein.
Hierin werden Cytokine als alle Proteine und Polypeptide außer Antikörper definiert, die von Zellen sezerniert werden und physiologische Funktionen zeigen, wie die Regulierung des Immunsystems, eine anti-Tumor-Funktion, eine anti-Virus-Funktion oder die Regulierung der Zelldifferenzierung (Aggarwal B. B. und Pocsik E., „Cytokines: from clone to clinic", Arch. Biochem. Biophys., 1992, 292 (2), 335–359). Lymphokine und Monokine sind im Wesentlichen dasselbe wie Cytokine und sind in dem Cytokin der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zusätzlich werden anti-inflammatorische Cytokine als Cytokine definiert, die die Synthese von einem oder mehreren Cytokinen inhibieren, die von irgendeiner der Th1-Zellen, NK-Zellen, Monocyten und Makrophagen (wie INF-γ, TNF-β, IL-2, IL-1, IL-6, IL-8 oder TNF-α) sezerniert werden. Cytokine können natürliche Proteine oder künstlich veränderte Proteine sein. Anti-inflammatorische Cytokine schließen IL-10, IL-4 und IL-12 ein, sind aber nicht darauf limitiert. Die Gene, die jene Cytokine codieren, können durch ein bekanntes Verfahren wie die PCR unter Verwendung von Primern, die basierend auf ihrer Nucleotidsequenz gestaltet sind, hergestellt werden. Am meisten bevorzugt ist das anti-inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung IL-10.
Hierin offenbart ist die Verwendung eines Paramyxovirus-Vektors für den Gentransfer in das kardiovaskuläre System. Die hier genannten Erfinder waren nicht nur im Überexprimieren eines Produkts eines transfizierten Gens an der Stelle der Injektion, sondern auch im Blut durch in vivo-Verabreichung eines Paramyxovirus-Vektors, der ein Fremdgen codiert, erfolgreich. Ein Sendai-Virus-Vektor für die Expression von IL-10 (SeV-IL10), der intranasal durch Schnüffeln an Mäuse verabreicht wurde, wurde in die nasalen Epithelien (Nasenmuschel („turbinate") und die Lunge eingebracht. Das Genprodukt wurde an der Stelle der Injektion überexprimiert, und ein signifikanter Anstieg des IL-10-Spiegels wurde auch im Blut beobachtet. Die Verabreichung durch Perfusion in die nasalen Epithelien (Nasenmuschel) resultierte auch in einem signifikanten Anstieg des IL-10-Spiegels im Blut. Darüber hinaus wurde auch die Verabreichung von SeV-IL10 in einen Skelettmuskel, von dem erwartet wird, dass er eine geeignete Stelle zum Produzieren von sekretorischen Proteinen ist, untersucht. Wenn SeV-IL10 in den vorderen Tibialis (TA)-Muskel verabreicht wurde, war der Spiegel der IL-10-Expression nicht nur im Muskel, der die Stelle der Injektion ist, sondern auch im Blut signifikant erhöht. Zusätzlich inhibierte die intramuskuläre Verabreichung von SeV-IL10 signifikant die Kollagen-Ablagerung in der Lunge von Lungenfibrose-Modellmäusen, die durch Bleomycin-Verabreichung hergestellt wurden. So wurde die therapeutische Wirkung der intramuskulären Injektion von SeV-IL10 auf die Lungenfibrose bestätigt. Der hierin offenbarte Vektor ist äußerst nützlich für den Transfer von therapeutischen Genprodukten in das gesamte kardiovaskuläre System. Zum Beispiel ist es möglich, eine Gentherapie für verschiedene Entzündungserkrankungen durch das Exprimieren eines anti-inflammatorischen Cytokins unter Verwendung des Vektors der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Es ist auch möglich, den Vektor für die Gentherapie unter Verwendung eines Gens, das eine anti-inflammatorische Funktion aufweist, zu verwenden, um die Entzündung zu reduzieren und die Akkumulierung von mukösen Sekretionen zu inhibieren.
Die hier genannten Erfinder zeigten, dass die Gene, die durch intramuskuläre Verabreichung von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren eingebracht wurden, zwei Tage nach der Injektion im Höchstspiegel exprimiert wurden und dass sie über eine Woche persistierend exprimiert wurden. Zusätzlich erhöhte eine wiederholte Verabreichung die Genexpression. Diese Eigenschaften sind vorteilhaft für das Erzielen einer schnellen und anhaltenden therapeutischen Wirkung in der Gentherapie unter Verwendung von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren.
Paramyxovirus-Vektoren können vorzugsweise auch in klinischen Versuchen der Gentherapie beim Menschen in Bezug auf die Sicherheit angewendet werden. Als Erstes ist es eine wesentliche Hürde im hochwirksamen Gentransfer, dass transfizierte DNA für die Expression eines Fremdgens in den Kern transportiert werden muss. Im Fall des Sendai-Virus und dergleichen wird die Expression eines Fremdgens jedoch sowohl durch das zelluläre Tubulin als auch seine RNA-Polymerase (L-Protein) im Cytoplasma gesteuert. Dies legt nahe, dass das Sendai-Virus nicht mit dem Genom der Wirtszellen interagiert, was Sicherheitsprobleme wie die Tumor-Entwicklung vermeidet. Als Zweites ist vom Sendai-Virus bekannt, dass es in Nagern pathogen ist, wobei Lungenentzündung verursacht wird, aber nicht in Menschen, was durch Untersuchungen unterstützt wird, die zeigen, dass die intranasale Verabreichung des Wildtyp-Sendai-Virus in nicht-menschlichen Primaten keinen Schaden anrichtet (Hurwitz J. L. et al., Vaccine, 1997, 15, 533–540). Diese Eigenschaften legen nahe, dass ein Sendai-Virus-Vektor in der Therapie beim Menschen angewendet werden kann, und unterstützen darüber hinaus die Auffassung, dass ein Sendai-Virus eine der Erfolg versprechenden Alternativen in der Gentherapie, die das Übertragen von Produkten eines Fremdgens in das kardiovaskuläre System beabsichtigt, sein kann.
Der entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor kann vorzugsweise in der Gentherapie unter Verwendung von anti-inflammatorischen Cytokinen, die spezifisch auf Entzündungserkrankungen zielen, verwendet werden. Der Paramyxovirus-Vektor zum Exprimieren eines anti-inflammatorischen Cytokins ist besonders für die Behandlung von Entzündungserkrankungen nützlich. Mit anderen Worten, das Einbringen von Genen, die ein anti-inflammatorisches Cytokin codieren, durch die Verwendung des Paramyxovirus-Vektors kann eine Entzündung inhibieren und die Erkrankungssymptome lindern. Die Erkrankungen schließen zum Beispiel Lungenfibrose, sklerosierende Peritonitis, Prostatomegalie, multiple Sklerose, Transplantat-Abstoßung, Typ I-Diabetes, chronischen Gelenkrheumatismus, entzündliche Enteropathie, Psoriasis, systemischen Lupus erythematodes, Iritis, granulomatöse Erkrankungen, chronische Nephritis, Sclerodermis, Hysteromyom, Keloid, Zirrhose und andere Erkrankungen, die von einer Entzündung begleitet werden, ein. Hierin schließt die Behandlung von Erkrankungen die Therapie und Prävention von Erkrankungen ein.
Der für den Gentransfer in das kardiovaskuläre System verwendete Paramyxovirus-Vektor ist nicht auf irgendeine besondere Art limitiert. Zum Beispiel können Vektoren, die die Replikationsfähigkeit aufweisen und die zu autonomer Vermehrung in der Lage sind, vorzugsweise angewendet werden. Im Allgemeinen enthält das Genom des Wildtyp-Paramyxovirus eine kurze 3'-Leaderregion, gefolgt von sechs Genen, die die N (Nucleocapsid)-, P (Phospho)-, M (Matrix)-, F (Fusions)-, HN (Hämagglutinin-Neuraminidase)- und L (großen)-Proteine codieren, und hat eine kurze 5'-Trailerregion am anderen Ende. Der Vektor, der sich autonom replizieren kann, kann durch das Gestalten eines Genoms erhalten werden, das eine ähnliche Struktur wie jene hat, die oben beschrieben ist. Zusätzlich kann ein Vektor zum Exprimieren eines Fremdgens durch Inserieren des Fremdgens in das Genom des obigen Vektors erhalten werden. Der Paramyxovirus-Vektor kann eine veränderte Ausrichtung von Virusgenen im Vergleich zum Wildtyp-Virus haben.
Der Paramyxovirus-Vektor kann eine Deletion oder Deletionen von manchen der Gene aufweisen, die im Wildtyp-Virus enthalten sind. Zum Beispiel wird angenommen, dass im Fall der Wiederherstellung des Sendai-Virus-Vektors die Proteine, die durch die NP-, P/C- und L-Gene codiert werden, in trans benötigt werden, aber die Gene müssen nicht ein Bestandteil des Virus-Vektors sein. Ein Expressionsvektor, der Gene trägt, die die Proteine codieren, kann in Wirtszellen mit einem anderen Expressionsvektor, der das Vektor-Genom codiert, co-transfiziert werden, um einen Virus-Vektor wiederherzustellen. Alternativ wird ein Expressionsvektor, der das Virusgenom codiert, in Wirtszellen transfiziert, die die Gene tragen, die die Proteine codieren, und so kann ein Virus-Vektor unter Verwendung der Proteine, die durch die Wirtszelle geliefert werden, wiederhergestellt werden. Die Aminosäuresequenz dieser Proteine muss nicht identisch zu jenen sein, die vom ursprünglichen Virus abgeleitet wurden, so lange sie eine äquivalente oder höhere Aktivität im Nucleinsäure-Transfer hat, und kann mutiert sein oder durch jene eines homologen Gens oder eines anderen Virus ersetzt werden.
Von den Proteinen, die durch die M-, F- und HN-Gene codiert werden, wird angenommen, dass sie für die Zell-zu-Zell-Vermehrung eines Paramyxovirus-Vektors wesentlich sind. Diese Proteine werden jedoch nicht benötigt, wenn der Vektor als RNP hergestellt wird. Wenn die Gene M, F und HN Bestandteile des Genoms sind, das im RNP enthalten ist, werden die Produkte dieser Gene produziert, wenn es in Wirtszellen eingebracht wird, und Viruspartikel, die eine Infektiosität aufweisen, werden hergestellt. RNP-Vektoren, die ein infektiöses Virus produzieren, schließen ein RNP ein, das eine Virus-Genom-RNA enthält, die die N-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene und die N-, P- und L-Proteine codiert. Wenn solch ein RNP in Zellen eingebracht wird, wird das Virusgenom exprimiert und durch die Funktionen der Proteine N, P und L repliziert, und so werden infektiöse Virus-Vektoren amplifiziert.
Das RNP kann als ein Komplex, der mit Lipofectamin, polykationischen Liposomen und dergleichen gebildet wird, in Zellen eingebracht werden. Insbesondere kann eine Vielzahl von Transfektions-Reagenzien verwendet werden, zum Beispiel DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169). Chloroquin kann zugefügt werden, um die Degradierung im Endosom zu verhindern (Calos M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). Im Fall von sich replizierenden Viren können die produzierten Viren durch Re-Infektion in kultivierte Zellen, Hühnereier oder Tiere (z.B. Säuger wie Mäuse) amplifiziert oder Passagen unterzogen werden.
Im Gegensatz dazu können dem Paramyxovirus-Vektor die M-, F- und/oder HN-Gene fehlen. Diese Vektoren können durch exogenes Liefern der deletierten Genprodukte wiederhergestellt werden. Solche Vektoren können sich noch an Wirtszellen anheften und eine Zellfusion wie der Wildtyp induzieren. Tochtervirus-Partikel, die die selbe Infektiosität wie die ursprünglichen aufweisen, werden jedoch nicht produziert, weil dem Vektorgenom, das in Zellen eingebracht wurde, eines der obigen Gene fehlt. Daher können diese Vektoren als sichere Virus-Vektoren, die nur zu einem einzigen Gentransfer in der Lage sind, nützlich sein. Zum Beispiel können Gene, die vom Genom deletiert werden, die F- und/oder HN-Gene sein. Virus-Vektoren können durch Co-Transfektion eines Expressionsplasmids, das das Genom eines rekombinanten Paramyxovirus, dem das F-Gen fehlt, codiert, eines Expressionsvektors für das F-Protein und jenes für die NP-, P/C- und L-Proteine in Wirtszellen wiederhergestellt werden (WO00/70055 und WO00/70070). Alternativ können Wirtszellen, ein denen das F-Gen in das Chromosom integriert ist, verwendet werden. Die Aminosäuresequenz dieser exogen bereitgestellten Proteine muss nicht identisch zu jenen des Wildtyps sein und kann mutiert oder durch ein homologes Protein eines anderen Virus ersetzt sein, so lange sie eine äquivalente oder höhere Gentransfer-Aktivität liefern.
Das Hüllprotein des Paramyxovirus-Vektors kann ein anderes Protein als das Hüllprotein des ursprünglichen Vektor-Genoms enthalten. Es gibt keine Einschränkung für solche Proteine. Diese können Hüllproteine von anderen Viren wie das G-Protein des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV-G) einschließen. So schließt der Paramyxovirus-Vektor einen Pseudotyp-Virus-Vektor ein, der ein Hüllprotein aufweist, das von einem anderen Virus als dem ursprünglichen Virus stammt.
Der Paramyxovirus-Vektor kann auch auf der Oberfläche seiner Hülle ein Protein haben, das gegen bestimmte Zellen gerichtet ist, wie Adhäsionsmoleküle, Liganden und Rezeptoren oder ein chimäres Protein, das diese Proteine in seiner extrazellulären Domäne und ein Polypeptid, das vom Virus-Hüllprotein abgeleitet ist, in seiner intrazellulären Domäne hat. Es ermöglicht die Produktion eines Vektors, der auf ein bestimmtes Gewebe gerichtet ist. Diese Proteine können durch das Virusgenom selbst codiert oder zur Zeit der Virus-Wiederherstellung durch die Expression von anderen Genen als dem Virusgenom (zum Beispiel einem anderen Expressionsvektor oder einem Wirtszell-Chromosom) bereitgestellt werden.
Die Virus-Gene, die in dem Vektor der Erfindung enthalten sind, können verändert werden, um die Antigenität zu reduzieren oder die RNA-Transkriptions-Effizienz oder die Replikations-Effizienz zu verstärken. Insbesondere ist es möglich, zumindest eines der NP-, P/C- und L-Gene, die Gene von Replikationsfaktoren sind, zu verändern, um die Transkription oder die Replikation zu verstärken. Es ist auch möglich, das HN-Protein, ein strukturelles Protein, das Hämagglutinin-Aktivität und Neuraminidase-Aktivität aufweist, zu verändern, um die Virus-Stabilität im Blut durch Schwächen der ersteren Aktivität zu verstärken und um die Infektiosität durch Verändern der letzteren Aktivität zu regulieren. Es ist auch möglich, das F-Protein zu verändern, das in die Membranfusion einbezogen ist, um die Fusionsfähigkeit zu regulieren. Darüber hinaus ist es möglich, einen Paramyxovirus-Vektor herzustellen, der durch Analysieren der Antigen-präsentierenden Epitope und solcher von möglicherweise antigenen Molekülen auf der Zelloberfläche wie F-Protein und HN-Protein manipuliert ist, um einen schwache Antigenität aufzuweisen.
Zusätzlich kann ein Paramyxovirus, dessen akzessorisches Gen fehlt, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel sinkt durch Ausschalten des V-Gens, einem der akzessorischen Gene von SeV, die Pathogenität von SeV für Wirte wie Mäuse dramatisch ohne Schäden für die Expression und Replikation von Genen in kultivierten Zellen (Kato, A. et al., J. Virol., 1997, 71, 7266–7272; Kato, A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578–587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179 ). Solche abgeschwächten Vektoren werden besonders als Virus-Vektoren für in vivo- oder ex vivo-Gentransfer bevorzugt.
Der hierin offenbarte Virus-Vektor kann ein Fremdgen in der genomischen RNA enthalten. Ein rekombinanter Paramyxovirus-Vektor, der ein Fremdgen enthält, kann durch Inserieren des Gens in das Genom des oben beschriebenen Paramyxovirus-Vektors erhalten werden. Das Fremdgen kann ein Gen sein, das ein erwünschtes Protein, das im Blut exprimiert werden soll, codiert. Es kann ein natürliches Protein oder ein verändertes Protein codieren, das eine Deletion, Substitution oder Insertion aufweist, so lange das Protein eine Funktion hat, die äquivalent zu jener des natürlichen Proteins ist. Alternativ kann es ein künstlich gestaltetes Protein wie eine dominant-negative Mutante sein. Zum Beispiel kann zum Zweck der Gentherapie und dergleichen ein Gen, das verwendet wird, um eine Ziel-Erkrankung zu behandeln, in die DNA inseriert werden, die das Genom des Virus-Vektors (die Virus-Vektor-DNA) codiert. Im Fall des Inserierens eines Fremdgens in die Sendai-Virus-Vektor-DNA wird eine Sequenz, die Nucleotide eines Vielfachen von Sechs umfasst, wünschenswerter zwischen die Transkriptionsend-Sequenz (E) und die Transkriptionsstart-Sequenz (S) inseriert (Calain P. und Roux L., J. Virol., 1993, 67(8), 4822–4830). Ein Fremdgen kann stromaufwärts und/oder stromabwärts von jedem der Virusgene (NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene) inseriert werden. Um nicht mit der Expression von stromaufwärts und stromabwärts liegenden Genen zu interferieren, kann eine E-I-S-Sequenz (Transkriptionsend-Sequenz – dazwischen liegende Sequenz – Transkriptionsstart-Sequenz) oder ein Teil davon passend stromaufwärts oder stromabwärts eines Fremdgens platziert werden, so dass die E-I-S-Sequenz zwischen jedem Gen gelegen ist. Alternativ kann ein Fremdgen mit IRES inseriert werden.
Der Expressionsspiegel von inserierten Genen kann durch den Typ der Transkriptionsstart-Sequenz, die stromaufwärts der Gene angelagert ist, reguliert werden (WO01/18223). Er kann auch durch die Position der Insertion und die Sequenz, die das Gen umgibt, reguliert werden. Im Sendai-Virus wird zum Beispiel der Expressionsspiegel des inserierten Gens umso höher sein, je näher die Insertionsposition zum 3'-Ende der Negativstrang-RNA des Virusgenoms (je näher zum NP-Gen in der Gen-Anordnung auf dem Wildtyp-Virusgenom) ist. Um eine hohe Expression eine Fremdgens zu erzielen, wird es vorzugsweise in die stromaufwärts-liegende Region des Negativstrang-Genoms wie stromaufwärts des NP-Gens (3'-flankierende Region auf dem negativen Strang) oder zwischen die NP- und P-Gene inseriert. Umgekehrt wird der Expressionsspiegel des inserierten Gens umso niedriger sein, je näher die Insertionsposition zum 5'-Ende der Negativstrang-RNA (je näher zum L-Gen in der Gen-Anordnung auf dem Wildtyp-Virusgenom) ist. Um die Expression eines Fremdgens zu reduzieren, kann es in die äußerst 5'-gelegene Position auf dem Negativstrang, das heißt stromabwärts des L-Gens im Wildtyp-Virusgenom (5'-flankierende Region des L-Gens auf dem Negativstrang) oder stromaufwärts des L-Gens (3'-flankierende Region des L-Gens auf dem Negativstrang) inseriert werden. So kann die Insertionsposition eines Fremdgens richtig angepasst werden, um einen erwünschten Expressionsspiegel des Gens zu erhalten oder um die Kombination der Insertion mit den Virusgenen, die es umgeben, zu optimieren. Zum Beispiel, wenn die Überexpression eines Gens, das durch einen Virus-Vektor mit hohem Titer eingebracht wurde, Toxizität verursachen kann, ist es möglich, nicht nur den Virustiter zu kontrollieren, sondern auch den Expressionsspiegel von individuellen Vektoren durch Konstruktion der Insertionsposition näher an das 5'-Ende des Negativstrangs oder Ersetzen der Transkriptionsstart-Sequenz durch eine, die eine niedrigere Wirksamkeit hat, zu reduzieren, um einen geeigneten therapeutischen Effekt zu erzielen.
Um die einfache Insertion eines Fremdgens zu unterstützen, kann eine Clonierungsstelle an der Position der Insertion konstruiert werden. Zum Beispiel kann die Clonierungsstelle die Erkennungssequenz von Restriktionsenzymen sein. Die Restriktionsstellen in der Virus-Vektor-DNA können verwendet werden, um ein Fremdgen zu inserieren. Die Clonierungsstelle kann eine Multiclonierungsstelle sein, die Erkennungssequenzen für mehrere Restriktionsenzyme enthält. Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann andere Fremdgene an anderen Positionen als jenen haben, die für die obige Insertion verwendet wurden. Solche Fremdgene sind nicht beschränkt, aber können andere anti-inflammatorische Cytokin-Gene sein oder können andere Arten von Genen sein.
Die Konstruktion eines rekombinanten Sendai-Virus-Vektors, der ein Fremdgen aufweist, kann wie folgt durchgeführt werden, zum Beispiel gemäß dem beschriebenen Verfahren (Hasan M. K. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813–2820; Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578–587; Yu D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457–466).
Als erstes wird eine DNA-Probe, die die cDNA-Nucleotidsequenz eines erwünschten Fremdgens umfasst, hergestellt. Es wird bevorzugt, dass die DNA-Probe elektrophoretisch als ein einzelnes Plasmid in Konzentrationen von 25 ng/μl oder mehr identifiziert werden kann. Unten wird ein Fall, bei dem ein Fremdgen in die DNA, die das virale Genom codiert, unter Ausnutzung einer NotI-Stelle inseriert wird, als ein Beispiel beschrieben werden. Wenn die NotI-Erkennungsstelle in die Ziel-cDNA-Nucleotidsequenz eingeschlossen ist, wird es bevorzugt, die NotI-Stelle vorher durch Modifizieren der Nucleotidsequenz unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese und solchen Verfahren zu deletieren, so dass die Aminosäuresequenz, die durch die cDNA codiert wird, nicht verändert wird. Von dieser DNA-Probe wird das erwünschte Genfragment durch PCR amplifiziert und gewonnen. Um NotI-Stellen an beiden Enden des amplifizierten DNA-Fragments zu haben und um darüber hinaus eine Kopie der Transkriptionsterminierungs-Sequenz (E), der dazwischen liegenden Sequenz (I) und der Transkriptionsstart-Sequenz (S) (EIS-Sequenz) des Sendai-Virus an ein Ende hinzuzufügen, werden eine synthetische Vorwärts-DNA-Sequenz (Sense-Strang) und eine synthetische Reverse-DNA-Sequenz (Antisense-Strang) als ein Paar von Primern hergestellt, die eine NotI-Restriktionsenzym-Spaltungsstellensequenz, eine Transkriptionsterminierungs-Sequenz (E), eine dazwischen liegende Sequenz (I), eine Transkriptionsstart-Sequenz (S) und eine teilweise Sequenz des Zielgens enthalten.
Zum Beispiel wird, um Spaltung durch NotI zu sichern, die synthetische Vorwärts-DNA-Sequenz in einer Form angeordnet, in der jegliche zwei oder mehr Nucleotide (vorzugsweise 4 Nucleotide außer GCG und GCC, Sequenzen, die von einer NotI-Erkennungsstelle stammen, mehr bevorzugt ACTT) auf der 5'-Seite der synthetischen DNA ausgewählt werden, die NotI-Erkennungsstelle „gcggccgc" wird an ihre 3'-Seite angefügt, und an die 3'-Seite davon werden irgendwelche erwünschten 9 Nucleotide oder Nucleotide von 9 plus ein Vielfaches von 6 Nucleotiden als die Spacersequenz angefügt, und an die 3'-Seite davon wird ein etwa 25 Nucleotide langer, äquivalenter ORF einschließlich des Startcodons ATG der erwünschten cDNA angefügt. Es wird bevorzugt, etwa 25 Nucleotide von der erwünschten cDNA als die synthetische Vorwärts-DNA-Sequenz auszuwählen, um ein G oder ein C als das finale Nucleotid an ihrem 3'-Ende zu haben.
In der synthetischen reversen DNA-Sequenz werden jegliche zwei oder mehr Nucleotide (vorzugsweise 4 Nucleotide außer GCG und GCC, Sequenzen, die von der NotI-Erkennungsstelle stammen, stärker bevorzugt ACTT) auf der 5'-Seite der synthetischen DNA ausgewählt, die NotI-Erkennungsstelle „gcggccgc" wird an ihre 3'-Seite angefügt, und an ihre noch weiter 3' gelegene Seite wird eine Oligo-DNA als das Insertionsfragment angefügt, um die Länge anzupassen. Diese Oligo-DNA ist so gestaltet, dass die gesamte Nucleotidzahl einschließlich der NotI-Erkennungsstelle „gcggccgc", der komplementären Sequenz von cDNA und der EIS-Nucleotidsequenz des Sendai-Virusgenoms, das im unten beschriebenen Virus seinen Ursprung nimmt, ein Vielfaches von Sechs wird (so genannte „Sechser-Regel"; Kolakofski D. et al., J. Virol., 1998, 72, 891–899; Calain P. und Roux L., J. Virol., 1993, 67, 4822–4830; Calain, P. und Roux, L., J. Virol., 1993, 67, 4822–4830). Weiter auf der 3'-Seite des inserierten Fragments werden eine Sequenz, die komplementär zu der S-Sequenz des Sendai-Virus ist, vorzugsweise 5'-CTTTCACCCT-3' (SEQ ID NO: 1), eine Sequenz, die komplementär zu der I-Sequenz, vorzugsweise 5'-AAG-3', ist, und eine Sequenz, die komplementär zu der E-Sequenz ist, vorzugsweise 5'-TTTTTCTTACTACGG-3' (SEQ ID NO: 2), angefügt, und weiter auf der 3'-Seite davon wird eine etwa 25 Nucleotide lange, äquivalente Komplementärsequenz, die in der umgekehrten Richtung vom Stoppcodon der erwünschten cDNA-Sequenz gezählt wird und deren Länge angepasst ist, um ein G oder ein C als das finale Nucleotid zu haben, ausgewählt und als das 3'-Ende der synthetischen reversen DNA angefügt.
PCR kann gemäß dem üblichen Verfahren mit zum Beispiel ExTaq-Polymerase (Takara Shuzo) durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die PCR unter Verwendung der Vent-Polymerase (NEB) durchgeführt, und die so amplifizierten erwünschten Fragmente werden mit NotI verdaut, dann in die NotI-Stelle des Plasmid-Vektors pBluescript inseriert. Die so erhaltenen Nucleotidsequenzen der PCR-Produkte werden mit einem Sequenziergerät bestätigt, um ein Plasmid auszuwählen, das die richtige Sequenz hat. Das inserierte Fragment wird aus dem Plasmid unter Verwendung von NotI ausgeschnitten und in die NotI-Stelle des Plasmids, das die genomische cDNA trägt, cloniert. Alternativ ist es auch möglich, die rekombinante Sendai-Virus-cDNA durch direktes Inserieren des Fragments in die NotI-Stelle ohne die Vermittlung des Plasmid-Vektors pBluescript zu erhalten.
Zum Beispiel kann eine rekombinante, genomische Sendai-Virus-cDNA gemäß den Verfahren in der Literatur konstruiert werden (Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578–598; Hasan M. K. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813–2820; Yu, D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457–466). Zum Beispiel wird eine Spacersequenz von 18 bp, die die NotI-Stelle (5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; SEQ ID NO: 3) enthält, in einen benachbarten Gen-Locus einer clonierten, genomischen Sendai-Virus-cDNA (pSeV(+)) zwischen die Leadersequenz und das 5'-Ende einer Sequenz, die das N-Protein codiert, inseriert, und das Plasmid pSeV18⁺b(+), das eine selbst-spaltbare Ribozym-Stelle enthält, die vom anti-genomischen Strang des Delta-Hepatitis-Virus stammt, wird erhalten (Hasan M. K. et al., J. General Virol., 1997, 78, 2813–2820). Ein Fremdgen-Fragment wird in die NotI-Stelle von pSeV18⁺b(+) inseriert, um eine rekombinante Sendai-Virus-cDNA zu erhalten, in die ein erwünschtes Fremdgen inseriert worden ist.
Eine rekombinante Paramyxovirus-Vektor-DNA wird in vitro oder in Zellen transkribiert, und ein RNP wird in der Anwesenheit der L-, P- und NP-Proteine wiederhergestellt, um einen Virus-Vektor herzustellen, der das RNP umfasst. Ein Verfahren zum Produzieren des Paramyxovirus-Vektors kann das Transkribieren einer DNA, die das Genom des Virus-Vektors codiert, umfassen. Eine DNA zum Produzieren des Paramyxovirus-Vektors kann die DNA umfassen, die das Genom des Virus-Vektors codiert. Die Verwendung einer DNA, die das Genom des Vektors codiert, um den Paramyxovirus-Vektor der Erfindung zu produzieren, ist auch hierin offenbart. Die Wiederherstellung eines Virus aus einer Virus-Vektor-DNA kann gemäß den bekannten Verfahren (WO97/16539; WO97/16538; Durbin A. P. et al., Virol., 1997, 235, 323–332; Whelan S. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 8388–8392; Schnell M. J. et al., EMBO J., 1994, 13, 4195–4203; Radecke F. et al., EMBO J., 1995, 14, 5773–5784; Lawson N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4477–4481; Garcin D. et al., EMBO J., 1995, 14, 6087–6094; Kato A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579; Baron M. D. und Barrett T., J. Virol., 1997, 71, 1265–1271; Bridgen A. und Elliott R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15400–15404) durchgeführt werden. Diese Verfahren ermöglichen die Wiederherstellung von erwünschten Paramyxovirus-Vektoren einschließlich der Parainfluenzavirus-, vesikulären Stomatitis-Virus-, Tollwutvirus-, Masernvirus-, Rinderpestvirus-, Sendai-Virus-Vektoren usw. aus DNA. Wenn eine virale Vektor-DNA hergestellt wird, der die F-, HN- und/oder M-Gene fehlen, werden keine infektiösen Virus-Partikel mit solch einem defekten Vektor gebildet. Es ist dennoch möglich, infektiöse Virus-Partikel durch getrenntes Transferieren von diesen fehlenden Genen, Genen, die andere virale Hüllproteine codieren, und dergleichen in Wirtszellen zu bilden und sie darin zu exprimieren.
Verfahren für das Transferieren von viraler Vektor-DNA in Zellen schließen die folgenden ein: 1) das Verfahren der Herstellung von DNA-Präzipitaten, die durch Zielzellen aufgenommen werden können; 2) das Verfahren der Herstellung eines positiv geladenen Komplexes, der DNA umfasst, der geeignet ist, durch Zielzellen aufgenommen zu werden, und auch nicht sehr cytotoxisch ist, und 3) das Verfahren der unmittelbaren Lochung von Poren auf der zellulären Zielmembran, die weit genug sind, um DNA-Molekülen zu erlauben, bei einem elektrischen Puls hindurch zu passieren.
Im Verfahren 2) kann eine Vielzahl von Transfektions-Reagenzien verwendet werden, Beispiele sind DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169) usw. Ein Beispiel vom Verfahren 1) ist ein Transfektions-Verfahren unter Verwendung von Calciumphosphat, bei dem die DNA, die in die Zellen eingedrungen ist, in Phagosomen eingebaut wird, und eine ausreichende Menge wird auch in die Kerne eingebaut (Graham, F. L. und Van Der Eb, J. Virologie, 1973, 52, 456; Wigler, M. und Silverstein, S., Cell, 1977, 11, 223). Chen und Okayama haben die Optimierung der Transfer-Technik untersucht und berichtet, dass optimale DNA-Präzipitate unter Bedingungen erhalten werden können, unter denen 1) die Zellen mit der DNA in einer Atmosphäre von 2 bis 4% CO₂ bei 35°C für 15 bis 24 h inkubiert werden, 2) zyklische DNA mit einer höheren Präzipitat-Bildungs-Aktivität als lineare DNA verwendet wird und 3) die optimale DNA-Konzentration im Präzipitat-Gemisch 20 bis 30 μg/ml ist (Chen, C. und Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). Das Verfahren 2) ist geeignet für eine transiente Transfektion. Ein altes Verfahren ist auf dem Fachgebiet bekannt, bei dem ein DEAE-Dextran (Sigma #D-9885, MG 5 × 10⁵)-Gemisch in einem erwünschten DNA-Konzentrations-Verhältnis hergestellt wird, um die Transfektion durchzuführen. Da die meisten Komplexe in den Endosomen abgebaut werden, kann Chloroquin zugefügt werden, um die Transfektions-Wirksamkeit zu verstärken (Calos M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). Das Verfahren 3) wird als Elektroporation bezeichnet und ist im Vergleich zu den Verfahren 1) und 2) vielseitiger, da es keine Zell-Selektivität hat. Vom Verfahren 3) wird gesagt, dass es unter optimalen Bedingungen für die Dauer des elektrischen Pulsstroms, die Puls-Form, die elektrische Feld-Potenz (Abstand zwischen den Elektroden, Spannung), die Leitfähigkeit der Puffer, die DNA-Konzentration und Zelldichte wirksam ist.
Unter den oben beschriebenen drei Kategorien sind in der vorliegenden Erfindung die Transfektions-Reagenzien (Verfahren 2) geeignet, weil das Verfahren 2) leicht durchführbar ist und das Untersuchen von vielen Testproben unter Verwendung einer großen Menge von Zellen ermöglicht. Vorzugsweise wird das Superfect Transfection Reagent (QIAGEN, Kat. Nr. 301305) oder das DOSPER Liposomal Transfections Reagent (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1811169) verwendet, aber die Transfektions-Reagenzien sind nicht darauf beschränkt.
Insbesondere kann die Wiederherstellung des viralen Vektors aus cDNA wie folgt durchgeführt werden.
Eine von Affen-Nieren abgeleitete Zelllinie LLC-MK2 wird in Plastikkulturschalen mit 24 Vertiefungen bis 6 Vertiefungen oder Kulturschalen mit 100 mm Durchmesser oder dergleichen unter Verwendung eines minimalen essentiellen Mediums (MEM), enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) und Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin) zu 70 bis 80% Konfluenz kultiviert und zum Beispiel bei 2 PBE/Zelle mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vTF7-3 infiziert, das T7-Polymerase exprimiert und das durch eine UV-Bestrahlungsbehandlung für 20 min in der Anwesenheit von 1 μg/ml Psoralen inaktiviert worden ist (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122–8126, 1986; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569–579, 1996). Die Menge des zugefügten Psoralens und die UV-Bestrahlungsdauer können entsprechend angepasst werden. Eine Stunde nach der Infektion werden die Zellen mit 2 bis 60 μg, stärker bevorzugt 3 bis 5 μg der oben beschriebenen rekombinanten Sendai-Virus-cDNA durch das Lipofektions-Verfahren oder dergleichen unter Verwendung von Plasmiden (24 bis 0,5 μg pGEM-N, 12 bis 0,25 μg pGEM-P und 24 bis 0,5 μg pGEM-L, mehr bevorzugt 1 μg pGEM-N, 0,5 μg pGEM-P und 1 μg pGEM-L) (Kato, A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579), die die trans-wirkenden viralen Proteine exprimieren, die für die Produktion des viralen Volllängen-Sendai-Genoms zusammen benötigt werden, mit Superfect (QIAGEN) transfiziert. Die transfizierten Zellen werden in einem serumfreien MEM, enthaltend je 100 μg/ml Rifampicin (Sigma) und Cytosin-Arabinosid (AraC), wenn gewünscht, stärker bevorzugt enthaltend nur 40 μg/ml Cytosin-Arabinosid (AraC) (Sigma), kultiviert, und die Konzentrationen der Reagenzien werden im Optimum festgesetzt, um die Cytotoxizität aufgrund des Vaccinia-Virus zu minimieren und die Gewinnungsrate des Virus zu maximieren (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579). Nach dem Kultivieren für etwa 48 bis 72 h nach der Transfektion werden die Zellen gewonnen, durch Wiederholen von drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen aufgebrochen, in LLC-MK2-Zellen transfiziert und kultiviert. Nach dem Kultivieren der Zellen für 3 bis 7 Tage wird die Kulturlösung gesammelt. Um einen Virus-Vektor, dem ein Gen fehlt, das ein Hüllprotein codiert, und der nicht zur Replikation in der Lage ist, wiederherzustellen, kann der Vektor in LLC-MK2-Zellen, die ein Hüllprotein exprimieren, transfiziert oder mit einem Expressionsplasmid für das Hüllprotein co-transfiziert werden. Alternativ können die LLC-MK2-Zellen, die ein Hüllprotein exprimieren, auf transfizierte Zellen überschichtet und kultiviert werden, um einen Deletions-Virus-Vektor zu vermehren (WO00/70055 und WO00/70070). Der Virus-Titer, der im Kulturüberstand enthalten ist, kann durch Messen der Hämagglutinations-Aktivität (HA), die durch das „Endpunkt-Verdünnungsverfahren" (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579; Yonemitsu Y. und Kaneda Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells., Molecular Biology of Vascular Diseases. Methods in Molecular Medicine, Hrsg. Baker A. H., Humana Press, 1999, 295–306) getestet werden kann, bestimmt werden. Die mögliche Kontamination von Vaccinia-Virus vTF7-3 kann durch Re-Amplifizieren in Hühnereiern eliminiert werden, nachdem die erhaltene Allantois-Probe entsprechend verdünnt wird (zum Beispiel 10⁶-mal). Die Re-Amplifikation kann zum Beispiel dreimal oder öfter wiederholt werden. Der so erhaltene Virus-Bestand kann bei –80°C gelagert werden.
Der Typ der Wirtszellen, die für die Virus-Wiederherstellung verwendet werden, ist nicht besonders eingeschränkt, so lange der virale Vektor darin wiederhergestellt werden kann. Zum Beispiel können kultivierte Zellen wie von Affen-Nieren abgeleitete CV-1-Zellen und LLC-MK2-Zellen, von Hamster-Nieren abgeleitete BHK-Zellen, von Menschen abgeleitete Zellen und so weiter verwendet werden. Um den Sendai-Virus-Vektor in einer großen Menge zu erhalten, kann der Vektor zum Beispiel durch Infizieren des von den oben-beschriebenen Wirtszellen erhaltenen Virus-Vektors in embryonierte Hühnereier amplifiziert werden. Verfahren zum Herstellen von viraler Flüssigkeit unter Verwendung von Hühnereiern sind bereits entwickelt worden (Nakanishi, et al. (Hrsg.), 1993, „Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III (High Technology Protocol III of Neuroscience Research), Molecular Neurocyte Physiology, Koseisha, Osaka, S. 153–172). Insbesondere werden zum Beispiel befruchtete Eier in einen Brutschrank platziert und für 9 bis 12 Tage bei 37 bis 38°C inkubiert, um Embryonen zu züchten. Der Sendai-Virus-Vektor wird in die Allantoishöhle von Eiern geimpft und für einige Tage kultiviert, um das Virus zu vermehren. Bedingungen wie die Kulturdauer können abhängig vom Typ des verwendeten rekombinanten Sendai-Virus variiert werden. In der Folge wird die Allantoisflüssigkeit, umfassend das Virus, gewonnen. Die Trennung und Aufreinigung des Sendai-Virus-Vektors kann gemäß Standardverfahren (Tashiro, M., „Virus Experiment Protocols", Nagai und Ishihama (Hrsg.), Medicalview, 1995, 68–73) durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann ein Sendai-Virus-Vektor, dem das F-Protein fehlt, wie folgt konstruiert und hergestellt werden (WO00/70055 und WO00/70070).
(1) Konstruktion der Sendai-Virus-Genom-cDNA, der das F-Gen fehlt, und eines Expressionsplasmids für das F-Gen
Die genomische Volllängen-Sendai-Virus(SeV)-cDNA pSeV18⁺b(+) (Hasan M. K. et al., J. General Virol., 1997, 78, 2813–2820) (pSeV18⁺b(+) kann auch SeV18⁺ genannt werden) wird mit SphI und KpnI verdaut, und das resultierende Fragment (14673 bp) wird gewonnen und in pUC18 cloniert, um pUC18/KS zu erhalten. pUC18/KS wird für die Konstruktion einer Region verwendet, der das F-Gen fehlt. Die Deletion des F-Gens wird durch die Kombination einer PCR-Ligierung durchgeführt, und der ORF des F-Gens (1698 bp, von ATG zu TGA) wird durch die Sequenz 5'-atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 4) in der resultierenden F-Gen-deletierten genomischen SeV-cDNA (pSeV18⁺/ΔF) ersetzt. Die PCR-Produkte, die unter Verwendung der Primer (vorwärts: 5'-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO: 5; rückwärts: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO: 6) erhalten werden, und jene, die mit den Primern (vorwärts: 5'-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO: 7; rückwärts: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO: 8) erhalten werden, werden mit EcoT22I verdaut und stromaufwärts beziehungsweise stromabwärts des F-Gens hinein cloniert. Das resultierende Plasmid wird mit SacI und SalI verdaut, und das Fragment, das die F-Gen-Deletionsstelle (4931 bp) enthält, wird gewonnen und in pUC18 cloniert, um pUC18/dFSS zu erhalten. pUC18/dFSS wird mit DraIII verdaut, und das gewonnene Fragment wird durch das DraIII-Fragment von pSeV18⁺ ersetzt, das das F-Gen enthält, und ligiert, um pSeV18⁺/ΔF zu erhalten.
Ein Fremdgen kann in die NsiI- oder NgoMIV-Stelle in der F-Gen-Deletionsstelle von pUC18/dFSS inseriert werden. Zu diesem Zweck kann ein Fragment, das ein Fremdgen enthält, unter Verwendung von Primern mit NsiI-Stellen-Anhängen oder Primern mit NgoMIV-Stellen-Anhängen amplifiziert werden.
(2) Herstellung von Helferzellen für die induzierbare Expression des SeV-F-Proteins
Ein Cre/loxP-induzierbares Expressionsplasmid für das Sendai-Virus-F-Gen (SeV-F) wird wie folgt konstruiert. Das SeV-F-Gen wird durch PCR amplifiziert und in die einmalige SwaI-Stelle des pCALNdLw-Plasmids (Arai T. et al., J. Virol., 1998, 72, 1115–1121) cloniert, das für die induzierbare Expression der Genprodukte durch die Funktion der Cre-DNA-Rekombinase gestaltet ist, um pCALNdLw/F zu erhalten.
Um infektiöse Viruspartikel des F-Gen-deletierten Genoms zu gewinnen, wird eine Helferzelllinie, das das SeV-F-Protein exprimiert, etabliert. LLC-MK2-Zellen, die von der Affenniere abgeleitet sind und häufig für die SeV-Vermehrung verwendet werden, können verwendet werden. LLC-MK2-Zellen werden bei 37°C, 5% CO₂ in MEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes und immobilisiertes fötales Rinderserum (FBS), 50 E/ml Natrium-Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycin, kultiviert. Wegen der Cytotoxizität des SeV-F-Genprodukts wird das Gen in pCALNdLw cloniert, wo die Expression eines clonierten Gens durch die Cre-DNA-Rekombinase induzierbar ist. Das obige pCALNdLw/F wird für das Transfizieren von LLC-MK2-Zellen durch das Calciumphosphat-Verfahren (Säuger-Transfektions-Kit (Stratagene)) gemäß dem Standardprotokoll verwendet.
LLC-MK2-Zellen, die in 10 cm-Schalen bis zu 40% Konfluenz kultiviert wurden, werden mit 10 μg pCALNdLw/F transfiziert und in 10 ml MEM, enthaltend 10% FBS, bei 37°C unter 5% CO₂ für 24 h inkubiert. Dann werden die Zellen dispergiert, in 10 ml Kulturmedium resuspendiert und auf fünf 10 cm-Schalen plattiert, wobei 5 ml der Zellsuspension auf eine Schale, 2 ml auf zwei und 0,2 ml auf zwei plattiert werden. Die Zellen werden in 10 ml MEM, enthaltend 10% FBS plus 1200 μg/ml G418 (GIBCO-BRL), für 14 Tage mit Mediumwechsel alle zwei Tage kultiviert, und stabile Transfektanten werden selektiert. Zellen, die in dem Medium gezüchtet werden, die resistent gegen G418 sind, werden unter Verwendung von Clonierungsringen gewonnen. Zellen von jedem Clon werden weiter kultiviert, bis sie in einer 10 cm-Schale zu 100% Konfluenz gewachsen sind.
Um die F-Protein Expression zu induzieren, werden die Zellen in 6 cm-Schalen gezüchtet, um 100% konfluent zu sein, und mit AxCANCre-Adenovirus bei MOI = 3 gemäß dem Verfahren von Saito et al. (Salto et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 3816–3821; Arai T. et al., J. Virol., 1998, 72, 1115–1121) infiziert.
(3) Wiederherstellung und Vermehrung des F-Gen-deletierten SeV-Virus
Das pSeV18⁺/ΔF, in das ein Fremdgen inseriert worden ist, wird wie folgt in LLC-MK2-Zellen transfiziert. Die Zellen werden zu 5 × 10⁶ Zellen/Schale auf 100 mm-Petrischalen plattiert, für 24 h kultiviert und dann bei Zimmertemperatur für 1 h mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert, das T7-RNA-Polymerase exprimiert und das mit Psoralen und langem UV (365 nm) für 20 min behandelt worden ist (Fuerst T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8122–8126) (MOI = 2 bis 3; vorzugsweise MOI = 2). Die UV-Bestrahlung kann unter Verwendung des UV Stratalinker 2400, der mit fünf 15 Watt-Lampen ausgestattet ist (Katalognummer 400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA) durchgeführt werden. Nachdem die Zellen dreimal gewaschen sind, werden die Plasmide pSeV18⁺/ΔF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L (Kato A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579) mit OptiMEM (GIBCO) in einem Verhältnis von 12 μg/Schale, 4 μg/Schale, 2 μg/Schale beziehungsweise 4 μg/Schale resuspendiert und mit dem SuperFect-Transfektions-Reagenz gemischt (5 μl SuperFect (QIAGEN) für 1 μg DNA). Das Gemisch wird für 10 min bei Zimmertemperatur inkubiert, dann mit 3 ml OptiMEM mit einer Endkonzentration von 3% FBS resuspendiert und zu den Zellen hinzugefügt. Nach einer 3 h-Kultur in einem Brutschrank werden die Zellen zweimal mit serumfreiem MEM gewaschen und weiter in MEM, enthaltend 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) und 7,5 μg/ml Trypsin (GIBCO), für 70 h kultiviert. Dann werden die Zellen gesammelt und in OptiMEM zu 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen werden dreimal gefroren und wieder aufgetaut, dann mit dem Lipofektions-Reagenz DOSPER (Boehringer Mannheim) gemischt (10⁶ Zellen pro 25 μl DOSPER), bei Zimmertemperatur für 15 min inkubiert und in LLC-MK2/F7-Zellen transfiziert (10⁶ Zellen/Vertiefung in einer Schale mit 12 Vertiefungen), die einer der Clone der F-Gen-exprimierenden Helferzellen sind, die, wie oben beschrieben, selektiert wurden. Die Zellen werden in serumfreiem MEM, enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin, kultiviert, und der Kulturüberstand wird geerntet.
Beim Herstellen von Deletionsvirus-Vektoren werden zwei Typen von Vektoren, in denen das vom viralen Genom fehlende Hüllgen anders ist, in die selbe Zelle transferiert. In diesem Fall wird das Hüllprotein, das in einem Vektor fehlt, durch die Expression des anderen Vektors bereitgestellt, um sich gegenseitig zu komplementieren, was so zu der Bildung von infektiösen Viruspartikeln und der Aktivierung des Replikationszyklus führt, um die viralen Vektoren zu amplifizieren. Das heißt, wenn zwei oder mehrere Typen von Vektoren in Zellen in Kombinationen geimpft werden, um die jeweils anderen Hüllproteine zu komplementieren, können Gemische von Virus-Vektoren, denen die jeweiligen Hüllgene fehlen, in einer großen Menge bei niedrigen Kosten produziert werden. Aufgrund des Fehlens von Hüllgenen haben diese Viren eine kleinere Genomgröße im Vergleich zum vollständigen Virus, dadurch können sie ein langes Fremdgen beherbergen. Darüber hinaus, da diese ursprünglich nicht-infektiösen Viren extrazellulär verdünnt werden und es schwierig ist, ihre Co-Infektion zu bewahren, werden sie steril, was vorteilhaft für die Bewerkstelligung ihrer Freisetzung in die Umwelt ist.
Wenn ein Vektor hergestellt wird, der ein therapeutisches Gen für eine bestimmte Erkrankung als das Fremdgen verwendet, kann die Gentherapie durch Verabreichen dieses Vektors durchgeführt werden. Der Virus-Vektor der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Expression eines Fremdgens, das helfen kann, eine Erkrankung zu heilen, eines endogenen Gens, das in Patienten fehlt oder unzureichend ist, entweder durch direkte Verabreichung oder indirekte Verabreichung (ex vivo). Ein Fremdgen ist nicht limitiert und kann jene einschließen, die ein sekretorisches Protein codieren, das wünschenswerterweise in das kardiovaskuläre System sezerniert wird. Humorale Faktoren wie verschiedene Cytokine, Hormone, Wachstumsfaktoren und dergleichen sind Beispiele. Es wird bevorzugt, dass ein anti-inflammatorisches Cytokin-Gen als das Fremdgen für die Behandlung von Entzündungserkrankungen verwendet wird.
Gewonnene Paramyxoviren können so aufgereinigt werden, dass sie im Wesentlichen rein sind. Die Aufreinigung kann durch bekannte Aufreinigungs- und Separationsverfahren, einschließlich Filtration, Zentrifugation, säulen-chromatographische Aufreinigung und dergleichen oder durch Kombinationen davon durchgeführt werden. Der hierin verwendete Ausdruck „im Wesentlichen rein" bedeutet, dass das Virus den Hauptanteil als ein Bestandteil der Probe, in der das Virus vorhanden ist, einnimmt. Typischerweise können im Wesentlichen reine Virus-Vektoren durch Bestätigen, dass das Verhältnis der Virus-abgeleiteten Proteine zu den Gesamtproteinen in der Probe 50% oder mehr, vorzugsweise 70% oder mehr, mehr bevorzugt 80% oder mehr und noch mehr bevorzugt 90% oder mehr einnimmt, nachgewiesen werden. Genau gesagt, kann ein Paramyxovirus zum Beispiel durch ein Verfahren, in dem ein Cellulosesulfatester oder ein kreuzvernetzter Polysaccharid-Sulfatester verwendet wird (Geprüfte Veröffentlichte Japanische Patent-Anmeldung (JP-B) No. Sho 62-30752; JP-B Sho 62-33879; JP-B Sho 62-30753), ein Verfahren, in dem die Adsorption an ein Fucosesulfat-enthaltendes Polysaccharid und/oder ein Abbauprodukt davon verwendet wird (WO97/32010), usw. aufgereinigt werden.
Der Paramyxovirus-Vektor kann als eine Zusammensetzung zusammen mit einem erwünschten, pharmazeutisch verträglichen Träger hergestellt werden. Hierin wird ein „pharmazeutisch verträglicher Träger" als ein Material definiert, das mit einem Vektor verabreicht werden kann, aber nicht den Gentransfer durch den Vektor verhindert. Zum Beispiel kann der Paramyxovirus-Vektor in geeigneter Weise mit Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dergleichen verdünnt werden, um eine Zusammensetzung herzustellen. Wenn die Paramyxovirus-Vektoren dieser Erfindung in Hühnereiern und dergleichen vermehrt werden, kann die Zusammensetzung Allantoisflüssigkeit enthalten. Zusammensetzungen, umfassend die Paramyxovirus-Vektoren dieser Erfindung, können physiologisch verträgliche Medien wie deionisiertes Wasser, 5% wässrige Dextroselösung und dergleichen enthalten, und darüber hinaus können auch andere Stabilisatoren und Antibiotika enthalten sein. Die Zusammensetzung kann als ein Arzneimittel verwendet werden. So bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung des Vektors oder der obigen Zusammensetzung als ein Pharmazeutikum, wie oben beschrieben.
Genau gesagt schließt die Zusammensetzung, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein:

(1) eine Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, umfassend den hierin offenbarten Paramyxovirus-Vektor oder Zellen, die den Vektor enthalten, wobei das Genprodukt des Vektors in eine Stelle eingebracht wird, die verschieden ist von der Stelle der Injektion durch den Blutstrom;
(2) die Zusammensetzung für die Behandlung einer Entzündungserkrankung von (1), wobei der Vektor ein Fremdgen enthält;
(3) die Zusammensetzung von (2), wobei das Fremdgen ein Cytokin-Gen ist;
(4) die Zusammensetzung von (3), wobei das Cytokin ein anti-inflammatorisches Cytokin ist;
(5) die Zusammensetzung von (4), wobei das anti-inflammatorische Cytokin IL-10 ist;
(6) die Zusammensetzung von (1) und (5), wobei die Entzündungserkrankung eine Lungenfibrose ist;
(7) die Zusammensetzung von einer von (1) bis (6), die intramuskulär verabreicht wird; und
(8) die Zusammensetzung von einer von (1) bis (7), wobei das Paramyxovirus ein Sendai-Virus ist.

Der obige Paramyxovirus-Vektor oder eine Zusammensetzung, umfassend den Vektor, wird verabreicht, um ein Fremdgen, das im Vektor gemäß der Definition der Ansprüche beherbergt ist, zu transduzieren.
Die Stelle der Verabreichung ist die intramuskuläre Verabreichung (IM). Der Vektor kann in vivo oder ex vivo und an eine einzige Stelle oder mehrere Stellen verabreicht werden. Zusätzlich kann der Vektor nur einmal oder mehrere Male verabreicht werden.
Das Gen, das durch den Paramyxovirus-Vektor transferiert wird, ist nicht eingeschränkt, so lange es ein sekretorisches Protein codiert, aber kann ein Gen sein, das eine Vielzahl von Cytokinen oder Hormonen codiert. Diese Proteine können Mitglieder ihrer entsprechenden Familien und auch Isoformen einschließen. Der Paramyxovirus-Vektor ist besonders nützlich für das Exprimieren von therapeutischen Genen von biologisch aktiven Substanzen und dergleichen, die eine kurze Halbwertszeit im Blut haben (wie Cytokine), im gesamten kardiovaskulären System. Die Halbwertszeit eines natürlichen Cytokins im kardiovaskulären System ist im Allgemeinen sehr kurz. Zum Beispiel ist natürliches IL-10 nur für die ersten 30 min nach der Verabreichung wirksam (Gerard et al., J. Exp. Med., 1993, 177 (2), 547). Die Verwendung des Paramyxovirus-Vektors der Erfindung ermöglicht eine kontinuierliche Versorgung des Bluts über einen langen Zeitraum mit biologisch aktiven Substanzen mit einer kurzen Halbwertszeit, einschließlich Cytokine.
Insbesondere haben Cytokine einen weiten Bereich von Funktionen, die mit der Zellproliferation und -Differenzierung in Beziehung stehen. Zum Beispiel hat IL-1 eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich T-Zell-Aktivierung, Expression des IL-2-Rezeptors, Induktion von Cytokin-Genen und anderen, Regulierung der Zellproliferation und Regulierung der Hormonsekretion. IL-1 stimuliert die Freigabe von Zellwachstums- und -Differenzierungsfaktoren von Knochenmark und Lymphocyten-Zelllinien. Zusätzlich induziert IL-1 die Proliferation von pluripotenten Vorläufern im Knochenmark und fördert die Hämatopoiese. Es wird wirksam in der Krebstherapie verwendet. IL-1 ist auch in die Angiogenese und Aktivierung von Fibroblasten involviert und ist auch in der Wundheilung nützlich.
IL-2 ist in die Aktivierung von T-, NK- und LAK-Zellen, Wachstumsförderung von bestimmten Zelltypen, Verstärkung der Produktion von Immunglobulin und IFN-γ, Induktion der IL-6-Produktion von Monocyten usw. involviert. IL-2 wird wirksam für die Behandlung von Tumoren und Immunschwäche-Erkrankungen oder die Aktivierung von NK-Zellen nach einer Knochenmarks-Transplantation verwendet. IL-3 ist in die Mastzellen-Proliferation, Produktion von Blutzellen von hämatopoietischen Vorläuferzellen usw. involviert. Es wirkt zusammen mit anderen Cytokinen (zum Beispiel IL-6), um die Differenzierung einer Vielzahl von Blutzellen zu regulieren. IL-3 kann wirksam in der Behandlung von zum Beispiel der aplastischen Anämie verwendet werden.
IL-4 ist in den Anstieg der Expression des MHC-Klasse II-Gens in ruhenden B-Zellen, die Proliferation von aktivierten T-Zellen und die Förderung von Effektorzell-Funktionen involviert. IL-4 ist auch in die Mastzell-Proliferation, die Förderung der Zellreifung im Thymus, die Proliferation von Blutzellen usw. involviert. IL-4 verstärkt in der Anwesenheit von IL-1 die Antigen-Präsentation und Phagocytose in Makrophagen. IL-4 nimmt an der funktionellen Wiederherstellung der zellulären und humoralen Immunsysteme nach einer Knochenmarks-Transplantation teil, heilt Immunschwäche mit erhöhtem IgM, induziert die terminale Differenzierung in akuter lymphoblastischer Leukämie, inhibiert das Wachstum von festen Tumoren und des B-Zell-Lymphoms, unterdrückt eine Entzündung durch die Inhibierung der Produktion von IL-1, TNF und IL-6 usw. Zusätzlich wird von IL-4 erwartet, dass es in der Behandlung von T-Zell-abhängigen Autoimmun-Erkrankungen wie Autoimmun-Diabetes und allergischer Encephalomyelitis und anderen Erkrankungen, in denen die T-Zell-abhängige Immunfunktion involviert ist, nützlich ist (Rapoport et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 87–99; Racke et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 1961).
IL-5 ist wirksam in der Stimulierung der IgA-Produktion und der Wachstumsförderung von eosinophilen Leukocyten und ist bekannt für seine Anwendung in der Behandlung von Bilharziose (Sanderson, „International Conference on the Clinical Impact of Interleukins" am Royal College of Physicians in London, April 1989) und Tumoren (Kolb et al., Br. J. Cancer, 1979, 40, 410; Pretlow et al., Cancer Res., 1983, 43, 2997; Iwasaki et al., Cancer, 1986, 58, 1321). Darüber hinaus wird von IL-6 berichtet, dass es viele Funktionen einschließlich der Induktion oder Inhibition der Proliferation einer Vielzahl von Zellen aufweist. IL-7 induziert die Proliferation eines bestimmten Typs von B-Zellen und T-Zellen. IL-9 ist in die Erythrocyten-Differenzierung, das T-Zell-Überleben, die Immunglobulin-Produktion von B-Lymphocyten und die Stimulation der IL-6-Produktion von Mastzellen involviert.
IL-10 wird durch aktivierte Th2-Zellen, B-Zellen, Keratinocyten, Monocyten und Makrophagen produziert (Moore et al., Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 165). IL-10 ist wirksam in der Stimulierung der Proliferation und Differenzierung von B-Zellen. Zusätzlich unterdrückt IL-10 die Cytokin-Produktion (wie IFN-γ, IFN-β und IL-2) durch Th1-Zellen, NK-Zellen, Monocyten und Makrophagen (Fiorentino et al., J. Exp. Med., 1989, 170, 2081–2095; Fiorentino et al., J. Immunol., 1991, 146, 3444; Hsu et al., Int. Immunol., 1992, 4, 563; D'Andrea et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1041; de Waal Malefyt et al., J. Exp. Med., 1991, 174, 915; Fiorentino et al., Int. Immunol., 1991, 147, 3815). Dementsprechend ist IL-10 durch die Suppression der Th1-Zell-Reaktion im Verhindern der Abstoßung nach einer Transplantation und von T-Zell-vermittelten Autoimmun-Erkrankungen wie Typ I-Diabetes und multipler Sklerose wirksam. IL-10 inhibiert die Sekretion von pro-inflammatorischen Cytokinen (wie IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α). Daher kann IL-10 für die Behandlung von Entzündungserkrankungen einschließlich der rheumatoiden Arthritis und der Psoriasis verwendet werden. Da IL-10 die Sekretion des Tumornekrose-Faktors inhibiert und septischen Schock unterdrückt, kann es in der Behandlung einer Sepsis nützlich sein. IL-10 kann auch für die Unterdrückung der Granulom-Bildung aufgrund von Schistosomen und auch die Unterdrückung von Leberfibrose nützlich sein. Interferon-α und -β haben anti-virale Funktionen gegen das Papilloma-Virus, Hepatitis-Virus, Herpes-Virus und so weiter und können für die Behandlung von Haarzellenleukämie, Myelom und anderen Tumoren in hämatopoietischen Organen nützlich sein.
Um die oben beschriebenen Cytokine in das kardiovaskuläre System zu übertragen, kann der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung, der jene Cytokine exprimiert, in geeigneter Weise verwendet werden. In einer wünschenswerten Ausführungsform enthält der Paramyxovirus-Vektor ein Gen, das ein anti-inflammatorisches Cytokin codiert. Anti-inflammatorische Cytokine können zum Beispiel IL-10, IL-4 und IL-12 einschließen. Der Paramyxovirus-Vektor, der anti-inflammatorische Cytokine exprimiert, kann ein nützlicher anti-inflammatorischer Arzneistoff sein.
Der hierin offenbarte Vektor kann in der Gentherapie von verschiedenen Erkrankungen anwendbar sein. Solch eine Gentherapie kann die Behandlung von Erkrankungen, die eine Entzündung begleiten, einschließlich Lungenfibrose, sklerosierender Peritonitis, Prostatomegalie, multipler Sklerose, Abstoßung nach einer Transplantation, Typ I-Diabetes, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Enteropathie, Psoriasis, systemischem Lupus erythematodes, Iritis, granulomatösen Erkrankungen, chronischer Nephritis, Sklerodermis, Hysteromyom, Keloid, Zirrhose und anderen Erkrankungen, die eine Entzündung begleiten, einschließen. Der Vektor kann auch in der Bildung von verschiedenen Krankheits-Tiermodellen nützlich sein und auch für die Entwicklung oder Bewertung von Verfahren für die Behandlung jener Krankheitsmodelle und dergleichen.
Zum Beispiel kann der hierin offenbarte Vektor vorzugsweise in der Gentherapie von Lungenfibrose verwendet werden. Lungenfibrose ist eine Erkrankung mit Fibrose der Lunge, einschließlich chronischer interstitieller Pneumonitis, wobei in vielen Fällen die Ursache der Erkrankung unklar ist, aber von einer Lungenfibrose, die durch entweder chronische Infektionskrankheiten oder ein abnormales Autoimmunsystem verursacht wird, begleitet wird. Genau gesagt, schließt die Erkrankung Pneumonitis und cystische Fibrose (CF) ein.
Der hierin offenbarte Paramyxovirus-Vektor kann in einer ausreichenden Dosis verabreicht werden, so dass eine wirksame Dosis des Vektors an die Zellen des Zielgewebes transferiert werden kann. Hierin wird die „wirksame Dosis" als eine Dosis definiert, die das Einbringen von Genen in die Zellen des Zielgewebes ermöglicht, um zumindest teilweise die erwünschte therapeutische Wirkung oder die vorbeugende Wirkung zu erbringen. Die Verabreichung einer wirksamen Dosis des Paramyxovirus-Vektors, der ein erwünschtes Gen enthält, ermöglicht es den transfizierten Zellen, das Genprodukt zu produzieren. Vorzugsweise kann die Verabreichung einer wirksamen Dosis des Paramyxovirus-Vektors, der ein erwünschtes Gen enthält, den Nachweis eines signifikanten Expressionsspiegels des transfizierten Gens in dem verabreichten Gewebe oder im Blut ermöglichen. Ein „signifikanter Spiegel" wird als der Spiegel definiert, bei dem die Expression des transfizierten Gens (die Menge der Transkripte oder der translatierten Produkte) nachweisbar ist. Zum Beispiel muss, wenn es ein endogenes Gegenstück des transfizierten Gens gibt, der maximale Spiegel des transfizierten Gens signifikant höher sein als der Expressionsspiegel des endogenen. Die Expression des transfizierten Gens kann ungefähr 1,2-fach oder mehr, vorzugsweise etwa 1,5-fach oder mehr, mehr bevorzugt etwa 2-fach oder mehr, viel mehr bevorzugt etwa 10-fach oder mehr und am meisten bevorzugt etwa 20-fach höher als der Expressionsspiegel des endogenen Gens an der Stelle der Verabreichung oder im Blut sein. Der Expressionsspiegel des transfizierten Gens muss jedoch unter Berücksichtigung seines wirksamen Spiegels und toxischen Spiegels bestimmt werden.
Der Expressionsspiegel von Genen, die in Zellen transfiziert werden, kann durch Tests bestimmt werden, die Fachleuten bekannt sind. Die Transkripte können durch Northern-Hybridisierung, RT-PCR, RNA-Protektions-Test und dergleichen nachgewiesen und quantifiziert werden. Der Nachweis durch Northern-Hybridisierung, RT-PCT und dergleichen kann in situ durchgeführt werden. Um die translatierten Produkte nachzuweisen, können Western-Blot, Immunpräzipitation, RIA, ELISA, Pulldown-Test und dergleichen unter Verwendung von Antikörpern übernommen werden. Für einen einfachen Nachweis von transfizierten Genprodukten kann das zu exprimierende Protein markiert werden, oder ein Reportergen kann in den Vektor aufgenommen werden. Ein Reportergen kann jenes sein, das β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), alkalische Phosphatase oder das grün-fluoreszierende Protein (GFP) codiert, ist aber nicht auf diese limitiert.
Die Dosis des Vektors, der für die Verabreichung verwendet wird, kann abhängig von einer Erkrankung, dem Körpergewicht, dem Alter, dem Geschlecht, den Symptomen, dem Verabreichungszweck und dem einzubringenden Gen und dergleichen variieren, aber sie kann durch Fachleute richtig bestimmt werden. Es wird bevorzugt, die Vektoren, deren Dosis im Bereich von vorzugsweise etwa 10⁵ PBE/ml bis etwa 10¹¹ PBE/ml, mehr bevorzugt etwa 10⁷ PBE/ml bis etwa 10⁹ PBE/ml und am bevorzugtesten etwa 1 × 10⁸ PBE/ml bis etwa 5 × 10⁸ PBE/ml liegt, mit pharmazeutisch verträglichen Trägern zu impfen. Das Ziel der Impfung der Zusammensetzungen, die Paramyxovirus-Vektoren enthalten, schließt alle Säuger wie Menschen, Affen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Rinder, Hunde usw. ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Dosis-abhängige Expression von IL-10 in SeV-IL10-transfizierten COS7-Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen. COS7-Zellen wurden mit SeV-IL10 in der angezeigten Dosis infiziert, und nach 16 h wurde die Konzentration von IL-10, das in das Kulturmedium sezerniert wurde, gemessen. Als eine Kontrolle wurden die Zellen mit einer Plasmid-DNA für die Expression von IL-10 transfiziert. Für jede Gruppe, n = 6.
2 zeigt die Expression von IL-10 in der Lunge von Mäusen, denen SeV-IL10 intranasal gegeben wurde. SeV-IL10 (6,8 × 10⁷ PBE/100 μl) wurde intranasal durch Schnüffeln verabreicht. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden die Mäuse getötet, und der Expressionsspiegel von IL-10 in Lungen-Homogenaten wurde quantifiziert. Die IL-10-Expression in Kontrollmäusen, denen das IL-10-Expressionsplasmid gegeben wurde, war 310 ± 54 pg/mg Protein (Mittelwert ± SEM).
3 zeigt die Sekretion von IL-10 in BALF von Mäusen, denen SeV-IL10 intranasal gegeben wurde. SeV-IL10 (6,8 × 10⁷ PBE/100 μl) wurde intranasal durch Schnüffeln verabreicht. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden die Mäuse getötet, und der IL-10-Expressionsspiegel in BALF wurde bestimmt. Die IL-10-Expression in Kontrollmäusen, denen das IL-10-Expressionsplasmid gegeben wurde, war 71 ± 63 pg/ml (Mittelwert ± SEM).
4 zeigt die Sekretion von IL-10 in das Blut in Mäusen, denen SeV-IL10 intranasal gegeben wurde. SeV-IL10 (6,8 × 10⁷ PBE/100 μl) wurde intranasal durch Schnüffeln verabreicht. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden die Mäuse getötet, und der IL-10-Spiegel im Serum wurde bestimmt.
5 zeigt die Expression von transfizierten Genen in der Nasenmuschel und Lunge durch Verabreichung des Sendai-Virus-Vektors durch Schnüffeln oder Perfusion. SeV-luc (7 × 10⁷ PBE/100 μl) wurde durch Schnüffeln oder Perfusion in die Nasenepithelien (Nasenmuschel) verabreicht, und nach 48 h wurden die Mäuse getötet, und die Expression der Luciferase in der Lunge und der Nasenmuschel wurde untersucht (n = 3).
6 zeigt die Expression von IL-10 in der Nasenmuschel und Lunge durch Verabreichung von SeV-IL10 durch Schnüffeln oder Perfusion. SeV-IL10 (7 × 10⁷ PBE/100 μl und 7 × 10⁸ PBE/100 μl) wurde durch Schnüffeln oder Perfusion in die Nasenepithelien (Nasenmuschel) verabreicht, und nach 48 h wurden die Mäuse getötet, und die IL-10-Expression in der Lunge und der Nasenmuschel wurde untersucht (n = 6).
7 zeigt die Sekretion von IL-10 in das Blut durch die Verabreichung von SeV-IL10 durch Schnüffeln oder Perfusion. SeV-IL10 (7 × 10⁷ PBE/100 μl und 7 × 10⁸ PBE/100 μl) wurde durch Schnüffeln oder Perfusion in die Nasenepithelien (Nasenmuschel) verabreicht, und nach 48 h wurden die Mäuse getötet, und der IL-10-Spiegel im Serum wurde untersucht (n = 6).
8 zeigt die Dosis-abhängige Expression von β-Galactosidase nach der Injektion von SeV-βgal in die vorderen Tibialis (TA)-Muskeln. Steigende Mengen von SeV-βgal oder Plasmid-DNA oder AAV, das das β-Galactosidase-Reportergen exprimiert, wurden Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert oder sie erhielten keine Injektionen (UT). Die Virus-Dosis und die Menge der DNA repräsentiert die Menge, die in jeden TA injiziert wurde. Zwei Tage nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, und der Expressionsspiegel der β-Galactosidase im Muskel-Homogenat wurde bestimmt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für jede Gruppe, n = 6 bis 12. **p < 0,01 im Vergleich mit der DNA-injizierten Gruppe und der AAV-injizierten Gruppe.
9 zeigt den Zeitablauf der β-Galactosidase-Expression nach der Injektion von SeV-βgal in die vorderen Tibialis (TA)-Muskeln. SeV-βgal (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) oder SeV-Luciferase (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) als Kontrolle wurde Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert. Nach der Injektion wurden die Mäuse zum angezeigten Zeitpunkt getötet, und der Expressionsspiegel der β-Galactosidase im Muskel-Homogenat wurde bestimmt. Mäuse, die mit dem Kontrollvirus injiziert wurden, wurden zwei Tage nach der Injektion getötet. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für jede Gruppe, n = 6. *p < 0,05 im Vergleich mit dem Wert 4 Tage nach der Injektion.
10 zeigt die Wirkung einer wiederholten Injektion des Sendai-Virus-Vektors in Muskeln. SeV-βgal (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) wurde Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert und sie erhielten weitere Injektionen mit SeV-Luciferase (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) zu den angezeigten Zeitpunkten. Zwei Tage nach der zweiten Injektion wurden die Mäuse getötet, und die Luciferase-Expression im Muskel-Homogenat wurde untersucht. Der Expressionsspiegel der Luciferase in allen Mäusen wurde mit den Mäusen, die nur eine Injektion von SeV-Luciferase erhalten hatten, oder nicht-injizierten Mäusen verglichen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für jede Gruppe, n = 6 bis 10. *p < 0,05 im Vergleich mit dem Wert in nicht behandelten Mäusen.
11 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung auf die Anwesenheit eines systemischen anti-SeV-Antikörpers nach der intramuskulären Injektion des Sendai-Virus-Vektors. SeV-βgal (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) wurde Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert. Nach der Injektion wurden die Mäuse zum angezeigten Zeitpunkt getötet, und die Anwesenheit von Antikörpern im Serum, die spezifisch gegen SeV waren, wurde untersucht. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für jede Gruppe, n = 6.
12 zeigt die Expression von IL-10 im Muskel nach der intramuskulären Injektion von SeV-IL10. SeV-IL10 wurde Mäusen in der angezeigten Dosis in jeden TA-Muskel injiziert, und nach zwei Tagen wurden die Mäuse getötet, und der IL-10-Spiegel im Muskel-Homogenat wurde gemessen. Als eine Kontrolle wurde Plasmid-DNA für die IL-10-Expression (pCI-IL10) oder SeV-βgal injiziert.
13 zeigt die Sekretion von IL-10 ins Blut nach der intramuskulären Injektion von SeV-IL10. SeV-IL10 wurde Mäusen in der angezeigten Dosis in jeden TA-Muskel injiziert, und nach zwei Tagen wurde der IL-10-Spiegel im Serum bestimmt. Plasmid-DNA für die IL-10-Expression (pCI-IL10) oder SeV-βgal wurde als Kontrolle injiziert. Der IL-10-Spiegel im Serum von Mäusen, denen Plasmid-DNA für die IL-10-Expression injiziert wurde, war unter der Nachweisgrenze. (n = 4 bis 6)
14 zeigt die Überexpression von IL-10 im Muskel nach der intramuskulären Injektion von SeV-IL10. SeV-IL10 (3,5 × 10⁷ oder 3,5 × 10⁸ PBE/Muskel) oder mit Plasmid-DNA oder AAV (IL10 AAV) für die IL-10-Expression wurde Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert. Unbehandelte Mäuse wurde auch untersucht. Zwei Tage nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, und der IL-10-Spiegel im Muskel-Homogenat wurde untersucht. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für jede Gruppe, n = 6. *p < 0,05 im Vergleich mit allen anderen Gruppen.
15 zeigt die Sekretion von IL-10 ins Blut nach der intramuskulären Injektion von SeV-IL10. SeV-IL10 (3,5 × 10⁷ oder 3,5 × 10⁸ PBE/Muskel) oder Plasmid-DNA oder AAV (IL10 AAV) für die IL-10-Expression wurde Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert. Unbehandelte Mäuse wurden auch untersucht. Nach zwei Tagen wurden die Mäuse getötet, und der IL-10-Spiegel im Serum wurde bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für jede Gruppe, n = 6. *p < 0,05 im Vergleich zu allen anderen Gruppen.
16 zeigt die Wirkung der intramuskulären Injektion von SeV-IL10 in Lungenfibrose-Modellmäusen. SeV-IL10 oder SeV für die Luciferase-Expression und SeV für die β-Galactosidase-Expression, die als Kontrollen verwendet wurden, wurden Mäusen in jeden TA-Muskel injiziert (je 7 × 10⁸ PBE/Maus). Zwei Tage nach der Injektion erhielten die Mäuse eine intratracheale Injektion von Bleomycin (0,075 E/100 μl) oder Salzlösung. Elf Tage nach der Bleomycin-Injektion wurden die Mäuse getötet, und die Kollagen-Ablagerung in der Lunge wurde durch den Hydroxyprolin- Test untersucht. Für jede Gruppe, n = 15 bis 21. *p < 0,05 im Vergleich mit der Kontrollgruppe, in die SeV-Luciferase/β-gal injiziert wurde.
Die beste Art und Weise für das Ausführen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail mit Bezugnahme auf Beispiele veranschaulicht, aber soll nicht ausgelegt werden, dass sie darauf limitiert ist. Alle hierin zitierten Dokumente sind durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiel 1: In vivo-Verabreichung des Sendai-Virus-Vektors
Rekombinante Sendai-Virus-Vektoren, die ein Gen enthalten, das IL-10, β-Galactosidase oder Luciferase codiert (SeV-IL10, SeV-βgal beziehungsweise SeV-Luciferase), und die zur Replikation fähig sind, wurden gemäß dem in Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578–587 und Yu D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457–466 beschriebenen Verfahren konstruiert. Die Vektoren wurden in Hühnereiern vermehrt, und die Allantoisflüssigkeit, die die Viren enthielt, wurde bis zur Verwendung als eine Zusammensetzung, die den rekombinanten Sendai-Virus-Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst, bei –80°C gelagert.
Sendai-Virus-Vektoren wurden in den Beispielen wie folgt verabreicht.
1. Intranasale Verabreichung
Mäuse wurden durch Metophan-Inhalation anästhesiert, und der Vektor wurde durch Schnüffeln verabreicht. Außer wenn anderweitig vorgegeben, wurde eine Dosis von 7 × 10⁶ bis 7 × 10⁸ PBE von SeV-IL10 oder des Kontrollvirus SeV-βgal in einem Gesamtvolumen von 100 μl in die Nase der Maus geimpft und wurde als ein Bolus über einen Zeitraum von 10 bis 20 Sekunden geschnüffelt. Dieses Verfahren resultierte in einer Virusablagerung in der Lunge und der Nase.
2. Perfusion
Mäuse wurden mit Hipnom/Hipnoval anästhesiert. SeV-IL10 oder das Kontrollvirus SeV-βgal wurde selektiv in das Nasenepithel (Nasenmuschel) über einen Zeitraum von 10 Minuten durch Verabreichen von 7 × 10⁷ oder 7 × 10⁸ PBE des Virus durch einen dünnen Katheter direkt auf das Nasenepithel in einem Gesamtvolumen von 100 μl verabreicht, außer wenn es anderweitig angegeben ist. Während des Verfahrens wurde die Maus in umgedrehter Lage mit ihrem Kopf nach unten gelagert. Überschüssiges Virus tropfte daher aus der Nase. Dieses Verfahren resultierte in einer Virusablagerung vorwiegend in der Nase, sehr wenig Virus erreichte die Lunge.
3. Intramuskuläre Verabreichung
Außer wenn es anderweitig angegeben ist, wurden 7 × 10⁷ oder 7 × 10⁸ PBE von SeV-IL10 oder Kontroll-SeV-βgal C57BL/6-Mäusen in beide vorderen Tibialis (TA)-Muskeln (50 μl pro jedem Muskel, n = 6 bis 11) injiziert. Eine dosisabhängige Reaktion wurde in einem Pilotversuch unter Verwendung von SeV-βgal (von 7 × 10⁴ bis 7 × 10⁸ PBE/Tier) beobachtet.
Beispiel 2: Herstellung von Gewebelysaten, Seren und broncho-alveolärer Spülflüssigkeit (BALF)
Mäuse wurden 48 h nach der Virusverabreichung getötet. Gewebelysate, Seren und BALF wurden wie folgt hergestellt.
1. Gewebelysate
TA-Muskeln, Lunge und Nasenmuschel wurden ausgeschnitten und in 300 μl 0,25 M Tris-HCl (pH 8)-Lösung homogenisiert. Die Zellen wurden durch drei Zyklen von Frieren und Wiederauftauen lysiert. Die Proben wurden bei 14 000 UpM für 10 min zentrifugiert, und die Überstände wurden bei –80°C für die folgende Analyse gelagert. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde durch den modifizierten Folin-Lowry-Proteintest bestimmt.
2. Seren
Eine Blutprobe wurde vom Herz gewonnen und bei 37°C für 2 h inkubiert, um Gerinnsel-Bildung zu induzieren. Die Proben wurden dann bei 4 000 Upm für 10 min zentrifugiert, und die erhaltenen Seren wurden in ein neues Röhrchen transferiert und bei –80°C für die folgende Analyse eingefroren.
3. BALF
Die Maus-Trachea wurde offengelegt, und ein Katheder wurde inseriert. Die Lunge wurde dreimal mit 0,5 ml PBS gespült. BALF wurde gewonnen und bei 4 000 UpM für 5 min zentrifugiert und bei –80°C für die spätere Analyse eingefroren.
Beispiel 3: Interleukin-10 (IL-10)-ELISA
ELISA von menschlichem IL-10 wurde unter Verwendung eines Kits, der von R&D gekauft wurde, gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Menge an IL-10 in den Gewebelysaten wurde durch Proteinkonzentration standardisiert, und die Daten wurden als die IL-10-Menge in Picogramm pro Millgramm cytosolisches Protein berechnet.
Beispiel 4: Reportergen-Test
Ein Luciferase-Test wurde unter Verwendung eines von Promega gekauften Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der β-Galactosidase-Test wurde unter Verwendung eines von Clontech gekauften Kits auch gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Diese Tests wurden unter Verwendung von Gewebelysaten durchgeführt, und die Daten wurden durch Proteinkonzentration standardisiert.
Beispiel 5: Statistische Analyse
Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SEM) gezeigt. Die Varianz wurde durch den Mann-Whitney-Test analysiert, und Daten mit p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Beispiel 6: Transfektion des IL-10-exprimierenden Sendai-Virus-Vektors in COS7-Zellen
COS7-Zellen wurden mit SeV-IL10 in unterschiedlichen Dosierungen (10⁴ bis 10⁶ PBE/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen) transfiziert. Nach 16 h der Transfektion wurde die Menge an sezerniertem IL-10 in dem Kulturüberstand untersucht. Das IL-10-exprimierende Plasmid (pCI-IL10) (80 μg/ml, 100 μl) wurde transient transfiziert (durch Lipofektion), und die IL-10-Expression wurde mit jener von SeV-IL10 verglichen. SeV-βgal wurde als eine Kontrolle verwendet.
In Zellen, die mit SeV-IL10 transfiziert wurden, stieg die Menge an sezerniertem IL-10 in einer dosisabhängigen Weise (1). Die Menge an IL-10, das von den Zellen, die mit SeV-IL10 mit höchstem Titer (10⁶ PBE/Vertiefung) infiziert wurden, sezerniert wurde, war um zwei Größenordnungen höher als in Zellen, die mit einem Plasmid, das IL-10 codiert, durch Lipofektion transfiziert wurden (SeV-IL10: 333 ± 47 ng/ml/mg Protein; Plasmid: 6,8 ± 1,4 ng/ml/mg Protein).
Beispiel 7: Intranasale Verabreichung des Sendai-Virus-Vektors in Mäuse durch Schnüffeln
Nach örtlicher Verabreichung des Virus-Vektors (6,7 × 10⁷ PBE/100 μl) durch intranasale Instillation in die Maus-Luftwege wurde die IL-10-Sekretion in Lungen-Homogenaten und BALF zwei Tage nach der Transfektion gemessen und mit der IL-10-Sekretion nach Liposomen-vermittelter Transfektion mit Plasmid-DNA verglichen. Die Konzentration von IL-10 im Serum wurde auch bestimmt.
In Lungen-Homogenaten war die Menge an sezerniertem IL-10 um zwei Größenordnungen höher als jene, die durch Plasmid-Transfektion erhalten wurde (SeV-IL10: 21457 ± 5112 pg/mg Protein; Plasmid: 310 ± 54 pg/mg Protein) (2). Darüber hinaus war in BALF die Menge an sezerniertem IL-10 nach zwei Tagen der Infektion um drei Größenordnungen höher als jene, die durch Plasmid-Transfektion erhalten wurde (SeV-IL10: 153366 ± 41823 pg/ml; Plasmid: 71 ± 63 pg/ml) (3). Zwei Tage nach der Verabreichung war der IL-10-Spiegel im Serum signifikant höher in SeV-IL10-infizierten Mäusen als in Kontrollvirus-infizierten Mäusen (SeV-IL10: 393 ± 132 pg/ml; SeV-βgal: 0,31 ± 0,26 pg/ml) (4).
Beispiel 8: Intranasale Verabreichung des Sendai-Virus-Vektors durch Schnüffeln oder Perfusion
Virus-Vektoren wurden durch intranasale Instillation (Schnüffeln) wie in Beispiel 7 verabreicht oder direkt auf die nasalen Epithelien (Nasenmuschel) durch Perfusion verabreicht, und die Expression des transfizierten Gens wurde verglichen. Mäuse wurden mit SeV-luc (7 × 10⁷ PBE/100 μl) durch entweder Schnüffeln oder Perfusion in die nasalen Epithelien (Nasenmuschel) infiziert und nach 48 h getötet, und die Luciferase-Expression in Lunge und Nasenmuschel wurde untersucht (n = 3). In Mäusen, die durch Schnüffeln infiziert wurden, wurde eine signifikante Expression des Luciferase-Gens sowohl in den Lungen als auch der Nasenmuschel beobachtet. Im Gegensatz dazu war in Mäusen, die durch Perfusion infiziert wurden, die Luciferase-Expression auf die Nasenmuschel beschränkt und wurde in den Lungen kaum nachgewiesen (5).
Als nächstes wurde SeV-IL10 (7 × 10⁷ PBE/100 μl und 7 × 10⁸ PBE/100 μl) durch Schnüffeln oder Perfusion in die nasalen Epithelien (Nasenmuschel) verabreicht, und die Mäuse wurden nach 48 h getötet, und die IL-10-Expression in den Lungen und der Nasenmuschel wurde untersucht (n = 6). Eine signifikante Menge an IL-10 wurde in den Lungen von den Mäusen nachgewiesen, denen die Virus-Vektoren durch Schnüffeln verabreicht wurden. Obwohl eine signifikante Expression auch in Nasenmuschel-Homogenaten von Mäusen, die durch Perfusion infiziert wurden, nachgewiesen wurde, wurde nur eine Spurenmenge an IL-10-Expression in ihren Lungen-Homogenaten nachgewiesen (6).
Der sezernierte IL-10-Spiegel im Serum wurde in den obigen Mäusen, denen SeV-IL10 verabreicht wurde, bestimmt. SeV-IL10 (7 × 10⁷ PBE/100 μl und 7 × 10⁸ PBE/100 μl) wurde durch Schnüffeln oder Perfusion in die nasalen Epithelien (Nasenmuschel) verabreicht, und die Mäuse wurden nach 48 h getötet, und die IL-10-Expression im Serum wurde untersucht (n = 6). IL-10-Sekretion in hoher Menge wurde im Serum von Mäusen beobachtet, bei denen die Verabreichung durch Schnüffeln erfolgte. Im Serum von Mäusen, bei denen die Verabreichung durch Perfusion erfolgte, wurde, obwohl die IL-10-Sekretion niedriger als jene von Mäusen, bei denen die Verabreichung durch Schnüffeln erfolgte, war, noch eine signifikante Menge der IL-10-Sekretion beobachtet (7). In Kontrollmäusen, die mit SeV-luc (7 × 10⁷ PBE/100 μl) infiziert wurden, gab es keine signifikante Sekretion von IL-10.
Beispiel 9: Intramuskuläre Verabreichung des Sendai-Virus-Vektors in Mäuse
SeV-βgal wurde in die TA-Muskeln von Mäusen injiziert, und der Expressionsspiegel von β-Gal nach zwei Tagen wurde durch den β-Galactosidase-Test untersucht. Die Expression von β-Gal stieg in einer dosisabhängigen Weise (8). Der Expressionsspiegel (61,672 pg β-Gal/mg Protein), der durch die Verabreichung von SeV-βgal mit dem höchsten Titer (3,5 × 10⁸ PBE) erreicht wurde, war 300-fach und 7-fach höher als jene, die mit nackter DNA beziehungsweise AAV (βgal AAV) in ihrer optimalen Dosis erzielt wurden.
Der Zeitablauf der β-Gal-Expression nach der SeV-βgal-Verabreichung wurde untersucht. SeV-βgal (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) oder Kontroll-SeV-luc (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) wurde in den TA-Muskel injiziert, und die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten getötet, und die β-Gal-Expression in Muskel-Homogenaten wurde bestimmt. Das Ergebnis zeigte, dass die Expression des transfizierten Gens den Höchstspiegel zwei Tage nach der Injektion erreichte und dann auf den Basisspiegel, den Spiegel vor der Injektion, nach 28 Tagen absank (9).
Der Expressionsspiegel, der durch die wiederholte Verabreichung des Sendai-Virus-Vektors erhalten wurde, wurde untersucht. Jeder der TA-Muskeln der Mäuse wurde mit SeV-βgal (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) infiziert und weiter mit SeV-luc (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) zu der angezeigten Zeit infiziert. Die Mäuse wurden zwei Tage nach der zweiten Injektion getötet, und die Luciferase-Expression in Muskel-Homogenaten wurde untersucht. Der Spiegel der Luciferase wurde mit jenem von Mäusen mit einer einzelnen Injektion von SeV-luc oder jenem von Mäusen ohne eine SeV-luc-Injektion verglichen. Durch die wiederholte Injektion wurde der Expressionsspiegel erniedrigt, aber es wurde noch ein signifikanter Anstieg im Expressionsspiegel nach der zweiten Injektion beobachtet (10). Ein signifikanter Anstieg im Expressionsspiegel war durch wiederholte Injektionen noch 28 Tage nach der ersten Injektion erreichbar (der Expressionsspiegel wurde auf 1/65 von jenem gesenkt, der durch eine einzelne Verabreichung erzielt wurde).
Der Anstieg von systemischen anti-SeV-Antikörpern, die durch die intramuskuläre Verabreichung von SeV induziert wurden, wurde untersucht. Jeder der TA-Muskeln von Mäusen wurde mit SeV-βgal (3,5 × 10⁷ PBE/Muskel) infiziert, und die Mäuse wurden zu den angezeigten Zeiten getötet, und SeV-spefizische Antikörper im Serum wurden nachgewiesen. Wie in 11 gezeigt, wurde die dosisabhängige Antikörper-Antwort eindeutig systemisch beobachtet. Zusätzlich wurde eine Entzündung im TA, die auch abhängig von der SeV-Dosis war, beobachtet. Die Antikörper-Antwort und Entzündung im TA, die durch die SeV-Verabreichung verursacht wurde, könnte der Grund für die erniedrigte Expression nach wiederholter Injektion sein.
Beispiel 10: Intramuskuläre Verabreichung des IL-10-exprimierenden Sendai-Virus-Vektors
SeV-IL10 wurde in den TA-Muskel verabreicht, und die IL-10-Sekretions-Wirsamkeit wurde untersucht (4 × 10⁸ PBE/Muskel). Zwei Tage nach der Injektion wurden Muskel-Homogenate hergestellt, und die IL-10-Expression wurde bestimmt. Das Ergebnis wurde mit jenem verglichen, das durch Plasmid-DNA-Transfektion, die durch Liposom vermittelt wurde, erhalten wurde. Zusätzlich wurde auch der IL-10-Spiegel im Serum bestimmt.
Es wurde gefunden, dass der Spiegel der IL-10-Expression in den Muskel-Homogenaten zwei Tage nach der Injektion um eine oder zwei Größenordnungen höher war als jener, der durch die Plasmid-DNA-Injektion (50 μg DNA/TA) erhalten wurde (SeV-IL10: 1067 ± 32 pg/mg Protein; Plasmid: 50,9 ± 11 pg/mg Protein) (12). Der IL-10-Spiegel im Serum war zwei Tage nach der SeV-IL10-Verabreichung erhöht, wohingegen IL-10 im Serum von Mäusen, denen Plasmid-DNA verabreicht worden war, nicht nachgewiesen wurde (13).
In einem separaten Experiment, das in ähnlicher Weise wie das obige Experiment durchgeführt wurde, war der IL-10-Spiegel in Muskel-Homogenaten zwei Tage nach der SeV-IL10-Injektion 160-fach höher als jener, der durch die Transfektion von nackter Plasmid-DNA, die IL-10 exprimiert, erhalten wurde (14). Im Gegensatz dazu wurde IL-10 in Mäusen, denen IL-10-exprimierendes AAV (IL-10 AAV) verabreicht wurde, zwei Tage nach der Injektion nicht in Muskel-Homogenaten nachgewiesen. IL-10 wurde nicht in den Seren von Mäusen, die entweder mit Plasmid-DNA transfiziert oder mit AAV infiziert wurden, nachgewiesen, wohingegen der IL-10-Spiegel in den Seren von Mäusen, denen SeV-IL10 injiziert wurde, zwei Tage nach der Injektion auf 797 ± 383 pg/ml erhöht war (15). Diese Daten weisen darauf hin, dass rekombinantes SeV Gene wirksam durch seine intramuskuläre Verabreichung transferieren kann.
Beispiel 11: Wirkung der SeV-IL10-Verabreichung in Lungenfibrose-Modellmäusen
Der Effekt von SeV-IL10 in Modellmäusen mit Bleomycin-induzierter Pneumonitis und Fibrose wurde untersucht. SeV-IL10 oder SeV-βgal und SeV-luc als Kontrollen (je 7 × 10⁸ PBE/Maus) wurden in die TA-Muskeln verabreicht. Zwei Tage nach der intramuskulären Verabreichung wurde Bleomycin (0,075 E/100 μl; 0,075 Einheiten, enthalten in 100 μl Salzlösung) oder Salzlösung intratracheal injiziert. Elf Tage nach der Bleomycin-Injektion wurden die Mäuse getötet, und die Kollagen-Ablagerung in der Lunge wurde durch einen Hydroxyprolin-Test gemäß dem beschriebenen Verfahren (Pettipher E. R., Br. J. Pharmacol., 1993, 110, 423–427) durch Bestimmen der Menge an 6-Hydroxyprolin bestimmt.
Es wurde gefunden, dass die Verabreichung von SeV alleine die Kollagenablagerung im Atmungstrakt erhöht (16; vergleiche die 1. (SeV-βgal + SeV-luc + Bleomycin) und 3. (Bleomycin) Säule von links). Die Verabreichung von SeV-IL10 reduzierte jedoch die Kollagenablagerung signifikant (vergleiche die 1. (SeV-βgal + SeV-luc + Bleomycin) und 2. (SeV-IL10 + Bleomycin) Säule von links). Es ist somit bestätigt, dass die intramuskuläre Verabreichung von SeV-IL10 eine therapeutische Wirkung auf Lungenfibrose hat.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Expression eines Fremdgens im kardiovaskulären System in hohem Ausmaß. Sie liefert auch eine fundamentale Technologie für die Gentherapie gegen eine Vielzahl von Entzündungserkrankungen, einschließlich Lungenfibrose, die durch die cystische Fibrose repräsentiert wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Paramyxovirus-Vektors, umfassend ein Fremdgen, das ein sekretorisches Protein codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Entzündungserkrankung, wobei der Paramyxovirus-Vektor intramuskulär zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das sekretorische Protein ein anti-inflammatorisches Cytokin ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das anti-inflammatorische Cytokin IL-10 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Paramyxovirus ein Sendai-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Entzündungserkrankung Lungenfibrose ist.