JPWO2005097988A1 - 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織の維持および／または修復に関連する形質転換骨髄関連細胞を提供する。さらに、本発明は、形質転換骨髄関連細胞を用いる、疾患組織の診断および治療方法を提供する。本発明の形質転換骨髄関連細胞は、遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞であって、組織の維持および／または修復に関連する形質転換骨髄関連細胞である。また、本発明の形質転換骨髄関連細胞の調製方法は、哺乳動物から取り出された骨髄関連細胞に、遺伝子を組み込んだベクターを用いて該遺伝子を導入することを含む。

Description

本発明は、遺伝子を組み込んだベクターが導入された、組織の維持および／または修復に関連する形質転換骨髄関連細胞、および該細胞の利用に関する。

従来の医療は、疾患部位である障害を受けた臓器や組織を早期に発見し、疾患の病因を突き止めるとともに、早期のうちに障害部位を切除することを治療目的とするものが主流であった。こうした治療は、切除後に残存する臓器または組織の自然治癒（または回復）能力に依存することが大きかった。しかしながら、このような治療を施す場合であっても、切除量が一定限度を超えてしまえば、臓器または組織本来の機能が回復することは困難となる。こうした患者に対しては、臓器や組織を再生するような治療を施すか、あるいは生体外から移植によって補足する必要がある。

最近、再生医療を目指す基礎研究が進み、幹細胞を用いた中枢神経機能の再生、筋ジストロフィー、パーキンソン病等の重篤な疾患の治療への期待が高まってきた。再生医療の基盤となる幹細胞は、分化の過程において階層的であり、より未分化な幹細胞は自己複製能が高い。骨髄細胞に含まれる骨髄幹細胞はより未分化な細胞であり、多分化能を有し、胚葉を越えて分化可能であることが報告されている（Ｊｉａｎｇら、２００２）。また、骨髄細胞を用いた骨・軟骨再生、皮膚再生などの組織工学の分野においては、すでに臨床応用されている（黒柳、２００３）。一方、再生医療においては、非自己の細胞だけでなく、自己の細胞を使用する研究も進み、自己の骨髄細胞をドナーソースとして、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞へと分化誘導させ、これらを用いて細胞療法を行う戦略が考案されている（高橋、２００２）。

一方、臓器および組織は実質細胞のみで構成されているわけではなく、これらは、細胞が接着する足場となる細胞外マトリックスや非実質系（または間葉系）細胞などの複数の構成因子によって構築されている。したがって、単に、疾患の原因となる標的細胞を除去または治癒することを目的とする治療法によっては、本来の大きさおよび機能を有する臓器および組織まで修復させることは困難である。

最近、骨髄移植後の患者では複数の臓器および組織において、移植骨髄細胞由来の細胞が存在することが明らかになり、骨髄細胞が組織回復に何らかの作用をしている可能性が示唆されている（Ｋｒａｕｓｅら、２００１）。また、生体外で遺伝子導入した間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）を生体にもどすことによって癌の治療効果を高めることも報告されている（Ｏｈｌｓｓｏｎら、２００３）。このように骨髄幹細胞や間葉系幹細胞は、臓器および組織の再生・回復において極めて重要な役割を果たしているといえる。
Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１８，４１−４９（２００２） 黒柳能光、日本再生医療学会雑誌「再生医療」、Ｖｏｌ．２、Ｎｏ．３、３９−４５（２００３） 高橋淳、日本再生医療学会雑誌「再生医療」、Ｖｏｌ．２、Ｎｏ．２、６７−７４（２００２） Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０５，３６９−３７７（２００１） Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，７５，２４８−２５５（２００３）

本発明の目的は、遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞であって、組織の維持および／または修復に関連する形質転換骨髄関連細胞を提供することである。また、本発明の目的は、哺乳動物から取り出された骨髄関連細胞に、遺伝子を組み込んだベクターを用いて該遺伝子を導入することを含む、形質転換骨髄関連細胞の調製方法を提供することである。

本願発明において、遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞を調製し、該細胞を利用することにより、生体の組織の維持および修復に関連する疾患の診断・治療が可能になる。

前述したように、骨髄幹細胞や間葉系細胞は再生医療において重要な役割を果たすと考えられている。従来、生体内で癌化した特定の細胞を死滅させることを目的として、特定の遺伝子を導入した間葉系細胞を生体内に投与するという治療は行われていた。しかしながら、標的となる細胞を直接死滅させるための治療とは異なり、臓器や組織が本来有する自然治癒力を発揮させることによって疾患を治療する方法は知られていなかった。そこで、本発明者らは、組織の維持および／または修復を目指した疾患の診断・治療を目的として、特定の遺伝子を導入した形質転換骨髄関連細胞を調製することを目指した。具体的には、本発明者らは、骨髄関連細胞に予め組織の維持または修復に関連する遺伝子を組み込んだベクターを導入し、疾患モデルの実験動物に形質転換した骨髄関連細胞を投与することによって、疾患組織の機能を回復させることに成功し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞を提供することにより、再生医療の分野における該細胞の多様な必要性を満たすのを援助する。

すなわち、本発明によれば、遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞であって、組織の維持および／または修復に関連する前記形質転換骨髄関連細胞が提供される。より具体的には、本発明は以下の発明に関する。
〔１〕遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞であって、組織の維持および／または修復に関連する前記形質転換骨髄関連細胞。
〔２〕前記遺伝子が、組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子であるか、あるいは、マーカー遺伝子である、〔１〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔３〕組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子が、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキン、ＧＣＳＦ、ＭＣＳＦ，ＳＣＦ、ＩＦＮ、Ｃｒｘ、およびＯｔｘ２からなる群から選択される細胞の分化・増殖制御活性または細胞の機能制御活性を有するタンパク質若しくはペプチドをコードする遺伝子である、〔２〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔４〕前記ベクターが、アデノウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクターである、〔１〕ないし〔３〕のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔５〕アデノウイルスベクターがＨＧＦ遺伝子を搭載したアデノウイルスベクターである、〔４〕記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔６〕センダイウイルスベクターがＦＧＦ２遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターである、〔４〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔７〕センダイウイルスベクターがＩＦＮ遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターである、〔４〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔８〕骨髄関連細胞が、骨髄細胞、骨髄由来細胞である、〔１〕ないし〔７〕のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔９〕前記組織が疾患組織である、〔１〕ないし〔８〕のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔１０〕疾患が肝疾患である、〔９〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔１１〕肝逸脱酵素値を下げる、〔１０〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔１２〕疾患が癌である、〔９〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔１３〕癌が肝癌である、〔１２〕に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔１４〕末梢血管に投与するための、〔１〕ないし〔１３〕のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
〔１５〕哺乳動物から取り出された骨髄関連細胞に、遺伝子を組み込んだベクターを用いて該遺伝子を導入することを含む、形質転換骨髄関連細胞の調製方法。
〔１６〕形質転換骨髄関連細胞を調製するための、遺伝子を担持する組換えベクターの使用。
〔１７〕〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の形質転換骨髄関連細胞を含む、組織の維持および／または修復のための医薬。
〔１８〕〔１０〕に記載の形質転換骨髄関連細胞を含む肝疾患治療薬。
〔１９〕肝疾患が肝障害、肝不全、肝硬変、または肝炎である、〔１８〕に記載の肝疾患治療薬。
〔２０〕肝疾患が肝癌である、〔１８〕に記載の肝疾患治療薬。
〔２１〕遺伝子がＨＧＦまたはＦＧＦ２である、〔１８〕または〔１９〕に記載の肝疾患治療薬。
〔２２〕遺伝子がＩＦＮである、〔１８〕または〔２０〕に記載の肝疾患治療薬。
〔２３〕ベクターが、アデノウイルスベクターまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔１８〕から〔２２〕のいずれかに記載の肝疾患治療薬。
〔２４〕ベクターがＦ遺伝子を欠損するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔２３〕に記載の肝疾患治療薬。
〔２５〕〔１０〕に記載の形質転換骨髄関連細胞および薬学的に許容される媒体を含む組成物を調製する工程を含む、肝疾患治療薬の製造方法。
〔２６〕肝疾患が肝障害、肝不全、肝硬変、または肝炎である、〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕肝疾患が肝癌である、〔２５〕に記載の方法。
〔２８〕遺伝子がＨＧＦまたはＦＧＦ２である、〔２５〕または〔２６〕に記載の方法。
〔２９〕遺伝子がＩＦＮである、〔２５〕または〔２７〕に記載の方法。
〔３０〕ベクターが、アデノウイルスベクターまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔２５〕から〔２９〕のいずれかに記載の方法。
〔３１〕ベクターがＦ遺伝子を欠損するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔３０〕に記載の方法。

本発明の形質転換骨髄関連細胞に導入される遺伝子は、組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子であるか、あるいは、マーカー遺伝子を含む。本発明の形質転換骨髄関連細胞は、組織の維持および／または修復を促進する医薬として使用できる。

本発明の形質転換骨髄関連細胞に導入される遺伝子を組み込むベクターは、一般的に、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞において遺伝子発現を可能にするものであれば特に限定されない。好ましくは、ウイルスベクター、特に組換えアデノウイルスベクターまたは、センダイウイルスベクターなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである。前記遺伝子を組み込んだベクターの好ましい態様は、ＨＧＦ遺伝子、ＦＧＦ−２遺伝子、またはＩＦＮβ遺伝子を担持したアデノウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクターが挙げられる。前記遺伝子を組み込んだベクターの特に好ましい態様は、ＨＧＦ遺伝子を担持したアデノウイルスベクター（ａｄｅｘＨＧＦ）、ＦＧＦ−２を担持しＦ遺伝子を欠失させたセンダイウイルスベクター（ＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ）、ＩＦＮβ遺伝子を担持しＦ遺伝子を欠失させたセンダイウイルスベクター（ＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦ）、より好ましくはａｄｅｘＨＧＦ、ＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ、ＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦである。本発明の一態様において、ヒト用の組換えセンダイウイルスベクターとしては、ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ、ＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦが使用できる。

本発明に使用される骨髄関連細胞は、骨髄細胞、骨髄由来細胞を含む。
本発明の形質転換骨髄関連細胞によって維持および／または修復される組織は、典型的には、疾患組織である。また、組織本来の機能を維持させることを目的とする場合においては、疾患組織に限定されない。疾患組織には、炎症性疾患、肝疾患、免疫性疾患、癌疾患、遺伝子疾患が例示される。好ましくは、炎症性疾患、肝疾患、癌疾患、より好ましくは、炎症性疾患、肝疾患である。すなわち、本発明の形質転換骨髄関連細胞は、炎症性疾患、肝疾患、免疫性疾患、癌疾患、遺伝子疾患等における疾患治療剤として使用できる。より好ましくは、本発明の形質転換骨髄関連細胞は、肝疾患治療剤として使用できる。細胞は、適宜薬学的に許容される媒体と共に医薬組成物とすることができる。本発明は、遺伝子を担持するベクターを骨髄関連細胞に導入する工程を含む、上記の疾患治療剤の製造方法、および上記の疾患治療剤の製造における、上記ベクターまたは形質転換骨髄関連細胞の使用にも関する。遺伝子は、好ましくはＨＧＦ、ＦＧＦ２、またはＩＦＮβである。

本発明の一態様において、本発明の形質転換骨髄関連細胞の使用により、肝逸脱酵素値を下げることができる。すなわち本発明の形質転換骨髄関連細胞は、肝逸脱酵素値の降下剤として使用できる。また本発明は、遺伝子を担持するベクターを骨髄関連細胞に導入する工程を含む、肝逸脱酵素値降下剤の製造方法、および肝逸脱酵素値降下剤の製造における、上記ベクターまたは形質転換骨髄関連細胞の使用にも関する。遺伝子は、好ましくはＨＧＦまたはＦＧＦ２が用いられる。
また本発明の一態様において、本発明の形質転換骨髄関連細胞の使用により、肝癌などの癌の増殖を抑制することができる。すなわち本発明の形質転換骨髄関連細胞は、肝癌などの癌に対する治療剤として使用できる。また本発明は、遺伝子を担持するベクターを骨髄関連細胞に導入する工程を含む、癌治療剤（または癌細胞増殖抑制剤）の製造方法、および癌治療剤（または癌細胞増殖抑制剤）の製造における、上記ベクターまたは形質転換骨髄関連細胞の使用にも関する。遺伝子は、好ましくはＩＦＮ、特にＩＦＮβが用いられる。

本発明の形質転換骨髄関連細胞は、これらに限定されないが、末梢血管内、皮下、筋肉内、腹腔内、気道内、脳室内、髄腔内、胸腔内に投与することができる。好ましくは、末梢血管内、皮下への投与、より好ましくは、末梢血管内への投与である。

本発明によれば、本発明の形質転換骨髄関連細胞を調製する方法が提供される。本発明の方法は、典型的には、哺乳動物から骨髄関連細胞を取り出し、遺伝子を組み込んだベクターを用いて該遺伝子を導入することを含む。

本発明によれば、形質転換骨髄関連細胞を調製するための、遺伝子を担持する組換えベクターの使用法が提供される。

以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
（１）骨髄関連細胞
本発明の形質転換骨髄関連細胞に使用する骨髄関連細胞には、骨髄細胞、骨髄由来細胞、あるいはその他の造血幹細胞および血液中の細胞成分が含まれる。好ましくは、骨髄細胞、骨髄由来細胞である。骨髄細胞は、骨髄を構成する細胞であって、造血に関与する前駆細胞の集団である。これにより、骨髄細胞には、造血幹細胞を多く含み、造血幹細胞としては、ＣＤ３４陽性細胞が例示される。分化の最終段階である赤血球は、造血幹細胞から分化した原赤芽球、前赤芽球、多染性赤芽球、正常赤芽球を経て形成したものである。また、白血球は、顆粒の染色性により好中性白血球、好エオシン性白血球、好塩基性白血球、リンパ球、単球などに分類される。特に、リンパ球は、骨髄で成熟する細胞と胸腺で成熟する細胞があり、胸腺で成熟するものはＴ細胞と考えられ、一方、骨髄で成熟するものはＢ細胞と考えられている。

本明細書において、「骨髄細胞」というときは、上記の通り、骨髄を構成する細胞のうち造血系に関与する前駆細胞群を示すものとし、特定の細胞に限定しない。また、前記造血幹細胞は、通常、骨髄に多く存在するが、化学療法後の骨髄造血の回復期やＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）使用後には、末梢血中にも現れることが知られ、このような造血幹細胞を特に末梢血幹細胞と称する。本発明の一態様において、骨髄関連細胞には、末梢血幹細胞も含まれる。また、臍帯血中にも造血幹細胞が存在することが知られており、臍帯血中の造血幹細胞も骨髄関連細胞に含まれる。末梢血造血幹細胞、臍帯血造血幹細胞、および骨髄細胞などの造血細胞を、本発明において好適に用いることができる。

本明細書において、「骨髄由来細胞」は、骨髄に由来する抗体産生細胞の前駆細胞であるＢ細胞を含む。Ｂ細胞は、胎生期では肝臓で、生後では骨髄で幹細胞より分化する細胞であるが、分化過程でＩｇ遺伝子座の活性化、リコンビナーゼ遺伝子産物発現に伴いＩｇＨ鎖の再編成が誘導され、μ鎖が発現する。この時期の細胞をプレＢ細胞と呼ぶ。プレＢ細胞におけるμ鎖発現は続いて誘導されるＢ細胞成熟に重要な役割を果たすと考えられている。さらに、Ｌ鎖再編成が誘導されたＢ細胞は、抗原刺激により抗体産生細胞へと分化する。また、Ｂ細胞以外の血液中の各種細胞成分、例えば、血小板、赤血球、顆粒球、Ｔ細胞なども含まれる。

また、骨髄関連細胞を得るには、骨髄または他の造血源中の他の細胞から多能性の幹細胞を単離することが必要である。骨髄細胞は、骨髄源、例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔から得ることができる。造血幹細胞の他の入手源は、胚卵黄包、胎児肝臓、胎児および成人の脾臓、成人末梢血液および臍帯血をはじめとする血液などが含まれる。胎児骨または他の骨源からの骨髄の単離に際しては、骨から洗い出すのに適当な平衡塩溶液を用いることができ、一般には、約５−２５ｍＭの低濃度の許容し得る緩衝液と一緒にしたウシ胎児血清若しくは他の天然性因子を補った平衡塩溶液を用いることができる。好ましくは、緩衝液は、Ｈｅｐｅｓ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液である。他の方法としては、常法に従って、骨から骨髄を吸引することができる。例えば、マウスの大腿骨や脛骨由来の骨髄細胞の採取については、Ｔｅｒａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４，５５１−５５８（２００３）に記載の方法に従って行うことができる。

骨髄由来細胞を得るには、前記方法で得られる骨髄から、骨髄由来細胞の膜表面に提示された抗原を指標として分離することができる。このような骨髄由来細胞を分離する装置としは、ＦＡＣＳ（ベクトンディッキンソン）が例示される。また、細胞表面に提示された抗原に対する分子を磁気ビーズ等に吸着させ、骨髄由来細胞を分離することもできる。

本発明において使用される骨髄関連細胞には、具体的には、脊椎動物、好ましくは哺乳動物由来の細胞、例えば、ヒト由来、マウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、またはサル由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが含まれる。

骨髄関連細胞に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）は、顆粒球、単球の前駆細胞をコロニーアッセイ法で算定したり、ＨＳＣに特徴的と考えられるＣＤ３４（抗原）陽性細胞をフローサイトメーターで測定することにより同定することができる。具体的には、造血幹細胞としては、ｌｉｎｅａｇｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ（ｌｉｎ⁻）の細胞であって、ＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻（Ｂｈａｔｉａ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９７；９４：５３２０−５３２５）の表現型を有する細胞が挙げられる。ｌｉｎ⁻（ｌｉｎｅａｇｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）の表現型は、適宜市販のキット等を用いて同定および選択することができるが、例えばＧＰＡ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、およびＣＤ９９ｂが全てｎｅｇａｔｉｖｅのものである。

ヒト造血幹細胞の分離方法は、以下の文献も参照することができる（Ｌｅａｒｙ，ＡＧ．，Ｂｌｏｏｄ ６９：９５３，１９８７；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪ，Ｂｌｏｏｄ ７４：１５６３，１９８９；Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６９：１７２１，１９８９；Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ ＬＷＭＭ，Ｂｌｏｏｄ ７７：１２１８，１９９１；Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７５：１５０１，１９９２；Ｂｒｉｄｄｅｌｌ ＲＡ，Ｂｌｏｏｄ ７９：３１５９，１９９２；Ｇｕｎｊｉ Ｙ，Ｂｌｏｏｄ ８０：４２９，１９９２；Ｃｒａｉｇ Ｗ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７７：１３３１，１９９３；Ｇｕｎｊｉ Ｙ，Ｂｌｏｏｄ ８２：３２８３，１９９３；Ｔｒａｙｃｏｆｆ ＣＮ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２２：２１５，１９９４；Ｈｕａｎｇ Ｓ，Ｂｌｏｏｄ ８３：１５１５，１９９４；ＤｉＧｉｎｓｔｏ Ｄ，Ｂｌｏｏｄ ８４：４２１，１９９４；Ｍｕｒｒａｙ Ｌ，Ｂｌｏｏｄ ８５：３６８，１９９５；Ｈａｏ ＱＬ，Ｂｌｏｏｄ ８６：３７４５，１９９５；Ｌａｖｅｒ ＪＨ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２３：１５１５，１９９５；Ｂｅｒａｒｄｉ ＡＣ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１０４，１９９５；Ｋａｗａｓｈｉｍａ Ｉ，Ｂｌｏｏｄ ８７：４１３６，１９９６；Ｌｅｅｍｈｕｉｓ Ｔ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２４：１２１５，１９９６；Ｃｉｖｉｎ ＣＩ，Ｂｌｏｏｄ ８８：４１０２，１９９６；Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ Ａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２：１３２９，１９９６；Ｔａｊｉｍａ Ｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４：１３５７，１９９６；Ｓａｋａｂｅ Ｈ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５：７３，１９９７；Ｓａｋａｂｅ Ｈ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：７２８，１９９８；原田実根他編，新しい造血幹細胞移植，南江堂，１９９８，９−２３ページ）。

骨髄細胞を得る方法をより具体的に例示すれば、例えば、骨髄の正常造血を確認後、全身麻酔下に腸骨および胸骨から採取する。目標細胞数は、骨髄有核細胞３×１０^８から５×１０^８／ｋｇ程度である。１回に数ｍｌずつ、複数回にわたって採取する。骨組織などの混入がある場合にはメッシュを通した後、バッグにつめる。移植の際には粗いフィルターを用いて輸注する。同種移植の場合は、ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）適合ドナーを選択することが好ましい。但し、ＧＶＨＤ予防法の確立、新しい免疫抑制剤の開発、およびＣＤ３４陽性細胞の純化技術などにより、ＨＬＡ不一致のドナーでも移植は可能になってきている。ドナーとしては、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−ＤＲの３組６抗原のうち、４種類以上、より好ましくは５種類以上、より好ましくは全てがレシピエントと一致することが好ましい。

末梢血より末梢血幹細胞を採取する場合は、連日Ｇ−ＣＳＦを皮下注し、動員された末梢血ＣＤ３４^＋細胞数のピーク時に採取を行う。一般に、ＣＤ３４陽性細胞の動員は数日程度持続するので、連日の末梢血幹細胞採取が可能である。末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）の動員および採取については、Ｈａｒａｄａ Ｍ．ら，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ ５：６３−７１，１９９６、Ｗａｌｌｅｒ ＣＦ．ら，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １８：２７９−２８３，１９９６、Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ．ら，Ｂｌｏｏｄ ９０：９０３−９０８，１９９７、原田実根他編，新しい造血幹細胞移植，南江堂，１９９８，６７−７２ページ、名古屋ＢＭＴグループ編，造血細胞移植マニュアル改訂三版，２００４，２３７−２４０ページも参照のこと。動員に用いるＧ−ＣＳＦとしては、野生型蛋白質の他、Ｎ末端を改変した誘導体（ｎａｒｔｏｇｒａｓｔｉｎなど）、糖鎖が付加された修飾蛋白質（ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｎなど）を用いることができる。またＧ−ＣＳＦと他の造血因子を併用してもよい。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、またはＳＣＦなどを併用することができる（Ｈｕｈｎ ＲＤ．ら，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２４：８３９−８４７，１９９６；Ｂｅｇｌｅｙ ＣＧ．ら，Ｂｌｏｏｄ ９０：３３７８−３３８９，１９９７；Ｌａｎｅ ＴＡ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８５：２７５−２８２，１９９５）。Ｇ−ＣＳＦ投与中は、腰痛、骨痛および発熱などの全身症状の軽減や、血小板凝集能亢進の防止のため、ａｓｐｉｒｉｎを投与することができる。

混入した血小板をそのまま輸注すると塞栓などの原因となる場合があるため、採取後に除去することが好ましい。例えばダブルバックに集めて弱遠心（２００ｇ、１５分）するか、遠心管に分注して１６００回転、１０分遠心して血小板を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地に交換することができる。採取した細胞を凍結保存する場合は、１０％自己血清、１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させて凍結させ、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｆｒｅｅｚｅｒで凍結、液体窒素中で保存する。細胞濃度は２×１０^７から６×１０^７／ｍｌとすることができる。比較的短期間の細胞保存のためには、細胞浮遊液（１×１０^８／ｍｌ以下の濃度）に終濃度６％Ｈｙｄｒｏｄｙｅｔｈｙｌ Ｓｔａｒｃｈ（ＨＥＳ）、５％ＤＭＳＯ、４％ａｌｂｕｍｉｎとなるように、氷冷した等量の保存液を混合し、−８０℃のｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒで凍結保存することができる（Ｋｎｕｄｓｅｎ ＬＭ.ら，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． ５：３９９−４０６，１９９６）。

臍帯血幹細胞の調製では、臍帯血に赤血球沈降剤（ＨＥＳ）を加え、上層を新しいバッグに回収し、遠心により細胞を分離・濃縮する。回収した細胞は、凍害保護液を加え、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｆｒｅｅｚｅｒで凍結させ保存が可能である。

連続式血液成分分離装置で得られた細胞浮遊液は、顆粒球や赤血球の混入が非常に少ないため、単核球分離操作を省略することができる。顆粒球や赤血球が多く含まれる場合には、Ｆｉｃｏｌｌ比重遠心法により単核球を分離することができる。骨髄液の場合は、顆粒球や赤血球の除去と濃縮のため、Ｆｉｃｏｌｌ処理または血液分離装置による単核球分離を行うことができる。得られた細胞画分からのＣＤ３４陽性細胞の精製純化には、例えばＩｓｏｌｅｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｘｅｌｌ社）またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（ＡｍＣｅｌｌ社）などを用いることができる。

なお、単離した骨髄関連細胞は、例えばメチルセスロース法により、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏを添加して培養することもできる（Ｓｏｎｏｄａ，Ｙ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８４：４０９９−４１０６，１９９４；Ｋｉｍｕｒａ Ｔ．ら，Ｂｌｏｏｄ ９０：４７６７−４７７８，１９９７）。細胞は１×１０^２から１×１０^４／ｍｌ程度で添加し、例えば３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２下で培養する。但し、培養条件は適宜調整してよい。

自家移植に用いるＣＤ３４陽性細胞数は、例えば２×１０^６／ｋｇ程度である（Ｓｃｈｏｔｓ Ｒ．ら，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １７：５０９−５１５，１９９６；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＴＭ．ら，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １５：４３９−４４４，１９９５）。ＣＤ３４陽性細胞数は、通常の２ ｃｏｌｏｒ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙで計測することができる。具体的には、骨髄細胞や末梢血アフェレーシス細胞を溶血処理により赤血球を除去した後、ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒと抗ＣＤ４５抗体で展開し、ｇａｔｅを決めて赤血球および血小板を除く。次に、このｇａｔｅをｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒと抗ＣＤ３４抗体で展開し、好中球などの非特異反応部分を除いた分画中の細胞数の全細胞数に対する割合で算定する。この値と、予め血球計測機で測定した血球数から、全ＣＤ３４陽性細胞数が算出できる。
凍結保存した細胞に含まれるｖｉａｂｌｅな幹細胞の数は、コロニー形成法によりＣＦＵ−ＧＭを数える方法で知ることができる。移植に必要なＣＦＵ−ＧＭの基準は、一般的には１×１０^５〜２×１０^５／ｋｇである。

（２）本発明の形質転換骨髄関連細胞
本発明の形質転換骨髄関連細胞は、遺伝子を組み込んだベクターが導入され形質転換した骨髄関連細胞である。

骨髄関連細胞の形質転換に使用する遺伝子は、組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子であるか、あるいは、マーカー遺伝子を含む。

組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子は、形質転換された骨髄関連細胞において発現され、当該遺伝子産物が組織の維持および／または修復に直接有用なものでよい。あるいは当該遺伝子産物が、骨髄関連細胞が本来有する組織の維持および／または修復する機能を、直接的若しくは間接的に補助する機能を有するものであってもよい。本発明に使用しうる遺伝子の一態様として、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキン、ＧＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ、ＣｒｘおよびＯｔｘ２からなる群から選択される、細胞の分化・増殖制御活性および様々な機能制御活性を有するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子が含まれる。こうした遺伝子の核酸配列の情報は、遺伝子データベース（例えば、ＮＣＢＩ）から入手可能である。したがって、当業者であれば、入手した遺伝子情報を利用することにより、発現ベクター等に組み込むことが可能である。

例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）であれば、Ｍｉｙａｚａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３，９６７−９７３，１９８９、Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０−４４３，１９８９、Ｓｅｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７２，３２１−３２７、１９９０、Ｔａｓｈｉｒｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３２００−３２０４，１９９０、Ｏｋａｊｉｍａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９３，３７５−３８１，１９９０、Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６，１５１１−１１５９，２０００などによって報告されている。ＨＧＦとしては、天然のポリペプチドに加え、多くのバリアントが知られている。例えば、特開平５−１１１３８３、米国特許第４６８３１９５号、同４８１６５６７号、同４７４５０５５号、同４４４４８７８号、欧州特許第２５６６５４号、同１２０６９４号、同１２５０２３号、同２５５６９４号、同２６６６６３号、国際公開第８８／０３５５９号、同８８／０３５６５号、同９４／０６４５６号に記載のＨＧＦおよびその誘導体をコードする遺伝子を用いることもできる。また、ヒトＨＧＦのアミノ酸５３４、６７３および／または６９２位のアミノ酸が置換されたＨＧＦを用いることができる（特開２００４−０００２３６号）。ＨＧＦ遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００６０１の１６６から２３４９番目およびＮＭ＿００１０１０９３２の１６６から２３３４番目、ＨＧＦのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０００５９２およびＮＰ＿００１０１０９３２にも記載されている。さらに、ＨＧＦとして、免疫グロブリン定常領域やフィブロネクチン断片などの所望のポリペプチドが付加された融合蛋白質を用いてもよい（特開２００４−２６９４２３、国際公開第９１／０８２９８号）。

線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とも呼ばれ、線維芽細胞の増殖のみならず、血管内皮細胞、軟骨、骨芽細胞、表皮細胞など様々な細胞の増殖を促進する活性を有する因子として知られている（Ａｂｒａｈａｍら，ＥＭＢＯ Ｊ．，５，２５２３−２５２８，１９８６、Ｐｒａｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１８３６−１８４０，１９８９）。例えばＦＧＦ２遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００２００６の６９から９３２番目、ＦＧＦ２のアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００１９９７にも記載されている。ＦＧＦ２としては、天然の蛋白質のみならず、組み換えＤＮＡ技術により遺伝子工学的に製造されたもの、およびそれらの修飾体であってもよい。例えば国際公開第８７／０１７２８、同８９／０４８３２、同８６／０７５９５、同８７／０３８８５、欧州特許出願公開第２３７９６６号、同２８１８２２号、同３２６９０７号、同３９４９５１号、同４９３７３７号などに記載のものを例示することができる。

インターフェロン（ＩＦＮ）であれば、例えばＩＦＮ−αは、Ｇｒｅｎら（１９８４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．４（４）：６０９−６１７、およびＷｅｉｓｍａｎｎら（１９８２）Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｓｙｍｐ．１２：１−２２に、ＩＦＮ−βはＤｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８５，５４２−５４７（１９８０）；Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，９５２２−９５２９（１９８３）；Ｋｕｇａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，３２９１（１９８９）を参照できる。例えばＩＦＮ−α１遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０２４０１３の６８から６３４番目、ＩＦＮ−α１のアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０７６９１８にも記載されている。ＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００２１７６の７６から６３６番目、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００２１６７にも記載されている。ＩＦＮ−γ遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００６１９の１２７から６２４番目、ＩＦＮ−γのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０００６１０にも記載されている。上記のサイトカインには多型およびバリアントが存在する。野生型と同等の活性を持つものであれば、これらの多型およびバリアントを適宜使用することができる。本発明においてＩＦＮには、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ等が含まれるが、好ましくはＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよび−β）である。

各種サイトカインおよびその誘導体の生物学的活性は、周知の方法によりアッセイすることができる。例えばＨＧＦであれば、インビトロまたはインビボにおける肝細胞増殖の促進を検出することにより測定できる。具体的には、肝細胞の初代培養に天然または人工のＨＧＦを添加し、細胞のＤＮＡ合成の促進を検出することにより肝細胞分裂促進作用を同定することができる。肝細胞のＤＮＡ合成は、［^３Ｈ］チミジンの取り込みによりアッセイが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２，１４０−１４５９，１９８４、同，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４，１０２９−１０３５，１９８３）。ＦＧＦ２であれば、線維芽細胞または血管内皮細胞などに対する増殖促進活性を上記と同様に検出することができる。ＩＦＮであれば、例えばｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓによる細胞毒性を阻害する活性のアッセイにより、抗ウイルス活性を測定することができる。具体的には、ＷＩＳＨ ｃｅｌｌｓ（ＣＣＬ−２５；Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）にｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ−Ｉｎｄｉａｎａ−ｖｉｒｕｓ［ＶＲ−１２３８ＡＦ；Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．］を接種し、ウイルスによる細胞死を検出し、ＩＦＮによる防御を測定する（測定条件は、Ｋｎｅｚｉｃ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２５，２１５−２２１に従う）。

本明細書において、「細胞の分化・増殖制御活性」とは、細胞を量的にコントロールし、目的の機能を有する細胞を増加させる活性をいう。
本明細書において、「細胞の機能制御活性」とは、細胞の機能を質的にコントロールし、既存の細胞において目的の機能を向上させる活性をいう。

本明細書において、「免疫抑制に関連する因子」とは、免疫反応を弱める、回避する、あるいは積極的に免疫寛容を導く活性を有するタンパク質、ペプチドをいう。
本明細書において、「マーカー」とは、組織または細胞の免疫組織学的染色または直接または間接免疫蛍光染色に適したタンパク質をコードする遺伝子をいう。好ましくはＧＦＰ、Ｌｉｖ２、ＨＮＦ４、Ａ６、アルブミン、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＳＥＡＰ、より好ましくはＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、さらにより好ましくはＧＦＰである。なお、ＧＦＰは、緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の略称である。

これらのマーカー遺伝子は、形質転換された骨髄関連細胞において発現され、マーカー遺伝子の種類に応じた公知の検出方法によって検出可能である。例えば、ＧＦＰは、４９０ｎｍないし５２０ｎｍの範囲で蛍光検出することが可能である。よって、直接または間接免疫蛍光染色によって、前記骨髄細胞の組織における局在を蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。

さらに、ＧＦＰの変異体でより強い蛍光を発するＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より入手可能）などもマーカーとして使用可能である。

骨髄関連細胞に遺伝子を組み込むことができるベクターとしては、簡単には当該技術分野において入手可能な発現ベクターである。発現ベクターの種類は、骨髄関連細胞において、所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されない。例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター等が含まれる。ウイルスベクターは、特にアデノウイルスベクター、センダイウイルスベクターを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターなどが好ましい。特に好ましくはアデノウイルスベクター、およびセンダイウイルスベクターなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである。

ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法および遺伝子発現は、村松、山本編集、「実験医学別冊 新訂 新遺伝子工学ハンドブック」改訂版（羊土社）、１９９９年、ｐ．２０２−２１５に準じて行うことができる。ウイルスベクターは動物培養細胞における発現効率が高いことで知られている。後述する実施例１に記載したように、骨髄細胞での遺伝子発現は、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクターともに８０％以上の細胞で認められた。こうしたウイルスベクターを用いることによって、遺伝子導入した細胞を死滅させることなく、遺伝子発現を行うことができ、該遺伝子の機能を調べることも可能となる。また、組換えウイルスベクターの調製法は極めて非効率であることが知られているが、例えば、ＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１３２０−１３２４（１９９６））を採用することにより、調製効率を高めることができる。

さらに例を挙げれば、アデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法および他（Ｍｉｙａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３巻，１３２０−１３２４，１９９６、Ｋａｎｅｇａｅら，Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ，３８巻，１８２−１８８，１９９６、鐘ヶ江ら，バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法，４３−５８，羊土社，１９９４、鐘ヶ江ら，細胞工学，１３巻，８号，７５７−７６３，１９９４）に従って製造することができる。また、例えばレトロウイルスベクターであれば、脇本ら，蛋白質核酸酵素，４０巻，２５０８−２５１３，１９９５、アデノ随伴ウイルスベクターであれば、玉寄ら，蛋白質核酸酵素，４０巻，２５３２−２５３８，１９９５の方法により、ベクターを調製することができる。哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウイルスベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０２０６９、特公平６−９５９３７、特公平６−７１４２９が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平６−３４７２７、特表平６−５０５６２６が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平５−３０８９７５が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０８０３９が知られている。マイナス鎖ＲＮＡウイルスであれば、国際公開番号９７／１６５３９、同９７／１６５３８、同００／７００５５、同００／７００７０などに記載の方法が知られている。

マイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］ＲＮＡをゲノムに有する一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（非分節型（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスとも言う）が特に好ましい。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。

本発明において用いられるマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、より好ましくは、パラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウィルス属（ｇｅｎｕｓ Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。

また、本発明において用いるマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、１つまたは複数のエンベロープ構成蛋白質の遺伝子を欠損するものが好ましい。エンベロープ構成蛋白質とは、ウイルスのエンベロープの成分となるウイルス蛋白質を言い、エンベロープ表面に露出し細胞への接着または感染に機能するスパイク蛋白質およびエンベロープの形成等に機能する裏打ち蛋白質が含まれる。典型的には、エンベロープ構成蛋白質の遺伝子としてはＦ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）、およびＭ（マトリックス）が挙げられ、ウイルス種によってはＨ（ヘマグルチニン）、Ｍ１、およびＧ等の遺伝子が含まれる。これらのエンベロープ構成蛋白質の遺伝子の１つまたは複数を変異および／または欠失させたウイルスは、感染細胞における感染性ウイルス粒子の形成能が低下するため安全性が高い。また細胞傷害性が有意に低下する。ゲノムにおいて欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子、ＨＮ（またはＨ）遺伝子、Ｍ遺伝子、またはその任意の組み合わせが挙げられる。特に好ましくは、Ｆ遺伝子が欠損している。Ｆ遺伝子が欠損しているとは、少なくともＦ遺伝子が欠損しているということであり、さらに他の遺伝子を欠損していてもよい。より好ましくは、少なくともＦ遺伝子およびＨＮ（またはＨ）遺伝子が欠損している。さらに好ましくは、Ｆ遺伝子、ＨＮ（またはＨ）遺伝子およびＭ遺伝子が欠損している。

より具体的な組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの再構成は、例えば以下の文献を参照することができる（国際公開番号（ＷＯ）９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；ＷＯ００／７００５５；ＷＯ００／７００７０；ＷＯ０１／１８２２３；ＷＯ０３／０２５５７０；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７：２３５；３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９５：９２；８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９４：１３；４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９５：１４；５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９５：１４；６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ら，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．，１９９６：１；５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．およびＢａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７：７１；１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．およびＥｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９６：９３；１５４００−１５４０４；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７：７８；２８１３−２８２０、Ｋａｔｏ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７：１６；５７８−５８７、Ｙｕ，Ｄ．ら，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，１９９７：２；４５７−４６６、Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，２００２：８６；３３−３８、Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００：７４；６５６４−６５６９；Ｈｉｒａｔａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２：１０４；１２５−１３３；Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３：７７；６４１９−６４２９；Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．．２００４；６：１０６９−１０８１）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスをＤＮＡから再構成させることができる。

組換えウイルスベクターの好ましい態様は、ａｄｅｘＨＧＦ（ＨＧＦ遺伝子を担持したアデノウイルスベクター）、ＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ（ＦＧＦ遺伝子を担持し、Ｆ遺伝子フラグメントを欠失させたセンダイウイルスベクター）、ＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦ（ＩＦＮβ遺伝子を担持し、Ｆ遺伝子フラグメントを欠失させたセンダイウイルスベクター）である。より好ましくは、ａｄｅｘＨＧＦ、ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ、ＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦである。具体的には、後述する実施例２などに記載したように、本発明の形質転換骨髄関連細胞は、ａｄｅｘＨＧＦ、ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ、ＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦなどを感染させることによって調製することができる。

本発明の一態様においては、ウイルスベクターに限定されず、動物細胞に通常使用される組換えベクターを使用することもできる。プラスミド等のベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法が挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法によって導入し、増幅・精製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，前記）。さらに、組換え発現ベクターの構築は、常法に従って行うことができ、例えば、制限酵素処理および連結作業を必要としないＧａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いて行うこともできる。発現ベクターの種類は、特に限定されないが、例えば、哺乳類細胞用発現ベクターとしてはｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎなどが好ましい。本発明の形質転換骨髄関連細胞は、組換え発現ベクターを骨髄関連細胞に導入することによって得ることができる。

本発明の一態様において、維持および／または修復の対象となる組織には、疾患組織が含まれる。ここで、疾患とは、細菌感染、ウイルス感染、アルコール摂取、薬物投与、癌化、遺伝子発現の異常などによって、生体の一部または全部の臓器または組織が正常の機能を維持できなくなった状態、またはこのような状態にある患者をいう。限定されるわけではないが、疾患には、炎症性疾患、肝疾患、免疫性疾患、癌疾患、遺伝子疾患などが含まれる。本発明の一態様において、炎症性疾患には、肝疾患が含まれる。好ましくは、肝障害、肝不全、肝炎、肝硬変、脂肪肝、肝癌、より好ましくは、肝障害、肝不全、肝炎である。すなわち本発明は、骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子を搭載するベクターを用いた肝疾患治療薬の製造方法、および肝疾患治療薬の製造における、骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子を搭載するベクターの使用、および該ベクターが導入された骨髄関連細胞の同使用に関する。本発明の形質転換骨髄関連細胞の投与により、肝逸脱酵素であるＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨの測定値を減少させ、肝機能を改善することができる。従って本発明は、骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子を搭載するベクターを用いた、肝機能改善剤の製造方法、および肝機能改善剤の製造における、骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子を搭載するベクターの使用、および該ベクターが導入された骨髄関連細胞の同使用に関する。ベクターに搭載させる遺伝子としては、特にＨＧＦ、ＦＧＦ２、およびＩＦＮβが挙げられる。

具体的には、本発明は以下の発明も含まれる。
〔１〕ＨＧＦ、ＦＧＦ２、またはＩＦＮをコードするベクターを骨髄関連細胞を導入する工程を含む、肝疾患治療薬の製造方法。
〔２〕ベクターがＨＧＦまたはＦＧＦ２をコードする、〔１〕に記載の方法。
〔３〕ベクターがＩＦＮをコードする、〔１〕に記載の方法。
〔４〕肝疾患が、肝障害、肝不全、肝硬変、または肝炎である、〔２〕に記載の方法。
〔５〕肝疾患が、肝癌である、〔３〕に記載の方法。
〔６〕該ベクターが、アデノウイルスベクターまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕該ベクターがＦ遺伝子を欠損するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔６〕に記載の方法。
〔８〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔９〕上記〔１〕から〔８〕のいずれかの方法により製造された肝疾患治療薬。
〔１０〕ＩＦＮをコードするベクターが導入された骨髄関連細胞および薬学的に許容される媒体を含む抗癌剤。
〔１１〕癌が肝癌である、〔１０〕に記載の抗癌剤。
〔１２〕該ベクターが、アデノウイルスベクターまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔１０〕または〔１１〕に記載の抗癌剤。
〔１３〕該ベクターがＦ遺伝子を欠損するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔１２〕に記載の抗癌剤。
〔１４〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔１２〕または〔１３〕に記載の抗癌剤。

本発明の一態様において、本発明の形質転換骨髄関連細胞の使用により、維持および／または修復される対象は、臓器であってもよい。臓器には、肝臓、腎臓、心臓が例示される。

本発明の一態様において、維持および／または修復の対象となる組織には、組織移植後の組織が含まれる。限定されるわけではないが、移植組織には、皮膚組織、各種の臓器（例えば、肝臓、腎臓、心臓）の組織が含まれる。さらに、移植組織は、自己、非自己のいずれの組織であってもよい。また、移植組織は、生体から取り出した組織に限定されず、生体から細胞または組織の一部を取り出し、生体外において培養して増殖させた培養組織、あるいは該細胞または組織を生体適合材料に組み込んだ人工培養組織であってもよい。

本明細書において、組織の「維持および／または修復」とは、組織または組織を構成する細胞がその機能を一定に保つこと、疾患によって損なった機能を一定レベルにまで回復すること、あるいは疾患部位の切除後における組織の再構築（再生）をいう。例えば、本発明の一態様において、肝疾患における肝逸脱酵素であるＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨの測定値を減少させることができる。ここで、本発明の形質転換骨髄関連細胞の使用により、「肝逸脱酵素値を下げる」とは、肝疾患における肝逸脱酵素値が、１／３以下、好ましくは１／５以下、より好ましくは１／１０以下、さらに好ましくは１／２０以下、さらにより好ましくは１／３０以下、最も好ましくは正常値まで下がることをいう。後述する実施例２に記載したように、本発明の形質転換骨髄関連細胞は、肝疾患のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨをそれぞれおよそ１／２３、１／２２、１／１４まで下げることができる。なお、ＧＯＴは、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼの略称であり、ＧＰＴは、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼの略称であり、ＬＤＨは、乳酸デヒドロゲナーゼの略称である。

本発明によれば、本発明の形質転換骨髄関連細胞を安全かつ効果的に投与することができれば、その投与経路は特に限定されない。このような条件が満たされる限り、末梢血管内、皮下、筋肉内、局所、腹腔内、脳室内、髄腔内、胸腔内への投与であってもよい。好ましくは、末梢血管内、皮下への投与、より好ましくは、末梢血管内への投与である。投与剤形は、当業者であれば、前記投与経路において適切な剤形を選択することができ、特に限定されない。例えば、本発明の形質転換骨髄関連細胞を緩衝溶液などに懸濁した溶液剤形として使用可能である。一般的に、投与時の形質転換骨髄関連細胞の使用濃度は、溶液剤形の場合は、１日あたり細胞密度としては約１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌないし約１×１０^１１ｃｅｌｌｓ／ｍｌであり、投与量は、約１ｍｌないし約１０００ｍｌである。また、１日あたりの量を適宜数回に分けて投与することもできる。当業者であれば、投与される疾患の年齢、体重、症状、投与経路、投与機関、治療経過、投与剤形に応じて変化させることはできる。投与の対象となる動物に特に制限はないが、例えば所望の哺乳動物が挙げられ、例えばマウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サルなどの非ヒト哺乳動物およびヒトが含まれる。

輸液への血小板の混入による血栓や塞栓を防止するため、抗ヒスタミン剤（ｈｙｄｒｏｘｙｚｉｎｅ ２５ｍｇ または ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒｍｉｎｅ ５ｍｇなど）または副腎皮質ステロイド（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ １００ｍｇ）などの前投与を行うことができる。移植に凍結細胞を用いる場合、移植細胞溶液中の赤血球の溶血が問題となる場合には、ハプトグロビン製剤４，０００単位の点滴などで尿細管障害を予防することができる。末梢血幹細胞移植の場合は、２日間に分けて輸注することも好ましい。

本発明によれば、哺乳動物から取り出した骨髄関連細胞に、遺伝子を組み込んだベクターを用いて該遺伝子を導入することを含む、形質転換骨髄関連細胞を調製する方法を提供することができる。本発明の形質転換骨髄関連細胞を調製する方法には、（ｉ）骨髄関連細胞を取り出すこと、（ｉｉ）ベクターに遺伝子を組み込むこと、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）で調製したベクターを（ｉ）の骨髄関連細胞に導入すること、が含まれる。各工程で使用可能な手法は、上述した通りである。但し、骨髄関連細胞の調製や、ベクターの作製は、骨髄関連細胞へのベクターの導入とは独立して行うことができる。

骨髄関連細胞へのベクターの導入は、プラスミドベクター等であれば、例えばリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９７３：５２；４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ．１９７７：１１；２２３；Ｃｈｅｎ，Ｃ．およびＯｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７：７；２７４５）、種々のトランスフェクション試薬を用いた方法、あるいは電気穿孔法等を用いることができる。トランスフェクション試薬については、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９８８５ Ｍ．Ｗ． ５×１０^５）、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． ＭＩＲ２３００）などを用いることができる。ウイルスベクターを用いる場合は、適当な生理的水溶液中で骨髄関連細胞をウイルスベクターと接触させることにより導入することができる。ウイルスベクターと骨髄関連細胞との接触は、体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）で行うことができ、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液中で実施すればよい。

ベクターと骨髄関連細胞との接触においては、ＭＯＩ（多重感染度；細胞１つあたりの感染ウイルス数）は１〜５００の間にすることが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００、さらに好ましくは５〜１００、さらに好ましくは７〜７０である。ベクターを導入した骨髄関連細胞は、薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせて移植組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、生細胞を懸濁できる溶液であれば制限はない。例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が挙げられる。

本発明によれば、本発明の形質転換骨髄関連細胞を調製するための、遺伝子を担持する組換えベクターの使用方法を提供することができる。
本発明によれば、本発明の形質転換骨髄関連細胞を生体内に投与することを含む、組織の維持および／または修復する方法を提供することができる。

本発明によれば、本発明の形質転換骨髄関連細胞を用いて疾患を診断する方法を提供することができる。本発明の方法は、マーカー遺伝子を組み込んだベクターが導入された、本発明の形質転換骨髄関連細胞を生体内に投与し、疾患組織における修復過程を観察することによって、行うことができる。

本発明の一態様においては、マーカー遺伝子としてＧＦＰをコードする遺伝子をウイルスベクターに組み込んだａｄｅｘＧＦＰ、ＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦなどが使用できる。より具体的には、後述する実施例３に記載したように、ラットを用いた場合には、採取した骨髄細胞にａｄｅｘＧＦＰまたはＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦを導入し、形質転換した骨髄細胞をラットの末梢血管に投与する。骨髄細胞の採取についての詳細な手法については、Ｔｅｒａｉら（２００３）の報告（前述）に従って行うことができる。ラットに投与して所定時間後（例えば、２４時間後、４８時間後）に、ラットから組織（例えば、肝臓、肝組織）を採取し凍結乾燥後に組織切片を作成する。このような組織の採取、固定法、切片の作製などは、常法に従って行うことができる。組織における修復過程の経過観察は、所定時間後の各組織を、例えば、直接または間接免疫蛍光染色によって、前記骨髄細胞の組織における局在を蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。蛍光染色による組織観察は、Ｔｅｒａｉら（２００３）、Ｌｉら（２０００）の報告（ともに前述）に記載した手法に準じて行うことができる。当業者であれば、組織観察は、使用するマーカー遺伝子の種類に応じて適切なものを使用可能である。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
当業者は、本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
なお、本明細書において引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。

実施例１ 遺伝子発現の評価
骨髄細胞における遺伝子発現を評価するために、ＧＦＰ遺伝子搭載アデノウイルスベクター（ａｄｅｘＧＦＰ）、ＧＦＰ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（ＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦ）を用いて行った。骨髄細胞は、雄ウイスター系ラット（１０−１２週齢、体重２５０−３００ｇ／匹；日本クレア）の大腿骨から採取した。骨髄細胞の採取は、Ｔｅｒａｉらの報告（前述）に記載されている方法に準じて行った。調整した骨髄細胞懸濁液を２４ウェルプレート（コーニング）にそれぞれ１ｍｌずつ播種した。直ちに、ａｄｅｘＧＦＰは２０ＭＯＩ、ＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦは１０ＭＯＩの濃度で培養した骨髄細胞に感染させた。マグネットスターラーで１５分間撹拌し、その後、３７℃で３０分間培養した。この工程をさらに１回行った。続いて、骨髄細胞をＰＢＳで２回洗浄し、生理食塩水１ｍｌ／ウェルを加え、遺伝子導入４８時間後に、骨髄細胞を回収し、ＦＡＣＳ（ベクトンディッキンソン）にて遺伝子発現を評価した。

骨髄細胞での遺伝子発現は、ａｄｅｘＧＦＰ、ＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦともに８０％以上の細胞で認められた。また、遺伝子発現強度（ｍｅａｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｈｉｆｔ）は、ａｄｅｘＧＦＰでは１２．６±０．２、ＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦでは１６．６±０．４であり、センダイウイルスの方が優れていた。なお、対照群の非感染細胞では、１．９±０．５であった。

実施例２ 肝疾患動物モデルにおける肝機能の修復
疾患組織の修復における本発明の形質転換骨髄関連細胞における効果を調べるために、実験動物を用いて検討した。動物は、実施例１と同様の雄ウイスターラットを使用した。肝疾患として急性肝不全モデルは、ラットに四塩化炭素（ＣＣｌ_４；Ｓｉｇｍａ）を０．４ｍｌ／ｋｇ／匹で腹腔内注射することによって作成した。骨髄細胞の採取は、Ｔｅｒａｉらの報告（前述）に記載されている方法に準じて行った。同系ラットの大腿骨から採取した骨髄細胞は、平衡塩溶液に１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整した。該細胞に導入する遺伝子は、ＨＧＦまたはｈＦＧＦ−２をコードする遺伝子であり、それぞれの遺伝子を組込んであるＨＧＦ遺伝子搭載アデノウイルスベクター（ａｄａｘＨＧＦ；理研ジーンバンク、ＲＤＢ Ｎｏ．１５５３）、ｈＦＧＦ−２遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ； Ｌｉ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，６５６４−６５６９（２０００）， Ｍａｓａｋｉ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９０，９６６−９７３（２００２））を組換えウイルスベクターとして使用した。

調整した細胞懸濁液を２４ウェルプレート（コーニング）にそれぞれ１ｍｌずつ播種した。直ちに、ａｄｅｘＨＧＦは２０ＭＯＩ、ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦは１０ＭＯＩの濃度で培養した骨髄細胞に感染させた。マグネットスターラーで１５分間撹拌し、その後、３７℃で３０分間培養した。この工程をさらに１回行った。続いて、骨髄細胞をＰＢＳで２回洗浄し、生理食塩水１ｍｌ／ウェルを加え、投与のための骨髄細胞の懸濁液として準備した。一方、ＣＣｌ_４投与４時間後、準備した骨髄細胞をラットの末梢静脈（尾静脈）から１ｍｌ（１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）注射し、ＣＣｌ_４投与２４時間後の血清を採取し、肝逸脱酵素（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ）値を測定した。ＧＯＴの酵素活性はシカリキッドＡＳＴ、ＧＰＴの酵素活性はシカリキッドＡＬＴ、ＬＤＨの酵素活性はシカリキッドＬＤＨＪ（全て、関東化学）を用いて測定した。

ラット急性肝不全モデルでのＣＣｌ_４投与２４時間後の肝逸脱酵素（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ）の測定値を表１に示す。正常値は、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨいずれも３０ＩＵ／ｌ以下である。

表１ 形質転換骨髄細胞による肝不全モデルの肝逸脱酵素値の改善

ＨＧＦまたはｈＦＧＦ−２の遺伝子を導入した骨髄細胞を投与することにより、未治療群に比べて、肝逸脱酵素値の顕著な低下が観察された。ＨＧＦとｈＦＧＦ−２とを比較した場合、ｈＦＧＦ−２の方がその効果が大きかった。未治療群と比較して、ＧＯＴ値は約１／２３、ＧＰＴ値は約１／２２、ＬＤＨ値は約１／１４まで減少した。以上の結果は、肝障害が進行している過程で、遺伝子導入骨髄関連細胞を末梢静脈から投与することで肝障害の修復、治療が促進することを示している。

実施例３ 組織修復の経過観察
急性肝不全モデルのラットの肝組織における修復過程は、ＧＦＰなどのマーカー遺伝子導入骨髄細胞を投与することにより検討することができる。ａｄｅｘＧＦＰまたはＧＦＰ−ＳｅＶ／ΔＦを遺伝子導入した骨髄細胞をラットの末梢血管に投与し、所定時間後に、ラットから肝臓を採取し凍結乾燥後に肝組織切片を作成することができる。肝組織における修復過程の経過観察は、所定時間後の各肝組織を、直接または間接免疫蛍光染色によって、前記骨髄細胞の組織における局在を蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。蛍光染色による組織観察は、Ｔｅｒａｉら（２００３）、Ｌｉら（２０００）の報告（ともに前述）に記載した手法に準じて行うことができる。

実施例４ 遺伝子導入骨髄細胞による肝癌に対する治療効果
雄ウィスターラット（日本クレア）の生後５週より、１％ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）を週一回７週間腹腔内注射し、さらにフェノバルビタール入り飼料（中部科学飼料）を１２週間毎日給餌することによって肝癌モデルを作製した。実験開始から６ヶ月後に以下の実験に使用した。骨髄細胞移植実験はＴｅｒａｉらの報告（Ｔｅｒａｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４，５５１−５５８（２００３））の方法に準じて行った。骨髄細胞採取は、同ウィスターラットの大腿骨から行い、１ｘ１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。遺伝子導入は、ヒトインターフェロンβ（ＩＦＮβ）遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（ｈＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦ：Ｌｉ，ＨＯ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６５６４−６５６９（２０００））を用いた。２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いて、ｈＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦをＭＯＩ＝１０で感染を行った。１５分マグネティックスターラーで攪拌、３０分インキュベーションを２回行い、細胞をＰＢＳで２回洗浄、生理食塩水１ｍｌを加えて準備した。このようにして準備したｈＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦによるｈＩＦＮβ遺伝子導入骨髄細胞（１ｘ１０^８ｃｅｌｌｓ）を末梢静脈（尾静脈）から注射した。骨髄細胞注射１ヶ月後に犠牲死させ、腫瘍数、腫瘍長径を測定した。骨髄注射を行わなかった対照の肝癌モデルにおける腫瘍数、腫瘍長径値と比較した。

その結果、骨髄細胞注射１ヶ月後の肝癌モデルにおける、腫瘍数（ｎｕｍｂｅｒ）／腫瘍径（ｍｍ）は、
未治療群（ｎ＝５）：１１±２．３／２．６±０．８
ＢＭ＋ｈＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦ導入骨髄細胞注入群（ｎ＝５）：３．６±０．５／０．７±０．１
であった（平均±S.D.）。以上の結果は、ｈＩＦＮβ−ＳｅＶ／ΔＦによるｈＩＦＮβ遺伝子導入骨髄細胞投与によって、肝癌の進行を抑制すること、あるいは肝癌の修復、治癒に効果があることが示している。

実施例５ 肝切除モデルにおける遺伝子導入骨髄細胞による治療効果
雄ウィスターラット（１０−１２週齢，２５０−３００ｇ：日本クレア）を用い、７０％肝切除を施行し（肝左葉切除）、切除後直ちに遺伝子導入骨髄細胞を注射した。この骨髄細胞移植実験はＴｅｒａｉらの報告（Ｔｅｒａｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４，５５１−５５８（２００３））の方法に準じて行った。骨髄細胞採取は、同ウィスターラットの大腿骨から行い、１ｘ１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。遺伝子導入は、ヒトＦＧＦ−２遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ：Ｌｉ，ＨＯ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６５６４−６５６９（２０００），Ｍａｓａｋｉ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０（９），９６６−９７３（２００２））を用いた。２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いて、ＭＯＩ＝１０で感染を行った。１５分マグネティックスターラーで攪拌、３０分インキュベーションを２回行い、細胞をＰＢＳで２回洗浄、生理食塩水１ｍｌを加えて準備した。７０％肝切除施行（肝左葉切除）後直ちに、準備した骨髄細胞を末梢静脈（尾静脈）から注射し、２４時間後の血清を採取、肝逸脱酵素値を測定した。

その結果、７０％肝切除および骨髄細胞注射後２４時間後のＧＯＴ／ＧＰＴ／ＬＤＨそれぞれの値は、
未治療群（ｎ＝５）：１１８６±１３７／６６２±４９／３２５０±２０５
ＢＭ＋ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦ（ｎ＝５）：７６４±８２／３５６±４１／１２６６±１１０
であった（平均±S.D.）。以上の結果は、大量肝切除時の肝組織傷害が進行している過程で、ｈＦＧＦ２−ＳｅＶ／ΔＦによるｈＦＧＦ２遺伝子導入骨髄細胞を投与することによって、肝障害の修復、および治癒が可能であることを示している。

本発明により、遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞を用いることによって、疾患組織の修復を行うことができた。疾患は、炎症疾患に限定されることはなく、免疫疾患、癌疾患、遺伝子疾患などを問わず、本発明の形質転換骨髄関連細胞が疾患・病態の組織修復に関与する可能性が示された。

Claims (31)

1. 遺伝子を組み込んだベクターが導入された形質転換骨髄関連細胞であって、組織の維持および／または修復に関連する前記形質転換骨髄関連細胞。
2. 前記遺伝子が、組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子であるか、あるいは、マーカー遺伝子である、請求項１に記載の形質転換骨髄関連細胞。
3. 組織の維持および／または修復に直接関与する、又は形質転換された骨髄関連細胞による組織の維持および／または修復する機能を補助する機能を有する遺伝子が、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキン、ＧＣＳＦ、ＭＣＳＦ，ＳＣＦ、ＩＦＮ、Ｃｒｘ、およびＯｔｘ２からなる群から選択される細胞の分化・増殖制御活性または細胞の機能制御活性を有するタンパク質若しくはペプチドをコードする遺伝子である、請求項２に記載の形質転換骨髄関連細胞。
4. 前記ベクターが、アデノウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクターである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
5. アデノウイルスベクターがＨＧＦ遺伝子を搭載したアデノウイルスベクターである、請求項４記載の形質転換骨髄関連細胞。
6. センダイウイルスベクターがＦＧＦ２遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターである、請求項４に記載の形質転換骨髄関連細胞。
7. センダイウイルスベクターがＩＦＮ遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターである、請求項４に記載の形質転換骨髄関連細胞。
8. 骨髄関連細胞が、骨髄細胞、骨髄由来細胞である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
9. 前記組織が疾患組織である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
10. 疾患が肝疾患である、請求項９に記載の形質転換骨髄関連細胞。
11. 肝逸脱酵素値を下げる、請求項１０に記載の形質転換骨髄関連細胞。
12. 疾患が癌である、請求項９に記載の形質転換骨髄関連細胞。
13. 癌が肝癌である、請求項１２に記載の形質転換骨髄関連細胞。
14. 末梢血管に投与するための、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の形質転換骨髄関連細胞。
15. 哺乳動物から取り出された骨髄関連細胞に、遺伝子を組み込んだベクターを用いて該遺伝子を導入することを含む、形質転換骨髄関連細胞の調製方法。
16. 形質転換骨髄関連細胞を調製するための、遺伝子を担持する組換えベクターの使用。
17. 請求項１から１４のいずれかに記載の形質転換骨髄関連細胞を含む、組織の維持および／または修復のための医薬。
18. 請求項１０に記載の形質転換骨髄関連細胞を含む肝疾患治療薬。
19. 肝疾患が肝障害、肝不全、肝硬変、または肝炎である、請求項１８に記載の肝疾患治療薬。
20. 肝疾患が肝癌である、請求項１８に記載の肝疾患治療薬。
21. 遺伝子がＨＧＦまたはＦＧＦ２である、請求項１８または１９に記載の肝疾患治療薬。
22. 遺伝子がＩＦＮである、請求項１８または２０に記載の肝疾患治療薬。
23. ベクターが、アデノウイルスベクターまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項１８に記載の肝疾患治療薬。
24. ベクターがＦ遺伝子を欠損するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項２３に記載の肝疾患治療薬。
25. 請求項１０に記載の形質転換骨髄関連細胞および薬学的に許容される媒体を含む組成物を調製する工程を含む、肝疾患治療薬の製造方法。
26. 肝疾患が肝障害、肝不全、肝硬変、または肝炎である、請求項２５に記載の方法。
27. 肝疾患が肝癌である、請求項２５に記載の方法。
28. 遺伝子がＨＧＦまたはＦＧＦ２である、請求項２５または２６に記載の方法。
29. 遺伝子がＩＦＮである、請求項２５または２７に記載の方法。
30. ベクターが、アデノウイルスベクターまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項２５に記載の方法。
31. ベクターがＦ遺伝子を欠損するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法。