WO2004074494A1

WO2004074494A1 - 虚血疾患の治療方法

Info

Publication number: WO2004074494A1
Application number: PCT/JP2004/000957
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Hamada; Yoshinori Ito; Kazuhiro Takahashi; Masayuki Morikawa
Original assignee: Dnavec Research Inc.
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2004-09-02
Also published as: CN100402654C; KR20050111593A; EP1600511A1; JPWO2004074494A1; HK1092180A1; US20070036756A1; CA2516486A1; EP1600511A4; CN1777678A

Abstract

　本発明はアンギオポエチン-1 (Ang1) またはAng1をコードするベクターを投与する工程を含む、虚血疾患の治療方法を提供する。また本発明は、Ang1を含む虚血疾患治療キットを提供する。Ang1を発現するベクターを作製し、ラット心筋梗塞急性期にベクターを心筋内に単独投与してAng1を心筋局所で発現させた。その結果、梗塞後死亡率の低下、心筋での血管数の増加、心筋梗塞巣の縮小、および心機能の改善などの顕著な効果が得られることが判明した。Ang1の血管形成作用に必要なVEGFを投与する必要はなかった。さらに、動脈結紮により誘導した重症虚血肢モデル動物にAng1発現ウイルスベクターを単独投与したところ、顕著な救肢効果が得られることが判明した。Ang1遺伝子治療は、虚血性心疾患および四肢虚血などの虚血疾患に対する安全かつ効果的な治療法として優れている。

Description

明細書虚血疾患の治療方法技術分野

本発明はアンギオポェチン- 1 (Angiopoietin-l ; Angl) または Anglをコードするベクターを用いる虚血疾患の治療方法に関する。また本発明は、 Anglまたは Ang 1をコードするベクターを含む虚血疾患治療キットに関する。背景技術

急性の損傷または動脈閉塞による虚血は、ときに四肢脱落、機能障害、または死をもたらす重篤な疾患となる。特に急性心筋梗塞 ·重症狭心症などの虚血性心疾患は社会環境変化、老齢ィヒ社会の到来により急速に増加し、成人病のなかでも多くの比重を占めている。急性心筋梗塞に対する治療は PTCA (経皮冠動脈形成術） •CABG (冠動脈パイパス術）など外科的な血行再建術が主体である。これらの既存の治療法に加え血管再生を促進する遺伝子工学的手法を合わせることにより心機能の積極的な改善、病床期間の短期化が可能となり得る。

これまで米国を中心に、その強い血管内皮増殖刺激作用から、血管内皮増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF) 遺伝子 ·蛋白質を用いた冠動脈虚血 (Losordo, D. W. , et al. (1998) Circulation. 98： 2800-2804； Rosengar t, T. K. , et al. (1999) Circulation. 100: 468-474； Lathi, K. G. , et al. (20 01) Anesth Analg. 92： 19—25 ; Symes, J. F.， et al. (1999) Ann Thorac Surg. 68： 830-836； discussion 836-837) およぴ重症虚血肢 (Baumgartner, L , et al . (1998) Circulation. 97： 1114一 1123 ; Isner, J. M. , et al. (1998) J Vase Su rg. 28： 964-973； discussion 973 - 965; Baumgartner, I. , et al. (2000) Ann I ntern Med. 132： 880 - 884) に対する血管新生療法臨床試験が進行中である。また現在のところ、 VEGF遺伝子治療の虚血性心疾患に対する適応は重症狭心症に限られ、急性心筋梗塞はその対象とはなっていない。心筋梗塞などの急性虚血では梗塞後、短時間で心筋局所 ·末梢血白血球 ·単核球、マクロファージでの VEGF産生が亢進し、循環 VEGFが極めて高い状態であることが明らかとなっている（Xu, X.， et al. (2001) J Thorac Cardiovasc Surg. 121： 735-742； Li, J. , et al. (19 96) Am J Physiol. 270： H1803— 1811 ; Ladoux, A. and C. Frelin. (1993) Bioch em Biophys Res Commun. 195： 1005 - 1010 ; Seko Y, et al. Clin Sci 92, 453-45 4, 1997; Banai S, et al. Cardiovasc Res. 28, 1176-1179, 1994； Berse B, et a 1. Mol Biol Cell, 3, 211-220， 1992； Taichman NS, J leukoc Biol, 62， 397-4 00, 1997)。この VEGF産生亢進の生理的意義については不明な点も多いが、虚血部における血管保護 ·修復に働き虚血からの敏速な回復に寄与していると推測されている（Banai S, et al. Cardiovasc Res. 28, 1176-1179, 1994)。その一方で過剰な VEGF投与は脆弱血管おょぴ未成熟血管を増加させ（Thurston, G. , et al. (1 999) Science. 286： 2511-2514)、投与部位で血管腫形成を誘発する（Schwarz, E . R. , et al. (2000) J Am Coll Cardiol. 35： 1323 - 1330)。さらに心筋梗塞での高 VEGF状態が肺水腫などを増悪させ、急性心筋梗塞での死亡率を増加させる可能性があることが最近 Matsunoらに (Matsuno H et al. Blood 100, 2487, 2002) より報告されている。発明の開示 ·

本発明は、 Anglまたは Anglをコードするベクターを用いる虚血疾患の治療方法を提供する。また本発明は、 Anglまたは Anglをコードするベクターを含む虚血疾患治療キットを提供する。

強力な血管誘導作用を有することが知られる VEGF165を心筋梗塞急性期にアデノウィルスベクターにより心筋局所で発現させたところ、生存ラットの梗塞心で血管誘導作用は確認きれたものの、梗塞後 4〜 5日後の急性期死亡率増加が確認された。この死亡ラットを剖検したところ著明な 4〜 5 mlの胸水貯留が認められた (データ省略)。 VEGFが毛細血管透過性を亢進させることから、 VEGF165投与による心筋梗塞後の肺血管透過性を検討したところ著明に増加していた（データ省略)。 Matsunoらは α 1 - antiplasminノックアウトマウスで心筋梗塞後高 VEGF状態が誘導され肺水 JSによる死亡が増加することを報告している。本発明者らが行なった上記の実験においても、心筋梗塞後の高 VEGF状態に加え、 over- expressionした VEGF 165が肺血管の透過性を亢進し肺水腫を誘発し死亡率を増大させたことが推定される。本発明者らは、より安全で有効な心筋梗塞遺伝子治療法を開発するため、ァンギオポェチン- 1 (Angiopoietin-l ; Angl) に着目した。

Tie - 2受容体リガンドである Anglは VEGFと協調的に作用し血管新生 ·血管成熟 · 血管安定化に関わる重要な血管新生因子である（Davis, S. , et al. (1996) Cell . 87: 1161-1169； Sato, T. N. , et al. (1995) Nature. 376： 70—74)。 Anglと VEG Fとを同時に投与することによって、虚血動物モデルにおいて血管再生が促進されることが報告されている（Jones, M. K. , et al. (2001) Gastroenterology. 121：

1040-1047； Chae, J. K.， et al. (2000) Arterioscler Thromb Vase Biol. 20: 2573-2578)。また本発明者らは閉塞性動脈硬化症モデルにおいて Angl遺伝子および VEGF遺伝子を併用した遺伝子治療が VEGFの血管透過性亢進による浮腫などの副作用を軽減しつつ VEGFの血管新生作用を増強することを報告してきた（Ito. , Y.， et al. , Molecular Therapy, 5 (5)， S162, 2002； W002/100441)。今回本発明者らは、虚血心に Anglを単独で投与して、その治療効果を検証した。 Anglは単独では血管内皮増殖刺激活性はないと言われており、実際に、 Anglトランスジェニックマウスでは血管内径の増大が認めらるが血管密度は増加しない（Thurston, G.，

J. Anat. 200： 575-580 (2002) ) 。しかし心筋梗塞などの急性虚血では内因性の VEGFが極めて高い状態であることから、本発明者らは、 Anglの単独投与でも血管新生効果が得られると考えた。すなわち、 Anglを心筋梗塞急性期に使用することにより、生体内で産生が亢進する VEGFと協調的に血管新生を促進し、 VEGF産生亢進に伴う toxicityを軽減しつつ血管再生を促すストラテジ一が可能となると考えた。 Anglは心筋梗塞の増悪にかかわる VEGF、 IL- 1、および TNFなど炎症性サイト力インにより誘導される血管透過性亢進 ·血液凝固亢進状態などを拮抗的に抑制する（Thurston, G. (2002) J Anat. 200: 575—580 ; Thurston, G. , et al. (2000)

Nat Med. 6： 460-463； Thurston, G. , et al. (1999) Science. 286： 2511-2514 )。本発明者らは、 Angl投与により、心筋梗塞急性期に産生の亢進する炎症性サイトカインによる血管透過性亢進 ·血液凝固亢進をも予防できると予想した。

そこで本発明者らは、 Angl遺伝子を発現するアデノウィルスベクターを作製し、ラット心筋梗塞モデルを用いて Angl発現ベクターを心飭内投与し、その血管新生効果、梗塞巣縮小効果、心機能の改善、および死亡率の低下を検討した。

動脈結紮により誘導した心筋梗塞により、梗塞部およびその周辺領域の血管密度は著明に減少した。さらに遺伝子投与部位より離れた中隔心筋でも心筋梗塞後に血管密度の減少が認められた。この理由は不明であるが心筋梗塞後の心不全状態を反映していると推測される。このモデルラット心臓の梗塞予定領域の周辺部にアデノウィルスベクターを心筋内投与した。手術の 5日後に導入遺伝子の発現を調べたところ、梗塞心においても正常心に投与した場合とほぼ同レベル（約 80%) の発現を示し、梗塞周辺領域にベタターを注入することで導入遺伝子の十分な発現量が得られることが実証された。興味深いことに Angl遺伝子投与群において梗塞部とその周辺領域の血管密度が増加していたのみならず中隔領域での血管密度も明らかに増加していた。このことは Anglが投与局所での血管新生を促しているのみではなく流血中に分泌され遠隔心筋での血管新生を誘導することを示唆している。また Angl遺伝子投与群では直径 10 / m以上の血管の増加が明らかであり、さらにより機能的な血管であることを示す周囲細胞を伴つた血管も明らかに増加していた。これは Anglにより誘導された血管がより機能的であることを支持している。

さらに本発明者らは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが、虚血疾患に対する An gl遺伝子治療のために非常に優れた治療効果を奏することを見出した。心筋細胞を用いた遺伝子導入試験では、マイナス鎖 RNAウィルスべクターは心筋細胞に対してアデノウィルスベクターよりも有意に優れた遺伝子導入能を示すことが証明された。そして Angl遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターほ、心筋梗塞および虚血肢に対して優れた治療効果を示した。これまで心血管系、特に心疾患治療ベクターとしては、心筋細胞を含む非分裂細胞に対する遺伝子導入効率の高さ、高遺伝子発現からアデノウイルスベクターが最も汎用されている。しかし高い免疫原性による炎症の誘発、極めて高い月干親和性による副作用発現の可能性が指摘され、アデノウィルスベクターに代わる安全で効率的な遺伝子導入手法が求められている。これまでアデノ随伴ウィルスベクター（MV)、レンチウィルスウイルスべクターなどが試みられ心臓での長期間の遺伝子発現が示されている。これらのレトロウイルスベクタ一や DNAゥィルスベクターは核内にて宿主細胞染色体と相互作用し、宿主染色体への組み込みが懸念される。これに対してマイナス鎖 RNA ウィルスベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれることなく、細胞質において搭載遺伝子を高発現する能力を有すること力ゝら、染色体損傷のリスクがなレ、。マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いた Angl遺伝子治療により、より効果的で安全性に優れた虚血疾患の遺伝子治療が可能になるものと考えられる。

Anglが梗塞心において血管密度を増大させることが明らかとなったが、この血管密度の増大がはたして梗塞巣の減少、心機能の改善に寄与している力否かが臨床応用において最も重要である。心筋梗塞後 4週目に梗塞巣を計測したところ、 A ngl遺伝子投与群において梗塞巣の縮小と梗塞壁厚の増大が認められた。心機能的には特に左室短径短縮率（FS， fractional shortening)、収縮期左室面積（LVAs, left ventricular area at systole)、およひ至駆出率 (EF, ejection fractio n) の改善を認めた。これまで肝細胞増殖因子（HGF)、低酸素誘導因子- l a (HIF- 1 α )、および VEGFがラット左前下行枝結紮による心筋梗塞モデルにおいて血管新生を誘導し、梗塞巣を縮小することが報告されている。しカしながら、血管新生因子単独で重篤な心筋梗塞での心機能を改善した報告はほとんどなく、心機能の改善は胎児心筋、 ES細胞、筋芽細胞など心筋の絶対量を補う細胞療法を併用した場合にのみに効果が認められている（Yau, T. M. , Circulation 104： 1218- 1222 ( 2001)； Suzuki, K. , Circulation 104： 1207-212 (2001)； Orlic, D.， Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 98: 10344-10349 (2001) )₀ 本発明において Anglの単独投与が、梗塞心の心機能を改善できることが初めて示された。心筋梗塞急性期における A ngl投与により、梗塞後死亡率の低下、心筋での血管数の増加、心筋梗塞巣の縮小、およぴ心機能の改善などの顕著な効果がもたらされる。 Angl遺伝子治療は、急性心筋梗塞に対するあらたな治療法として有効である。

また本発明者らは、 Anglを高発現するアデノウイ/レスベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いて、重症虚血肢モデル動物に対して Angl遺伝子の単独投与による遺伝子治療を実施した。心筋において naked DNAが極めて効率的な発現を示すのとは対照的に、骨格筋においては naked DNAベクターによる導入遺伝子の発現レベルは低く（実施例 8 )、 Anglプラスミドの直接投与では虚血肢において十分は救肢効果は期待できなかった（W002/100441)。しかし骨格筋において naked DNAよりも発現効率の高いウィルスベクターを用いることによって、 Angl遺伝子の単独投与が、顕著な救肢効果を発揮することが明らかとなった（実施例 7、 1 3、および 1 4 )。特筆すべきことに、 Angl遺伝子投与による救肢効果は、 arteti ogenesisによる血液の組織還流が開始するよりも前においても観察された。従つて Angl遺伝子治療は、血管形成の誘導による治療効果だけでなく、抗アポトーシス作用などによる効果により、血管形成が誘導されるよりも早い段階から虚血組織を保護するという予想外の効果を発揮したと考えられる。このように、 Anglをコードするウィルスベクターを用いた Angl遺伝子の単独投与は、虚血心疾患のみならず、四肢虚血、血流不全を伴う損傷、および切断などの外傷および骨折などを含む虚血疾患一般においても、プラスミドベクターでは困難であった治療効果を得ることが期待できる。 VEGFを併用するこれまでの治療では、過剰な VEGFが血管の透過性t進をもたらし肺水腫などを增悪させる懸念があるが、 Anglをコードするウィルスベクターの単独投与により、このような副作用を回避しつつ効果的な虚血治療を実施することが可能である。

すなわち本発明は、 Anglまたは Anglをコードするベクターを用いる虚血疾患の治療方法、およぴ Anglまたは Anglをコードするベクターを含む虚血疾患治療キットに関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の 1つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明、特に、同一の独立項（他の項に記載の発明に包含されない発明に関する項）を引用する項（従属項）に記載の発明の 1つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明にも関する。各独立項に記載の発明には、その従属項の任意の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、

〔1〕虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターを投与する工程を含む方法、

〔2〕〔1〕に記載の虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポェチン - 1またはアンギオポェチン - 1をコードするベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法、 ·

〔 3〕アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターが、アンギオポェチン- 1をコードするウィルスベクターである、〔1〕または〔2〕に記載の方法、 ·

〔4〕ウィルスベクターがアデノウイルスベクターである、〔3〕に記載の方法

〔5〕ウィルスベクターがマイナス鎖 RNAウィルスベクターである、〔3〕に記載の方法、

〔6〕アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターが nak ed DNA (裸の DNA) である、〔1〕または〔2〕に記載の方法、〔7〕アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターが、 C Aプロモーターあるいは CAプロモーターと同等またはそれ以上の転写活性を有するプロモーターによりアンギオポェチン- 1の発現を駆動するベクターである、〔1 〕から〔6〕のいずれかに記載の方法、

〔8〕アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターの投与が心筋への注入である、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の方法、

〔9〕虚血疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1をコードするウィルスベタターを投与する工程を含む方法、

〔1 0〕〔9〕に記載の虚血疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1をコードするウィルスベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法、

〔1 1〕ウィルスベクターがアデノウイルスベクターである、〔9〕または〔1 0〕に記載の方法、

〔1 2〕ウィルスベクターがマイナス鎖 RNAウィルスベクターである、〔9〕または〔1 0〕に記載の方法、

〔1 3〕ベクターの投与が虚血部位への注入である、〔9〕から〔1 2〕のいずれかに記載の方法、

〔1 4〕アンギオポェチン- 1をコードする外来遺伝子を有する、遺伝子改変された間葉系細胞、

〔1 5〕アンギオポェチン - 1をコードするアデノウイルスベクターが導入されている、〔1 4〕に記載の間葉系細胞、

〔1 6〕アンギオポェチン - 1をコードするマイナス鎖脆ウィルスベクターが導入されている、〔1 4〕に記載の間葉系細胞、

〔1 7〕〔1 4〕から〔1 6〕のいずれかに記載の間葉系細胞および薬学的に許容される担体を含む虚血治療組成物、

〔1 8〕遺伝子改変された間葉系細胞の製造方法であって、遺伝子を搭載するマィナス鎮 RNAウィルスベクターを間葉系細胞に接触させる工程を含む方法、

〔1 9〕遺伝子がアンギオポェチン- 1をコードする、〔1 8〕に記載の方法、を提供する。

本発明は、虚血性心疾患の治療方法であって、 Anglまたは Anglをコードするべクタ一を投与する工程を含む方法に関する。 Anglは単独では血管内皮増殖刺激活性はなく、 Angl遺伝子単独投与により虚血性心疾患に対する治療効果が得られるか否かについては不明であった。しかし本発明において、心筋梗塞における Angl の単独投与が顕著な治療効果をもたらすことが実証された。急性心筋梗塞患者においては、梗塞後 2〜 3日後に血清中 VEGFが増加すること、心筋梗塞モデルでも心局所での VEGF発現が心筋梗塞 1〜 3日後より増加し、 1週間以上持続することが知られている。また、本発明者らが作製したラット心筋梗塞モデルでも局所および血清 VEGFの増加が確認できた（データ省略)。従って、 Angl単独投与による治療効果は、内因性の VEGFとの併用効果である可能性がある。過剰な VEGFは肺血管の透過性を亢進し肺水腫を誘発し死亡率を増大させるが、 VEGFを投与せず Anglのみを単独で投与することにより、内因性の VEGFと遺伝子導入により発現する Angl が協調的に作用し、強力な血管新生作用を発揮し、同時に VEGF投与により起こり得る副作用を回避することができる。特に本発明は、 Anglまたは Anglをコードするベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子（VEGF) またはその遺伝子を投与しない、虚血性心疾患の治療方法を提供する。 Angl単独投与で梗塞部およびその周辺部に明らかな血管密度の増大が認められ、この血管密度の増大効果は同量の VEGF165遺伝子単独をアデノウィルスベクターにより導入した場合とほぼ同程度であった。本発明に従って、 VEGFを投与することなく Ang - 1またはその遺伝子を投与することによって、虚血組織をより安全で効果的の保護することが可能となる。本発明の虚血性疾患およぴ虚血性心疾患の治療方法は、虚血組織の保護のための方法として、また、拒絶組織の再生方法として、さらには拒絶組織における血管の再生方法としても有用である。本発明においてアンギオポェチン- 1 (Angl) とは、 Tie- 2受容体に結合し、この受容体を介するシグナル伝達を活性化させ血管新生を促進するリガンドを言う。 Tie- 2はチロシンキナーゼ受容体であり内皮細胞系列で発現される（Ac. No. NM —000459, protein ID. Q02763, P— 000450) (Ziegler, S. F. et al. , Oncogene 8 (3) , 663-670 (1993)； Boon, L. M. et al. , Hum. Mol. Genet. 3 (9) , 1583—1587 (1994) ; Dumont, D. J. et al. , Genomics 23 (2)， 512-513 (1994) ; Gallione CJ et al. , J. Med. Genet. 32 (3) , 197 - 199 (1995) ; Vikkula M et al. , Cell 87 (7) , 1181-1190 (1996) ; Witzenbichler, B. et al.， J. Biol. Chem. 273 (29)， 18514-18521 (1998) ; Asahara, T. et al. , Circ. Res. 83 (3)， 233-240 (1998) ; Calvert, J. T. et al. , Hum. Mol. Genet. 8 (7) , 1279-1289 (1999) )。 Tie- 2はヒト以外にも、ゥシ、マウスを含む哺乳動物で単離されている（Sato，T. N. et al .， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (20) , 9355—9358 (1993) ; Iwama, A. et a 1. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 195 (1) , 301-309 (1993))。野生型ヒト Ti e - 2をコ一ドする DMの塩基配列おょぴァミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 1および 2に例示した。配列番号： 2に示したヒト Tie-2および上記の哺乳動物ホモ口グに対するリガンドであって、血管新生を促進するものは本発明において好適に用いることができる。また本発明において Anglは、天然の蛋白質のみならず、その改変体または部分ぺプチドなどであって、天然の Anglと同様に Tie - 2リガンドとして機能するものが含まれる。また、 Tie- 2の細胞外ドメインに結合する抗 Tie- 2抗体の断片または非ぺプチド性ィ匕合物であって Tie - 2リガンドとして機能するものであってもよレヽ。

哺乳動物 Angl蛋白質は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ゥシなどを含む様々な哺乳動物から単離されている (Davis, S. et al. , Cell 87 (7) , 1161-1169 (1996 )； Valenzuela, D. . et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (5)， 1904 - 190 9 (1999) ; Suri, C. et al. , Cell 87 (7) , 1171-1180 (1996)； Valenzuela, D. M. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (5) , 1904 - 1909 (1999)； Kim, I. , et al. , Cardiovasc. Res. 49 (4) , '872 - 881 (2001) ; Mandriota, S. J. and Peppe r, M. S.， Circ. Res. 83 (8) , 852 - 859 (1998) ; Goede, V. et al.， Lab. Invest. 78 (11) , 1385-1394 (1998) ) (GenBank Ac. No : U83508, 画一 009640, AF233227, 丽— 053546 ; protein— ID: AAB50557, NP— 033770， 008538, AAK14992, NP_445998, 018920) 。野生型ヒト Anglをコードする DNAの塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 3および 4に例示した。配列番号： 4に示したヒト Anglおよび上記の哺乳動物ホモログを好適に用いることができる。

また、ヒトまたはその他の哺乳動物 Anglのァミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または付カ卩したアミノ酸配列を含む蛋白質、ヒトまたはその他の哺乳動物 Anglのァミノ酸配列と 70%以上、好ましくは 75%以上、より好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の同一性を有するァミノ配列を含む蛋白質、ならびにヒトまたはその他の哺乳動物 Angl遺伝子のコ一ド領域の一部または全部を含む核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸がコードする蛋白質であつて、哺乳動物 Tie- 2受容体に結合し、この受容体を介するシグナル伝達を活性ィ匕させ血管新生を促進する蛋白質は本発明において Anglに含まれる。これらの蛋白質には、 Anglの多型およびスプライシングバリアントなどが含まれ得る。

アミノ酸の置換、欠失、および/または付加においては、改変されるアミノ酸数は、通常 15以内、好ましくは 11以内、より好ましくは 9以内、より好ましくは 7以内、より好ましくは 5以内である。特にアミノ酸を保存的に置換した蛋白質は活性が維持されやすい。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ二 7レアラニン、メチォニン、トリプトファン）、 ]3分岐アミノ酸（例えばスレオニン、パリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ二ルァラニン、トリブトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。ァミノ酸配列の同一性は、例えば BLASTPプログラム (Altschul, S. F. et al. , 1990， J . Mol. Biol. 215： 403-410) を用いて決定することができる。具体的には blastp プログラムを用いることができる。例えば NCBI (National Center for Biothchno logy Information) の BLASTのウェブページにおいて Low complexityを含むフィルターは全て OFFにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Altschul, S. F. et al. (1993) Nature Genet. 3: 266—272 ; Madden, T. L. et al. (1996) Me th. Enzymol. 266: 131—141 ; Altschul, S. F. et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25 : 3389-3402； Zhang, J. & Madden, T. L. (1997) Genome Res. 7: 649-656) 。例えば 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. ( 1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250) により、 2配列のァライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱レ、、例えば哺乳動物野生型 Angl蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。また、ハイブリダィゼ一シヨンにおいては、ヒトなどの Angl遺伝子の蛋白質コード配列を含む核酸、またはハイプリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダィズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5 XSS (：、 7%(W/V) SDS、 100 μ g/ml 変性サケ精子 DNA、 5 Xデンハルト液（ 1 Xデンハルト溶液は 0· 2%ポリビニ^"ルピロリドン、 0. 2%牛血清アルブミン、および 0. 2%フイコールを含む）を含む溶液中、 48° (、好ましくは 50° (：、より好ましくは 52°Cでノ、イブリダイゼーシヨンを行い、その後ハイブリダィゼーシヨンと同じ温度、より好ましくは 60°C、さらにこの好ましくは 65°C、最も好ましくは 68°Cで 2 XSSC中、好ましくは 1 X SSC中、より好ましくは 0. 5 X SSC中、より好ましくは 0. 1 XSSC中で、振蘯しながら 2時間洗浄する条件である。

Anglをコードするベクターとは、 Angl蛋白質をコードする核酸を含むベクターである。蛋白質をコードするとは、核酸が該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードする 0RFをセンスまたはアンチセンス（ある種のウィルスベクター等においては）に含むことを言う。核酸は一本鎖または二本鎖であってよい。また核酸は DNAであっても RNAであってもよい。ベクターとしては、例えばプラスミドベクター、その他の naked DNA、ウィルスベクターが挙げられる。

Naked DNAとは、 DNAが、ウィルスエンベロープ、リボソーム、または力チォニック脂質などの核酸を細胞に導入する試薬と結合していない DNAを言う（WoL f et al.， 1990, Science 247, 1465 - 1468)。この場合、 DNAは生理的に許容可能な溶液、例えば滅菌水、生理食塩水、または緩衝液中に溶解して使用することができる。プラスミドなどの naked DNAの注入は最も安全で簡便な遺伝子送達法であり、これまでに承認されている臨床心血管遺伝子治療プロトコルの多くを占めるが（L ee, Y. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 272: 230-235)、導入遺伝子の発現が比較的低いことと心筋細胞への導入効率が悪いことが、このァプローチの治療的な利益を損なっていた（Lin， H. et al.， Circulation 1990； 82: 2 217-2221； Kass-eisler, A. et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993； 90： 11498- 11502)。例えば、サイトメガロウィルス（CMV) プロモーターは入手可能な最も強力な転写制御配列の 1つであり、 CMVプロモーターを含むべクターは臨床の遺伝子治療にも広く用いられている（Foecking, M. K, and Hofstetter H. Gene 1986； 4 5 : 101-105)。しかしながら、骨格筋にプラスミドを注入した幾つかの報告により、強力な CMVプロモーターを利用したとしても、導入遺伝子の発現量または発現期間はしばしば不十分であることが指摘されていた。

ところが驚くべきことに、本発明者らが、 nakedプラスミドを心筋に直接注入により投与したところ、骨格筋に比べ心筋では約一桁の高い発現レベルが得られることが判明した。特に転写活性の強い CAプロモーターを持つプラスミドベクターを 20 ^i g用いた時の心臓における導入遺伝子の発現レベルは、 6. 0 X 10⁹ oDtical u nits (OPU) のアデノウイルスベクターによるものに匹敵した。従って、 CAプロモ一ターあるいはこれと同等以上の転写活性を持つプロモーターを持つプラスミドを用いて、本発明の虚血疾患の遺伝子治療を実施することができる。 CAプロモーターとは、 CMV immediately earlyェンハンサーおよぴニヮトリ j3ァクチンプロモーターを含むキメラプロモーターである（Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108： 193-199)。 CAプロモーターまたはこれを同等以上の転写活性を有するプロモータ一を用いれば、 naked DNAを用いてより安全に遺伝子治療を実施することができる

CMV immediately earlyェンハンサ一としては、所望の CMV株の immediately ea rly遺伝子ェンハンサーを用いることができるが、例えば配列番号： 5の:!〜 367番目までの塩基配列を例示することができる。また、ニヮトリァクチンプロモーターとしては、ニヮトリァクチンゲノム DNAの転写開始部位を含む DNA断片であつて、プロモーター活性を持つ断片を使用することができる。ニヮトリ j3ァクチン遺伝子の第 1イントロンには転写を促進する活性があるため、このイントロンの少なくとも一部までを含むゲノム DNA断片を用いることが好ましい。このようなニヮトリ）3ァクチンプロモーターとしては、具体的には、例えば配列番号： 5の 3 68〜1615番目までの塩基配列を例示することができる。イントロンのァクセプタ一配列は、適宜他の遺伝子の配列を使うことができ、例えばゥサギ ]3グロビンのイントロンァクセプター配列を用いてよい。本発明において CAプロモーターとしては、 CMV immediately earlyェンハンサー酉己列の下流に、イントロ'ンの一部までを含むニヮトリ ]3ァクチンプロモーターを連結し、その下流に所望のイントロンァクセプター配列を付加した DNAが好適である。一例を配列番号： 5に示した。この配列の最後の ATGを開始コドンとして、 Angl蛋白質のコード配列を付加すればよい。伹し、 CMVェンハンサーおよぴニヮトリァクチン遺伝子は、単離株または単離個体によって配列に多様性があり得る。また、 CMV immediately earlyェンハンサーおよぴニヮトリ ]3ァクチンプロモーターとして配列番号： 5に示したのと全く同一の領域を使う必要はなく、当業者であれば様々なバリアントを構築することができる。配列番号： 5に示したプロモーターと同等またはそれ以上の転写活 1"生を有するバリアントは全て、本発明において好適に用いることができる。べクター中に SV40oriが含まれる場合は、 SV40ori配列を欠失させることが好ましい。 SV40 large T antigen は幾つかのヒト癌に関連しており、 SV40に関連した癌を持つ患者では SV40oriを含むベクターの増幅が懸念される（Martini, F. et a 1.， Cancer 2002； 94： 1037-1048； Malkin, D. Lancet 2002 ; 359： 812-813)。本発明者らの検証によれば、ベクターから SV40oriを欠失させても、導入遺伝子の発現は骨格筋でも心臓でも影響されなかった（実施例 8 )。この結果は、 CAプロモーターの制御下に Anglを発現する、 SV40oriを持たないベクターが、心筋遺伝子治療への臨床適用に最も安全かつ有用なベクターの 1つであることを示唆する。特に S V40oriを欠失させた pCAlベクターは、心筋遺伝子治療に適していると考えられるまた、 DNAは適宜トランスフエクション試薬と組み合わせて投与することもできる。例えば、リボソームまたは所望のカチォニック脂質と結合させてトランスフヱクシヨン効率を上昇させることができる。

本発明の虚血疾患治療に用いられるもう 1つの好ましいベクターはウィルスべクターである。ウィルスベクターを用いることによって、心筋のみならず骨格筋など他の組織においても十分な量の Anglを発現させることができる。ウィルスべクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウイノレスベタター、レンチウィルスベクター、単純へルぺスウィルスべクタ一、ワクシニアウィルスベクターなどが挙げられるがこれらに制限されない。好ましいウィルスベクターの 1つはアデノウィルスベクターである。アデノウィルスべクタ一は、心筋細胞に高い効率で遺伝子を導入し、導入遺伝子を高発現させることができる。実施例に示すように、 Anglを発現するアデノウイルスベクターは、虚血心および虚血肤に対して有意な治療効果を発揮する。このように、本発明においてはアデノウィルスベクターを好適に用いることができる。本発明において、アデノウイルスベクターは適宜公知のベクターを用いることができ、それらは例えば外来遺伝子発現の向上のため、または抗原性の減弱などのために野生型ゥィスの遺伝子が改変されていてよい。.アデノウィルスベクターの作製は、例えば斎藤らにより開発された COS- TPC法 (Miyake, S. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA

93： 1320-1324 (1996) ) を用いることができる。

ベクターに Anglを組み込む場合は、 Angl遺伝子の発現効率を高めるため、 Angl の開始ロドン周辺の配列は Kozakのコンセンサス配列 [例えば CC(G/A) CCATG] とすることが好ましい (Kozak, M. , Nucleic Acids Res 9 (20) , 5233 (1981) ; Kozak,

M. , Cell 44, 283 (1986) ; Kozak, M. Nucleic Acids Res. 15 : 8125 (1987)； Koz ak, M. , J. Mol. Biol. 196, 947 (1987)； Kozak, M. , J. Cell Biol. 108， 229 (1989)； Kozak, M.， Nuel. Acids Res. 18， 2828 (1990))。

本発明において好適に用いることができるウィルスベクターの他の 1つは、マイナス鎖 R Aウィルスベクターである。実施例に示すように、マイナス鎖 RNAウイルスベクターは、アデノウィルスよりも低い力価でより高い導入遺伝子を発現をもたらすことが示された。本発明において、 Anglをコードするマイナス鎖腿ウイルスベクターは、最も好適に用いられるベクターの 1つである。マイナス鎖 RNAゥィ/レスとは、マイナス鎖（ウィルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスである。マイナス鎖 RNAはネガティブ鎖 RNAとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖 RNAウイ'ルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖 RNAウィルス（非分節型（non- segmented) マイナス鎖 R NAウィルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖腿ウィルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナス鎖] RNAをゲノムに有するウィルスを言う。このようなウイ/レスとしては、パラミクソゥイノレス（Paramyxoviridae; Pararay xovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, ぉょぴ Pneumovirusfe等を' a-む) 、フプドウィルス (Rhabdoviridae ; Vesiculovirus, Lyssavirus, ぉょぴ Ephemeroviru s属等を含む）、フイロウィルス（Filoviridae) 、オルトミクソウィルス（Ortho myxoviridae ; Infuluenza virus A, B, C，ぉょぴ Thogoto - like viruses等を含む) 、ブニャクイルス (Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む）、ァレナウィルス（Arenaviridae) などの科に属するウィルスが含まれる。本発明において用いられるマイナス鎖腿ウィルスべクタ一は、伝播能を有していてもよく、伝播能を有さない欠損型ベクターであつてもよレ、。「伝播能を有する」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。

本発明におレ、て得に好適に用レヽられるマイナス鎖 RNAゥィルスを具体的に挙げれば、例えばパラミクソウィルス科（Pararayxoviridae)ウィルスのセンダイウィルス (Sendai virus)、ニューカツスノレ病クイ/レス (Newcastle disease virus)、お Γこふくかぜウィルス（Mumps virus)、麻疹ウイノレス（Measles virus)、 RSウイノレス（Resp iratory syncytial virus)、牛投ウイノレス (rinderpest virus)、ンスアンノヽーゥィルス（distemper virus：)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5) 、ヒトパラィンフルェンザウィルス 1, 2， 3型、オルトミクソウィルス科（Orthomyxoviridae)のィンフノレエンザゥイノレス（Influenza virus)、ラブドウィルス科（Rhabdoviridae) の水疱性口内炎ウイノレス（Vesicular stomatitis virus) _s 狂犬病ウィルス（Rabies virus)等が例示できる。

本発明において用いることができるウィルスをさらに例示すれば、 '例えば Send ai virus (SeV)、 human paraini丄 uenza virus - 1 (HPIV - 1)、 human parainfluenza virus - 3 (HPIV-3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste-des-petits-ruminants virus (PDP R)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Ni pah virus (Nipah)、 human parainfluenza virus - 2 (HPIV - 2)、 simian parainflu enza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza virus - 4a (HPIV - 4a)、 human parainf luenza virus- 4b (HPIV - 4b)、 mumps virus (Mumps)、およ ^Newcastle disease v irus (NDV) などが含まれる。より好ましくは、 Sendai virus (SeV)、 human para influenza virus - 1 (HPIV- 1)、 human parainfluenza virus - 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivir us (DMV)、 peste-des-pet its-ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 ri nderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、ぉょぴ Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウィルスが挙げられる。

より好ましくは、パラミクソウィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウィルス属を含む）に属するウィルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウィルス属（genus Respirovirus) (パラミクソウィルス属（Paramyxovirus) とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウィルス遺伝子が改変されたウィルス、および化学修飾されたウィルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルェンザウィルス 1型（HPIV-1) 、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型（HPIV- 3) 、ゥシパラインフルエンザウイルス 3型（BPIV- 3) 、センダイウィルス（Sendai virus ; マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス 10型（SPIV- 10) などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは. 、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。

組み換えマイナス鎖 R Aウィルスべクターの再構成は公知の方法を利用して行うことができる (W097/16539 ; W097/16538 ; WO00/70055; W000/70070; W003/025570 ； Durbin, A. P. et al. , 1997, Virology 235： 323 - 332 ; Whelan, S. P. et al. ， 1995， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92： 8388 - 8392 ; Schnell. M. J. et al. , 1994, EMB0 J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al.， 1995, EMB0 J. 14： 5773-5 784； Lawson, N. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4477-4481； Garc in, D. et al. , 1995, EMBO J. 14: 6087-6094； Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1： 569-579； Baron, M. D. and Barrett, T. , 1997, J. Virol. 71： 1265— 1271； Bridgen, A. and Elliott, R. M. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 ： 15400-15404； Hasan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78： 2813-2820, 1997； K ato, A. et al. , 1997， EMBO J. 16： 578—587; Yu, D. et al. , - 1997, Genes Cel Is 2： 457-466) 。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイノレス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一ペストウィルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖腿ウィルスを DNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のウィルスを再構成させることができる。ウィルスゲノムをコードする DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、および/または M遺伝子等のエンベロープを構成する蛋白質をコードする遺伝子をウィルスゲノムから欠失させた場合には、そのままでは感染性のウィルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウィルスのエンベロープ蛋白質（例えば水疱性口内炎ウィルス（Vesicular stomatitis virus； VSV) の G蛋白質（V SV-G) (J. Virology 39： 519-528 (1981) ) ) をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウィルス粒子を形成させることが可能である（Hirata, T. et al. , 2002, J. Virol. Methods, 104: 125-133; Inou e, M. et al. , 2003, J. Virol. 77: 6419—6429) 。

マイナス鎖 RNAウィルスは宿主細胞の細胞質でのみ転写 ·複製を行い、 DNAフエーズを持たないため染色体への組み込み（integration) は起こらない（Lamb, R. A. and Kolakofsky, D. , Paramyxoviridae： The viruses and their replication . In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM， (eds) . Fields Virology, 3rd Edition ， Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers : Philadelphia, 1996, pp. 1177-120 4) 。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。マイナス鎖 RNAウィルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウィルス（SeV) を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu, D. et al. , Genes Cells 2, 457-466 (1997) ) 。また、力プシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性 (flexibility) など性質上のメリットがある。またセンダイウィルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウィルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Hurwitz, J. L. e t al. , Vaccine 15： 533—540, 1997 ; Bitzer, M. et al. , J. Gene Med, . 5： 543 - 553, 2003) 。このように、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ヒトの虚血疾患に対する遺伝子治療のための治療用ベクターとして極めて有用である。

回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーシヨン（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製 ·分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウィルスベクターを含む溶液中で該ウィルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウィルスべクター組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクターの成分として含まれる蛋白質の割合力 S10% (重量/重量）以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 50%以上、好ましくは 70% 以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウィルスベクターであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸ェステルを用いる方法（特公昭 62- 30752号公報、特公昭 62-33879号公報、およぴ特公昭 62- 30753号公報）、およぴフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010) 等を例示することができるが、これらに制限されない。

本発明において虚血疾患とは、組織への血液供給の減少または途絶による機能異常あるいは組織変性または壊死を言い、具体的には心筋梗塞および狭心症などの虚血性心疾患、並びに四肢虚血、血流不全を伴う損傷、および切断などの外傷および骨折などが含まれる。すなわち本発明において虚血疾患には、虚血性の疾病のみならず、損傷 ·傷害による虚血状態も含まれる。 Anglまたは Anglをコードするベクターを投与することにより、血管形成誘導、およぴ抗アポトーシス作用および抗炎症作用などの他の作用により、虚血組織周辺の壊死が抑えられ、機能が改善される。本発明の Anglの投与において、好ましくは VEGFは投与しない。 VEG Fを投与しなくても、 Anglの単独投与で有意な治療効果が期待できる。 VEGFを投与しないとは、具体的には、 Anglまたは Anglをコードするベクターの投与の前後、少なくとも 12時間以内、好ましくは 24時間以内、より好ましくは 14日以内に、 VEG Fまたは VEGFをコードするベクターを投与しないことを言う。なお、微量または痕跡量の VEGFまたは VEGFをコードするベクターを投与したとしても、その VEGFの作用が有意に検出できない程度であればそれは投与しないと考える。 VEGF (Vascula r Endothelial Growth Factor) は血管内皮細胞に特異的な増殖因子であり VPF (V ascular Permeability Factor; 血管透過性冗進因子）として 1989年に報告され現在 VEGF A, B， C, D， Eに分類されている（渋谷正史， VEGF受容体とシグナル伝達，最新医学 56: 1728-1734， 2001)。 VEGF Aはさらに 6種類のサブタイプに分けられそのうち可溶性の VEGF121, 165が特に強い血管増殖能を持つとされ現在臨床応用されている。本発明において VEGFとしては特に VEGF165および VEGF121が挙げられ、好ましくは VEGF165および VEGF121を含む VEGFの各種メンバーが含まれる。特に、内因性 VEGFレベルが亢進する症状を伴う虚血疾患に対して本発明の治療方法は有効性が高い。内因性 VEGFレベルが亢進するとは、血中または組織局所における内因性 VEGFレベルが健常者のそれよりも高いことを言う。上記に挙げた心筋梗塞、狭心症、急性四肢虚血、血流不全を伴う損傷、切断、骨折等においては、内因性 VEGFレベルが上昇する。

本発明におレ、て虚血性心疾患とは、心筋への血液供給の減少または途絶による心機能異常あるいは心筋の変性または壊死を言い、具体的には狭心症、心筋梗塞、および一部の心筋症が含まれる。 Anglまたは Anglをコードするベクターを虚血心に投与することにより、血管形成が促進され心機能が改善される。本発明の方法は、特に内因性 VEGFレベルが亢進する症状を伴う虚血性心疾患に対して高い効果を発揮し、例えば狭心症、心筋梗塞、およぴ虚血性心筋症などが治療の対象として適している（Xu, X. , et al. (2001) J Thorac Cardiovasc Surg. 121 : 735— 742； Banai, S. , et al. (1994) Cardiovasc Res. 28 : 1176—1179 ; Sellke, F. W. , et al. (1996) Am J Physiol. 271： H713- 720)。本発明の方法が最も有効な虚血性心疾患は心筋梗塞である。

狭心症とは、心筋が過性に虚血、つまり酸素欠乏に陥ったために生ずる胸部不快感を主症状とする臨床的症候群を意味する（小川久雄，狭心症に対する薬物療法，別冊医学のあゆみ；循環器疾患： 352- 355, 1996, 矢崎義雄他編，医歯薬出版株式会社)。急性心筋梗塞は冠動脈の血流障害により心筋壊死を伴う虚血性心疾患である（阿武正弘，高野照夫，急性心筋梗塞，循環器疾患最新の治療 2002-2003 II冠動脈疾患： 37-42, 2002, 篠山重威、矢崎義雄編、南江堂)。

本発明の虚血疾患の治療においては、 VEGFのみならず、他の血管新生因子または血管新生因子をコードするベクターも投与しないことが好ましい。血管新生因子とは、血管構成に関与する細胞の発生、遊走、増殖、成熟に直接、 'あるいは間接的に関わる因子を言う。具体的には、血管内皮増殖因子（VEGFs；)、線維芽細胞増殖因子（FGFs)、上皮増殖因子（EGF)、肝細胞増殖因子（HGF)、胎盤由来増殖因子（PDGF)、単球走化性蛋白質- 1 (MCP- 1)、 thymidine phosphorylase (TP) , アンギオポェチン（Angiopoietin)、エフリン（ephrin / Eph)、マトリクスメタロプ口テナーゼ（匿）， tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) などが含まれる（Kuwano, M. et al.， Angiogenesis Int. Med. 40： 565—572 (2001)； Freed man, S. B. et al. , Ann. Intern. Med. 136: 54-71 (2002) )。投与しないとは、投与個体においてこれらの血管新生因子の作用を有意に検出するほどの量またはそれ以上を投与しないという意味である。

虚血組織への投与においては、 Anglまたは Anglをコードするベクターを、全身投与または虚血組織に局所投与する。 Anglは大量投与によっても顕著な副作用を示さないことから、全身投与による虚血治療が可能である。投与においては、 Ang 1または Anglをコードするベクターの直接投与、あるいは担体を用いた投与が挙げられる。担体は、生理的に許容できるもので、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリェチレングリコ一ルポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などがあげられる。更に担体はこれらの生理的に許容される材料の混合組成物でも良い。用いるベクターは生理的に許容されるべクターならば特に制限はなく、上に例示したウィルスベクター、あるいは非ウィルスベクターも含めて、所望のベクターが利用できる。またベクターはベクターにより処理された患者自身の細胞の形態で投与してもよい。例えばべクターまたはベクターを導入した細胞の筋肉（心筋または骨格筋）内注射や静脈内注射 (in vi vo投与おょぴ ex vivo投与）が考えられる。全身投与（筋注、ないし静注）された細胞は、病変局所へ移行することにより虚血組織の生存を促進し得る。例えば、間葉系幹細胞 (MSC)は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などへ分化するとともに、骨格筋、心筋、神経系細胞への分化能の保持することが近年示され、再生医療の細胞源として多くの研究がなされている。本発明に従って MSCに Ang - 1遺伝子を導入し、これを虚血治療に用いることによって、優れた効果を発揮することが期待できる。 MSCは例えば Tsuda, H. et al. (2003) Mol Ther 7 (3) : 354-65 に記載の方法に従って調製することができる。心臓への局所投与のためには、注射により A nglまたは Anglをコードするベクターを心筋に注入（injection) すればよい。あるいは、 Anglをコードするベクターを導入した細胞を、心筋に移植することもできる（ex vivo投与）。注入手段は通常の医療用注射器または、体外おょぴ体内に留置される持続注入器などの工業製品があげられる。

投与量は、例えばウィルスであれば虚血部位周辺の生存筋（骨格筋または心筋など）に 1箇所または複数箇所（例えば 2から 10箇所）に投与してよい。投与量は、アデノウイルスであれば、例えば 10¹⁽⁾〜10¹³ pfu/body、より好ましくは ΙΟ^ ΙΟ¹ ³ pfu/bodyが望ましい。マイナス鎖 RNAウィルスであれば、例えば 2 X 10⁵ CIU〜 5 X 10¹¹ CIUが望ましい。 Naked DNAであれば、虚血部位周辺の生存筋に 1箇所または複数箇所（例えば 2から 10箇所）に投与してよい。投与部位 1箇所あたりの投与量は、例えば 10μ _§〜1Ό mg、より好ましくは 100 /^〜1 mgが望ましい。 Ex vivo投与において、ベクターを導入した細胞を投与する場合は、例えば M0I 1〜500の間で体外（例えば試験管またはシャーレ内）で標的細胞にベクターを導入する。本発明においてマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、間葉系細胞に対して極めて高い効率で外来遺伝子を導入することが判明した。従って、 _ex vivo投与において間葉系細胞を用いる場合は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いて間葉系細胞に遺伝子導入を行うことが好ましい。 Ang - 1遺伝子導入細胞は、例えば 10⁵〜10⁹細胞、好ましくは 10⁶〜10⁸細胞を虚血組織に移植することができる。蛋白製剤であれば虚血部位周辺の生存筋に 1箇所または複数箇所（例えば 2から 10箇所）に投与してよレ、。投与量は、例えば l / g/kg〜10 mg/kgが望ましい。より好ましくは lO ^i g/kg 1 mg/kgが望ましい。また、ベクターまたは蛋白質製剤は、例えば虚血組織に至る動脈内（例えば虚血心であれば心臓の冠動脈内）に複数回（1〜1 0'回）動脈投与してよい。この場合投与部位 1箇所あたりの投与量は、蛋白質製剤であれば例えば 1 μ g/kg〜10 mg/kgが望ましい。より好ましくは 10 μ g/kg 〜 1 mg/kgが望ましい。またベクターまたは蛋白質製剤は、経静脈的に複数回（1〜1 0回）または持続投与してよい。この場合総投与量は、蛋白製剤であれば例えば 1 ^u g/kg l 0 mg/kgが望ましい。より好ましくは lO z g/kg〜 1 rag/kgが望ましい。ベクターであれば、上記の筋注と同様の量を投与することができる。投与量については、文献 Freedman SB et al Ann Intern Med 136 : 54-71 (2002) を参照することができる。

但し、ベクターの投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与組成物の形態、投与方法等により異なってよく、当業者であれば適宜調整することが可能である。投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、投与部位についても一箇所または複数箇所投与してよい。ヒト以外の動物についても、 kg当たりヒトと同様の投与量とするカあるいは例えば目的の動物とヒトとの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば平均値）等で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明の治療の対象動物としては、ヒトおよびその他の所望の哺乳動物が挙げられ、具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ゥシ、ィヌなどが含まれる。

本発明の治療方法は、単独ないし、他のスタンダードないし先進的な治療法との組み合わせで実施することができる。例えば、本発明の虚血性心疾患の治療方法を PTCA (経皮冠動脈形成術)および/または CABG (冠動脈バイパス術）などの外科的な血行再建術と組み合わせることも好適である。本発明の治療法を合わせて用いることにより、心機能の積極的な改善、病床期間の短期化が可能となる。また、本発明の Anglを用いた治療は、梗塞心筋の再生などの梗塞巣に対するリモデリングの促進などの治療を組み合わせることにより、より高い効果が期待される。 Anglによる遺伝子治療は梗塞巣厚の増加をもたらすが、細胞療法の併用など心筋絶対量の不足を改善した際に認められる LVAd, Eddなど拡張期パラメーターの改善については比較的効果が弱い。 Anglによる収縮期容積、駆出率などの改善は、梗塞周囲筋など残存心筋の血管密度が増加することにより梗塞周囲筋での機能低下を予防し、さらに残存心筋の代償性肥大を促進し、心筋機能を改善しているものと推測される。そこで、例えば、胎児心筋、 ES細胞、筋芽細胞、または間葉系細胞などの移植、または梗塞部位への移動を誘導することにより心筋の絶対量を捕う細胞療法を併用することは好ましいと考えられる。これらの細胞に Ang - 1遺伝子を ex vivoで導入し、虚血組織の治療効果をより高めることも有用である。また本発明は、 Anglまたは Anglをコードするベクターを含む虚血性心疾患治療剤を提供する。また本発明は、虚血性心疾患の治療における、虚血心へ投与するための Anglまたは Anglをコードするベクターの使用を提供する。さらに本発明は、該 Anglまたは Anglをコードするベクターを虚血心へ投与するための虚血性心疾患の治療薬製造における、 Anglまたは Anglをコードするベタターの使用を提供する。特に本発明は、 Anglまたは Anglをコードするベクターを含む虚血性心疾患治療剤であって、 VEGFまたは VEGFベクターを投与せずに該 Anglまたは Anglをコードするベクターを虚血心へ投与するための治療剤を提供する。また本発明は、虚血性心疾患の治療における Anglまたは Anglをコードするベクターの使用であって、 V EGFまたは VEGFベクタ一を投与せずに該 Anglまたは Anglをコードするベクターを虚血心へ投与するための使用を提供する。さらに本発明は、 VEGFまたは VEGFベタタ一を投与せずに該 Anglまたは Anglをコードするベクターを虚血心へ投与するための虚血性心疾患の治療薬製造における、 Anglまたは Anglをコードするベクターの使用を提供する。上記の治療剤および使用においては、 VEGFのみならず、他の血管新生因子またはその血管新生因子をコードするベクターも投与しないものであることがより好ましい。また Anglまたは Anglをコードするベクターは、虚血心への局所投与のために製剤化されることが好ましい。例えば、心筋への注入により投与されるものが好ましい。 Anglをコードするベクターは、好ましくは Anglをコードするウィルスベクターまたは naked DNAである。ウィルスベクターとしては特に制限はないが、特にアデノウィルスベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスべクターが好ましい。 naked DNAとしてはプラスミドが挙げられる。プラスミドは環状でも直鎖化されていてもよレ、。またプラスミドには SV40oriが含まれないことが好ましい。ベクターにおいて Angl転写を駆動するプロモーターは強力な転写活性を持つものが好ましく、例えば CAプロモーターを好適に用いることができる。

また本発明は、（a ) Anglまたは Anglをコードする.ベクター、および（b ) Ang 1または Anglをコードするベクターの投与において、 VEGFまたは VEGFベクターを投与しないことの指示の記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含む虚血性心疾患治療キットに関する。本キットは、心筋梗塞または狭心症を含む虚血性心疾患の少なくとも 1つに対する治療キットである。好ましくは、本発明のキットは、狭心症おょぴ Zまたは急性心筋梗塞に対する治療キットである。このキットには、上記で説明した Anglまたは Anglをコードするベクターが含まれる。 Angl をコードするベクターは、好ましくは Anglをコードする naked DNAまたはウィルスベクターであり、ウィルスベクターとしては特に制限はないが、特にアデノウィルスベクターおよびマイナス鎖脆ウィルスベクターが好ましい。キット中に含まれる Anglまたは Anglをコードするベクターは、 Angl以外に、薬学的に許容できる所望の担体および/または添加物等を含む組成物であってよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クェン酸、他の有機酸等）、安定剤、塩、酸化防止剤（ァスコルビン酸等）、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または保存剤などを含んでよい。局所投与のために、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などと組み合わせることも好ましい。好ましい態様においては、 Anglまたは Anglをコードするベクターは注射に適当な剤型に調製される。このためには、 Anglまたは Anglをコードするベクターは薬学的に許容される水溶液中に溶解されているカゝ、または溶解できるように例えば凍結乾燥製剤であることが好ましい。本発明のキットには、 Anglまたは Anglをコードするベクターを溶解または希釈するために用いることができる、薬学的に許容できる所望の担体をさらに含んでもよい。このような担体としては、例えば蒸留水、生理食塩水などが挙げられる。

また本発明は、 Anglをコードするウィルスベクターを含む虚血疾患治療剤を提供する。また本発明は、虚血疾患の治療における、 Anglをコードするウィルスべクタ一の使用を提供する。さらに本発明は、 Anglをコードするウィルスベクターを含む虚血疾患の治療薬製造における、該 Anglウィルスべクターの使用を提供する。特に本発明は、 Anglをコードするウィルスベクターを含む虚血疾患治療剤であって、 VEGFまたは VEGFベクタ一を投与せずに該 Anglウィルスベクターを虚血個体へ投与するための治療剤を提供する。また本発明は、虚血疾患の治療における A nglをコードするウィルスベクターの使用であって、 VEGFまたは VEGFベクターを投与せずに該 Anglウィルスベクターを虚血個体へ投与するための使用を提供する。さらに本発明は、 VEGFまたは VEGFベクターを投与せずに Anglをコードするウィルスベクターを虚血個体へ投与するための虚血疾患の治療薬製造における、該 Angl ウィルスベクターの使用を提供する。上記の治療剤および使用においては、 VEGF のみならず、他の血管新生因子またはその血管新生因子をコードするベクターも投与しないものであることがより好ましい。また Anglをコードするウィルスべクターは、虚血組織への局所投与のために製剤化されることが好ましい。ウィルスベクターとしては、好ましくはアデノウィルスベクターおよびマイナス鎖 RNAウイルスベクターが用いられる。

また本発明は、（a ) Anglをコードするウィルスベクター、および（b ) Angl をコードするウィルスベクターの投与において、 VEGFまたは VEGFベクターを投与しないことの指示の記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含む虚血疾患治療キットに関する。本キットは、心筋梗塞および狭心症などの虚血性心疾患、並びに四肢虚血、血流不全を伴う損傷、および切断などの外傷および骨折などを含む虚血疾患の少なくとも 1つに対する治療キットである。このキットには、上記で説明した Anglをコードするウィルスベクターが含まれる。ウィルスベクタ一としては特に制限はないが、特にアデノウィルスベクターおよびマイナス鎖 RNA ウィルスベクターが好ましい。キット中に含まれる Anglをコードするウィルスべクタ一は、ベクター以外に、薬学的に許容できる所望の担体および/または添加物等を含む組成物であってよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クェン酸、他の有機酸等）、安定剤、塩、酸化防止剤（ァスコルビン酸等 ) 、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または保存剤などを含んでよい。局所投与のために、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシァパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコ一ルポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などと Eみ合わせることも好ましい。好ましい態様においては、 Anglをコードするウイルスベクターは注射に適当な剤型に調製される。このためには、 Anglをコードするウィルスベクターは薬学的に許容される水溶液中に溶解されている力または溶解できるように例えば凍結乾燥製剤であることが好ましい。本発明のキットには、 Anglをコードするウィルスベクターを溶解または希釈するために用いることができる、薬学的に許容できる所望の担体をさらに含んでもよい。このような担体としては、例えば蒸留水、生理食塩水などが挙げられる。

本発明のキットには、 Anglまたは Anglをコードするベクターの投与において、 V EGFまたは VEGFベクタ一を投与しないことの指示の記載または該記載へのリンクを含む記録媒体が含まれている。 VEGFまたは VEGFベタターを投与しないことの指示とは、例えば VEGFまたは VEGFべクターの投与を禁忌または避けるように指示または推奨する内容の記載である。具体的には、 Anglまたは Anglをコードするべクタ一の投与の前後、少なくとも 12時間以内に、 VEGFまたは VEGFをコードするべクタ一を投与しないことを指示する内容が記載されている。好ましくは、 Anglまたは A ngiベクターの投与の前後の 24時間以内、より好ましくは 14日以内に、' VEGFまたは VEGFベクターを投与しないことが指示されている。 VEGFとしては特に VEGF165およぴ VEGF121が挙げられ、好ましくは VEGF165およひ EGF121を含む VEGFの各種メンバ一が含まれる。本キットには、 Anglまたは Anglをコードするベクターの治療的有効量を罹患個体に投与することの記載または該記載へのリンクを含むことが好ましい。記録媒体としては、紙および..プラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルディスク（FD)、コンパクトディスク（CD)、デジタルビデオディスク（DVD)、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられる。リンクとは、 Anglまたは Anglをコードするベクターの投与において、 VEGF121を投与しないことの指示に関する記載が、キット中に直接には記載されていないが、キットに含まれる印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記載にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙または URLなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙または URLに該記載がある場合などが含まれる。

以下に、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いた間葉系細胞への遺伝子導入について記載する。本発明による間葉系細胞とは、好ましくは骨髄細胞（骨髄細胞の単核球分画成分）、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞、間葉系幹細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞などを指す。また、本発明の間葉系細胞には、たとえば、間葉系に関連する細胞、中胚葉幹細胞などが含まれる。尚、本発明において「間葉系細胞」として記述された細胞が、将来的に間葉系細胞以外の細胞として分類される場合であっても、本発明においては当該細胞を好適に利用することができる。

骨髄中には、幹細胞として、造血幹細胞と、「間葉系幹細胞（MSC： Mesenchyma 1 stem cell) 」とがある。ここで「幹細胞.」とは、一般に、生体を構成する細胞の生理的な増殖 ·分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分ィ匕する能力とを併せ有する未分ィ匕細胞のことである。造血幹細胞は、赤血球、白血球、あるいは血小板に分ィヒする幹細胞である。間葉系幹細胞は、神経に分化する場合、心血管系に分ィ匕する場合、内臓に分ィ匕する場合、または、骨、軟骨、脂肪、あるいは筋肉に分ィ匕する場合があることが知られている。

本発明では、主として間葉系幹細胞を利用するが、造血幹細胞や、体内の他の幹細胞（前駆細胞）を利用できる可能性があることにも言及しておく。間葉系幹細胞は、骨髄から採取された骨髄細胞から分離して得られる。なお、間葉系幹細胞を分離していない骨髄細胞も、有効性は若干劣るものの、間葉系幹細胞と同じように治療に用いることができる。

また、間葉系幹細胞のような細胞が、末梢血中から調製できる可能性も考えられる。従って、末梢血中の細胞を培養することにより、間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞を調製し、本発明に利用することも可能である。

本発明において、中胚葉性幹細胞とは、発生学的に中胚葉と分類される組織を構成している細胞を指し、血液細胞も含まれる。また、中胚葉幹細胞とは、自己と同じ能力を持った細胞をコピー（分裂、増殖）することができ、中胚葉の組織を構成している全ての細胞へ分化し得る能力を持った細胞を指す。中胚葉幹細胞は、たとえば、 SH2 (+)、 SH3 (+)、 SH4(+)、 CD29 (+)、 CM4(+)、 CD14(— )、 CD34 (— ) 、 CD45 ( -）の特徴を有する細胞であるが、これらマーカーに特に制限されない。また、いわゆる、間葉系に関連する幹細胞も、本発明の中胚葉幹細胞に含まれる。上記の間葉系に関連する細胞とは、間葉系幹細胞、間葉系細胞、間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞のことを意味する。

間葉系幹細胞とは、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、さらには、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞のことである。また、末梢血中の細胞を培養して得ることができる間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞も本発明の間葉系幹細胞に含まれる。

本発明において好ましい間葉系細胞としては、骨髄細胞、骨髄幹細胞（mesench ymal stem cells) を好適に示すことができる。その他、本発明の細胞の好ましい例として、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞などをあげることができる。本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞の好ましい態様としては、骨髄、臍帯血、末梢血、または、胎児肝より分離して得た細胞の 1 分画であって、心血管系細胞あるいは心筋細胞などへ分化し得る細胞を含む細胞分画を挙げることができる。

他の一つの態様において、該細胞分画は、 SH2 (+)、 SH3(+)、 SH4(+)、 CD29 (+)、 CD44 (+)、 CD14 (- )、 CD34 (- )、 CD45 (-)の特徴を有する中胚葉肝細胞を含む細胞分画である。

本発明において、上記以外の細胞分画の例としては、 Lin (-)、 Sea- 1 (+)、 CD10 ( +) , CD11D (十）、 CD44 (+)、 CD45 (+)、 CD71 (+)、 CD90 (+)、 CD105 (+)、 CDwl23 (+)、 CD 127 (+)、 CD164(+)、フイブロネクチン（十）、 ALPH (十）、コラーゲナーゼ - 1 (+)の特徴を有する間質細胞を含む細胞分画、あるいは AC133 (+)の特徴を有する細胞を含む細胞分画を挙げることができる。

本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞（細胞分画）は、一般的には、脊椎動物に由来する。好ましくは哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、ゥサギ、ブタ、ィヌ、サル、ヒトなど）由来であるが、特に制限されない本発明において、 Angl遺伝子を導入した間葉系細胞は、遺伝子改変されていない間葉系細胞に比べ高い虚血治療効果を発揮することが示された。従って、間葉系細胞に Angl遺伝子を外来的に導入することによって、虚血治療に有用な細胞を調製することができる。この細胞を虚血組織に投与することによって、虚血組織における血管形成および再生を促進することができる。間葉系細胞への Angl遺伝子導入は、上述のプラスミドベクター、その他の naked DNA、およびウィルスべクターを用いて実施することが可能である。ベクターのプロモーターは、投与した組織で Anglを高発現できるように効率の高いものを用いることが好ましい。好ましくは上記の CAプロモーターが用いられる。より好ましい態様では、 'ウィルスべクタ一を用いて Angl遺伝子を間葉系細胞に導入する。特に好ましいウィルスべクターとしては、アデノウィルスベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスベクターが挙げられる。最も好ましくは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが用いられる。マィナス鎖 RNAウィルスベクターを用いることで、 Angl遺伝子を間葉系細胞において極めて高いレベルで発現させることが可能である。

ウィルスベクターを用いて間葉系細胞に遺伝子を導入するには、導入したい遺伝子を持つウィルスベクターを間葉系細胞に接触させる。ベクターと間葉系細胞との接触は、 in vivoまたは in vitroで行うことができ、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液中で実施すればよい。 In vi troで導入する場合は、 M0I (多重感染度；細胞 1つあたりの感染ウィルス数）は 1 〜500の間にすることが好ましく、より好ましくは 1〜300、さらに好ましくは;!〜 2 00、さらに好ましくは 1〜100、さらに好ましくは 1〜70である。例えば、間葉系細胞を含む細胞分画とウィルスベクターとを混合することによって感染を実施することができる。マイナス鎖脆ウィルスベクターを用いる場合は、ベクターと間葉系細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分以上、好ましくは 3分以上、 5分以上、 10分以上、または 20分以上接触させればよく、例えば 1〜60分程度、より特定すれば 5分〜 30分程度であつてよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば 24時間、数日間またはそれ以上接触させてもよレ、。接触は体内でも体外でも実施し得る。例えば、体内から取り出した間葉系細胞を体外でウイルスベクターと接触させ、ベクターを導入後に体内に戻す ex vivo遺伝子導入において、ベクターとの接触時間が短くて済むマイナス鎖 R Aウィルスベクターによる遺伝子導入方法は好適に用いられる。本方法により血管新生遺伝子を導入した間葉系細胞は、心虚血および四肢虚血等の遺伝子治療において有用である。

間葉系細胞の調製は例えば Tsuda, H. et al. (2003) Mol Ther 7 (3)： 354-65 に記載の方法に従って調製することができる。またヒト間葉系細胞の培養などに関しては、 Kobune M, et al. , Hamada h, Telomerized human raultipotent me sen chymal cells can differentiate into hematopoietic and cobblestone area-su pporting cells Exp. Hematol Exp Hematol. 31 (8) : 715-22， 2003 の記載を参照することができる。調製した細胞は、すぐに治療に用いてもよく、また、 10から 40 PD (Population Doubling) 程度まで、 in vitroで培養増殖させて用いることもできる。

より具体的に記載すると、間葉系細胞を含む細胞分画は、例えば、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、 2000回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重 1. 07 g/mlから 1. 1 g/mlの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、 10〜3 0分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは 1. 07 g/mlから 1. 08 g/ mlの範囲（例えば、 1. 077 g/ml) である。密度勾酉己遠心のための溶液としては、 F icol液や Percol液を用いることができるがこれらに制限されない。また、脊椎動物から採取した臍帯血細胞を上記と同様に調製し、細胞分画として利用することもできる。

具体例を示せば、まず、脊椎動物より採取した骨髄液 (5-10 ^ 1) を溶液（L - 15 を 2 ml +Ficolを 3 ml) に混合し、遠心（2000回転で 15分間）し、単核細胞分画（約 1 ml) を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液 (DMEM 2 ml) に混合して、再度、遠心（2000回転で 15分間）する。次いで、上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収する。本発明の細胞分画の採取源としては、大腿骨 '以外にも、胸骨や、骨盤を形成している腸骨から採取することもできる。これらの骨以外でも大きい骨であれば採取可能である。また、骨髄バンクに保存してある骨髄液や臍帯血から採取することも可能である。臍帯血細胞を利用する場合には、骨髄バンクに保存してある臍帯血から採取することも可能である。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞より単離 ·精製して得た単核細胞分画であって、心血管系細胞へ分ィヒしうる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画である。中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記 SH2等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、心血管系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、 900 gで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重 1. 07 g/mlから L 1 g/mlの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、 10〜30分間程度である。回収する細胞分画の比重は、細胞の由来する動物の種類（例えば、ヒト、ラット、マウス）により変動しうる。密度勾配遠心のための溶液としては、 Ficol液や Percol液を用いることができるが、これらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液（25 ml) または臍帯血を同量の PBS溶液に混合し、遠心（900gで 10分間）し、沈降細胞を PBSに混合して回収（細胞密度は 4 X 10⁷細胞/ ml程度）することにより、血液成分を除去する。その後、そのうち 5 mlを Percol液（1. 073 g/ml) と混合し、遠心（900 gで 30分間）し、単核細胞分画を抽出する。細胞の洗浄のために、抽出した単核細胞分画を培養溶液（DMEM, 10% FBS, Γ/o anti - biotic - antimycotic solution) に混合し、遠心 C2000回転で 15分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去し、沈降した細胞を回収し、培養する（37° (、 5% C0₂ in air) 。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞より分離して得た単核細胞分画であって、心血管系細胞へ分化しうる間質細胞を含む細胞分画である。間質細胞は、例えば、 Lin (-）、 Sca-1 (+) _s CD10 (十）、 CD11D (+) , CD44 (+) , CD45 (+) 、 CD71 (+)、 CD90 (+)、 CD105 (+)、 CDW123 (+) , CD127 (+)、 CD164(+)、フイブロネクチン (+)、 ALPH (十)、コラ^"ゲナーゼ- 1 (+)の特徴を有する細胞である。間質細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記 Lin等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、 800 gで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重 1. 07 g/mlから 1. 1 g/mlの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、 10〜30分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは 1. 07 g/mlから 1. 08 g/mlの範囲（例えば、 1. 077 g/ml) である。密度勾配遠心のための溶液としては、 Ficol液や Percol液を用いることができるがこれらに制限されない具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を同量の溶液（PBS+2%BSA+0. 6%クェン酸ナトリウム + 1%ぺニシリン―ストレプトマイシン）溶液に混合し、そのうちの 5 mlを Ficol+Paque液（1. 077 g/ml) と混合し、遠心（800 gで 20分間）し、単核細胞分画を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液 (Alfa MEM, 12. 5% FBS, 12. 5% ゥマ血清， 0. 2% i -イノシトール， 20 mM葉酸， 0. 1 mM 2-メルカプトエタノール， 2 mM L-グルタミン， 1 M ヒドロコノレテゾン， 1% anti-biotic-antimycotic solution) に合し、 us' 、 2000回転、 15分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収し、培養する（37°C、 5% C0₂ in air) 。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、心血管系細胞へ分化しうる A C133 (+)の特徴を有する細胞を含む細胞分画である。この細胞分画は、'例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記 AC133 (+)の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、その他の態様として、脊椎動物から採取した胎児肝細胞を、 2000回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重 1. 07 g/mlから 1. 1 g/mlの範囲に含まれる細胞分画を回収し、この細胞分画から、 AC133 (+)の特徴を有する細胞を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、 10〜30 分間程度である。密度勾配遠心のための溶液としては、 Ficol液や Percol液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した肝臓組織を L-15溶液内で洗浄し、酵素処理（L-15 + 0. 01%DNaseI， 0. 25%トリプシン， 0. 1%コラーゲナーゼを含む溶液中で、 37°Cで 30分間）し、ピペッティングにより単一細胞にする。この単 —細胞となった胎児肝細胞から、大腿骨から単核細胞分画を調製する場合と同様に、遠心分離を行なう。これにより得られた細胞を洗浄し、洗浄後の細胞から AC1 33抗体を利用して AC133 (+)細胞を回収する。これにより胎児肝細胞から心血管系細胞へ分化しうる細胞を調製することができる。抗体を利用した AC133 (+)細胞の回収は、マグネットビーズを利用して、または、セルソーター（FACSなど）を利用して行なうことができる。

また、上記細胞分画に含まれる心血管系細胞に分ィヒし得る細胞として、例えば、上記細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、およぴ間質細胞、 AC1 33陽性細胞が食まれるが、心血管系細胞に分ィヒし得る限り、これらに制限されなレ、。

また本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスべクターを口腔扁平上皮細胞に接触させる工程を含む、遺伝子改変された口腔扁平上皮細胞の製造方法に関する。また本発明は、遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターをマクロファージに接触させる工程を含む、遺伝子改変されたマクロファージの製造方法に関する。さらに本発明は、遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを樹状細胞に接触させる工程を含む、遺伝子改変された樹状細胞の製造方法に関する。一般に導入遺伝子の高発現が期待されるアデノウイルスベクターと比べても、マイナス鎖 R NAウィルスベクターは、口腔扁平上皮細胞、マクロファージ、およぴ樹状細胞に対して、はるかに高い効率で遺伝子を導入できることが判明した。従って、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、口腔扁平上皮細胞（口腔扁平上皮癌細胞を含む）、マクロファージ、および樹状細胞への遺伝子導入に極めて有用である。すなわち本発明は、（i) 遺伝子改変された口腔扁平上皮細胞の製造方法であって、遣伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを口腔扁平上皮細胞に接触させるェ程を含む方法、（ii) 遺伝子改変されたマクロファージの製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖 R Aウィルスベクターを樹状細胞に接触させる工程を含む方法、および（iii) 遺伝子改変されたマクロファージの製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを樹状細胞に接触させる工程を含む方法に関する。さらに本発明は、これらの方法により製造された遺伝子改変細胞にも関する。これらの細胞の遺伝子改変は、口腔扁平上皮癌の遺伝子治療、癌およぴ免疫疾患の遺伝子治療における免疫系の制御などにおいて有用である。図面の簡単な説明

図 1は、正常または梗塞ラット心へのアデノウィルス遺伝子導入による LacZ発現を示す図である。 E. coli /3 -ガラクトシダーゼ遺伝子を持つアデノウイルスべクタ一（1 X 10⁹〜1 X 10^1Q opu) を、正常または梗塞後のラット心前壁（anterior cardiac wall) に注入した。遺伝子投与の 5日後にラットを屠殺し、摘出した心臓を組織溶解液中でホモジェナイズした。心ホモジェネートの -ガラクトシダーゼ活性を測定した。白いバーは偽手術（正常）心、灰色のバーは梗塞心を示す。図 2は、ラットの偽手術心または梗塞心の LacZ陽性域の分布を示す写真である。（A) X- gal染色した心臓の全体図。上段パネル， AxCAZ3 (lxlO¹⁰ opu) を心筋内注入した正常（偽手術）心。中段パネル，生理食塩水を注入した梗塞心。下段パネル， AxCAZ3 (lxlO¹⁰ opu) を心筋内注入した梗塞心。左パネル，右室側より観察、中央のパネル，腹側（正面）より観察、右パネル，左室側より観察。実線の矢印（黄色）は左冠状動脈（LAD) の結紮部位を示し、破線の矢印（白）は注入部位を示す。矢尻（赤）で囲んだ領域は梗塞域心筋を表す。 (B) X- gal染色した心筋梗塞心の横断面。梗塞心を結紮部位と心尖部との中間およぴ下 1/4部位で水平に切断した。薄い灰色の領域，梗塞域、濃い灰色の領域， X- gal陽性心筋。 LV，左心室、 RV, 右心室。

図 3は、偽手術心および梗塞心のアデノウィルスによる Anglの発現を示す写真である。遺伝子導入の 5日後の正常心および梗塞心において、ヒト Angl特異的 mRNA の発現を PCRにより調べた。（A) ヒト Angl特異的発現。レーン 1 : 長さのマーカーとしての 100塩基対 DNAラダー、レーン 2: 陽性対照（AxCAhAnglを感染させた HeLa 細胞）、レーン 3 : 正常心、レーン 4: AxCAZ3を注入した心臓、レーン 5 : AxCAhAngl を注入した正常心、レーン 6: AxCAhAnglを注入した梗塞心。（B) 内部対照としての対応する細胞 ·組織のラット GAPDHの発現。長さのマーカーの最も明るいパンドは 500塩基対の長さである。

図 4は、梗塞心の様々な領域の毛細血管密度を示す図おょぴ写真である。 CD34 陽性の毛細管密度を各領域で測定した（A, 梗塞壁、 B, 中隔壁、 C, 梗塞域と隣接する境界領域)。抗 CD34モノクローナル抗体で染色された毛細管数をブラインドで計数し、毛細管密度を数/腿²で表した。 *: pく 0. 01を示す。

図 5は、偽手術心および梗塞心の組織学的所見を示す写真である。心筋梗塞の 4 週間後、心臓を摘出し Masson' s trichrome染色（A〜D)、抗 CD34モノクローナル抗体による免疫染色（E〜！ 0、および抗 Qi -SMAモノクローナル抗体による免疫染色（ I〜L) を行なった。偽手術心（A， E, 1)、生理食塩水の対照（B， F, 'J)、アデノウィルスの対照（C, G, K)、 Angl処置心（D， H, L)。バーは 50ju mを表す。

図 6は、エコーカルヂォグラフィ一による収縮末期 (end-systole) および拡張末期 (end-diastole) の長軸図を示す写真である。心筋梗塞の 4週間後、エコー力ルヂォグラフィ一により心機能を評価した。 2次元エコー力ルヂォグラフによる長軸断面が示されている。上パネル，収縮末期の図；下パネル，拡張期の図。矢尻の間の領域は梗塞した前壁を示す。破線で囲んだ領域は左室腔を示す。図 7は、マウス急性下肢虚血モデルにおける Angl発現アデノウィルスベクターの単独投与による壊死抑制効果を示す写真である。

図 8は、ラット骨格筋（A) およぴ心臓 (B) における naked DNAの注入による La cZ発現を示す図である。図示した量のプラスミド（20 // g) を下肢大腿筋または心臓心尖に注入した（n=4)。プラスミド注入の 4日後に Galacto-light plus kit を用いて ]3 -gal活性を測定し、筋または心当たりの ng活性 LacZとして表した。バーは標準誤差を表す。

図 9は、ラット心への naked DNA注入とアデノウィルスベクター注入における La cZ発現の比較を示す図である。 20 μ gの pCAZ2または様々な量の AxCAZ3を心筋に注入した。バーは標準誤差を表す（n=4)。

図 1 0は、アデノウイルス（Ad) ベクターおよびセンダイウィルス（SeV) べクターの心筋細胞への遺伝子導入効果を示す図である。 LacZをコードするアデノゥィルスベクター（AxCAZ3) および SeVベクター（SeVAngl) を、 moiおよび感染時間を変えてラット心筋細胞に導入し、 jS - galacosidaseの発現を測定した。

図 1 1は、 in vivo投与における心筋へのアデノウイルスベクターおよびセンダィウィルスベクターの遺伝子導入を示す図である。 LacZ発現 AdVまたは SeVを心筋内投与して 3日後のレポーター遺伝子発現を示す。

図 1 2は、 Adベクターおよび SeVベクター静脈または心筋内投与による遺伝子発現の臓器分布を示す図である。 1 X 10 IUの SeVLacZまたは lxl0¹⁽⁾ opuの AxCAZ3を正常ラット陰茎静脈より投与し、 72時間後に摘出した臓器における La'cZ発現を測定した。また、 SeVベクターの心筋内投与後の各臓器の LacZ発現を測定した。

図 1 3は、 SeVベクターを用いたラット梗塞心への Angl遺伝子導入による心筋梗塞治療効果を示す図である。 5 X 10⁷ CIUの SeVAnglを LAD還流域周囲の左室前壁に 2 力所に分け注射し、 4週間後に測定した梗塞サイズおよび梗塞厚を示す。

図 1 4は、ラット梗塞心への SeVベクターを用いた Angl遺伝子導入による心筋梗塞治療効果を示す図である。 5 X 10⁷ CIUの SeVAnglを LAD還流域周囲の左室前壁に 2 力所に分け注射し、 4週間後に測定した心筋内血管密度を示す。

図 1 5は、ラット下肢虚血モデルに対する SeVを用いた Angl遺伝子導入による治療効果を示す図である。大腿動脈結紮ラットの大腿直筋 2ケ所に 5 X CIUの SeV Anglを投与し、虚血後 2週間にわたりレーザードップラー血流イメージ解析により血流測定を行った。正常側の下肢血流に対する虚血側の下肢血流の比（組織血流比：虚血側血流/正常側血流）を示す。

図 1 6は、アデノウイルス（Ad) ベクターおょぴセンダイウィルス（SeV) ベタターの間葉系細胞（MSC) の遺伝子導入を示す図である。 LacZをコードするアデノウィルスベクター（AxCAZ3) および SeVベクター（SeVAngl) を、 moiを変えてラット MSCに導入し、 β - galacosidaseの発現を測定した。

図 1 7は、アデノウイルス（Ad) ベクターおよびセンダイウィルス（SeV) べクターにより LacZ遺伝子を導入した MSCの X- gal染色を示す写真である。

図 1 8は、 Angl導入 MSCを用いた虚血肢治療の治療効果を示す図である。

図 1 9は、培養細胞株への SeVベクターによる遺伝子導入を、アデノウイルスべクタ一と比較した結果を示す図および写真である。

図 2 0は、アデノウィルス抵抗性ヒト口腔扁平上皮癌細胞株に対する SeVべクタ一の遺伝子導入を示す図である。

図 2 1は、ヒトマクロファージおよぴヒト樹状細胞に対する SeVベクターの遺伝子導入を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の —部として組み込まれる。

[実施例 1 ] VEGFおよび Angl発現アデノウィルスべクター

ヒト VEGF遺伝子はヒトグリオ一マ細胞株 U251由来の cDNAから PCR法にてクロー二ングし得られた VEGF遺伝子の塩基配列は Big-dye terminater法（Perkin- Elmer社）によりシークェンスを確認した。同様にヒト Angl遺伝子はヒト骨髄細胞 cDNAより PCR法によりクローニングし、塩基配列を確認した。得られた Angl遺伝子の塩基配列をジーンバンク U83508と比較したところ 933番目の塩基力 S Aから Gへ置換されていたことを除き同一であった。本塩基置換による Angl蛋白質のアミノ酸配列はジーンバンク U83508と同一であった。これらのクローニングされた VEGF/Angl cDNAを p CAGGS (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108： 193-199) 由来の pCAccベクター（WO 02/100441； I to. , Y.， et al. (2002) Mol Ther. 5： S162) の EcoRI- Bglll制限酵素サイト間に挿入し、 VEGF/Angl発現ベクターである pCAhVEGFおよび pCAhAnglを作製した。 VEGF/Angl発現アデノウイルスは斎藤らにより開発された COS - TPC法（Miy ake, S.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93： 1320-1324 (1996) ) を用い作製した。 pCAhVEGFおよび pCAhAnglを Clal制限酵素により切断し得られる VEGF/Angl cDNA 、 CAプロモーターを含む遺伝子発現ュニットをアデノウィルス 5型遺伝子の一部を含むコスミド pAxcw (Nakamura, T. et al. (2002) Hum Gene Ther. 13 : 613 - 62 6) の Clal制限酵素部位に挿入し pAxCAhVEGF/Anglを作製した。 pAxCAhVEGF/Anglと 5型アデノウイルス全長を含む DNA - terminal protein complex (TPC) の EcoT22I 制限酵素切断産物をリン酸カルシウム共沈法により 293細胞に遺伝子導入し、改変アデノウイルスを含むプラークを回収した（Graham, F. L. and A. J. van der E b. (1973) Virology. 52： 456-467) 。個々のプラークのアデノウイルスを制限酵素切断パターンで確認しさらに PCRを用レ、野生ゥィルスの混入がないことを確認し、 VEGFおよび Angl発現アデノウイルスベクターである AxCAhVEGF、 AxCA nglを得た。ラット心筋梗塞モデルには CsCl不連続密度勾配を用いた超遠心法により精製した後、 10% glycerol添加 PBSにて透析をした精製アデノウイルスを用いた（Kane gae, Y.， et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23： 3816—3821)。精製アデノウィルスベクターの濃度（opu/ml, optical density units/ml) は 0. 1%SDS存在下での A₂₆。により測定し以下の式を用い決定した（Nyberg- Hoffman, C. et al. (1997) N at Med. 3： 808-811)。

opu = A₂₆₀ x (1. 1 x 10¹²)

ウイノレスカ価 (pfu: plaque forming units) は 293細胞を用いた限界希釈法により決定した（Miyake, S.， et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93： 132 0-1324)。コントロールアデノウィルスとして coli /3 - galactosidase遺伝子を発現する AxCAZ3 (Nakamura, T. et al. (2002) Hum Gene Ther. 13 : 613-626) を用いた。このベクターは、挿入した cDNA以外は AxCAMnglと同一である。今回用いたウィルスベクターの AxCAhAngl、 AxCAhVEGFおよび AxCAZ3の opu/pfu比はそれぞれ 13. 3, 28. 0, 80. 0であった。

[実施例 2 ] アデノウィルスベクターによる梗塞心での遺伝子発現

これまで梗塞心では、正常心と比べ外来遺伝子発現が極めて低いことが報告 (L eor, J. et al. (1996) J Mol Cell Cardiol. 28 : 2057 - 2067) されていたことから、治療実験を行う前にラット心筋梗塞モデルにおいてアデノウィルスで遺伝子導入した際に十分な遺伝子発現がされる力否かを検討した。

ラット心筋梗塞モデルの作製

ラット心筋梗塞モデルは Pfefferらの方法（Pfeffer, M. A. et al. Cir. Res. 4 4: 503 - 512, 1979) にしたがい作製した。 Lewisラット（8週齢、雄、体重約 300g ) をジェチルエーテル吸入およぴケタミン 70 mg/kg, キシラジン 6〜7 mg/kgを腹腔内投与にて麻酔後，挿管した。その後、分時換気量 200〜250ml、 1回換気量 3 ml、呼吸回数 60〜80回/ min、 0₂ 1 l/min、ハロセン 0. 5〜2. 0%の条件で吸入麻酔を行い、左側胸部より開胸した。左前下行枝 (LAD) を確認し 6-0の非吸収糸（ナイロン糸）を用い，左前下行枝を左心耳の高さで結紮した。結紮後、呼気終末陽圧式人工呼吸 (positive end-expiratory pressure) でム¾¾させた。月 φ 傷つけないように肋間を閉じた後，筋層，皮膚と連続縫合にて閉創した。対照の偽手術では、冠動脈を結紮しない以外は同様に手術を行なった。アデノウイルスベクターの心筋内投与は、左前下行枝の結紮後、左前下行枝還流域と推定される領域周辺部左右ニケ所に 30G針を用い⁵ X 10⁹ opu/δθ μ ΐ (総量 1 X 10¹⁰ opuの場合）ずつアデノウィルスベクターを心筋内投与した。

心筋内 LacZ遺伝子発現の検討

アデノウイルスベクター投与によるラット心筋での E. coli ]3 - galacosidase遺伝子発現を X- gal染色 (Nakamura, Y. , et al. (1994) Cancer Res. 54： 5757-576 0) により確認した。 AxCAZ3 1 X 10^1D 0Ρυ/100 1を心筋内投与 5日後、深麻酔下に 2% paraforraaldehideを全身に還流し臓器を固定した。摘出した固定後の心臓を X- gal (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 溶液 (PBS pH 7. 2, 2 mM MgCl₂, 4 niM p otassium ferricyanide, 1 mg / ml Xgal) に 30°Cで 16時間浸し染色した。また心臓での j8 - galacosidase遺 1S子発現 ¾rGalacto- Light puis kit (Tropix Inc. Bedf ord, MA) と；3 - galacosidase標準標本 (Roche) を用レヽ、；3 - galacosidase酵素活性を定量的にて検討した（Shaper NL et al. J. Biol. Chem. 269 (40) , 25165-2517 1, 1994)。 AxCAZ3 1 x 10⁹〜1 x 10¹⁰ opuを心筋内投与 5日後にラットを屠殺、摘出心を Lysis Buffer (100 mM potassium phosphate, pH 7. 8， 0. 2% Triton X- 100 ， 1 mM dithiothreitol, 0. 2 mM phenylmethyl sulf ony 1 fluoride, 5 g / ml le upeptin) 存在下で homogenizeした。 12, 500 xg， 10 min遠心後、上清中の内因性 jS - galacosidase活性を失活するため 48°C、 1時間インキュベートした（Young DC, Anal. Biochemi. 215, 24 - 30, 1993)。

上清中の酵素活性は Galacto-Light puisを用い室温で 1時間反応後、化学発光を Mini-Lumat LB9506 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG, Wildba'd, Germany) を用い測定した。得られた結果（Relative light units) は組み換え j3 - galacos idase標準標本 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) を用いた標準曲線により、 β -galacos idase活性（pg/ml)に変換した。

アデノウィルスベクターの心筋内投与は以下のごとく施行した。左前下行枝の結紮後、左前下行枝還流域と推定される領域周辺部左右ニケ所に 30G針を用い 5 X 1 0⁹ opu/50 ^ 1 (総量 I X 10¹。 opuの場合）ずつアデノウイルスベクターを心筋内投与した。正常心および梗塞心の 2ケ所に分け心筋内投与し、 5日後にその発現を測定した。図 1に示すごとく 5xl0⁹ opu以上のアデノウィルスべクター投与により正常心、梗塞心で明らかな遺伝子発現を認め、梗塞心でも正常心とほぼ同等の発現であった。導入遺伝子の発現は用量依存的であり、アデノウイルスの用量の増加に従って発現も増加した。また梗塞心での遺伝子発現の分布は図 2 (A) に示すように遺伝子導入部である前側壁を中心に広範囲に認められたが、横断面での X - g al染色像（図 2 (B)) で明らかなように梗塞部心筋および中隔部、右室心筋での遺伝子発現は認めなかった。

[実施例 3 ] VEGFおよび Angl遺伝子導入による心筋梗塞後生存率

アデノウィルス 1χ10^ω opuにより梗塞心筋で明らかな遺伝子発現を認めたことから血管新生因子遺伝子によるラット心筋梗塞モデルの治療を行った。また慢性心筋虚血に対しすでに効果が示されている VEGF遺伝子による心筋梗塞治療効果を同時に検討した。心筋梗塞後未治療群、コントロールアデノウイルス投与群、 AxCAh VEGF投与群、 AxCAMngl投与群の心筋梗塞 4週後のラット生存率を算出した。モデル作製 24時間以内の死亡ラットは本算出より除外した。

また、ベクターを投与した心臓における Anglの発現を RT-PCRにより調べた（図 3 ) 。アデノウイルスベクターによる遺伝子導入（1 X 10¹⁰ opu/心）の 5日後に心臓を摘出し、全 RNAを R easy kit (Qiagen K. Κ, Tokyo, Japan) により左心室心筋から抽出した。心筋全醒中の DNAのコンタミネーシヨンを避けるため、 R ase - f re e DNase Set (Qiagen) を用いて説明書に従って DNasel消化を行った。第一鎖 cDNA 合成はランダムプライマ—ミクスチヤ一（Invitrogen, Carlsbad, CA) および Sep erscript™ II (Invitrogen) を用いて全 RNAのランダムプライマー法により行なつた。アデノウイルスベクターから転写されたヒト Angl特異的 mRNAは、ヒト Angl特異的フォワードプライマーと、 Angl発現単位のターミネータ一部位にあるゥサギ /3グロプリンに対するリバースプライマーを用いて検出した。また内部対照としてラット glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) を RT- PCRにより検出した。ヒト Anglフォワードプライマー、ゥサギ /3グロブリンリバースプライマ一、および GAPDHプライマーを以下に示した。

ヒト Anglプライマー

フォワード， 5，— CAGAGGCAGTACATGCTMGMTTGAGTTA - 3，（配列番号： 6 ) ゥサギグロブプライマー

リバース， 5' - AGATGCTCMGGGGCTTCATGATG- 3，（配列番号： 7 )

ゥサギ GAPDHプライマー

フォワード， 5' - TATTGGGCGCCTGGTCACCA- 3，（配列番号： 8 )

リバース， 5， - CCACCTTCTTGATGTCATCA- 3，（配列番号： 9 )

30サイクルの PCRを行い、ヒト Angl mRNAおよび GAPDH mRNAを検出した。 PCR産物は 2%ァガロースゲルで分離した。ヒト Angl mRNAの陽性対照として、 100 opu/cell で AxCAhAnglを感染させた HeLa細胞から抽出した全 RNAを用いた。

ラット GAPDH遺伝子由来の産物（内部対照）は全ての心筋 RNA試料で 407 bpの位置に等しく検出された（図 3 )。ヒト Anglに特異的な 453bpの PCRバンドを、 AxCA A ngl投与したラット心サンプル、 AxCAhAnglを用い遺伝子導入した HeLa細胞サンプルに認めた。また正常心、 AxCAZ3投与心ではヒト Anglに特異的なバンドは認められなかった。

心筋梗塞モデルにおけるモデル作製 24時間以内の死亡を抜いた死亡率は約 25%であり、コントロールアデノウィルス AxCAZ3を投与した群では死亡率 20°/。とアデノゥィルス投与による死亡率への影響は軽微であった。まず慢性心筋虚血に対し既に効果が示されている VEGF遺伝子による心筋梗塞治療効果を検討したところ、 VEGF 遺伝子投与群では心筋梗塞 4週後死亡率が約 40%とむしろ増加することが明らかとなった。一方、 cl0^1Q opuの AxCAhAnglを投与群では 8%と死亡率の低下が認められた（表 1 )。

このことから急性心筋梗塞では VEGFより Anglがより有効であることが明らかとなった。表 1 実験的に心筋梗塞を誘導しラットの生存率

%生存率

偽手術 75.9 (18/25)

AxCAZ3 1 X 10¹⁰ opu 81.3 (13/16)

AxCA VEGF 1 x 10¹⁰opu 60.0 (6/10)

AxCAhAngl 1 x 10¹⁰opu 92.0 (23/25)

[実施例 4 ] Angl遺伝子、 VEGF遺伝子による心筋梗塞後血管誘導

VEGF遺伝子は強力な新生血管誘導作用があることが知られている。また Anglは V EGFとの協同作用にて新生血管誘導を増強することが知られている。そこで Angl遺伝子導入効果を直接証明するために、遺伝子投与した梗塞心での血管密度を測定した。心筋梗塞作製 4週後の心筋内血管密度を、 CD34モノクロナール抗体を用いた血管内皮細胞の免疫組織染色により評価した。心臓をホルマリンで固定後パラフィン包埋し、 10 /z mの切片を作製した。 1次抗体として Anti - CD34モノクローナル抗体（MoAb) (NU-4A1, Nichirei, Tokyo Japan) 使用し、ビォチン化 anti- Mouse IgG 2次抗体とアビジンィヒ Horseradish peroxidase (DAB paraffin IHC staining module, Ventana Medical System Inc, Tuson, AZ) を用い染色した。サブタイプが同一のマウス IgGを用いて一次抗体の特異性を確認した。心室中隔、梗塞部周辺領域、心筋梗塞巣内残存心筋での切片内の血管数を 200倍拡大し顕微鏡下でブラインドにて測定した。心臓当たり 40の切片のそれぞれに対して、ランダムに選んだ 5つの視野について計数した。染色された血管を、梗塞領域、境界領域、およぴ中隔壁について計数した。結果は血管数/ mm² の平均値として表記した。また、成熟血管を確認するため、抗 a - SMA MoAb (clone 1A4, Dako Japan, Tokyo, Japa n) を用いて、抗 CD34 MoAbと同様に染色を行なった。 a - SMA陽性の血管は、上記の毛細管密度の計数と同様に行なった。

梗塞心では正常心に比べ梗塞部、梗塞周囲部心筋で血管密度の低下が認められた（図 4 )。 VEGFあるいは Anglをアデノウイルスにより投与したところ、その梗塞部、梗塞周囲心筋で有意な血管密度の増加が認められ、特に遺伝子投与部近傍である梗塞周囲部では正常心筋よりさらに増加していた（梗塞周囲心筋の血管密度は、 Angl処理群では 644±96/應 ²、生理食塩水処理群では 350±79/mm² (p<0. 01 v s Angl処理群）、 AxCAZ3処理群では 332± 127/mm² (pく 0. 01 vs Angl処理群）、偽手術群では 402± 121/顧² ；)。 Angl処理群では、血管腫は肉眼でも顕微鏡でも観察されなかった。興味深いことに、生食投与群および AxCAZ3投与群では、遺伝子投与部位から離れた心室中隔部でも心筋梗塞後 4週目で血管数の減少を認め（それぞれ 341±60/膽²および 367 ± 113 /匪² ) , Angl遺伝子（461± 100/mm²) または VEGF 遺伝子の投与によりこの中隔部での血管数の減少は抑制された（偽手術群では 48 3±46/mm²)。図 5に anti- CD34 MoAbによる血管内皮の免疫染色像を示すが Angl遺伝子投与群では 10 ju m以下の micro vesselの増加とともに 10 μ m以上の vesselの増加も観察された（Angl処置した梗塞心の左心室領域では、全ての試料で多数の a - SMA陽性血管が観察された；中隔領域で 38. 9 ±7. 35/讓 ²、梗塞境界域で 38. 9 ±4. 81 /蘭²、梗塞域で 112±26. 1/mm²)。 Angl処理群を除くいずれの群でも、を超える CK -SMA陽性の血管密度は有意に変化しなかった（19- 22/醒 ²)。また Angl単独の遺伝子投与でも VEGF遺伝子投与と同程度の血管密度の増加が観察された（図 4 )。 [実施例 5 ] Angl遺伝子による心筋梗塞巣の縮小

心筋梗塞モデルでの Angl遺伝子による梗塞巣への影響を確認した。以下のように、心筋梗塞域の測定を行なった。心筋梗塞 4週後の梗塞域のサイズを Edelberg ら（Edelberg JM et al. Circulation 105, 608-613, 2001) の方法および Robert sらの方法 (Roberts CS et al, Am. J. Cardiol. 51， 872-876， 1983) に従い測定した。モデル作製後、 4週後にラットを屠殺し梗塞心を摘出、冷生理食塩水に浸して心室から余分な血液を除去した後、 4% formaldehideで 48時間固定、 parrafin 包埋し、の切片を作製した。左前下行枝結紮部と心尖部の中間部位にて短軸方向に切片を作製、 Hematoxyline— Eosin染色、 Mas son' s trichrome染色にて梗塞部を染色した。切片をデジタルカメラにて取り込み NIH imageにて以下のパラメ一ターをブラインドにて測定した。

総左心室（LV)域（Total left ventricle (LV) area) (mm²) , 梗塞域（infarction area) (ram²) , 中隔壁厚（septal wall thickness) (mm) , 梗塞壁厚（infarction wall thickness) (mm) , LVの心外膜側周および心内膜側周（epicardial and end ocardial circumference of LV) (mm) , 心外膜側および心外膜側の梗塞長（epica rdial and endocardial infarction length) mn)。

これらの結果から以下の式を用い評価を行った。

%梗塞サイズ（％ infarction size) =梗塞域 /総 LV域 100

%前/中隔壁厚 (% Ant/septal wall thickness) =前壁（梗塞)厚 I 中隔壁厚 X 100

生存 LV域 (vaiable LV area) = (総 LV心筋域） - （梗塞心筋域）；

%心内膜側梗塞長 ·（％ endocardial infract length) =梗塞の心内膜側長 I LVの心内膜側周 X 100；

%心外膜側梗塞長 ( epicardial infract length) =梗塞の心外膜側長 I LV の心外膜側周 X 100 ;

図 5に示すように梗塞心筋では梗塞巣さらには左室残存心筋全体にわたる心筋壁のひ薄化、左室内腔の拡大傾向を認め心不全兆候が明らかである。表 2に示すように Angl遺伝子投与群でコントロールと比べ有意な梗塞域の縮小（。/。梗塞サイズ

(%infarction size) ) , さらに残存心筋量の有意な増加（。生存 LV域（％ viable LV area) ) を認め、 Anglの心筋梗塞巣の縮小効果とともに残存心筋に対する効果も明らかであった。また梗塞壁厚を反映する％梗塞厚 (%infarct thickness) でも有意な増加を Angl投与群で認めた。表 2 ラット心筋梗塞後の左心室の Angl遺伝子治療の有無による解剖学的変化 %梗塞サイズ。/。前/中隔壁厚生存 LV域％心内膜梗塞％心外膜梗塞

(匪²) 長長偽手術（"=5) - 123±29.0 37.4±9.36 ― 一生理食塩水（《=14) 31.6±8.66 34.0±7.05 19.8±4.91 44.0±10.8 34.4±8.86 AxCAZ3 («=8) 34.9±6.69 31.3±4.64 19.2±4.68 52.5±3.99 43.7±7.52

(表の説明）値は平均 ±SDで示した。 LVは左心室を示す。心筋梗塞の 4週間後にラットを屠殺した。全てのパラメータ一は、心臓の冠動脈結紮部位と心尖部の中間部横断面で測定した。統計解析は Bonf erroni/Dunnの検定による AN0VAを用いて行なった。

[実施例 6 ] Angl遺伝子による心筋梗塞後心機能の改善

Anglによる梗塞心での血管新生作用、心筋梗塞巣縮小効果が明らかとなったが、はたしてこれらの効果が心機能の改善に結びついている力否かを検討した。心機能の計測は心ェコーを用レ、M- mode法、 B- mode長軸断を用いた Area- length法により評価した。

具体的には、 LAD結紮の 4週間後にエコーカルヂォグラム（L0GIQ500, GE Yokoka wa Medical System, Tokyo, Japan) を用いて心機能測定を行った。測定中は、塩酸ケタミン（50 m_g/kg) およぴキシラジン（2. 5mg/kg) を筋注により麻酔を行なつた。 10- MHzプローブを用い long axis viewにより Mモードの計測部位を決定した。 Mモード法により左室拡張終末期径 Edd (end diastolic diameter) , '左室収縮終末期径 Esd (end systolic diameter)を計測し左室短径短縮率（FS， fractional s hortening) を算出した。

FS (%) = (Edd-Eds) /Edd x 100

また Bモードにて心の左室長軸断を描出し、拡張期左室面積（LVAd, left ventr icular area at diastole)、収 fe期 i室積 (LVAs, left ventricular area at systole)、拡張期左室長軸径 (LVLd left ventricular long -axis length at dias tole)、収縮期左室長軸径 (LVLs, left ventricular long-axis length at systol e)を測定し以下の式により左室駆出率 (EF， ejection fraction)を算出した (Area- 1 ength法） (Sjaastad, I. et al. (2000) J. Appl. Physiol. 89： 1445—1454)。 EF (%) = [ (0. 85xLVAd²/LVLd)- (0. 85xLVAs²/LVLs) ]/ (0. 85xLVAd²/LVLd) x 100 ラット心筋梗塞モデルでの心エコー長軸断層像を図 6に示すが、梗塞心では梗塞部である左室前壁のひ薄化とエコー輝度の増加、左室内腔の拡大を明瞭に認め、組織像と同様に心不全所見を呈していた。

心エコーにて測定した各種のパラメーターを表 3に示す。心筋梗塞後、生食コントロール群、アデノウイルスコントロール（AxCAZ3) 群いずれも Edd， Esd, LVA d， LVAsの著明な増加を認め、 FS， EFも正常心の 40- 50%と低下しており心筋梗塞後 4週目には心ェコーパラメーターでも心不全状態を呈していることが確認できた。一方、 Angl遺伝子投与群では Edd， Esd, LVAdの有意な改善は認められなかったものの FS， LVAsはコントロールにくらべ増加し、 EFも 55%と改善していた。表 3 梗塞心の Angl遺伝子治療における心ェコ一による心機能評価

Mモード評価 2次元評価

Edd Esd FS LVAd LVAs FAC EF (mm) ^mm) (%) (mm²) (mm )― (%) (%) 偽手術 5.50±0.20 2.50±0.177 54.6±1.99 55.2±9.57 24.6±5.50 55.5±4.82 72.8±5.86 生理食塩水 7.43±U5 5.86±0.0851 20.8±4.63 75.3±9.03 57.8±1.89 22.6±6.99 36.0±9.46 AxCAZ3 7.54±0.544 5.93+0.693 21.6i4.50 73.7±4.04 54.3±6.66 26.4±5.54 40.5±7.62

AxCAhAngl _7.13±0.985 4.69±1.31 34.7±11.1^ 71.6±3.46 45.0i5.12*¹ 34.8i5.47*¹ 55.0±2.16^ *,p < 0.05 vs.生理食塩水; ^l,pく 0.05 vs. AxCAZ3

(表の説明）梗塞の 4週間後、 I X 10¹。 opuの AxCAZ3または AxCAhAnglで処理した心臓の心機能を心エコーカルヂォグラフィ一による Mモードおよび Area- length法を用いて測定した。値は平均土 SDで示した。 Eddは左室拡張終末期径（end diastoli c diameter) , Esdは左室収縮終末期径 (end systolic diameter) _N FSは左室短径短縮率（fractional shortening) , LVAdは拡張期左室面積 (left ventricular ar ea at diastole)、 LVAsは収縮期室 [fi積 (left ventricular area at systole) 、 FACは左室内腔面積変化率（fractional area change)、 EFは左室駆出率（eject ion fraction) を表す。統計解析は Bonferroni/Dunnの検定による A 0VAを用いて行なった。

[実施例 7 ] マウス急性下肢虚血モデルに対する Angl遺伝子単独投与による壌死抑制効果

下肢急性虚血は、心筋虚血と同様に組織 VEGF産生が宂進する。そこでマウス急性下肢虚血モデルを作製し、 Angl発現アデノウィルスベクターの単独投与により虚血治療を試みた。 C3H/HeNマウス（male, 20-25 g) を用いて Couffinhalらの方法 (Couffinhal T et al. (1998) Am J Pathol 152 (6) : 1667— 79) に準じ下肢虚血モデルを作製した。全身麻酔下はケタラール（50 mg/kg)、キシラジン（20 mg/kg ) を筋注した。両下肢の悌毛後、左鼠径部を切開、左大腿動脈とその全分枝を露出した。大腿動脈起始部 7 - 0ナイロン縫合糸を用いて結紮、さらに膝窩動脈と伏在動脈の分岐部直前で同様に結紮した。また他の全分枝を結紮後、左大腿動脈を切除 ·除去した。切開創を縫合閉鎖し手術を終了した。

Angl発現アデノウイルス AxCAhAngl (opu/pfu比は 13. 3) は上記と同様に作製した。 AxCAhAngl (1 X 10¹⁰ opu/匹）を、下肢虚血を作製直後に左大腿部'内転筋及ぴ左腓腹筋に 2. 5 X 10⁹ opu I 25 // Iを各 2力所ずつ、計 4力所に 29G針付き 1. 0 ml注射器により筋肉内投与した。対照群には虚血作製マウス 5匹を使用した。モデル作製 3日後、 9または 1 0日後に壊死部の確認、肢指脱落、下肢脱落、潰瘍形成を肉眼により確認、し、虚血の評価を行った。

対照群ではモデル作製 3日後に壌死部の確認 (3/5) (すなわち 5例中 3例）、肢指脱落（2/5)、下肢脱落（0/5)、潰瘍形成（1/5)を認め、さらに 9日後には壊死部の確認 (3/5)、肤指脱落（3/5)、下肢脱落（0/5)、潰瘍形成（1/5)と虚血の進行を認めた。一方、 Angl群ではモデル作製 3日後に壊死部の確認 (0/5)、肢指脱落（0/ 5)、下肢脱落（0/5)、潰瘍形成（2/5)を認め、さらに 9日後には壌死部の確認 (3/ 5)、肢指脱落（1/5)、下肢脱落（0/5)、潰瘍形成（2/5)と虚血の進行が抑制されていた。結果を図 7に示した。

Angl発現アデノウイルスの単独投与により、肢指脱落、下肢脱落の明らかな抑制効果を認めた。虚血 3日目の患肢の状況を検討したところ Angl投与肢では対照に比べ明らかに虚血による変化は軽減されていた。血管新生には萌出、分岐など多くのステップがある。特に組織還流を促す機能的な血管の形成には動脈新生（a rteriogenesis) が関与し、主に虚血 1 0日以後と血管新生の後期に観察される。したがって今回観察された Anglの早期の効果は血管新生によるものとは考え難く、血管新生以外の機序が推定される。 Anglは Tie- 2を介し PI3キナーゼを活性化し、抗アポトーシス作用有する Aktを活性化することが知られている。また Tie - 2を介し血管内皮アポトーシス抑制効果を有する NO産生を亢進させる。これらの Angl の作用により血管内皮細胞のアポトーシスを抑制し、虚血の進展を抑制した可能性がある。

急性虚血によりもたらされる VEGFの産生亢進は組織浮腫を増悪させ、組織還流の更なる低下をもたらすと推定される。実際、本モデルで VEGFを高発現させると、下肢の壌死脱落を促進することが報告されている。本実施例においては、 Angl を虚血急性期に投与することにより還流低下につながる浮腫の進展を抑制したと推測される。 Angl投与群では 9日目でも肢指脱落を伴う高度の壊死は 1例に観察されるのみであった。 '

以上、急性下肢虚血モデルに Anglを投与することにより壌死の進展を抑制し、壊死後の肢脱落より救肢できることが確認された。

[実施例 8 ] Nakedプラスミドによる骨格筋および心筋への Angl遺伝子導入

Nakedプラスミドを直接組織に注入することは、最も安全で簡便な遺伝子送達方法であり、これまで承認された臨床の心血管遺伝子治療プロトコルの多くにおいて、サイトメガロウィルス（CMV) プロモーターをベースにしたプラスミドが採用されている。 Nakedプラスミド注入に主要な限界の 1つは導入遺伝子の発現レベルが低いことである。 CAプロモーター（サイトメガロウィルスェンハンサーを持つニヮトリァクチンプロモーター）は、 in vitroおよび in vivoにおける最も強力な転写制御モジュールの 1つである。しかしながら、 CAプロモーターにより駆動される遺伝子発現は細胞おょぴ器官の種類に依存する。実際、 CAプロモーターべースのベクターを用いて nakedプラスミドの注入することによって、心組織で適切なレベルの導入遺伝子の発現が得られるかは不明である。そこで、 CAプロモータ一をベースにした nakedプラスミドを作製し、心筋への直接注入による導入遺伝子に発現レベルを検討した。

pIND/lacZ (Invitrogen社) 力ら Escherichia coli ]3ガラク卜シターで (LacZ) 遺伝子を切り出し、 pcDNA3ベクター（Invitrogen社）、 CAプロモーターを持つ pCA GGSベクター (Niwa, M. et al. , Gene 1991； 108: 193—199)、および pCAGGSから s imian virus複製 origin (SV40ori) を欠失した pCAlに組み込み、それぞれ pcDNA3 LacZ, pCAZ2、および pCAlLacZとした。なお、 pCAZ2は Yoshida et al.， Hum. Gen e Ther. 9 :2503-2515, 1998 に記載されているプラスミド pCAZ2 を用いた。また、 pCAlは、 pCAGGSを BamHIと Hindlllで切断して SMOoriを含む断片（522 bp) を除いて作製した。その後、切断したプラスミドの 5'端の T4 DNAポリメラーゼで fill inし、 T4 DNAリガーゼでライゲーシヨンして発現ベクター pCAlとした。全てのプラスミドは Endofree Maxi kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) を用いて精製した。 '

0. 1 mlの 0. 9%生理食塩水中の 20 ^u gの nakedプラスミドを、 27ゲージの注射針を持つ 1 mlシリンジを用いて、 Lewisラット（雄， 8週齢， 250〜300 g重， Sankyo La bo Service (Tokyo, Japan) ) の骨格筋または心臓に注入した。 0. 1 mlの 0. 9%生理食塩水中の AxCAZ3アデノウイルス粒子（ΙΟ¹⁰, 5 X 10⁹, および 10⁹ 0PU) も同様に心臓に注入した。骨格筋への注入では、後肢の大腿筋への注入を容易にするため 2 cm切開した (Wolff, J. A. et al. , Science 1990; 247： 1465 - 1468)。心臓への注入では、左胸を開胸し nakedプラスミドまたはアデノウイルス粒子を心尖部に注入した（Lin, H. et al. , Circulation 1990； 82： 2217 - 2221)。注入後、切開部を絹縫合糸で縫合した。

骨格筋および心臓における gal活性を以前のように解析した（Shaper, N. L. et al. , J Boil Chem 1994； 269： 25165-25171)。具体的には、 4 mlの組織溶解液 (100 mM リン酸カリウム， 0. 2% Triton X- 100, 2 inM leupeptin, 1 mM phenylme thylsulfonyl fluoride, および 0. 5 mM dithiothreitol, pH 7. 8) 中で 1分間糸且織（0. 8〜1. 0 g) をホモジェナイズした。ホモジェナイズした組織は、続いて 12， 000 xgで 10分遠心した。上清を回収し、 48°Cで 1時間加熱して内在性の j3ガラクトシダーゼ活性を不活化した。上清中の J3 - gal活性は Galacto- Light™ Plus kit ( Tropix, Bedford, MA) により、製造元のプロトコルに従って測定した。ケミルミネッセンスは MicroLumat LB96ルミノメーター（Wallac, Gaitherburg, MD) を用いて検出した。 Relative light units (RLUs) として得られたデータは、組み換え 3ガラク卜シダーゼ標準 (Roche Diagnostics, Man eim, Germany) を用レヽて cZの ng活性に変換した。 LacZの組織ィ匕学的検出では、 10 μ mの心組織凍結切片をまず X- gal溶液で 37°Cで 24時間染色（Nabel, E. G. et al. , Science 1989； 244： 134 2-1344) し、その後ェォシンで対比染色した。値は平均土 S. E.で表した。統計学的解析は、 Scheffeの検定で行った。 0. 05未満の p値を有意とする。

ここで用いた nakedプラスミド量（20 μ _§) は、虚血肤（Losordo, D. W. et al. ,

Circulation 1998； 98： 2800-2804) およぴ心疾患 (Baumgartner, Γ. et al. , C irculation 1998； 97： 1114-1123) の臨床遺伝子治療の試行において用いられた用量（g/kg) と相同である。前者は、計 4 mgの naked DNAが用いられ、後者では 2

00〜2，000 ^ §の 3 6(1 0 が用ぃられた。ここでは、 CAプロモーターおよび CMVプ口モーターベースのベクターからのレポーター遺伝子の発現を、ラット骨格筋おょぴ心臓において調べた。 2つの組織は、臨床心血管遺伝子治療における nakedプラスミドの注入部位として共によく知られている。後肢の大腿筋 (n=4) および心臓（n=4) にプラスミドを注入してから 5日後に、 CMVプロモーター（pcDNA3LacZ, pCMV^) および CAプロモーター（pCAZ2， pCAlLacZ) ベースのベクターに媒介される LacZの発現は、骨格筋においてそれぞれ 1.6±0,4、 10.2±2,0、 37.2±6.9、および 27.2±6.8 ngであった（図 8A)。骨格筋において、 CAプロモーターベースのベクターは CMVプロモーターベースのベクターよりもレポーター遺伝子の発現レべルが高かった。同様に、心臓では、 CAプロモーターベースのベクターの導入遺伝子発現（pCAZ2， 510.8±69.8 ng; pCAlLacZ, 509.9±66.7 ng) は、 CMVプロモーターベースのベクターの場合 (pcDNA3LacZ, 46.2±13.2 ng; pCMVjS, 108·8±37. 8 ng) と比較して優れていた。心臓における導入遺伝子の発現レベルは、全てのプラスミドにおいて骨格筋で観察されたものよりも約一桁高いことが判明した（図 8B)。安全性を向上させるため SV40ori配列を取り除いた pCAlLacZベタターに関しても、導入遺伝子の発現を検討した。図 8に示したように、骨格筋または心臓のどちらにおいても、 pCAlLacZと pCAZ2との間で LacZの発現につレ、て有意な違いは見られなかった。

心臓における、 CAプロモーターベースのプラスミドベクターとアデノウイルスベクターとの間の LacZ発現の比較を行なった。様々な量のアデノウィルスベクタ一 AxCAZ3 (10¹⁰, 5X10⁹、 10⁹ 0PU) を心臓の心尖部に注入した（n=4)。 5日後に、 AxCAZ3を注入した心臓における LacZの発現レベルを、 20 gの pCAZ2を注入した心組織と比較した。その結果、 20 gの pCAZ2に媒介される心臓における導入遺伝子発現の平均レベルは、 6.0X10⁹ 0PUの AxCAZ3によるものとほぼ同等であることが判明した（図 9)。

pcDNA3LacZ (20 μ g) , pCAZ2 (20 μ g) , または 5Χ 10⁹ 0PUの AxCAZ3を注入し、その後 X- galで染色した。 LacZ陽性筋細胞が調べた全てのグループの試料において検出された。 pcDNA3LacZを注入した心試料では、針を注入した部位周辺にほとんど LacZ陽性細胞は見られなかった。これに対して、 pCAZ2の場合は、散発的ではあるが発現の強レ、LacZ陽性心筋細胞が注入領域周辺に観察された。 5 X 10⁹ 0PUの AxC AZ3を注入した心組織は、 pCAZ2を注入したもので見られたのと類似した導入遺伝子発現のレベルおょぴパターンを示した。以上のように、プラスミドの直接投与は心筋においては極めて効率的に導入遺伝子を発現することができ、特に CAプロモーターを用いることにより、アデノウィルスベクターとほぼ同等の高いレベルの発現が得られることが実証された。

[実施例 9 ] ヒト Angl発現マイナス鎖 RNAウィルスベクターによる心筋細胞への遺伝子導入効果

ヒト Angl cDNA を揷入した伝播型センダイウィルスベクター（SeVAngl) は、公知の方法に基づいて製造した (Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1： 569 - 579 ； Yu， D. et al. , 1997, Genes Cells 2： 457—466) 。対照ベクターとして、外来遺伝子発現のない SeV (SeVNull) およぴ£ coJi -galacosidase遺伝子（LacZ) 発現 SeV (SeVLacZ) を用いた。また比較として、 LacZをコードするアデノウィルスベクター AxCAZ3 を用いた。 SeVベクターは、 10- day- oldの有胚鶏卵の尿膜腔に注入して増殖させ回収した。ニヮトリ赤血球を用いたへマグルチネーシヨンアツセィによりタイターを決定し、使用するまで- 80°Cで保存した。 LacZをコードするアデノウイルスベクター（AxCAZ3) はヒト胚腎由来 293細胞で増殖させ、 CsCl不連続密度勾配を用いた超遠心法により精製した後、 10% glycerol添加 PBSで透析後、使用するまで- 70°Cで保存した。使用前に、ウィルスストック中のアデノウイルスの濃度、タイター、および複製能を持つアデノウイルスのコンタミネーシヨンを評価した。アデノウイルスのタイターは、 293細胞を用いた LD50 (pfu, plaque fo rming units) および A260測定 (opu, optical particle units) により決定したラット新生児心筋細胞でのアデノウィルスベクターおよびセンダイウィルスべクタ一による LacZ遺伝子発現を以下のように検討した。ラット新生児心筋細胞分離を、以下のように行った。 Lewisラット新生児を深麻酔下に心を摘出し酸素飽和 Tyrode' s液（143 mM NaCl, 5. 4 mM KC1, 1. 8 raM CaCl₂, 0. 5 raM MgCl₂, 0. 33 mM N aH₂P0₄, 5. 5 mM glucose, 5. 0 mM HEPES) に浸し心室筋を分離した。得られた心室筋 collagenase (5 mg/ml, Wako Pure Chemical Industries) 含 Ca'+- free Tyrod e' s液にて 37°C 1時間インキュベーションし心筋細胞を単離した。単離したラット新生児心筋細胞は KB液 (50 raM L - glutamic acid, 40 mM KCl 40, 20 raM taurine,

20 raM KH₂P0₄, 3 raM MgCl₂, 10 mM glucose, 0. 5 mM EGTA, 10 mM HEPES) 内で 5 分間ピペッティングし細胞懸濁液を作製し、 10%ゥシ胎児血清（FBS) を含む DMEM 中、 5 X 10⁴/wellの濃度で 24 well plateに播種した。

ラット新生児心筋細胞への遺伝子導入は以下のごとく行った。上記のようにラット新生児心筋細胞を 5 X 10⁴/wellの細胞密度で 24 well plateに播種、翌日ウイルスベクター感染を行った。 SeVLacZまたは AxCAZ3を 2% Fetal bovine serum (FBS ) 添加 Dulbeco' s mod ied Eagle Medium (DMEM) にて希釈した各種 multiplicity of infection (moi, SeVベクターについては CIU/cells、 Adベクターについては pfu/cells) のウィルス液にてラット新生児心筋細胞に 37°C 1時間感染した。その後、 Phosphate Buffered Saline (PBS) を用い洗浄後、 10%FBS添加 DMEMにて 24 時間培養し、 LacZ発現を検討した。 LacZ活性は beta- gal Reporter Gene Assay Ki t (Rosche) と beta - galacosidase標準標本 (Rosche) を用レヽ、 beta- galacosidase 酵素活性を定量的にて検討した。

結果を図 1 0に示した。 SeVLacZおよび AxCAZ3は両者とも、高 moi (> 30 moi) ではラット心筋細胞において導入遺伝子の高発現をもたらすことが示された。 SeV は 10 moi以下の低 moiによる感染でも高いレポーター遺伝子の発現を示し、ウィルス濃度依存性にその発現は増加し 30 moi以上でほぼプラトーに達した。一方 Adベクタ一のラット新生児心筋細胞での遺伝子導入はウィルス濃度依存性であり、 100 moiのウィルス濃度でも最大発現量に達していなかった。 Adベクター 10 moiと Se Vベクター 1 moiのラット新生児心筋細胞 LacZ発現はほぼ同等であり、特に低 moi ( 10 moi以下）では SeVベクターの遺伝子導入効率は AdVと比較し高かった。次にウイルス液曝露時間のラット新生児心筋細胞への遺伝子導入に与える影響を検討した。アデノウイルスベクターでは、心筋細胞への in vitro遺伝子導入において導入遺伝子を最大に発現させるには長時間（120分以上）が必要であった。それに対し、 SeVベクターでは、ウィルス液を同条件で短時間（30分以内）暴露させるだけでも導入遺伝子の最大発現を得るのに十分であった。

[実施例 1 0 ] SeVベクター心筋内投与による遺伝子発現

ラット新生児心筋細胞での SeVベクターによる効率的な遺伝子発現が確認された力 in vivo心筋内投与による心臓での遺伝子発現は未だ報告がなく不明である。そこで正常ラット心に各種濃度の LacZ発現 Adべクターまたは SeVベタターを心筋内投与し、 3日後に屠殺し心臓でのレポーター遺伝子発現を検討した。ラット心における in vivoにおけるベクターからの遺伝子発現の評価は以下にように行った。 Le wisラットをジェチルエーテル吸入および塩酸ケタミン 50 mg/kg, キシラジン 2. 5 mg/kgを腹腔内投与にて麻酔後、挿管した。その後、左側胸部より開胸し、 30G針をつけたシリンジで様々なタイターの SeVLacZまたは AxCAZ3を心尖部中に心筋内投与した。遺伝子導入の 72時間後にラットを屠殺し LacZ発現を評価した。

結果を図 1 1に示した。図から分かるように、心臓でのレポーター遺伝子発現はウィルスベクターの容量依存性に増加した。また 3. 3 X 10⁹ opuの Adベクターと 1 X 10⁸ CIUの SeVべクターはほぼ同等のレポーター遺伝子発現を示した。

[実施例 1 1 ] SeVべクター静脈 ·心筋内投与による遺伝子発現臓器分布心筋内投与後、オーバーフローなどにより流血中にウィルスが混入した際の他臓器での発現は副作用を誘発する可能性もあり臨床的には極めて重要な問題である。しかし SeVベクター静脈投与後の遺伝子発現臓器分布の報告はない。そこで静脈投与後およぴ心筋投与後の遺伝子発現臓器分布を検討した。

1 X 10⁸CIUの SeVLacZを正常ラット陰茎静脈より投与し、 72時間後に屠殺し心、右肺、肝、右腎、脾を摘出し LacZ発現を測定した。また同様に 1 X 10⁸CIUの SeVLac Zまたは lxli^ lxlO"¹ opuの AxCAZ3を正常ラット心筋内投与し 72時間後に屠殺し、心、右肺、肝、右腎、脾を摘出し LacZ発現を測定した。 LacZ発現の測定には、摘出臓器を Lysis Buffer (100 mM potassium phosphate, pH 7. 8， 0. 2% Triton X— 100, 1 mM dithiothreitol, 0. 2 mM phenylmethylsulfo nyl fluoride, 5 /z g leupeptin) 存在下でホモジェナイズした。 12， 500 xg, 10 min遠心後、上清中の内因性 ]3 - galacosidase活性を失活するため 48°C、 1時間インキュペートした（Young DC, Anal. Biochemi. 215， 24-30, 1993)。上清中の酵素活性は /3 - gal Reporter Gene Assay Kit用い室温で 1時間反応後、化学発光を Min i-Lumat LB9506 (Bethold) を用い測定した（Shaper NL et al. J. Biol. Chemi. 2 69 (40) , 25165-25171, 1994) ₀ 得られた結果 (Relative light units) I β -gala cosidase標準標本を用いた標準曲線により、 ]3 -galacosidase活性 (pg/ml) に変換した。

結果を図 1 2に示した。静脈投与後の Adベクター導入外来遺伝子は良く知られているように大部分は肝臓で発現していた。一方 SeVベクターでは肺 ·心 ·脾での遺伝子発現を認めたものの AdVと異なり肝でのレポーター遺伝子発現は殆んど認めなかった。図に示した結果は全臓器（肺は右肺、腎は右腎）抽出液による結果であり臓器重量を考慮すると肺 >脾>心の順に高い遺伝子発現が認められた。心筋内投与後の遺伝子発現の臓器分布でも静脈投与とほぼ同様の遺伝子発現の臓器分布パターンを認め、ベクターオーバーフローによる他臓器遺伝子発現の標的臓器が肺およぴ脾であることが明らかとなった。

[実施例 1 2 ] SeVを用レ、た Angl遺伝子導入による心筋梗塞治療

SeVベクターによるヒト angiopoietin- 1 (Angl) 遺伝子を用いた心筋梗塞治療を以下のように実施した。上記のアデノウィルスベクターを用いた Angl遺伝子治療では 1 X 10¹⁽⁾ opu (7. 5 X 10⁸ pfu相当）のアデノウイルスベクターを用いたが、 Se Vベクターによる心筋細胞（i_n vi_tro) および心臓（i_n vivo) への LacZ遺伝子導入において Adベクターに比べ比較的高い遺伝子導入効率がえられたので、 5 X 10⁷ CIUの SeVAngl心筋内投与によるラット心筋梗塞治療を試みた。 Lewisラット左冠状動脈前下行枝結紮直後に 5 X 10⁷ CIUの SeVAnglを LAD還流域周囲の左室前壁に 2力所に分け注射し、 4週間後に心筋梗塞域 ·毛細血管数を組織学的に検討した。

ラット心筋梗塞モデルは Pfeifferら（Pfeffer, M. A. , et al. (1979) . Myocard ial infarct size and ventricular function in rats. Circ Res. 44: 503 - 512) の方法に従い作製した。 Lewisラット（8週齢、雄、体重約 300g) をジェチルエーテル吸入およぴケタミン 70mg/kg，キシラジン 6〜7mg/kgを腹腔内投与にて麻酔後，挿管した。その後、分時換気量 200〜250ml、 1回換気量 3ml、呼吸回数 60〜8 0回/ min、 0₂ 1 l/min、ハロセン 0. 5〜2. 0%の条件で吸入麻酔を行い、左側胸部より開胸した。左冠状動脈前下行枝（LAD) を確認し 6-0の非吸収糸（ナイロン糸）を用い，左前下行枝を左心耳の高さで結紮した（LAD ligation) 。肺を傷つけないように肋間を閉じた後，筋層，皮膚と連続縫合にて閉創した。

SeVベクターの心筋内投与は以下のごとく施行した。左前下行枝の結紮後、左前下行枝還流域と推定される領域周辺部左右 2ケ所に 30G#|"を用い 5 X 10⁷ CIUの SeVAn glを心筋内投与した。 Null群としては、 SeVAnglの代わりに 5 X 10⁷ CIUの SeVNullを注入した。陰性対照群は 0. 9%生理食塩水を注入した。

心筋梗塞 4週後の梗塞域のサイズを Edelbergら（Edelberg JM et al. Circulat ion 105, 608-613, 2001) の方法およびに Robertsらの方法- (Roberts CS et al, Am. J. Cardiol. 51， 872-876, 1983) に従い測定した。モデル作製後、 4週後にラットを屠殺し梗塞心を摘出 formaldehide固定、 parrafin包埋した。左前下行枝結紮部と心尖部の中間部位にて短軸方向に切片を作製、 Hematoxyline - eosin染色、 Masson s tri chrome染色にて梗塞部を染色した。切片を Digital Cameraにて取り込み NIH imageにて以下のパラメーターをブラインドにて測定した。

総左心室（LV)域（Total left ventricle (LV) area) (mm²) , '梗塞域 (infarcti on area) (mm²) , 中隔壁厚（septal wall thickness) (mm) , 梗塞壁厚（infarcti on wall thickness) (mm) , LVの心外膜側周おょぴ心内膜側周（epicardial and e ndocardial circumference of LV) (mm) , 心外膜側および心外膜側の梗塞長（epi cardial and endocardia丄 infarction length) nm)。これらの結果から以下の式を用レ、評価を行つた。

%梗塞サイズ（％ infarction size) =梗塞域（infarction area) I総 LV域

(total LV area) 100

%梗塞厚 (% infarction thickness) =前壁（梗塞）厚（anterior wall (inf arction) thickness) / 中隔壁厚 (septal wall thickness) 100 Viable LV area, (total LV myocardial area) - (infarction myocardial area)

また、心筋梗塞作製 4週後の心筋内血管密度の評価を、 CD34モノクロナール抗体を用いた血管内皮細胞の免疫組織染色により行った。 1次抗体として Anti- CD34M oAb (NU-4A1, Nichirei, Tokyo Japan) 使用し、ピオチン化 anti - Mouse IgG 2次抗体とアビジンィ匕 HRP (DAB paraffin IHC staining module, Ventana Medical Sy stem Inc, Tuson, AZ) を用い染色した。心室中隔、梗塞部周辺領域、心筋梗塞巣内残存心筋での切片内の血管数を 200倍拡大し顕微鏡下でプラインドにて測定した。結果は血管数/ mm²で表記した。

SeVAnglによる心筋梗塞治療後の梗塞サイズおょぴ梗塞厚を図 1 3に示すが、コントロ一ノレべクターである SeVNullの心筋投与では明らかな心筋梗塞サイズぉよび梗塞厚に改善を認めなかったのに対し、 SeVAngl投与群では Angl発現アデノウィルスによる心筋梗塞治療と同様に有意な梗塞巣縮小および梗塞厚増加を認めた。また血管数評価でも SeVAngl治療群において梗塞周囲心筋おょぴ梗塞巣での有意な毛細血管増加が観察された（図 1 4 ) 。このように比較的少量のウィルス力価の SeV Anglでもラット心筋梗塞モデルに対し Adベクターと同様の治療効果が認められた

[実施例 1 3 ] ラット下肢虚血モデルに対する SeVAnglの治療効果

Lewisラット（8週齢、雄、体重約 300g) をジェチルエーテル吸入おょぴケタミン 40 mg/kg, キシラジン 4 mg/kgを上肢への筋肉内投与にて麻酔した。両側下肢の悌毛後、腹部および左鼠径部を切開し右腸骨動脈と右大腿動脈その全分枝を露出した。右腸骨動脈と分枝を結紮後さらに左大腿動脈起始部、膝窩動脈と伏在動脈の分岐部直前で同様に結紮した。また左大腿動脈の他の全分枝を確認 ·結紮後、左大腿動脈を切除 ·除去した。手術時に SeVベクター 5 X 10⁷ CIUを大腿直筋 2 ケ所に 30G針を用い 5 X 10⁷ CIUを投与した。出血の無いことを確認後、切開創を縫合閉鎖し手術を終了とした。 Null群としては、 SeVAnglの代わりに 5 X 10⁷CIUの S eVNullを注入した。陰†生対照群は 0. 9%生理食塩水を注入した。

レーザードップラー血流イメージ解析は次のようにして実施した。 Laser Doppl er system (Moor LDI, Moor Instruments, Devon, United Kingdom) を使用して下肢血流測定を連続的に虚血後 2週間（虚血後 1、 3、 7、 148日）にわたり実施した。血流測定はエーテルによる吸入麻酔後、ケタミン（25 mg/kg) 及ぴキシラジン（2 mg/kg) による麻酔にて鎮静し、 37°Cの環境下で 10分間保温した後に測定した。連続血流測定は同一ラットの同一領域において実施され、得られた血流ィメージょり両肢の足部および腓腹部の平均血流量を解析後、測定条件による影響を少なくするため正常側（右下肢）の血流に対する虚血側（左下肢）の血流の比（組織血流比：虚血側血流/正常側血流）を算出した。

ラット下肤虚血モデル作製 3日後の患肢血流は生食群で健肢の 45¾、コントロール SeVべクタ一群（SeVNull)で 48%と重度の血流障害が認められた。一方、 SeVAngl 群の 3日後の患肢血流は 63%と有意に高かった。この生食群、 SeVNull群とも虚血モデル作製 7， 14日後には患肢血流の自然回復を認めたが SeVAngl投与によりこの血流回復は促進され、 14日後には健常肢の 87%まで改善した（図 1 5 ) 。'

[実施例 1 4 ] Angl遺伝子導入間葉系細胞を用いた虚血肢治療

間葉系幹細胞 (MSC)は骨、脂肪など間葉組織のみならず心筋組織、筋組織などへの分ィ匕が示されている。また種々の血管新生因子を分泌し血管新生を誘導する可能性が示されている。本実施例では、 MSC移植による組織血流改善効果を遺伝子治療と比較した。また虚血治療用の遺伝子修飾 MSCを作製した。

ラット心間葉系幹細胞 (MSC) を既報 (Tsuda, Η· , T. Wada, et al. (2003) Mo 1 Ther 7 (3)： 354-65) に準じ Lewisラット大腿骨より分離した。両端を裁断した大腿骨を注射器により 10%FBS添カロ Dulbecco' s modified Eagle' s medium (DMEM) をフラッシュし骨髄を回収した。骨髄浮遊液を 18, 20， 22G注射針に順に通すことにより骨髄細胞浮遊液を作製した。得られた骨髄細胞を 5 X 10⁷有核細胞 /10 cm 培養皿の濃度で播種し培地（10%FBS、 100 micro g/ml streptomycin, 0. 25 micro g/ml amphotericins, 2 niM L-glutamine添加 DMEM) にて 4日間培養した。 3〜4日ごとに培地を交換し、浮遊細胞を除去し、付着細胞を系代培養しラット MSCとして用いた。

ラット下肢虚血モデルを実施例 1 3と同様に作製し 5 X 10⁶のラット MSCを虚血作製直後に大腿直筋内に投与した。遺伝子治療群として angiopoietin-1 (Angl) 遺伝子を発現するセンダイウィルスベクターを用いた。 Laser Dopplerを用い、経時的に組織血流 (患側/健側）を測定した。虚血 3日後、対照（medium) 群の血流比は 4 8. 2%と重度の虚血が確認され、 7日目には 60%に回復し、その後プラトーとなった。 MSC投与群の 3, 7日目の血流は対照群と差を認めず、 14日目に 89%と有意な血流改善を認めた。一方、遺伝子治療群では 3日目より 63%と早期血流改善を認め 14日目には 87°/。に達した。 .

遺伝子 ·細胞治療両者の利点を合わせた遺伝子修飾 MSCを作製した。 MSCは物理 •化学的遺伝子導入ゃレト口ウィルス ·アデノウィルスなどのウィルスべクターに比較的抵抗性であることが知られている。そこで多くの初代培養細胞に高い遺伝子導入効率を示すセンダイウィルスベクターによるラット間葉系幹細胞への遺伝子導入を試み、その効率をアデノウィルスベクターと比較検討した。

ラット MSCへの遺伝子導入は以下のごとく行った。ラット MSCを 2. 5 X lOVwellの細胞密度で 24 well plateに播種、翌日ウィルスベクター（SeVLacZまたは AxCAZ3 ) 感染を行った。 SeVLacZまたは AxCAZ3を 2% Fetal bovine serum (FBS) 添加 Dulb eco' s modified Eagle Medium (DMEM) にて希釈した各種 multiplicity of infect ion (moi, SeVベクターについては CIU/cells、 Adベクターについては pfu/cells )のウィルス液にてラット新生児心筋細胞に 3⁷°C 1時間感染した。その後、 Phosp hate Buffered Saline (PBS)を用い洗浄後、 10%FBS添加 DMEMにて 24時間培養し Lac Z発現を検討した。 LacZ活性は /3 - gal Reporter Gene Assay Kit (Rosche) を用い測定した。

結果を図 1 6に示す。 SeVは 3 moi以下の低 moiによる感染でも高いレポーター遺伝子発現を示し、ウィルス濃度依存性にその発現は増加し 30 moi以上でほぼプラトーに達した。一方 Adベクターのラット MSCでの遺伝子導入はウィルス濃度依存性ではあるが、今回比較したいずれのウィルス濃度でも遺伝子発現は悪く 30 moi 以下では SeVベクターによる遺伝子発現の 1/100以下であった。 100 moiでの SeVべクター、 Adベクターによる LacZ遺伝子導 AMSCの X - gal染色の結果、 Adベクターでは陽性細胞は比較的少なかったのに対し、 SeVベクタ一ではほぼ 100%の細胞が LacZ陽性であった（図 1 7 ) 。 ·

Angl遺伝子を導入した MSCを用いてラット重症虚血肢モデルの虚血治療を行った。間葉系幹細胞（MSC) は Lewisラット（8wo, M) より既報（Tsuda, H. , T. Wada, et al. (2003) Moi Ther 7 (3)： 354-65) に従い分離、培養した。得られた MSCは moi 2の条件で 37°C、一時間の SeV/Angl感染により遺伝子導入 MSCを作製した。遺伝子導入から 24時間後、 5X 10⁶の遺伝子導入 MSCをラット下肢虚血モデルに投与した（モデル作製は実施例 1 3と同様）。遺伝子改変 MSCの注入は虚血直後に行った。その後、レーザードップラー血流イメージ解析により肢の血流を調べた。データは°/。血流（虚血側血流/正常側血流 X 100) で表した。 Angl遺伝子導入 MSCsの移植により虚血肢の血流は治療 3日後より対照に比べ有意な血流改善を示した（図 1 8 ) 。 7日後には、その改善度は SeV/Anglの直接投与に比べても良好な血流改善が得られた（図 1 8 ) 。

[実施例 1 5 ] マイナス鎖脆ウィルスベクターを用いた遺伝子導入

以下の哺乳動物細胞を用いて、マイナス鎖 RNAウィルスベクターの遺伝子導入効率を、アデノウイルスベクターと比較した。 ( 1 ) 培養細胞株

LacZ遺伝子を発現する SeVベクター（SeV - LacZ) またはアデノウイルスベクター (AxCAZ3) を、様々な濃度で HeLa細胞に 1時間感染させた。ベクター感染から 24時間後に、 i3 -ガラクトシダーゼレポーターアツセィキットまたは X - gal染色により、 LacZ活性を測定した。 SeVベクターは、 M0I 10以下（特に M0I 0. 3〜3) の低 M0I 条件において、導入遺伝子の発現量がアデノウィルスベクターに比べ極めて高いことが判明した（図 1 9 A) 。遺伝子導入細胞を X - gal染色により確認したところ、 SeVベクターを用いた場合、遺伝子導入された細胞の割合は、アデノウイルスべクターを用いた場合よりもはるかに高く、個々細胞における導入遺伝子の発現量も、アデノウイルスベクターによる場合よりも有意に高いことが判明した（図 1 9 B

) o

( 2 ) ヒトロ腔扁平上皮癌

アデノウイルスベクター（AxCAZ3) による遺伝子導入に対して抵抗性を示すヒトロ腔扁平上皮癌細胞株 HSC3 (JCRB Cell Bank: JCRB0623, Rikimaru, K. et al . , In Vitro Cell Dev. Biol. , 26： 849-856, 1990) および 0SC19 (JCRB Cell B ank: JCRB0198, Yokoi, T. et al. , Tumor Res. , 23 : 43—57, 1988; Yokoi, T. et al. , Tumor res. , 24： 57-77, 1989; Kawahara, E. et al. , Jpn. J. Cancer Res. , 84： 409-418, 1993 ; Kawahara, E. et al.， Jpn J. Cancer Res, 84： 409-418， 1993； Kawashiri, S. et al.， Eur. J. Cancer B Oral Oncol. , 3 IB: 216—221, 19 95) に対する遺伝子導入効果を検討した。 SeV- LacZまたは AxCAZ3を様々な M0Iで 1 時間感染後、 j3 -ガラクトシダーゼレポーターアツセィキットにより LacZ活性を定量した。 0SC19および HSC3とも、調べた全ての M0Iにおいて、 SeV-LacZによる遺伝子導入は AxCAZ3より良好であった（図 2 0 ) 。特に野生型アデノウイルスおよびインテグリン標的としたアデノウィルス（adenovirus with RGD - modified fiber) (Dehari H, Ito Y et al. Cancer Gene Therapy 10: 75-85, 2003) に対しても抵抗性を示し遺伝子導入が極めて困難であった HSC3に対しても良好な遺伝子導入が確認された。このように SeVべクターは、口腔扁平上皮癌細胞への遺伝子導入に非常に適している。

( 3 ) ヒトマクロファージおよぴ樹状細胞

ヒトマクロファージおよび樹状細胞への SeVベクターによる遺伝子導入を、アデノウィルスベクターを比較した。 LacZを発現する SeVベクターおよびアデノウィルスベクターを M0I 1で 1時間感染させ、ベクターの感染から 24時間後に /3 -ガラタトシダーゼレポーターアツセィキットを用いて LacZ活性を測定した。 SeVベクターは、アデノウイルスベクターの 1000倍以上の発現量を示した（図 2 1 ) 。従って SeV ベクターは、マクロファージおよび樹状細胞への遺伝子導入に非常に適している

産業上の利用の可能性

本発明により、虚血疾患に対する新たな遺伝子治療剤および治療方法が提供された。本発明の方法は、副作用の少ない、安全で効果的な虚血治療法として優れている。現在、急性心筋梗塞に対する治療は PTCA (経皮冠動脈形成術） - CABG (冠動脈バイパス術）など外科的な血行再建術が主体であるが、本発明の方法を用いることにより遺伝子工学的な血管再生促進が可能となる。これにより、心機能の積極的な改善、病床期間の短期化が期待される。また、四肢虚血等の治療においても、本発明の方法は優れた治療効果を発揮する。

Claims

請求の範囲

1 . 虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターを投与する工程を含む方法。

2 . 請求項 1に記載の虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン - 1をコードするベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法。

3 . アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターが、ァンギオポェチン- 1をコードするウィルスベクターである、請求項 1に記載の方法

4 . ウィルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項 3に記載の方法

5 . ウィルスベクターがマイナス鎖 RNAウィルスベクターである、請求項 3に記載の方法。

6 . アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターが naked DNA (裸の DNA) である、請求項 1に記載の方法。

7 . アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターが、 CA プロモーターあるいは CAプロモーターと同等またはそれ以上の転写活性を有するプロモータ一によりアンギオポェチン- 1の発現を駆動するベクターである、請求項 1に記載の方法。 '

8 . アンギオポェチン- 1またはアンギオポェチン- 1をコードするベクターの投与が心筋への注入である、請求項 1に記載の方法。

9 . 虚血疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1をコードするウィルスべクタ一を投与する工程を含む方法。

1 0 . 請求項 9に記載の虚血疾患の治療方法であって、アンギオポェチン- 1をコードするウィルスベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法。

11. ウィルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項 9に記載の方法。

12. ウィルスベクターがマイナス鎖 R Aウィルスベクターである、請求項 9に記載の方法。

13. ベクターの投与が虚血部位への注入である、請求項 9に記載の方法。

14. アンギオポェチン- 1をコードする外来遺伝子を有する、遺伝子改変された間葉系細胞。

15. アンギオポェチン- 1をコードするアデノウイルスベクターが導入されている、請求項 14に記載の間葉系細胞。

16. アンギオポェチン- 1をコードするマイナス鎖 R Aウィルスベクターが導入されている、請求項 14に記載の間葉系細胞。

17. 請求項 14に記載の間葉系細胞および薬学的に許容される担体を含む虚血治療組成物。

18. 遺伝子改変された間葉系細胞の製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを間葉系細胞に接触させる工程を含む方法。 .

19. 遺伝子がアンギオポェチン- 1をコードする、請求項 18に記載の方法。