JP2021080272A - 改善された幹細胞組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
・短時間作用型L−アスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型L−アスコルビン酸誘導体の相当量を含まない。及び/または
・10%(v/v)未満のウシ胎児血清で補充される。
・短時間作用型L−アスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型L−アスコルビン酸誘導体の相当量を含まない。及び/または
・10%(v/v)未満のウシ胎児血清で補充される。及び/または
・非胎児血清で補充される。
本明細書を通じて、特に明記がないまたは文脈上必要とされない限り、単一の工程への参照、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群は、これらの工程、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群の複数(すなわち1つまたは複数)を包含すると解釈すべきである。
本明細書で使用するとき、「幹細胞」の用語は、表現型的及び遺伝子型的に同一の娘及び少なくとも1つの他の最終的な細胞種(たとえば、最終的に分化した細胞)を生じさせ得る自己再生細胞を意味する。「幹細胞」の用語は、全能性、多能性及び多分化能の細胞ならびにそれらの分化由来の前駆細胞及び/または前駆体を含む。幹細胞は、成体または胚性幹細胞であっても良い。
本明細書で使用される場合、「遺伝的に変更されていない」という用語は、Ang1を発現またはコード化する核酸でトランスフェクションすることにより変更されていない細胞を指す。誤解を避けるために言及すると、本開示の文脈でのAng1をコード化する核酸でトランスフェクションされた幹細胞は、遺伝的に変更されたと考えられる。本開示の文脈では、「遺伝的に変更されていない」細胞は、天然のAng1をコード化する核酸でトランスフェクションすることなく、ある程度までAng1を発現する。
本発明の幹細胞は、遺伝的に変更されておらず、少なくとも0.1μg/106細胞の量でAng1を発現する。しかし、様々な実施形態では、本発明の幹細胞は、少なくとも0.2μg/106細胞、0.3μg/106細胞、0.4μg/106細胞、0.5μg/106細胞、0.6μg/106細胞、0.7μg/106細胞、0.8μg/106細胞、0.9μg/106細胞、1μg/106細胞、1.1μg/106細胞、1.2μg/106細胞、1.3μg/106細胞、1.4μg/106細胞、1.5μg/106細胞の量でAng1を発現し得ることが想定される。
本発明の1つの実施例では、幹細胞は組成物の形態で投与される。1つの実施例では、そのような組成物は、薬学的に許容される担体及び/または賦形剤を含む。
本開示の組成物は、様々な細胞培養方法によって製造することができる。
i) 短時間作用型L−アスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型L−アスコルビン酸誘導体の相当量を含まない。及び/または
ii) 10%(v/v)未満のウシ胎児血清。
i) 短時間作用型L−アスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型L−アスコルビン酸誘導体の相当量を含まない。
ii) 10%(v/v)未満のウシ胎児血清。及び/または
iii) 非胎児血清。
アスコルビン酸は、培養中の様々な細胞の増殖及び分化に必須のサプリメントである。特定のアスコルビン酸誘導体は、特に、中性pH及び37℃の通常の細胞培養条件下で、溶液中で安定していないため、「短時間作用型」であることが現在では理解されている。これらの短時間作用型誘導体は、急速にシュウ酸またはトレオン酸に酸化する。37℃の培養培地(pH7)では、酸化により、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体のレベルは、24時間後に約80〜90%低下する。したがって、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体は、様々な細胞型の従来の細胞培養で、より安定した「長時間作用型」アスコルビン酸誘導体に置き換えられる。
本開示の培養方法で使用される培地は、血清含有培地または無血清培地であり得る。
別の実施形態では、細胞培養培地は、lα,25−ジヒドロキシビタミンD3(1,25D)、PDGF−BBなどの血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン−1β(IL−1β)、間質由来因子lα(SDF−lα)及びEGFで構成されるグループから選択される1つまたは複数の刺激因子で補充される。
疾患の発症または進行を処置または予防または遅延させる、本開示の細胞の能力を決定するための方法は、当業者には明らかであろう。たとえば、本発明の幹細胞は、Ang1のレベルを増加させるその能力について評価することができる。
(i)関連疾患に罹患している試験対象に細胞を投与し、対象の疾患の症状を評価する。
(ii)(i)の対象の障害の症状と、疾患を罹患しているが細胞を投与していない対照被験体の疾患または活性の症状とを比較し、対照被験体と比較した試験対象の症状の改善が、幹細胞が疾患を治療することを示す。細胞は、任意の実施例による、本開示に記載の任意の細胞であっても良い。
骨髄(BM)を、健康な正常成人ボランティア(20〜35歳)から採取する。簡潔には、40mlのBMを、後腸骨稜から、リチウム−ヘパリン抗凝固剤含有チューブに吸引する。
一般にイーグルαMEMと称される、アール平衡塩を有するイーグル最小必須培地(MEM)のα修飾は、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及び添付されたビタミンを含む。これらの修飾は、ハイブリッド マウス及びハムスター細胞(Stannersら 1971)を増殖させる際に使用するための最初に説明した。
プロセスBでは、プロセスAで使用したイーグルαMEM培地は、以下によって改変(改変αMEM)された。
− 長時間作用型のアスコルビン酸誘導体 L−アスコルビン酸−2−リン酸を短期作用型のアスコルビン酸誘導体 L−アスコルビン酸ナトリウム(50mg/L)で置換する。
− FCSを10%(v/v)から5%(v/v)まで低減する。
− 非胎児血清(5% v/v)で補充する。
− Ang1レベルを増加させ、
− VEGFレベルを減少させ、
− 以前に血管新生を増強する上で特に効果があることを示したAng1:VEGF比率と一致するAng1:VEGFの比率を提供する。
長時間作用アスコルビン酸誘導体、L−アスコルビン酸−2−リン酸の短時間作用型のアスコルビン酸誘導体L−アスコルビン酸ナトリウムとの交換を制御するために、3つの異なるドナーからのMPCは、α−MEM+10%FCS+50mg/LのL−アスコルビン酸ナトリウム(プロセスC)またはα−MEM+3%ヒトAB血清+50mg/LのL−アスコルビン酸ナトリウム(プロセスD)とPDGF及びEGFなどの増殖因子で連続的に伝播された。
− Ang1レベルを増加させ、
− VEGFレベルを減少させ、
− VEGF:Ang1の比率を増加させる。
Claims (46)
- 遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物であって、前記遺伝的に変更されていない幹細胞が、少なくとも0.1μg/106細胞の量でアンジオポエチン−1(Ang1)を発現することを含む組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも0.5μg/106細胞の量でAng1を発現する、請求項1に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも0.7μg/106細胞の量でAng1を発現する、請求項1に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも1μg/106細胞の量でAng1を発現する、請求項1に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、約0.05μg/106細胞よりも少ない量で血管内皮増殖因子(VEGF)を発現する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、約0.05μg/106細胞よりも少ない量でVEGFを発現する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、約0.03μg/106細胞よりも少ない量でVEGFを発現する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも2:1の比率でAng1:VEGFを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも10:1の比率でAng1:VEGFを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも20:1の比率でAng1:VEGFを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも30:1の比率でAng1:VEGFを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも50:1の比率でAng1:VEGFを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、間葉系前駆細胞である、請求項13に記載の組成物。
- さらに薬学的に許容される担体を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 幹細胞でのAng1の発現を誘導するためのインビトロでの方法であって、前記方法が、細胞培養培地で幹細胞の集団を培養することであって、前記細胞培養培地が、
短時間作用型L−アスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型L−アスコルビン酸誘導体の相当量を含まない、及び/または
10%(v/v)未満のウシ胎児血清(FCS)で補充される、及び/または
非胎児血清で補充される、前記細胞培養培地を含む、方法。 - Ang1の発現が誘導されることを決定するためにAng1のレベルを測定することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 誘導されたAng1の発現を有する細胞を選択することをさらに含む、請求項16または17に記載の方法。
- 前記短時間作用型のL−アスコルビン酸誘導体が、L−アスコルビン酸塩である、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記短時間作用型のL−アスコルビン酸塩が、L−アスコルビン酸ナトリウム塩である、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、少なくとも約5%(v/v)のFCSで補充される、請求項16〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、lα,25−ジヒドロキシビタミンD3(1,25D)、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキンキン−1β(IL−1β)及び間質由来因子lα(SDF−lα)で構成されるグループから選択される1つまたは複数の刺激因子で補充される、請求項16〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、非胎児血清で補充される、請求項16〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非胎児血清が、新生児血清である、請求項23に記載の方法。
- 前記新生児血清が、新生児ウシ血清(NBCS)である、請求項24に記載の方法。
- 前記新生児血清が、ヒト血清である、請求項24に記載の方法。
- 前記非胎児血清が、成人血清である、請求項23に記載の方法。
- 成人血清が、ヒト血清である、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、少なくとも約5%(v/v)レベルでNBCSを含む、請求項16〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、少なくとも約2%(v/v)レベルでNBCSを含む、請求項16〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、NBCS及びFCSの混合物で補充される、請求項16〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FCSとNBCSの比率が約1:1である、請求項31に記載の方法。
- 前記培地が、5%(v/v)のFCS及び5%(v/v)のNBCSで補充される、請求項31または32に記載の方法。
- 血管化及び/または血管新生の促進に使用するのに適した、遺伝的に変更されていない幹細胞を得るための方法であって、
少なくとも一人のドナーからの幹細胞を含む少なくとも1つの細胞集団を得ることと、
前記幹細胞を培養することと、
前記少なくとも1つの細胞集団のそれぞれの前記幹細胞によって発現されるAng1の量を決定することと、
少なくとも0.1μg/106細胞の量でAng1を発現する細胞を選択することとを含む、方法。 - 前記少なくとも1つの細胞集団(複数可)のそれぞれの前記幹細胞によって発現されるVEGFの前記量を決定することと、
少なくとも10:1の比率でAng1:VEGFを発現する幹細胞を選択することと、をさらに含む、請求項34に記載の方法。 - 前記幹細胞が、選択される少なくとも20:1の比率でAng1:VEGFを発現する、請求項35に記載の方法。
- 少なくとも30:1の比率でAng1:VEGFを発現する前記幹細胞が選択される、請求項35に記載の方法。
- 少なくとも50:1の比率でAng1:VEGFを発現する前記幹細胞が選択される、請求項35に記載の方法。
- 血管化及び/または血管新生を促進するための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- さらなるAng1の発現が望まれる状態を処置するための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 対象の血管化及び/または血管新生を促進するための方法であって、対象に請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 対象のさらなるAng1の発現が望まれる状態を処置するための方法であって、前記対象に請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 請求項16〜33のいずれかに1項に記載の方法によって培養される、または請求項34〜38のいずれか1項に記載の方法によって得られる、幹細胞集団。
- 前記幹細胞が、請求項16〜33のいずれか1項に記載の方法に従って幹細胞の集団を培養することによって産生される、または請求項34〜38のいずれか1項に記載の方法によって得られる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 血管化及び/または血管新生を促進するための薬剤の製造での請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物の使用または請求項16〜38のいずれか1項に記載の方法の使用。
- さらなるAng1の発現が望まれる状態を処置するための薬剤の製造での請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物の使用または請求項16〜38のいずれか1項に記載の方法の使用。
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