WO2006001122A1

WO2006001122A1 - Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤

Info

Publication number: WO2006001122A1
Application number: PCT/JP2005/008175
Authority: WO
Inventors: Shinji Okano; Yoshikazu Yonemitsu; Katsuo Sueishi; Satoko Shibata; Mamoru Hasegawa; Haruhiko Kondo
Original assignee: Dnavec Research Inc.
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2006-01-05
Also published as: AU2005257107A1; CN101006172B; EP1775343A1; US20080014183A1; EP1775342A4; JPWO2006001120A1; EP1775343A8; JP2013151523A; CN101006171A; US20080031855A1; EP1775342A1; HK1106794A1; JPWO2006001122A1; KR20070032022A; KR20070028573A; CN101006172A; AU2005257105A1; US8889118B2; CA2571844A1; CA2571849A1

Abstract

　本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤を提供する。また本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を製造する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。また本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を用いた癌の治療方法を提供する。本発明は、RNAウイルスと樹状細胞を組み合わせた効果的な癌の治療方法を提供する。

Description

明細書

RNAウィルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤

技術分野

[0001] 本発明は癌治療の分野に関する。

背景技術

[0002] 近年、進行癌を対象とした増殖型ウィルスによるウィルス療法（virotherapy)の臨床研究が進められている。ウィルス療法とは、 HSV-1やアデノウイルスなどの増殖型ウイルスを腫瘍細胞に感染させ、ウィルス増殖に伴うウィルスの殺細胞効果により腫瘍の治癒を図る治療法である。 HSV-1やアデノウイルスの場合、腫瘍治療用の増殖型ウイルスは、ウィルスゲノムに遺伝子操作を加えた変異ウィルスで、腫瘍内での複製能を保ちつつ、ヒト正常組織での病原性が最小限に押さえられている。腫瘍細胞に感染した治療用の増殖型ウィルスは、細胞内で複製し、その過程で感染細胞は死滅する。増殖したウィルスは周囲の腫瘍細胞に再感染し、抗腫瘍作用を広げる (Alemany R. et al" Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol., 2000,

18:723-727; Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy. , Clin Cancer Res., 2000, 6:3395—9; Kirn, D., Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 9:959—960, 2002; Mineta T. et al., Attenuated multi-mutated herpes simplex virus- 1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med 1:938-943,1995)。癌に対するウィルス療法は、手術'放射線療法 '化学療法といった従来の治療法との併用が可能で、固形癌一般に適用が可能であること、反復投与が可能であること、サイトカインなどの治療遺伝子をウィルスゲノムに直接組み込んで抗腫瘍効果を増強するができることなど、その応用範囲が広ぐ実用面で優れている。より効果的なウィルス療法を開発することができれば、癌治療に大きく貢献できるものと期待される。

非特干文献 1： Alemany R. et ai., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol, 2000, 18:723-727

非特許文献 2 : Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res., 2000, 6:3395—9 非特言午文献 3 : Kirn, D.， Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 2002, 9:959—960

特言午文献 4 : Mineta T. et al.， Attenuated multi— mutatea herpes simplex virus— 1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med， 1995， 1:938—943

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明は、 RNAウィルスが導入された榭状細胞を含む抗癌剤を提供する。また本発明は、 RNAウィルスが導入された榭状細胞を製造する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。また本発明は、 RNAウィルスが導入された榭状細胞を用いた癌の治療方法を提供する。

課題を解決するための手段

[0004] 本発明者らは、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスを榭状細胞に導入すると、榭状細胞が活性化され、優れた制癌効果を発揮することを見出した。榭状細胞を介して RNAウィルスを癌に注入した場合の癌増殖に対する抑制効果は、 RNAウィルスを直接癌に注射するよりも有意に高カゝつた。榭状細胞に RNAウィルスを導入する工程は体外で行うことができるため、従来のウィルス療法に比べウィルス導入条件を厳密に制御することが可能であり、さらに、榭状細胞に感染しな力つたウィルスを除去することで安全性を高めることもできる。また、 RNAウィルスを導入した榭状細胞による制癌効果は、感染性ウィルス粒子を放出しない欠損型ウィルスを用いた場合にも同様に見られた。すなわち、 RNAウィルスを導入した榭状細胞による制癌効果は、 RNAウイルスが榭状細胞内でゲノム RNAを複製することが重要であり、感染性ウィルス粒子を放出して周囲の細胞に感染を広げる必要は必ずしもない。従って、例えばウィルスェンべロープ蛋白質などの、感染ウィルス粒子の形成に必須の蛋白質をコードするウイルス遺伝子を欠損させることで感染性ウィルス粒子の形成能をなくした安全性の高い RNAウィルスを用いて、ウィルス療法を行うことも可能になる。

[0005] すなわち本発明は、 RNAウィルスが導入された榭状細胞を含む抗癌剤、該抗癌剤の製造方法、および RNAウィルスが導入された榭状細胞を用いた癌の抑制方法に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の 1つまたは複数の組み合わせ力なる発明は、それらの請求項に記載の発現に既に意図されている。すなわち本発明は、

〔1〕ゲノム複製能を持つ RNAウィルスが導入された榭状細胞を含む抗癌剤、

〔2〕 RNAウィルスが外来蛋白質をコードしない、〔1〕に記載の抗癌剤、

〔3〕 RNAウィルスが感染性ウィルス粒子を形成しな、複製欠損ウィルスである、〔1〕または〔2〕に記載の抗癌剤、

〔4〕 RNAウィルスが可溶性 FGF受容体または IFN- βをコードする、〔1〕または〔3〕に記載の抗癌剤、

〔5〕 RNAウィルスが感染性または非感染性ウィルス粒子である、〔1〕から〔4〕の、ずれかに記載の抗癌剤、

〔6〕 RNAウィルスがゲノム RNA—蛋白複合体である、〔1〕から〔4〕の!、ずれかに記載の抗癌剤、

〔7〕ゲノム複製能を持つ RNAウィルスを榭状細胞に導入する工程を含む、抗癌剤の製造方法、

〔8〕ゲノム複製能を持つ RNAウィルスが導入された榭状細胞を投与する工程を含む癌の抑制方法、に関する。

図面の簡単な説明

[図 1]末梢血単球濃縮細胞の単核細胞に由来する榭状細胞の表現型を示す図である。 ΡΙで判別できた生細胞にゲートをかけ、抗 CD 11c- ΡΕ結合抗体及び抗 HLA- class II(DR, DP, DQ) FITC結合抗体を用いて、 CD 11cおよび HLA- class II(DR, DP, DQ) の発現を観察した（左のマトリックス）。更に CDllcおよび HLA- class II(DR, DP, DQ) が共に陽性のゲートを選択し、 1)抗 CD14-APC結合抗体、 2)抗 CDla-APC結合抗体、 3)抗 CD80-biotin結合抗体（2次的にストレプトアビジン- APCで染色）を使用して、それぞれの発現レベルを CDllcとのドットプロットで示した（右の 3つのマトリックス）。なお、実施例中の〃 Class Π〃は HLA- DR、 DQ、 DPを全て認識する抗体を使用した結果を、 "HLA-DR〃は HLA-DRを特異的に認識する抗体を使用した結果を表す。

[図 2]GFP発現 RNAウィルスを導入した DCにおける GFPおよび costimulatory moleculesの発現を示す図である。

[図 3]ヒト単球由来榭状細胞への GFP発現 RNAウィルスの導入効率と榭状細胞の活性ィ匕を示す図である (感染後 2日目）。

[図 4]ヒト単球由来榭状細胞への GFP発現 RNAウィルスの導入効率と榭状細胞の活性ィ匕を示す図である (感染後 4日目）。

[図 5]ヒト単球由来榭状細胞への GFP発現 RNAウィルスの導入効率と榭状細胞の活性ィ匕を示す図である (感染後 8日目）。

[図 6]GFP発現 RNAウィルス導入後の DC数の変化を示す図である。

[図 7]GFP発現 RNAウィルス導入後の GFP発現期間を示す図である。

[図 8]ヒト DCへの GFP発現 RNAウィルス導入導入効率における LPS刺激の効果を示す図である。

[図 9]ヒト DCへの GFP発現 RNAウィルス導入導入効率における LPS刺激の効果を示す図である。

[図 10]DCへの遺伝子導入におけるインキュベーション時間の検討結果を示す図である。

[図 11]臍帯血由来の DCへの遺伝子導入を示す図である。

[図 12]臍帯血由来の DCへの遺伝子導入を示す図である。

[図 13]遺伝子導入後の costimulatory moleculesの発現を示す図である（LPS刺激との比較)。

[図 14]遺伝子導入後の costimulatory moleculesの発現を示す図である（LPS刺激との比較)。

[図 15]遺伝子導入後の costimulatory moleculesの発現を示す図である（LPS刺激との比較)。

圆 16]遺伝子導入後の貪食能を示す図である。

圆 17]遺伝子導入後の貪食能を示す図である。

[図 18]RNAウィルスの導入後の単球由来 DCのサイト力イン産生を示す図である。

[図 19]RNAウィルスの導入後の榭状細胞上のマーカー蛋白質の発現を示す図である。 [図 20]RNAウィルスの導入後の榭状細胞上のマーカー蛋白質の発現を示す図である。

[図 21]RNAウィルスを導入した DCのァロ T細胞刺激能を示す図である。

[図 22]RNAウィルスを導入した榭状細胞の抗原特異的 T細胞の増殖誘導を示す図である。

[図 23]RNAウィルスの導入により、 MART-1特異的 CTLをインビトロで誘導した結果を示す図である。

[図 24]皮下接種された B16メラノーマ細胞の増殖曲線を示す図である。

[図 25]YAC-1ターゲット細胞の⁵¹ Cr放出アツセィの結果を示す図である。

[図 26]TRP2ペプチド +EL- 4の⁵¹ Cr放出アツセィの結果を示す図である。

[図 27]GFP発現 SeV、可溶型 FGF受容体発現 SeV、または可溶型 PDGFR α発現 SeV の in vivo投与によるメラノーマに対する治療効果を示す図である。

[図 28]GFP発現 SeVまたは可溶型 PDGFR a発現 SeVを導入した榭状細胞の ex vivo 投与によるメラノーマに対する治療効果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスが導入された榭状細胞を含む抗癌剤を提供する。本発明において RNAウィルスとは、 RNAゲノムを持つウィルスを言う。本発明にお、て RNAウィルスは、好ましくはウィルスのライフサイクルにお!/、て RNAを铸型に RNA合成を行うウィルスである。 RNAウィルスとしては、榭状細胞においてゲノム RNAを複製する所望の RNAウィルスであってよぐ野生型ウィルスであっても、弱毒型ウィルスや温度感受性ウィルスなどの変異型ウィルスであってよい。また、天然のウイルス (自然発生したウィルス）であっても、組み換えウィルスであってもよヽ。 RNAウイルスには、一本鎖 RNAウィルス（プラス鎖 RNAウィルスおよびマイナス鎖 RNAウィルスを含む）、および二本鎖 RNAウィルスを含む。またエンベロープを有するウィルス（ェンべロープウィルス； enveloped viruses)およびエンベロープを有さな、ウィルス（非ェンべロープウイノレス； non- enveloped viruses)を含むが、好ましくはエンベロープウイルスが用いられる。本発明において RNAウィルスには、具体的には以下の科に属するウィルスが含まれる„ ラッサウィルスなどのァレナウィルス科（Arenaviridae)

インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウィルス科（Orthomyxoviridae)

SARSウィルスなどのコロナウィルス科（Coronaviridae)

風疹ウィルスなどのトガウィルス科（Togaviridae)

ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、センダイウィルス、 RSウィルスなどのパラミクソゥィルス科 ( Paramyxovindae)

ポリオウイルス、コクサツキ一ウィルス、エコーウィルスなどのピコルナウィルス科（ Picornavindae

マールブルダウィルス、エボラウィルスなどのフイロウィルス科（Filoviridae) 黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、 C型肝炎ウィルス、 G型肝炎ウィルスなどのフラビウィルス科（Flaviviridae)

ブンャゥイノレス科（Bunyaviridae)

狂犬病ウィルスなどのラブドウィルス科（Rhabdoviridae)

レオウイノレス科（Reoviridae)

[0008] 本発明におヽて、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスが導入された榭状細胞とは、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスのゲノム RNAを含む榭状細胞であって、該 RNAがコードするウィルス蛋白質によって、該 RNAが榭状細胞内で複製する細胞を言う。 RNAゥィルスのゲノム RNAと、該 RNAに結合するウィルス蛋白質は、細胞内でリボヌクレオプ口ティン (RNP)複合体を形成し、細胞内で該ゲノム RNAを複製する。この RNPはヌクレオ力プシドとも呼ばれる。すなわち、本発明においてゲノム複製能を持つ RNAウイルスが導入された榭状細胞は、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスのリボヌクレオプロティン (ヌクレオカブシド)を有する榭状細胞を意味する。

[0009] RNAウィルスが導入された榭状細胞を得るには、 RNAウィルスを榭状細胞またはその前駆細胞に、感染性 RNAウィルス粒子を接触させ感染させればよい。あるいは、感染性ウィルス粒子を使用しなくても、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスに含まれる RNP を細胞に導入したり、あるいは感染性のないウィルス粒子であって、該 RNPを含むゥィルス粒子 (非感染性ウィルス粒子、またはウィルス様粒子（VLP)と呼ぶ）を細胞に導入してもよ、。ウィルス粒子からエンベロープまたは外殻を除去した RNP (ウィルスコア）であっても、榭状細胞に導入されれば、細胞内においてウィルスゲノム RNAを複製することができる（W097/16538; WO00/70055)。また、ウィルスゲノム RNAおよび該ゲノム RNAの複製に必要なウィルス蛋白質（マイナス鎖 RNAウィルスであれば N 、 Pおよび L蛋白質)をコードする発現ベクターを榭状細胞に導入して、榭状細胞内で RNPを形成させてもょヽ。 RNPや VLPを榭状細胞またはその前駆細胞に導入するには、周知のトランスフエクシヨン方法を利用することができる。具体的には、リン酸カルシゥム（Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H.， 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、 DEAE-デキストラン（Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリボソームベースのトランスフエクション試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレ■ ~~シヨン

(Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5および 9)など、当業者に知られる様々な技術で榭状細胞にトランスフエタトすることが可能である。エンドノームでの分解を抑制するため、トランスフエクシヨンにおいてクロ口キンをカ卩えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。トランスフエクシヨン試薬を幾つか例示すれば、 DOTMA (Roche) , Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)、 TransIT—LTl (Mirus, Product No. MIR 2300)、 CalPhos™ Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051- 1)、

CLONfectin™ (Clontech #8020-1)などが挙げられる。特にエンベロープウィルスは、ウィルス粒子形成の際に宿主細胞由来の蛋白質を取り込むことが知られており、このような蛋白質は、榭状細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる（J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584)。従って、エンベロープが除去された RNPを榭状細胞に導入することには利点がある（WO00/70055)。

RNAウィルスが導入されると、榭状細胞内でウィルスゲノムの複製が起こり、榭状細胞の活性化が誘導され成熟榭状細胞に分化する。得られた成熟榭状細胞は、 T細胞を活性化する能力を保持してヽる。 RNAウィルスを導入した榭状細胞は免疫系を活性ィ匕する高い能力を有しており、腫瘍に投与することにより制癌作用を発揮できる。 RNAウィルスの榭状細胞への感染は、例えば培養液または生理食塩水など所望の生理的水溶液中で in vitro (または ex vivo)で行うことができる。本発明は、体内から取り出した榭状細胞またはその前駆細胞を体外で RNAウィルスと接触させ、ウィルスを導入後に体内に戻す ex vivoの抗腫瘍治療において有用である。 RNAウィルスを体外で感染させる場合は、 RNAウィルスを未成熟榭状細胞に接触、または未成熟榭状細胞を含む細胞画分と混合することが好ま Uヽ。榭状細胞は RNAウィルスを導入することにより活性ィ匕することができる力それとは別に、細菌またはリポポリサッカライド（ LPS)などとの接触によっても活性ィ匕することができる。榭状細胞をこのような方法で別途活性化させる場合は、活性ィ匕してカゝら RNAウィルスを導入してもよいが、ウィルスの導入効率が低下しないようにするため、活性化の操作を、ウィルスの導入前ではなぐウィルスを導入した後（またはウィルスを榭状細胞に接触させるのと同時）に行うことが好ましい。

[0011] ウィルスと榭状細胞またはその前駆細胞との接触においては、 MOI (多重感染度；細胞 1つあたりの感染ウィルス数）は 1〜500の間にすることが好ましぐより好ましくは 2 〜300、さらに好ましくは 3〜200、さらに好ましくは 5〜100、さらに好ましくは？〜 70である。 RNAウィルスと榭状細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分以上、好ましくは 3分以上、 5分以上、 10分以上、または 20分以上接触させればよぐ例えば 1 〜60分程度、より特定すれば 5分〜 30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよぐ例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。

[0012] 榭状細胞 (Dendritic cell; DC)とは、成熟状態にお!、て樹枝状形態をとり、抗原を提示して T細胞を活性ィ匕する能力を持つ細胞である。榭状細胞には、生体内各種組織器官に分布する骨髄細胞由来の榭枝状形態をとる細胞群、および骨髄または血液由来の幹細胞から、 in vitroでサイト力イン等を利用して分ィ匕誘導をかけた生体内組織器官に分布する樹枝状形態をとる細胞と同等の細胞群が含まれる。具体的には、榭状細胞には、例えばリンパ球系榭状細胞 (Th2への誘導または免疫寛容を誘導するものであってもよい）、骨髄球系榭状細胞（一般的に用いられる榭状細胞。未熟榭状細胞および成熟榭状細胞を含む)、ランゲルハンス細胞 (皮膚の抗原提示細胞で重要な榭状細胞）、相互連結細胞（リンパ節、脾臓の T細胞領域にあり、 T細胞への抗原提示に働ヽてヽると考えられて！/ヽる細胞）、ろ胞榭状細胞 (B細胞への抗原提示細胞として重要、抗原と抗体複合体、抗原と補体複合体を抗体レセプター、補体レセプターにより、榭状細胞上に提示することで、 B細胞に抗原提示している。）などを含むものであり、好ましくは、 MHCクラス Iおよびクラス IIを高発現しており、さらに好ましくは CD1 lcを発現して!/、る細胞である。

[0013] また、榭状細胞は、榭枝状形態を有し、 CDllc、 HLA-class II (HLA-DR、 - DP、または - DQ)、 CD40、および CDlaからなる群より選択される表面マーカーの 2つ以上が陽性の細胞であってよい。本発明において榭状細胞は、より好ましくは、

HLA-class 11+および CDllc+の細胞、より好ましくは CDla+、 HLA-class II+、および CDllc+の細胞で、かつ T細胞マーカー（CD3)、 B細胞マーカー（CD19、 CD20)、 NK 細胞マーカー（CD56)、好中球マーカー（CD15)、単球マーカー（CD14)を発現してな、細胞である。 RNAウィルスの導入に使用される榭状細胞集団の CD14+の割合は、例えば 10%以下、好ましくは 5%以下、更に好ましくは 1%以下がよい。

[0014] また、本発明にお、て榭状細胞には成熟榭状細胞および未成熟榭状細胞が含まれる。未成熟榭状細胞とは、 T細胞活性化能力が低い榭状細胞を言う。具体的には、未成熟榭状細胞は、 LPS (1 micro-g/ml)を添加し 2日間培養して成熟を誘導した榭状細胞に比べ、抗原提示能が 1/2未満、好ましくは 1/4未満のものであってよい。抗原提示能は、例えばァロ T細胞活性化能 (混合リンパ球試験;ァロ T細胞と榭状細胞の混合培養で、 T細胞対榭状細胞の割り合いは 1： 10で培養、好ましくはその比率を変化させて培養したもので、培養終了 8時間前に³ H- thymidineを添カロし、その T細胞の DNA内の取込み量によって、 T細胞増殖能力を定量したもの:図 21および 22参照；文献 Gene Therapy 2000; 7; 249-254)、あるいはペプチドを用いた特異的細胞傷害性 T細胞 (CTL)の誘導能試験 (榭状細胞に、ある抗原のある Class I拘束性の既知のペプチドを添加して、榭状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血の T細胞を共培養（3日目以降は IL-2を 25U/ml、好ましくは 100U/ml) (好ましくは 21日間 3回の榭状細胞による刺激、更に好ましくは 14日間 2回の榭状細胞の刺激)し、得られたェフクタ一細胞を⁵¹ Crでラベルされたターゲット細胞（ペプチドの拘束性の Class I陽性の腫瘍細胞）と 20:1、 10:1、 5:1、および 2.5:1、好ましくは 100:1、 50:1、 25:1、および 12.5:1で 4時間混合培養してターゲット細胞の⁵¹ Cr遊出量で定量したもの；図 23参照；文献 Arch Dermatol Res 2000; 292; 325-332)により定量することができる。また未成熟榭状細胞は、好ましくは抗原貪食能を持ち、更に好ましくは T細胞活性ィ匕のための副刺激を誘導する受容体の発現が低発現 (例えば上記のように LPS誘導した成熟 DCに比べ有意に）あるいは陰性である。一方で、成熟榭状細胞とは T細胞活性化などの為の抗原提示能力が高い榭状細胞を言う。具体的には、成熟榭状細胞は、 LPS (1 micro-g/ml)を添加し 2日間培養して成熟を誘導した榭状細胞の抗原提示能の 1/2以上、好ましくは同等以上の抗原提示能を持つ細胞であってよい。また成熟榭状細胞は、好ましくは抗原貪食能が低いか、または持たず、更に好ましくは T細胞活性化のための副刺激を誘導する受容体の発現が高いものをいう。また、榭状細胞の活性化とは、未成熟榭状細胞から成熟榭状細胞への移行を言い、活性化榭状細胞には、成熟榭状細胞、および、活性化刺激により副刺激を誘導する CD80、 CD86の発現を上昇させている途中経過の榭状細胞が、その範疇に含まれる。 CDllc陽性の榭状細胞にぉ、ては、 CD83陽性が成熟榭状細胞の指標とされる。

[0015] 例えば成熟榭状細胞は、好ましくは CD40、 CD80、 CD86および HLA-class IIの発現が強陽性の細胞であってよい。更に好ましくは、成熟榭状細胞は CD83を発現する。例えば、 CD80、 CD83、および CD86からなる群より選択されるマーカーを基に、未成熟榭状細胞と成熟榭状細胞を見分けることができる。未成熟榭状細胞ではこれらのマーカーは弱いか、好ましくは陰性である力成熟榭状細胞では陽性である。

[0016] 上記のように、未成熟榭状細胞は、通常、高、貪食能を保持して!/、る。榭状細胞に LPS (1 micro-g/ml)を添加し 2日間培養すると、榭状細胞は活性ィ匕され貪食能は低下する。貪食能は、榭状細胞内への小分子の取り込み量または取り込み細胞の割合を測定して知ることができる。好ましくは、貪食能は、榭状細胞内への小分子の取り込み量で決定される。例えば、 1 micro-m程度の着色ビーズを用いて、榭状細胞内へのビーズの取り込みを測定することができる。 4°Cで陽性となるバックグランドを差し引いて定量する。高い貪食能とは、榭状細胞内への小分子の取り込み量が、榭状細胞を上記のように LPS (1 micro-g/ml)で 2日間刺激した榭状細胞の 4倍以上、より好ましくは 5倍以上、より好ましくは 6倍以上の貪食能を言う。あるいは、小分子の取り込み細胞の割合力 ¾倍以上、より好ましくは 3倍以上である。低い貪食能とは、榭状細胞内への小分子の取り込み量が、 LPS (1 micro-g/ml)で 2日間刺激した榭状細胞の 4 倍未満、より好ましくは 2倍未満、より好ましくは 1.5倍未満である。あるいは、小分子の取り込み細胞の割合で測定した場合に、 2倍未満、より好ましくは 1.5倍未満である。

[0017] 成熟榭状細胞の判別は当業者が通常行っており、上記の各マーカーおよびその発現の測定方法も当業者に周知である。例えば CDl lcは約 150 kDの接着糖蛋白 (pl50,インテグリン alpha鎖）である。 CDl lcは CD18と結合して CDl lc/CD18複合体を形成し、フイブリノ一ゲンへの結合力を有し、また、 iC3bおよび ICAM-1の受容体となることが報告されている。また、 CDl lc/CD18は刺激を受けた上皮の受容体に結合する接着分子として働きうることが報告されている（Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Barclay, N.A. et al., eds., 1993, The Leucocyte Antigen FactsBook, CD11 Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124; Stacker, S.A. and T.A. Springer, 1991, J. Immunol. 146:648) ₀

[0018] CDlaは約 49 kDのポリペプチドで beta 2ミクログロブリンと結合する。 CDlaは MHC class I抗原と構造的に類似しており、抗原提示に機能するとみなされる（Knapp, W. et al., eas., 1989, Leucocyte Typing IV: White し ell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Scnlossman, S. et al., eds., 199b, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermatol. 95: 503; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Tissue Antigens 37: 1)。

[0019] CD14は 53- 55 kDのグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI)アンカー型単鎖糖蛋白で、細網榭状細胞およびある種のランゲルハンス細胞で発現する。 CD14は LPS と血清 LPS結合蛋白質（LPB)の複合体に対する高親和性の表面受容体として同定された（McMichael, A.J. et al., eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al" eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Wright , S.D. et al" 1990, Science 249: 1434) ₀

[0020] CD40は 45- 48 kDの I型膜嵌入型蛋白質（type I integral membrane glycoprotein)であり、抗 CD40抗体は細胞マーカーとしてよく使用されている（Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Galy, A.H.M.; and H. Spits, 1992, J. Immunol. 149: 775; Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et al" 1991, Cell 66: 233; Barclay, N.A. et al" 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press)。

[0021] CD80は約 60 kDの膜貫通型糖蛋白であり Ig supergene familyの一員である。 CD80 は T細胞で発現する CD28および CD152 (CTLA-4)のリガンドである（Schlossman, S. et al., eas., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Schwarts, R.H., 1992, Cell 71: 1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 845; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759; Freeman, G.J. et al" 1998, J. Immunol. 161: 2708; Behrens, L. et al" 1998, J. Immunol., 161(11):5943; Guesdon, J.-L. et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139)。

[0022] CD83は約 45 kDの膜貫通蛋白質で Ig superfamilyの一員である。 CD83は短鎖の V 型 Igの細胞外ドメインと C末の細胞質 tailを持つ。 CD83は主にろ胞榭状細胞、循環榭状細胞、リンパ組織の相互連結（interdigitating)榭状細胞、 in vitroで生成させた榭状細胞、および胸腺榭状細胞に発現する（Zhou, L-J., and T.F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821; Zhou, L-J. et al., 1992, J. Immunol. 149: 735; Summers, K.L. et al" 1995, Clin Exp. Immunol. 100:81; Weissman, D. et al" 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 826; Hart, D.N.J. , 1997, Blood 90: 3245)。

[0023] CD86 (B70/B7-2)は約 75 kDの細胞表面蛋白質で CD28および CTLA-4の第 2のリガンドであり初期免疫応答における T細胞の副刺激に重要な役割を持つ (Azuma M. et al" 1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al" CD86 Workshop Report. In: Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds., 1994, Oxford University Press; Yang, X.F. et al., 1994, Upregulation of CD86 antigen on TPAstimulated U937 cells, 1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN; Guesdon, J.-し et al" 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131—1139)。

[0024] CCR7は BLR-2、 EBI- 1、および CMKBR7とも呼ばれる 7回膜貫通型 G蛋白質結合受容体であり、 CCケモカインである MIP- 3beta/Exodus 3/ELC/CCL19および

6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21の受容体である（Sallusto, F. et al., 1999, Nature 401:708-12; Lipp, M. et al., 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol.

251: 173-9; Birkenbach, M.et al., 1993, J. Virol. 67:2209—20; Schweickart, V. L. et al., 1994, Genomics 23:643-50; Burgstahler, R. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:737—43; Yoshida, R. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 13803—9; Yoshida, R. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:7118-22; Yoshida, R. et al., 1998, Int. Immunol. 10:901-10; Kim, C. H. et al" 1998, J. Immunol. 161:2580-5; Yanagihara, S. et al" 1998, J. Immunol. 161:3096-102)。

[0025] HLA-class IIは DR, DP,および DQがあり、その全てに結合する抗体により網羅的に検出することができる（Pawelec, G. et al., 1985, Human Immunology 12:165; Ziegler, A. et al., 1986, Immunobiol. 171:77)。 HLA- DRは MHCのヒト class II抗原の 1つで alpha鎖（36 kDa)と betaサブユニット（27 kDa)力もなる膜貫通糖蛋白質である。表皮のランゲルノヽンス細胞では CDla抗原と共発現する。 CDlaは抗原提示にぉヽて細胞の相互作用に主要な役割を果たす（Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press)。

[0026] またヒト以外の哺乳動物に関しても、上記のマーカー遺伝子の相同遺伝子産物を指標に榭状細胞を特定することができる。これらのマーカーに対する抗体は、例えば BD Biosciences社（BD PharMingen)より入手することができ、その詳細は同社または販売代理店のウェブサイトで知ることができる。

[0027] また、榭状細胞マーカーに関しては、以下の Kiertscherらおよび Oehlerらの文献も参照のこと（Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+ leukocytes acquire the phenotype and function of antigen— presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL— 4, J. Leukoc. Biol., 1996, 59(2):208— 18; Oehler, L. et al.， Neutrophil granulocyte— committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics., J. Exp. Med., 1998, 187(7):1019- 28)。また、フローサイトメトリーに関しては、 Okanoら、および Stitesらの文献を参照することができる（Okano, S. et al.， Recombinant Senaai virus vectors ror activated Γ lymphocytes., ene Ther., 2003, 10(lb 1381- 91; Stites, D. et al., Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual

immunofluorescence . , Clin. Immunol. Immunopathol., 1986, 38:161-177)。各マ ~~力一の発現については、例えば、 isotype control antibodyで染色した時に、陽性率が 1 %以下の蛍光強度を境界として、それ以上は陽性、それ未満は陰性と判断される。

[0028] 榭状細胞またはその前駆細胞の調製は、公知の方法に従ってまたは準じて行うことができる。例えば、血液 (例えば末梢血または臍帯血）、骨髄、リンパ節、他のリンパ器官、脾臓、皮膚など力も分離することができる。好ましくは、榭状細胞は、本発明に使用するために血液または骨髄力得られる。また、本発明で用いられる榭状細胞は、皮膚のランゲルノヽンス細胞、輸入リンパ管のベール細胞、ろ胞榭状細胞、脾臓の榭状細胞、およびリンパ器官の指状突起細胞などであってもよい。また本発明で用いられる榭状細胞は、 CD34+由来榭状細胞、骨髄由来榭状細胞、単球由来榭状細胞、脾細胞由来榭状細胞、皮膚由来榭状細胞、濾胞榭状細胞、および胚中心榭状細胞からなる群から選択される榭状細胞が含まれる。 CD34+由来榭状細胞は、臍帯血または骨髄等力得た造血幹細胞または造血始原細胞等から、顆粒球コロニー刺激因子（G- CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF)、腫瘍ネクローシスファクター（TNF)- alpha、 IL-4、 IL-13、ステムセルフアクター（SCF)、 Flt-3リガンド、 c-kitリガンド、またはその組み合わせなどにより分ィ匕させることができる。例えば、末梢血の単球を GM-CSFおよび IL-4により未成熟榭状細胞に分化させ、さら〖こ TNF-alphaで刺激することにより成熟榭状細胞へと分ィ匕させることができる。

[0029] 榭状細胞およびそれ以外の細胞を含む組成物から榭状細胞を選択 (または濃縮）する場合は、榭状細胞以外の細胞を取り除くいわゆるネガティブ選択を実施することが好ましい。ネガティブ選択を用いることにより、 DC- granulocytesの precursor (J. Exp. Med., 1998, 187: 1019-1028; Blood, 1996, 87: 4520-4530)が除去されずに残り、接着性の CD 14細胞カゝら分ィ匕した DCだけでなぐそれらの precursorから分化した DCをあわせて回収することが可能と考えられる。これにより細胞障害性を軽減することが期待できる。

[0030] 例えば、 T細胞、 NK細胞、 B細胞などに特異的な抗体を用いて、これらの細胞を取り除くことにより、榭状細胞を濃縮することが可能である。具体的には、例えば、 CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、 CD66bから選択される表面マーカーまたはその任意の組み合わせの発現が lowまたは negativeの細胞を得ることが好まし、。より好ましくは、 CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、および CD66bの全てが lowまたは negativeの細胞である。そのために、これらのマーカーに対する抗体を用いて、これらのマーカーを発現する細胞を除去するとよい（Hsuら（1996) Nature Med. 2: 52)。なお、ネガティブ選択にお、ては、本実施例に示されて、るような多価抗体を用いて行うことができるし、あるいは磁気細胞分離（MACS)のためにビーズ等を用いても、同様のセレクションを実施することが可能である。血球分離等をもちいて単核球を採取するなど、細胞を大量に調整する場合は、ビーズを用いることが好ましい。例えば生体から得た細胞溶液力単球をエンリッチし、これに対してネガティブ選択を行って調製した榭状細胞を本発明にお、て好適に用いることができる。

[0031] また、 RNAウィルスを導入する前に接着細胞により得られた末梢血単球を榭状細胞へ分化させたものを選択すると、ウィルスの導入効率が低下することがある。本発明で用いられる榭状細胞はこれに限られるものではな、が、未成熟榭状細胞の比率を低下させないように、 RNAウィルスを接触させる前の細胞培養は、固体支持体 (例えば培養ディッシュまたはボトルなどの培養容器）に接着した細胞を選択する工程を含まないことが好ましい。すなわち本発明は、 RNAウィルスと榭状細胞との接触の前 24 時間以内に、固体支持体に付着した細胞を選択する工程を含まないような方法を提供する。より好ましくは、 RNAウィルスと榭状細胞との接触の前の 2日、 3日、 5日、または 7日以内に、固体支持体に付着した細胞を選択する工程を含まないようにするとよい。

[0032] また、これに限られるものではな!/、が、 RNAウィルスを接触させる前に、 CD14+細胞を選択する工程を含まないことが好ましい。すなわち本発明は、 RNAウィルスと榭状細胞との接触の前 24時間以内に、 CD14+細胞を選択する工程を含まないような方法を提供する。より好ましくは、 RNAウィルスと榭状細胞との接触の前の 2日、 3日、 5日、または 7日以内に、 CD14+細胞を選択する工程を含まないようにするとよい。

[0033] 榭状細胞の具体的な単離方法は、例えば Cameron et al., 1992, Science 257: 383 、し anghoff et al" 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7998、 Chehimi et al" 1993J. Gen. Viol. 74: 1277、 Cameron et al" 1992, Clin. Exp. Immunol. 88: 226、 Thomas et al., 1993, J. Immunol. 150: 821、 Karhumaki et al., 1993, Clin. Exp. Immunol. 91: 482などに記載されている。また、フローサイトメトリーによる榭状細胞の単離については、例えば、 Thomas et al., 1994, J. Immunol. 153: 4016、 Ferbas et al" 1994, J. Immunol. 152: 4649、および O'Dohelrty et al" 1994, Immunology 82: 487に記載されている。また、磁気細胞選別については、例えば Miltenyi et al, 1990, Cytometry 11: 231-238に記述されている。

[0034] また、例えばヒト榭状細胞の単離および増殖に関しては、 Macatonia et al., 1991, Immunol. 74: 399—406、 O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1067—1078、 Markowicz et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 955—961、 Romani et al" 1994, J. Exp. Med. 180: 83—93、 Sallusto et al" 1994, J. Exp. Med. 179: 1109—1118、 Berhard et al., 1995, J. Exp. Med. 55: 1099-1104などに記載の方法を用いてもよい。また、骨髄、臍帯血、または末梢血等力も得られる CD34+細胞および末梢血由来の単核細胞からの榭状細胞形成については Van Tendeloo et al., 1998, Gene Ther. 5: 700-707 に記載の方法を用いて実施してもよヽ。

[0035] 本発明にお、ては、榭状細胞またはその前駆細胞 (例えば CD1 lc+細胞または

CD34+細胞）を高濃度で含む細胞画分に RNAウィルスを混合することが好ましい。前駆細胞とは、適当なサイト力イン（すなわち G- CSF、 GM- CSF、 TNF- alpha、 IL- 4、 IL-13、 SCF、 Flt-3リガンド、 c-kitリガンド、またはそれらの組み合わせ）の存在下で榭状細胞に分ィ匕することができる細胞を言い、好ましくは 4週間以内、より好ましくは 20 日以内、より好ましくは 18日以内、より好ましくは 16日以内に榭状細胞に分ィ匕できる細胞である。このような細胞には、 CD34+幹細胞が挙げられる。榭状細胞への分化は、例えば SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 TNF- alpha (50 ng/ml)の存在下で 3 日間程度培養後、 SCF (50 ng/ml), GM-CSF (500 U/ml)、 IL- 4 (250 U/ml)、

TNF-alpha (50ng/ml)の存在下で培養することで実施することであってよい。また細胞画分とは、細胞の分離 (または分画）により得られた細胞集団である。細胞画分は、細胞および薬学的に許容される担体を含む組成物であってよい。担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、培養液、血清など、生細胞を懸濁することができる所望の溶液が挙げられる。本発明の方法にぉ、て RNAウィルスの接触に用 V、られる細胞画分は、全生細胞中の榭状細胞および Zまたはその前駆体の割合が、例えば 30%以上、好ましくは 40%以上、好ましくは 50%以上、好ましくは 60%以上、好ましくは 70%以上である。

[0036] また、 RNAウィルスに接触させる榭状細胞中には、未成熟榭状細胞が含まれることが好ましい。 RNAウィルスを混合する榭状細胞を含む細胞画分は、全生細胞中の未成熟榭状細胞の割合が、例えば 10%以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 30% 以上、より好ましくは 40%以上、より好ましくは 50%以上、より好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上である。

[0037] RNAウィルスと榭状細胞とを組み合わせた抗癌剤は優れた性質を有している。例えば RNAウィルスを用いれば、ウィルスの感染のみで、活性ィ匕榭状細胞が得られ、後の成熟榭状細胞を得るための工程が省略できる。榭状細胞を免疫賦活に用いるためには活性ィ匕が必要であるので、ウィルスの感染だけで活性ィ匕を起こせることには利点がある。また、この性質を利用し、 in vitroで T細胞移入療法に必要な活性化 T細胞、特に細胞傷害性 T細胞などを効率良く短期間で誘導することができる。ウィルスを導入してヽなヽ榭状細胞では CTLを誘導できず、他のウィルスベクターでこれまで報告されている性質から、他のウィルスベクターの遺伝子導入のみでは in vitroでの CTL誘導は困難である。従って、 RNAウィルスは、ウィルスの導入のみで T細胞を活性化（ CTL誘導）が可能と、う利点を有して、る（図 21〜23参照)。

[0038] 本発明の抗癌剤の製造においては、 RNAウィルスを幹細胞に遺伝子導入した後に、榭状細胞を分ィ匕させてもよい。例えばセンダイウィルスを幹細胞に遺伝子導入した後に、榭状細胞への分化を誘導した場合、遺伝子導入効率は 70%近くに達する。これは、レトロウイルスおよびレンチウィルスベクターの改変型に匹敵する。アデノウィルスベクターは、導入後の episomeの希釈により発現が低下するため、幹細胞から遺伝子導入することは困難である。ゲノム複製型 RNAウィルスが導入された榭状細胞の調製は、幹細胞に導入後に榭状細胞分化を行う方法、および、末梢血単核球より分化させた榭状細胞に遺伝子を導入する方法、のどちらの方法によっても可能である。

[0039] また、 RNAウィルスを感染させる時に MOIを高く（例えば 10以上、好ましくは 20以上、より好ましくは 30以上、例えば 40以上、さらには 50以上)すれば、細胞傷害性に有為な影響なぐ安定してほぼ 100%の導入効率で細胞に導入することが期待できる。さら〖こ、宿主染色体にゲノムを組み込まない RNAウィルスを用いれば、宿主ゲノム改変に起因する腫瘍発生などのリスクが低いという利点も有している。この点で、レトロゥィルス以外の RNAウィルスが好適に用いられる。

[0040] RNAウィルスとしては、組み換えウィルスでなくても、天然のウィルスでも使用することが可能であり、各 RNAウィルスの精製方法、増殖方法、単離株の取得方法については、ウィルス学実験学各論、改訂二版 (国立予防衛生研究所学友会編、丸善、 1982)を参照することができる。例えば、パラミクソウィルス科（Paramyxoviridae)のセンダイウィルスなどパラインフルエンザウイルスは、各型ともサル腎臓 (MK2)、ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞、およびトリプシン添カ卩 Vero細胞で良く増殖し（同上， p334 ; Itoh H et al.， Jap. J. Med. Sci. Biol. 23, 227 (1970))回収することができる。精製は、ショ糖密度勾配遠心法、平衡遠心法などで精製できる (p336)。麻疹ウィルスは、サル由来の各種細胞で良く増殖でき（Matsumoto M, Bact. Rev. 30, 152 (1966)) Vero細胞が最も汎用されている力 CV1, FL, KB, HeLa HEp2などを使用して増殖可能である（P351)。狂犬病ウィルスなどのラブドウィルス科（Rhabdoviridae)では組織培養法を用いて、 BHK、 CEおよび Vero細胞などが使用されている。精製法としては、感染 3〜4日の培養液を pH7.4以上に補正し、低速遠心で細胞片を除き濃縮する（p376)。ラッサウィルスなどのァレナウィルス科（Arenaviridae)は、 in vitroで継代されているほとんどの培養細胞でよく増殖する力 HK-21/13S細胞に感染させた後、寒天中に suspendした形で培養することによって増殖が可能である（Sedwik W.D., J. Virol. 1, 1224 (1967)) (p240) _o風疹ウィルスなどのトガウィルス科（Togaviridae)は、初代アフリカミドリザル腎細胞（GMK)、 Vero、 BHK21、 RK13、初代ゥズラまたは-ヮトリ胚細胞、 R66、および SIRC細胞など広範囲にわたる各種の培養細胞中で増殖する。比較的収量の高いウィルスを得るには BHK21あるいは Vero細胞がよく用いられる（ p227) ₀インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウィルス科（Orthomyxoviridae)は、発育鶏卵や MDCK細胞において増殖できる（p295)。精製は遠心分画法、赤血球への吸着'游出による精製（Laver W.G., Fundamental Techniques in Virology, 82 (I⁹⁶⁹))などで精製できる ⁷)。

RNAウィルスは、天然力も単離されたウィルスであっても、遺伝子組み換えにより人為的に作出したウィルスであってもよい。また、感染細胞においてゲノム RNAを複製する能力を保持する限り、野生型ウィルスが持ついずれかのウィルス遺伝子に変異および/または欠損があるものであってよい。例えば、ウィルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子に変異または欠損を有するゥィルスを好適に用いることができる。このようなウィルスは、感染細胞においては RNA ゲノムを複製することはできるが、感染性ウィルス粒子を形成できない。従って、周囲に感染を拡大する懸念がな、ので安全性が高ヽ。例えばマイナス鎖 RNAウィルスにおいては、 F、 H、 HN、または Gなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれてヽな、ウイルスを用いることができる（WO00/70055および WO00/70070; Li, H.— O. et al, J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、 P、および L蛋白質）をゲノム RNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。つまり、少なくとも N、 L、および P蛋白質をコードするゲノム RNAとそれらの蛋白質とを含む RNP、ならびに該 RNPを含むウィルス粒子は、本発明の抗腫瘍剤の製造において榭状細胞に導入されるものとして適当である。欠損型ウィルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウィルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。但し、例えばマイナス鎖 RNAウイルスにおいては、 M蛋白質遺伝子を持つウィルスであれば、 F蛋白質や HN蛋白質などのスパイク蛋白質をコードする遺伝子を持たなくても非感染性のウィルス粒子 (VLP )が放出されるので、ウィルス蛋白質を相補することなく VLPを製造することが可能である（WO00/70070)。また、エンベロープ蛋白質遺伝子を何も持たなくても、 N、 L、 P 蛋白質、およびゲノム RNAからなる RNPは細胞内において増幅することができるので、細胞ライセートから遠心分離等により RNPを回収することができる。得られた VLPや RNPは、所望のトランスフエクシヨン試薬と混合して榭上細胞に導入することにより、抗腫瘍剤を製造することができる。

[0042] また、変異型の RNAウィルスを用いて本発明の抗腫瘍剤を製造することもできる。

例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において多数の温度感受性変異が知られてヽる。これらの温度感受性変異蛋白質遺伝子を有する RNAウィルスを本発明において好適に用いることができる。温度感受性変異とは、低温（例えば 30°Cないし 32 °C)に比べ、ウィルス宿主の通常の温度（例えば 37°Cないし 38°C)において有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度 (低温)下でウィルスを作製することができるので有用である。

[0043] 例えば、マイナス鎖 RNAウィルスの M遺伝子の温度感受性変異としては、センダイウィルスの M蛋白質における G69、 T116、および A183からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al.， J.Virol. 2003, 77: 3238-3246) 。他のマイナス鎖 RNAウィルス M蛋白質の相同な部位のアミノ酸は容易に同定できる 1S 具体的に示せば、例えば SeV M蛋白質の G69に相当する M蛋白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV-1) (括弧は略称）であれば G69、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV-3)であれは G7«3、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれば G70、 dolphin molbillivirus (DMV)であれば G71、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、および rinderpest virus (RPV)で teれば G70、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば G81、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)であれば G70、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)および human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)であれば E47、 mumps virus (Mumps)であれば E72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す)。また、 SeV M蛋白質の T116に相当する各 M蛋白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus— 1 (HPIV— 1)で ¾>れは Γ116、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)でれば T120、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれば T104、 dolphin molbillivirus (DMV)であれは T105、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)およ O、rinderpest virus

(RPV)であれば T104、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば T120、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)および simian parainfluenza virus 5 (S V5)" ¾) l iiT 117 ^ human parainfluenza virus— 4a (HPIV— 4a)および human parainfluenza virus— 4b (HPIV— 4b)であれば T121、 mumps virus (Mumps)であれば T119、 Newcastle disease virus (NDV)であれば S120が挙げられる。 SeV M蛋白質の A183に相当する各 M蛋白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)であれば A183、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)であれな F187、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれば Y171、 dolphin molbillivirus (DMV)であれば Y 172、 peste-des-petits- ruminants virus (PDPR) 、 measles virus (MV)および rinderpest virus (RPV)であれは Y171、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば Y187、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)であれは Yl 84、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)であれば F184、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)および human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)であれは F188、 mumps virus (Mumps)であれば F186、 Newcastle disease virus (NDV)であれば Y187が挙げられる。ここに挙げたウィルスにおいて、それぞれの M蛋白質に上記の 3つの部位のいずれ力、好ましくは任意の 2部位の組み合わせ、さらに好ましくは 3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異 M蛋白質をコードするゲノムを有するウィルスは、本発明において好適に用いられる。アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましぐ例えば BLOSUM62マトリックス (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:

10915-10919)の値が 3以下、好ましくは 2以下、より好ましくは 1以下、より好ましくは 0 以下のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウィルス M蛋白質の G69、 T116、および A183あるいは他のウィルス Μ蛋白質の相同部位を、それぞれ Glu (E)、 Ala (A) 、および Ser (S)へ置換することができる。また、麻疹ウィルス温度感受性株

P253-505 (Morikawa, Y. et al, Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15- 30)の M蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよ、。

[0044] また、 HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウィルスの HN蛋白質の A262、 G264、および K461からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al.， J.Virol. 2003, 77: 3238-3246)。好ましい一例を挙げれば、センダイウィルス HN蛋白質の A262、 G264、および K461あるいは他のウィルス HN 蛋白質の相同部位を、それぞれ Thr (T)、 Arg (R)、および Gly (G)へ置換する。また、例えば、ムンプスウィルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、 HN蛋白の 464及び 468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al.， Virus Res. 2000: 67; 49-57)。

[0045] またマイナス鎖 RNAウィルスは、 P遺伝子または L遺伝子に変異を有してヽてもよヽ。このような変異としては、具体的には、 SeV P蛋白質の 86番目の Glu (E86)の変異、 SeV P蛋白質の 511番目の Leu (L511)の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖 RNAウィルス P蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、 86番目のアミノ酸の Lysへの置換、 511番目のアミノ酸の Pheへの置換などが例示できる。また L蛋白質においては、 SeV L蛋白質の 1197番目の Asn (N1197)および/または 1795番目の Lys (K1795)の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖 RNAウィルス L蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、 1197番目のアミノ酸の Serへの置換、 1795番目のアミノ酸の Gluへの置換などが例示できる。 P遺伝子および L遺伝子の変異は、持続感染性、 2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および/または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。

[0046] またエンベロープウィルスを用いる場合は、ウィルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウィルスを榭状細胞に感染させてもよい。例えば、ウィルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウィルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウィルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなぐ哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウィルス（Vesicular stomatitis virus; VSV) の G蛋白質 (VSV-G)を挙げることができる。 VSV-G蛋白質は、任意の VSV株に由来するものであってよぐ例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981))由来の VSV-G蛋白を用いることができる力これに限定されない。本発明において用いられる RNAウィルスは、他のウィルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。

[0047] RNAウィルスは、ゲノム RNA中に外来遺伝子をコードしてもよ!/、し、しなくてもよ！/、。

榭状細胞に導入されることによって、外来蛋白質をコードしない RNAウィルスでも制癌作用を発揮するため、外来遺伝子は必ずしも必要ではない。従って本発明には、野生型 RNAウィルスや天然力ゝら単離されたウィルス (変異株を含む)などの所望の RNAウィルスを利用できる利点がある。例えば本発明にお！/、て用いる RNAウィルスとしては、癌治療効果を有する蛋白質をコードしな、RNAウィルスを用いることができる。このようなウィルスとしては、癌治療効果を有さない所望の外来蛋白質をコードする RNAウィルスが含まれ、例えば RNAウィルスの導入を検出するために、緑色蛍光蛋白質（GFP)、ルシフェラーゼ、各種ペプチドタグなどのマーカー蛋白質をコードする RNAウィルスなどを用いることができる。あるいは、 RNAウィルスに制癌作用を助ける外来遺伝子をさらに組み込むことで、制癌作用をより高めることもできる。

[0048] 外来遺伝子を持つ組み換え RNAウィルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順は、典型的には、（a) RNAウィルスゲノム RNAをコードする cDNAを、ウィルス粒子形成に必要なウィルス蛋白質を発現する細胞で転写させるェ程、（b)生成したウィルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。ウィルス蛋白質は、転写させたウィルスゲノム RNAから発現されてもよいし、ゲノム RNA以外からトランスに供給されてもょ、。ゲノム RNAにお、て粒子形成に必要なゥィルス遺伝子が欠損してヽる場合は、そのウィルス遺伝子をウィルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウィルス蛋白質や RNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノム RNAをコードする DNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノム RNAは、ウィルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウィルス粒子が形成される。ェンべロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウィルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウィルス蛋白質などをウィルス産生細胞において発現させる。

[0049] 例えば、マイナス鎖 RNAウィルスの製造であれば、以下の公知の方法を利用することができる（W097/16539; W097/16538; WO00/70055; WO00/70070;

WOOl/18223; Hasan, M. K. et al" J. Gen. Virol. 78: 2813—2820, 1997、 Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466;

Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323—332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388—8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al" 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477—4481; Garcin, D. et al" 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al" 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T.， 1997, J. Virol. 71: 1265—1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404)。これらの方法により、パラインフルェンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一ペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖 RNAウィルスを DNAから再構成させることができる。本発明においては、マイナス鎖 RNAウィルス、特に一本鎖マイナス鎖 RNAゥィルス、より好ましくはパラミクソウィルス科ウィルス、より好ましくはレスピロウィルス属ウィルスを好適に用いることができる。

[0050] ゲノム複製能を持つマイナス鎖 RNAウィルスが導入された榭状細胞の製造方法をより具体的に示せば、ゲノム複製に必要なウィルス蛋白質 (N、 P、および L)を発現する細胞に、ウィルスゲノム RNA (マイナス鎖)またはその相補鎖 (プラス鎖）を導入または転写させる。 N、 P、および L蛋白質は、例えば、これらの蛋白質を発現する発現プラスミドを細胞に導入して供給する。ウィルスゲノム RNAとしては、ゲノム複製に必要なウィルス蛋白質 (N、 P、および L)をコードするものを用いる。この過程を榭状細胞で行えば、榭状細胞内でゲノム RNAおよび N、 P、および Lを含む RNPが形成し、該 RNP は榭状細胞内で自律的に複製させることができる。本発明においては、このように榭状細胞にぉ、てウィルス RNPを直接生成させて、マイナス鎖 RNAウィルスが導入された榭状細胞を得ることもできる。榭状細胞以外の細胞を用いる場合は、生成した RNP 、感染性または非感染性ウィルス粒子を回収する。 M蛋白質が存在すれば、その働きにより細胞力もウィルス粒子 (または VLP)が放出される。さらにスノイク蛋白質 (例えば F' HN (または H)蛋白質、あるいは G蛋白質など）が存在すれば、形成された粒子にはこれらのスパイク蛋白質が取り込まれ、感染性ウィルス粒子となる。スパイク蛋白質が存在しない場合は、 M蛋白質の存在下、非感染性ウィルス粒子 (VLP)が放出される。回収された RNPまたは VLPは、例えばトランスフエクシヨン試薬などと共に、榭状細胞に導入される。感染性ウィルス粒子は、そのまま榭状細胞に添加して感染させることができる。こうして、マイナス鎖 RNAウィルスが導入された榭状細胞を製造することが可能である。

プラス（+)鎖 RNAウィルスの製造方法としては、以下の例が挙げられる。

1)コロナウィルス

Enjuanes L, Sola I, Alonso S, scors D, Zuniga ¾.

Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression. Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:161-97. Review.

2)トガウィルス

Yamanaka R, Zullo SA, Ramsey J, Onodera M, Tanaka R, Blaese M, Xanthopoulos KG.

Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin— producing Semliki Forest virus.

Cancer Gene Ther. 2001 Oct;8(10):796- 802.

Datwyler DA, Eppenberger HM, Koller D, Bailey JE, Magyar JP.

Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.

J Mol Med. 1999 Dec;77(12):859-64.

3)ピコルナウィルス

Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.

Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus: the manipulation of G/ C contents and their distribution patterns increases the genetic stability or inserts in a poliovirus— based RPS-Vax vector system. J Virol. 2002 Feb ;76(4) :1649-62.

Mueller S, Wimmer E.

Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion: analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.

J Virol. 1998 Jan;72(l):20-31.

4)フラビウィルス

Yun SI, Kim SY, Rice CM, Lee YM.

Development and application of a reverse genetics system for Japanese

encephalitis virus.

J Virol. 2003 Jun;77(l l):6450-65.

Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX, Monath TP, Chambers TJ.

Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax- JE).

J Virol. 2001 Jan;75(2):934-42.

5)レオウイノレス

Roner MR, Joklik WK.

Reovirus reverse genetics: Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):8036— 41. Epub 2001 Jun 26.

その他の RNAウィルスの増殖方法および組み換えウィルスの製造方法については、ウィルス学実験学各論、改訂二版 (国立予防衛生研究所学友会編、丸善、 1982 を参照のこと。

RNAウィルスに搭載させる外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイト力イン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、抗体 (全長抗体、 Fabなどの抗体断片、一本鎖抗体などを含む)、ペプチドなど力 S挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質 (受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよヽ。導入遺伝子としてアンチセンス RNA分子または RNA切断型リボザィムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として制癌作用を示す治療用遺伝子を用いてウィルスを調製すれば、制癌作用をより高めることが可能となる。

[0053] 例えば、血管形成または血管新生を阻害する遺伝子を榭状細胞で発現させることで、抗癌効果をより高めることができる。血管形成または血管新生を促進する遺伝子としては、例えば線維芽細胞増殖因子 2 (FGF2) (Balfour, R. et al., J. Vase. Surg. 16(2):181-91, 1992)、内皮細胞増殖因子（endothelial cell growth factor; ECGF) ( Pu, L. Q. et al., J. Surg. Res. 54(6):575- 83, 1993)、血管内皮増殖因子/血管透過性因十 (vascular endothelial growth factor; VEGF I vascular permeability factor; VPF) (Takeshita, S. et al" Circulation 90(5 Pt 2):II228-34, 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93(2):662- 70, 1994)、肝細胞増殖因子/ scatter因子（hepatocyte growth factor/scatter factor) (HGF/SF)などが知られている。これらのシグナル分子の作用を阻害する分泌蛋白質をコードする遺伝子を榭状細胞で発現させることが可能である。具体的には、これらのシグナル分子またはその受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチド、該受容体の可溶型蛋白質 (リガンド結合部を持ち、膜貫通領域を持たない分泌型受容体)などが挙げられる。特に、 FGF受容体 (FGF-R)の可溶型ポリペプチドをコードする RNAウィルスを榭状細胞に導入すると、癌の増殖抑制効果は有意に上昇させることができる。従って、可溶性 FGF-Rをコードする RNAウィルスは、本発明において好適に用いられる。可溶性 FGF-Rとしては、天然の可溶型 FGF-Rを用いることもできるし、膜結合型の FGF-R (FGF-R1など）の細胞外ドメインからなる断片を用いてもよい（A. Hanneken and A. Baird,

Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 3り, 1192—1196, 1995; Takaishi, S. et al" Biochem Biophys Res Commun., 267(2):658- 62, 2000; Seno M, et al" Cytokine, 10(4):290— 4, 1998; Hanneken, A., FEBS Lett. 489:176, 2001)。

[0054] また、標的とする癌が発現する癌抗原ペプチドを榭状細胞に提示させることもできる。榭状細胞に提示させる抗原は、 RNAウィルスにコードさせたり、あるいは RNAウイルスを導入した榭状細胞に添カ卩（すなわちパルス）したり、または別の所望のベクターで発現させることができる。腫瘍抗原は腫瘍細胞に特異的なもの（すなわち、腫瘍細胞に存在するが、非腫瘍細胞には存在しないもの）が好ましいが、同じタイプの非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に高レベルで存在するものであってもよい。また、癌抗原蛋白質全長であっても、その部分ペプチドであってもよい。榭状細胞において提示されるペプチドを同定することで、そのペプチドを合成して用いることができる。抗原べプチドは、榭状細胞表面の MHC分子に結合して細胞表面に提示され、免疫応答が誘導される。

[0055] CTLが主なエフェクターとして働く場合は、抗原としては細胞内外に発現する所望の腫瘍抗原を用いることができる。榭状細胞を用いて、 CD4 T細胞の活性化から引き続く B細胞の活性ィ匕による抗体産生を惹起し、抗体をエフェクターとして作用させる場合には、抗原としては細胞表面に表出するものが好ましぐ例えば、細胞表面受容体または細胞接着蛋白質を用いることができる。腫瘍抗原の例としては、卵巣癌等にする Muc-1または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、子宮頸癌を引き起こすヒト乳頭腫ウィルス蛋白質 E6および E7、メラノーマ抗原 MART- 1、 MAGE-1、 -2、 -3、 gplOOおよびチロシナーゼ、前立腺癌抗原 PSA、その他にも、 CEA(Kim, C. et al, Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90-96)、および Her2neu (HER2p63- 71、 p780- 788; Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3338- 3346)などが挙げられる。

[0056] また、榭状細胞力もサイト力イン類を発現させれば、免疫系を刺激して癌に対する免疫応答を高めることから、サイト力インをコードする遺伝子を導入した榭状細胞も有用である。免疫刺激性サイト力インをコードする遺伝子を搭載する RNAウィルスが導入された榭状細胞は効果的な腫瘍免疫誘導剤となる。例えば、免疫刺激性サイト力インとして、インターロイキン（例えば、 IL- lalpha、 IL- lbeta、 IL- 2、 IL- 3、 IL- 4、 IL- 6、 IL - 7、 IL- 8、 IL- 9、 IL- 10、 IL- 12、 IL- 15、 IL- 18、 IL- 19、 IL- 20、 IL- 21、 IL- 23、 IL - 27) 、インターフェロン（例えば、 IFN- alpha、 IFN- beta、 IFN- gamma)、腫瘍壊死因子（ TNF)、トランスフォーミング増殖因子 (TGF)- beta、顆粒球コロニー刺激因子（G- CSF )、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF)、インスリン様増殖因子（IGF)- 1、 IGF- 2、 Fit- 3リガンド、 Fasリガンド、および c-kitリガンド、ならびに他の免疫調節蛋白質 (ケモカインおよびコスティミュラトリ一分子など）が含まれる。

[0057] これらのサイト力インのアミノ酸配列は当業者には周知であり、 IL-4については、例えば、 Araiら（1989)、 J. Immunol. 142(1) 274-282、 IL- 6については、例えば、 Yasukawaら（1987)、 EMBO 、 6(10): 2939-2945、 IL- 12は、例えば、 Wolfe (1991)、 J. Immunol. 146(9): 3074-3081、 IFN- alphaは、例えば、 Grenら（1984) J. Interferon Res. 4(4): 609—617、および Weismannら（1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1—22、 IFN- betaは、例えば Accession number NM_002176の 139〜636番目の配列（アミノ酸配列は NP_002167の 22〜187番目）を含む配列が挙げられる（Derynck, R. et al.， Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al, J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al., Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989))。また、 TNFは、例えば、 Pennicaら（1984) Nature 312: 724—729、 G— CSFは、例えば、 Hiranoら（1986) Nature 324:73-76、 GM- CSFは、例えば、 Cantrellら（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254を参照することができる。より具体的には、 GM- CSFをコードする核酸配列としては Accession number NM_000758の 84〜461番目の配列（ァミノ酸配列は NP_000749の 18〜144番目）を含む配列が挙げられる。 IL-4をコードする核酸配列としては、 Accession number NM_000589の 443〜829番目の配列（アミノ酸配列は NP_000580の 25〜153番目）を含む配列が挙げられる。シグナルペプチド配列は、適宜他の蛋白質のシグナルペプチドの配列に置換してもよい。これらのサイト力インをコードする天然の遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して、機能的サイト力インをコードする変異遺伝子を構築し、榭状細胞に導入することができる。

[0058] また、これらのサイト力インの改変体を発現するように遺伝子改変してもよ、。例えば、前駆体および成熟体の 2つの形態を持つサイト力イン (例えば、シグナルぺプチドの切断により活性フラグメントを生成するもの、または蛋白質の限定分解により活性フラグメントを生成するものなど）について、前駆体または成熟体のいずれかを発現するように遺伝子改変してもよい。その他の改変体 (例えば、サイト力インの活性フラグメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質)を用いてもよい。

[0059] RNAウィルスが導入された榭状細胞は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体 (例えば生理食塩水、リンゲル液、培養液、血清など）と組み合わせることができる。また、必要に応じて遠心などにより濃縮され、培養液または生理食塩水などの生理的溶液中に再懸濁されてよ!/、。本発明によって調製される榭状細胞は、癌に対する有効な免疫療法において有用であり、腫瘍抗原をコードする遺伝子が導入された榭状細胞またはその榭状細胞で刺激された T細胞による免疫感作は、患者において抗腫瘍作用を誘導する有効な方法となる。本発明は、本発明の方法により得られた榭状細胞の抗癌治療における使用に関する。また本発明は、本発明の方法により得られた榭状細胞の、抗癌剤 (または制癌剤、癌増殖抑制剤など)の製造における使用に関する。また本発明は、 RNAウィルスおよび榭状細胞の、抗癌剤（または制癌剤、癌増殖抑制剤など)の製造における使用に関する。

[0060] 得られた榭状細胞は、 DCワクチンとして有用である。免疫原性を高めるために、

RNAウィルスが導入された榭状細胞には、サイト力イン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またミヨゥバン、不完全 Freund'sアジュバント、 MF59 (オイルェマルジヨン)、 MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、および QS— 21 (soapbark tree Quilaia saponaria由来)などのァシュノントを組み合わせることもできる。

[0061] また本発明は、 RNAウィルスおよび榭状細胞を含むパッケージであって、該榭状細胞を癌抑制に使用することの記載を含むパッケージに関する。 RNAウィルスおよび榭状細胞は、別々の容器中に含まれていてもよいし、同一の容器に含まれていてもよい。また本発明は、 RNAウィルスが導入された榭状細胞を含むパッケージであって、該榭状細胞を癌抑制に使用することの記載を含むパッケージにも関する。 RNAウイルスおよび榭状細胞は、培養液または生理食塩水などの溶液中に懸濁されてヽてよい。癌抑制に使用することとは、例えば RNAウィルスが導入された榭状細胞、またはそれを含む組成物が、腫瘍増殖抑制、癌の縮退、癌治療、癌患者の処置'治療、癌患者の延命、または抗癌剤として用いられることである。該記載は、ノ¾ /ケージに直接記載されて、てもよ、し、該記載を含む紙やシールをパッケージに含んで、てもよい。ノッケージは、 RNAウィルスおよび/または榭状細胞を含む容器であってよぐその場合、容器は、例えばボトル、チューブ、ビニールバッグ、バイアル、シリンジ等であってよい。また本発明のノッケージは、該容器を収納するバッグまたは外箱等を含んでもよい。パッケージには、榭状細胞の投与方法が記載された説明書を含んでもよぐ榭状細胞投与のためのシリンジ、カテーテル、および/または注射針等をさらに含んでもよい。

[0062] 本発明により製造される制癌剤は体内に接種されることから、そこに含まれる榭状細胞は細胞増殖性を無くしておくとより安全である。例えば、臍帯血由来の単球は分化誘導することにより増殖能が極度に低下することが知られて、るが、細胞ワクチンとしてより安全に利用するため、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシン C処理などで処理し、ワクチンとしての機能を残したまま、増殖性をなくすことができる。例えば、 X線照射を利用する場合、総放射線量 1000〜3300 Radで照射することができる。マイトマイシン C処理法は、例えば、榭状細胞に 25〜50 micro-g/mlのマイトマイシン Cを添加し、 37°C、 30〜60分間保温処理することができる。熱による細胞処理方法は、例えば、 50〜65°Cで 20分間加熱処理を行うことができる。

[0063] 榭状細胞の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイト力イン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i) IL-2と一本鎖 IL-12との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999)、 ii) IL- 2とインタ一フエロン- γ (米国特許第 5,798,100号）、 iii)単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（GM- CSF)、 iv) GM- CSFと IL- 4の組み合わせ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999))などが挙げられる。

[0064] RNAウィルスが導入された榭状細胞は、患者自身の T細胞を in vivoで刺激するのに有用であり、あるいはこの榭状細胞は T細胞を in vitroで刺激するのにも有用である。感作した T細胞を患者に投与し、エタスビボ免疫療法を介して患者の腫瘍免疫を刺激することちでさる。

[0065] 本発明は、榭状細胞により刺激された T細胞を含む抗癌剤の製造方法であって、 ( a) RNAウィルスを榭状細胞またはその前駆細胞に導入する工程、 (b)該細胞を成熟榭状細胞に分化させる工程、（c)該成熟榭状細胞に癌抗原を提示させる工程、 (d) 該成熟榭状細胞を T細胞に接触させる工程、を含む方法に関する。 RNAウィルスを導入した榭状細胞は T細胞を活性ィ匕し、 CTLを誘導する。榭状細胞で提示させる抗原は、 RNAウィルス力も発現させた癌抗原（またはそのプロセスされた産物）であってもよいし、外力榭状細胞にパルスしてもよい。得られた T細胞は癌治療のために使用できる。インビトロで T細胞と榭状細胞を接触させる場合、患者から T細胞を採取して、榭状細胞と接触させた後、 T細胞をエタスビボ投与することが好ましい。

[0066] また本発明は、本発明の方法により製造した榭状細胞を用いて、癌を抑制する方法に関する。例えば癌患者において抗腫瘍免疫を刺激する治療を行うことができる。この方法は、榭状細胞を投与する工程を含む方法である。具体的には、ゲノム複製能を持つ RNAウィルスの RNP複合体を有する榭状細胞の治療上有効量を、患者に投与する工程を含む方法である。本方法により、本発明の榭状細胞を投与しない場合に比べ、癌の増殖を抑制することが期待できる。 RNAウィルスは、外来遺伝子を持たないものであってもよぐあるいは癌抗原、免疫刺激性サイト力イン、血管新生を阻害する蛋白質などの 1つまたは複数をコードする遺伝子を持つものであってもよい。 RNAウィルスが榭状細胞に導入されることにより、榭状細胞は活性ィ匕するので、外来遺伝子を持たな、RNAウィルスを導入した榭状細胞を癌に投与することによっても、癌に対する患者の免疫系を活性ィ匕させることができる。この榭状細胞に、癌抗原ぺプチドをパルスして、所望の抗原を提示させることで、癌抑制効果をより高めた榭状細胞を得ることができる。

[0067] 本発明は、所望の固形癌に適用することができ、例えば舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫 (メラノーマ)、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、肺癌、乳癌、脾癌、消化器癌 (食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌)、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫などが挙げられる。対象となる癌は、好ましくは上皮癌であり、より好ましくは、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーェン病、皮膚ページエツト病、皮膚悪性黒色腫などを含む皮膚癌である。

[0068] RNAウィルスを導入した榭状細胞を投与する場合は、一般的には 10⁵〜10⁹細胞、好ましくは 10⁶〜10⁸細胞、より好ましくは約 10⁷細胞を患者の癌病巣に投与する。癌病巣とは、癌組織またはその周囲（例えば癌から 5 mm以内、好ましくは 3 mm以内）の領域を言う。なお投与量は、癌のタイプやステージ、導入遺伝子の有無等により適宜調節されてょ、。 RNAウィルスは外来遺伝子を搭載して、なくても抗腫瘍効果が期待できるが、 IFN-beta遺伝子または可溶性 FGF受容体遺伝子などを RNAウィルスに搭載させることでより高い効果が得られる。また、榭状細胞を腫瘍に投与する前に、榭状細胞に腫瘍抗原を接触させるとより高い効果を得ることができる。榭状細胞への腫瘍抗原の接触は、榭状細胞と腫瘍細胞の cell lysate (細胞溶解物）とを混合する方法、腫瘍抗原ペプチドを榭状細胞にパルスする方法、あるいは榭状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入して発現させる方法などを用いることができる。また、 IFN-beta、可溶性 FGF 受容体、またはそれらをコードする遺伝子を搭載する所望のベクターを、本発明の榭状細胞と共に癌病巣に直接注入することによっても抗腫瘍効果が得られる。すなわち、 RNAウィルスを導入した榭状細胞の投与と、 IFN-betaまたは可溶性 FGF受容体による抗腫瘍処置との組み合わせは、本発明にお、て好適である。

[0069] 榭状細胞により活性ィ匕した T細胞を投与する場合は、例えば T細胞は、 1 m²の体表面積あたり約 10⁵〜10⁹細胞、好ましくは 10⁶〜10⁹細胞、より好ましくは 10⁸〜10⁹細胞の用量で、静脈内注入によって投与され得る（Ridellら、 1992、 Science 257: 238-241を参照)。注入は、所望の間隔 (例えば、毎月）で繰り返され得る。投与後のレシピエントは、必要に応じて任意の副作用について、 T細胞注入の間または注入後にモニタ一されてよい。このとき、 T細胞は榭状細胞を得た患者と同じ患者力も得ることが好ましい。あるいは、 T細胞を患者力も採取し、 T細胞を刺激するために用いる榭状細胞は、 HLA適合性の健常なドナーに由来してもよい。または逆に、榭状細胞を患者から採取し、 T細胞は HLA適合性の健常なドナーに由来してもよ!、。

[0070] 榭状細胞または T細胞の投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、 1日の投与回数についても同様である。投与対象としては特に制限はないが、例えば、ニヮトリ、ゥズラ、マウス、ラット、ィヌ、ブタ、ネコ、ゥシ、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、哺乳動物 (ヒトおよび非ヒト哺乳動物 )が挙げられる。ヒト以外の動物に投与する場合は、例えば目的の動物とヒトとの体重比で上記の投与量を換算した量を投与することができる。

実施例

[0071] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。

[0072] A.導入効率の検討

(実験 1)

健常者より単球をネガティブセレクションで濃縮（enrichment)した。単球の濃縮の 7こめのネカァイブセレクション【ま、 RosetteSep -human monocyte enrichment cocktail

(Stem Cell Technology Inc.)を用いた。すなわち、 tetrameric antibody (抗体 2分子が結合している抗体で、一方は赤血球を認識する抗 glycophorin A抗体、他方が単核球の表面抗原を認識する抗体でできて、る）を用い、除去した!/、細胞を赤血球に結合させ、 Ficoll Paque™ Plus (Pharmacia Biotech Inc.)で除去することにより実施した。このネガティブセレクションにより、 CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、 CD66bを発現している細胞が除去され、残った細胞を単球濃縮細胞として、次の DCの分化誘導に用いた。この時の CD14+細胞は 65-80%であった。単球濃縮細胞に GM-CSF (500 U/ml)と IL— 4 (250 U/ml)を添加し、 endotoxin free RPMI + 10%FCSで培養後、 DCの作成を行った。 3-4日目に半分の培養上清を同じ組成の新しい培養液で培養液交換を行った。副刺激分子（Costimulatory molecule)、ならびに CDl lc、 HLA- class II (DR, DP, DQ)、および CDlaの発現が陽性であることを確認し、その他の lineage marker (CD3、 CD56、 CD19、 CD15および CD14)を表出していないことも確認した（図 1および非提示データ)。この細胞を用いて、ウィルスの導入効率を検討した。この時点で、生細胞の 90- 98%が DCマーカー（CDl lc、 HLA- class II(DR,DP,DQ》を発現していた。

なお、本実施例におけるセレクションは上記キットを用いた力抗体でコートされた磁気ビーズを用いても、同様のセレクションを実施することが可能である。血球分離等をもちいて単核球を採取するなど、細胞を大量に調製する場合は、ビーズを用いるこが好ましい„ [0073] (実験 2)

実験 1より得られた DC (分化誘導後 7日目）に、緑色蛍光蛋白質（GFP)を発現するセンダイウィルス（SeV-GFP) (伝播型、 WO00/70070)を MOIをふって感染させ、経時的に細胞数の変化、 GFPの発現、 costimulatory moleculesの発現程度について検討した。その結果、 MOIについては、 MOI 20以上で％GFPは最大となった（図 2〜5)。 GFPの平均蛍光強度（mean fluorescence intensity; MFI)については、 MOI 100まで上げることにより更に上昇させることが可能である（非提示データ)。また、 8日目まで GFPの MFIは上昇した。 costimulatory molecules (CD80および CD86)については、全体的に MOI 20以上で最大となった。細胞数の減少については、 MOIで 1〜20の間はあまり変化ないが、 MOI 50ではやや減少する傾向が見られたが有意差はな力つた（図 6)。

[0074] (実験 3)

MOI 20で DCに SeV-GFPを感染させ、経時的に FACSを用いて、 GFPの発現を検討した。その結果、 2週以後は発現が低下する（細胞数も減少)ものの、 2箇月までは発現細胞を確認できた（図 7)。以下の実施例で示すように、 RNAウィルスの感染で DC は活性ィ匕される。従って、 RNAウィルスを用いた DCへの遺伝子導入は臨床応用として、ワクチンへの応用が可能である。投与はインビボでもエタスビボでも可能であるが、例えばエタスビボ投与により RNAウィルスを感染させた DCを頻回投与することにより、長期にわたつて体内における遺伝子発現を持続させることが可能である。

[0075] (実験 4)

活性ィヒと感染効率を検討した。活性化の有無でウィルスの感染効率が変化するかどうか検討を行った。 7日間培養後の DCに 2日間 LPS (1 micro-g/ml)で刺激した後、 SeV- GFPを MOI 30で感染、 2日後に FACSで GFPを解析した。逆に SeV- GFP感染 2 日後に LPS刺激 (2日間）を同じ条件で施行した。（図 8および 9)

結果;ヒトでは、 LPSで活性ィ匕した後に、％GFPにおいて 60%近くの陽性を認めた。これに対してマウス DCでは陽性率は極めて低力つた（非提示データ)。しかしヒトにおいても MFIは非常に低ぐ活性ィ匕した後の DCには遺伝子導入効率の極端な低下を認めた。これに対して、 SeVを導入後に LPSで刺激しても、遺伝子導入効率は変化しなかった。この結果は、 RNAウィルスを導入した DCを得るには、未成熟 DC、すなわち活性ィ匕を受けて、な、DCを使用することが好まし、ことを示して、る。

[0076] (実験 5)

感染に必要な接触時間の検討を行った（図 10)。その結果、約 30分以下で遺伝子導入が可能であることが判明した。

[0077] (実験 6)

他のウィルスベクターでの報告で CD34細胞に遺伝子導入し、 DC分化誘導で遺伝子導入 DC作製に成功した報告がある（J. Immunol. Meth. 2002; 153-165)。

SeV-GFPでも同様の方法を試みた。ヒト臍帯血より、 CD34マイクロビーズを用いて、 CD34陽性幹細胞を分離 (CD34〉90%)し、 MOI 0、 10、 100で感染させた後、良く洗浄した。その細胞を RPMI + 10%FCSに SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 TNF— alpha (50 ng/ml)を添加し、 3日間培養後、 SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 IL-4 (250 U/ml)、 TNF- alpha (50ng/ml)を添カ卩したメディウムで継代（半量のメディウムを 3〜4日に交換）したものをウィルス感染より 13日目に GFPの発現を検討した。その結果、遺伝子導入効率は 65〜70%に達し、他のベクター以上に GFPの発現効率の良い DCが作製された。感染後の DCは副刺激分子の発現の解析より、感染させてヽな、ものと比べて活性ィ匕を受けて、るものが回収された。（図 11および 12) 以上の実施例から、 RNAウィルスはレンチウィルス、レトロウイルスに比較して、導入効率は格段に優れており、アデノウイルスに劣らない導入効率を極めて簡便に迅速に得ることができることが実証された。また、他のベクターでは活性ィ匕マーカーは変動しな！/、が、 RNAウィルスの感染により DCを活性ィ匕を誘導できることが判明した。

[0078] B.導入後の DC機能の評価

(実験 1)

DCに SeV- GFPを MOI 30-50で感染させ、 1日後に LPSで刺激（2日間）し、その後、 costimulatory moleculesの発現を検討した。コントロールとして、 LPS刺激のみ、 SeV-GFP感染のみ、および LPS刺激も SeV-GFP感染もなし、の条件について比較検 B、Jした。

結果;得られた結果から、 SeV感染のみでも DCの活性ィ匕が起こることが示された。 LPSと匹敵するもの； CD80 (+) HLA-DR (-) CD83 (-)

LPSより強!、もの； CD86 (+) CCR7 (-)

LPSより弱いもの； CD40 (- )

(+)は LPS+SeVで相乗効果のあるものを表す。（図 13— 15)

[0079] (実験 2)

MOI 30で DCに SeV- GFPを感染 (感染後 3日目、感染後 1日目に、あるグループは LPSで刺激)させ、実験 1と同様の群について、食細胞能力を検討した（1 micro-m PCV-RED latex- microspheresを使用。棒グラフは 4°Cで陽性となるバックグランドを差し引いたもの)。

結果;活性ィ匕マーカーでも見たように、 SeVで感染したものは、活性ィ匕のため、貪食能の低下が見られた。特に、 GFPの発現が高いもの程、貪食能が低力つた。従って、例えば DCで腫瘍抗原を提示させるために腫瘍の lysateを使用する場合は、 RNAウイルスを DCに導入する前に lysateと DCを共培養することが好ましい。（図 16— 17) [0080] (実験 3)

RNAウィルスによる榭状細胞の活性ィ匕に伴う榭状細胞サイト力イン産生能を検討するために、 7日間の培養で得られた単球由来榭状細胞（MoDC)を 12穴のプレートで 48時間（8xl0⁵/2ml/well:メディウムは X- vivol5™+2%自己血清 + GM-CSF (500 U/ml)+IL-4 (250 U/ml))、以下の群の条件で培養した上清中の TNF-alpha、 IL-lbeta 、 IL- 6、 IL-8の値を Luminex™ systemで測定した。 SeVの感染は MOI 30で 2日間培養した。

Unstimulated群：メディウムのみの群

Allantoic fluid群： SeVの浮遊液である鶏卵しょう尿液（SeVは含まない） 60 micro-L添加した群

UV-SeV-GFP群： SeV-GFP溶液を紫外線照射し、 replication能力を除去した溶液 60 micro— L添カ卩した群

SeV- GFP: SeV- GFP溶液を 60 micro- L添カ卩した群（replication- competent SeV) 結果： UV照射をしな!、複製可能な SeV (replication-competent SeV)で GFPを遺伝子導入した榭状細胞のみ TNF-alpha、 IL-lbeta, IL-6を産生、 IL-8の産生を増大した (図 18)。この時の、榭状細胞上の CD40、 CD80、 CD83、 CD86、 HLA- DRの発現上昇は replication- competent SeVのみで誘導された（図 19および 20)。このことは、 SeV を榭状細胞に遺伝子導入するのみで、免疫応答時に重要な炎症性サイト力イン（ proinflammatory cytokine)の榭状細胞による産生を惹起することができることを意味している。また、 UV処理した SeVではサイト力イン産生を誘導できな力つたことから、榭状細胞遺伝子導入時における榭状細胞の膜上のレセプターと SeVの接触による榭状細胞の活性ィ匕というよりも、 SeVの感染後におこるウィルスゲノム RNAの増幅過程が、榭状細胞の活性ィ匕に重要であることも示唆している。

[0081] (実験 4)

RNAウィルスによる榭状細胞の活性ィ匕に伴う榭状細胞抗原提示能を検討するために、上記と同様の実験群について、それらの DCを 3000 radの放射線を照射した後、 T細胞の活性化能力につ!/、て検討した。（doseをふった DCと純化（CD3+〉95%)のァロあるいは syngenic T細胞と 3日間共培養した)。 SeV-GFPに対する反応の指標として、 syngenic T細胞を用いた。

結果; DC比と T細胞の量が少なく差が比較的顕著でないが、 SeV感染単独で、 LPS に匹敵するァロ T細胞刺激性を持っていることが示された（図 21)。なお、 DCは放射線照射しな、で用いることも可能である。

[0082] (実験 5)

RNAウィルスによる榭状細胞の活性ィ匕に伴う榭状細胞抗原提示能を、現在もっとも榭状細胞成熟化能力が強力とされているサイト力インカクテル刺激による抗原提示能と比較した。 7日間の培養で得られたヒト単球由来榭状細胞（MoDC)を 12ゥエルのプレートで 48時間培養した { 1 X 10⁶/2 ml/well:メディウムは X-vivol5™+2%自己血清 + GM-CSF (500 U/ml)+IL-4 (250 U/ml)、以下の群の条件で培養）。なお RNAウィルスとして、 F遺伝子を欠失し、温度感受性の変異 Mおよび HN蛋白質 (M遺伝子： G69E, T116A, A183S、 HN遺伝子： A262T, G264R, K461G)遺伝子を搭載し、且つ、持続感染型変異を有する変異 Pおよび L蛋白質 (P遺伝子： L511F、 L遺伝子： Nl 197S, K1795E)遺伝子を搭載するセンダイウィルス (SeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP (SeV/TS dFとも略称する)）も比較として用いた (WO2003/025570; Inoue M, et al. J Virol 2003;77:3238-3246; Inoue M, et al. Mol. Ther. 2003; 7(5):S37) _Gこのウィルスは、感染した細胞にぉ、て感染性ウィルス粒子を形成する能力を失ってヽる。

•SeV (-)群:メディウムのみの群

• SeV- dFM^tsHN^tsPLmut- GFP群： SeV- dFM^tsHN^tsPLmut- GFP (GFPを搭載した F遺伝子欠損， M/HN/P/L変異型 SeV)を MOI 50で添カ卩した群

• SeV-GFP群： SeV-GFP (GFPを搭載した伝播型 SeV)溶液をを MOI 50で添カ卩した群 'サイト力インカクテル群：サイト力インカクテル群（IL-1 β 50 ng/ml、 IL- 6 500 ng/ml、 INF- a 2500 U/ml、 TNF— a 100 ng/ml、 PGE 20 μ M)を添カロした群

2

48時間後に得られた MoDCに 30 Gy照射した後、その MoDC (4 x 10 ゥエルから 6.25 X 10²/ゥエル）とァ口の末梢血由来 T細胞（1 X 10⁵/ゥエル） {ァ口の末梢血より、 RosetteSep -human T cell enrichment kit (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)を用いて得られた 96%以上の純度の T細胞 }を 4日間培養した後、各ゥエルに 1 μ Ciの [³H]- thymidineを添カ卩し、 8時間後の [ ]- thymidineの取り込み量を Beta Plate system (Pahrmacia LKB Biothechnology, Uppsala, Sweden;で力¹/ントした。メディウムは X-vi_V015™+2%自己血清を使用した。示された図の X軸はゥエルあたりの培養 MoDC数/ゥエルあたりの T細胞数（=1 X 10⁵)、 Y軸は [³H]- thymidine取り込み量（ cpm)を示す（図 22)。

結果：刺激して!/、な、榭状細胞と比較し、 SeV-GFPを感染させた榭状細胞はァ口の T細胞を有意に増殖させ、その能力は、ポシティブコントロールで、現在もっとも榭状細胞成熟化能力が強力とされているサイト力インカクテル刺激と同等以上であった。この抗原提示能力の程度は F欠損型 HN温度感受性 SeV (SeV-dFM^tsHN^ts

PLmut-GFP)を感染させた榭状細胞でもほぼ同等であった（図 22)。

C.癌抗原特異的 CTLの誘導

Aに記載の方法でヒト末梢血（HLA-A 0201の健常ドナー）より、 CD14+細胞を濃縮し、 X— vivo 15™ (Cambrex社製） + 2% autologous serumをメディウムとして、 GM— CSF (500U/ml)、 IL-4 (250U/ml)を添カ卩（3〜4日に一度、半量のメディウムを交換）、未熟榭状細胞を作製した。作製した未熟榭状細胞を次の 3群に分け、更に 48時間

GM-CSF (500U/ml)、 IL-4 (250U/ml)の存在下に培養した。 1群何も加えない

2群 SeV- GFPの感染（MOI 30)

3群サイト力インのカクテル (IL-1 β 50ng/ml、 IL- 6 500ng/ml、 IFN- a 2500U/ml 、 TNF- α lOOng/mU PGE2 20 micro- M)による刺激

その後、榭状細胞を回収して、 MART-1ペプチド（EAAGIGILTV (配列番号： 1》をパルス（50 micro-g/ml ; 3時間）して、榭状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血の T 細胞をネガティブセレクションで濃縮（CD3+〉97%)して、ペプチドパルスした上記 3群の榭状細胞と 7日間培養した (X- vivo 15™ + 2%autologous serum)。（3-4日毎、あるいはメディウムの黄変時に半量のメディウムを交換した。最初の刺激時は IL-2なしで T細胞と榭状細胞を混合培養し、 3日目から IL-2を 100 U/ml添カ卩開始した。）これを 2 回繰り替えし、それぞれの混合培養から、細胞を回収し、 CTL assayのエフェクター細胞として使用した。

ターゲット細胞は、 T2細胞（HLA-A2+の人から得られた T細胞- B細胞ハイプリドーマで TAP欠損細胞株）を使用した。この細胞は、 TAP (class Iへのトランスポーター）がないため、細胞質内の蛋白の分解により産生されたペプチドを Class Iに誘導できないこと力ら、ペプチドを外来から添加するとそのペプチドが Class Iに loadされて、 Class I の発現が起こる。このターゲットを変異 MART-1ペプチド（ELAGIGILTV (配列番号： 2)) (上記の刺激で使用したペプチドに対して T細胞レセプター認識部は変化なぐ HLA-A2の結合を強めたもの）をパルスしたもの、 Infoluenzaのペプチド（Flu; third partyとしてのペプチド； GILGFVFTL (配列番号： 3》をパルスしたものを作製し、 Cr で細胞をラベルし、上記 3群のエフェクター T細胞とこの 2種類の targetを 20: 1、 10: 1、 5: 1、 2.5: 1で 4時間混合培養して CTL活性を調べた。

以下に実験の組み合わせをまとめた。エフヱクタ一細胞ターゲット細胞図のシンボル

1群のエフェクター T細胞変異 MART1ペプチド + T2細胞実線の黒四角

2群のエフェクター T細胞変異 MART1ペプチド + T2細胞実線の黒三角

3群のエフェクター T細胞変異 MART1ペプチド + T2細胞実線の黒逆三角 1群のエフェクター T細胞 Fluペプチド + T2細胞点線の黒菱形

2群のエフェクター Τ細胞 Fluペプチド + T2細胞点線の黒丸

3群のエフェクター T細胞 Fluペプチド + T2細胞点線の白四角結果；上記 3群の DCで活性ィ匕をして、な、DC (MARTIペプチド + )で T細胞を刺激しても、 MART-1特異的 CTLは誘導できないが、ポジティブコントロールとして、サイト力インで活性ィ匕 (現在腫瘍免疫の榭状細胞療法で最も強く活性化できる方法)した榭状細胞で、 T細胞を刺激すると MART-1特異的 CTLが誘導できた (ターゲットにパルスする変異 MART-1ペプチドに替えて、刺激に用いた MART-1ペプチドを用いても同様の結果が得られた)。 SeVを導入した榭状細胞を使用した場合、ポジティブコント口ールと同程度の CTL活性が得られた（図 23)。つまり、 CTLアツセィで判定した場合、 SeVを感染させるだけで榭状細胞は活性化され、サイト力インで活性ィ匕した榭状細胞と同じレベルに in vitroで CTLを誘導できることが示された。 T細胞賦活ィ匕として SeVを使用すれば、標的遺伝子の導入とともに活性ィ匕が起こせるので、サイト力インなどの活性ィ匕因子を添加する必要がなくなり、コスト節減、時間節減、細胞の viabilityの保持に寄与する。

D. RNAウィルス導入 DCによる癌増殖抑制

本実施例は、 RNAウィルスのインビボおよびエタスビボ投与による腫瘍の治療方法の一例を示す。

(実験 1)

腫瘍モデルとして、 MHC Class Iを非常に低いレベルでしカゝ発現せず免疫原性に乏しい B16メラノーマの移植モデルを採用した。腫瘍モデルマウスには、 C57BL/6マウス（6〜8週齢、メス）（日本チャールズ 'リバ一）を用い、榭状細胞は C57BL/6マウス（ 8週齢、メス）（日本チャールズ 'リバ一）より採取した。榭状細胞は、 C57BL/6マウスの大腿' より' 耀を採取し、 SpinSep , murine hematopoetic progenitor

enrichmentcocktail (抗 CD5抗体，抗 CD45R抗体，抗 CDllb抗体，抗 Gr- 1抗体,抗 TER119抗体，抗 7/4抗体、 StemCell technology)を使用し、 T cellを除去した後、 IL- 4および GM- CSFを添カ卩し 1週間培養して得た。 1 x !O lOO micro- Lの B16メラノ一マ細胞を day 0にマウスの腹部皮下（s. ）接種した。 Day 10、 17、および 24に、活性ィ匕刺激を加えない榭状細胞、 LPSで活性化させた榭状細胞（LPS DC)、あるいは SeV- GFPまたはマウスインターフェロン 13を発現する SeV- IFN βを導入して活性化させた榭状細胞（それぞれ SeV GFP DCまたは SeV IFN |8 DC)を腫瘍周囲に投与した。このとき、榭状細胞に腫瘍抗原（B 16の freeze and thawによる腫瘍ライセート）をパルスして力も投与する実験も行った。これらとは別に、腫瘍接種後 10日目（day 10)に SeV- IFN j8を直接、腫瘍内注入 (intratumoral injection)して抗腫瘍効果を調べる実験も行った。

榭状細胞への SeVの導入では、上記のように 1週間培養した榭状細胞に SeV-IFN β を ΜΟΙ 40で感染させ、 8時間培養した。腫瘍抗原をパルスする場合は、上記のよう〖こ 1週間培養した榭状細胞を回収し、腫瘍抗原となる tumor lysateをパルス (DC： tumor lysate= 1： 3)し、 18時間培養した後、 SeV- IFN j8を MOI 40で感染させ、 8時間培養した。その後、これらの榭状細胞を回収し、 5xl0⁵から ΙΟχΙΟ⁵細胞数をマウスの腫瘍周囲に投与した。

[0085] 図 24に示すように、 SeV-IFN βの直接腫瘍内注入および榭状細胞を介したェクスビボ投与は、どちらも腫瘍増殖を抑制した。特に DC/SeV-IFN |8で処理したマウスでは、非常に強い腫瘍抑制効果が観察された。

[0086] 上記の各治療群における抗腫瘍効果をより詳細に検討した。ナチュラルキラー

(NK)細胞活性をアツセィするために、上記の各治療群について、 3回の DC療法終了 7日後のマウスより脾臓を摘出し、エフェクター細胞を作成した。ターゲットとして

Yac-1を使用し、 ⁵¹Cr放出アツセィを行った。また、 Tリンパ球の細胞傷害性をアツセィするため、上記の NK細胞活性アツセィに使用した脾臓細胞の残りを用いて、 B16の腫瘍抗原である TRP-2ペプチドとともに、 5日間培養した細胞をエフェクター細胞として用い、 mTRP-2ペプチドをパルスした EL-4ターゲット細胞と共培養し、 ⁵¹Cr放出アツセィを行った。特異的⁵¹ Cr放出の割合は以下のように計算した。

[(試料の cpm -自発放出の cpm) / (最大放出の cpm -自発放出の cpm)] x 100

ここで、最大放出は 1% triton Xと共にインキュベートしたターゲット細胞、自発放出は培養液のみでインキュベートしたターゲット細胞を用いた。 [0087] ナチュラルキラー (NK)細胞の活性ィ匕は、直接 SeVを注入したマウスにのみ見られ、榭状細胞投与群では検出されな力つた（図 25)。これに対して、細胞傷害性 Tリンパ球（cytotoxic T- lymphocytes, CTL)の活性化は、 DC/LPS処理群および

DC/SeV-IFN βで処理したマウスで最も強ぐ DC/SeV-GFP処理群ではそれよりも若干弱ぐ SeV-IFN iSの直接注入群では検出されなカゝつた（図 26)。腫瘍ライセートのパルスは、腫瘍増殖にも CTL応答にも有意に影響しな力つた。このように、 SeVにより免疫刺激性サイト力イン遺伝子を導入した榭状細胞を用いた腫瘍免疫治療は、強、抗腫瘍治療効果を発揮することが示された。 DC/LPS処理群と DC/SeV-IFN β処理群の間で CTL活性に若干の違いがあるにも関わらず、同程度の抗腫瘍効果が見られた。このように、 SeV-IFN |8の直接投与は NK細胞を強く活性ィ匕する一方で、榭状細胞を介した間接投与は CTL活性を誘導することが判明した。従って、これらを組み合わせた治療はより効果を発揮することが期待される。

[0088] (実験 2)

メラノーマ細胞株 B16F1 (ATCC CRL-6323) 1 X 10⁵個を、 C57BL/6マウス（6〜8週齢、雌)の腹側皮下へ接種した (n = 4)。接種後 5日（day 5)および 12日（day 12)に、特別な治療遺伝子を有さない SeV (GFP発現 SeV ; SeV-GFP)、ヒト可溶型 FGF受容体を発現するセンダイウィルス (SeV-sFGFR)、またはヒト PDGFR a可溶型を発現する SeV- hsPDGFR a、各 1 X 10⁸PFUを腫瘍内注射し、以降、腫瘍サイズを経時的に測定した。その結果、いずれの SeV投与群においても、 SeV非投与群に比べて腫瘍サイズが有意に縮小した（図 27)。このように、 SeVのインビボ投与は、治療遺伝子を持たな V、ものであっても抗腫瘍効果を発揮することができた。可溶型 FGF受容体を発現する SeVを投与した場合は、 SeV-GFP投与群よりも強ヽ腫瘍増殖抑制効果が確認され、可溶型 PDGFR aを発現する SeVを投与した場合の抗腫瘍効果は最も顕著で、腫瘍サイズはほどんど増加しな力つた。

[0089] (実験 3)

メラノーマ細胞株 B16F1 (ATCC CRL-6323) 1 X 10⁵個を、 C57BL/6マウス（6週齢、雌)の腹側皮下へ接種した (n = 4)。それとは別に、 C57BL/6マウス（6〜8週齢、雌）の骨髄細胞を採取し、 SpinSep™ (STEM CELL TECHNOLOGIES, INC)による CD45R、 CD5、 CDl lb、 TER119、 Gr-1、 7-4のネガティブセレクションにて抽出した細胞を GM- CSF 250IU/ml、 IL-4 250IU/ml存在下に 7日間培養し、マウス骨髄細胞由来の榭状細胞を得た。その榭状細胞に、治療遺伝子を有さないセンダイウィルス（ GFP発現 SeV; SeV-GFP)を MOI 60、あるいはヒト可溶型 PDGF α受容体を発現するセンダイウィルス (SeV-hsPDGFR a )、腫瘍抗原 TRP2を発現するセンダイウィルス ( SeV-TRP2)、または腫瘍抗原 gplOOを発現するセンダイウィルス (SeV-gplOO)をそれぞれ MOI 20ずつで感染させ、遺伝子導入を行った。

[0090] B16F1の接種後 10日（day 10)および 17日（day 17)に、 SeV- GFPまたは

SeV- hsPDGFR aを導入した榭状細胞 1 X 10⁶個を腫瘍内注射し、以降、腫瘍サイズを経時的に測定した結果を図 28に示した。上記のウィルスのインビボ投与と同様に、 SeV-GFPを導入した榭状細胞を投与したマウスでも、 SeV未導入榭状細胞を投与したマウスに比べ腫瘍サイズが有意に縮小した。 SeVによる抗腫瘍効果は、榭状細胞を用いたエタスビボ投与の方力 SeVのインビボ投与よりも顕著であった（図 28)。可溶型 PDGFR aを発現する SeVを投与した榭状細胞のエタスビボ投与では抗腫瘍効果はさらに上昇し、腫瘍サイズはほどんど増加しな力つた。

産業上の利用可能性

[0091] 本発明により、 RNAウィルスが導入された榭状細胞を有効成分とする抗癌剤が提供された。 RNAウィルスの導入は榭状細胞の活性ィ匕を惹起するため、導入後のサイト力インなどでの活性ィ匕処理の工程が省略可能で、細胞の viabilityの維持やコスト削減、さらなる ex vivoでの操作時間の削減に寄与するものと考えられる。本発明は、 RNAゥィルスと榭状細胞を組み合わせた新たなウィルス療法を可能にする。

Claims

請求の範囲

[1] ゲノム複製能を持つ RNAウィルスが導入された榭状細胞を含む抗癌剤。

[2] RNAウィルスが外来蛋白質をコードしな、、請求項 1に記載の抗癌剤。

[3] RNAウィルスが感染性ウィルス粒子を形成しなヽウィルスである、請求項 1に記載の抗癌剤。

[4] RNAウィルスが可溶性 FGF受容体または IFN- βをコードする、請求項 1に記載の抗癌剤。

[5] RNAウィルスが感染性または非感染性ウィルス粒子である、請求項 1から 4のいずれかに記載の抗癌剤。

[6] RNAウィルスがゲノム RNA—蛋白複合体である、請求項 1から 4のいずれかに記載の抗癌剤。

[7] ゲノム複製能を持つ RNAウィルスを榭状細胞に導入する工程を含む、抗癌剤の製造方法。

[8] ゲノム複製能を持つ RNAウィルスが導入された榭状細胞を投与する工程を含む癌の抑制方法。