CN101006171A - 含有单链负链rna病毒的抗癌剂 - Google Patents

Abstract

我们得出了单链负链RNA病毒即使在不携带具有治疗效果的基因的情况时，也有显著的抑制肿瘤的效果。本发明提供了包含单链负链RNA病毒的抗癌剂。另外，本发明还提供了包含将单链负链RNA病毒和药学上可容许的承运体混合的步骤的抗癌剂的制备方法。另外，本发明还提供了包含将单链负链RNA病毒向癌组织进行给药的步骤的癌症抑制方法。

Description

含有单链负链RNA病毒的抗癌剂

技术领域

[0001]本发明涉及癌症治疗的领域

背景技术

[0002]近年来，以进行性癌症为治疗对象的由增殖型病毒进行的病毒疗法(virotherapy)的临床研究有了进展。所谓病毒疗法就是使HSV-1、腺病毒等增殖型病毒感染肿瘤细胞，随着病毒的增殖，通过病毒对细胞的杀伤效果来治疗肿瘤的治疗方法。在使用HSV-1，腺病毒时，治疗肿瘤用的增殖型病毒是在病毒基因组中进行了基因工程操作的变异病毒，在肿瘤内部仍然保持复制的功能，而对人类正常组织的病原性被抑制到了最小程度。在肿瘤细胞中感染的治疗用的增殖型病毒在细胞内复制，在这个过程中感染细胞死亡。增殖了的病毒对周围的肿瘤细胞进行再感染，以扩大其抗肿瘤的作用(Alemany R.et al.，Replicative adenoviruses for cancer therapy.NatBiotechnol.，2000，18：723-727；Curiel，D.T.，The development of conditionallyreplicative adenoviruses for cancer therapy.，Clin Cancer Res.，2000，6：3395-9；Kirn，D.，Virotherapy for cancer：Current status，hurdles，and future directions.，Cancer Gene Therapy，9：959-960，2002；Mineta T.et al.，Attenuatedmulti-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas.NatMed 1：938-943，1995)针对癌症的病毒疗法可与手术，放射线疗法和化学疗法等已有的疗法并用，它也可以适用于普通的固形癌症，还可以反复使用，通过将细胞因子等治疗用基因直接搭载于病毒基因组中来增强其抗肿瘤效果等，其应用范围很广，并且在实用性方面有着很高的优越性。我们期待通过开发效果更显著的病毒疗法，可望对癌症的治疗作出更大的贡献。

[0003]非专利文献一：Alemany R.et al.，Replicative adenoviruses forcancer therapy.Nat Biotechnol.，2000，18：723-727

非专利文献二Curiel，D.T.，The development of conditionally replicativeadenoviruses for cancer therapy.，Clin Cancer Res.，2000，6：3395-9

非专利文献三Kim，D.，Virotherapy for cancer：Current status，hurdles，andfuture directions.，Cancer Gene Therapy，2002，9：959-960

非专利文献四Mineta T. et al.，Attenuated multi-mutated herpes simplexvirus-1 for the treatment of malignant gliomas.Nat Med，1995，1：938-943

发明的公开

本发明要解决的课题

[0004]本发明以提供具有更显著的抗癌症效果的病毒疗法以及抗癌剂为课题。更详细地说，本发明提供一种含有单链负链RNA病毒的抗癌剂的制备方法，并且还提供利用单链负链RNA病毒的癌症治疗方法。

解决本课题的手段

[0005]本发明的发明者们为了验证体内给药时的RNA病毒对肿瘤的治疗效果，利用向腹部皮下接种了黑色素瘤细胞株的小白鼠进行了实验。结果发现，通过向该动物的肿瘤内注射不带有治疗基因的单链负链RNA病毒，肿瘤的尺寸显著缩小。也就是说，即使该病毒不带有治疗基因，该单链负链RNA病毒的体内给药也能发挥抗肿瘤作用。

因此我们推断单链负链RNA病毒自身就是有效的抗癌制剂。另外，通过直接向肿瘤部位(即癌组织)注入该病毒，可期待有效的抗肿瘤效果，因此该病毒对治疗癌症十分有用。

[0006]换句话说，本发明涉及一种含有单链负链RNA病毒的抗癌剂，和该抗癌剂的制备方法，以及利用该RNA病毒抑制癌症的方法，更加具体的说，涉及到权利要求各项中记载的发明。并且，引用同一权利要求的权利要求中记载的一个或者数个组合的发明也在那些权利要求中记载的发明中被描述。也就是说本发明是

[1]一种包含单链负链RNA病毒的抗癌剂

[2][1]中记载的抗癌剂，其中所述单链负链RNA病毒不编码外源蛋白质

[3][1]或者[2]中记载的抗癌剂，其中所述单链负链RNA病毒是感染性或者非感染性病毒粒子

[4][1]到[3]中任意一项记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒是基因组RNA-蛋白复合体

[5][1]到[4]中任意一项记载的抗癌剂，其中所述单链负链RNA病毒是副粘病毒

[6][5]中记载的抗癌剂，其中所述副粘病毒是仙台病毒

[7]一种抗癌剂的制备方法，其中包含将单链负链RNA病毒和药学上可容许的承运体或者媒体混合的步骤

[8]一种涉及包含向癌组织给药单链负链RNA病毒步骤的抑制癌症的方法

构造图简单的说明

[0007][图1]将GFP表达SeV，可溶型FGF受体表达SeV，和可溶型PDGFRa表达SeV向体内给药时的黑色素瘤的治疗效果的图解。

[图2]皮下接种了B16黑色素瘤细胞的增殖曲线图。

[图3]YAC-1靶细胞的⁶¹Cr释放结果图解

[图4]TRP2肽+EL-4的⁶¹Cr释放结果图解

实施本发明的最佳形态

[0008]本发明提供一种以包含单链负链RNA病毒为有效成分的抗癌剂(治癌剂)。在本发明中，RNA病毒是指带有RNA基因组的病毒。

作为本发明抗癌剂有效成分的RNA病毒，最优选为单链负链RNA病毒。所谓单链负链RNA病毒，是指包含以负链RNA(与编码病毒蛋白的(+)子链互补的(-)子链)为基因组的病毒。负链RNA(miners strand RNA)又称否定链RNA(Negative strand RNA)。在本发明中使用的负链RNA病毒，特别是指例如单链负链RNA病毒(也称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。所谓「单链负链RNA病毒」，是指以单链负链[也就是负链]RNA为基因组的病毒。这样的病毒当中，包括属于副粘病毒科(包含副粘病毒属；副粘病毒，麻疹病毒属，腮腺炎病毒属，以及肺病毒属等)，棒状病毒科(包含弹状病毒属；水泡病毒属，狂犬病病毒属，以及短暂热病毒(Ephemerovirus)属等)，纤丝病毒科(Filoviridae)，正粘病毒科(包含正粘病毒属；流感病毒A，B，C，以及索戈托样病毒属等)，布尼亚病毒科(包含布尼亚病毒属；布尼亚病毒，亨德拉病毒属，内罗病毒属，以及白蛉热病毒属等)，沙粒病毒科(Arenaviridae)等科的病毒。

[0009]本发明中，优选的单链负链RNA病毒，例如可以是副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)，鸡新城疫病毒(Newcastledisease virus)，流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)，麻疹病毒(Measles virus)，RS病毒(Respiratory syncytial virus)，牛疫病毒(rinderpest virus)，犬瘟热病毒(distemper virus)，猴副流感病毒(SV5)，人副流感病毒1，2，3型，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)，棒状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)，狂犬病病毒(Rabies virus)等。

[0010]如果进一步举例说明本发明中可以利用的病毒，包含例如仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，犬瘟热病毒(PDV)，牛瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛疫病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，尼派病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，流行性腮腺炎病毒(Mumps)以及新城疫病毒(NDV)等。更优选的例如，包含仙台病毒(SeV)，人副流感病毒1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，犬瘟热病毒(PDV)，牛瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛疫病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，以及尼派病毒(Nipah)等病毒。

[0011]优选属于副粘病毒亚科(包括肺呼吸病毒属，腮腺炎病毒属以及麻疹病毒属)的病毒或者其衍生物，更优选属于来呼吸道合胞病毒属(genusRespirovirus)(也称副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或者其衍生物。在衍生物中，包含在不损伤病毒的基因导入能力而对病毒基因进行修饰以及化学修饰的病毒等。可适用于本发明的呼吸道合胞病毒属的病毒，例如包含人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(也称Sendai virus；鼠副流感病毒1型)，以及猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。在本发明中的副粘病毒，最优选的是仙台病毒。

[0012]作为本发明的单链负链RNA病毒，最优选是仙台病毒。

[0013]本发明中的单链负链RNA病毒可来源于天然株，野生型株、突变株、实验室传代株、以及人为构筑的病毒株等。也就是说，单链负链RNA病毒不论是从天然中分离出来的单链负链RNA病毒，还是通过基因重组人为制备出来的单链负链RNA病毒都可以使用。另外，在感染细胞中，只要保持有复制其基因组RNA的能力，野生型单链负链RNA病毒携带的任意基因都可以有变异或者缺损。例如，可以优选利用使编码单链负链RNA病毒的包被蛋白质或者外壳蛋白质的至少一个基因中发生突变或者缺损的单链负链RNA病毒。这种单链负链RNA病毒可以在感染细胞中复制RNA基因组，但是不能形成感染性病毒粒子。因此，不必担心会向周围扩大其感染，所以很安全。例如，可以利用不包含编码F、H、HN，或者G等包被蛋白质或者刺状蛋白质的至少一个基因，或者它们的组合的单链负链RNA病毒(WO00/70055以及WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。只要在基因组RNA中编码基因组复制时所必需的蛋白质(例如N、P以及L蛋白质)，就可以在感染细胞中扩增基因组。在制备缺损型病毒时，例如，在病毒产生细胞中外来地供给缺损的基因产物或者可以互补它的蛋白质(WO00/70055以及WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。但是，例如在单链负链RNA病毒中，如果是携带有M蛋白质基因的病毒的话，即使没有携带编码F蛋白质，HN蛋白质等刺状蛋白质的基因，也由于可以释放出非感染性的病毒粒子(VLP)，因此不需补充病毒蛋白质也可以制造VLP(WO00/70070)。另外，即使不携带任何一种包被蛋白质基因，由N、L、P蛋白质以及基因组RNA组成的RNP在细胞内可以进行扩增，所以通过对细胞裂解物进行离心分离等方法可以对RNP进行回收。

[0014]另外，利用突变型RNA病毒也可以制备本发明的抗癌剂。例如，已知在包被蛋白质，外壳蛋白质中有许多温度敏感性突变。在本发明中可以优选利用这些携带温度敏感性突变蛋白质基因的RNA病毒。所谓温度敏感性突变是指与低温(例如30℃到32℃)相比，在病毒宿主通常的温度(例如37℃到38℃)下，会使病毒活性显著下降的突变。这种携带温度敏感性突变的蛋白质由于可以在容许温度(低温)下制备病毒，所以十分有用。

[0015]例如，作为单链负链RNA病毒的M基因的温度敏感性突变，例如可以通过对由仙台病毒的M蛋白质中的G69、T166以及A183组成的任意选择部位上的氨基酸置换来举例说明(Inoue，M.et al.，J.Virol.2003，77：3238-3246)。其他单链负链RNA病毒M蛋白质相同部位上的氨基酸可以很容易地被确定，具体地，例如作为与SeV M蛋白质的G69相当的M蛋白质的相同部位来说，如果是人副流感病毒I型(HPIV-1)(括弧内省略)为G69、人副流感病毒III型(HPIV-3)为G73、犬瘟热病毒(PDV)以及牛瘟热病毒(CDV)则为G70、海豚麻疹病毒(DMV)为G71、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、以及牛疫病毒(RPV)为G70、亨德拉病毒(Hendra)以及尼派病毒(Nipah)为G81、人副流感病毒II型(HPIV-2)为G70、人副流感病毒IVa型(HPIV-4a)以及人副流感病毒IVb型(HPIV-4b)为E47、流行性腮腺炎病毒(Mumps)为E72等可被列举了出来(文字和序号表示的是氨基酸及其位置)。另外、对相当于SeV M蛋白質的T116的各M蛋白質的相同部位来说、如果是人副流感病毒I型(HPIV-1)为T116、人副流感病毒III型(HPIV-3)为T120、犬瘟热病毒(PDV)以及牛瘟热病毒(CDV)为T104、海豚麻疹病毒(DMV)为T105、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)以及牛疫病毒(RPV)为T104、亨德拉病毒(Hendra)以及尼派病毒(Nipah)为T120、人副流感病毒II型(HPIV-2)以及猴副流感病毒V型(SV5)为T117、人副流感病毒IVa型(HPIV-4a)以及人副流感病毒IVb型(HPIV-4b)为T121、流行性腮腺炎病毒(Mumps)为T119、新城疫病毒(NDV)为S120等可被列举出来。对相当于SeV M蛋白质的A183的各M蛋白质的相同部位来说、如果是人副流感病毒I型(HPIV-1)为A183、人副流感病毒III型(HPIV-3)为F187、犬瘟热病毒(PDV)以及牛瘟热病毒(CDV)为Y171、海豚麻疹病毒(DMV)为Y172、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)以及牛疫病毒(RPV)为Y171、亨德拉病毒(Hendra)以及尼派病毒(Nipah)为Y187、人副流感病毒II型(HPIV-2)为Y184、猴副流感病毒V型(SV5)为F184、人副流感病毒IVa型(HPIV-4a以及人副流感病毒IVb型(HPIV-4b)为F188、流行性腮腺炎病毒(Mumps)为F186、新城疫病毒(NDV)为Y187等可被列举出来。(文字和序号代表氨基酸及其位置)。在这里列举的病毒中，上述各个M蛋白质上三个部位的任意一个，优选是任意两个部位的组合，更优选是携带有编码三个部位的全部氨基酸被其他氨基酸置换后得到的变异M蛋白质的基因组的病毒，在本发明中是优选使用的。

[0016]氨基酸变异优选向与其侧链化学性质具有不同性质的其他氨基酸的置换，例如，置换成BLOSUM62基本值(Henikoff，S.and Henikoff，J.G(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)在3以下，优选2以下、更优选是1以下、更优选是0以下的氨基酸。具体地，仙台病毒M蛋白质的G69，T116以及A183或者其他病毒M蛋白质的相同部位，可以分别被置换成Glu(E)，Ala(A)以及Ser(S)。另外，也可以利用与麻疹病毒温度敏感株P253-505(MORIKAWA，Y.ET AL.，KITASATO ARCH，EXP，MED.1991：64；15-30)的M蛋白质的变异相同的变异。突变的导入，例如可以利用寡核苷酸等，根据众所周知的变异导入方法进行实施。

[0017]另外，作为HN基因的温度敏感性变异来说，例如可以通过对仙台病毒的HN蛋白质的由A262，G264以及K461组成的任意部位上的氨基酸置换来举例说明(Inoue，M.et al.，J.Virol.2003，77：3238-3246)。一个优选的例子，那就是仙台病毒HN蛋白质的A262，G264以及K461或者其他病毒HN蛋白质的相同部位分别被置换成Thr(T)，Arg(R)，以及Gly(G)。另外，例如，以流行性腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株URABE AM9为参考，在HN蛋白质的第464以及468位氨基酸中进行突变导入(WRIGHT，K.E.ETAL.，VIRUS RES。2000：67；49-57)。

[0018]另外，单链负链RNA病毒也可以在P基因或者L基因中有变异。作为这种变异，具体地，SeV P蛋白质的第86位的Glu(E86)变异，SeV P蛋白质的第511位的Leu(L511)被其他氨基酸置换，或者被置换成其他单链负链RNA病毒P蛋白质的相同部位等可被列举出来。具体地，第86位氨基酸被Lys置换，第511位氨基酸被Phe置换可以作为示例列举出来。另外，L蛋白质中，SeV L蛋白质的第1197位的Asn(N1197)和/或第1795位的Lys(K1795)被其他氨基酸置换，或者被其他单链负链RNA病毒L蛋白质的相同部位置换等可被列举出来。具体地，第1197位的氨基酸被Ser置换，第1795位氨基酸被Glu置换可以作为示例被列举出来。P基因以及L基因的突变可以显著提高持续感染性，对二次粒子的放出以及细胞毒性具有抑制效果。进一步地，通过组合包被蛋白质基因的变异和/或缺损，可以明显提高上述效果。

[0019]另外，在利用包被病毒时，可以使用在包被中含有与本来携带包被蛋白质不同的蛋白质的病毒。例如，在制备病毒时，通过在病毒产生细胞中表达所望的外源性包被蛋白质，可以制备含有该外源性包被蛋白质的病毒。对于这种蛋白质没有特殊的限制，可以使用对哺乳动物细胞有感染能力的所望的蛋白质。具体地，可以列举出水疱性口内炎病毒(Vesicularstomatitis virus；VSV)的G蛋白质(VSV-G)。VSV-G蛋白质可以是来源于任意VSV株的蛋白质，例如可以利用来源于INDIANA血清型株(J.VIROLOGY39：519-528(1981))的VSV-G蛋白，但是并不局限于此。在本发明中使用的单链负链RNA病毒可以任意组合并含有来源于其他病毒的包被蛋白质。

[0020]另外，本发明的单链负链RNA病毒以它本身具有抗癌作用为特征。也就是说，该单链负链RNA病毒没有必要含有外源蛋白质或者编码该蛋白质的核酸。因此本发明涉及了一种包含不编码外源蛋白质的单链负链RNA病毒的抗癌剂。本发明的单链负链RNA病毒在基因组RNA中可以编码外源蛋白质或者外源基因，也可以不编码。即使是不编码外源蛋白质的单链负链RNA病毒也能发挥抗癌(治癌)作用，所以外源基因不是必需的。因此本发明有着如下优点，她可以利用野生型单链负链RNA病毒或者从天然中分离出来的单链负链RNA病毒(包含变异株)等所望的单链负链RNA病毒。例如本发明中使用的RNA病毒，可以使用不编码具有癌症治疗效果的蛋白质的RNA病毒。对于这种病毒，包含编码不具有癌症治疗效果的所望的外源蛋白质的RNA病毒，例如为了检测RNA病毒的导入情况，可以利用编码绿色荧光蛋白质(GFP)，荧虫素酶，各种标记肽等标记蛋白质的RNA病毒等。或者可以通过在单链负链RNA病毒中进一步附加有助于抗癌(治癌)作用的外源蛋白质或者外源基因，来进一步提高其治癌(抗癌)作用。

[0021]携带外源基因的重组单链负链RNA病毒的再构筑可以利用众所周知的方法进行。具体地，可通过下述的典型步骤来制备：(A)在表达病毒粒子形成时必要的病毒蛋白质的细胞中使编码单链负链RNA病毒基因组RNA的cDNA进行转录，(B)回收含有生成的病毒的培养上清。病毒蛋白质可以通过被转录的病毒基因组RNA来表达，也可以从基因组RNA以外的反式方式供给。在基因组RNA中，粒子形成时所必需的病毒基因缺损时，在病毒产生细胞中另外表达该病毒蛋白质，补充形成病毒粒子。为了在细胞内表达病毒蛋白质和RNA基因组，将其连接在适当启动子下游的载体导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中使编码该蛋白质及基因组RNA的DNA发挥作用。被转录的基因组RNA在病毒蛋白质存在的情况下进行复制，形成感染性病毒粒子。制备缺损有包被蛋白质等基因的缺损型病毒时，在病毒产生细胞中，可以表达缺损的蛋白质或者可以补充其机能的其他病毒蛋白质等。

[0022]例如、本发明的单链负链RNA病毒的制备可以利用以下众所周知的方法实施。(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587以及Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.andElliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。通过上述方法，可以使包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛疫病毒(rinderpest virus)、仙台病毒等在内的单链负链RNA病毒从DNA开始再构筑。在本发明中，负链RNA病毒、特别是单链负链RNA病毒、优选是副粘病毒科、更优选使用呼吸道合胞病毒属的病毒。

[0023]对单链负链RNA病毒中搭载的外源基因没有特殊的限制，但作为天然的蛋白质，例如荷尔蒙、细胞因子、生长因子、受体，细胞内信号分子、酶、抗体(包含全长抗体、Fab等抗体片断、单链抗体等在内)、肽等可被列举出来。蛋白质可以是分泌蛋白质，膜蛋白质，细胞质蛋白质、核蛋白质等。作为人工的蛋白质，例如，嵌和型毒素等融合蛋白质、负显性蛋白质(包含受体的可溶性分子或者膜结合型负显性受体)、缺损型细胞粘附分子以及细胞表面分子等可被列举出来。另外，也可以是附加了分泌信号、膜定位信号、或者核转移信号等的蛋白质。作为导入基因，通过使反义链RNA分子或者RNA切割型核酶等表达、可以抑制特定的基因机能。作为外源基因，如果利用显示有制癌作用的治疗用基因来调制病毒，可以进一步提高其制癌作用。

[0024例如、如果使用阻碍血管形成或者血管新生的基因，可以更加提高其抗癌效果。对于促进血管形成或者血管新生的基因，例如纤维芽细胞生长因子2(FGF2)(Baffour，R.et al.，J.Vasc.Surg.16(2)：181-91，1992)、内皮細胞生长因子(endothelial cell growth factor；ECGF)(Pu，L.Q.et al.，J.Surg.Res.54(6)：575-83，1993)、血管内皮生长因子/血管渗透性因子(vascular endothelialgrowth factor；VEGF/vascular permeability factor；VPF)(Takeshita，S.et al.，Circulation 90(5 Pt 2)：II228-34，1994；Takeshita，S.et al.，J.Clin.Invest.93(2)：662-70，1994)、肝细胞生长因子/散射(scatter)因子(hepatocyte growthfactor/scatter factor)(HGF/SF)等已被人们所知。使阻碍这些信号分子作用的编码分泌蛋白质的基因作为外源基因被利用已经成为可能。具体地，包含与上述信号分子或者其受体结合的抗体或者其抗原结合片断的多肽、该受体的可溶型蛋白质(携带配体结合部、不携带膜贯通领域的分泌型受体)等可被列举出来。特别是编码FGF受体(FGF-R)的可溶型多肽的单链负链RNA病毒可以显著提高对癌症増殖的抑制効果。因此，编码可溶性FGF-R的单链负链RNA病毒在本发明中是优选使用的。作为可溶性FGF-R，它可以利用天然的可溶型FGF-R，也可以利用由膜结合型的FGF-R(FGF-R1など)的细胞外结构域组成的片断(A.Hanneken and A.Baird，Investigative Ophthalmology &Visual Science，Vol 36，1192-1196，1995；Takaishi，S.et al.，Biochem BiophysRes Commun.，267(2)：658-62，2000；Seno M，et al.，Cytokine，10(4)：290-4，1998；Hanneken，A.，FEBS Lett.489：176，2001)。

[0025]另外，如果使细胞因子类表达的话，因为可以刺激免疫系统，从而提高对癌症的免疫应答，因此编码有细胞因子基因的单链负链RNA病毒是很有用处的。搭载有编码免疫刺激性细胞因子的基因的单链负链RNA病毒可以成为具有有效地肿瘤免疫诱导作用的抗癌药剂。例如，免疫刺激性细胞因子包含有、白细胞介素(例如IL-1alpha、IL-1beta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27)、干扰素(例如，IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma)、肿瘤坏死因子(TNF)、转移型生长因子(TGF)-beta、颗粒球集落刺激因子(G-CSF)、吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、颗粒球吞噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-2、Flt-3配体、Fas配体、以及c-kit配体、同时还包含其他免疫调节型蛋白质(趋化因子以及媒介分子等)。

[0026]这些细胞因子的氨基酸序列为本领域工作人员所周知的，关于IL-4，例如，包含Arai等(1989)、J.Immunol.142(1)274-282、关于IL-6，例如，包含Yasukawa等(1987)、EMBO J.、6(10)：2939-2945、关于IL-12，例如，包含Wolf等(1991)、J.Immunol.146(9)：3074-3081；关于IFN-alpha，例如包含Gren等(1984)J.Interferon Res.4(4)：609-617、以及Weismann等(1982) Princess Takamatsu Symp.12：1-22；关于IFN-beta，例如包含Accessionnumber NM_002176的139～636位的序列(氨基酸序列为NP_002167的22～187位)等序列可被列举出来(Derynck，R.et al.，Nature 285，542-547(1980)；Higashi，Y. et al.，J.Biol.Chem.258，9522-9529(1983)；Kuga，T.et al.，NucleicAcids Res.17，3291(1989))。另外，关于TNF，例如Pennica等(1984)Nature312：724-729、关于G-CSF，例如Hirano等(1986)Nature 324：73-76、关于GM-CSF，例如，Cantrell等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82(18)：6250-6254可以被参照。更具体地，编码GM-CSF的核苷酸序列，包含Accession number NM_000758的84～461位的序列(氨基酸序列为NP_000749的第18～144位)的序列可被列举出来。对于编码IL-4的核苷酸序列，包含Accession number NM_000589的443～829位的序列(氨基酸序列为NP_000580的第25～153位)的序列被可列举出来。信号肽序列可以置换成适当的其他蛋白质的信号肽序列。利用编码这些细胞因子的天然基因或者基因暗号的缩重，可以构筑编码机能性细胞因子的变异基因来利用。

[0027]另外，也可以通过基因修饰来表达这些细胞因子的修饰体。例如，关于具有前驱体以及成熟体两种形态的细胞因子(例如，通过信号肽的切断来生成活性片断，或者通过蛋白质的限定分解来生成活性片断等)，为了实现前驱体或者成熟体的任意一种形式的表达可对基因进行修饰。也可以利用其他修饰体(例如，将细胞因子的活性片断和异种序列(例如，异种信号肽)融合的蛋白质)来获得。

[0028]再者，作为本发明的重组病毒是指通过重组多核苷酸合成的病毒，或者该病毒的扩増产物。作为重组多核苷酸是指两端或者一端与自然状态不同方式结合的多核苷酸。具体地，重组多核苷酸是指通过人工来改变多核苷酸链的结合(切断和/或结合)的多核苷酸。重组多核苷酸集合了多核苷酸的合成、核酶处理、连接酶处理等、可以通过众所周知的基因重组方法来生成。重组病毒是通过表达由基因操作构筑的编码病毒基因组的多核苷酸，来进行病毒的再构筑生成的。例如，已知从编码病毒基因组的cDNA，来进行病毒再构筑的方法(Y.Nagai，A.Kato，Microbiol.Immunol.，43，613-624(1999))。

[0029]本发明中的基因是指遗传物质，包含被转录序列的正义链或者反义链的核酸。基因可以是RNA也可以是DNA。在本发明中，编码蛋白质的核酸被称为该蛋白质的基因。另外，一般来说，基因也可以不编码蛋白质，例如也可以利用编码核酶或者反义链RNA等机能RNA的基因。基因通常是天然或者人工设计的序列。此外，在本发明中，「DNA」包含单链DNA以及双链DNA。另外，所谓编码蛋白质是指，为使多核苷酸能够在适当的条件下表达该蛋白质，使其包含编码该蛋白质氨基酸序列的ORF的正义链或者反义链。

[0030]单链负链RNA病毒，根据需要可以在其病毒基因组RNA中以反义方式编码搭载基因。所谓病毒基因组RNA，是指具有与单链负链RNA病毒的病毒蛋白质一起形成核糖核蛋白复合体(RNP)，并且通过该蛋白质表达基因组中的基因，同时该RNA还具有被复制后形成子RNP的功能。一般来说，单链负链RNA病毒的基因组是由下述基本构造构成的，即在3′前导区(leader)区域和5′尾区(trailer)区域之间，病毒基因逐次以反义序列被排列。在每个基因的ORF之间，有转录终止序列(E序列)-介入序列(I序列)-转录开始序列(S序列)存在，由此编码每个基因ORF的RNA可以分别作为顺反子被转录。

[0031]作为编码单链负链RNA病毒的病毒蛋白质基因，NP、P、M、F、HN、以及L基因被包含在内。「NP、P、M、F、HN、以及L基因」分别是指编码病毒核蛋白(NP)，磷酸酶小亚基(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血凝活性和神经氨酸酶hemagolchain-noiraminidaza(HN)，以及磷酸酶大亚基(L)蛋白质的基因。对属于副粘病毒亚科的各病毒中的基因一般进行如下记述。一般地，NP基因(N基因)也可用″N″来表示。

呼吸道病毒属    NP  P/C/V  M  F HN  -      L

腮腺炎病毒属    NP  P/V    M  F HN  (SH)   L

麻疹病毒属      NP  P/C/V  M  F  H  -      L

[0032]例如，仙台病毒的每个基因的碱基序列的数据库序号为：关于NP基因：M29343、M30202，M30203，M30204，M5 1331，M55565，M69046，X17218、关于P基因：M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008、关于M基因：D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056、关于F基因：D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131、关于HN基因：D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131、关于L基因，要参照D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886。另外，例如编码其他病毒的病毒基因，关于N基因，CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV， AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；以及Tupaia，AF079780、关于P基因、CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；SeV，M30202；SV5，AF052755；以及Tupaia，AF079780、关于C基因CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1.M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；以及Tupaia，AF079780、关于M基因CDV，M12669；DMV Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；以及SV5，M32248、关于F基因，CDV，M21 849；DMV，AJ224704；HPN-1.M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3.X 05303，HPIV-4a，D 49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D 86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；以及SV5，AB021962、关于HN(H或者G)基因CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z 81358；PDV，Z36979；RPV，AF132934；SeV，U06433；以及SV-5，S76876。但是，已知关于每个病毒都有数个病毒株，根据毒株的不同，也存在除上述以外的序列组成的基因。

[0033]编码该等病毒蛋白的ORF以及外源基因的ORF，在基因组RNA中通过上述的E-I-S序列以反义形式被配置。在基因组RNA中，离3′端距离最近的ORF仅在3′前导区(leader)区域和该ORF之间需要配置S序列，E以及I序列都是没有必要的。另外，在基因组RNA中离5′端距离最近的ORF在5′尾区(trailer)区域和该ORF之间，只需要有E序列即可，I以及S序列是没有必要的。另外在两个ORF之间，例如可以利用IRES等序列，将它们以同一顺反子进行转录。在该情况下，这两种ORF之间不需要E-I-S序列。例如，野生型副粘病毒，其典型的RNA基因组是继3′前导区(leader)区域之后，以反义形式编码的N、P、M、F、HN、以及L蛋白等6种ORF被逐次排列，在其后面，有5′尾区(trilar)末端区域。本发明的基因组RNA，病毒基因的配置可以不受上述限制，但是优选与野生型病毒相同，即继3′前导区(leader)区域之后，使编码N、P、M、F、HN、以及L蛋白的ORF顺次排列，在其后，配置5′尾区(trailer)区域。在某种特定病毒中，病毒基因与前述是不同的，在该情况下，也与上述方法相同，优选将各个病毒基因按与野生型同样进行配置。通常，保持N、P、以及L基因的病毒在细胞内自律地从RNA基因组中表达基因，基因组RNA被复制。进而，通过F以及HN基因等编码包被蛋白的基因，以及M基因的作用，可以形成感染性病毒粒子，并被释放到细胞外。因此，该病毒被称为具有传播能力的病毒。具有传播能力是指病毒在感染宿主细胞时，病毒在该细胞内被复制而生成感染性病毒粒子的过程。在本发明中，外源基因根据需要可以插入到该基因组的非蛋白编码区域中。

[0034]另外，本发明的单链负链RNA病毒，可以是缺损了任意的野生型病毒所含有基因的病毒。例如，缺失了M、F、或者HN基因，或者它们的组合的病毒也可优选用于本发明中。该病毒的再构筑，例如可以通过外来地供给缺损的基因产物来进行。如此制备出来的病毒，与野生型病毒一样，可以粘附于宿主细胞并引起细胞融合，但由于导入细胞内的病毒基因组缺损了病毒基因，所以不能形成与最初具有同样感染力的子病毒粒子。因此，作为仅具有一次性基因导入能力的较为安全的病毒是十分有用的。从基因组中缺损的基因，例如可以是F基因和/或HN基因。例如，表达缺损了F蛋白的重组单链负链RNA病毒基因组的质粒，通过与F蛋白的表达载体，以及与NP、P、以及L蛋白的表达载体同时转染宿主细胞，可以重新构筑重组病毒。(WO 00/70055，WO 00/70070，WO 03/025570；Li，H.-O.etal.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。另外，再如，也可以使用其染色体中整合了F基因的宿主细胞来制备病毒。该等蛋白群，其氨基酸序列可以不是来自病毒序列其本身，但只要其核酸导入活性和天然型等同或更高，就可以导入变异，或者代用其他病毒的同源基因。

[0035]另外，本发明中使用的病毒，可以制备成包被中包含与病毒基因组由来病毒的包被蛋白不同来源的蛋白的重组病毒。例如，在病毒再构筑时，通过在细胞内表达作为基本骨骼的病毒基因组中编码的原有包被蛋白以外的包被蛋白，可以制备拥有所望的包被蛋白的重组病毒。对于上述的蛋白并没有特殊的限制。可以使用具有细胞感染能力的所望的蛋白。例如，其他病毒的包被蛋白，例如，水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以来自任意的VSV株。例如，可以利用来自Indiana血清型株(J.Virology 39：519-528(1981))的VSV-G蛋白，但不限于此。另外，本发明的病毒，可以包含来自其他病毒的包被蛋白的任意组合。例如，该蛋白优选，来自感染人细胞的病毒的包被蛋白。关于该蛋白，并没有特殊的限制，例如也可以是逆转录病毒中的双嗜性病毒包被蛋白。作为逆转录病毒的双嗜性病毒包被蛋白，例如可以使用来自鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的包被蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV10A1的包被蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux，R.K.et al.，J.Virol.70：5701-5705(1996))。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白、EB病毒的gp350、gp220蛋白。作为嗜肝DNA病毒科的蛋白，可以举出B型肝炎病毒的S蛋白等。该蛋白质也可以制成上述蛋白的细胞外领域与F蛋白或者HN蛋白的细胞内领域相结合的融合蛋白来使用。如此，本发明中使用的病毒可以是假型病毒，其包含如VSV-G蛋白等来自基因组由来病毒以外的病毒的包被蛋白。将病毒的基因组RNA，设计成不编码该等包被蛋白的基因组时，病毒粒子感染细胞后，不会从该病毒中表达该蛋白。

[0036]另外，本发明中使用的病毒可以包含下列物质：例如，包被表面上附有能与特定细胞粘附的粘附因子、配体、受体等蛋白质、抗体或其片断、或者在胞外区域拥有上述蛋白，在胞内区域拥有来自病毒包被的多肽的嵌合型蛋白等。该等蛋白可由病毒基因组编码，也可以在病毒再构筑时，通过病毒基因组以外的基因(例如，其他的表达载体或者宿主染色体上等含有的基因)表达来提供。

[0037]另外，病毒，为了降低例如病毒蛋白质引起的免疫原性，或者为了提高RNA的转录效率或者复制效率，包含在病毒内的任意病毒基因可以从野生型基因修饰而来。具体地，认为例如修饰复制因子——N、P、以及L基因中的至少一个、可以提高转录或者复制功能。另外，包被蛋白之一的HN蛋白质具有红血球凝集素——血凝(hemagglutinin)活性和神经氨酸酶(neuraminidase)活性两种活性，例如可以通过减弱前者的活性，提高血液中病毒的稳定性。也可以例如通过改变后者的活性来调节感染能力。另外，通过改变F蛋白，可以调节细胞膜的融合能力。另外，例如，解析可成为细胞表面抗原分子的F蛋白和/或HN蛋白的抗原表位，利用该结果可以制备减弱的与这些蛋白相关的抗原提示能力的病毒。

[0038]另外，单链负链RNA病毒的附属基因可以缺损。例如，通过敲除SeV的附属基因之一的V基因，在不使培养细胞中的基因表达以及复制受到阻碍的同时，可使对小鼠等宿主的SeV病原性显著降低(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.71：7266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；Curran，J.et al.，WO 01/04272，EP1067179)。

[0039]单链负链RNA病毒，例如可以作为导入其携带的与其自身的抗癌作用具有相乘效果的所望外源基因的载体来使用。该载体，仅在宿主细胞细胞质中进行转录/复制，由于没有DNA相，所以也不会发生向染色体整合的现象。(integration)(Lamb，R.A.and Kolakofsky，D.，Paramyxoviridae：Theviruses and their replication.In：Fields BN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields of virology.Vol.2.Lippincott-Raven Publishers：Philadelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，不会在因染色体异常而引起癌化以及不死化等安全方面出现问题。单链负链RNA病毒的这些特征，大大地提高了将其作为载体使用时的安全性。在异源基因表达的结果中，例如，即使使仙台病毒(SeV)连续多代传代，也几乎确认不到碱基的突变，基因组的稳定性较高，而且经过长时间的观察得出了插入的异源基因很稳定的事实。(Yu，D.et al.，GenesCells 2，457-466(1997))。另外，由于不存在粒子的构造蛋白，而具备了在导入基因的大小或者粒子包装的弹性(flexibility)等性能上的优点。如此，单链负链RNA病毒可以作为对人的基因治疗用高效率载体来使用。例如，具有传播能力的SeV病毒，可以导入至少4kb的外源基因，通过附加转录单位，可以同时表达两种以上的基因。

[0040]另外，仙台病毒对于啮齿类来说具有病原性，会引起肺炎，但对人类来说没有病原性。该观点得到通过将野生型仙台病毒经鼻给药到非人类灵长类中，没有显示严重的有害作用的报告的支持。(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15：533-540，1997；Bitzer，M.et al.，J.Gene Med，.5：543-553，2003)。仙台病毒的这些特征，使得仙台病毒可以应用到人类的治疗上，由此，可以得出仙台病毒是对癌症的基因治疗的很有前途的选择之一的结论。

[0041]本发明的单链负链RNA病毒虽然不是必需的但是也可以在基因组RNA中编码外源基因。包含外源基因的重组病毒，是通过向病毒基因组中插入外源基因来得到的。对于外源基因，可以利用可期待与本发明的RNA病毒的抗癌作用具有相乘效果等的基因。外源基因可以是编码天然型蛋白质的基因，或者也可以是编码通过缺损、置换或者插入，使天然型蛋白质被修饰了的蛋白质的基因。外源基因的插入位置可以选择，例如病毒基因组的蛋白质非编码区域的所望部位，例如可以向基因组RNA的3′端前导区区域和距离3′端最近的病毒蛋白质ORF之间，各个病毒蛋白质ORF之间，和/或距离5′端最近的病毒蛋白质ORF和5′端尾区区域之间插入。另外，缺损F或者HN基因等的基因组中，可以向缺损区域插入编码外源基因的核酸。向副粘病毒导入外源基因时，插入到基因组的多核苷酸片断的链长应该为六的倍数。(Journal of Virology，Vol.67，No.8，4822-4830，1993)。在插入的外源基因和病毒ORF之间，应设计E-I-S序列。通过E-I-S序列，可以并列地插入2个或者2个以上的外源基因。

[0042]搭载于单链负链RNA病毒的外源基因的表达水平，可以通过附加在该基因上游(即单链负链(否定链)的3′侧)的转录起始序列的种类来调节。(WO01/18223)。另外，可以通过基因组上的外源基因的插入位置来控制，插入部位离单链负链的3′端越近其表达水平就越高，插入部位离5′端越近其表达水平也越低。如此，为了获得所望的基因表达量，并且为了使该基因与其前后的编码病毒蛋白的基因的组合变得最适合，对外源基因的插入位置可以进行适当地调节。一般认为取得较高水平的外源基因的表达是有利的，因此，将外源基因与效率高的转录起始序列连结后，插入到单链负链基因组的3端附近是最适合的。具体地，插入到3′前导区区域和距离3′端最近的病毒蛋白质ORF之间。或者，可以插入到距离3′端最近的病毒基因和第二近的病毒基因之间。野生型副粘病毒中，距离基因组的3′端最近的病毒蛋白质基因是N基因，第二近的基因是P基因。反过来，不希望导入基因高表达时，例如，也可以通过把外源基因的插入位置设定在单链负链基因组的尽量靠近5′端的一侧，把转录起始序列设定成效率较低的等，将其在病毒中的表达水平抑制在很低的水平，以达到最恰当的效果。

[0043]为了制备单链负链病毒，在哺乳动物细胞中，在包含病毒成分的RNP再构筑时所必需的病毒蛋白质，即在N、P、以及L蛋白质存在的情况下，使编码单链负链RNA病毒的基因组RNA的cDNA得到转录。可以通过转录生成负链基因组(也就是与基因组相同的反义链)，或者也可以生成正链(反义基因组，基因组RNA的互补链)，来进行病毒RNP的再构筑。为了提高单链负链RNA病毒的再构筑效率，优选生成正链。RNA末端应与天然的病毒基因组相同，尽量正确地反映3′前导区序列和5′尾区序列的末端。为了正确地控制转录产物的5′端，例如作为转录起始部位，可以利用T7 RNA转录酶识别序列，并在细胞内表达该转录酶。为了控制转录产物的3′端，例如在转录产物的3′端事先编码自我切割型酶(核酶，ribozyme)、通过该核酶(ribozyme)可以正确地切割出3′末端(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587以及Yu，D.et al.，1997，Genes Cells2：457-466)。

[0044]例如，含有外源基因的重组仙台病毒，依照Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587以及Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466的记载，可以进行如下构筑。

[0045]首先，准备包含目标外源基因cDNA碱基序列的DNA试料。DNA试料在25ng/ml以上浓度时，可优选通过电泳来确认其为单一的质粒。下面，以利用NotI部位，向编码病毒基因组RNA的DNA中插入外源基因来说明如何构建。在目标cDNA碱基序列中含有NotI识别序列时，优选事先通过利用部位特异性变异导入法等，另外还要不使编码的氨基酸序列发生变化的前提下改变碱基序列来除去NotI部位。从该材料中，通过PCR对目标基因片断进行扩增来回收。通过在两个引物的5′端中事先附加NotI序列，使被扩增的片断的两端具有NotI序列。并且，使在被插入到病毒基因组上后的外源基因的ORF和其两侧的病毒基因的ORF之间，配置有E-I-S序列，在设计时使引物中包含E-I-S序列。

[0046]例如，合成的正义侧DNA序列，为了保证由NotI进行的切割，在5′侧添加任意选择的2个以上的核苷酸(优选GCG以及GCC等不包含来自NotI识别部位序列的4个碱基，更优选ACTT)，其3′侧附加NotI识别部位GCGGCCGC，并且在此序列的3′侧附加作为间隔序列的任意9个或9的6倍数的碱基，再在其3′侧附加所望的cDNA的包含开始序列ATG在内的该ORF的约25个碱基序列。最后的碱基，优选使正义侧寡DNA的3′侧末端成为G或者C，来选择该所望cDNA的约25个碱基。

[0047]合成的反义侧DNA序列，在5′侧添加任意选择的2个以上的核苷酸(优选GCG以及GCC等不包含来自NotI识别部位序列的4个碱基，更优选ACTT)，其3′侧附加NotI识别部位GCGGCCGC，并且在此序列的3′侧附加为了调节长度而插入的寡DNA。该寡DNA的长度，应设计成使最终PCR扩増产物的NotI片断的链长为6的倍数的碱基数(即6的法则)(rule of six)」；Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72：891-899，1998；Calain，P. and Roux，L.，J.Virol.67：4822-4830，1993；Calain，P. and Roux，L.，J.Virol.67：4822-4830，1993)。在该引物中附加E-I-S序列时，在插入片断的寡DNA的3′侧附加仙台病毒的S序列，I序列以及E序列的互补链序列，优选各为5′-CTTTCACCCT-3′(序列号：1)，5′-AAG-3′，以及5′-TTTTTCTTACTACGG-3′(序列号：2)，并且再在其3′侧附加所望的cDNA序列的包含终止序列的逆向计数的约25个碱基的互补序列。反义侧合成寡DNA的3′侧末端的最后碱基，应成为G或者C。

[0048]PCR，通常可以使用Taq聚合酶或者其他的DNA聚合酶等。扩增了的目标片断被NotI消化后，插入到pBluescript等质粒载体的NotI部位。用测序仪确认得到的PCR产物的碱基序列后，选择序列正确的质粒。从该质粒中使用NotI切出该插入片断后，将其插入到包含基因组cDNA的质粒的NotI部位进行克隆。另外，也可以不通过质粒载体直接插入到基因组cDNA的NotI部位，来获取重组仙台病毒cDNA。

[0049]例如，如果是重组仙台病毒基因组cDNA，可以按照文献记载的方法进行构筑。(Yu，D.et al.，Genes Cells 2：457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997)。例如，以如下方法构筑下述质粒，将含有NotI识别部位的18bp的间隔序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′)(序列号：3)插入到被克隆的仙台病毒基因组cDNA(pSeV18(+))的前导区序列和N蛋白的ORF之间，并使其包含来自三角洲肝炎病毒的反义链(antigenomic strand)的自我裂解型核酶部位来获得质粒(pSeV18+b(+))(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 78：2813-2820)。在pSeV18+b(+)的NotI部位插入外源基因片断，以获得搭载有所望外源基因的重组仙台病毒cDNA。

[0050]如上所述，在病毒蛋白质(L、P、以及N)存在的条件下，通过在细胞内转录如上构筑的编码重组病毒基因组RNA的DNA，可以对病毒进行再构筑。

[0051]重组病毒的再构筑可以利用众所周知的方法进行。(WO97/16539；WO97/16538；WO03/025570；Durbin，A.P. et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P. et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，GenesCells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。通过上述方法，可以使包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛疫病毒(rinderpest virus)、仙台病毒等在内的单链负链RNA病毒从DNA再构筑。按照该等方法，可以对本发明的病毒进行再构筑。但在编码病毒基因组的DNA中缺损了F基因、HN基因、和/或M基因时，不会形成感染性的病毒粒子。另一方面，在宿主细胞中导入并使这些缺损了的基因和/或编码其他病毒包膜蛋白的基因等进行表达，可以形成具有感染性的病毒粒子。(Hirata，T.et al.，2002，J.Virol.Methods，104：125-133；Inoue，M.et al.，2003，J.Virol.77：6419-6429)。

[0052]具体制备程序为，(a)使编码单链负链RNA病毒基因组RNA(负链RNA)或者其互补链(正链)的cDNA在表达N、P、以及L蛋白质的细胞中进行转录的步骤，(b)回收包含生成的单链负链RNA病毒的培养上清的步骤。为了进行转录，将编码基因组RNA的DNA连接到适宜的启动子的下游。被转录的基因组RNA在N、L、以及P蛋白存在的条件下，被复制，形成RNP复合体。之后，在M、HN、以及F蛋白存在的条件下，形成被包膜包裹的病毒粒子。编码基因组RNA的DNA，例如与T7启动子的下游连结，通过T7 RNA聚合酶被转录成RNA。作为启动子，除了包含T7聚合酶的识别序列以外，还可以利用所望的各种启动子。或者，可以将在试管内转录合成的RNA向细胞转染来制备。

[0053]来自DNA的基因组RNA的最初转录，需要T7 RNA聚合酶等，可以通过导入表达该合成酶的质粒或者病毒载体来供给，或者，例如，为了诱导表达，可以事先将其导入细胞染色体中，通过在病毒再构筑时进行诱导表达来供给。另外，基因组RNA以及病毒再构筑时必要的病毒蛋白质，通过例如导入表达它们的质粒来供给。在供给这些病毒蛋白时，可以利用野生型或者特定的变异型负链RNA病毒等作为辅助病毒进行。

[0054]在向细胞内导入表达基因组RNA的DNA的方法中，例如有如下的方法，(i)制备可被靶细胞内摄的DNA沉淀物的方法、(ii)制备包含具有适合靶细胞的内摄，并且细胞毒性很少的带有正电荷特性的DNA的复合体的方法、(iii)在靶细胞膜中，使用电脉冲瞬间打开刚好能使DNA分子通过的大小的孔的方法等。

[0055]作为(ii)，各种各样的转染试剂可以被利用。例如，DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)等可被列举出来。作为(i)例如，可以举出使用磷酸钙的转染法，通过该方法，进入细胞内的DNA被贪食小胞吞食，并且已知有足量的DNA可进入核内(Graham，F.L. and Van Der Eb，J.，1973，Virology52：456；Wigler，M.and Silverstein，S.，1977，Cell 11：223)。Chen以及Okayama进行了转染技術的优化探讨，并报告了1)细胞和共同沉淀物的孵育条件为2～4％的CO2、35℃、15～24小时，2)DNA方面，与直链状相比环状的活性会更高，3)沉淀混合液体中的DNA浓度为20～30mg/ml时，可以得到最适合的沉淀(Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)。(ii)的方法适合瞬间转染。我们知道旧的做法是以所望的DNA浓度比来进行DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885 M.W.5×10⁵)混合液的调制，然后进行转染的方法。大多数复合体在核内体中被分解，因此为了提高效果，可以加入氯奎(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。(iii)的方法又叫做电气穿孔法，由于没有细胞选择性与(i)或者(ii)的方法相比使用范围较广。转染効率在脉冲电流的持续时间，脉冲的形状，电场(电极间的间隙，电压)的强度，缓冲液的导电率，DNA浓度，细胞密度的最适宜条件下良好。

[0056]以上，在三个方法中，(ii)的方法操作比较简单，并且可以利用大量的细胞来检测大量的检体，所以为进行病毒再构筑而向细胞内转导DNA时，使用转染试剂的方法是最合适的。优选，SuperfectTM TransfectionReagent(QIAGEN，Cat No.301305)、或者DOSPER Liposomal TransfectionReagent(Roche，Cat No.1811169)可以使用，但不限制此。

[0057]从cDNA开始进行病毒再构筑时，具体地可以按如下方法进行。

在24孔到6孔的多孔培养皿或者100mm培养皿等中，利用含有10％牛胎儿血清(FCS)以及抗生物质(100U/ml青霉素G以及100μg/ml链霉素)的最少必需培养基(MEM)，将来自猴肾的细胞株LLC-MK2(ATCC CCL-7)培养至满底，例如在1mg/ml补骨脂素(psoralen)存在的条件下，将经紫外线(UV)照射处理20分失活的表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒vTF7-3(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986、Kato，A.et al.，Genes Cells 1：569-579，1996)以2 PFU/细胞进行感染。补骨脂素(psoralen)的添加量以及UV照射时间都可以进行适当地调整。感染1小时后，将2-60μg，更优选3-20μg的编码重组仙台病毒基因组RNA的DNA与病毒RNP生成时必要的编码病毒蛋白的质粒(0.5-24μg的pGEM-N、0.25-12μg的pGEM-P、以及0.5-24μg的pGEM-L)(Kato，A.et al.，Genes Cells1：569-579，1996)一起，通过使用Superfect(QIAGEN社)的lipofectin法等进行转染。使编码N、P、以及L蛋白的表达质粒的量比为，优选例如2∶1∶2，质粒的量为例如，在1-4μg的pGEM-N、0.5-2μg的pGEM-P、以及1-4μg的pGEM-L左右进行适当调整。

[0058]转染了的细胞，可以根据需要，使用100μg/ml的利福平(rifampicin)(Sigma)以及阿糖胞苷(AraC)、或者更优选在仅含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，不含血清的MEM中培养，以由痘病毒引起的细胞毒性被控制到最低，并使病毒的回收率最大化为基准，来设定药剂的最适合的浓度(Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579)。转染后培养48-72小时后回收细胞，进行反复三次的冻结融解，破坏细胞后，把含有RNP的裂解物添加到LLC-MK2细胞中，再一次进行转染，培养。或者，回收培养上清后添加到LLC-MK2细胞的培养液中，进行感染，培养。转染，例如可以与Lipofectamine或者多聚阳性脂质体(polycationic liposome)等一起形成复合体，导入细胞。具体地，可以利用各种转染试剂。例如，DOTMA(Roche)、SuperfectTM(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)等。为了防止在核内体(endosome)中被分解，可以加入氯喹(chloroquine)(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。在RNP被导入的细胞中，进行RNP中的病毒基因的表达以及RNP的复制过程，由此病毒被扩增。通过将得到的病毒溶液(培养上清)稀释后(例如10⁶倍)反复进行再扩增，可以完全除去痘病毒vTF7-3。再扩増，例如可以反复进行三次或以上。得到的病毒可以在-80度下保存。为了再构筑缺损了编码包被蛋白质的基因的没有传播能力的病毒，可以利用表达包被蛋白质的LLC-MK2细胞，或者与包被蛋白表达质粒一起转染为好。另外，对进行了转染的细胞，通过与表达包被蛋白质的LLC-MK2细胞进行覆层培养，可以使包被基因缺损型病毒得到扩增。(参照国际公开序号 WO00/70055以及WO00/70070)。

[0059]回收了的病毒的力价，例如，可以通过CIU(Cell-Infected Unit)测定或者红血球凝集活性(HA)的测定来决定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virusof Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)。另外，关于搭载了GFP(绿色荧光蛋白质)等标记基因的病毒，以标记为指标可以通过直接记数感染细胞来定量力价(例如作为GFP-CIU)。这样测定出来的力价可以和CIU同等对待(WO00/70070)。

[0060]只要能够进行病毒再构筑，对于再构筑用宿主细胞没有特别的限制。例如，在仙台病毒等的再构筑中，可以使用来自猴肾脏的LLC-MK2细胞以及CV-1细胞、来自仓鼠肾脏的BHK细胞等培养细胞、和来自人的细胞等细胞。通过使上述细胞表达适当的包被蛋白，可以获得在包被中含有该蛋白的感染性病毒粒子。另外，为了大量地获取仙台病毒，使从上述宿主中得到的病毒在发育鸡卵中进行感染，以使该病毒进行增殖。使用鸡卵的病毒的制造方法已经被开发(中西等人编，(1993)，「神经科学研究的尖端技术操作记录III，分子神经细胞生理学」，厚生社，大阪，pp.153-172)。具体地，例如，把受精卵放入培养器中，在37-38度的温度下，培养9-12天，使胚胎成长。然后，将病毒向尿膜腔内接种后，培养卵数日(例如三天)，使病毒繁殖。培养时间等的条件，可以根据重组仙台病毒的不同而不同。其后，回收含有病毒的尿液。尿液中的仙台病毒载体的分离/纯化等可以按照通常方法进行。(田代真人，「病毒实验操作记录」，永井、石滨监修，medicalview社，pp.68-73，(1995))。

[0061]例如，缺损了F基因的仙台病毒的构筑和制备可以按照如下方法进行(参照WO00/70055以及WO00/70070)。

[0062]<1>F基因缺损型仙台病毒基因组cDNA以及F表达质粒的构筑

将仙台病毒(SeV)全长基因组cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 78：2813-2820)(「pSeV18+b(+)」也叫做「pSeV18+」)的cDNA在SphI/KpnI中消化，回收片断(14673bp)，并在pUC18中进行克隆，作为质粒pUC18/KS。F基因缺损部位的构筑在上述的pUC18/KS上进行。F基因的缺损通过PCR-连接酶法的组合来进行，其结果除去F基因的ORF(ATG-TGA＝1698bp)，例如，以atgcatgccggcagatga(序列序号：14)序列进行连结，构筑F基因缺损型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。使用引物对，F基因的上游[forward：5′-gttgagtactgcaagagc/序列序号：15，reverse：5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/序列序号：16]，F基因的下游[forward：5′-atgcatgccggcagatga/序列序号：17，reverse：5′-tgggtgaatgagagaatcagc/序列序号：18]进行扩增的PCR产物用EcoT22I进行连结。由此获得的质粒用SacI和SalI进行消化后，回收包含F基因缺损部位区域的片断(4931bp)，并在pUC18中进行克隆，构筑pUC18/dFSS。然后，pUC18/dFSS在DraIII中消化，回收片断，与pSeV18+中包含F基因区域的DraIII片断进行置换连接，得到质粒pSeV18+/ΔF。外源基因，插入到例如pUC18/dFSS的F基因缺损部位上的限制酶NsiI以及NgoMIV部位上。为此，例如，可以把外源基因片断在以NsiI识别序列为末端的引物以及以NgoMIV识别序列为末端的引物对中进行扩增。

[0063]<2>诱导表达SeV-F蛋白的辅助细胞的制作

如下构筑表达仙台病毒的F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型表达质粒：把SeV-F基因在PCR中进行扩增，然后插入到利用Cre DNA重组酶来使基因产物被诱导表达而设计的质粒pCALNdlw(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)的特异性SwaI部位，构筑质粒pCALNdLw/F。

为了从F基因缺损基因组回收感染病毒粒子，建立了表达SeV-F蛋白的辅助细胞株。细胞，例如，可以使用常用于SeV增殖的来自猴肾脏的细胞株LLC-MK2细胞。LLC-MK2细胞在添加了10％左右的经热处理的非活化牛胎儿血清(FBS)、青霉素G钠50单位/ml，以及链霉素50μg/ml的MEM中，在37度，5％CO2下进行培养。由于SeV-F基因具有细胞破坏性，使用通过CreDNA重组酶诱导表达F基因产物而设计的上述质粒pCALNdLw/F，通过磷酸钙法(mammalian transfection kit(Stratagene))，按照众所周知的操作规程对LLC-MK2细胞进行基因导入。

用10cm培养皿培养LLC-MK2细胞直到长满底至40％，导入10μg的质粒pCALNdLw/F后，在含有10ml的10％FBS的MEM培养基中，在37度的5％CO2的培养箱中，培养24小时。24小时后，剥离细胞，悬浮于10ml的培养基中，用5个10cm的浅底培养皿，5ml的1个，2ml的2个，0.2ml的2个顺次播埋细胞，在10ml含有1200μg/ml的G418(GIBCO-BRL)，和10％FBS的MEM培养基中进行培养，每2天交换1次培养基，持续培养14天后，进行基因稳定导入株的选择。对于在该培养基中生长出来的对G418表现有抗性的细胞克隆进行回收。回收了的各个克隆细胞在10cm的培养皿上继续扩大培养，直到长满底。

F蛋白的诱导表达是使细胞在6cm的浅底培养皿中长满底后，通过将腺病毒AxCANCre按照齐藤等人的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.23：3816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121(1998))例如以moi＝3进行感染来获得。

[0064]<3>F基因缺损型SeV病毒的再构筑以及扩增

将上述插入了外源基因的pSeV18+/ΔF的质粒按照如下方法转染到LLC-MK2细胞中。将LLC-MK2细胞以5×10⁶cells/皿的浓度铺于100mm平板上。利用T7 RNA聚合酶进行基因组RNA转录时，细胞培养24小时后，在补骨脂素(psoralen)存在下用MOI 2左右的用长波长紫外线(365nm)处理20分钟后的表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))，在室温下感染1小时。对痘病毒的紫外线照射，例如可以使用安装有15瓦特的5个电子管的UVStratalinker 2400(目录序号400676(100V)，Stratagene社，La Jolla，CA，USA)。将细胞用不含血清的MEM洗净后，将表达基因组RNA的质粒、以及分别表达单链负链RNA病毒的N、P、L、F、以及表达HN蛋白质的质粒用适当的转染药剂对该细胞中进行转染。对于质粒的数量比并没有特殊限制，但最优选的比例按顺序为6∶2∶1∶2∶2∶2。例如，将表达基因组RNA的质粒、N、P、L、以及表达F加上HN蛋白质的表达质粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L以及pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.，Genes Cells1，569-579(1996))分别以12μg，4μg，2μg，4μg以及4μg/皿的量比进行转染。经过数小时的培养后，在不含血清的MEM中反复两次清洗细胞后，在含有40μg/mL的阿糖胞苷(AraC：Sigma，St.Louis，MO)以及7.5μg/ml的胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中进行培养。细胞被回收后，将沉淀物质悬浮于OptiMEM中(10⁷细胞/ml)。反复三次进行冻结融解，与lipofection试剂DOSPER(Roche#1811169)混合，(106cells/25μl DOSPER)在室温下放置15分钟后，在上述克隆的F表达辅助细胞中进行转染(10⁶细胞/孔，12孔平板培养皿)，在不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC，7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培养，回收上清。F以外的基因，例如缺损HN或者M基因的病毒也可以相同的方法调制。

[0065]再者，本发明的单链负链RNA病毒不是重组病毒，即便是天然的病毒也可以使用。关于各RNA病毒的纯化方法、増殖方法、单离株的获得方法，可以参照病毒学実験学各論、改订二版(国立预防卫生研究所学友会编、丸善、1982)。例如，副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙台病毒等的副流感病毒，其各型都可以在猴肾脏(MK2)、人类胎儿肺部、肾脏、羊膜的初代培养细胞、以及胰蛋白酶添加Vero细胞中很好的进行増殖(同上，p334；Itoh H et al.，Jap.J.Med.Sci.Biol.23，227(1970))及回收。至于纯化，可以用庶糖密度勾配离心法、平衡离心法等进行纯化(p336)。麻疹病毒可以在猴由来的各种细胞中进行很好的増殖(Matsumoto M，Bact.Rev.30，152(1966))Vero细胞使用范围是最广的，但也可以使用CV1，FL，KB，HeLa，HEp2等细胞进行増殖(p351)。狂犬病病毒等的棒状病毒科(Rhabdoviridae)，利用组织培养法，可以使用BHK、CE以及Vero细胞等。对于纯化，可以将感染3到4天的培养液纠正到pH7.4以上，利用低速离心法除去细胞碎片并进行浓缩(p376)。拉撒病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)，在体外继代培养的几乎所有的细胞中都能得到很好的増殖，但对HK-21/13S细胞进行感染后，只能在琼脂中以悬浮的方式培养才可以得到増殖(SedwikW.D.，J.Virol.1，1224(1967))(p240)。流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae)可以在发育鸡卵，及MDCK细胞中进行増殖(p295)。纯化方面，可以通过离心法、对红血球的吸附·游离等纯化方法(Laver W.G.，Fundamental Techniques in Virology，82(1969))等进行纯化(p317)。

[0066]在本发明的一个实施方案中，对通过单链负链RNA病毒导入的外源基因，并没有特殊的限制，作为天然蛋白质，例如荷尔蒙、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号分子、酶、肽等可被列举出来。蛋白质可以是分泌蛋白质、膜蛋白质、细胞质蛋白质、核蛋白质等。对于人工蛋白质，例如，嵌合型毒素等的融合蛋白质、负显性蛋白质(包含受体的可溶性分子或者膜结合型负显性受体)、缺损型细胞粘附分子以及细胞表面分子等可被列举出来。另外，可以是附加了分泌信号、膜定位信号、或者附加了核移位信号等的蛋白质。对于导入基因，使反义链RNA分子或者RNA切割型核酶等进行表达，可以抑制特定基因的机能。作为外源基因，如果利用疾患治疗用基因来调制本发明的病毒时，可以将对该病毒进行给药，并且以此进行基因治疗。

[0067]如果按照本说明书中记载的病毒制备方法，本发明的病毒，例如可以1×10⁵CIU/ml或以上、优选1×10⁶CIU/ml或以上、更优选5×10⁶CIU/ml或以上、更优选1×10⁷CIU/ml或以上、更优选5×10⁷CIU/ml或以上、更优选1×10⁸CIU/ml或以上、最优选5×10⁸CIU/ml或以上的力价被释放到病毒产生细胞的细胞外液中。病毒的力价可以根据本说明书以及其他的记载方法来测定。(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。

[0068]为了使回收的病毒达到基本纯，可以对其进行纯化。纯化方法包括过滤，离心分离，吸附，以及柱层吸纯化等众所周知的纯化/分离方法，或者通过上述任意的组合来进行。所谓「基本纯」是指在包含病毒的溶液中，该病毒为主要成分。例如，基本纯的病毒蛋白质组份，占其所在溶液中包含的全蛋白质(但是要去除作为传递体或者稳定剂添加的蛋白质)的10％或以上(重量/重量)、优选20％或以上、更优选50％或以上、更优选70％或以上、更优选80％或以上、更优选90％或以上来确认。例如，副粘病毒，作为具体的纯化方法，例如可以使用纤维素硫酸酯或者架桥多糖硫酸酯的方法(特公昭62-30752号公报、特公昭62-33879号公报、以及特公昭62-30753号公报)、以及褐藻多糖硫酸酯和/或吸附其分解物质的方法(WO97/32010)等，但不限于此。

[0069]本发明的单链负链RNA病毒，例如，可以是感染性病毒粒子也可以是非感染性病毒粒子。另外，本发明的RNA病毒也可以是基因组RNA蛋白复合体(ribonucleoprotein complex；RNP)。利用这些病毒粒子或者复合体时，优选将该病毒粒子或复合体与脂转染试剂混合后体内给药。例如将脂转染试剂(lipofectamine)或多价正电荷脂质体等和病毒粒子或复合体混合，然后将该混合物体内给药(WO00/70055)。对于该方法，可以利用各种转染试剂。例如，可以使用DOTMA(Boehringer))、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer)#1811169)等方法。为了防止在核内体中被分解，可以加入氯奎(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。

[0070]关于本发明中的包含单链负链RNA病毒抗癌药剂的制备方面，单链负链RNA病毒在必要时可以与药理学上可容许的所望承运体或者媒介混合(结合)。也就是说，本发明提供了包含单链负链RNA病毒和药理学上可容许的承运体或者媒介混合的步骤的抗癌药剂的制备方法。

[0071]所谓「药学上可容许的承运体或者媒介」是指可以与单链负链RNA病毒一同给药，并且不明显阻碍单链负链RNA病毒的感染的材料。这样的承运体或者媒介，例如脱离子水、杀菌水、塩化氯化钠溶液、糊精溶液、糊精以及氯化钠、含有乳酸的林格氏溶液、培养液、血清、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等可被列举出来，这些与单链负链RNA病毒适当进行组合，然后制成制剂。另外，根据需要，先通过离心法进行浓缩后，在培养液或者生理盐水等生理性溶液中重新悬浮。另外，还可以包含核糖体的膜安定化剂(例如胆固醇等的固醇类)。另外，还可以包含抗酸化剂(例如生育酚或者维他命E等)。进一步地，其他还可以包含植物油，悬浮剂，表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。另外还可以添加保存剂，及其他添加剂。本发明的组成物通常是水溶液、胶囊、悬浮液、糖浆等形态。另外本发明的病毒组成物可以是溶剂，冻干剂，或者是气溶胶等形态的组成物。若为冻干剂时作为稳定剂，可以包含山梨(糖)醇、庶糖、氨基酸以及各种蛋白质等。

[0072]本发明中的单链负链RNA病毒具有抗癌活性，通过对肿瘤(癌组织)进行给药，可以发挥抗癌(制癌)的作用。也就是说本发明涉及到了包含向癌组织给药单链负链RNA病毒(体内给药)的步骤、和癌症的抑制方法(癌细胞增殖的抑制方法、或者癌症的治疗方法)。

[0073]例如，对于癌症患者，可以进行癌症的治疗。这种方法是包含了给药单链负链RNA病毒(本发明的抗癌剂)的步骤的方法。具体地，是包含了对患者进行单链负链RNA病毒的治疗有效量的给药步骤的方法。通过本方法，与本发明的不给药单链负链RNA病毒的情况相比，可期望抑制癌细胞的增殖。单链负链RNA病毒可以是不携带外源基因的病毒，或者也可以是携带编码癌抗原、免疫刺激性细胞因子、阻碍血管新生等一个或者多个蛋白质的基因(外源基因)。

[0074]本发明可以适用于所望的固形癌、例如舌癌、牙龈癌、恶性淋巴肿瘤、恶性黒色素肿瘤(黒色素瘤)、上颚癌、鼻癌、鼻腔癌、喉头癌、咽喉癌、神经胶肿瘤、髓膜肿瘤、神经胶肿瘤、肺癌、乳癌、胰腺癌、消化道癌症(食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌)、扁平上皮癌、腺癌、肺泡上皮癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、横纹肌肿瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、软骨肉肿等可被列举出来。给药对象的癌症优选为上皮癌，更优选是包含皮肤扁平上皮癌、皮肤基底细胞癌、癌前皮炎、乳头乳晕炎性癌变、皮肤恶性黒色素肿瘤等的皮肤癌。

[0075]本发明的单链负链RNA病毒(本发明的抗癌剂)的体内给药量因疾患、患者的体重、年龄、性别、症状、给药组合物的形态、给药方法、导入基因等不同而不同，如果是从事本行业者，可以进行适当的调整。给药途径可以进行适当的选择，例如可以是经皮、鼻腔内、气管内、肌肉内、腹腔内、静脉内、关节内、或者皮下给药等。并且可以是局部也可以是全身给药。被给药的病毒优选浓度大约为10⁵CIU/ml-10¹¹CIU/ml、更优选10⁷CIU/ml-10⁹CIU/ml、最优选1×10⁸CIU/ml-5×10⁸CIU/ml，在药理学上可容许的承运体中给药。在人体中，优选一次给药量为2×10⁵CIU-2×10¹¹CIU；给药次数为一次或者在临床上可容许副作用的范围内，反复多次给药；一天的给药次数也与此相同。关于人类以外的动物，例如，可以用靶动物与人的体重比或者给药靶部位的容积比(例如平均值)来换算上述给药量，然后给药换算后的剂量。并且，具有传播性的单链负链RNA病毒给药到个体或者细胞后，在治疗结束后有必要抑制病毒繁殖时，可以给药RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂，可以不对宿主造成损伤而很特异地抑制病毒的繁殖。

[0076]进行本发明的单链负链RNA病毒给药时，优选是对患者的癌病巢进行给药。作为癌病巢，是指癌组织或者其周围(例如距离癌5mm以内、优选是3mm以内)的领域。再者，给药量根据癌的类型及程度、导入基因的有无等来适当调节。单链负链RNA病毒即使不搭载外源基因也可以得到预期的抗肿瘤效果，但是期待更显著的相乘效果，例如，可以使IFN-beta基因或者可溶性FGF受体基因等在RNA病毒中搭载。

[0077]单链负链RNA病毒的给药次数为一次或者在临床上可容许的副作用的范围内可以进行重复给药，一天的给药次数也是一样的。至于给药对象没有什么特殊的限制，例如，其中包含了包括鸟类，人类以及非人类的哺乳动物在内的哺乳动物，具体包括鸡，鹌鹑，小白鼠，大鼠，狗，猪，猫，牛，兔子，山羊，绵羊，猴子以及人类等。对人类以外的动物进行给药时，例如以靶动物和人类之间的体重比来换算给药上述给药量。

[0078]另外本发明涉及了单链负链RNA病毒的在癌治疗方面的使用。另外本发明还涉及了单链负链RNA病毒的、在抗癌剂(或者制癌剂、癌増殖抑制剂等)制备方面的使用。

[0079]另外，本发明还涉及了包含单链负链RNA病毒的包装，是有关在癌的抑制中记载有使用该单链负链RNA病毒的包装。单链负链RNA病毒可以在培养液或者生理盐水等溶液中进行悬浮。所谓癌抑制上的使用，例如单链负链RNA病毒或者包含此病毒的組合物，作为肿瘤增殖抑制、癌的缩退、癌治疗、癌患者的处置·治疗、癌患者寿命的延长，或者抗癌药剂来使用。该记载可以在包装上直接记载，也可以将含有该记载的纸或贴纸包含在该包装内。包装可以是包含单链负链RNA病毒的容器、这种情况时，容器例如可以是瓶，软管，塑料袋，样品瓶，注射筒等。另外本发明的包装也可以是包含上述容器的袋子或者外包装。在包装中，单链负链RNA病毒的给药方法可以包含在记载的说明书中，也可以包含单链负链RNA病毒给药用的注射器、导管、和/或注射针等。

[0080]还有，本发明中还涉及作为组成成分至少包含单链负链RNA病毒的癌治疗用或者抗癌药剂制备用的试剂盒。本发明的试剂盒除了单链负链RNA病毒以外，还适当包含例如承运体，生理盐水，缓冲液，瓶，软管，塑料袋，样品瓶，注射筒等。另外，也可以把使用说明书包装在内。

[实施例]

[0081]以下通过实施例来对本发明进行更详尽的说明，但是本发明并不局限于这些实施例。

[0082]〔实例1〕不携带治疗基因的仙台病毒的抗肿瘤效果

把1×10⁵个黑色素肿瘤细胞株B16F1(ATCC CRL-6323)向C57BL/6小白鼠(六到八周龄、雌性)的腹部皮下接种(n＝4)。在接种后的第5天(day 5)到第12天(day 12)，将不携带特殊治疗基因的仙台病毒(表达GFP的SeV；SeV-GFP)、表达人可溶型FGF受体的仙台病毒(SeV-sFGFR)、或者人PDGFRα可溶型的仙台病毒(SeV-hsPDGFRα)各以1×10⁸PFU的量注射到肿瘤内，在这以后，定时地对肿瘤尺寸进行测定。

结果发现，所有的SeV给药群中，与SeV非给药群相比，肿瘤尺寸有明显的缩小。(图1)。如此，体内给药SeV，即使不携带治疗基因也可以发挥抗肿瘤的效果。给药表达可溶型FGF受体的SeV时，确认到了与SeV-GFP给药群相比具有更强的抑制肿瘤增殖的效果，而给药表达可溶型PDGFRα的SeV的抗肿瘤效果最为显著，肿瘤尺寸几乎没有增加。

综上所述，可以看出即使是不携带治疗基因等外源基因的SeV也可以充分发挥抗肿瘤效果。

[0083]〔实例2〕携带治疗基因(IFNβ)的仙台病毒的抗肿瘤效果

该实施例是举例说明RNA病毒的体内以及回体给药的肿瘤治疗方法。

作为肿瘤模型，采用了仅以非常低的水平表达MHC Class I的缺乏免疫原性的B16黑色素肿瘤的移植模型。肿瘤模型小白鼠，采用了C57BL/6的小白鼠(6到8周龄、雌性)(日本charles river laboratories)、树突状细胞是从C57BL/6的小白鼠(8周龄、雌性)(日本charles river laboratories)采样的。树突状细胞，是从C57BL/6小白鼠的股骨抽取骨髓、采用了SpinSep^TM，murine hematopoetic progenitor enrichmentcocktail(抗CD5抗体，抗CD45R抗体，抗CD11b抗体，抗Gr-1抗体，抗TER119抗体，抗7/4抗体、StemCelltechnology)、除去T细胞之后、添加IL-4以及GM-CSF，培养一周的时间。在第0天把1×10⁵/100ml的B16黑色素肿瘤细胞向小白鼠的腹部皮下(s.c.)接种。在第10天，第17天以及第24天的时候，给药未进行活化刺激的树突状细胞、在LPS中使之活化的树突状细胞(LPS DC)、或者通过导入SeV-GFP或表达小白鼠干扰素β的SeV-IFNβ而使之活化的细胞(分别为SeV GFP DC或者SeV IFNβ DC)到肿瘤组织周围。此时，同时进行了对树突状细胞的肿瘤抗原(对B16进行冻融获得的肿瘤裂解物)电脉冲导入后给药的实验。此外，在肿瘤接种后第10天(day 10)时还进行了把SeV-IFNβ直接注入到肿瘤中(intratumoral injection)，然后观察其抗肿瘤效果的实验。

向树突状细胞的SeV导入，如上所述，向培养1周时间的树突状细胞中使SeV-IFNβ以MOI 40进行感染、然后培养8小时。对肿瘤抗原进行电脉冲时，如上述那样回收培养了1周时间的树突状细胞，对成为肿瘤抗原的肿瘤裂解物(tumor lysate)进行电脉冲(DC∶tumor lysate＝1∶3)，培养18小时之后，以MOI 40感染SeV-IFNβ，并继续培养8小时。在这之后，回收这些树突状细胞，以5×10⁵到10×10⁵细胞数量给药到小白鼠的肿瘤周围。

[0084]如图2所示，通过把SeV-IFNβ直接注入肿瘤内部以及通过树突状细胞的回体给药都可以抑制肿瘤的增殖。特别是在DC/SeV-IFNβ处理的小白鼠中观察到了非常强的抑制肿瘤的效果。

[0085]在这里更加详尽的对上述各治疗群的抗肿瘤效果进行了验证。为了测试自然杀伤(NK)细胞的活性，对上述的各治疗群，进行了3次的DC疗法并在结束后的第7天从小白鼠中摘出脾脏，以制备效应细胞。作为靶细胞，利用Yac-1，进行⁵¹Cr释放测试。另外，为了对T淋巴球的细胞杀伤性进行测试，利用上述NK细胞活性测试时剩余的脾细胞，与B16的肿瘤抗原TRP-2肽一起，把培养了5天时间的细胞作为效应细胞来使用，与将mTRP-2肽进行脉冲的EL-4靶细胞一起培养，进行⁵¹Cr释放测试。特异的⁵¹Cr释放比例是按照以下方式计算的。

[(样品cpm-自发释放出的cpm)/(最大释放出的cpm-自发释放出的cpm)]×100

在这里，最大释放出是使用与1％的triton X一起温育了的靶细胞，自发释放出则使用了仅在培养液中温育了的靶细胞。

[0086]自然杀伤(NK)细胞的活化在直接注入了SeV的小白鼠中可以被观察到，在树突状细胞给药群中并不能检测出来(图3)。与此相比，细胞杀伤性T淋巴球(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)的活化在DC/LPS处理群以及DC/SeV-IFNβ中处理了的小白鼠中最为明显，而DC/SeV-GFP处理群与前者相比稍微弱一些，在SeV-IFNβ的直接注入群中不能检测出该活性(图4)。肿瘤裂解物的电脉冲对肿瘤增殖或者CTL应答都没有明显的影响。如此，可以判明SeV-IFNβ的直接给药可以给予NK细胞很强的活性。

因此，上述结果显示了SeV给药时的肿瘤抑制效果，是以NK细胞的活化为机制。进一步地，在给药不携带治疗基因的SeV之上，再通过给药携带可期待具有治疗效果的基因的SeV时，显示了其对癌症可发挥出更加有效的治疗效果。

[产业上的可利用性]

[0087]本发明提供了一种以单链负链RNA病毒为有效成分的抗癌剂。本发明的RNA病毒在不携带具有治疗效果的外源基因的状态下，可以发挥有效的癌治疗效果，由此，我们认为该特点可以在削减因外源基因的导入而消耗的成本、以及因病毒的调制而消耗的操作时间等方面将会有很大的贡献。本发明使由单链负链RNA病毒进行的新的病毒疗法成为可能。

序列表

<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)

<120>含有单链负链RNA病毒的抗癌剂

<130>D3-A0307Y1P2

<150>JP 2004-187028

<151>2004-06-24

<150>PCT/JP2004/16089

<151>2004-10-29

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>1

ctttcaccct                                            10

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>2

tttttcttac tacgg                                      15

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>3

cggccgcaga tcttcacg                                   18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>4

atgcatgccg gcagatga                                   18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>5

gttgagtact gcaagagc                                   18

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>6

tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc       42

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>7

atgcatgccg gcagatga                                  18

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的序列

<400>8

tgggtgaatg agagaatcag c                              21

Claims (8)

1.一种包含单链负链RNA病毒的抗癌剂。

2.权利要求1中记载的抗癌剂，其中所述单链负链RNA病毒不编码外源蛋白质。

3.权利要求1或2中记载的抗癌剂，其中所述单链负链RNA病毒为感染性或者非感染性病毒粒子。

4.权利要求1到3的任意一项中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒为基因组RNA-蛋白复合体。

5.权利要求1到4的任意一项中记载的抗癌剂，其中所述单链负链RNA病毒为副粘病毒科病毒。

6.权利要求5中记载的抗癌剂，其中所述副粘病毒科病毒为仙台病毒。

7.一种抗癌剂的制备方法，其中包含将单链负链RNA病毒和药学上可容许的承运体或者媒介混合的步骤。

8.一种抑制癌症的治疗方法，包含将单链负链RNA病毒向癌组织给药的步骤。

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