KR101506751B1 - 수상세포의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복수의 사이토카인의 존재하에서 DC 전구세포를 배양하는 공정을 포함하는, DC의 제조방법, 제조된 수상세포 및 그의 이용을 제공한다. 본 발명의 방법은, DC로의 높은 분자능을 갖는 대량의 DC 전구체를 제조하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 의해, 적은 DC 전구세포로부터 대량의 DC를 얻는 것이 가능해지기 때문에, DC를 사용한 항종양 면역요법 및 감염증치료 등에 있어서 투여하는 DC 수를 늘리는 것이 용이해져, DC 백신의 효과 증대가 기대된다.
Description
본 발명은 수상세포의 제조방법, 제조된 수상세포 및 그의 이용에 관한 것이다.
수상세포(dendritic cell; DC)는 말초혈액, 피부, 림프기관 및 흉선 등에 존재하는 항원제시세포(APC)의 하나로, 림프조직 및 비림프조직에 널리 분포하고 있다(Steinman, R. M. 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:271; Banchereau, J.B. 및 R.M. Steinman, 1998, Nature 392:245 참조). 수상세포는 강력한 항원제시능을 가져, 수상세포 상의 MHC 클래스 I, 클래스 II에 항원 펩티드를 발현시켜, 각각 CD4, CD8 T세포를 활성화한다. 이것에 의해 특정 항원(병원미생물의 항원, 종양 관련 항원, 이식항원 등)에 대한 생체 내의 면역응답을 유도한다.
DC가 갖는 높은 면역 유도능은, 많은 종양에 대한 면역요법(DC 치료)에 유용하다. 본 발명자 등은 이전, 마우스에 있어서 센다이 바이러스(SeV)로 자극한 DC가 강력한 항종양효과를 갖는 것을 나타내어 왔다(S. Shibata et al., J. Immunol, 2006 177: 3564-3576; Yoneyama, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 355:129-135). 그런데 항종양효과는 접종하는 DC의 수에 의존한다. 임상에 있어서도, 접종하는 DC의 수량이 치료효과에 크게 관여하는 것으로 생각되는데, 환 자의 용태에 따라서는, 채취 가능한 DC 전구세포(DC progenitors)의 수가 한정되는 경우가 많이 있을 것으로 예상되어, 결과적으로 얻어지는 DC의 수가 충분하지 않기 때문에 치료효과가 불충분해질 가능성이 있다. 따라서, 한정된 DC 전구세포를 효율적으로 증폭시키는 방법이 요구되고 있다.
비특허문헌 1: Steinman, R. M., 1991, Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296
비특허문헌 2: Banchereau, J.B. 및 R.M. Steinman, 1998, Nature 392: 245-252
비특허문헌 3: Shibata, S. et al., J. Immunol, 2006 177: 3564-3576
비특허문헌 4: Yoneyama, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 355:129-135
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 대량의 수상세포를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
DC 전구세포를 효율적으로 증폭하여 DC로 분화시키는 방법을 개발하기 위해, 본 발명자 등은, DC 전구세포를 다양한 사이토카인의 첨가에 의해 기간을 바꿔가면서 배양하고, 그 후에 DC를 분화시킨 후, DC의 표면 마커를 지표로 증폭된 세포를 분석하였다. 그 결과, DC 전구세포를 줄기세포인자(Stem cell factor; SCF) 및 인터류킨(IL)-3를 포함하는 배지에서 배양하면, DC 전구세포는 현저한 증식을 나타내는 것을 발견하였다. SCF 및 IL-3에 더하여, Flt-3 리간드 및 IL-6도 첨가한(즉, Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 IL-6(FS36으로 약기)를 포함) 배지에서 배양하면, DC 전구세포는 더욱 현저한 증식을 나타내었다. 증식된 세포를 GM-CSF 및 IL-4, 또는 GM-CSF 및 SCF에 의해 분화시켜서 얻어진 DC의 수는, 채취 직후부터 분화시킨 경우와 비교하면 수백배에 달하였다. 특히 FS36으로 약 3주간 배양한 후에 분화시킨 세포집단은, DC의 비율이 현저히 높아, FS36에 의한 약 3주간의 배양이 DC의 증폭법으로서 매우 우수한 것이 판명되었다. 증폭 후에 얻어진 세포는, 종래의 분화방법에 의해 얻어진 DC와 마찬가지로, RNA 바이러스의 감염 또는 LPS 등에 의해, 보조자극분자(co-stimulatory molecules)인 CD80 및 CD86의 발현이 증강되는 것이 확인되었다. 또한, 인간 CD34+ 세포를 GM-CSF 및 SCF를 포함하는 배지에서 배양하는 것으로도, DC가 현저히 증식되는 것을 발견하였다. 얻어진 DC는, 상기와 마찬가지로, LPS에 의해 CD86의 발현이 증강되는 것이 확인되었다. 이와 같이 본 발명은, DC 전구세포를 대량으로 증폭시키는 방법, 및 얻어진 DC 전구세포를 높은 효율로 DC로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다. 이들 방법에 의해 제조된 DC는 암이나 감염증 등에 대한 면역요법에 유용하다.
즉 본 발명은, 수상세포의 제조방법, 제조된 수상세포 및 그의 이용 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,
[1] 수상세포를 제조하는 방법으로서, 수상세포 전구세포를 복수의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
[2] 복수의 사이토카인이 과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 줄기세포인자(SCF)인, [1]에 기재된 방법.
[3] 수상세포 전구세포는 인간 유래의 세포인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 상기 공정이 수상세포 전구세포를 GM-CSF 1 ng/㎖ 이상, 및 SCF 0.5 ng/㎖ 이상의 존재하에서 배양하는 공정인, [2] 또는 [3]에 기재된 방법.
[5] 상기 공정이 수상세포 전구세포를 GM-CSF 10 ng/㎖ 이상, 및 SCF 5 ng/㎖ 이상의 존재하에서 배양하는 공정인, [4]에 기재된 방법.
[6] 상기 공정이 수상세포 전구세포를 GM-CSF 1 ng/㎖~100 ng/㎖, 및 SCF 0.5 ng/㎖~50 ng/㎖의 존재하에서 배양하는 공정인, [4]에 기재된 방법.
[7] 상기 공정이 수상세포 전구세포를 GM-CSF 10 ng/㎖~100 ng/㎖, 및 SCF 5 ng/㎖~50 ng/㎖의 존재하에서 배양하는 공정인, [5] 또는 [6]에 기재된 방법.
등에 관한 것이다.
또한 상기 각 항에 있어서, 동일 항을 인용하는 각 항에 기재된 발명의 둘 또는 그 이상을 임의로 조합시킨 발명은, 그들에 인용되는 상위 항에 기재된 발명에 있어서, 이미 의도되어 있다. 또한, 본 명세서에 기재한 임의의 발명요소 및 그의 임의의 조합은, 본 명세서에 있어서 의도되어 있다. 또한, 그들 발명에 있어서, 본 명세서에 기재된 임의의 요소 또는 그의 임의의 조합을 제외한 발명도, 본 명세서에 의도되어 있다. 또한 본 명세서는, 명세서 중에 예를 들면 바람직한 것으로 되어 있는 특정 태양을 기재한 경우, 그것을 개시할 뿐 아니라, 그 태양을 포함하는 보다 상위의 본 명세서에 개시된 발명으로부터, 그 태양을 제외한 발명도 개시하는 것이다.
발명의 효과
수상세포는 높은 면역 유도능을 갖기 때문에, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 수상세포는, 암 및 감염증 등의 면역치료에 유용한 수상세포(DC) 백신으로서 유용하다. 예를 들면, 종양 면역치료에 관해서는, 수상세포에 종양항원을 제시시키기 위해, 종양세포의 세포 용해물(cell lysate)과 혼합, 펩티드로 펄스, 또는 수상세포에 종양항원 유전자를 도입하는 방법 등에 의해 항원을 제시시켜, 종양에 대한 DC 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면, 환자로부터 채취한 DC가 적더라도, 치료효과를 얻기에 충분한 세포수의 DC를 조제하는 것이 가능해진다.
도면의 간단한 설명
또한, 하기 도 1, 도 2, 도 4~도 10, 도 13, 도 15, 도 21(A), 도 21(B), 도 22(A), 도 28, 도 29에 기재된 그래프의 세로축 눈금의 표기는, 이하를 의미하는 것으로 한다.
1.E+04, 1e4, 또는 1.00E+04:1.0×104(개)
1.E+05 또는 1.00E+05:1.0×105(개)
1.E+06 또는 1.00E+06:1.0×106(개)
1.E+07 또는 1.00E+07:1.0×107(개)
1.E+08 또는 1.00E+08:1.0×108(개)
1.E+09 또는 1.00E+09:1.0×109(개)
1.E+10 또는 1.00E+10:1.0×1010(개)
1.E+11 또는 1.00E+11:1.0×1011(개)
1.E+12 또는 1.00E+12:1.0×1012(개)
도 1은 FS36 투여군, GMSCF 투여군, GMIL-4 투여군의 조건으로 배양한 DC 전구세포의 증식곡선을 나타내는 도면이다. FS36 투여군에서는 42일간 배양하였다.
도 2는 DC를 이하의 (i)~(iii)의 조건으로 조제한 과정을 나타내는 증식곡선을 나타낸 도면과, (1)·(2)·(3)시점에 있어서의 DC 및 DC 전구세포의 형태를 나타낸 사진이다. (1) 및 (3)시점에 있어서는, 수상돌기가 관찰되었다((3)). 각 DC는, 각각 이하 (i)~(iii)의 공정에서 조제하였다. (i) 전구세포를 FS36 투여군의 조건으로 42일간 배양하여 얻어진 DC. (ii) 전구세포를 FS36 투여군의 조건으로 21일간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 7일간 배양하여 얻어진 DC. (iii) 전구세포 GMIL-4 투여군의 조건으로 7일간 배양하여 얻어진 DC.
도 3은 DC 전구세포 증식 배양기간 중의 CD11b, c-kit, CD131 양성률의 추이를 나타내는 도면이다. 왼쪽의 칼럼이 CD11b+ 세포의 비율을, 가운데 칼럼이 c-kit+ 세포의 비율을, 오른쪽 칼럼이 CD131세포의 비율을 나타낸다. 도면에 기재된 각 샘플(1)~(6)은, 이하의 배양조건으로 제조한 DC다. (1): 통상 DC(normal DC). (2): FS36 투여군의 조건으로 1주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (3): FS36 투여군의 조건으로 2주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (4): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (5): FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (6): FS36 투여군의 조건으로 5주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것.
도 4는 FS36 투여군(1), GMIL-4 투여군(2), GMSCF 투여군(3)의 조건에 따른 1주간의 배양에 있어서의 DC 전구세포의 증식곡선, 및 CD11b+/CD11c+율을 나타내는 도면이다.
도 5는 각 샘플(1)~(4)에 있어서의, CD11b+/CD11c+율과 배양기간의 증식곡선을 나타내는 도면이다. (1)~(4)는 이하의 배양조건으로 제조한 DC이다. (1): FS36 투여군의 조건으로 1주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (2): FS36 투여군의 조건으로 1주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (3): GMIL-4 투여군의 조건으로 2주간 배양한 것. (4): GMSCF 투여군의 조건으로 2주간 배양한 것.
도 6은 각 샘플(1)~(2)에 있어서의, CD11b+/CD11c+율과 배양기간의 증식곡선을 나타내는 도면이다. (1)~(2)는 이하의 배양조건으로 제조한 DC이다. (1): FS36 투여군의 조건으로 2주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (2): FS36 투여군의 조건으로 2주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것.
도 7은 각 샘플(1)~(2)에 있어서의, CD11b+/CD11c+율과 배양기간의 증식곡선을 나타내는 도면이다. (1)~(2)는 이하의 배양조건으로 제조한 DC이다. (1): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (2): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것.
도 8은 각 샘플(1)~(2)에 있어서의, CD11b+/CD11c+율과 배양기간의 증식곡선을 나타내는 도면이다. (1)~(2)는 이하의 배양조건으로 제조한 DC이다. (1): FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (2): FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것.
도 9는 각 샘플(1)~(2)에 있어서의, CD11b+/CD11c+율과 배양기간의 증식곡선을 나타내는 도면이다. (1)~(2)는 이하의 배양조건으로 제조한 DC이다. (1): FS36 투여군의 조건으로 5주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것. (2): FS36 투여군의 조건으로 5주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것.
도 10은 DC 전구세포를 FS36 투여군의 조건에 따른 배양 후에, GMIL-4 투여군 또는 GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 기간의 세포수의 추이, 및 얻어진 CD11b+ CD11c+ 세포수를 나타내는 도면이다.
도 11은 하기 (A)~(D)의 DC에, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)(도면 중에서는 DC(SeV)로 표기) 또는 LPS(도면 중에서는 DC(LPS)로 표기)를 첨가하고 2일 후의 CD80, CD86, MHC class II, 및 CD40의 발현량의 비교를 나타내는 도면이다. 아무것도 첨가하지 않은 대조(도면 중에서는 DC(NT)로 표기)의 결과도 나타내었다. 도면 중의 (A)~(D)에서 나타내고 있는 것을 사용한 DC는, 이하와 같다. (A): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC. (B): 통상 DC(normal DC). (C): FS36 투여군의 조건으로 2주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC. (D): FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC.
도 12는 하기 (A)~(D)의 DC에, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF) 또는 LPS를 첨가하고 2일 후의 CD80, CD86, 및 CD40의 발현량의 비교를 나타내는 도면이다. 아무것도 첨가하지 않은 대조(DC(NT))의 결과도 나타내었다. 도면 중의 (A)~(D)에서 나타내고 있는 것을 사용한 DC는, 이하와 같다. (A): GMSCF 투여군의 조건으로 1주간 배양함으로써 얻어진 DC. (B): FS36 투여군의 조건으로 2주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC. (C): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC. (D): FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC.
도 13은 인간 CD34+ 세포의 증식곡선을 나타내는 도면이다. GMIL-4 투여군(1) 또는 GMSCF 투여군의 조건의 배지 중에서의 세포의 증식을 나타낸다.
도 14는 인간 CD34+ 세포의 CD11c+율의 추이를 나타내는 도면이다. GMIL-4 투여군(1) 또는 GMSCF 투여군의 조건의 배지 중에서 세포를 배양하고, CD11c+율의 추이를 결정하였다.
도 15는 인간 CD34+ 세포로부터 얻은 CD11c+ 세포수(전세포×CD11c+율)의 추이를 나타내는 도면이다. GMIL-4 투여군(1) 또는 GMSCF 투여군의 조건의 배지 중에서 세포를 배양하고, CD11c+ 세포수를 측정하였다.
도 16은 GMSCF 투여군의 조건으로 35일간 배양한 인간 CD34+ 세포와, 35일간의 마지막 3일간에 LPS로 자극한 인간 CD34+ 세포의 CD86의 발현량의 비교를 나타내는 도면이다. 인간의 제대혈 유래 DC 전구세포는, GM-CSF와 SCF로 증폭과 동시에 분화된다.
도 17은 FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 DC의 ELISA법에 의한 사이토카인 생산량을 검토한 결과이다. DC에, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)(도면 중에서는 SeV로 표기하고 있다) 또는 LPS(도면 중에서는 LPS로 표기하고 있다)를 첨가하고 2일 후의 배양상청액(105 cells/㎖)을 샘플로서 사용하여, 사이토카인 생산량을 측정하였다. 도면 중의 DC(NT)는, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF) 또는 LPS를 첨가하지 않은 샘플을 나타낸다. GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 DC에 있어서, 사이토카인 처리되지 않은 DC와 마찬가지로, IL-12 및 IFN-β의 생산이 확인되었다. 도면 중의 (1)~(4)의 상세는, 이하와 같다. (1): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC에 있어서의, IFN-β의 생산량의 측정결과. (2): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC에 있어서의, IL-12의 생산량의 측정결과. (3): 통상 DC(normal DC)에 있어서의, IFN-β의 생산량의 측정결과. (4): 통상 DC(normal DC)에 있어서의, IL-12의 생산량의 측정결과.
도 18은 FS36 투여군의 조건에 의해 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC에, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF) 또는 LPS를 첨가하고 2일 후의 FITC-dextran 흡수능(endo-phagocytotic activity)을 측정하였다. 도면 중의 DC(NT)는, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)(도면 중에서는 SeV로 표기하고 있다) 또는 LPS(도면 중에서는 LPS로 표기하고 있다)를 첨가하지 않은 샘플을 나타낸다. DC의 FITC-dextran(MW=40,000) 흡수는 37℃에서 활발하고, 4℃에서 저해된다. 각 반응은 37℃ 및 4℃에 있어서, FITC-dextran 1 ㎎/㎖로 30분 흡수시켰다. FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC는, 항원 흡수능을 보유하고 있었다. 도면 중의 (1)·(2)의 상세는, 이하와 같다. (1): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC에 있어서의 측정결과. (2): 통상 DC(normal DC)에 있어서의 측정결과.
도 19는 FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC에 대해서 T cell(C57BL/6)에 대한 증식자극의 강도를 측정하였다. 또한, T세포는 모두 106세포로 하였다. FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC는, T세포의 증식·활성화능을 보유하고 있다. (1): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC(F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)나 LPS에 의한 자극을 행하지 않은 샘플)에 있어서의 측정결과. (2): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC에 있어서, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)를 첨가하고 2일 후의 샘플에 있어서의 측정결과. (3): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC 전구세포에 있어서, LPS를 첨가하고 2일 후의 샘플에 있어서의 측정결과. (4): 통상 DC(normal DC)(F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)나 LPS에 의한 자극을 행하지 않은 DC)에 있어서의 측정결과. (5): 통상 DC(normal DC)에 있어서, F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)를 첨가하고 2일 후의 샘플에 있어서의 측정결과. (6): 통상 DC(normal DC)에 있어서, LPS를 첨가하고 2일 후의 샘플에 있어서의 측정결과. (7): 동계 림프구에 의한 혼합배양에 따른 샘플의 측정결과. (8): 통상 DC(normal DC)자체(T세포 없음)의 측정결과.
도 20은 FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC에 대한 인비보(in vivo)에서의 치료효과를 검토하였다. 도면 중의 샘플(1)~(4)의 상세는, 이하와 같다. (1): DC를 투여하지 않은 마우스에 있어서의, 폐로의 전이 결절 수의 계수 결과. (2): 통상 DC(normal DC)를 마우스의 꼬리정맥에 투여한 마우스에 있어서의, 폐로의 전이 결절 수의 계수 결과. (3): FS36 투여군의 조건으로 2주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC를 마우스의 꼬리정맥에 투여한 마우스에 있어서의, 폐로의 전이 결절 수의 계수 결과. (4): FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC를 마우스의 꼬리정맥에 투여한 마우스에 있어서의, 폐로의 전이 결절 수의 계수 결과.
도 21은 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 증식분화곡선을 나타내는 도(A) 및 도(B)와 증식된 세포의 CD11c 양성세포의 비율을 나타낸 도(C)이다. 도(B)는 도(A)에 있어서의 샘플(5)의 투여군 및 샘플(6)의 투여군에 있어서의, 배양기간 0일부터 15일의 기간에 대한 상기 세포의 증식에 대해서, 상세하게 나타낸 것이다. 또한, 다른 실험에 있어서 GMSCF 배지 중에서 5주간 배양한 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 FACS 해석 결과를 도(D)에 나타내었다(CD11c 양성률 88.87%). 도(D)의 검게 칠한 그래프는 CD11c 항체의 결과를, 흰색 그래프는 아이소타이프 컨트롤(iso)의 결과를 나타낸다. 도(D) 중의 오른쪽 수치는 CD11c 항체, 왼쪽 수치는 아이소타이프 컨트롤(iso)에 있어서의 M1영역의 세포수의 비율(%)을 나타낸다. 도(A)의 샘플(1)~(8)의 상세는, 이하와 같다. 또한, 도(A) 및 도(B)에서 기재되어 있는 샘플(1)~(8)의 표기 말미의 A~E는, 각각 상이한 피험자 유래 세포의 결과인 것을 나타내고 있다. (1)~(5): GMSCF 투여군의 조건으로 배양. (6): GMIL4 투여군(2)의 조건으로 배양. (7) 및 (8): GMIL4 투여군(1)의 조건으로 배양.
도 22는 인간 G-CSF 처치 말초혈 유래 CD34+ 세포의 증식곡선을 나타내는 도(A)와 증식된 세포의 CD11c 양성세포의 비율을 나타낸 도(B)이다. 도면의 샘플(1)~(3)의 상세는, 이하와 같다. 도(A)에서 기재되어 있는 샘플(1)~(3)의 표기 말미의 A 및 B는, 각각 상이한 피험자 유래 세포의 결과인 것을 나타내고 있다. (1) 및 (2): GMSCF 투여군의 조건으로 배양. (3): GMIL4 투여군(1)의 조건으로 배양.
도 23은 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, GMSCF 투여군의 조건으로 35일간 배양한 시점의 세포에 대해서, 수상돌기의 유무에 대해 확인한 결과이다. 패널 B는 패널 A의 중앙의 샘플(GMSCF 투여군의 조건으로 5주간 배양 후, LPS로 48시간 자극한 것)의 확대도이다. 수상돌기를 명확히 확인할 수 있다.
도 24는 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 14일(2W) 또는 35일(5W) 시점의 세포(GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 세포)에 대해서, CD11b, CD33, HLA-ABC 발현을 해석한 결과이다.
도 25는 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포에 대해서, LPS 처리 또는 SeV/dF 처리한 경우에 있어서의, ICAM-1, CD86, HLA-DR, CD40, CD80, 및 CCR7의 발현을 해석한 결과이다. 또한, 도면 중의 표기는 이하와 같다. iDC: iDC 처리, SeV: SeV/dF 처리, LPS: LPS 처리.
도 26은 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포(GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 세포)에 대해서, 미성숙 DC(iDC), 또는 LPS를 첨가하고 2일 후의 DC의 FITC-dextran 흡수능(endo-/phagocytoic activity)을 측정하였다. 수상세포의 FITC-dextran(MW=40,000) 흡수는 37℃에서 활발하고, 4℃에서 저해된다. 각 반응은 37℃ 및 4℃에 있어서, FITC-dextran 1 ㎎/㎖로 30분 흡수시켰다. 상기 세포는, 수상세포와 같이, FITC-dextran(MW=40,000) 흡수는 37℃에서 활발하고, 4℃에서 저해되는 결과가 되었다.
도 27은 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포(GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 세포)에 대해서, ELISA법으로 사이토카인 생산량을 검토한 결과이다. 상기 배양한 세포에, 하기 소정의 처리를 행하였다. 상기 처리 후의 배양상청액(105 cells/㎖)을 샘플로서 사용하여, 사이토카인 생산량을 측정하였다. 도면 중의 NT는 하기 소정의 처리를 행하지 않은 샘플을 나타낸다. 또한, 「소정의 처리」란, 구체적으로는 이하를 가리킨다. (1) iDC 처리: 도면 중에서는 iDC로 표기하고 있다. (2) SeV/dF 처리: 도면 중에서는 SeV로 표기하고 있다. (3) LPS 처리: 도면 중에서는 LPS로 표기하고 있다. (4) Poly(I:C) 처리: 도면 중에서는 Poly(I:C)로 표기하고 있다. (5) CpG 처리: 도면 중에서는 CpG로 표기하고 있다. (6) R-848 처리: 도면 중에서는 R-848로 표기하고 있다. (7) OK432 처리: 도면 중에서는 OK432로 표기하고 있다.
도 28은 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포(도 21에 기재된 (1) 또는 (2)의 조건으로 배양한 세포)에 대해서, T세포(allogenic T cell from volunteer)에 대한 증식자극의 강도를 측정하였다. 또한, T세포는 모두 105세포로 하였다. 오른쪽 위의 패널에 있어서, DC 세포수가 1.00E+03(1×103개)의 결과가, DC:CD3+ T세포=1:100(혼합군 1)에 대응하고, DC 세포수가 1.00E+04(1×104개)의 결과가, DC:CD3+ T세포=1:10(혼합군 2)에 대응한다. iDC:iDC+T세포, SeV:SeV로 자극한 DC+T세포, LPS:LPS로 자극한 DC+T세포, iDC만:iDC만으로 T세포 없음, T만:T세포만.
도 29는 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 하기 (1)~(3)의 조건에 있어서의 배양결과이다. (1): GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 것(도면의 표기는, 「GMSCF」). (2): 0.1 GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 것(도면의 표기는, 「GMSCF0.1」). (3): 0.01 GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 것(도면의 표기는, 「GMSCF0.01」).
도 30은 상기 도 29의 별표(*)로 나타낸 시점(35일간 배양 시점)에 있어서의 각 조건으로 배양한 세포의 CD11c 양성세포율을 측정한 결과이다. 도면의 표기는 이하와 같다. (1) GMSCF: GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 것. (2) GMSCF0.1: 0.1 GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 것. (3) GMSCF0.01: 0.01 GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 것.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 수상세포 전구세포를 복수의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는, 수상세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 당해 공정에 의해, DC 전구세포를 효율적으로 증폭 및/또는 분화시킬 수 있다. 본 발명의 방법은, 복수의 사이토카인을 첨가한 배지 중에서, DC 전구세포를 배양함으로써 실시한다. 복수의 사이토카인으로서는, SCF 및 인터류킨-3(IL-3)를 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 FLT-3 리간드(FLT-3L) 또는 인터류킨-6(IL-6)를 추가적으로 포함한다. 즉, FLT-3L, SCF, IL-3, 및 IL-6 전부를 첨가한 배지를 적합하게 사용할 수 있어, 환자로부터 채취한 DC가 적더라도, 치료효과를 얻기에 충분한 세포수의 DC를 조제하는 것이 가능해진다.
더욱 바람직하게는, FLT-3L, SCF, IL-3, 및 IL-6 전부를 첨가한 배지의 존재하에서 배양한 공정 후에, (i) GM-CSF 및 IL-4, 또는 (ii) GM-CSF 및 SCF의 존재하에서 배양하는 공정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. DC 전구세포를 효율적으로 DC로 분화하는데 유효하다. 즉, 환자로부터 채취한 DC가 적더라도, 치료효과를 얻기에 충분한 세포수의 DC를 효율적으로 조제하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서 수상세포(Dendritic cell; DC)는, 성숙상태에 있어서 수지상 형태를 취하고, 항원을 제시하여 T세포를 활성화하는 능력을 갖는 세포이다. 또한 본 발명에 있어서 수상세포 전구세포란, 적당한 사이토카인(즉 G-CSF, GM-CSF, TNF-α, IL-4, IL-13, SCF(c-kit 리간드), Flt-3 리간드, 또는 그들의 조합)의 존재하에서 DC로 분화하는 세포를 말하고, 바람직하게는 4주간 이내, 보다 바람직하게는 20일 이내, 보다 바람직하게는 18일 이내, 보다 바람직하게는 16일 이내에 수상세포로 분화 가능한 세포이다. 이러한 세포에는 CD34+ 줄기세포, 조혈 원시세포, 골수단구핵 등을 들 수 있다. 이들 세포는, 예를 들면 세포분획으로서 조제할 수 있다. 세포분획이란, 세포의 분리(또는 분획)에 의해 얻어진 세포집단이다. 세포분획은, 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이면 된다. 담체로서는, 생리식염수, 인산완충 생리식염수(PBS), 배양액, 혈청 등, 생세포를 현탁할 수 있는 소망하는 용액을 들 수 있다. 수상세포로의 분화는, 예를 들면 SCF(50 ng/㎖), GM-CSF(500 U/㎖), TNF-α(50 ng/㎖)의 존재하에서 3일간 정도 배양 후, SCF(50 ng/㎖), GM-CSF(500 U/㎖), IL-4(250 U/㎖), TNF-α(50 ng/㎖)의 존재하에서 배양함으로써 실시하면 된다. 보다 바람직하게는, GM-CSF(20 ng/㎖) 및 IL-4(20 ng/㎖)의 존재하, 또는 GM-CSF(20 ng/㎖) 및 SCF(10 ng/㎖)의 존재하에서 배양한다.
수상세포에는, 생체 내 각종 조직기관에 분포하는 골수세포 유래의 수상돌기를 갖는 세포군, 및 골수 또는 혈액 유래의 줄기세포로부터, 인비트로(in vitro)에서 사이토카인 등을 이용하여 분화유도 처리한 생체 내 조직기관에 분포하는 수상돌기를 갖는 세포, 및 그것과 동등한 세포군이 포함된다. 구체적으로는, 수상세포에는, 예를 들면 림프구계 수상세포(Th2로의 유도 또는 면역관용을 유도하는 것이어도 된다), 골수구계 수상세포(일반적으로 사용되는 수상세포. 미숙 수상세포 및 성숙 수상세포를 포함한다), 랑게르한스세포(피부의 항원제시세포에서 중요한 수상세포), 상호연결세포(림프절, 비장의 T세포영역에 있어, T세포로의 항원제시에 작용하고 있는 것으로 생각되고 있는 세포), 여포 수상세포(B세포로의 항원제시세포로서 중요, 항원과 항체 복합체, 항원과 보체 복합체를 항체 리셉터, 보체 리셉터에 의해, 수상세포 상에 제시함으로써, B세포에 항원제시하고 있다.) 등을 포함하는 것으로, 바람직하게는, MHC 클래스 I 및 클래스 II를 고발현하고 있고, 더욱 바람직하게는 CD11c를 발현하고 있는 세포이다. 본 발명에 있어서는, 보다 바람직하게는 골수 또는 말초혈로부터 회수된 세포로부터 DC 또는 DC 전구세포가 사용된다. 또한 DC 유래 생물종은 특별히 한정되지 않고, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 랫트 등의 설치류, 토끼, 소, 염소 등의 포유류의 DC이면 된다.
또한, 수상세포는, 수지상 형태를 갖고, CD11c, HLA-class II(HLA-DR, -DP, 또는 -DQ), CD40, 및 CD1a로 이루어진 군으로부터 선택되는 표면 마커의 2개 이상이 양성의 세포여도 된다. 본 발명에 있어서 수상세포는, 보다 바람직하게는 HLA-calss II+ 및 CD11c+의 세포, 보다 바람직하게는 CD1a+, HLA-class II+, 및 CD11c+의 세포이고, 또한 계통 마커가 음성(Lin-), 즉 T세포 마커(CD3), B세포 마커(CD19, CD20), NK세포 마커(CD56), 호중구 마커(CD15), 단구 마커(CD14)를 발현하고 있지 않은 세포이다. 골수구계 수상세포(Myeloid DC)의 경우, CD11b를 추가적으로 발현하고 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, CD11b+ CD11c+ 세포는, 본 발명에 있어서 DC에 포함된다. 림프구계 수상세포(Lymphoid DC)에 있어서는, CD8을 추가적으로 발현하고 있어도 된다.
또한, 본 발명에 있어서 수상세포에는 성숙 수상세포 및 미성숙 수상세포가 포함된다. 미성숙 수상세포란, 성숙상태에 비해 T세포 활성화능력이 유의하게 낮은 수상세포를 말한다. 구체적으로는, 미성숙 수상세포는 LPS(1 ㎍/㎖)를 첨가하고 2일간 배양하여 성숙을 유도한 수상세포에 비해, 항원제시능이 1/2 미만, 바람직하게는 1/4 미만인 것이면 된다. 항원제시능은 예를 들면 알로 T세포 활성화능(혼합 림프구시험; 알로 T세포와 수상세포의 혼합배양으로, T세포:수상세포의 비율은 1:10으로 배양, 바람직하게는 그 비율을 변화시켜서 배양한 것으로, 배양 종료 8시간 전에 3H-thymidine을 첨가하여, 그 T세포의 DNA 내의 흡수량에 의해, T세포 증식능력을 정량한 것; 문헌 Gene Therapy 2000; 7; 249-254), 또는 펩티드를 사용한 특이적 세포상해성 T세포(CTL)의 유도능시험(수상세포에, 어느 항원의 어느 Class I 구속성의 기지의 펩티드를 첨가하여, 수상세포를 채취한 것과 동일한 건강한 정상인 말초혈의 T세포를 공배양(3일째 이후는 IL-2를 25 U/㎖, 바람직하게는 100 U/㎖)(바람직하게는 21일간 3회의 수상세포에 의한 자극, 더욱 바람직하게는 14일간 2회의 수상세포의 자극)하여, 얻어진 이펙터세포와 51Cr로 라벨된 타겟세포(Class I 구속성의 펩티드 양성 종양세포)를 100:1~2.5:1(100:1, 50:1, 25:1, 20:1, 12.5:1, 10:1, 5:1, 또는 2.5:1), 바람직하게는 10:1로 4시간 혼합배양하여 타겟세포의 51Cr 유출량으로 정량한 것(문헌 Arch Dermatol Res 2000; 292; 325-332))에 의해 정량할 수 있다. 또한 미성숙 수상세포는, 바람직하게는 항원 탐식능을 갖고, 더욱 바람직하게는 T세포 활성화를 위한 부자극을 유도하는 수용체의 발현이 저발현(예를 들면 상기와 같이 LPS 유도한 성숙 DC에 비해 유의하게) 또는 음성이다. 한편으로, 성숙 수상세포란 T세포 활성화 등을 위한 항원제시능력이 미성숙 상태에 비해 유의하게 높은 수상세포를 말한다. 구체적으로는, 성숙 수상세포는, LPS(1 ㎍/㎖)를 첨가하고 2일간 배양하여 성숙을 유도한 수상세포의 항원제시능의 1/2 이상, 바람직하게는 동등 이상의 항원제시능을 갖는 세포이면 된다. 또한 성숙 수상세포는, 바람직하게는 항원 탐식능이 낮거나, 또는 갖지 않으며, 더욱 바람직하게는 T세포 활성화를 위한 부자극을 유도하는 수용체의 발현이 양성인 것을 말한다. 또한, 수상세포의 활성화란, 미성숙 수상세포로부터 성숙 수상세포로의 이행을 말하고, 활성화 수상세포에는, 성숙 수상세포, 및 활성화 자극에 의해 부자극을 유도하는 CD80, CD86의 발현을 상승시키고 있는 도중 경과의 수상세포가 그 범주에 포함된다.
성숙 인간 수상세포는, CD40, CD80, CD86 및 HLA-class II의 발현이 양성인 세포이다. 예를 들면, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커를 토대로, 미성숙 수상세포와 성숙 수상세포를 구분할 수 있다. 미성숙 수상세포에서는 이들 마커는 약하거나, 바람직하게는 음성이나, 성숙 수상세포에서는 양성이다.
상기와 같이, 미성숙 수상세포는, 통상, 높은 탐식능을 보유하고 있다. 수상세포에 LPS(1 ㎍/㎖)를 첨가하고 2일간 배양하면, 수상세포는 활성화되어 탐식능은 저하된다. 탐식능은 수상세포 내로의 소분자의 흡수량 또는 흡수세포의 비율을 측정하여 알 수 있다. 바람직하게는, 탐식능은 수상세포 내로의 소분자의 흡수량으로 결정된다. 예를 들면, 직경 1 ㎛ 정도의 착색 비드를 사용하여, 수상세포 내로의 비드의 흡수를 측정할 수 있다. 4℃에서 양성이 되는 백그라운드를 빼고 정량한다. 높은 탐식능이란, 수상세포 내로의 소분자의 흡수량이, 수상세포를 상기와 같이 LPS(1 ㎍/㎖)로 2일간 자극한 수상세포의 4배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 6배 이상의 탐식능을 말한다. 또는, 소분자의 흡수세포의 비율이 2배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상이다. 낮은 탐식능이란, 수상세포 내로의 소분자의 흡수량이, LPS(1 ㎍/㎖)로 2일간 자극한 수상세포의 4배 미만, 보다 바람직하게는 2배 미만, 보다 바람직하게는 1.5배 미만이다. 또는, 소분자의 흡수세포의 비율로 측정한 경우에, 2배 미만, 보다 바람직하게는 1.5배 미만이다.
성숙 수상세포의 판별은 당업자가 통상 행하고 있어, 상기 각 마커 및 그 발현의 측정방법도 당업자에게 주지이다. 예를 들면 CD11c는 약 150 kD의 접착 당단백(p150, 인테그린 α사슬)이다. CD11c는 CD18과 결합하여 CD11c/CD18 복합체를 형성하고, 피브리노겐으로의 결합력을 가지며, 또한, iC3b 및 ICAM-1의 수용체가 되는 것이 보고되어 있다. 또한, CD11c/CD18은 자극을 받은 상피의 수용체에 결합하는 접착분자로서 작용할 수 있는 것이 보고되어 있다(Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Barclay, N.A. et al., eds., 1993, The Leucocyte Antigen FactsBook, CD11 Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124; Stacker, S.A. and T.A. Springer, 1991, J. Immunol. 146:648).
CD1a는 약 49 kD의 폴리펩티드로 β2 미크로글로불린과 결합한다. CD1a는 MHC class I 항원과 구조적으로 유사하여, 항원제시에 기능하는 것으로 인정된다(Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermatol. 95: 503; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Tissue Antigens 37: 1).
CD11b는 인테그리 αM 사슬, Mac-1, CR3, iC3bR(complement receptor type 3), Mo1으로도 불리는, 분자량이 약 165~약 170인 I형 막관통 당단백질이다. 보체(iC3b), 피브리노겐, 응고인자 X의 리셉터로서 기능하여, 식세포 운동(phagocytosis)에 관여한다(Todd R.F. et al. J. Immunol.,126,1435-1442 (1981); Leong A.S.Y. Appl. Immunohistochem. Surg. Pathol.,120-128 (1993); Todd R.F. et al. Hybridoma, 1, 329-337 (1982); Cobbold S. et al. Leucocyte Typing III, 788-803 (1987); Keizer G. et al. Eur. J. Immunol., 15,1142-1148. (1985); Laffon A. et al. J.Clin. Invest., 88, 546-552 (1991); Acevedo A. et al. J. Invest. Dermatol., 97, 659-666 (1991)).
CD11c(인테그린 αX 서브유닛, 또는 p150 백혈구 표면 항원)는, 인테그린 패밀리의 분자로, 다른 백혈구 인테그린(CD11a, CD11b, CD11d)과 마찬가지로, 인테그린 β2 서브유닛(CD18)과 비공유 결합적으로 결합하고 있다. CD11c는 분자량 145-150 kDa의 막관통 당단백으로, 수상세포의 마커로서 잘 알려져 있다(Molica S. et al. Blood, 81, 2466 (1993); Van der Vieren M. et al. Immunity, 3, 683-690 (1995); Hogg N. et al. Leucocyte Typing III, 576-602 (1987)).
CD14는 53-55 kD의 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커형 싱글 체인 당단백으로, 세망 수상세포(dendritic reticulum cell) 및 어느 종의 랑게르한스세포에서 발현한다. CD14는 LPS와 혈청 LPS 결합 단백질(LPB)의 복합체에 대한 고친화성 표면 수용체로서 동정되었다(McMichael, A.J. et al., eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Wright, S.D. et al., 1990, Science 249:1434).
CD40은 45-48 kD의 I형 막감입형 단백질(type I integral membrane glycoprotein)로, CD40는 세포 마커로서 자주 사용되고 있다(Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Galy, A.H.M.; and H. Spits, 1992, J. Immunol. 149: 775; Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et al., 1991, Cell 66: 233; Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press).
CD80은 약 60 kD의 막관통형 당단백으로, Ig supergene family의 일원이다. CD80은 T세포에서 발현하는 CD28 및 CD152(CTLA-4)의 리간드이다(Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Schwarts, R.H., 1992, Cell 71: 1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 845; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759; Freeman, G.J. et al., 1998, J. Immunol. 161: 2708; Behrens, L. et al., 1998, J. Immunol., 161(11):5943; Guesdon, J.-L. et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139).
CD83은 약 45 kD의 막관통 단백질로 Ig superfamily의 일원이다. CD83은 단쇄(短鎖)의 V형 Ig의 세포외 도메인과 C 말단의 세포질 tail을 갖는다. CD83은 주로 여포 수상세포, 순환 수상세포, 림프조직의 상호연결(interdigitating) 수상세포, in vitro에서 생성시킨 수상세포, 및 흉선 수상세포에 발현한다(Zhou, L-J., and T.F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821; Zhou, L-J. et al., 1992, J. Immunol. 149: 735; Summers, K.L. et al., 1995, Clin Exp. Immunol. 100:81; Weissman, D. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 826; Hart, D.N.J., 1997, Blood 90: 3245).
CD86(B70/B7-2)은 약 75 kD의 세포 표면 단백질로 CD28 및 CTLA-4의 제2 리간드로서 초기 면역응답에 있어서의 T세포의 부자극에 중요한 역할을 갖는다(Azuma M. et al., 1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al., CD86 Workshop Report. In: Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds., 1994, Oxford University Press; Yang, X.F. et al., 1994, Upregulation of CD86 antigen on TPAstimulated U937 cells, 1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN; Guesdon, J.-L.et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139).
CCR7은 BLR-2, EBI-1, 및 CMKBR7로도 불리는 7회 막관통형 G 단백질 결합 수용체로, CC 케모카인인 MIP-3β/Exodus 3/ELC/CCL19 및 6 Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21의 수용체이다(Sallusto, F. et al., 1999, Nature 401:708-12; Lipp, M. et al., 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 251:173-9; Birkenbach, M.et al., 1993, J. Virol. 67:2209-20; Schweickart, V. L. et al., 1994, Genomics 23:643-50; Burgstahler, R. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:737-43; Yoshida, R. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:13803-9; Yoshida, R. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:7118-22; Yoshida, R. et al., 1998, Int. Immunol. 10:901-10; Kim, C. H. et al., 1998, J. Immunol. 161:2580-5; Yanagihara, S. et al., 1998, J. Immunol. 161:3096-102).
HLA-calss II는 DR, DP, 및 DQ가 있고, 그 모두에 결합하는 항체에 의해 망라적으로 검출할 수 있다(Pawelec, G. et al., 1985, Human Immunology 12:165; Ziegler, A. et al., 1986, Immunobiol. 171:77). HLA-DR은 MHC의 인간 class II 항원의 하나로 α사슬(36 kDa)과 β서브유닛(27 kDa)으로 되는 막관통 당단백질이다. 표피의 랑게르한스세포에서는 CD1a 항원과 공발현한다. CD1a는 항원제시에 있어서 세포의 상호작용에 주요한 역할을 한다(Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press).
상기 마커 유전자 및 그들의 상동 유전자산물을 지표로, 인간 및 인간 이외의 포유동물에 관하여 수상세포를 특정할 수 있다. 이들 마커에 대한 항체는, 예를 들면 BD Biosciences사(BD PharMingen)로부터 입수할 수 있고, 그 상세는 동사 또는 판매대리점의 웹사이트에서 알 수 있다.
또한, 수상세포 마커에 관해서는, 이하의 Kiertscher 등 및 Oehler 등의 문헌도 참조할 것(Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+ leukocytes acquire the phenotype and function of antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL-4, J. Leukoc. Biol., 1996, 59(2):208-18; Oehler, L. et al., Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics., J. Exp. Med., 1998, 187(7):1019-28). 또한, 플로우 사이토메트리(Flow cytometric analysis)에 관해서는, Okano 등, 및 Stites 등의 문헌을 참조할 수 있다(Okano, S. et al., Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes., Gene Ther., 2003, 10(16):1381-91; Stites, D. et al., Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence., Clin. Immunol. Immunopathol., 1986, 38:161-177). 각 마커의 발현에 대해서는, 예를 들면, isotype control antibody로 착색했을 때에, 양성률이 1% 이하인 형광강도를 경계로 하여, 그 이상은 양성, 그 미만은 음성으로 판단된다.
수상세포 또는 그의 전구세포의 조제는, 공지의 방법에 따라 또는 준하여 행할 수 있다. 예를 들면, 혈액(예를 들면 말초혈 또는 제대혈), 골수, 림프절, 다른 림프기관, 비장, 피부 등으로부터 분리할 수 있다(Bishop et al., Blood 83: 610-616, 1994; Bontkes, H. J. et al. (2002) J. Leukoc. Biol. 72, 321-329; Katsuaki, S. et al. (1998) CRYOBIOLOGY 37, 362-371; Ladan, K. et al. (2006) Stem Cells 24, 2150-2157; Ueda, T. et al. (2000) J. Clin. Invest. 105: 1013-1021). 바람직하게는, 수상세포는 본 발명에 사용하기 위해 혈액 또는 골수로부터 얻어진다. 또한, 본 발명에서 사용되는 수상세포는, 피부의 랑게르한스세포, 수입 림프관의 베일세포, 여포 수상세포, 비장의 수상세포, 및 림프기관의 지상 돌기세포(interdigitating cell) 등이어도 된다. 또한 본 발명에서 사용되는 수상세포는, CD34+ 유래 수상세포, 골수 유래 수상세포, 단구 유래 수상세포, 비장세포 유래 수상세포, 피부 유래 수상세포, 여포 수상세포, 및 배 중심 수상세포(germinal center dendritic cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 수상세포가 포함된다. DC 전구세포로서는, 특히 골수 또는 말초혈로부터 얻어진 조혈 줄기세포 또는 조혈 시원세포 등이 바람직하다. 조혈 줄기세포 또는 조혈 시원세포는, 시판의 키트 등을 사용한 네거티브 셀렉션(negative selection)이나, CD34+ 등의 포지티브 셀렉션에 의해 단리할 수 있다(미국 특허출원 08/539,142 참조). 예를 들면, 자기 비드, 형광 라벨에 의한 소팅, 비오틴 또는 아비딘 결합 항체 등에 의해, 표면 항원을 이용한 세포의 단리방법이 알려져 있다(Berenson et al., J. Immunol. Meth., 91:11, 1986; WO 93/08268).
DC나 DC 전구세포와 그 이외의 세포를 포함하는 조성물로부터 DC나 DC 전구세포를 선택(또는 농축)하는 경우는, DC 및 DC 전구세포 이외의 세포를 제거하는 이른바 네거티브 셀렉션을 실시하는 것이 바람직하다. 네거티브 셀렉션을 이용함으로써, DC-granulocytes의 precursor(J. Exp. Med., 1998, 187: 1019-1028; Blood, 1996, 87: 4520-4530)가 제거되지 않고 남아, 접착성의 CD14 세포로부터 분화된 DC 뿐 아니라, 그들의 precursor로부터 분화된 DC를 모아서 회수하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 이것에 의해, DC에 벡터를 도입할 때 등에 있어서의 세포상해성(cytotoxicity)을 경감하는 것을 기대할 수 있다.
예를 들면, T세포, NK세포, B세포 등에 특이적인 항체를 사용하여, 이들 세포를 제거함으로써, DC를 농축하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면, CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b로부터 선택되는 표면 마커 또는 그의 임의의 조합의 발현이 low 또는 negative인 세포를 얻는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, 및 CD66b의 모두가 low 또는 negative인 세포이다. 이 때문에, 이들 마커에 대한 항체를 사용하여, 이들 마커를 발현하는 세포를 제거하면 된다(Hsu et al. (1996) Nature Med. 2: 52). 또한, 네거티브 셀렉션에 있어서는 다가항체를 사용하여 행할 수 있고, 또는 자기 세포 분리(magnetic cell separation; MACS)를 위해 비드 등을 사용해도, 동일한 셀렉션을 실시하는 것이 가능하다. 혈구 분리 등을 사용하여 단핵구를 채취하는 등, 세포를 대량으로 조제하는 경우에는, 비드를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 생체로부터 얻은 세포용액으로부터 단구를 엔리치(enrich)하고, 이에 대해 네거티브 셀렉션을 행하여 조제한 DC 전구세포를 본 발명에 있어서 적합하게 사용할 수 있다.
수상세포의 구체적인 단리방법은, 예를 들면 Cameron et al., 1992, Science 257: 383, Langhoff et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7998, Chehimi et al., 1993,J. Gen. Viol. 74: 1277, Cameron et al., 1992, Clin.Exp.Immunol. 88: 226, Thomas et al., 1993, J. Immunol. 150: 821, Karhumaki et al., 1993, Clin.Exp.Immunol. 91: 482 등에 기재되어 있다. 또한, 플로우 사이토메트리에 의한 수상세포의 단리에 대해서는, 예를 들면, Thomas et al., 1994, J.Immunol. 153: 4016, Ferbas et al., 1994, J.Immunol. 152: 4649, 및 O'Dohelrty et al., 1994, Immunology 82: 487에 기재되어 있다. 또한, 자기 세포 선별에 대해서는, 예를 들면 Miltenyi et al., 1990, Cytometry 11: 231-238에 기술되어 있다.
또한, 예를 들면 인간 수상세포의 단리 및 증식에 관해서는, Macatonia et al., 1991, Immunol. 74: 399-406, O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1067-1078, Markowicz et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 955-961, Romani et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 83-93, Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118, Berhard et al., 1995, J. Exp. Med. 55: 1099-1104 등에 기재된 방법을 사용해도 된다. 또한, 골수, 제대혈, 또는 말초혈 등으로부터 얻어지는 CD34+ 세포 및 말초혈 유래의 단핵세포로부터의 수상세포 형성에 대해서는 Van Tendeloo et al., 1998, Gene Ther. 5: 700-707에 기재된 방법을 사용해서 실시해도 된다.
DC 전구세포는, 1 또는 복수의 사이토카인을 포함하는 배지 중에서 증폭된다. 예를 들면, IL-3 단독으로도 약 10일에 걸쳐 DC 전구세포를 증폭하는 것이 가능하다. 그러나, 보다 장기에 걸친 증폭은, IL-3 단독에서는 보이지 않는다. 본 발명자 등은 SCF 및 IL-3를 포함하는 배지에서 DC 전구세포를 배양함으로써, 매우 높은 효율로 DC로의 분화능을 갖는 세포를 증폭시킬 수 있는 것을 발견하였다. 따라서, 2주 이상의 증폭에는 IL-3와 SCF를 조합시키는 것이 바람직하다. 특히, FLT-3L, SCF, IL-3, 및 IL-6의 4종의 사이토카인을 포함하는 배지에서 DC 전구세포를 배양함으로써, DC로의 높은 분화능을 갖는 DC 전구세포를 대량으로 얻을 수 있다. 본 발명은 IL-3 및 SCF를 포함하고 FLT-3L 및 IL-6를 포함하지 않는 배지, FLT-3L, SCF, 및 IL-3를 포함하고 IL-6를 포함하지 않는 배지, 또는 SCF, IL-3, 및 IL-6를 포함하고 FLT-3L을 포함하지 않는 배지에서 DC 전구세포를 증폭하는 공정을 포함하는, DC의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, FLT-3L, SCF, IL-3, 및 IL-6를 포함하는 배지, 예를 들면 그들을 포함하고, G-CSF, GM-CSF, IL-4, 및 TNF-α로부터 선택되는 하나 이상(또는 그들의 임의의 조합)의 사이토카인을 유의하게 포함하지 않는 배지에서 DC 전구세포를 증폭하는 공정을 포함하는, DC의 제조방법에 관한 것이다.
FLT-3L(Fms 유사 티로신키나아제 3 리간드)은, Flt-3의 리간드로, 조혈계 전구세포의 분화, 증식을 촉진시킨다(Namikawa R. et al., BLOOD 87: 1881-1890, 1996). EP 0627487 A2 및 WO 94/2839에 기재되어 있는 1군의 폴리펩티드는, 본 발명에 있어서 Flt-3L에 포함된다. 인간 FLT-3L cDNA는 accession number ATCC 69382로서 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수할 수 있다. SCF는 c-kit 리간드, 마스트세포 증식인자(MGF), 또는 스틸 인자(steel factor)로도 불린다(Zsebo et al., Cell 63: 195-201, 1990; Huan, E. Cell 63: 225-233; Williams, D.E., Cell 63: 167-174, 1990; Toksoz. D et al, PNAS 89: 7350-7354, 1992). SCF로서는, EP 423,980에 기재되어 있는 폴리펩티드가 포함된다.
IL-3는 활성화 T세포, 비만세포, 호산구에 의해 생산되는 조혈인자이다. 본 발명에 있어서 IL-3에는, 미국 특허 제5,108,910호에 기재되어 있는 IL-3 폴리펩티드가 포함된다. 인간 IL-3 단백질을 코드하는 DNA 서열은, accession number ATCC 67747로서 입수 가능하다. IL-6는 B세포의 분화유도인자로서 발견되어, 항체생산계 뿐 아니라, 간에 있어서의 급성기 단백의 생합성유도나 IL-3와의 상승(相乘)작용에 기인하는 조혈 줄기세포의 증식촉진 등 다채로운 생리활성을 갖는다(Paul SR et al., Blood, 1991, 77: 1723-1733). IL-4는 주로 헬퍼 T세포로부터 생산되고, T세포, B세포 및 다른 혈구세포에 광범위한 생리활성을 갖는다(Mosley et al., Cell 59: 335 (1989); Idzerda et al., J. Exp. Med. 171: 861 (1990); Galizzi et al., Intl. Immunol. 2: 669 (1990)). GM-CSF는 마크로파지 또는 과립구를 함유하는 콜로니의 성장을 자극한 인자로서 단리된 사이토카인이다(미국 특허 제5,108,910호 및 5,229,496호). GM-CSF는 과립구 및 마크로파지의 전구세포의 성장 및 발생에 필수인 인자로, 골수아구(myeloblast) 및 단아구(monoblast)를 자극하여 분화를 유도한다.
각 사이토카인의 농도는 적절히 조정해도 되나, FLT-3L이라면 5~35 ng/㎖, 바람직하게는 10~30 ng/㎖, 보다 바람직하게는 15~25 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 20 ng/㎖이다. SCF, IL-3, IL-6에 대해서는, 예를 들면 FS36 등의 GM-CSF 불포함 배지를 사용하는 경우는, 3~20 ng/㎖, 바람직하게는 5~15 ng/㎖, 보다 바람직하게는 7~12 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 10 ng/㎖이나, 이들에 한정되지 않는다. 배지로서는, 예를 들면 RPMI1640 또는 IMDM을 사용할 수 있다. 배지에는 5~20%, 바람직하게는 약 10%의 혈청, 바람직하게는 소태아혈청(FBS)을 적절히 첨가한다. DC 전구세포는 1×105~5×105 세포 정도, 예를 들면 약 2.5×105 세포로부터 배양을 개시할 수 있다. 바람직하게는 3일~4일마다 계대(繼代)한다. 계대시에는 2×106/㎖ 이하의 농도가 되도록 세포수를 조정하는 것이 바람직하다. 인간 CD34+ 세포 등의 영장류 CD34+ 세포를 GM-CSF와 SCF를 조합해서 배양하는 경우는, GM-CSF는 예를 들면 1~500 ng/㎖(1~200 ng/㎖ 또는 1~100 ng/㎖), 보다 바람직하게는 2~300 ng/㎖, 예를 들면 5~200 ng/㎖, 바람직하게는 10~150 ng/㎖, 보다 바람직하게는 20~120 ng/㎖, 보다 바람직하게는 30~100 ng/㎖로 사용하면 된다. SCF는 예를 들면 0.5~500 ng/㎖(0.5~100 ng/㎖ 또는 0.5~50 ng/㎖), 보다 바람직하게는 1~300 ng/㎖, 보다 바람직하게는 2~200 ng/㎖, 보다 바람직하게는 5~100 ng/㎖, 예를 들면 10~70 ng/㎖, 보다 바람직하게는 예를 들면 20~60 ng/㎖, 보다 바람직하게는 25~50 ng/㎖ 정도로 사용하면 된다.
본 발명자 등은 DC 전구세포의 증폭기간을 약 3~4주간으로 함으로써, 그 후의 DC로의 분화효율을 현저히 높일 수 있는 것을 발견하였다. 이 보다 오랜 기간 배양하면, 보다 많은 세포를 얻을 수 있으나, DC로의 분화효율은 저하된다. 특히 FS36 배지에 있어서 5주간 증폭시킨 DC 전구세포는, DC로의 분화효율이 현저히 저하된다. 따라서, 예를 들면 FS36 등의 GM-CSF 불포함 배지를 사용하는 경우는, DC 전구세포의 배양기간은 약 3주간~약 4주간, 바람직하게는 약 3주간으로 하는 것이 바람직하고, 예를 들면 18~24일간, 보다 바람직하게는 20~22일간 배양하고, 그 기간을 초과하여 동일한 사이토카인의 조합을 포함하는 배지에서 DC 전구세포를 증폭시키는 것은 피하는 것이 바람직하다. 그 기간 배양한 후, 이하에 기재하는 바와 같이 DC 분화배지에서 배양하여, DC를 분화시킨다. 예를 들면, FLT-3L, SCF, IL-3, 및 IL-6를 포함하는 배지에서 DC 전구세포를 배양하는 경우는, 상기 기간 배양 후, FLT-3L, SCF, IL-3, 및 IL-6의 모두를 포함하는 배지 이외의 배지에서 배양된다.
증폭된 DC 전구세포는, 사이토카인에 의해 DC로 분화시킬 수 있다. 예를 들면 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), GM-CSF, 종양괴자인자(tumor necrosis factor; TNF)-α, IL-4, IL-13, SCF(c-kit 리간드), Flt-3 리간드, 또는 그들의 조합 등에 의해 분화시킬 수 있다. 예를 들면, GM-CSF 불포함 배지(FS36 등)에서 증폭시킨 DC 전구세포를, GM-CSF 및 IL-4의 존재하, 또는 GM-CSF 및 SCF의 존재하에서 DC로 분화시키는 것이 바람직하다. TNF-α로 추가 자극함으로써 성숙 수상세포로 분화시키는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서는, 바람직하게는 상기의 방법에 따라 GM-CSF 불포함 배지(FS36 등)에서 증폭한 DC 전구세포를, (i) GM-CSF 및 IL-4, 또는 (ii) GM-CSF 및 SCF의 존재하에서 배양한다. 사이토카인의 농도는 적절히 조정하면 되나, GM-CSF 불포함 배지를 사용하여 DC 전구세포를 증폭한 경우는, GM-CSF 및 IL-4에 대해서는, 예를 들면 1~500 ng/㎖, 보다 구체적으로는 2~300 ng/㎖, 예를 들면 5~100 ng/㎖, 바람직하게는 10~50 ng/㎖, 보다 바람직하게는 15~25 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 20 ng/㎖이다. SCF에 대해서는, 예를 들면 1~200 ng/㎖, 보다 구체적으로는 2~100 ng/㎖, 2~80 ng/㎖, 또는 2~60 ng/㎖, 보다 구체적으로는, 예를 들면 3~20 ng/㎖, 바람직하게는 5~15 ng/㎖, 보다 바람직하게는 7~12 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 10 ng/㎖이다. 배지로서는, 예를 들면 RPMI1640 또는 IMDM을 사용할 수 있다. 5~20%, 바람직하게는 약 10%의 혈청, 바람직하게는 소태아혈청(FBS)을 적절히 첨가한다. 배양기간은 예를 들면 5~15일간, 바람직하게는 6~10일, 보다 바람직하게는 약 7일간이다. FS36으로 세포를 증폭한 경우는, GM-CSF 및 IL-4의 존재하에서 분화시키는 것 보다도, GM-CSF 및 SCF의 존재하에서 분화시키는 쪽이, 보다 효율적으로 DC를 얻을 수 있다.
또한 인간 CD34+ 세포 등의 인간 DC 전구세포 또는 다른 영장류 DC 전구세포의 경우에는, 상기와 같이 SCF 및 IL-3(S3), 또는 FS36으로 증폭하지 않더라도, (i) GM-CSF 및 IL-4, 또는 (ii) GM-CSF 및 SCF의 존재하에서 배양함으로써, 증폭과 동시에 분화시키는 것이 가능하다. 이 경우, 배양기간은 1~10주간, 예를 들면 1~6주간, 바람직하게는 2~5주간, 바람직하게는 3~6주간, 바람직하게는 3~5주간, 바람직하게는 4~5주간으로 한다. 영장류 CD34+ 세포로서는, 예를 들면 제대혈 유래 CD34+ 세포, 골수 유래 CD34+ 세포, 및 말초혈 유래 CD34+ 세포 등을 사용할 수 있다.
배양액으로서는, 적절히 소망하는 배지를 사용할 수 있으나, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), MEM(Minimum Essential Medium), RPMI-1640, X-VIVOTM(Lonza), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등을 들 수 있다. 가장 바람직하게는 IMDM이 사용된다. 적절히 혈청을 첨가하는 것이 바람직하고, 예를 들면 1~20%(v/v), 보다 바람직하게는 2~20%, 보다 바람직하게는 5~15%, 보다 바람직하게는 5~10%(예를 들면 약 10%)를 첨가한다. 혈청은 소 유래의 혈청이 바람직하고, 가장 바람직하게는 소태아혈청(FCS)이다. 인간 CD34+ 세포로부터 iDC를 증폭할 때는, TNF-α 및/또는 IL-4를 첨가하지 않는 것이 바람직하다. 예를 들면 배지 중의 TNF-α 및 IL-4 농도는, 첨가하는 혈청 중에 포함되는 각 농도와 비교하여, 그것을 현저히 초과하지 않는 범위, 예를 들면 혈청(예를 들면 정상 FCS) 중의 각 사이토카인농도의 3, 2, 또는 1배 이하인 것이 바람직하고, 바람직하게는 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 또는 1/5 이하, 구체적으로는 50 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 40, 30, 20, 10, 5, 3, 또는 1 ng/㎖ 이하이다. 인간 CD34+ 세포로부터 iDC를 증폭하기 위한 배지는, 바람직하게는 사이토카인으로서는 GM-CSF 및 SCF만이 첨가된 배지이다. 배지는 바람직하게는 사이토카인으로서는 GM-CSF 및 SCF만을 포함하고, 다른 사이토카인을 포함하지 않는다.
본 발명은 GM-CSF 및 SCF를 포함하는, 수상세포 증폭용 조성물, 수상세포 조제용 조성물, 수상세포 제조용 조성물, 수상세포 증폭용 배지, 수상세포 조제용 배지, 및 수상세포 제조용 배지를 제공한다. 조성물은 적절히 멸균수, 완충액, 염 등을 포함해도 된다. 또한 배지로서는, 상기에 기재한 배양액 등을 들 수 있으나, 그들에 한정되지 않는다. 배지는 혈청을 포함해도 되고, 포함하지 않아도 된다. 또한, 항생물질을 포함해도 되고, 포함하지 않아도 된다. 또한 본 발명은, 이들 조성물 또는 배지의 제조에 있어서의, GM-CSF 및 SCF의 사용에 관한 것이기도 하다. 또한 본 발명은 GM-CSF 및 SCF를 키트의 요소로서 포함하는, 수상세포 증폭용 키트, 수상세포 조제용 키트, 수상세포 제조용 키트에 관한 것이기도 하다. 당해 키트는, 배양액(예를 들면 혈청을 포함하지 않는다) 또는 배양액을 조제하기 위한 분말(아미노산이나 염 등을 포함하고, 혈청이나 항생물질 등이 포함되어 있지 않은 것)을 추가적으로 포함해도 된다. 이들 조성물, 배지, 및 키트는, 바람직하게는 인간을 포함하는 영장류 수상세포를 증폭, 조제, 및 제조하기 위한 것으로, 보다 바람직하게는 인간을 포함하는 영장류 CD34+ 세포로부터 수상세포를 증폭, 조제, 및 제조하기 위한 것이다. 이들은 TNF-α 및/또는 IL-4를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 예를 들면 조성물 및 배지 중의 TNF-α 및 IL-4 농도는, 혈청을 포함하는 경우는 혈청 중에 포함되는 각 농도와 비교하여, 그것을 현저히 초과하지 않는 범위, 예를 들면 혈청(예를 들면 정상 FCS) 중의 각 사이토카인농도의 3, 2, 또는 1배 이하인 것이 바람직하고, 바람직하게는 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 또는 1/5 이하, 구체적으로는 50 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 40, 30, 20, 10, 5, 3, 또는 1 ng/㎖ 이하이다. 혈청을 포함하지 않는 경우는, 바람직하게는 사이토카인으로서는 GM-CSF 및 SCF만을 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, CD34+ 세포로부터 DC를 예를 들면 102배, 바람직하게는 0.5×103배, 보다 바람직하게는 1×103배, 보다 바람직하게는 0.5×104배, 보다 바람직하게는 1×104배, 보다 바람직하게는 0.5×105배, 보다 바람직하게는 1×105배, 보다 바람직하게는 0.5×106배 이상으로 증폭하여 얻을 수 있다. 세포는 예를 들면 1주간의 배양으로 5배, 바람직하게는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13배 이상의 속도로 증가시킬 수 있다. 증폭된 세포는, 고순도로 DC(iDC)를 포함한다. 증폭된 세포의 CD11c 양성률(전세포 중의 CD11c+ 세포의 비율)은, 예를 들면 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 85% 이상이다. 또한, iDC를 LPS 또는 Poly(I:C), 또는 센다이 바이러스 등으로 처리함으로써, 성숙 DC를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 수상세포는, 감염증, 암, 기타, 면역 유도에 의해 유익한 효과를 기대할 수 있는 소망하는 질환의 면역치료에 유용한 DC 백신으로서 유용하다. 예를 들면, 종양 면역치료에 관해서는, 수상세포에 종양항원을 제시시키기 위해, 종양세포의 세포 용해물(cell lysate)과 혼합, 펩티드로 펄스, 또는 수상세포에 종양항원 유전자를 도입하는 방법 등에 의해 항원을 제시시켜, 종양에 대한 DC 치료에 사용할 수 있다.
예를 들면 수상세포에 종양항원을 유전자 도입하면, 종양 용해물(lysate) 및 펩티드 펄스 보다도 인비보에서의 종양항원 제시시간의 연장을 기대할 수 있고, 또한 HLA의 제한(펩티드의 경우; 펩티드는 항원 유래의 어느 한 펩티드를 사용하나, HLA와의 결합 관계상, HLA의 종류가 바뀌면, 그 항원 중의 사용하는 펩티드의 부위가 변화된다) 등을 받지 않게 되는 이점을 갖는다.
수상세포에 유전자를 도입하는 벡터로서, 플라스미드를 도입하는 리포솜법, electroporation 등이 있다(Cancer Gene Ther 1997, 4, 17-25). 보다 실용적인 벡터로서, 이하의 3종류의 벡터가 있다. i) 아데노바이러스 벡터(J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454, Gene therapy 2000; 7; 249-254), ii) 레트로바이러스 벡터(J. Leuko. Biol., 1999; 263-267., Br. J. Haematol. 2000; 108; 817-824), iii) 렌티바이러스 벡터(J. Gene Med. 2001; 3; 311-320, J. Immunol. Meth. 2002; 153-165, Mol. Ther., 2002; 283-290, Cancer Gene Therapy 2002; 9: 715-724). 벡터와 수상세포의 접촉은, 인비보 또는 인비트로에서 행할 수 있고, 예를 들면 배양액, 생리식염수, 혈액, 혈장, 혈청, 체액 등 소망하는 생리적 수용액 중에서 실시하면 된다.
예를 들면 렌티바이러스 벡터 등의 레트로바이러스 벡터를 사용하여, CD34 양성의 줄기세포에 유전자를 도입하고, 그 후 인비트로에서 수상세포를 얻을 수 있다. 또한, 원숭이 면역 부전 바이러스(SIV)의 경우, helper construct에 있어서 vpx(proviral DNA의 핵내 이행을 촉진한다)를 남김으로써, 또는, HIV로 DNA-flap 시퀀스를 삽입(이것도 proviral DNA의 핵내 이행을 촉진한다)함으로써, 말초혈 유래 단구 및 분화된 수상세포로의 유전자 도입이 가능해졌다(Mol. Ther. 2002; 283-290).
한편, 아데노바이러스에 관해서는, 그 높은 도입효율(약 80%)과 분화된 수상세포로 직접 유전자 도입할 수 있기 때문에, 수상세포 유전자 도입용 벡터로서 기대되고 있다(J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454). 단, 유전자 도입효율을 높게 하는 MOI에서는 알로 T세포의 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction; MLR)을 저하시키는 면역 억제작용이 있기 때문에(Gene Therapy 2000; 7; 249-254), 고 MOI에서의 사용은 주의를 요한다(특히 높은 DC:T의 비율로). 또한, 에피솜(episome)의 희석을 위해, CD34 양성세포 등의 줄기세포에 유전자 도입 후에 수상세포를 분화시키는 것 보다도, 보다 분화가 진행된 단계에서 도입하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 바이러스 벡터 외에, 마이너스 가닥 RNA 바이러스(minus-strand RNA virus) 등의 RNA 바이러스를 DC로 도입하는 것도 바람직하다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입은 매우 단기간의 접촉으로 종료되고, 100%에 가까운 도입효율을 얻을 수 있으며, 또한 알로 T세포 응답의 억제 정도는 비교적 경도(輕度)로, T세포의 자극성이 유지된다(WO2005/042737). 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 마이너스 가닥(바이러스 단백질을 코드하는 센스 가닥에 대한 안티센스 가닥)의 RNA를 게놈으로서 포함하는 바이러스로, 네거티브 가닥 RNA 바이러스로도 불린다. 본 발명에 있어서 사용되는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae과; Respirovirus속, Morbillivirus속, Rubulavirus속, 및 Pneumovirus속 등을 포함한다), 라브도바이러스(Rhabdoviridae과; Vesiculovirus속, Lyssavirus속, 및 Ephemerovirus속 등을 포함한다), 필로바이러스(Filoviridae과), 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae과; Infuluenza virus A, B, C, 및 Thogoto-like viruses 등을 포함한다), 분야바이러스(Bunyaviridae과; Bunyavirus속, Hantavirus속, Nairovirus속, 및 Phlebovirus속 등을 포함한다), 아레나바이러스(Arenaviridae과) 등의 과에 속하는 바이러스가 포함된다.
본 발명에 있어서 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 보다 바람직하게는, 파라믹소바이러스아과(레스피로바이러스속, 루블라바이러스속, 및 모빌리바이러스속을 포함한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체가 사용되고, 보다 바람직하게는 센다이 바이러스를 포함하는 레스피로바이러스속(genus Respirovirus)(파라믹소바이러스속(genus Paramyxovirus)이라고도 한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체가 사용된다. 유도체에는, 바이러스에 의한 유전자 도입능을 손상시키지 않도록, 바이러스 유전자가 개변된 바이러스, 및 화학 수식된 바이러스 등이 포함된다. 예를 들면 F 유전자 결손형 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 바람직하다. 다양한 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서, 재조합 바이러스의 제조방법이 알려져 있다(WO97/16539; WO97/16538; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404).
마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터의 도입효율은, 수상세포가 비활성화 상태(미성숙 상태)인 쪽이, 성숙 수상세포에 대한 것 보다도 유의하게 높다. 따라서, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 미성숙 수상세포에 접촉, 또는 미성숙 수상세포를 포함하는 세포분획과 혼합하는 것이 바람직하다. 수상세포는, 세균 또는 리포폴리사카라이드(LPS), 이중 가닥 RNA(double-stranded RNA), 또는 RNA 바이러스 등과의 접촉에 의해 활성화할 수 있다. 유전자 도입하는 수상세포를 이러한 방법으로 별도 활성화시키는 경우는, 활성화한 후 벡터를 도입해도 되나, 벡터의 도입효율이 저하되지 않도록 하기 위해, 활성화의 조작을 벡터의 도입 전이 아니라, 벡터에 의해 유전자를 도입한 후(또는 벡터를 수상세포에 접촉시키는 것과 동시)에 행하는 것이 바람직하다.
예를 들면 본 발명의 방법에 의해 증폭한 DC 전구세포를, GM-CSF 및 SCF의 존재하에서 배양하여 DC로 분화시킨 후에, LPS 또는 RNA 바이러스 등의 존재하에서 배양함으로써, DC를 활성화시킨다. 배양기간은 적절히 조정하면 되나, 예를 들면 2~7일간이다. 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스 등의 RNA 바이러스는, 면역 부활(종양 면역 등)에 사용함에 있어서 유전자 도입에 이용할 수 있을 뿐 아니라, RNA 바이러스의 감염 자체가 수상세포의 활성화를 야기하기 때문에, 도입 후의 사이토카인 등으로의 활성화 처리 공정이 생략 가능하여, 세포의 생존능력(viability)의 유지나 비용 삭감, 추가적인 엑스비보(ex vivo)에서의 조작시간의 삭감에 기여할 것으로 생각된다. 또한, RNA 바이러스 벡터로 유전자 도입된 수상세포를 사용하여, T세포 이입 요법에 필요한 활성화 T세포, 특히 종양 특이적 세포상해성 T세포 등을 엑스비보에서 효율적으로, 단기간, 간단하게 유도할 수 있다(WO2005/042737;WO2006/001122).
DC는 적절히 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 조성물로 할 수 있다. 담체로서는, 생리식염수, 인산완충 생리식염수(PBS), 배양액, 혈청 등, 생세포를 현탁할 수 있는 소망하는 용액을 들 수 있다. 또한 조성물은, 수상세포에 제시시키는 항원 펩티드가 포함되어 있어도 된다. 또한, DC를 백신으로서 사용하는 경우, 백신 조성물에는 면역원성을 높이기 위해, 사이토카인, 콜레라 독소, 살모넬라 독소 등의 면역촉진제를 첨가하는 것도 가능하다. 또한 백신에는, 명반, 불완전 Freund's 애쥬번트, MF59(오일 에멀젼), MTP-PE(마이코박테리아 세포벽 유래의 muramyl tripeptide), 및 QS-21(soapbark tree Quilaja saponaria 유래) 등의 애쥬번트를 조합시키는 것도 가능하다.
항원은 항원으로 하는 세포 용해물과의 혼합, 펩티드 펄스, 또는 벡터에 코드시킨 항원 유전자를 DC에 도입함으로써 DC에 제시시킬 수 있다. 항원으로서는, 감염 미생물, 바이러스, 기생충, 병원체, 및 암 등에 관련된 소망하는 항원을 들 수 있다. 이들은, 구조 단백질 또는 비구조 단백질이어도 된다. 이와 같은 항원(또는 그의 프로세스된 펩티드)은, 수상세포 표면의 MHC 분자에 결합하여 세포 표면에 제시되어, 면역응답이 유도된다.
백신으로서 사용하는 경우, 예를 들면, 종양, 감염증, 및 그 밖의 일반적인 질환에 대하여 적용할 수 있다. 감염증의 치료로서는, 예를 들면, 감염성 미생물의 항원 단백의 에피토프를 해석하여, 이것을 수상세포에서 발현 또는 제시시킬 수 있다.
예를 들면, 병원체 유래의 항원으로서는, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 델타형 간염 바이러스, 유두종 바이러스 항원(papilloma virus antigen), 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus; HSV), 수두-대상 포진 바이러스(varicella-zoster virus; VZV), 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus; CMV), HIV, 및 말라리아 등이 갖는 단백질 또는 그의 부분 펩티드를 들 수 있다(G.L. Mandell et al. (Ed.) Hinman et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3rd Ed., Churchill Livingstone Inc., NY, pp. 2320-2333). 이들의 항원을 제시하는 DC를, 감염증에 대해 예방적 및 치료적으로 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 인플루엔자에 있어서는, 강독주(highly-virulent strain) H5N1형 등의 엔벨로프, 일본뇌염에 있어서는, 예를 들면, 일본뇌염 바이러스의 엔벨로프 단백질(Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882(1999)), 에이즈에 있어서는, 예를 들면, HIV gag 또는 SIV gag 단백질(J. Immunology(2000) vol. 164, 4968-4978), HIV 엔벨로프 단백질, Nef 단백질, 그 밖의 바이러스 단백질 등을 들 수 있다. 콜레라에 있어서는, 예를 들면, 콜레라 독소의 B 서브유닛(CTB)(Arakawa T, et al., Nature Biotechnology(1998) 16(10): 934-8, Arakawa T. et al., Nature Biotechnology(1998) 16(3): 292-7), 광견병에 있어서는, 예를 들면, 광견병 바이러스의 당단백(Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8): 949-52), 자궁경부암(cervical carcinoma )에 있어서는, 인간 유두종 바이러스 6형(human papilloma virus 6 type)의 캡시드 단백 L1(J. Med. Virol, 60, 200-204(2000)) 등을 들 수 있다. 또한, 일본뇌염 바이러스의 JE-E 항원 단백질(일본국 특허공개 소64-74982, 일본국 특허공개 평1-285498), 인간 단순 헤르페스 바이러스의 gD2 단백질(일본국 특허공개 평5-252965), C형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드(일본국 특허공개 평5-192160), 가성 광견병 바이러스(pseudorabies virus) 유래 폴리펩티드(일본국 특허공표 평7-502173) 등을 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 이들의 병원성 미생물에 감염된 환자 유래의 세포를 해석하고, 항원제시세포(APC)에 있어서 제시된 항원 단백의 에피토프를 동정하여, 이것을 사용해도 된다. HLA형을 적절히 선택함으로써, 소망하는 HLA형에 대한 에피토프를 동정하여 사용하는 것도 바람직하다.
종양에 대한 면역응답을 특이적으로 촉진시키기 위해서는, 1 이상의 종양항원을 수상세포에 제시시킨다. 종양 관련 항원은, 예를 들면 종양세포의 조추출액(crude tumor cell extracts)을 조제하거나, 또는 항원을 부분적으로 정제함으로써 얻을 수 있다(Cohen et al., Cancer Res. 54: 1055 (1994); Cohen et al., Eur. J. Immunol. 24: 315 (1994); Itoh et al., J. Immunol. 153: 1202 (1994)). 얻어진 종양항원은 추가적으로 정제해도 되고, 또한, 재조합 펩티드로서 합성 또는 발현시켜도 된다.
정제한 수상세포에 항원을 펄스(폭로)하여 DC에 항원을 흡수시키면, 항원은 DC에 의해 처리되고, 세포 표면에 제시된다(Germain, R.N., Cell 76: 287 (1994)). 수상세포를 항원으로 펄스하는 다수의 방법이 알려져 있어, 당업자라면, 제시시키는 항원에 따라 적용하는 방법을 선택하는 것은 일상 행해지고 있다. 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 제조한 DC에 항원을 제시시킨 것을 포함하는 조성물 및 그의 면역치료로의 사용을 제공한다. 본 발명의 조성물은, 면역응답을 자극하기 위해, 인젝션, 연속 점적, 임플란트로부터의 지속적 방출, 또는 다른 적당한 기술에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로는, 생리학적으로 수용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 수상세포를 포함하는 조성물을 투여한다. 담체로서는, 사용되는 약량(dose) 및 농도에 있어서 투여 개체에 유의한 독성이 없는 것으로, 예를 들면 생리식염수를 들 수 있다.
종양항원은 종양세포에 특이적인 것(즉, 종양세포에 존재하지만, 비종양세포에는 존재하지 않는 것)이어도 되고, 동일한 타입의 비종양세포보다도 종양세포에 높은 레벨로 존재하는 것이어도 된다. 이 수상세포를 투여함으로써 면역계가 자극된다. CTL이 주요한 이펙터(effector)로서 작용하는 경우는, 항원으로서는 세포 내외에 발현하는 소망하는 종양항원을 사용할 수 있다. 수상세포를 사용하여, CD4 T세포의 활성화로부터 계속되는 B세포의 활성화에 의한 항체 생산을 야기하여, 항체를 이펙터로서 작용시키는 경우에는, 항원으로서는 세포 표면에 표출하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 세포 표면 수용체 또는 세포 접착 단백질을 사용할 수 있다. 종양항원의 예로서는, 난소암 등으로 하는 Muc-1 또는 Muc-1 유사 뮤신 탠덤 리피트 펩티드(mucin tandem repeat peptide)(미국 특허 제5,744,144호), 자궁경부암을 일으키는 인간 유두종 바이러스 단백질 E6 및 E7, 흑색종 항원 MART-1, MAGE-1, -2, -3, gp 100 및 티로시나아제(tyrosinase), 전립선암 항원 PSA, 그 밖에도, CEA(Kim, C. et al., Cancer Immunol. Immunother. 47(1998) 90-96), 및 Her2neu(HER2p63-71, p780-788; Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3338-3346) 등을 들 수 있다.
본 발명에 의해 조제되는 수상세포는, 암 및 감염증에 대한 유효한 면역요법에 있어서 유용하고, 종양항원 또는 감염증 관련 항원의 유전자가 도입된 수상세포 또는 그의 수상세포에서 자극된 T세포에 의한 면역감작은, 환자에 있어서 항종양 또는 항감염증 면역을 유도하는 유효한 방법이 된다. 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 수상세포의 면역반응의 유도에 있어서의 사용에 관한 것이기도 하다. 즉, 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 수상세포의, 면역요법에 있어서의 사용, 구체적으로는, 예를 들면, 종양 또는 감염증의 치료에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 수상세포의, 면역 활성화제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 수상세포의, 면역치료제의 제조에 있어서의 사용, 구체적으로는, 예를 들면 항종양제(종양 증식 억제제) 또는 감염증 치료제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다.
또한, 일반병으로의 적용도 생각되어진다. 당뇨병에 있어서는, 예를 들면, I형 당뇨병 환자 또는 그의 모델 동물에 있어서, 인슐린 단편의 펩티드를 에피토프로서 이용하는 것이 생각되어진다(Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104(2): 189-94).
DC 조성물에는, 가용성 사이토카인 수용체 또는 사이토카인 또는 다른 면역제어분자를 추가적으로 포함해도 된다(Schrader, J.W. Mol. Immunol. 28: 295 (1991)). 이들 사이토카인은 DC 조성물과는 별도의 조성물로서 조제하고, DC와 동시에, 따로 따로, 또는 축차적으로 투여하는 것도 가능하다. 또한, 수상세포로부터 사이토카인류를 발현시키면, 면역계를 자극하여 감염 미생물 또는 암에 대한 면역응답을 높이기 때문에, 사이토카인을 코드하는 유전자를 도입한 수상세포도, 암과 기타 사이토카인 치료가 유효하다고 생각되어지는 질환의 치료에 있어서 유용하다. 면역자극성 사이토카인을 코드하는 유전자를 탑재하는 벡터가 도입된 수상세포는 효과적인 면역 유도제가 된다. 예를 들면, 면역자극성 사이토카인으로서, 인터류킨(예를 들면, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-27), 인터페론(예를 들면, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 종양괴사인자(TNF), 트랜스포밍 증식인자(TGF)-β, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF), GM-CSF, IL-3와 GM-CSF를 포함하는 융합단백질, 인슐린 유자 증식인자(IGF)-I, IGF-2, Flt-3 리간드, Fas 리간드, 및 c-kit 리간드, CD40 리간드(CD40L), 및 다른 면역조절 단백질(케모카인(chemokines) 및 보조자극분자(costimulatory molecule) 등)이 포함된다. 이들은 단독 또는 조합하여 사용 가능하다.
이들 사이토카인의 아미노산서열은 당업자에게는 주지이고, IL-4에 대해서는, 예를 들면, Arai 등(1989), J. Immunol. 142(1) 274-282, IL-6에 대해서는, 예를 들면, Yasukawa 등(1987), EMBO J., 6(10): 2939-2945, IL-12는 예를 들면, Wolf 등(1991), J. Immunol. 146(9): 3074-3081, IFN-α는 예를 들면, Gren 등(1984) J. Interferon Res. 4(4): 609-617, 및 Weismann 등(1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1-22, TNF는 예를 들면, Pennica 등(1984) Nature 312: 724-729, G-CSF는 예를 들면, Hirano 등(1986) Nature 324: 73-76, GM-CSF는 예를 들면, Cantrell 등(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254를 참조할 수 있다. 보다 구체적으로는, GM-CSF를 코드하는 핵산서열로서는 Accession number NM_000758의 84~461번째 서열(아미노산서열은 NP_000749의 18~144번째)을 포함하는 서열을 들 수 있다. IL-4를 코드하는 핵산서열로서는, Accession number NM_000589의 443~829번째 서열(아미노산서열은 NP_000580의 25~153번째)을 포함하는 서열을 들 수 있다. 이들 사이토카인을 코드하는 천연의 유전자 또는 유전자 암호의 축중(縮重)을 이용하여, 기능적 사이토카인을 추가로 코드하는 변이 유전자를 포함하는 벡터를 설계하고, 수상세포에 도입할 수 있다.
또한, 이들 사이토카인의 개변체를 발현하도록 유전자 개변해도 된다. 예를 들면, 전구체 및 성숙체의 2개의 형태를 갖는 사이토카인(예를 들면, 시그널 펩티드의 절단에 의해 활성 프래그먼트를 생성하는 것, 또는 단백질의 한정분해에 의해 활성 프래그먼트를 생성하는 것 등)에 대해서, 전구체 또는 성숙체 중 어느 하나를 발현하도록 유전자 개변해도 된다. 기타 개변체(예를 들면, 사이토카인의 활성 프래그먼트와 이종 서열(예를 들면, 이종 시그널 펩티드) 간의 융합 단백질)를 사용해도 된다.
수상세포는 환자 자신의 T세포를 인비보에서 자극하는데 유용하고, 또는 수상세포는 T세포를 인비트로에서 자극하는 것에도 유용하다. 감작(感作)한 T세포를 환자에게 투여하고, 엑스비보 면역요법을 매개로 환자의 면역계를 자극하는 것도 가능하다. 예를 들면, 항원을 제시시킨 성숙 수상세포를 T세포에 접촉시킴으로써, 수상세포에 의해 자극된 T세포를 만들어 낼 수 있다. 수상세포에서 제시시키는 항원은, 벡터로부터 발현시킨 단백질(또는 그의 프로세스된 산물)이어도 되고, 바깥에서 수상세포에 펄스해도 된다. 활성화된 T세포에 의해 CTL이 유도된다.
또한 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 제조한 수상세포를 사용하여, 면역계를 자극하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면 감염증 또는 암 등을 앓고 있는 환자에 있어서 면역계를 자극하는 치료를 행할 수 있다. 이 방법은, 수상세포 또는 T세포를 투여하는 공정을 포함하는 방법이다. 이 방법은, 구체적으로는 본 발명에 의해 제조된 DC 또는 그 DC에 의해 자극된 T세포의 치료상 유효량을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는 방법이다. 수상세포에 항원 펩티드를 펄스하고, 소망하는 항원을 제시시킴으로써, 소망하는 항원에 대한 면역을 유도할 수 있다. 인비트로에서 T세포와 수상세포를 접촉시키는 경우, 환자로부터 T세포를 채취하여, 엑스비보 투여를 행하는 것이 바람직하다.
DC 또는 T세포를 포함하는 조성물의 개체로의 투여량은, 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여목적, 투여조성물의 형태, 투여방법 등에 따라 상이하나, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 투여경로는 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 이환(罹患)부위에 투여되는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 근육 내, 복강 내, 피하 또는 정맥 내 주사, 또는 림프절로의 직접 주입에 의해 주입할 수 있다. 바람직하게는 피하, 복강 내 주사 또는 림프절로의 직접 주입에 의해, 환자에게 투여한다. 수상세포는 일반적으로는 105~109세포, 바람직하게는 106~108세포, 보다 바람직하게는 약 107세포를 환자에게 투여할 수 있다. 투여횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용의 범위에서 복수회 가능하다. 투여대상으로서는 특별히 제한은 없으나, 예를 들면, 닭, 메추라기, 마우스, 랫트, 개, 돼지, 고양이, 소, 토끼, 양, 염소, 원숭이, 및 인간 등을 포함하는 조류, 포유동물(인간 및 비인간 포유동물), 및 기타 척추동물을 들 수 있다.
수상세포는 항종양제로서 유용하다. 예를 들면 종양항원을 제시시킨 수상세포를 종양부위에 투여함으로써, 종양의 증식을 억제할 수 있다. 종양부위란, 종양 또는 그의 주위(예를 들면 종양으로부터 5 ㎜ 이내, 바람직하게는 3 ㎜ 이내)의 영역을 말한다. 수상세포를 종양에 투여하기 전에, 수상세포에 종양항원을 접촉시키면 보다 높은 효과를 얻을 수 있다. 수상세포로의 종양항원의 접촉은, 수상세포와 종양세포의 세포 용해물(cell lysate)을 혼합하는 방법, 종양항원 펩티드를 수상세포에 펄스하는 방법, 또는 수상세포에 종양항원 유전자를 도입하여 발현시키는 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, IFN-β 또는 IFN-β 유전자를 탑재하는 벡터로 DC를 처리하거나, 또는 종양에 직접 주입함으로써 항종양 효과가 증대되는 것을 기대할 수 있다. 예를 들면, IFN-β 유전자를 탑재하는 RNA 바이러스 벡터(예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터)는, 항종양제로서 우수하다. RNA 바이러스 벡터를 도입한 수상세포의 투여와, IFN-β 유전자를 탑재하는 벡터의 종양부위로의 주입을 조합하면, 보다 높은 항종양 효과가 발휘된다.
수상세포에 의해 활성화된 T세포를 투여하는 경우는, 예를 들면 T세포는, 1 ㎡의 체표면적당 약 105~109 세포, 바람직하게는 106~109 세포, 보다 바람직하게는 108~109 세포의 용량으로, 정맥 내 주입에 의해 투여될 수 있다(Ridell 등, 1992, Science 257: 238-241을 참조). 주입은, 소망하는 간격(예를 들면, 매월)으로 반복될 수 있다. 투여 후의 레시피언트(recipient)는, 필요에 따라 임의의 부작용에 대해서, T세포 주입의 사이 또는 주입 후에 모니터되어도 된다. 이 때, T세포는 수상세포를 얻은 환자와 동일한 환자로부터 얻는 것이 바람직하다. 또는, T세포를 환자로부터 채취하고, T세포를 자극하기 위해 사용하는 수상세포는, HLA 적합성의 건강한 정상의 도너(donor)에 유래해도 된다. 또는 반대로, 수상세포를 환자로부터 채취하고, T세포는 HLA 적합성의 건강한 정상의 도너에 유래해도 된다.
본 발명에 의해 제조되는 백신의 유효성분인 수상세포를 포함하는 세포는, 인간 체내에 치료용 백신으로서 접종하기 때문에, 안전성을 높이기 위해 세포 증식성을 없애 두는 것도 가능하다. 예를 들면, 제대혈 유래의 단구는 분화 유도함으로써 증식능이 극도로 저하되는 것이 알려져 있지만, 세포 백신으로서 보다 안전하게 이용하기 위해, 가열처리, 방사선처리, 또는 마이토마이신 C(MMC) 처리 등으로 처리하고, 백신으로서의 기능을 남긴 채, 증식성을 없앨 수 있다. 예를 들면, X선 조사를 이용하는 경우, 총방사선량 1000~3300 Rad로 조사할 수 있다. 마이토마이신 C 처리법은, 예를 들면, 수상세포에 25~50 ㎍/㎖의 마이토마이신 C를 첨가하여, 37℃, 30~60분간 보온처리할 수 있다. 열에 의한 세포처리방법은, 예를 들면, 50~65℃에서 20분간 가열처리를 행할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서 중에 인용된 문헌은, 모두 본 명세서의 일부로서 포함된다.
이하, 실시예 1, 2, 4, 5, 및 그들 실시예의 도면에 있어서, FS36 투여군, GMSCF 투여군, 및 GMIL-4 투여군은, 이하의 조성으로 한다.
FS36 투여군: Flt-3 리간드(20 ng/㎖), 줄기세포인자(Stem cell factor;SCF)(10 ng/㎖), IL-3(10 ng/㎖), IL-6(10 ng/㎖)(FS36으로 약기)를 포함하는 10% FBS 첨가 RPMI1640
GMIL-4 투여군: GM-CSF(20 ng/㎖), IL-4(20 ng/㎖)를 포함하는 10% FBS 첨가 RPMI1640
GMSCF 투여군: GM-CSF(20 ng/㎖), SCF(10 ng/㎖)를 포함하는 10% FBS 첨가 RPMI1640
이하, 실시예 3, 6, 7 및 그들 실시예의 도면에 있어서, GMIL-4 투여군(1), GMIL-4 투여군(2), GMSCF 투여군, 0.1 GMSCF 투여군, 및 0.01 GMSCF 투여군은, 이하의 조성으로 한다.
GMIL-4 투여군(1): 재조합 인간 GM-CSF(25 ng/㎖)(Wako, Japan), 재조합 인간 IL-4(50 ng/㎖)(Wako, Japan)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
GMIL-4 투여군(2): 재조합 인간 GM-CSF(100 ng/㎖)(Wako, Japan), 재조합 인간 IL-4(50 ng/㎖)(Wako, Japan)를 포함하는 10% FBS IMDM
GMSCF 투여군: 재조합 인간 GM-CSF(100 ng/㎖)(Wako, Japan), 재조합 인간 SCF(50 ng/㎖)(Wako, Japan)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
0.1 GMSCF 투여군: 재조합 인간 GM-CSF(10 ng/㎖)(Wako, Japan), 재조합 인간 SCF(5 ng/㎖)(Wako, Japan)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
0.01 GMSCF 투여군: 재조합 인간 GM-CSF(1 ng/㎖)(Wako, Japan), 재조합 인간 SCF(0.5 ng/㎖)(Wako, Japan)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
이하, 실시예 6 및 그들 실시예의 도면에 있어서, (1) iDC 처리, (2) SeV/dF 처리, (3) LPS 처리는 이하의 처리로 한다.
(1) iDC 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
10% FBS 첨가 IMDM
(2) SeV/dF 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
F 유전자가 결실되어 있는 센다이 바이러스(moi=50)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
(3) LPS 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
LPS(1 ㎍/㎖)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
또한 본 실험에서는 이하의 LPS를 사용하였다.
SIGMA 카탈로그 No. L7895-1MG(유래 생물=Salmonella typhosa)
(4) Poly(I:C) 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
Poly(I:C)(100 ㎍/㎖)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
(5) CpG 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
CpG(10 ㎍/㎖)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
(6) R-848 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
R-848(1 ㎍/㎖)을 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
(7) OK432 처리: 하기 농도의 배지에서 2일간 인큐베이션하는 것이다.
OK432(0.5 KE/㎖)(중외제약 일본 표준상품 분류번호 874299)를 포함하는 10% FBS 첨가 IMDM
[실시예 1] 사이토카인에 의한 수상세포(DC) 전구세포의 증폭 및 분화의 확인
먼저, 마우스(C3H)의 대퇴골·경골(脛骨)의 골수로부터 네거티브 셀렉션에 의해, 조혈 전구세포를 채취하였다(SpinSep mouse hematopoietic progenitor enrichment kit, StemCell technologies, Canada). 이 전구세포를 FS36 투여군, GMIL-4 투여군, GMSCF 투여군으로 세 그룹으로 나눠 배양하였다. 배양은 2.4×105세포로부터 시작하여, 3~4일마다 200만 cells/㎖ 이하의 농도가 되도록 계대를 계속하여, 6주간까지 배양하였다. 또한, 그 과정에 있어서, 수상세포(DC) 전구세포가 조제된다(도 1). 그 사이, 세포수를 계수하여, 증식속도를 확인하는 동시에, 항CD11b-FITC, 항CD11c-PE, 항c-kit-PE, 항CD131-PE로 염색 후, FACS 해석을 행하여, 상기 전구세포의 분화능을 확인하였다(도 3).
FS36 투여군에 있어서는, 다른 투여군에 비해, 마우스 조혈 전구세포는 현저히 증폭되고, FS36을 사용한 배양에 의해 21일간에 약 10,000배로 증폭되었다(도 1, 도 2). 또한, 도 2에 있어서 (1)에서 나타내고 있는 사진은, 그래프 중에 (1)에서 나타낸 시점에 대응하고 있고, 마우스 조혈 전구세포를 GMIL-4 투여군의 조건으로 7일간 배양하여 얻어진 DC의 세포형태를 나타낸 사진(현미경으로 관찰)이나, 실시예 1, 2, 4, 5, 및 그들 실시예의 도면에서 나타내는 통상 DC(normal DC)는, 이 세포, 즉 마우스 조혈 전구세포를 GMIL-4 투여군의 조건으로 7일간 배양하여 얻어진 DC로 한다. 또한 통상 DC(normal DC)에 있어서도, 수상돌기를 확인할 수 있다. 또한, 도 2(3)은, 도 8에서 나타내고 있는 FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC의 세포형태를 나타낸 사진(현미경으로 관찰)을 나타내고 있는데, 수상돌기를 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 있어서는, (3)에서 나타내고 있는 사진은 곡선(ii)에 해당하는 과정을 거쳐 얻어진 것이다.
FS36 투여군에 있어서는, 마우스 조혈 전구세포를 배양함으로써, 그 후에 GM-CSF 및 IL-4 등으로 1주간 배양에 의해 수상세포의 마커인 CD11c의 양성이 되는 세포로 분화능을 유지하는 전구세포를 증폭할 수 있었다. 마우스 조혈 전구세포는, FS36을 사용한 배양에 의해 21일간에 약 10,000배로 증폭되었다(도 1, 도 2). 이들 세포를 GM-CSF 및 IL-4, 또는 GM-CSF 및 SCF에 의해 분화시켜서 얻어진 DC에 있어서의 CD11b+ CD11c+ 세포수는, 채취 직후부터 분화시킨 경우와 비교하면 약 470배나 되었다.
이 증폭은 6주에 걸쳤으나(도 1), 분화능은 4주의 증폭 후부터 서서히 떨어졌다. 5주 증폭시킨 후에는, 분화 후의 CD11c 양성 세포수는 급속히 감소되었다. 따라서, CD11c 양성 세포수가 많이 얻어지는 것은, 3주 증폭 후 1주 분화 또는, 4주 증폭 후 1주 분화시켰을 때인 것이 판명되었다(도 10).
또한, 도 4~도 9에 있어서는, FS36 투여군, GMIL-4 투여군, GMSCF 투여군의 조건에 따른 1주간의 마우스 조혈 전구세포의 배양에 있어서의 DC 전구세포의 증식곡선, 및 항CD11b-FITC, 항CD11c-PE를 사용한 세포의 분화를 확인한 결과를 나타내고 있다. 각 도면에, CD11b+/CD11c+율(%)을 나타내었다. 배양방법은 FS36 투여군의 조건으로 증폭 배양시킨 마우스의 골수 조혈 전구세포로부터, 1주마다 106 전후의 세포를 취출하여, GMIL-4 투여군, 또는 GMSCF 투여군의 조건으로 7일간 배양하였다. 분화의 확인을 항CD11b-FITC, 항CD11c-PE를 사용하여 FACS 해석으로 행한 후, CD11b+/CD11c+율에 의해, 세포의 분화효율을 확인하였다. CD11b+/CD11c+율이 가장 높은 조건은, 도 7에 나타내고 있는 FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양한 것이다. 여기에서, CD11b+/CD11c+율이 가장 높다는 것은, DC 전구세포로부터 DC로 분화된 세포의 비율이 높다는 것을 가리키고 있다. 또한, 도 2(3)에서 도 7에서 나타내고 있는 FS36 투여군의 조건으로 4주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양하여 얻어진 DC의 세포형태를 나타낸 사진(현미경으로 관찰)을 나타내고 있는데, 수상돌기를 확인할 수 있었다.
[실시예 2] DC의 분화
마우스 조혈 전구세포로부터 얻어진 DC에 F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)를 moi 50으로 감염, 또는 LPS(1 ㎍/㎖) 첨가 후, 추가적으로 2일간 배양을 행하고, CD80-PerCP, CD86-PerCP, MHC class II-PerCP, CD40-PerCP를 사용하여 DC의 표면 마커의 발현을 플로우 사이토미터(Flow cytometer)에 의해 분석하였다(도 11, 도 12). 그 결과, 센다이 바이러스의 감염 또는 LPS에 의해, 통상 DC(normal DC)와 마찬가지로(도 11(B)), FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 제조한 DC에 있어서는, 보조자극분자(co-stimulatory molecule)인 CD80, CD86의 발현, MHC Class II의 발현, 접착분자(CD40)를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 11(A)).
[실시예 3] GM-CSF 및 SCF에 의한 DC의 증폭
인간 제대혈 CD34+ 세포(Cambrex사로부터 구입)를 GMSCF 투여군 또는 GMIL-4 투여군(1)의 조건으로 35일간 배양하고, 증폭과 분화를 행하였다. 배양기간 중, 배양 3일~7일마다 c-kit, CD11c, CD86의 발현을 플로우 사이토미터에 의해 분석하였다. 1×105개의 인간 제대혈 CD34+ 세포를 GM-CSF 및 SCF를 첨가한 배지 중에서 배양함으로써, CD11c+ 세포가 서서히 증폭하고, 35일 후에는 3.8×109개를 얻을 수 있었다. 또한 32일째에 LPS를 첨가하고, 그 3일 후에 CD11c-PE, CD86-PE로 FACS를 행하였다. 그 결과, 상기 실시예 2의 결과와 마찬가지로, LPS에 의해 CD86의 발현이 증강되는 것이 확인되었다(도 16). 이와 같이, 마우스, 인간 모두, CD11c+ 세포를 사이토카인 카테터에 의해 증폭시킬 수 있다(도 13, 14, 및 15).
[실시예 4] 증폭된 DC의 사이토카인 생산량 및 항원 흡수능 및 T세포로의 증식·활성화능의 검토
FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC에 대해서, 사이토카인 생산량(도 17) 및 항원 흡수능(도 18) 및 T세포로의 증식·활성화능의 검토(도 19)를 행하였다.
마우스 골수 유래 조혈 전구세포를 FS36 투여군의 조건으로 3주간 배양하고, 그후에 배지를 GMIL-4 투여군의 조건으로 하여, 1주간 배양함으로써 얻어진 DC는, 통상 DC(normal DC)(마우스 조혈 전구세포를 GMIL-4 투여군의 조건으로 7일간 배양하여 얻은 것)와 마찬가지로, IL-12 및 IFN-β의 생산이 확인되어(도 17), 항원 흡수능(도 18) 및 T세포의 증식·활성화능(도 19)을 가지고 있는 것이 나타내어졌다.
[실시예 5] 증폭 DC 투여에 의한 마우스 골육종의 폐전이 억제
<샘플의 조제>
마우스 조혈 전구세포 유래의 DC(1×105개)에 종양 용해액(3×105개 종양세포가 들어 있음)을 첨가하고, 8시간 인큐베이션하였다. 그 다음, 그 DC에 F 유전자 결실형 센다이 바이러스(SeV/dF)(moi 50)를 도입하고, 추가적으로 2일간 배양을 행하였다. 그 배양 후의 DC를 마우스(C3H, 7주령 암컷 마우스)의 꼬리정맥에 투여하였다. 투여 2일 후, LM8 마우스 골육종 세포를 마우스의 꼬리정맥에 투여하였다. LM8 마우스 골육종 세포 투여 17일 후, 마우스를 개흉하고, 폐로의 전이 결절 수를 육안으로 계수하였다(도 20).
<결과>
FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 추가적으로 GMIL-4 투여군 또는 GMSCF 투여군의 조건으로 하여 1주간 배양하여 얻어진 DC(도 20의 (3) 및 (4) 참조)의 투여에 있어서, 통상 DC(normal DC)(마우스 조혈 전구세포를 GMIL-4 투여군의 조건으로 7일간 배양하여 얻은 것)와 마찬가지로, 폐로의 암전이가 억제된 것을 확인할 수 있었다. FS36 투여군의 조건으로 배양하고, 그 후에 배지를 GMIL-4 투여군 또는 GMSCF 투여군의 조건으로 하여, 추가적으로 1주간 배양하여 얻어진 DC가 암치료에 유용한 것이 시사되었다.
[실시예 6] GM-CSF 및 SCF에 의한 인간 유래 수상세포 전구세포로부터의 DC의 증폭(그 첫번째)
<실험 1>
인간 제대혈 유래 CD34+ 세포(Lonza사로부터 구입) 및 인간 G-CSF 처치 말초혈 유래 CD34+ 세포(Lonza사로부터 구입)를, GM-CSF 및 SCF를 포함하는 배지에서, 35일간 배양하여, 증폭과 분화를 행하였다.
<실험 1의 결과>
도 21(A), (B)에 나타낸 결과로부터 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양 및 인간 G-CSF 처치 후 말초혈 유래 CD34+ 세포의 배양으로도, GM-CSF 및 SCF를 첨가한 배지 중에서 배양함으로써, 대량으로 세포를 얻을 수 있었다(도 21, 도 22). 또한 그 세포는 CD11c 양성(+)세포의 비율이 높다(도 21(C), (D), 도 22(B)).
또한 도면에 기재된 GMSCF 투여군에 있어서, 배양 35일 시점에서의 세포에 상기 LPS 처리를 한 것에 대해서는, 수상돌기를 확인할 수 있었다(도 23).
<실험 2>
실험 1에서 나타내고 있는 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배 양 14일과 배양 35일 시점의 세포 중 CD11c 양성(+)세포에 대한 CD11b, CD33, HLA-ABC의 발현을 플로우 사이토미터에 의해 분석하였다(도 24). 성숙한 수상세포라면, CD11c 양성(+)이며 또한 CD11b 양성(+), CD11c 양성(+)이며 또한 CD33 양성(+), 및 CD11c 양성(+)이며 또한 HLA-ABC 양성(+)이라는 경향이 나타내어진다.
또한, 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포에 대해서, LPS 처리 또는 SeV/dF 처리한 경우에 있어서의, ICAM-1, CD86, HLA-DR, CD40, CD80, 및 CCR7의 발현을 플로우 사이토미터에 의해 분석하였다(도 25). 성숙한 수상세포라면, LPS 처리 또는 SeV/dF 처리한 경우에 있어서, 처리하지 않은 경우(iDC 처리)와 비교하여, ICAM-1, CD86, HLA-DR, CD40, CD80, 및 CCR7의 발현이 항진되는 경향이 나타내어진다(Nauta AJ., et al. Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells. J Immunol 177(4), 2080-2087 (2006))(Yoneyama, Y., et al. Development of immunostimulatory virotherapy using non-transmissible Sendai virus-activated dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun 355, 129-135 (2007)).
<실험 2의 결과>
도 24에서 나타내고 있는 결과로부터(도면 중의 화살표를 참조), CD11c 양성(+)이며 또한 CD11b 양성(+), CD11c 양성(+)이며 또한 CD33 양성(+), 및 CD11c 양성(+)이며 또한 HLA-ABC 양성(+)이라는 경향이 나타내어졌다.
또한, 도 25에서 나타내고 있는 결과로부터, LPS 처리 또는 SeV/dF 처리한 경우에 있어서, 처리하지 않은 경우(iDC 처리)와 비교하여, ICAM-1, CD86, HLA-DR, CD40, CD80, 및 CCR7의 발현이 항진되는 경향이 나타내어졌다.
따라서, 도 24 및 도 25에 나타내어진 결과로부터, GM-CSF 및 SCF를 포함하는 배지에서 배양하여 증폭된 세포는, 표면 마커의 발현 경향으로부터, 수상세포일 가능성이 시사된다.
<실험 3>
인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포에 대해서, 식작용(phagocytosis)의 능력을 조사하였다(도 26).
<실험 3의 결과>
세포의 식작용의 능력이 매우 낮은 4℃의 조건과 비교하여, 37℃의 조건에 있어서는, 세포의 식작용의 능력이 항진되어 있는 것이 판명되었다(도 26).
그리고, 37℃의 조건에 있어서, iDC 처리와 비교하여, LPS 처리를 한 것에 있어서는, 세포의 식작용의 능력이 저하되어 있는 것이 판명되었다. 수상세포는 성숙에 수반하여 탐식능력이 저하되는 것이 알려져 있는 것을 감안하면(Yoneyama, Y., et al. Development of immunostimulatory virotherapy using non-transmissible Sendai virus-activated dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun 355, 129-135 (2007)), 본 실험에서 사용하고 있는 세포(GM-CSF 및 SCF를 포함하는 배지에서 배양하여 증폭시킨 세포)는, 수상세포일 가능성이 시사된다.
<실험 4>
인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 배양기간 중, 배양 35일 시점의 세포에 대해서, 사이토카인 생산능을 조사하였다. 실험에 있어서는, 벡톤·딕킨슨 앤드 컴퍼니(BD)사의 Human Inflammation Kit(카탈로그 번호: 551811)를 사용하였다(도 27).
<실험 4의 결과>
LPS 등의 자극에 의해, IL-6, TNF-α, IL-1β의 생산능이 높아졌다. GM-CSF 및 SCF를 포함하는 배지에서 배양하여 증폭시킨 세포는, 사이토카인을 생산하는 능력이 있는 것으로 생각된다(도 27).
<실험 5>
림프구의 증식 자극능의 검토를 행하였다(도 28). 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포로부터 GMSCF 배지에서의 배양을 통해 얻은 DC를 마이토마이신 C(MMC)로 처리하고, CD3+ T세포와 이하의 비율로 혼합하였다.
혼합군 1에 대해서
MMC 처리한 DC 수 : CD3+ T세포수 = 1:100
혼합군 2에 대해서
MMC 처리한 DC 수 : CD3+ T세포수 = 1:10
상기 혼합한 세포를 5일간 배양하였다. 또한, 혼합군 2에 대해서는 T세포의 증식을 측정하였다.
<실험 5의 결과>
혼합군 2에 있어서, 혼합군 1에 비해 LPS 등의 자극에 의한 효과가 높은 것이 나타내어졌다(도 28). 또한 상기 DC가 T세포의 증식·활성화능(도 28)을 가지고 있는 것이 나타내어졌다.
따라서, 실험 1~실험 5의 결과로부터, 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 GMSCF 투여군의 조건으로의 배양을 통해 얻은 세포가, 성숙한 수상세포라는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는, 얻어진 세포가 자극에 의해 전형적인 수상돌기를 형성하는 것, MHC Class II 분자, 접착분자, 보조자극분자를 발현하는 것, 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α, IL-1β를 포함한다)을 발현하는 것, 엔도사이토시스 활성(endocytic activity)을 가지며, 알로스티뮬레이토리 활성(allostimulatory activity)을 갖는 것을 나타내고 있다. 즉 실험 2~5의 결과로부터, 실험 1에서 나타내어져 있는 GMSCF 투여군의 조건으로 배양한 세포는, 생물활성이 있는 수상세포로 생각된다. 따라서, GM-CSF 및 SCF를 포함하는 배지에서, 수상세포 전구세포로부터 수상세포를 제조할 수 있다는 것이 명확해졌다.
[실시예 7] GM-CSF 및 SCF에 의한 인간 유래 세포로부터의 DC의 증폭(그 두번째)
도 29에서는, GM-CSF/SCF의 농도에 따른 DC 증식의 영향을 나타내고 있다. GM-CSF(100 ng/㎖) 및 SCF(50 ng/㎖)의 농도를 1/10로 저하시켜도(10 ng/㎖ GM-CSF, 5 ng/㎖ SCF), 세포수는 약간 저하되지만 높은 증식성은 유지되었다. GM-CSF(100 ng/㎖) 및 SCF(50 ng/㎖)의 농도를 1/100로 저하시킨 경우(1 ng/㎖ GM- CSF, 0.5 ng/㎖ SCF)에도, DC를 증폭시킬 수 있다. 그리고, 35일간 배양시점에 있어서의 CD11c 양성 세포율에 대해서 도 30에서 나타내고 있다. 어느 투여군도 CD11c 양성 세포율이 높다.
도 29 및 도 30에 나타내고 있는 데이터로부터, 효율적으로 DC를 증폭시키기 위해서는, GM-CSF를 1 ng/㎖보다 높은 농도로, 및 SCF를 0.5 ng/㎖보다 높은 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 0.01 GMSCF 투여군의 조건으로 배양해도 DC를 증폭시킬 수 있기 때문에, 적은 사이토카인량으로 효율적으로 DC를 증폭시킬 수 있는 것이 시사되어, 본 발명의 방법이 제조비용이 억제된 DC 제조방법으로 되는 것을 기대할 수 있다.
본 발명에 의해, 수상세포를 대량으로 제조하는 것이 가능해졌다. 제조된 DC는, 암항원을 제시시켜서 항종양 DC 백신으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면, 환자로부터 얻어지는 DC 전구세포가 적더라도 대량의 DC를 효율적으로 제조하는 것이 가능해졌다. 이 제조방법에 의해 얻어진 DC는, 높은 항종양효과가 있어, 암 및 감염증 등의 면역치료에 유용한 DC 백신으로서 유용하다. 본 발명은 암에 대한 면역요법에 크게 공헌하는 것이 기대된다.
Claims (8)
- 수상세포를 제조하는 방법으로서, 수상세포 전구세포를 과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 줄기세포인자(SCF)의 존재하로서, 종양괴사인자-α(TNF-α)를 첨가하지 않거나, 1 ng/㎖ 이하의 농도에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,수상세포 전구세포는 인간 유래의 세포인 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서,상기 공정이 수상세포 전구세포를 과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 1 ng/㎖ 이상, 및 줄기세포인자(SCF) 0.5 ng/㎖ 이상의 존재하에서 배양하는 공정인 방법.
- 제4항에 있어서,상기 공정이 수상세포 전구세포를 과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 10 ng/㎖ 이상, 및 줄기세포인자(SCF) 5 ng/㎖ 이상의 존재하에서 배양하는 공정인 방법.
- 제4항에 있어서,상기 공정이 수상세포 전구세포를 과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 1 ng/㎖~100 ng/㎖, 및 줄기세포인자(SCF) 0.5 ng/㎖~50 ng/㎖의 존재하에서 배양하는 공정인 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서,과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 줄기세포인자(SCF)의 존재하에서 배양하는 배양기간이 2주간 이상인 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서,과립구/마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 줄기세포인자(SCF)의 존재하에서 배양하는 배양기간이 3~6주간인 방법.
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