DE60133767T2

DE60133767T2 - Für fibroblasten-wachstumsfaktor 2 (fgf2) kodierender paramyxovirus-vektor und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60133767T2
Application number: DE60133767T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Fukuoka-shi YONEMITSU; Katsuo Fukuoka-shi SUEISHI; Masayuki Ikeda-shi FUKUMURA; Xiaogang Alhambra HOU; Mamoru Tsukuba-shi HASEGAWA
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2000-11-27
Filing date: 2001-11-27
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2021-11-28
Also published as: US20110212059A1; KR20030074627A; JP4212357B2; ATE393235T1; CN100357443C; US20100158867A1; JPWO2002042481A1; EP1344829B1; ES2305138T3; KR100812884B1; EP1344829A4; WO2002042481A1; CA2430112A1; US20040005296A1; US8211868B2; DE60133767D1; DK1344829T3; CN1487999A; AU2002224113A1; CA2430112C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, und ihre Verwendung.
Hintergrundwissen
Die neuere Forschung für die Behandlung von ischämischen Krankheiten ist unter Verwendung von Wachstumsfaktoren durchgeführt worden, die die Angiogenese induzieren. Zum Beispiel ist die therapeutische Wirkung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) (Baffour, R. et al., J. Vasc. Surg. 16 (2): 181–91, 1992) und endothelialem Zell-Wachstumsfaktor (ECGF) (Pu, L. Q. et al., J. Surg. Res. 54 (6): 575–83, 1993) auf Patienten mit Herzinfarkt und akuter Extremitäten-Ischämie untersucht worden. Eine kürzliche Untersuchung hat offenbart, dass der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF)/vaskuläre Permeabiliätsfaktor (VPF) in Tiermodellen mit Myokard-Ischämie und Extremitäten-Ischämie die Vasculogenese fördert (Takeshita, S. et al., Circulation 90 (5 Pkt. 2): 11228–34, 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93 (2): 662–70, 1994).
Klinische Versuche der menschlichen Gentherapie unter Verwendung von angiogenen Wachstumsfaktoren sind vor kurzem durchgeführt worden. Die menschliche Gentherapie ist klinisch auf die therapeutische Angiogenese angewendet worden, um eine kritisch ischämische Extremität zu behandeln. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor/vaskuläre Permeabilitätsfaktor (VEGF/VPF), ein endotheliales zellspezifisches Mitogen, ist ein starkes therapeutisches Gen für diesen Zweck, und es hat relativ vielversprechende Ergebnisse durch Plasmid-basierenden Gentransfer, der menschliche Patienten involviert, gezeigt (Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114–1123 (1998); Isner, J. M. et al., J. Vasc. Surg. 28, 964–973 (1998)). Die damit einhergehenden schädlichen Wirkungen und die Toxizitätsspiegel des intramuskulären Gentransfers von VEGF sind jedoch derzeit weniger dokumentiert worden, weil die Wirksamkeit des Plasmid-vermittelten intramuskulären Gentransfers und die Expression nicht sehr hoch sind. Da neue Berichte darauf hinweisen, dass eine transgene (Thurston, G., et al., Science 286, 2511–2514 (1999)) oder adenovirale (Thurston G., et al., Nature Med. 6, 460–463 (2000)) Überexpression von VEGF zu einer abnormalen Vasculogenese in den Transgen-eingebrachten Tieren führt und dass der Plasmid-basierende intramuskuläre VEGF-Gentransfer ein transitorisches Ödem in menschlichen Patienten mit einer ischämischen Extremität zeigte (Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114–1123 (1998); Isner, J. M., et al., J. Vasc. Surg. 28, 964–973 (1998)), bleiben die detaillierten Mechanismen, die diese Pathologien verursachen, aufzuklären. Andere potenzielle ungünstige Wirkungen der VEGF-Überexpression sind wahrscheinlich die Bildung von „Angiom-ähnlichen" brüchigen Kapillargefäßen, möglicherweise aufgrund des Ungleichgewichts von angiogenen Signalen (Carmeliet, P., Nature Med. 6, 1102–1103 (2000)). Ein VEGF-Gentransfer in die Gefäßwand in vivo kann eine angiomatöse endotheliale Proliferation von Erythrocyten bei der starken Neointima-Bildung, die mit einer Extravasation assoziiert ist, bewirken (Yonemitsu, Y., et al., Lab. Invest. 75, 313–323 (1996)). Ähnliche pathologische Ergebnisse wurden in einer Retrovirus-vermittelten konstitutiven Überexpression von VEGF im Myokard gezeigt (Lee, R. J., et al., Circulation 102, 898–901 (2000)). Darüber hinaus ist ein anderes wichtiges Thema, das in einer klinischen Einrichtung angesprochen werden muss, der Grad des Austretens dieser lokal exprimierten angiogenen Faktoren in den systemischen Kreislauf. Solch ein Austreten kann unerwartete angiogene Komplikationen bewirken, die mit einer diabetischen Retinopathie oder dem Wachstum eines Neoplasmas assoziiert sind.
Eine akute kritische Extremitäten-Ischämie, die aus der akuten Verstopfung der Hauptarterien resultiert, wird vorwiegend durch eine thrombotische Verstopfung verursacht und ist ein wichtiges Ziel der therapeutischen Angiogenese. Eine akute kritische Extremitäten-Ischämie wird ziemlich erfolglos in späten Interventionen behandelt, was oft zu einer Extremitäten-Amputation führt. Darüber hinaus ist die Langzeit-Prognose von Patienten mit einer Extremitäten-Amputation schlecht, und die Ein-Jahres-Überlebensrate von Patienten nach der Operation ist nur 50%. Die Spiegel der Plasmid-basierenden Genexpression sind niedrig, und die Wirksamkeit der Plasmid-basierenden Therapie für einen akuten schweren Arterienverschluss ist noch immer unbekannt.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, und deren Verwendung bereitzustellen. Spezifischer liefert die vorliegende Erfindung Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, angiogene Zusammensetzungen, einschließlich der Vektoren, und Verfahren zum Fördern der Angiogenese in ischämischen Geweben unter Verwendung der Vektoren.
Voruntersuchungen durch die vorliegenden Erfinder weisen auf erfolglose Ergebnisse hin, in denen eine Extremitäten-Erhaltung durch Plasmid-basierenden menschlichen VEGF165-Gentranfer in einem Mausmodell der akuten kritischen Extremitäten-Ischämie erzielt wurde (Daten nicht gezeigt). Um zu testen, ob eine höhere Expression des Transgens ein besseres Ergebnis zeigen kann, verwendeten die vorliegenden Erfinder durch rekombinantes Sendai-Virus (SeV) vermittelten Gentransfer, eine Technik, die einen hoch-wirksamen Gentransfer in verschiedene Organe zeigt. Wie in den Beispielen dieser Anmeldung gezeigt, verwendeten die vorliegenden Erfinder zwei rekombinante SeV-Vektoren als therapeutische Mittel für die Extremitäten-Ischämie: einen, der den menschlichen VEGF165 exprimiert, und den anderen, der den murinen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) exprimiert. FGF2 (oft als bFGF bezeichnet)-Protein ist ein Wachstumsfaktor, der eine angiogene Wirkung zeigt, wenn er verabreicht wird (Baffour, R. et al., J. Vasc. Surg. 16: 181–191 (1992)).
Unter Verwendung dieser Vektoren analysierten die vorliegenden Erfinder 1) den Transgen-Expressionsspiegel und die Kinetik des SeV-vermittelten intramuskulären Gentransfers; 2) ob eine höhere Expression der angiogenen Faktoren eine Extremitäten-Nekrose verhindern kann, die durch akute kritische Extremitäten-Ischämie oder irgendwelche schädlichen Wirkungen verursacht wird; und 3) ob die höhere Expression der angiogenen Proteine in den Muskeln zu ihrem Austreten in den systemischen Kreislauf führt.
Die Erfinder verwendeten ischämische Mausmodelle, einschließlich BALG/c nu/nu-untere Gliedmaßen-Amputations-Modelle (Auto-Amputations-Modell), in denen die gesamte externe Ilias-Arterie und -Vene und die Femoral-Arterie und -Vene oberhalb des Knies exzidiert wurden (kritisches Ischämie-Modell), und C57BL/6-Extremitäten-Erhaltungs-Modelle, die aufgrund einer physiologischen Angiogenese nach derselben chirurgischen Vorgehensweise wie vorstehend ihre unteren Gliedmaßen nicht verlieren. Vektoren, die den menschlichen VEGF165, den Maus-FGF2 oder Luciferase (SeV-hVEGF165, SeV-mFGF2 beziehungsweise SeV-Luciferase) exprimieren, wurden konstruiert und zwei Tage vor der ischämischen Operation in die Oberschenkel- und Unterschenkel-Muskeln verabreicht. Die unteren Extremitäten wurden bis zu 10 Tage nach der Operation beobachtet.
Im Fall des Luciferase-Gentransfers in den unteren Maus-Extremitäts-Skelettmuskel zeigte SeV 5- bis 120-fach höhere Genexpressionsspiegel im Vergleich zu Kontroll-Plasmidvektoren, die in einer Menge von 100 μg (200 mg/60 kg menschlichem Körpergewicht: entsprechend 25- bis 50-fach der klinischen Dosis) verabreicht wurden. In verschiedenen Zellkulturen zeigten sowohl SeV-hVEGF165 als auch SeV-mFGF2 einen hohen Protein-Sekretionsspiegel (50 bis 500 ng/10⁵ Zellen/24 Stunden). Der FGF2-Spiegel wurde durch die intramuskuläre Verabreichung von SeV-mFGF2 im Vergleich zu nicht-verabreichten Kontrollen (Grundlinie) 5- bis 100-fach erhöht. Im Gegensatz dazu bewirkte die Verabreichung von SeV-hVEGF165 nur eine eingeschränkte Expression von VEGF im Muskel (höchstens 2-fach über der Grundlinie) und erhöhte die Expression von endogenem VEGF signifikant. 2 Tage nach der Verabreichung wurde eine weit ausgedehnte Nekrose in Muskelgeweben beobachtet, wo SeV-hVEGF165 verabreicht worden war, und die Amputation der unteren Extremitäten wurde gefördert. Auf der anderen Seite zeigte die SeV-mFGF2-Verabreichung mit einem Anstieg in der endogenen VEGF-Expression eine signifikante therapeutische Wirkung auf die Extremitäten-Erhaltung. In beiden Fällen wurde kein signifikantes Auslaufen der Vektor-abgeleiteten Proteine in das Serum beobachtet (< 5 pg/ml). Alle Extremitäten wurden in den nicht-verabreichten, SeV-Luciferase- und SeV-mFGF2-Gruppen gerettet, ein Drittel oder mehr der SeV-hVEGF-Gruppe-Mäuse im Extremitäten-Erhaltungsmodell verloren jedoch ihre unteren Extremitäten. Im Auto-Amputationsmodell zeigte nur die FGF2- Gruppe eine hohe Extremitäten-Erhaltungswirkung, die unteren Extremitäten der meisten der Mäuse in den anderen Gruppen wurden jedoch auto-amputiert.
Die vorliegende Erfindung offenbarte, dass die intramuskuläre Verabreichung von rekombinanten Sendai-Virus-Vektoren die Transgen-Expression signifikant erhöhte. Rekombinante Sendai-Virus-Vektoren zeigen eine 10- bis 100-fach höhere Expression als Plasmidvektoren. Es wurde jedoch gefunden, dass die in vitro-Verabreichung von rekombinanten Sendai-Virus-Vektoren, die VEGF165 exprimieren, die Extremitäten-Amputation im akuten schweren Ischämie-Mausmodell förderte. Die Verabreichung von SeV-hVEGF165 induzierte ein Ödem (Beispiel 4, 8), verhinderte die Durchblutung nach der ischämischen Operation (Beispiel 5, 11 und 12) und erhöhte den Anteil der Extremitäten-Amputation durch die Ischämie signifikant (Beispiel 5, 9 und 10). Diese Pathologien würden zum Teil aufgrund der starken vaskulären Permeabilitäts-erhöhenden Aktivität von VEGF erfolgen. Im Gegensatz dazu zeigte die Verabreichung von Sendai-Virus, das FGF2 exprimiert, konsistent eine hohe therapeutische Wirkung. In beiden Modellen legte die Tatsache, dass keine rekombinanten Proteine im systemischen Kreislaufsystem nachgewiesen wurden, nahe, dass eine SeV-vermittelte FGF2-Therapie geringe Wirkungen auf andere Organe oder weite Sicherheitsgebiete hat. Diese Ergebnisse wiesen auch darauf hin, dass die Aufmerksamkeit auf unerwünschte Wirkungen gerichtet werden muss, die in menschlichen klinischen Anwendungen durch VEGF in bestimmten Extremitäten-Zuständen bewirkt werden. Daher würde die FGF2-Gentherapie, die einen weiten Bereich der Sicherheit und therapeutischen Wirkung zeigt, ein sicheres Gentherapie-System sein. Darüber hinaus zeigte die vorliegende Erfindung die Wirkung des SeV-Vektors, der ein starkes Mittel zum Einbringen von therapeutischen Genen in vitro ist, und ermöglicht seine Verwendung in der klinischen Therapie für eine akute stark ischämische Extremität.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Paramyxovirus-Vektoren, die angiogene Gene codieren, und deren Verwendung. Spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf:

(1) einen Paramyxovirus-Vektor, der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, der in der Lage ist, exprimiert zu werden;
(2) den Paramyxovirus-Vektor von (1), wobei das Paramyxovirus Sendai-Virus ist;
(3) den Paramyxovirus-Vektor von (1), wobei dem Vektor das F-Gen fehlt;
(4) ein Arzneimittel, umfassend den Paramyxovirus-Vektor von einem von (1) bis (3) oder eine Zelle, enthaltend den Vektor und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff;
(5) das Arzneimittel von (4), wobei die Zusammensetzung eine angiogene Zusammensetzung ist;
(6) die Zusammensetzung von (4) oder (5), wobei die Zusammensetzung für die Behandlung von ischämischen Geweben ist;
(7) die Zusammensetzung von (4) oder (5), wobei die Zusammensetzung für die intramuskuläre Verabreichung geeignet ist;
(8) die Verwendung der angiogenen Zusammensetzung von einem von (4) bis (7) für die Herstellung eines Arzneimittels zum Induzieren der Angiogenese; und
(9) die Verwendung der angiogenen Zusammensetzung, wie in einem von (4) bis (7) definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischen Geweben oder ischämischen Krankheiten.

Unter Verwendung von rekombinantem SeV als ein starkes Mittel zum Fördern der therapeutischen Gene in Muskeln charakterisierten die vorliegenden Erfinder die in vivo-Wirkung der angiogenen Faktoren VEGF165 und FGF2 auf eine akute schwere Extremitäten-Ischämie. Die Schlüsselaspekte, die in dieser Untersuchung erhalten wurden, waren; 1) eine Extremitäten-Ischämie-induzierter endogener VEGF diffundierte eher in den systemischen Kreislauf als dass er sich in Muskeln konzentrierte, und die Expression von VEGF165, die durch den Vektor der vorliegenden Erfindung vermittelt wird, läuft nicht signifikant in den systemischen Kreislauf aus; 2) die exogene FGF2-Expression, 5- bis 100-fach höher als die endogene, führte nicht zu einer signifikanten systemischen Diffusion; 3) dieser Spiegel der FGF2-Expression induziert auch eine endogene VEGF-Expression und zeigte eine signifikante Extremitäten-Erhaltungswirkung, die eine signifikant ansteigende Extremitäten-Durchblutung verbindet; und 4) die Überexpression von VEGF165 induzierte im Gegensatz zu jener von FGF2 offensichtlich die Extremitäten-Schädigung. Diese Ergebnisse legen die klinische Realisierbarkeit von FGF2 mit einem breiteren Sicherheitsbereich als ein therapeutischer angiogener Faktor, um eine akute klinische Extremitäten-Ischämie zu behandeln, nahe. Darüber hinaus sind die vorliegenden Erfinder die ersten, die eine schwere schädliche Wirkung des VEGF165-Gentransfers auf die Extremitäten-Ischämie offenlegen.
Interessanterweise fanden die vorliegenden Erfinder, dass Extremitäten-Ischämie-induzierter endogener VEGF eher in den systemischen Kreislauf diffundiert als dass er sich im Muskel selbst konzentriert. Obwohl eine durch eine ischämische Operation induzierte endogene VEGF-Expression in Muskeln und endothelialen Zellen (ECs) bereits angesprochen wurde (Florkiewicz, R. Z. et al., J. Cell. Physiol. 162, 388–399 (1995)), sind die vorliegenden Erfinder die ersten, die zeigen, dass endogener VEGF für die Induktion einer systemischen aber nicht für eine lokale angiogene Antwort verantwortlich zu sein scheint. Asahara et al. zeigten, dass eine systemische Verabreichung von VEGF endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) mobilisiert (Asahara, T. et al., EMBO J. 18, 3964–3972 (1999)), was nahe legt, dass eine physiologische Antwort auf eine Extremitäten-Ischämie, die kollaterale Gefäße bildet, in einem gewissen Ausmaß eher von einer EPC-vermittelten „Vasculogeneseähnlichen" Neovaskularisierung als von einer lokalen Angiogenese durch proliferierende ECs, die aus bereits vorhandenen Gefäßen sprießen, abhängig zu sein scheint (Isner J. M., J. Clin. Invest. 106, 615–619 (2000)). Da durch den Gentransfer verstärkter VEGF in einer ischämischen Extremität zu einem Fehlen einer signifikanten Durchblutung und in einer Extremitäten-Amputation führte, wie hier gezeigt, kann in diesem Fall VEGF vielmehr dominant als „vaskulärer Permeabilitätsfaktor" als als „angiogener Faktor" wirken. Dies kann auch durch die Histologie der Muskeln unterstützt werden, die offensichtlich ein ausgedehnteres intermuskuläres Ödem in der VEGF165-Gruppe anzeigt.
Zweitens zeigten die vorliegenden Erfinder, dass eine FGF2-Gentherapie allein wirksam ist, um eine ischämische Extremität zu behandeln, und eine endogene VEGF-Funktion in vivo involviert. Sogar wenn die Gesamt-Proteinkonzentration von VEGF im Muskel durch den FGF2-Gentransfer ähnlich zu jener des VEGF-Gentransfers war, war die FGF2-Gentherapie selbst aber nicht VEGF ausreichend wirksam. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht nur VEGF sondern auch FGF2 notwendig sein kann, um reife Blutgefäße für therapeutische Durchblutung zu ischämischen Extremitäten zu bilden und um eine vaskuläre Undichtheit zu verhindern. Darüber hinaus kann Angiopoietin-1, ein angiogener Faktor, der eine vaskuläre Undichtheit von VEGF-induzierten unreifen Gefäßen verhindert, dazu beitragen.
Mit dem Grund, warum eine Injektion von SeV-VEGF165 keine vergleichbare Expression zu SeV-FGF2 oder SeV-Luciferase im Muskel in vivo zeigen konnte, befasst man sich noch immer nicht vollständig, weil SeV-VEGF165 in vitro ausreichend wirkt, um ein Genprodukt ähnlich zu SeV-FGF2 zu sezernieren. Ähnlich zu der histologischen Untersuchung zeigte die Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebung (LDPI) ausgedehnt geschädigtes Muskelgewebe, dem eine Durchblutung fehlt. Daher kann es möglich sein, dass die zelluläre Maschinerie der SeV-vermittelten Transkription, einschließlich Tubulin (Moyer, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5405–5409 (1986)) und Phosphoglycerat-Kinase (Ogino, T., et al., J. Biol. Chem. 274, 35999–36008 (1999)), aufgrund des Ödems, das durch VEGF165-induzierte Gewebeschädigung verursacht wurde, gestört sein kann. Umgekehrt verstärkte ein relativ niedriger Spiegel einer exogenen VEGF165-Genexpression das endogene VEGF merklich (ungefähr 200 pg/g Muskel) in stark ischämischen Muskeln (1400 pg/g Muskel), was zu einer beschleunigten Extremitäten-Amputation führte. Diese Ergebnisse legen deutlich nahe, dass eine verstärkte Konzentration von VEGF im Muskel, sogar wenn sie relativ niedrig und etwa 2-fach höher als die Grundlinie ist, Extremitäten in eine kritische Extremitäten-Ischämie führen kann.
Die Angiogenese wird als ein gut harmonisierter Prozess angesehen, und viele Faktoren können involviert sein. Unter diesen Faktoren ist die biologische Funktion von VEGF hochgradig dosisabhängig, was zu einem verhängnisvollen Defekt sogar bei einem einzelnen Allelverlust führt (Carmeliet, P. et al., Nature 380, 435–439 (1996)). Die konstitutive VEGF-Expression ist während des gesamten Vorgangs der vaskulären Integrität und Reifung notwendig, weil eine transitorische VEGF-Expression nur kurzzeitige angiogene Antworten induziert (Pettersson, A. et al., Lab. Invest. 80, 99–115 (2000)) und weiterhin die VEGF-induzierte Kapillarähnliche Struktur selten Verbindungen mit bereits bestehenden Blutgefäßen aufnimmt (Springer, M. L., et al., Mol. Cell 2, 549–558 (1998)). Daher legt die vorliegende Erfindung nahe, dass eine mehr als 2-fach höhere Konzentration von VEGF im Muskel ohne ausreichenden FGF2 wahrscheinlich stark toxisch ist. In Anbetracht dessen sollte eine vorsichtigere Aufmerksamkeit denn je auf die Verwendung von VEGF für eine therapeutische Angiogenese gelenkt werden, obwohl VEGF noch ein großes klinisches Potenzial behält. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der intramuskuläre FGF2-Gentransfer sicher und signifikant therapeutisch wirksam für die Extremitäten-Erhaltung in akuten schweren Extremitäten-Ischämie-Fällen ist.
Hierin wird ein „Paramyxovirus-Vektor" als ein Vektor (oder Trägerstoff) definiert, der von dem Paramyxovirus abgeleitet ist und der für einen Gentransfer in Wirtszellen verwendet wird. Der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung kann ein Ribonucleoprotein (RNP) oder ein Viruspartikel sein, das eine Infektiosität aufweist. Hierin wird der Begriff „Infektiosität" als eine Fähigkeit des rekombinanten Paramyxovirus-Vektors definiert, durch seine Zelladhäsions- und Membranfusions-Fähigkeiten ein Gen, das im Vektor enthalten ist, zu Zellen, an die der Vektor angehaftet ist, zu transferieren. Der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung kann eine Replikationsfähigkeit aufweisen oder kann ein defekter Vektor ohne die Replikationsfähigkeit sein. Hierin wird „Replikationsfähigkeit" als die Fähigkeit des Virusvektors definiert, sich zu replizieren und infektiöse Viruspartikel in Wirtszellen, die mit den Virusvektoren infiziert wurden, zu produzieren. Die Replikationsfähigkeit kann unter Verwendung von zum Beispiel der Affennierenabgeleiteten Zelllinie LLC-MK2 oder CV-1 bestimmt werden.
Hierin wird ein „rekombinanter" Paramyxovirus-Vektor als ein Paramyxovirus-Vektor, der durch Gentechnik konstruiert wurde, oder seine amplifizierten Produkte definiert. Zum Beispiel können rekombinante Paramyxovirus-Vektoren durch Rekonstitution einer rekombinanten Paramyxovirus-cDNA hergestellt werden.
Hierin wird ein Paramyxovirus als ein Virus der Paramyxoviridae-Familie oder ein Derivat davon definiert. In der vorliegenden Erfindung verwendete Paramyxoviren schließen zum Beispiel Viren, die zu den Paramyxoviridae gehören, wie Sendai-Virus, Newcastle-Krankheit-Virus, Mumps-Virus, Masern-Virus, respiratorisches Syncytium-Virus, Rinderpest-Virus, Staupe-Virus, Affen-Parainfluenza-Virus (SV5) und menschliches Typ I-, II- und III-Parainfluenza-Virus ein. Das Virus der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise ein Virus der Gattung Paramyxovirus oder ein Derivat davon sein. Das Paramyxovirus, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt zum Beispiel menschliches Typ I-Parainfluenza-Virus (HPIV-1), menschliches Typ III-Parainfluenza-Virus (HPIV-3), bovines Typ III-Parainfluenza-Virus (BPIV-3), Sendai-Virus (auch als „Maus-Typ I-Parainfluenza- Virus" bezeichnet), Typ X-Affen-Parainfluenza-Virus (SPIV-10) usw. ein. Das bevorzugteste Paramyxovirus der Erfindung ist Sendai-Virus. Diese Viren können natürlich vorkommende, Wildtyp-, mutante, im Labor passagierte, künstlich konstruierte Stämme, usw. sein. Unvollständige Viren wie das DI-Partikel (Willenbrink W. und Neubert W. J., J. Virol., 1994, 68, 8413–8417) und synthetisierte Oligonucleotide können auch als ein Material für das Herstellen des Virusvektors der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Gene, die die Proteine eines Paramyxovirus codieren, schließen die NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene ein. Hierein repräsentieren die „NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene" jene, die das Nucleokapsid-Protein, das Phosphoprotein, das Matrix-Protein, das Fusionsprotein, die Hämagglutinin-Neuraminidase beziehungsweise das große Protein codieren. Die Gene von jedem Virus der Unterfamilie Paramyxovirus werden im Allgemeinen wie folgt beschrieben. Im Allgemeinen kann das NP-Gen auch als „N-Gen" angezeigt werden.

Paramyxovirus NP P/CN M F HN – L

Rublavirus NP P/V M F HN (SH) L

Morbillivirus NP P/CN M F H – L
Zum Beispiel sind die Zugangsnummern von jedem Gen des Sendai-Virus, das als ein Respirovirus der Paramyxoviridae in der Nucleotidsequenz-Datenbank klassifiziert ist, M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046 und X17218 für das NP-Gen; M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007 und X17008 für das P-Gen; D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584 und X53056 für das M-Gen; D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 und X02131 für das F-Gen; D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808 und X56131 für das HN-Gen; und D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 und X58886 für das L-Gen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Gen" eine genetische Substanz, einschließlich Nucleinsäuren wie RNA und DNA, die Protein codieren kann oder nicht kann. Ein Gen kann eine funktionelle RNA wie Ribozym oder Antisense-RNA codieren. Es kann eine natürlich vorkommende Sequenz oder eine künstlich gestaltete Sequenz sein. Darüber hinaus, wie hierin verwendet, schließt der Begriff „DNA" eine einzelsträngige DNA und eine doppelsträngige DNA ein.
Die vorliegende Erfindung liefert einen Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, und die Verwendung desselben. Die vorliegenden Erfinder zeigten, dass die Transgen-Expression an den verabreichten Stellen erhöht war, wo ein Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, intramuskulär in vivo verabreicht wurde. Die vorliegenden Erfinder offenbarten, dass eine Nekrose in ischämischen Geweben durch die Verabreichung eines rekombinanten Paramyxovirus-Vektors, der ein angiogenes Gen (FGF2) codiert, verhindert werden konnte und der Verlust der Hinterextremität in einem Extremitäten-Erhaltungs-Experiment unter Verwendung von Mäusen mit ischämischen Hinterextremitäten verhindert werden konnte. Die Vektoren dieser Erfindung sind nützlich im wirksamen Induzieren einer Angiogenese in ischämischen Geweben und im Verhindern einer Nekrose und können daher vorzugsweise für die Gentherapie von ischämischen Krankheiten verwendet werden.
Darüber hinaus offenbarten die vorliegenden Erfinder, dass die Gene, die intramuskulär unter Verwendung von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren verabreicht wurden, kontinuierlich für 1 bis 2 Wochen exprimiert werden konnten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass eine Gentherapie mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) unter Verwendung von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren kontinuierliche therapeutische Wirkungen erzielen kann. Darüber hinaus konnte der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), der von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren exprimiert wurde, die intramuskulär verabreicht wurden, nicht im systemischen Kreislaufsystem nachgewiesen werden und würde daher keine unerwünschten Wirkungen außerhalb der Zielgewebe verursachen. Daher legen die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung, dass Paramyxovirus-Vektoren verschiedene Vorteile im angiogenen Gentransfer haben, eine mögliche große Verbesserung in der Gentherapie durch spezifisches Anzielen von ischämischen Geweben nahe.
Da Paramyxovirus-Vektoren in Menschen nicht pathogen sind, kann nahegelegt werden, dass sie in Anbetracht der Sicherheit vorzugsweise in klinischen Versuchen der menschlichen Gentherapie verwendet werden. Es ist ein Haupthindernis im hoch-wirksamen Gentransfer, dass die eingebrachte DNA in den meisten Fällen in den Kern transportiert werden muss oder die Kernmembran für die Expression eines exogenen Gens durch Plasmid-DNA oder dergleichen eliminiert werden muss. Im Fall des Sendai-Virus wird die Expression eines exogenen Gens jedoch sowohl durch zelluläres Tubulin als auch seine RNA-Polymerase (1-Protein) im Cytoplasma gelenkt, wenn sich die Viren replizieren. Dies legt nahe, dass das Sendai-Virus nicht mit den Chromosomen der Wirtszellen interagiert, was Risiken wie eine Krebsbildung und die Immortalisierung von Zellen vermeidet. Darüber hinaus ist bekannt, dass das Sendai-Virus in Nagern pathogen ist, was eine Lungenentzündung hervorruft, aber nicht in Menschen, was durch Untersuchungen unterstützt wird, die zeigen, dass die intranasale Verabreichung des Wildtyp-Sendai-Virus in nicht-menschlichen Primaten keinen Schaden anrichtet (Hurwitz J. L. et al., Vaccine, 1997, 15, 533–540). Diese Eigenschaften legen nahe, dass ein Sendai-Virus-Vektor in der menschlichen Therapie verwendet werden kann, und unterstützen weiterhin die Ansicht, dass Sendai-Virus-Vektoren eines der vielversprechenden Mittel in der Gentherapie mit angiogenen Genen sein kann.
Die hierin beschriebenen angiogenen Gene bezeichnen Gene, die Faktoren codieren, die Aktivitäten aufweisen, um die Angiogenese und/oder die Vasculogenese direkt oder indirekt zu fördern. Die Faktoren können Proteine oder Peptide sein oder können Nucleinsäuren wie funktionelle RNAs (Ribozyme oder Antisense-RNAs) sein. Angiogene Proteine schließen den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) (auch basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) genannt) ein (Klagsbrun, M. und D' Amore, P., A. Annu. Rev. Physiol. 53: 217–39, 1991; Folkman, J. und Shing, Y., J. Biol. Chem. 267 (16): 10931–4, 1992; Symes, J. F. und Sniderman, A. D., Curr. Opin. Lipidol. 5(4): 305–12, 1994).
Die bevorzugten angiogenen Proteine in der vorliegenden Erfindung schließen FGF2 ein, und die Vektoren können unter Verwendung von Genen konstruiert werden, die die Proteine, die aus der obigen Liste ausgewählt wurden, codieren.
Proteine, die unter den angiogenen Proteinen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, besonders bevorzugt sind, sind nicht jene, die durch VEGF eine unreife Angiogenese induzieren, sondern jene, die die Angiogenese erzielen, in der das Blutgefäß durch parietale Zellen umgeben ist, die sich von den neu hergestellten endothelialen Zellen, die an mesenchymale Zellen angehaftet sind, differenziert haben. Es ist bekannt, dass die Vaskularisation aus drei Schritten, Vasculogenese, Angiogenese und vaskuläre Reifung besteht. Beobachtungen von verschiedenen Transkriptionsfaktor-Knockout-Untersuchungen offenbarten, dass die Reifung der Vaskularisation mehrere Gene involviert. Insbesondere ist der Transkriptionsfaktor SCL/tal-1 hauptsächlich in die vaskuläre Bildung involviert, und HIF-1, Id, ETS-1, HOXD₃, COUP-TFII und MEF2C sind in die Angiogenese involviert. Darüber hinaus ist es bekannt, dass ein Lungen-Kruppel-ähnlicher Faktor (LKLF)- oder dHAND-Gen-Knockout embryonalen Tod aufgrund von unterentwickelten parietalen Zellen bewirkt.
Daher sind die angiogenen Gene, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bevorzugter jene, die Transkriptionsfaktoren, einschließlich LKLF und dHAND, die in die parietale Zell-Reifung in unreifen mesenchymalen Zellen involviert sind, induzieren. Es wird vorhergesagt, dass eine FGF2-Stimulierung direkt in die Induktion dieser Transkriptionsfaktoren involviert ist oder die Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen Zellen durch andere Wachstumsfaktoren wie Angiopoietin und HGF fördert.
Angiogene Proteine enthalten vorzugsweise Sekretions-Signalsequenzen, die die Sekretion der angiogenen Proteine ermöglichen. Proteine wie FGF2 können jedoch außerhalb der Zellen ohne eine natürliche und typische Sekretions-Signalsequenz sezerniert werden (siehe Beispiel). Diese Proteine benötigen nicht unbedingt Sekretions-Signalsequenzen. Die Gene, die diese angiogenen Proteine codieren, können zum Beispiel durch bekannte Verfahren wie PCR unter Verwendung von Primern, die basierend auf der Nucleotidsequenz-Information gestaltet wurden, erhalten werden. Ein Beispiel des am meisten bevorzugten angiogenen Faktors, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist FGF2, der eine stabile therapeutische Wirkung in einem weiten Bereich von Expressionsspiegeln zeigt. (Abraham, J. A. et al., 1986, EMBO J. 5: 2523–2528; Moscatelli, D. A. et al., US 4994559 ; Baird, A. et al., US 5155214 ; Isner, J. M. US 6121246 ; WO 97/14307 ).
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)-Gene, die für die Vektorkonstruktion verwendet werden, können heterolog oder homolog, vorzugsweise homolog zu den Ziel-Individuen für den Gentransfer sein, um eine gewünschte Wirkung zu erzielen.
Darüber hinaus sind die Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)-Gene, die für die Vektor-Konstruktion verwendet werden, vorzugsweise Säuger-Gene, vorzugsweise menschliche Gene für die Anwendung am Menschen.
Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) der vorliegenden Erfindung codieren, sind besonders für die Behandlung von ischämischen Geweben wirksam. Der Gentransfer von angiogenen Genen unter Verwendung der Vektoren der vorliegenden Erfindung kann nämlich die Angiogenese fördern und eine Nekrose aufgrund einer Ischämie verhindern. Die ischämischen Gewebe, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind nicht limitierend, solange die Gewebe eine Ischämie zeigen oder eine Ischämie entwickeln. Zum Beispiel schließen solche Gewebe Muskel, Gehirn, Niere und Lunge ein. Die ischämischen Krankheiten, die durch das Verabreichen der Vektoren der vorliegenden Erfindung behandelt werden, schließen cerebrovaskuläre Ischämie, Nieren-Ischämie, Lungen-Ischämie, Extremitäten-Ischämie, ischämische Cardiomyopathie und myocardiale Ischämie ein. Die Behandlung von ischämischen Geweben in der vorliegenden Erfindung schließt die Therapie von ischämischen Geweben oder die Verhinderung eines ischämischen Verschlusses, insbesondere zum Beispiel die Verhinderung einer Nekrose in ischämischen Geweben, das Erhalten von ischämischen Geweben, die Förderung der Angiogenese in ischämischen Geweben, die Geweberegenerierung und das Verhindern und Vermindern eines Verschlusses, der durch Ischämie verursacht wurde, ein.
Die vorliegende Erfindung liefert zweite medizinische Verwendungen zum Induzieren der Angiogenese, das den Schritt des Verabreichens eines Arzneimittels, umfassend Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, umfasst. Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung zweite medizinische Verwendungen zum Behandeln von ischämischen Geweben, die den Schritt des Verabreichens eines Arzneimittels umfassen, umfassend einen Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert. Es gibt keine Einschränkung für die Ziel-Individuen, und zum Beispiel kann ein erwünschter Säuger, einschließlich eines Menschen, verwendet werden. Insbesondere können nicht-menschliche Säuger wie Primaten, einschließlich Affen wie Halbaffen, Platyrrhin-Affen und Schmalnasenaffen, Menschenaffen oder menschenähnliche Affen, Nager wie Mäuse, Ratten und Meerschweinchen sowie Rinder, Hunde, Katzen, Pferde, Schafe und Kaninchen Ziele für die Verabreichung sein. Es ist möglich, eine Ischämie in dem Tier unter Verwendung von Vektoren der vorliegenden Erfindung zu behandeln, und auch möglich, die Tiere als Ischämie-Therapiemodelle für Menschen zu verwenden (Morinaga, K. et al., 1987, J. Vasc. Surg. 5: 719–730; Itoh, H. et al., 1994, Atherosclerosis 110: 259–270).
Spezifische Verwendungen zum Induzieren der Angiogenese gemäß der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden Verwendungen ein:

[a] eine zweite medizinische Verwendung zum Induzieren der Angiogenese, die den Schritt des Verabreichens eines Arzneimittels, umfassend einen Paramyxovirus-Vektor, der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, oder eine Zelle, die den Vektor enthält, umfasst;
[b] die Verwendung von [a], in der das Gen intramuskulär verabreicht wird; und
[c] die Verwendung von [a] oder [b], in der das Paramyxovirus Sendai-Virus ist.

Beispiele der Verwendungen zum Behandeln der ischämischen Gewebe in der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden Verwendungen ein:

[a] eine zweite medizinische Verwendung zum Behandeln der ischämischen Gewebe, die den Schritt des Verabreichens eines Arzneimittels, umfassend einen Paramyxovirus-Vektor, der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, oder eine Zelle, die den Vektor enthält, umfasst;
[b] die Verwendung von [a], in der das Gen intramuskulär verabreicht wird; und
[c] die Verwendung von [a] oder [b], in der das Paramyxovirus Sendai-Virus ist.

Die Verabreichung kann entweder in vivo oder ex vivo ausgeführt werden. Für die in vivo-Verabreichung können die Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, über Verabreichungswege injiziert werden, die Fachleuten wohlbekannt sind, wie intramuskuläre Injektion, subcutane Injektion und Katheter-Verabreichung. Für eine ex vivo-Verabreichung werden die Vektoren verwendet, um Zellen in vitro vorzutransfizieren. Die Zellen, die die Vektoren enthalten, werden dann in vivo durch Verfahren wie die intramuskuläre Injektion, subcutane Injektion und Katheter-Verabreichung injiziert. Die Zellen zum Transferieren der Vektoren in der ex vivo-Verabreichung können entweder heterolog oder homolog zu den Ziel-Individuen sein, sind aber vorzugsweise homolog dazu. Die Zellen werden bevorzugter vom Ziel-Individuum abgeleitet. Darüber hinaus werden die Zellen am bevorzugtesten vom Knochenmark oder Blut abgeleitet, einschließlich Zellen, die vaskuläre endotheliale Zellen bilden können oder die in vaskuläre endotheliale Zellen differenziert werden können, das heißt, vaskuläre endotheliale Vorläufer-Zellen. Die Angiogenese kann in den Zielgeweben, in die eine pharmazeutisch wirksame Dosis eines Vektors der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, induziert werden. Daher ist es möglich, eine Behandlung zum Verhindern einer Gewebenekrose und einer Extremitäten-Amputation zum Beispiel in ischämischen Gehirnen, Herzen, Nieren, Lungen und Extremitäten durchzuführen.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, um ischämische Gewebe zu behandeln. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung:

[a] einen Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, zum Behandeln eines ischämischen Gewebes;
[b] den Vektor von [a], in dem der Vektor für eine intramuskuläre Verabreichung verwendet wird; und
[c] den Vektor von [a] oder [b], in dem das Paramyxovirus Sendai-Virus ist.

Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, umfassend Paramyxovirus-Vektoren, zum Behandeln von ischämischen Geweben. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe zusätzlich zu den Paramyxovirus-Vektoren einschließen. Zum Beispiel können die Vektoren der vorliegenden Erfindung in Injektionen mit physiologischen Lösungen oder in Implantate mit festen oder halbfesten (Gel) Materialen formuliert werden.
Paramyxovirus-Vektoren, die für den angiogenen Gentransfer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders limitiert. Zum Beispiel schließen bevorzugte Paramyxovirus-Vektoren Vektoren ein, die in der Lage sind, sich zu replizieren und autonom zu proliferieren. Im Allgemeinen enthält zum Beispiel das Genom von Wildtyp-Paramyxoviren eine kurze 3'-Leader-Region, gefolgt von sechs Genen, die die Nucleokapsid (N)-, Phospho (P)-, Matrix (M)-, Fusions (F)-, Hämagglutinin-Neuraminidase (HN)-, und großen (L) Proteine codieren, und hat eine kurze 5'-Ausläufer-Region am anderen Terminus. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, sich autonom zu replizieren, können durch Gestalten eines Genoms, das eine ähnliche Struktur zu jener, wie vorstehend beschrieben, hat, erhalten werden. Zusätzlich kann ein Vektor zum Exprimieren eines exogenen Gens durch Inserieren eines exogenen Gens in das Genom des obigen Vektors erhalten werden. Paramyxovirus-Vektoren der Erfindung können eine veränderte Ausrichtung der Virusgene im Vergleich zu Wildtyp-Viren aufweisen.
Die Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung können eine beliebige Deletion der Gene haben, die im Wildtyp-Paramyxovirus enthalten sind. Zum Beispiel, wenn Sendai-Virus-Vektoren rekonstituiert werden, wird angenommen, dass die Proteine, die durch die NP-, P/C- und L-Gene codiert werden, in trans benötigt werden, aber die Gene selbst dürfen kein Bestandteil des Virusvektors der vorliegenden Erfindung sein. Zum Beispiel kann ein Expressionsvektor, der Gene trägt, die die Proteine codieren, in die Wirtszellen mit einem anderen Expressionsvektor co-transfiziert werden, der das Vektor-Genom codiert, um einen Vektor zu rekonstituieren. Alternativ wird ein Expressionsvektor, der das Virusgenom codiert, in die Wirtszellen eingebracht, die Gene tragen, die die Proteine codieren, und dann kann der Vektor durch Verwenden der Proteine, die von der Wirtszelle stammen, rekonstituiert werden. Die Aminosäuresequenz dieser Proteine darf nicht identisch zu jenen sein, die vom ursprünglichen Virus abgeleitet wurden, solange sie eine äquivalente oder höhere Aktivität im Nucleinsäure-Transfer hat, und kann mutiert oder mit jener eines homologen Gens eines anderen Virus ersetzt sein.
Es wird angenommen, dass die Proteine, die durch die M-, F- und HN-Gene codiert werden, für die Zell-zu-Zell-Vermehrung eines Paramyxovirus-Vektors wesentlich sind. Diese Proteine werden jedoch nicht benötigt, wenn ein Paramyxovirus-Vektor als ein RNP hergestellt wird. Wenn die Gene M, F und HN Bestandteile des Genoms sind, das im RNP enthalten ist, werden die Produkte dieser Gene produziert, wenn sie in die Wirtszellen eingebracht werden, und Viruspartikel, die eine Infektiosität haben, werden hergestellt. RNP-Vektoren, die ein infektiöses Virus produzieren, schließen zum Beispiel eine virale genomische RNA, die die N-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene codiert, und die N-, P- und L-Proteine ein. Wenn solch ein RNP in Zellen eingebracht wird, wird das Virusgenom exprimiert und durch die Funktionen der N-, P- und L-Proteine repliziert, und so werden infektiöse Virusvektoren amplifiziert.
RNP kann in Zellen als ein Komplex mit zum Beispiel Lipofectamin und polykationischen Liposomen eingebracht werden. Insbesondere kann eine Vielzahl von Transfektions-Reagenzien verwendet werden, zum Beispiel DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE und DOSPER (Boehringer #1811169). Chloroquin kann zugefügt werden, um einen Abbau im Endosom zu verhindern (Calos M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). Für replizierende Viren können die produzierten Viren durch Re-Infizieren in kultivierte Zellen, Hühnereier oder Tiere (z. B. Säuger wie Mäuse) amplifiziert oder passagiert werden.
Paramyxovirus-Vektoren, denen die M-, F- und/oder HN-Gene fehlen, werden auch vorzugsweise als Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet. Diese Virusvektoren können durch exogenes Bereitstellen der deletierten Genprodukte rekonstituiert werden. Solche Vektoren können wie das Wildtyp-Virus noch an Wirtszellen anhaften und eine Zellfusion induzieren. Die Tochtervirus-Partikel haben jedoch nicht dieselbe infektiosität wie die Eltern, weil dem Vektorgenom, das in die Zellen eingebracht wurde, eines oder mehrere dieser Gene fehlen. Daher können diese Vektoren als sichere Virusvektoren nützlich sein, die nur zu einem einzigen Gentransfer in der Lage sind. Genau können die Gene, die aus dem Genom deletiert werden, die F- und/oder HN-Gene sein. „Gen-defizient" wird als ein wesentlicher Verlust der Genfunktion definiert, und wenn ein defektes Gen ein Protein codiert, exprimiert die Gen-defiziente Mutante kein Protein, das eine Funktion aufweist, die äquivalent zum Wildtyp-Protein ist. Zum Beispiel kann das Defizientsein in einem oder mehreren Genen durch eine Nicht-Transkription des/der Gens/Gene, Verlust-der-Funktion-Mutanten und Deletieren der Gene erzielt werden. Gendefizient bedeutet, dass vorzugsweise mindestens ein Teil der codierenden Region, bevorzugter die ganze codierende Region des Gens defekt ist. Zum Beispiel sind F-Gen-defiziente Vektoren Vektoren, die vorzugsweise in einem Teil der F-Protein-codierenden Region, bevorzugter der gesamten F-Protein-codierenden Region defekt sind. Noch bevorzugter fehlt den F-Gen-defizienten Vektoren der vorliegenden Erfindung die Startsignalsequenz auf der 3'-flankierenden Seite des F-Gens, die in der negativen Kette im Genom defekt ist. Daher kann eine unnötige Polypeptid-Expression von dem defekten Gebiet unterdrückt werden. Wenn der offene Leserahmen (ORF), der unnötige Polypeptide codiert, in der defekten Region vorhanden ist, ist es wünschenswert, den ORF durch Verfahren wie ortsgerichtete Mutagenese (später beschrieben) zu entfernen.
Zum Herstellen von F-Gen-defizienten Vektoren können die Virusvektoren durch Co-Transfektion eines Expressionsplasmids, das das Genom eines rekombinanten Paramyxovirus-Vektors codiert, dem das F-Gen fehlt, mit einem Expressionsvektor für das F-Protein und jenem für die NP-, P/C- und L-Proteine in die Wirtszellen rekonstituiert werden (Internationale Veröffentlichungen Nummer WO 00/70055 und WO 00/70070 ). Alternativ können Wirtszellen verwendet werden, in denen das F-Gen in das Chromosom integriert wurde. Die Aminosäuresequenz dieser Proteine, die exogen bereitgestellt werden, muss nicht identisch zu jener des Wildtyps sein und kann mutiert oder durch ein homologes Protein eines anderen Virus ersetzt sein, so lange sie eine äquivalente oder höhere Gentransfer-Aktivität liefern.
Das Hüllprotein der Paramyxovirus-Vektoren der Erfindung kann ein anderes Protein als das Hüllprotein des ursprünglichen Vektorgenoms enthalten. Es gibt keine Einschränkung für solche Proteine. Diese schließen Hüllproteine von anderen Viren wie das G-Protein (VSV-G) des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) ein. Daher schließen die Paramyxovirus-Vektoren der Erfindung einen Pseudo-Typ-Virusvektor ein, der ein Hüllproteine aufweist, das von einem anderen Virus als dem ursprünglichen Virus abgeleitet ist.
Paramyxovirale Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch zum Beispiel auf der viralen Hüllenoberfläche Proteine, die zum Anhaften an bestimmte Zellen in der Lage sind, wie Adhäsionsfaktoren, Liganden und Rezeptoren oder chimäre Proteine, die ein Protein, das oben beschrieben ist, auf der äußeren Oberfläche und von der viralen Hülle abgeleitete Polypeptide umfassen, innerhalb des Virus umfassen. Es ermöglicht die Produktion eines Vektors, der ein bestimmtes Gewebe anzielt. Diese Proteine können durch das Virusgenom selbst codiert werden oder zum Zeitpunkt der Virus-Rekonstitution durch Expression anderer Gene als des Virusgenoms bereitgestellt werden (zum Beispiel Gene, die von einem anderen Expressionsvektor oder dem Wirtszell-Chromosom stammen).
Die Virusgene, die im Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können verändert werden, zum Beispiel um die Antigenität zu reduzieren oder die RNA-Transkriptionseffizienz oder die Replikationseffizienz zu verstärken. Insbesondere ist es möglich, mindestens eines der NP-, P/C- und L-Gene, die Gene von Replikationsfaktoren sind, zu verändern, um die Transkription oder Replikation zu verstärken. Es ist auch möglich, das HN-Protein, ein Strukturprotein, das eine Hämagglutinin-Aktivität und Neuraminidase-Aktivität aufweist, zu verändern, um die Virus-Stabilität im Blut durch Schwächen der ersteren Aktivität zu verstärken und um die Infektiosität durch Verändern der letzteren Aktivität zu regulieren. Es ist auch möglich, das F-Protein, das mit der Membranfusion in Verbindung gebracht wird, zu verändern, um seine Fusionsfähigkeit zu regulieren. Darüber hinaus ist es möglich, die Antigen-präsentierenden Epitope und solche von möglichen antigenen Molekülen auf der Zelloberfläche, wie das F-Protein und HN-Protein zu analysieren und sie zu verwenden, um einen Paramyxovirus-Vektor herzustellen, der konstruiert wird, um eine schwache Antigen-präsentierende Fähigkeit aufzuweisen. Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch Hilfsgene fehlen. Zum Beispiel resultiert die Zerstörung des V-Gens, einem der Hilfsgene von SeV, in einer Reduktion der Pathogenität von SeV gegenüber Wirten wie einer Maus, ohne die Genexpression und Replikation in kultivierten Zellen zu beeinflussen (Kato, A. et al. 1997. J. Virol. 71:7266–7272; Kato, A. et al. 1997. EMBO J. 16:578–587; Curran, J. et al., WO 01/04272 ; EP 1067079 ). Solche abgeschwächten Vektoren sind besonders geeignet als in vivo- oder ex vivo-Gentransfer-Vektoren. Die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung codieren den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) in ihrer genomischen RNA. Ein rekombinanter Paramyxovirus-Vektor, der exogene Gene umfasst, kann durch Insertion von exogenen Genen in das oben erwähnte Paramyxovirus-Vektor-Genom hergestellt werden. Ein exogenes Gen kann ein erwünschtes angiogenes Gen, das in Zielgeweben wie ischämischen Geweben exprimiert werden soll, für den Vektortransfer sein. Das exogene Gen kann ein natürlich vorkommendes Protein oder ein modifiziertes Protein, das durch Modifizieren des ursprünglichen Proteins durch Deletion, Substitution oder Insertion hergestellt wurde, codieren, so lange das modifizierte Protein funktionell äquivalent zum natürlich vorkommenden Protein ist. Zum Beispiel kann für den Zweck der Gentherapie und dergleichen ein Gen, das verwendet wird, um eine Zielkrankheit zu behandeln, in die DNA (Virusvektor-DNA) inseriert werden, die das Genom des Virusvektors codiert. Im Fall des Inserierens eines exogenen Gens in die Virusvektor-DNA wie Sendai-Virusvektor-DNA wird eine Sequenz, umfassend Nucleotide in Mehrfachen von sechs, vorzugsweise zwischen die Transkriptionsendsequenz (E) und die Transkriptionsstartsequenz (S) inseriert (Calain P. und Roux L., J. Virol., 1993, 67(8), 4822–4830). Ein exogenes Gen kann stromaufwärts und/oder stromabwärts von jedem der Virusgene (NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene) inseriert werden. Um nicht mit der Expression von stromaufwärts oder stromabwärts liegenden Genen zu interferieren, kann eine E-I-S-Sequenz (Transkriptionsend-Sequenz – dazwischen liegende Sequenz – Transkriptionsstart-Sequenz) oder ein Teil davon passend stromaufwärts oder stromabwärts eines exogenen Gens platziert werden, sodass die E-I-S-Sequenz zwischen jedem Gen liegt. Alternativ kann ein exogenes Gen durch eine IRES-Sequenz inseriert werden.
Der Expressionsspiegel des inserierten exogenen Gens kann durch den Typ der Transkriptionsstart-Sequenz, die stromaufwärts der Gene angeheftet ist, reguliert werden ( WO 01/18223 ). Er kann auch durch die Position der Insertion und die Sequenz, die das Gen umgibt, reguliert werden. Im Sendai-Virus wird zum Beispiel der Expressionsspiegel des inserierten Gens umso höher sein, je näher die Insertionsposition zum 3'-Terminus der Negativ-Strang-RNA des Virusgenoms (je näher zum NP-Gen in der Gen-Anordnung am Wildtyp-Virusgenom) ist. Um eine hohen Expression eines exogenen Gens zu erzielen, wird es vorzugsweise in die Stromaufwärts-Region des negativ-strängigen Genoms wie stromaufwärts des NP-Gens (3'-flankierende Sequenz auf dem Negativstrang) oder zwischen die NP- und P-Gene inseriert. Umgekehrt, je näher zum 5'-Terminus der Negativstrang-RNA (je näher zum L-Gen in der Gen-Anordnung am Wildtyp-Virusgenom) die Insertionsposition ist, umso niedriger wird der Expressionsspiegel des inserierten Gens sein. Um die Expression eines exogenen Gens zu reduzieren, kann es in die äußerste 5'-Position am Negativstrang inseriert werden, das heißt stromabwärts des L-Gens im Wildtyp-Virusgenom (5'-flankierende Region des L-Gens am Negativstrang) oder stromaufwärts des L-Gens (3'-flankierende Region des L-Gens am Negativstrang). So kann die Insertionsposition eines exogenen Gens korrekt angepasst werden, um einen erwünschten Expressionsspiegel des Gens zu erhalten oder die Kombination der Insertion mit den Virusgenen, die es umgeben, zu optimieren. Wenn zum Beispiel die Überexpression eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors 2 (FGF2), der durch einen Virusvektor mit hohem Titer eingebracht wurde, eine Toxizität verursachen kann, ist es möglich, nicht nur den Titer der Viren, die verabreicht werden sollen, zu kontrollieren sondern auch den Expressionsspiegel von individuellen Virusvektoren durch Gestalten der Insertionsposition des angiogenen Gens näher zum 5'-Terminus des Negativstrangs oder Ersetzen der Transkriptionsstart-Sequenz mit einer, die eine niedrigere Wirksamkeit hat, zu reduzieren, um eine geeignete Wirkung zu erhalten.
Um die einfache Insertion eines exogenen Gens zu erleichtern, kann eine Clonierungsstelle an der Position der Insertion gestaltet werden. Zum Beispiel kann die Clonierungsstelle die Erkennungssequenz von Restriktionsenzymen sein. Die Restriktionsstellen in der Vektor-DNA, die das virale Genom codiert, können verwendet werden, um ein exogenes Gen zu inserieren. Die Clonierungsstelle kann eine Mehrfach-Clonierungsstelle sein, die Erkennungssequenzen für mehrere Restriktionsenzyme enthält. Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann andere exogene Gene an anderen Positionen als jenen aufweisen, die für die obige Insertion verwendet werden. Solch ein exogenes Gen kann ohne Einschränkung ein angiogenes Gen oder ein anderes Gen sein.
Die Konstruktion eines rekombinanten Sendai-Virusvektors, der ein exogenes Gen aufweist, kann wie folgt zum Beispiel gemäß dem Verfahren, beschrieben in Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78: 2813–2820, Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16: 578–587 und Yu D. et al., Genes Cells, 1997, 2: 457–466, durchgeführt werden.
Zuerst wird eine DNA-Probe, enthaltend eine cDNA-Nucleotidsequenz, die ein erwünschtes exogenes Gen codiert, hergestellt. Es wird bevorzugt, dass die Konzentration der DNA-Probe 25 ng/μl oder höher ist und dass sie als ein einzelnes Plasmid durch Elektrophorese nachgewiesen werden kann. Die folgende Beschreibung ist ein Beispiel, wo ein exogenes Gen in die NotI-Stelle der genomischen Virus-DNA inseriert wird. Wenn die Ziel-cDNA-Sequenz eine NotI-Erkennungsstelle enthält, ist es wünschenswert, die Stelle vorher durch Verändern der Nucleotidsequenz unter Verwendung des bekannten Verfahrens wie der ortsgerichteten Mutagenese zu entfernen, während die codierte Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Ein erwünschtes DNA-Fragment wird durch PCR von der DNA-Probe amplifiziert. Um ein Fragment zu erhalten, das NotI-Stellen an beiden Enden aufweist, und um eine einzelne Kopie der Transkriptionsendsequenz (E), der dazwischen liegenden Sequenz (I) und der Transkriptionsstartsequenz (S) des Sendai-Virus (EIS-Sequenz) an ein Ende hinzuzufügen, werden synthetisierte DNA-Sequenzen (Primerpaar), nämlich ein Paar eines Vorwärts-Primers (Sense-Strang), umfassend einen Teil des erwünschten Gens, und eines Rückwärts-Primers (Antisense), umfassend eine NotI-Erkennungsstelle, die E-, I- und S-Sequenzen und ein Teil des erwünschten Gens hergestellt.
Zum Beispiel enthält die synthetische Vorwärts-DNA-Sequenz zwei oder mehrere Nucleotide am 5'-Terminus, um den Verdau mit NotI sicherzustellen (vorzugsweise 4 Nucleotide, die keine Sequenz enthalten, die von der NotI-Erkennungsstelle stammt, wie GCG und GCC; bevorzugter ACTT). Zum 3'-Terminus der Sequenz wird die NotI-Erkennungssequenz GCGGCCGC zugefügt. Darüber hinaus werden zum 3'-Terminus beliebige 9 Nucleotide oder jene der 9 plus die Mehrfachen von 6 als ein Spacer zugefügt. Darüber hinaus wird zum 3'-Terminus eine Sequenz von ungefähr 25 Nucleotiden, die dem ORF der erwünschten cDNA entsprechen, beginnend vom Startcodon ATG zugefügt. Der 3'-Terminus der synthetischen Vorwärts-Oligo-DNA, die ungefähr 25 Nucleotide der erwünschten cDNA enthält, wird vorzugsweise so ausgewählt, dass das letzte Nucleotid G oder C ist.
Die reverse synthetische DNA-Sequenz enthält zwei oder mehr Nucleotide am 5'-Terminus (vorzugsweise 4 Nucleotide, die keine Sequenz enthalten, die von der NotI-Erkennungsstelle stammt, wie GCG und GCC; bevorzugter ACTT). Zum 3'-Terminus der Sequenz wird die NotI-Erkennungsstelle GCGGCCGC zugefügt. Darüber hinaus wird zum 3'-Terminus eine Spacer-Oligo-DNA zugefügt, um die Länge des Primers anzupassen. Die Länge der Oligo-DNA wird so gestaltet, dass sie ein Mehrfaches von 6 Nucleotiden ist, einschließlich der NotI-Erkennungssequenz GCGGCCGC, der Sequenz, die komplementär zu der cDNA ist, und der EIS-Sequenz, die vom Sendai-Virusgenom abgeleitet ist, wie nachstehend beschrieben (sogenannte „Regel von Sechs"; Kolakofski D. et al., J. Virol. 1998, 72, 891–899; Calain P. und Roux L., J. Virol., 1993, 67, 4822–4830). Darüber hinaus werden zum 3'-Terminus der zugefügten Sequenz komplementäre Sequenzen zu der S-Sequenz des Sendai-Virus, vorzugsweise 5'-CTTTCACCOT-3'(SEQ ID NO: 1), zu der I-Sequenz, vorzugsweise 5'-AAG-3', und zu der E-Sequenz, vorzugsweise 5'-TTTTTOTTACTACG-3' (SEQ ID NO: 2), zugefügt. Schließlich wird zum 3'-Terminus eine Sequenz, die so ausgewählt wird, dass das letzte Nucleotid der komplementären Sequenz der erwünschten cDNA G oder C wird, zugefügt, wobei das letzte Nucleotid ungefähr 25 Nucleotide stromaufwärts des Stopp-Codons ist. So wird der 3'-Terminus der reversen synthetischen Oligo-DNA hergestellt.
Die PCR kann durch ein übliches Verfahren zum Beispiel unter Verwendung der ExTaq-Polymerase (TaKaRa) durchgeführt werden. Vorzugsweise kann die Vent-Polymerase (NEB) verwendet werden, und das amplifizierte Fragment wird mit NotI verdaut und in die NotI-Stelle des Plasmidvektors pBluescript inseriert. Die Nucleotidsequenz des erhaltenen PCR-Produkts wird mit einem automatisierten DNA-Sequenziergerät überprüft, und ein Plasmid, das die korrekte Sequenz hat, wird selektiert. Die Insertion wird aus dem Plasmid durch einen NotI-Verdau ausgeschnitten und in die NotI-Stelle des Plasmids, das die genomische Paramyxovirus-cDNA umfasst, subcloniert. Alternativ können die PCR-Produkte direkt in die NotI-Stelle ohne Verwendung des pBluescript-Plasmidvektors cloniert werden, um eine rekombinante Sendai-Virus-cDNA zu erhalten.
Zum Beispiel kann die rekombinante genomische Sendai-Virus-cDNA gemäß den Verfahren konstruiert werden, die in der Literatur beschrieben sind (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578–598, 1997; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol., 78: 2813–2820, 1997; Yu, D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457–466; und Li, H. O. et al., J. Virology 74, 6564-6569, 2000). Zum Beispiel wird eine 18 bp-Spacersequenz, enthaltend die NotI-Stelle (5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; SEQ ID NO: 3), in einen benachbarten Genlocus einer clonierten genomischen Sendai-Virus-cDNA (pSeV(+)) zwischen die Leadersequenz und den 5'-Terminus einer Sequenz, die das N-Protein codiert, inseriert, und das Plasmid pSeV18⁺b(+), das eine selbst-spaltbare Ribozymstelle enthält, die vom antigenomischen Strang des Hepatitis-Delta-Virus stammt, wird erhalten (Hasan M. K. et al., J. General Virol., 1997, 78, 2813–2820). Ein exogenes Genfragment wird in die NotI-Stelle von pSeV18⁺b(+) inseriert, um eine rekombinante Sendai-Virus-cDNA zu erhalten, in die ein erwünschtes exogenes Gen inseriert worden ist.
Der rekombinante Paramyxovirus-Vektor, der wie vorstehend beschrieben hergestellt worden ist, wird in vitro oder intrazellulär transkribiert, und das RNP wird in der Anwesenheit der viralen L-, P- und NP-Proteine rekonstituiert, um einen viralen Vektor zu produzieren, der das RNP umfasst. Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Produzieren eines Paramyxovirus-Vektors, der ein angiogenes Gen codiert, wobei das Verfahren die Schritte des intrazellulären Transkribierens der DNA, die das Paramyxovirus-Vektor-Genom codiert, in der Anwesenheit von Proteinen, die die Transkription und Replikation des Genoms erlauben, und Gewinnen der Paramyxovirus-Vektor-Produkte umfasst. Die Proteine, die die Transkription und Replikation des Paramyxovirus-Vektor-Genoms erlauben, schließen zum Beispiel die N-, L- und P-Proteine ein. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine DNA zum Produzieren eines Paramyxovirus-Vektors der vorliegenden Erfindung, wobei die DNA die vorstehend erwähnte DNA umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der DNA, die das Vektorgenom codiert, zum Produzieren von Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung. Die Rekonstitution eines Virus von einer Virusvektor-DNA kann gemäß den bekannten Verfahren durchgeführt werden ( WO97/16539 ; WO97/16538 ; Durbin A. P. et al., Virol., 1997, 235, 232–332; Whelan S. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 8388–8392; Schnell M. J. et al., EMBO J., 1994, 13, 4195–4203; Radecke F. et al., EMBO J., 1995, 14, 5773–5784; Lawson N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4477–4481; Garcin D. et al., EMBO J., 1995, 14, 6087–6094; Kato A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579; Baron M. D. und Barrett T., J. Virology, 1997, 71, 1265–1271; Bridgen A. und Elliott R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15400–15404). Diese Verfahren. ermöglichen die Rekonstitution von erwünschten Paramyxovirus-Vektoren, einschließlich der Parainfluenza-Virus-, vesikulären Stomatitis-Virus-, Tollwut-Virus-, Masern-Virus-, Rinderpest-Virus- und Sendai-Virusvektoren von DNA. Wenn die F-, HN- und/oder M-Gene aus der Virusvektor-DNA deletiert sind, werden keine infektiösen Viruspartikel gebildet. Es ist jedoch möglich, durch Einbringen dieser deletierten Gene und/oder von Genen, die ein Hüllprotein von einem anderen Virus codieren, in die Wirtszellen und das Exprimieren von ihnen infektiöse Viruspartikel herzustellen.
Verfahren zum Einbringen von Vektor-DNA in Zellen können (1) ein Verfahren zum Bilden von DNA-Präzipitaten, die in die erwünschten Zellen inkorporiert werden können, (2) ein Verfahren zum Herstellen eines Komplexes, der positiv geladene DNA umfasst, die geeignet ist, um in die erwünschten Zellen inkorporiert zu werden, und die eine niedrige Cytotoxizität hat, und (3) ein Verfahren zum sofortigen Öffnen einer Pore, die groß genug ist, dass DNA durchpassieren kann, in der erwünschten Plasmamembran unter Verwendung eines elektrischen Pulses einschließen.
Eine Vielzahl von Transfektions-Reagenzien kann in (2) verwendet werden, zum Beispiel einschließlich DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE und DOSPER (Boehringer #1811169). Für (1) kann eine Transfektion unter Verwendung von Calciumphosphat verwendet werden. In diesem Verfahren wird die DNA, die durch Zellen inkorporiert wurde, in phagocytische Vesikel aufgenommen, aber es ist bekannt, dass eine ausreichende Menge der DNA auch in den Kern aufgenommen wird (Graham F. L. und van Der Eb J., Virology, 1973, 52, 456; Wigler M. und Silverstein S., Cell, 1977, 11, 223). Chen und Okayama untersuchten die Optimierung der Transfertechnologie und berichteten, (1) dass die maximale Wirksamkeit erhalten wird, wenn die Zellen und Präzipitate bei 2% bis 4% CO₂ bei 35°C für 15 h bis 24 h inkubiert werden, (2) dass eine zirkuläre DNA eine höhere Aktivität aufweist als lineare DNA und (3) dass die optimalen Präzipitate gebildet werden, wenn die DNA-Konzentration in der gemischten Lösung 20 μg/ml bis 30 μg/ml ist (Chen C. und Okayama H., Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 2745). Das Verfahren von (2) ist für eine transitorische Transfektion geeignet. Klassischer ist ein Transfektionsverfahren, in dem DEAE-Dextran (Sigma #D-9885 M. W. 5 × 10⁵) mit der DNA in einer erwünschten Konzentration gemischt wird, bekannt. Weil die meisten Komplexe im Endosom abgebaut werden, kann Chloroquin zugefügt werden, um die Transfektionswirksamkeit zu verstärken (Calos, M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). Das Verfahren von (3), genannt Elektroporation, kann weitreichender angewendet werden als die Verfahren von (1) und (2), weil es für jede Art von Zellen verwendet werden kann. Die Transfektionswirksamkeit kann durch Optimieren der Dauer der Puls-Ströme, der Form des Pulses, der Stärke des elektrischen Felds (Abstand zwischen den Elektroden und Spannung), der Leitfähigkeit des Puffers, der DNA-Konzentration und der Zelldichte maximiert werden.
In der vorliegenden Erfindung werden die Transfektions-Reagenzien geeignet verwendet, weil unter den obigen drei Verfahren das Verfahren von (2) leicht durchzuführen ist und das Testen einer großen Anzahl von Proben unter Verwendung einer großen Anzahl von Zellen ermöglicht. Bevorzugte Transfektions-Reagenzien schließen das Superfect-Transfektionsreagenz (QIAGEN, Kat. Nr. 301305) und das liposomale DOSPER-Transfektionsreagenz (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1811169) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Genau wird die Rekonstitution von cDNA wie folgt durchgeführt.
LLC-MK2, eine Zelllinie, die von einer Affenniere abgeleitet wurde, wird in einer Plastikplatte mit 24 Vertiefungen bis 6 Vertiefungen oder in einer 100 mm-Petrischale in Minimum-Essential-Medium (MEM), enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) und ein Antibiotikum (100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin) gezüchtet, bis zu 70% bis 80% Konfluenz. Die Zellen werden dann zum Beispiel bei 2 pfu/Zelle mit rekombinantem Vaccinia-Virus vTF7-3, das die T7-Polymerase exprimiert und das durch eine 20 Minuten-UV-Bestrahlung in der Anwesenheit von 1 μg/ml Psoralen inaktiviert worden ist, infiziert (Fuerst T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8122–8126; und Kato, A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579). Die Menge an Psoralen und die Dauer der UV-Bestrahlung kann optimiert werden. Eine Stunde nach der Infektion werden die Zellen zum Beispiel durch Lipofektion unter Verwendung von Superfect (QIAGEN) mit 2 μg bis 60 μg oder bevorzugter 3 μg bis 5 μg der obigen rekombinanten Sendai-Virus-cDNA zusammen mit Expressionsplasmiden für Virusproteine (24-0,5 μg pGEM-N, 12-0,25 μg pGEM-P und 24-0,5 μg pGEM-L oder bevorzugter 1 μg pGEM-N, 0,5 μg pGEM-P und 1 μg pGEM-L) (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579), die in trans wirken und zum Produzieren eines Volllängen-Sendai-Virusgenoms benötigt werden, transfiziert. Die transfizierten Zellen werden in serumfreiem MEM, enthaltend, wenn gewünscht, 100 μg/ml Rifampicin (Sigma) und Cytosin-Arabinosid (AraC) (Sigma), bevorzugter 40 μg/ml Arabinosid alleine, gezüchtet, so dass die Arzneistoffkonzentration angepasst wird, dass sie optimal ist, um die Cytotoxizität des Vaccinia-Virus zu minimieren und die Gewinnung des Virus zu maximieren (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579). Die Zellen werden für 48 h bis 72 h nach der Transfektion gezüchtet, dann gewonnen und durch drei Zyklen von Einfrieren-Auftauen lysiert. Die Zelllysate werden in LLC-MK2-Zellen transfiziert, und nach einer 3 Tage- bis 7 Tage-Kultur wird das Kulturmedium gewonnen. Um einen Virusvektor zu rekonstituieren, dem ein Gen fehlt, das ein Hüllprotein codiert, der zur Replikation unfähig ist, kann der Vektor in LLC-MK2-Zellen transfiziert werden, die ein Hüllprotein exprimieren oder die mit einem Expressionsplasmid für das Hüllprotein co-transfiziert wurden. Alternativ können die transfizierten Zellen überschichtet und auf LLC-MK2-Zellen kultiviert werden, die das Hüllprotein exprimieren, um einen Deletions-Virusvektor zu vermehren (siehe Internationale Veröffentlichungen Nr. WO 00/70055 und WO 00/70070 ). Der Virustiter des Kulturmediums kann durch Messen der Hämagglutinin-Aktivität (HA) bestimmt werden. Die HA kann durch eine „Endpunkt-Verdünnung" bestimmt werden (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579; Yonemitsu Y. und Kaneda Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells., Molecular Biology of Vascular Diseases. Methods in Molecular Medicine, Hrsg. Baker A. H., Humana Press, 1999, 295–306). Um die mögliche Kontamination des Vaccinia-Virus vTF7-3 zu eliminieren, kann die erhaltene Allantoisflüssigkeit-Probe geeignet (10⁶-mal zum Beispiel) verdünnt und in Hühnereiern re-amplifiziert werden. Die Re-Amplifizierung kann zum Beispiel dreimal oder öfter wiederholt werden. Der erhaltene Virus-Bestand kann bei –80°C gelagert werden.
Die Wirtszellen für die virale Rekonstitution sind nicht auf irgendwelche besonderen Typen von Zellen beschränkt, solange der Virusvektor in den Zellen rekonstituiert werden kann. Die Wirtszellen können Affennieren-abgeleitete Zellen wie LLC-MK2-Zellen und CV-1-Zellen, kultivierte Zelllinien wie BHK-Zellen, die von einer Hamsterniere abgleitet wurden, und von Menschen abgeleitete Zellen einschließen. Darüber hinaus, um eine große Menge des Sendai-Virusvektors zu erhalten, können embryonierte Hühnereier mit Virusvektoren, die von den obigen Wirtszellen erhalten wurden, infiziert werden, und die Vektoren können amplifiziert werden. Das Verfahren des Produzierens von Virusvektoren unter Verwendung von Hühnereiern ist etabliert worden (Advanced protocols in neuroscience study III, Molecular physiology in neuroscience., Hrsg. Nakanishi et al., Kouseisha, Osaka, 1993, 153–172). Genau werden zum Beispiel befruchtete Eier für 9 Tage bis 12 Tage bei 37°C bis 38°C in einem Brutschrank inkubiert, um die Embryonen zu züchten. Die Virusvektoren werden in die Allantoishöhle beimpft, und die Eier werden weiter für einige Tage inkubiert, um die Vektoren zu vermehren. Die Bedingungen wie die Dauer der Inkubation können in Abhängigkeit des Typs des verwendeten rekombinanten Sendai-Virus variieren. Dann werden die Allantoisflüssigkeiten, die die Viren enthalten, gewonnen. Der Sendai-Virus-Vektor wird abgetrennt und aus der Allantoisflüssigkeit-Probe gemäß dem Standardverfahren gereinigt (Tashiro M., Protocols in virus experiments., Hrsg. Nagai und Ishihama, MEDICAL VIEW, 1995, 68–73). Darüber hinaus werden Trypsin-resistente Zellen (zum Beispiel Zellen wie LLC-MK2) für die Massenproduktion von F-Gen-defizientem Sendai-Virus bevorzugt.
Die Konstruktion und die Herstellung von Sendai-Virusvektoren, denen das F-Gen fehlt, kann zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden (siehe WO 00/770055 ) und WO00/70070 ).
1. Konstruktion von cDNA, die das F-Gen-defiziente Sendai-Virusgenom codiert, für das Clonieren von endogenen Genen.
Genomische Volllängen-Sendai-Virus (SeV)-cDNA, pSeV18⁺b(+) (Hasan M. K. et al., J. Gen. Virol. 78, 2813–2820, 1997) („ pSeV18⁺b(+)" wird auch als „pSeV18+" bezeichnet) wird mit SphI/KpnI verdaut, und das verdaute Fragment (14673 bp) wird gewonnen. Das Fragment wird in pUC18 subcloniert, um das Plasmid pUC18/KS zu erhalten. Die Konstruktion der F-Gen-defizienten Region wird unter Verwendung von pUC18/KS mit einer Kombination von PCR und Ligierungs-Techniken durchgeführt. Die genomische F-Gen-defiziente SeV-cDNA (pSeV18⁺/ΔF) wird durch Entfernen des F-Gen-ORF (ATG-TGA= 1698 bp) und Füllen der Lücke mit atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 4) konstruiert. In der PCR werden Primerpaare, die aus vorwärts: 5'-gttgagtactgcaagagc (SEQ ID NO: 5) und revers: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc (SEQ ID NO: 6) bestehen, stromaufwärts des F-Gens verwendet, und Primerpaare, die aus vorwärts: 5'-atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 7) und revers: 5'-tggtgaatgagagaatcagc (SEQ ID NO: 8) bestehen, werden stromabwärts des F-Gens verwendet. Die PCR-Produkte werden dann in die EcoT22I-Stelle ligiert. Das so erhaltene Plasmid wird mit SacI und SalI verdaut, und das Fragment (4931 bp), das die F-Gen-defiziente Region enthält, wird in pUC18 subcloniert, um pUC18/dFSS zu ergeben. Dieses pUC18/dFSS wird mit DraIII verdaut, und das verdaute Fragment wird gewonnen. Das Fragment wird mit einem F-Genenthaltenden DraIII-Fragmente von pSeV18⁺ ersetzt, um das Plasmid pSeV18+/ΔF zu konstruieren.
Die EIS-Sequenz (SeV-spezifische Sequenz, E, Ende; I, zwischen den Genen; S, Start) des F-Gens bleibt im Konstrukt, und das Konstrukt kann Polypeptide exprimieren, die aus 5 Aminosäuren bestehen, die von dem Primer stammen, der verwendet wurde, um die Lücke zu verbinden, obwohl der stromabwärts liegende ORF des F-Gens entfernt ist.
Die Insertion von exogenen Genen in die F-Gen-defekte Region kann unter Verwendung der Nsil- und NgoMIV-Restriktionsenzym-Stellen, die in der F-Gendefekten Region in pUC18/dFSS liegen, erzielt werden. Um exogene Gene in die Region zu clonieren, können zum Beispiel exogene Genfragmente unter Verwendung eines Nsil-endenden Primers und eines NgoMIV-endenden Primers amplifiziert werden.
Zum Beispiel wird das EGFP-Gen zuerst durch PCR amplifiziert, um eine cDNA zu konstruieren, die das EGFP-Gen enthält (pSeV18⁺/ΔF-GFP). Um die Zahl der Nucleotide des EGFP-Genfragments anzupassen, um ein Mehrfaches von 6 zu enthalten (Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033–1045, 1996), wird die PCR unter Verwendung des NsiI-endenden Primers (5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/SEQ ID NO: 9) als der 5'-End-Primer und des NgoMIV-endenden Primers (5'-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/SEQ ID NO: 10) als der 3'-End-Primer durchgeführt. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Nsil und NgoMIV verdaut, und das Fragment wird von einem Gel gewonnen. Das Fragment wird in die F-Gen-defekte Region in pUC18/dFSS unter Verwendung der NsiI- und NgoMIV-Restriktionsenzym-Stellen subcioniert, und die Sequenz wird bestätigt. Das DraIII-Fragment, das das EGFP-Gen enthält, wird dann gewonnen, mit dem F-Gen-enthaltenden DraIII-Fragment von pSeV18⁺ ersetzt und ligiert, um pSeV18⁺/ΔF-GFP zu erhalten.
Die Insertion von exogenen Genen stromaufwärts des NP-Gens wird unter Verwendung der Restriktionsenzym NotI-Erkennungsstelle, die in pSeV18⁺/ΔF oder pSeV18⁺/ΔF-GFP liegt, erzielt. pSeV18⁺/ΔF hat jedoch eine Sequenz, die ein 5 Aminosäuren-Peptid exprimieren kann, das von dem Primer stammt, der verwendet wurde, um die F-Gen-defiziente Region zu verbinden. Darüber hinaus wird GFP durch pSeV18⁺/ΔF-GFP co-exprimiert. Daher werden die Genkonstrukte wie folgt hergestellt, sodass die Peptide oder GFP nicht exprimiert werden, wenn es nötig ist.
Das Fragment (6288 bp), das die F-Gen-defiziente Region enthält, wird durch Verdauen von pSeV18⁺/ΔF-GFP mit SalI und NheI gewonnen und in Litmus 38 (New England Biolabs, Beverly, MA) subcloniert, um LitmusSalINhelfrg/ΔF-GFP zu erhalten. Die Deletion des EGFP-Gens, das die EIS-Sequenz stromaufwärts des F-Gens, das deletiert worden ist, enthält, wird durch das inverse PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR wird unter Verwendung eines reversen Primers (5'-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/SEQ ID NO: 11), der gestaltet ist, um die Restriktionsenzym SexAI-Erkennungssequenz stromaufwärts des GFP-Gens zu enthalten, und eines Vorwärts-Primers (5'-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/SEQ ID NO: 12), der gestaltet ist, um die Restriktionsenzym SexAI-Erkennungssequenz stromabwärts des GFP-Gens zu enthalten, durchgeführt. Das Fragment mit der bevorzugten Größe (10855 bp) wird ausgeschnitten und ligiert, um das EGFP-Gen zu deletieren, das die EIS-Sequenz stromaufwärts des F-Gens, das deletiert worden ist, enthält.
Das resultierende Konstrukt hat aufgrund der Primer-Gestaltung eine Extra-15 bp-Sequenz zwischen den zwei SexAI-Stellen. Daher wird das Plasmid verwendet, um den E. coli.-SCS110-Stamm zu transformieren (der dcm^–/dam^– SCS110-Stamm wird verwendet, weil SexAI methyliert ist und nicht damit verdaut werden kann). Das Plasmid wird mit dem Restriktionsenzym SexAI verdaut, und zwei Genfragmente, 1628 bp und 9219 bp, werden gewonnen und ligiert, um das Extra-15 bp-Fragment zu entfernen, das in LitmusSalINhelfrg/ΔF (Δ5aa) enthalten ist, in dem das EGFP-Gen, das die EIS-Sequenz stromaufwärts des F-Gens enthält und ein Mehrfaches von 6 Nummern an Nucleotiden aufweist, deletiert ist. Das Plasmid wird mit SalI und NheI verdaut, und das Fragment wird gewonnen, mit einem SalI/Nhel-Fragment ersetzt, das das F-Gen von pSeV18⁺ enthält, und ligiert, um das Plasmid pSeV18⁺/ΔF (Δ5aa) zu erhalten.
Die Insertion eines exogenen Gens in das Plasmid wird zum Beispiel unter Verwendung der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Not, das stromaufwärts des NP-Gens lokalisiert ist, durchgeführt.
2. Konstruktion einer cDNA, die das F-Gen-defiziente Sendai-Virusgenom codiert, das das hFGF2 Gen enthält
Verschiedene Verfahren für das Erhalten von menschlicher FGF2 (hFGF2)-cDNA sind bekannt. Zum Beispiel wird die RT-PCR durchgeführt, um cDNA unter Verwendung von vaskulären glatten Muskelzellen, die von der menschlichen Vena saphena magna mit dem Einverständnis eines Patienten erhalten worden sind, zu isolieren. Die hFGF2-cDNA wird dann durch Sub-Clonieren des amplifizierten Produkts in pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA) bei HindIII (5'-Ende) und EcoRI (3'-Ende) hergestellt. Die hFGF2-cDNA-Sequenz kann durch Vergleichen mit jener im Bericht von Abraham et al. (Abraham, J. A. et al., EMBO J. 5 (10), 2523–2528, 1986) bestätigt werden.
Um das hFGF2-Gen an der Restriktionsenzym NotI-Stelle, die stromaufwärts des NP-Gens lokalisiert ist, zu inserieren, kann das hFGF2-Genfragment die SeV-spezifische Sequenz (EIS-Sequenz) an seinem 3'-Ende und Not'-Erkennungssequenzen an seinen beiden Enden enthalten. Genau wird die PCR unter Verwendung der hFGF2-cDNA als eine Matrize und des N-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccg aggatggcggcagcggcgcc/SEQ D NO: 13), der ein Start-Codon enthält, und des C-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacat tggaagaaaaagtatagc/SEQ ID NO: 14), der eine Stopp-Codon-Region und die EIS-Sequenz enthält, durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wird mit NotI verdaut und dann in pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA) subcloniert, um pBS – hFGF2 zu erhalten. Die Nucleotidsequenz wird bestätigt, und im Fall, dass das Gen Mutationen enthält, werden die Mutationen unter Verwendung zum Beispiel des QuickChange^TM ortsgerichteten Mutagenese-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß dem beigefügten Protokoll korrigiert. Das Fragment, das die hFGF2-cDNA enthält, wird durch Verdauen von pBS-hFGF2 mit NotI erhalten und in pSeV18⁺/ΔF (Δ5aa) an der NotI-Stelle inseriert, die stromaufwärts des NP-Gens lokalisiert ist, um eine genomische F-Gen-defiziente Sendai-Virus-cDNA zu konstruieren, die das hFGF2-Gen enthält, pSeV18⁺ hFGF2/ΔF (Δ5aa). Hierin nachstehend wird pSeV18⁺hFGF2/ΔF (Δ5aa) auch als pSeV18⁺hFGF2/ΔF angezeigt.
3. Konstruktion eines F-Expressionsplasmids
Das Plasmid pCALNdLw (Cre//oxP-induzierbares Expressionsplasmid; Arai, T. et al., J. Virol. 72 (2), 1115-1121, 1998), das gestaltet ist, um die Expression von Genprodukten durch die Cre-DNA-Rekombinase zu induzieren, kann verwendet werden, um das Sendai-Virus-F-Gen (SeV-F) zu exprimieren. Das Fragment (1783 bp), das das SeV-F-Gen enthält, wird durch Verdauen von pUC18/KS mit Styl und BstUI isoliert, stumpf beendet und in pCALNdLw an einer einzigen SwaI-Stelle inseriert, um das F-Expressionsplasmid pCALNdLw/F zu konstruieren.
4. Herstellung einer Helfer-Zelllinie, die das SeV-F-Protein induzierbar exprimiert
Eine Helfer-Zelllinie, die das SeV-F-Protein exprimiert, wird etabliert, um infektiöse Viruspartikel aus dem F-Gen-defizienten Genom zu gewinnen. Zum Beispiel können Zellen von LLC-MK2-Zellen, einer Affennieren-abgeleiteten Zelllinie, die oft für die SeV-Vermehrung verwendet wird, erhalten werden. LLC-MK2-Zellen werden in MEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 20 E/ml Natrium-Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycin, in einer Atmosphäre, enthaltend 5% CO₂, bei 37°C kultiviert. Das Plasmid pCALNdLw/F, das gestaltet ist, um die Expression des F-Genprodukts durch die Cre-DNA-Rekombinase zu induzieren, wird unter Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens mit dem Mammalian Transfection Kit (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß den Protokollen, die Fachleuten bekannt sind, in LLC-MK2-Zellen transferiert.
Genau werden 10 μg des Plasmids pCALNdLw/F in LLC-MK2-Zellen transferiert, die zu 40% Konfluenz in einer 10 cm Schale vermehrt werden, und dann werden die Zellen in 10 ml MEM-Medium, enthaltend 10% FBS, in einem Brutschrank mit einer Atmosphäre von 5% CO₂ bei 37°C für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen werden nach 24 Stunden von der Schale geschabt, in 10 ml Medium suspendiert und auf fünf 10 ml-Schalen aliquotiert, sodass zum Beispiel 1 Schale 5 ml enthält, 2 Schalen 2 ml enthalten und 2 Schalen 0,2 ml der Zellsuspension enthalten. Jede Zelle wird in 10 ml MEM-Medium, enthaltend 1200 μg/ml G418 (Gibco-BRL, Rockville, MD) und 10% FBS, für 14 Tage mit einem Mediumwechsel alle 2 Tage kultiviert, und stabil transfizierte Zelllinien werden selektiert. Zum Beispiel werden 30 Stämme von G418-resistenten Zellen, die in dem Medium gezüchtet wurden, unter Verwendung eines Clonierungsrings gewonnen. Jeder Clon wird vermehrt, bis er in einer 10 cm-Schale konfluent wird.
Die Selektion von stabil transfizierten Zelllinien mit dem F-Gen wird wie folgt ausgeführt. Genau kann der Expressionsspiegel des F-Proteins durch Western-Blotten semi-quantitativ analysiert werden. Die Zellen werden in 6 cm-Schalen zur Konfluenz kultiviert und dann mit Adenovirus AxCANCre bei einer moi = 3 durch das Verfahren von Saito et al. (Saito et al., Nucl. Acids Res. 23, 3816–3821, 1995; Arai, T. et al., J. Virol. 72 (2), 1115–1121, 1998) infiziert, um die Expression des F-Proteins in jedem Clon zu induzieren. Drei Tage nach der Infektion wurde das Kulturmedium aus der Schale entfernt, und dann wurden die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, mit einem Schaber abgeschabt, bei 1500 × g für 5 min zentrifugiert und gewonnen. Die Zellen werden bei –80°C gelagert und nach dem Auftauen in 150 μl PBS-Puffer resuspendiert. Eine gleiche Menge von 2x Tris-SDS-BME-Proben-Ladepuffer (0,625 M Tris (pH 6,8), 5% SDS, 25% 2-ME, 50% Glycerin und 0,025% BPB, Owl Separation Systems) wird dazu zugefügt. Das Gemisch wird bei 98°C für 3 min hitzebehandelt und dann einer Elektrophorese unterzogen. Die Proben (1 × 10⁵ Zellen pro Spalte) werden dann einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Western-Blotten gemäß bekannten Protokollen unterzogen. Der SeV-F-Expressionsspiegel wird durch Western-Blotten unter Verwendung einer 1:1000-Verdünnung eines anti-SeV-F-Antikörpers (f236) als der primäre Antikörper semi-quantitativ gemessen.
Durch das Verfahren, wie oben beschrieben, wird die Etablierung von LLC-MK2-Zellen, in denen das SeV-F-Genprodukt induzierbar exprimiert werden kann, bestätigt. Hierin nachstehend werden diese Zellen vor der Induktion der SeV-F-Genexpression als LLC-MK2/F beschrieben, und die Zellen nach der Induktion werden als LLC-MK2/F/Ad beschrieben.
5. Rekonstitution und Amplifizierung eines F-Gen-defizienten SeV
F-Gen-defiziente genomische Sendai-Virus-cDNA, die ein angiogenes Gen (angiogene Gene) enthält, kann durch Transfizieren von Helferzellen, die das F-Gen damit exprimieren, rekonstituiert werden. Zum Beispiel wird die F-Gen-defiziente genomische Sendai-Virus-cDNA, die das hFGF2-Gen enthält (pSeV18⁺hFGF2/ΔF), wie vorstehend beschrieben, verwendet, um LLC-MK2-Zellen wie folgt zu transfizieren. LLC-MK2-Zellen werden auf 10 cm-Petrischalen in einer Dichte von 5x 10⁶ Zellen/Schale ausgesät, für 24 Stunden inkubiert und (in einer moi = 2 bis 3, vorzugsweise 2) für eine Stunde bei Zimmertemperatur mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122–8126, 1986), das mit langwelligem UV (365 nm) und Solaren für 20 min behandelt worden ist, transfiziert. Für die UV-Bestrahlung des Vaccinia-Virus wird zum Beispiel der UV Stratalinker 2400 (Katalog-Nr. 400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA) verwendet, der mit fünf 15 Watt-Lampen ausgestattet ist. Die Zellen werden zweimal gewaschen, und die Plasmide pSeV18⁺hFGF2/ΔF, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L (Kato, A., et al., Genes Cells 1, 569–579, 1996) und pGEM/F-HN ( WO 00/70070 ) werden in OptiMEM (GIBCO) in Verhältnissen von 12 μg, 4 μg, 2 μg, 4 μg beziehungsweise 4 μg/Schale resuspendiert und mit SuperFect-Transfektionsreagenz (1 μg DNA/5 μl Superfect, QIAGEN) gemischt. Die Gemische werden bei Zimmertemperatur für 15 min stehengelassen und dann zu 3 ml OptiMEM, enthaltend 3% FBS, zugefügt. Das resultierende Gemisch wird zu den Zellen zugefügt und für 3 bis 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden dann zweimal mit serumfreiem MEM gewaschen und in serumfreiem MEM, enthaltend 40 μg/ml Cytosin-ß-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) und 7,5 μg/ml Trypsin (GIBCO) für 24 Stunden inkubiert.
Das Kulturmedium wird von der Zellkultur entfernt, und Helferzellen, die das F-Gen exprimieren, LLC-MK2/F/Ad-Zellen, die, wie vorstehend beschrieben, konstruiert worden sind, werden auf die Zellen geschichtet. Genau werden LLC-MK2/F/Ad-Zellen in serumfreiem MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) resuspendiert, auf die Zellen ohne Kulturmedium überschichtet und dann für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen werden unter Verwendung eines Schabers gewonnen, und die Pellets werden in OptiMEM (10⁷ Zellen/ml) resuspendiert und dreimal eingefroren und aufgetaut. Die Lysate werden zu den LLC-MK2/F/Ad-Zellen (4 × 10⁶ Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen) zugefügt (200 μl/Vertiefung), und zusätzliche 300 μl/Vertiefung serumfreies MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC, 7,5 μg/ml Trypsin) werden zu jeder Vertiefung zugefügt und dann für 15 Stunden bis 24 Stunden inkubiert. Das Kulturmedium wird entfernt, und die Zellen werden mit serumfreiem MEM gewaschen und mit frischem serumfreiem MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) ersetzt. Die Zellen werden für 5 Tage bis 9 Tage inkubiert, und das Kulturmedium wird gewonnen. Das gewonnene Medium enthält rekonstituierte F-Gen-defiziente SeV-Partikel. Die F-Gen-defizienten SeV-Partikel können durch Infizieren in LLC-MK2/F/Ad-Zellen und Kultivieren (oder Wiederholen des Vorgangs) der Zellen in serumfreiem MEM (enthalten 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) amplifiziert werden.
Zu dieser Zeit wird eine Kontamination des rekombinanten Vaccinia-Virus, das verwendet wird, um die T7-RNA-Polymerase während der Rekonstitution zu exprimieren, großteils durch zweimaliges Filtern des Kulturmediums, enthaltend die F-Gen-defizienten SeV-Partikel, mit einem 0,22 μm-Filter verhindert. Genau wird die Kultur (post-P2-Proben), die zweimal oder öfter in serumfreiem MEM, enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin), amplifiziert wurde, zweimal mit einem 0,22 μm-Filter gefiltert, und die Kultur wird weiter einmal in serumfreiem MEM, enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin), amplifiziert, um amplifiziertes F-Gen-defizientes SeV zu erhalten, das als SeV dienen kann, das frei von einer rekombinanten Vaccinia-Virus-Kontamination ist.
Beim Herstellen von Deletions-Virusvektoren können zwei verschiedene Virusvektoren, die eine Deletion eines anderen Hüllgens im Genom aufweisen, in dieselbe Zelle transfiziert werden. In diesem Fall wird jedes deletierte Hüllprotein durch die Expression vom anderen Vektor bereitgestellt, und diese gegenseitige Komplementierung erlaubt die Herstellung von infektiösen Viruspartikeln, die sich replizieren und vermehren können. Daher können zwei oder mehrere Virusvektoren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig in einer Kombination beimpft werden, die sich gegenseitig komplementieren, wodurch ein Gemisch von jedem Hüllen-Deletions-Virusvektor zu niedrigen Kosten und in einer großen Menge produziert wird. Weil diese Viren, denen ein Hüllgen fehlt, ein kleineres Genom haben, können sie die Insertion eines langen exogenen Gens ermöglichen. Zusätzlich ist es für diese Viren, die intrinsisch nicht infektiös sind, schwierig, den Status einer Co-Infektion beizubehalten, nachdem sie außerhalb der Zellen verdünnt worden sind, und sie werden so sterilisiert und weniger schädlich für die Umwelt.
Sobald ein viraler Vektor unter Verwendung eines Gens für die Behandlung einer Krankheit als das exogene Gen hergestellt ist, dann kann der Vektor verabreicht werden, um eine Gentherapie durchzuführen. Wenn der virale Vektor der vorliegenden Erfindung in einer Gentherapie verwendet wird, kann ein exogenes Gen, das erwünschte therapeutische Wirkungen zusichert, oder ein endogenes Gen, dessen Expression im Körper eines Patienten beeinträchtigt ist, entweder durch ein Verfahren der direkten Verabreichung oder durch ein Verfahren der indirekten (ex vivo) Verabreichung für die Genexpression exprimiert werden. Es gibt keine Einschränkung für den Typ des exogenen Gens, so lange es ein angiogenes Gen ist oder die Angiogenese fördert, einschließlich nicht nur einer Nucleinsäure, die ein Protein codiert, sondern auch einer Nucleinsäure, die kein Protein codiert, zum Beispiel eines Ribozyms oder einer Antisense-Nucleinsäure eines Gens, das die Angiogenese unterdrückt.
Das gewonnene Paramyxovirus kann gereinigt werden, um im Wesentlichen rein zu sein. Die Reinigung kann durch ein bekanntes Reinigungs-/Separierungsverfahren wie Filtration, Zentrifugation und Säulen-Reinigung oder die Kombination davon durchgeführt werden. Der Begriff „im Wesentlichen rein" bedeutet, dass ein Virus in einer Probe, wo es als ein Bestandteil vorhanden ist, den Hauptteil umfasst. Typischerweise kann ein im Wesentlichen reiner Virusvektor in einer Probe bestätigt werden, wenn das Protein, das vom Virusvektor stammt, 50% oder mehr, vorzugsweise 70% oder mehr, bevorzugter 80% oder mehr, noch mehr bevorzugt 90% oder mehr der Gesamtproteine in der Probe einnimmt. Beispielhafte Reinigungsverfahren, die für Paramyxovirus spezifisch sind, schließen Verfahren unter Verwendung von Cellulose-Schwefelsäureester oder vernetztem Polysaccharid-Schwefelsäureester (geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. ( JP-B) Sho 62-30752 ; JP-B Sho 62-33879 ; und JP-B Sho 62-30753 ) und Verfahren ein, die das Ermöglichen eines Polysaccharids, das Fucose-Schwefelsäure und/oder sein Abbauprodukt umfasst, umfassen ( WO 97/32010 ).
Der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung kann als eine Zusammensetzung zusammen mit einem erwünschten, pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Medium hergestellt werden. Ein „pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff", wie hierin definiert, bezeichnet jene Materialien, die mit einem Vektor verabreicht werden können und den Gentransfer, der durch den Vektor erreicht wird, nicht signifikant inhibieren. Zum Beispiel kann der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung geeignet mit einem Medium wie Kochsalzlösung und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt werden, um eine Zusammensetzung herzustellen. Wenn der Paramyxovirus-Vektor der Erfindung in Hühnereiern vermehrt wird, kann die Zusammensetzung Allantoisflüssigkeiten enthalten. Zusätzlich kann die Zusammensetzung Medien wie deionisiertes Wasser oder eine wässrige 5%-Dextrose-Lösung enthalten. Sie kann weiterhin Stabilisierer, Antibiotika und dergleichen enthalten. Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Produzieren von angiogenen Zusammensetzungen in der vorliegenden Erfindung, die den Schritt des Mischens des Vektors der vorliegenden Erfindung mit den pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung der Vektoren der vorliegenden Erfindung zum Produzieren der angiogenen Zusammensetzungen in der vorliegenden Erfindung.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich als Arzneimittel. Die vorliegenden Erfindung betrifft Ischämie-therapeutische Präparate, einschließlich die Vektoren in der vorliegenden Erfindung und pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe. Die vorliegenden Erfindung betrifft auch die Verwendung der Vektoren und der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutika. Ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)-Gen, das durch Paramyxovirus-Vektoren getragen wird, kann durch Verabreichen der Paramyxovirus-Vektoren, die, wie vorstehend beschrieben, konstruiert worden sind, oder der Zusammensetzungen, die die Vektoren enthalten, transferiert werden. Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Induzieren der Angiogenese, das den Schritt des Verabreichens der Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung oder der angiogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfasst. Das Verfahren ist besonders nützlich, um ischämische Gewebe zu behandeln. Obwohl es keine Einschränkung im Bezug auf die Stellen der Verabreichung gibt, ist die lokale Verabreichung des Transgens direkt in ischämische Gewebe oder ihre umgebenden Gebiete bevorzugt, sodass die Expressionsprodukte in den ischämischen Geweben konzentriert sind und vom Auslaufen in das Kreislaufsystem abgehalten werden. Alternativ wird es bevorzugt, das Transgen lokal unter Verwendung von korrekten Gen-Abgabesystemen in den Zielgewebs-Gebieten zu exprimieren. Zum Beispiel kann eine Gen-Abgabe durch Verabreichung von Paramyxovirus-Vektor-enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von innerhalb oder außerhalb der ischämischen Gewebe in vivo erreicht werden, um exogene Gene in den ischämischen Geweben zu exprimieren. Zusätzlich kann sie durch eine ex vivo-Verabreichung erreicht werden. Zum Beispiel können Zellen, die mit Paramyxovirus-Vektoren, die angiogene Gene codieren, transfiziert wurden, in ischämische Gewebegebiete injiziert oder in Arterien, die durch die ischämischen Gewebe fließen, infundiert werden.
Darüber hinaus kann die lokale Verabreichung unter Verwendung eines Katheters ausgewählt werden. Zum Beispiel können die Vektoren der vorliegenden Erfindung durch das Doppelballon-Katheter-Verfahren, in dem die Vektor-Zusammensetzungen in das Gebiet infundiert werden, in dem das Blutgefäß durch zwei Ballons getrennt ist, oder durch das Verabreichungsverfahren unter Verwendung eines porösen Ballons (Jorgensen, B. et al., Lancet 1 (8647): 1106–8, 1989; Wolinsky, H. und Thung, S. N., J. Am Coll. Cardiol. 15 (2): 475–81, 1990; WO 93/00051 ; WO 93/00052 ) verabreicht werden. Hydrogel-beschichtete Ballons können auch verwendet werden, wie vorstehend beschrieben (Takeshita, S. et al., Lab. Invest. 75 (4): 487–501, 1996).
Zum Beispiel können die Vektor-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch die Ventrikel-Höhle unter Verwendung eines Katheters direkt in das Myokard infundiert werden, um zum Beispiel einen Herzinfarkt, Angina oder andere ischämische Herzkrankheiten zu behandeln. Darüber hinaus kann die Angiogenese und die Entwicklung eines kollateralen Kreislaufs in dem Gebiet einer Stenose in der Coronararterie durch lokale Infusion der Vektoren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Katheters gefördert werden.
Die Verwendung eines Katheters, um die Vektoren zu verabreichen, erfordert jedoch einen relativ langen Zeitraum der Inkubation und kann durch den Ballon eine vaskuläre Verletzung verursachen. Darüber hinaus ist es oft schwierig, einen Katheter in diffuse Blutgefäße in ischämischen Geweben einzuführen. Die intramuskuläre (IM) Verabreichung der Vektoren wird für die Behandlung von ischämischen Geweben in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Die intramuskuläre Verabreichung ist leichter als die Verabreichung unter Verwendung eines Katheters, und das Risiko des Schädigens eines Blutgefäßes ist gering. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung werden zum Beispiel in ischämische Gewebe oder quergestreifte Muskeln, die die ischämischen Gewebe umgeben, verabreicht. Quergestreifte Muskeln schließen die Skelett- und Herzmuskeln ein. Bupivacain, von dem bekannt ist, dass es die Expression von Transgenen durch Induzieren der Regenerierung von Muskeln fördert, kann vor der Verabreichung der Virusvektoren verabreicht werden. Darüber hinaus kann auch die intradermale (ID) Verabreichung ausgewählt werden. Die Vektoren können zum Beispiel in Muskeln subkutan oder direkt durch eine Hautinzision transferiert werden. Es ist notwendig, vorsichtig zu sein, um nicht während des Vektortransfers eine Faszie zu schädigen. Zum Beispiel kann die Verabreichung unter Verwendung von Nadeln und Spritzen oder eines Bio-Injektors, der nicht die Verwendung von Nadeln erfordert, durchgeführt werden. Die Verabreichung kann entweder an einer einzigen Stelle oder an mehreren Stellen durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Verabreichung entweder einmal oder mehrere Male durchgeführt werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können wirksam in der Form einer Matrix verabreicht werden. Ein beispielhaftes Verfahren kann durch Dispergieren der Virusvektoren in einer Aterocollagen-Matrix und Verfestigen des resultierenden Gemischs durch Gefriertrocknung durchgeführt werden, wodurch die Matrix stufenweise abgebaut werden kann. Es ist berichtet worden, dass die Verwendung dieses Verfahrens für andauernde Wirkungen von Adenovirus-Vektoren, die für ihre transitorische Genexpression bekannt sind, und von nackter DNA nützlich ist (Ochida, T. et al., Nature Medicine 5, 707–710, 1999). Die Virusvektoren der vorliegenden Erfindung können mit diesen Hilfsmitteln formuliert werden und können gefriergetrocknet werden. Darüber hinaus kann ein Lipid-Kation zugefügt werden, um die Expressionswirkung zu erhöhen.
Es ist bekannt, dass sogar eine kleine verabreichende Matrix Proteine wie Wachstumsfaktoren über einen langen Zeitraum durch Nadeln mit der geeigneten Größe von 18 Gauge stufenweise freisetzten kann. Zum Beispiel hält im Fall, der Verabreichung von Protein-Präparaten die Wirksamkeit der Präparate wie eines Wachstumshormons länger an, zum Beispiel 7 Tage oder länger, als wenn Präparate wie ein Wachstumshormon alleine verabreicht werden. Es gibt einen Bericht, dass die Wirksamkeit normalerweise 10 Tage oder länger anhalten kann (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patent-Anmeldung Nr. ( JP-A) Hei 10-001440 ). Dieses Verfahren ermöglicht es daher, die Zahl der Verabreichungen und das Ausmaß das Schmerzes, der durch Patienten erlitten wird, signifikant zu verringern. Die Präparate können zum Beispiel als feste Injektionen (wie Implantate), die subcutan und intramuskulär verabreicht werden, und muköse Membran-Absorptionsmittel wie Suppositorien verwendet werden. Die Formen der festen Präparate für die Injektion sind oft partikel- oder stabförmig, was durch Injektionsnadeln verabreicht werden kann. Partikelformen wie eine Kugelform und Stabformen wie quadratische und zylindrische Formen sind bevorzugte Formen für das Präparat.
Die Größe der parenteralen Formulierung der vorliegenden Erfindung kann abhängig von der Art der Verabreichung gewählt werden, und jede Größe ist geeignet, so lange sie keinen übermäßigen Schmerz für Patienten verursacht. Wenn die Injektion aus einer stabförmigen Matrix von zum Beispiel 3 mm oder weniger (zum Beispiel 0,1 mm bis 3 mm) im Durchmesser und 30 mm oder weniger (zum Beispiel 0,5 mm bis 30 mm) Länge, vorzugsweise 1,3 mm oder weniger (zum Beispiel 0,1 mm bis 1,2 mm) im Durchmesser und 20 mm oder weniger (zum Beispiel 0,5 mm bis 20 mm) Länge besteht, was mit einer Injektionsnadel von 14 Gauge oder kleiner und bevorzugter jener von 0,1 mm bis 1 mm Durchmesser und etwa 1 mm bis 20 mm Länge verabreicht werden kann. Die Matrix ist vorzugsweise zylindrisch. Darüber hinaus, wenn die Injektion eine partikelförmige Matrix enthält, muss der Matrixdurchmesser 1 mm oder weniger (zum Beispiel etwa 0,1 μm bis 1 mm), vorzugsweise 150 μm oder weniger (zum Beispiel etwa 0,5 μm bis 100 μm), mehr bevorzugt etwa 1 μm bis 100 μm sein. Darüber hinaus kann das Gewicht der Matrix abhängig von der Form des Präparats ausgewählt werden, und für die Injektion sind die Gewichte oft 40 mg oder weniger, vorzugsweise 1 mg bis 25 mg.
Die Gene, die durch den Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung transferiert werden und, wie oben beschrieben, FGF2 (bFGF) codieren, fördern die Angiogenese und/oder die Vaskularisation. Diese Proteine schließen jedes Mitglied und jede Isoform ein, das/die zu der Familie gehört. Es wird zum Beispiel erwartet, dass FGF2 für die akute Ischämie-Therapie anwendbar ist. Zum Beispiel kann eine signifikante therapeutische Wirkung für akut kritische ischämische Extremitäten erwartet werden. Darüber hinaus zeigt FGF2 eine therapeutische Wirkung für einen Herzinfarkt (Yanagisawa-Miwa, A. et al., Science 257 (5075): 1401–3, 1992). Die Proteine können ein sekretorisches Protein, ein Membranprotein, ein cytoplasmatisches Protein oder ein nukleäres Protein sein. Vorzugsweise wird ein sekretorisches Protein verwendet. Darüber hinaus können Proteine künstlich synthetisiert werden. Beispiele von künstlich synthetisierten Proteinen sind Fusionsproteine mit andere Proteinen, dominant-negative Proteine (einschließlich lösliche Moleküle von Rezeptoren oder Membran-bindende dominant negative Rezeptoren), defiziente Formen von Zelladhäsions-Molekülen und Zelloberflächen-Moleküle. Darüber hinaus können Proteine, die an sekretorische Signale, Membran-Lokalisierungssignale, nukleäre Importsignale und dergleichen angeheftet sind, verwendet werden. Die Transgene können endogen induziert werden, um in ischämischen Geweben exprimiert zu werden. Es ist auch möglich, dass ihre Expressionen nicht induziert werden, sondern an verschiedenen Stellen exprimiert werden können. Darüber hinaus kann die Funktion der unerwünschten Gene, die in ischämischen Geweben exprimiert werden, durch die Expression von Antisense-RNA-Molekülen oder RNA-spaltenden Ribozymen unterdrückt werden.
Es wird erwartet, dass die Vektoren der vorliegenden Erfindung für die Gentherapie anwendbar sind, um verschiedene ischämische Krankheiten sowie Krankheiten, die durch eine Angiogenese behandelbar sind, zu behandeln. Solch eine Gentherapie schließt zum Beispiel die Behandlung einer Ischämie, die durch Gefäßzerreißung verursacht wird, eines Infarkts und einer Hämostase aufgrund einer vaskulären Dissoziation ein. Die ischämischen Krankheiten, die durch die Vektoren der vorliegenden Erfindung behandelbar sind, sind zum Beispiel eine cerebrovaskuläre Ischämie, eine Nierenischämie, eine Lungenischämie, eine Extremitäten-Ischämie, eine ischämische Cardiomyopathie und eine Myokard-Ischämie. Gewebe, die für die Gentherapie anwendbar sind, sind nicht besonders limitiert, und zum Beispiel können Muskeln, Gehirne, Nieren und Lungen verwendet werden. Darüber hinaus ist er für das Fördern der Angiogenese in Transplantaten wirksam. Darüber hinaus ist er für das Konstruieren von verschiedenen Krankheitsmodellen und für die Entwicklung oder Bewertung von Behandlungsverfahren in Krankheitsmodellen nützlich.
Eine beschleunigte Angiogenese durch die Vektor-Verabreichung kann zum Beispiel durch Messen der Dichte und Analysieren der Zahl von Kapillargefäßen in Biopsieproben und Bilder von einer Angiographie bestätigt werden. Darüber hinaus kann sie auch durch eine Blutfluss-Analyse unter Verwendung der Doppler-Perfusions-Bildanalyse bestätigt werden. Die Behandlungswirkung auf ischämische Gewebe wird durch makroskopische Beobachtung der Gewebenekrose oder der Gewebeamputation und die mikroskopische Beobachtung der Gewebeproben bestätigt.
Die Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung werden in Zielgewebe in pharmazeutisch wirksamen Dosen verabreicht, und so werden die Vektoren in die Zellen der Zielgewebe transferiert. Eine „pharmazeutisch wirksame Dosis" bedeutet eine Menge von Genen, die in die Zellen der Zielgewebe eingebracht werden soll, die zumindest teilweise die bevorzugte Behandlungswirkung oder eine Krankheits-Verhinderungswirkung erreicht. qAngiogene Faktoren werden von den Zellen produziert, an die die Vektoren durch Verabreichen einer wirksamen Dosis der Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung, die die erwünschten angiogenen Gene enthalten, transferiert werden. Vorzugsweise werden signifikante Spiegel der angiogenen Faktoren in den Geweben nachgewiesen, wo die wirksame Dosis der Vektoren der vorliegenden Erfindung, die die erwünschten angiogenen Gene enthalten, verabreicht wird. Der Begriff „signifikanter Spiegel" zeigt an, dass die Menge der Expression (Menge der Transkriptions- und Translationsprodukte) der Gene, die durch die Vektoren der vorliegenden Erfindung transferiert wurden, nachweisbar ist. Zum Beispiel weist sie darauf hin, dass der maximale Expressionsspiegel des transferierten Gens im Vergleich zum Expressionsspiegel des endogenen Gens signifikant verstärkt ist, wenn ein endogenes Gen, das dem Transgen entspricht, vorhanden ist. Vorzugsweise ist der Expressionsspiegel der angiogenen Gene an der Stelle der Verabreichung 1,2-mal oder mehr größer als der Expressionsspiegel des endogenen Gens, vorzugsweise 1,5-mal oder mehr, bevorzugter 2-mal oder mehr, noch mehr bevorzugt 10-mal oder mehr und am meisten bevorzugt 20-mal oder mehr. Der Expressionsspiegel des Transgens sollte jedoch durch Abwägen der wirksamen Expressionsdosis und der toxischen Spiegel entschieden werden.
Der Expressionsspiegel der Transgene in den Zellen kann durch Verfahren getestet werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Die Transkriptionsprodukte der Gene können nachgewiesen und durch die Verfahren wie Northern-Hybridisierung, RT-PCR und RNA-Protektionstest quantifiziert werden. Ein in situ-Nachweis kann durch Verfahren wie Northern-Hybridisierung und RT-PCR durchgeführt werden. Western-Blotten, Immunpräzipitierung, RIA, ELISA, Pull-down-Tests und dergleichen unter Verwendung von Antikörpern können durchgeführt werden, um Translationsprodukte nachzuweisen. Darüber hinaus, um den Nachweis der Expressionsprodukte des Transgens leichter zu machen, können Tags an das exprimierte Protein angeheftet werden oder Reportergene können inseriert werden, sodass die Reportergene exprimiert werden. Beispiele von Reportergenen schließen ohne Einschränkung die β-Galactosidase-, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-, alkalische Phosphatase- und die grün-fluoreszierendes Protein (GFP)-Gene ein.
Eine Dosis des Vektors kann abhängig von der Krankheit, dem Körpergewicht, dem Alter, dem Geschlecht, dem Symptom, dem Zweck der Verabreichung, dem Transgen und dergleichen variieren, aber sie kann durch Fachleute passend bestimmt werden. Die Dosis des Vektors kann vorzugsweise im Bereich von etwa 10⁵ Zell-infektiösen Einheiten (CIU)/ml bis etwa 10¹¹ CIU/mi und bevorzugter etwa 10⁷ CIU/ml bis etwa 10⁹ CIU/ml aber am meisten bevorzugt etwa 1 × 10⁸ CIU/ml bis etwa 5 × 10⁸ CIU/ml mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen sein. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die das Virus umfasst, kann an Patienten, einschließlich alle Säuger-Tiere, einschließlich Menschen, Affen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Rinder und Hunde verabreicht werden.
Die Dosis für Menschen liegt vorzugsweise im Bereich von 2 × 10⁸ CIU bis 2 × 10¹⁰ CIU im Allgemeinen für jede Verabreichungsstelle, bevorzugter eine Dosis von etwa 2 × 10⁹ CIU, zum Beispiel im Bereich von 5 × 10⁸ CIU bis 1 × 10¹⁰ CIU. Die Häufigkeit der Verabreichung ist einmal oder öfter innerhalb des Bereichs von klinisch verträglichen Nebenwirkungen. Die Häufigkeit der Verabreichung pro Tag ist dieselbe. Für nicht-menschliche Tiere kann zum Beispiel die Verabreichung durch Erhöhen oder Absenken der Zahl der Verabreichungsstellen oder durch Berechnen der Dosen basierend auf dem Gewichtsverhältnis von Mensch zu den Zieltieren oder dem Gewichtsverhältnis oder Volumenverhältnis der Zielstellen (wie ischämischen Geweben) erfolgen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der operativen Vorgehensweisen für eine mäßige (linkes Feld) und schwere (rechtes Feld) akute Hinterextremitäts-Ischämie von Mäusen. Die verzweigten Linien zeigen Arterien und Venen in der Hinterextremität an. Kurze dicke Linien weisen auf Exzisionsstellen von Gefäßen hin.
2 ist eine Graphik, die eine mit einer Hinterextremitäts-Ischämie in Verbindung stehende Expression von endogenem VEGF (ausgefüllt) und FGF2 (offen) im Muskel (linke Graphik) und Serum (rechte Graphik) zeigt. Mäßige und schwere Ischämie-Modelle von C57BL/6-Mäusen wurden verwendet. Zwei Tage nach der Operation wurden alle Oberschenkel- und Unterschenkel-Muskeln (n = 6) und Serum (n = 6) erhalten und Enzym-verbunden Immunabsorptions-Tests (ELISA) ausgesetzt. Die Werte wurden durch das extrahierte Gesamtprotein des Muskels beziehungsweise das Volumen standardisiert und mit Mittelwert ± S. D. ausgedrückt. Die Werte des Muskels enthalten sowohl die Daten von Oberschenkel als auch Unterschenkel (d. h. n = 12 in jeder Gruppe). Die Mittelwerte sind in der Graphik gezeigt. *P < 0,01, #P < 0,05 (analysiert durch Einweg-ANOVA).
3 ist ein Foto, das das Ergebnis der RT-PCR für den Nachweis der Induzierung der VEGF-Expression aufgrund einer Ischämie zeigt.
4, Graphiken, die den Expressionsspiegel (links) und seine Änderung im Zeitverlauf (rechts) des SeV-vermittelten Leuchtkäfer-Luciferase-Gens, das in Muskeln transferiert wurde, zeigt. Luciferase-Aktivitäten werden in der unbehandelten Gruppe, der pCMV-luc (100 μg)-verabreichten Gruppe und der SeV-luc (10 pfu oder 10⁸ pfu)-verabreichten Gruppe unter Verwendung eines gemäßigten Ischämie-Modells von C57BL/6-Mäusen (links) untersucht. Das rechte Feld zeigt die Änderungen im Zeitverlauf des Expressionsspiegels des Luciferase-Gens, das im gemäßigten Ischämie-Modell transferiert wurde. Weiße Kreise weisen auf die pCMV-luc (100 μg)-verabreichte C57BL/6-Mausgruppe hin. Schwarze Kreise zeigen die SeV-Luc (10⁸ pfu)-verabreichte C57BL/6-Mausgruppe an. Schattierte Kreise zeigen die SeV-luc (10⁸ pfu)-verabreichte BALG/c nu/nu-Mausgruppe an. Die dicke Linie zeigt die Grenzwerte an, über denen die Expression des Transgens signifikant wird. Der Spiegel der Genexpression in jeder Grafik wird im selben log-Maßstab dargestellt.
5 ist eine Grafik, die den Sekretionsspiegel eines angiogenen Proteins in menschlichen endothelialen Nabelvenen-Zellen (HUVEC), COS7-Zellen, bovinen vaskulären glatten Muskelzellen (BSMC) und Cardiomyoblasten-Zellen (H9C2) zeigt. „Basale Freisetzung" bezeichnet die Produktionsmenge von jedem Faktor ohne die Vektoren. „Grenzwert" bezeichnet den Spiegel, über dem die Expression des Transgens signifikant wird.
6 zeigt Grafiken, die die in vivo-Expression von exogen transferiertem FGF2-(a) und VEGF-(b) Gen im Muskel (links) und Serum (rechts) einer mäßig ischämischen Extremität von C57BL/6-Mäusen zeigt. Bald nach dem operativen Vorgehen wurden 50 μl einer jeden Vektorlösung in die Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln injiziert. Zwei Tage nach der Operation wurden alle Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln (je n = 6) und Serum (n = 6) erhalten und einem ELISA für murinen FGF2 (a) und murinen beziehungsweise menschlichen VEGF (b) ausgesetzt. Die Werte wurden durch das extrahierte Gesamtprotein oder das Gesamtvolumen des Muskels standardisiert und mit Mittelwert + S. D.
ausgedrückt. Die Mittelwerte sind in der Figur gezeigt. Beachte, dass die Maßstäbe in log-Maßstäben vorliegen.
7 zeigt Grafiken, die eine Gentransfer-vermittelte Verstärkung der endogenen murinen VEGF-Expression in den Extremitätenmuskeln von C57BL/6-Mäusen ohne Operation (links), mit gemäßigter Ischämie (Mitte) und schwerer Ischämie (rechts) zeigen. Bald nach dem operativen Vorgehen wurden 50 μl einer jeden Vektorlösung in die Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln injiziert. Zwei Tage nach der Operation wurden alle Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln und Serum (je n = 6, gesamt n = 12) erhalten und einem ELISA für murinen VEGF unterzogen. Die Werte wurden durch das extrahierte Gesamtprotein des Muskels standardisiert und mit Mittelwert ± S. D. ausgedrückt. Die Mittelwerte sind in der Figur gezeigt. *P < 0,01, #P < 0,05 (analysiert durch Einweg-ANOVA).
8 zeigt Fotos, die Gewebeabbildungen von Gen-transferierten Maus-Extremitätenmuskeln zeigen. Eine histologische Beobachtung wurde 2 Tage nach einer schwere Ischämie-Operation für C57BU6-Mäuse durchgeführt, die dann behandelt wurden, wie in der Beschreibung von 7 beschrieben. Ein offensichtliches entzündliches Infiltrat und Stroms-Ödem kann in Scheintransfiziertem (SeV-Luciferase; Schein) Oberschenkelmuskel (oben rechts) im Vergleich zu einem unbehandelten Tier (oben links; keine Ischämie) gesehen werden. Eine schwere Schädigung der Muskelfasern, intrazelluläres Ödem und ein entzündliches Infiltrat kann in VEGF165-behandelten Tieren gesehen werden (unten links; VEGF165). Diese Schädigungen werden durch FGF2-Gentransfer inhibiert (unten rechts; FGF2). Jede Gruppe enthält 6 Tiere und zeigt ähnliche Ergebnisse. Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Ursprüngliche Vergrößerung x200.
9 zeigt Fotos, die therapeutische oder schädliche Wirkungen von exogen transferierten angiogenen Faktor-Genen in Muskeln von schweren Extremitäten-Ischämie-Mäusen 10 Tage nach der Operation für die linken Hinterextremitäten zeigen. Jedes Foto zeigt gleichzeitig den Extremitäten-Erhaltungswert (LSS). Die oberen Felder zeigen eine typische schädliche Wirkung im schweren Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen (Extremitäten-Erhaltungsmodell). Eine VEGF165-transferierte Maus zeigte eine vollständige Extremitäten-Amputation (oberes mittleres Feld), während eine Kontrollmaus mit Luciferase (oberes linkes Feld) und eine FGF2-behandelte Maus (oberes rechtes Feld) erhaltene Extremitäten anzeigten. Die unteren Felder zeigen eine typische therapeutische Wirkung im schweren Ischämie-Modell von BALG/c nu/nu-Mäusen (Auto-Amputations-Modell). Die FGF2-behandlete Maus zeigte eine Extremitäten-Erhaltung (unteres rechtes Feld), während die Kontrollmaus mit Luciferase (unteres linkes Feld) und die VEGF165-behandelte Mause (unteres rechtes Feld) einen fast vollständigen Verlust der Hinterextremität anzeigte.
10 zeigt Grafiken, die die Extremitäten-Prognose-Kurve in den Vektorverabreichten Extremitäten-Erhaltungs- und Auto-Amputations-Modellen zeigen. Die Grafiken zeigen die Rate (Extremitäten-Erhaltungsrate) von Vektor-verabreichten Tieren, die die Extremität behalten. Als ein Ergebnis des intramuskulären Transfers von angiogenen Genen zeigt A schädliche Wirkungen von VEGF165 im schweren Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen (Extremitäten-Erhaltungsmodell), und B zeigt die therapeutischen Wirkungen von FGF2 im schweren Ischämie-Modell von BALG/c nu/nu-Mäusen (Auto-Amputations-Modell). Jede Gruppe wurde 3 getrennten Experimenten ausgesetzt (n = 10). Die Kurve wurde durch das Kaplen-Mayer-Verfahren beschrieben, und die Daten wurden mit dem log-Rang-Test analysiert. *P < 0,0001.
11 zeigt Fotos, die die angiogene in vivo-Wirkung in C57BL/6-Mäusen mit schwerer Hinterextremitäten-Ischämie zeigen (Extremitäten-Erhaltungsmodell), gemessen mit einem Laser-Doppler-IPerfusions-Bildgebungs-Analysegerät. Eine Wiederherstellung der Durchblutung wurde in den Mäusen beobachtet, die mit SeV-Luciferase, SeV-VEGF165 und SeV-FGF2 bei 10⁷ pfu behandelt wurden. Jede Gruppe zeigt den Zeitablauf desselben Tiers. Die oberen Felder zeigen typische Ergebnisse des Zeitablaufs der Blutfluss-Wiederherstellung in einer Maus, die mit SeV-Luciferase behandelt wurde (Schein-Transfektion). Die Blutreperfusion des Oberschenkelmuskels wurde um 4 Tage nach der Intervention erkannt und war am Tag 7 offensichtlich. Am Tag 10 war dennoch keine klare Durchblutung im Unterschenkelbereich schwer nachzuweisen, was in einer Extremitätenatrophie mit einem Zeichen einer Zehennekrose resultierte (äußerst rechtes Feld). Die mittleren Felder zeigen den typischen Zeitablauf einer Maus mit SeV-VEGF165. Keine offensichtliche und signifikante Durchblutung wurde im Oberschenkel und Unterschenkel während der Beobachtung erkannt, was in einer Auto-Amputation der Extremität resultierte (äußerst rechtes Feld). Die unteren Felder zeigen den typischen Zeitablauf einer Maus, die mit SeV-FGF2 behandelt wurde. Eine offensichtliche Wiederdurchblutung im Oberschenkelbereich wurde bis zum Tag 4 deutlich gesehen, und ein signifikanter Blutfluss wurde in der ganzen Extremität bis zum Tag 10 erkannt, was in einer vollständigen Extremitäten-Erhaltung resultierte (äußerst rechtes Feld).
12 ist eine Grafik, die die Wiederherstellung der Durchblutung durch eine angiogene Gentherapie in C57BL/6-Mäusen mit schwere Ischämie zeigt (Extremitäten-Erhaltungsmodell). Die durchschnittliche Durchblutung in der ischämischen Extremität und der Kontroll-Extremität, die wie in der Beschreibung von 11 behandelt wurde, wurde berechnet, um das Durchblutungswert-Verhältnis der linken Extremität (ischämisch)/rechten Extremität (Kontrolle) zu ergeben. *P < 0,001 (im Vergleich zu allen anderen Gruppen), #p < 0,05 (im Vergleich zu allen anderen Gruppen), ##p <0,05 [im Vergleich zur nicht-verabreichten (Schein)-Gruppe].
13 ist eine Grafik, die die Änderung im Zeitablauf in den Extremitäten-Erhaltungs-Raten in Mausmodellen der schweren Ischämie (Auto-Amputations-Modell) zu denen des F-Gen-defizienten SeV-Vektors, der das hFGF2-Gen enthält, oder des replikativen SeV-Vektors, der das hFGF2-Gen enthält, zeigt. In der Figur sind die Zahl der Subjekte (n) und die Dosis der Vektoren gezeigt.
Beste Art und Weise für das Ausführen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezugnahme auf Beispiele spezifisch illustriert, sie soll aber nicht als darauf limitiert angesehen werden.
Rekombinantes SeV wurde hergestellt, wie früher beschrieben (Yu, D. et al., Genes Cells 2(7): 457–66, 1997; Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970–973 (2000); Kato, A., et al., Genes Cells 1, 569–579 (1996); Hasan, M. K., et al., J. Gen. Virol. 78, 2813–2820 (1997)).
Der Virustiter wurde durch den Hämagglutinations-Test unter Verwendung von Hühner-Erythrocyten bestimmt, und ein Bestand mit hohem Titer (10⁹ pfu/ml) wurde bei –80°C bis zur Verwendung bewahrt. Menschliche VEGF165-cDNA wurde durch RT-PCR isoliert, wie früher beschrieben (Yonemitsu, Y., et al., Lab. Invest. 75, 313–323 (1996)). Maus-Volllängen-FGF2-cDNA wurde durch PCR unter Verwendung einer teilweisen Sequenz der cDNA hergestellt (Imamura, T., et al., Science 249, 1567–1570 (1990)), gespendet von Dr. Imamura (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Tsukuba, Japan). Genau wurde die Volllängen-cDNA unter Verwendung eines teilweisen Maus-FGF2-cDNA-Fragments (eines Fragments der Nucleotidposition 7 bis 435 der Zugangsnummer M30644), dem die Start- und Stopp-Codon-Regionen fehlen, als eine Matrize und des N-Terminus-Primers (5'-ACGTGCGGCCGCCAAAGTTCATCCACCATGGCTGCCAGCGGCACACCTCGCTTCCC-3'/SEQ ID NO: 15), der das Startcodon der Maus-FGF2-cDNA enthält, und des C-Terminus-Primers (5'-ACTGCGGCCGCOATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGCGGATCAGCTCTTAGCAGA CATTGGAAAGAAACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGTCCCGT-3'/SEQ ID NO: 16) der das Stoppcodon und die SeV-spezifische Sequenz enthält, amplifiziert. Die menschliche VEGF165- und Maus-FGF2-cDNAs, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, wurden an der NotI-Stelle in pSeV18⁺b(+) (Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813–2820) cloniert, nachdem jede Nucleotidsequenz bestätigt wurde. Sendai-Virus-Vektoren, die den menschlichen VEGF165 oder den Maus-FGF2 exprimieren, wurden als SeV-VEGF165 beziehungsweise SeV-FGF2 bezeichnet. SeV-Luciferase (Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78 (Pkt. 11): 2813–2820, 1997; Yonemitsu, Y. et al., Nature Biotechnol. 18: 970–973, 2000) und pCMV-Luciferase (Yonemitsu, Y. et al., Nature Biotechnol. 18: 970–973, 2000) wurden hergestellt, wie oben beschrieben.
Alle Daten der Beispiele der vorliegenden Erfindung wurden in der statistischen Analyse als Mittelwerte ± S. D. dargestellt. Die Daten, mit Ausnahme jener der Extremitäten-Erhaltung, wurden durch Einweg-ANOVA mit der Scheffe-Anpassung analysiert. Für die Extremitäten-Erhaltung wurde die Rate, die durch den Extremitäten-Erhaltungswert (LSS) ausgedrückt wird, durch das Kaplen-Mayer-Verfahren analysiert. Die statistische Signifikanz der Extremitäten-Erhaltungs-Experimente wurde unter Verwendung des log-Rang-Tests festgestellt, und p < 0,05 wurde in allen statistischen Analysen als signifikant angesehen.
Die vorliegende Erfindung liefert die Basis-Technologie für die Gentherapie, die ischämische Gewebe anzielt. Die Angiogenese in den ischämischen Geweben kann wirksam induziert werden, und eine Nekrose kann durch Verwendung des Gentransfers der vorliegenden Erfindung verhindert werden.
[Beispiel 1]
Ischämie-induzierte endogene VEGF-Expression trägt nicht zu der lokalen Protein-Akkumulierung im Hinterextremitätsmuskel bei
Um die therapeutischen und schädlichen Wirkungen von angiogenen Faktoren zu bewerten, etablierten die vorliegenden Erfinder die folgenden 3 Modelle der Extremitäten-Ischämie durch 2 unterschiedliche Operationen (1): (1) mäßiges Extremitäten-Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen, in denen die gesamte Fernoral-Arterie und -Vene und die Saphena-Arterien und -Vene exzidiert worden sind (1, linkes Feld) (Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998); Kalks, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3422–3427 (2000)); (2) schweres Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen, in denen die gesamte externe Iliakal-Arterie und -Vene, Femoral-Arterie und -Vene und alle in Beziehung stehenden Zweige exzidiert worden sind (1, rechtes Feld); und (3) immun-defiziente BALG/c nu/nu-Mäuse, die dengleichen chirurgischen Vorgehensweisen wie in (2) ausgesetzt wurden (d. h. schweres Ischämie-Modell von BALG/c nu/nu-Mäusen).
Adulte männliche C57BL/6-, BALB/c- und BALG/c nu/nu-Mäuse (6–8 Wochen alt, Charles River-Marke) wurden von KBT Oriental Co. Ltd. (Tosu, Saga, Japan) erworben. Die Tier-Experimente wurden unter Verwendung von genehmigten Protokollen und gemäß den Empfehlungen für die korrekte Haltung und Verwendung von Labortieren durch das Komitee für Tier-, rekombinante DNA- und infektiöse Pathogen-Experimente an der Kyushu University durchgeführt und wurden gemäß dem Gesetz (Nr. 105) und dem Bescheid (Nr. 6) der japanischen Regierung und den „Principles of Laboratory Animal Care" und dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" durch das National Institute of Health der USA (Veröffentlichung Nr. NIH 80–23, überarbeitet 1985) unternommen.
Unter ausreichender Anästhesie unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital wurden die Mäuse einer Hautinzision ausgesetzt. Für das gemäßigte Ischämie-Modell wurde die gesamte oberflächliche Femoral-Arterie und -Vene und die Saphena-Arterie und -Vene (von kurz unter den tiefen Femoral-Arterien bis zur Kniekehlen-Arterie und -Vene) ligiert, geschnitten und entfernt (1, linkes Feld) (Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998); Kalks, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3422–3427 (2000)). Für das schwere Ischämie-Modell wurde auch eine zusätzliche Exzision der externen Iliakal-Arterie und -Vene mit der tiefen Femoral-Arterie gemacht (1, rechtes Feld). Die Wiederholbarkeit der Extremitäten-Prognose dieser Modelle wurde durch die 3 bis 5 getrennten Experimente unter Verwendung von 10 oder mehr Tieren/Modell durch denselben Operateur (I. M.) bestätigt. Alle Extremitäten-Erhaltungs-Experimente enthielten Tiere, die 4 individuellen getrennten Experimenten ausgesetzt wurden.
Das Modell (1), wie vorstehend beschrieben, verlor nie seine Extremitäten, wobei es gelegentlich nur ein Anzeichen einer Zehennekrose zeigte. Weiterhin zeigte das Modell (2) (schweres Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen) keine Extremitäten-Nekrose (genannt „Extremitäten-Erhaltungsmodell"), und alle Tiere des Modells (3) (schweres Ischämie-Modell von BALG/c nu/nu-Mäusen) resultierten in einer beinahe vollständigen Extremitäten-Amputation innerhalb von 10 Tagen nach der Operation (genannt „Auto-Amputations-Modell"). Das schwere Ischämie-Modell der immunkompetenten BALB/c-Mäuse zeigte auch einen ähnlichen Grad der Extremitäten-Nekrose wie die BALB/c nu/nu-Mäuse (Daten nicht gezeigt). Zusammen mit einem früheren Bericht, der darauf hinweist, dass BALB/c-Mäuse empfänglicher für eine Angiogenese gegen Wachstumsfaktoren sind als C57BU6-Mäuse (Rohan, M. R. et al., FASEB J. 14, 871–876 (2000)), legen diese Ergebnisse nahe, dass die Extremitäten-Erhaltung in C57BL/6-Mäusen vielmehr von einem besseren kollateralen Extremitäten-Kreislauf als von der Empfänglichkeit für eine Angiogenese abhängig zu sein scheint.
Die vorliegenden Erfinder bewerteten die endogene Expression von VEGF und FGF2 im ischämischen Muskel und Serum des gemäßigten und schweren Ischämie-Modells, wie oben beschrieben. Zwei Tage nach der Operation wurden jeder Extremitätenmuskel (gesamter Oberschenkel- und Unterschenkelmuskel) und Serum von C57BL/6-Mäusen gewonnen, und ihre Gewebe werden homogenisiert oder lysiert und dann einem Enzym-verbunden Immunadsorptions-Test (ELISA) ausgesetzt. Rekombinante Proteine wurden unter Verwendung der Qantikine Immunoassay-Systeme (R & D Sytems Inc., Minneapolis, MN) für menschlichen VEGF oder Maus-FGF2 synthetisiert und dann gemäß ihrer Anweisung quantifiziert. Die Konzentrationen der Gesamtproteine wurden durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung eines Protein-Testsystems (Bio-Rad Laborstories, Hertfordshire, UK) bestimmt und standardisiert (Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970–973 (2000)).
Da es keine signifikanten Unterschiede in der Proteinkonzentration zwischen den Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln gab, wurden beide in jeder Gruppe eingeschlossen. Interessanterweise verstärkte die ischämische Operation den FGF2-Proteingehalt in beiden Hinterextremität-Ischämie-Modell-Mäusen signifikant (im gemäßigten Modell, 874,5 ± 187,7 pg/g Muskel; im schweren Modell, 985,4 ± 209,5 pg/g Muskel; je n = 12) im Vergleich zu der Grundlinie (489,7 ± 108,6 pg/g Muskel; n = 12) für unbehandelte Mäuse (P < 0,001) (2). Auf der anderen Seite wurde eine mit der Ischämie in Beziehung stehende Verstärkung der VEGF-Expression in der schwer-ischämischen Gruppe gesehen, aber nicht signifikant in den Muskeln (unbehandelt, 174,7 ± 43,1; gemäßigt, 119,2 ± 53,4; und schwer, 242,5 ± 244,3, n = 12). Diese schienen paradoxe Ergebnisse, weil VEGF ein gut bekanntes Mitogen ist, das durch Gewebe-Ischämie stark induziert wird (Shweiki, D. et al., Nature 359, 843–845 (1992); Forsythe, J. A., et al., Mol. Cell. Biol. 16, 4604–4613 (1996)). Die vorliegenden Erfinder maßen den VEGF-Spiegel im Serum, da VEGF in den systemischen Kreislauf austreten kann. Wie erwartet, wurde ein von der Schwere abhängiger Anstieg des VEGF-Proteinspiegels im Serum beobachtet, während der FGF2-Spiegel im Serum nicht nachgewiesen werden konnte (2, rechtes Feld).
Die vorliegenden Erfinder stellten die Hypothese auf, dass eine Extremitäten-Ischämie eher kleinere Isoformen von VEGF, von denen wohlbekannt ist, dass sie weniger mit Heparinsulfat interagieren als VEGF von mittlerer oder größerer Größe, induzieren kann (Cohen, T., et al., J. Biol. Chem. 270, 11322–11326 (1995)). Um diese Hypothese zu bewerten, analysierten die vorliegenden Erfinder die Expression von VEGF-Isoformen im Oberschenkelmuskel von männlichen C57BL/6-Mäusen einen Tag nach der Operation. Die Analyse wurde durch RT-PCR unter Verwendung von Primer-Sets durchgeführt, die zwischen murinen VEGF-Spleißungs-Isoformen, einschließlich VEGF188, 164, 144 und 120, unterscheiden können (Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398–404 (1999)). Die Primer-Sets wurden früher für den Ratten-VEGF auf Exon 1 und Exon 8 berichtet (Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398–404 (1999)): Vorwärts-Primer (5'-TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA-3'/SEQ ID NO: 17) und Rückwärts-Primer (5'-TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T-3'/SEQ ID NO: 18), die den Sequenzen der murinen VEGF-Isoformen entsprechen. Für das Nachweisen der kleinsten Isoform des murinen VEGF (VEGF115) wurden derselbe Vorwärts-Primer wie oben und ein VEGF115-spezifischer Rückwärtsprimer (5'-CTA CCM GTT TCC CAG GCA G-3'/SEQ ID NO: 19) verwendet (Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033–3038 (1998)). Eine RT-PCR wurde unter Bedingungen gemäß Literaturstellen durchgeführt (Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398–404 (1999); Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033–3038 (1998)).
Als ein Ergebnis wurde die mit der Ischämie in Beziehung stehende endogene VEGF-Expression nur in der 164-Isoform gesehen, während keine offensichtliche Expression von anderen Isoformen nach gewiesen wurde (3). Eine zusätzliche RT-PCR-Analyse kann die Expression einer bekannten kleinsten Isoform, VEGF115, nicht nachweisen (Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033–3038 (1998)).
[Beispiel 2]
Kinetik des rekombinanten Sendai-Virus-vermittelten intramuskulären Gentransfers in eine Maus-Hinterextremität
Für die kinetische Untersuchung bewerteten die vorliegenden Erfinder die Spiegel und den Zeitablauf der Transgen-Expression unter Verwendung der Leuchtkäfer-Luciferase. Der Luciferase-Test wurde unter Verwendung eines Luminometers (Modell LB 9507, EG&G Berthold, Deutschland) gemäß der Literatur (Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970–973 (2000)) durchgeführt. Die Daten werden als relative Lichteinheiten (RLU)/mg Protein dargestellt. Die Konzentrationen der Gesamtproteine wurden durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung eines Protein-Testsystems (Bio-Rad Laborstories, Hertfordshire, UK) bestimmt und wurden zum Standardisieren der Werts, der durch den Luciferase-Test erhalten wurde, verwendet. Da der Extremitätenmuskel des schweren Extremitäten-Ischämie-Modells offensichtlich geschädigt war, was eine reduzierte Transgen-Expression nahe legt, wurde das gemäßigte Ischämie-Modell (1, linkes Feld) für die Analyse verwendet. Das Gen (25 μl) wurde an zwei Stellen, Oberschenkel- und untere Oberschenkelmuskeln, zum Zeitpunkt der Operation transferiert. Die hierin nachstehend beschriebenen Dosen sind die Summe der Dosen an zwei Stellen. Mäuse (C57BL/6-Mäuse), die 100 μg pCMV-Luciferase (etwa 50-mal höher als die klinische Dosis) erhielten (Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114–1123 (1998); Isner, J. M. et al., J. Vasc. Surg. 28, 964–973 (1998)), zeigten zwei Tage nach dem Gentransfer eine relativ hohe Luciferase-Aktivität (Durchschnitt ± S. D. = 5,1 ± 3,9 × 10⁶ RLU/mg Protein, n=6), während ungefähr 5-mal (2,4 ± 3,8 × 10⁷ RLU/mg Protein, n=12) und 120-mal (7,3 ± 4,7 × 10⁸ RLU/mg Protein, n = 6) höhere Expressionen in Mäusen beobachtet wurden, die SeV-Luciferase zu 10⁷ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) beziehungsweise SeV zu 10⁸ pfu erhielten. Weiterhin wurde der Zeitablauf der Transgen-Expression unter Verwendung des gemäßigten Ischämie-Modells von C57BL/6-Mäusen, die das Luciferase-Expressionsplasmid (pCMV-luc) oder SeV-luc auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, erhielten, analysiert. Das gemäßigte Ischämie-Modell der C57BL/6-Mäuse, die eine intramuskuläre Injektion von 10⁸ pfu SeV-Luciferase erhielten, zeigte auch einen Abfall der Expression in einer zeitabhängigen Weise (Tag 2: 7,3 ± 4,3 × 10⁸ RLU/mg Protein, n = 12; Tag 7: 3,4 ± 4,7 × 10⁷ RLU/mg Protein, n=12; und Tag 14: 2,6 + 1,2 × 10⁴ RLU/mg Protein, n=12) (4, rechtes Feld). Obwohl der Zeitablauf der Luciferase-Aktivität im gemäßigten Ischämie-Modell von immun-defizienten BALG/c nu/nu-Mäusen, an die 10⁸ pfu SeV-Luciferase intramuskulär verabreicht wurden, bis zum Tag 7 ähnlich zu jenen der C57BL/6-Mäuse war, behielten die Mäuse ihre Expressionsspiegel später (Tag 2: 9,4 ± 3,7 × 10⁸ RLU/mg Protein, n = 12; Tag 7: 1,3 ± 1,9 × 10⁷ RLU/mg Protein, n = 12; und Tag 14: 0,9 ± 1,3 × 10⁷ RLU/mg Protein, n = 12).
Als Nächstes bewerteten die vorliegenden Erfinder die Sekretion von angiogenen Proteinen in vitro unter Verwendung von verschiedenen Kulturzellen, einschließlich nicht nur Muskelzellen wie primäre bovine glatte Muskelzellen (BSMCs) und Cardiomyoblasten (H9C2) sondern auch primäre menschliche endotheliale Nabelvenen-Zellen (HUVECs) und COS7-Zellen. Der FGF2-Vektor (SeV-FGF2), der keine klassischen Signalsequenzen für sezernierende Proteine enthält, wurde in der vorliegenden Erfindung verwendet, weil frühere Untersuchungen durch die vorliegenden Erfinder und andere zeigten, dass FGF2 extrazellulär ohne sezernierende Sequenzen exprimiert werden konnte (Piotrowicz, R. S. et al., J. Biol. Chem. 272, 7042–7047 (1997); Qu, Z., et al., J. Histochem. Cytochem. 46, 1119–1128 (1998); Florkiewicz, R. Z. et al., J. Cell. Physiol. 162, 388–399 (1995)). Wie erwartet, konnte die wirksame Sekretion des FGF2-Proteins in das Kulturmedium wie ähnliche Spiegel von VEGF165 in einer Dosis-abhängigen Weise nachgewiesen werden (zum Beispiel bei MOI = 100: VEGF165 gegenüber FGF2= 4354 + 2794 gegenüber 3682 ± 1063 in HUVEC, 275 ± 58 gegenüber 398 ± 154 in BSMC, 16987 ± 4748 gegenüber 5976 ± 381 in H9C2 und 38648 ± 4913 gegenüber 1547237 + 176502 in COS7-Zellen, pg/10⁵ Zellen/24 Stunden, jeweils n = 3) (5).
[Beispiel 3]
Kinetik der SeV-vermittelten intramuskulären Expression von angiogenen Faktoren in vivo Die vorliegenden Erfinder untersuchten den Expressionsspiegel von angiogenen Faktoren im Muskel nach einer intramuskulären in vivo-Verabreichung von SeV-VEGF165 und SeV-FGF2 in das gemäßigte Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen. Jede 25 μl-Verabreichung wurde einmal während der Operation unter Verwendung einer 26-Gange-Nadel in die Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln durchgeführt.
Interessante Ergebnisse wurden für die in vivo-Expression von angiogenen Faktoren im Vergleich zu ihrer in vitro-Expression und der in vivo-Expression des Reportergens erhalten. Wie in 6 gezeigt, stieg die SeV-FGF2-vermittelte Proteinsynthese in einer Dosis-abhängigen Weise und erreichte beim höchsten Titer eine 110-fach größere als die endogene Genexpression (Grundlinie, 429 ± 79, Ischämie, 974 ± 150, 10⁶ pfu, 4913 + 313, 10⁷ pfu, 13469 ± 12611 und 10⁸ pfu, 46703 ± 12092 pg/g Muskel, je n = 6 im Oberschenkelmuskel; Grundlinie, 550 ± 104, Ischämie, 720 ± 128, 10⁶ pfu, 1376 ± 158, 10⁷ pfu, 8252 ± 8190 und 10⁸ pfu, 59704 ± 35297 pg/g Muskel, je n = 6 im Unterschenkelmuskel). Signifikanter Serum-FGF2 konnte sogar beim höchsten Titer in keinen Tieren nachgewiesen werden, die SeV-FGF2 erhielten. Auf der anderen Seite war der Dosis-abhängige Anstieg von VEGF165 viel weniger als jener von FGF2 und erreichte bei 10 pfu nicht das 2-fache davon, und umgekehrt war die Expression des SeV-abstammenden menschlichen VEGF165-Proteins bei 10⁸ pfu beinahe nicht nachweisbar (Grundlinie, 176 ± 44, Ischämie, 143 ± 64, 10⁶ pfu, 159 ± 67, 10⁷ pfu, 224 ± 216 und 10⁸ pfu, < 5 pg/g Muskel, je n = 6 im Oberschenkelmuskel; Grundlinie, 173 ± 45, Ischämie, 95 ± 28, 10⁶ pfu, 186 ± 30, 10⁷ pfu, 172 ± 101 und 10⁸ pfu, < 5 pg/g Muskel, je n = 6 im Unterschenkelmuskel). Obwohl der Serumspiegel des endogenen murinen VEGF durch die gemäßigte Extremitäten-Ischämie signifikant erhöht wurde (37,7 ± 15,4 pg/ml, n = 6), konnte der Vektor-abstammende menschliche VEGF165 nicht signifikant nachgewiesen werden, was nahe legt, dass intramuskulär exprimiertes VEGF165 nicht in den systemischen Kreislauf diffundierte.
[Beispiel 4]
Ischämie-induzierte endogene VEGF-Expression wird durch angiogenen Gentransfer merklich verstärkt
Die vorliegenden Erfinder stellten die Hypothese auf, dass das nicht vergleichbare Expressionsmuster zwischen VEGF165 und FGF2 aufgrund der endogenen VEGF-Expression erfolgt. Die Überexpression von endogenem VEGF165 kann die Gewebe-Ischämie durch zu viel stärkere Permeabilitäts-Wirkung verschlimmern und kann die SeV-abhängige Transkription herunterregulieren. Weiterhin wies ein früherer Bericht darauf hin, dass die angiogene Aktivität von FGF2 teilweise aufgrund einer verstärkten endogenen VEGF-Expression in vitro und in vivo erfolgte (Asahara, T., et al., Circulation 92, 365–371 (1995)). Daher bewerteten die vorliegenden Erfinder die Modulierung der endogenen murinen VEGF-Proteinsynthese in den Muskeln durch exogen transduzierte Gene eines angiogenen Faktors unter Verwendung eines für murinen VEGF spezifischen ELISA-Systems. Wie in 7 gezeigt, verstärkte der Transfer des FGF2-Gens aber nicht des VEGF165-Gens die endogenen murinen VEGF-Spiegel in Muskeln in beiden Extremitäten-Zuständen wie dem normalen Kreislauf (keine Operation) und der gemäßigten Ischämie signifikant. Im Fall der schweren Extremitäten-Ischämie verstärkte der Gentransfer von beiden angiogenen Faktoren die endogene murine VEGF-Expression dramatisch, und insbesondere resultierte VEGF165 in einer rund 7-fach höheren als jene der Ischämie selbst (Schein).
Um diese weiter zu bewerten, beobachteten die vorliegenden Erfinder Wirkungen des Gentransfers von angiogenen Faktoren im schweren C57BL/6-Ischämie-Modell histologisch (8). Die ischämische Operation, gefolgt durch Schein-Transfektion (Schein), zeigte diffus pyknotische Muskelfasern, die zwei Tage später ein intrazelluläres Ödem und ein entzündliches Infiltrat begleiteten. Diese Ergebnisse wurden durch den VEGF165-Gentransfer merklich verstärkt, während sie durch den FGF2-Gentransfer offensichtlich inhibiert wurden (8).
[Beispiel 5]
Exogen transduziertes VEGF165 wirkt in der akuten schweren Extremitäten-Ischämie eher als ein Extremitäten-schädigender Faktor als als Extremitätenerhaltender Faktor
Basierend auf den Ergebnissen, wie vorstehend beschrieben, testeten die vorliegenden Erfinder die therapeutischen Wirkungen des in vivo-Gentransfers von angiogenen Faktoren unter Verwendung sowohl der gemäßigten als auch der schweren ischämischen Extremitäten-Modelle. Die vorliegenden Erfinder verwendeten Viren in 10⁷ pfu zum Beobachten der therapeutischen in vivo-Wirkung, da VEGF165 bei der höchsten Dosis von 10⁸ pfu keine Transgenprodukte produzieren konnte, wie vorstehend gezeigt. Die vorliegenden Erfinder kategorisierten den Grad der Extremitäten-Nekrose für 4 Erhaltungs-Werte (Extremitäten-Erhaltungswert: LSS): LSS = 4, vollständige Extremitäten-Erhaltung; LSS = 3, Extremitäten-Nekrose unter der Ferse; LSS = 2, Extremitäten-Nekrose unter dem Knie; LSS = 1 Extremitäten-Nekrose über dem Knie; und LSS = 0, vollständige Extremitäten-Amputation um das inguinale Ligament. Gemäß dieser Klassifizierung testeten die vorliegenden Erfinder zuerst die Toxizität der SeV-vermittelten Expression der angiogenen Faktoren unter Verwendung des Extremitäten-Erhaltungs-Modells der C57BL/6-Mäuse unter einer schweren Extremitäten-Ischämie. Die angiogenen Gene wurden auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2 transferiert.
Die Mäuse aller Gruppen behielten ihren Extremitäten vollständig, wenn die Vektoren zwei Tage vor der Ischämie-Operation dazu injiziert wurden. Die Mäuse von allen Gruppen, einschließlich der FGF2-verabreichten Gruppe, außer der VEGF165-verabreichten Gruppe, zeigten eine vollständige Extremitäten-Erhaltung (%LLS = 100%), wenn der Vektor im Zeitraum der Operation injiziert wurde. Wie in den 9 und 10 gezeigt, verloren jedoch manche Mäuse, die VEGF165 erhielten, ihre Extremitäten (5/10 Mäusen verloren ihre Extremitäten, %LLS = 52,5%, p < 0,0001 im Vergleich zu den anderen Gruppen) (10A). Diese Ergebnisse legen eine Extremitäten-schädigende Wirkung des VEGF165-Gentransfers nahe. Als Nächstes wurde die Wirkung der Gentherapie mit angiogene Genen unter Verwendung des schweren Ischämie-Modells (Auto-Amputations-Modell) von BALG/c nu/nu-Mäusen analysiert. Als ein Ergebnis konnte die Verabreichung von SeV-VEGF165 die Hinterextremitäts-Prognose nicht verbessern (8/10 verloren Extremitäten, %LLS = 15,0%), ähnlich zu jener von Luciferase-exprimierendem SeV (5/6 verloren Extremitäten, %LLS = 16,7%), während die Verabreichung von SeV-FGF2 die Extremitäten-Amputation in nu/nu-Mäusen signifikant inhibierte (2/10 verloren Extremitäten, %LLS = 77,5%) (10B). Dies weist auf eine offensichtliche Extremitäten-Erhaltungswirkung des FGF2-Gentransfers hin.
In der Folge bestimmten die vorliegenden Erfinder die Wirkung des intramuskulären Gentransfers auf die Wiederherstellung der Blutperfusion in linken Extremitäten, die schweren Ischämie-Operationen ausgesetzt wurden, durch Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebungsanalyse (Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998); Murohara, T., et al., J. Clin. Invest. 105, 1527–1536 (2000)). Das schwere Ischämie-Modell (Extremitäten-Erhaltungsmodell) von C57BU6-Mäusen wurde dem Gentransfer unter denselben Bedingungen wie in der Beschreibung von 10A ausgesetzt (Extremitäten-Erhaltungsmodell). Die Messungen des ischämischen (linken)/normalen (rechten) Extremitäten-Blutfluss-Verhältnisses unter Verwendung eines Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebungs (LDPI)-Analysegeräts (Moor Instruments, Devon, UK) wurden durchgeführt, wie früher beschrieben (Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998); Murohara, T., et al., J. Clin. Invest. 105, 1527–1536 (2000)). Genau wurden die Mäuse auf einer Wärmeplatte platziert, die bei 37°C gehalten wurde, um die Daten-Variationen aufgrund der Körpertemperatur vor dem Beginnen der Laser-Abtastung zu minimieren. Zu vorbestimmten Zeitpunkten (vor der Operation und an den postoperativen Tagen 2, 4, 7 und 10) wurden zwei aufeinanderfolgende Abtastungen über derselben Region von Interesse (Beine und Füße) in jedem Tier durchgeführt (11). Es wurde kein wesentlicher Unterschied zwischen den zwei Abtastungen gefunden. Nach der Laser-Abtastung wurden die gespeicherten Bilder einer Computer-unterstützten Quantifizierung des Blutflusses ausgesetzt, und der durchschnittliche Fluss der ischämischen und nicht-ischämischen Füße wurde berechnet. Um die Daten-Variablen aufgrund des Umgebungslichts und der Temperatur zu minimieren, wurde der LDPI-Index als das Verhältnis des linken (ischämischen) zum rechten (nicht-ischämischen) Extremitäten-Blutfluss ausgedrückt.
Sowohl in Mäusen mit SeV-Luciferase (Schein) als auch SeV-FGF2 wurde eine offensichtliche Durchblutung um den oberen Oberschenkel am Tag 4 nachgewiesen, und insbesondere am Tag 4, 7 und 10 wurde eine signifikante Durchblutung in den Unterschenkelmuskel in der FGF-verabreichten Gruppe im Vergleich zu einer eingeschränkten Durchblutung im Oberschenkelmuskel in der Luciferase-verabreichten Gruppe zu denselben Zeitpunkten gesehen (11). Als repräsentative Ergebnisse zeigten manche der Luciferase-injizierten Mäuse mäßig atrophische Extremitäten, während FGF2-injizierte Mäuse großteils nicht-geschädigte Extremitäten zeigten. Im Gegensatz dazu offenbarten Mäuse, die VEGF165 erhielten, eine sehr niedrige Durchblutung im Oberschenkelmuskel, was in einer Extremitäten-Amputation resultierte (11). Alle Mäuse, die SeV-VEGF165 erhielten, hatten ihre Extremitäten zu mindestens im Knie-Bereich verloren. Die Beobachtungsergebnisse der Extremitäten-Durchblutung in jeder Verabreichungsgruppe sind nachstehend beschrieben.
1. SeV-Luciferase-verabreichte Individuen
Unmittelbar nach der Operation wurde kaum eine Durchblutung in der linken unteren Extremität beobachtet: Die Durchblutung wurde graduell wiederhergestellt, und 4 Tage nach der Operation war sie bis ungefähr zur Mitte der femoralen Region wiederhergestellt. Die Durchblutung in den unteren Oberschenkel war jedoch 10 Tage nach der Operation nicht wiederhergestellt. Als ein Ergebnis hatte die untere Extremität keine Nekrose, zeigte aber zu einem gewissen Grad eine Atrophie, wie im äußerst rechten Feld gezeigt. Dasselbe Ergebnis wurde in einem Drittel der Individuen beobachtet. Einige Individuen zeigten eine bessere Wiederherstellung als es andere Individuen taten, wie vorstehend beschrieben.
2. SeV-VEGF165-verabreichte Individuen
Wie vorstehend beschrieben, war der Großteil der Durchblutung direkt nach der Operation verringert. Eine weitere periodische Beobachtung konnte die Wiederherstellung der Durchblutung in der femoralen Region kaum finden. Als ein Ergebnis wurde die untere Extremität von der Mitte der femoralen Region auto-amputiert, wie im äußerst rechten Feld gezeigt. Alle 10 Individuen zeigten völlig dasselbe Ergebnis.
3. SeV-FGF2-verabreichte Individuen
Wie vorstehend beschrieben, war der Großteil der Durchblutung in der linken unteren Extremität direkt nach der Operation verringert. Die Region, wo die Durchblutung verringert war, war etwa diegleiche wie die der SeV-Luciferaseverabreichten Individuen. Eine starke Durchblutung (angezeigt durch rote Punkte) wurde in der femoralen Region etwa am Tag 4 beobachtet, und eine schwache Durchblutung in der unteren Extremität wurde schon am Tag 7 beobachtet. Eine geringe aber signifikante Durchblutung (angezeigt in blau) durch die linke untere Extremität wurde am Tag 10 beobachtet. Als ein Ergebnis wurde die untere Extremität erhalten, da sie normal in der Erscheinung war, wie im äußerst rechten Feld gezeigt.
Die vorliegenden Erfinder verglichen statistisch den Dopplar-Bild-basierenden Blutfluss im Oberschenkelmuskel von allen Gruppen. Wie in 12 gezeigt, zeigten Mäuse, die SeV-FGF2 erhielten, mit einer physiologischen Wiederherstellung des Extremitäten-Kreislaufs eine signifikant höhere Durchblutung als jene, die SeV-Luciferase erhielten. Im Gegensatz dazu blieb der Blutfluss im Oberschenkelmuskel von Mäusen, die mit SeV-VEGF165 behandelt wurden, niedrig, und 7 Tage nach der Operation verloren viele von ihnen ihre Extremitäten zumindest ab dem Knie-Bereich.
[Beispiel 6]
Therapie einer akut ischämischen Extremität unter Verwendung eines Replikationsfähigkeit-defekten Sendai-Virus-Vektors
1. Konstruktion von F-Gen-deffekten Sendai-Virusgenom-cDNA, die angiogene Gene enthält
Zuerst wurde die Amplifikation des EGFP-Gens durch PCR durchgeführt, um das Plasmid (pSeV18⁺/ΔF-GFP) zu konstruieren, das das EGFP-Gen an der F-Gendefizienten Stelle im Plasmid pSeV18⁺/ΔF enthält (siehe WO00/70055 und WO00/70070 ), das durch Deletieren des F-Gens des Plasmids pSeV18+b(+) hergestellt wurde (Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78, 2813–2820, 1997), das die genomische Volllängen-Sendai-Virus (SeV)-cDNA enthält. Die PCR wurde unter Verwendung eines NsiI-endenden Primers (5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/SEQ ID NO: 9) für das 5'-Ende und eines NgoMIV-endenden Primers (5'-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/SEQ ID NO: 10) für das 3'-Ende durchgeführt, um die Zahl der Nucleotide des EGFP-Genfragments anzupassen, dass sie eine Vielzahl von 6 ist (Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033–1045, 1996). Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen NsiI und NgoMIV verdaut, und ein Fragment wurde von einem Gel gewonnen und in die F-Gen-defekte Region in pUC18/dFSS zwischen NsiI und NgoMIV subcloniert, und für die Bestätigung wurde eine Sequenzierung durchgeführt. Das EGFP-enthaltende DraIII-Fragment, das von diesem Vektor isoliert wurde, wurde mit dem DraIII-Fragment von pSeV18⁺, das das F-Gen enthält, ersetzt und ligiert, um pSeV18⁺/ΔF-GFP zu konstruieren. Obwohl der stromabwärts liegende ORF des F-Gens von pSeV18⁺/ΔF entfernt ist, bleibt dennoch die EIS-Sequenz (SeV-spezifische Sequenz, E: Ende, I: zwischen Genen, S: Start) des F-Gens, was die mögliche Expression eines 5 Aminosäuren-Peptids bewirkt, das vom Primer stammt, der verwendet wird, um das Fragment in den Vektor zu verbinden. Darüber hinaus, da GFP in pSeV18⁺/ΔF-GFP co-exprimiert wird, wurde ein Vektor konstruiert, der GFP und das 5 Aminosäuren-Peptid nicht co-exprimierte. Die Rekombination wurde durchgeführt, um den Vektor wie folgt zu konstruieren.
Das Fragment (6288 bp), das die F-Gen-defekte Region enthält, wurde durch Verdauen von pSeV18⁺/ΔF-GFP mit Sail und Nhel gewonnen und in Litmus38 (New England Biolabs, Beverly, MA) cloniert, um LitmusSalINhelfrg/ΔF-GFP zu konstruieren. Die Deletion des EGFP-Gens, das die EIS-Sequenz enthält, die stromaufwärts der F-Gen-defizienten Region gelegen ist, wurde durch inverse PCR durchgeführt. Genau wurde die PCR unter Verwendung eines reversen Primers {5'-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/SEQ ID NO: 11), der so gestaltet wurde, dass er eine Restriktionsenzym SexAI-Erkennungssequenz stromaufwärts des GFP-Gens enthält, und eines Vorwärts-Primers (5'-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/SEQ ID NO: 12) der so gestaltet wurde, dass er die Restriktionsenzym SexAI-Erkennungssequenz stromabwärts des GFP-Gens enthält, durchgeführt. Das Fragment mit der erwünschten Größe (10855 bp) wurde isoliert und ligiert, um das EGFP-Gen zu deletieren, das die EIS-Sequenz enthält, die stromaufwärts der F-Gen-defizienten Region gelegen ist.
In diesem Konstrukt wird die zusätzliche 15 bp-Sequenz aufgrund des Designs der Primer zwischen die SexAI-Stellen inseriert. Daher wurde das Plasmid durch Transformieren in den E. coli SCS110-Stamm hergestellt (der dmc^–/dam^–-SCS110-Stamm wurde verwendet, weil SexAI methyliert war und nicht verdaut werden konnte). Zwei DNA-Fragmente, 1628 bp und 9219 bp, wurden nach dem Verdauen mit SexAI gewonnen und ligiert, um das zusätzliche 15 bp-Fragment zu entfernen. Schließlich wurde LitmusSalINhelfrg/ΔF (Δ5aa) konstruiert, in dem das EGFP-Gen, das die EIS-Sequenz enthält, die stromaufwärts des F-Gens gelegen ist und aus einer Vielzahl von 6 Anzahl von Nucleotiden besteht, deletiert wurde. Nachdem das Plasmid mit SalI und NheI verdaut wurde, wurde das resultierende Fragment gewonnen, mit einem SalI/NheI-Fragment, das das F-Gen von pSeV 18⁺ enthält, ersetzt und ligiert, um das Plasmid pSeV18⁺/ΔF (Δ5aa) zu konstruieren. Die Insertion des angiogenen Gens (zum Beispiel des menschlichen FGF2-Gens) in das Plasmid wurde wie folgt unter Verwendung der Restriktionsenzym NotI-Erkennungssequenz, die stromaufwärts des NP-Gens gelegen ist, durchgeführt.
2. Konstruktion von F-Gen-defekter Sendai-Virusgenom-cDNA, die hFGF2 codiert
Menschliche FGF2(hFGF2)-cDNA wurde durch RT-PCR von vaskulären glatten Muskelzellen, die von der menschlichen Arteria saphena magna mit dem Einverständnis des Patienten isoliert wurden, und dadurch Sub-Clonieren des PCR-Produkts in pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA) an den HindiII-(5'-Ende) und EcoRI-(3'-Ende) Stellen erhalten. Zur selben Zeit wurde bestätigt, dass die hFGF2-cDNA-Sequenz identisch zu der von Abraham et al. (Abraham, J. A. et al., EMBO J. 5 (10), 2523–2528, 1986) berichteten Sequenz ist.
Um das hFGF2-Gen an der Restriktionsenzym NotI-Stelle, die stromaufwärts des NP-Gens in pSeV18⁺/ΔF (Δ5aa) gelegen ist, zu inserieren, wurde eine SeV-spezifische Sequenz (EIS-Sequenz) am 3'-Ende des hFGF2-Gens zugefügt, und das Fragment, das eine NotI-Erkennungssequenz an beiden Enden enthält, wurde hergestellt. Genau wurde die PCR unter Verwendung der hFGF2-cDNA, die vorstehend beschrieben ist, als eine Matrize und unter Verwendung des N-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccg aggatggcggcagcggcgcc/SEQ ID NO: 13), der ein Start-Codon enthält, und eines C-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacat tggaagaaaaagtatagc/SEQ ID NO: 14), der ein Stopp-Codon und die EIS-Sequenz enthält, durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit NotI verdaut und dann in pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA) an einer NotI-Stelle subcloniert, um pBS-hFGF2 zu erhalten. Die Nucleotidsequenz von pBS-hFGF2 wurde bestätigt.
Das Fragment, das die hFGF2-cDNA enthält, wurde durch Verdauen von pBS-hFGF2 mit NotI erhalten und in pSeV18⁺/ΔF (Δ5aa) an einer NotI-Stelle, die stromaufwärts des NP-Gens gelegen ist, subcloniert, um eine genomische F-Gen-defiziente Sendai-Virus-cDNA zu konstruieren, die das hFGF2-Gen enthält, pSeV18⁺hFGF2/ΔF (Δ5aa) (pSeV18⁺hFGF2/ΔF (Δ5aa) wird auch als pSeV18⁺hFGF2/ΔF angegeben). Darüber hinaus wurde ein NotI-Fragment, das die hFGF2-cDNA enthält, an der NotI-Stelle in pSeV18⁺b(+) inseriert, das Virus-cDNA mit einer Replikationsfähigkeit codiert, um pSeV18⁺hFGF2 zu konstruieren. Der replikative SeV-Vektor, der den menschlichen FGF2 exprimiert, wurde von pSeV18⁺hFGF2 durch das bekannte Verfahren (Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813–2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578–587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457–466) hergestellt, um SeV-hFGF2 zu konstruieren.
3. Rekonstruktion und Amplifizierung des F-Gen-defizienten SeV
Die Rekonstruktion des F-Gen-defizienten SeV-Vektors wurde unter Verwendung von F-exprimierenden Helferzellen (LLC-MK2/F; siehe WO00/70055 und WO00/70070 ), die das Sendai-Virus-F-Gen (SeV-F) durch Cre-DNA-Rekombinase induzierbar exprimierten, durchgeführt (die Zellen vor der Induktion der SeV-F-Genexpression werden als LLC-MK2/F bezeichnet, und die Zellen nach jener als LLC-MK2/F/Ad). Die LLC-MK2-Zellen wurden auf ein Petrischale mit 10 cm Durchmesser zu 5 × 10⁶ Zellen/Schale ausgesät, für 24 Stunden inkubiert und dann für 1 Stunde (moi=2) mit einem T7-RNA-Polymerase-exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Virus transfiziert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122–8126, 1986), das mit Solaren und langwelligem ultraviolettem Licht (365 mm) für 20 min behandelt wurde. Der UV-Stratalinker 2400 (Katalognummer 400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA), der mit fünf 15 Watt-Lampen ausgestattet ist, wurde für die UV-Bestrahlung des Vaccinia-Virus verwendet. Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen. Die Plasmide pSeV18⁺hFGF2/ΔF, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L (Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569–579, 1996) und pGEM/F-HN ( WO00/70070 ) wurden in OptiMEM (GIBCO) in einer Konzentration von 12 μg, 4 μg, 2 μg, 4 μg beziehungsweise 4 μg pro Schale resuspendiert und dann mit dem SuperFect-Transfektionsreagenz gemischt (1 μg DNA/5 μl SuperFect, QIAGEN). Das Gemisch wurde für 15 min bei Raumtemperatur belassen, mit 3 ml OptiMEM, enthaltend 3% FBS, gemischt und dann zu den Zellen zugefügt. Die Zellen wurden für 3 bis 5 Stunden inkubiert, zweimal mit serumfreiem MEM gewaschen und weiter in serumfreiem MEM, enthaltend 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) und 7,5 μg/ml Trypsin (GIBCO) für 24 Stunden inkubiert.
Das Kulturmedium wurde von den Zellkulturen entfernt, und die F-exprimierenden Helferzellen LLC-MK2/F/Ad-Zellen, die wie vorstehend beschrieben cloniert wurden, wurden auf die Zellen geschichtet. Genau wurden die LLC-MK2/F/Ad-Zellen, die in serumfreiem MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) suspendiert waren, auf die Zellen geschichtet, in denen das Kulturmedium entfernt worden war, und dann wurden die Zellen für weitere 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Schaber entfernt, und die Pellets wurden in OptiMEM resuspendiert (10 Zellen/ml) und dreimal gefroren und wieder aufgetaut. Diese Lysate (200 μl/Vertiefung) wurden auf die LLC-MK2/F/Ad-Zellen geschichtet (4 × 106 Zellen/Vertiefung einer Platte mit 12-Vertiefungen), 300 μl/Vertiefung serumfreies MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) wurden dazu zugefügt, und die Zellen wurden für 15 bis 24 Stunden inkubiert. Das Kulturmedium wurde entfernt, und die Zellen wurden mit serumfreiem MEM gewaschen. Frisches serumfreies MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) wurde zu den Zellen zugefügt und dann für 5 bis 9 Tage inkubiert, und das Kulturmedium wurde gewonnen. Das gewonnene Kulturmedium wurde verwendet, um LLC-MK2/F/Ad-Zellen zu infizieren, und die Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, in serumfreiem MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin) inkubiert, um F-Gen-defizientes SeV zu amplifizieren.
Zur selben Zeit wurde das Kulturmedium, enthaltend F-Gen-defiziente SeV-Partikel, zweimal durch einen 0,22 μm-Filter passiert, um kontaminierendes rekombinantes Vaccinia-Virus zu entfernen, das während der Rekonstruktion für die T7-RNA-Polymerase-Expression verwendet wurde. Genau wurde das Kulturmedium (Probe nach P2), das mindestens zweimal mit serumfreiem MEM, enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin), amplifiziert wurde, zweimal durch einen 0,22 μm-Filter passiert. Darüber hinaus wurde das Kulturmedium, das einmal mit serumfreiem MEM, enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin), amplifiziert wurde, gewonnen, um F-Gen-defizientes SeV (SeV-hFGF2/ΔF) zu erhalten, das ohne Kontamination eines rekombinanten Vaccinia-Virus amplifiziert wurde.
4. Gentherapie für eine ischämische Extremität unter Verwendung eines replikativen und nicht-replikativen menschlichen FGF2-Expressions-SeV-Vektor
Die vorliegenden Erfinder bewerteten die Behandlungswirkung durch die Verabreichung eines replikativen und nicht-replikativen menschlichen FGF2-Expressions-SeV-Vektors unter Verwendung des schweren Ischämie-Modells von BALG/c nu/nu-Mäusen (Auto-Amputations-Modell), das im Beispiel 1 beschrieben wurde. Der angiogene Gentransfer wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt. Die Vektoren wurden während der Operation injiziert. Die Extremitäten-Amputation nach der Operation wurde beobachtet, und die Extremitäten-Erhaltungsrate (Rate der Zahl der Individuen, die die Extremitäten behielten, zu der Gesamtzahl von Tieren) in jedem Zeitraum wurde berechnet (13).
Die Kontrollmäuse, die das Luciferase-Expressions-SeV (SeV-Luciferase) erhielten, zeigten eine hohe Extremitäten-Amputationsrate, ähnlich zu den nichtverabreichten Mäusen. Im Gegensatz dazu wurde die Extremitäten-Amputation in Mäusen, die den menschlichen FGF2-Expressionsvektor (SeV-hFGF2 und SeV-hFGF2/ΔF) erhielten, signifikant unterdrückt. Dieses Experiment offenbarte, dass der menschliches FGF2-exprimierende Paramyxovirus-Vektor hochwirksam als ein angiogener Gentransfer-Vektor ist, um ischämische Krankheiten zu behandeln, und dass ein nicht-replikativer Paramyxovirus-Vektor wirksam für eine Ischämie-Behandlung ist. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Paramyxovirus-Vektor, der Fibroblastenwachstums-Faktor 2 (FGF2), welcher exprimierbar ist, codiert.
Paramyxovirus-Vektor nach Anspruch 1, wobei der Paramyxovirus Sendaivirus ist.
Paramyxovirus-Vektor nach Anspruch 1, wobei der Vektor kein F-Gen besitzt.
Arzneimittel, umfassend den Paramyxovirus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Zelle, welche den Vektor enthält, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
Arzneimittel nach Anspruch 4, wobei das Arzneimittel eine angiogene Zusammensetzung ist.
Arzneimittel nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Arzneimittel geeignet ist für die Behandlung von ischämischen Geweben.
Arzneimittel nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Arzneimittel für die intramuskuläre Verabreichung geeignet ist.
Verwendung der angiogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Angiogenese.
Verwendung der angiogenen Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 4 bis 7 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischen Geweben oder ischämischen Krankheiten.