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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) codieren, und ihre Verwendung.
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Hintergrundwissen
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Die
neuere Forschung für
die Behandlung von ischämischen
Krankheiten ist unter Verwendung von Wachstumsfaktoren durchgeführt worden,
die die Angiogenese induzieren. Zum Beispiel ist die therapeutische Wirkung
von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) (Baffour, R. et al., J.
Vasc. Surg. 16 (2): 181–91,
1992) und endothelialem Zell-Wachstumsfaktor (ECGF) (Pu, L. Q. et
al., J. Surg. Res. 54 (6): 575–83,
1993) auf Patienten mit Herzinfarkt und akuter Extremitäten-Ischämie untersucht
worden. Eine kürzliche
Untersuchung hat offenbart, dass der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor
(VEGF)/vaskuläre
Permeabiliätsfaktor
(VPF) in Tiermodellen mit Myokard-Ischämie und Extremitäten-Ischämie die
Vasculogenese fördert
(Takeshita, S. et al., Circulation 90 (5 Pkt. 2): 11228–34, 1994;
Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93 (2): 662–70, 1994).
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Klinische
Versuche der menschlichen Gentherapie unter Verwendung von angiogenen
Wachstumsfaktoren sind vor kurzem durchgeführt worden. Die menschliche
Gentherapie ist klinisch auf die therapeutische Angiogenese angewendet
worden, um eine kritisch ischämische
Extremität
zu behandeln. Der vaskuläre
endotheliale Wachstumsfaktor/vaskuläre Permeabilitätsfaktor
(VEGF/VPF), ein endotheliales zellspezifisches Mitogen, ist ein
starkes therapeutisches Gen für
diesen Zweck, und es hat relativ vielversprechende Ergebnisse durch
Plasmid-basierenden Gentransfer, der menschliche Patienten involviert,
gezeigt (Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114–1123 (1998);
Isner, J. M. et al., J. Vasc. Surg. 28, 964–973 (1998)). Die damit einhergehenden
schädlichen
Wirkungen und die Toxizitätsspiegel
des intramuskulären
Gentransfers von VEGF sind jedoch derzeit weniger dokumentiert worden,
weil die Wirksamkeit des Plasmid-vermittelten
intramuskulären Gentransfers
und die Expression nicht sehr hoch sind. Da neue Berichte darauf
hinweisen, dass eine transgene (Thurston, G., et al., Science 286,
2511–2514
(1999)) oder adenovirale (Thurston G., et al., Nature Med. 6, 460–463 (2000)) Überexpression
von VEGF zu einer abnormalen Vasculogenese in den Transgen-eingebrachten
Tieren führt
und dass der Plasmid-basierende intramuskuläre VEGF-Gentransfer ein transitorisches Ödem in menschlichen
Patienten mit einer ischämischen
Extremität
zeigte (Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114–1123 (1998);
Isner, J. M., et al., J. Vasc. Surg. 28, 964–973 (1998)), bleiben die detaillierten
Mechanismen, die diese Pathologien verursachen, aufzuklären. Andere
potenzielle ungünstige
Wirkungen der VEGF-Überexpression
sind wahrscheinlich die Bildung von „Angiom-ähnlichen" brüchigen
Kapillargefäßen, möglicherweise
aufgrund des Ungleichgewichts von angiogenen Signalen (Carmeliet,
P., Nature Med. 6, 1102–1103
(2000)). Ein VEGF-Gentransfer in die Gefäßwand in vivo kann eine angiomatöse endotheliale
Proliferation von Erythrocyten bei der starken Neointima-Bildung,
die mit einer Extravasation assoziiert ist, bewirken (Yonemitsu,
Y., et al., Lab. Invest. 75, 313–323 (1996)). Ähnliche
pathologische Ergebnisse wurden in einer Retrovirus-vermittelten
konstitutiven Überexpression
von VEGF im Myokard gezeigt (Lee, R. J., et al., Circulation 102,
898–901
(2000)). Darüber
hinaus ist ein anderes wichtiges Thema, das in einer klinischen
Einrichtung angesprochen werden muss, der Grad des Austretens dieser
lokal exprimierten angiogenen Faktoren in den systemischen Kreislauf.
Solch ein Austreten kann unerwartete angiogene Komplikationen bewirken,
die mit einer diabetischen Retinopathie oder dem Wachstum eines
Neoplasmas assoziiert sind.
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Eine
akute kritische Extremitäten-Ischämie, die
aus der akuten Verstopfung der Hauptarterien resultiert, wird vorwiegend
durch eine thrombotische Verstopfung verursacht und ist ein wichtiges
Ziel der therapeutischen Angiogenese. Eine akute kritische Extremitäten-Ischämie wird
ziemlich erfolglos in späten
Interventionen behandelt, was oft zu einer Extremitäten-Amputation
führt.
Darüber
hinaus ist die Langzeit-Prognose von Patienten mit einer Extremitäten-Amputation
schlecht, und die Ein-Jahres-Überlebensrate
von Patienten nach der Operation ist nur 50%. Die Spiegel der Plasmid-basierenden
Genexpression sind niedrig, und die Wirksamkeit der Plasmid-basierenden
Therapie für
einen akuten schweren Arterienverschluss ist noch immer unbekannt.
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Offenbarung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Paramyxovirus-Vektoren,
die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, und deren
Verwendung bereitzustellen. Spezifischer liefert die vorliegende
Erfindung Paramyxovirus-Vektoren,
die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, angiogene
Zusammensetzungen, einschließlich
der Vektoren, und Verfahren zum Fördern der Angiogenese in ischämischen
Geweben unter Verwendung der Vektoren.
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Voruntersuchungen
durch die vorliegenden Erfinder weisen auf erfolglose Ergebnisse
hin, in denen eine Extremitäten-Erhaltung
durch Plasmid-basierenden menschlichen VEGF165-Gentranfer in einem
Mausmodell der akuten kritischen Extremitäten-Ischämie erzielt wurde (Daten nicht
gezeigt). Um zu testen, ob eine höhere Expression des Transgens
ein besseres Ergebnis zeigen kann, verwendeten die vorliegenden
Erfinder durch rekombinantes Sendai-Virus (SeV) vermittelten Gentransfer,
eine Technik, die einen hoch-wirksamen Gentransfer in verschiedene
Organe zeigt. Wie in den Beispielen dieser Anmeldung gezeigt, verwendeten
die vorliegenden Erfinder zwei rekombinante SeV-Vektoren als therapeutische
Mittel für
die Extremitäten-Ischämie: einen,
der den menschlichen VEGF165 exprimiert, und den anderen, der den
murinen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) exprimiert. FGF2 (oft
als bFGF bezeichnet)-Protein ist ein Wachstumsfaktor, der eine angiogene
Wirkung zeigt, wenn er verabreicht wird (Baffour, R. et al., J.
Vasc. Surg. 16: 181–191 (1992)).
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Unter
Verwendung dieser Vektoren analysierten die vorliegenden Erfinder
1) den Transgen-Expressionsspiegel und die Kinetik des SeV-vermittelten
intramuskulären
Gentransfers; 2) ob eine höhere
Expression der angiogenen Faktoren eine Extremitäten-Nekrose verhindern kann,
die durch akute kritische Extremitäten-Ischämie oder irgendwelche schädlichen
Wirkungen verursacht wird; und 3) ob die höhere Expression der angiogenen
Proteine in den Muskeln zu ihrem Austreten in den systemischen Kreislauf
führt.
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Die
Erfinder verwendeten ischämische
Mausmodelle, einschließlich
BALG/c nu/nu-untere Gliedmaßen-Amputations-Modelle
(Auto-Amputations-Modell), in denen die gesamte externe Ilias-Arterie
und -Vene und die Femoral-Arterie und -Vene oberhalb des Knies exzidiert
wurden (kritisches Ischämie-Modell),
und C57BL/6-Extremitäten-Erhaltungs-Modelle,
die aufgrund einer physiologischen Angiogenese nach derselben chirurgischen
Vorgehensweise wie vorstehend ihre unteren Gliedmaßen nicht
verlieren. Vektoren, die den menschlichen VEGF165, den Maus-FGF2 oder Luciferase
(SeV-hVEGF165, SeV-mFGF2 beziehungsweise SeV-Luciferase) exprimieren, wurden konstruiert
und zwei Tage vor der ischämischen
Operation in die Oberschenkel- und Unterschenkel-Muskeln verabreicht.
Die unteren Extremitäten
wurden bis zu 10 Tage nach der Operation beobachtet.
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Im
Fall des Luciferase-Gentransfers in den unteren Maus-Extremitäts-Skelettmuskel zeigte
SeV 5- bis 120-fach höhere
Genexpressionsspiegel im Vergleich zu Kontroll-Plasmidvektoren,
die in einer Menge von 100 μg
(200 mg/60 kg menschlichem Körpergewicht:
entsprechend 25- bis 50-fach der klinischen Dosis) verabreicht wurden.
In verschiedenen Zellkulturen zeigten sowohl SeV-hVEGF165 als auch
SeV-mFGF2 einen hohen Protein-Sekretionsspiegel (50 bis 500 ng/105 Zellen/24 Stunden). Der FGF2-Spiegel wurde
durch die intramuskuläre
Verabreichung von SeV-mFGF2 im Vergleich zu nicht-verabreichten
Kontrollen (Grundlinie) 5- bis 100-fach erhöht. Im Gegensatz dazu bewirkte
die Verabreichung von SeV-hVEGF165 nur eine eingeschränkte Expression
von VEGF im Muskel (höchstens
2-fach über
der Grundlinie) und erhöhte
die Expression von endogenem VEGF signifikant. 2 Tage nach der Verabreichung
wurde eine weit ausgedehnte Nekrose in Muskelgeweben beobachtet,
wo SeV-hVEGF165 verabreicht worden war, und die Amputation der unteren
Extremitäten
wurde gefördert.
Auf der anderen Seite zeigte die SeV-mFGF2-Verabreichung mit einem
Anstieg in der endogenen VEGF-Expression
eine signifikante therapeutische Wirkung auf die Extremitäten-Erhaltung.
In beiden Fällen
wurde kein signifikantes Auslaufen der Vektor-abgeleiteten Proteine
in das Serum beobachtet (< 5
pg/ml). Alle Extremitäten
wurden in den nicht-verabreichten,
SeV-Luciferase- und SeV-mFGF2-Gruppen gerettet, ein Drittel oder
mehr der SeV-hVEGF-Gruppe-Mäuse
im Extremitäten-Erhaltungsmodell
verloren jedoch ihre unteren Extremitäten. Im Auto-Amputationsmodell
zeigte nur die FGF2- Gruppe
eine hohe Extremitäten-Erhaltungswirkung,
die unteren Extremitäten
der meisten der Mäuse
in den anderen Gruppen wurden jedoch auto-amputiert.
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Die
vorliegende Erfindung offenbarte, dass die intramuskuläre Verabreichung
von rekombinanten Sendai-Virus-Vektoren die Transgen-Expression
signifikant erhöhte.
Rekombinante Sendai-Virus-Vektoren zeigen eine 10- bis 100-fach
höhere
Expression als Plasmidvektoren. Es wurde jedoch gefunden, dass die
in vitro-Verabreichung
von rekombinanten Sendai-Virus-Vektoren, die VEGF165 exprimieren,
die Extremitäten-Amputation
im akuten schweren Ischämie-Mausmodell
förderte.
Die Verabreichung von SeV-hVEGF165 induzierte ein Ödem (Beispiel
4, 8), verhinderte die Durchblutung nach der ischämischen
Operation (Beispiel 5, 11 und 12) und
erhöhte
den Anteil der Extremitäten-Amputation
durch die Ischämie
signifikant (Beispiel 5, 9 und 10). Diese
Pathologien würden
zum Teil aufgrund der starken vaskulären Permeabilitäts-erhöhenden Aktivität von VEGF
erfolgen. Im Gegensatz dazu zeigte die Verabreichung von Sendai-Virus,
das FGF2 exprimiert, konsistent eine hohe therapeutische Wirkung.
In beiden Modellen legte die Tatsache, dass keine rekombinanten
Proteine im systemischen Kreislaufsystem nachgewiesen wurden, nahe,
dass eine SeV-vermittelte FGF2-Therapie geringe Wirkungen auf andere
Organe oder weite Sicherheitsgebiete hat. Diese Ergebnisse wiesen
auch darauf hin, dass die Aufmerksamkeit auf unerwünschte Wirkungen
gerichtet werden muss, die in menschlichen klinischen Anwendungen
durch VEGF in bestimmten Extremitäten-Zuständen bewirkt werden. Daher
würde die
FGF2-Gentherapie,
die einen weiten Bereich der Sicherheit und therapeutischen Wirkung
zeigt, ein sicheres Gentherapie-System sein. Darüber hinaus zeigte die vorliegende
Erfindung die Wirkung des SeV-Vektors, der ein starkes Mittel zum
Einbringen von therapeutischen Genen in vitro ist, und ermöglicht seine
Verwendung in der klinischen Therapie für eine akute stark ischämische Extremität.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Paramyxovirus-Vektoren, die
angiogene Gene codieren, und deren Verwendung. Spezifischer bezieht
sich die vorliegende Erfindung auf:
- (1) einen
Paramyxovirus-Vektor, der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)
codiert, der in der Lage ist, exprimiert zu werden;
- (2) den Paramyxovirus-Vektor von (1), wobei das Paramyxovirus
Sendai-Virus ist;
- (3) den Paramyxovirus-Vektor von (1), wobei dem Vektor das F-Gen
fehlt;
- (4) ein Arzneimittel, umfassend den Paramyxovirus-Vektor von
einem von (1) bis (3) oder eine Zelle, enthaltend den Vektor und
einen pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoff;
- (5) das Arzneimittel von (4), wobei die Zusammensetzung eine
angiogene Zusammensetzung ist;
- (6) die Zusammensetzung von (4) oder (5), wobei die Zusammensetzung
für die
Behandlung von ischämischen
Geweben ist;
- (7) die Zusammensetzung von (4) oder (5), wobei die Zusammensetzung
für die
intramuskuläre
Verabreichung geeignet ist;
- (8) die Verwendung der angiogenen Zusammensetzung von einem
von (4) bis (7) für
die Herstellung eines Arzneimittels zum Induzieren der Angiogenese;
und
- (9) die Verwendung der angiogenen Zusammensetzung, wie in einem
von (4) bis (7) definiert, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischen
Geweben oder ischämischen
Krankheiten.
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Unter
Verwendung von rekombinantem SeV als ein starkes Mittel zum Fördern der
therapeutischen Gene in Muskeln charakterisierten die vorliegenden
Erfinder die in vivo-Wirkung der angiogenen Faktoren VEGF165 und
FGF2 auf eine akute schwere Extremitäten-Ischämie. Die Schlüsselaspekte,
die in dieser Untersuchung erhalten wurden, waren; 1) eine Extremitäten-Ischämie-induzierter
endogener VEGF diffundierte eher in den systemischen Kreislauf als
dass er sich in Muskeln konzentrierte, und die Expression von VEGF165,
die durch den Vektor der vorliegenden Erfindung vermittelt wird,
läuft nicht
signifikant in den systemischen Kreislauf aus; 2) die exogene FGF2-Expression,
5- bis 100-fach höher
als die endogene, führte
nicht zu einer signifikanten systemischen Diffusion; 3) dieser Spiegel
der FGF2-Expression induziert auch eine endogene VEGF-Expression
und zeigte eine signifikante Extremitäten-Erhaltungswirkung, die
eine signifikant ansteigende Extremitäten-Durchblutung verbindet;
und 4) die Überexpression
von VEGF165 induzierte im Gegensatz zu jener von FGF2 offensichtlich
die Extremitäten-Schädigung.
Diese Ergebnisse legen die klinische Realisierbarkeit von FGF2 mit
einem breiteren Sicherheitsbereich als ein therapeutischer angiogener
Faktor, um eine akute klinische Extremitäten-Ischämie zu behandeln, nahe. Darüber hinaus
sind die vorliegenden Erfinder die ersten, die eine schwere schädliche Wirkung
des VEGF165-Gentransfers auf die Extremitäten-Ischämie offenlegen.
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Interessanterweise
fanden die vorliegenden Erfinder, dass Extremitäten-Ischämie-induzierter
endogener VEGF eher in den systemischen Kreislauf diffundiert als
dass er sich im Muskel selbst konzentriert. Obwohl eine durch eine
ischämische
Operation induzierte endogene VEGF-Expression in Muskeln und endothelialen Zellen
(ECs) bereits angesprochen wurde (Florkiewicz, R. Z. et al., J.
Cell. Physiol. 162, 388–399
(1995)), sind die vorliegenden Erfinder die ersten, die zeigen,
dass endogener VEGF für
die Induktion einer systemischen aber nicht für eine lokale angiogene Antwort
verantwortlich zu sein scheint. Asahara et al. zeigten, dass eine systemische
Verabreichung von VEGF endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) mobilisiert
(Asahara, T. et al., EMBO J. 18, 3964–3972 (1999)), was nahe legt,
dass eine physiologische Antwort auf eine Extremitäten-Ischämie, die
kollaterale Gefäße bildet,
in einem gewissen Ausmaß eher
von einer EPC-vermittelten „Vasculogeneseähnlichen" Neovaskularisierung
als von einer lokalen Angiogenese durch proliferierende ECs, die
aus bereits vorhandenen Gefäßen sprießen, abhängig zu
sein scheint (Isner J. M., J. Clin. Invest. 106, 615–619 (2000)).
Da durch den Gentransfer verstärkter
VEGF in einer ischämischen
Extremität
zu einem Fehlen einer signifikanten Durchblutung und in einer Extremitäten-Amputation
führte,
wie hier gezeigt, kann in diesem Fall VEGF vielmehr dominant als „vaskulärer Permeabilitätsfaktor" als als „angiogener
Faktor" wirken.
Dies kann auch durch die Histologie der Muskeln unterstützt werden,
die offensichtlich ein ausgedehnteres intermuskuläres Ödem in der
VEGF165-Gruppe anzeigt.
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Zweitens
zeigten die vorliegenden Erfinder, dass eine FGF2-Gentherapie allein
wirksam ist, um eine ischämische
Extremität
zu behandeln, und eine endogene VEGF-Funktion in vivo involviert.
Sogar wenn die Gesamt-Proteinkonzentration von VEGF im Muskel durch
den FGF2-Gentransfer ähnlich
zu jener des VEGF-Gentransfers
war, war die FGF2-Gentherapie selbst aber nicht VEGF ausreichend
wirksam. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht nur VEGF sondern
auch FGF2 notwendig sein kann, um reife Blutgefäße für therapeutische Durchblutung
zu ischämischen
Extremitäten
zu bilden und um eine vaskuläre
Undichtheit zu verhindern. Darüber
hinaus kann Angiopoietin-1, ein angiogener Faktor, der eine vaskuläre Undichtheit
von VEGF-induzierten unreifen Gefäßen verhindert, dazu beitragen.
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Mit
dem Grund, warum eine Injektion von SeV-VEGF165 keine vergleichbare
Expression zu SeV-FGF2 oder SeV-Luciferase im Muskel in vivo zeigen
konnte, befasst man sich noch immer nicht vollständig, weil SeV-VEGF165 in vitro
ausreichend wirkt, um ein Genprodukt ähnlich zu SeV-FGF2 zu sezernieren. Ähnlich zu
der histologischen Untersuchung zeigte die Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebung
(LDPI) ausgedehnt geschädigtes
Muskelgewebe, dem eine Durchblutung fehlt. Daher kann es möglich sein,
dass die zelluläre
Maschinerie der SeV-vermittelten Transkription, einschließlich Tubulin
(Moyer, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5405–5409 (1986))
und Phosphoglycerat-Kinase (Ogino, T., et al., J. Biol. Chem. 274, 35999–36008 (1999)),
aufgrund des Ödems,
das durch VEGF165-induzierte Gewebeschädigung verursacht wurde, gestört sein
kann. Umgekehrt verstärkte
ein relativ niedriger Spiegel einer exogenen VEGF165-Genexpression
das endogene VEGF merklich (ungefähr 200 pg/g Muskel) in stark
ischämischen
Muskeln (1400 pg/g Muskel), was zu einer beschleunigten Extremitäten-Amputation
führte.
Diese Ergebnisse legen deutlich nahe, dass eine verstärkte Konzentration
von VEGF im Muskel, sogar wenn sie relativ niedrig und etwa 2-fach
höher als
die Grundlinie ist, Extremitäten
in eine kritische Extremitäten-Ischämie führen kann.
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Die
Angiogenese wird als ein gut harmonisierter Prozess angesehen, und
viele Faktoren können
involviert sein. Unter diesen Faktoren ist die biologische Funktion
von VEGF hochgradig dosisabhängig,
was zu einem verhängnisvollen
Defekt sogar bei einem einzelnen Allelverlust führt (Carmeliet, P. et al.,
Nature 380, 435–439
(1996)). Die konstitutive VEGF-Expression ist während des gesamten Vorgangs
der vaskulären
Integrität
und Reifung notwendig, weil eine transitorische VEGF-Expression
nur kurzzeitige angiogene Antworten induziert (Pettersson, A. et
al., Lab. Invest. 80, 99–115
(2000)) und weiterhin die VEGF-induzierte Kapillarähnliche
Struktur selten Verbindungen mit bereits bestehenden Blutgefäßen aufnimmt
(Springer, M. L., et al., Mol. Cell 2, 549–558 (1998)). Daher legt die
vorliegende Erfindung nahe, dass eine mehr als 2-fach höhere Konzentration
von VEGF im Muskel ohne ausreichenden FGF2 wahrscheinlich stark
toxisch ist. In Anbetracht dessen sollte eine vorsichtigere Aufmerksamkeit
denn je auf die Verwendung von VEGF für eine therapeutische Angiogenese
gelenkt werden, obwohl VEGF noch ein großes klinisches Potenzial behält. Darüber hinaus
wurde gezeigt, dass der intramuskuläre FGF2-Gentransfer sicher
und signifikant therapeutisch wirksam für die Extremitäten-Erhaltung
in akuten schweren Extremitäten-Ischämie-Fällen ist.
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Hierin
wird ein „Paramyxovirus-Vektor" als ein Vektor (oder
Trägerstoff)
definiert, der von dem Paramyxovirus abgeleitet ist und der für einen
Gentransfer in Wirtszellen verwendet wird. Der Paramyxovirus-Vektor
der vorliegenden Erfindung kann ein Ribonucleoprotein (RNP) oder
ein Viruspartikel sein, das eine Infektiosität aufweist. Hierin wird der
Begriff „Infektiosität" als eine Fähigkeit
des rekombinanten Paramyxovirus-Vektors definiert, durch seine Zelladhäsions- und
Membranfusions-Fähigkeiten
ein Gen, das im Vektor enthalten ist, zu Zellen, an die der Vektor
angehaftet ist, zu transferieren. Der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung
kann eine Replikationsfähigkeit
aufweisen oder kann ein defekter Vektor ohne die Replikationsfähigkeit
sein. Hierin wird „Replikationsfähigkeit" als die Fähigkeit
des Virusvektors definiert, sich zu replizieren und infektiöse Viruspartikel
in Wirtszellen, die mit den Virusvektoren infiziert wurden, zu produzieren.
Die Replikationsfähigkeit
kann unter Verwendung von zum Beispiel der Affennierenabgeleiteten
Zelllinie LLC-MK2 oder CV-1 bestimmt werden.
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Hierin
wird ein „rekombinanter" Paramyxovirus-Vektor
als ein Paramyxovirus-Vektor,
der durch Gentechnik konstruiert wurde, oder seine amplifizierten
Produkte definiert. Zum Beispiel können rekombinante Paramyxovirus-Vektoren
durch Rekonstitution einer rekombinanten Paramyxovirus-cDNA hergestellt
werden.
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Hierin
wird ein Paramyxovirus als ein Virus der Paramyxoviridae-Familie
oder ein Derivat davon definiert. In der vorliegenden Erfindung
verwendete Paramyxoviren schließen
zum Beispiel Viren, die zu den Paramyxoviridae gehören, wie
Sendai-Virus, Newcastle-Krankheit-Virus,
Mumps-Virus, Masern-Virus, respiratorisches Syncytium-Virus, Rinderpest-Virus,
Staupe-Virus, Affen-Parainfluenza-Virus (SV5) und menschliches Typ
I-, II- und III-Parainfluenza-Virus ein. Das Virus der vorliegenden
Erfindung kann vorzugsweise ein Virus der Gattung Paramyxovirus
oder ein Derivat davon sein. Das Paramyxovirus, das in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, schließt zum Beispiel menschliches
Typ I-Parainfluenza-Virus
(HPIV-1), menschliches Typ III-Parainfluenza-Virus (HPIV-3), bovines
Typ III-Parainfluenza-Virus
(BPIV-3), Sendai-Virus (auch als „Maus-Typ I-Parainfluenza- Virus" bezeichnet), Typ
X-Affen-Parainfluenza-Virus (SPIV-10) usw. ein. Das bevorzugteste
Paramyxovirus der Erfindung ist Sendai-Virus. Diese Viren können natürlich vorkommende,
Wildtyp-, mutante, im Labor passagierte, künstlich konstruierte Stämme, usw.
sein. Unvollständige
Viren wie das DI-Partikel (Willenbrink W. und Neubert W. J., J.
Virol., 1994, 68, 8413–8417)
und synthetisierte Oligonucleotide können auch als ein Material
für das
Herstellen des Virusvektors der vorliegenden Erfindung verwendet
werden.
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Gene,
die die Proteine eines Paramyxovirus codieren, schließen die
NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene ein. Hierein repräsentieren
die „NP-,
P-, M-, F-, HN- und L-Gene" jene,
die das Nucleokapsid-Protein, das Phosphoprotein, das Matrix-Protein, das Fusionsprotein,
die Hämagglutinin-Neuraminidase
beziehungsweise das große
Protein codieren. Die Gene von jedem Virus der Unterfamilie Paramyxovirus
werden im Allgemeinen wie folgt beschrieben. Im Allgemeinen kann
das NP-Gen auch als „N-Gen" angezeigt werden.
Paramyxovirus | NP | P/CN | M | F | HN – | L |
Rublavirus | NP | P/V | M | F | HN
(SH) | L |
Morbillivirus | NP | P/CN | M | F | H – | L |
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Zum
Beispiel sind die Zugangsnummern von jedem Gen des Sendai-Virus,
das als ein Respirovirus der Paramyxoviridae in der Nucleotidsequenz-Datenbank
klassifiziert ist, M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565,
M69046 und X17218 für
das NP-Gen; M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007
und X17008 für
das P-Gen; D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584
und X53056 für
das M-Gen; D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204,
M69046, X00152 und X02131 für
das F-Gen; D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586,
X02808 und X56131 für
das HN-Gen; und D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 und
X58886 für
das L-Gen.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Gen" eine genetische Substanz, einschließlich Nucleinsäuren wie
RNA und DNA, die Protein codieren kann oder nicht kann. Ein Gen
kann eine funktionelle RNA wie Ribozym oder Antisense-RNA codieren.
Es kann eine natürlich
vorkommende Sequenz oder eine künstlich gestaltete
Sequenz sein. Darüber
hinaus, wie hierin verwendet, schließt der Begriff „DNA" eine einzelsträngige DNA
und eine doppelsträngige
DNA ein.
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Die
vorliegende Erfindung liefert einen Paramyxovirus-Vektor, der den
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, und die Verwendung
desselben. Die vorliegenden Erfinder zeigten, dass die Transgen-Expression
an den verabreichten Stellen erhöht
war, wo ein Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) codiert, intramuskulär
in vivo verabreicht wurde. Die vorliegenden Erfinder offenbarten, dass
eine Nekrose in ischämischen
Geweben durch die Verabreichung eines rekombinanten Paramyxovirus-Vektors,
der ein angiogenes Gen (FGF2) codiert, verhindert werden konnte
und der Verlust der Hinterextremität in einem Extremitäten-Erhaltungs-Experiment
unter Verwendung von Mäusen
mit ischämischen
Hinterextremitäten
verhindert werden konnte. Die Vektoren dieser Erfindung sind nützlich im
wirksamen Induzieren einer Angiogenese in ischämischen Geweben und im Verhindern
einer Nekrose und können
daher vorzugsweise für
die Gentherapie von ischämischen
Krankheiten verwendet werden.
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Darüber hinaus
offenbarten die vorliegenden Erfinder, dass die Gene, die intramuskulär unter
Verwendung von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren verabreicht
wurden, kontinuierlich für
1 bis 2 Wochen exprimiert werden konnten. Dieses Ergebnis weist
darauf hin, dass eine Gentherapie mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2
(FGF2) unter Verwendung von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren kontinuierliche
therapeutische Wirkungen erzielen kann. Darüber hinaus konnte der Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2), der von rekombinanten Paramyxovirus-Vektoren exprimiert
wurde, die intramuskulär
verabreicht wurden, nicht im systemischen Kreislaufsystem nachgewiesen
werden und würde
daher keine unerwünschten
Wirkungen außerhalb
der Zielgewebe verursachen. Daher legen die Ergebnisse der vorliegenden
Erfindung, dass Paramyxovirus-Vektoren verschiedene Vorteile im
angiogenen Gentransfer haben, eine mögliche große Verbesserung in der Gentherapie
durch spezifisches Anzielen von ischämischen Geweben nahe.
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Da
Paramyxovirus-Vektoren in Menschen nicht pathogen sind, kann nahegelegt
werden, dass sie in Anbetracht der Sicherheit vorzugsweise in klinischen
Versuchen der menschlichen Gentherapie verwendet werden. Es ist
ein Haupthindernis im hoch-wirksamen Gentransfer, dass die eingebrachte
DNA in den meisten Fällen
in den Kern transportiert werden muss oder die Kernmembran für die Expression
eines exogenen Gens durch Plasmid-DNA oder dergleichen eliminiert
werden muss. Im Fall des Sendai-Virus wird die Expression eines
exogenen Gens jedoch sowohl durch zelluläres Tubulin als auch seine
RNA-Polymerase (1-Protein) im Cytoplasma gelenkt, wenn sich die
Viren replizieren. Dies legt nahe, dass das Sendai-Virus nicht mit
den Chromosomen der Wirtszellen interagiert, was Risiken wie eine
Krebsbildung und die Immortalisierung von Zellen vermeidet. Darüber hinaus
ist bekannt, dass das Sendai-Virus in Nagern pathogen ist, was eine
Lungenentzündung
hervorruft, aber nicht in Menschen, was durch Untersuchungen unterstützt wird,
die zeigen, dass die intranasale Verabreichung des Wildtyp-Sendai-Virus in nicht-menschlichen
Primaten keinen Schaden anrichtet (Hurwitz J. L. et al., Vaccine,
1997, 15, 533–540).
Diese Eigenschaften legen nahe, dass ein Sendai-Virus-Vektor in der menschlichen Therapie
verwendet werden kann, und unterstützen weiterhin die Ansicht,
dass Sendai-Virus-Vektoren eines der vielversprechenden Mittel in
der Gentherapie mit angiogenen Genen sein kann.
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Die
hierin beschriebenen angiogenen Gene bezeichnen Gene, die Faktoren
codieren, die Aktivitäten aufweisen,
um die Angiogenese und/oder die Vasculogenese direkt oder indirekt
zu fördern.
Die Faktoren können
Proteine oder Peptide sein oder können Nucleinsäuren wie
funktionelle RNAs (Ribozyme oder Antisense-RNAs) sein. Angiogene
Proteine schließen
den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) (auch basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) genannt)
ein (Klagsbrun, M. und D' Amore,
P., A. Annu. Rev. Physiol. 53: 217–39, 1991; Folkman, J. und
Shing, Y., J. Biol. Chem. 267 (16): 10931–4, 1992; Symes, J. F. und
Sniderman, A. D., Curr. Opin. Lipidol. 5(4): 305–12, 1994).
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Die
bevorzugten angiogenen Proteine in der vorliegenden Erfindung schließen FGF2
ein, und die Vektoren können
unter Verwendung von Genen konstruiert werden, die die Proteine,
die aus der obigen Liste ausgewählt
wurden, codieren.
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Proteine,
die unter den angiogenen Proteinen, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, besonders bevorzugt sind, sind nicht jene, die
durch VEGF eine unreife Angiogenese induzieren, sondern jene, die
die Angiogenese erzielen, in der das Blutgefäß durch parietale Zellen umgeben
ist, die sich von den neu hergestellten endothelialen Zellen, die
an mesenchymale Zellen angehaftet sind, differenziert haben. Es ist
bekannt, dass die Vaskularisation aus drei Schritten, Vasculogenese,
Angiogenese und vaskuläre
Reifung besteht. Beobachtungen von verschiedenen Transkriptionsfaktor-Knockout-Untersuchungen
offenbarten, dass die Reifung der Vaskularisation mehrere Gene involviert.
Insbesondere ist der Transkriptionsfaktor SCL/tal-1 hauptsächlich in
die vaskuläre
Bildung involviert, und HIF-1, Id, ETS-1, HOXD3,
COUP-TFII und MEF2C sind in die Angiogenese involviert. Darüber hinaus
ist es bekannt, dass ein Lungen-Kruppel-ähnlicher Faktor (LKLF)- oder dHAND-Gen-Knockout
embryonalen Tod aufgrund von unterentwickelten parietalen Zellen
bewirkt.
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Daher
sind die angiogenen Gene, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, bevorzugter jene, die Transkriptionsfaktoren, einschließlich LKLF
und dHAND, die in die parietale Zell-Reifung in unreifen mesenchymalen
Zellen involviert sind, induzieren. Es wird vorhergesagt, dass eine
FGF2-Stimulierung direkt in die Induktion dieser Transkriptionsfaktoren
involviert ist oder die Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen
Zellen durch andere Wachstumsfaktoren wie Angiopoietin und HGF fördert.
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Angiogene
Proteine enthalten vorzugsweise Sekretions-Signalsequenzen, die
die Sekretion der angiogenen Proteine ermöglichen. Proteine wie FGF2
können
jedoch außerhalb
der Zellen ohne eine natürliche und
typische Sekretions-Signalsequenz
sezerniert werden (siehe Beispiel). Diese Proteine benötigen nicht
unbedingt Sekretions-Signalsequenzen. Die Gene, die diese angiogenen
Proteine codieren, können
zum Beispiel durch bekannte Verfahren wie PCR unter Verwendung von
Primern, die basierend auf der Nucleotidsequenz-Information gestaltet
wurden, erhalten werden. Ein Beispiel des am meisten bevorzugten
angiogenen Faktors, der in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, ist FGF2, der eine stabile therapeutische Wirkung in einem
weiten Bereich von Expressionsspiegeln zeigt. (Abraham, J. A. et
al., 1986, EMBO J. 5: 2523–2528; Moscatelli,
D. A. et al.,
US 4994559 ;
Baird, A. et al.,
US 5155214 ;
Isner, J. M.
US 6121246 ;
WO 97/14307 ).
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Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2)-Gene, die für
die Vektorkonstruktion verwendet werden, können heterolog oder homolog,
vorzugsweise homolog zu den Ziel-Individuen für den Gentransfer sein, um
eine gewünschte
Wirkung zu erzielen.
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Darüber hinaus
sind die Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)-Gene, die für die Vektor-Konstruktion
verwendet werden, vorzugsweise Säuger-Gene,
vorzugsweise menschliche Gene für
die Anwendung am Menschen.
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Paramyxovirus-Vektoren,
die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) der vorliegenden Erfindung codieren,
sind besonders für
die Behandlung von ischämischen
Geweben wirksam. Der Gentransfer von angiogenen Genen unter Verwendung
der Vektoren der vorliegenden Erfindung kann nämlich die Angiogenese fördern und
eine Nekrose aufgrund einer Ischämie
verhindern. Die ischämischen
Gewebe, die für
die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind nicht limitierend,
solange die Gewebe eine Ischämie
zeigen oder eine Ischämie
entwickeln. Zum Beispiel schließen
solche Gewebe Muskel, Gehirn, Niere und Lunge ein. Die ischämischen
Krankheiten, die durch das Verabreichen der Vektoren der vorliegenden
Erfindung behandelt werden, schließen cerebrovaskuläre Ischämie, Nieren-Ischämie, Lungen-Ischämie, Extremitäten-Ischämie, ischämische Cardiomyopathie
und myocardiale Ischämie
ein. Die Behandlung von ischämischen
Geweben in der vorliegenden Erfindung schließt die Therapie von ischämischen
Geweben oder die Verhinderung eines ischämischen Verschlusses, insbesondere
zum Beispiel die Verhinderung einer Nekrose in ischämischen
Geweben, das Erhalten von ischämischen
Geweben, die Förderung
der Angiogenese in ischämischen
Geweben, die Geweberegenerierung und das Verhindern und Vermindern
eines Verschlusses, der durch Ischämie verursacht wurde, ein.
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Die
vorliegende Erfindung liefert zweite medizinische Verwendungen zum
Induzieren der Angiogenese, das den Schritt des Verabreichens eines
Arzneimittels, umfassend Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) codieren, umfasst. Darüber
hinaus liefert die vorliegende Erfindung zweite medizinische Verwendungen
zum Behandeln von ischämischen
Geweben, die den Schritt des Verabreichens eines Arzneimittels umfassen,
umfassend einen Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) codiert. Es gibt keine Einschränkung für die Ziel-Individuen, und
zum Beispiel kann ein erwünschter
Säuger,
einschließlich
eines Menschen, verwendet werden. Insbesondere können nicht-menschliche Säuger wie
Primaten, einschließlich
Affen wie Halbaffen, Platyrrhin-Affen und Schmalnasenaffen, Menschenaffen
oder menschenähnliche
Affen, Nager wie Mäuse,
Ratten und Meerschweinchen sowie Rinder, Hunde, Katzen, Pferde,
Schafe und Kaninchen Ziele für
die Verabreichung sein. Es ist möglich,
eine Ischämie in
dem Tier unter Verwendung von Vektoren der vorliegenden Erfindung
zu behandeln, und auch möglich,
die Tiere als Ischämie-Therapiemodelle für Menschen
zu verwenden (Morinaga, K. et al., 1987, J. Vasc. Surg. 5: 719–730; Itoh,
H. et al., 1994, Atherosclerosis 110: 259–270).
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Spezifische
Verwendungen zum Induzieren der Angiogenese gemäß der vorliegenden Erfindung schließen die
folgenden Verwendungen ein:
- [a] eine zweite
medizinische Verwendung zum Induzieren der Angiogenese, die den
Schritt des Verabreichens eines Arzneimittels, umfassend einen Paramyxovirus-Vektor,
der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, oder eine
Zelle, die den Vektor enthält,
umfasst;
- [b] die Verwendung von [a], in der das Gen intramuskulär verabreicht
wird; und
- [c] die Verwendung von [a] oder [b], in der das Paramyxovirus
Sendai-Virus ist.
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Beispiele
der Verwendungen zum Behandeln der ischämischen Gewebe in der vorliegenden
Erfindung schließen
die folgenden Verwendungen ein:
- [a] eine zweite
medizinische Verwendung zum Behandeln der ischämischen Gewebe, die den Schritt
des Verabreichens eines Arzneimittels, umfassend einen Paramyxovirus-Vektor,
der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codiert, oder eine
Zelle, die den Vektor enthält,
umfasst;
- [b] die Verwendung von [a], in der das Gen intramuskulär verabreicht
wird; und
- [c] die Verwendung von [a] oder [b], in der das Paramyxovirus
Sendai-Virus ist.
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Die
Verabreichung kann entweder in vivo oder ex vivo ausgeführt werden.
Für die
in vivo-Verabreichung können
die Paramyxovirus-Vektoren, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, über Verabreichungswege
injiziert werden, die Fachleuten wohlbekannt sind, wie intramuskuläre Injektion,
subcutane Injektion und Katheter-Verabreichung. Für eine ex
vivo-Verabreichung werden die Vektoren verwendet, um Zellen in vitro
vorzutransfizieren. Die Zellen, die die Vektoren enthalten, werden
dann in vivo durch Verfahren wie die intramuskuläre Injektion, subcutane Injektion
und Katheter-Verabreichung injiziert. Die Zellen zum Transferieren
der Vektoren in der ex vivo-Verabreichung können entweder heterolog oder
homolog zu den Ziel-Individuen sein, sind aber vorzugsweise homolog
dazu. Die Zellen werden bevorzugter vom Ziel-Individuum abgeleitet.
Darüber
hinaus werden die Zellen am bevorzugtesten vom Knochenmark oder
Blut abgeleitet, einschließlich
Zellen, die vaskuläre
endotheliale Zellen bilden können
oder die in vaskuläre
endotheliale Zellen differenziert werden können, das heißt, vaskuläre endotheliale
Vorläufer-Zellen.
Die Angiogenese kann in den Zielgeweben, in die eine pharmazeutisch
wirksame Dosis eines Vektors der vorliegenden Erfindung verabreicht
wird, induziert werden. Daher ist es möglich, eine Behandlung zum
Verhindern einer Gewebenekrose und einer Extremitäten-Amputation
zum Beispiel in ischämischen
Gehirnen, Herzen, Nieren, Lungen und Extremitäten durchzuführen.
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Darüber hinaus
liefert die vorliegende Erfindung Paramyxovirus-Vektoren, die den
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) codieren, um ischämische Gewebe
zu behandeln. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung:
- [a] einen Paramyxovirus-Vektor, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) codiert, zum Behandeln eines ischämischen Gewebes;
- [b] den Vektor von [a], in dem der Vektor für eine intramuskuläre Verabreichung
verwendet wird; und
- [c] den Vektor von [a] oder [b], in dem das Paramyxovirus Sendai-Virus
ist.
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Darüber hinaus
liefert die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, umfassend Paramyxovirus-Vektoren,
zum Behandeln von ischämischen
Geweben. Die Zusammensetzungen können
pharmazeutisch verträgliche
Trägerstoffe
zusätzlich
zu den Paramyxovirus-Vektoren einschließen. Zum Beispiel können die Vektoren
der vorliegenden Erfindung in Injektionen mit physiologischen Lösungen oder
in Implantate mit festen oder halbfesten (Gel) Materialen formuliert
werden.
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Paramyxovirus-Vektoren,
die für
den angiogenen Gentransfer gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders limitiert. Zum
Beispiel schließen
bevorzugte Paramyxovirus-Vektoren Vektoren ein, die in der Lage
sind, sich zu replizieren und autonom zu proliferieren. Im Allgemeinen
enthält zum
Beispiel das Genom von Wildtyp-Paramyxoviren eine kurze 3'-Leader-Region, gefolgt
von sechs Genen, die die Nucleokapsid (N)-, Phospho (P)-, Matrix
(M)-, Fusions (F)-, Hämagglutinin-Neuraminidase
(HN)-, und großen
(L) Proteine codieren, und hat eine kurze 5'-Ausläufer-Region am anderen Terminus.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, sich
autonom zu replizieren, können
durch Gestalten eines Genoms, das eine ähnliche Struktur zu jener,
wie vorstehend beschrieben, hat, erhalten werden. Zusätzlich kann ein
Vektor zum Exprimieren eines exogenen Gens durch Inserieren eines
exogenen Gens in das Genom des obigen Vektors erhalten werden. Paramyxovirus-Vektoren
der Erfindung können
eine veränderte
Ausrichtung der Virusgene im Vergleich zu Wildtyp-Viren aufweisen.
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Die
Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung können eine
beliebige Deletion der Gene haben, die im Wildtyp-Paramyxovirus
enthalten sind. Zum Beispiel, wenn Sendai-Virus-Vektoren rekonstituiert werden,
wird angenommen, dass die Proteine, die durch die NP-, P/C- und
L-Gene codiert werden, in trans benötigt werden, aber die Gene
selbst dürfen
kein Bestandteil des Virusvektors der vorliegenden Erfindung sein.
Zum Beispiel kann ein Expressionsvektor, der Gene trägt, die
die Proteine codieren, in die Wirtszellen mit einem anderen Expressionsvektor
co-transfiziert werden, der das Vektor-Genom codiert, um einen Vektor
zu rekonstituieren. Alternativ wird ein Expressionsvektor, der das
Virusgenom codiert, in die Wirtszellen eingebracht, die Gene tragen,
die die Proteine codieren, und dann kann der Vektor durch Verwenden
der Proteine, die von der Wirtszelle stammen, rekonstituiert werden.
Die Aminosäuresequenz
dieser Proteine darf nicht identisch zu jenen sein, die vom ursprünglichen
Virus abgeleitet wurden, solange sie eine äquivalente oder höhere Aktivität im Nucleinsäure-Transfer
hat, und kann mutiert oder mit jener eines homologen Gens eines
anderen Virus ersetzt sein.
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Es
wird angenommen, dass die Proteine, die durch die M-, F- und HN-Gene
codiert werden, für
die Zell-zu-Zell-Vermehrung eines Paramyxovirus-Vektors wesentlich
sind. Diese Proteine werden jedoch nicht benötigt, wenn ein Paramyxovirus-Vektor
als ein RNP hergestellt wird. Wenn die Gene M, F und HN Bestandteile
des Genoms sind, das im RNP enthalten ist, werden die Produkte dieser
Gene produziert, wenn sie in die Wirtszellen eingebracht werden,
und Viruspartikel, die eine Infektiosität haben, werden hergestellt.
RNP-Vektoren, die ein infektiöses
Virus produzieren, schließen
zum Beispiel eine virale genomische RNA, die die N-, P-, M-, F-,
HN- und L-Gene codiert, und die N-, P- und L-Proteine ein. Wenn
solch ein RNP in Zellen eingebracht wird, wird das Virusgenom exprimiert
und durch die Funktionen der N-, P- und L-Proteine repliziert, und so
werden infektiöse
Virusvektoren amplifiziert.
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RNP
kann in Zellen als ein Komplex mit zum Beispiel Lipofectamin und
polykationischen Liposomen eingebracht werden. Insbesondere kann
eine Vielzahl von Transfektions-Reagenzien verwendet werden, zum Beispiel
DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE und
DOSPER (Boehringer #1811169). Chloroquin kann zugefügt werden,
um einen Abbau im Endosom zu verhindern (Calos M. P., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). Für replizierende Viren können die
produzierten Viren durch Re-Infizieren in kultivierte Zellen, Hühnereier
oder Tiere (z. B. Säuger
wie Mäuse)
amplifiziert oder passagiert werden.
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Paramyxovirus-Vektoren,
denen die M-, F- und/oder HN-Gene fehlen, werden auch vorzugsweise
als Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet.
Diese Virusvektoren können
durch exogenes Bereitstellen der deletierten Genprodukte rekonstituiert
werden. Solche Vektoren können
wie das Wildtyp-Virus noch an Wirtszellen anhaften und eine Zellfusion
induzieren. Die Tochtervirus-Partikel
haben jedoch nicht dieselbe infektiosität wie die Eltern, weil dem
Vektorgenom, das in die Zellen eingebracht wurde, eines oder mehrere
dieser Gene fehlen. Daher können
diese Vektoren als sichere Virusvektoren nützlich sein, die nur zu einem
einzigen Gentransfer in der Lage sind. Genau können die Gene, die aus dem
Genom deletiert werden, die F- und/oder HN-Gene sein. „Gen-defizient" wird als ein wesentlicher
Verlust der Genfunktion definiert, und wenn ein defektes Gen ein
Protein codiert, exprimiert die Gen-defiziente Mutante kein Protein,
das eine Funktion aufweist, die äquivalent
zum Wildtyp-Protein ist. Zum Beispiel kann das Defizientsein in
einem oder mehreren Genen durch eine Nicht-Transkription des/der
Gens/Gene, Verlust-der-Funktion-Mutanten und Deletieren der Gene
erzielt werden. Gendefizient bedeutet, dass vorzugsweise mindestens
ein Teil der codierenden Region, bevorzugter die ganze codierende
Region des Gens defekt ist. Zum Beispiel sind F-Gen-defiziente Vektoren Vektoren, die
vorzugsweise in einem Teil der F-Protein-codierenden Region, bevorzugter der
gesamten F-Protein-codierenden Region defekt sind. Noch bevorzugter
fehlt den F-Gen-defizienten Vektoren der vorliegenden Erfindung
die Startsignalsequenz auf der 3'-flankierenden
Seite des F-Gens, die in der negativen Kette im Genom defekt ist.
Daher kann eine unnötige
Polypeptid-Expression
von dem defekten Gebiet unterdrückt
werden. Wenn der offene Leserahmen (ORF), der unnötige Polypeptide
codiert, in der defekten Region vorhanden ist, ist es wünschenswert,
den ORF durch Verfahren wie ortsgerichtete Mutagenese (später beschrieben)
zu entfernen.
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Zum
Herstellen von F-Gen-defizienten Vektoren können die Virusvektoren durch
Co-Transfektion eines Expressionsplasmids, das das Genom eines rekombinanten
Paramyxovirus-Vektors codiert, dem das F-Gen fehlt, mit einem Expressionsvektor
für das
F-Protein und jenem für
die NP-, P/C- und L-Proteine in die Wirtszellen rekonstituiert werden
(Internationale Veröffentlichungen
Nummer
WO 00/70055 und
WO 00/70070 ). Alternativ
können
Wirtszellen verwendet werden, in denen das F-Gen in das Chromosom
integriert wurde. Die Aminosäuresequenz
dieser Proteine, die exogen bereitgestellt werden, muss nicht identisch
zu jener des Wildtyps sein und kann mutiert oder durch ein homologes
Protein eines anderen Virus ersetzt sein, so lange sie eine äquivalente
oder höhere
Gentransfer-Aktivität
liefern.
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Das
Hüllprotein
der Paramyxovirus-Vektoren der Erfindung kann ein anderes Protein
als das Hüllprotein
des ursprünglichen
Vektorgenoms enthalten. Es gibt keine Einschränkung für solche Proteine. Diese schließen Hüllproteine
von anderen Viren wie das G-Protein (VSV-G) des vesikulären Stomatitis-Virus
(VSV) ein. Daher schließen
die Paramyxovirus-Vektoren der Erfindung einen Pseudo-Typ-Virusvektor
ein, der ein Hüllproteine
aufweist, das von einem anderen Virus als dem ursprünglichen
Virus abgeleitet ist.
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Paramyxovirale
Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch zum Beispiel auf
der viralen Hüllenoberfläche Proteine,
die zum Anhaften an bestimmte Zellen in der Lage sind, wie Adhäsionsfaktoren,
Liganden und Rezeptoren oder chimäre Proteine, die ein Protein,
das oben beschrieben ist, auf der äußeren Oberfläche und
von der viralen Hülle
abgeleitete Polypeptide umfassen, innerhalb des Virus umfassen.
Es ermöglicht
die Produktion eines Vektors, der ein bestimmtes Gewebe anzielt.
Diese Proteine können
durch das Virusgenom selbst codiert werden oder zum Zeitpunkt der
Virus-Rekonstitution durch Expression anderer Gene als des Virusgenoms
bereitgestellt werden (zum Beispiel Gene, die von einem anderen
Expressionsvektor oder dem Wirtszell-Chromosom stammen).
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Die
Virusgene, die im Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten sind,
können
verändert
werden, zum Beispiel um die Antigenität zu reduzieren oder die RNA-Transkriptionseffizienz
oder die Replikationseffizienz zu verstärken. Insbesondere ist es möglich, mindestens
eines der NP-, P/C- und L-Gene, die Gene von Replikationsfaktoren
sind, zu verändern,
um die Transkription oder Replikation zu verstärken. Es ist auch möglich, das
HN-Protein, ein Strukturprotein, das eine Hämagglutinin-Aktivität und Neuraminidase-Aktivität aufweist,
zu verändern,
um die Virus-Stabilität
im Blut durch Schwächen
der ersteren Aktivität
zu verstärken
und um die Infektiosität
durch Verändern
der letzteren Aktivität
zu regulieren. Es ist auch möglich,
das F-Protein, das mit der Membranfusion in Verbindung gebracht
wird, zu verändern,
um seine Fusionsfähigkeit
zu regulieren. Darüber
hinaus ist es möglich,
die Antigen-präsentierenden
Epitope und solche von möglichen
antigenen Molekülen
auf der Zelloberfläche,
wie das F-Protein und HN-Protein zu analysieren und sie zu verwenden,
um einen Paramyxovirus-Vektor herzustellen, der konstruiert wird,
um eine schwache Antigen-präsentierende
Fähigkeit
aufzuweisen. Paramyxovirus-Vektoren
der vorliegenden Erfindung können
auch Hilfsgene fehlen. Zum Beispiel resultiert die Zerstörung des
V-Gens, einem der Hilfsgene von SeV, in einer Reduktion der Pathogenität von SeV
gegenüber
Wirten wie einer Maus, ohne die Genexpression und Replikation in
kultivierten Zellen zu beeinflussen (Kato, A. et al. 1997. J. Virol.
71:7266–7272;
Kato, A. et al. 1997. EMBO J. 16:578–587; Curran, J. et al.,
WO 01/04272 ;
EP 1067079 ). Solche abgeschwächten Vektoren
sind besonders geeignet als in vivo- oder ex vivo-Gentransfer-Vektoren.
Die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung codieren den Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2 (FGF2) in ihrer genomischen RNA. Ein rekombinanter Paramyxovirus-Vektor,
der exogene Gene umfasst, kann durch Insertion von exogenen Genen
in das oben erwähnte
Paramyxovirus-Vektor-Genom hergestellt werden. Ein exogenes Gen
kann ein erwünschtes
angiogenes Gen, das in Zielgeweben wie ischämischen Geweben exprimiert
werden soll, für
den Vektortransfer sein. Das exogene Gen kann ein natürlich vorkommendes
Protein oder ein modifiziertes Protein, das durch Modifizieren des
ursprünglichen Proteins
durch Deletion, Substitution oder Insertion hergestellt wurde, codieren,
so lange das modifizierte Protein funktionell äquivalent zum natürlich vorkommenden
Protein ist. Zum Beispiel kann für
den Zweck der Gentherapie und dergleichen ein Gen, das verwendet
wird, um eine Zielkrankheit zu behandeln, in die DNA (Virusvektor-DNA)
inseriert werden, die das Genom des Virusvektors codiert. Im Fall
des Inserierens eines exogenen Gens in die Virusvektor-DNA wie Sendai-Virusvektor-DNA
wird eine Sequenz, umfassend Nucleotide in Mehrfachen von sechs,
vorzugsweise zwischen die Transkriptionsendsequenz (E) und die Transkriptionsstartsequenz
(S) inseriert (Calain P. und Roux L., J. Virol., 1993, 67(8), 4822–4830).
Ein exogenes Gen kann stromaufwärts
und/oder stromabwärts
von jedem der Virusgene (NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene) inseriert
werden. Um nicht mit der Expression von stromaufwärts oder
stromabwärts
liegenden Genen zu interferieren, kann eine E-I-S-Sequenz (Transkriptionsend-Sequenz – dazwischen
liegende Sequenz – Transkriptionsstart-Sequenz)
oder ein Teil davon passend stromaufwärts oder stromabwärts eines
exogenen Gens platziert werden, sodass die E-I-S-Sequenz zwischen
jedem Gen liegt. Alternativ kann ein exogenes Gen durch eine IRES-Sequenz
inseriert werden.
-
Der
Expressionsspiegel des inserierten exogenen Gens kann durch den
Typ der Transkriptionsstart-Sequenz, die stromaufwärts der
Gene angeheftet ist, reguliert werden (
WO 01/18223 ). Er kann auch durch
die Position der Insertion und die Sequenz, die das Gen umgibt,
reguliert werden. Im Sendai-Virus wird zum Beispiel der Expressionsspiegel
des inserierten Gens umso höher
sein, je näher
die Insertionsposition zum 3'-Terminus
der Negativ-Strang-RNA des Virusgenoms (je näher zum NP-Gen in der Gen-Anordnung
am Wildtyp-Virusgenom) ist. Um eine hohen Expression eines exogenen
Gens zu erzielen, wird es vorzugsweise in die Stromaufwärts-Region
des negativ-strängigen
Genoms wie stromaufwärts
des NP-Gens (3'-flankierende Sequenz
auf dem Negativstrang) oder zwischen die NP- und P-Gene inseriert.
Umgekehrt, je näher
zum 5'-Terminus
der Negativstrang-RNA (je näher
zum L-Gen in der Gen-Anordnung am Wildtyp-Virusgenom) die Insertionsposition
ist, umso niedriger wird der Expressionsspiegel des inserierten
Gens sein. Um die Expression eines exogenen Gens zu reduzieren,
kann es in die äußerste 5'-Position am Negativstrang
inseriert werden, das heißt
stromabwärts
des L-Gens im Wildtyp-Virusgenom (5'-flankierende Region des L-Gens am Negativstrang)
oder stromaufwärts
des L-Gens (3'-flankierende
Region des L-Gens am Negativstrang). So kann die Insertionsposition
eines exogenen Gens korrekt angepasst werden, um einen erwünschten
Expressionsspiegel des Gens zu erhalten oder die Kombination der
Insertion mit den Virusgenen, die es umgeben, zu optimieren. Wenn
zum Beispiel die Überexpression
eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors
2 (FGF2), der durch einen Virusvektor mit hohem Titer eingebracht
wurde, eine Toxizität
verursachen kann, ist es möglich,
nicht nur den Titer der Viren, die verabreicht werden sollen, zu
kontrollieren sondern auch den Expressionsspiegel von individuellen
Virusvektoren durch Gestalten der Insertionsposition des angiogenen
Gens näher
zum 5'-Terminus
des Negativstrangs oder Ersetzen der Transkriptionsstart-Sequenz
mit einer, die eine niedrigere Wirksamkeit hat, zu reduzieren, um
eine geeignete Wirkung zu erhalten.
-
Um
die einfache Insertion eines exogenen Gens zu erleichtern, kann
eine Clonierungsstelle an der Position der Insertion gestaltet werden.
Zum Beispiel kann die Clonierungsstelle die Erkennungssequenz von
Restriktionsenzymen sein. Die Restriktionsstellen in der Vektor-DNA,
die das virale Genom codiert, können
verwendet werden, um ein exogenes Gen zu inserieren. Die Clonierungsstelle
kann eine Mehrfach-Clonierungsstelle sein, die Erkennungssequenzen
für mehrere
Restriktionsenzyme enthält.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann andere exogene Gene an
anderen Positionen als jenen aufweisen, die für die obige Insertion verwendet
werden. Solch ein exogenes Gen kann ohne Einschränkung ein angiogenes Gen oder
ein anderes Gen sein.
-
Die
Konstruktion eines rekombinanten Sendai-Virusvektors, der ein exogenes
Gen aufweist, kann wie folgt zum Beispiel gemäß dem Verfahren, beschrieben
in Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78: 2813–2820, Kato
A. et al., EMBO J., 1997, 16: 578–587 und Yu D. et al., Genes
Cells, 1997, 2: 457–466,
durchgeführt
werden.
-
Zuerst
wird eine DNA-Probe, enthaltend eine cDNA-Nucleotidsequenz, die
ein erwünschtes
exogenes Gen codiert, hergestellt. Es wird bevorzugt, dass die Konzentration
der DNA-Probe 25 ng/μl
oder höher
ist und dass sie als ein einzelnes Plasmid durch Elektrophorese
nachgewiesen werden kann. Die folgende Beschreibung ist ein Beispiel,
wo ein exogenes Gen in die NotI-Stelle der genomischen Virus-DNA
inseriert wird. Wenn die Ziel-cDNA-Sequenz eine NotI-Erkennungsstelle
enthält,
ist es wünschenswert,
die Stelle vorher durch Verändern
der Nucleotidsequenz unter Verwendung des bekannten Verfahrens wie
der ortsgerichteten Mutagenese zu entfernen, während die codierte Aminosäuresequenz
erhalten bleibt. Ein erwünschtes
DNA-Fragment wird durch PCR von der DNA-Probe amplifiziert. Um ein
Fragment zu erhalten, das NotI-Stellen an beiden Enden aufweist,
und um eine einzelne Kopie der Transkriptionsendsequenz (E), der
dazwischen liegenden Sequenz (I) und der Transkriptionsstartsequenz
(S) des Sendai-Virus (EIS-Sequenz) an ein Ende hinzuzufügen, werden
synthetisierte DNA-Sequenzen
(Primerpaar), nämlich
ein Paar eines Vorwärts-Primers
(Sense-Strang), umfassend einen Teil des erwünschten Gens, und eines Rückwärts-Primers
(Antisense), umfassend eine NotI-Erkennungsstelle, die E-, I- und
S-Sequenzen und ein Teil des erwünschten
Gens hergestellt.
-
Zum
Beispiel enthält
die synthetische Vorwärts-DNA-Sequenz
zwei oder mehrere Nucleotide am 5'-Terminus, um den Verdau mit NotI sicherzustellen
(vorzugsweise 4 Nucleotide, die keine Sequenz enthalten, die von
der NotI-Erkennungsstelle
stammt, wie GCG und GCC; bevorzugter ACTT). Zum 3'-Terminus der Sequenz
wird die NotI-Erkennungssequenz GCGGCCGC zugefügt. Darüber hinaus werden zum 3'-Terminus beliebige
9 Nucleotide oder jene der 9 plus die Mehrfachen von 6 als ein Spacer
zugefügt.
Darüber
hinaus wird zum 3'-Terminus
eine Sequenz von ungefähr
25 Nucleotiden, die dem ORF der erwünschten cDNA entsprechen, beginnend
vom Startcodon ATG zugefügt.
Der 3'-Terminus
der synthetischen Vorwärts-Oligo-DNA,
die ungefähr
25 Nucleotide der erwünschten
cDNA enthält,
wird vorzugsweise so ausgewählt,
dass das letzte Nucleotid G oder C ist.
-
Die
reverse synthetische DNA-Sequenz enthält zwei oder mehr Nucleotide
am 5'-Terminus (vorzugsweise
4 Nucleotide, die keine Sequenz enthalten, die von der NotI-Erkennungsstelle
stammt, wie GCG und GCC; bevorzugter ACTT). Zum 3'-Terminus der Sequenz wird die NotI-Erkennungsstelle
GCGGCCGC zugefügt.
Darüber
hinaus wird zum 3'-Terminus
eine Spacer-Oligo-DNA zugefügt,
um die Länge
des Primers anzupassen. Die Länge
der Oligo-DNA wird so gestaltet, dass sie ein Mehrfaches von 6 Nucleotiden
ist, einschließlich
der NotI-Erkennungssequenz GCGGCCGC, der Sequenz, die komplementär zu der
cDNA ist, und der EIS-Sequenz,
die vom Sendai-Virusgenom abgeleitet ist, wie nachstehend beschrieben
(sogenannte „Regel von
Sechs"; Kolakofski
D. et al., J. Virol. 1998, 72, 891–899; Calain P. und Roux L.,
J. Virol., 1993, 67, 4822–4830).
Darüber
hinaus werden zum 3'-Terminus
der zugefügten
Sequenz komplementäre
Sequenzen zu der S-Sequenz des Sendai-Virus, vorzugsweise 5'-CTTTCACCOT-3'(SEQ ID NO: 1), zu
der I-Sequenz, vorzugsweise
5'-AAG-3', und zu der E-Sequenz,
vorzugsweise 5'-TTTTTOTTACTACG-3' (SEQ ID NO: 2),
zugefügt.
Schließlich
wird zum 3'-Terminus
eine Sequenz, die so ausgewählt
wird, dass das letzte Nucleotid der komplementären Sequenz der erwünschten
cDNA G oder C wird, zugefügt,
wobei das letzte Nucleotid ungefähr
25 Nucleotide stromaufwärts
des Stopp-Codons ist. So wird der 3'-Terminus der reversen synthetischen Oligo-DNA
hergestellt.
-
Die
PCR kann durch ein übliches
Verfahren zum Beispiel unter Verwendung der ExTaq-Polymerase (TaKaRa)
durchgeführt
werden. Vorzugsweise kann die Vent-Polymerase (NEB) verwendet werden,
und das amplifizierte Fragment wird mit NotI verdaut und in die
NotI-Stelle des Plasmidvektors pBluescript inseriert. Die Nucleotidsequenz
des erhaltenen PCR-Produkts wird mit einem automatisierten DNA-Sequenziergerät überprüft, und
ein Plasmid, das die korrekte Sequenz hat, wird selektiert. Die
Insertion wird aus dem Plasmid durch einen NotI-Verdau ausgeschnitten
und in die NotI-Stelle des Plasmids, das die genomische Paramyxovirus-cDNA
umfasst, subcloniert. Alternativ können die PCR-Produkte direkt
in die NotI-Stelle ohne Verwendung des pBluescript-Plasmidvektors
cloniert werden, um eine rekombinante Sendai-Virus-cDNA zu erhalten.
-
Zum
Beispiel kann die rekombinante genomische Sendai-Virus-cDNA gemäß den Verfahren
konstruiert werden, die in der Literatur beschrieben sind (Kato,
A. et al., EMBO J. 16: 578–598,
1997; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol., 78: 2813–2820, 1997;
Yu, D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457–466; und Li, H. O. et al.,
J. Virology 74, 6564-6569, 2000). Zum Beispiel wird eine 18 bp-Spacersequenz,
enthaltend die NotI-Stelle (5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; SEQ ID NO: 3),
in einen benachbarten Genlocus einer clonierten genomischen Sendai-Virus-cDNA
(pSeV(+)) zwischen die Leadersequenz und den 5'-Terminus einer Sequenz, die das N-Protein
codiert, inseriert, und das Plasmid pSeV18+b(+),
das eine selbst-spaltbare Ribozymstelle enthält, die vom antigenomischen
Strang des Hepatitis-Delta-Virus stammt, wird erhalten (Hasan M.
K. et al., J. General Virol., 1997, 78, 2813–2820). Ein exogenes Genfragment
wird in die NotI-Stelle von pSeV18+b(+) inseriert,
um eine rekombinante Sendai-Virus-cDNA zu erhalten, in die ein erwünschtes
exogenes Gen inseriert worden ist.
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Der
rekombinante Paramyxovirus-Vektor, der wie vorstehend beschrieben
hergestellt worden ist, wird in vitro oder intrazellulär transkribiert,
und das RNP wird in der Anwesenheit der viralen L-, P- und NP-Proteine rekonstituiert,
um einen viralen Vektor zu produzieren, der das RNP umfasst. Die
vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Produzieren eines
Paramyxovirus-Vektors, der ein angiogenes Gen codiert, wobei das
Verfahren die Schritte des intrazellulären Transkribierens der DNA,
die das Paramyxovirus-Vektor-Genom codiert, in der Anwesenheit von
Proteinen, die die Transkription und Replikation des Genoms erlauben,
und Gewinnen der Paramyxovirus-Vektor-Produkte umfasst. Die Proteine,
die die Transkription und Replikation des Paramyxovirus-Vektor-Genoms
erlauben, schließen
zum Beispiel die N-, L- und P-Proteine ein. Die vorliegende Erfindung
liefert auch eine DNA zum Produzieren eines Paramyxovirus-Vektors
der vorliegenden Erfindung, wobei die DNA die vorstehend erwähnte DNA
umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung
der DNA, die das Vektorgenom codiert, zum Produzieren von Paramyxovirus-Vektoren
der vorliegenden Erfindung. Die Rekonstitution eines Virus von einer
Virusvektor-DNA kann gemäß den bekannten
Verfahren durchgeführt
werden (
WO97/16539 ;
WO97/16538 ; Durbin A. P.
et al., Virol., 1997, 235, 232–332;
Whelan S. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 8388–8392; Schnell
M. J. et al., EMBO J., 1994, 13, 4195–4203; Radecke F. et al., EMBO
J., 1995, 14, 5773–5784;
Lawson N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4477–4481; Garcin
D. et al., EMBO J., 1995, 14, 6087–6094; Kato A. et al., Genes
Cells, 1996, 1, 569–579; Baron
M. D. und Barrett T., J. Virology, 1997, 71, 1265–1271; Bridgen
A. und Elliott R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15400–15404).
Diese Verfahren. ermöglichen
die Rekonstitution von erwünschten
Paramyxovirus-Vektoren, einschließlich der Parainfluenza-Virus-,
vesikulären
Stomatitis-Virus-, Tollwut-Virus-, Masern-Virus-, Rinderpest-Virus-
und Sendai-Virusvektoren
von DNA. Wenn die F-, HN- und/oder M-Gene aus der Virusvektor-DNA deletiert sind,
werden keine infektiösen
Viruspartikel gebildet. Es ist jedoch möglich, durch Einbringen dieser
deletierten Gene und/oder von Genen, die ein Hüllprotein von einem anderen
Virus codieren, in die Wirtszellen und das Exprimieren von ihnen
infektiöse
Viruspartikel herzustellen.
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Verfahren
zum Einbringen von Vektor-DNA in Zellen können (1) ein Verfahren zum
Bilden von DNA-Präzipitaten,
die in die erwünschten
Zellen inkorporiert werden können,
(2) ein Verfahren zum Herstellen eines Komplexes, der positiv geladene
DNA umfasst, die geeignet ist, um in die erwünschten Zellen inkorporiert
zu werden, und die eine niedrige Cytotoxizität hat, und (3) ein Verfahren
zum sofortigen Öffnen
einer Pore, die groß genug
ist, dass DNA durchpassieren kann, in der erwünschten Plasmamembran unter
Verwendung eines elektrischen Pulses einschließen.
-
Eine
Vielzahl von Transfektions-Reagenzien kann in (2) verwendet werden,
zum Beispiel einschließlich
DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE und
DOSPER (Boehringer #1811169). Für
(1) kann eine Transfektion unter Verwendung von Calciumphosphat
verwendet werden. In diesem Verfahren wird die DNA, die durch Zellen
inkorporiert wurde, in phagocytische Vesikel aufgenommen, aber es
ist bekannt, dass eine ausreichende Menge der DNA auch in den Kern
aufgenommen wird (Graham F. L. und van Der Eb J., Virology, 1973,
52, 456; Wigler M. und Silverstein S., Cell, 1977, 11, 223). Chen
und Okayama untersuchten die Optimierung der Transfertechnologie
und berichteten, (1) dass die maximale Wirksamkeit erhalten wird,
wenn die Zellen und Präzipitate
bei 2% bis 4% CO2 bei 35°C für 15 h bis 24 h inkubiert werden,
(2) dass eine zirkuläre
DNA eine höhere
Aktivität
aufweist als lineare DNA und (3) dass die optimalen Präzipitate
gebildet werden, wenn die DNA-Konzentration in der gemischten Lösung 20 μg/ml bis
30 μg/ml
ist (Chen C. und Okayama H., Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 2745). Das
Verfahren von (2) ist für
eine transitorische Transfektion geeignet. Klassischer ist ein Transfektionsverfahren,
in dem DEAE-Dextran (Sigma #D-9885 M. W. 5 × 105)
mit der DNA in einer erwünschten
Konzentration gemischt wird, bekannt. Weil die meisten Komplexe
im Endosom abgebaut werden, kann Chloroquin zugefügt werden,
um die Transfektionswirksamkeit zu verstärken (Calos, M. P., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). Das Verfahren von (3), genannt
Elektroporation, kann weitreichender angewendet werden als die Verfahren
von (1) und (2), weil es für
jede Art von Zellen verwendet werden kann. Die Transfektionswirksamkeit
kann durch Optimieren der Dauer der Puls-Ströme, der Form des Pulses, der
Stärke
des elektrischen Felds (Abstand zwischen den Elektroden und Spannung),
der Leitfähigkeit
des Puffers, der DNA-Konzentration und der Zelldichte maximiert
werden.
-
In
der vorliegenden Erfindung werden die Transfektions-Reagenzien geeignet
verwendet, weil unter den obigen drei Verfahren das Verfahren von
(2) leicht durchzuführen
ist und das Testen einer großen
Anzahl von Proben unter Verwendung einer großen Anzahl von Zellen ermöglicht.
Bevorzugte Transfektions-Reagenzien
schließen
das Superfect-Transfektionsreagenz (QIAGEN, Kat. Nr. 301305) und
das liposomale DOSPER-Transfektionsreagenz (Boehringer Mannheim,
Kat. Nr. 1811169) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Genau
wird die Rekonstitution von cDNA wie folgt durchgeführt.
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LLC-MK2,
eine Zelllinie, die von einer Affenniere abgeleitet wurde, wird
in einer Plastikplatte mit 24 Vertiefungen bis 6 Vertiefungen oder
in einer 100 mm-Petrischale
in Minimum-Essential-Medium (MEM), enthaltend 10% fötales Kälberserum
(FCS) und ein Antibiotikum (100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin)
gezüchtet,
bis zu 70% bis 80% Konfluenz. Die Zellen werden dann zum Beispiel
bei 2 pfu/Zelle mit rekombinantem Vaccinia-Virus vTF7-3, das die
T7-Polymerase exprimiert und das durch eine 20 Minuten-UV-Bestrahlung
in der Anwesenheit von 1 μg/ml
Psoralen inaktiviert worden ist, infiziert (Fuerst T. R. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8122–8126; und Kato, A. et al.,
Genes Cells, 1996, 1, 569–579).
Die Menge an Psoralen und die Dauer der UV-Bestrahlung kann optimiert
werden. Eine Stunde nach der Infektion werden die Zellen zum Beispiel
durch Lipofektion unter Verwendung von Superfect (QIAGEN) mit 2 μg bis 60 μg oder bevorzugter
3 μg bis
5 μg der
obigen rekombinanten Sendai-Virus-cDNA zusammen mit Expressionsplasmiden
für Virusproteine
(24-0,5 μg
pGEM-N, 12-0,25 μg
pGEM-P und 24-0,5 μg
pGEM-L oder bevorzugter 1 μg
pGEM-N, 0,5 μg
pGEM-P und 1 μg
pGEM-L) (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579), die
in trans wirken und zum Produzieren eines Volllängen-Sendai-Virusgenoms benötigt werden,
transfiziert. Die transfizierten Zellen werden in serumfreiem MEM,
enthaltend, wenn gewünscht,
100 μg/ml
Rifampicin (Sigma) und Cytosin-Arabinosid (AraC) (Sigma), bevorzugter
40 μg/ml
Arabinosid alleine, gezüchtet,
so dass die Arzneistoffkonzentration angepasst wird, dass sie optimal
ist, um die Cytotoxizität
des Vaccinia-Virus zu minimieren und die Gewinnung des Virus zu
maximieren (Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579). Die
Zellen werden für
48 h bis 72 h nach der Transfektion gezüchtet, dann gewonnen und durch
drei Zyklen von Einfrieren-Auftauen lysiert. Die Zelllysate werden
in LLC-MK2-Zellen transfiziert, und nach einer 3 Tage- bis 7 Tage-Kultur
wird das Kulturmedium gewonnen. Um einen Virusvektor zu rekonstituieren,
dem ein Gen fehlt, das ein Hüllprotein
codiert, der zur Replikation unfähig
ist, kann der Vektor in LLC-MK2-Zellen transfiziert werden, die
ein Hüllprotein
exprimieren oder die mit einem Expressionsplasmid für das Hüllprotein
co-transfiziert wurden. Alternativ können die transfizierten Zellen überschichtet
und auf LLC-MK2-Zellen kultiviert werden, die das Hüllprotein
exprimieren, um einen Deletions-Virusvektor zu vermehren (siehe
Internationale Veröffentlichungen
Nr.
WO 00/70055 und
WO 00/70070 ). Der Virustiter
des Kulturmediums kann durch Messen der Hämagglutinin-Aktivität (HA) bestimmt
werden. Die HA kann durch eine „Endpunkt-Verdünnung" bestimmt werden
(Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569–579; Yonemitsu Y. und Kaneda
Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery
to vascular cells., Molecular Biology of Vascular Diseases. Methods in
Molecular Medicine, Hrsg. Baker A. H., Humana Press, 1999, 295–306). Um
die mögliche
Kontamination des Vaccinia-Virus
vTF7-3 zu eliminieren, kann die erhaltene Allantoisflüssigkeit-Probe
geeignet (10
6-mal zum Beispiel) verdünnt und
in Hühnereiern
re-amplifiziert werden. Die Re-Amplifizierung
kann zum Beispiel dreimal oder öfter
wiederholt werden. Der erhaltene Virus-Bestand kann bei –80°C gelagert
werden.
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Die
Wirtszellen für
die virale Rekonstitution sind nicht auf irgendwelche besonderen
Typen von Zellen beschränkt,
solange der Virusvektor in den Zellen rekonstituiert werden kann.
Die Wirtszellen können
Affennieren-abgeleitete Zellen wie LLC-MK2-Zellen und CV-1-Zellen,
kultivierte Zelllinien wie BHK-Zellen, die von einer Hamsterniere
abgleitet wurden, und von Menschen abgeleitete Zellen einschließen. Darüber hinaus,
um eine große
Menge des Sendai-Virusvektors zu erhalten, können embryonierte Hühnereier
mit Virusvektoren, die von den obigen Wirtszellen erhalten wurden,
infiziert werden, und die Vektoren können amplifiziert werden. Das
Verfahren des Produzierens von Virusvektoren unter Verwendung von
Hühnereiern
ist etabliert worden (Advanced protocols in neuroscience study III,
Molecular physiology in neuroscience., Hrsg. Nakanishi et al., Kouseisha,
Osaka, 1993, 153–172).
Genau werden zum Beispiel befruchtete Eier für 9 Tage bis 12 Tage bei 37°C bis 38°C in einem
Brutschrank inkubiert, um die Embryonen zu züchten. Die Virusvektoren werden
in die Allantoishöhle
beimpft, und die Eier werden weiter für einige Tage inkubiert, um
die Vektoren zu vermehren. Die Bedingungen wie die Dauer der Inkubation
können
in Abhängigkeit
des Typs des verwendeten rekombinanten Sendai-Virus variieren. Dann
werden die Allantoisflüssigkeiten,
die die Viren enthalten, gewonnen. Der Sendai-Virus-Vektor wird
abgetrennt und aus der Allantoisflüssigkeit-Probe gemäß dem Standardverfahren gereinigt
(Tashiro M., Protocols in virus experiments., Hrsg. Nagai und Ishihama,
MEDICAL VIEW, 1995, 68–73).
Darüber
hinaus werden Trypsin-resistente Zellen (zum Beispiel Zellen wie
LLC-MK2) für
die Massenproduktion von F-Gen-defizientem Sendai-Virus bevorzugt.
-
Die
Konstruktion und die Herstellung von Sendai-Virusvektoren, denen
das F-Gen fehlt,
kann zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden (siehe
WO 00/770055 ) und
WO00/70070 ).
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1. Konstruktion von cDNA, die das F-Gen-defiziente
Sendai-Virusgenom codiert, für
das Clonieren von endogenen Genen.
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Genomische
Volllängen-Sendai-Virus
(SeV)-cDNA, pSeV18+b(+) (Hasan M. K. et
al., J. Gen. Virol. 78, 2813–2820,
1997) („ pSeV18+b(+)" wird
auch als „pSeV18+" bezeichnet) wird
mit SphI/KpnI verdaut, und das verdaute Fragment (14673 bp) wird
gewonnen. Das Fragment wird in pUC18 subcloniert, um das Plasmid pUC18/KS
zu erhalten. Die Konstruktion der F-Gen-defizienten Region wird
unter Verwendung von pUC18/KS mit einer Kombination von PCR und
Ligierungs-Techniken durchgeführt.
Die genomische F-Gen-defiziente SeV-cDNA (pSeV18+/ΔF) wird durch
Entfernen des F-Gen-ORF (ATG-TGA= 1698 bp) und Füllen der Lücke mit atgcatgccggcagatga
(SEQ ID NO: 4) konstruiert. In der PCR werden Primerpaare, die aus
vorwärts:
5'-gttgagtactgcaagagc
(SEQ ID NO: 5) und revers: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc
(SEQ ID NO: 6) bestehen, stromaufwärts des F-Gens verwendet, und
Primerpaare, die aus vorwärts:
5'-atgcatgccggcagatga (SEQ
ID NO: 7) und revers: 5'-tggtgaatgagagaatcagc
(SEQ ID NO: 8) bestehen, werden stromabwärts des F-Gens verwendet. Die
PCR-Produkte werden dann in die EcoT22I-Stelle ligiert. Das so erhaltene
Plasmid wird mit SacI und SalI verdaut, und das Fragment (4931 bp),
das die F-Gen-defiziente Region enthält, wird in pUC18 subcloniert,
um pUC18/dFSS zu ergeben. Dieses pUC18/dFSS wird mit DraIII verdaut,
und das verdaute Fragment wird gewonnen. Das Fragment wird mit einem
F-Genenthaltenden DraIII-Fragmente von pSeV18+ ersetzt,
um das Plasmid pSeV18+/ΔF
zu konstruieren.
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Die
EIS-Sequenz (SeV-spezifische Sequenz, E, Ende; I, zwischen den Genen;
S, Start) des F-Gens bleibt im Konstrukt, und das Konstrukt kann
Polypeptide exprimieren, die aus 5 Aminosäuren bestehen, die von dem
Primer stammen, der verwendet wurde, um die Lücke zu verbinden, obwohl der
stromabwärts
liegende ORF des F-Gens entfernt ist.
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Die
Insertion von exogenen Genen in die F-Gen-defekte Region kann unter
Verwendung der Nsil- und NgoMIV-Restriktionsenzym-Stellen, die in
der F-Gendefekten Region in pUC18/dFSS liegen, erzielt werden. Um
exogene Gene in die Region zu clonieren, können zum Beispiel exogene Genfragmente
unter Verwendung eines Nsil-endenden Primers und eines NgoMIV-endenden
Primers amplifiziert werden.
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Zum
Beispiel wird das EGFP-Gen zuerst durch PCR amplifiziert, um eine
cDNA zu konstruieren, die das EGFP-Gen enthält (pSeV18+/ΔF-GFP). Um
die Zahl der Nucleotide des EGFP-Genfragments anzupassen, um ein
Mehrfaches von 6 zu enthalten (Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033–1045, 1996),
wird die PCR unter Verwendung des NsiI-endenden Primers (5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/SEQ ID
NO: 9) als der 5'-End-Primer
und des NgoMIV-endenden Primers (5'-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/SEQ
ID NO: 10) als der 3'-End-Primer
durchgeführt.
Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Nsil und NgoMIV
verdaut, und das Fragment wird von einem Gel gewonnen. Das Fragment
wird in die F-Gen-defekte Region in pUC18/dFSS unter Verwendung
der NsiI- und NgoMIV-Restriktionsenzym-Stellen subcioniert, und
die Sequenz wird bestätigt.
Das DraIII-Fragment, das das EGFP-Gen enthält, wird dann gewonnen, mit
dem F-Gen-enthaltenden DraIII-Fragment von pSeV18+ ersetzt
und ligiert, um pSeV18+/ΔF-GFP zu erhalten.
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Die
Insertion von exogenen Genen stromaufwärts des NP-Gens wird unter
Verwendung der Restriktionsenzym NotI-Erkennungsstelle, die in pSeV18+/ΔF
oder pSeV18+/ΔF-GFP liegt, erzielt. pSeV18+/ΔF
hat jedoch eine Sequenz, die ein 5 Aminosäuren-Peptid exprimieren kann,
das von dem Primer stammt, der verwendet wurde, um die F-Gen-defiziente
Region zu verbinden. Darüber
hinaus wird GFP durch pSeV18+/ΔF-GFP co-exprimiert.
Daher werden die Genkonstrukte wie folgt hergestellt, sodass die
Peptide oder GFP nicht exprimiert werden, wenn es nötig ist.
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Das
Fragment (6288 bp), das die F-Gen-defiziente Region enthält, wird
durch Verdauen von pSeV18+/ΔF-GFP mit
SalI und NheI gewonnen und in Litmus 38 (New England Biolabs, Beverly,
MA) subcloniert, um LitmusSalINhelfrg/ΔF-GFP zu erhalten. Die Deletion
des EGFP-Gens, das die EIS-Sequenz stromaufwärts des F-Gens, das deletiert worden ist, enthält, wird
durch das inverse PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR wird unter Verwendung
eines reversen Primers (5'-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/SEQ
ID NO: 11), der gestaltet ist, um die Restriktionsenzym SexAI-Erkennungssequenz
stromaufwärts
des GFP-Gens zu enthalten,
und eines Vorwärts-Primers
(5'-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/SEQ
ID NO: 12), der gestaltet ist, um die Restriktionsenzym SexAI-Erkennungssequenz
stromabwärts
des GFP-Gens zu
enthalten, durchgeführt.
Das Fragment mit der bevorzugten Größe (10855 bp) wird ausgeschnitten
und ligiert, um das EGFP-Gen zu deletieren, das die EIS-Sequenz stromaufwärts des
F-Gens, das deletiert worden ist, enthält.
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Das
resultierende Konstrukt hat aufgrund der Primer-Gestaltung eine
Extra-15 bp-Sequenz zwischen den zwei SexAI-Stellen. Daher wird
das Plasmid verwendet, um den E. coli.-SCS110-Stamm zu transformieren (der
dcm–/dam– SCS110-Stamm
wird verwendet, weil SexAI methyliert ist und nicht damit verdaut
werden kann). Das Plasmid wird mit dem Restriktionsenzym SexAI verdaut,
und zwei Genfragmente, 1628 bp und 9219 bp, werden gewonnen und
ligiert, um das Extra-15 bp-Fragment zu entfernen, das in LitmusSalINhelfrg/ΔF (Δ5aa) enthalten
ist, in dem das EGFP-Gen,
das die EIS-Sequenz stromaufwärts
des F-Gens enthält und
ein Mehrfaches von 6 Nummern an Nucleotiden aufweist, deletiert
ist. Das Plasmid wird mit SalI und NheI verdaut, und das Fragment
wird gewonnen, mit einem SalI/Nhel-Fragment ersetzt, das das F-Gen
von pSeV18+ enthält, und ligiert, um das Plasmid
pSeV18+/ΔF
(Δ5aa) zu
erhalten.
-
Die
Insertion eines exogenen Gens in das Plasmid wird zum Beispiel unter
Verwendung der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Not, das
stromaufwärts
des NP-Gens lokalisiert ist, durchgeführt.
-
2. Konstruktion einer cDNA, die das F-Gen-defiziente
Sendai-Virusgenom codiert, das das hFGF2 Gen enthält
-
Verschiedene
Verfahren für
das Erhalten von menschlicher FGF2 (hFGF2)-cDNA sind bekannt. Zum Beispiel wird
die RT-PCR durchgeführt,
um cDNA unter Verwendung von vaskulären glatten Muskelzellen, die von
der menschlichen Vena saphena magna mit dem Einverständnis eines
Patienten erhalten worden sind, zu isolieren. Die hFGF2-cDNA wird
dann durch Sub-Clonieren des amplifizierten Produkts in pBluescriptSK+ (Stratagene,
La Jolla, CA) bei HindIII (5'-Ende)
und EcoRI (3'-Ende)
hergestellt. Die hFGF2-cDNA-Sequenz kann durch Vergleichen mit jener
im Bericht von Abraham et al. (Abraham, J. A. et al., EMBO J. 5
(10), 2523–2528,
1986) bestätigt
werden.
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Um
das hFGF2-Gen an der Restriktionsenzym NotI-Stelle, die stromaufwärts des
NP-Gens lokalisiert ist, zu inserieren, kann das hFGF2-Genfragment
die SeV-spezifische
Sequenz (EIS-Sequenz) an seinem 3'-Ende und Not'-Erkennungssequenzen
an seinen beiden Enden enthalten. Genau wird die PCR unter Verwendung
der hFGF2-cDNA als eine Matrize und des N-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccg
aggatggcggcagcggcgcc/SEQ D NO: 13), der ein Start-Codon enthält, und
des C-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacat
tggaagaaaaagtatagc/SEQ ID NO: 14), der eine Stopp-Codon-Region und
die EIS-Sequenz enthält,
durchgeführt.
Das amplifizierte Fragment wird mit NotI verdaut und dann in pBluescriptSK+
(Stratagene, La Jolla, CA) subcloniert, um pBS – hFGF2 zu erhalten. Die Nucleotidsequenz
wird bestätigt,
und im Fall, dass das Gen Mutationen enthält, werden die Mutationen unter
Verwendung zum Beispiel des QuickChangeTM ortsgerichteten
Mutagenese-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß dem beigefügten Protokoll
korrigiert. Das Fragment, das die hFGF2-cDNA enthält, wird
durch Verdauen von pBS-hFGF2 mit NotI erhalten und in pSeV18+/ΔF
(Δ5aa) an
der NotI-Stelle inseriert, die stromaufwärts des NP-Gens lokalisiert
ist, um eine genomische F-Gen-defiziente Sendai-Virus-cDNA zu konstruieren,
die das hFGF2-Gen
enthält, pSeV18+ hFGF2/ΔF
(Δ5aa).
Hierin nachstehend wird pSeV18+hFGF2/ΔF (Δ5aa) auch
als pSeV18+hFGF2/ΔF angezeigt.
-
3. Konstruktion eines F-Expressionsplasmids
-
Das
Plasmid pCALNdLw (Cre//oxP-induzierbares Expressionsplasmid; Arai,
T. et al., J. Virol. 72 (2), 1115-1121, 1998), das gestaltet ist,
um die Expression von Genprodukten durch die Cre-DNA-Rekombinase zu
induzieren, kann verwendet werden, um das Sendai-Virus-F-Gen (SeV-F)
zu exprimieren. Das Fragment (1783 bp), das das SeV-F-Gen enthält, wird
durch Verdauen von pUC18/KS mit Styl und BstUI isoliert, stumpf beendet
und in pCALNdLw an einer einzigen SwaI-Stelle inseriert, um das
F-Expressionsplasmid pCALNdLw/F zu konstruieren.
-
4. Herstellung einer Helfer-Zelllinie,
die das SeV-F-Protein induzierbar exprimiert
-
Eine
Helfer-Zelllinie, die das SeV-F-Protein exprimiert, wird etabliert,
um infektiöse
Viruspartikel aus dem F-Gen-defizienten Genom zu gewinnen. Zum Beispiel
können
Zellen von LLC-MK2-Zellen, einer Affennieren-abgeleiteten Zelllinie,
die oft für
die SeV-Vermehrung verwendet wird, erhalten werden. LLC-MK2-Zellen
werden in MEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum
(FBS), 20 E/ml Natrium-Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycin, in einer
Atmosphäre,
enthaltend 5% CO2, bei 37°C kultiviert.
Das Plasmid pCALNdLw/F, das gestaltet ist, um die Expression des
F-Genprodukts durch die Cre-DNA-Rekombinase zu induzieren, wird
unter Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens mit dem Mammalian
Transfection Kit (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß den Protokollen, die Fachleuten
bekannt sind, in LLC-MK2-Zellen transferiert.
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Genau
werden 10 μg
des Plasmids pCALNdLw/F in LLC-MK2-Zellen transferiert, die zu 40%
Konfluenz in einer 10 cm Schale vermehrt werden, und dann werden
die Zellen in 10 ml MEM-Medium, enthaltend 10% FBS, in einem Brutschrank
mit einer Atmosphäre
von 5% CO2 bei 37°C für 24 Stunden kultiviert. Die
Zellen werden nach 24 Stunden von der Schale geschabt, in 10 ml
Medium suspendiert und auf fünf
10 ml-Schalen aliquotiert, sodass zum Beispiel 1 Schale 5 ml enthält, 2 Schalen
2 ml enthalten und 2 Schalen 0,2 ml der Zellsuspension enthalten.
Jede Zelle wird in 10 ml MEM-Medium, enthaltend 1200 μg/ml G418
(Gibco-BRL, Rockville, MD) und 10% FBS, für 14 Tage mit einem Mediumwechsel
alle 2 Tage kultiviert, und stabil transfizierte Zelllinien werden
selektiert. Zum Beispiel werden 30 Stämme von G418-resistenten Zellen,
die in dem Medium gezüchtet
wurden, unter Verwendung eines Clonierungsrings gewonnen. Jeder
Clon wird vermehrt, bis er in einer 10 cm-Schale konfluent wird.
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Die
Selektion von stabil transfizierten Zelllinien mit dem F-Gen wird
wie folgt ausgeführt.
Genau kann der Expressionsspiegel des F-Proteins durch Western-Blotten semi-quantitativ
analysiert werden. Die Zellen werden in 6 cm-Schalen zur Konfluenz
kultiviert und dann mit Adenovirus AxCANCre bei einer moi = 3 durch das
Verfahren von Saito et al. (Saito et al., Nucl. Acids Res. 23, 3816–3821, 1995;
Arai, T. et al., J. Virol. 72 (2), 1115–1121, 1998) infiziert, um
die Expression des F-Proteins in jedem Clon zu induzieren. Drei
Tage nach der Infektion wurde das Kulturmedium aus der Schale entfernt,
und dann wurden die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, mit
einem Schaber abgeschabt, bei 1500 × g für 5 min zentrifugiert und gewonnen. Die
Zellen werden bei –80°C gelagert
und nach dem Auftauen in 150 μl
PBS-Puffer resuspendiert. Eine gleiche Menge von 2x Tris-SDS-BME-Proben-Ladepuffer (0,625
M Tris (pH 6,8), 5% SDS, 25% 2-ME, 50% Glycerin und 0,025% BPB,
Owl Separation Systems) wird dazu zugefügt. Das Gemisch wird bei 98°C für 3 min
hitzebehandelt und dann einer Elektrophorese unterzogen. Die Proben
(1 × 105 Zellen pro Spalte) werden dann einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
gefolgt von Western-Blotten gemäß bekannten
Protokollen unterzogen. Der SeV-F-Expressionsspiegel wird durch Western-Blotten
unter Verwendung einer 1:1000-Verdünnung eines
anti-SeV-F-Antikörpers
(f236) als der primäre
Antikörper
semi-quantitativ
gemessen.
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Durch
das Verfahren, wie oben beschrieben, wird die Etablierung von LLC-MK2-Zellen, in denen
das SeV-F-Genprodukt induzierbar exprimiert werden kann, bestätigt. Hierin
nachstehend werden diese Zellen vor der Induktion der SeV-F-Genexpression als
LLC-MK2/F beschrieben, und die Zellen nach der Induktion werden
als LLC-MK2/F/Ad beschrieben.
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5. Rekonstitution und Amplifizierung eines
F-Gen-defizienten SeV
-
F-Gen-defiziente
genomische Sendai-Virus-cDNA, die ein angiogenes Gen (angiogene
Gene) enthält, kann
durch Transfizieren von Helferzellen, die das F-Gen damit exprimieren,
rekonstituiert werden. Zum Beispiel wird die F-Gen-defiziente genomische
Sendai-Virus-cDNA, die das hFGF2-Gen enthält (pSeV18
+hFGF2/ΔF), wie vorstehend
beschrieben, verwendet, um LLC-MK2-Zellen wie folgt zu transfizieren. LLC-MK2-Zellen
werden auf 10 cm-Petrischalen in einer Dichte von 5x 10
6 Zellen/Schale
ausgesät,
für 24 Stunden
inkubiert und (in einer moi = 2 bis 3, vorzugsweise 2) für eine Stunde
bei Zimmertemperatur mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das
die T7-RNA-Polymerase exprimiert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83, 8122–8126,
1986), das mit langwelligem UV (365 nm) und Solaren für 20 min
behandelt worden ist, transfiziert. Für die UV-Bestrahlung des Vaccinia-Virus
wird zum Beispiel der UV Stratalinker 2400 (Katalog-Nr. 400676 (100
V), Stratagene, La Jolla, CA, USA) verwendet, der mit fünf 15 Watt-Lampen
ausgestattet ist. Die Zellen werden zweimal gewaschen, und die Plasmide
pSeV18
+hFGF2/ΔF, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L (Kato,
A., et al., Genes Cells 1, 569–579,
1996) und pGEM/F-HN (
WO 00/70070 )
werden in OptiMEM (GIBCO) in Verhältnissen von 12 μg, 4 μg, 2 μg, 4 μg beziehungsweise
4 μg/Schale
resuspendiert und mit SuperFect-Transfektionsreagenz (1 μg DNA/5 μl Superfect,
QIAGEN) gemischt. Die Gemische werden bei Zimmertemperatur für 15 min
stehengelassen und dann zu 3 ml OptiMEM, enthaltend 3% FBS, zugefügt. Das
resultierende Gemisch wird zu den Zellen zugefügt und für 3 bis 5 Stunden inkubiert.
Die Zellen werden dann zweimal mit serumfreiem MEM gewaschen und
in serumfreiem MEM, enthaltend 40 μg/ml Cytosin-ß-D-Arabinofuranosid
(AraC, Sigma) und 7,5 μg/ml
Trypsin (GIBCO) für
24 Stunden inkubiert.
-
Das
Kulturmedium wird von der Zellkultur entfernt, und Helferzellen,
die das F-Gen exprimieren, LLC-MK2/F/Ad-Zellen,
die, wie vorstehend beschrieben, konstruiert worden sind, werden
auf die Zellen geschichtet. Genau werden LLC-MK2/F/Ad-Zellen in serumfreiem
MEM (enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml Trypsin)
resuspendiert, auf die Zellen ohne Kulturmedium überschichtet und dann für 48 Stunden
inkubiert. Die Zellen werden unter Verwendung eines Schabers gewonnen,
und die Pellets werden in OptiMEM (107 Zellen/ml)
resuspendiert und dreimal eingefroren und aufgetaut. Die Lysate
werden zu den LLC-MK2/F/Ad-Zellen (4 × 106 Zellen/Vertiefung
in einer Platte mit 12 Vertiefungen) zugefügt (200 μl/Vertiefung), und zusätzliche
300 μl/Vertiefung
serumfreies MEM (enthaltend 40 μg/ml
AraC, 7,5 μg/ml
Trypsin) werden zu jeder Vertiefung zugefügt und dann für 15 Stunden
bis 24 Stunden inkubiert. Das Kulturmedium wird entfernt, und die
Zellen werden mit serumfreiem MEM gewaschen und mit frischem serumfreiem
MEM (enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml
Trypsin) ersetzt. Die Zellen werden für 5 Tage bis 9 Tage inkubiert,
und das Kulturmedium wird gewonnen. Das gewonnene Medium enthält rekonstituierte
F-Gen-defiziente SeV-Partikel. Die F-Gen-defizienten SeV-Partikel
können
durch Infizieren in LLC-MK2/F/Ad-Zellen und Kultivieren (oder Wiederholen
des Vorgangs) der Zellen in serumfreiem MEM (enthalten 40 μg/ml AraC
und 7,5 μg/ml
Trypsin) amplifiziert werden.
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Zu
dieser Zeit wird eine Kontamination des rekombinanten Vaccinia-Virus,
das verwendet wird, um die T7-RNA-Polymerase während der Rekonstitution zu
exprimieren, großteils
durch zweimaliges Filtern des Kulturmediums, enthaltend die F-Gen-defizienten
SeV-Partikel, mit einem 0,22 μm-Filter
verhindert. Genau wird die Kultur (post-P2-Proben), die zweimal
oder öfter
in serumfreiem MEM, enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml AraC
und 7,5 μg/ml
Trypsin), amplifiziert wurde, zweimal mit einem 0,22 μm-Filter
gefiltert, und die Kultur wird weiter einmal in serumfreiem MEM,
enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml
Trypsin), amplifiziert, um amplifiziertes F-Gen-defizientes SeV
zu erhalten, das als SeV dienen kann, das frei von einer rekombinanten
Vaccinia-Virus-Kontamination ist.
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Beim
Herstellen von Deletions-Virusvektoren können zwei verschiedene Virusvektoren,
die eine Deletion eines anderen Hüllgens im Genom aufweisen,
in dieselbe Zelle transfiziert werden. In diesem Fall wird jedes
deletierte Hüllprotein
durch die Expression vom anderen Vektor bereitgestellt, und diese
gegenseitige Komplementierung erlaubt die Herstellung von infektiösen Viruspartikeln,
die sich replizieren und vermehren können. Daher können zwei
oder mehrere Virusvektoren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig
in einer Kombination beimpft werden, die sich gegenseitig komplementieren,
wodurch ein Gemisch von jedem Hüllen-Deletions-Virusvektor zu niedrigen
Kosten und in einer großen
Menge produziert wird. Weil diese Viren, denen ein Hüllgen fehlt,
ein kleineres Genom haben, können
sie die Insertion eines langen exogenen Gens ermöglichen. Zusätzlich ist
es für
diese Viren, die intrinsisch nicht infektiös sind, schwierig, den Status
einer Co-Infektion beizubehalten, nachdem sie außerhalb der Zellen verdünnt worden
sind, und sie werden so sterilisiert und weniger schädlich für die Umwelt.
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Sobald
ein viraler Vektor unter Verwendung eines Gens für die Behandlung einer Krankheit
als das exogene Gen hergestellt ist, dann kann der Vektor verabreicht
werden, um eine Gentherapie durchzuführen. Wenn der virale Vektor
der vorliegenden Erfindung in einer Gentherapie verwendet wird,
kann ein exogenes Gen, das erwünschte
therapeutische Wirkungen zusichert, oder ein endogenes Gen, dessen
Expression im Körper
eines Patienten beeinträchtigt
ist, entweder durch ein Verfahren der direkten Verabreichung oder
durch ein Verfahren der indirekten (ex vivo) Verabreichung für die Genexpression
exprimiert werden. Es gibt keine Einschränkung für den Typ des exogenen Gens,
so lange es ein angiogenes Gen ist oder die Angiogenese fördert, einschließlich nicht
nur einer Nucleinsäure,
die ein Protein codiert, sondern auch einer Nucleinsäure, die
kein Protein codiert, zum Beispiel eines Ribozyms oder einer Antisense-Nucleinsäure eines
Gens, das die Angiogenese unterdrückt.
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Das
gewonnene Paramyxovirus kann gereinigt werden, um im Wesentlichen
rein zu sein. Die Reinigung kann durch ein bekanntes Reinigungs-/Separierungsverfahren
wie Filtration, Zentrifugation und Säulen-Reinigung oder die Kombination
davon durchgeführt
werden. Der Begriff „im
Wesentlichen rein" bedeutet, dass
ein Virus in einer Probe, wo es als ein Bestandteil vorhanden ist,
den Hauptteil umfasst. Typischerweise kann ein im Wesentlichen reiner
Virusvektor in einer Probe bestätigt
werden, wenn das Protein, das vom Virusvektor stammt, 50% oder mehr,
vorzugsweise 70% oder mehr, bevorzugter 80% oder mehr, noch mehr
bevorzugt 90% oder mehr der Gesamtproteine in der Probe einnimmt.
Beispielhafte Reinigungsverfahren, die für Paramyxovirus spezifisch
sind, schließen
Verfahren unter Verwendung von Cellulose-Schwefelsäureester oder
vernetztem Polysaccharid-Schwefelsäureester (geprüfte veröffentlichte
japanische Patentanmeldung Nr. (
JP-B) Sho 62-30752 ;
JP-B Sho 62-33879 ; und
JP-B Sho 62-30753 ) und
Verfahren ein, die das Ermöglichen eines
Polysaccharids, das Fucose-Schwefelsäure und/oder
sein Abbauprodukt umfasst, umfassen (
WO 97/32010 ).
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Der
Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung kann als eine Zusammensetzung
zusammen mit einem erwünschten,
pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoff
oder Medium hergestellt werden. Ein „pharmazeutisch verträglicher
Trägerstoff", wie hierin definiert,
bezeichnet jene Materialien, die mit einem Vektor verabreicht werden
können
und den Gentransfer, der durch den Vektor erreicht wird, nicht signifikant
inhibieren. Zum Beispiel kann der Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung geeignet
mit einem Medium wie Kochsalzlösung
und phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) verdünnt
werden, um eine Zusammensetzung herzustellen. Wenn der Paramyxovirus-Vektor
der Erfindung in Hühnereiern
vermehrt wird, kann die Zusammensetzung Allantoisflüssigkeiten
enthalten. Zusätzlich
kann die Zusammensetzung Medien wie deionisiertes Wasser oder eine
wässrige
5%-Dextrose-Lösung
enthalten. Sie kann weiterhin Stabilisierer, Antibiotika und dergleichen
enthalten. Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Produzieren
von angiogenen Zusammensetzungen in der vorliegenden Erfindung,
die den Schritt des Mischens des Vektors der vorliegenden Erfindung
mit den pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoffen
umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung der
Vektoren der vorliegenden Erfindung zum Produzieren der angiogenen
Zusammensetzungen in der vorliegenden Erfindung.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich als
Arzneimittel. Die vorliegenden Erfindung betrifft Ischämie-therapeutische
Präparate,
einschließlich
die Vektoren in der vorliegenden Erfindung und pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe.
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch die Verwendung der Vektoren
und der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutika.
Ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)-Gen, das durch Paramyxovirus-Vektoren
getragen wird, kann durch Verabreichen der Paramyxovirus-Vektoren,
die, wie vorstehend beschrieben, konstruiert worden sind, oder der Zusammensetzungen,
die die Vektoren enthalten, transferiert werden. Die vorliegende
Erfindung liefert ein Verfahren zum Induzieren der Angiogenese,
das den Schritt des Verabreichens der Paramyxovirus-Vektoren der
vorliegenden Erfindung oder der angiogenen Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung umfasst. Das Verfahren ist besonders nützlich,
um ischämische
Gewebe zu behandeln. Obwohl es keine Einschränkung im Bezug auf die Stellen
der Verabreichung gibt, ist die lokale Verabreichung des Transgens
direkt in ischämische
Gewebe oder ihre umgebenden Gebiete bevorzugt, sodass die Expressionsprodukte
in den ischämischen
Geweben konzentriert sind und vom Auslaufen in das Kreislaufsystem
abgehalten werden. Alternativ wird es bevorzugt, das Transgen lokal
unter Verwendung von korrekten Gen-Abgabesystemen in den Zielgewebs-Gebieten
zu exprimieren. Zum Beispiel kann eine Gen-Abgabe durch Verabreichung
von Paramyxovirus-Vektor-enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung von innerhalb oder außerhalb
der ischämischen
Gewebe in vivo erreicht werden, um exogene Gene in den ischämischen
Geweben zu exprimieren. Zusätzlich
kann sie durch eine ex vivo-Verabreichung erreicht werden. Zum Beispiel
können
Zellen, die mit Paramyxovirus-Vektoren, die angiogene Gene codieren,
transfiziert wurden, in ischämische
Gewebegebiete injiziert oder in Arterien, die durch die ischämischen
Gewebe fließen,
infundiert werden.
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Darüber hinaus
kann die lokale Verabreichung unter Verwendung eines Katheters ausgewählt werden. Zum
Beispiel können
die Vektoren der vorliegenden Erfindung durch das Doppelballon-Katheter-Verfahren,
in dem die Vektor-Zusammensetzungen
in das Gebiet infundiert werden, in dem das Blutgefäß durch
zwei Ballons getrennt ist, oder durch das Verabreichungsverfahren
unter Verwendung eines porösen
Ballons (Jorgensen, B. et al., Lancet 1 (8647): 1106–8, 1989;
Wolinsky, H. und Thung, S. N., J. Am Coll. Cardiol. 15 (2): 475–81, 1990;
WO 93/00051 ;
WO 93/00052 ) verabreicht werden.
Hydrogel-beschichtete Ballons können
auch verwendet werden, wie vorstehend beschrieben (Takeshita, S.
et al., Lab. Invest. 75 (4): 487–501, 1996).
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Zum
Beispiel können
die Vektor-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch die
Ventrikel-Höhle
unter Verwendung eines Katheters direkt in das Myokard infundiert
werden, um zum Beispiel einen Herzinfarkt, Angina oder andere ischämische Herzkrankheiten
zu behandeln. Darüber
hinaus kann die Angiogenese und die Entwicklung eines kollateralen
Kreislaufs in dem Gebiet einer Stenose in der Coronararterie durch
lokale Infusion der Vektoren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
eines Katheters gefördert werden.
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Die
Verwendung eines Katheters, um die Vektoren zu verabreichen, erfordert
jedoch einen relativ langen Zeitraum der Inkubation und kann durch
den Ballon eine vaskuläre
Verletzung verursachen. Darüber
hinaus ist es oft schwierig, einen Katheter in diffuse Blutgefäße in ischämischen
Geweben einzuführen.
Die intramuskuläre
(IM) Verabreichung der Vektoren wird für die Behandlung von ischämischen
Geweben in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Die intramuskuläre Verabreichung
ist leichter als die Verabreichung unter Verwendung eines Katheters,
und das Risiko des Schädigens
eines Blutgefäßes ist
gering. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung werden zum Beispiel
in ischämische
Gewebe oder quergestreifte Muskeln, die die ischämischen Gewebe umgeben, verabreicht.
Quergestreifte Muskeln schließen
die Skelett- und Herzmuskeln ein. Bupivacain, von dem bekannt ist,
dass es die Expression von Transgenen durch Induzieren der Regenerierung
von Muskeln fördert,
kann vor der Verabreichung der Virusvektoren verabreicht werden.
Darüber
hinaus kann auch die intradermale (ID) Verabreichung ausgewählt werden.
Die Vektoren können
zum Beispiel in Muskeln subkutan oder direkt durch eine Hautinzision
transferiert werden. Es ist notwendig, vorsichtig zu sein, um nicht
während
des Vektortransfers eine Faszie zu schädigen. Zum Beispiel kann die
Verabreichung unter Verwendung von Nadeln und Spritzen oder eines
Bio-Injektors, der
nicht die Verwendung von Nadeln erfordert, durchgeführt werden.
Die Verabreichung kann entweder an einer einzigen Stelle oder an
mehreren Stellen durchgeführt
werden. Darüber
hinaus kann die Verabreichung entweder einmal oder mehrere Male
durchgeführt
werden.
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Die
Vektoren der vorliegenden Erfindung können wirksam in der Form einer
Matrix verabreicht werden. Ein beispielhaftes Verfahren kann durch
Dispergieren der Virusvektoren in einer Aterocollagen-Matrix und
Verfestigen des resultierenden Gemischs durch Gefriertrocknung durchgeführt werden,
wodurch die Matrix stufenweise abgebaut werden kann. Es ist berichtet
worden, dass die Verwendung dieses Verfahrens für andauernde Wirkungen von
Adenovirus-Vektoren, die für
ihre transitorische Genexpression bekannt sind, und von nackter
DNA nützlich
ist (Ochida, T. et al., Nature Medicine 5, 707–710, 1999). Die Virusvektoren
der vorliegenden Erfindung können
mit diesen Hilfsmitteln formuliert werden und können gefriergetrocknet werden.
Darüber
hinaus kann ein Lipid-Kation zugefügt werden, um die Expressionswirkung
zu erhöhen.
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Es
ist bekannt, dass sogar eine kleine verabreichende Matrix Proteine
wie Wachstumsfaktoren über einen
langen Zeitraum durch Nadeln mit der geeigneten Größe von 18
Gauge stufenweise freisetzten kann. Zum Beispiel hält im Fall,
der Verabreichung von Protein-Präparaten
die Wirksamkeit der Präparate
wie eines Wachstumshormons länger
an, zum Beispiel 7 Tage oder länger,
als wenn Präparate
wie ein Wachstumshormon alleine verabreicht werden. Es gibt einen
Bericht, dass die Wirksamkeit normalerweise 10 Tage oder länger anhalten
kann (ungeprüfte
veröffentlichte
japanische Patent-Anmeldung Nr. (
JP-A) Hei 10-001440 ). Dieses Verfahren ermöglicht es
daher, die Zahl der Verabreichungen und das Ausmaß das Schmerzes,
der durch Patienten erlitten wird, signifikant zu verringern. Die
Präparate
können
zum Beispiel als feste Injektionen (wie Implantate), die subcutan
und intramuskulär
verabreicht werden, und muköse
Membran-Absorptionsmittel wie Suppositorien verwendet werden. Die
Formen der festen Präparate
für die
Injektion sind oft partikel- oder stabförmig, was durch Injektionsnadeln
verabreicht werden kann. Partikelformen wie eine Kugelform und Stabformen
wie quadratische und zylindrische Formen sind bevorzugte Formen
für das
Präparat.
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Die
Größe der parenteralen
Formulierung der vorliegenden Erfindung kann abhängig von der Art der Verabreichung
gewählt
werden, und jede Größe ist geeignet,
so lange sie keinen übermäßigen Schmerz
für Patienten
verursacht. Wenn die Injektion aus einer stabförmigen Matrix von zum Beispiel
3 mm oder weniger (zum Beispiel 0,1 mm bis 3 mm) im Durchmesser
und 30 mm oder weniger (zum Beispiel 0,5 mm bis 30 mm) Länge, vorzugsweise
1,3 mm oder weniger (zum Beispiel 0,1 mm bis 1,2 mm) im Durchmesser
und 20 mm oder weniger (zum Beispiel 0,5 mm bis 20 mm) Länge besteht,
was mit einer Injektionsnadel von 14 Gauge oder kleiner und bevorzugter
jener von 0,1 mm bis 1 mm Durchmesser und etwa 1 mm bis 20 mm Länge verabreicht
werden kann. Die Matrix ist vorzugsweise zylindrisch. Darüber hinaus,
wenn die Injektion eine partikelförmige Matrix enthält, muss
der Matrixdurchmesser 1 mm oder weniger (zum Beispiel etwa 0,1 μm bis 1 mm),
vorzugsweise 150 μm
oder weniger (zum Beispiel etwa 0,5 μm bis 100 μm), mehr bevorzugt etwa 1 μm bis 100 μm sein. Darüber hinaus
kann das Gewicht der Matrix abhängig
von der Form des Präparats
ausgewählt
werden, und für
die Injektion sind die Gewichte oft 40 mg oder weniger, vorzugsweise
1 mg bis 25 mg.
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Die
Gene, die durch den Paramyxovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung
transferiert werden und, wie oben beschrieben, FGF2 (bFGF) codieren,
fördern
die Angiogenese und/oder die Vaskularisation. Diese Proteine schließen jedes
Mitglied und jede Isoform ein, das/die zu der Familie gehört. Es wird
zum Beispiel erwartet, dass FGF2 für die akute Ischämie-Therapie
anwendbar ist. Zum Beispiel kann eine signifikante therapeutische
Wirkung für
akut kritische ischämische
Extremitäten
erwartet werden. Darüber
hinaus zeigt FGF2 eine therapeutische Wirkung für einen Herzinfarkt (Yanagisawa-Miwa,
A. et al., Science 257 (5075): 1401–3, 1992). Die Proteine können ein
sekretorisches Protein, ein Membranprotein, ein cytoplasmatisches
Protein oder ein nukleäres
Protein sein. Vorzugsweise wird ein sekretorisches Protein verwendet.
Darüber
hinaus können
Proteine künstlich
synthetisiert werden. Beispiele von künstlich synthetisierten Proteinen
sind Fusionsproteine mit andere Proteinen, dominant-negative Proteine
(einschließlich
lösliche
Moleküle
von Rezeptoren oder Membran-bindende dominant negative Rezeptoren),
defiziente Formen von Zelladhäsions-Molekülen und
Zelloberflächen-Moleküle. Darüber hinaus
können
Proteine, die an sekretorische Signale, Membran-Lokalisierungssignale, nukleäre Importsignale
und dergleichen angeheftet sind, verwendet werden. Die Transgene
können
endogen induziert werden, um in ischämischen Geweben exprimiert
zu werden. Es ist auch möglich,
dass ihre Expressionen nicht induziert werden, sondern an verschiedenen
Stellen exprimiert werden können.
Darüber
hinaus kann die Funktion der unerwünschten Gene, die in ischämischen
Geweben exprimiert werden, durch die Expression von Antisense-RNA-Molekülen oder
RNA-spaltenden Ribozymen unterdrückt
werden.
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Es
wird erwartet, dass die Vektoren der vorliegenden Erfindung für die Gentherapie
anwendbar sind, um verschiedene ischämische Krankheiten sowie Krankheiten,
die durch eine Angiogenese behandelbar sind, zu behandeln. Solch
eine Gentherapie schließt
zum Beispiel die Behandlung einer Ischämie, die durch Gefäßzerreißung verursacht
wird, eines Infarkts und einer Hämostase
aufgrund einer vaskulären
Dissoziation ein. Die ischämischen
Krankheiten, die durch die Vektoren der vorliegenden Erfindung behandelbar
sind, sind zum Beispiel eine cerebrovaskuläre Ischämie, eine Nierenischämie, eine
Lungenischämie,
eine Extremitäten-Ischämie, eine
ischämische
Cardiomyopathie und eine Myokard-Ischämie. Gewebe,
die für
die Gentherapie anwendbar sind, sind nicht besonders limitiert,
und zum Beispiel können
Muskeln, Gehirne, Nieren und Lungen verwendet werden. Darüber hinaus
ist er für
das Fördern
der Angiogenese in Transplantaten wirksam. Darüber hinaus ist er für das Konstruieren
von verschiedenen Krankheitsmodellen und für die Entwicklung oder Bewertung
von Behandlungsverfahren in Krankheitsmodellen nützlich.
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Eine
beschleunigte Angiogenese durch die Vektor-Verabreichung kann zum
Beispiel durch Messen der Dichte und Analysieren der Zahl von Kapillargefäßen in Biopsieproben
und Bilder von einer Angiographie bestätigt werden. Darüber hinaus
kann sie auch durch eine Blutfluss-Analyse unter Verwendung der
Doppler-Perfusions-Bildanalyse
bestätigt
werden. Die Behandlungswirkung auf ischämische Gewebe wird durch makroskopische
Beobachtung der Gewebenekrose oder der Gewebeamputation und die
mikroskopische Beobachtung der Gewebeproben bestätigt.
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Die
Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung werden in Zielgewebe
in pharmazeutisch wirksamen Dosen verabreicht, und so werden die
Vektoren in die Zellen der Zielgewebe transferiert. Eine „pharmazeutisch
wirksame Dosis" bedeutet
eine Menge von Genen, die in die Zellen der Zielgewebe eingebracht
werden soll, die zumindest teilweise die bevorzugte Behandlungswirkung
oder eine Krankheits-Verhinderungswirkung erreicht. qAngiogene Faktoren
werden von den Zellen produziert, an die die Vektoren durch Verabreichen
einer wirksamen Dosis der Paramyxovirus-Vektoren der vorliegenden Erfindung,
die die erwünschten
angiogenen Gene enthalten, transferiert werden. Vorzugsweise werden
signifikante Spiegel der angiogenen Faktoren in den Geweben nachgewiesen,
wo die wirksame Dosis der Vektoren der vorliegenden Erfindung, die
die erwünschten
angiogenen Gene enthalten, verabreicht wird. Der Begriff „signifikanter
Spiegel" zeigt an,
dass die Menge der Expression (Menge der Transkriptions- und Translationsprodukte)
der Gene, die durch die Vektoren der vorliegenden Erfindung transferiert
wurden, nachweisbar ist. Zum Beispiel weist sie darauf hin, dass
der maximale Expressionsspiegel des transferierten Gens im Vergleich
zum Expressionsspiegel des endogenen Gens signifikant verstärkt ist,
wenn ein endogenes Gen, das dem Transgen entspricht, vorhanden ist.
Vorzugsweise ist der Expressionsspiegel der angiogenen Gene an der
Stelle der Verabreichung 1,2-mal oder mehr größer als der Expressionsspiegel
des endogenen Gens, vorzugsweise 1,5-mal oder mehr, bevorzugter
2-mal oder mehr, noch mehr bevorzugt 10-mal oder mehr und am meisten
bevorzugt 20-mal oder mehr. Der Expressionsspiegel des Transgens
sollte jedoch durch Abwägen
der wirksamen Expressionsdosis und der toxischen Spiegel entschieden
werden.
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Der
Expressionsspiegel der Transgene in den Zellen kann durch Verfahren
getestet werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Die Transkriptionsprodukte
der Gene können
nachgewiesen und durch die Verfahren wie Northern-Hybridisierung,
RT-PCR und RNA-Protektionstest quantifiziert werden. Ein in situ-Nachweis
kann durch Verfahren wie Northern-Hybridisierung und RT-PCR durchgeführt werden.
Western-Blotten, Immunpräzipitierung,
RIA, ELISA, Pull-down-Tests und dergleichen unter Verwendung von
Antikörpern
können
durchgeführt
werden, um Translationsprodukte nachzuweisen. Darüber hinaus,
um den Nachweis der Expressionsprodukte des Transgens leichter zu
machen, können
Tags an das exprimierte Protein angeheftet werden oder Reportergene
können
inseriert werden, sodass die Reportergene exprimiert werden. Beispiele
von Reportergenen schließen
ohne Einschränkung
die β-Galactosidase-,
Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-, alkalische Phosphatase-
und die grün-fluoreszierendes
Protein (GFP)-Gene ein.
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Eine
Dosis des Vektors kann abhängig
von der Krankheit, dem Körpergewicht,
dem Alter, dem Geschlecht, dem Symptom, dem Zweck der Verabreichung,
dem Transgen und dergleichen variieren, aber sie kann durch Fachleute
passend bestimmt werden. Die Dosis des Vektors kann vorzugsweise
im Bereich von etwa 105 Zell-infektiösen Einheiten
(CIU)/ml bis etwa 1011 CIU/mi und bevorzugter
etwa 107 CIU/ml bis etwa 109 CIU/ml
aber am meisten bevorzugt etwa 1 × 108 CIU/ml
bis etwa 5 × 108 CIU/ml mit pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoffen
sein. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die das Virus
umfasst, kann an Patienten, einschließlich alle Säuger-Tiere,
einschließlich
Menschen, Affen, Mäuse,
Ratten, Kaninchen, Schafe, Rinder und Hunde verabreicht werden.
-
Die
Dosis für
Menschen liegt vorzugsweise im Bereich von 2 × 108 CIU
bis 2 × 1010 CIU im Allgemeinen für jede Verabreichungsstelle,
bevorzugter eine Dosis von etwa 2 × 109 CIU,
zum Beispiel im Bereich von 5 × 108 CIU bis 1 × 1010 CIU.
Die Häufigkeit
der Verabreichung ist einmal oder öfter innerhalb des Bereichs
von klinisch verträglichen
Nebenwirkungen. Die Häufigkeit
der Verabreichung pro Tag ist dieselbe. Für nicht-menschliche Tiere kann
zum Beispiel die Verabreichung durch Erhöhen oder Absenken der Zahl
der Verabreichungsstellen oder durch Berechnen der Dosen basierend
auf dem Gewichtsverhältnis
von Mensch zu den Zieltieren oder dem Gewichtsverhältnis oder
Volumenverhältnis
der Zielstellen (wie ischämischen
Geweben) erfolgen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 ist
eine schematische Darstellung der operativen Vorgehensweisen für eine mäßige (linkes Feld)
und schwere (rechtes Feld) akute Hinterextremitäts-Ischämie
von Mäusen.
Die verzweigten Linien zeigen Arterien und Venen in der Hinterextremität an. Kurze
dicke Linien weisen auf Exzisionsstellen von Gefäßen hin.
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2 ist
eine Graphik, die eine mit einer Hinterextremitäts-Ischämie in Verbindung stehende
Expression von endogenem VEGF (ausgefüllt) und FGF2 (offen) im Muskel
(linke Graphik) und Serum (rechte Graphik) zeigt. Mäßige und
schwere Ischämie-Modelle
von C57BL/6-Mäusen
wurden verwendet. Zwei Tage nach der Operation wurden alle Oberschenkel-
und Unterschenkel-Muskeln (n = 6) und Serum (n = 6) erhalten und Enzym-verbunden
Immunabsorptions-Tests (ELISA) ausgesetzt. Die Werte wurden durch
das extrahierte Gesamtprotein des Muskels beziehungsweise das Volumen
standardisiert und mit Mittelwert ± S. D. ausgedrückt. Die
Werte des Muskels enthalten sowohl die Daten von Oberschenkel als
auch Unterschenkel (d. h. n = 12 in jeder Gruppe). Die Mittelwerte
sind in der Graphik gezeigt. *P < 0,01,
#P < 0,05 (analysiert
durch Einweg-ANOVA).
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3 ist
ein Foto, das das Ergebnis der RT-PCR für den Nachweis der Induzierung
der VEGF-Expression aufgrund einer Ischämie zeigt.
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4,
Graphiken, die den Expressionsspiegel (links) und seine Änderung
im Zeitverlauf (rechts) des SeV-vermittelten Leuchtkäfer-Luciferase-Gens,
das in Muskeln transferiert wurde, zeigt. Luciferase-Aktivitäten werden
in der unbehandelten Gruppe, der pCMV-luc (100 μg)-verabreichten Gruppe und
der SeV-luc (10
pfu oder 108 pfu)-verabreichten Gruppe unter
Verwendung eines gemäßigten Ischämie-Modells
von C57BL/6-Mäusen
(links) untersucht. Das rechte Feld zeigt die Änderungen im Zeitverlauf des
Expressionsspiegels des Luciferase-Gens, das im gemäßigten Ischämie-Modell
transferiert wurde. Weiße
Kreise weisen auf die pCMV-luc
(100 μg)-verabreichte
C57BL/6-Mausgruppe hin. Schwarze Kreise zeigen die SeV-Luc (108 pfu)-verabreichte C57BL/6-Mausgruppe an.
Schattierte Kreise zeigen die SeV-luc (108 pfu)-verabreichte BALG/c
nu/nu-Mausgruppe an. Die dicke Linie zeigt die Grenzwerte an, über denen
die Expression des Transgens signifikant wird. Der Spiegel der Genexpression
in jeder Grafik wird im selben log-Maßstab dargestellt.
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5 ist
eine Grafik, die den Sekretionsspiegel eines angiogenen Proteins
in menschlichen endothelialen Nabelvenen-Zellen (HUVEC), COS7-Zellen,
bovinen vaskulären
glatten Muskelzellen (BSMC) und Cardiomyoblasten-Zellen (H9C2) zeigt. „Basale
Freisetzung" bezeichnet
die Produktionsmenge von jedem Faktor ohne die Vektoren. „Grenzwert" bezeichnet den Spiegel, über dem
die Expression des Transgens signifikant wird.
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6 zeigt
Grafiken, die die in vivo-Expression von exogen transferiertem FGF2-(a)
und VEGF-(b) Gen im Muskel (links) und Serum (rechts) einer mäßig ischämischen
Extremität
von C57BL/6-Mäusen
zeigt. Bald nach dem operativen Vorgehen wurden 50 μl einer jeden
Vektorlösung
in die Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln injiziert. Zwei Tage
nach der Operation wurden alle Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln
(je n = 6) und Serum (n = 6) erhalten und einem ELISA für murinen
FGF2 (a) und murinen beziehungsweise menschlichen VEGF (b) ausgesetzt.
Die Werte wurden durch das extrahierte Gesamtprotein oder das Gesamtvolumen
des Muskels standardisiert und mit Mittelwert + S. D.
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ausgedrückt. Die
Mittelwerte sind in der Figur gezeigt. Beachte, dass die Maßstäbe in log-Maßstäben vorliegen.
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7 zeigt
Grafiken, die eine Gentransfer-vermittelte Verstärkung der endogenen murinen
VEGF-Expression in den Extremitätenmuskeln
von C57BL/6-Mäusen ohne
Operation (links), mit gemäßigter Ischämie (Mitte)
und schwerer Ischämie
(rechts) zeigen. Bald nach dem operativen Vorgehen wurden 50 μl einer jeden Vektorlösung in
die Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln injiziert. Zwei Tage
nach der Operation wurden alle Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln
und Serum (je n = 6, gesamt n = 12) erhalten und einem ELISA für murinen
VEGF unterzogen. Die Werte wurden durch das extrahierte Gesamtprotein
des Muskels standardisiert und mit Mittelwert ± S. D. ausgedrückt. Die
Mittelwerte sind in der Figur gezeigt. *P < 0,01, #P < 0,05 (analysiert durch Einweg-ANOVA).
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8 zeigt
Fotos, die Gewebeabbildungen von Gen-transferierten Maus-Extremitätenmuskeln
zeigen. Eine histologische Beobachtung wurde 2 Tage nach einer schwere
Ischämie-Operation
für C57BU6-Mäuse durchgeführt, die
dann behandelt wurden, wie in der Beschreibung von 7 beschrieben.
Ein offensichtliches entzündliches
Infiltrat und Stroms-Ödem
kann in Scheintransfiziertem (SeV-Luciferase; Schein) Oberschenkelmuskel
(oben rechts) im Vergleich zu einem unbehandelten Tier (oben links;
keine Ischämie)
gesehen werden. Eine schwere Schädigung
der Muskelfasern, intrazelluläres Ödem und
ein entzündliches
Infiltrat kann in VEGF165-behandelten Tieren gesehen werden (unten
links; VEGF165). Diese Schädigungen
werden durch FGF2-Gentransfer inhibiert (unten rechts; FGF2). Jede
Gruppe enthält
6 Tiere und zeigt ähnliche
Ergebnisse. Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Ursprüngliche
Vergrößerung x200.
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9 zeigt
Fotos, die therapeutische oder schädliche Wirkungen von exogen
transferierten angiogenen Faktor-Genen in Muskeln von schweren Extremitäten-Ischämie-Mäusen 10
Tage nach der Operation für die
linken Hinterextremitäten
zeigen. Jedes Foto zeigt gleichzeitig den Extremitäten-Erhaltungswert
(LSS). Die oberen Felder zeigen eine typische schädliche Wirkung
im schweren Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen (Extremitäten-Erhaltungsmodell).
Eine VEGF165-transferierte
Maus zeigte eine vollständige
Extremitäten-Amputation
(oberes mittleres Feld), während
eine Kontrollmaus mit Luciferase (oberes linkes Feld) und eine FGF2-behandelte
Maus (oberes rechtes Feld) erhaltene Extremitäten anzeigten. Die unteren
Felder zeigen eine typische therapeutische Wirkung im schweren Ischämie-Modell von BALG/c
nu/nu-Mäusen
(Auto-Amputations-Modell). Die FGF2-behandlete Maus zeigte eine
Extremitäten-Erhaltung
(unteres rechtes Feld), während
die Kontrollmaus mit Luciferase (unteres linkes Feld) und die VEGF165-behandelte
Mause (unteres rechtes Feld) einen fast vollständigen Verlust der Hinterextremität anzeigte.
-
10 zeigt
Grafiken, die die Extremitäten-Prognose-Kurve
in den Vektorverabreichten Extremitäten-Erhaltungs- und Auto-Amputations-Modellen
zeigen. Die Grafiken zeigen die Rate (Extremitäten-Erhaltungsrate) von Vektor-verabreichten
Tieren, die die Extremität
behalten. Als ein Ergebnis des intramuskulären Transfers von angiogenen
Genen zeigt A schädliche
Wirkungen von VEGF165 im schweren Ischämie-Modell von C57BL/6-Mäusen (Extremitäten-Erhaltungsmodell),
und B zeigt die therapeutischen Wirkungen von FGF2 im schweren Ischämie-Modell
von BALG/c nu/nu-Mäusen
(Auto-Amputations-Modell). Jede Gruppe wurde 3 getrennten Experimenten
ausgesetzt (n = 10). Die Kurve wurde durch das Kaplen-Mayer-Verfahren beschrieben,
und die Daten wurden mit dem log-Rang-Test analysiert. *P < 0,0001.
-
11 zeigt
Fotos, die die angiogene in vivo-Wirkung in C57BL/6-Mäusen mit
schwerer Hinterextremitäten-Ischämie zeigen
(Extremitäten-Erhaltungsmodell),
gemessen mit einem Laser-Doppler-IPerfusions-Bildgebungs-Analysegerät. Eine
Wiederherstellung der Durchblutung wurde in den Mäusen beobachtet, die
mit SeV-Luciferase,
SeV-VEGF165 und SeV-FGF2 bei 107 pfu behandelt
wurden. Jede Gruppe zeigt den Zeitablauf desselben Tiers. Die oberen
Felder zeigen typische Ergebnisse des Zeitablaufs der Blutfluss-Wiederherstellung
in einer Maus, die mit SeV-Luciferase behandelt wurde (Schein-Transfektion).
Die Blutreperfusion des Oberschenkelmuskels wurde um 4 Tage nach
der Intervention erkannt und war am Tag 7 offensichtlich. Am Tag
10 war dennoch keine klare Durchblutung im Unterschenkelbereich
schwer nachzuweisen, was in einer Extremitätenatrophie mit einem Zeichen
einer Zehennekrose resultierte (äußerst rechtes
Feld). Die mittleren Felder zeigen den typischen Zeitablauf einer
Maus mit SeV-VEGF165. Keine offensichtliche und signifikante Durchblutung
wurde im Oberschenkel und Unterschenkel während der Beobachtung erkannt,
was in einer Auto-Amputation der Extremität resultierte (äußerst rechtes
Feld). Die unteren Felder zeigen den typischen Zeitablauf einer
Maus, die mit SeV-FGF2 behandelt wurde. Eine offensichtliche Wiederdurchblutung
im Oberschenkelbereich wurde bis zum Tag 4 deutlich gesehen, und
ein signifikanter Blutfluss wurde in der ganzen Extremität bis zum
Tag 10 erkannt, was in einer vollständigen Extremitäten-Erhaltung
resultierte (äußerst rechtes
Feld).
-
12 ist
eine Grafik, die die Wiederherstellung der Durchblutung durch eine
angiogene Gentherapie in C57BL/6-Mäusen mit schwere Ischämie zeigt
(Extremitäten-Erhaltungsmodell).
Die durchschnittliche Durchblutung in der ischämischen Extremität und der
Kontroll-Extremität,
die wie in der Beschreibung von 11 behandelt
wurde, wurde berechnet, um das Durchblutungswert-Verhältnis der
linken Extremität
(ischämisch)/rechten
Extremität
(Kontrolle) zu ergeben. *P < 0,001
(im Vergleich zu allen anderen Gruppen), #p < 0,05 (im Vergleich zu allen anderen
Gruppen), ##p <0,05
[im Vergleich zur nicht-verabreichten (Schein)-Gruppe].
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13 ist
eine Grafik, die die Änderung
im Zeitablauf in den Extremitäten-Erhaltungs-Raten
in Mausmodellen der schweren Ischämie (Auto-Amputations-Modell) zu denen
des F-Gen-defizienten SeV-Vektors, der das hFGF2-Gen enthält, oder
des replikativen SeV-Vektors, der das hFGF2-Gen enthält, zeigt.
In der Figur sind die Zahl der Subjekte (n) und die Dosis der Vektoren
gezeigt.
-
Beste Art und Weise für das Ausführen der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezugnahme auf Beispiele
spezifisch illustriert, sie soll aber nicht als darauf limitiert
angesehen werden.
-
Rekombinantes
SeV wurde hergestellt, wie früher
beschrieben (Yu, D. et al., Genes Cells 2(7): 457–66, 1997;
Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970–973 (2000); Kato, A., et al.,
Genes Cells 1, 569–579
(1996); Hasan, M. K., et al., J. Gen. Virol. 78, 2813–2820 (1997)).
-
Der
Virustiter wurde durch den Hämagglutinations-Test
unter Verwendung von Hühner-Erythrocyten bestimmt,
und ein Bestand mit hohem Titer (109 pfu/ml)
wurde bei –80°C bis zur
Verwendung bewahrt. Menschliche VEGF165-cDNA wurde durch RT-PCR
isoliert, wie früher
beschrieben (Yonemitsu, Y., et al., Lab. Invest. 75, 313–323 (1996)).
Maus-Volllängen-FGF2-cDNA
wurde durch PCR unter Verwendung einer teilweisen Sequenz der cDNA
hergestellt (Imamura, T., et al., Science 249, 1567–1570 (1990)),
gespendet von Dr. Imamura (National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Tsukuba, Japan). Genau wurde die Volllängen-cDNA unter
Verwendung eines teilweisen Maus-FGF2-cDNA-Fragments (eines Fragments
der Nucleotidposition 7 bis 435 der Zugangsnummer M30644), dem die
Start- und Stopp-Codon-Regionen
fehlen, als eine Matrize und des N-Terminus-Primers (5'-ACGTGCGGCCGCCAAAGTTCATCCACCATGGCTGCCAGCGGCACACCTCGCTTCCC-3'/SEQ ID NO: 15),
der das Startcodon der Maus-FGF2-cDNA enthält, und des C-Terminus-Primers (5'-ACTGCGGCCGCOATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGCGGATCAGCTCTTAGCAGA CATTGGAAAGAAACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGTCCCGT-3'/SEQ ID NO: 16) der
das Stoppcodon und die SeV-spezifische Sequenz enthält, amplifiziert.
Die menschliche VEGF165- und Maus-FGF2-cDNAs, die wie vorstehend
beschrieben hergestellt wurden, wurden an der NotI-Stelle in pSeV18+b(+) (Hasan, M. K. et al., 1997, J. General
Virology 78: 2813–2820)
cloniert, nachdem jede Nucleotidsequenz bestätigt wurde. Sendai-Virus-Vektoren,
die den menschlichen VEGF165 oder den Maus-FGF2 exprimieren, wurden
als SeV-VEGF165 beziehungsweise SeV-FGF2 bezeichnet. SeV-Luciferase
(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78 (Pkt. 11): 2813–2820, 1997;
Yonemitsu, Y. et al., Nature Biotechnol. 18: 970–973, 2000) und pCMV-Luciferase (Yonemitsu,
Y. et al., Nature Biotechnol. 18: 970–973, 2000) wurden hergestellt,
wie oben beschrieben.
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Alle
Daten der Beispiele der vorliegenden Erfindung wurden in der statistischen
Analyse als Mittelwerte ± S.
D. dargestellt. Die Daten, mit Ausnahme jener der Extremitäten-Erhaltung,
wurden durch Einweg-ANOVA mit der Scheffe-Anpassung analysiert. Für die Extremitäten-Erhaltung
wurde die Rate, die durch den Extremitäten-Erhaltungswert (LSS) ausgedrückt wird,
durch das Kaplen-Mayer-Verfahren
analysiert. Die statistische Signifikanz der Extremitäten-Erhaltungs-Experimente wurde
unter Verwendung des log-Rang-Tests festgestellt, und p < 0,05 wurde in allen
statistischen Analysen als signifikant angesehen.
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Die
vorliegende Erfindung liefert die Basis-Technologie für die Gentherapie,
die ischämische
Gewebe anzielt. Die Angiogenese in den ischämischen Geweben kann wirksam
induziert werden, und eine Nekrose kann durch Verwendung des Gentransfers
der vorliegenden Erfindung verhindert werden.
-
[Beispiel 1]
-
Ischämie-induzierte
endogene VEGF-Expression trägt
nicht zu der lokalen Protein-Akkumulierung
im Hinterextremitätsmuskel
bei
-
Um
die therapeutischen und schädlichen
Wirkungen von angiogenen Faktoren zu bewerten, etablierten die vorliegenden
Erfinder die folgenden 3 Modelle der Extremitäten-Ischämie durch 2 unterschiedliche Operationen
(1): (1) mäßiges Extremitäten-Ischämie-Modell
von C57BL/6-Mäusen,
in denen die gesamte Fernoral-Arterie
und -Vene und die Saphena-Arterien und -Vene exzidiert worden sind
(1, linkes Feld) (Couffinhal, T., et al., Am. J.
Pathol. 152, 1667–1679
(1998); Kalks, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3422–3427 (2000));
(2) schweres Ischämie-Modell
von C57BL/6-Mäusen,
in denen die gesamte externe Iliakal-Arterie und -Vene, Femoral-Arterie
und -Vene und alle in Beziehung stehenden Zweige exzidiert worden sind
(1, rechtes Feld); und (3) immun-defiziente BALG/c
nu/nu-Mäuse,
die dengleichen chirurgischen Vorgehensweisen wie in (2) ausgesetzt
wurden (d. h. schweres Ischämie-Modell
von BALG/c nu/nu-Mäusen).
-
Adulte
männliche
C57BL/6-, BALB/c- und BALG/c nu/nu-Mäuse (6–8 Wochen alt, Charles River-Marke)
wurden von KBT Oriental Co. Ltd. (Tosu, Saga, Japan) erworben. Die
Tier-Experimente wurden unter Verwendung von genehmigten Protokollen
und gemäß den Empfehlungen
für die
korrekte Haltung und Verwendung von Labortieren durch das Komitee
für Tier-,
rekombinante DNA- und infektiöse
Pathogen-Experimente an der Kyushu University durchgeführt und
wurden gemäß dem Gesetz
(Nr. 105) und dem Bescheid (Nr. 6) der japanischen Regierung und
den „Principles
of Laboratory Animal Care" und
dem „Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals" durch das National Institute of Health
der USA (Veröffentlichung
Nr. NIH 80–23, überarbeitet
1985) unternommen.
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Unter
ausreichender Anästhesie
unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital wurden
die Mäuse
einer Hautinzision ausgesetzt. Für
das gemäßigte Ischämie-Modell
wurde die gesamte oberflächliche
Femoral-Arterie und -Vene und die Saphena-Arterie und -Vene (von
kurz unter den tiefen Femoral-Arterien bis zur Kniekehlen-Arterie
und -Vene) ligiert, geschnitten und entfernt (1,
linkes Feld) (Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998);
Kalks, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3422–3427 (2000)).
Für das
schwere Ischämie-Modell
wurde auch eine zusätzliche
Exzision der externen Iliakal-Arterie und -Vene mit der tiefen Femoral-Arterie
gemacht (1, rechtes Feld). Die Wiederholbarkeit
der Extremitäten-Prognose
dieser Modelle wurde durch die 3 bis 5 getrennten Experimente unter
Verwendung von 10 oder mehr Tieren/Modell durch denselben Operateur
(I. M.) bestätigt.
Alle Extremitäten-Erhaltungs-Experimente
enthielten Tiere, die 4 individuellen getrennten Experimenten ausgesetzt
wurden.
-
Das
Modell (1), wie vorstehend beschrieben, verlor nie seine
Extremitäten,
wobei es gelegentlich nur ein Anzeichen einer Zehennekrose zeigte.
Weiterhin zeigte das Modell (2) (schweres Ischämie-Modell
von C57BL/6-Mäusen)
keine Extremitäten-Nekrose
(genannt „Extremitäten-Erhaltungsmodell"), und alle Tiere
des Modells (3) (schweres Ischämie-Modell von BALG/c nu/nu-Mäusen) resultierten
in einer beinahe vollständigen Extremitäten-Amputation
innerhalb von 10 Tagen nach der Operation (genannt „Auto-Amputations-Modell"). Das schwere Ischämie-Modell
der immunkompetenten BALB/c-Mäuse
zeigte auch einen ähnlichen
Grad der Extremitäten-Nekrose
wie die BALB/c nu/nu-Mäuse
(Daten nicht gezeigt). Zusammen mit einem früheren Bericht, der darauf hinweist,
dass BALB/c-Mäuse
empfänglicher
für eine
Angiogenese gegen Wachstumsfaktoren sind als C57BU6-Mäuse (Rohan, M. R. et al., FASEB
J. 14, 871–876
(2000)), legen diese Ergebnisse nahe, dass die Extremitäten-Erhaltung
in C57BL/6-Mäusen
vielmehr von einem besseren kollateralen Extremitäten-Kreislauf
als von der Empfänglichkeit
für eine
Angiogenese abhängig
zu sein scheint.
-
Die
vorliegenden Erfinder bewerteten die endogene Expression von VEGF
und FGF2 im ischämischen Muskel
und Serum des gemäßigten und
schweren Ischämie-Modells,
wie oben beschrieben. Zwei Tage nach der Operation wurden jeder
Extremitätenmuskel
(gesamter Oberschenkel- und Unterschenkelmuskel) und Serum von C57BL/6-Mäusen gewonnen,
und ihre Gewebe werden homogenisiert oder lysiert und dann einem Enzym-verbunden
Immunadsorptions-Test (ELISA) ausgesetzt. Rekombinante Proteine
wurden unter Verwendung der Qantikine Immunoassay-Systeme (R & D Sytems Inc.,
Minneapolis, MN) für
menschlichen VEGF oder Maus-FGF2 synthetisiert und dann gemäß ihrer
Anweisung quantifiziert. Die Konzentrationen der Gesamtproteine
wurden durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung eines Protein-Testsystems
(Bio-Rad Laborstories, Hertfordshire, UK) bestimmt und standardisiert
(Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970–973 (2000)).
-
Da
es keine signifikanten Unterschiede in der Proteinkonzentration
zwischen den Oberschenkel- und Unterschenkelmuskeln gab, wurden
beide in jeder Gruppe eingeschlossen. Interessanterweise verstärkte die ischämische Operation
den FGF2-Proteingehalt
in beiden Hinterextremität-Ischämie-Modell-Mäusen signifikant
(im gemäßigten Modell,
874,5 ± 187,7
pg/g Muskel; im schweren Modell, 985,4 ± 209,5 pg/g Muskel; je n =
12) im Vergleich zu der Grundlinie (489,7 ± 108,6 pg/g Muskel; n = 12)
für unbehandelte
Mäuse (P < 0,001) (2).
Auf der anderen Seite wurde eine mit der Ischämie in Beziehung stehende Verstärkung der
VEGF-Expression in der schwer-ischämischen Gruppe gesehen, aber
nicht signifikant in den Muskeln (unbehandelt, 174,7 ± 43,1;
gemäßigt, 119,2 ± 53,4;
und schwer, 242,5 ± 244,3,
n = 12). Diese schienen paradoxe Ergebnisse, weil VEGF ein gut bekanntes
Mitogen ist, das durch Gewebe-Ischämie stark induziert wird (Shweiki,
D. et al., Nature 359, 843–845
(1992); Forsythe, J. A., et al., Mol. Cell. Biol. 16, 4604–4613 (1996)).
Die vorliegenden Erfinder maßen
den VEGF-Spiegel im Serum, da VEGF in den systemischen Kreislauf
austreten kann. Wie erwartet, wurde ein von der Schwere abhängiger Anstieg
des VEGF-Proteinspiegels im Serum beobachtet, während der FGF2-Spiegel im Serum
nicht nachgewiesen werden konnte (2, rechtes
Feld).
-
Die
vorliegenden Erfinder stellten die Hypothese auf, dass eine Extremitäten-Ischämie eher
kleinere Isoformen von VEGF, von denen wohlbekannt ist, dass sie
weniger mit Heparinsulfat interagieren als VEGF von mittlerer oder
größerer Größe, induzieren
kann (Cohen, T., et al., J. Biol. Chem. 270, 11322–11326 (1995)). Um
diese Hypothese zu bewerten, analysierten die vorliegenden Erfinder
die Expression von VEGF-Isoformen im Oberschenkelmuskel von männlichen
C57BL/6-Mäusen
einen Tag nach der Operation. Die Analyse wurde durch RT-PCR unter
Verwendung von Primer-Sets durchgeführt, die zwischen murinen VEGF-Spleißungs-Isoformen,
einschließlich
VEGF188, 164, 144 und 120, unterscheiden können (Burchardt, M., et al.,
Biol. Reproduct. 60, 398–404
(1999)). Die Primer-Sets wurden früher für den Ratten-VEGF auf Exon
1 und Exon 8 berichtet (Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct.
60, 398–404
(1999)): Vorwärts-Primer
(5'-TGC ACC CAC
GAC AGA AGG GGA-3'/SEQ
ID NO: 17) und Rückwärts-Primer (5'-TCA CCG CCT TGG
CTT GTC ACA T-3'/SEQ
ID NO: 18), die den Sequenzen der murinen VEGF-Isoformen entsprechen.
Für das
Nachweisen der kleinsten Isoform des murinen VEGF (VEGF115) wurden
derselbe Vorwärts-Primer wie
oben und ein VEGF115-spezifischer Rückwärtsprimer (5'-CTA CCM GTT TCC
CAG GCA G-3'/SEQ
ID NO: 19) verwendet (Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033–3038 (1998)).
Eine RT-PCR wurde unter Bedingungen gemäß Literaturstellen durchgeführt (Burchardt,
M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398–404 (1999); Sugihara, T. et
al., J. Biol. Chem. 273, 3033–3038
(1998)).
-
Als
ein Ergebnis wurde die mit der Ischämie in Beziehung stehende endogene
VEGF-Expression nur in der 164-Isoform gesehen, während keine
offensichtliche Expression von anderen Isoformen nach gewiesen wurde
(3). Eine zusätzliche
RT-PCR-Analyse kann die Expression einer bekannten kleinsten Isoform, VEGF115,
nicht nachweisen (Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033–3038 (1998)).
-
[Beispiel 2]
-
Kinetik des rekombinanten Sendai-Virus-vermittelten
intramuskulären
Gentransfers in eine Maus-Hinterextremität
-
Für die kinetische
Untersuchung bewerteten die vorliegenden Erfinder die Spiegel und
den Zeitablauf der Transgen-Expression unter Verwendung der Leuchtkäfer-Luciferase.
Der Luciferase-Test wurde unter Verwendung eines Luminometers (Modell
LB 9507, EG&G
Berthold, Deutschland) gemäß der Literatur
(Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970–973 (2000)) durchgeführt. Die
Daten werden als relative Lichteinheiten (RLU)/mg Protein dargestellt.
Die Konzentrationen der Gesamtproteine wurden durch das Bradford-Verfahren unter
Verwendung eines Protein-Testsystems (Bio-Rad Laborstories, Hertfordshire,
UK) bestimmt und wurden zum Standardisieren der Werts, der durch
den Luciferase-Test erhalten wurde, verwendet. Da der Extremitätenmuskel
des schweren Extremitäten-Ischämie-Modells
offensichtlich geschädigt
war, was eine reduzierte Transgen-Expression nahe legt, wurde das
gemäßigte Ischämie-Modell
(1, linkes Feld) für die Analyse verwendet. Das
Gen (25 μl)
wurde an zwei Stellen, Oberschenkel- und untere Oberschenkelmuskeln,
zum Zeitpunkt der Operation transferiert. Die hierin nachstehend
beschriebenen Dosen sind die Summe der Dosen an zwei Stellen. Mäuse (C57BL/6-Mäuse), die
100 μg pCMV-Luciferase
(etwa 50-mal höher
als die klinische Dosis) erhielten (Baumgartner, I., et al., Circulation
97, 1114–1123
(1998); Isner, J. M. et al., J. Vasc. Surg. 28, 964–973 (1998)),
zeigten zwei Tage nach dem Gentransfer eine relativ hohe Luciferase-Aktivität (Durchschnitt ± S. D.
= 5,1 ± 3,9 × 106 RLU/mg Protein, n=6), während ungefähr 5-mal (2,4 ± 3,8 × 107 RLU/mg Protein, n=12) und 120-mal (7,3 ± 4,7 × 108 RLU/mg Protein, n = 6) höhere Expressionen
in Mäusen
beobachtet wurden, die SeV-Luciferase zu 107 Plaque-bildenden
Einheiten (pfu) beziehungsweise SeV zu 108 pfu
erhielten. Weiterhin wurde der Zeitablauf der Transgen-Expression
unter Verwendung des gemäßigten Ischämie-Modells
von C57BL/6-Mäusen,
die das Luciferase-Expressionsplasmid (pCMV-luc) oder SeV-luc auf
dieselbe Weise, wie oben beschrieben, erhielten, analysiert. Das
gemäßigte Ischämie-Modell
der C57BL/6-Mäuse,
die eine intramuskuläre
Injektion von 108 pfu SeV-Luciferase erhielten,
zeigte auch einen Abfall der Expression in einer zeitabhängigen Weise
(Tag 2: 7,3 ± 4,3 × 108 RLU/mg Protein, n = 12; Tag 7: 3,4 ± 4,7 × 107 RLU/mg Protein, n=12; und Tag 14: 2,6 +
1,2 × 104 RLU/mg Protein, n=12) (4,
rechtes Feld). Obwohl der Zeitablauf der Luciferase-Aktivität im gemäßigten Ischämie-Modell
von immun-defizienten BALG/c nu/nu-Mäusen, an die 108 pfu SeV-Luciferase intramuskulär verabreicht
wurden, bis zum Tag 7 ähnlich
zu jenen der C57BL/6-Mäuse
war, behielten die Mäuse
ihre Expressionsspiegel später
(Tag 2: 9,4 ± 3,7 × 108 RLU/mg Protein, n = 12; Tag 7: 1,3 ± 1,9 × 107 RLU/mg Protein, n = 12; und Tag 14: 0,9 ± 1,3 × 107 RLU/mg Protein, n = 12).
-
Als
Nächstes
bewerteten die vorliegenden Erfinder die Sekretion von angiogenen
Proteinen in vitro unter Verwendung von verschiedenen Kulturzellen,
einschließlich
nicht nur Muskelzellen wie primäre
bovine glatte Muskelzellen (BSMCs) und Cardiomyoblasten (H9C2) sondern
auch primäre
menschliche endotheliale Nabelvenen-Zellen (HUVECs) und COS7-Zellen.
Der FGF2-Vektor (SeV-FGF2), der keine klassischen Signalsequenzen
für sezernierende
Proteine enthält,
wurde in der vorliegenden Erfindung verwendet, weil frühere Untersuchungen
durch die vorliegenden Erfinder und andere zeigten, dass FGF2 extrazellulär ohne sezernierende
Sequenzen exprimiert werden konnte (Piotrowicz, R. S. et al., J.
Biol. Chem. 272, 7042–7047
(1997); Qu, Z., et al., J. Histochem. Cytochem. 46, 1119–1128 (1998);
Florkiewicz, R. Z. et al., J. Cell. Physiol. 162, 388–399 (1995)).
Wie erwartet, konnte die wirksame Sekretion des FGF2-Proteins in
das Kulturmedium wie ähnliche
Spiegel von VEGF165 in einer Dosis-abhängigen Weise nachgewiesen werden
(zum Beispiel bei MOI = 100: VEGF165 gegenüber FGF2= 4354 + 2794 gegenüber 3682 ± 1063
in HUVEC, 275 ± 58
gegenüber
398 ± 154
in BSMC, 16987 ± 4748
gegenüber
5976 ± 381
in H9C2 und 38648 ± 4913
gegenüber
1547237 + 176502 in COS7-Zellen, pg/105 Zellen/24
Stunden, jeweils n = 3) (5).
-
[Beispiel 3]
-
Kinetik
der SeV-vermittelten intramuskulären
Expression von angiogenen Faktoren in vivo Die vorliegenden Erfinder
untersuchten den Expressionsspiegel von angiogenen Faktoren im Muskel
nach einer intramuskulären
in vivo-Verabreichung von SeV-VEGF165 und SeV-FGF2 in das gemäßigte Ischämie-Modell
von C57BL/6-Mäusen. Jede
25 μl-Verabreichung
wurde einmal während
der Operation unter Verwendung einer 26-Gange-Nadel in die Oberschenkel-
und Unterschenkelmuskeln durchgeführt.
-
Interessante
Ergebnisse wurden für
die in vivo-Expression von angiogenen Faktoren im Vergleich zu ihrer
in vitro-Expression und der in vivo-Expression des Reportergens
erhalten. Wie in 6 gezeigt, stieg die SeV-FGF2-vermittelte
Proteinsynthese in einer Dosis-abhängigen Weise und erreichte
beim höchsten
Titer eine 110-fach größere als
die endogene Genexpression (Grundlinie, 429 ± 79, Ischämie, 974 ± 150, 106 pfu, 4913
+ 313, 107 pfu, 13469 ± 12611 und 108 pfu,
46703 ± 12092
pg/g Muskel, je n = 6 im Oberschenkelmuskel; Grundlinie, 550 ± 104,
Ischämie,
720 ± 128,
106 pfu, 1376 ± 158, 107 pfu,
8252 ± 8190
und 108 pfu, 59704 ± 35297 pg/g Muskel, je n
= 6 im Unterschenkelmuskel). Signifikanter Serum-FGF2 konnte sogar
beim höchsten Titer
in keinen Tieren nachgewiesen werden, die SeV-FGF2 erhielten. Auf der anderen Seite
war der Dosis-abhängige
Anstieg von VEGF165 viel weniger als jener von FGF2 und erreichte
bei 10 pfu nicht das 2-fache davon, und umgekehrt war die Expression
des SeV-abstammenden menschlichen VEGF165-Proteins bei 108 pfu beinahe nicht nachweisbar (Grundlinie,
176 ± 44,
Ischämie,
143 ± 64,
106 pfu, 159 ± 67, 107 pfu,
224 ± 216
und 108 pfu, < 5 pg/g Muskel, je n = 6 im Oberschenkelmuskel;
Grundlinie, 173 ± 45,
Ischämie,
95 ± 28,
106 pfu, 186 ± 30, 107 pfu,
172 ± 101
und 108 pfu, < 5 pg/g Muskel, je n = 6 im Unterschenkelmuskel).
Obwohl der Serumspiegel des endogenen murinen VEGF durch die gemäßigte Extremitäten-Ischämie signifikant
erhöht
wurde (37,7 ± 15,4
pg/ml, n = 6), konnte der Vektor-abstammende menschliche VEGF165
nicht signifikant nachgewiesen werden, was nahe legt, dass intramuskulär exprimiertes
VEGF165 nicht in den systemischen Kreislauf diffundierte.
-
[Beispiel 4]
-
Ischämie-induzierte
endogene VEGF-Expression wird durch angiogenen Gentransfer merklich
verstärkt
-
Die
vorliegenden Erfinder stellten die Hypothese auf, dass das nicht
vergleichbare Expressionsmuster zwischen VEGF165 und FGF2 aufgrund
der endogenen VEGF-Expression erfolgt. Die Überexpression von endogenem
VEGF165 kann die Gewebe-Ischämie
durch zu viel stärkere
Permeabilitäts-Wirkung
verschlimmern und kann die SeV-abhängige Transkription herunterregulieren.
Weiterhin wies ein früherer
Bericht darauf hin, dass die angiogene Aktivität von FGF2 teilweise aufgrund
einer verstärkten
endogenen VEGF-Expression in vitro und in vivo erfolgte (Asahara,
T., et al., Circulation 92, 365–371
(1995)). Daher bewerteten die vorliegenden Erfinder die Modulierung
der endogenen murinen VEGF-Proteinsynthese
in den Muskeln durch exogen transduzierte Gene eines angiogenen
Faktors unter Verwendung eines für
murinen VEGF spezifischen ELISA-Systems. Wie in 7 gezeigt,
verstärkte
der Transfer des FGF2-Gens aber nicht des VEGF165-Gens die endogenen
murinen VEGF-Spiegel in Muskeln in beiden Extremitäten-Zuständen wie
dem normalen Kreislauf (keine Operation) und der gemäßigten Ischämie signifikant.
Im Fall der schweren Extremitäten-Ischämie verstärkte der
Gentransfer von beiden angiogenen Faktoren die endogene murine VEGF-Expression
dramatisch, und insbesondere resultierte VEGF165 in einer rund 7-fach
höheren
als jene der Ischämie
selbst (Schein).
-
Um
diese weiter zu bewerten, beobachteten die vorliegenden Erfinder
Wirkungen des Gentransfers von angiogenen Faktoren im schweren C57BL/6-Ischämie-Modell
histologisch (8). Die ischämische Operation, gefolgt durch
Schein-Transfektion (Schein), zeigte diffus pyknotische Muskelfasern,
die zwei Tage später
ein intrazelluläres Ödem und
ein entzündliches
Infiltrat begleiteten. Diese Ergebnisse wurden durch den VEGF165-Gentransfer
merklich verstärkt,
während
sie durch den FGF2-Gentransfer offensichtlich inhibiert wurden (8).
-
[Beispiel 5]
-
Exogen transduziertes VEGF165 wirkt in
der akuten schweren Extremitäten-Ischämie eher
als ein Extremitäten-schädigender
Faktor als als Extremitätenerhaltender
Faktor
-
Basierend
auf den Ergebnissen, wie vorstehend beschrieben, testeten die vorliegenden
Erfinder die therapeutischen Wirkungen des in vivo-Gentransfers
von angiogenen Faktoren unter Verwendung sowohl der gemäßigten als
auch der schweren ischämischen
Extremitäten-Modelle.
Die vorliegenden Erfinder verwendeten Viren in 107 pfu
zum Beobachten der therapeutischen in vivo-Wirkung, da VEGF165 bei
der höchsten
Dosis von 108 pfu keine Transgenprodukte
produzieren konnte, wie vorstehend gezeigt. Die vorliegenden Erfinder kategorisierten
den Grad der Extremitäten-Nekrose
für 4 Erhaltungs-Werte
(Extremitäten-Erhaltungswert: LSS):
LSS = 4, vollständige
Extremitäten-Erhaltung;
LSS = 3, Extremitäten-Nekrose
unter der Ferse; LSS = 2, Extremitäten-Nekrose unter dem Knie;
LSS = 1 Extremitäten-Nekrose über dem
Knie; und LSS = 0, vollständige
Extremitäten-Amputation
um das inguinale Ligament. Gemäß dieser
Klassifizierung testeten die vorliegenden Erfinder zuerst die Toxizität der SeV-vermittelten
Expression der angiogenen Faktoren unter Verwendung des Extremitäten-Erhaltungs-Modells
der C57BL/6-Mäuse
unter einer schweren Extremitäten-Ischämie. Die
angiogenen Gene wurden auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2 transferiert.
-
Die
Mäuse aller
Gruppen behielten ihren Extremitäten
vollständig,
wenn die Vektoren zwei Tage vor der Ischämie-Operation dazu injiziert
wurden. Die Mäuse
von allen Gruppen, einschließlich
der FGF2-verabreichten Gruppe, außer der VEGF165-verabreichten
Gruppe, zeigten eine vollständige
Extremitäten-Erhaltung (%LLS
= 100%), wenn der Vektor im Zeitraum der Operation injiziert wurde.
Wie in den 9 und 10 gezeigt,
verloren jedoch manche Mäuse,
die VEGF165 erhielten, ihre Extremitäten (5/10 Mäusen verloren ihre Extremitäten, %LLS
= 52,5%, p < 0,0001
im Vergleich zu den anderen Gruppen) (10A).
Diese Ergebnisse legen eine Extremitäten-schädigende Wirkung des VEGF165-Gentransfers
nahe. Als Nächstes
wurde die Wirkung der Gentherapie mit angiogene Genen unter Verwendung
des schweren Ischämie-Modells
(Auto-Amputations-Modell) von BALG/c nu/nu-Mäusen analysiert. Als ein Ergebnis
konnte die Verabreichung von SeV-VEGF165 die Hinterextremitäts-Prognose
nicht verbessern (8/10 verloren Extremitäten, %LLS = 15,0%), ähnlich zu
jener von Luciferase-exprimierendem SeV (5/6 verloren Extremitäten, %LLS
= 16,7%), während
die Verabreichung von SeV-FGF2
die Extremitäten-Amputation
in nu/nu-Mäusen
signifikant inhibierte (2/10 verloren Extremitäten, %LLS = 77,5%) (10B). Dies weist auf eine offensichtliche
Extremitäten-Erhaltungswirkung
des FGF2-Gentransfers hin.
-
In
der Folge bestimmten die vorliegenden Erfinder die Wirkung des intramuskulären Gentransfers
auf die Wiederherstellung der Blutperfusion in linken Extremitäten, die
schweren Ischämie-Operationen
ausgesetzt wurden, durch Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebungsanalyse
(Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998);
Murohara, T., et al., J. Clin. Invest. 105, 1527–1536 (2000)). Das schwere
Ischämie-Modell (Extremitäten-Erhaltungsmodell)
von C57BU6-Mäusen
wurde dem Gentransfer unter denselben Bedingungen wie in der Beschreibung
von 10A ausgesetzt (Extremitäten-Erhaltungsmodell).
Die Messungen des ischämischen
(linken)/normalen (rechten) Extremitäten-Blutfluss-Verhältnisses
unter Verwendung eines Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebungs (LDPI)-Analysegeräts (Moor
Instruments, Devon, UK) wurden durchgeführt, wie früher beschrieben (Couffinhal,
T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667–1679 (1998); Murohara, T.,
et al., J. Clin. Invest. 105, 1527–1536 (2000)). Genau wurden
die Mäuse
auf einer Wärmeplatte
platziert, die bei 37°C gehalten
wurde, um die Daten-Variationen aufgrund der Körpertemperatur vor dem Beginnen
der Laser-Abtastung zu minimieren. Zu vorbestimmten Zeitpunkten
(vor der Operation und an den postoperativen Tagen 2, 4, 7 und 10)
wurden zwei aufeinanderfolgende Abtastungen über derselben Region von Interesse
(Beine und Füße) in jedem
Tier durchgeführt
(11). Es wurde kein wesentlicher Unterschied zwischen
den zwei Abtastungen gefunden. Nach der Laser-Abtastung wurden die
gespeicherten Bilder einer Computer-unterstützten Quantifizierung des Blutflusses
ausgesetzt, und der durchschnittliche Fluss der ischämischen
und nicht-ischämischen
Füße wurde
berechnet. Um die Daten-Variablen aufgrund des Umgebungslichts und
der Temperatur zu minimieren, wurde der LDPI-Index als das Verhältnis des
linken (ischämischen)
zum rechten (nicht-ischämischen)
Extremitäten-Blutfluss
ausgedrückt.
-
Sowohl
in Mäusen
mit SeV-Luciferase (Schein) als auch SeV-FGF2 wurde eine offensichtliche
Durchblutung um den oberen Oberschenkel am Tag 4 nachgewiesen, und
insbesondere am Tag 4, 7 und 10 wurde eine signifikante Durchblutung
in den Unterschenkelmuskel in der FGF-verabreichten Gruppe im Vergleich
zu einer eingeschränkten
Durchblutung im Oberschenkelmuskel in der Luciferase-verabreichten
Gruppe zu denselben Zeitpunkten gesehen (11). Als
repräsentative
Ergebnisse zeigten manche der Luciferase-injizierten Mäuse mäßig atrophische
Extremitäten,
während
FGF2-injizierte Mäuse
großteils
nicht-geschädigte Extremitäten zeigten.
Im Gegensatz dazu offenbarten Mäuse,
die VEGF165 erhielten, eine sehr niedrige Durchblutung im Oberschenkelmuskel,
was in einer Extremitäten-Amputation
resultierte (11). Alle Mäuse, die SeV-VEGF165 erhielten,
hatten ihre Extremitäten
zu mindestens im Knie-Bereich verloren. Die Beobachtungsergebnisse
der Extremitäten-Durchblutung
in jeder Verabreichungsgruppe sind nachstehend beschrieben.
-
1. SeV-Luciferase-verabreichte Individuen
-
Unmittelbar
nach der Operation wurde kaum eine Durchblutung in der linken unteren
Extremität
beobachtet: Die Durchblutung wurde graduell wiederhergestellt, und
4 Tage nach der Operation war sie bis ungefähr zur Mitte der femoralen
Region wiederhergestellt. Die Durchblutung in den unteren Oberschenkel
war jedoch 10 Tage nach der Operation nicht wiederhergestellt. Als
ein Ergebnis hatte die untere Extremität keine Nekrose, zeigte aber
zu einem gewissen Grad eine Atrophie, wie im äußerst rechten Feld gezeigt.
Dasselbe Ergebnis wurde in einem Drittel der Individuen beobachtet.
Einige Individuen zeigten eine bessere Wiederherstellung als es
andere Individuen taten, wie vorstehend beschrieben.
-
2. SeV-VEGF165-verabreichte Individuen
-
Wie
vorstehend beschrieben, war der Großteil der Durchblutung direkt
nach der Operation verringert. Eine weitere periodische Beobachtung
konnte die Wiederherstellung der Durchblutung in der femoralen Region
kaum finden. Als ein Ergebnis wurde die untere Extremität von der
Mitte der femoralen Region auto-amputiert,
wie im äußerst rechten
Feld gezeigt. Alle 10 Individuen zeigten völlig dasselbe Ergebnis.
-
3. SeV-FGF2-verabreichte Individuen
-
Wie
vorstehend beschrieben, war der Großteil der Durchblutung in der
linken unteren Extremität
direkt nach der Operation verringert. Die Region, wo die Durchblutung
verringert war, war etwa diegleiche wie die der SeV-Luciferaseverabreichten
Individuen. Eine starke Durchblutung (angezeigt durch rote Punkte)
wurde in der femoralen Region etwa am Tag 4 beobachtet, und eine
schwache Durchblutung in der unteren Extremität wurde schon am Tag 7 beobachtet.
Eine geringe aber signifikante Durchblutung (angezeigt in blau)
durch die linke untere Extremität
wurde am Tag 10 beobachtet. Als ein Ergebnis wurde die untere Extremität erhalten,
da sie normal in der Erscheinung war, wie im äußerst rechten Feld gezeigt.
-
Die
vorliegenden Erfinder verglichen statistisch den Dopplar-Bild-basierenden
Blutfluss im Oberschenkelmuskel von allen Gruppen. Wie in 12 gezeigt,
zeigten Mäuse,
die SeV-FGF2 erhielten, mit einer physiologischen Wiederherstellung
des Extremitäten-Kreislaufs
eine signifikant höhere
Durchblutung als jene, die SeV-Luciferase
erhielten. Im Gegensatz dazu blieb der Blutfluss im Oberschenkelmuskel
von Mäusen,
die mit SeV-VEGF165 behandelt wurden, niedrig, und 7 Tage nach der
Operation verloren viele von ihnen ihre Extremitäten zumindest ab dem Knie-Bereich.
-
[Beispiel 6]
-
Therapie einer akut ischämischen
Extremität
unter Verwendung eines Replikationsfähigkeit-defekten Sendai-Virus-Vektors
-
1. Konstruktion von F-Gen-deffekten Sendai-Virusgenom-cDNA,
die angiogene Gene enthält
-
Zuerst
wurde die Amplifikation des EGFP-Gens durch PCR durchgeführt, um
das Plasmid (pSeV18
+/ΔF-GFP) zu konstruieren, das
das EGFP-Gen an der F-Gendefizienten Stelle im Plasmid pSeV18
+/ΔF
enthält
(siehe
WO00/70055 und
WO00/70070 ), das durch
Deletieren des F-Gens des Plasmids pSeV18+b(+) hergestellt wurde
(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78, 2813–2820, 1997), das die genomische Volllängen-Sendai-Virus
(SeV)-cDNA enthält.
Die PCR wurde unter Verwendung eines NsiI-endenden Primers (5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/SEQ ID
NO: 9) für
das 5'-Ende und
eines NgoMIV-endenden Primers (5'-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/SEQ
ID NO: 10) für
das 3'-Ende durchgeführt, um
die Zahl der Nucleotide des EGFP-Genfragments anzupassen, dass sie
eine Vielzahl von 6 ist (Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033–1045, 1996).
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen NsiI und NgoMIV
verdaut, und ein Fragment wurde von einem Gel gewonnen und in die
F-Gen-defekte Region in pUC18/dFSS zwischen NsiI und NgoMIV subcloniert,
und für
die Bestätigung
wurde eine Sequenzierung durchgeführt. Das EGFP-enthaltende DraIII-Fragment,
das von diesem Vektor isoliert wurde, wurde mit dem DraIII-Fragment
von pSeV18
+, das das F-Gen enthält, ersetzt
und ligiert, um pSeV18
+/ΔF-GFP zu konstruieren. Obwohl
der stromabwärts
liegende ORF des F-Gens von pSeV18
+/ΔF entfernt
ist, bleibt dennoch die EIS-Sequenz (SeV-spezifische Sequenz, E: Ende,
I: zwischen Genen, S: Start) des F-Gens, was die mögliche Expression
eines 5 Aminosäuren-Peptids bewirkt,
das vom Primer stammt, der verwendet wird, um das Fragment in den
Vektor zu verbinden. Darüber hinaus,
da GFP in pSeV18
+/ΔF-GFP co-exprimiert wird, wurde
ein Vektor konstruiert, der GFP und das 5 Aminosäuren-Peptid nicht co-exprimierte.
Die Rekombination wurde durchgeführt,
um den Vektor wie folgt zu konstruieren.
-
Das
Fragment (6288 bp), das die F-Gen-defekte Region enthält, wurde
durch Verdauen von pSeV18+/ΔF-GFP mit
Sail und Nhel gewonnen und in Litmus38 (New England Biolabs, Beverly,
MA) cloniert, um LitmusSalINhelfrg/ΔF-GFP zu konstruieren. Die Deletion
des EGFP-Gens, das die EIS-Sequenz enthält, die stromaufwärts der
F-Gen-defizienten Region gelegen ist, wurde durch inverse PCR durchgeführt. Genau wurde
die PCR unter Verwendung eines reversen Primers {5'-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/SEQ
ID NO: 11), der so gestaltet wurde, dass er eine Restriktionsenzym
SexAI-Erkennungssequenz stromaufwärts des GFP-Gens enthält, und
eines Vorwärts-Primers
(5'-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/SEQ
ID NO: 12) der so gestaltet wurde, dass er die Restriktionsenzym
SexAI-Erkennungssequenz stromabwärts
des GFP-Gens enthält,
durchgeführt.
Das Fragment mit der erwünschten
Größe (10855
bp) wurde isoliert und ligiert, um das EGFP-Gen zu deletieren, das
die EIS-Sequenz enthält,
die stromaufwärts
der F-Gen-defizienten Region gelegen ist.
-
In
diesem Konstrukt wird die zusätzliche
15 bp-Sequenz aufgrund des Designs der Primer zwischen die SexAI-Stellen
inseriert. Daher wurde das Plasmid durch Transformieren in den E.
coli SCS110-Stamm hergestellt (der dmc–/dam–-SCS110-Stamm wurde
verwendet, weil SexAI methyliert war und nicht verdaut werden konnte).
Zwei DNA-Fragmente, 1628 bp und 9219 bp, wurden nach dem Verdauen
mit SexAI gewonnen und ligiert, um das zusätzliche 15 bp-Fragment zu entfernen.
Schließlich
wurde LitmusSalINhelfrg/ΔF
(Δ5aa) konstruiert,
in dem das EGFP-Gen, das die EIS-Sequenz enthält, die stromaufwärts des
F-Gens gelegen ist und aus einer Vielzahl von 6 Anzahl von Nucleotiden
besteht, deletiert wurde. Nachdem das Plasmid mit SalI und NheI
verdaut wurde, wurde das resultierende Fragment gewonnen, mit einem
SalI/NheI-Fragment, das das F-Gen von pSeV 18+ enthält, ersetzt
und ligiert, um das Plasmid pSeV18+/ΔF (Δ5aa) zu konstruieren.
Die Insertion des angiogenen Gens (zum Beispiel des menschlichen
FGF2-Gens) in das Plasmid wurde wie folgt unter Verwendung der Restriktionsenzym
NotI-Erkennungssequenz,
die stromaufwärts
des NP-Gens gelegen ist, durchgeführt.
-
2. Konstruktion von F-Gen-defekter Sendai-Virusgenom-cDNA,
die hFGF2 codiert
-
Menschliche
FGF2(hFGF2)-cDNA wurde durch RT-PCR von vaskulären glatten Muskelzellen, die
von der menschlichen Arteria saphena magna mit dem Einverständnis des
Patienten isoliert wurden, und dadurch Sub-Clonieren des PCR-Produkts in pBluescriptSK+
(Stratagene, La Jolla, CA) an den HindiII-(5'-Ende) und EcoRI-(3'-Ende) Stellen erhalten. Zur selben
Zeit wurde bestätigt,
dass die hFGF2-cDNA-Sequenz
identisch zu der von Abraham et al. (Abraham, J. A. et al., EMBO
J. 5 (10), 2523–2528,
1986) berichteten Sequenz ist.
-
Um
das hFGF2-Gen an der Restriktionsenzym NotI-Stelle, die stromaufwärts des
NP-Gens in pSeV18+/ΔF (Δ5aa) gelegen ist, zu inserieren,
wurde eine SeV-spezifische
Sequenz (EIS-Sequenz) am 3'-Ende
des hFGF2-Gens zugefügt,
und das Fragment, das eine NotI-Erkennungssequenz an beiden Enden
enthält,
wurde hergestellt. Genau wurde die PCR unter Verwendung der hFGF2-cDNA,
die vorstehend beschrieben ist, als eine Matrize und unter Verwendung
des N-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccg
aggatggcggcagcggcgcc/SEQ ID NO: 13), der ein Start-Codon enthält, und eines
C-Terminus-Primers (5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacat
tggaagaaaaagtatagc/SEQ ID NO: 14), der ein Stopp-Codon und die EIS-Sequenz enthält, durchgeführt. Das
PCR-Produkt wurde mit NotI verdaut und dann in pBluescriptSK+ (Stratagene,
La Jolla, CA) an einer NotI-Stelle subcloniert, um pBS-hFGF2 zu erhalten.
Die Nucleotidsequenz von pBS-hFGF2 wurde bestätigt.
-
Das
Fragment, das die hFGF2-cDNA enthält, wurde durch Verdauen von
pBS-hFGF2 mit NotI
erhalten und in pSeV18+/ΔF (Δ5aa) an einer NotI-Stelle, die
stromaufwärts
des NP-Gens gelegen ist, subcloniert, um eine genomische F-Gen-defiziente Sendai-Virus-cDNA
zu konstruieren, die das hFGF2-Gen enthält, pSeV18+hFGF2/ΔF (Δ5aa) (pSeV18+hFGF2/ΔF
(Δ5aa) wird
auch als pSeV18+hFGF2/ΔF angegeben). Darüber hinaus
wurde ein NotI-Fragment, das die hFGF2-cDNA enthält, an der NotI-Stelle in pSeV18+b(+) inseriert, das Virus-cDNA mit einer
Replikationsfähigkeit
codiert, um pSeV18+hFGF2 zu konstruieren.
Der replikative SeV-Vektor, der den menschlichen FGF2 exprimiert,
wurde von pSeV18+hFGF2 durch das bekannte
Verfahren (Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813–2820, 1997;
Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578–587; Yu, D. et al., 1997,
Genes Cells 2: 457–466)
hergestellt, um SeV-hFGF2 zu konstruieren.
-
3. Rekonstruktion und Amplifizierung des
F-Gen-defizienten SeV
-
Die
Rekonstruktion des F-Gen-defizienten SeV-Vektors wurde unter Verwendung
von F-exprimierenden Helferzellen (LLC-MK2/F; siehe
WO00/70055 und
WO00/70070 ), die das Sendai-Virus-F-Gen
(SeV-F) durch Cre-DNA-Rekombinase
induzierbar exprimierten, durchgeführt (die Zellen vor der Induktion
der SeV-F-Genexpression werden als LLC-MK2/F bezeichnet, und die
Zellen nach jener als LLC-MK2/F/Ad). Die LLC-MK2-Zellen wurden auf
ein Petrischale mit 10 cm Durchmesser zu 5 × 10
6 Zellen/Schale
ausgesät,
für 24 Stunden
inkubiert und dann für
1 Stunde (moi=2) mit einem T7-RNA-Polymerase-exprimierenden rekombinanten
Vaccinia-Virus transfiziert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83, 8122–8126,
1986), das mit Solaren und langwelligem ultraviolettem Licht (365
mm) für
20 min behandelt wurde. Der UV-Stratalinker 2400 (Katalognummer
400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA), der mit fünf 15 Watt-Lampen
ausgestattet ist, wurde für
die UV-Bestrahlung des Vaccinia-Virus verwendet. Die Zellen wurden
dann zweimal gewaschen. Die Plasmide pSeV18
+hFGF2/ΔF, pGEM/NP,
pGEM/P, pGEM/L (Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569–579, 1996) und
pGEM/F-HN (
WO00/70070 )
wurden in OptiMEM (GIBCO) in einer Konzentration von 12 μg, 4 μg, 2 μg, 4 μg beziehungsweise
4 μg pro
Schale resuspendiert und dann mit dem SuperFect-Transfektionsreagenz
gemischt (1 μg
DNA/5 μl
SuperFect, QIAGEN). Das Gemisch wurde für 15 min bei Raumtemperatur
belassen, mit 3 ml OptiMEM, enthaltend 3% FBS, gemischt und dann
zu den Zellen zugefügt.
Die Zellen wurden für
3 bis 5 Stunden inkubiert, zweimal mit serumfreiem MEM gewaschen
und weiter in serumfreiem MEM, enthaltend 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid
(AraC, Sigma) und 7,5 μg/ml
Trypsin (GIBCO) für
24 Stunden inkubiert.
-
Das
Kulturmedium wurde von den Zellkulturen entfernt, und die F-exprimierenden Helferzellen LLC-MK2/F/Ad-Zellen,
die wie vorstehend beschrieben cloniert wurden, wurden auf die Zellen
geschichtet. Genau wurden die LLC-MK2/F/Ad-Zellen, die in serumfreiem
MEM (enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml
Trypsin) suspendiert waren, auf die Zellen geschichtet, in denen
das Kulturmedium entfernt worden war, und dann wurden die Zellen
für weitere
48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Schaber entfernt,
und die Pellets wurden in OptiMEM resuspendiert (10 Zellen/ml) und
dreimal gefroren und wieder aufgetaut. Diese Lysate (200 μl/Vertiefung)
wurden auf die LLC-MK2/F/Ad-Zellen geschichtet (4 × 106 Zellen/Vertiefung
einer Platte mit 12-Vertiefungen), 300 μl/Vertiefung serumfreies MEM
(enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml
Trypsin) wurden dazu zugefügt,
und die Zellen wurden für
15 bis 24 Stunden inkubiert. Das Kulturmedium wurde entfernt, und
die Zellen wurden mit serumfreiem MEM gewaschen. Frisches serumfreies
MEM (enthaltend 40 μg/ml AraC
und 7,5 μg/ml
Trypsin) wurde zu den Zellen zugefügt und dann für 5 bis
9 Tage inkubiert, und das Kulturmedium wurde gewonnen. Das gewonnene
Kulturmedium wurde verwendet, um LLC-MK2/F/Ad-Zellen zu infizieren,
und die Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, in serumfreiem
MEM (enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml
Trypsin) inkubiert, um F-Gen-defizientes SeV zu amplifizieren.
-
Zur
selben Zeit wurde das Kulturmedium, enthaltend F-Gen-defiziente
SeV-Partikel, zweimal
durch einen 0,22 μm-Filter
passiert, um kontaminierendes rekombinantes Vaccinia-Virus zu entfernen,
das während der
Rekonstruktion für
die T7-RNA-Polymerase-Expression verwendet wurde. Genau wurde das
Kulturmedium (Probe nach P2), das mindestens zweimal mit serumfreiem
MEM, enthaltend AraC (enthaltend 40 μg/ml AraC und 7,5 μg/ml Trypsin),
amplifiziert wurde, zweimal durch einen 0,22 μm-Filter passiert. Darüber hinaus wurde
das Kulturmedium, das einmal mit serumfreiem MEM, enthaltend AraC
(enthaltend 40 μg/ml
AraC und 7,5 μg/ml
Trypsin), amplifiziert wurde, gewonnen, um F-Gen-defizientes SeV
(SeV-hFGF2/ΔF)
zu erhalten, das ohne Kontamination eines rekombinanten Vaccinia-Virus
amplifiziert wurde.
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4. Gentherapie für eine ischämische Extremität unter
Verwendung eines replikativen und nicht-replikativen menschlichen
FGF2-Expressions-SeV-Vektor
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Die
vorliegenden Erfinder bewerteten die Behandlungswirkung durch die
Verabreichung eines replikativen und nicht-replikativen menschlichen
FGF2-Expressions-SeV-Vektors
unter Verwendung des schweren Ischämie-Modells von BALG/c nu/nu-Mäusen (Auto-Amputations-Modell),
das im Beispiel 1 beschrieben wurde. Der angiogene Gentransfer wurde
in derselben Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt. Die Vektoren wurden während der
Operation injiziert. Die Extremitäten-Amputation nach der Operation wurde
beobachtet, und die Extremitäten-Erhaltungsrate (Rate
der Zahl der Individuen, die die Extremitäten behielten, zu der Gesamtzahl von
Tieren) in jedem Zeitraum wurde berechnet (13).
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Die
Kontrollmäuse,
die das Luciferase-Expressions-SeV (SeV-Luciferase) erhielten, zeigten
eine hohe Extremitäten-Amputationsrate, ähnlich zu
den nichtverabreichten Mäusen.
Im Gegensatz dazu wurde die Extremitäten-Amputation in Mäusen, die
den menschlichen FGF2-Expressionsvektor (SeV-hFGF2 und SeV-hFGF2/ΔF) erhielten,
signifikant unterdrückt.
Dieses Experiment offenbarte, dass der menschliches FGF2-exprimierende
Paramyxovirus-Vektor hochwirksam als ein angiogener Gentransfer-Vektor
ist, um ischämische
Krankheiten zu behandeln, und dass ein nicht-replikativer Paramyxovirus-Vektor
wirksam für
eine Ischämie-Behandlung ist. SEQUENZPROTOKOLL