KR20030074627A - 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용을 제공한다. 파라믹소바이러스 벡터를 사용함으로써, 개체조직에 혈관신생 유전자를 효율 좋게 도입하는 것이 가능해졌다. in vivo 투여로 도입된 FGF2 유전자는 허혈조직에 있어서 부종을 동반하지 않고 혈관신생 유전자를 발현하여, 허혈에 의한 괴사를 방지하였다. 본 발명의 벡터는 허혈조직을 대상으로 한 유전자 치료에 적합하게 사용된다.

Description

혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용{Paramyxovirus vector encoding angiogenesis gene and utilization thereof}

최근, 혈관신생을 유도하는 증식인자를 사용한 허혈질환의 치료에 관한 연구가 진행되고 있다. 예를 들면, 심근경색이나 급성 허혈지(虛血肢)에 대해서, 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)(Baffour, R. et al., J. Vasc. Surg. 16(2): 181-91, 1992)나 내피세포 증식인자(endothelial cell growth factor; ECGF)(Pu, L. Q. et al., J. Surg. Res. 54(6): 575-83, 1993)의 투여에 의한 치료 효과가 조사되고 있다. 보다 최근에는, 혈관내피 증식인자/혈관 투과성 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF/vascular permeability factor; VPF)가 심근허혈 및 사지허혈의 동물모델에 있어서 혈관형성을 촉진하는 것이 나타나 있다(Takeshita, S. et al., Circulation 90(5 Pt 2): II228-34, 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93(2): 662-70, 1994).

또한, 최근 혈관신생을 유도하는 증식인자를 사용한 인간 유전자 치료의 임상시험이 개시되어, 이것을 중증 허혈지의 혈관신생 치료에 대해서 임상 응용하는 연구도 진행되고 있다. 내피세포 특이적인 증식인자인 혈관내피 증식인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF)는 이 목적에 적합한 치료 유전자로 간주되고 있으며, 실제 플라스미드 벡터를 사용한 인간으로의 유전자 도입에 있어서 비교적 양호한 치료 효과가 보고되어 있다(Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114-1123(1998); Isner, J. M., et al., J. Vasc. Surg. 28, 964-973(1998)). 그러나, 플라스미드를 사용한 근육으로의 유전자 도입 및 발현 효율은 그다지 높지 않아, VEGF의 근육 중 유전자 투여의 유해한 부작용이나 독성 레벨에 대해서는 현재 거의 보고가 없다. 최근의 보고에 의하면, 트랜스제닉(Thurston, G., et al., Science 286, 2511-2514(1999)) 또는 아데노바이러스(Thurston, G., et al., Nature Med. 6, 460-463(2000))에 의한 VEGF의 과잉 발현이 유전자가 도입된 동물에 있어서 비정상적인 혈관형성을 일으키는 것, 더욱이 플라스미드에 의한 근육 중으로의 VEGF 유전자 도입이 인간의 허혈지에 있어서 일과적인 부종을 일으키는 것이 나타나 있지만(Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114-1123(1998); Isner, J. M., et al., J. Vasc. Surg. 28, 964-973(1998)), 이들의 상세한 기구는 명확하지 않다. 또한, VEGF의 과잉 발현은 혈관신생 시그날의 균형을 무너뜨려 혈관 종양의 취약 모세관을 형성하는 가능성을 생각할 수 있다(Carmeliet, P., Nature Med. 6, 1102-1103(2000)). 또한, VEGF를 in vivo로 혈관벽으로 유전자 도입한 경우, 혈관 종양의 내피 증식에 의하여 신생 내막의 현저한 비후를 초래하여 적혈구의 혈관외유출(extravasation)을 일으킬 수 있다(Yonemitsu, Y., et al., Lab. Invest. 75, 313-323(1996)). 또한 레트로바이러스를 사용하여 심근에 항상적으로 VEGF를 과잉 발현시킨 경우에서도 동일한 병리 소견이 관찰되고 있다(Lee, R. J., et al., Circulation 102, 898-901(2000)). 또 특히 임상 적용을 생각한 경우, 국소적으로 발현시킨 이들의 혈관신생 인자가 전신의 순환계에 누출되는 레벨은 지극히 중요한 문제로, 예상 밖의 혈관신생의 합병증에 의한 당뇨병성 망막증이나 종양 증식이 우려된다.

한편, 주간(主幹)동맥이 급성으로 폐색됨으로써 발증하는 급성 중증 허혈지는 주로 혈전성 폐색에 기인하여, 혈관신생 치료의 대상이 되는 중요한 허혈질환 중 하나이다. 급성 중증 허혈지의 후기 치료의 성적은 지극히 불량하여 대부분의 경우 사지 절단에 이른다. 더욱이 사지 절단에 이른 환자의 생명 예후도 불량하여 1년 생존율은 50%로 낮다. 플라스미드에 의한 유전자 발현 레벨은 낮고, 이와 같은 보다 중독한 급성 동맥폐색 등에 대한 유효성은 아직 명확하지 않다.

본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터, 상기 벡터를 포함하는 혈관신생 조성물 및 상기 벡터를 이용하여 허혈조직의 혈관신생을 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명자 등의 예비적인 연구에 의하면, 급성 중증 허혈지의 마우스 모델에 있어서, 플라스미드를 베이스로 한 VEGF165의 유전자 도입에서는 사지 구제(limb salvage)에 성공하지 못했다(데이터 생략). 도입유전자를 보다 강하게 발현시킴으로써 보다 양호한 결과가 얻어지는지를 확인하기 위해, 본 발명자 등은 여러 기관에서 높은 효율로 유전자를 도입할 수 있는 것이 시사되어 있는 재조합 센다이 바이러스(SeV)를 매개로 한 유전자 도입에 의하여 치료유전자를 도입하는 연구를 행하였다. 실시예에 있어서 본 발명자 등은 허혈지 치료를 위한 도구로서 2개의 재조합 SeV 벡터, 즉 인간 VEGF165를 발현하는 SeV 벡터 및 단백질로서 투여했을 때에 혈관신생 작용을 나타내는 증식인자인 것이 알려져 있는 FGF2(bFGF라고도 한다)(Baffour, R. et al., J. Vasc. Surg. 16: 181-191(1992))에 착안하고, 마우스 FGF-2를 발현하는 SeV 벡터를 구축하여 사용하였다. 이들 벡터를 사용하여 (1) SeV를 매개로 한 근육 중 유전자 도입에 있어서의 도입유전자의 발현 레벨과 카이네틱스(kinetics), (2) 혈관신생 인자의 고발현이 급성 중증 허혈지의 사지 괴사를 막는지 또는 반대로 유해하게 작용하는지, 그리고 (3) 근육 중에 있어서 고발현시킨 혈관신생 단백질이 전신의 순환계로 누출되는지의 여부에 대해서 실험을 행하였다.

허혈 모델에는 외장골(外腸骨) 동정맥부터 슬상(膝上) 대퇴동정맥까지 모두를 제거(중증 허혈 모델)하여 얻어지는 BALB/c nu/nu 마우스 하지 탈락 모델(auto-amputation 모델), 동일 조작 후의 생리적 혈관신생에 의하여 하지 탈락에 이르지않는 C57BL/6 마우스 사지 구제 모델(limb salvage 모델)을 사용하였다. 인간 VEGF165, 마우스 FGF2 또는 루시페라아제를 발현하는 벡터(각각 SeV-hVEGF165, SeV-mFGF2 또는 SeV-luciferase)를 구축하여, 허혈수술 2일 전에 대퇴근, 하퇴근에 투여하고, 수술 후 10일까지 하지의 상태를 관찰하였다.

루시페라아제 유전자를 사용한 마우스 하지 골격근으로의 유전자 도입에서는 100 ㎍의 플라스미드 투여에서의 발현 레벨(인간 60 kg에 대해서 200 mg: 임상 사용량의 25~50배에 상당)에 비교하여, SeV에서는 5~120배 높은 유전자 발현이 얻어졌다. 각종 배양세포에서는 SeV-hVEGF165, SeV-mFGF2 모두 50~500 ng/10⁵cells/24 hours로 높은 단백의 분비를 인정하였다. SeV-mFGF2의 근육내 투여는 비투여 대조(베이스 라인)에 비해 FGF2 레벨을 5~100배로 상승시킨 것에 대해서, SeV-hVEGF165의 투여에서는 근육에 있어서 한정된 발현밖에 보이지 않아(최대이더라도 베이스 라인의 2배), 내인성 VEGF의 발현을 현저하게 증가시켰다. SeV-hVEGF165의 투여에 있어서는, 벡터 투여를 받은 근육조직이 투여 후 2일째에는 광범한 괴사에 빠져 후지(後肢)의 탈락을 촉진하는 결과가 되었다. 한편, SeV-mFGF2 투여에서는 내인성 VEGF의 발현을 동반하여 사지 구제에 있어서 유의한 치료 효과가 얻어졌다. 양쪽에서 혈청 중에 유의한 벡터 유래 단백의 유출이 인지되지 않았다(<5 pg/ml). 사지 구제 모델에서는 수술만 행한 군, SeV-luciferase군 및 SeV-mFGF2군에 있어서 모두 사지가 구제되었지만, SeV-hVEGF군에서만 1/3 이상의 개체의 하지가 탈락하였다. 하지 탈락 모델에서는 FGF2군에서만 높은 사지 구제 효과가 얻어지고, 다른 군에서는 대부분의 하지가 탈락하였다.

본 발명에 있어서, 재조합 센다이 바이러스 벡터의 근육 중 투여가 도입유전자의 발현을 현저하게 증강시키는 것이 실증되었다. 재조합 센다이 바이러스 벡터는 플라스미드 벡터에 비하여 10~100배 이상 높은 발현을 나타냈지만, VEGF165를 발현하는 재조합 센다이 바이러스 벡터의 in vivo 투여에 있어서는 마우스의 급성 중증 허혈지에 있어서의 사지 탈락을 오히려 증악화시키는 것이 명확해졌다. SeV-hVEGF165의 투여는 부종을 일으키고(실시예 4, 도 8), 허혈수술 후의 혈류 회복을 방해하였다(실시예 5, 도 11 및 12). 그리고, 허혈에 의한 사지 탈락의 비율을 유의하게 증악화시켰다(실시예 5, 도 9 및 10). 이것은 VEGF의 강한 혈관 투과성 항진작용이 하나의 원인으로 생각된다. 이에 대해, FGF2를 발현하는 센다이 바이러스 벡터의 투여는 일정하게 높은 치료 효과를 나타냈다. 어느 모델에 있어서도 전신의 순환계에 분비된 재조합 단백질은 검출되지 않는 것으로 보아, 다른 장기로의 영향이 작고 안전역이 높은 것이 시사되었다. 이들 결과는, 인간으로의 임상 적용에 있어서 특정 사지상태에 있어서의 VEGF의 바람직하지 않은 효과에 주의를 기울일 필요가 있음을 나타내고 있다. 그리고, 보다 넓은 범위에서 안전성과 치료 효과를 나타내는 FGF2의 유전자 치료가, 안전한 유전자 치료계가 될 수 있음이 나타났다. 또한, 본 발명은 in vivo에 있어서의 치료유전자 도입에서의 강력한 도구인 SeV 벡터의 유효성을 실증하는 동시에, 급성 중증 허혈지에 대한 임상 치료에 있어서의 이용을 가능하게 한다.

즉, 본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는

(1) 혈관신생 유전자를 발현 가능하게 코드하는 파라믹소바이러스 벡터,

(2) (1)에 있어서, 혈관신생 유전자가 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)인 파라믹소바이러스 벡터,

(3) (1)에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 파라믹소바이러스 벡터,

(4) (1)에 있어서, F 유전자를 결손하고 있는 파라믹소바이러스 벡터,

(5) (1)의 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포 및 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 포함하는 혈관신생 조성물,

(6) (5)에 있어서, 허혈조직을 처치하기 위한 조성물,

(7) (5)에 있어서, 근육 중 투여용인 조성물,

(8) (5) 내지 (7) 중 어느 하나의 혈관신생 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 혈관신생을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 (1) 사지 허혈이 유도하는 내인성 VEGF는 근육 중에 국재한다기 보다 오히려 전신 순환계에 확산되는 것에 대해, 본 발명의 벡터를 매개로 한 VEGF165의 발현은 전신 순환계에는 유의하게 누출되지 않는 것, (2) 내인성 FGF2의 발현에 비해 5~100배 높은 레벨로 외래성 FGF2를 발현시키더라도 전신 순환계로의 유의한 확산은 보이지 않는 것, (3) FGF2의 이 레벨의 발현은 내인성 VEGF의 발현을 유도하여, 사지의 혈류를 현저하게 증가시켜 유의한 사지 구제 효과를 나타내는 것, 그리고 (4) VEGF165의 과잉 발현은 FGF2와는 대조적으로 사지 파괴를유도하는 것이 나타났다. 이들 사실은 특히 FGF2는 임상 응용에 적합하고, 급성 중증 사지 허혈의 처치에 있어서의 치료 혈관신생 인자로서 넓은 안전역을 가지고 있는 것을 시사하고 있다. 또한 본 발명은 사지 허혈에 대한 VEGF165의 유전자 도입이 심각한 유해 효과를 초래할 수 있는 것을 처음 명시하는 것이다.

흥미깊게도, 사지 허혈에 의하여 유도되는 내인성 VEGF는 근육 중에 농축되지 않고, 전신 순환계로 확산되었다. 허혈수술이 근육 및 내피세포(EC)에 있어서 내인성 VEGF의 발현을 유도하는 것은 알려져 있었지만(Florkiewicz, R. Z. et al., J. Cell. Physiol. 162, 388-399(1995)), 본 발명은 내인성 VEGF가 국소적인 혈관신생이 아니라 전신적인 혈관신생 반응을 유도하는 가능성을 나타내는 최초의 실험 데이터를 개시한다. Asahara 등은 VEGF의 전신 투여는 내피 전구세포(endothelial progenitor cells; EPCs)의 이동성을 상승시키는 것을 나타내고 있고(Asahara, T, et al, EMBO J. 18, 3964-3972(1999)), 사지 허혈에 대한 생리적 반응에 의한 측지 혈관(collateral vessels)의 형성은 기존의 혈관으로부터 방출되는 증식성 EC에 의한 국소적 혈관신생(Isner J. M., J. Clin. Invest. 106, 615-619(2000)) 보다도 EPC를 매개로 한 「혈관신생 유사」의 신혈관형성("vasculogenesis-like" neovascularization)에 어느 정도 의존하고 있을 가능성이 있다. 허혈지로의 유전자 도입에 의한 VEGF의 유도는 유의한 혈류를 초래하지 않고 사지 탈락을 일으키는 것이 판명되었지만, 이 경우 VEGF는 「혈관신생 인자」가 아니라 주로 「혈관투과 인자」로서 작용하고 있는 것인지도 모른다. 이것은 근육의 조직학적 관찰에 의하여 VEGF165군에서 보다도 중독한 근육간 부종이 보였다는 것으로도 지지된다.

둘째로, 본 발명에 의하여 FGF2의 유전자 치료는 그 자신만으로 허혈지의 처치에 있어서 효과를 가지고 있고, 또한 in vivo에 있어서의 내인성 VEGF의 기능도 관여하고 있는 것이 나타났다. FGF2의 유전자 도입에 의한 근육 중의 VEGF의 총 단백질 농도는 VEGF 유전자 도입에 있어서의 경우와 동등하지만, FGF2 유전자 치료 자체는 VEGF 유전자 치료와는 달리 충분한 효과를 나타냈다. 이들 사실은, 허혈지의 치료에 필요한 혈액을 관류시키고, 또한 혈관누출을 일으키지 않는 성숙 혈관이 형성되는 데에는 VEGF 뿐만 아니라 FGF2도 필요함을 시사하고 있다. VEGF에 의하여 유도되는 미성숙 혈관의 혈관누출을 억제하는 작용을 가지는 혈관신생 인자인 angiopoietin-1이 이것에 공헌하고 있을 가능성도 생각할 수 있다.

SeV-VEGF165는 in vitro에 있어서 SeV-FGF2와 동일한 레벨로 유전자 산물을 분비시키는 것이 나타나 있기 때문에, in vivo의 근육 중에 있어서 주입된 SeV-VEGF165가 왜 SeV-FGF2나 SeV-luciferase와 동일한 발현을 나타내지 않는지는 완전히 명확하지는 않다. 조직학적인 해석과 동일하게, 레이저 도플러 관류상(LDPI) 해석에서도 근조직의 강한 파괴와 혈액관류의 저하가 나타났기 때문에, VEGF165가 유도하는 부종 등의 조직파괴의 결과로서 예를 들면 튜뷸린(Moyer, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5405-5409(1986))이나 포스포글리세레이트 키나아제(Ogino, T., et al., J. Biol. Chem. 274, 35999-36008(1999)) 등의 SeV가 매개하는 전사의 세포내 기구가 장애받을 가능성을 생각할 수 있다. 또는, 비교적 낮은 레벨의 내인성 VEGF165 유전자의 발현(약 200 pg/g muscle)이 중증 허혈근에서는 현저하게 증가(1,400 pg/g muscle)하기 때문에, 사지 탈락이 촉진될 가능성도 생각할 수 있다. 이들의 결과는, 근육 중의 VEGF 농도의 증가는 예를 들어 베이스 라인의 2배 정도의 저레벨이라고 해도 중증의 사지 허혈을 초래할 가능성을 강하게 시사하고 있다.

혈관신생은 잘 조화된 과정으로 다수의 인자가 관여하고 있다고 생각되고 있다. 이들 인자 중에서도 VEGF의 생물학적 기능은 그 용량에 고도로 의존하고 있어 대립유전자가 하나 결실하는 것 만으로도 치명적인 결손을 초래한다(Carmeliet, P. et al., Nature 380, 435-439(1996)). 혈관의 통합 및 성숙의 전과정에 있어서 VEGF의 지속적인 발현이 필요하고, 일과적인 VEGF의 발현은 단시간의 혈관신생 반응 밖에 유도하지 않으며(Pettersson, A. et al., Lab. Invest. 80, 99-115(2000)), 더욱이 VEGF가 유도하는 모세관 유사 구조는 기존의 혈관과는 거의 연결되지 않는다(Springer, M. L., et al., Mol. Cell 2, 549-558(1998)). 따라서, 본 발명의 결과로부터는, 충분한 FGF2가 존재하지 않는 경우에 근육 중의 VEGF 농도가 2배를 상회하면 매우 유독해질 가능성이 시사된다. 이들을 종합하여 생각해보면, 치료적 혈관신생에 있어서 VEGF는 임상적으로 매우 높을 가능성을 가지는 것에 변함은 없지만, VEGF의 사용에는 종래 이상으로 주의를 기울여야 하는 것이 시사된다. 그리고 급성 중증 사지 허혈의 사지 구제에 있어서의 근육내로의 FGF2 유전자의 도입은 안전하고 현저한 치료적 효과를 발휘하는 것이 실증되었다.

본 발명에 있어서 「파라믹소바이러스 벡터」란 파라믹소바이러스에 유래하여 유전자를 숙주세포에 도입하는 벡터(담체)를 가리킨다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 리보핵산단백질(RNP)이더라도 좋고, 또한 감염력을 가지는 바이러스입자이더라도 좋다. 여기서 「감염력」이란 재조합 파라믹소바이러스 벡터가 세포로의 접착능 및 막 융합능을 보유하고 있음으로써, 접착된 세포의 내부에 벡터 내부의 유전자를 도입할 수 있는 능력을 말한다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 복제능을 가지고 있더라도 좋고, 복제능을 가지지 않는 결손형 벡터이더라도 좋다. 「복제능을 가진다」란 바이러스 벡터가 숙주세포에 감염한 경우, 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되어 감염성 바이러스 입자가 생산되는 것을 가리킨다. 복제능은 예를 들면 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2 또는 CV-1 등을 사용하여 조사할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「재조합」 파라믹소바이러스 벡터란 유전자 조작에 의하여 구축된 파라믹소바이러스 벡터 또는 그것을 증폭하여 얻어지는 파라믹소바이러스 벡터를 말한다. 재조합 파라믹소바이러스 벡터는 예를 들면, 재조합 파라믹소바이러스 cDNA를 재구성하여 생성하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 파라믹소바이러스란 파라믹소바이러스과에 속하는 바이러스 또는 그 유도체를 가리킨다. 본 발명을 적용할 수 있는 파라믹소바이러스로서는 예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(simian parainfluenza virus)(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1,2,3형 등을 들 수 있다. 본 발명의 바이러스는 바람직하게는 파라믹소바이러스속(Paramyxovirus)에 속하는 바이러스 또는 그 유도체이다. 본 발명을 적용할 수 있는 파라믹소바이러스속 바이러스로서는, 예를 들면 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus; 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형이라고도 불리운다) 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 및 그 밖의 많은 파라믹소바이러스속 바이러스가 포함된다. 본 발명의 파라믹소바이러스는 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다. 이들 바이러스는 천연주, 야생주, 변이주, 실험실 계대주(laboratory-passaged strain) 및 인위적으로 구축된 주 등일 수 있다. DI 입자(J. Virol. 68, 8413-8417(1994)) 등의 불완전 바이러스나 합성된 올리고뉴클레오티드 등도 본 발명의 바이러스 벡터를 제조하기 위한 재료로서 사용할 수 있다.

파라믹소바이러스의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자로서는 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자가 포함된다. 「NP, P, M, F, HN 및 L 유전자」란 각각 뉴클레오캡시드(nucleocapsid), 포스포(phospho), 매트릭스(matrix), 퓨젼(fusion), 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin-neuraminidase) 및 라지(large) 단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 파라믹소바이러스 아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 일반적으로, NP 유전자는 「N 유전자」로 표기되는 경우도 있다.

파라믹소바이러스속 NP P/C/V M F HN - L

루블라바이러스속 NP P/V M F HN (SH) L

모빌리바이러스속 NP P/C/V M F H - L

예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 레스피로바이러스(Respirovirus)로 분류되는 센다이 바이러스의 각 유전자의 염기서열 데이터베이스의 액세션 번호(accession number)는 NP 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 DOO152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조할 것.

본 발명에 있어서 「유전자」란 유전물질을 가리키며, RNA 및 DNA 등의 핵산이 포함된다. 일반적으로, 유전자는 단백질을 코드하더라도 좋고, 또한 단백질을 코드하고 있지 않더라도 좋다. 유전자는 리보자임(ribozyme) 또는 안티센스 RNA 등의 기능적 RNA를 코드하는 것이더라도 좋다. 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「DNA」란 단일가닥 DNA 및 이중닥 DNA를 포함한다.

본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 용도를 제공한다. 본 발명자 등은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터를in vivo로 근육 중에 투여함으로써, 투여부위에 있어서 도입유전자를 고발현시킬 수 있는 것을 실증하였다. 본 발명자 등에 의한 마우스 허혈 후지의 사지 구제 실험에서는 혈관신생 유전자(FGF2)를 코드하는 재조합 파라믹소바이러스 벡터의 투여에 의하여, 허혈조직의 괴사가 방지되고 후지의 탈락을 예방할 수 있는 것이 나타났다. 이들 벡터는 허혈조직에 있어서 효과적으로 혈관신생을 유도하여 괴사를 방지하기 때문에 유용하고, 본 발명의 벡터는 허혈질환에 대한 유전자 치료에 적합하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명자 등에 의하여, 재조합 파라믹소바이러스 벡터를 이용하여 근육 중에 투여된 유전자가 1~2주일에 걸쳐 지속적으로 발현하는 것이 나타났다. 이것은 재조합 파라믹소바이러스 벡터를 이용하여 혈관신생 인자의 유전자 치료를 행한 경우에 지속적인 치료 효과를 얻을 수 있다고 하는 이점을 가져온다. 더욱이, 근육 중 투여된 재조합 파라믹소바이러스 벡터로부터 발현된 혈관신생 인자는 전신의 순환계에서는 검출되지 않아, 대상조직 이외에서의 바람직하지 않은 부작용을 야기하지 않는 점에서도 유용한 것이 나타났다. 이와 같이 파라믹소바이러스 벡터가 혈관신생 유전자의 도입에 있어서 여러 가지 이점을 가진다고 하는 본 발명에 의하여 얻어진 사실은, 특히 허혈조직을 표적으로 한 유전자 치료 등에 있어서 큰 진보를 가져올 가능성을 나타내고 있다.

또한, 안전성면에 있어서도 인간으로의 병원성이 부정되고 있기 때문에, 파라믹소바이러스 벡터는 인간으로의 유전자 치료의 임상시험에 적합하게 사용될 수 있는 것이 시사된다. 첫째로, 플라스미드 DNA 등에 의한 외래유전자의 발현은 대부분의 경우, 도입한 DNA의 핵 국재화 또는 핵막의 소실이 필요한 것이 유전자 발현의 성공률을 저하시키는 주요한 장애가 되고 있다. 그러나, 예를 들면 센다이 바이러스 등의 경우, 외래유전자의 발현은 세포질 내에서 세포성 튜뷸린(cellular tubulin) 및 자신이 가지는 RNA 폴리머라아제(L 단백질) 양쪽에 의하여 바이러스의 복제에 동반되어 구동된다. 이것은, 센다이 바이러스가 숙주의 염색체와 상호 작용하지 않는 것을 나타내고 있어, 염색체 이상에 의한 세포의 암화 및 불사화(不死化) 등 안전면에 있어서의 문제가 발생하지 않는다고 생각된다. 둘째로, 센다이 바이러스는 설치류에 있어서는 병원성으로 폐렴을 발생시키는 것이 알려져 있지만, 인간에 대해서는 병원성이 없다. 이것은 또한, 야생형 센다이 바이러스의 경비적 투여에 의하여 비인간 영장류에 있어서 중독한 유해작용을 나타내지 않는다는 지금까지의 보고에 의해서도 지지되고 있다(Hurwitz, J. L. et al., Vaccine 15: 533-540, 1997). 센다이 바이러스의 이들 특징은 센다이 바이러스 벡터를 인간의 치료에 응용할 수 있는 것을 시사하고, 센다이 바이러스 벡터가 혈관신생 유전자의 유전자 치료에 있어서의 유망한 선택지 중 하나가 되는 것을 지지하는 것이다.

본 발명에 있어서 혈관신생 유전자란 혈관신생(angiogenesis) 및/또는 혈관형성(vasculogenesis)을 직접 또는 간접적으로 촉진하는 활성을 가지는 인자를 코드하는 유전자를 가리킨다. 상기 인자는 단백질 또는 펩티드이더라도 좋고, 또한 기능적 RNA(리보자임이나 안티센스 RNA) 등의 핵산이더라도 좋다. 혈관신생 단백질로서는, 예를 들면 산성 섬유모세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor; aFGF), 섬유모세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)(염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF)라고도 한다), 혈관내피 증식인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 안지오포이에틴(angiopoietins; Ang)(Ang-1 및 Ang-2를 포함한다), 상피 증식인자(epideramal growth factor; EGF), 트랜스포밍 증식인자 α(transforming growth factor-α; TGF-α), TGF-β, 혈소판 유래 내피 증식인자(platelet-derived endothelial cell growth factor; PD-ECGF), 혈소판 유래 증식인자(platelet-derived growth factor; PDGF), 종양 괴사인자 α(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor; HGF), 인슐린 유사 증식인자(insulin-like growth factor; IGF), 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO), 콜로니-자극인자(colony-stimulating factor; CSF), 마크로파지-CSF(macrophage colony-stimulating factor; M-CSF), 과립구/마크로파지 CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF), 인터류킨(interleukin; IL)-8 및 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase; NOS)를 들 수 있다(Klagsbrun, M. and D'Amore, P., A. Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39, 1991; Folkman, J. and Shing, Y., J. Biol. Chem. 267(16): 10931-4, 1992; Symes, J. F. and Sniderman, A. D., Curr. Opin. Lipidol. 5(4): 305-12, 1994).

본 발명에 있어서 바람직한 혈관신생 단백질로서는, 예를 들면 aFGF, FGF2, Ang-1, Ang-2, EGF, TGF-α, TGF-β, PD-ECGF, PDGF, TNF-α, HGF, IGF, EPO, CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8 및 NOS 등을 예시할 수 있고, 이들로부터 선택되는 단백질을 코드하는 유전자를 사용하여 벡터를 제작할 수 있다.

본 발명에 사용하는 혈관신생 단백질 중에서 특히 바람직한 단백질은 VEGF에 의하여 유도되는 미숙한 혈관신생이 아니라, 신생된 내피세포에 간엽계세포가 접착하여 벽세포로 분화하여 혈관을 둘러싸는 작용을 가지는 단백질이다. 혈관형성은 3개의 프로세스(맥관형성, 혈관신생, 혈관성숙)로 된 것이 알려져 있고, 성숙한 혈관형성은 각종 전사인자 녹아웃 실험으로부터 복수의 유전자의 관여가 알려져 있다. 특히 전사인자 SCL/tal-1은 주로 맥관형성에 관여하고, HIF-1, Id, ETS-1, HOXD₃, COUP-TFII, MEF2C는 혈관신생에 관여한다. 더욱이 LKLF(Lung kruppel-like factor) 또는 dHAND 유전자를 녹아웃하면 벽세포가 발달되지 않아 태생치사로 되는 것이 알려져 있다.

따라서 본 발명에 사용하는 혈관신생 유전자로서는 LKLF 및 dHAND를 포함하는, 간엽계의 미성숙한 세포에 있어서 벽세포의 성숙에 관여하는 것의 전사인자를 유도하는 유전자인 것이 보다 바람직하다. FGF2의 자극은 이들 전사인자의 유도에 직접 관여하고 있거나, 다른 증식인자인 안지오포이에틴 및 HGF 등을 통하여 간엽계 세포의 증식분화를 촉진하고 있다고 생각된다.

혈관신생 단백질은 바람직하게는 상기 단백질을 분비시키는 분비 시그날 서열을 포함한다. 단, FGF2 등은 천연의 전형적인 분비 시그날을 가지지 않아도 세포밖으로 분비된다(실시예 참조). 이러한 단백질은 반드시 분비 시그날을 가질 필요는 없다. 이들의 혈관신생 인자를 코드하는 유전자는 예를 들면 염기서열 정보를 토대로 하여 설계한 프라이머를 사용한 PCR 등의 공지의 방법에 의하여 조제할 수있다. 본 발명에 있어서 사용되는 특히 바람직한 혈관신생 인자로서는 광범위한 발현 레벨에 있어서 안정된 치료 효과를 발휘하는 FGF2를 예시할 수 있다(Abraham, J. A. et al., 1986, EMBO J. 5: 2523-2528; Moscatelli, D. A. et al., US4994559; Baird, A. et al., US5155214; Isner, J. M. US6121246; WO97/14307).

벡터가 탑재하는 혈관신생 유전자는 유전자 도입의 표적 개체와 동일한 종에 유래하는 유전자가 아니더라도 효과를 기대할 수 있지만, 표적 개체와 동일한 종의 유전자가 바람직하다. 벡터가 탑재하는 혈관신생 유전자는 바람직하게는 포유동물의 혈관신생 유전자이고, 인간으로의 적용을 위해서는 인간 유전자인 것이 바람직하다.

본 발명의 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터는 특히 허혈조직의 처치에 유용하다. 즉, 본 발명의 벡터를 사용한 혈관신생 유전자의 유전자 도입에 의하여 혈관신생을 촉진해, 허혈에 의한 괴사를 방지할 수 있다. 본 발명에 있어서 허혈조직으로서는 허혈을 일으킨 조직 및 허혈을 일으키고 있는 조직이라면 특별히 제한은 없다. 이러한 조직에는 예를 들면 근육, 뇌, 신장 및 폐가 포함된다. 본 발명의 벡터 투여의 대상이 되는 허혈질환에는, 예를 들면 뇌혈관 허혈, 신허혈, 폐허혈, 사지의 허혈, 허혈성 심근증 및 심근허혈을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 허혈조직의 처치란 허혈조직의 치료 또는 허혈장애의 예방을 가리키고, 구체적으로는 허혈조직의 괴사 방지, 허혈조직의 생존, 허혈조직에 있어서의 혈관신생의 촉진, 조직재생 또는 허혈에 기인하는 장애의 방지 ·저감 등을 의미한다.

본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터를 투여하는공정을 포함하는, 혈관신생을 유도하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터를 투여하는 것을 특징으로 하는, 허혈조직을 처치하는 방법을 제공한다. 투여대상이 되는 개체에 특별히 제한은 없어, 예를 들면 인간을 포함하는 목적의 포유동물을 들 수 있다. 또한 투여대상으로서, 특히 비인간 포유동물을 들 수 있고, 구체적으로는 예를 들면 원숭이 등을 포함하는 영장류[원원(原猿), 진원(眞猿)의 광비원(廣鼻猿) 및 협비원(狹鼻猿)의 유인원 등을 포함한다], 마우스, 래트, 모르모트를 포함하는 설치류 및 소, 개, 고양이, 말, 양, 토끼 등이 포함된다. 본 발명의 벡터를 사용하면 이들 동물에 대한 허혈치료가 가능하고, 또는 인간 허혈치료의 모델로서 이용하는 것도 가능하다(Morinaga, K. et al., 1987, J. Vasc. Surg. 5: 719-730; Itoh, H. et al., 1994, Atherosclerosis 110: 259-270).

본 발명의 혈관신생을 유도하는 방법은 구체적으로는 이하를 포함한다. [1] 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 투여하는 공정을 포함하는, 혈관신생을 유도하는 방법, [2] [1]에 있어서, 혈관신생 유전자가 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)인 방법, [3] [1] 또는 [2]에 있어서, 투여가 근육 중 투여인 방법, [4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 방법. 또한 본 발명의 허혈조직을 처치하는 방법은 구체적으로는 아래를 포함한다. [1] 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 투여하는 공정을 포함하는, 허혈조직을 처치하는 방법, [2] [1]에 있어서, 혈관신생 유전자가 섬유모세포 성장인자2(FGF2)인 방법, [3] [1] 또는 [2]에 있어서, 투여가 근육 중 투여인 방법, [4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 방법.

투여는 in vivo이더라도 ex vivo이더라도 좋다. in vivo 투여인 경우는 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터를 근육주사, 피하주사, 카테터 투여 등의 당업자에게 공지인 투여 경로에 의하여 주입할 수 있다. ex vivo 투여인 경우는 미리 체외에서 세포에 이 벡터를 도입한다. 그 후, 벡터를 도입한 세포를 근육주사, 피하주사, 카테터 투여 등에 의하여 개체내에 주입한다. ex vivo 투여에 있어서 벡터를 도입하는 세포는 투여 개체와 다른 종 또는 같은 종이더라도 좋지만, 바람직하게는 같은 종, 보다 바람직하게는 투여 개체로부터 채취한 세포이다. 더욱이 가장 바람직하게는, 혈관 내피세포를 형성 또는 혈관 내피세포로 분화할 수 있는 세포, 즉 혈관내피 전구세포를 포함하는 골수 또는 혈액 유래의 세포이다. 약학적 유효량의 본 발명의 벡터를 투여함으로써 투여조직에 있어서 혈관신생을 유도할 수 있다. 이것에 의하여, 예를 들면 뇌, 심장, 신장, 폐 및 사지 등의 허혈에 있어서, 조직의 괴사 및 탈락을 방지하는 치료가 가능하다.

또한, 본 발명은 허혈조직을 처치하기 위한, 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터의 용도 및 사용을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은

[1] 허혈조직을 처치하기 위한, 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터,

[2] [1]에 있어서, 혈관신생 유전자가 섬유모세포 성장인자 2[FGF2]인 벡터,

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 근육 중 투여용인 벡터,

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 파라믹소바이러스 벡터를 포함하는, 허혈조직을 처치하기 위한 조성물을 제공한다. 이 조성물은 상기 파라믹소바이러스 벡터 이외에, 약학적으로 허용되는 목적의 담체를 포함하더라도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 벡터를 생리적 용액과 조합하여 주사제로서, 또는 고체 또는 반고체(겔)와 조합하여 체내 삽입형 제제로서 제제화하여 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 혈관신생 유전자의 도입에 사용하는 파라믹소바이러스 벡터로서는 특별히 제한은 없다. 적절한 파라믹소바이러스 벡터로서 예를 들면 복제능을 가지고, 자립적으로 증식하는 벡터를 들 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 천연형 파라믹소바이러스의 게놈은 3'의 짧은 리더영역(leader region)에 이어서 N(뉴클레오캡시드), P(포스포), M(매트릭스), F(퓨젼), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제) 및 L(라지) 단백질을 코드하는 6개의 유전자가 늘어서 있고, 짧은 5'트레일러영역(trailer region)을 다른 말단에 가진다. 이것과 동일한 구조를 가지는 게놈을 설계함으로써 자율복제 가능한 본 발명의 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 게놈내에 외래유전자를 삽입함으로써 외래유전자를 발현하는 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터에 있어서는 바이러스 유전자의 배치는 야생형 바이러스로부터 개변되어 있더라도 좋다.

또한, 본 발명에 사용하는 파라믹소바이러스 벡터로서는 야생형 파라믹소바이러스가 가지는 유전자 중 어느 하나를 결손한 것이더라도 좋다. 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터를 재구성시키는 경우, NP, P/C 및 L 유전자로부터 만들어지는 단백질군이 트랜스(trans)에 필요하다고 생각되고 있지만, 상기 단백질군을 코드하는 유전자 자체는 본 발명의 바이러스 벡터에 반드시 포함되어 있을 필요는 없다. 예를 들면, 상기 단백질군을 코드하는 유전자를 가지는 발현 벡터를, 벡터 게놈을 코드하는 발현 벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션함으로써 벡터의 재구성을 행할 수 있다. 또한, 상기 단백질군을 코드하는 유전자를 가지는 숙주세포에 벡터 게놈을 코드하는 발현 벡터를 도입하여, 상기 숙주세포로부터 상기 단백질군을 공급하여 재구성을 행하더라도 좋다. 이들 단백질군의 아미노산서열은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니어도, 핵산의 도입에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이라면, 변이를 도입하거나 또는 다른 바이러스의 상동 유전자로 대용하더라도 좋다.

또한, 파라믹소바이러스 벡터가 세포에 전파해 가기 위해서는 M, F 및 HN 유전자로부터 만들어지는 단백질군이 필요하다고 생각되고 있지만, 파라믹소바이러스 벡터를 RNP로서 조제하는 경우는 이들 단백질은 필요없다. RNP에 포함되는 게놈에 M, F 및 HN 유전자가 포함되어 있으면 숙주에 도입되었을 때에, 이들의 유전자 산물이 생산되어 감염성이 있는 바이러스 입자가 형성된다. 감염성 바이러스를 생산하는 RNP 벡터로서는, 예를 들면 N, P, M, F, HN 및 L 유전자를 코드하는 바이러스게놈 RNA와 N 단백질, P 단백질 및 L 단백질을 포함하는 RNP를 들 수 있다. 이러한 RNP를 세포내에 도입하면 N 단백질, P 단백질 및 L 단백질의 움직임에 의하여 바이러스 게놈이 발현, 복제되고, 감염성 바이러스 벡터가 증폭한다.

RNP를 세포에 도입하기 위해서는 예를 들면 리포펙트아민(lipofectamine)이나 폴리양이온 리포솜(polycationic liposome) 등과 함께 복합체를 형성시켜 도입하는 것이 가능하다. 구체적으로는 여러 가지 트랜스펙션 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 들 수 있다. 엔도솜(endosome) 중에서의 분해를 막기 위해 클로로퀸(chloroquine)을 가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). 복제형 바이러스의 경우, 생산된 바이러스는 배양세포, 계란, 개체(예를 들면 마우스 등의 포유동물) 등에 재감염시켜 증폭 또는 계대하는 것이 가능하다.

또한, M, F 및/또는 HN 유전자가 포함되어 있지 않은 파라믹소바이러스 벡터도 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터로서 적합하게 사용할 수 있다. 이러한 바이러스 벡터의 재구성은 예를 들면, 결손되어 있는 유전자 산물을 외래적으로 공급함으로써 행할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 바이러스 벡터는 야생형 바이러스와 동일하게 숙주세포에 접착하여 세포융합을 일으키지만, 세포에 도입된 벡터 게놈은 이들 중 어느 하나의 유전자를 결손하고 있기 때문에, 최초와 동일한 감염력을 가지는 딸 바이러스 입자는 형성되지 않는다. 이 때문에, 1회 제한의 유전자 도입력을 가지는 안전한 바이러스 벡터로서 유용하다. 게놈으로부터 결손시키는 유전자로서는 특히 F 유전자 및/또는 HN 유전자를 들 수 있다. 유전자의 결손이란, 그 유전자의 기능이 실질적으로 손실되는 것을 말하며, 그 유전자가 단백질을 코드하는 경우에 있어서는 그 야생형 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질이 발현되지 않는것을 말한다. 예를 들면, 그 유전자가 전사되지 않는 것, loss-of-function 변이체인 것, 또는 결실되어 있는 것 등이더라도 좋다. 바람직하게는, 유전자의 결손이란 그 유전자의 코드 영역의 적어도 일부가, 보다 바람직하게는 전부가 결실되어 있는 것이다. 예를 들면, F 유전자가 결손되어 있는 벡터는 바람직하게는 F 단백질의 코드 영역의 일부, 보다 바람직하게는 전부를 결실하고 있는 벡터이다. 본 발명의 F 유전자 결손 벡터는 보다 바람직하게는 그 네거티브 가닥 게놈에 있어서 결손된 F 유전자의 3'인접부위의 스타트 시그날 서열을 더욱이 결손하고 있다. 이에 따라, 결손부위로부터의 필요없는 폴리펩티드의 발현을 억제할 수 있다. 결손부위에 필요없는 폴리펩티드를 코드하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 존재하는 경우에는, 부위특이적 변이도입 등에 의하여 그 ORF를 제거하는 것이 바람직하다(후술).

F 유전자가 결손된 벡터의 제조에 있어서는, 예를 들면 F 유전자가 결손된 재조합 파라믹소바이러스 벡터 게놈을 발현하는 플라스미드를, F 단백질의 발현 벡터 및 NP, P/C 및 L 단백질의 발현 벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션함으로써, 바이러스 벡터의 재구성을 행할 수 있다(국제공개번호 WO00/70055 및 WO00/70070). 또한, 예를 들면 F 유전자가 염색체에 삽입된 숙주세포를 사용하여 제조하는 것도 가능하다. 이들 단백질군을 밖으로부터 공급하는 경우, 그 아미노산서열은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니어도, 핵산 도입에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이라면, 변이를 도입하거나 또는 다른 바이러스의 상동 유전자로 대용하더라도 좋다.

또한, 벡터 게놈이 유래하는 바이러스의 외피(envelope)단백질과는 다른 단백질을 벡터의 외피에 포함하는 벡터를 제작하는 것도 가능하다. 이러한 단백질에 특별히 제한은 없다. 예를 들면 다른 바이러스의 외피단백질, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 VSV-G 단백질 등과 같이 게놈이 유래하는 바이러스 이외의 바이러스에 유래하는 외피단백질을 포함하는 슈도타입(pseudo type) 바이러스 벡터가 포함된다.

또한, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 예를 들면, 외피 표면에 특정 세포에 접착할 수 있는 접착인자, 리간드, 수용체 등의 단백질, 또는 이들 단백질을 세포외 영역에 가지고 바이러스 외피 유래의 폴리펩티드를 세포내 영역에 가지는 키메라단백질 등을 포함하는 것이더라도 좋다. 이것에 의하여 특정 조직을 표적으로 하는 벡터를 만들어내는 것도 가능하다. 이들은 바이러스 게놈에 코드되어 있더라도 좋고, 바이러스 벡터의 재구성시에 바이러스 게놈 이외의 유전자(예를 들면 다른 발현 벡터 또는 숙주 염색체 등에 포함되는 유전자)의 발현에 의하여 공급되더라도 좋다.

또한, 본 발명의 바이러스 벡터는 예를 들면, 면역원성을 저하시키기 위해 또는 RNA의 전사효율이나 복제효율을 높이기 위해, 벡터에 포함되는 바이러스 유전자가 개변된 것이더라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 복제인자인 NP 유전자, P/C 유전자 및 L 유전자의 적어도 하나를 개변하여, 전사 또는 복제의 기능을 높이는 것을 생각할 수 있다. 또한, 구조체 단백질의 하나인 HN 단백질은 적혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin) 활성과 뉴라미니다아제(neuraminidase) 활성 양자의 활성을 가지는데, 예를 들면 전자의 활성을 약화시키는 것이 가능하다면 혈액중에서의 바이러스의 안정성을 향상시키는 것이 가능할 것이고, 예를 들면 후자의 활성을 개변함으로써 감염능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 막 융합에 관한 F 단백질을 개변함으로써, 막 융합능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 예를 들면 세포표면의 항원분자가 될 수 있는 F 단백질이나 HN 단백질의 항원제시 에피토프 등을 해석하고, 이것을 이용하여 항원제시능을 약화시킨 파라믹소바이러스 벡터를 제작하는 것도 가능하다.

또한 본 발명에 있어서의 파라믹소바이러스 벡터로서는, 악세사리 유전자가 결손된 것이더라도 좋다. 예를 들면 SeV의 악세사리 유전자의 하나인 V 유전자를 녹아웃함으로써, 배양세포에 있어서의 유전자 발현이나 복제는 장애받지 않고, 마우스 등의 숙주에 대한 SeV의 병원성이 현저하게 감소한다(Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179). 이러한 약독화 벡터는 in vivo 또는 ex vivo에 있어서의 유전자 도입용 바이러스 벡터로서 특히 적합하다.

본 발명의 바이러스 벡터는 게놈 RNA 중에 혈관신생 유전자를 코드한다. 외래유전자를 포함하는 재조합 파라믹소바이러스 벡터는 상기의 파라믹소바이러스 벡터 게놈에 외래유전자를 삽입함으로써 얻어진다. 외래유전자로서는 벡터 도입의 표적으로 하는 조직(허혈조직 등)에 있어서 발현시키고자하는 목적의 혈관신생 유전자를 사용할 수 있다. 외래유전자는 천연형 단백질을 코드하는 유전자이더라도 좋고, 또한 천연형 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질을 코드하는 한, 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 천연형 단백질을 개변한 단백질을 코드하는 유전자이더라도좋다. 예를 들면, 유전자 치료 등을 목적으로 하는 경우에는, 상기 바이러스 벡터의 게놈을 코드하는 DNA(바이러스 벡터 DNA)에 대상이 되는 질환의 치료용 유전자를 삽입한다. 바이러스 벡터 DNA에 외래유전자를 도입하는 경우는, 예를 들면 센다이 바이러스 벡터 DNA에 있어서는 전사종결(E)서열과 전사개시(S)서열과의 사이 등에, 6의 배수의 염기수를 가지는 서열을 삽입하는 것이 바람직하다(Calain P. and Roux L., 1993, J. Virol., 67(8), 4822-4830). 외래유전자는 바이러스의 각 유전자(NP, P, M, F, HN 및 L 유전자)의 앞 및/또는 뒤에 삽입할 수 있다. 전후의 유전자 발현을 방해하지 않도록 하기 위해, 외래유전자의 앞 또는 뒤에 적절히 E-I-S서열(전사개시서열-개재서열-전사종결서열) 또는 그 부분을 삽입하고, 각 유전자 사이에 E-I-S 서열을 배치한다. 또는, IRES와 함께 외래유전자를 삽입할 수 있다.

삽입한 외래유전자의 발현량은 외래유전자의 상류에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다(W001/18223). 또한, 유전자 삽입의 위치 및 유전자 전후의 염기서열에 따라 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스에 있어서는 삽입 위치가 바이러스 게놈의 네거티브 가닥 RNA의 3'말단에 가까울수록(야생형 바이러스 게놈 상의 유전자 배치에 있어서는 NP 유전자에 가까울수록) 삽입된 유전자의 발현량이 높다. 외래유전자의 높은 발현을 얻기 위해서는, 외래유전자를 NP 유전자의 상류(네거티브 가닥에 있어서는 3'측) 또는 NP 유전자와 P 유전자 사이 등, 네거티브 가닥 게놈에 있어서 상류영역에 삽입하는 것이 바람직하다. 반대로, 삽입위치가 네거티브 가닥 RNA의 5'말단에 가까울수록(야생형 바이러스 게놈 상의 유전자 배치에 있어서는 L 유전자에 가까울수록) 삽입된 유전자의 발현량이 낮아진다.외래유전자의 발현을 낮게 억제하기 위해서는, 예를 들면 네거티브 가닥의 가장 5'측, 즉 야생형 바이러스 게놈에 있어서는 L 유전자의 하류(네거티브 가닥에 있어서는 L 유전자의 5'인접부위), 또는 L 유전자의 상류(네거티브 가닥에 있어서는 L 유전자의 3'인접부위)에 외래유전자를 삽입한다. 이와 같이, 외래유전자의 삽입 위치는 상기 유전자의 목적의 발현량을 얻기 위해, 또한 전후의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자와의 조합이 최적이 되도록 적절히 조절할 수 있다. 예를 들면, 고역가 바이러스 벡터의 투여에 의한 혈관신생 유전자의 고발현이 독성을 나타내는 경우는, 투여하는 바이러스 역가를 제한할 수 있는 것 외에, 예를 들면 벡터에 있어서의 혈관신생 유전자의 삽입 위치를 네거티브 가닥의 되도록 5'측에 설정하거나, 전사개시서열을 효율이 낮은 것으로 하는 등, 개개의 바이러스 벡터로부터의 발현 레벨을 낮게 억제함으로써 적절한 치료 효과가 얻어지도록 하는 것도 가능하다.

외래유전자를 용이하게 삽입할 수 있도록 하기 위해 삽입부위에 클로닝 사이트를 설계할 수 있다. 클로닝 사이트는 예를 들면 제한효소의 인식서열로 할 수 있다. 게놈을 코드하는 벡터 DNA 중 해당 제한효소 부위에 외래유전자 단편을 삽입할 수 있다. 클로닝 사이트는 복수의 제한효소 인식서열을 가지는 소위 멀티클로닝 사이트(multicloning site)로 하더라도 좋다. 또한, 본 발명의 벡터는 이와 같이 삽입한 것 이외의 위치에 다른 외래유전자를 보유하고 있더라도 좋다. 이러한 외래유전자로서는 제한은 없어, 다른 혈관신생 유전자이더라도 좋고, 또 그 밖의 유전자이더라도 좋다.

외래유전자를 가지는 재조합 센다이 바이러스 벡터는 예를 들면, Hasan, M.K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466의 기재에 준하여, 다음과 같이 하여 구축할 수 있다.

먼저, 목적의 외래유전자의 cDNA 염기서열을 포함하는 DNA 시료를 준비한다. DNA 시료는 25 ng/㎕ 이상의 농도로 전기영동적으로 단일한 플라스미드로 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이하, 외래유전자를 NotI 부위를 이용하여 바이러스 게놈을 코드하는 DNA에 삽입하는 경우를 예로 들어 설명한다. 목적으로 하는 cDNA 염기서열 중에 NotI 인식부위가 포함되는 경우는, 부위특이적 변이삽입법 등을 사용하여 코드하는 아미노산서열을 변화시키지 않도록 염기서열을 개변하여, NotI 부위를 미리 제거해 두는 것이 바람직하다. 이 시료로부터 목적으로 하는 유전자 단편을 PCR로 증폭 회수한다. 증폭된 단편의 양끝을 NotI 부위로 하고, 더욱이 한쪽 끝에 센다이 바이러스의 전사종결서열(E), 개재서열(I) 및 전사개시서열(S)(EIS 서열)의 복제물을 부가하기 위해, NotI 제한효소 절단부위서열 및 전사종결서열(E), 개재서열(I) 및 전사개시서열(S)과 목적 유전자의 일부 서열을 포함하는 프라이머쌍으로서, 포워드측(센스 가닥) 합성 DNA서열 및 리버스측(안티센스 가닥) 합성 DNA서열(프라이머 세트)을 작성한다.

예를 들면, 포워드측 합성 DNA서열은 NotI에 의한 절단을 보증하기 위해 5'측에 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 스페이서 서열로서 임의의 9염기 또는 9에 6의 배수를 더한 수의 염기를 부가하여, 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA의 개시코돈 ATG로부터 이것을 포함하여 ORF의 약 25염기 상당의 서열을 부가한 형태로 한다. 마지막 염기는 G 또는 C가 되도록 상기 목적으로 하는 cDNA로부터 약 25염기를 선택하여 포워드측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 하는 것이 바람직하다.

리버스측 합성 DNA서열은 5'측으로부터 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않은 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 길이를 조절하기 위한 삽입단편의 올리고 DNA를 부가한다. 이 올리고 DNA의 길이는 NotI 인식부위 gcggccgc를 포함하여 cDNA의 상보 가닥 염기서열과 후술하는 센다이 바이러스에 유래하는 센다이 바이러스 게놈의 EIS 염기서열의 합계가 6의 배수가 되도록 염기수를 설계한다(소위 「6의 룰(rule of six)」; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1933). 더욱이 삽입단편의 3'측에 센다이 바이러스의 S서열의 상보 가닥 서열, 바람직하게는 5'-CTTTCACCCT-3'(서열번호: 1), I서열, 바람직하게는 5'-AAG-3', E서열의 상보 가닥 서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(서열번호: 2), 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA 서열의 종지코돈으로부터 반대로 세어서 약 25염기 상당의 상보 가닥의 마지막 염기가 G 또는 C가 되도록 길이를 선택해 서열을 부가하여, 리버스측 합성 올리고 DNA의 3'말단으로 한다.

PCR은 예를 들면, ExTaq 폴리머라아제(Takara)를 사용하는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 Vent 폴리머라아제(NEB)를 사용하여 행하고, 증폭된 목적단편은 NotI로 소화한 후, 플라스미드 벡터 pBluescript의 NotI 부위에 삽입한다. 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 시퀀서로 확인하여 바른 서열의 플라스미드를 선택한다. 이 플라스미드로부터 삽입단편을 NotI로 잘라내, 게놈 cDNA를 포함하는 플라스미드의 NotI 부위에 클로닝한다. 또한 플라스미드 벡터 pBluescript를 매개로 하지 않고 NotI 부위에 직접 삽입하여, 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 얻는 것도 가능하다.

예를 들면, 재조합 센다이 바이러스 게놈 cDNA라면, 문헌 기재의 방법에 준하여 구축할 수 있다(Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-598, 1997, Hasan, M.K. et al. J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Li, H. O. et al., J. Virology 74, 6564-6569, 2000). 예를 들면, 먼저 NotI 제한부위를 가지는 18 bp의 스페이서 서열(5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3')(서열번호: 3)을 클로닝된 센다이 바이러스 게놈 cDNA(pSeV(+))의 리더 서열과 N-단백질을 코드하는 서열의 5'말단 사이의 인접 유전자좌에 삽입하여, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥(antigenomic strand) 유래의 자기개열 리보자임 부위를 포함하는 플라스미드 pSeV18⁺b(+)를 얻는다(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820). pSeV18⁺b(+)의 NotI 부위에 외래유전자 단편을 삽입하여, 목적의 외래유전자가 삽입된 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 제작한 재조합 파라믹소바이러스 벡터 DNA를 시험관내 또는 세포내에서 전사시키고 바이러스의 L, P 및 NP 단백질의 공존하에서 RNP를 재구성시키면, 이 RNP를 포함하는 바이러스 벡터를 생성시킬 수 있다. 본 발명은 혈관신생 유전자를 코드하는 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터의 게놈을 전사 및 복제하는 단백질의 공존하, 상기 게놈을 코드하는 DNA를 세포내에서 전사시키는 공정 및 생성한 파라믹소바이러스 벡터를 회수하는 공정을 포함하는, 상기 벡터의 제조방법을 제공한다. 파라믹소바이러스 벡터의 게놈을 전사 및 복제하는 단백질로서는, 예를 들면 N, L 및 P 단백질이다. 또한 본 발명은 상기 DNA로 된, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터 제조용 DNA를 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 제조하기 위한, 상기 벡터의 게놈을 코드하는 DNA의 사용에 관한 것이다. 바이러스 벡터 DNA로부터의 바이러스의 재구성은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(국제공개 97/16539호; 국제공개 97/16538호; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13; 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404). 이들 방법에 의하여 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이바이러스 등을 포함하는 목적의 파라믹소바이러스 벡터를 DNA로부터 재구성시킬 수 있다. 바이러스 벡터 DNA에 있어서 F 유전자, HN 유전자 및/또는 M 유전자를 결실시킨 경우에는 그대로는 감염성 바이러스 입자를 형성하지 않지만, 숙주세포에 이들 결실시킨 유전자 및/또는 다른 바이러스의 외피단백질을 코드하는 유전자 등을 별도로 도입하여 발현시킴으로써, 감염성의 바이러스 입자를 형성시키는 것이 가능하다.

예를 들면, 벡터 DNA를 세포내에 도입하는 방법에는 다음과 같은 방법, ① 목적으로 하는 세포가 도입할 수 있는 DNA 침전물을 만드는 방법, ② 목적으로 하는 세포에 의한 도입에 적합하고, 또한 세포독성이 적은 양전하특성을 가지는 DNA를 포함하는 복합체를 만드는 방법, ③ 목적으로 하는 세포막에, DNA 분자가 빠져나갈 수 있을 만큼 충분한 구멍을 전기펄스로 순간적으로 뚫는 방법 등이 있다.

②로서는 여러 가지 트랜스펙션 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 들 수 있다. ①로서는 예를 들면 인산칼슘을 사용한 트랜스펙션법을 들 수 있고, 이 방법에 의하여 세포내에 들어간 DNA는 포식소포(phagocytic vesicle)에 삽입되지만, 핵내에도 충분한 양의 DNA가 들어가는 것이 알려져 있다(Graham, F. L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11:223). Chen 및 Okayama는 트랜스퍼기술의 최적화를 검토하여, 1) 세포와 공침전물의 인큐베이션 조건을 2~4% CO₂, 35℃, 15~24시간,2) DNA는 직쇄상 보다 고리상의 것이 활성이 높고, 3) 침전혼액 중의 DNA 농도가 20~30 ㎍/ml일 때 최적의 침전이 얻어진다고 보고하고 있다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). ②의 방법은 일과적인 트랜스펙션에 적합하다. 더 오래된 것으로서는 DEAE-덱스트란(Sigma #D-9885 M. W. 5×10⁵) 혼액을 목적의 DNA 농도비로 조제하여 트랜스펙션을 행하는 방법이 알려져 있다. 복합체의 대부분은 엔도솜 중에서 분해되어 버리기 때문에, 효과를 높이기 위해 클로로퀸을 가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). ③의 방법은 전기천공법이라 불리는 방법으로, 세포선택성이 없다고 하는 점에서 ①이나 ②의 방법에 비해 범용성이 높다. 효율은 펄스 전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 버퍼(buffer)의 도전율, DNA 농도, 세포밀도의 최적 조건하에서 좋다고 한다.

이상, 3개의 범주 중에서 ②의 방법은 조작이 간편하고 다량의 세포를 사용하여 다수의 검체를 검토할 수 있기 때문에, 본 발명에 있어서는 트랜스펙션 시약이 적합하다. 적합하게는 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305) 또는 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169)가 사용되지만, 이들에 한정되지 않는다.

cDNA로부터의 재구성은 구체적으로는 다음과 같이 하여 행할 수 있다.

24웰에서 6웰 정도의 플라스틱 플레이트 또는 100 mm 페트리접시 위에서, 10% 소 태아 혈청(FCS) 및 항생물질(100 units/ml 페니실린 G 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)을 포함하는 최소필수배지(MEM)를 사용하여 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2를 70~80% 컨플루언트(colfluent)가 될 때까지 배양하여, 예를 들면 1 ㎍/ml psoralen(소랄렌) 존재하 UV 조사처리를 20분 처리로 불활화한, T7 폴리머라아제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 vTF7-3(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1:569-579, 1996)을 2 PFU/세포로 감염시킨다. 소랄렌의 첨가량 및 UV 조사시간을 적당히 조정할 수 있다. 감염 1시간 후 2~60 ㎍, 보다 바람직하게는 3~5 ㎍의 상기의 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 전장 센다이 바이러스 게놈의 생성에 필수인 트랜스에 작용하는 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드(24-0.5 ㎍의 pGEM-N, 12-0.25 ㎍의 pGEM-P 및 24-0.5 ㎍의 pGEM-L, 보다 바람직하게는 예를 들면 1 ㎍의 pGEM-N, 0.5 ㎍의 pGEM-P 및 1 ㎍의 pGEM-L)(Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)와 함께 Superfect(QIAGEN사)를 사용한 리포펙션법 등에 의하여 트랜스펙션한다. 트랜스펙션을 행한 세포는 목적에 따라 100 ㎍/ml의 리팜피신(rifampicin)(Sigma) 및 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside)(AraC), 보다 바람직하게는 40 ㎍/ml의 시토신 아라비노시드(AraC)(Sigma)만을 포함하는 혈청 불함유의 MEM에서 배양하고, 백시니아 바이러스에 의한 세포독성을 최소로 억제하고 바이러스의 회수율을 최대로 하도록 약제의 최적 농도를 설정한다(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). 트랜스펙션으로부터 48~72시간 정도 배양한 후 세포를 회수하여, 동결융해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하여 배양한다. 배양3~7일 후에 배양액을 회수한다. 외피단백질을 코드하는 유전자를 결손한 복제능을 가지지 않는 바이러스 벡터를 재구성시키기 위해서는, 외피단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포를 트랜스펙션에 사용하거나 또는 외피 발현 플라스미드를 함께 트랜스펙션하면 된다. 또한, 트랜스펙션을 행한 세포에 외피단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포를 중층하여 배양함으로써 결손형 바이러스 벡터를 증폭하는 것도 가능하다(국제공개번호 WO00/70055 및 WO00/70070 참조). 배양상청에 포함되는 바이러스 역가는 적혈구 응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다. HA는 「endo-point 희석법」(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999)에 의하여 결정할 수 있다. 혼입할 수 있는 백시니아바이러스 vTF7-3을 제거하기 위해, 얻어진 뇨액시료를 적당히 희석(예를 들면 10⁶배)하여 계란에서 재증폭시킬 수 있다. 재증폭은 예를 들면 3회 이상 반복할 수 있다. 얻어진 바이러스 스톡은 -80℃에서 보존할 수 있다.

바이러스 벡터가 재구성하는 한, 재구성에 사용하는 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 원숭이 신장 유래의 LLCMK2 세포, CV-1 세포, 햄스터 신장 유래의 BHK 세포 등의 배양세포, 인간 유래 세포 등을 사용할 수 있다. 또한, 대량으로 센다이 바이러스 벡터를 얻기 위해, 상기의 숙주로부터 얻어진 바이러스벡터를 발육계란에 감염시켜 상기 벡터를 증폭할 수 있다. 계란을 사용한 바이러스 벡터의 제조방법은 이미 개발되어 있다(나카니시 등 편, (1993), 「신경과학연구의 첨단기술 프로토콜 Ⅲ, 분자신경세포생리학」, 고세이샤, 오사카, pp.153-172). 구체적으로는, 예를 들면 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하여 배(胚)를 성장시킨다. 바이러스 벡터를 뇨막강에 접종하고, 며칠간 알을 배양하여 바이러스 벡터를 증식시킨다. 배양기간 등의 조건은 사용하는 재조합 센다이 바이러스에 따라 변할 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 뇨액을 회수한다. 뇨액으로부터의 센다이 바이러스 벡터의 분리 ·정제는 일반적인 방법에 따라 행할 수 있다(다시로 마비토, 「바이러스 실험 프로토콜」, 나가이, 이시하마 감수, MEDICAL VIEW사, pp. 68-73, (1995)). 또한, 다음에 언급하는 F 결실 센다이 바이러스의 대량생산에는 트립신 내성의 세포(예를 들면 LLCMK2 등)가 바람직하다.

F 유전자를 결손한 센다이 바이러스 벡터의 구축과 조제는, 예를 들면 아래와 같이 행할 수 있다(국제공개번호 WO00/70055 및 WO00/70070 참조).

1. 외래유전자 탑재용 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA의 구축

센다이바이러스(SeV)의 전장 게놈 cDNA, pSeV18⁺b(+)(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78, 2813-2820, 1997)(「pSeV18⁺b(+)」는 「pSeV18⁺」라고도 한다)를 SphI/KpnI로 소화하여 프래그먼트(14673 bp)를 회수하고, pUC18에 클로닝하여 플라스미드 pUC18/KS로 한다. F 결손부위의 구축은 이 pUC18/KS상에서 행한다. F 유전자의 결손은 PCR-라이게이션 방법의 조합으로 행하고, 결과로서 F 유전자의ORF(ATG-TGA=1698 bp)를 제거해 atgcatgccggcagatga(서열번호: 4)로 연결하여, F 결실형 SeV 게놈 cDNA(pSeV18⁺/△F)를 구축한다. PCR법으로서는, F의 상류에는 forward: 5'-gttgagtactgcaagagc(서열번호: 5), reverse: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc(서열번호: 6), F 유전자의 하류에는 forward: 5'-atgcatgccggcagatga(서열번호: 7), reverse: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc(서열번호: 8)의 프라이머쌍을 사용하여 얻어진 PCR 산물을 EcoT22I로 연결한다. 이와 같이 하여 얻어진 플라스미드를 SacI와 SalI로 소화하여, F 결손부위를 포함하는 영역의 단편(4931 bp)을 회수하고 pUC18에 클로닝하여, pUC18/dFSS로 한다. 이 pUC18/dFSS를 DraIII로 소화하여 단편을 회수하고, pSeV18⁺의 F 유전자를 포함하는 영역의 DraIII 단편과 치환하고, 라이게이션하여 플라스미드 pSeV18⁺/△F를 얻는다.

또한, 이 구조는 F 유전자의 EIS 서열(SeV 특이적 서열, E; end, I; intergenic, S; start)이 잔존하고, 하류의 F 유전자의 ORF는 제거되어 있지만, 이 부위의 연결에 사용한 프라이머 유래의 5 아미노산 펩티드가 발현할 가능성이 있는 구조로 되어 있다.

F유전자의 결손위치로의 외래유전자의 삽입은 pUC18/dFSS의 F 결실부위에 있는 제한효소 NsiI 및 NgoMIV 부위를 이용하여 행한다. 이를 위해서는 예를 들면 외래유전자 단편을 NsiI-taild 프라이머 및 NgoMIV-tailed 프라이머로 증폭하면 된다.

예를 들면 실제로 EGFP 유전자를 탑재한 cDNA(pSeV18⁺/△F-GFP)를 구축하는 경우에는, 먼저 EGFP 유전자의 PCR에 의한 증폭을 행한다. EGFP 유전자 단편의 염기수를 6의 배수(Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033-1045, 1996)로 맞추기 위해 5' 말단은 NsiI-tailed 프라이머(5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/서열번호: 9), 3'말단은 NgoMIV-tailed 프라이머(5'-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/서열번호: 10)를 사용하여 PCR을 행한다. PCR 산물을 제한효소 NsiI와 NgoMIV로 소화하여 겔로부터 단편을 회수하고, pUC18/dFSS의 F 결실부위에 있는 NsiI와 NgoMIV라고 하는 제한효소부위에 연결하여 시퀀스를 확인한다. 이곳으로부터 EGFP 유전자를 포함하는 DraIII 단편을 회수하여, pSeV18⁺의 F 유전자를 포함하는 영역의 DraIII 단편과 치환하고, 라이게이션하여 pSeV18⁺/△F-GFP를 얻는다.

NP 유전자의 앞 위치로의 외래유전자의 삽입은 pSeV18⁺/△F 또는 pSeV18⁺/△F-GFP의 제한효소 NotI의 인식부위를 이용하여 행한다. 단, pSeV18⁺/△F인 경우는 결실한 F 유전자 위치에 연결에 사용한 프라이머 유래의 5 아미노산 펩티드가 발현할 가능성이 있는 구조로 되어 있고, 또한 pSeV18⁺/△F-GFP의 경우는 GFP가 함께 발현하기 때문에, 필요하다면 그 펩티드 및 GFP가 함께 발현할 가능성이 없는 유전자의 구축을 행한다. 그러기 위해서는 아래와 같이 행한다.

pSeV18⁺/△F-GFP를 SalI와 NheI로 소화하여 F 결손부위를 포함하는 영역의단편(6288 bp)을 회수하고, Litmus38(New England Biolabs, Beverly, MA)에 클로닝하여 LitmusSalINheIfrg/△F-GFP로 한다. 결손시킨 F 유전자 상류의 EIS 서열을 포함하는 EGFP 유전자의 결손은 Inverse PCR법에 의하여 행한다. 즉, GFP 유전자 상류에서 제한효소 SexAI의 인식서열을 디자인한 reverse 프라이머(5'-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/서열번호: 11)와 GFP 유전자 하류에서 제한효소 SexAI의 인식서열을 디자인한 forward 프라이머(5'-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/서열번호: 12)로 PCT을 행하고, 목적 크기의 단편(10855 bp)을 잘라내어 그대로 라이게이션을 행하여, 결손시킨 F 유전자 상류의 EIS 서열을 포함하는 EGFP 유전자를 결실시킨다.

단, 이 경우 프라이머 디자인상의 SexA1로 좁혀진 서열 15 bp가 여분으로 삽입되어 있다. 따라서, 플라스미드를 대장균 SCS110주에 트랜스폼하여 조제하고(SexA1은 메틸화 영향을 받아 절단할 수 없어지기 때문에 dcm^-/dam^-의 SCS110주를 이용한다), 제한효소 SexA1로 소화한 후, 1628 bp 및 9219 bp의 2개의 유전자단편을 회수하여 라이게이션을 행하고, 여분의 15 bp를 결실시키고, 6의 배수로 F 유전자 상류의 EIS 서열을 포함하는 EGFP 유전자를 결실시킨 LitmusSalINheIfrg/△F(△5aa)를 조제한다. 이 플라스미드를 SalI 및 NheI로 소화하여 단편을 회수하고, pSeV18⁺의 F 유전자를 포함하는 영역의 SalI/NheI 단편과 치환하고, 라이게이션하여 플라스미드 pSeV18⁺/△F(△5aa)를 얻는다.

이 플라스미드로의 외래유전자 삽입은 예를 들면 NP 유전자 앞에 위치하는제한효소 NotI의 인식서열을 이용하여 행한다.

2. hFGF2 유전자 탑재 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA의 구축

인간의 FGF2(hFGF2) cDNA의 취득에는 여러 가지 방법이 있지만, 예를 들면 환자 본인의 양해를 얻어 채취한 인간 대복재정맥으로부터 분리한 혈관 평활근세포로부터 RT-PCR로 cDNA를 분리하고, pBluescriptSK+(Stratagene, La Jolla, CA)의 HindIII(5'말단), EcoRI(3'말단)에 서브클로닝하여 조제할 수 있다. 그 때, hFGF2 cDNA의 유전자 서열은 Abraham 등의 보고(Abraham, J.A. et al., EMBO J. 5(10), 2523-2528,1986)를 참조할 수 있다.

NP 유전자 앞에 위치하는 제한효소 NotI의 위치에 hFGF2 유전자를 삽입하기 위해서는 hFGF2 유전자의 3'말단측에 SeV 특이적 서열(EIS 서열)을 부가하여 양 끝에 NotI 인식서열을 가지는 프래그먼트를 조제하면 된다. 구체적으로는, 상기 hFGF2 cDNA를 주형으로 하여 개시코돈을 포함하는 N말단측 프라이머(5'-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgcc/서열번호: 13) 및 종지코돈 영역과 EIS 서열을 포함하는 C말단측 프라이머(5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacattggaagaaaaagtatagc/서열번호: 14)를 사용하여 PCR을 행하고, NotI로 소화한 후, pBluescriptSK+(Stratagene, La Jolla, CA)의 NotI 부위에 서브클로닝하여 pBS-hFGF2를 조제한다. 염기서열을 확인하여 얻어진 유전자에 변이가 있는 경우는, 예를 들면 QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 목적 서열로 수정한다. pBS-hFGF2를 NotI로 소화 후, hFGF2 cDNA를 포함하는 단편을 pSeV18⁺/△F(△5aa)의 NP 유전자 앞에 위치하는 NotI 부위에 삽입하여, hFGF2 유전자 탑재 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA pSeV18⁺hFGF2/△F(△5aa)를 구축한다. pSeV18⁺hFGF2/△F(△5aa)는 이후 pSeV18⁺hFGF2/△F라고도 표기한다.

3. F 발현 플라스미드의 구축

센다이바이러스의 F 유전자(SeV-F)의 발현에는 Cre DNA 리콤비나아제에 의하여 유전자 산물이 유도발현되도록 설계된 플라스미드 pCALNdLw(Cre/loxP 유도형 발현 플라스미드; Arai, T. et al., J. Virol. 72(2), 1115-1121, 1998)를 이용할 수 있다. pUC18/KS를 StyI 및 BstUI로 소화하여 SeV-F 유전자를 포함하는 단편(1783 bp)을 잘라내고, 평활말단 처리 후, pCALNdLw의 유니크사이트 SwaI 부위에 삽입하여 F 발현 플라스미드 pCALNdLw/F를 구축한다.

4. SeV-F 단백을 유도발현하는 헬퍼세포의 제작

F 결손 게놈으로부터 감염 바이러스 입자를 회수하기 위해, SeV-F 단백을 발현하는 헬퍼세포주를 수립한다. 세포는 예를 들면 SeV의 증식에 자주 사용되고 있는 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2 세포를 사용할 수 있다. LLC-MK2 세포는 10%의 열처리한 비동화(非動化) 소 태아 혈청(FBS), 페니실린 G 나트륨 50 단위/ml 및스트렙토마이신 50 ㎍/ml를 첨가한 MEM에서 37℃, 5% CO₂로 배양한다. Cre DNA 리콤비나아제에 의하여 F 유전자 산물이 유도발현되도록 설계된 상기 플라스미드 pCALNdLw/F를, 인산칼슘법(Mammalian Transfection Kit; Stratagene, La Jolla, CA)에 의하여 주지의 프로토콜에 따라 LLC-MK2 세포에 유전자 도입한다.

구체적으로는, 예를 들면 10 cm 플레이트를 사용하여 40% 컨플루언트까지 생육한 LLC-MK2 세포에 10 ㎍의 플라스미드 pCALNdLw/F를 도입한 후, 10 ml의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서, 37℃의 5% CO₂인큐베이터중에서 24시간 배양한다. 24시간 후에 세포를 떼어내어, 10 ml 배지에 현탁한 후, 10 cm 샬레 5장을 사용하여, 예컨대 5 ml 1장, 2 ml 2장, 0.2 ml 2장에 뿌려, G418(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 1200 ㎍/ml 포함하는 10 ml의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 배양을 행하고, 2일마다 배지를 교환하면서 14일간 배양하여, 유전자의 안정도입주의 선택을 행한다. 상기 배지에 의하여 생육해 온 G418에 내성을 나타내는 세포는 클로닝링을 사용하여 예를 들면 30주를 회수한다. 각 클론은 10 cm 플레이트에서 컨플루언트가 될 때까지 확대배양을 계속한다.

F 유전자의 안정도입주의 선택은 아래의 방법으로 행한다. 즉, F 단백질의 발현량을 웨스턴 블로팅으로 반정량적으로 해석함으로써 행할 수 있다. 각 클론의 F 단백질의 발현유도는 세포를 6 cm 샬레에서 컨플루언트까지 생육시킨 후, 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(Saito et al., Nucl. Acids Res. 23, 3816-3821, 1995; Arai, T. et al., J. Virol. 72(2), 1115-1121, 1998)에 의하여 moi=3에서 감염시켜 행한다. 감염 3일 후에 세포의 배양상청을 제거한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하고, 스크레이퍼로 세포를 벗겨 1500 ×g으로 5분간 원심하여 세포를 회수한다. 상기 세포는 -80℃에서 보존하고, 해동 후 150 μL의 PBS 완충액에 현탁하고, 추가로 동량의 2 ×Tris-SDS-BME sample loading buffer(0.625 M Tris(pH 6.8), 5% SDS, 25% 2-ME, 50% glycerol, 0.025% BPB, Owl사제)를 가하여 98℃ 3분간 가열처리한 후, 전기영동용 시료에 제공한다. 상기 시료(1레인 당 1 ×10⁵세포)를 주지의 프로토콜에 따라 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅을 행한다. 웨스턴 블로팅에 있어서의 일차항체에 항SeV-F 항체(f236)를 1/1000 희석으로 사용하여, 각 클론의 SeV-F의 발현을 반정량적으로 해석한다.

이러한 방법으로 SeV-F 유전자 산물을 유도발현하는 LLC-MK2 세포의 작출이 확인된다. 이후, SeV-F 유전자 유도발현 전의 상기 세포를 LLC-MK2/F로 표기하고, 유도발현 후의 세포를 LLC-MK2/F/Ad로 표기한다.

5. F 결실 SeV 바이러스의 재구성 및 증폭

혈관신생 유전자를 포함하는 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA를 F 발현 헬퍼세포에 트랜스펙션하여 발현시킴으로써 바이러스를 재구성할 수 있다. 예를 들면, 상기 hFGF2 유전자 탑재 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA(pSeV18⁺hFGF2/△F)를 사용하는 경우는, 이 cDNA를 아래와 같이 하여 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션한다. LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 직경 10 cm의 페트리접시에 뿌려 24시간 배양한 후, 소랄렌과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126, 1986)로 실온에서 1시간 감염시킨다(moi=2~3, 적합하게는 moi=2가 사용된다). 백시니아바이러스로의 자외선 조사에는, 예를 들면 15 와트 전구 5개가 장비된 UV Stratalinker 2400(카달로그번호 400676(100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA)을 사용한다. 세포를 2회 세척하고 플라스미드 pSeV18⁺hFGF2/△F, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L(Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579, 1996) 및 pGEM/F-HN(WO00/70070)을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 OptiMEM(GIBCO)에 현탁하여, SuperFect transfection reagent(1 ㎍ DNA/5 ㎕의 SuperFect, QIAGEN)를 넣고 혼합하여, 실온에서 15분간 방치한 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 OptiMEM 3 ml에 넣고 세포에 첨가하여 배양한다. 3~5시간 배양 후, 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 2회 세척하여, 시토신 β-D-아라비노프라노시드 40 ㎍/ml(AraC, Sigma) 및 트립신 7.5 ㎍/ml(GIBCO)를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 24시간 배양한다.

배양상청을 제거하여, 상기에서 클로닝한 F 발현 헬퍼세포 LLC-MK2/F/Ad 세포를 중층한다. 구체적으로는 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에 분산된 LLC-MK2/F/Ad 세포를 배양상청을 제거한 세포에 중층하여, 48시간 배양을 계속한다. 스크레이퍼로 이들 세포를 회수하여 펠릿을 OptiMEM 에 현탁하고(10⁷cells/ml), 동결융해를 3회 반복하여 행한다. 이 라이세이트(lysate)를 LLC-MK2/F/Ad 세포(4 ×10⁶cells/well 12-well-plate)에 가하고(200㎕/well), 추가로 300 ㎕/well의 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)을 첨가하여 15~24시간 배양한다. 배양상청을 제거하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 세척한 후, 새로운 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)을 첨가하고, 5~9일간 배양을 행하여 상청을 회수한다. 회수한 상청에는 재구성된 F 결실형 SeV 입자가 포함되어 있고, LLC-MK2/F/Ad 세포에 감염시켜 동일하게 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 배양을 행함으로써(또는 그것을 반복함으로써) F 결실형 SeV를 증폭할 수 있다.

그 때, F 결실형 SeV 입자가 포함되어 있는 배양상청을 0.22 ㎛의 필터에 반복하여 2회 통과시킴으로써, 재구성시의 T7 RNA 폴리머라아제의 발현에 이용한 리콤비넌트 백시니아바이러스의 혼입을 대부분 회피할 수 있다. 구체적으로는, 2회 이상 AraC를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 증폭한 배양상청(P2 이후의 샘플)에 대해서 0.22 ㎛의 필터에 2회 통과시키고, 더욱이 1회 AraC를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 증폭한 배양상청을 리콤비넌트 백시니아바이러스의 혼입을 회피하여 증폭한 F 결실형 SeV로서 취급할 수 있다.

결손형 바이러스 벡터를 조제하는 경우, 예를 들면 게놈상에서 결손되어 있는 외피유전자가 다른 2종의 벡터를 동일한 세포에 도입하면, 각각에서 결손되는 외피단백질이 또 다른 한쪽의 벡터로부터의 발현에 의하여 공급되기 때문에 서로 상보하여 감염력이 있는 바이러스 입자가 형성되어, 복제사이클이 돌아 바이러스벡터가 증폭된다. 즉, 2종류 또는 그 이상의 본 발명의 벡터를 외피단백질을 상보하는 조합으로 접종하면, 각각의 외피유전자 결손형 바이러스 벡터의 혼합물을 대량 및 저비용으로 생산할 수 있다. 이들 바이러스는 외피유전자가 결손되어 있기 때문에, 외피유전자를 결손하고 있지 않은 바이러스에 비해 게놈 사이즈가 작아져 긴 외래유전자를 유지할 수 있다. 또한, 원래 감염성이 없는 이들 바이러스는 세포밖에서 희석되어 공감염의 유지가 곤란하기 때문에 불임화되어, 환경방출 관리상의 이점이 있다.

외래유전자로서 질환의 치료용 유전자를 사용하여 바이러스 벡터를 조제하면, 이 벡터를 투여하여 유전자치료를 행하는 것이 가능해진다. 본 발명의 바이러스 벡터의 유전자 치료로의 응용으로서는, 직접투여에 의한 유전자 발현, 간접(ex vivo)투여에 의한 유전자 발현 중 어느 방법으로도 치료 효과를 기대할 수 있는 외래유전자 또는 환자의 체내에서 공급이 부족한 내재유전자 등을 발현시키는 것이 가능하다. 외래유전자로서는 혈관신생 유전자 또는 혈관신생을 촉진하는 유전자라면 특별히 제한은 없어, 단백질을 코드하는 핵산 뿐만 아니라, 예를 들면 혈관신생을 억제하는 유전자의 안티센스 또는 리보자임 등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이더라도 좋다.

회수한 파라믹소바이러스는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 여과(filtration), 원심분리 및 컬럼정제 등을 포함하는 공지의 정제 ·분리방법 또는 그 조합에 의하여 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란 바이러스가 그것이 존재하는 시료 중의 성분으로서 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 전형적으로는 실질적으로 순수한 바이러스 벡터는 시료 중에 포함되는 전체 단백질 중 바이러스 벡터 유래의 단백질 비율이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지하는 것에 의하여 확인할 수 있다. 파라믹소바이러스의 구체적인 정제방법으로서는, 예를 들면 셀룰로오스 황산에스테르 또는 가교 다당류(polysaccharide) 황산에스테르를 사용하는 방법(일본국 특공소62-30752호 공보, 일본국 특공소62-33879호 공보 및 일본국 특공소62-30753호 공보) 및 푸코오스(fucose)황산 함유 다당 및/또는 그 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 약학적으로 허용되는 목적 담체 또는 매체와 함께 조성물로 할 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체」란 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하고, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 예를 들면 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 생리식염수나 인산완충생리식염수(PBS) 등으로 적당히 희석하여 조성물로 할 수 있다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 계란에서 증식시킨 경우 등에 있어서는 뇨액을 포함하더라도 좋다. 또한 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 탈이온수, 5% 덱스트로스(dextrose) 수용액 등의 매체를 포함하고 있더라도 좋다. 더욱이, 그 밖에도 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있더라도 좋다. 본 발명은 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 공정을 포함하는, 본 발명의 혈관신생 조성물의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 혈관신생 조성물의 제조를 위한 본 발명의 벡터의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 의약조성물로서도 유용하다. 본 발명은 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 허혈치료 제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 상기 조성물의 의약으로서의 사용에도 관한 것이다.

상기와 같이 하여 얻어진 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 파라믹소바이러스 벡터가 가지는 혈관신생 유전자를 도입할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터 또는 본 발명의 혈관신생 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 혈관신생을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법은 특히 허혈조직을 처치하기 위한 방법으로서 유용하다. 투여부위에 특별히 제한은 없지만, 허혈처치에 있어서는, 도입유전자 산물이 허혈조직에 집중하여, 전신의 순환계에 누출되지 않도록 허혈조직 또는 그 주변에 국소 투여되거나, 또는 적당한 유전자 송달계(gene delivery system)에 의하여 목적 조직 주변에 국소 발현시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터 함유 조성물을 허혈조직 내 또는 그 밖으로부터 in vivo로 투여하여, 외래유전자를 허혈조직에서 발현시킴으로써 실시할 수 있다. 또한, ex vivo에 의한 투여를 행하더라도 좋다. 예를 들면, 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터를 감염시킨 세포를 허혈조직 국소 또는 허혈조직을 환류하는 동맥 내에 주입하더라도 좋다.

예를 들면, 카테터를 사용한 국소투여도 선택될 수 있다. 예를 들면 2개의 풍선에 의하여 혈관을 격리하고, 풍선으로 격리된 혈관의 간격에 벡터 조성물을 주입하는 더블 풍선 카테터법이나, 다공성 풍선을 사용한 투여법 등에 의하여 본 발명의 벡터를 투여하더라도 좋다(Jorgensen, B. et al., Lancet 1(8647): 1106-8,1989; Wolinsky, H. and Thung, S. N., J. Am. Coll. Cardiol. 15(2): 475-81, 1990; WO93/00051; WO93/00052). 이들 투여에 있어서는 히드로겔을 코팅한 풍선을 사용하는 것도 가능하다(Takeshita, S. et al., Lab. Invest. 75(4): 487-501, 1996).

예를 들면 심근경색이나 협심증, 기타 허혈성 심질환의 치료에 있어서는, 예를 들면 카테터를 사용하여 심실 내강으로부터 심근 내에 직접 본 발명의 벡터 조성물을 주입할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 카테터에 의하여 국소 주입함으로써, 관상동맥 내의 협착부분의 혈관신생이나 측부혈행로의 발달을 촉진할 수 있다.

그러나, 카테터에 의한 벡터 투여는 인큐베이션에 비교적 장시간이 필요한 것 외에, 풍선에 의한 혈관손상 등도 염려된다. 또한, 허혈조직 내의 미만성(彌漫性) 혈관에 카테터를 삽입하는 것은 곤란한 경우도 많다. 본 발명의 허혈조직의 처치에 있어서는 특히 근육내(intramuscular; IM)로의 벡터 투여가 바람직하다. 근육내로의 주입은 카테터를 매개로 한 투여 보다도 간편하여 혈관을 손상시키는 위험도 낮다. 본 발명의 벡터는 예를 들면 허혈조직 또는 그 근방의 횡문근에 투여된다. 횡문근은 골격근 및 심근을 포함한다. 바이러스 벡터의 투여 전에 근육의 재생을 유발함으로써 도입유전자의 발현을 증강하는 것이 알려져 있는 부피바카인(bupivacaine)을 투여하더라도 좋다. 또한, 피하(intradermal; ID) 투여도 선택할 수 있다. 근육내로의 벡터 도입은 예를 들면, 경피적으로 도입하는 방법이나 개피하여 직접 도입하는 방법을 들 수 있다. 벡터를 도입할 때에는 근상막을 파손하지 않도록 처치하는 것에 유의할 필요가 있다. 투여는 예를 들면 바늘과 시린지를 사용하여 행할 수 있는 것 외에, 바늘을 사용하지 않는 바이오 인젝터에 의하여 투여하는 것도 가능하다. 투여는 1개소 또는 복수 개소에 투여할 수 있다. 또한, 투여는 1회 또는 복수회 행할 수 있다.

본 발명의 벡터를 매트릭스의 형태로 투여하는 것도 유용하다. 알려져 있는 방법으로서는, 아테로콜라겐 매트릭스(aterocollagen matrix)에 바이러스 벡터를 분산시키고, 동결건조에 의하여 고형화하여 매트릭스가 서서히 붕괴하는 것을 응용하는 것으로, 일시적 유전자 발현으로 알려져 있는 아데노바이러스 벡터나 노출된 DNA(naked DNA)의 효과 지속화에 관한 보고가 있다(Ochida, T. et al., Nature Medicine 5, 707-710, 1999). 본 발명의 바이러스 벡터는 이러한 보조제와 공존시키는 것이 가능하고, 동결건조가 가능하다. 또 발현효과를 증강하기 위해 양이온 지질을 공존시키는 것도 가능하다.

투여 가능한 작은 매트릭스이더라도, 18 G 정도의 주사바늘에 의하여 장기간에 걸쳐 성장인자 등을 서방할 수 있는 것은 알려져 있다. 예를 들면, 단백질의 제제에 있어서, 성장호르몬 등의 지속시간은 성장호르몬 등을 단독으로 투여한 경우에 비해 혈액 중의 지속시간이 길고, 예를 들면 7일 이상이다. 보통, 10일 이상에 이르는 지속도 달성할 수 있다고 보고되어 있다(일본국 특개평10-001440). 그 때문에, 제제의 투여횟수, 환자에게 주는 고통을 현저히 줄일 수 있다. 상기 제제는 예를 들면, 피하나 근육내에 투여되는 고형주사제(임플란트 등)나, 좌제 등의 점막흡수제로서 이용할 수 있다. 제제의 형상은 주사제로서 사용하는 경우에는 주사바늘로 투여 가능한 기둥(柱)형상 또는 입형상인 경우가 많다. 바람직한 제제의 형상에는 각주형상, 원주형상 등의 기둥형상 및 구형상 등의 입상이 포함된다.

본 발명의 비경구제제의 크기도 투여형태에 따라 선택할 수 있고, 환자에게 과도한 고통을 주지 않는 크기라면 좋다. 주사제로서는, 주상 매트릭스로 구성되어 있는 경우 예를 들면, 직경 3 mm 이하(예를 들면 0.1~3 mm), 길이 30 mm 이하(예를 들면 0.5~30 mm), 바람직하게는 14 G 이하의 주사바늘로 투여 가능한 직경 1.3 mm 이하(예를 들면 0.1~1.2 mm), 길이가 20 mm 이하(예를 들면 0.5~20 mm), 더욱 바람직하게는 직경 0.1~1 mm, 길이 1~20 mm 정도로 원주가 바람직하다. 또한, 입상 매트릭스로 구성된 주사제의 입경은, 최대 직경 1 mm 이하(예를 들면 0.1 ㎛~1 mm 정도), 바람직하게는 150 ㎛ 이하(예를 들면 0.5~100 ㎛ 정도), 더욱 바람직하게는 1~100 ㎛ 정도이다. 또한, 매트릭스의 중량은 제제의 형태에 따라 선택할 수 있고, 주사제에 있어서는 예를 들면, 40 mg 이하, 바람직하게는 1~25 mg 정도인 경우가 많다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터에 의하여 도입하는 유전자로서는 혈관신생 및/또는 혈관형성을 촉진하는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 상기와 같이 aFGF, FGF2(bFGF), VEGF, Ang(Ang-1 및 Ang-2를 포함한다), EGF, TGF-α, TGF-β, PD-ECGF, PDGF, TNF-α, HGF, IGF, EPO, CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-8, NOS 등을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 이들 단백질에는 각각의 패밀리에 속하는 각 멤버나 아이소형 등을 포함한다. 본 발명의 파라믹소바이러스에 의하여 도입하는 혈관신생 유전자의 적합한 일례로서, 특히 FGF2를 코드하는 유전자를 들 수 있다. FGF2는 예를 들면 급성 허혈의 치료로의 응용이 기대된다. 예를 들면, 급성 중증허혈지의 치료 등에 있어서 유의한 치료 효과를 기대할 수 있다. 또한, FGF2는 심근경색에 있어서의 치료 효과도 나타나 있다(Yanagisawa-Miwa, A. et al., Science 257(5075): 1401-3, 1992). 단백질은 분비 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는 분비 단백질이다. 또한, 인공적으로 구축한 단백질이더라도 좋다. 인공적인 단백질로서는 예를 들면, 다른 단백질과의 융합 단백질, 도미넌트 네거티브 단백질(dominant negative protein)(수용체의 가용성 분자 또는 막결합형 도미넌트 네거티브 수용체를 포함한다), 결실형 세포접착분자 및 세포표면분자 등의 형태일 수 있다. 또한, 분비 시그날이나 막 국재화 시그날, 핵이행 시그날 등을 부가한 단백질이더라도 좋다. 도입유전자는 허혈조직에서 내인적으로 발현이 유도되는 유전자이더라도 좋고, 또한 발현이 유도되지 않는 유전자를 이소적(異所的)으로 발현시키더라도 좋다. 또한, 안티센스 RNA 분자 또는 RNA 절단형 리보자임 등을 발현시켜 허혈조직에서 발현하는 바람직하지 않은 유전자의 기능을 억제하는 것도 가능하다.

본 발명의 벡터는 여러 가지 허혈질환 및 혈관신생에 의하여 치료 가능한 질환에 대한 유전자 치료에 적용하는 것이 기대된다. 이러한 유전자 치료로는, 예를 들면 혈관절단이나 경색, 혈관해리 등에 의한 혈류차단으로 인한 허혈에 대한 치료를 들 수 있다. 본 발명의 벡터 투여의 대상이 되는 혀혈질환에는 예를 들면 뇌혈관 허혈, 신허혈, 폐허혈, 사지의 허혈, 허혈성 심근증 및 심근허혈을 들 수 있다. 또한, 유전자 치료의 대상이 되는 조직에는 특별히 제한은 없어, 예를 들면 심근, 뇌, 신장 및 폐가 포함된다. 또한 이행에 있어서의 혈관신생의 촉진에도 유용하다.또한, 여러 가지 질환 모델의 제작이나, 질환 모델 등에 있어서의 치료방법의 개발 또는 평가에 있어서도 유용하다.

벡터의 투여에 의하여 혈관신생이 촉진되었는지는 예를 들면 부검시료 중의 모세관수나 모세관 밀도의 계측이나, 혈관 조영에 의한 화상 해석 등에 의하여 확인하는 것이 가능하다. 또한, 도플러 관류상 해석에 의한 혈류량의 해석에 의하여 측정하는 것도 가능하다. 허혈조직의 처치 효과는 조직의 괴사 또는 탈락을 거시적 또는 조직 절편의 현미경 관찰 등에 의하여 확인하는 것이 가능하다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 약학적 유효량의 벡터가 대상조직에 투여되고, 이것에 의하여 이 벡터가 대상조직의 세포에 도입된다. 「약학적 유효량」이란 목적의 치료 또는 예방 효과를 적어도 부분적으로 가져오도록 대상조직의 세포에 유전자가 도입되는 양을 말한다. 목적의 혈관신생 유전자를 포함하는 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터의 유효량이 투여됨으로써, 벡터가 도입된 세포로부터 혈관신생 유전자가 생산된다. 바람직하게는, 목적으로 하는 혈관신생 유전자를 가지는 본 발명의 벡터의 유효량이 투여됨으로써, 투여된 조직 중에서 유의한 레벨의 혈관신생 인자가 검출된다. 「유의한 레벨」이란 본 발명의 벡터에 의하여 도입된 유전자의 발현량(전사산물 또는 번역산물의 양)이 검출 가능한 것을 가리킨다. 예를 들면, 도입하는 유전자에 대응하는 내인성 유전자가 있는 경우, 도입한 유전자의 최대 발현레벨이 내인적인 발현레벨에 대해서 유의하게 상승하고 있는 것을 가리킨다. 바람직하게는, 투여부위에 있어서의 혈관신생 유전자의 발현량이 내인적인 발현량의 약 1.2배 이상, 바람직하게는 약 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 약 2배이상, 보다 바람직하게는 약 10배 이상, 가장 바람직하게는 약 20배 이상의 발현이 얻어지는 것을 말한다. 단, 도입유전자의 발현량은 그 유효 발현량 레벨 및 중독 레벨을 고려하여 결정되어야 한다.

세포에 도입된 유전자의 발현량은 당업자에게 공지인 방법에 의하여 어세이하는 것이 가능하다. 유전자의 전사산물은 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization), RT-PCR, RNA 프로텍션 어세이(protection assay) 등에 의하여 검출 ·정량할 수 있다. 노던 하이브리다이제이션이나 RT-PCR 등에 의한 검출은 in situ로도 행할 수 있다. 또한, 번역산물을 검출하는 데에는 항체를 사용한 웨스턴 블롯(Western blotting), 면역침강, RIA, ELISA, 풀다운 어세이(pull-down assay) 등에 의하여 행할 수 있다. 또한, 도입유전자 발현산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 발현시키는 단백질에 태그를 부가하거나, 리포터 유전자를 발현하도록 삽입해 두는 것도 가능하다. 리포터 유전자는 β갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라아제(CAT), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 녹색 형광 단백질(GFP)을 코드하는 유전자 등을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.

벡터의 투여량은 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여목적, 도입유전자 등에 따라 다르지만, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 투여하는 벡터량은 약 10⁵cell-infectious units(CIU)/ml에서 약 10¹¹CIU/ml의 범위 내이면 좋다. 보다 바람직하게는, 투여하는 벡터량은 약 10⁷CIU/ml에서 약10⁹CIU/ml의 범위 내이면 좋다. 가장 바람직하게는, 약 1 ×10⁸CIU/ml에서 약 5 ×10⁸CIU/ml의 범위 내의 양을 약학상 용인 가능한 담체 중에서 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바이러스 함유 조성물의 투여 대상으로서는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개 등 모든 포유동물이 포함된다.

인간에 있어서의 투여량은 보통 투여부위 1개소에 대해 2 ×10⁸CIU~ 2 ×10¹⁰CIU의 범위인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2 ×10⁹CIU를 중심으로 한 투여량, 예를 들면 5 ×10⁸CIU~ 1×10¹⁰CIU 등이다. 투여횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용 범위에서 복수회 가능하고, 1일 투여횟수에 대해서도 동일하다. 인간 이외의 동물에 대해서도 예를 들면 투여하는 동물과 인간과의 체중비 또는 투여 표적부위(허혈조직 등)의 중량비 또는 용적비에 따라 투여 개소를 증감 또는 투여량을 환산하여 투여할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 중도(中度)(왼쪽) 및 중증(重症)(오른쪽)의 마우스 급성 후지허혈의 수술순서의 모식도이다. 분지한 선은 후지의 동맥 및 정맥을 나타낸다. 혈관의 절제부위를 짧고 굵은 선으로 나타냈다.

도 2는 후지허혈에 동반되는 근육 중(왼쪽) 및 혈청(오른쪽)에서의 내인성 VEGF(흑색) 및 FGF2(백색)의 발현을 나타내는 도이다. C57BL/6 마우스의 중도 및중증 허혈 모델을 사용하였다. 수술 2일 후에 전대퇴근 및 비골근(n=6)과 혈청(n=6)을 채취하여 ELISA에 제공하였다. 값은 각각 근육의 전 추출단백질 또는 용량으로 표준화하여, 평균 ±S.D.로 나타냈다. 근육의 값은 대퇴근 및 비골근 양자의 데이터를 포함한다(따라서 각 군 n=12). 평균값을 도에 나타냈다. *p<0.01, #p<0.05(일원배치 분산분석에 의한 해석).

도 3은 허혈에 의한 VEGF 발현의 유도를 RT-PCR을 사용하여 조사한 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 SeV를 매개로 한 근육 중으로의 반딧불 루시페라아제 유전자의 유전자 도입에 있어서의 발현레벨(왼쪽) 및 시간경과(오른쪽)를 나타내는 도이다. C57BL/6 마우스의 중도 허혈 모델에 있어서, 미처리, pCMV-luc(100 ㎍) 투여 또는 SeV-luc(10⁷pfu 또는 10⁸pfu) 투여에 의한 루시페라아제 활성을 조사하였다(왼쪽). 오른쪽 패널은 중도 허혈 모델로의 루시페라아제 유전자 도입에 있어서의 발현레벨의 시간경과를 나타낸다. 백색 동그라미: C57BL/6 마우스로의 pCMV-luc(100 ㎍) 투여, 짙은 동그라미: C57BL/6 마우스로의 SeV-luc(10⁸pfu) 투여, 옅은 동그라미: BALB/c nu/nu 마우스로의 SeV-luc(10⁸pfu) 투여. 굵은 선은 도입유전자 발현이 유의해지는 컷 오프(cut-off) 값을 나타낸다. 각 그래프 모두 유전자발현의 레벨은 동일한 스케일을 사용하고 있다. log 스케일인 것에 주의.

도 5는 in vitro에 있어서의 혈관신생 단백질의 분비를 인간 제대혈관 내피세포(HUVEC), COS7 세포, 소 혈관 평활근세포(BSMC) 및 심근아세포(H9C2)를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 도이다. 「기본적인 방출(basal release)」은 벡터 없음에 있어서의 각 인자의 생산량을 나타낸다. 도입유전자 유래의 발현이 유의해지는 레벨을 컷 오프(cut-off)값으로서 나타냈다.

도 6은 C57BL/6 마우스의 중도 허혈지에 외래적으로 도입한 FGF2(a) 및 VEGF(b) 유전자의 근육 중(왼쪽) 및 혈청(오른쪽)에서의 in vivo의 발현을 나타내는 도이다. 수술 후 바로 각각의 벡터 용액 50 ㎕를 대퇴근 및 비골근에 주입하였다. 수술 2일 후에 전대퇴근 및 비골근(n=6)과 혈청(n=6)을 채취하여, 마우스 FGF2(a)와 마우스 및 인간 VEGF(b)의 ELISA에 제공하였다. 값은 각각 근육의 전 추출단백질 또는 용량으로 표준화하여, 평균 ±S.D.로 나타냈다. 평균값을 도에 나타냈다. log 스케일인 것에 주의.

도 7은 유전자 도입에 의한 내인성 마우스 VEGF의 발현 증강을 나타내는 도이다. 수술 없음(왼쪽), 중도 허혈(중앙) 및 중증 허혈(오른쪽)의 C57BL/6 마우스의 사지 근육 중에 있어서의 내인성 마우스 VEGF 발현의 유전자 도입에 의한 증강을 나타낸다. 수술 직후에 50 ㎕의 각 벡터 용액을 대퇴근 및 비골근에 주입하였다. 수술 2일 후에 전대퇴근 및 비골근과 혈청(각 n=6, 전부 n=12)을 채취하여 마우스 VEGF의 ELISA에 제공하였다. 값은 근육의 전 추출단백질로 표준화하여 평균 ±S.D.로 나타냈다. 평균값을 도에 나타냈다. *p<0.01, #p<0.05(일원배치 분산분석에 의한 해석).

도 8은 유전자 도입에 의한 마우스 사지 근육의 조직상을 나타내는 사진이다. C57BL/6 마우스를 중증 허혈수술에 제공하고, 도 7과 동일하게 처리하여 수술2일 후에 조직학적 관찰을 행하였다. 미처리 동물(왼쪽 위; 비허혈(no ishemia))에 비하여, 명확한 염증성 침윤 및 스트로마 세포의 부종이 거짓투여(SeV-luciferase; mock)의 대퇴근(오른쪽 위)에 있어서 인지되었다. 중독한 근선유의 파괴, 세포내 부종 및 염증성 침윤이 VEGF165처리 동물에서 관찰되었다(왼쪽 아래; VEGF165). 이들의 상해는 FGF2 유전자 도입에 의하여 억제되었다(오른쪽 아래; FGF2). 각 군 모두 6개체를 사용하여 동일한 결과를 얻었다. 헤마톡실린 ·에오신 염색. 오리지날배율 ×200.

도 9는 왼쪽 후지에 수술하여 10일 후에 있어서의 중증 허혈 마우스의 근육 중으로의 혈관신생 인자 유전자의 외래도입의 치료 또는 증악(增惡) 효과를 나타내는 사진이다. 각 도에 사지 구제 스코어(limb salvage score; LSS)를 나타냈다. 상단은 C57BL/6 마우스의 중증 허혈 모델[사지 구제 모델(limb salvage model)]에 있어서의 전형적인 증악 효과를 나타낸다. VEGF165를 도입한 마우스는 전체 사지가 탈락(중앙 위 패널)하였지만, 루시페라아제의 대조(왼쪽 위 패널) 및 FGF2처리 마우스(오른쪽 위 패널)는 사지가 구제되었다. 하단은 BALB/c nu/nu 마우스의 중증 허혈 모델[하지 탈락 모델(auto-amputation model)]에 있어서의 전형적인 치료 효과를 나타낸다. FGF2처리한 마우스는 사지가 구제(오른쪽 아래 패널)되었지만, 루시페라아제의 대조(왼쪽 아래 패널) 및 VEGF165처리 마우스(오른쪽 아래 패널)에서는 후지가 거의 모두 탈락하였다.

도 10은 사지 구제 모델 및 탈락 사지 모델에 있어서의 벡터 투여 후의 후지의 예후곡선을 나타내는 도이다. 투여개체 중에서 사지가 남아 있는 개체의 비율(사지 구제율)을 나타냈다. 혈관신생 유전자의 근육 중으로의 유전자 도입에 의하여, A에 표시된 C57BL/6 마우스의 중증 허혈 모델(사지 구제 모델)에서는 VEGF165의 증악 효과가, B에 표시된 BALB/c nu/nu 마우스의 중증 허혈 모델(하지 탈락 모델)에서는 FGF2의 치료 효과가 나타나 있다. 각 군은 3회의 각각의 실험을 행하였다(n=10). 곡선은 Kaplan-Mayer법에 의한다. 데이터는 log-rank 검정에 의하여 해석하였다. *p<0.0001.

도 11은 C57BL/6 마우스의 중증 허혈(사지 구제 모델)을 사용하여 in vivo에 있어서의 혈관신생 효과를 레이저 도플러 관류상 해석에 의하여 측정한 결과를 나타내는 사진이다. SeV-luciferase, SeV-VEGF165 및 SeV-FGF2를 10⁷pfu로 투여하여, 혈액관류의 회복을 관찰하였다. 각 군은 동일 개체의 시간경과를 나타낸다. 상단은 SeV-luciferase처리 마우스(Mock transfection)의 혈류 회복의 시간경과의 전형적인 결과를 나타낸다. 대퇴근의 혈액 재관류는 수술 4일 후부터 인지되고, 7일째에는 명확하게 관찰되었다. 그러나, 10일째에서도 하퇴부의 명확한 관류는 검출되지 않고, 사지는 위축되고 발가락의 괴사 징후가 보였다(가장 오른쪽 패널). 중단(中段)은 SeV-VEGF165처리 마우스의 전형적인 시간경과를 나타낸다. 대퇴부 및 하퇴부에 있어서, 관찰기간 중 명확하고 유의한 재관류는 인지되지 않고, 사지는 탈락하였다(가장 오른쪽 패널). 하단은 SeV-FGF2처리 마우스의 전형적인 시간경과를 나타낸다. 4일째까지 대퇴부에서 명확한 재관류를 인지하고, 10일째까지는 사지 전체에서 유의한 혈류가 보여, 완전히 사지가 구제되었다(가장 오른쪽 패널).

도 12는 C57BL/6 마우스의 중증 허혈(사지 구제 모델)에 있어서의 혈관신생 유전자 치료에 의한 혈액관류의 회복을 나타내는 도이다. 도 11과 동일한 실험에 있어서의 허혈지 및 비허혈지의 평균혈류량을 산출하여, 오른쪽 사지(비허혈)의 혈류값에 대한 왼쪽 사지(허혈)의 혈류값의 비로서 나타냈다. *p<0.01(다른 모든 군과의 비교에 있어서), #p<0.05(다른 모든 군과의 비교에 있어서), ##p<0.05[거짓 투여군(mock)과의 비교에 있어서].

도 13은 마우스 중증 허혈 모델(탈락 사지 모델)에 있어서의 hFGF2 유전자 탑재 복제형 SeV 벡터 또는 hFGF2 유전자 탑재 F 결실형 SeV 벡터 투여에 의한 사지 구제율의 경시적 관찰결과를 나타내는 도이다. 실험개체수(n) 및 벡터의 투여량은 도 중에 나타냈다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 한정되지는 않는다. 또한, 본 명세서 전체를 통하여 인용된 문헌은 모두 본 명세서에 삽입된다.

재조합 SeV는 이전의 기재(Yu, D. et al, Genes Cells 2(7): 457-66, 1997; Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970-973(2000); Kato, A., et al., Genes Cells 1, 569-579(1996); Hasan, M. K., et al., J. Gen. Virol. 78, 2813-2820(1997))에 따라 조제하였다.

바이러스의 역가는 닭 적혈구를 사용한 헤마글루티네이션 어세이에 의하여결정하였다. 고역가 스톡(10⁹pfu/ml)은 사용시까지 -80℃에서 보존하였다. 인간 VEGF165 cDNA는 이전에 기재한 바와 같이 RT-PCR로 단리하였다(Yonemitsu, Y., et al., Lab. Invest. 75, 313-323(1996)). 마우스 FGF2 cDNA는 이마무라 히로시(Natinal Institute of Bioscience and Human-Technology, Tsukuba, Japan)로부터 공여된 cDNA의 부분서열을 토대로, PCR에 의하여 전장 마우스 FGF2 cDNA를 조제하였다(Imamura, T., et al., Science 249, 1567-1570(1990)). 구체적으로는 개시코돈 영역 및 종지코돈 영역을 결실한 마우스 FGF2 cDNA의 부분단편(Accession Number M30644의 7~435번째 단편)을 주형으로 사용하여, 마우스 FGF2 cDNA의 개시코돈을 포함하는 N말단측 프라이머(5'-ACGTGCGGCCGCCAAAGTTCATCCACCATGGCTGCCAGCGGCATCACCTCGCTTCCC-3'/서열번호: 15) 및 종지코돈 영역과 SeV 특이적 서열을 포함하는 C말단측 프라이머(5'-ACGTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGCGGATCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGTCCCGT-3'/서열번호: 16)를 사용하여 완전장 cDNA를 증폭하였다. 이와 같이 하여 조제한 인간 VEGF165 cDNA 및 마우스 FGF2 cDNA는 염기서열이 맞는 것을 확인한 후, pSeV18⁺b(+)(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)의 NotI 부위에 삽입하였다. 인간 VEGF165 또는 마우스 FGF2를 발현하는 센다이 바이러스 벡터는 각각 SeV-VEGF165 또는 SeV-FGF2로 명명하였다. SeV-luciferase(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78(Pt 11): 2813-2820, 1997; Yonemitsu, Y. et al., Nature Biotechnol. 18: 970-973, 2000) 및pCMV-luciferase(Yonemitsu, Y. et al., Nature Biotechnol. 18: 970-973, 2000)는 상기와 동일하게 조제하였다.

통계해석에 있어서, 본 실시예의 모든 데이터는 평균 ±S.D.로서 나타냈다. 사지 구제 이외의 데이터는 Scheffe의 수정을 가한 일원배치 분산분석에 의하여 해석하였다. 사지 구제 데이터의 해석은 사지 구제의 비율을 사지 구제 스코어(limb salvage score; LSS)로서 나타내고, Kaplan-Mayer법에 의하여 해석하였다. 사지 구제 실험의 통계적 유의차는 log-rank 검정을 사용하여 결정하고, 모든 해석에 있어서 p<0.05를 통계적으로 유의로 하였다.

[실시예 1] 허혈에 의하여 유도되는 내인성 VEGF의 발현은 후지 근육 중의 국소적인 단백질 축적을 일으키지 않는다

혈관신생 인자의 치료 효과 또는 유해 효과를 명확하게 하기 위해, 본 발명자 등은 2개의 다른 수술을 사용한 허혈지의 3개 모델을 구축하였다(도 1). 즉, (1) C57BL/6 마우스의 전 대퇴동정맥 및 복재동정맥 절제에 의한 중도의 허혈지(도 1 왼쪽에 나타낸 중도 허혈 모델)(Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667-1679(1998); Kalka, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3422-3427(2000)), (2) C57BL/6 마우스의 전 외장골 동정맥, 대퇴동정맥 및 그들 주위의 분지혈관을 모두 절제하는 모델(도 1 오른쪽에 나타낸 중증 허혈 모델), (3) 면역부전 BALB/c nu/nu 마우스를 사용하여 상기 (2)와 동일한 수술을 행하는 모델(즉, BALB/c nu/nu 마우스에 있어서의 중증 허혈 모델)이다.

성수(成獸) 수컷 C57BL/6, BALB/c, BALB/c nu/nu 마우스(6-8주령, CharlesRiver Grade)는 KBT Oriental Co. Ltd. (Tosu, Saga, Japan)로부터 구입하였다. 동물실험은 인가된 순서를 채용하여, 규슈대학의 동물, 재조합 DNA 및 병원성감염 실험위원회에 의한 연구동물의 사육 및 사용의 장려순서 및 일본국 정부의 법률(No.105) 및 고지(No.6)에 따랐다. 또한, 미국 국립위생연구소의 「Principles of Laboratory Animal Care」 및 「Guide for the Care and Use of laboratory Animals」(publication No. NIH 80-23, revised 1985)에도 따랐다.

펜토바르비탈의 복강내 주사에 의하여 충분히 마취한 상태에서 피부를 절개하고, 중도 허혈 모델에서는 표층의 전 대퇴동정맥 및 복재동정맥[대퇴심동맥(deep femoral arteries)의 바로 아래부터 슬와동정맥까지]을 결찰하여 절제하였다(도 1 왼쪽)(Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667-1679(1998); Kalka, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3422-3427(2000)). 중증 허혈 모델에서는 더욱이 외장골 동정맥부터 대퇴심동맥까지의 절제를 행하였다(도 1 오른쪽). 이들 모델 사지의 회복상태의 재현성은 동일 수술자(I.M.)에 의한 3~5회의 각각의 실험에 의하여 확인하고, 각 수술에서는 각 모델에 대해 10개체 이상의 동물을 사용하였다. 각각의 사지 구제 실험은 동일한 실험자가 동일 조건의 실험을 4회 반복하여 행하였다.

상기 (1)의 모델에서는 전혀 사지는 손실되지 않고, 경우에 따라 발가락의 괴사 징후를 보일 뿐이었다. 상기 (2)의 모델(즉 C57BL/6 마우스에 있어서의 중증 허혈 모델)에서는 사지의 괴사는 일어나지 않고(이것을 「사지 구제 모델(limb salvage model)」이라고도 부른다), 상기 (3)의 모델(BALB/c nu/nu 마우스에 있어서의 중증 허혈 모델)에서는 모든 동물에서 수술 10일 이내에 거의 사지 전체가 탈락하였다(이것을 「하지 탈락 모델(limb amptation model)」이라고도 부른다). 면역적합성 BALB/c 마우스의 중증 허혈 모델에서는 BALB/c nu/nu 마우스와 동일한 정도인 사지의 괴사가 관찰되었다(데이터 생락). BALB/c 계통의 마우스는 C57BL/6 계통에 비하여 증식인자에 대한 혈관신생의 감수성이 높은 것이 보고(Rohan, M. R. et al., FASEB J. 14, 871-876(2000))되어 있는 것을 종합하여 생각하면, 이들의 결과는, C57BL/6 계통의 사지 구제는 혈관신생에 대한 감수성 보다도 오히려 측지(collateral limb)의 순환이 보다 높은 것으로 인한 가능성이 시사된다.

상기의 중도 및 중증 허혈 모델을 사용하여, 허혈근 및 혈청의 VEGF 및 FGF2의 내인적 발현을 조사하였다. 수술 2일 후, C57BL/6 마우스로부터 각 사지 근육(전대퇴근 및 비골근) 및 혈청을 채취하여, 조직을 호모게나이즈 또는 용해 후, 효소결합 면역측정법(ELISA)에 제공하였다. 재조합 단백질의 합성은 인간 VEGF 또는 마우스 FGF2용의 Quantikine Immunoassay systems(R&D Systems Inc. Minneapolis, MN)을 사용하여 설명서에 따라 정량하였다. 전 단백질 농도를 protein assay system(Bio-Rad Laboratories, Hertfordshire, UK)을 사용하여, Bradford법으로 결정하여 값을 표준화하였다(Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970-973(2000)).

전대퇴근과 비골근 사이에 단백질 농도의 유의한 차는 보이지 않았기 때문에, 양자를 각 군에 포함하여 해석을 행하였다. 흥미 깊게도, 허혈수술은 2개의 허혈지 모델(중도 모델: 847.5 ±187.7 pg/g muscle, 중증 모델: 895.4 ±209.5 pg/gmuscle, 각 n=12)에 있어서, 미처리 마우스의 베이스 라인(489.7 ±108.6 pg/g muscle, n=12)에 비하여 FGF2 단백질의 농도를 유의하게 상승시켰다(p<0.001)(도 2). 한편, 중증 허혈군에서는 허혈에 의한 VEGF 단백질 발현의 상승이 보였지만, 근육 중에 있어서 유의하지 않았다(미처리: 174.7 ±43.1, 중도: 119.2 ±53.4 및 중증: 242.5 ±244.3, n=12). VEGF는 조직의 허혈에서 보다 강하게 발현이 유도되는 내피 증식인자로서 잘 알려져 있고(Shweiki, D. et al., Nature 359, 843-845(1992); Forsythe, J. A., et al., Mol. Cell. Biol. 16, 4604-4613(1996)), 이 결과는 그것과 일치하지 않아 보인다. 따라서, VEGF가 전신의 순환계로 방출되는 가능성을 생각하여 혈청 중의 VEGF 레벨을 측정하였다. 그러자 예상대로, 중증도에 의존하여 혈청 중의 VEGF 단백질 레벨의 증가가 관찰되었지만, 혈청 중의 FGF2는 검출되지 않았다(도 2 오른쪽).

본 발명자 등은 사지 허혈은 고분자 또는 중분자량형의 VEGF 보다도 헤파란황산과의 상호작용능이 낮은 저분자형의 VEGF 아이소형(Cohen, T., et al., J. Biol. Chem. 270, 11322-11326(1995))을 유도한다고 예상하였다. 이것을 확인하기 위해, VEGF188, 164, 144 및 120을 포함하는 마우스 VEGF의 스플라이싱 형태(Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398-404(1999))를 식별할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여, RT-PCR에 의하여 C57BL/6 마우스 수컷(수술 없음, 중도 허혈 모델 및 중증 허혈 모델)의 수술 1일 후의 대퇴근에 있어서의 VEGF 아이소형의 발현 해석을 행하였다. 프라이머쌍은 이전에 기재(Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398-404(1999))된 래트 VEGF의 엑손1 및 엑손8용의 것을 이용하고, 마우스 VEGF 아이소형의 서열에 대응하는 포워드 프라이머(5'-TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA-3'/서열번호: 17) 및 리버스 프라이머(5'-TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T-3'/서열번호: 18)를 사용하였다. 가장 작은 마우스 VEGF 아이소형(VEGF115)의 검출에는 상기와 동일한 포워드 프라이머 및 VEGF115 특이적 리버스 프라이머(5'-CTA CCA AAA GTT TCC CAG GCA G-3'/서열번호: 19)를 사용하였다(Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033-3038(1998)). RT-PCR의 조건은 문헌과 동일하게 행하였다(Burchardt, M., et al., Biol. Reproduct. 60, 398-404(1999); Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033-3038(1998)).

그 결과, 허혈에 관련하는 내인성 VEGF의 발현은 164 아이소형만 관찰되고, 그 밖의 아이소형의 명확한 발현은 검출되지 않았다(도 3). 더욱이, 기지의 가장 작은 아이소형인 VEGF115(Sugihara, T. et al., J. Biol. Chem. 273, 3033-3038(1998))의 발현을 RT-PCR에 의하여 해석하였지만 검출할 수 없었다.

[실시예 2] 마우스 후지로의 재조합 센다이 바이러스를 매개로 한 근육 중 유전자 도입의 카이네틱스

카이네틱스의 해석을 위하여, 먼저 반딧불 루시페라아제를 사용하여 도입유전자의 발현레벨과 시간경과를 조사하였다. 루시페라아제 어세이는 루미노미터(Model LB 9507, EG&G Berthold, Germany)를 사용하여 문헌에 따라 행하였다(Yonemitsu, Y., et al., Nature Biotech. 18, 970-973(2000)). 데이터는 relative light units(RLU)/mg protein으로 나타냈다. 전 단백질 농도를 protein assay system(Bio-Rad Laboratories, Hertfordshire, UK)을 사용하여 Bradford법으로 결정하고, 이것에 의하여 루시페라아제 어세이의 값을 표준화하였다. 중증 허혈지 모델에서는 명확하게 사지 근육이 심하게 파괴를 받아 도입유전자의 발현 저하가 시사되었기 때문에, 중도 허혈 모델(도 1 왼쪽)을 사용하여 해석을 행하였다. 유전자의 주입은 수술시에 대퇴근 및 하퇴근 각각 2개소에 25 ㎕씩 행하였다. 아래의 투여량은 그 합계를 나타낸다. 마우스(C57BL/6 마우스)(6~8주령, 평균 30 g)에 100 ㎍의 pCMV-luciferase(임상용량의 약 50배의 양)(Baumgartner, I., et al., Circulation 97, 1114-1123(1998); Isner, J. M., et al., J. Vasc. Surg. 28, 964-973(1998))를 투여한 바, 유전자 도입 2일 후의 측정에서는 비교적 높은 루시페라아제 활성(평균 ±S.D.=5.1 ±3.9 ×10⁶RLU/mg protein, n=6)을 나타낸 것에 대해서, 10⁷plaque forming unit(pfu)의 SeV-luciferase의 투여에서는 그의 약 5배(2.4 ±3.8 ×10⁷RLU/mg protein, n=12), 10⁸pfu의 SeV 투여에서는 약 120배(7.3 ±4.7 ×10⁸RLU/mg protein, n=6)의 발현을 나타냈다(도 4 왼쪽).

C57BL/6 마우스의 중도 허혈 모델에 루시페라아제 발현 플라스미드(pCMV-luc) 또는 SeV-luc를 상기와 동일하게 투여하고, 도입유전자 발현의 시간경과를 측정하였다. 10⁸pfu의 SeV-luciferase를 근육 중에 투여한 C57BL/6 마우스의 중도 허혈 모델에서도 시간경과와 함께 발현의 저하가 보였다(day 2: 7.3 ±4.3 ×10⁸RLU/mg protein, n=12, day 7: 3.4 ±4.7 ×10⁷RLU/mg protein, n=12 및 day 14:2.6 ±1.2 ×10⁴RLU/mg protein, n=12)(도 4 오른쪽). 10⁸pfu의 SeV-luciferase를 근육 중에 투여한 BALB/c nu/nu 면역부전 마우스의 중도 허혈 모델에 있어서의 루시페라아제 활성은 day 7까지는 C57BL/6 마우스와 동일한 시간경과를 나타냈지만, 후기에 있어서도 그 발현이 유지되었다(day 2: 9.4 ±3.7 ×10⁸RLU/mg protein, n=12, day 7: 1.3 ±1.9 ×10⁷RLU/mg protein, n=12 및 day 14: 0.9 ±1.3 ×10⁷RLU/mg protein, n=12).

이어서, in vitro에 있어서의 혈관신생 단백질의 분비를 근육계의 초대 소 혈관 평활근세포(BSMCs) 및 심근아세포(H9C2) 뿐만 아니라, 초대 인간 제대혈관 내피세포(HUVECs) 및 COS7 세포를 포함하는 여러 가지 배양세포를 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 사용한 FGF2 벡터(SeV-FGF2)는 단백질 분비를 위한 고전적인 시그날 서열을 가지지 않지만, 본 발명자 등 및 타인의 연구에 의하여 분비서열을 가지지 않는 FGF2에서도 세포밖에 발현되는 것이 보고되어 있다(Piotrowicz, R.S. et al., J. Biol. Chem. 272, 7042-7047(1997); Qu, Z., et al. et al., J. Histochem. Cytochem. 46, 1119-1128(1998); Florkiewicz, R. Z. et al., J. Cell. Physiol. 162, 388-399(1995)). 예상대로, 용량의존적으로 배양상청 중에 FGF2 단백질의 효율적인 분비가 검출되고, 그 레벨은 VEGF165와 동등하였다[예를 들면, MOI=100에서는 VEGF165 vs FGF2=4,354 ±2,794 vs 3,682 ±1,063(HUVEC의 경우), 275 ±58 vs 398 ±154(BSMC의 경우); 16,987 ±4,748 vs 5,976 ±381(H9C2의 경우); 38,648 ±4,913 vs 1,547,237 ±176,502(COS7의 경우), 각각 pg/10⁵세포/24시간, n=3](도 5).

[실시예 3] in vivo에 있어서의 SeV를 매개로 한 혈관신생 인자의 근육 중 발현의 카이네틱스

C57BL/6 마우스의 중도 허혈 모델(도 1 왼쪽)로의 SeV-VEGF165 및 SeV-FGF2의 in vivo 근육 중 투여에 있어서의 혈관신생 인자의 근육 중 발현을 조사하였다. 투여는 대퇴근 및 비골근의 각각 2개소, 25 ㎕씩 26 게이지 주사바늘로 수술시에 1회만 투여하였다.

혈관신생 인자의 in vivo 발현의 결과는 in vitro의 결과 및 in vivo 리포터 유전자의 결과와 비교하여 흥미 깊은 것이었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, SeV-FGF2를 매개로 한 단백질 합성은 용량의존적으로 증가하고, 고역가의 벡터 도입에서는 내인성 유전자 발현의 약 100배에 달하였다(대퇴근: 기저상태: 429 ±79, 허혈: 974 ±150, 10⁶pfu: 4,913 ±313, 10⁷pfu: 13,469 ±12,611 및 10⁸pfu: 46,703 ±12, 092 pg/g muscle, 각 n=6, 비골근: 기저상태: 550 ±104, 허혈: 720 ±128, 10⁶pfu: 1,376 ±158, 10⁷pfu: 8,252 ±8,190 및 10⁸pfu: 59,704 ±35,297 pg/g muscle, 각 n=6). SeV-FGF2 투여군에서는 가장 높은 역가에 있어서도 유의한 혈청 FGF2는 검출되지 않았다. 이것에 대해서, VEGF165의 용량의존적인 증가는 FGF2의 그것에 비해 매우 작고, 10⁷pfu에서도 2배에 이르지 않고, 10⁸pfu에서는 반대로SeV 유래의 인간 VEGF165 단백질의 발현은 거의 검출되지 않았다(대퇴근: 기저상태: 176 ±44, 허혈: 143 ±64, 10⁶pfu: 159 ±67, 10⁷pfu: 224 ±216 및 10⁸pfu: <5 pg/g muscle, 각 n=6, 비골근: 기저상태: 173 ±45, 허혈: 95 ±28, 10⁶pfu: 186 ±30, 10⁷pfu: 172 ±101 및 10⁸pfu: <5 pg/g muscle, 각 n=6). 내인성 마우스 VEGF의 혈청 레벨은 중도 사지 허혈에서는 유의하게 증가하였지만(37.7 ±15.4 pg/ml, n=6), 벡터 유래의 인간 VEGF165는 유의하게는 검출되지 않아, 근육 중에서 발현시킨 VEGF165는 전신의 순환계로는 확산되지 않는 것이 시사된다.

[실시예 4] 허혈에 의하여 유도되는 내인성 VEGF의 발현은 혈관신생 유전자의 도입에 의하여 현저하게 증강된다

본 발명자 등은 VEGF165와 FGF2의 발현 패턴의 차이에는 내인성 VEGF의 발현이 관여하고 있는 것이 아닌가 하고 생각하였다. 내인성 VEGF의 과잉 발현은 지나치게 강한 투과성 작용을 매개로 하여 조직의 허혈을 증악시키고, SeV로부터의 전사를 음으로 조절할 가능성이 있다. 또한 in vitro 및 in vivo에 있어서, FGF2의 혈관신생 작용은 부분적으로는 내인성 VEGF의 발현 증강에 의하여 일어나고 있는 것이 나타나 있다(Asahara, T., et al., Circulation 92, 365-371(1995)).

따라서, 외래적으로 도입한 혈관신생 인자 유전자에 의하여 매개되는 근육 중에서의 내인성 마우스 VEGF 단백질 합성의 변화를 마우스 VEGF 특이적 ELISA계를 사용하여 조사하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, VEGF165가 아니라, FGF2의 유전자 도입은 정상 순환(수술 없음) 및 중도 허혈 양쪽의 사지조건에 있어서 근육 중의내인성 마우스 VEGF 레벨을 현저하게 상승시켰다. 중증 사지 허혈에서는 2개의 혈관신생 인자의 유전자 도입 양쪽에 있어서, 내인성 마우스 VEGF의 발현을 극적으로 상승시키고, 특히 VEGF165는 허혈 뿐인 것(Mock)에 비하여 7배 정도까지 상승시켰다.

이것을 더욱 상세하게 조사하기 위하여, C57BL/6 마우스의 중증 허혈 모델에 있어서의 혈관신생 인자의 유전자 도입에 의한 효과를 조직학적으로 관찰하였다(도 8). 허혈수술 후에 거짓 도입을 행한 경우(mock)는 분산된 밀한 근섬유(diffusely picnotic muscle fibers)는 세포내 부종(intracellular edema)을 동반하고, 2일 후에는 염증성 침윤이 보였다. 이들 소견은 VEGF165의 유전자 도입에 의하여 현저하게 증강된 한편, FGF2의 유전자 도입에서는 명확하게 억제되었다(도 8).

[실시예 5] 외래적으로 도입된 VEGF165는 급성 중증 허혈지에 있어서 사지 구제 인자가 아니라 사지 파괴 인자로서 작용한다

상기의 사실을 토대로, 상기의 중도 및 중증 허혈지 모델을 사용하여 in vivo에 있어서의 혈관신생 인자의 유전자 도입에 의한 치료효과를 조사하였다. 앞서 나타낸 바와 같이, VEGF165에서는 가장 높은 역가인 10⁸pfu의 투여에 있어서 도입유전자 산물의 생산이 보이지 않았기 때문에, 10⁷pfu의 바이러스 투여에 의하여 in vivo 치료 효과를 관찰하였다. 여기서, 사지의 괴사정도를 4단계의 사지 구제 스코어로 분류하였다(Limb Salvage Score; LSS). LSS=4: 완전한 사지 구제(complete limb salvage), LSS=3: 발뒤꿈치 아래의 괴사(limb necrosis belowheel), LSS=2: 무릎 아래의 괴사(limb necrosis below knee), LSS=1: 무릎 위까지의 괴사(limb necrosis above knee) 및 LSS=0: 서경인대 주변부터 전체 하지 탈락(total auto amputation around the inguinal ligament). 이 분류를 토대로, 먼저 SeV를 매개로 한 혈관신생 인자의 발현의 독성을 C57BL/6 마우스의 중증 허혈지의 사지 구제 모델을 사용하여 조사하였다. 혈관신생 유전자의 도입은 실시예 2와 동일하게 행하였다.

허혈수술 2일 전에 벡터의 주입을 행한 경우, 모든 군에서 모든 사지가 완전히 유지되었다(데이터 생략). 수술시에 벡터의 주입을 행한 경우, VEGF165 투여군 이외에는 FGF2 투여군을 포함하여, 모든 군의 마우스에서 완전히 사지가 구제되었다(%LLS=100%). 그러나, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, VEGF165 투여 마우스에서는 사지가 탈락하는 개체가 관찰되었다(5/10는 사지가 탈락하였다. %LLS=52.2%, 다른 군과 비교한 경우 p<0.0001)(도 10A). 이 결과로부터, VEGF165의 유전자 도입에 의한 사지 파괴 효과가 시사된다. 이어서, BALB/c nu/nu 마우스의 중증 허혈 모델(사지 탈락 모델)을 사용하여, 혈관신생 인자의 유전자 치료의 효과를 검증하였다. 그 결과, SeV-FGF2 투여는 nu/nu 마우스의 사지 탈락을 유의하게 억제한(2/10가 사지 탈락, %LLS=77.5%) 것에 대해서, SeV-VEGF165의 투여(8/10이 사지 탈락, %LLS=15.0%)는 루시페라아제 발현 SeV의 투여(5/6가 사지 탈락, %LLS=16.7%)와 동일, 후지의 예후를 개선시키지 않았다(도 10B). 이 결과는, FGF2의 유전자 도입이 사지 구제 효과를 가지는 것을 명확하게 나타내고 있다.

이어서, 중증 허혈수술을 행한 왼쪽 발의 혈류 회복에 대한 근육내 유전자도입 처치에 의한 효과를 레이저 도플러 관류상 해석에 의하여 측정하였다(Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667-1679(1998); Murohara, T., et al, J. Clin. Invest. 105, 1527-1536(2000)). 유전자 도입의 조건은 상술한 도 10A(사지 구제 모델)와 완전히 동일한 조건으로 하고, C57BL/6 마우스의 중증 허혈 모델(사지 구제 모델)을 사용하였다. 허혈지(왼쪽)/정상사지(오른쪽)의 혈류비의 측정을 레이저 도플러 관류상(laser Doppler perfusion image; LDPI) 해석기(Moor Instruments, Devon, UK)를 사용하여 문헌에 따라 행하였다(Couffinhal, T., et al., Am. J. Pathol. 152, 1667-1679(1998); Murohara, T., et al, J. Clin. Invest. 105, 1527-1536(2000)). 구체적으로는, 체온에 의한 데이터의 변동을 최소한으로 억제하기 위하여 레이저 스캐닝을 행하기 전에 마우스를 37℃의 항온판에 두었다. 미리 결정한 시간(실험 전 및 수술 후 2, 4, 7 및 10일)에 각각의 개체의 목적 부위(사지 및 발)를 2회 연속하여 스캐닝을 행하였다(도 11). 2회의 스캐닝으로 본질적인 차이는 보이지 않았다. 레이저 스캐닝 후, 보존한 화상을 컴퓨터에 의한 혈류량을 측정하여, 허혈 및 비허혈 발의 평균 혈류량을 산출하였다. 주위의 빛이나 온도의 영향에 의한 데이터의 변동을 억제하기 위하여, LDPI 인덱스는 오른쪽 사지(비허혈)의 혈류값에 대한 왼쪽 사지(허혈)의 혈류값의 비로 하여 나타냈다.

SeV-luciferase(Mock) 및 SeV-FGF2의 투여는 모두 4일째에 있어서 대퇴상부 주변에 명확한 혈류가 검출되고, 특히 FGF2 투여군에서는 4, 7 및 10일째에 있어서 비골근으로의 유의한 혈류가 보여, 같은 시기의 luciferase 투여군에서는 대퇴근에한정된 혈류가 보인 것과 차가 보였다(도 11). 대표적인 결과로는, luciferase 투여군의 사지는 경도의 위축(mildly atrophic limb)을 일으키는 것이 있었지만, FGF2 투여군의 대부분의 사지는 장애를 나타내지 않았다. 이들과는 대조적으로 VEGF165 투여 마우스는 대퇴근에 거의 혈류가 보이지 않고, 하지 탈락을 일으켰다(도 11). SeV-VEGF165가 투여된 모든 마우스는 적어도 무릎 위치에서 사지를 잃었다. 아래에 각각의 투여군에 있어서의 사지혈류의 관찰결과를 상술한다.

1. SeV-luciferase를 투여한 개체

수술 직후는 왼쪽 하지의 혈류는 거의 보이지 않았다. 점차 혈류가 회복되고, 4일째 쯤에는 대퇴부의 중앙 부근까지 혈류의 회복이 보였다. 그러나 10일째까지 이 개체의 하퇴까지의 혈류는 회복되지 않았다. 결과로서, 패널 오른쪽 끝에 나타낸 바와 같이 하지는 썩지 않았지만, 조금 위축되어 있었다. 동일한 개체는 1/3 정도로 관찰되었다. 이것보다도 회복이 진행된 예도 인지되었다.

2. SeV-VEGF165를 투여한 개체

상기와 동일하게, 수술 직후는 거의 혈류가 소실하였다. 이후, 경시적으로 관찰하더라도 대퇴부의 혈행 회복은 거의 인지되지 않고, 결과로서 패널 오른쪽 끝에 나타낸 바와 같이 대퇴의 중간 정도부터 하지가 탈락하였다. 10개체 전체 예에서 완전히 동일한 결과를 얻었다.

3. SeV-FGF2 투여 개체

상기와 동일하게, 수술 직후의 왼쪽 하지의 혈류는 거의 소실하였다. 혈류의 소실 범위는 SeV-luciferase를 투여한 개체와 동일한 정도였다. 4일째 쯤부터 강한혈류(빨간 점으로 표시된다)가 대퇴부에 나타나, 7일째에는 이미 약하지만 하퇴의 혈행이 인지되었다. 10일째에는 조금(파란색으로 표시된다)이지만 왼쪽 하지 전체에 유의한 혈행이 인지되고, 결과로서 패널 오른쪽 끝에 나타낸 바와 같이 하지는 외견상 완전히 정상인 채로 유지되었다.

각 군에 있어서, 도플러상을 토대로 하는 대퇴근의 혈류를 통계학적으로 비교하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이 SeV-FGF2 투여 마우스는 SeV-luciferase 투여 마우스에 비하여, 사지 혈류의 생리적 회복시의 혈류는 유의하게 높은 값을 나타냈다. 이것에 대해서, SeV-VEGF165 투여 마우스 대퇴근의 혈류는 낮은 값에 머물러, 수술 후 7일째 이후는 대부분의 동물에서 하지 중앙부 또는 그것보다 상부부터 사지가 탈락하였다.

[실시예 6] 복제능 결손형 센다이 바이러스 벡터를 사용한 급성 허혈지 치료

1. 혈관신생 유전자 탑재 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA의 구축

센다이 바이러스(SeV)의 전장 게놈 cDNA를 포함하는 pSeV18⁺b(+)(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78, 2813-2820, 1997)에서 F 유전자를 결실시킨 플라스미드 pSeV18⁺/△F(WO00/70055 및 WO00/70070 참조)의 F 유전자 결손부위에 EGFP 유전자를 탑재한 플라스미드(pSeV18⁺/△F-GFP)를 구축하기 위해, 먼저 EGFP 유전자의 PCR에 의한 증폭을 행하였다. EGFP 유전자 단편의 염기수를 6의 배수(Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033-1045, 1996)로 맞추기 위해 5'말단은 NsiI-tailed 프라이머(5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/서열번호: 9), 3'말단은 NgoMIV-tailed 프라이머(5'-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/서열번호: 10)를 사용하여 PCR을 행하였다. PCR 산물을 제한효소 NsiI와 NgoMIV로 소화하여 겔로부터 단편을 회수하고, pUC18/dFSS의 F 결실부위에 있는 NsiI와 NgoMIV라는 제한효소부위에 연결하여 시퀀스를 확인하였다. 여기로부터 EGFP 유전자를 포함하는 DraIII 단편을 회수하여, pSeV18⁺의 F 유전자를 포함하는 영역의 DraIII 단편과 치환하고, 라이게이션하여 pSeV18⁺/△F-GFP를 얻었다. 단, pSeV18⁺/△F의 경우는 F 유전자의 EIS 서열(SeV 특이적 서열, E; end, I; intergenic, S; start)이 잔존하고, 하류의 F 유전자의 ORF는 제거되어 있지만, 이 부위의 연결에 사용한 프라이머 유래의 5 아미노산 펩티드가 발현할 가능성이 있는 구조로 되어 있다. 또한 pSeV18⁺/△F-GFP의 경우는 GFP가 함께 발현하기 때문에, 그 펩티드 및 GFP가 함께 발현할 가능성이 없는 벡터의 구축을 행하였다. 그러기 위해서는 아래와 같이 재조합을 행하였다.

pSeV18⁺/△F-GFP를 SalI와 NheI로 소화하여 F 결손부위를 포함하는 영역의 단편(6288 bp)을 회수하고, Litmus38(New England Biolabs, Beverly, MA)에 클로닝하여 LitmusSalINheIfrg/△F-GFP로 하였다. 결손시킨 F 유전자 상류의 EIS 서열을 포함하는 EGFP 유전자의 결손은 Inverse PCR법으로 행하였다. 즉, GFP 유전자 상류에서 제한효소 SexAI의 인식서열을 디자인한 reverse 프라이머(5'-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/서열번호: 11)와 GFP 유전자 하류에서 제한효소 SexAI의 인식서열을 디자인한 forward 프라이머(5'-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/서열번호: 12)로 PCT을 행하여, 목적 크기의 단편(10855 bp)을 잘라내어 그대로 라이게이션을 행하여, 결손시킨 F 유전자 상류의 EIS 서열을 포함하는 EGFP 유전자를 결실시켰다.

이 경우, 프라이머 디자인상의 SexA1로 좁혀진 서열 15 bp가 여분으로 삽입되어 있다. 따라서, 플라스미드를 대장균 SCS110주에 트랜스폼하여 조제하고(SexA1은 메틸화 영향을 받아 절단할 수 없어지기 때문에, dcm^-/dam^-의 SCS110주를 이용하였다), 제한효소 SexA1로 소화한 후, 1628 bp 및 9219 bp의 2개의 유전자 단편을 회수하여 라이게이션을 행하고, 여분의 15 bp를 결실시켜 6의 배수로 F 유전자 상류의 EIS 서열을 포함하는 EGFP 유전자를 결실시킨 LitmusSalINheIfrg/△F(△5aa)를 조제하였다. 이 플라스미드를 SalI 및 NheI로 소화하여 단편을 회수하여, pSeV18⁺의 F 유전자를 포함하는 영역의 SalI/NheI 단편과 치환하고, 라이게이션하여 플라스미드 pSeV18⁺/△F(△5aa)를 얻었다. 이 플라스미드로의 혈관신생 유전자(예로서 인간 FGF2를 사용하였다) 삽입은 NP 유전자 앞에 위치하는 제한효소 NotI의 인식서열을 이용하여 아래와 같이 행하였다.

2. hFGF2 유전자 탑재 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA의 구축

인간의 FGF2(hFGF2) cDNA는 환자 본인의 양해를 얻어 채취한 인간 대복재정맥으로부터 분리한 혈관 평활근세포로부터 RT-PCR로 분리하고, pBluescriptSK+(Stratagene, La Jolla, CA)의 HindIII(5'말단), EcoRI(3'말단)에 서브클로닝하여 조제하였다. 그 때, hFGF2 cDNA의 유전자서열은 Abraham 등의보고(Abraham, J. A. et al., EMBO J. 5(10), 2523-2528, 1986)와 동일한 것을 확인하였다.

pSeV18⁺/△F(△5aa)의 NP 유전자 앞에 위치하는 제한효소 NotI의 위치에 hFGF2 유전자를 삽입하기 위해서, 먼저 hFGF2 유전자의 3'말단측에 SeV 특이적 서열(EIS 서열)을 부가하여 양 끝에 NotI 인식서열을 가지는 프래그먼트를 조제하였다. 구체적으로는 상기 hFGF2 cDNA를 주형으로 하여, 개시코돈을 포함하는 N말단측 프라이머(5'-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgcc/서열번호: 13) 및 종지코돈 영역과 EIS 서열을 포함하는 C말단측 프라이머(5'-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacattggaagaaaaagtatagc/서열번호: 14)를 사용하여 PCR을 행하고, NotI로 소화한 후, pBluescriptSK+(Stratagene, La Jolla, CA)의 NotI 부위에 서브클로닝하여 pBS-hFGF2를 조제하여, 염기서열을 확인하였다. pBS-hFGF2를 NotI로 소화한 후, hFGF2 cDNA를 포함하는 단편을 pSeV18⁺/△F(△5aa)의 NP 유전자 앞에 위치하는 NotI 부위에 삽입하여, hFGF2 유전자 탑재 F 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA pSeV18⁺hFGF2/△F(△5aa)를 구축하였다(pSeV18⁺hFGF2/△F(△5aa)는 pSeV18⁺hFGF2/△F로도 표기한다). 또한, 복제능을 가지는 바이러스 cDNA를 코드하는pSeV18⁺b(+)의 NotI 부위에도 hFGF2 cDNA를 포함하는 NotI 단편을 삽입하여 pSeV18⁺hFGF2를 구축하였다. pSeV18⁺hFGF2로부터는 공지의 방법(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466)에 의하여 인간 FGF2를 발현하는 복제형 SeV 벡터를 조제하여, SeV-hFGF2로 하였다.

3. F 결실 SeV 바이러스의 재구성 및 증폭

센다이 바이러스의 F 유전자(SeV-F)를 Cre DNA 리콤비나아제에 의하여 유도적으로 발현하는 F 발현 헬퍼세포(LLC-MK2/F; WO00/70055 및 WO00/70070 참조)를 사용하여, F 결손 SeV 벡터의 재구축을 행하였다(SeV-F 유전자 유도발현 전의 상기 세포를 LLC-MK2/F로 표기하고, 유도발현 후의 세포를 LLC-MK2/F/Ad로 표기한다). LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 직경 10 cm의 페트리접시에 뿌려, 24시간 배양한 후, 소랄렌과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126, 1986)로 실온에서 1시간 감염시켰다(moi=2). 백시니아바이러스로의 자외선 조사에는 15 와트 전구 5개가 장비된 UV Stratalinker 2400(카달로그번호 400676(100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA)을 사용하였다. 세포를 2회 세척하고 플라스미드 pSeV18⁺hFGF2/△F, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L(Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579, 1996) 및 pGEM/F-HN(WO00/70070)을 각각 12 ㎍, 4㎍, 2 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 OptiMEM(GIBCO)에 현탁하여, SuperFect transfection reagent(1 ㎍ DNA/5 ㎕의 SuperFect, QIAGEN)를 넣고 혼합하여, 실온에서 15분간 방치한 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 OptiMEM 3 ml에 넣고, 세포에 첨가하여 배양하였다. 3~5시간 배양 후, 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 2회 세척하여, 시토신 β-D-아라비노프라노시드 40 ㎍/ml(AraC, Sigma) 및 트립신 7.5 ㎍/ml(GIBCO)를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 24시간 배양하였다.

배양상청을 제거하여, 상기에서 클로닝한 F 발현 헬퍼세포 LLC-MK2/F/Ad 세포를 중층하였다. 구체적으로는 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에 분산된 LLC-MK2/F/Ad 세포를 배양상청을 제거한 세포에 중층하고, 48시간 배양을 계속하였다. 스크레이퍼로 이들 세포를 회수하고, 펠릿을 OptiMEM에 현탁하여(10⁷cells/ml), 동결융해를 3회 반복하여 행하였다. 이 라이세이트를 LLC-MK2/F/Ad 세포(4 ×10⁶cells/well 12-well-plate)에 가하고(200 ㎕/well), 추가로 300 ㎕/well의 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)을 첨가하여 15~24시간 배양하였다. 배양상청을 제거하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 세척한 후, 새로운 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)을 첨가하여, 5~9일간 배양을 행하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청을 LLC-MK2/F/Ad 세포에 감염시켜 동일하게 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 배양을 행함으로써 F 결실형 SeV를 증폭하였다.

그 때, F 결실형 SeV 입자가 포함되어 있는 배양상청을 0.22 ㎛의 필터에 반복하여 2회 통과시킴으로써, 재구성시의 T7 RNA 폴리머라아제의 발현에 이용한 리콤비넌트 백시니아바이러스의 혼입을 제거하였다. 구체적으로는, 2회 이상 AraC를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 증폭한 배양상청(P2 이후의 샘플)에 대해서 0.22 ㎛의 필터에 2회 통과시키고, 더욱이 1회 AraC를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 증폭한 배양상청을 회수하고, 리콤비넌트 백시니아바이러스의 혼입을 회피하여 증폭한 F 결실형 SeV(SeV-hFGF2/△F)를 얻었다.

4. 복제형 및 복제능 결실형 인간 FGF2 발현 SeV 벡터를 사용한 허혈지 유전자 치료

실시예 1의 BALB/c nu/nu 마우스 중증 허혈 모델(탈락 사지 모델)을 사용하여, 복제형 및 복제능 결실형 인간 FGF2 발현 SeV 벡터의 투여에 의한 치료 효과를 검증하였다. 혈관신생 유전자의 도입은 실시예 2와 동일하게 행하였다. 벡터의 주입은 수술시에 행하였다. 수술 후의 사지 탈락을 관찰하고, 각 시점에 있어서의 사지 구제율(사지가 남아 있는 개체의 비율)을 산출하였다(도 13).

대조의 루시페라아제 발현 SeV(SeV-luciferase)를 투여한 마우스에서는 비투여 마우스와 동일하게 높은 빈도로 사지가 탈락하였다. 이것에 대해서, 인간 FGF2 발현벡터(SeV-hFGF2 및 SeV-hFGF2/△F)를 투여한 경우는 사지 탈락을 유의하게 억제하였다. 본 실시예에 의하여, 인간 FGF2를 발현하는 파라믹소바이러스 벡터가 허혈 치료를 위한 혈관신생 유전자로서 높은 효과를 가지는 것이 나타났다. 더욱이,복제능 결실형 파라믹소바이러스 벡터가 허혈 치료에 유효한 것을 실증하였다.

본 발명에 의하여 허혈조직을 표적으로 한 유전자 치료를 위한 기반기술이 제공되었다. 이에 따라, 허혈조직의 혈관신생을 효과적으로 유도하여, 괴사를 방지하는 것이 가능해진다.

Claims (8)

1. 혈관신생 유전자를 발현 가능하게 코드하는 파라믹소바이러스 벡터.
2. 제1항에 있어서, 혈관신생 유전자가 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)인 파라믹소바이러스 벡터.
3. 제1항에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 파라믹소바이러스 벡터.
4. 제1항에 있어서, F유전자를 결손하고 있는 파라믹소바이러스 벡터.
5. 제1항의 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포 및 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 포함하는 혈관신생 조성물.
6. 제5항에 있어서, 허혈조직을 처치하기 위한 조성물.
7. 제5항에 있어서, 근육 중 투여용인 조성물.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 혈관신생 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 혈관신생을 유도하는 방법.