CN100358581C - 具有降低的血凝活性的药物载体组合物或基因载体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了血凝活性降低了的药物载体组合物或基因载体组合物。通过将化合物附加于具血凝活性的负链RNA病毒的包膜蛋白，可成功地构建一种药物载体组合物或基因载体组合物，所述组合物与没有附着化合物的组合物相比，具有较低的血凝活性。例如，本发明的一种实施方案提供一种病毒载体，其红细胞聚集活性和溶血活性显著降低，而其血液中的稳定性却明显提高。本发明中提供的药物载体组合物或基因载体组合物可优选用于体内导入药物或基因。

Description

具有降低的血凝活性的药物载体组合物或基因载体组合物
技术领域
本发明涉及用于药物或基因递送进入细胞的载体，其血凝活性通过修饰一种负链RNA病毒的包膜蛋白降低。
背景技术
仙台病毒(SeV)包括两种类型的外包膜蛋白：血凝素-唾液酸苷酶(HN)和融合蛋白(F)。HN蛋白与细胞表面的唾液酸结合，紧跟着通过F蛋白的介导与所述细胞发生融合，从而使SeV能直接、快速、高效地感染进入细胞质。而且，因为唾液酸存在于几乎所有细胞的表面，SeV能够感染很广范围的细胞。为了将这些极具感染性的SeV应用于基因治疗，已开发出一种携带各种基因的重组SeV载体(Shiotani等，Gene Therapy，2001，8，1043-1050)，同时对一种药物递送系统的研究也在进行之中，该系统中基因和各种药物包裹在含SeV包膜蛋白的脂质体的水相核心中(Ramani等，FEBSLetters，1997，404，164-168；Isaka等，Experimental Nephrology，1998，6，144-147)。
SeV载体有很多这样的优点，但其广泛的感染力也是一个不利的因素。SeV载体也可与包含大量唾液酸的红细胞融合，从而引发高溶血活性。因此，从安全性角度来看要求进一步改进。此外，SeV载体与红细胞融合意味着该载体不能递送需要量的药物到达靶细胞，表明SeV载体可能在血液中极不稳定。因此，预测SeV载体在体内的施用方法将限制于那些不以血液为介导的方法，例如暂时停止血流或灌注的方法，或是对那些几乎不受血液成分影响的位点进行局部施用的方法。
为了解决这些与安全性和稳定性相关的问题，HN蛋白的血凝活性有必要被去除或降低以减少其与红细胞的结合。但是，降低血凝活性会导致SeV与将要导入药物的靶细胞的结合力降低，这样可以很容易地推断出药物运输效力将明显降低。因此，要求必须使有一些窍门(ingenuity)。
至今为止，已有很多研究报道通过用二硫苏糖醇(DTT)特异性地还原SeV的HN蛋白从而降低血凝活性的方法。然而，这些研究大多数是用对红细胞的溶血活性作为指标。例如，Tomashi等在FEBS Letters，1982，143(2)，252-256中报道用DTT还原SeV从而消除其血凝活性。不过，他们仅报道了将识别红细胞的抗体分子重新导入HN蛋白分子的SH基团(由DTT还原形成的)，能互补SeV结合红细胞的能力，表现出恢复的溶血活性。此外，由于融合活性大大降低，存在对此方法可能性的怀疑。Gitman等在Biochemistry，1985，24，2762-2768中报道了对SeV外包膜蛋白的化学修饰。他们成功地消除了血凝活性，但与此同时也完全去除了融合能力。他们报道说，要想获得融合能力必须重新掺入未经修饰的包膜蛋白，而这样又导致血凝活性的恢复。
还有几个对靶细胞研究的报道。举例来说，Bagai等在Journal of Virology，1993，67(6)，3312-3318，提出了F蛋白的糖链特异性感染的药物递送系统，其中包括如下步骤：使用表面活性剂溶解其HN已被还原的SeV；然后重构仅含有F蛋白的病毒粒子。Ramani等在FEBS Letters，1997，404，164-168，也报道了使用类似系统在体外进行基因导入的结果。这些方法确实可以去掉血凝活性并使SeV仅与靶细胞融合，可同时还存在一些有待解决的问题。例如，虽然较少，F蛋白也伴随着HN蛋白的还原而被还原。而且，在重构过程中(Ponimaskin等，Virology，2000，269，391-403)并不是所有的包膜蛋白都被整合入病毒粒子，因而削弱了重构载体的融合能力，导致剂量的增加。还有，在生产过程中，对大量病毒的需求、去除表面活性剂的繁琐步骤、重构病毒粒子的异质性等，都为进一步改进提供了的大量空间。
因此，至今还没有已知的基于负链RNA病毒包膜蛋白、其血凝活性显著降低而递送药物进入细胞的能力保持不变的药物传输系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种载体，通过修饰负链RNA病毒的包膜蛋白，仅使其血凝活性显著降低而仍保持将药物或基因导入细胞的能力。
在药物和药物配制剂的开发中，药物递送系统(DDS)作为减少不希望的作用并显示所需功能的一种方法，是很重要的技术。本发明者们认为，作为DDS技术中的一种，化学修饰负链RNA病毒的包膜蛋白可以降低作用于红细胞的活性并保持细胞导入能力。就此而言，优选选择性地修饰负责血凝活性的包膜蛋白，从而在降低该活性的同时尽可能使对融合起关键作用的包膜蛋白的影响最小化。
本发明者们进行了详尽地研究并发现，用聚合体如聚乙二醇(PEG)修饰时可有效降低血凝作用。例如，在一个通过将活化PEG共价结合于仙台病毒(SeV)包膜蛋白氨基基团上而获得的PEG修饰的SeV载体(图1)中，显而易见，根据PEG的反应量，血凝反应(HAU)显著降低。尽管也担心随着HAU的降低载体对靶细胞的感染力也可能降低，但与HAU的降低相比，修饰载体将基因导入细胞能力的降低程度是比较小的，确保其保持了足够的载体感染能力(表1和2)。在这种情况下，显示了较大分子量的PEG可增强将基因导入细胞的能力。而且，制备PEG修饰载体的方法非常快速便宜。
在对经PEG修饰的SeV载体的组成蛋白进行的电泳图中，HN蛋白大量减少而作为替代观察到了新大分子的出现。另一方面，F蛋白的减少相对较小，表明PEG优选修饰HN蛋白而不是与F蛋白结合。由此可认为这是在HAU大幅度降低的同时仍保持融合能力的原因之一(图4、15和16)。
作为HAU减少的一个反映，PEG修饰的SeV载体对大鼠血的溶血活性显著下降，表明该载体在安全性方面是非常出色的(图2)。此外，尽管SeV载体的基因导入能力在与血液接触的过程中显著降低，但修饰后的载体即使在血液处理之后仍可保持足够水平的基因导入能力(图3和20)。这些结果说明，修饰不仅具有降低与红细胞结合的作用，同时还能够对那些例如血液中补体等很可能破坏载体活性的因子具有稳定化作用。此外，由于PEG修饰的载体实际上即使在中和抗体存在下也可稳定地导入基因(图5和17)，因此认为PEG修饰可以对各种活体成分具有稳定化作用。
另外，当检测PEG修饰载体在体内施用的效果时，多次给药后该载体的基因导入效率明显高于未经修饰的载体，证实了PEG修饰载体在体内有高基因导入能力(图19)。
如前所述，已发现了适宜地选择PEG修饰条件可降低SeV载体与红细胞的相互作用，并仍保持高水平的将基因导入细胞的能力。
此外，本发明者们还检测了纯化后抗-HN蛋白单克隆抗体(MAb)的用途，该抗体选择性地与负责血凝活性的包膜蛋白结合，并降低其活性(Miura等，Exp.Cell Res.，1982，141，409-420)。用MAb处理后的仙台病毒载体根本表现不出任何血凝活性。其血凝活性完全被封闭，而且也观察不到经处理后的载体将基因导入细胞的现象。当将靶细胞结合的配体分子重新结合到MAb分子上后，经此配体偶联的MAb处理的仙台病毒(图5)显示既没有血凝活性也没有溶血活性(图7、10和11)，但尽管如此，该处理后的病毒却能够高效将基因导入可与配体偶联的靶细胞(图8和9)。基因只能被导入靶细胞中，而且当存在过量竞争性物质时基因导入能力会被消除(表4)。这些结果证明，尽管修饰载体完全丧失了血凝活性，仍可高效地将基因专一地导入靶细胞中。
通过将用来连接的配体分子，改变成可与在某靶细胞中高度表达受体产生应答反应的分子，认为该系统可适用于对任何细胞进行导入。
而且，由于该系统可方便地通过在即将使用前混合各成分来制备，因此其非常容易应用。
这种技术也可应用于由SeV外膜组成蛋白重构的病毒粒子制剂。在这种情况下，可能没有必要如上所述还原HN蛋白。如果在没有预先还原就将SeV溶解并重构包裹有所需药物的病毒粒子之后应用本技术，所形成的载体能够具有更高的融合能力并且不会对F蛋白造成任何由于还原作用带来的影响。
本发明涉及其血凝活性降低了的药物载体组合物或基因载体组合物。更明确地说，本发明提供：
[1]一种药物-载体组合物或基因-载体组合物，其包含细胞膜，该细胞膜含有具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白，其中：
(a)一种化合物附着于所述蛋白；
(b)血凝活性比没有附着所述化合物的组合物降低；而且
(c)该组合物具有将药物或基因导入靶细胞的能力；
[2][1]中的组合物，其中
(d)对红细胞的溶血活性比没有附着该化合物的组合物降低；
[3][1]或[2]中的组合物，其包含负链RNA病毒的感染型病毒粒子；
[4][1]或[2]中的组合物，其包含灭活的负链RNA病毒或该病毒的包膜部分；
[5][1]-[4]之一的组合物，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒科的病毒；
[6][5]中的组合物，其中所述副粘病毒科的病毒是仙台病毒；
[7][1]-[6]之一的组合物，其中所述附着于蛋白的化合物的分子量为1,800或更高；
[8][7]中的组合物，其中所述附着于蛋白的化合物的分子量为4,500或更高；
[9][8]中的组合物，其中所述附着于蛋白的化合物的分子量为16,000或更高；
[10][1]-[9]之一的组合物，其中所述附着于蛋白的化合物是聚乙二醇；
[11][1]-[10]之一的组合物，其中所述蛋白进一步与聚乙烯亚胺形成复合物；
[12][1]-[11]之一的组合物，其中所述蛋白与细胞结合化合物形成复合物；
[13][12]中的组合物，其中所述细胞结合化合物与所述附着于所述蛋白的化合物相结合；
[14][12]或[13]中的组合物，其中所述附着于所述蛋白的化合物是与该蛋白相结合的抗体或其片段；
[15][12]-[14]之一的组合物，其中所述细胞结合化合物是细胞表面受体的配体；
[16][15]中的组合物，其中所述配体是叶酸；
[17]与细胞结合化合物结合的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白相结合；
[18][17]中的抗体或其片段，其是F(ab′)2；
[19][17]或[18]中的抗体或其片段，其中所述细胞结合化合物是某细胞表面受体的配体；
[20][19]中的抗体或其片段，其中所述配体是叶酸；还有
[21]一种药物或基因-载体试剂盒其包括：
(a)一种抗体或其片段，其与具有血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白相结合，并且与细胞结合化合物相结合；和
(b)含有所述包膜蛋白的药物-载体组合物或基因-载体组合物。
本发明提供了药物-载体组合物或基因-载体组合物，包括含有具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜，其中：(a)一种化合物附着于所述蛋白上；(b)与该化合物没有附着的组合物相比，其血凝活性降低；而且(c)该组合物具有将药物或基因导入靶细胞的能力。本发明中的组合物是复合物，包括含有具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜。举例来说，这类复合物可以是感染性病毒粒子、灭活的负链RNA病毒、或含有分解后负链RNA病毒的包膜成分如重构的脂质体。
感染性病毒粒子通过感染细胞将包裹在该病毒中的药物或基因载入细胞。具体地，通过将外源基因整合入病毒基因组，该基因可以从被该感染性病毒粒子感染的细胞中的病毒基因组表达。该感染性病毒可以是有复制能力的病毒或复制缺陷型病毒。术语“有复制能力的病毒”是指当病毒感染宿主细胞后，其可在那些宿主细胞中复制产生感染性病毒粒子。
在该基因组RNA转录和复制所必需的病毒蛋白存在时，负链RNA病毒可通过在细胞内转录病毒基因组RNA来重构。重组负链RNA病毒的重构可采用本领域内熟知方法(WO 97/16539；WO 97/16538；WO 00/70055；WO 00/70070；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.等，1994，EMBOJ.13：4195-4203；Radecke，F.等，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16：578-587；Yu，D.等，1997，Genes Cells 2：457-466)。采用这些方法，负链RNA病毒载体，包括如副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙台病毒等，可从DNA重构。
含有外源基因的重组病毒载体可通过将外源基因插入病毒载体基因组来获得。任何将要在细胞中表达的基因都可用作为外源基因。外源基因可以是编码天然蛋白的基因、或是编码通过缺失、取代或插入核苷酸对天然蛋白进行修饰所得蛋白的基因，只要该基因编码与天然蛋白具有同等功能的蛋白即可。可选地，该外源基因可编码天然蛋白的缺失衍生物或人工合成蛋白。举例来说，对于基因治疗或类似情况，病毒的重构是通过将一个用于治疗靶疾病的基因插入作为病毒载体模版(病毒载体DNA)的DNA中，然后转录该重组DNA来完成的。将外源基因导入病毒载体DNA中，如导入仙台病毒载体DNA中时，由6的倍数个核苷酸组成的序列优选插入在如转录终止(E)序列和转录起始(S)序列之间(Joumal of Virology，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。在副粘病毒中，外源基因可插入在各个病毒蛋白开放读码框架(ORF)的上游和/或下游(例如NP、P、M、F、HN和L蛋白的ORF)。为了避免抑制该外源基因上游和下游基因的表达，将适宜E-I-S(转录终止序列-插入序列-转录起始序列)序列或其部分序列插入在外源基因的上游或下游，以便将该E-I-S序列单元安置在各个基因之间。
回收的病毒可以纯化到基本纯。纯化可以通过本领域内已知的纯化/分离方法来完成，包括过滤、离心、以及柱纯化或任何这些方法的联合使用。“基本纯”是指病毒在其作为一种成分的样品中占主要部分。通常，基本纯病毒载体的认定可通过以下方式确认：确定病毒载体产生的蛋白为该样品所含总蛋白的50％或更多，优选70％或更多，更优选80％或更多，而且还更优选90％或更多。特异性纯化负链RNA病毒方法的实例是那些使用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(Examined Published Japanese PatentApplcations No.(JP-B)Sho 62-30752，JP-B No.62-33 879，还有JP-B No.62-30753)，以及那些将蛋白吸附于含硫酸海藻糖和/或其降解产物上(WO97/32010)的方法等。
无活性的病毒或由分解病毒重构的产物，用作将药物或基因导入细胞的转染剂。负链RNA病毒可以通过如UV照射的方法来灭活。另外，脂质体是利用灭活病毒如日本血凝病毒(HVJ)-脂质体来制备，例如可使用振荡和超声波方法(见，“Liposome in Life Science/Laboratory Manual”，Springer-Verlag Tokyo(1992)，pp.282-287)。此外，一种通过将灭活仙台病毒粒子或脂质体和核酸混合形成的组合物(膜融合脂质体)的研究也见诸报道(Yasushi Kaneda：BIOTHERAPY，8，1265(1994))。可选地，分解后的病毒可通过如下例的方法来重构，从病毒溶解物重新构筑脂质体来制备所谓的“病毒体”(Bagai等，(1993)Biochem.Biophys.Acta 1152，15-25)。具体地，在用如Triton X-100等表面活性剂溶解负链RNA病毒后，不溶性的RNP可通过离心来除去。病毒体可通过从含有包膜和包膜蛋白的溶解液中去除表面活性剂重构病毒粒子来制备。相同颗粒大小的病毒体可通过离心方法来收集(例如，在12,000rpm下离心10分钟)。
在含有感染性病毒粒子的组合物中，该感染性病毒粒子既可以是负链RNA病毒，也可以是其它含有具有血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的病毒。用另一种病毒包膜蛋白重构的假型病毒是本领域已知的(WO 01/92508)。含有负链RNA病毒包膜蛋白的假型病毒可通过如下步骤来制备：例如制备含有灭活负链RNA病毒或含有该病毒包膜蛋白的病毒体；然后将该病毒与另一病毒相融合。作为另一选择，假型病毒可通过在另一病毒的包装细胞中表达一种可表达具有血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的表达载体来制备。其包装细胞可用来表达该载体的所述病毒实例有逆转录病毒，尤其是属于肿瘤病毒亚科的病毒，包括莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病毒(MoMLV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、以及诸如此类(本发明中称为癌病毒的病毒)；还有那些属于慢病毒属亚科的病毒，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV1或HIV2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、麦西维斯那病病毒(meadi visna virus)、马感染性贫血病毒(EIAV)、caraparu关节炎脑炎病毒(caraparu arthritis encephalitis virus)(CAEV)、以及诸如此类(本发明中称为慢病毒的病毒)。HIV-1包括所有主要(M)亚型(包括A-J)、N和outlier(O)(Hu，D.J.等，JAMA 1996，275：210-216；Zhu，T.等，Nature 1998，5：391(6667)：594-7；Simon，F.等，Nat.Med.1998，4(9)：1032-7)。SIV分离株的例子有SIVagm、SIVcpz、SIVmac，SIVmnd，SIVsnm和SIVsyk等。也可以使用源自泡沫病毒的逆转录病毒，包括泡沫病毒(Spuma virus)(DE 4318387；WO 9607749；Virology(1995)210，1，167-178；J.Virol.(1996)70，1，217-22)。由泡沫病毒(foamy virus)得来的病毒载体可用于将外源基因导入人体细胞，特别是在基因治疗和重组疫苗等中可用于给药。
除了具有血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白外，假型病毒载体还可以包括，如该病毒的其它包膜蛋白。举例来说，本发明包括的组合物，其包括一种含有副粘病毒HN和F蛋白的假型化病毒载体，其中有一个化合物附着在HN蛋白上。包括具有血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的病毒载体，还可包括来自另一病毒的包膜蛋白。所述包膜蛋白，举例来说，优选可感染人类细胞的病毒的包膜蛋白。这类蛋白没有特殊限制，而且还包括如，逆转录病毒的兼嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白等。此外，疱疹病毒蛋白的实例有单纯疱疹病毒的gB、gD、gH和gp85蛋白；还有EB病毒的gp350和gp220蛋白等。嗜肝DNA病毒(hepdonaviridea)蛋白Naviaux，R.K.等，J.Virol.70：5701-5705(1996))。至于嗜亲性包膜蛋白，举例来说，可使用来自莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV)的包膜蛋白。至于水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，举例来说，可使用来自其印第安纳血清型毒株(J.Virology 39：5 19-528(1981))的蛋白。除此之外，也可使用来自任何优选毒株的蛋白。
本发明中，负链RNA病毒是含有负链(相对于编码其病毒基因的有义链的反义链)RNA作为基因组的病毒，并且包膜蛋白含有血凝活性。负链RNA也可指负链。负链RNA病毒实例有副粘病毒科仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、以及麻疹病毒；正粘病毒科流感病毒；以及弹状病毒科水泡性口炎病毒和狂犬病毒。
本发明中，具血凝活性的病毒包膜蛋白优选单负链RNA病毒的包膜蛋白。单链负链RNA病毒也可指为非节段型负链RNA病毒，包括属于以下病毒科的病毒：副粘病毒科(包括副粘病毒属、麻疹病毒属(morbillivirus)、腮腺炎病毒属(rubulavirus)、肺病毒属(pneumovirus)等)；弹状病毒科(包括水泡病毒属(genera vesiculovirus)、狂犬病病毒属、短暂热病毒属(ephemerovirus)等)；Firoviridae；正粘病毒科(包括下面所述的属，流感病毒A、B和C、索戈托样病毒(thogoto-like viruses)等)；布尼病毒科(Bunyaviridae)(包括下面所述的属，布尼病毒(bunyavirus)、汉坦病毒(hantavirus)、内罗病毒(nairovirus)、白蛉热病毒(phlebovirus)等)以及沙粒病毒科(Arenaviridae)的病毒。具有血凝活性包膜蛋白的具体实例有，副粘病毒属(paramyxovirus)病毒的HN蛋白、正粘病毒属(orthomyxovirus)病毒的HA蛋白、流感病毒(influenza virus)的HA蛋白、布尼病毒属(bunyavirus)病毒的G1蛋白、弹状病毒属(rhabdovirus)病毒的G蛋白、firovirus的VP1蛋白等。
本发明中，具血凝活性的病毒包膜蛋白更优选来自副粘病毒。“副粘病毒”是指属于副粘病毒科的病毒。副粘病毒包括，如副粘病毒属、麻疹病毒属(genus morbillivirus)、腮腺炎病毒属(genus rubulavirus)、肺病毒属(genuspneumovirus)以及genus metapneumovirus等；具体的例子有仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、瘟热病毒、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1、2、3型等。具有血凝活性的副粘病毒包膜蛋白中一个具体例子是HN蛋白(也指H蛋白)。本发明中，具血凝活性的病毒包膜蛋白更优选那些属于副粘病毒亚科(subfamily Paramyxovirinae)的病毒，包括副粘病毒属、麻疹病毒属以及腮腺炎病毒属(genus rubulavirus)的包膜蛋白，并且更加优选副粘病毒属病毒包膜蛋白。具血凝活性的病毒包膜蛋白最优选仙台病毒HN蛋白。这些病毒可来自野生株、突变株、实验室传代株以及人工构建株。举例来说，来自仙台病毒Z株的HN蛋白可优选使用。仙台病毒HN基因的核苷酸序列登记在GenBank，登录号为No.D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131等。
另外，作为具血凝活性的病毒包膜蛋白，正粘病毒科病毒的HA蛋白也可优选使用。例如，利用流感病毒的包膜蛋白表达质粒制备的假型病毒可以感染包括人类细胞在内的很大范围的哺乳动物细胞。可以使用来自优选分离株的流感病毒包膜蛋白。在流感病毒的出芽(budding)过程中，唾液酸苷酶在裂解HA蛋白和唾液酸之间的键中起重要作用。因此，在制备HA假型病毒过程中，感染性病毒可通过在将化合物附着于HA之前、同时或之后，用唾液酸苷酶处理病毒来获得。另一种方案，通过制备与具唾液酸苷酶活性蛋白共存的病毒载体，连接唾液酸的键可以自动裂解。在这种情况下，具有唾液酸苷酶活性的病毒包膜蛋白，例如副粘病毒的HN蛋白，是优选使用的。因此，本发明提供具有降低的病毒血凝活性的组合物，其包含同时含有正粘病毒科病毒HA蛋白和副粘病毒科病毒HN蛋白的假型病毒载体，其中有化合物附着在一种或全部两种蛋白上。
病毒包膜蛋白可以是来自野生型病毒的完整蛋白、或者是天然或人工突变后的蛋白。例如，有可能通过分析抗原呈递表位等作为这些包膜蛋白中潜在的细胞表面抗原分子，然后利用这些表位用抗原呈递能力降低了的蛋白构建病毒。此外，还有可能使用来自经灭活的致病性病毒减毒株的包膜蛋白等。
例如，使用其细胞质内结构域已经通过缺失、取代、和/或增加氨基酸残基进行修饰的具血凝活性的病毒包膜蛋白以及其它包膜蛋白，可以构建成具有更高基因导入能力的载体。本发明涉及含有病毒载体的组合物，该载体包括具血凝活性的天然病毒包膜蛋白(其部分或全部细胞质结构域是经取代、缺失、和/或增加氨基酸残基修饰的)，其中在具血凝活性的病毒包膜蛋白上附着了一种化合物。具体举例来说，通过缺失负粘病毒HN蛋白的细胞质结构域、或通过在其它膜蛋白(如包括慢病毒在内的逆转录病毒包膜蛋白)细胞质结构域中进行取代或加合所获得的修饰蛋白，优选用于制备具有高感染效率的假型化逆转录病毒载体。
本发明中，血凝活性是指引起血凝作用(HA)的活性，也就是使红细胞聚集的活性。血凝活性可通过本领域已知的方法来检测(Kokuritsu Yobou
本发明中，血凝活性是指引起血凝作用(HA)的活性，也就是使红细胞聚集的活性。血凝活性可通过本领域已知的方法来检测(Kokuritsu YobouEisei Kenkyujo Gakuyukai，ed.Second edition，“Virus Experiments”，Introduction，pp.214-225，Maruzen Co.，Ltd.)。例如，来自鸡(包括雏鸡和成年鸡)、鹅、大鼠、豚鼠、恒河猴、绿猴、或人的红细胞都可以使用。根据这些蛋白在适宜的条件下进行反应，如在0℃、4℃、室温或37℃。具体来说，血凝活性可以通过如“终点稀释法”(Kato，A.等，1996，Genes Cells 1：569-579；Yonemitsu，Y.&amp and Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)来测定。
在本发明中具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白上附着有化合物，与没有附着化合物时相比其血凝活性降低。本发明中，术语“降低了的血凝活性”是指显著降低了的血凝活性，还包括如在统计学上显著降低了的活性(例如，5％或更高的显著水平)，也包括完全消除了的活性(或者说低于可检测水平的活性)。本发明组合物的血凝活性，优选降至其中没有附着化合物的对照组合物活性的1/2或更低，更优选降至其1/3或更低，更优选降至其1/5或更低，更优选降至其1/10或更低，更优选降至其1/20或更低，更优选降至其1/50或更低，更优选降至其1/100或更低，更优选降至其1/200或更低，更优选降至其1/500或更低，还更优选降至其1/1000或更低。相反，与血凝活性的降低相比，本发明的组合物将药物或基因导入细胞的能力仍保持不变。也就是说，与其中没有附着化合物的对照组合物相比，本发明组合物将药物或基因导入细胞的能力仅有较小程度的降低，或更优选不但没降低反而增加。
而且，本发明中组合物的溶血活性也优选显著降低的。溶血活性可通过如下方法来检测，将受试组合物与血液混合；静置该混合物；离心除去血细胞成分；然后测量洗脱下来血色素的吸收值(见实施例)。本发明中组合物的溶血活性优选降至其中没有附着化合物的对照组合物的活性的70％或更低，更优选降至其60％或更低，更优选降至其1/2或更低，更优选降至其1/3或更低，更优选降至其1/5或更低，更优选降至其1/10或更低，更优选降至其1/20或更低，还更优选降至其1/50或更低。
本发明中组合物的血凝活性降低，并且在优选实施例中，其溶血活性也降低；但它们将药物或基因导入细胞的能力则得到保留。例如含有负链RNA病毒或该病毒包膜蛋白成分的组合物，可与靶细胞的细胞膜融合，将药物或基因带入细胞。细胞膜融合能力是指，当本发明中组合物所含有的复合物(载体)粘附于细胞膜后，利用该复合物的融合活性将组成成分整合入细胞内的能力。这种活性是由于融合蛋白(F)的功能而产生的，该蛋白可引起细胞融合并包含在负链RNA病毒的包膜中。本发明中组合物所含的细胞膜除包含具有血凝活性且其上附有化合物的包膜蛋白以外，优选含有负链RNA病毒的F蛋白。
与细胞融合的能力可以通过如下方法来检测：(1)用红细胞溶血作用作为指示物；(2)将荧光物质掺入膜中，然后利用由于融合过程中发生膜流通(membrane flux)造成的稀释作用而产生的荧光强度的变化来检测；或(3)将药物包入作为细胞膜模型的脂质体的水相核心中，然后利用该药物的渗漏作为指示剂来检测。
此外，在本发明中组合物是作为假型病毒从其它病毒如前述逆转录病毒来制备时，由于各自病毒包膜蛋白的作用，组合物仍能够将该病毒中所含有的药物或基因导入细胞。将药物或基因导入细胞的能力可通过从细胞内检测该药物或基因来确定。药物可通过如下方法来检测，举例来说，通过检测摄取进入细胞的标记药物，或通过将某种生物活性物质导入细胞，然后检查由于该物质造成的细胞特性的变化。另外，细胞内基因的表达可通过如RT-PCR、Northern印迹杂交、免疫沉淀反应、Western印迹等方法，在RNA或蛋白水平进行检测。另外，可将编码某种生物活性蛋白的基因插入细胞，然后可检测由该蛋白造成的细胞特性的改变。
此外，本发明中组合物在血中的稳定性优选明显提高。在血中稳定性的提高意味着当本发明中组合物置于血液中时，其运输药物或基因的能力仅会有较小程度的降低。该组合物运输能力的降低越少，其在血液中的稳定性越高。血液中稳定性的提高可以这样来检测，通过将本发明组合物与血液一起温育；测量该组合物递送的药物或基因在温育后的水平；然后将此水平与其上没有化合物附着的对照组合物(见实施例)所得的水平相比。递送能力在递送的是药物的情况下可以参考药物的活性，在递送基因的情况下可以参考该基因的表达水平。基因表达可通过如直接或间接检测转录产物(mRNA)或翻译产物(蛋白质)的方法来测定。生物活性蛋白可通过测定该蛋白的活性来检测。本发明中组合物递送药物或基因能力的降低程度，优选降至其中没有附着化合物的对照组合物的70％或更低，更优选为60％或更低，更优为1/2或更低，更优为1/3或更低，更优选为1/5或更低，更优为1/10或更低。与未经修饰的对照组合物相比，理想的结果是，相对于其血凝活性降低的变化，本发明中组合物递送药物或基因的能力反而提高。
本发明中，术语“一种化合物附着于具血凝活性的包膜蛋白上”是指所述蛋白与所述化合物相结合。这种结合可以是共价或非共价键结合。非共价结合的例子有氢键、配位键、离子键、疏水相互作用(疏水键)以及分子间作用力(范德华力)等。该蛋白和该化合物开始时可能是分离存在的，然后该化合物可能通过成键作用附着于该蛋白。通过如交联作用形成的共价键，化合物可附着于具血凝活性的包膜蛋白上。交联可与任何优选的功能团形成。所述功能团包括，如羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅烷醇基、酰氨基、环氧基团、琥珀酰亚胺基、苯酚基等，但不仅限于这里所说的这些。共价键的实例有，酯键、醚键、氨基键、酰胺键、硫醚键、亚氨基键、二硫键、等。该蛋白和该化合物优选用非肽键结合。形成共价键的方法包括溴化氰激活(cyanogen bromide activation)法、酸性叠氮化物衍生(acid azidederivative)法、缩合剂(condensing agent)法、重氮化(diazotization)法、烷基化(alkylation)法等。
本发明中的药物-载体组合物或基因-载体组合物可通过包括如下步骤的方法来制备：将一个化合物与具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白相接触；并使该蛋白与该化合物结合。化合物结合在包膜蛋白暴露在病毒表面的结构域上。因此，具体来说，将化合物与蛋白相接触的步骤优选通过将该化合物与含有该蛋白的病毒粒子接触来完成。这样，通过暴露于病毒表面的结构域，化合物可特异性地附着于参与血凝活性的蛋白。具体地，本发明证实即使在其它包膜蛋白存在时，该化合物也将优选通过化合物交联与病毒表面具血凝活性的包膜蛋白结合，从而显著降低血凝活性。因此，通过例如下面的步骤，有可能容易地制备出这样的病毒，其中有化合物附着于具血凝活性的包膜蛋白上：将通过常规方法产生的化合物与其上没有化合物附着的病毒结合；然后将所述化合物与所述病毒结合。
用于附着于具血凝活性包膜蛋白上的化合物没有限制，只要它们能够显著地抑制该蛋白的血凝活性。优选这些化合物没有明显的生物毒性，并且与蛋白连接后在化学上是稳定的。而且，该化合物没有抗原性或仅有低的抗原性。此外，用于附着的化合物优选水溶的。为了有效地抑制血凝活性，化合物的分子量为优选1600道尔顿(Da)或更高、更优选1800或更高、更优选1900道尔顿或更高、而且更优选2000道尔顿或更高。特别优选的化合物的分子量为2800Da或更高、更优选为3800Da或更高、更优选为4300Da或更高、更优选为4500Da或更高、并且更加优选为5000Da或更高。尤其是，分子量为12000Da或更高、更优选14000或更高、更优选15000或更高、更优选16000或更高、更优选18000或更高、而且更优选20000或更高的化合物，可以显著抑制血凝活性。
用来附着的化合物可以是各种聚合体如有机化合物聚合体。它们也可以有不均一的分子量分布，在这种情况下此处所用的术语“附着化合物的分子量”是指平均分子量。分子量分布(MW/Mn)值优选小的，例如5或更小、优选3或更小、更优选2或更小、更优选1.6或更小、而且更优选1.4或更小。
具体地，举例来说天然高分子可以是蛋白如抗体、白蛋白、胶原、明胶、纤维蛋白、外源凝集素、以及肝素，或其片段；多糖如葡聚糖、环糊精、硫酸葡聚糖、纤维素、几丁质、脱乙酰壳多糖、以及褐藻酸；和脂类。作为合成聚合体，多聚乳酸、聚赖氨酸、聚苯乙烯、吡喃聚合物、聚谷氨酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、苯乙烯马来酸共聚物、赖氨酸-谷氨酸共聚物、聚羟乙基异丁烯酸、Ficoll等都可以使用。
特别地使用聚乙二醇(PEG)作为例子来说明用来附着的化合物(J.M.Harris，″Polyethylene Glycol Chemistry.Biotechnical and BiomedicalApplications″，Plenum，New York，NY，1992；J.M.Harris and S.Zalipsky，″Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol″，ACS Books，Washington，D.C.，1997)。由于其水溶性以及低或无毒性，优选使用PEG。“PEG”代表含有如下结构的化合物：
-(CH2CH2O)n-[化合物1]，
其中n是2或2以上的自然数。举例来说，典型的PEG是以含有如下结构的化合物：
HO-(CH2CH2O)n-H[化合物2]，
其中n是2或2以上的自然数。
PEG可包括任何想要的修饰衍生物，例如其中上述结构的末端可由羟基或类似基团取代。例如，单甲基醚(monomethylether)(mPEG)是本发明优选使用的，其中主链一端的羟基被取代。PEG可以是线状或分支状。例如，可以使用含有一个、两个、三个或更多侧链的PEG。这些侧链可能含有乙二醇结构。各种分子量的PEG都可以使用。举例来说，PEG2000(平均分子量：2000)、PEG3000(平均分子量：3000)、PEG4000(平均分子量：4000)、PEG5000(平均分子量：5000)、PEG8000(平均分子量：8000)、PEG10000(平均分子量：10000)、或PEG20000(平均分子量：20000)可以优选使用。利用含有用于交联的功能团的PEG，可将该PEG附着于具血凝活性的包膜蛋白。
举例来说，在末端含有伯氨的PEG可与酰基化试剂交联(Buckmann，A.等(1981)Makromol.Chem.182：1379；Zalipsky，S.等(1983)Eur.Polym.J.19：1177；Eidelman，O.等(1991)Am.J.Physiol.260(Cell Physiol 29)：C1094；Pillai，V.N.R.等(1980)J.Org.Chem.45：5364)。另外，PEG可方便地通过利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-活化的酯、活化的羧酸、活性的醛等来进行交联。PEG·羧酸NHS酯的具体例子有PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG-succinimidylsuccinate)、PEG-琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯、以及PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(Olson，K.等，(1997)J.M.Harris & S.Zalipsky Eds.，Poly(ethylene glycol)，Chemistry&Biological Applications，pp 170-181，ACS，Washington，DC.；Harris，J.M.and Kozlowski，A.，US Patent No.5,672,662)。此外，PEG的苯丙三唑碳酸盐衍生物与蛋白的氨基形成稳定的氨基甲酸乙酯键(Dolence，Eric K.，US Patent No.5,650,234)。也可以使用在其末端含有醛基的PEG。醛基可在比使用NHS酯更温和的条件下与胺反应。例如，PEG-丙醛可优选使用(Harris，J.M.等(1 984)J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22：341；Kinstler，Olaf B.等，U.S.Patent 5,824,784；Wirth，P.等(1991)Bioorg.Chem.19：133)。此外，PEG的马来酰亚胺衍生物可与巯基交联(Goodson，R.J.&Katre，N.V.(1990)Bio/Technology 8：343；Kogan，T.P.(1992)Synthetic Comm.22，2417)。也可以使用羧甲基-NHS衍生物、正亮氨酸-NHS衍生物、三乙磺酸盐(酯)(tresylate)衍生物、环氧化物衍生物、羰基咪唑衍生物、以及PEG的PNP碳酸盐衍生物。尤其是，PEG三乙磺酸酯以及PEG琥珀酰丙酸酯可以优选使用。
化合物的结合可通过如下步骤来完成，通过以1mg蛋白/ml的浓度制备含有具血凝活性的包膜蛋白的病毒粒子，然后将优选用来附着的化合物以大约0.1-100mg(优选约1-50mg)附于该病毒粒子。例如，通过在缓冲液(pH8.5)中将SPA-PEG5K(1-5mg)或SPA-PEG20K(约10-20mg)与病毒(1mg蛋白)反应，有可能显著地降低病毒的血凝活性而仍然保持该病毒将药物或基因导入细胞的能力。由于化合物与蛋白的附着可受如反应中使用化合物的量等反应条件的影响，因此条件经过适当调整以便能够显著降低血凝活性并保持将药物或基因导入细胞的能力。
举例说明，将化合物附着于负链RNA病毒时，化合物与病毒的量比(化合物量以摩尔数，病毒量以该蛋白的量来表示)可设定在1-10μmol/mg蛋白(化合物：病毒的比率)，更优选2-8μmol/mg蛋白、而且更优选3-8μmol/mg蛋白，例如约4μmol/mg。
为避免丧失将药物或基因导入细胞的能力，用于附着的化合物的分子量优选100000Da或更低、更优选80000Da或更低、更优选60000Da或更低、而且更优选50000Da或更低。特别是，分子量为40000Da或更低、更优选35000Da或更低、更优选30000Da或更低、更优选25000Da或更低、更优选20000Da或更低的化合物，优选用来保持该导入能力并特异性降低血凝活性。
如实施例28中所示，在修饰血凝蛋白时，通过用脂肪族多胺如聚乙烯亚胺(PEI)进一步修饰该蛋白，发现导入药物或基因的能力甚至更加增强了。“PEI”代表含有如下结构的化合物：
-(CH2CH2NH)n[化合物3]
其中n是2或更大的自然数。
例如，将PEI附着于负链RNA病毒的PEG-修饰衍生物上，能够显著增强其基因导入能力。在这种情况下，PEI对病毒的量比(化合物以重量，病毒量以该蛋白的量来表示)可设定为0.001比1(化合物/病毒比)，更优选0.01-0.2、而且更优选0.01-0.1。平均分子量为如25kDa-750kDa的PEI可优选使用，但不限于此。
此外，在本发明中发现，即使在由于化合物附着于血凝蛋白而导致药物或基因导入效力降低或丧失时，通过将具有细胞结合活性的化合物附着于包含该蛋白的复合物上，也能够继续保持导入效率。因此，在不限制将要附着于包膜蛋白的化合物分子量的情况下，也可制备本发明中的药物-载体组合物或基因-载体组合物。本发明提供药物-载体组合物或基因-载体组合物，其中包括含有具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜，其中：(a)一种化合物附着于该蛋白；(b)与没有该化合物附着的组合物相比，其血凝活性降低；(c)该组合物含有一个由该蛋白与含细胞结合活性的化合物一起形成的复合物；而且(d)该组合物具有将药物或基因导入靶细胞的能力。即使当一种化合物结合于包膜蛋白来抑制血凝活性和基因导入，通过再将配体掺入该化合物，仍有可能既抑制血凝活性同时仍保持基因导入能力。“配体”是一种结合于细胞表面受体的化合物，能够活化受体功能。例如，在使用抗体F(ab′)2片段(MW：约50kDa)时，通过缩减抗体片段的结合量，仍能够保持与残余血凝活性相应的该病毒载体的基因导入能力。然而，即使在血凝活性完全被抑制时，通过将该抗体与有细胞结合活性的配体(叶酸)结合，载体的基因导入能力可大幅度增强(见实施例)。
在有细胞结合活性的化合物和具血凝活性包膜蛋白之间形成复合物，是指该化合物和该蛋白彼此之间通过共价或非共价键直接或间接地(例如通过另一个化合物)结合。键既可以是共价也可以是非共价的。例如，组合物可包括含有具血凝活性的包膜蛋白和具细胞结合活性的化合物的细胞膜。有细胞结合活性的化合物必须暴露于该复合物的表面。例如，当该复合物是病毒粒子时，该蛋白和该化合物可存在于该病毒包膜表面。另外，当复合物是脂质体时，该蛋白和该化合物可存在于该脂质体的表面。为了将有细胞结合活性的化合物与复合物相结合，举例来说，该化合物可与该复合物中包括的所需包膜蛋白交联，或优选与具血凝活性的包膜蛋白交联。交联可通过使用所需的功能基团，以与上述相似的方法来形成。另外，如果化合物是蛋白质，它可以作为膜蛋白在包膜上表达，或作为与该复合物所含包膜蛋白的融合蛋白的形式表达。在一个优选的实施例中，有细胞结合活性的化合物，通过共价或非共价键直接与附着于具血凝活性的包膜蛋白的化合物结合。该有细胞结合活性的化合物也可以是附着于具血凝活性的包膜蛋白上的化合物。本发明涉及用于制备药物-载体组合物或基因-载体组合物的方法，其包括含有血凝活性降低了的负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜，其中的方法包括下列步骤：(a)将化合物与该蛋白相接触；和(b)将该蛋白和该化合物相结合；而且进一步(i)将有细胞结合活性的化合物附着于该化合物。步骤(i)可在步骤(a)之前进行，或与步骤(a)或步骤(b)同时进行，或在步骤(a)或步骤(b)之间进行，或在步骤(b)之后进行。步骤(i)优选在步骤(a)之前进行。另外，也可将预先经过步骤(i)处理的化合物附着于具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白。
任何优选的化合物可用作有细胞结合活性的化合物，只要它们能够与细胞表面结合，并因此能协助本发明中的组合物将药物或基因导入细胞。例如，结合于细胞表面蛋白或细胞表面糖链的化合物可用作为此类化合物。具体的例子有病毒包膜蛋白、天然或合成配体、激素或细胞粘附因子等。特别地，叶酸、转铁蛋白、促红细胞生成素、抗体、外源凝集素、半乳糖、甘露糖等也可使用。
它们之中，本发明的叶酸经证实在保持本发明中组合物所含复合物的药物或基因导入能力上是非常有效的。本发明提供了药物-载体组合物或基因-载体组合物，其中包括含有具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜，其中：(a)一种化合物附着于该蛋白；(b)与没有该化合物附着的组合物相比，其血凝活性降低；(c)该组合物含有由该蛋白与叶酸形成的复合物；而且(d)该组合物具有将药物或基因导入靶细胞的能力。特别地，叶酸优选直接与附着于该蛋白的化合物相结合。
当使用有细胞结合活性的化合物制备本发明中的组合物时，一种特别优选的待附着于具血凝活性包膜蛋白的化合物是与该蛋白结合的抗体。在一个优选的实施例中，本发明的组合物是含有与抗体或其片段相结合的具血凝活性包膜蛋白的组合物，其中包膜蛋白与有细胞结合活性的化合物形成复合物。也就是说，本发明涉及药物-载体组合物或基因-载体组合物，其中包括含有具血凝活性负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜，其中：(a)能与该蛋白结合的抗体或其片段结合于该蛋白；(b)与没有化合物附着的组合物相比，其血凝活性降低；(c)该组合物含有由该蛋白与有细胞结合活性的化合物形成的复合物；而且(d)该组合物具有将药物或基因导入靶细胞的能力。有细胞结合活性的化合物更优选直接与该抗体或其片段相结合。
本发明中，抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。它们还包括用本发明中蛋白对实验动物如家兔进行免疫所获得的抗血清、所有种类的多克隆抗体和单克隆抗体、而且还有人抗体、以及通过基因重组得到的人源化抗体。多克隆抗体的制备是通过，举例来说，制备具血凝活性的包膜蛋白或其部分肽段；然后用该蛋白或多肽作为抗原免疫家兔、山羊、绵羊等来制备的。具血凝活性的包膜蛋白的细胞外结构域或其片段可用作抗原多肽。为了用于免疫，抗原多肽可适当地与其它蛋白相结合，如载体蛋白如匙孔血蓝蛋白、白蛋白。单克隆抗体的制备可通过使用免疫后小鼠或大鼠的脾细胞，通过获得可制备单克隆抗体的杂交瘤来完成。抗体可通过本领域内已知的方法来制备(Harlow，E.and Lane，D.(eds.)，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Shepherd，P.and Dean，C.(eds.)，Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(Practical Approach Series，227)，Oxford Univ Press，1999)。多克隆抗体可以从血清中纯化，单克隆抗体可从杂交瘤培养上清液或用杂交瘤接种的动物的腹水中纯化，所述纯化可使用普通的生化技术如硫酸铵分级、蛋白G琼脂糖柱、有抗原固定其中的亲合柱等。本发明中，与具血凝活性包膜蛋白的外部区域(细胞外结构域)结合的抗体优选单克隆抗体，且可更优选使用实施例12中所述的HN-1(Miura等，Exp.Cell Res.，1982，141，409-420)。本发明中的抗体可以是抗体片段，只要它们可与具血凝活性的包膜蛋白(抗原蛋白)相结合，且包括例如，Fab、Fab(t)、Fab′、F(ab′)2、抗体可变区片段(Fv)、单链Fv(scFv)、或其修饰衍生物。Fab是复合物，由一条含有抗体H链可变区的多肽链和一条含有L链可变区的多肽链组成。这些多肽彼此结合形成抗原结合位点(单价的)。尽管Fab常规是通过用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而获得，在本发明中，含有与之等同结构的片段也称为Fab。具体地，Fab包括一个二聚体蛋白，其中免疫球蛋白L链和含有一个H链可变区(Vh)和CHl的多肽链结合在一起。Fab’(通过用胃蛋白酶消化免疫球蛋白然后裂解H链间的二硫键而获得)、Fab(t)(通过用胰蛋白酶消化免疫球蛋白获得)等也含有与Fab等同的结构。此外，F(ab′)2是指恒定区被删除的抗体，或含有与其等同结构的蛋白复合物，而且具体是指由两种复合物组成的蛋白复合物，其由一条含有抗体H链可变区的多肽链和一条含有L链可变区的多肽链组成。F(ab′)2是一个含有两个抗原结合位点的二价抗体。F(ab′)2常规是通过用胃蛋白酶在pH4左右消化抗体获得，并且含有H链铰链区。不过，F(ab′)2也可用其它蛋白酶消化、或用药物裂解，或人工设计。scFv是指一种多肽，其中抗体H链可变区和L链可变区包含在一条多肽链里。H链可变区和L链可变区经一个适当长度的间隔物连接，彼此结合以形成抗原结合位点。这种抗体片段可通过如“NewBiochemistry Experiments(Shin Seikagaku Jikken Kouza)12，Japanese Societyof Biochemistry，ed.Molecular Immunology III pp 185-195(Tokyo KagakuDojin)”和/或“Current Protocols in Immunology，Volume 1，(John Wiley & Sons，Inc.)”所述的方法制备。抗体片段可通过用蛋白水解酶如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、或胰蛋白酶消化抗体来获得。另外，抗体片段可通过鉴定可变区的氨基酸序列，然后以重组蛋白形式表达这些序列来制备。此外，抗体也可包括人源化抗体或人抗体。抗体可通过用蛋白A柱、蛋白G柱等亲合层析来纯化。
本发明中，特别优选将含有抗体可变区(抗原结合区)的片段附着于具血凝活性的包膜蛋白上。任何含有抗体H链和/或L链可变区的优选片段都可用作这种片段，包括如Fab、Fab(t)、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv或它们的修饰衍生物。
本发明中，将要转入细胞的药物可以是任何优选的化合物，如天然存在的化合物、合成化合物、无机或有机化合物、以及小分子或大分子化合物。此外，通过本发明中组合物递送的基因可以是任何优选的核酸，具体例子为诸如DNA或RNA的核酸，以及它们的衍生物。核酸可以是环状和线状的单链或双链的脱氧核糖核酸或核糖核酸。核酸衍生物的实例有硫代磷酸酯(phosphothioate)和二硫代磷酸酯(phosphodithioate)。本发明中组合物递送的特殊药物或基因的具体实例有：反义核酸(Drug Delivery System，10，91-97，1995)、诱杀物(decoy)(Journal of Biological Chemistry，267，12403-12406，1994)、核酶(Drug Delivery System，10，91-97，1995)、三链DNA(Saibokogaku，vol.13，No.4，277-285，1994)、质粒DNA(MethodsEnzymology，221，317-327，1993)、RNA载体；以及这些物质和载体的复合物(Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America，89，7934-7938，1992)或与蛋白的复合物(Journal of Biological Chemistry，266(6)，3361-3364，1991)；以及抗癌药物、抗病毒药物、毒素(diphtheria toxin(Biochim Biophys Acta，1192，253-262，1994/赖氨酸(Biochim Biophys Acta，1070，246-252，1991))、酶(Immunology，81，280-284，1994)、和其它优选生物活性物质。也可将优选基因插入基因组核酸中并由重组病毒表达。
本发明中的组合物可用于活体直接给药(体内)或间接给药(离体)，而且可以活体体外(体外)给药细胞。在体内应用时，组合物可通任何优选的给药途径给药，只要药物或基因可到达靶细胞或组织。根据有效成分的特性，给药可通过如口服、经皮、鼻内、支气管、肌肉内、腹膜内、静脉内、关节内或皮下来完成，但不限于此。而且，该组合物可以系统地或局部地给药。在体外(包括离体)给药时，本发明组合物以便于与靶细胞接触的方式添加，例如它们可加入细胞培养基中。特别是因为本发明组合物在血液中非常稳定，它们可作为注射剂给药到血液内如静脉内注射。
通过本发明的方法制备的，包括含有具血凝活性负链RNA病毒包膜蛋白的细胞膜的复合物，可以根据需要与优选的并且可药用的载体或运输工具(vehicles)相结合。“可药用的载体或运输工具”是指可与该复合物一起给药的物质，并且其不会明显抑制通过该复合物将药物或基因导入细胞。该载体或运输工具可通过适当地与如无菌水、生理盐水、培养液、血清、以及磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)混合来配制。当负链RNA病毒载体如在鸡蛋中增殖时，该组合物可含有尿囊液。此外，本发明中组合物可含有载体或运输工具如去离子水和5％葡聚糖水溶液；脂质体膜稳定剂(例如固醇类如胆固醇)；抗氧化剂(如生育酚和维生素E)；还有植物油、悬浮试剂、表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。此外，防腐剂和其它添加剂可添入其中。本发明组合物可以是例如水溶液、胶囊、悬液、或糖浆等形式。也可以是溶液、冻干制剂或气溶胶。在冻干制剂时，本发明中组合物可包括山梨糖醇、蔗糖、氨基酸、各种蛋白质等作为稳定剂。含有负链RNA病毒载体的组合物易于用作试剂和药物。
本领域内技术熟练技术人员可恰当地决定本发明中组合物的剂量，其根据疾病、病人体重、年龄、性别、症状、给药目的、组合物剂型、给药方法、要导入的药物或基因类型等而不同。该组合物包含感染性负链RNA病毒时，优选由可药用的载体给药，优选给药剂量在约105 CIU/ml-约1011CIU/ml范围之间，更优选在约107CIU/ml-约109CIU/ml之间，并且最优选在约1×108CIU/ml-约5×108CIU/ml之间。在给药人时，单一剂量优选在2×109CIU-2×1010CIU范围内，且可在临床上可接受的副作用范围内一次或多次给药。对每日给药次数也如此。对于非人动物，根据靶动物和人类之间的体重比或给药靶位点的体积比(例如平均值)，可从上述剂量中计算出其给药量。
将用本发明中组合物给药的动物没有特别的限制，可以是鸟类、哺乳动物、以及其它脊椎动物、例如鸡、鹌鹑、小鼠、大鼠、狗、猪、猫、牛、兔、绵羊、山羊、猴、和人。当本发明中的方法用于体外(包括离体)时，举例来说可以使用如人类、非人哺乳动物以及鸟。当本发明中的方法用于体内时，尤其可以使用非人哺乳动物和鸟类。
此外，本发明涉及可与具血凝活性的负链RNA病毒包膜蛋白结合的抗体或其片段，其中结合于细胞的化合物连接在该抗体或其片段上。这种抗体或其片段，通过添加于负链RNA病毒或其加工产物来结合包膜蛋白，并因此降低其血凝活性，同时通过细胞结合化合物来维持帮助病毒吸附于细胞的功能。因此，这样一种抗体或其片段在制备本发明中药物-载体组合物或基因-载体组合物中非常有用。如前说述，该抗体或其片段可以是任何含有抗体L链和/或H链可变区的优选片段。更明确地，例如Fab、Fab(t)、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv等。其中，F(ab′)2是特别优选使用的。至于细胞结合化合物，细胞表面受体的配体是特别优选的，诸如叶酸、转铁蛋白、促红细胞生成素、抗体、凝集素、半乳糖、甘露糖等。
本发明中的抗体或其片段，可与可药用的载体一起形成一个组合物。这类载体包括，举例说如水、乙醇、甘油、盐、蛋白、以及明胶、以及pH缓冲试剂、稳定剂、混悬剂、和本领域内所知的防腐剂。
此外，本发明涉及试剂盒，其包括：(a)与具血凝活性负链RNA病毒包膜蛋白结合的抗体或其片段，其中有一种化合物结合在该抗体或其片段上；和(b)药物-载体组合物或基因-载体组合物，其包括含有该包膜蛋白的细胞膜。药物-载体组合物或基因-载体组合物的实施例包括含有所述包膜蛋白的细胞膜，包括感染性病毒粒子、灭活病毒、或含有病毒包膜的脂质体。感染性病毒粒子可以是，例如负链RNA病毒或其它含有负链RNA病毒的具血凝活性包膜蛋白的病毒。血凝活性降低了的药物-载体组合物或基因-载体组合物可通过如下步骤来制备，将上述抗体或其片段加入这些病毒中，使这些抗体或其片段结合在包膜蛋白上。例如，血凝活性可以根据目的适当进行控制，以便增强其在血液中的稳定性以便进行体内给药。这些组合物可方便地通过在使用前混合试剂盒成分来制备，从而产生一种非常易于使用的递药系统。
附图简述
图1是一个示例图，显示用TPEG-和SPA-PEG修饰试剂对SeV载体的包膜蛋白(HN和F蛋白)进行PEG-修饰。
图2是测定SeV载体和TPEG-修饰的SeV载体对大鼠血液的溶血活性的结果(37℃15分钟)曲线。
图3是一个柱图，显示SeV载体和TPEG-修饰的SeV载体在大鼠血液中稳定性的测定结果。在37℃分别处理1、15和30分钟后，分离血浆并用其感染HeLa细胞。24小时后，定量测定LacZ基因的表达水平。结果显示为三次测定的平均值±标准偏差。
图4是照片，显示SeV载体和TPEG-修饰的SeV载体经SDS电泳，然后进行银染的结果。箭头指示HN蛋白和F蛋白的电泳位置。0泳道对应于SeV载体，而8-10泳道分别对应于表2中的8-10号样品。
图5是一系列照片，显示在兔抗SeV抗血清(稀释10-、100-和1000-倍的血清)存在下，将SeV载体和SPA-PEG5K-修饰的SeV载体导入LLCMK2细胞后，利用X-gal染色法评估LacZ表达水平的结果。
图6是示例图，说明了用叶酸-结合的抗HN单克隆抗体对SeV载体中所含HN蛋白的选择性修饰。
图7是图解，表示了通过用HN-1、HN-1/F(ab′)2、或用NHS法制备的叶酸结合的抗体所修饰的SeV载体的HAU。x-轴代表抗体浓度，而y-轴代表血凝活性的对数(log2(HAU))。
图8是柱图，表示SeV载体、HN-1-修饰的SeV载体、以及叶酸-结合的HN-1-修饰的SeV载体对鸡红细胞的溶血活性。所得结果对应的SeV载体浓度为1×107、1×108和1×109pfu/ml。修饰载体即用100μg/ml抗体修饰1×109pfu/ml的每种SeV载体。图中y-轴是在570nm的吸收值，显示测量的游离血红蛋白量。
图9是柱图，表示在用SeV载体、HN-1-修饰的SeV载体和叶酸-结合的HN-1-修饰的SeV载体感染KB细胞两天后LacZ基因的表达。在感染试验中，过量叶酸存在条件是通过在培养基中添加1mM的叶酸来创造的。结果表示为三次测定的平均值±标准偏差。
图10是柱图，表示在用经HN-1、HN-1/F(ab′)2或其叶酸结合衍生物修饰的SeV载体感染KB细胞两天后LacZ基因的表达。结果表示为三次测定的平均值±标准偏差。
图11是图示了用HN-1或通过EDC法制备的叶酸结合的HN-1修饰的SeV载体，在不同量抗体存在下的HAU变化。x-轴代表抗体浓度，而y-轴代表红细胞聚集活性的对数(log2(HAU))。
图12是图示了PEG-修饰的SeV的滴度变化。SeV用不同量的PEG修饰，并且对修饰后SeV载体的相对感染效率(％)进行了检测。
图13是图示了PEG-修饰SeV的HA活性的变化。SeV用不同量PEG修饰，并对修饰后SeV载体的HA活性进行了检测。
图14是柱图，显示了PEG-修饰SeV的感染力和HA活性之间的相关性，说明与HA活性相比，PEG-修饰可相对提高感染力。
图15是一系列照片，显示用银染法分析PEG-修饰SeV组成型蛋白的结果。随着参与反应PEG量的增加，来自包膜蛋白F和HN蛋白的条带减少，并且在大分子级分中有其它条带出现。
图16是一系列照片，显示通过Western印迹分析PEG-修饰SeV组成型蛋白的结果。
图17出示一系列柱图和照片，显示PEG-修饰SeV对中和抗体的抗性。抗性是在修饰的SeV总病毒粒子数(总蛋白量)固定的条件下进行比较的。
图18说明对PEG10K-修饰SeV的体内评价，显示了修饰SeV的给药方案和给药条件，以及在抗SeV抗体滴度的变化。
图19是一系列照片，表示了对PEG10K-修饰SeV的体内评价，显示了将图18中修饰SeV的体内给药后，导入的基因在肺部的表达。
图20是一系列柱图，显示在4℃贮存条件下PEG-修饰SeV感染力的维持效果。
图21是柱图，显示聚乙烯亚胺(PEI750K)的修饰作用。PEI提高了PEG-修饰SeV的感染力。
实施例
下文中，本发明将使用实施例来详细描述，但不局限于这些实施例。此处引用的文献的全部内容作为其一部分并入文中。
[实施例1]含NLS-LacZ基因SeV载体的制备和纯化
载有含一个核定位信号的LacZ基因的NLS-LacZ/SeV是通过以前公开的方法(Kato等，Genes Cells，1996，1，569-579；Hasan等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820)制备的。此载体接种于含10日龄胚的鸡蛋中。在35.3℃温育三天以后，收获尿囊液，然后以4,000rpm离心15分钟。所得上清液接着在10,000rpm离心一小时以沉淀该载体。在PBS中重悬后，将该载体在蔗糖密度梯度(30％/50％)上分层，然后在25,000rpm离心一小时(在Beckmanrotor SW28中)。回收在蔗糖交界面的载体，离心、沉淀，然后在PBS中重悬浮从而制备纯化载体(这以后描述为SeV载体)的贮存溶液。该载体的蛋白浓度通过BCA蛋白测定法(Pierce)测定，将溶解后的载体与等体积2％SDS溶液混合作为样品，用BSA作为标准。血凝单位(HAU)按照下面描述来测定。在96-孔圆底板(Asahi Technoglass)中，将该载体用PBS连续稀释两倍(50μl每孔)。每孔加入50μl用PBS洗过的1％鸡红细胞溶液，4℃温育一小时，然后测定。HAU表示为引起血凝的最大载体稀释比率。此外，利用下述公式可计算噬斑形成单位(pfu)：1HAU的SeV＝约106pfu/ml。对于纯化的载体来说，该公式如下：1mg蛋白/ml＝4096-5120HAU/ml＝约5×109pfu/ml。
[实施例2]TPEG-修饰的SeV载体的制备
实施例1中的SeV载体贮存溶液在PBS中稀释至2mg蛋白/ml。在0.5ml此溶液中加入0.5ml0.5M的硼酸缓冲液(pH8.5)以制备出pH8.5的1mg蛋白/ml的溶液。在搅拌的同时以小量将1mg Tresyl-活化的PEG试剂(TPEG，MW：5000)(Shearwater Polymers)加入上述溶液中，在室温下反应90分钟(图1)。反应完后，反应混合物用冰冷的PBS(14ml)稀释，然后通过在15,000rpm离心一小时回收载体(在Beckman rotor SW28.1中)。载体重悬于PBS(0.8ml)中，并获得TPEG-修饰的SeV载体。该修饰载体的蛋白浓度及HAU如实施例1中测定。
[实施例3]利用TPEG-修饰的SeV载体进行体外基因表达
实施例1中的SeV载体贮存溶液在PBS中稀释至1×105pfu/ml。实施例2中TPEG-修饰SeV载体溶液和非修饰SeV载体溶液的蛋白浓度都是经过标准化的，因此两种载体提供等数目的病毒粒子。实验前一天，将HeLa细胞(来自人子宫颈癌)以5×104细胞/孔培养(以1ml/孔添加含有10％灭活胎牛血清(FCS)的MEM培养基)于12孔板(Sumitomo Bakelite)上。将培养基减至0.5ml后，每孔中加入50μl上述稀释载体溶液(当转换成SeV载体以后，等同于5×103pfu/孔，moi＝0.1)，在5％CO2存在时37℃下进行感染。一小时后，去掉载体，细胞用培养基洗涤两遍。将新鲜培养基(2ml)加入细胞，然后在5％CO2存在时37℃下进一步温育24小时。通过使用Galacto-LightPlusTM(Tropix)方法测量LacZ基因的表达，而细胞蛋白用BCA法(Pierce)来测定。结果表示为光单位(RLU/μg蛋白)。
表1显示TPEG-SeV载体的HAU以及该载体的基因表达水平。对于同样的蛋白浓度，也就是同样的病毒粒子数，TPEG-SeV载体的HAU是SeV载体的HAU的1/2000或更少。与此同时，对于同样病毒粒子数，TPEG-SeV载体在HeLa细胞中保持约50％的基因表达水平。因此，现在已有可能制备一种载体，其中仅HAU显著降低，而其将基因导入细胞的能力却没有严重损害。
表1
蛋白浓度(mg/ml) HAU/mg LacZ表达水平(RLU/μg细胞蛋白)
SeV载体0.93     5120 2335604±72774
TPEG-修饰的0.99SeV载体 2 1046353±29841
[实施例4]溶血活性测定
实验中使用新鲜血液，使用肝素化注射器采集自处于乙醚麻醉下的SD品系大鼠颈静脉。实施例1中的SeV载体和实施例2中的TPEG-修饰的SeV载体在PBS中稀释，制备一系列含1-1000μg蛋白/ml的溶液。载体稀释溶液(50μl)和在37℃下保温的大鼠血液(50μl)混合后放置15分钟。在4℃冷却后，血浆通过离心分离。通过570nm(OD570)吸收值测量释放入血浆的血色素量。利用PBS代替载体溶液用作阴性对照。用蒸馏水作为阳性对照(100％溶血)。载体的溶血活性利用下式计算：
溶血活性(％)＝[(载体溶液的OD570)-(PBS的OD570)]/[(蒸馏水的OD570)-(PBS的OD570)]×100。
如图2所示，SeV载体显示了强的浓度依赖溶血活性。而另一方面，发现TPEG-修饰的SeV载体溶血活性非常地低。1000μg的TPEG-修饰SeV载体具有的溶血活性相当于5μg SeV载体的，说明经TPEG-修饰载体安全性提高了约200倍。
[实施例5]大鼠血液中稳定性试验
实施例1中的SeV载体用PBS稀释至1×108pfu/ml。实施例2中的TPEG-修饰SeV载体用PBS稀释使得其病毒蛋白浓度与SeV载体的浓度相等。250μl稀释载体溶液和250μl新鲜SD大鼠(雄性)血液混合，并在37℃温育。在预定时间过后，收集80μl血液样品，在4℃离心收集血浆。使用50μl将10μl血浆在PBS稀释50倍制备的溶液，通过实施例3中的方法测定LacZ基因在HeLa细胞中的表达。
如图3所示，SeV载体经血液处理后立即显示稳定性的显著降低，而且15分钟的血液处理将其基因表达能力降低至未经处理SeV载体的1/1000。另一方面，TPEG-修饰的SeV载体在血液中的稳定性提高了，与未修饰的载体相比其显示了非常高的表达能力。
[实施例6]SPA-PEG2K-修饰SeV载体的制备
实施例1中的SeV载体贮存溶液用PBS稀释，调整浓度至2mg蛋白/ml。该溶液用0.5M硼酸缓冲液(pH8.5)稀释两倍，以制备出1mg/ml蛋白溶液。在搅拌下将琥珀酰亚胺基丙酸衍生物PEG试剂(分子量2000)(SPA-PEG2K，Shearwater Polymers)(1、2或4mg)以小量加入上述溶液中，在室温反应30分钟(图1)。反应完后，反应混合物用冰冷的PBS(14ml)稀释，然后在13000rpm离心一小时(在Beckman rotor SW28.1中)。回收的载体接着重悬于0.8ml PBS中，以获得SPA-PEG2K-修饰的SeV载体(表2，样品号1-3)。修饰载体的蛋白浓度按照实施例1来测定。
表2
样品名称     样品号   PEG的反应量 HAU/mg蛋 LacZ基因表达率(％)
    (mg)     白
SeV载体(实施例1)     -     4096     100.0±7.5
SPA-PEG2K修饰的(实施例6)     123     124     1024512＜1     29.1±2.64.7±0.20.5±0.01
SPA-PEG5K修饰的(实施例7)     4567     12.5510     20482048512＜1     115.4±14.293.1±4.242.7±4.91.6±0.1
SPA-PEG20K修饰的(实施例8)     8910     102040     10244＜1     95.3±9.748.3±1.50.2±0.02
[实施例7]SPA-PEG5K-修饰SeV载体的制备
实施例6中的SPA-PEG2K用SPA-PEG5K(MW：5000)(ShearwaterPolymers)代替。使用1、2.5、5或10mg的PEG反应量，进行同样的反应和纯化来获得SPA-PEG5K-修饰的SeV(表2，样品号4-7)。
[实施例8]SPA-PEG20K-修饰SeV载体的制备
实施例6中的SPA-PEG2K用SPA-PEG20K(MW：20000)(ShearwaterPolymers)代替。使用10、20或40mg的PEG反应量，进行同样的反应和纯化来获得SPA-PEG20K-修饰的SeV(表2，样品号8-10)。
图4显示SPA-PEG20K-修饰的SeV载体经SDS电泳，然后对每一个组成型蛋白进行银染的结果。随着参与反应PEG量的增加，来自HN蛋白的条带减少，并且同时在较高分子量级分有条带出现。这些条带认为来自聚合的PEG-结合的HN蛋白。另一方面，F蛋白带发现有有少量减少。这些结果显示在HN和F这两个蛋白中，HN蛋白是在SeV外膜的PEG修饰中主要被修饰的。
[实施例9]SPA-PEG-修饰SeV载体的HAU以及该载体在体外的基因表达
实施例1中SeV载体以及实施例6、7和8(样品号1-10)中PEG-修饰的SeV载体的HAU活性，通过使用实施例1所述方法来测量。此外，在HeLa细胞中的LacZ基因表达通过使用实施例3中所述方法来测定，但MOI变为0.5，温育天数变为两天除外。
表2显示HAU和LacZ表达结果。随着PEG的反应量增加，所得修饰SeV载体的HAU降低。尽管PEG-修饰SeV载体的LacZ基因表达与SeV载体相比减少了，但通过如表2所示限制PEG的反应量，在抑制基因表达能力降低的同时，HAU可大幅度降低。因此，通过选择修饰条件，发现可获得具有足够基因表达能力的修饰载体。
[实施例10]SPA-PEG-修饰SeV载体在红细胞存在下的体外基因表达
HeLa细胞如实施例3中制备。在马上开始实验前去掉培养基，取而代之加入300μl经PBS洗过、调整为1×109细胞/ml的鸡红细胞。在对照组中，PBS用来代替红细胞溶液。将实施例1中的SeV载体或表2中的PEG-修饰SeV载体(样品号1、  2、4、5、6、8和9)以各50μl加入孔中，在37℃短时间感染细胞5分钟。加入的载体量根据表2调整，使得表达效率相同。按照实施例3的方法，细胞处理48小时后测定LacZ基因表达水平。
表3显示在红细胞存在下每种样品的基因表达水平。结果表示为相对比率(以没有红细胞存在的表达水平作100)。对于SeV载体，红细胞的存在将基因表达水平降低至对照组的约20％。另一方面，在PEG-修饰样品中，伴随着载体与红细胞相互作用的减少HAU降低，说明即使在红细胞存在下也有高的基因导入效率。这些结果说明，在临床方案中，PEG-修饰的SeV载体可以允许通过血液介导的快速基因导入。
表3
样品名称 样品号   红细胞存在时的LacZ基因表达率(％)
SeV载体(实施例1) 22.5±4.2
SPA-PEG2K修饰的(实施例6)  12   47.6±2.049.2±13.8
SPA-PEG5K修饰的(实施例7)  45   34.4±3.446.7±4.0
 6   53.9±4.8
SPA-PEG20K修饰的(实施例8)  89   46.1±9.749.6±6.1
[实施例11]在中和抗体存在下通过SPA-PEG5K-修饰SeV载体进行基因导入
(1)SPA-PEG5K-修饰的SeV载体的制备
NLS-LacZ/SeV载体如实施例1来制备和纯化，从而制备出其贮存溶液。利用实施例7的方法，该载体与5mg SPA-PEG5K反应，然后制备得到SPA-PEG5K-修饰的SeV载体。该载体对LLCMK2细胞的滴度按下面所述方法测定。在试验前一天，将LLCMK2细胞以1×106细胞/孔(在2ml/孔补加有10％FCS的MEM培养基中)铺于6孔板(Sumitomo Bakelite)上。载体在含1％FCS的PBS中稀释至浓度为1mg蛋白/ml，然后进一步制备分别稀释10倍的连续稀释系列溶液。去掉上述细胞的培养基后，每孔中加入1ml稀释载体溶液，在5％CO2存在时37℃下进行感染一小时。去掉载体溶液后，细胞用培养基洗涤，以2ml/孔加入新鲜培养基。在5％CO2存在、37℃下进一步温育。两天后去掉培养基，用PBS洗涤后，表达LacZ基因的细胞用β-Gal染色试剂盒进行X-gal染色。计数一个孔的任何十个随机点的200×放大视野内的感染细胞数目。根据平均细胞数和该视野的面积，利用下述公式可计算出该孔中总的滴度：
LacZ感染滴度(CIU/ml)＝(感染细胞数)×854.865×(稀释比例)
结果，SeV载体和SPA-PEG5K-修饰的SeV载体的滴度分别为1.4×1010CIU/ml和2.7×109 CIU/ml。
(2)在中和抗体存在下的基因导入
用PBS稀释实施例11-(1)中的SeV载体和SPA-PEG5K-修饰的SeV载体，调整滴度至1×107CIU/ml。通过用SeV免疫兔子制备所得的抗SeV抗血清(在56℃处理一小时)经10-、100-和1000-倍稀释后的溶液或PBS(每个取30μl)加入30μl载体溶液中，并在室温温育一小时。在试验前一天，将LLCMK2细胞以2×105细胞/孔(以1ml/孔添加含有10％FCS的MEM培养基)铺于12孔板(Sumitomo Bakelite)上。培养基减少至0.5ml，每孔加入40μl上述抗血清处理的载体溶液，在存在5％CO2下，在37℃温育一小时以感染细胞。两天后，如实施例11-(1)用X-gal染色评估LacZ基因表达。
如图5所示，在抗血清存在下SeV载体的基因导入效率显著降低。另一方面，SPA-PEG5K-修饰SeV载体即使在该抗血清存在下也可保持足够的基因导入能力。
[实施例12]抗-HN单克隆抗体，即HN-1的制备和纯化
生产抗-HN单克隆抗体，即HN-1(Miura等，Exp.Cell Res.，1982，141，409-420)的杂交瘤细胞，在杂交瘤-SFM培养基(Gibco-BRL)中，5％CO2存在下于37℃连续传代，并制备得到1000ml含2×105细胞/ml的细胞悬浮液。培养再持续两个星期，然后通过在3000rpm离心10分钟获得上清液。该上清液随后经0.45μm的滤膜过滤。单克隆抗体用蛋白G柱层析纯化。利用蠕动泵(peristaltic pump)以4.2ml/min的流速，将培养液上清通过经20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡过的5ml蛋白G柱(Pharmacia)，且所述抗体结合在柱上。用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗柱后，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.7)将抗体洗脱。洗脱液用1M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)中和，然后通过超滤(Centriplus-20，分子量截流30,000：Amicon)浓缩。使用经PBS平衡好的PD-10脱盐柱(Pharmacia)，用PBS交换缓冲液后，对该溶液再次进行超滤浓缩，然后得到160μl的HN-1 PBS溶液。以牛血清γ-球蛋白为标准，蛋白浓度通过BCA蛋白分析法(Pierce)测定，结果为37.6mg/ml。
[实施例13]抗-HN单克隆抗体HN-1的F(ab′)2片段
实施例12中纯化的单克隆抗体HN-1以0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释，调整浓度为2mg蛋白/ml。将2.35ml在0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.5)中调整浓度为0.1mg/ml的胃蛋白酶溶液(Sigma)加入2.35ml该蛋白溶液中，然后在37℃反应21小时。用700μl 1N氢氧化钠溶液中和该反应混合物后，将PBS加入该溶液以调整总体积至25ml。该溶液上样至用PBS平衡过的1ml蛋白A柱(Pharmacia)，没有参加反应的抗体吸附于柱上。通过柱子的级分回收后按照实施例12经超滤浓缩。浓缩后的溶液使用PBS平衡过的Sephadex 75柱(Pharmacia)，通过凝胶过滤法来进一步纯化。纯化溶液通过超滤浓缩，以回收HN-1的F(ab′)2片段(下文中缩写为HN-1/F(ab′)2)的PBS溶液(300μl)。蛋白浓度按实施例12测定，所得HN-1/F(ab′)2测定为4.08mg/ml。
[实施例14]通过NHS法制备叶酸-结合的单克隆抗体
(1)合成NHS-活化的叶酸
合成通过Robert等的方法来完成(Journal of Biological Chemistry：Feb.4，269(5)，3198-3204，1994)。具体地，叶酸(Sigma)溶于二甲基亚砜(DMSO)，制备成50mg/ml的溶液。在此溶液中依次加入250μl三乙胺(Pierce)、470mg二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide)(Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.)以及260mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Sigma)。所得混合物在暗处室温搅拌过夜。沉淀的副产物经过滤除去，然后在搅拌下将滤液滴加入250ml二乙醚。黄色沉淀用醚重复清洗，然后减压干燥以获得NHS-活化的叶酸。
(2)制备叶酸结合的HN-1
100μl含2.0mg/ml经实施例12方法纯化的HN-1溶液的PBS溶液，和100μl 0.5M的硼酸缓冲液(pH8.0)混合，然后用作反应溶液。将2.5μl实施例14-(1)中含NHS-活化的叶酸(5mg或10mg/ml)的DMSO溶液，一滴滴地加入该反应溶液中。然后在暗处室温反应一小时。未反应的叶酸用经PBS平衡的PD-10柱除去。回收蛋白级分，通过超滤浓缩以获得叶酸结合的HN-1，接着根据实施例12测定蛋白浓度。
(3)叶酸结合的HN-1/F(ab′)2的制备
用HN-1/F(ab′)2溶液代替HN-1，并使NHS-活化的叶酸浓度改变为10mg/ml，接下来的反应和纯化按照实施例14-(2)来进行，以获得叶酸结合的HN-1/F(ab′)2。
[实施例15]叶酸结合的单克隆抗体修饰的SeV载体的HA活性
实施例1的NLS-LacZ/SeV用PBS稀释至1×108pfu/ml，然后以50μl每孔分配入一个96孔圆底板中。通过实施例12的方法纯化的HN-1；实施例13中的HN-1/F(ab′)2；以及实施例14中的叶酸结合的HN-1和叶酸结合的HN-1/F(ab′)2用PBS稀释，调整其浓度至1-100μg蛋白/ml。50μl稀释后的抗体溶液分别与这些载体混合，并且于室温下放置30分钟以制备经修饰的载体(Fig.6)。然后用实施例1中的方法测定HAU。
图7显示了HAU测定的结果。所有经修饰的SeV载体，其HAU随着所加抗体量的增加而降低，当抗体浓度为10μg蛋白/ml或更高时变成无法检测。另外，叶酸结合并没有导致极度的HAU活性的下降.从这些结果中看到，有可能制备以叶酸结合的抗体修饰的SeV载体，该载体与红细胞的相互作用显著降低。
[实施例16]以叶酸结合的单克隆抗体修饰的SeV载体的溶血活性
实施例1的NLS-LacZ/SeV用PBS稀释至1×109pfu/ml，然后以50μl每孔分配入96孔圆底板中。通过实施例12的方法纯化的HN-1以及实施例14中叶酸结合的HN-1，用PBS稀释至浓度为100μg蛋白/ml。抗体稀释液或PBS(各50μl)与载体混合，并于室温放置30分钟以制备经修饰的载体。除了将实施例4的方法中的大鼠血用1×109细胞/ml的鸡血代替，并将温育时间变为30分钟外，溶血活性按前述方法检测。
图8显示溶血活性测量结果。用HN-1和叶酸结合的HN-1修饰的SeV载体的溶血活性非常低，而且当与SeV载体比较时，上述载体的溶血活性甚至比浓度为其1/100的SeV载体的溶血活性都低。
[实施例17]叶酸结合的单克隆抗体修饰的SeV载体的体外基因导入试验
通过改变实施例15中SeV载体的滴度至1×107pfu/ml，抗体浓度至10μg/ml，制备修饰的载体。试验前一天，将KB细胞(来自人鼻咽癌)以2×105细胞/孔(添加含有10％FCS的无叶酸RPMI1640培养基：Gibco-BRL，1ml/孔)铺板于12孔板。试验前一小时，培养基用0.5ml无叶酸RPMI1640培养基或补加有1mM叶酸的同样培养基替换。每孔中加入20μl上述载体，在5％CO2存在时在37℃感染细胞。三小时后，去掉载体，细胞用培养基洗两遍，将每孔加入2ml新鲜培养基。然后在5％CO2存在下、在37℃温育48小时。LacZ基因的表达按照实施例3中方法测量。
图9显示LacZ基因在KB细胞中表达的结果。HN-1修饰的SeV载体的基因表达是未修饰SeV载体的1/100或更少，说明随着HAU的减少基因导入也减少。另一方面，与没有叶酸结合的HN-1相比，观察到叶酸结合的HN-1的基因表达显著增加，显示约为未修饰SeV载体基因导入的15％。当过量叶酸存在于培养基中时，观察到使用叶酸结合的HN-1的基因导入被抑制。这表明通过叶酸结合的HN-1的基因导入的发生，是由于作为配体结合于HN-1的叶酸与KB细胞的叶酸受体结合，接着由F蛋白介导融合而引起的。
当抗体分子是HN-1/F(ab′)2时进行的比较如图10所示。只有当叶酸结合于该抗体时，才能在HN-1/F(ab′)2和HN-1中都观察到高水平的基因导入。
[实施例18]通过EDC法制备叶酸结合的HN-1以及对该修饰抗体的评估
(1)通过EDC法制备叶酸结合的HN-1
制备是通过Leamon等(Journal of Biological Chemistry，1992，267(35)，24966-24971)报道的方法。也就是，将二甲基亚砜(DMSO)中浓度为21.7mg/ml的1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC:Sigma)(1ml)，加至DMSO中浓度为10mg/ml的叶酸(Sigma)(1ml)中。混合物于暗处室温静止30分钟。在搅拌下，将叶酸-EDC溶液(16.6μl)一滴滴地加入实施例12的HN-1溶液(300μl，用PBS调整浓度为1mg蛋白/ml)中。所得混合物在暗处室温反应一小时，于是获得了如实施例14-(2)的叶酸结合的HN-1。
(2)叶酸结合HN-1修饰的SeV载体的HA活性
通过用实施例18-(1)的叶酸结合的HN-1代替实施例15的叶酸结合的HN-1，制备修饰的载体并测定了HAU。
如图11所示，通过EDC法制备的叶酸结合的HN-1也可有效地用于通过修饰SeV载体消除HAU。
(3)叶酸结合的HN-1修饰的SeV载体的基因表达
修饰载体利用实施例1的SeV载体溶液(1×107pfu/ml)，以及实施例12的HN-1和实施例18-(1)的叶酸结合HN-1(两个都是100μg/ml)来制备。除实施例16的KB细胞外还使用A549细胞(人肺癌)，同样地进行感染试验。
表4比较KB细胞中的基因表达，其中叶酸受体以高水平表达，而在A549细胞中几乎无此受体(Wang等，Bioconjugate Chemistry.1997，8，673-679)。叶酸结合HN-1修饰的SeV载体在KB细胞中表现出高水平基因导入，但仅是在没有过量叶酸存在时。这说明取代了HN蛋白血凝活性的叶酸配体通过与叶酸受体结合而介导特定基因导入。
表4
LacZ基因表达的相对比例(有过量叶酸(-)的SeV载体为100％)
过量叶酸   KB细胞  A549细胞
SeV载体 -   100.0±10.9  100.0±6.6
+   107.7±12.3  142.1±13.3
HN-1-修饰的SeV载体 -   0.5±0.1  0.8±0.1
叶酸结合的HN-1修饰的SeV载体 -   14.8±1.3  3.2±0.7
+   2.4±0.1  2.4±0.6
[实施例19]携带GFP的SeV载体的制备和纯化
携带GFP基因的SeV/GFP是通过已知方法制备的(Kato等，Genes Cells，1996，1，569-579；Hasan等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820)。此载体接种于含10日龄胚的鸡蛋中。在35.3℃温育三天后，收获尿囊液，然后在4℃以3000rpm离心30分钟。所得上清液在4℃、35000xg离心一小时以沉淀该载体。载体在PBS中重悬，然后在4℃以3000rpm再离心30分钟，然后上清液在4℃、35000xg离心一小时以沉淀该载体。载体重悬于PBS以制备纯化载体的贮存溶液(下文中指为SeV载体)。该载体的蛋白浓度通过BCA蛋白测定法(Pierce)测定，将溶于等体积3％Triton X-100溶液的载体作为样品，用BSA作为标准品。纯化载体的浓度约为1mg蛋白/ml。
[实施例20]SPA-PEG2K-修饰的SeV载体的制备
硼酸盐缓冲液(pH8.5)(0.5ml)加入实施例19的SeV载体贮存溶液中(0.5ml)，以制备出0.5mg蛋白/ml(pH8.5)的溶液。在搅拌下将0、2、4、6、8和10mg PEG丙酸试剂(MW：2000)(SPA-PEG2K，Shearwater Polymers)的琥珀酰亚胺基衍生物，以小量加入上述溶液。然后该溶液在室温下反应一小时。反应完后，反应溶液在4℃以15000rpm离心一小时。获得沉淀用冰冷的PBS悬浮，然后在4℃以15000rpm再离心一小时以回收载体，然后重悬于PBS(0.5ml)，以获得SPA-PEG2K-修饰的SeV载体。此修饰载体的蛋白浓度按照实施例19来测定。
[实施例21]SPA-PEG5K-修饰的SeV载体的制备
用SPA-PEG5K(MW：5000)(Shearwater Polymers)代替实施例20的SPA-PEG2K后，并使用0、5、10、15、20和25mg的PEG反应量，按照实施例20中的方法制备和纯化SPA-PEG5K-修饰的SeV。此载体的蛋白浓度按实施例19来测定。
[实施例22]PEG2NHS-10K-修饰的SeV载体的制备
用PEG2NHS-10K(MW：10000)(两个分枝(two-branched)；ShearwaterPolymers)代替实施例20的SPA-PEG2K后，并使用0、10、20、30、40和50mg的PEG反应量，按照实施例20中的方法制备和纯化PEG2NHS-10K-修饰的SeV。此修饰载体的蛋白浓度按实施例19来测定。
[实施例23]PEG-修饰的SeV载体的血凝活性(HAU)和体外感染力(CIU)
对实施例20、21和22的PEG-修饰的SeV载体的血凝活性(HAU)和体外感染力(CIU)进行了测定。如图12、13和14所示，测定上述三种类型PEG-修饰SeV载体的HAU和CIU，显示了HAU和CIU随反应中PEG量的增加而降低的趋势。PEG衍生物的分子量越大，通过增加其反应量而造成的HAU和CIU的降低程度越小。而且，检测HAU和CIU之间的相关性时，用适量SPA-PEG5K修饰的SeV，其每HAU的CIU约是未经修饰载体的7-8倍。这些结果认为是显示了通过PEG修饰保持感染力，同时降低血凝并提高SeV载体在血液中的稳定性的可能性。
HAU测定如下：载体用PBS(50μl)在96孔圆底板(Asahi Technoglass)中进行连续2倍稀释。每孔加入50μl用PBS洗涤过的1％鸡红细胞溶液，4℃静置一小时，对其进行血凝检测。HAU表示为造成血凝的最大稀释比。
CIU测定如下：载体用PBS/1％BSA连续稀释10倍，然后以10μl/孔感染24孔板中的满底LLC-MK2细胞。两天以后，计数每孔中GFP表达细胞数以计算CIU。
[实施例24]PEG修饰的确证
对实施例20、21和22所述PEG-修饰SeV载体进行SDS-PAGE分析。如图15所示，当用银染凝胶分析病毒载体组成型蛋白时，随着PEG反应量的增加，来自包膜蛋白F和HN的条带减少，而在较高分子量级分中有条带出现。与HN蛋白相比F蛋白量的降低较小，很可能说明有比F蛋白更多的HN蛋白被修饰。此外，如图16所示，用兔抗F1多克隆抗体和小鼠抗HN单克隆抗体，通过Western印迹对PEG-修饰的SeV载体的包膜蛋白即F和HN蛋白进行分析，所得结果与经银染分析获得的结果相似。
[实施例25]在中和抗体存在下通过PEG2-NHS10K-修饰的SeV载体的体外基因导入
PEG2-NHS10K修饰的SeV，通过与实施例22相同的反应和纯化获得(使用0、15、20和25mg的PEG反应量)。此修饰载体的蛋白浓度按实施例19所述来测定。载体溶液以PBS/1％BSA稀释至浓度为0.01μg/μl。抗-SeV抗血清(通过用SeV免疫兔(56℃，一小时)制备)，经10、100和1000倍稀释，并将此稀释抗血清或者35μl PBS/1％BSA加入35μl载体溶液，然后于室温反应1个小时。将20μl由抗血清处理的上述载体溶液加入满底的LLC-MK2细胞24孔板的每个孔中，并进行感染。感染后第三天GFP的表达通过使用荧光显微镜拍照进行评价，并且使用荧光读板计在荧光波长530nm和激发波长485nm处定量性地评价GFP的荧光强度。
如图17所示，未修饰的SeV载体显示了随着抗体浓度增高感染效率降低的趋势，但是，这种下降可通过用PEG2-NHS10K修饰载体而被抑制。在所有测试的抗体浓度中，感染效率都高于那些未修饰的载体，显示出感染效率最大提高了约70％。
[实施例26] PEG2-NHS10K-修饰的SeV载体的体内基因导入
将由0mg PEG制备的未修饰SeV对照载体和由20mg PEG反应量制备的PEG-修饰的SeV载体反复对小鼠给药，上述两种载体都在实施例25中制备。如图18和19所示，小鼠被分为五组A-E；首次给药时，携带萤光素酶的SeV通过对小鼠进行鼻内给药以产生抗-SeV的抗体；两个星期后，第二次给药通过分别在组B中使用携带GFP的未修饰的SeV作为对照和在组C中使用PEG-修饰的SeV进行。组A用作未处理的对照，组D和E用作单次给药的对照。从小鼠中收集首次给药前，首次给药一星期后，和首次给药两星期后的血样，使用商品ELISA试剂盒(Prezyme“Seiken”，DenkaSeiken Co.，Ltd.)检测抗SeV抗体的滴度。在已接受首次给药的组B和组C的小鼠中，观察到了抗SeV抗体的滴度升高情况。首次给药两星期后当抗体滴度充分升高时，进行第二次给药。两天后，解剖小鼠，肺中GFP的表达通过使用荧光显微镜拍照进行观察。
如图19的荧光照片所示，在第一次给药中，可在很广的范围内观测到SeV感染，并且在未修饰的载体和PEG修饰的载体中没有观察到很大差异。在第二次给药中，未修饰的SeV显示整个画面中几乎没有GFP的表达，并且甚至在放大的画面中，也只在肺部表面的一些部分中稀疏可见表达。另一方面，PEG修饰的SeV，尽管有比在首次给药中更低的GFP表达，而在与未修饰的SeV比较时仍然在更大的范围内显示出更多的GFP表达细胞。如在特别放大的画面中所示，可观察到GFP表达细胞的集落。
[实施例27]在4℃贮存条件下PEG修饰的SeV保持感染力的效果
PEG2NHS-20K-修饰的SeV和PEG2NHS-40K-修饰的SeV以相似的方式制备和纯化，分别用PEG2NHS-20K(MW：20000)(两个分枝(two-branched)；Shearwater Polymers)代替实施例20中的SPA-PEG2K，使用10、20和40mg的PEG反应量；以及用PEG2NHS-40K(MW：40000)(两个分枝；ShearwaterPolymers)替换，使用20、40和80mg的PEG反应量。修饰载体的蛋白浓度按实施例19来测定。
使用实施例5中的方法检测上述PEG修饰的SeV以及未修饰的SeV在4℃贮存8天和20天时的CIU。如图20所示，在未处理的SeV对照中，贮存于4℃两周后滴度降至1/3，而经适当量的带有两个分枝的大分子PEG修饰的SeV保持了最大感染效率的近80％。
[实施例28]通过PEI修饰提高PEG修饰的SeV的感染效率
在实施例21中使用0、5、10和15mg的反应量的PEG制备的SPA-PEG5K-修饰的SeV载体，用MW为750000的聚乙烯亚胺(PEI；SIGMA)，按照PEI∶SeV的重量比为0、0.01、0.025、0.05、0.1和0.2进行修饰，用LLC-MK2细胞检测其感染效率(检测方法见实施例23)。如图21所示，加入一定量的PEI有提高PEG修饰的SeV感染效率大约10倍的效果。PEG修饰的量越高，PEI的提高效果越好。用MW为25000的PEI(Sigma)也可得到相似的结果。
工业实用性
在药物疗法或基因治疗中一个重要的技术领域，涉及到向靶细胞或细胞内细胞器递送生物活性物质，如药品(特别是大分子化合物)和核酸的系统，即，药物递送系统(以下简称为DDS)。DDS可通过使用病毒载体或通过给药一种组合物(其中优选的生物活性物质包含于其中或携带于人工或半人工载体上)来实现。本发明能够降低两种类型的DDS中的血凝活性，提高在血液中的稳定性以及基因导入效率。例如，在使用病毒载体的DDS中，具有特异性降低的血凝活性的病毒载体可以通过如下方式产生：通过将本发明应用到负链RNA病毒载体或源自编码具血凝活性的外膜蛋白的所述病毒的基因的假型病毒载体等。此外，本发明也能够降低人工脂质体制备物等情况中的血凝活性。使用本发明制备的用于DDS的化合物在体内应用中非常有效。

Claims (14)

1.一种药物-载体组合物或基因-载体组合物，其包含细胞膜，该细胞膜含有属于副粘病毒属的病毒的HN蛋白，其中：
(a)化合物附着于所述HN蛋白，其中
(i)所述化合物是聚乙二醇，或
(ii)所述化合物是具有结合HN蛋白活性的抗体或该抗体片段，并且该组合物进一步包含叶酸；
(b)血凝活性比没有附着所述化合物的组合物降低；且
(c)该组合物具有将药物或基因导入靶细胞的能力。
2.权利要求1的组合物，且其中(d)对红细胞的溶血活性比没有附着所述化合物的组合物降低。
3.权利要求1的组合物，其包含负链RNA病毒的感染性病毒粒子。
4.权利要求1的组合物，其包含灭活的负链RNA病毒，或该病毒的包膜部分。
5.权利要求1的组合物，其中所述病毒是仙台病毒。
6.权利要求1-5中任何一个的组合物，其中所述附着于HN蛋白的化合物具有1,800或更高的分子量。
7.权利要求6的组合物，其中所述附着于HN蛋白的化合物具有4,500或更高的分子量。
8.权利要求7的组合物，其中所述附着于HN蛋白的化合物具有16,000或更高的分子量。
9.权利要求1-5中任何一个的组合物，其中所述附着于HN蛋白的化合物是聚乙二醇。
10.权利要求9的组合物，其中所述HN蛋白进一步与聚乙烯亚胺形成复合物。
11.权利要求1-5中任何一个的组合物，其中所述附着于HN蛋白的化合物是具有结合HN蛋白活性的抗体或该抗体片段，其中该组合物进一步包含叶酸。
12.结合叶酸的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段具有结合属于副粘病毒属的病毒的HN蛋白的结合活性。
13.权利要求12的抗体或其片段，其是F(ab′)2。
14.一种用于制备权利要求11的药物-载体或基因-载体的组合物的试剂盒，其包括：(a)一种抗体或其片段，其具有结合属于副粘病毒属的病毒的HN蛋白的结合活性，并且与叶酸相结合；和(b)药物-载体组合物或基因-载体组合物，其包含含有属于副粘病毒属的病毒的HN蛋白的细胞膜。
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