WO2003092738A1 - Composition support de medicament ou de gene avec activite d'hemagglutinine - Google Patents

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WO2003092738A1
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Hiroto Hara
Yasuji Ueda
Mamoru Hasegawa
Jun You
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    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source

Definitions

  • Drug or gene delivery composition having reduced glutinin activity
  • the present invention relates to an intracellular drug or gene carrier having reduced hemagglutinin activity by modifying the envelope protein of a minus-strand RNA virus.
  • SeV Sendai virus
  • H hemagglutinin
  • F fuyujon
  • SeV can be infected directly into the cytoplasm in a short time and with high efficiency by fusion with F protein after the HN protein binds to sialic acid on the cell surface. Also, sialic acid is present on most cell surfaces, so it can infect a wide range of cells. SeV, which has such excellent infection characteristics, has been developed as a recombinant SeV vector carrying various genes for the purpose of gene therapy (Shiotani et al., Gene Therapy, 2001, 8, 1043-1050).
  • SeV vector has many advantages, its widespread infectivity is also a drawback of the vector.
  • SeV vectors also fuse with erythrocytes containing a large amount of sialic acid and cause strong hemolytic activity, so improvement in safety is desired. Fusing with erythrocytes also means that the required amount of drug cannot be delivered to the target cells, and can be said to be extremely unstable in blood. Therefore, the method of injecting into the living body is to temporarily stop the blood flow, or to perform the method without the intervention of blood by the perfusion method. It is anticipated that this method will be limited to local administration to sites that have little effect on blood components.
  • An object of the present invention is to provide a transporter that modifies an envelope protein in a minus-strand RA virus particle to greatly reduce only the hemagglutinin activity and maintains a drug or gene transfer ability into cells.
  • the DDS Drug Delivery System
  • the DDS is an important technology in drug and formulation development as a methodology for reducing unwanted effects and extracting desired functions.
  • the present inventors have found that by applying chemical modification, one of the DDS technologies, to the envelope of a negative-strand RNA virus, the effect on red blood cells can be reduced and the ability to introduce cells into cells can be maintained. I thought.
  • a PEG-modified SeV vector (Fig. 1) obtained by covalently binding activated PEG to an amino group present in the envelope protein of Sendai virus (SeV) depends on the amount of PEG reacted. ⁇ 27
  • Hemagglutination was found to be significantly reduced. It was feared that the infectivity to target cells would also decrease with a decrease in HAU.However, the decrease in gene transfer ability of the modified vector into cells was smaller than the degree of decrease in HAU, indicating that sufficient capacity was achieved. (Tables 1 and 2). At this time, it was revealed that the larger the molecular weight of PEG, the higher the ability to introduce genes into cells. Also, the method for preparing the PEG-modified vector was very simple and easy.
  • the PEG-modified SeV vector showed a markedly reduced hemolytic activity in rat blood, reflecting the reduction in HAU, indicating that it was an extremely safe vector (Figure 2).
  • the SeV vector significantly reduced its gene transfer ability when it came into contact with blood, while the modified vector maintained its gene transfer ability sufficiently after blood treatment ( Figures 3 and 20).
  • the PEG-modified vector was able to transfect the gene stably even in the presence of the neutralizing antibody (Figs. 5 and 17), it also imparted a stability effect to various biological components. It was thought that it was done.
  • the present inventors have found that one of the substances that selectively binds to the envelope protein responsible for hemagglutin activity is that purified monoclonal antibody (MAb) against HN protein reduces the activity (Miura et al., Exp. Cell Res., 1982, 141, 409-420), and its use was also studied.
  • MAb monoclonal antibody
  • the Sendai virus vector treated with MAb did not show any hemagglutination reaction, its hemagglutin activity was completely blocked, and no gene transfer to cells was observed.
  • Another feature of this system is that it is very easy to use because it can be easily prepared by mixing immediately before use.
  • Such a technique can also be applied to a fine particle preparation reconstituted from the envelope component protein of SeV. In this case, it would be unnecessary to reduce the HN protein as described above. After performing soluble lysis as it is without reducing SeV and reconstituting the microparticles containing the required drug, this technology can be used to reduce the amount of FV without affecting the F protein. It is thought that a carrier with higher fusion ability is formed.
  • the present invention relates to a drug or gene delivery composition having reduced hemagglutinin activity, more specifically, (1) a drug or gene delivery composition comprising a cell membrane having an envelope protein having a hemadaltun activity of a minus-strand RNA virus, (a) a compound is added to the protein, and (b) the compound is (C) a composition having the ability to introduce the drug or gene into target cells,
  • composition according to (1) or (2), wherein the composition is a composition comprising the negative strand RNA virus infectious virus particles.
  • composition according to (1) or (2) wherein the composition comprises an inactivated DNA virus of the minus-strand RNA virus or an envelope portion of the virus.
  • composition according to any one of (1) to (6), wherein the conjugate attached to the protein has a molecular weight of 1,800 or more.
  • composition according to (7), wherein the compound added to the protein has a molecular weight of 4,500 or more.
  • composition according to (8), wherein the compound added to the protein has a molecular weight of 16,000 or more.
  • composition according to any one of (1) to (9), wherein the compound attached to the protein is polyethylene glycol.
  • composition according to (12), wherein the conjugate which binds to the cells is bound to a compound added to the protein.
  • composition according to any one of (12) to (14), wherein the conjugate which binds to the cell is a ligand for a cell surface receptor.
  • an antibody or a fragment thereof which binds to an envelope protein having a hemagglutinin activity of a minus-strand RNA virus, wherein the antibody or a fragment thereof binds to a cell-binding compound;
  • the antibody or a fragment thereof according to (19), wherein the ligand is folate (21) (a) an antibody or a fragment thereof that binds to a negative-strand RNA virus having a hemaldarun activity and an envelop protein; And an antibody or a fragment thereof to which a compound that binds to a cell is bound, and (b) a drug or gene delivery kit comprising the drug or gene delivery composition containing the envelope protein.
  • the present invention relates to a drug or gene delivery composition
  • a drug or gene delivery composition comprising a cell membrane having an envelope protein having a hemadaltune activity 14 of a minus-strand RNA virus, wherein (a) a compound is added to the protein;
  • the present invention provides a composition which has reduced hemagglutining activity as compared to the case where no compound is added, and which has the ability to introduce the drug or gene into target cells.
  • the composition of the present invention comprises a negative-strand RNA PC leakage 27
  • a complex including a cell membrane having an envelope protein having a virus hemadaltin activity.
  • a complex may be, for example, an infectious virus particle, an inactivated negative-strand RNA virus, or an enzymatic component of, for example, a fragment of a banded virus, such as a reconstituted ribosome.
  • Infected live virus particles may carry a drug or gene contained in the virus into the cell into the cell via infection of the cell.
  • the gene can be expressed from the virus genome in cells infected with infectious virus particles.
  • the infectious virus may be a replication competent virus or a replication deficient virus.
  • a virus capable of replication means that when the virus infects a host cell, the virus is replicated in the cell and infectious virus particles are produced.
  • Negative-strand RNA viruses can be reconstituted in a cell by transcribing the genome genome of the virus in the presence of a viral protein necessary for transcription and replication of the genomic RNA. Reconstitution of the recombinant minus-chain virus can be performed using a known method (International Publication No. W097 / 16539; International Publication No. TO9 7/16538; International Publication No. W000 / 70055; International Publication No. WOOO / 70070; Durbin, AP et ah, 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, SP et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell.
  • RNA virus vectors including parainfluenza, 7j stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Linda plague virus, Sendai virus, etc. can be reconstituted from DNA.
  • a recombinant virus vector containing a foreign gene can be obtained by introducing the foreign gene into the virus vector genome.
  • a desired gene to be expressed in a target cell can be used.
  • the foreign gene may be a gene encoding a native protein, or a protein obtained by modifying a native protein by deletion, substitution or insertion as long as it encodes a protein having a function equivalent to that of the native protein. Gene.
  • the protein may be a deletion of the natural protein or an artificial protein.
  • a gene for the treatment of the disease of interest is inserted into the type II DNA of the virus vector (virus vector DNA), and this is transcribed to reconstitute the virus. .
  • a foreign gene is introduced into a viral vector DNA
  • a sequence having a multiple of 6 times the number of bases between the transcription termination (E) sequence and the transcription initiation (S) sequence is used. It is desirable to introduce it (Journal of Virology, Vo 1.67, No. 8, 1993, p. 4822-4830).
  • foreign genes are inserted before and / or after the open reading frame (0RF) of each viral protein (eg, ORF of NP, P, M, F, HN, and L proteins). be able to.
  • E-IS sequence transcription initiation sequence-intervening sequence-transcription termination sequence
  • a portion thereof is inserted before or after the foreign gene as appropriate so as not to interfere with the expression of the preceding and following genes. So that the unit of the E-IS arrangement is arranged.
  • the recovered virus can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification method including filtration, centrifugation, column purification and the like, or a combination thereof. "Substantially pure" means that the virus makes up a major proportion of the components in the sample in which it is present.
  • a qualitatively pure virus vector has a ratio of a protein derived from a virus setter of 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% of the total proteins contained in a sample. It can be confirmed by occupying the above.
  • a specific method for purifying a negative-strand RNA virus for example, a method using cellulose sulfate ester or a crosslinked polysaccharide sulfate (Japanese Patent Publication No. 62-30752, Japanese Patent Publication No. 62-33879, and Japanese Patent Publication No. -30753), and a method of adsorbing to sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its decomposition product (TO97 / 32010), and the like.
  • the reconstituted product of the inactivated virus or the broken frame virus is used as a transfection reagent for introducing a drug or gene into cells.
  • Inactivation of the minus-strand RNA virus is performed, for example, by UV irradiation.
  • a method for producing ribosomes using an inactivated virus such as HVJ (Hemmaggulutinating Virus of Japan) -ribosome can be prepared, for example, by shaking and ultrasonic waves (see “Liposomes in Life Science / Experiment Manual ", Springer * Hue Alark Tokyo (1992) pp.
  • inactive Sendai virus particles or a composition (membrane fusion ribosome) in which ribosomes and nucleic acids are mixed have been reported.
  • This can be carried out by reconstituting ribosomes from the solubilized stalks and preparing a so-called virosome (Bagai et al., 1993, Biochem. Biophys. Acta 1152, 15-25).
  • a detergent such as Trit on X-100
  • the insoluble RNP is removed by centrifugation.
  • the detergent is removed from the lysate containing the envelope and the envelope protein.
  • virosomes can be reconstituted and virosomes can be prepared by centrifugation (for example, 12000 rpm, 10 minutes) to separate pyrosomes of uniform particle size. Can be recovered.
  • the infectious virions may be The virus may be an inas chain RA virus or another virus having an envelope protein having vemagglutinin activity of a sinus chain RNA virus.
  • Viruses pseudotyped with the envelope protein of a heterologous virus are well known (International Publication No. TO01 / 92508).
  • an inactivated virus of the minus-strand RNA virus or a virosome having the envelope protein of the virus is prepared, and this is then used for other methods. It can be produced by fusing to a virus.
  • RNA virus RNA virus
  • a packaging cell of another virus an expression vector that expresses an enbe protein having hemagglutinin activity of a minus-strand RNA virus.
  • viruses include, for example, retroviruses. Specifically, Moroni mouse leukemia virus (Moloney virus)
  • Retroviruses belonging to the Oncovirus subfamily including Murine Leukaemia Virus (MoMLV) and mouse stem cell virus (Murine Stem Cell Virus; MSCV), etc., and human immunity Deficiency virus (human immunodeficiency virus; HIV) (eg, HIV1 or HIV2), simian immunodeficiency virus (SIV), feline immunodeficiency virus,
  • Oncoviruses including Murine Leukaemia Virus (MoMLV) and mouse stem cell virus (Murine Stem Cell Virus; MSCV), etc.
  • human immunity Deficiency virus human immunodeficiency virus
  • HIV human immunodeficiency virus
  • SIV simian immunodeficiency virus
  • feline immunodeficiency virus feline immunodeficiency virus
  • Retroviruses belonging to the subfamily Lentivirus including (FIV), Maedi visna virus, pest infectious anemia virus (EIAV), goat arthritis encephalitis virus (CAEV), etc. Lentivirus).
  • Lentivirus For HIV-1, all major (M) subtypes (including A through J), N and outlier
  • SIV isolate examples include SIVagm, SIVcpz, SIVmac, SIVmnd, SIVsnm, SIVsyk and the like. It may also be a retrovirus derived from Spumavirus, and includes, for example, Foamyvirus (DE4318387; W09607749; Virology (1995) 210, 1, 167-178; J. Virol. (1996) 70, 1, 217-22).
  • a viral vector derived from a foamy virus can be used for introducing a foreign gene into human cells, particularly for gene therapy and administration of a recombinant vaccine.
  • the pseudotyped virus vector can further contain, for example, in addition to the envelope protein having the hemagglutinating activity of the minus-strand RNA virus, other envelope proteins of the virus.
  • a composition comprising a pseudotyped viral vector having HN and F proteins of a paramyxovirus and having a compound added to the H protein is included in the present invention.
  • a viral vector containing an envelope protein having a hemagglutinin activity of a minus RNA virus can further contain an envelope protein derived from another virus.
  • such a protein can be used for viruses infecting human cells.
  • the derived envelope protein is preferred.
  • Such proteins include, but are not particularly limited to, retrovirus amphotope pick envelope protein and vesicular stomatitis virus (VSV) G protein.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the protein herpes virus family e.g., to a simple of Lupe scan virus gB, gD, g H, gp85 protein, and the like gP 350, g P 220 protein EB virus.
  • Hepadnaviridae proteins include the hepatitis B virus S protein.
  • an envelope protein derived from mouse leukemia virus (MuLV) 4070A strain can be used as the amphotropic envelope protein of the retrovirus.
  • an envelope protein derived from MuMLV 10A1 can be used (for example, pCL-IOAl (Imgenex) (Naviaux, RK et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))).
  • Vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G) 'includes, for example, Indiana serotype strain (J. Virology 39: 519-528 ( 1981)).
  • a protein derived from a desired strain can also be used.
  • a minus-strand RNA virus is a minus-strand (virus gene is (An antisense strand to the sense strand that binds) is a virus that contains RNA as a genome and has an envelope protein that has hemagglutinin activity. Negative strand RNA is also called negative strand.
  • the negative-strand RNA virus include, for example, Sendai virus of Paramyxoviridae N Newcastle disease virus 8 Mumps virus, Mumps virus, and Measles virus virus), water pain of the family Olestomyxodinaceae (Rhabdoviridae), vesicular stomatitis virus, and rabies virus.
  • the virus envelope protein having hemadaltun activity is preferably a single-strand minus-strand RNA virus virus envelope protein.
  • Single-stranded minus-strand RNA viruses are also known as non-segmented minus-strand RNA viruses, and include paramyxoviridae (including the genus Paramyxovirus, Morbill i virus, Rubulavirus, and Pneumovirus).
  • Rhab doviridae (Vesiculovirus, Lyssavirus, , Philovirinoe (Firoviridae), Onoletomyxovirenoe (Orthomyxoviridae; including Infuluenza virus A, B, C, and Thogoto-like viruses), Buyaviridae; Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus, etc.), and viruses belonging to families such as Arenaviridae.
  • the envelope protein having hemadaltun activity examples include HN protein of paramyxovirus, HA protein of orthomyxovirus, HA protein of influenza virus, G1 protein of buyavirus, G protein of rhabdovirus, and VP1 of filovirus.
  • the protein and white matter can be fisted.
  • the virus envelope protein having hemadaltun activity is more preferably a paramyxovirus virus envelope protein.
  • "Paramyxovirus" is NO. It belongs to the ramyxoviridae family (ParamYxoviridae). Virus.
  • Paramyxoviruses include, for example, the genus Paramyxovirus, the genus Monorebilivirus, the genus Rubulavirus, the genus Pneumovirus, and the genus Metapneumovirus. Specifically, Sendai virus (Sendai virus), Newcastle disease virus s Mumps virus, Measles virus, RS virus (Respiratory synvirus virus) ), Rinderpest virus, cystenhawinores (dist emper virus), simian parainfluenza virus (SV5), human parainfluenza virus 1, 2 and 3. etc.
  • Sendai virus Sendai virus
  • Newcastle disease virus s Mumps virus Newcastle disease virus
  • Measles virus Measles virus
  • RS virus Respiratory synvirus virus
  • Rinderpest virus cystenhawinores
  • cystenhawinores dis emper virus
  • simian parainfluenza virus simian parainfluenza virus (SV5), human parainfluenza virus
  • the active envelope protein include HN protein (H
  • the virus envelope protein having hemagglutinin activity is more preferably a virus belonging to the subfamily of Paramyxovirinae including Paramyxovirus, Morbillivirus, and Rubravirus.
  • it is a virus envelope protein of a paramyxovirus virus
  • a virus envelope protein having a hemagglutinin activity is most preferably an HN protein of Sendai virus, each virus being a wild strain, a mutant strain, or a laboratory passage.
  • the HN protein of Sendai virus derived from strain Z can be preferably used
  • the base sequence of the HN gene of Sendai virus is GenBank accession number D26475. , M12397, M30202, M30203, M30204, M 69046, X00586, X02808, X56131 and the like.
  • an HA protein of an orthomyxoviridae virus as the envelope protein having the virus hemagglutining activity.
  • a pseudotyped virus produced using an influenza virus envelope protein expression plasmid can infect a wide range of mammalian cells, including human cells.
  • the influenza virus envelope may be derived from a desired isolate.
  • neuraminidase is sial Has the role of breaking the bond with the acid. Therefore, in the production of an HA pseudotyped virus, an infectious virus can be obtained by treating it with neuraminidase before, during, or after adding a compound to HA.
  • the bond with cyanoric acid can be automatically cleaved.
  • a Wi / resen envelope protein having neuraminidase activity such as the H protein of paramyxovirus.
  • the present invention provides a virus vector pseudotyped with both the HA of the orthomyxoviridae virus and the HN protein of the paramyxoviridae virus, and a conjugate is added to either or both of them. And a composition comprising a virus having reduced hemadalchen activity.
  • the virus envelope protein may be an intact protein of a wild-type virus, or may be naturally or artificially mutated. For example, it is also possible to analyze antigen-presenting epitopes or the like that can serve as antigen molecules on the cell surface in these envelope proteins, and use these to create a virus using a protein having a weakened antigen-presenting ability. . Further, an envelope protein derived from an attenuated strain of a pathogenic virus or the like can also be used.
  • the present invention is directed to a virus containing a protein in which a part or all of the cytoplasmic side region of a naturally occurring virus envelope protein having a hemaldalun activity has been replaced, deleted, and modified by 7 or 7
  • the present invention also relates to a composition comprising a vector in which a compound is added to a virus envelope protein having hemadaldin activity.
  • the cytoplasmic region of the HN protein of paramyxovirus is deleted, or other membrane proteins (for example, retroviruses including lentiviruses) are deleted.
  • the modified protein substituted or added in the cytoplasmic region of the envelope protein is suitably used for producing a pseudotyped retrovirus vector having high infection efficiency.
  • the hemagglutinin activity refers to an activity of causing hemagglutination (HA), that is, an activity of agglutinating erythrocytes.
  • Hemagglutinin activity can be tested by a known method (National Institutes of Health, Alumni Association, 2nd revised edition, Introduction to Virus Experiments, pp. 214-225, Maruzen Co., Ltd.).
  • erythrocytes for example, erythrocytes of chickens (including chicks and adult chickens), geese, rats, guinea pigs, macaques, green monkeys, or humans can be used.
  • the reaction temperature is 0 ° (:, 4 ° C, room temperature, or 37 ° C, etc.).
  • the reaction is performed under conditions more suitable for the protein. Specifically, the measurement of hemagglutinin activity is performed using, for example, the “endo-point dilution method”. (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulut inating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascu lar cells. Ed. By. Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999).
  • a compound is added to an envelope protein having a hemagglutinin activity of a negative-strand RNA virus, whereby a hemadaltin is added as compared with the case where the conjugate is not added.
  • Activity is reduced.
  • the decrease in activity may be significantly reduced, and includes, for example, a case where the activity is statistically significantly reduced (for example, a significant level of 5% or more). It also includes cases where the activity is completely deleted (or below the detection limit).
  • the composition of the present invention preferably has a hemagglutinin activity of 1/2 or less, more preferably 1/3 or less, more preferably, as compared to a control composition in which the i-conjugation product is not added.
  • the ability of the composition of the present invention to introduce a drug or gene into cells is maintained higher than the decrease in hemagglutinin activity. That is, the ability of the composition of the present invention to introduce a drug or gene into cells is less than that of the control composition when the compound is not added, and the degree of the decrease is 1 compared with the control composition. 1. Less or more preferably not reduced or increased compared to the degree of decline in raw.
  • compositions of the present invention also preferably have significantly reduced hemolytic activity. Hemolytic activity can be detected by adding a test composition to blood, allowing the mixture to stand, centrifuging to remove blood cell components, and measuring the eluted hemoglobin by absorbance measurement (see Examples).
  • the composition of the present invention preferably has a hemolytic activity of 70% or less, more preferably 60% or less, more preferably 1/2 or less, more preferably, as compared to a control composition in which the compound is not added. Is reduced to 1/3 or less, more preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less, more preferably 1/20 or less, more preferably 1/50 or less.
  • the composition of the present invention has reduced hemagglutinin activity and, in a preferred embodiment, reduced hemolytic activity, but retains the ability to introduce a drug or gene into cells.
  • the composition in the case of a composition containing a minus-strand RNA virus or an envelope component of the virus, the composition has a cell membrane fusion ability with a target cell, whereby a drug or gene is delivered to the target cell. Is done.
  • the cell membrane fusion ability refers to the ability of a component (carrier) contained in the composition of the present invention to be incorporated into a cell by the fusion activity of the complex after being adsorbed to the cell membrane.
  • the cell membrane contained in the composition of the present invention may be a cell membrane which preferably contains, in addition to the compound-added enema protein having hemagglutinin activity, an F protein of a minus-strand RNA virus.
  • the fusion ability of is detected, for example, by using 1. hemolysis of red blood cells as an index. 2. Incorporate a fluorescent substance into the membrane, and dilute the fluorescent substance due to the flow of the membrane due to fusion. Detection is performed by using a change in light intensity. Alternatively, it can be detected by a method such as 3. a ribosome in which a drug is sealed in the inner water layer is used as a model of a cell membrane, and its leakage is detected as an index.
  • the drug or gene in the virus is introduced into cells by the envelope protein of each virus. Capability is retained. The ability to introduce a drug or gene into cells can be confirmed by detecting these drugs or genes introduced into cells.
  • a drug it can be detected, for example, by detecting the incorporation of a labeled drug into cells, or by incorporating a bioactive substance and detecting a change in cellular characteristics due to this. If it is a gene, the expression of the gene in cells can be detected at the RNA or protein level by methods such as RT-PCR, Northern blot hybridization, immunoprecipitation, and Western blot.
  • the gene can be detected by incorporating a gene encoding a physiologically active protein and detecting a change in cell characteristics caused by the protein.
  • the composition of the present invention preferably has significantly increased blood stability.
  • Increased stability in blood refers to a decrease in the ability of a drug or gene to carry a drug when the composition of the present invention is placed in blood. The lower the decrease in carrying capacity, the higher the blood stability.
  • the composition of the present invention was incubated with blood, and then the drug or gene delivery of the composition was measured. The control composition in the case where the conjugate was not added was used. It can be found by comparing with (see Examples).
  • the transport ability may be, for example, the magnitude of the activity of the drug if it is a drug, or the expression level of the gene if it is a gene.
  • Gene expression can be determined, for example, by directly or indirectly detecting a transcription product (mRNA) or a translation product (protein). Detection of a protein having physiological activity can be performed by measuring the activity of the protein.
  • the composition of the present invention has the compound not added.
  • the degree of decrease in the ability to transport a drug or gene, V is preferably 70% or less, more preferably 60% or less, and more preferably 1 / It is reduced to 2 or less, more preferably 1/3 or less, more preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less.
  • the compositions of the present invention preferably have increased drug or gene delivery capacity for hemagglutinin activity relative to the unmodified control composition.
  • the fact that a compound is added to the envelope protein having hemaltin activity means that the protein is bound to the conjugate.
  • the bond may be covalent or non-covalent.
  • Non-covalent bonds include, for example, hydrogen bonds, coordination bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions (hydrophobic bonds), and intermolecular forces (van der Derska).
  • the protein and the compound originally existed separately from each other, but may be those obtained by binding the conjugate to the protein by bonding.
  • the compound can be added to the envelope protein having hemagglutinin activity by, for example, forming a covalent bond by crosslinking. Crosslinks can be formed via desired functional groups.
  • Examples of the functional group include a hydroxyl group, an amino group, an aldehyde group, a carboxyl group, a thiol group, a hydroxyl group, a silanol group, an amide group, an epoxy group, a succinilimide group, and a phenol group.
  • Examples of the covalent bond include an ester bond, an ether bond, an amino bond, an amide bond, a snoresulfide bond, an imino bond, a disulfide bond, and the like.
  • the protein and the conjugate are preferably linked by non-peptide bonds.
  • Examples of the covalent bonding method include cyanogen bromide activation method, acid azide derivative method, condensation reagent method, diazo method, and alkylidation method.
  • the production of the drug 'or the gene delivery composition of the present invention is carried out by a method comprising the steps of: contacting a compound with an envelope protein having hemagglutinin activity of a minus-strand RNA virus; and binding the protein to the compound.
  • the compound binds to a region outside the envelope of the envelope protein .
  • the step of bringing the compound into contact with the protein is carried out by bringing the compound into contact with virus particles containing the protein. This makes it possible to specifically add a compound to a region of the protein involved in hemagglutinin activity exposed on the virus surface.
  • the compound is preferentially added to the envelope protein having hemagglutinin activity by crosslinking the compound, It was found that hemagglutinin activity was significantly reduced. Therefore, for example, by adding a compound to a virus to which a compound has not been added and producing the compound to the virus, the envelope protein having a hemagglutinin activity can be easily produced by a conventional method. A virus to which a compound has been added can be produced.
  • the compound to be added to the envelope protein having hemagglutinin activity is not limited as long as it significantly inhibits the hemagglutinin activity of the protein. It is preferable that the compound has no significant biotoxicity and is chemically stable after being added to the protein. In addition, it is preferable that the antigenicity is low or non-antigenic.
  • the compound to be added is preferably water-soluble. In order to effectively inhibit hemagglutinin activity, the molecular weight of the conjugate is preferably at least 1,600 (Dalton; Da), more preferably at least 1,800, more preferably at least 1,900, more preferably Preferably it is 2,000 or more.
  • compounds having a molecular weight of 12,000 or more, more preferably 14,000 or more, more preferably 15,000 or more, more preferably 16,000 or more, more preferably 18,000 or more, more preferably 20,000 or more can be particularly significantly inhibited.
  • the compound to be added may be various polymers, for example, an organic compound polymer.
  • the molecular weight of the compound to be added may vary, and in this case, the molecular weight of the compound to be added in the present specification is an average molecular weight.
  • Molecular weight dispersion (M (W / Mn) is small For example, it is 5 or less, preferably 3 or less, more preferably 2 or less, more preferably 1.6 or less, more preferably 1.4 or less.
  • proteins such as antibodies, anolebumin, collagen, gelatin, fibrin, lectin, and heparin, or fragments thereof, or dextran, cyclodextrin, dextran sulfate, cellulose, chitin Polysaccharides such as chitosan and alginic acid, and lipids can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG is preferably used because it is water-soluble and has low or no toxicity.
  • PEG refers to a compound having the following structure.
  • n is a natural number of 2 or more
  • a typical PEG includes a compound having the following structure.
  • n is a natural number of 2 or more
  • 'PEG contains a desired modified form.
  • the terminal of the above structure may be replaced with a hydroxyl group or the like.
  • monomethyl ether (mPEG) in which the hydroxy group at one end of the main chain is substituted is suitably used in the present invention.
  • the PEG may be linear or branched PEG. For example 1, 2, 3, or more PEGs with upper side chains can be used.
  • the side chain may have an ethylene glycol structure.
  • PEG is available in a variety of molecular weights, such as PEG2000 (average molecular weight 2000), PEG3000 (average molecular weight 3000), PEG4000 (average molecular weight 4000), PEG5000 (average molecular weight 5000), PEG8000 (average molecular weight 8000), PEG10000 (average molecular weight 10000), PEG20000 (average molecular weight 20000) and the like can be suitably used.
  • PEG having a functional group for cross-linking the PEG can be added to an envelope protein having hemagglutinin activity.
  • PEG having a primary amino group at the end can be cross-linked with an acylating reagent (Buckmann, A. et al (1981) Makromol. Chem. 182: 1379; Zalipsky, S. et al (1983). Eur. Polym. J. 19: 1177; Eidelman, 0. et al (1991) Am. J. Physiol. 260 (Cell Physiol 29): 01094; Pillai, VNR et al (1980) J. Org. Chem. 45: 5364).
  • cross-linking can be carried out more easily using an activated ester of N-hydroxysuccinimide (NHS), activated carboxylic acid aldehyde, or the like.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • NHS ester of PEG carboxylic acids as for example PEG- Succini midyl succinate ⁇ PEG-Succinimidyl carbonate s PEG- Succinimidyl Propionate, like Oyopi PEG-Succinimidyl Butanoate (Olson, K. et al, (1 997) JM Harris & S. Zalipsky Eds., Poly (ethylene glycol), Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, ACS, Washington, DC .; Harris, JM and Kozlowski, A., US Patent 5, 672. , 662).
  • a benzotriazole carbonate derivative of PEG forms a stable urethane bond with an amino group of a protein (Dolence, Eric K., US Patent 5, 650, 234).
  • PEG having an aldehyde group at the terminal can also be used. Aldehyde groups can react with amines under milder conditions than NHS esters.
  • PEG-Propionaldeiiyde and the like can be suitably used (Harris, JM et al (1984) J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22: 341; Kinstler, Olaf B. et al., US Patent 5). , 824, 784; Wirth, P. et al (1991) Bioorg.
  • a virus particle containing an envelope protein having hemaltin activity is prepared at a concentration of about lmg protein / ml, and the compound to be added is added in an amount of 0.1 to 100 mg, preferably about l to 50 mg.
  • hemagglutinin activity is increased by reacting l--5 mg of SPA-PEG5K with buffer of pH 8.5 against lmg protein of virus, and by reacting about 10-20 mg of SPA-PEG20K with buffer of pH 8.5. It significantly reduces the ability to maintain the ability to introduce drugs or genes into cells.
  • the addition of the compound to the protein may vary depending on the reaction conditions such as the amount of the compound used in the reaction, but is appropriately adjusted so that the hemagglutinin activity is significantly reduced and the ability to introduce the drug or gene into the cell is maintained. You.
  • the amount ratio of the compound to the virus is 1 to: lO / z mol / mg protein (compound / virus) when the compound is the number of moles and the virus amount is the protein amount. Ratio), more preferably 2-8 ⁇ mol / mg protein, more preferably 3-8 ⁇ mol / mg protein, for example about 4 ⁇ mol / mg protein.
  • the molecular weight of the compound to be added is preferably 100,000 or less, more preferably 80,000 or less, more preferably 60,000 or less, more preferably 50,000 or less, so as not to lose the ability to introduce the drug or gene into the cell. 000 or less.
  • the molecular weight is 40,000 or less, more preferably 35,000 or less, more preferably 30,000 or less, more preferably 25,000 or less, and more preferably '20, 000 or less. It is suitable for maintaining and specifically reducing the activity of dartin.
  • PEI polyethyleneimine
  • n is a natural number of 2 or more
  • the gene transfer ability can be significantly increased.
  • the ratio of the amount of PEI to the virus is 0.001 to 1 (compound / virus ratio), more preferably 0.01 to 0.2, more preferably 0.01 to 0.2 when the compound is the weight and the virus amount is the protein amount. It can be set to 0.01 to 0.1.
  • PEI having an average molecular weight of, for example, 25 kDa to 750 kDa can be suitably used, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a drug or a gene delivery composition comprising a cell membrane having an envelope protein having hemagglutinin activity of a minus-strand RNA virus,
  • a compound is added to the protein;
  • the hemagglutinin activity is lower than in the case where the compound is not added; and
  • the activity of the protein binding to cells (D) a composition comprising a complex formed with the compound having the ability to introduce the drug or gene into target cells. Even when a compound that inhibits gene transfer by inhibiting hemagglutinin activity is bound, by incorporating a ligand into the compound, hemagglutinin activity can be inhibited and gene transfer can be maintained.
  • a ligand is a compound that binds to a cell surface receptor and activates the function of the receptor.
  • the F (ab ') 2 fragment of an antibody (molecular weight: about 50 kDa)
  • the amount of binding is adjusted to a small amount, Can maintain the gene transfer ability of a virus vector, but the gene transfer of the vector can be maintained even if hemagglutinin activity is completely inhibited by binding a ligand (folate) having cell binding activity to the antibody. It is possible to dramatically improve performance (see Examples).
  • the composition may be a composition comprising a cell membrane having an envelope protein having a hemadaltune activity and a compound having an activity of binding to cells. It is necessary that the compound having the activity of binding to cells is exposed on the surface of the complex. For example, if the complex is a virus particle, the protein and the echium compound are exposed on the surface of the virus envelope. If the complex is a ribosome, the protein and the compound may be present on the ribosome surface.
  • the compound is cross-linked to a desired envelope protein contained in the complex, or preferably to an envelope protein having hemagglutinin activity. be able to.
  • Crosslinking can be formed by using a desired functional group in the same manner as described above.
  • the compound if it is a protein, it can be expressed as an envelope protein as a membrane protein or as a fusion protein with the envelope protein contained in the complex.
  • the compound having an activity of binding to a cell is a compound directly or covalently or non-covalently bonded to a compound added to an envelope protein having a hemaldaltune activity, or the same compound. It is a compound.
  • the present invention relates to a method for producing a drug or a gene delivery composition having a reduced hemagglutinin activity, comprising a cell membrane having an envelope protein having a hemagglutinin activity of a minus-strand RNA virus, wherein (a) Contacting a compound, and (b) the protein and the compound And (i) ′ a method further comprising the step of adding a compound having an activity of binding to cells to the compound.
  • Step (i) may be performed before step (a), or simultaneously with step (a) or (b), between (a) and (b), or after step (b). Good.
  • step (i) is performed before step (a).
  • the compound which has been subjected to the step (i) in advance may be added to the envelope protein having the hemadaltun activity of the minus-strand RNA virus.
  • any desired compound can be used as long as it has a function of binding to the cell surface and thereby facilitating the drug or gene transfer of the composition of the present invention.
  • a compound that binds to a cell surface protein or a compound that binds to a sugar chain on a cell surface can be used.
  • Specific examples include viral envelope proteins or natural or synthetic ligands, hormones, or cell adhesion factors.
  • Specific examples include folate, transferrin, erythropoietin, antibodies, lectins, galactose, and mannose. Examples can be given.
  • folic acid was found to be extremely effective in maintaining the ability of the complex contained in the composition of the present invention to introduce a drug into a gene.
  • the present invention relates to a drug or a gene delivery composition comprising a cell membrane having an envelope protein having a hemagnoretin activity of a minus-strand RNA virus, and (a) a compound is added to the protein; (B) hemadalutin activity is lower than 1 / ⁇ when the compound is not added, (c) the protein includes a complex formed together with folic acid, and (d) the drug or gene is A composition having the ability to be introduced into cells to be transformed.
  • it is preferable that folic acid is directly bound to the compound added to the white matter.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is produced using a compound having an activity of binding to cells, it is particularly preferable as a compound to be added to an envelope protein having a glutinin activity.
  • a compound to be added to an envelope protein having a glutinin activity Preferred are antibodies that bind to the protein.
  • the composition of the present invention is a composition containing an antibody or a fragment thereof that binds to an envelope protein having hemagglutining activity, wherein the protein binds to a cell. And a compound that forms a complex with a compound having the following activity.
  • the present invention relates to a drug or a gene delivery composition
  • a drug or a gene delivery composition comprising a cell membrane having an envelop protein having a hemaggluten activity of a minus-strand RNA virus, and (a) an antibody that binds to the protein. Or a fragment thereof is bound, (b) the hemagglutinin activity is reduced as compared to the case where the compound is not added, and (c) the protein is formed together with a compound having an activity of binding to cells.
  • a drug or a gene delivery composition comprising a cell membrane having an envelop protein having a hemaggluten activity of a minus-strand RNA virus, and (a) an antibody that binds to the protein. Or a fragment thereof is bound, (b) the hemagglutinin activity is reduced as compared to the case where the compound is not added, and (c) the protein is formed together with a compound having an activity of binding to cells. Including the complex,
  • composition capable of introducing the drug or gene into target cells.
  • a compound having an activity of binding to a cell be directly bound to the antibody or a fragment thereof.
  • antibodies include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies. It also includes antisera obtained by immunizing immunized animals such as egrets with the protein of the present invention, all classes of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, human antibodies and humanized antibodies obtained by genetic recombination. It is.
  • the polyclonal antibody for example, an envelope protein having a hemagglutinin activity or a partial peptide thereof is prepared, and a polyclonal antibody is prepared by immunizing a rabbit, a goat, a sheep and the like with the antigen.
  • the antigen peptide an extracellular domain of an envelop protein having hemadaltun activity or a fragment thereof can be used.
  • the antigen peptide can be immunized by binding it to another protein, for example, a keyhole limpet, to a carrier protein such as mosin or aluminin.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by using spleen cells of immunized mice and rats to obtain hybridomas that produce monoclonal antibodies.
  • Antibodies can be prepared according to known methods (Harlow, E. and Lane, D. (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Shepherd , P. and Dean, C. (eds.), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Practical Approach Series, 227), Oxford Univ Press, 1999).
  • Polyclonal antibodies are used for serum, and monoclonal antibodies are used for general sclerosis such as ammonium sulfate fractionation from the supernatant of hybridoma culture supernatant or ascites of animals inoculated with the hybridoma, protein G sepharose columns, and affinity columns on which antigens are immobilized.
  • Antibodies can be purified by standard techniques.
  • an antibody that binds to a region outside the envelope (extracellular region) of an envelope protein having hemagglutinin activity can be used.
  • a monoclonal antibody is used, and more preferably, the antibody is used in Example 12. HN-1 as described (Miura et al., Exp.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment thereof as long as it binds to an envelope protein (antigen protein) having hemadaltun activity.
  • an envelope protein antigen protein
  • Fab fragment
  • Fab fragment
  • Fab ⁇ F (ab ') 2 antibody variable region fragment
  • Fv single chain variable region fragment
  • scFv single chain Fv
  • Fab is a complex composed of one polypeptide chain including the antibody H chain variable region and one polypeptide chain including the L chain variable region. These polypeptides bind to each other to form one antigen-binding site (monovalent).
  • Fab is typically obtained by digesting immunoglobulin with papain, but one having an equivalent structure is also referred to as Fab in the present invention.
  • Fab includes a dimeric protein in which an immunoglobulin L chain and a heavy chain variable region (V h ) and a polypeptide chain containing C ⁇ ⁇ ⁇ l are bound.
  • F () (obtained by digestion of disulfide bonds between H chains after digestion with pepsin) and Fab (t) (obtained by trypsin digestion of immunoglobulin) have the same structure as Fab.
  • ab ') 2 refers to an antibody lacking the constant region of the antibody or a protein complex of an equivalent form, and specifically, one polypeptide chain containing the variable region of the antibody H chain and F (ab ') 2 is a bivalent antibody having two antigen-binding sites, and is typically a protein complex having two complexes consisting of one polypeptide chain containing Is obtained by digesting an antibody with pepsin at around pH 4, and has an H chain hinge region.
  • the scFv refers to a polypeptide in which an antibody H chain variable region and an L chain variable region are contained in one polypeptide chain.
  • the H chain variable region and the L chain variable region are linked via a spacer of an appropriate length, and bind to each other to form an antigen binding portion.
  • Such an antibody fragment can be obtained, for example, by referring to “The Japanese Society of Biochemistry, New Chemistry Laboratory 12 Molecular Immunology III, pages 185-195 (Tokyo Kagaku Doujinshi)” and / or “Current Protocols in Immunology, Volume 1, ( John Wiley & Sons, Inc.) J.
  • the antibody fragment can be obtained, for example, by digesting the antibody with a protease such as pepsin, papain, or trypsin.
  • the antibody can be prepared by analyzing the amino acid sequence of the variable region and expressing it as a recombinant protein, including human-type antibodies or human antibodies, etc.
  • Antibodies include protein A columns and protein G columns. It can be purified by affinity chromatography using a gel.
  • a fragment containing the variable region (antigen-binding region) of the antibody to the envelope protein having hemagglutinin activity.
  • a desired fragment containing the variable region of the H chain and / or L chain of the antibody can be used.
  • the drug to be introduced into cells may be a desired compound, for example, a natural compound, a synthetic compound, an inorganic or organic compound, a low-molecular or high-molecular compound, and the like.
  • the gene may be a desired nucleic acid, and may be a nucleic acid such as DNA or RA or a derivative thereof.
  • the nucleic acid may be a cyclic or linear single- or double-stranded deoxyriboic acid or a liponucleic acid. Examples of nucleic acid derivatives include phosphorothioate and phosphorodithioate.
  • drugs or genes to be carried in the composition of the present invention include, for example, antisense nucleic acids (Drug Delivery System, 10, 91-97, 1995), decoys (The Jou rnal of Biological Chemistry, 267, 12403-12406, 1994), ribozyme (The Drug Delivery System, 10, 91-97, 1995), triple-stranded DNA (Cell Engineering, Vol. 13, No.
  • Plasmid DNA Methods Enzymology, 221, 317-327, 1993), RNA Better, and Carriers (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 89, 7934-7938, 1992)
  • a complex with a protein Journal of Biological Chemistry, 266 (6), 3361-3364, 1991
  • an anticancer agent an anti-inoles agent, a toxin (diphtheria toxin; Biochim Biophys Acta, 1192, 253- 262, 1994Z lysine; Biochim Biophys Acta, 1070, 246-252, 1991), enzymes (Immunology, 81, 280-284, 1994), or other desired physiologically active substances.
  • the desired gene can also be inserted into the genomic nucleic acid to express the gene from a recombinant virus.
  • composition of the present invention can be used for direct administration (in vivo) and indirect administration (etas vivo) to a living body.
  • it can be administered to in vitro cells (in vitro).
  • the route of administration may be by any desired route of administration, so long as the drug or gene reaches the target cell or tissue.
  • the active ingredient for example, oral, transdermal, intranasal, transbronchial, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraarticular, or subcutaneous, it can be performed, but is not limited thereto. No. It can also be administered systemically or locally.
  • the compositions of the invention are added to contact target cells.
  • it is added to a cell culture solution.
  • the composition of the present invention is particularly excellent in blood stability, it is useful as an injection used for blood administration such as intravenous injection.
  • the complex comprising a cell membrane having an envelope protein having hemagglutinin activity of minus-strand RNA virus, which is produced by the method of the present invention, can be combined with a desired pharmacologically acceptable carrier or medium, if necessary.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle can be administered with the complex, It is a material that does not significantly inhibit the introduction of a drug or gene into cells by the complex.
  • a carrier or medium for example, sterile water, physiological saline, culture solution, serum, phosphate buffered saline (PBS), etc., may be combined as appropriate to formulate the preparation.
  • PBS phosphate buffered saline
  • composition of the present invention may contain a carrier or a medium such as deionized water and a 5% dextrose aqueous solution. Further, it may contain a ribosome membrane stabilizer (for example, sterols such as cholesterol). It may also contain antioxidants (eg, tocopherol or vitamin E). In addition, vegetable oils, suspending agents, surfactants, stabilizers, biocides, and the like may also be contained. Further, a preservative and other additives can be added.
  • the compositions of the present invention may be in the form of aqueous solutions, capsules, suspensions, syrups and the like.
  • composition of the present invention may be a composition in the form of a solution, a lyophilized product, or an aerosol.
  • sorbitol, sucrose, amino acids and various proteins may be contained as a stabilizer.
  • Compositions containing negative-strand RNA viral vectors are useful as reagents and as pharmaceuticals.
  • the dose of the composition of the present invention varies depending on the disease, patient's body weight, age, sex, symptoms, administration purpose, form of administration composition, administration method, drug or gene to be introduced, and the like. It is possible to decide. If a composition comprising an infectious virus negative strand RNA viruses, the dose preferably from about 10 5 CIU / ml to about 10 u CIU / ml, more preferably about 10 7 CIU / ml to about 10 9 CIU / ml, it is preferable to administer an amount in the range and most preferably from about 1 X 10 8 CI U / ml to about 5 X 10 8 CIU / ml in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the dose per dose is 2 X 10 9 CII! ⁇ 2 X 10 10 Higa
  • the number of doses the or one may be a plurality of times in the range of clinically acceptable side effects The same applies to the number of doses per day.
  • the above doses can be administered, for example, based on the weight ratio of the target animal to humans or the volume ratio (for example, the average value) of the administration target site.
  • the organism to which the composition of the present invention is administered is not particularly limited.
  • birds, mammals, and other vertebrates including birds, birds, mice, rats, dogs, dogs, cats, cats, sea lions, rabbits, sheep, sheep, goats, monkeys, and humans .
  • the method of the present invention is used in vitro (including etas vivo)
  • the individual to which the method is applied includes, for example, humans, non-human mammals and birds.
  • non-human mammals, birds, and the like are particularly applied to individuals.
  • the present invention relates to an antibody or a fragment thereof that binds to an enbe protein having a hemagglutinin activity of a minus-strand RNA virus, and an antibody or a fragment thereof to which a compound that binds to a cell is bound.
  • an antibody or a fragment thereof binds to the minus-strand RNA virus or a processed product thereof and binds to the protein, thereby reducing hemadalchen activity.
  • the work that helps is maintained. Therefore, such an antibody or a fragment thereof is extremely useful for producing the drug or the gene delivery composition of the present invention.
  • the antibody or fragment thereof may be a desired fragment containing the variable region of the L chain and / or H chain of the antibody as described above.
  • the ligand binding to the cell is particularly preferably a ligand for a receptor on the cell surface, and examples thereof include folate transferrin, erythropoietin, antibodies, lectins, galactose, and mannose.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention can be made into a composition together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include water, alcohol, glycerol, salt, protein, gelatin, a known p! L powder, a stabilizer, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the present invention provides (a) an antibody or a fragment thereof which binds to an envelope protein having a hemagglutinin activity of a minus-chain RM virus, and which comprises a compound which binds to a cell.
  • a kit comprising a drug or a gene delivery composition comprising a cell membrane having the envelope protein.
  • the drug or the gene delivery composition containing the cell membrane having the envelope protein include infectious virus particles, or a liposome containing an inactivated virus or the envelope of the virus.
  • the infectious virus particle may be, for example, a minus-strand RNA virus or another virus containing an envelope protein having a hemagglutinin activity of minus-strand RNA virus.
  • a drug or gene delivery composition in which the hemagglutinin activity is reduced by binding of the antibody or a fragment thereof to the envelope protein can be prepared.
  • a drug or gene delivery composition in which the hemagglutinin activity is reduced by binding of the antibody or a fragment thereof to the envelope protein can be prepared.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing PEG modification of envelope proteins (H and F proteins) of a SeV vector with TPEG and SP A-PEG modification reagents.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the hemolytic activity of rat SeV vector and TPEGf! -Decorated SeV vector on rat blood at 37 ° C. for 15 minutes.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of examining the stability of SeV betater and TPEG ⁇ -decorated SeV betater in rat blood. After treatment at 37 ° C for 1, 15, and 30 minutes, plasma was separated, HeLa cells were infected, and the expression of LacZ gene 24 hours later was quantified. The results were expressed as the mean standard deviation of three cases.
  • 'FIG. 4 is a photograph showing the results of performing SDS electrophoresis on the SeV vector and the TPEGf ⁇ -decorated SeV vector and staining them by the silver staining method. The migration positions of HN protein and F protein are indicated by arrows. 0 corresponds to the SeV vector, and 8 to 10 correspond to sample numbers 8 to 10 in Table 2.
  • PC orchid hire 27 corresponds to the SeV vector, and 8 to 10 correspond to sample numbers 8 to 10 in Table 2.
  • Figure 5 shows X-gal staining of LacZ expression after gene transfer into LLCMK2 cells using SeV vector and SPA-PEG5K modified SeV vector in the presence of egret anti-SeV antiserum (10, 100 and 1000-fold diluted serum). It is a photograph showing a result.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of selectively modifying the HN protein with a SeV vector using a folate-binding anti-HN monoclonal antibody.
  • FIG. 7 is a view showing HJ of H-1, HN-1 / F (ab ') 2 and the SeV vector thereof modified with folate-binding antibody prepared by the NHS method.
  • the horizontal axis represents the antibody concentration, and the vertical axis represents the log expression (log 2 (HAU)) of the erythrocyte aggregation activity.
  • FIG. 8 shows the results of examining the hemolytic activity of SeV vector, HN-1 modified SeV vector and folate-bound HN-1 modified SeV beta, on chicken erythrocytes.
  • SeV vectors at 1 X 10 7, 1 10 8 Oyobi 1 10 9/1111, modification vector in Betata obtained by modifying both the SeV vector 1 X 10 9 pfu / mL in 100 mu g / mL of antibody The results are shown.
  • the vertical axis of the figure indicates the amount of released hemoglobin by absorbance at 570 nm.
  • FIG. 9 shows the infection of KB cells with one SeV vector, one HN-1 modified SeV vector and one folate-binding H-1 modified SeV vector!
  • FIG. 4 shows the results of examining LacZ gene expression two days after the test. Excess folate conditions refer to a system in which ImM folic acid was added to the culture medium during infection experiments. The results are shown as the mean soil standard error of three cases.
  • Figure 10 shows the expression of the LacZ gene two days after infection when HN-1 or HN-1 / F (ab ') 2 and its folate conjugate were used to modify SeV butter to infect KB cells. It is a figure showing a result. The average value of three cases was shown by the soil standard error.
  • FIG. 11 is a diagram showing changes in HAU of a vector obtained by modifying the SeV vector with HN-1 or folate-bound HN-1 prepared by the EDC method while changing the amount of antibody.
  • FIG. 12 is a diagram showing the titer change of PFG-modified SeV. SeV was modified by changing the amount of PEG reaction, and the relative infection efficiency of the modified SeV beta was examined.
  • FIG. 13 is a diagram showing changes in HA activity of PFG-modified SeV. Change the reaction amount of PEG V was decorated, and the HA recovery of the predatory SeV vector was examined.
  • FIG. 14 shows the correlation between the infectivity of PFfrf-decorated SeV and HA activity. It can be seen that the infectivity for HA activity can be increased by PEG decoration.
  • Figure 15 is a photograph showing the result of analyzing the protein composition of SeV decorated with PFG ⁇ by silver staining. Pands derived from the envelope proteins F and HN decreased with an increase in the amount of PEG reacted, but instead appeared in the high molecular weight fraction.
  • FIG. 16 is a photograph showing the result of analyzing the composition of PFG-modified SeV by Western plotting.
  • FIG. 17 is a photograph showing the resistance of PEG-modified SeV to neutralizing antibodies. The comparison was made under the condition that the total number of modified SeV particles (total protein amount) was fixed.
  • FIG. 18 shows in vivo evaluation of PEG10K-modified SeV. The administration schedule and administration conditions of the modified SeV, and changes in the anti-SeV antibody titer are shown.
  • FIG. 19 is a photograph showing an in vivo evaluation of PEG10K-modified SeV.
  • FIG. 18 shows the expression of the transgene in the lung when the modified SeV shown in FIG. 18 is administered in vivo.
  • FIG. 20 is a view showing the effect of maintaining infectivity of PEG-modified SeV at 4 ° C. storage conditions.
  • FIG. 21 is a diagram showing the modification effect of polyethyleneimine (PEI750K). PEI increased the infectivity of PEG ⁇ decorated SeV. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • NLS-LacZZSeV carrying the LacZ gene with nuclear translocation signal was prepared by the method described previously (Kato et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Hasan et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813-2820).
  • This vector is used for chicken sexual eggs (10 days Eggs), and cultured at 35.3 ° C for 3 days. After centrifugation at 4,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was centrifuged at 10,000 rpm for 1 hour to precipitate the vector.
  • SeV vector a purified vector stock
  • the protein concentration of the vector was measured by a BC A protein assay (Pierce) using BSA as a sample, which was dissolved in an equal volume of a 2% SDS solution.
  • Hemagglutination activity (HAU) was determined as follows.
  • the stock of the SeV vector of Example 1 was diluted to 2 mg protein / ml with PBS.
  • 0.5 ml of 0.5M borate buffer (pH 8.5) was added to 0.5 ml of this solution to prepare a pH 8.5 solution of lmg protein / ml.
  • Lmg of Tresyl-activated PEG reagent TPEG, molecular weight 5000: Shearwater Polymers was added little by little to the above solution while stirring, and the reaction was carried out at room temperature for 90 minutes (Fig. 1).
  • reaction solution was diluted with 14 ml of ice-cold PBS, centrifuged at 15,000 rpm for 1 hour (Beckman, vector recovered by Rotor SW28.D , resuspended in 0.8 ml of PBS, and reconstituted with The protein concentration and HAU of the modified vector were determined in the same manner as in Example 1.
  • the stock of the SeV container of Example 1 was diluted with PBS to 1 ⁇ 10 5 pfu / ml.
  • the number of virus particles was the same for the TPEGf-decorated SeV vector of Example 2 by matching the protein concentration to that of the unmodified vector.
  • HeLa cells derived from human cervical cancer
  • FCS clear
  • FCS clear
  • medium newly 2ml added at medium and incubated at 37 ° C, 5% C0 2 24 hours.
  • LacZ gene expression was measured according to the protocol of Galacto-Light Plus TM (Tropix).
  • Cell protein measurement was performed according to the BCA method (Pierce). The results were expressed in light units (RLU / ⁇ g protein) per cell protein.
  • Table 1 shows the HAU and gene expression levels of the TPEG-SeV vector.
  • the TPEG-SeV vector was less than 2,000 times less HAU than the SeV vector.
  • gene expression in HeLa cells with the same number of particles was maintained at about 50%. As described above, it became possible to prepare a vector in which only HAU was significantly reduced without extremely impairing the ability to introduce a gene into cells.
  • the SeV vector of Example 1 and the TPEGl! I-decorated SeV vector of Example 2 were diluted with PBS to prepare a solution of 1 to 1000 proteins / ml. 50 ⁇ l of the vector diluent and 50 / il of rat blood kept at 37 ° C. were mixed, and incubated for 15 minutes. After ice cooling at 4 ° C, the plasma was centrifuged. The amount of hemoglobin released into plasma was measured by absorbance at 570 nm (0D570).
  • the hemolytic activity of the vector was calculated from the following formula using PBS as a negative control and distilled water as a positive control (100% hemolysis).
  • Hemolytic activity (%) ⁇ (0D570 in vector solution) — (0D570 in PBS) ⁇ / ⁇ (0D570 in distilled water)-(0D570 in PBS) ⁇ X 100
  • the SeV vector showed a strong hemolytic activity depending on the vector concentration.
  • the hemolytic activity of the TPEG-modified SeV vector was found to be very low. Since the hemolytic activity of TPEG ⁇ -decorated SeV vector 1000 / zg was equivalent to that of SeV vector, it was considered that the safety was improved about 200 times.
  • the SeV vector of Example 1 was diluted with PBS to 1 ⁇ 10 8 pfu / ml.
  • the TPE-decorated SeV vector of Example 2 was diluted with PBS so that the virus protein concentration would be the same.
  • 250 ⁇ l of the vector mono-diluted solution was mixed with 250 ⁇ l of fresh blood of SD rats (oss), and the mixture was incubated at 37 ° C. After a predetermined time, 80 blood samples were collected and centrifuged at 4 ° C to collect plasma. According to the method described in Example 3, the LacZ gene expression in HeLa cells was examined using a solution (50 ⁇ 1) of plasma 101 diluted 50 times with PBS.
  • the SeV vector was remarkably destabilized immediately after blood treatment, and the gene expression ability was reduced to 1/1000 of the 15-minute treatment compared to the untreated blood.
  • the TPEG ⁇ -decorated SeV vector had improved stability in blood and maintained significantly higher gene expression ability than the unmodified vector.
  • the stock solution of the SeV vector of Example 1 was diluted to 2 mg protein / ml by diluting with PBS. This solution was diluted 2-fold with 0.5M borate buffer (pH 8.5) to prepare a lmg protein / ml solution. Succimimidyl 'propionic acid derivative with a molecular weight of 2000 PEG reagent (SPA-PEG2K, Searwater Polymers) 1, 2, or 4 mg was added little by little to the above solution while stirring, and the reaction was carried out at room temperature for 30 minutes ( Figure 1). . After the reaction is completed, dilute the reaction solution with ice-cold PBS 11 ⁇ 21.
  • SPA-PEG2K Searwater Polymers
  • the vector was recovered by centrifugation at 13,000 rpm for 1 hour (Beckman, rotor SW28.1) and resuspended in 0.8 ml of PBS to obtain a SPA-PEG2K-modified SeV vector (Table 2, Samples). Numbers 1-3).
  • the protein concentration of the modified vector was determined in the same manner as in Example 1.
  • the SPA-PEG2K of Example 6 was changed to SPA-PEG5K (Shearwater Polymers) having a molecular weight of 5000, and the reaction and purification were carried out in the same manner at 1, 2.5, 5 or 10 mg of PEG. K-modified SeV was obtained (Table 2, specimen numbers 4 to 7).
  • SPA-PEG2K of Example 6 was changed to SPA-PEG20K (Shearwater Polymers) having a molecular weight of 20,000, and the reaction was similarly carried out at a PEG reaction amount of 10, 20, or 40 mg. (Table 2, specimen numbers 8 to 10). '
  • Figure 4 shows the results of SDS-electrophoresis using SPA-PEG20K-modified vector 1 / ⁇ and staining of each constituent protein by silver staining.
  • the PEG reaction amount increased, the amount of the band derived from the HN protein decreased, and instead, the band appeared in the high molecular weight fraction. This is the PEG-bound HN protein Was presumed to have been polymerized.
  • the decrease in the F protein band was small. From these results, it was found that the modification of H and F proteins to PEGj decoration on the SeV envelope is mainly performed.
  • Example 9 SPA-PEG-modified SeV vector fraction activity and in vitro gene expression HAU activity was measured by the method described in Example 1. Furthermore, LacZ gene expression in HeLa cells was measured according to the method described in Example 3, except that the infection moi was changed to 0.5 and the number of culture days after infection was changed to 2 days.
  • Table 2 shows the results of HAU and LacZ expression.
  • HJ of the obtained modified product decreased.
  • HAU could be significantly reduced while suppressing the decrease in expression ability.
  • HeLa cells were prepared as in Example 3. The culture medium was removed just prior to the experiment, and the PBS wash Niwatori erythrocytes prepared in IX 10 9 cells / ml were added 300 / zl instead. In the control group, PBS was used instead of red blood cell fluid. Add 50 1 of the SeV vector of Example 1 or the PEG-modified SeV vector shown in Table 2 (sample Nos. 1, 2, 4, 5, 6, 8, and 9) and incubate for 5 minutes at 37 ° C. Infection. The amount of vector added was adjusted based on Table 2 so that the expression efficiency would be the same. Cells were treated according to Example 3 and LacZ gene expression was measured 48 hours later.
  • Table 3 shows the gene expression level of each sample in the presence of ⁇ blood cells. The results are shown as a relative ratio with the expression level in the absence of erythrocytes being 100. In the SeV vector, the gene expression level was reduced to about 20% due to the presence of erythrocytes. On the other hand, in the case of PEG ⁇ -decorated specimen, the interaction with erythrocytes decreases with the decrease in HAU activity. However, it showed high gene transfer. These results suggest that PEG ⁇ -decorated SeV vectors can be used to transduce blood in a short period of time in clinical settings.
  • NLS-LacZ / SeV vector was prepared and purified according to Example 1 to prepare a stock. This vector was reacted with SPA-PEG5K (5 mg) according to the method described in Example 7 to prepare a SPA-PEG5K modified SeV vector.
  • the titer of the vector for LLCMK2 cells was determined as follows. On the day before the experiment, LLCMK2 cells were seeded in a 6-well plate (Sumitomo Belite) at 1 ⁇ 10 6 cells / lwel (MEM medium supplemented with 10% FCS 2 ml / vrel 1 ′). The vector was diluted to 1 mg protein / ml with 1% FCS-containing PBS to prepare a 10-fold dilution series.
  • the medium was removed the cells, diluted vector solution was added to 1 mL or 1 well Oh was subjected to 1 hour of infection at 37 ° C, 5% C0 2 . After removal of the vector solution, washed with medium, fresh medium was added 2 ml per well, with further 37 ° C, 5% C0 2 Culture was continued. Two days later, the medium was removed, and after washing with PBS, cells expressing the LacZ gene were stained with X-gal using a] -Gal staining kit (Invitrogen). The number of infected cells in a visual field of ⁇ 200 was counted at any 10 locations in the well, and the titer of the entire well was calculated from the average value and the area of the visual field by the following formula.
  • the titers of the SeV vector and SPA-PEG5K-modified SeV were 1.4 ⁇ 10 10 CIU / ml and 2.7 ⁇ 10 9 CIU / ml, respectively.
  • Example 11 The SeV betater described in (1) and the SPA-PEG5K modified SeV betater were diluted with PBS to prepare 1 ⁇ 10 7 CIU / ml. To a 30 / zl vector solution, add 30 ⁇ l of 10, 100 or 1000-fold diluted serum of anti-SeV antiserum (56, 1 hour treatment) or PBS prepared by immunizing egos with SeV. Time processed. On the day before the experiment, LLCMK2 cells were seeded on a 12-well plate (Sumitomo Bakelite) at 2 ⁇ 10 5 cells per well (lml / well of MEM medium supplemented with 10% FCS). Reduce the medium 0.
  • the antiserum treated vector solution 40 1 was added to Ueru, it was carried out for 1 hour infection at 37 ° C, 5% C0 2 .
  • LacZ gene expression 2 days later was evaluated by X-gal staining in the same manner as in Example 1 (1).
  • the SeV vector significantly reduced the gene transfer efficiency due to the presence of the antiserum.
  • the SPA-PEG5K modified SeV vector was able to maintain sufficient gene transfer ability even in the presence of antiserum.
  • HN-1 producing hybridoma cells (Miura et al., Exp. Cell Res., 1982, 141, 409-420) were cultured in Hybridoma-SFM medium (Gibco-BRL) at 37 ° C, 5 ° C. % (0 2 continued subculture was prepared 2 X 10 5 'cell number / ml of cell suspension 1000 ml. the resulting further, after continued for 2 weeks in culture, 3,000 rpm, by centrifugation for 10 minutes the supernatant was filtered through a filter of 0. 45 ⁇ ⁇ . purification of the monoclonal antibodies was carried out by Protein G column chromatography. culture supernatants 20fflM sodium phosphate buffer (P H7 5527).
  • the antibody was bound to the 5 ml Protein G column (Pharmacia) equilibrated in (2). After washing with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), the antibody was eluted with 0.1 M glycine-hydrochloride buffer (pH 2.7). The eluate was neutralized with 1M Tris-HCl buffer (pH 9.0), and concentrated by ultrafiltration (Centriplus-120, molecular weight cut 30,000: Amicon).
  • P-1 pump Bulmasia
  • the solution was again concentrated by ultrafiltration to obtain a PBS solution of HN-1 160 / il.
  • the protein concentration was determined to be 37.6 mg / ml by the BCA protein assay (Pierce) using ⁇ ⁇ gamma globulin as a standard.
  • Example 13 F (ab,) 2 fragmentation of anti-HN monoclonal antibody, H-1
  • the purified monoclonal antibody HN-1 of Example 12 was diluted with 0.2 M acetate buffer (pH 4.5). It was adjusted to 2 mg protein / ml.
  • Protein solution 2. 2.35 ml of 0.2M acetate buffer (pH 4.5) of pepsin (Sigma) prepared above was added thereto, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 21 hours. After neutralization with 1N sodium hydroxide (700/1), PBS was added to make a total volume of 25 ml.
  • the precipitated by-product was removed by filtration, and the filtrate was added dropwise to 250 ml of getyl ether with stirring.
  • the precipitated yellow precipitate was repeatedly washed with ether and dried under reduced pressure to obtain NHS-activated folic acid.
  • a reaction solution was prepared by mixing 100 1 of a 2.Omg protein / ml PBS solution of HN-1 purified according to the method of Example 12 and 100 ⁇ l of 0.5M borate buffer (pH 8.5).
  • Example 14 A DMS0 solution (5 mg or 10 mg / ral) 2.5 // 1 of the NHS-activated folate described in (1) was added dropwise and reacted at room temperature in a dark place for 1 hour. After reacting for 1 hour at room temperature in the dark, unreacted folic acid was removed with a PD-10 column equilibrated with PBS, and the protein fraction was recovered. Concentration was performed by P Gonkai filtration method to obtain folate-bound -1. The protein concentration was measured according to Example 12.
  • Example 14 The same reaction and purification were carried out by changing the concentration of NHS-activated folate to 10 mg / ml, and adding HN-1 of (1) to HN-1 / F (ab,) 2 solution. The bound HN-1 / F (ab ') 2 was obtained.
  • Example 15 HA recovery of folate-binding monoclonal antibody-modified SeV betater NLS-LacZ / SeV described in Example 1 was diluted to 1 ⁇ 10 8 pfu / ral with PBS, and 50 ⁇ l was added to a 96-well round bottom plate. Dispensed one by one.
  • ⁇ -1 purified according to the method of Example 12 ⁇ -1 / F (ab ′) 2 of Example 13 and folate-bound HN-1 and folate-bound HN-1 described in Example 14 / F (ab,) 2 was diluted with PBS to make 1 ⁇ g / 100 ⁇ g protein / ml. 50 ⁇ l of the antibody diluent was mixed with the vector, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to prepare a modified vector (FIG. 6). Thereafter, HJ was measured according to the method of Example 1.
  • Figure 7 shows the HAU measurement results.
  • the amount of antibody added increased; ⁇ U decreased, and the antibody concentration fell below the detection limit at an antibody concentration of lO / zg / ml or more.
  • no extreme decrease in HAU inhibitory activity due to folic acid binding was observed.
  • Example 16 Hemolytic activity of folate-binding monoclonal antibody-modified SeV betater
  • the NLS-LacZZSeV described in Example 1 was diluted to 1 x 10 9 pfu / ml with PBS and dispensed 50 1 into 96-well round bottom plates. did.
  • HN-1 purified according to the method of Example 12 and folate-bound HN-1 described in Example 14 were diluted to 100 ⁇ g protein / ml with PBS.
  • the antibody diluent or 50 ⁇ l of PBS was mixed with the vector, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to prepare a modified vector.
  • Example 4 according to the method described for rats blood into two Watori erythrocytes in PBS IX 10 9 cells number / mL, except for changing the incubation time to 30 minutes was performed in the same manner, was tested hemolytic activity.
  • FIG. 8 shows the measurement results of the hemolytic activity.
  • HN-1 and folate-bound HN-1 modified SeV beta had very low hemolytic activity. Compared to the hemolytic activity of the SeV vector, the hemolytic activity was lower than that of the SeV vector at a 1/100 concentration.
  • the modified vector of Example 15 was prepared by changing the SeV vector to 1 ⁇ 10 7 pfu / ml and the antibody concentration to 10 g / ml.
  • KB cells derived from human nasopharyngeal carcinoma
  • FCS-free, folic acid-free RPMI1640 medium Gibco-BRL, lml / well.
  • the medium was replaced with 0.5 ml of a folic acid-free RPMI 1640 medium or a medium obtained by adding ImM folic acid to the same medium.
  • the vector was added at 20 / / well, it was infected at 37 ° C, 5% C0 2 . 3 hours vector Except after, washed twice with medium, newly added media 2ml per Ueru were cultured at 37 ° C, 5% C0 2 48 hours. LacZ gene expression was measured according to Example 3.
  • Figure 9 shows the results of LacZ gene expression in Pico KB cells.
  • the gene expression of the Human 1-modified SeV vector was less than one-hundredth of that of the unmodified SeV vector, indicating a decrease in gene transfer with HAU loss.
  • folate-bound HN-1 showed a significant increase in gene expression compared to non-folate-bound HN-1 and showed about 15% gene transfer compared to unmodified SeV beta.
  • excess folate was present in the culture medium, gene transfer was inhibited in folate-bound HN-1. It was speculated that this occurred after the fusion with the F protein.
  • FIG. 10 shows a comparison when the antibody molecule is HN-1 / F (ab ') 2. Similarly to HN-1, HN-1 / F (ab ') 2 showed high gene transfer only at the time of folate binding.
  • Example 12 To the HN-1 solution of Example 12 prepared in PBS at lmg protein / ml in 300 ⁇ l, 16.6 l of the above-mentioned folate- EDC solution was added dropwise with stirring. After performing the reaction at room temperature for 1 hour in the dark, folate-bound HN-1 was obtained in the same manner as in Example 14- (2).
  • Example 15 A modified vector was prepared by changing folate-bound HN-1 to that described in Example 18- (1), and HAU was measured.
  • Example 100 100 ⁇ g / ml of folate-bound HN-1 described in (1)
  • a modified vector was prepared using the solution. Infection experiments were similarly performed using A549 cells (human lung carcinoma) in addition to the KB cells of Example 16.
  • Table 4 shows KB cells with high expression of folate receptor and almost no receptor A 549 cells (Wang et al., Bioconjugate Chemistry. 1997, 8, 673-679) were compared for gene expression.
  • Folate-binding HN-1 modified SeV vector showed high gene transfer in KB cells only in the absence of excess folate, indicating that the folate ligand replaced with the hemagglutinin activity of HN protein is responsible for binding to the folate receptor. It was found that gene transfer was more specific.
  • LacZ gene expression relative ratio (SeV vector, excess folate (-) is assumed to be 100%)
  • Escess folate KB cells A540 cells
  • SeV / GFP carrying the GFP gene was prepared by the method described previously (Kato et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Hasan et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813). -2 820).
  • This vector was inoculated into a chicken fertilized egg (10-day egg), and cultured at 35.3 ° C. for 3 days, and then the serum was collected. After centrifugation at 3000 rpm for 30 min at 4 ° C, the supernatant was centrifuged at 35000 g for 1 h at 4 ° C to precipitate the vector.
  • SeV protein a stock of the purified vector (hereinafter, referred to as SeV protein).
  • the protein concentration of Vector 1 was measured by a BCA protein assay (Pierce) using BSA as a standard, which was dissolved in an equal volume of a 3% Triton®-100 solution.
  • the purification vector was about 1 mg protein / ml.
  • Example 19 0.5 ml of a phosphate buffer (pH 8.5) was added to 0.5 ml of the stock of SeV Better in Example 9 to prepare a 0.5 mg protein / ml pH 8.5 solution.
  • succinimidyl-pulp acid derivative PEG reagent SPA-PEG2K, Shearwater Polymers
  • SPA-PEG2K succinimidyl-pulp acid derivative PEG reagent
  • the reaction solution was centrifuged at 4 ° C and 15000 rpra for 1 h, the precipitate was suspended in water-cooled PBS, and the vector was collected again by centrifugation at 4 ° C and 15000 rpm for 1 h.
  • the suspension was resuspended in PBS to obtain a SPA-PEG2K modified SeV vector.
  • the protein concentration of the modified vector was determined in the same manner as in Example 19.
  • Example 20 The reaction and purification were performed in the same manner as in Example 20 except that SPA-PEG2K in Example 20 was changed to SPA-PEG5K (Shearwater Polymers) with a molecular weight of 5000, and the PEG reaction amount was changed in the same manner at 0, 5, 10, 15, 20, and 25 mg. -PEG5K modified SeV was obtained.
  • the protein concentration of the modified vector was determined in the same manner as in Example 19.
  • Example 20 SPA-PEG2K was changed to PEG2NHS-10K (double-stranded, Shearwater Polymers) having a molecular weight of 10,000 and the PEG reaction amount was similarly changed to 0, 10, 20, 30, 40, and 50 mg. Purification was performed to obtain PEG2NHS-10K-modified SeV. The protein concentration of the modified vector was determined in the same manner as in Example 19.
  • HAU Hemagglutination activity
  • CIU in vitro infectivity
  • HAU HAU called for:
  • the vector was serially 2-fold diluted with PBS in a 96-well round bottom plate (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) (50 ⁇ 50).
  • 50 1% of a 1% nitrile erythrocyte solution washed with PBS was added, and each well was allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour, and then judged. Fractions were expressed as the highest dilution of the vector that caused red blood cell aggregation.
  • the vector was serially diluted 10-fold with PBS / 1% BSA, and the LLC-MK2 cells that had become confluent in 24-we11 were infected at 10 1 / well.After 2 days, the number of GFP-expressing cells per well was counted. Calculated.
  • Reaction and purification were carried out in the same manner as in Example 22 with the PEG reaction amounts of 0, 15, 20, and 25 mg to obtain PEG2-NHS10K-modified SeV.
  • the protein level of the modified vector was determined in the same manner as in Example 19.
  • the vector solution was diluted with PBS / 1% BSA to prepare O. Ol ⁇ ug / ⁇ . Add 35 ⁇ l of 10, 100 or 1000-fold diluted serum of anti-SeV antiserum (treated at 56 ° C for 1 hour) or PBS / 1% BSA prepared by immunizing rabbits with SeV to vector solution 35. 1 hour at room temperature was.
  • the anti-serum-treated vector solution was added to LLC-K2 cells confluent in a 24-well at 20 / l per well to infect the cells.
  • GFP expression on day 3 after infection was photographed with a fluorescence microscope and quantitatively evaluated using a fluorescence plate reader based on GFP fluorescence intensity measured at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 530 nm.
  • the unmodified SeV vector tended to decrease the infection efficiency with increasing antibody concentration, but the modification was suppressed by the modification of PEG2-NHS10K.
  • the infection efficiency was higher than that of unmodified, and the infection efficiency was improved up to about 70 %.
  • Example 26 Gene transfer in vivo using PEG2-NHS10K-modified SeV vector
  • Example 25 uses an unmodified SeV control prepared at 0 mg PEG reaction amount and a PEG-modified SeV prepared at 20 mg. The mice were repeatedly administered. As shown in Figs. 18 and 19, the experimental group was divided into five groups. The first time, SeV with Ludf erase was instilled in nose to produce an anti-SeV antibody.Two weeks later, glue 73 ⁇ 4 was loaded with GFP. For the unmodified SeV control, Gnorape C, a second dose was given using PEG-modified SeV. Group A was an untreated control, and D and E were single-dose controls.
  • the first administration showed a wide range of infection with SeV, and there was no significant difference between unmodified and PEG-modified vectors.
  • the second injection when unmodified, GFP expression was barely visible in the whole picture, and even when enlarged, it was sparsely visible on a part of the lung surface.
  • the cells were decorated with PEGf! I, the number of GFP-expressing cells was larger than that of the unmodified cells and was observed in a wider range, although the number was smaller than in the first experiment. In particular, colonies of GFP-expressing cells can be seen as seen in the enlarged photograph. I was guessed.
  • Example 2 0 of SPA- PEG2K a molecular weight 20000 PEG2NHS- 2 0K (2-stranded, Shearwater Pol ymers Corporation) PEG reaction volume was changed to at 10, 20, 40 mg, PEG2NHS- 40K molecular weight 40000 (2 This chain was changed to Shearwater Polymers), and the reaction and purification were carried out in the same manner at PEG reaction amounts of 20, 40, and 80 mg to obtain PEG2NHS-20K-modified SeV and PEG2NHS-40K-modified SeV.
  • the protein concentration of the modified vector was determined in the same manner as in Example 19.
  • Example 5 According to the method used in Example 5, the above-mentioned PE ( ⁇ -decorated SeV and untreated SeV that had been stored at 4 ° C for 8 days and 20 days were measured for CIU. As shown in FIG. After storage at 4 ° C for 2 weeks, the titer decreased to one third, but the modification with the appropriate amount of high-molecular-weight double-stranded PEG kept the infection efficiency up to nearly 80%!
  • Example 21 SeV weight ratio of 0, 0.01, 0.025 was prepared by using pol yethylenimine (PEI, SIGMA) having a molecular weight of 750,000 and prepared at a PEG reaction amount of 0, 5, 10, 15 mg in Example 21. , 0.05, 0.1, and 0.2, and the efficiency of infection of LLC-MK2 cells was measured (for the measurement method, see Example 23). As shown in Fig. 21, the addition of a certain amount of PEI had the effect of increasing the infection efficiency of PEG-modified SeV by about 10-fold. The greater the amount of PEG decoration, the more effective the PEI infection efficiency was. Similar results were obtained with PEI having a molecular weight of 25,000 (SIGMA). Industrial applicability
  • a drug particularly a high molecular compound
  • a physiologically active substance such as a nucleic acid
  • a target cell or an intracellular tissue that is, a drug delivery system (DDS).
  • DDS can be carried out using a viral vector or by administering a composition in which a desired physiologically active substance is encapsulated or carried in an artificial or semi-artificial transport carrier (carrier).
  • carrier artificial or semi-artificial transport carrier
  • the present invention in the case of DDS using a virus vector, if the present invention is applied to a minus-chained virus vector or a virus vector sieved with an envelope gene having the hemagglutinin activity of the virus, the hemagglutinin activity will be specific. It is possible to produce a virus vector that has been significantly reduced. In addition, even when ribosomes and the like are artificially prepared, hemagglutinin activity can be reduced by applying the present invention.
  • the composition for DDS manufactured using the present invention exerts an extremely excellent effect for in vivo application

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Description

グルチニン活性を低下させた薬剤または遺伝子運搬組成物 技術分野
本発明は、 マイナス鎖 RNAウィルスのエンベロープ蛋白質を修飾することにより 、 へマグルチニン活性を低減させた、 細胞内への薬物または遺伝子運搬体に関す る。 直
センダイウィルス (SeV) のエンベロープ蛋白質はへマグルチニン （H ) とフユ 一ジョン （F) の 2種類から構成される。 SeVは HN蛋白質が細胞表面のシアル酸に結 合した後、 F蛋白による融合により、 細胞質内へ直接、 短時間に、 かつ高効率で感 染することが可能である。 また、 シアル酸はほとんどの細胞表面に存在するため 、 広範囲の細胞への感染が可能である。 このような、 優れた感染特性を有する SeV は遺伝子治療を目的に、 種々の遺伝子を搭載した組替え SeVベクターとしての開発 や （Shiotani et al. , Gene Therapy, 2001, 8， 1043-1050) 、 そのエンベロープ 蛋白質を含むリボソーム内水相に遺伝子や種々の薬物を封入した、 薬物送達シス テムとしての研究も進められている （Ramani et al. , FEBS Letters, 1997, 404, 164-168； Isaka et al. , Experimental Nephrology, 1998, 6, 144一 147)。
このように、 SeVベクターは多くの利点を有しているが、 その広範な感染性は本 ベクターの欠点にもなる。 SeVベクタ一はシアル酸を大量に含む赤血球とも融合し て、 強い溶血活性 引き起こすことから安全性の面で改善が望まれる。 また、 赤 血球と融合することは、 標的とする細胞に必要な量の薬物を送達できないことを 意味しており、 血液中で極めて不安定であると言える。 そのため、 生体内への投 与方法は、 一時的に血流を止める、 あるいは還流法などによる血液を介さずに行 う方法か、 血液成分の影響の少ない部位への局所投与に限定されることが予測さ れる。
このような安全性、 安定性にかかわる問題を解決するには HN蛋白質のへマダル チュン活性を消失または低減して、 赤血球との結合を少なくすることが必要であ る。 しかし、 へマグルチニン活性の消失は、 薬物を導入する標的細胞への結合を 低下することにもなり、 効率が著しく低下することが容易に推測されるので工夫 が必要となる。
これまでに、 SeVの HN蛋白をジチオスレィトール （DTT) により特異的に還元し て、 へマグルチニン活性を消失させる方法を利用した研究が多数報告されている 力 そのほとんどは赤血球への溶血活性を指標にした研究である。 例えば、 Tomas hiらは FEBS Letters, 1982, 143, (2)， 252 - 256において、 SeVを DTTで還元して、 そのへマグルチ二ン活性を消失させた。 そのときに形成される HN蛋白分子中の SH 基に新たに、 赤血球を認識する抗体分子を導入することで、 再度赤血球への結合 能を補い、 溶血活性を再び示すことを報告するのみに留まっている。 しかも、 そ の融合活性は著しく低下しており、 この方法の発展性には疑問が残る。 また、 Git manらは、 Biochemistry, 1985， 24, 2762 - 2768において、 SeVのエンベロープへの 化学的な修飾について報告している。 へマグルチニン活性を消失させることに成 功しているが、 融合能も同時に完全に消失しており、 融合能を付与するには新た に修飾していないェンベロープ蛋白を糸且み込み、 へマグルチニン活性を再度もた らす必要があると報告している。
細胞を標的とした研究もいくつ力、報告はされている。 例として、 Bagaiらは Jour nal of Virology, 1993, 67, (6)， 3312- 3318において、 HNを還元した SeVを界面 活生剤で可溶ィ匕を行った後、 F蛋白のみからなる微粒キを再構成させて、 F蛋白の 糖鎖特異的な感染を目指した薬物送達システムを提唱している。 また、 Ramaniら も、 FEBS Letters, 1997, 404, 164- 168にて、 同様のシステムでインビト口にお ける遺伝子導入の結果を報告している。 この方法論では、 確かにへマグルチニン 活性を消失した上で、 標的とする細胞のみに融合させることは可能である力 HN 蛋白と同時に F蛋白も少なからず還元を受けることや再構成の過程でエンベロープ 蛋白が完全に粒子に組み込まれず （Ponimaskinら、 Virology, 2000, 269, 391-403 ) 、 再び得られる運搬体の融合能は低下するために、 投与量が多くなることが改 善すべき点として挙げられる。 また、 調製において、 ウィルスを大量に必要とす ることや界面活性剤の除去が煩雑であること、 さらに、 再構成される粒子の不均 一性など調製方法の面からも改良の余地は大き!/、。
このように、 これまでに、 へマグルチニン活性を著しく低減させ、 かつ細胞へ の薬剤送達能を維持した、 マイナス鎖 RNAウィルスのエンベロープ蛋白をベースと した薬物送達システムは知られていない。 発明の開示
本発明は、 マイナス鎖 R Aウィルス粒子中のエンベロープ蛋白を修飾することで 、 へマグルチニン活性のみを大きく低減させて、 細胞内への薬物または遺伝子導 入能は維持した運搬体を提供することを課題とする。
薬物や製剤の開発において、 望まない作用を軽減させ、 目的とする機能を引き 出す方法論として、 DDS (Drug Delivery System) は重要な技術である。 本発明者 らは、 DDS技術の一つである化学修飾をマイナス鎖 RNAウィルスのェンべロープに 対して適用することで、 赤血球に対する作用を低下させ、 細胞への導入能を維持 しうることを考えた。 そのためには、 へマグルチニン活性を担うエンベロープ蛋 白への選択的修飾を行い、 その活性を低減させるとともに、 融合に重要なェンべ ロープ蛋白への影響は可能な限り小さくするのが望ましい。
本発明者らは鋭意検討した結果、 ポ'リエチレングリコール （PEG) などの高分子 修飾が赤血球凝集反応を低減させるのに有効であることを見出した。 例えばセン ダイウィルス （SeV) のエンベロープ蛋白に存在するァミノ基に対して活性化 PEG を共有結合させて得られる PEG修飾 SeVベクター （図 1 ) は、 PEGの反応量に応じて 脑 27
4
赤血球凝集反応 （HAU) が著しく低下することが明らかとなった。 HAUの低下に伴 い、 標的細胞への感染性も同様に低下することが懸念されたが、 修飾ベクターの 細胞への遺伝子導入能の低下は HAUの低下度合いに比べて小さく、 十分な能力を維 持していることを認めた （表 1および 2 ) 。 このとき、 PEGの分子量が大きいほど 、 細胞への遺伝子導入能を高くすることができることを明らかにした。 また、 PEG 修飾ベクターの調製方法も、 非常に短時間で容易であった。
PEG修飾 SeVベタタ一の構成蛋白の電気泳動パターンから、 HN蛋白量の大幅な減 少と、 それに代わる新たな高分子の出現を認めた。 一方、 F蛋白の減少は小さいこ と力ゝら、 HN蛋白が優先的に PEG修飾され、 F蛋白への結合よりも優位に起こること が示唆された。 このことが HAUを大きく低下しつつ、 融合能を維持する要因となつ ていると推測された （図 4、 1 5、 および 1 6 ) 。
PEG修飾 SeVベクターは HAUの低下を反映して、 ラット血液に対する溶血活性が著 しく低下しており、 安全性の面で非常に優れたベクターであることが示された （ 図 2 ) 。 また、 SeVベクターは血液と接触するとその遺伝子導入能が著しく低下し たが、 修飾ベクターでは血液処理後も遺伝子導入能を十分に維持していた （図 3 および 2 0 ) 。 このことは、 修飾による赤血球との結合を低下させる効果に加え て、 補体などの血液中に存在するベクターの活性を不安定ィヒすると考えられる因 子に対しての安定ィ匕効果も同時に付与できることを示す結果であった。 さらに、 P EG修飾ベクターが中和抗体存在下にお!/、ても、 実に安定に遺伝子導入可能であつ たことから （図 5および 1 7 ) 、 様々な生体成分に対する安定ィヒ効果も付与され ていると考えられた。
さらに、 PEGf!i飾ベクターの in vivo投与の効果を調べたところ、 複数回投与に おいて PEG^飾べク^ーの遺伝子導入効率は未修飾ベクターに比べ明ら; Hこ高く、 生体内において高い遺伝子導入能を持つことが確認された （図 1 9 ) 。
このように、 PEGf 飾の条件を適当に選ぶことにより、 赤血球とのインタラクシ ョンのみを低減させ、 細胞へ高い導入能を維持しうることを見出した。 さらに、 本発明者らはへマグルチュン活性を担うエンベロープ蛋白に選択的に 結合する物質の一つとして、 HN蛋白に対する精製モノクローナル抗体 （MAb) が活 性を低下させることから (Miura et al. , Exp. Cell Res. , 1982, 141, 409-420 ) 、 その利用についても検討を行った。 MAbで処理したセンダイウィルスベクター は赤血球凝集反応を全く示さず、 そのへマグルチュン活性は完全にプロックされ て、 細胞への遺伝子導入も認められなかった。 そこで、 新たに、 MAb分子に標的細 胞へ結合するリガンド分子を導入したところ、 このリガンド結合 MAbで処理したセ ンダイウィルス （図 5 ) は、 赤血球凝集反応や溶血活性は示さなかったにもかか わらず （図 7、 1 0、 および 1 1 ) 、 リガンドが結合しうる標的細胞に対しては 遺伝子を高効率に導入し得た （図 8および 9 ) 。 標的細胞以外には遺伝子導入が できなかつたことや、 過剰の競合物質存在下で遺伝子導入能が消失したことから (表 4 ) 、 修飾ベクターのへマグルチニン活性が完全に消失しているにもかかわ らず、 標的とする細胞にのみ高効率で遺伝子導入が可能となることを裏付ける結 果を得た。
組み込むリガシド分子をターゲットとする細胞に高発現しているレセプターに 応じた分子に変更することで、 種々の細胞に対して導入可能なシステムになると 考えられる。
また、 このシステムは、 使用直前に混和することで容易に調製できるため、 非 常に使いやすいシステムであることも特徴としてあげられる。
このような技術は SeVのエンベロープ構成蛋白から再構成した微粒子製剤にも適 用できる。 この場合、 先述したような HN蛋白を還元する必要はなくなると考えら れる。 SeVを還元せずにそのまま可溶ィヒを行い、 必要な薬物を封入した微粒子を再 構成させた後、 この技術を適用すれば、 還元【こよる F蛋白への影響を与えることな く、 より融合能の高い運搬体が形成されると考えられる。
本発明は、 へマグルチニン活性が低減した薬剤または遺伝子運搬組成物に関し 、 より具体的には、 (1) マイナス鎖 RNAウィルスのへマダルチュン活性を有するエンベロープ蛋白質 を有する細胞膜を含む、 薬剤または遺伝子運搬組成物であって、 （a) 該蛋白質 に化合物が付加されており、 （b) 該化合物が付カ卩されていない場合に比べへマ グルチニン活性が低下しており、 （c) 該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ 導入する能力を有する、 組成物、
(2) さらに （d) 該ィ匕合物が付加されていない場合に比べ赤血球に対する溶血 活性が低下している、 （1) に記載の組成物、
(3) 該組成物が、 該マイナス鎖 RNAウィルスの感染性ウィルス粒子を含む組成物 である、 （1) または （2) に記載の組成物、
(4) 該組成物が、 該マイナス鎖 RNAウィルスの不活ィ匕ウィルスまたは該ウィルス のエンベロープの部分を含む、 （1) または （2) に記載の組成物、
(5) 該マイナス鎖 RNAウィルスが、 パラミクソウィルス科ウィルスである、 （1 ) から （4) のいずれかに記載の組成物、
(6) 該パラミクソウィルス科ウィルスが、 センダイウィルスである、 (5) に 記載の組成物、
(7) 該蛋白質に付カ卩されているィ匕合物が分子量 1， 800以上である、 （1) から （ 6) のいずれかに記載の組成物、
(8) 該蛋白質に付加されている化合物が分子量 4, 500以上である、 （7) に記载 の組成物、
(9) 該蛋白質に付加されている化合物が分子量 16， 000以上である、 （8) に記 載の組成物、
(10) 該蛋白質に付 ¾されている化合物がポリエチレングリコールである、 （ 1) から (9) のいずれかに記載の組成物、
(11) 該蛋白質が、 さらにポリエチレンィミンと共に複合体を形成している、 (1) から （10) のいずれかに記載の組成物、
(12) 該蛋白質が、 細胞に結合する化合物と共に複合体を形成している、 （1 ) から （1 1) のいずれかに記載の組成物、
(1 3) 該細胞に結合するィ匕合物が、 該蛋白質に付加されている化合物と結合し ている、 （1 2) に記載の組成物、
(1 4) 該蛋白質に付加されている化合物力 該蛋白質に結合する抗体またはそ の断片である、 （1 2) または （1 3) に記載の組成物、
(1 5) 該細胞に結合するィ匕合物が、 細胞表面の受容体のリガンドである、 （ 1 2) から （14) のいずれかに記載の組成物、
(1 6) 該リガンドが葉酸である、 （1 5) に記載の組成物、
(1 7) マイナス鎖 RNAウ^ルスのへマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白 質に結合する抗体またはその断片であって、 細胞に結合する化合物が結合してい る抗体またはその靳片、
(1 8) 抗体またはその断片が F(a ） 2である、 （1 7) に記載の抗体またはその 断片、
(1 9) 細胞に結合するィヒ合物が細胞表面の受容体のリガンドである、 （1 7) または （1 8) に記載の抗体またはその断片、
(20) 該リガンドが葉酸である、 （1 9) に記載の抗体またはその断片、 (2 1) (a) マイナス鎖 RNAウィルスのへマダルチュン活性を有するェンベロー プ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、 細胞に結合する化合物が結合 している抗体またはその断片、 および （b) 該エンベロープ蛋白質を含む薬剤ま たは遺伝子運搬組成物、 を含む薬剤または遺伝子運搬キット、 を提供するもので あ o。
本発明は、 マイナス鎖 RNAウィルスのへマダルチュン活 14を有するエンベロープ 蛋白質を有する細胞膜を含む薬剤または遺伝子運搬組成物で ¾つて、 （a) 該蛋 白質に化合物が付加されており、 （ b ) 該化合物が付加されて!/ヽない場合に比べ へマグルチュン活性が低下しており、 (c) 該薬剤または遺伝子を標的とする細 胞へ導入する能力を有する組成物を提供する。 本発明の組成物は、 マイナス鎖 RNA PC漏應 27
8
ゥィルスのへマダルチ-ン活性を有するェンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含 む複合体である。 このような複合体は、 例えば感染性ウィルス粒子であってもよ いし、 不活ィ匕したマイナス鎖 RNAウィルス、 または例えば再構成リボソームなどの 鎖匪ゥィルスの破砕物のェンべ口ープ成分を含む複合体であってもよい 感染 1·生ウィルス粒子は、 細胞への感染を介して該細胞内にウィルスに含まれる 薬物または遺伝子を細胞内に運搬する。 特にウィルスゲノムに外来遺伝子を組み 込むことにより、 感染性ウィルス粒子が感染した細胞内においてウィルスゲノム から該遺伝子を発現させることができる。 感染性ウィルスは、 複製能を有する （r eplication competent) ウィルスであってもよく、 あるいは複製能を有さない （r eplication deficient) ウィルスであってもよい。 複製能を有するウィルスとは 、 該ウィルスが宿主細胞に感染した場合、 該細胞においてウィルスが複製され、 感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。
マイナス鎖 RNAウィルスは、 細胞内において該ウィルスのゲノム墜を、 このゲ ノム RNAの転写および複製に必要なウィルス蛋白質の共存下で転写させることによ り再構成させることができる。 組み換えマイナス鎖腿ウィルスの再構成は公知の 方法を利用して行うことができる （国際公開番号 W097/16539; 国際公開番号 TO9 7/16538； 国際公開番号 W000/70055 ; 国際公開番号 WOOO/70070; Durbin, A. P. et ah , 1997, Virology 235： 323 - 332; Whelan, S. P. et al. , 1995, Proc. Na tl. Acad. Sci. USA 92： 8388 - 8392; Schnell. M. J. et al. , 1994, EMBO J. 13 ： 4195-4203； Radecke, F. et al. , 1995, EMBO J. 14： 5773 - 5784; Lawson, N. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92： 4477-4481； Garcin, D. et al.， 1 995, EMBO J. 14： 6087-6094； Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1 : 569-579 ； Baron, M. D. and Barrett, T. , 1997, J. Virol. 71 : 1265-1271； Bridgen, A . and Elliott, R. M. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93： 15400 - 15404; H asan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78 : 2813 - 2820， 1997； Kato, A. et al. , P T/JP03/05527
9
1997， EMBO J. 16： 578 - 587 ; Yu， D. et al. , 1997, Genes Cells 2： 457-466) 。 これらの方法により、 パラインフルエンザ、 7j疱性口内炎ウィルス、 狂犬病ゥ ィルス、 麻疹ウィルス、 リンダ一ペストウィルス、 センダイウィルスなどを含む マイナス鎖 RNAウィルスベクターを DNAから再構成させることができる。
外来遺伝子を含む組換えウィルスベクターは、 ウィルスベクターゲノムに外来 遺伝子を揷入することによって得られる。 外来遺伝子としては、 標的とする細胞 において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。 外来遺伝子は天然型 蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、 また天然型蛋白質と同等の機能を有 する蛋白質をコードする限り、 欠失、 置換または揷入により天然型蛋白質を改変 した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。 あるいは、 天然型蛋白質の欠失 型や人工的な蛋白質などであってもよい。 例えば、 遺伝子治療などを目的とする 場合には、 ウィルスベクターの铸型となる DNA (ウィルスベクター DNA) に対象と なる疾患の治療用遺伝子を挿入し、 これを転写させてウィルスの再構成を行う。 ウィルスベクター DNAに外来遺伝子を導入する場合は、 例えば、 センダイウィルス ベクター DNAにおいては、 転写終結 (E)配列と転写開始 (S)配列との間などに、 6の 倍数の塩基数を有する配列を揷入することが望ましい （Journal of Virology, Vo 1. 67, No. 8， 1993, p. 4822-4830) 。 パラミクソウィルス等においては、 外来 遺伝子は、 ウィルスの各蛋白質のオープンリーディングフレーム （0RF) (例えば NP、 P、 M、 F、 HN、 および L蛋白質の ORF) の前および/または後ろに揷入すること ができる。 前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、 外来遺伝子の前また は後ろに適宜 E- I-S配列 （転写開始配列一介在配列一転写終結配列） またはその 部分を揷入し、 各遺伝子の間に E - I-S配列のュニットが配置されるようにする。 回収したウィルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。 精製方法 は濾過、 遠心分離、 およびカラム精製等を含む公知の精製'分離方法またはその 組み合わせにより行うことができる。 「実質的に純粋」 とは、 ウィルスが、 それ が存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。 典型的には、 実 質的に純粋なウィルスベクターは、 試料中に含まれる全蛋白質のうち、 ウィルス ベタター由来の蛋白質の割合が 50%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 8 0%以上、 さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。 マイナス鎖 RNAウィルスの具体的な精製方法としては、 例えばセルロース硫酸エス テルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法 （特公昭 62 - 30752号 公報、 特公昭 62- 33879号公報、 およぴ特公昭 62- 30753号公報） 、 およぴフコース 硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 （TO97/32010) 等を例示 することができる。
(不活ィ匕したウィルスまたは破枠ウィルスの再構成生成物は、 細胞に薬物または 遺伝子を導入するためのトランスフヱクション試薬として用いられる。 マイナス 鎖 RNAウィルスの不活化は、 例えは UV照射により行うことができる。 また、 HVJ (H emmaggulutinating Virus of Japan) -リボソームなど、 不活化ウィルスを用いた リボソームの製造方法は、 例えば震盪と超音波により調製することができる （ 「 ライフサイエンスにおけるリポソーム/実験マニュアル」 シュプリンガー *フエ アラーク東京 (1992) pp. 282〜287参照） 。 また不活性ィヒしたセンダイウィルス粒 子、 またはリボソーム及び核酸を混合した組成物 （膜融合リボソーム） が報告さ れている （金田安史： BI0THERAPY，8, 1265 (1994) ) 。 あるいは破砕ウィルスの再構 成は、 例えば、 ウィルス可溶ィ匕物からリボソームを再構成させ、 いわゆるビロソ ーム （virosome) を調製することにより実施できる （Bagai et al. , 1993, Bioch em. Biophys. Acta 1152, 15-25) 。 具体的には、 マイナス鎖腿ウィルスを Trit on X- 100 などの界面活性剤で可溶ィ匕した後、 不溶性の RNPを遠心除去する。 ェン ベロープおよびエンベロープ蛋白質を含む可溶化液から界面活性剤を除くことに より粒 ¥を再構成させ、 ビロソームを調製することができる。 ビロソームは粒子 径を均一化するために、 遠心分離 （例えば 12000rpm, 10分） により粒子サイズが 揃ったピロソームを分離して回収することができる。
感染性ウィルス粒子を含む組成物においては、 その感染性ウィルス粒子は、 マ イナス鎖 R Aウィルスであってもよく、 あるいはャィナス鎖 RNAウィルスのべマグ ルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を持つ別のウィルスであってもよい。 異種ウィルスのエンベロープ蛋白質でシユードタイプィ匕されたウィルスはよく知 られている （国際公開番号 TO01/92508) 。 マイナス鎖腿ウィルスのェンベロー プ蛋白質を含むシユードタイプウィルスを調製するには、 例えば、 マイナス鎖 RNA ウィルスの不活化ウィルスまたは該ウィルスのエンベロープ蛋白質を持つビロソ ームなどを調製し、 これを他のウィルスに融合させることにより製造することが できる。 あるいは、 マイナス鎖 RNAウィルスのへマグルチニン活性を有するェンべ 口ープ蛋白質を発現する発現べクターを、 他のウィルスのパッケージング細胞で 発現させることにより製造することができる。 該他のウィルスとしては、 例えば レトロウイルスが挙げられ、 具体的にはモロニ一マウス白血病ウィルス （Moloney
Murine Leukaemia Virus ; MoMLV) およぴマウス幹細胞ウィルス （Murine Stem C ell Virus ; MSCV) などを含むオンコウィルス亜科 (Oncovirus) に属するレトロ ウィルス （本発明においてオンコウィルスと呼ぶ） 、 およぴヒト免疫不全ウィル ス （human immunodeficiency virus ; HIV) (例えば HIV1または HIV2) 、 サル免疫 不全ウィルス (simian immunodeficiency virus; SIV) 、 ネコ免疫不全ウイノレス
(FIV) 、 マエディ · ビスナウィルス、 ゥマ伝染性貧血ウィルス （EIAV) 、 ャギ関 節炎脳炎ウィルス （CAEV) などを含むレンチウィルス亜科 (Lent i virus) に属す るレトロウイルス （本発明においてレンチウィルスと呼ぶ） が挙げられる。 HIV- 1 としては、 全てのメジャー （M) サブタイプ （Aから Jを含む） 、 Nおよび outlier
(0) が含まれる （Hu， D. J. et al. , JAMA 1996； 275: 210-216; Zhu, T. et al . , Nature 1998, 5； 391 (6667)： 594-7； Simon, F. et al.， Nat. Med. 1998, 4 ( 9)： 1032-7) 。 SIV単離株としては、 SIVagm、 SIVcpz、 SIVmac, SIVmnd, SIVsnm、 SIVsyk等が例示できる。 また、 スプーマウイ ス （Spumavirus) に由来するレト ロウィルスなどであってもよく、 例えばフォーミーウィルス （Foamyvirus) が含 まれる （DE4318387; W09607749; Virology (1995) 210, 1， 167-178； J. Virol. (1996) 70, 1, 217-22) 。 フォーミーウィルスに由来するウィルスベクターは、 ヒト細胞への外来遺伝子導入、 特に遺伝子治療およぴ組換えワクチンの投与など に利用され得る。
シユードタイプウィルスベクターは、 例えばマイナス鎖 RNAウィルスのへマグル チュン活性を有するエンベロープ蛋白質に加えて、 該ウィルスの他のェンベロー プ蛋白質をさらに含むことができる。 例えば、 パラミクソウィルスの HNおよび F蛋 白を持つシユードタイプウィルスベクターで、 H蛋白質に化合物が付加されたべ クタ一を含む組成物は、 本発明に含まれる。 またマイナス鎮 RNAウィルスのへマグ ルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を含むウィルスベクターは、 他のウイ ルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができ、 例えばこのような蛋白 質として、 ヒト細胞に感染するウィルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適で ある。 このような蛋白質としては、 特に制限はないが、 レトロウイルスのアンフ オト口ピックエンベロープ蛋白質、 水疱性口内炎ウィルス （VSV) の G蛋白質など が挙げられる。 また、 ヘルぺスウィルス科の蛋白質としては、 例えば単純へルぺ スウィルスの gB、 gD、 gH、 gp85蛋白質、 EBウィルスの gP350、 gP220蛋白質などが 挙げられる。 へパドナウィルス科の蛋白質としては、 B型肝炎ウィルスの S蛋白質 などが挙げられる。 レトロウイ スのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質と しては、 例えばマウス白血病ウィルス （MuLV) 4070A株由来のエンベロープ蛋白質 を用いることができる。 また、 MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いるこ ともできる （例えば pCL-lOAl (Imgenex) (Naviaux, R. K. et al. , J. Virol. 70： 5701-5705 (1996) ) 。 ェコトロピックエンベロープ蛋白質としては、 例えばモロ ニーマウス白血病ウイノレス （MoMuLV) 由来のエンベロープ蛋白質を用いること力 S できる。 水疱性口内炎ウィルス G蛋白 （VSV- G) 'としては、 例えば Indiana血清型 株 （J. Virology 39： 519-528 (1981) ) 由来の蛋白を用いることができる。 これ ら以外にも、 所望の株由来の蛋白質を用いることができる。
本発明においてマイナス鎖 RNAウィルスとは、 マイナス鎖 （ウィルス遺伝子をコ 一ドするセンス鎖に対するアンチセンス鎖） の RNAをゲノムとして含むウィルスで あって、 へマグルチ二ン活性を有するエンベロープ蛋白質を有するウィルスを言 う。 マイナス鎖 RNAはネガティブ鎖とも呼ばれる。 マイナス鎖 RNAウィルスとして は、 例えばパラミクソゥィルス科（Paramyxoviridae)のセンダイウィルス（Sendai virus) N ニュー刀ッスノレ病ウイノレス (Newcastle disease virus八 おたふく力、せゥ イノレス (Mumps virus)、 麻疼ウイノレス (Measles virus)、 オスレトミクソゥイノレス科 ( ス科 (Rhabdoviridae)の水痛†生口内炎ウイノレス（Vesicular stomatitis virus)、 狂 犬病ウィルス（Rabies virus)等が挙げられる。
本発明においてへマダルチュン活性を有するウィルスエンベロープ蛋白質は、 好ましくは一本鎖マイナス鎖 RNAウィルスのウィルスエンベロープ蛋白質である。 一本鎖マイナス鎖 RNAウィルスは非分節型 （non- segmented) マイナス鎖 RNAウィル スとも目われ、 ノ、フ クソウイノレス (Paramyxoviridae； Paramyxovirus, Morbill i virus, Rubulavirus, およぴ Pneumovirus属等を含む) 、 ラフドウイノレス (Rhab doviridae； Vesiculovirus, Lyssavirus, ぉょぴ
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、 フィロウイノレス （Firoviridae) 、 ォノレトミクソゥイノレス （Orthomyxoviridae; In fuluenza virus A, B， C， およぴ Thogoto-like viruses属等を含む） 、 ブ -ャゥ ィルス (Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovi rus属等を含む） 、 ァレナウィルス （Arenaviridae) などの科に属するウィルスが 含まれる。 へマダルチュン活性を持つエンベロープ蛋白質としては、 具体的には 、 パラミクソウィルスの HN蛋白質、 オルソミクソウィルスの HA蛋白質、 インフル ェンザウィルスの HA蛋白質、 ブュャウィルスの G1蛋白質、 ラブドウィルスの G蛋白 質、 フイロウィルスの VP1蛋'白質などが拳げられる。 ' 本発明においてへマダルチュン活性を有するウィルスエンベロープ蛋白質は、 さらに好ましくはパラミクソウィルスのウィルスエンベロープ蛋白質である。 「 パラミクソウィルス」 とは、 ノヽ。ラミクソウィルス科 (ParamYxoviridae)に属するゥ ィルスを指す。 パラミクソウィルスとしては、 例えばパラミクソウィルス （Param yxovirus) 属、 モノレビリウィルス （Morbillivirus) 属、 およびルプラウィルス ( Rubulavirus) 属、 ニューモウイノレス (Pneumovirus) 属、 ぉょぴメタニューモウ ィルス （Metapneumovirus) 属が含まれ、 具体的にはセンダイウィルス（Sendai vi ms)、 ニューカツスノレ病ウイノレス (Newcastle disease virus) s おたふく力ぜウイ ルス (Mumps virus)、 麻疼ウィルス (Measles virus)、 RSウィルス (Respiratory sy ncytial virus)、 牛疫ウィルス (rinderpest virus 、 システンハーウイノレス (dist emper virus)、 サルパラインフルエンザウイルス （SV5) 、 ヒ トパラインフルェン ザウィルス 1, 2， 3型等が挙げられる。 パラミクソウィルスのへマダルチュン活性を 有するエンベロープ蛋白質は、 具体的には HN蛋白質が挙げられる （H蛋白質とも言 われる） 。 本発明においてへマグルチニン活性を有するウィルスエンベロープ蛋 白質は、 さらに好ましくはパラミクソウィルス属、 モルビリウィルス属、 および ルブラウィルス属を含むパラミクソウィルス亜科のウィルスであり、 さらに好ま しくはパラミクソウィルス属ウィルスのウィルスエンベロープ蛋白質である。 へ マグルチニン活性を有するウィルスエンベロープ蛋白質は、 最も好ましくはセン ダイウィルスの HN蛋白質である。 各ウィルスは、 野生株、 変異株、 ラボ継代株、 および人為的に構築された株などが含まれる。 例えば Z株由来のセンダイウィルス の HN蛋白質を好適に用いることができる。 センダイウィルスの HN遺伝子の塩基配 列は、 GenBankァクセッション番号 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M 69046, X00586, X02808, X56131 などに記載されている。
また、 ウィルスのへマグルチュン活性を有するエンベロープ蛋白質として、 ォ ルトミクソウィルス科ウィルスの HA蛋白質を用いることも好ましい。 例えば、 ィ ンフルェンザウィルスのエンベロープ蛋白発現プラスミドを用いて製造されたシ ユードタイプウィルスは、 ヒト細胞を含めた広い哺乳動物細胞に感染可能である 。 インフルエンザウイルスエンベロープには所望の単離株由来のものが用いられ 得る。 インフルエンザウイルスの buddingにおいては、 ノィラミニダーゼがシアル 酸との結合を切断する役割を担っている。 このため、 HAシユードタイプウィルス の作製においては、 HAに化合物を付加した前、 中、 または後の時期にノィラミニ ダーゼで処理することで感染性ウィルスを得ることができる。 あるいは、 ノイラ ミニダーゼ活性を有する蛋白質を共存させたウィルスベクターを作製することに よって、 自動的にシァノレ酸との結合を切断させることができる。 この場合、 パラ ミクソウィルスの H蛋白質などの、 ノイラミニダーゼ活性を有するウイ/レスェン ベロープ蛋白質を用いることが特に好適である。 このように本発明は、 オルトミ クソウィルス科ウィルスの HAとパラミクソウィルス科ウィルスの HN蛋白質の両方 でシユードタイプ化されたウィルスベクターで、 これらのいずれかまたは両方に ィ匕合物が付加されており、 へマダルチェン活性が低下したウィルスを含む組成物 を提供する。
ウィルスエンベロープ蛋白質は、 野生型ウィルスが持つインタクトな蛋白質で あってもよいし、 天然または人為的に変異が導入されていてもよい。 例えば、 こ れらのエンベロープ蛋白質において細胞表面の抗原分子となりうる抗原提示ェピ トープ等を解析し、 これを利用して抗原提示能を弱めた蛋白質を用いてウィルス を作成することも可能である。 また、 病原性ウィルス等における弱毒株由来のェ ンべロープ蛋白質などを用いることもできる。
例えば、 へマグルチニン活性を有するウィルスエンベロープ蛋白質や、 他のェ ンべロープ蛋白質の細胞質側領域を欠失、 置換、 およひ 7または付加により改変し た蛋白質を用いて、 より高い遺伝子導入能を有するベクターを製造することが可 能である。 本宪明は、 天然に存在するへマダルチュン活性を有するウィルスェン ベロープ蛋白質の細胞質側領域の一部または全部が、 置換、 欠失、 およひ 7または 付カ卩により改 された蛋白質を含むウィルスであって、 へマダル 二ン活性を有 するウィルスエンベロープ蛋白質に化合物が付カ卩されているベクターを含む組成 物に関する。 具体的には、 例えばパラミクソウィルスの HN蛋白質の細胞質側領域 を欠失させたり、 他の膜蛋白質 （例えばレンチウィルスを含むレトロウイルスの エンベロープ蛋白質） の細胞質側領域で置換または付加した改変蛋白質は、 感染 効率の高いシユードタイプレトロウイルスベクターを製造するために好適に用い られる。
本発明においてへマグルチ二ン活性とは、 へマグルチネーション （Hemagglutin ation, HA) を起こす活性、 すなわち赤血球を凝集させる活性を言う。 へマグルチ ニン活性は公知の方法により試験することができる （国立予防衛生研究所学友会 編， 改訂二版 ウィルス実験学総論， pp. 214-225, 丸善株式会社） 。 赤血球とし ては、 例えばニヮトリ （ヒョコおよぴ成鶏を含む） 、 ガチョウ、 ラット、 モルモ ット、 ァカゲザル、 ミドリザル、 またはヒトなどの赤血球が用いられ得る。 反応 温度は、 0° (：、 4°C、 室温、 または 37°Cなど、 蛋白質により適した条件で行う。 具 体的には、 へマグルチニン活性の測定は、 例えば 「endo- point希釈法」 （Kato, A. et al.， 1996, Genes Cells 1： 569 - 579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y. , Hemaggulut inat ing virus of Japan - liposome- mediated gene delivery to vascu lar cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Metho d in Molecular Medicine: Humana Press : pp. 295-306, 1999) により実施する ことができる。
本発明の組成物は、 マイナス鎖 RNAゥィルスのへマグルチ-ン活性を有するェン ベロープ蛋白質に化合物が付加されており、 これにより該ィ匕合物が付加されてい ない場合に比べへマダルチ-ン活性が低下している。 本発明にお ヽて活†生の低下 は有意に低下していればよく例えば統計学的に有意 （例えば有意水準 5%またはそ れより有意） に低下している場合が含まれる。 また活性が完全に欠失 （または検 出限界未満） している場合も含まれる。 本発明の組成物は、 該ィ匕合物が付カ卩され ていない場合の対照組成物と比べ、 へマグルチニン活性が好ましくは 1/2以下、 よ り好ましくは 1/3以下、 より好ましくは 1/5以下、 より好ましくは 1/10以下、 より 好ましくは 1/20以下、 より好ましくは 1/50以下、 より好ましくは 1/100以下、 より 好ましくは 1/200以下、 より好ましくは 1/500以下、 より好ましくは 1/1000以下に 低下している。 これに対して本発明の組成物が持つ薬剤または遺伝子を細胞へ導 入する能力は、 該へマグルチニン活性の低下に比べて高く維持されている。 すな わち、 本発明の組成物が持つ薬剤または遺伝子を細胞へ導入する能力は、 化合物 が付加されていな 、対照組成物の場合と比べ低下の度合 1、が、 該へマダルチ-ン 活 1·生の低下の度合いに比べて少ないか、 より好ましくは低下していないか上昇し ている。
また本発明の組成物は、 好ましくは溶血活性も有意に低下している。 溶血活性 は、 血液に被検組成物を添加し静置後、 遠心して血球成分を除き、 溶出したへモ グロビンを吸光度測定により測定して検出することができる （実施例参照） 。 本 発明の組成物は、 該化合物が付加されていない場合の対照組成物と比べ、 溶血活 性が好ましくは 70%以下、 より好ましくは 60%以下、 より好ましくは 1/2以下、 よ り好ましくは 1/3以下、 より好ましくは 1/5以下、 より好ましくは 1/10以下、 より 好ましくは 1/20以下、 より好ましくは 1/50以下に低下している。
本発明の組成物は、 へマグルチニン活性が低下しており、 好ましい態様におい ては溶血活性も低下しているが、 薬剤または遺伝子を細胞に導入する能力を保持 している。 例えばマイナス鎖 RNAウィルス、 あるいは該ウィルスのエンベロープ成 分を含む組成物にぉ ヽては、 該組成物は標的細胞との細胞膜融合能を有しており 、 これにより薬剤または遺伝子を標的細胞に送達される。 細胞膜融合能とは、 本 発明の組成物に含まれる複合体 （運搬体） が細胞膜に吸着した後、 該複合体の持 つ融合活性により、 細胞内にその構成成分が組み込まれる能力を言う。 この活性 は、 マイナス鎖 RNAウィルスのエンベロープに含まれる、 細胞融合を起こすェンべ ロープ蛋白質であるフュージョン （F) 蛋白質の働きによる。 本発明の組成物に含 まれる細胞膜には、 化合物が付加されたへマグルチ二ン活性を有するェンべ口一 プ蛋白質に加え、 好ましくはマイナス鎖 RNAウィルスの F蛋白質も含んでいる 細胞との融合能は、 例えば、 1 . 赤血球の溶血を指標として検出する。 2 . 膜 に蛍光物質を組み込んでおき、 融合による膜の流動により蛍光物質が希釈され蛍 光強度の変化が起きることを利用して検出する。 あるいは 3 . 内水層に薬物を封 入したリボソームを細胞膜のモデルとして、 その漏出を指標として検出する、 な どの方法により検出することができる。
また、 上記のようにレトロウイルスなど他のウィルスにおけるシユードタイプ ウィルスとして本発明の組成物を調製する場合は、 それぞれのウィルスのェンべ ロープ蛋白質により、 ウィルス内の薬剤または遺伝子が細胞に導入される能力が 保持されている。 薬物または遺伝子の細胞への導入能力は、 細胞内に導入された これらの薬剤または遺伝子を検出することにより確認することができる。 薬剤で あれば、 例えば標識された薬剤の細胞内への取り込みを検出したり、 あるいは生 理活性物質を取り込ませ、 これによる細胞の形質の変化を検出することによって 検出することができる。 遺伝子であれば、 細胞内における該遺伝子の発現を、 RT - PCR、 ノ一ザンブロットハイブリダイゼーション、 免疫沈降、 ウェスタンブロット 等の方法により RNAレベルまたは蛋白質レベルで検出することができる。 また、 生 理活性蛋白質をコードする遺伝子を取り込ませ、 該蛋白質による細胞の形質の変 化を検出することによって検出することができる。
また本発明の組成物は、 好ましくは血中安定性が有意に上昇している。 血中安 定性の上昇とは、 本発明の組成物が血中に置かれたときに、 薬剤または遺伝子の 運搬能力の低下の度合いが小さくなることを言う。 運搬能力の低下が少ないほど 血中安定性は高い。 血中安定性の上昇は、 本発明の組成物を血液と共にインキュ ペートし、 その後の該組成物の薬剤または遺伝子の運搬を測定し、 ィ匕合物が付加 されていな 、場合の対照組成物と比べることにより知ることができる （実施例参 照） 。 運搬能力は、 例えば薬剤であればその薬剤の活性の大きさであってよく、 遺伝子でればその遺伝子の発現レベルであってよい。 遺 子の発現は、 例えば転 写産物 (mRNA) または翻訳産物 （蛋白質） を直接または間接に検出することによ り決定することができる。 生理活十生を持つ蛋白質の検出は、 その蛋白質の活性の 測定により行うことができる。 本発明の組成物は、 該化合物が付加されていない 場合の対照組成物の運搬能力の低下の度合 、と比べ、 薬剤または遺伝子の運搬能 力の低下の度合 V、が好ましくは 70%以下、 より好ましくは 60%以下、 より好まし くは 1/2以下、 より好ましくは 1/3以下、 より好ましくは 1/5以下、 より好ましくは 1/10以下に縮小している。 本発明の組成物は、 へマグルチニン活性に対する薬剤 または遺伝子運搬能力が、 未修飾の対照組成物に比べ上昇していることが好まし い。
本発明においてへマダルチ-ン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物が付 加されているとは、 該蛋白質と該ィ匕合物とが結合していることを言う。 結合は共 有結合または非共有結合であってよい。 非共有結合としては、 例えば水素結合、 配位結合、 イオン結合、 疎水相互作用 （疎水結合） 、 および分子間力 （ファンデ ルヮールスカ） などが挙げられる。 該蛋白質と該化合物は、 もともとは分離して 存在していたが、 結合により該ィ匕合物が該蛋白質に付カ卩されたものであってよい 。 へマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質への化合物の付加は、 例えば 架橋による共有結合形成により行うことができる。 架橋は、 所望の官能基を介し て形成させることができる。 官能基としては、 例えば、 水酸基、 アミノ基、 アル デヒド基、 カルボキシル基、 チオール基、 ヒドロキシル基、 シラノール基、 アミ ド基、 エポキシ基、 サクシ二ルイミド基、 フエノール基等が挙げられるが、 これ らに制限されない。 共有結合の例としてエステル結合、 エーテル結合、 アミノ結 合、 アミ ド結合、 スノレフィ ド結合、 ィミノ結合、 ジスルフィド結合等が挙げられ る。 該蛋白質と該ィヒ合物は、 好ましくは非ペプチド結合で結合されている。 共有 結合法としては、 臭化シアン活性ィ匕法、 酸アジド誘導体法、 縮合試薬法、 ジァゾ 法、 およびアルキルィ匕法などが挙げられる。
本発明の薬剤'または遺伝子運搬組成物の製造は、 マイナス鎖 RNAウィルスのへマ グルチ二ン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物を接触させる工程、 および 該蛋白質と該化合物を結合させる工程を含む方法により実施することができる。 化合物は、 該エンベロープ蛋白質のェンべロープ外側にあたる領域に結合させる 。 このためには、 特に、 該蛋白質に化合物を接触させる工程を、 該蛋白質を含む ウィルス粒子に該化合物を接触させることにより行うことが好ましい。 これによ り、 へマグルチニン活性に関与する該蛋白質のウィルス表面に露出した領域に特 異的に化合物を付加することができる。 特に本発明において、 ウィルス表面にへ マグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に加え、 他のエンベロープ蛋白質 が存在する場合でも、 化合物の架橋によりへマグルチニン活性を有するェンベロ ープ蛋白質に優先的に化合物が付加され、 有意にへマグルチニン活性が低下する ことが判明した。 従って、 例えば通常通りの方法で生産された、 化合物が付加さ れていないウィルスに化合物を添加し、 該化合物を該ウィルスに付加する工程を 実施することにより、 簡単にへマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に 化合物が付加されたウイルスを製造することができる。
へマグルチ二ン活性を有するェンベロープ蛋白質に付加する化合物としては、 該蛋白質のへマグルチュン活性を有意に阻害する限り制限されない。 好ましくは 有意な生物毒性を持たず、 蛋白質に付加された後は化学的に安定な化合物である ことが好ましい。 また、 非抗原性または抗原性が低いことが好ましい。 また、 付 加する化合物は水溶性であることが好ましい。 へマグルチニン活性を有効に阻害 するためには、 ィ匕合物の分子量は好ましくは 1, 600 (ダルトン； Da) 以上、 より好 ましくは 1， 800以上、 より好ましくは 1， 900以上、 より好ましくは 2, 000以上である 。 特に、 分子量が 2, 800以上、 より好ましくは 3， 800以上、 より好ましくは 4， 300以 上、 より好ましくは 4, 500以上、 より好ましくは 5, 000以上の化合物である。 また 分子量が 12, 000以上、 より好ましくは 14， 000以上、 より好ましくは 15, 000以上、 より好ましくは 16， 000以上、 より好ましくは 18， 000以上、 より好ましくは 20, 000 以上の化合物は、 へマダルチュン活性を特に顕著に阻害することができる。
付加する化合物としては各種のポリマーであってよく、 例えば有機化合物重合 体が挙げられる。 付加するィ匕合物は分子量にばらつきがあってもよく、 その場合 、 本明細書で言う付加する化合物の分子量とは平均分子量である。 分子量分散 （M W/Mn) は小さ
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しく、 例えば 5以下、 好ましくは 3以下、 より好ましくは 2 以下、 より好ましくは 1. 6以下、 より好ましくは 1. 4以下である。
具体的には、 天然高分子として、 例えば、 抗体、 ァノレブミン、 コラーゲン、 ゼ ラチン、 フイブリン、 レクチン、 へパリンなどの蛋白質またはその断片、 あるい は、 デキストラン、 シクロデキストリン、 硫酸デキストラン、 セルロース、 キチ ン、 キトサン、 アルギン酸などの多糖類、 さらには脂質を用いることができる。 また、 合成高分子として、 ポリ乳酸、 ポリリジン、 ポリスチレン、 ピラン重合体 、 ポリグルタミン酸、 ポリアクリルアミド、 ポリビュルアルコール、 ポリエチレ ングリコール、 スチレン一マレイン酸共重合体、 リジン一グルタミン酸共重合体 、 ポリヒドロキシェチルメタクリレート、 フイコー^/などを用いることができる 付加する化合物としては、 特にポリエチレングリコール （PEG) が挙げられる （ J. M. Harris, Polyethylene Glycol Cnemistry. Biotechnica丄 and Biomedical Applications", Plenum, New York, NY, 1992； J. M. Harris and S. Zalipsky, " Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol", ACS Books,
Washington, D. C. , 1997) 。 PEGは水溶性で毒性が低いまたはないため好適に用 いられる。 PEGとは、 下記の構造を有する化合物を言う。
- (CH2CH20)n- [化合物 1 ]
(ここで nは 2以上の自然数）
例えば代表的な PEGとしては、 以下の構造からなる化合物が挙げられる。
H0- (CH2CH20)n-H [化合物 2 ]
(ここで nは 2以上の自然数）
' PEGは所望の修飾体が含まれ、 例えば上記構造の末端はヒドロキシル基等から置 換されていてもよい。 例えば主鎖の一端のヒドロキシノレ基が置換されたモノメチ ルエーテル （mPEG) は、 本発明において好適に用いられる。 PEGは直鎖状であって もよく、 あるいは分枝を持つ PEGであってもよい。 例えば 1、 2、 3、 またはそれ以 上の側鎖を有する PEGを用いることができる。 側鎖はエチレングリコール構造を有 していてよい。 PEGは各種の分子量のものが入手可能であり、 例えば PEG2000 (平 均分子量 2000) 、 PEG3000 (平均分子量 3000) 、 PEG4000 (平均分子量 4000) 、 PEG5000 (平均分子量 5000) 、 PEG8000 (平均分子量 8000) 、 PEG10000 (平均分 子量 10000) 、 または PEG20000 (平均分子量 20000) などを好適に用いることが できる。 架橋のための官能基を持つ PEGを用いて、 へマグルチニン活性を有するェ ンべロープ蛋白質にこの PEGを付加することができる。
例えば、 末端に一級ァミノ基を有する PEGは、 ァシル化試薬で架橋することが可 能である （Buckmann, A. et al (1981) Makromol. Chem. 182 : 1379； Zalipsky, S . et al (1983) Eur. Polym. J. 19: 1177; Eidelman, 0. et al (1991) Am. J. P hysiol. 260 (Cell Physiol 29) :01094； Pillai, V. N. R. et al (1980) J. Org. Chem. 45: 5364) 。 あるいは、 N- hydroxysuccinimide (NHS) 活性化エステル、 活 性ィ匕カルボン酸おょぴアルデヒドなどを利用してより簡便に架橋させることがで きる。 具体的には、 PEGカルボン酸の NHSエステル、 としては例えば PEG- Succini midyl succinate^ PEG-Succinimidyl carbonate s PEG— Succinimidyl Propionate 、 およぴ PEG-Succinimidyl Butanoate などが挙げられる （Olson, K. et al, (1 997) J. M. Harris & S. Zalipsky Eds. , Poly (ethylene glycol) , Chemistry & Biological Applications, pp 170 - 181, ACS, Washington, DC.； Harris, J. M. and Kozlowski, A. , U. S. Patent 5, 672, 662) 。 また、 PEGの benzotriazole carb onate誘導体は、 蛋白質のァミノ基と安定なウレタン結合を形成する （Dolence, Eric K.， U. S. Patent 5, 650, 234) 。 また、 アルデヒド基を末端に有する PEGを用 いることもできる。 アルデヒド基は NHSエステルよりも穏やかな条件でァミンに反 ^させることができる。 たとえば PEG - Propionaldeiiydeなどを好適に用いること ができる （Harris, J. M. et al (1984) J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22 : 34 1； Kinstler, Olaf B. et al. , U. S. Patent 5, 824, 784； Wirth, P. et al (199 1) Bioorg. Chem. 19： 133) 。 また PEGの Maleimide誘導体はチオール基に架橋す ることができる (Goodson, R. J. & Katre, N. V. (1990) Bio/Technology 8 : 343； Kogan, T. P. (1992) Synthetic Comm. 22, 2417) 。 PEGの carboxymethyl-NHS誘 導体、 noiieucine - NHS誘導体、 tresylate誘導体、 epoxide誘辱体、 carbonyliraida zole誘導体、 および PNP carbonate誘導体などを用いることもできる。 特に、 PEG Tresylateおよび PEG Succinimidyl Propionateを好適に用いることができる。 化合物の結合は、 例えばへマダルチ-ン活性を有するェンベロープ蛋白質を含 むウィルス粒子を lmg蛋白/ ml程度の濃度で調製し、 付加したい化合物を 0. 1〜1 00mg、 好ましくは l〜50mg程度添加して結合させることができる。 例えば、 ウィル ス lmg蛋白に対して、 pH8. 5の緩衝液中で、 SPA - PEG5Kを l〜5mgを反応させること により、 また、 SPA - PEG20Kを 10〜20mg程度反応させることによりへマグルチニン 活性が有意に低下し、 細胞への薬剤または遺伝子導入能を維持させることができ る。 蛋白質への化合物の付加は、 反応に用いる化合物の量などの反応条件により 変化し得るが、 へマグルチニン活性が有意に低下し、 細胞への薬剤または遺伝子 導入能は維持されるように適宜調整される。
例えばマイナス鎖 RNAウィルスに化合物を付加する場合、 その化合物とウィルス との量比は、 化合物をモル数、 ウィルス量をタンパク量とした場合に 1〜： lO/z mol /mg蛋白質 （化合物/ウィルス比） 、 より好ましくは 2〜8 μ mol/mg蛋白質、 より好 ましくは 3〜8 μ mol/mg蛋白質、 例えば約 4 μ mol/mg蛋白質とすることができる。 薬剤または遺伝子を細胞に導入する能力を失わせないために、 付加する化合物 の分子量は好ましくは 100， 000以下、 より好ましくは 80， 000以下、 より好ましくは 60, 000以下、 より好ましくは 50, 000以下である。 特に分子量が 40, 000以下、 より 好ましくは 35, 000以下、 より好ましくは 30, 000以下、 より好ましくは 25, 000以下 、 より好ましく'は 20, 000以下のィ匕合物は該導入能力を維持しへマ 'ダルチ-ン活性 を特異的に低下させるのに好適である。
実施例 2 8に示すように、 へマグルチニン蛋白質を修飾した場合に薬剤または 遺伝子の導入能力は、 ポリエチレンィミン （PEI) などの脂肪族ポリアミンにより さらに修飾することにより顕著に改善できることが明らかとなった。 PEIとは、 下 記の構造を有する化合物を言う。
-(CH2CH2NH)n- [化合物 3 ]
(ここで nは 2以上の自然数）
例えばマイナス鎖 RNAウィルスの PEG修飾物に PEIを付加することにより、 遺伝子 導入能を有意に上昇させることができる。 この場合、 PEIとウィルスとの量比は、 化合物を重量、 ウィルス量をタンパク量とした場合に 0. 001〜1 (化合物/ウィル ス比） 、 より好ましくは 0. 01〜0.2、 より好ましくは 0.01〜0. 1 とすることがで きる。 PEIの平均分子量は例えば 25 kDa〜750 kDaのものを好適に用いることがで きるが、 これに限定されない。
また、 本発明において、 へマグルチニン蛋白質への化合物の付加により薬剤ま たは遺伝子の導入効率が低下または喪失する場合でも、 この蛋白質を含む複合体 に、 細胞に結合する活性を有する化合物を付加することにより導入効率を維持で きることが判明した。 これにより、 エンベロープ蛋白質に付加する化合物の分子 量は制限されずに、 本発明の薬剤または遺伝子運搬組成物を調製することが可能 となった。 本発明は、 マイナス鎖 RNAウィルスのへマグルチニン活性を有するェン ベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、 薬剤または遺伝子運搬組成物であって、
( a ) 該蛋白質に化合物が付カ卩されており、 （b ) 該化合物が付加されていない 場合に比べへマグルチニン活性が低下しており、 （c ) 該蛋白質が細胞に結合す る活性を有する化合物と共に形成した複合体を含み、 （d) 該薬剤または遺伝子 を標的とする細胞へ導入する能力を有する、 組成物を提供する。 へマグルチニン 活性を阻害して、 遺伝子の導入を阻害する化合物を結合した場合も、 その化合物 にさらにリガンドを組み入れることで、 へマグルチ二ン活性を阻害して、 遺伝子 導入は維持することができる。 リガンドとは、 細胞表面の受容体に結合し受容体 の機能を活性化する化合物である。 例えば、 抗体の F(ab' ) 2 断片 （分子量約 50kDa ) を用いた場合、 結合量を少なく調節すれば、 へマダルチュン活性の残存に応じ たウィルスベクターの遺伝子導入能を維持することができるが、 細胞に結合する 活性を有するリガンド （葉酸） を抗体に結合することにより、 へマグルチニン活 性を完全に阻害した場合でも、 ベクターの遺伝子導入能を劇的に向上させること が可能である （実施例参照） 。
細胞に結合する活性を有するィ匕合物が、 へマグルチ二ン活性を有するェンベロ ープ蛋白質と共に複合体を形成しているとは、 該化合物と該蛋白質が、 共有結合 または非共有結合により直接または間接 （例えば他の化合物を介して） に結合し ていることを言う。 結合は共有結合でも非共有結合でもよい。 例えば、 へマダル チュン活性を有するエンベロープ蛋白質と細胞に結合する活性を有する化合物と を有する細胞膜を含む組成物などであってよい。 細胞に結合する活性を有する化 合物は複合体の表面に露出していることが必要であり、 例えば該複合体がウィル ス粒子であれば、 該蛋白質と該ィヒ合物がウィルスエンベロープ表面に存在してい るものであってよく、 該複合体がリボソームであれば、 該リボソーム表面に該蛋 白質と該化合物が存在しているものであってよい。 細胞に結合する活性を有する 化合物を該複合体に結合させるには、 例えば該化合物を該複合体に含まれる所望 のエンベロープ蛋白質に架橋したり、 あるいは好ましくはへマグルチニン活性を 有するエンベロープ蛋白質に架橋させることができる。 架橋は、 上記と同様に所 望の官能基を利用して形成させることができる。 あるいは、 該化合物が蛋白質で あれば、 膜蛋白質としてエンベロープに発現させたり、 該複合体に含まれるェン ベロープ蛋白質との融合蛋白質として発現させることができる。 好ましい態様に おいては、 細胞に結合する活性を有する化合物は、 へマダルチュン活性を有する エンベロープ蛋白質に付加されている化合物と共有結合または非共有結合により 直接結合しているカゝ、 あるいは同一のィ 合物である。 本発明は、 マイナス鎖 RNAゥ ィルスのへマグルチ二ン活性を有するェンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む 、 へマグルチニン活性が低下した薬剤または遺伝子運搬組成物の製造方法であつ て、 （a ) 該蛋白質に化合物を接触させる工程、 および （b ) 該蛋白質と該化合 物を結合させる工程を含む方法であり、 （ i ) '該化合物に、 細胞に結合する活性 を有する化合物を付加する工程をさらに含む方法に関する。 工程 （i ) は、 工程 ( a ) の前に行ってもよく、 あるいは工程 ( a ) または （b ) と同時あるいは （ a ) と （b ) の間、 または工程 （b ) の後に行ってもよい。 好ましくは工程 ( i ) は工程 （a ) の前に行われる。 あるいは、 予め工程 （i ) が行われた化合物を マイナス鎖 RNAウィルスのへマダルチュン活性を有するエンベロープ蛋白質に付カロ してもよい。
細胞に結合する活性を有する化合物としては、 細胞表面に結合し、 それにより 本発明の組成物の薬剤または遺伝子導入を助ける働きを有する限り、 所望のもの を用いることができる。 そのような化合物としては、 例えば細胞表面蛋白質に結 合する化合物、 または細胞表面の糖鎖に結合する化合物などを用いることができ る。 具体的には、 例えばウィルスのエンベロープ蛋白質、 あるいは天然または合 成のリガンド、 ホルモン、 または細胞接着因子などが挙げられ、 具体的には葉酸 、 トランスフェリン、 エリスロポエチン、 抗体、 レクチン、 ガラクトース、 マン ノースなどを例示することができる。
中でも、 本発明において葉酸は、 本発明の組成物に含まれる複合体の薬剤 '遺 伝子導入能を維持させるのに極めて有効であることが判明した。 本発明は、 マイ ナス鎖 RNAウィルスのへマグノレチ二ン活性を有するェンベロープ蛋白質を有する細 胞膜を含む、 薬剤または遺伝子運搬組成物であって、 （a ) 該蛋白質に化合物が 付加されており、 （ b ) 該化合物が付加されていな 1/ヽ場合に比べへマダルチュン 活性が低下しており、 （c ) 該蛋白質が葉酸と共に形成した複合体を含み、 （d ) 該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、 組成物を提供 する。 特に、 該^白質に付加されている化合物に葉酸が直接結合していることが 好ましい。
細胞に結合する活性を有する化合物を用いて本発明の組成物を製造する際に、 グルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加する化合物として特に好 ましいのは該蛋白質に結合する抗体である。 本発明の組成物は、 好ましい態様と して、 へマグルチュン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはそ の断片が結合している該蛋白質を含む組成物であって、 該蛋白質が、 細胞に結合 する活性を有する化合物と共に複合体を形成している組成物が挙げられる。 すな わち本発明は、 マイナス鎖 RNAゥィルスのへマグルチェン活性を有するェンベロー プ蛋白質を有する細胞膜を含む、 薬剤または遺伝子運搬組成物であって、 （a ) 該蛋白質に、 該蛋白質に結合する抗体またはその断片が結合しており、 （b ) 該 化合物が付カ卩されていない場合に比べへマグルチニン活性が低下しており、 （ c ) 該蛋白質が細胞に結合する活性を有する化合物と共に形成した複合体を含み、
( d ) 該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、 組成物に 関する。 特に、 細胞に結合する活性を有する化合物が、 該抗体またはその断片と 直接結合して 、ることがより好ましい。
本発明において抗体にはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含ま れる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、 す ベてのクラスのポリクローナル抗体およぴモノクローナノレ抗体、 さらにヒト抗体 や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。 ポリクローナル抗体は、 例え ばへマグルチ二ン活性を有するエンベロープ蛋白質またはそれらの部分べプチド を調製し、 これを抗原にゥサギ、 ャギ、 ヒッジなどを免疫してポリクローナル抗 体を作製する。 抗原ペプチドとしては、 へマダルチュン活性を有するェンベロー プ蛋白質の細胞外ドメインまたはその断片を用いることができる。 抗原べプチド は、 適宜他のタンパク質、 例えばキーホールリンペットへモシァ-ンやアルプミ ンなどのキヤリァ蛋白質に結合させて免疫することができる。 モノクローナル抗 体は、 免疫したマウス ラットの脾細胞を用い、 モノクローナル抗体を産生する ハイブリドーマを得ることにより作製することができる。 抗体の作製は、 公知の 方法に従って行うことができる （Harlow, E. and Lane, D. (eds. )， Antibodies ： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Shepherd ， P. and Dean, C. (eds. ) , Monoclonal Antibodies : A Practical Approach (Pr actical Approach Series, 227) , Oxford Univ Press, 1999) 。 ポリクローナル 抗体は血清から、 モノクローナル抗体ではハイプリドーマ培養上清またはハイプ リドーマを接種した動物の腹水から硫安分画、 プロテイン Gセファロースカラム、 抗原を固定したァフィ二ティーカラムなどの一般的な生ィ匕学的手法で抗体を精製 することができる。 本発明において用いられる抗体は、 へマグルチニン活性を有 するエンベロープ蛋白質のエンベロープ外側の領域 （細胞外領域） に結合する抗 体を用いることができ、 好ましくはモノクローナル抗体、 さらに好ましくは実施 例 1 2に記載の HN- 1 (Miura et al. , Exp. Cell Res. , 1982， 141, 409 - 420) で ある。 本発明の抗体は、 へマダルチュン活性を有するエンベロープ蛋白質 （抗原 蛋白質） に結合する限り、 その抗体断片であってもよい。 例えば、 Fab, Fab (t)、 Fab\ F(ab' )2、 抗体可変領域断片 （Fv) 、 単鎖可変領域断片 （single chain Fv ； scFv) 、 またはそれらの修飾物が含まれる。 Fabは抗体 H鎖可変領域を含む 1つ のポリぺプチド鎖および L鎖可変領域を含む 1つのポリぺプチド鎖からなる複合体 である。 これらのポリペプチドは互いに結合し 1つの抗原結合部位 （1価） を形 成する。 Fabは、 典型的にはィムノグロプリンをパパインで消化することにより得 られるが、 これと同等の構造を有するものも本発明において Fabと称す。 具体的に は、 Fabはィムノグロプリン L鎖と、 H鎖可変領域 （Vh) および C„lを含むポリぺプ チド鎖とが結合した二量体蛋白質が含まれる。 Fab， (ィムノグロブリンをぺプシ ン消化後、 H鎖間のジスルフィド結合を切断して得られる） 、 および Fab (t) (ィ ムノグロブリンのトリプシン消化で得られる） なども、 Fabと同等の構造を有する 。 また F(ab' )2とは、 抗体の定常領域を欠失する抗体またはそれと同等の形態の蛋 白質複合体を言レヽ、 '具体的には抗体 H鎖可変領域を含む 1つのポリぺプチド鎖およ び L鎖可変領域を含む 1つのポリぺプチド鎖からなる複合体を 2つ有する蛋白質複 合体を言う。 F(ab' ) 2は抗原結合部が 2つある二価抗体であり、 典型的には抗体を pH 4付近でペプシンにより消化して得られ、 H鎖のヒンジ領域を有しているが、 他 P T/JP03/05527
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のプロテアーゼまたは薬剤により切断されたもの、 あるいは人工的に設計したも のであってよい。 scFvとは、 抗体 H鎖可変領域おょぴ L鎖可変領域が一本のポリべ プチド鎖に含まれているポリぺプチドを言う。 H鎖可変領域および L鎖可変領域は 適当な長さのスぺーサーを介して連結されており、 互いに結合して抗原結合部を 形成する。 このような抗体断片は、 例えば 「日本生化学会編 新生ィヒ学実験講座 1 2 分子免疫学 III 185- 195ページ （東京化学同人） 」 および/または （"Current P rotocols in Immunology, Volume 1、 (John Wiley & Sons, Inc. ) J の Sti載こ従 つて作製することができる。 抗体断片は、 例えば抗体をペプシン、 パパイン、 ト リプシン等の蛋白質分解酵素で消化することにより得ることができる。 あるいは 可変領域のアミノ酸配列を解析し、 組み換え蛋白質として発現させ調製すること が可能である。 また抗体には、 ヒト型抗体もしくはヒト抗体なども含まれる。 抗 体は、 プロテイン Aカラムまたはプロテイン Gカラム等を用いたァフィ-ティーク 口マトグラフィ一により精製することができる。
本発明においては、 特に抗体の可変領域 （抗原結合領域） を含む断片をへマグ ルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加することが好ましい。 このよう な断片としては、 抗体の H鎖および/または L鎖の可変領域を含む所望の断片を用い ることができるが、 例えば上記のように Fab、 Fab (t)、 Fab,、 F (ab' )2、 Fv、 scFv 、 またはそれらの修飾物を挙げることができる。
本発明において細胞に導入する薬剤は所望の化合物であってよく、 例えば天然 化合物、 合成化合物、 無機または有機化合物、 低分子または高分子化合物などが 拳げられる。 また遺伝子は所望の核酸であってよく、 DNAまたは R Aなどの核酸お ょぴその誘導体が挙げられる。 核酸としては、 環状および直鎖状の 1本鎖もしくは 2本鎖のデォキシリボ 酸であっても、 リポ核酸であってもよい。 核酸の誘導体と しては、 例えば、 ホスフォロチォエート、 ホスフォロジチォエート等が例示され る。 本発明の組成物で運搬する薬剤または遺伝子としては、 具体的には、 例えば 、 アンチセンス核酸 (Drug Delivery System, 10, 91-97, 1995) 、 デコイ （The Jou rnal of Biological Chemistry, 267, 12403-12406, 1994) 、 リボザィム （The Drug Delivery System, 10， 91-97， 1995) 、 三重鎖 DNA (細胞工学、 13巻、 No. 4、 277-28 5、 1994) 、 プラスミ ド DNA (Methods Enzymology, 221, 317-327, 1993) 、 RNAベタ ター、 およぴ、 これらとキャリアー (Proceedings of National Academy of Scie nces of United States of America, 89, 7934-7938, 1992) または、 蛋白 （Journal of Biological Chemistry, 266 (6) , 3361-3364, 1991) との複合体、 あるいは、 抗 癌剤、 抗ゥイノレス剤、 トキシン （ジフテリアトキシン； Biochim Biophys Acta, 119 2, 253-262， 1994Zリシン； Biochim Biophys Acta, 1070, 246-252, 1991) 、 酵素 （Im munology, 81, 280-284, 1994) 、 あるいはその他の所望の生理活性物質を用いるこ とができる。 所望の遺伝子をゲノム核酸中に挿入し、 組み換えウィルスから該遺 伝子を発現させることもできる。
本発明の組成物は、 生体への直接投与 （インビボ） および間接投与 （エタスビ ボ） において使用することができる。 また、 生体外細胞において投与 （インビト 口） することができる。 インビボでの適用においては、 投与ルートは薬剤または 遺伝子が標的細胞または組織に到達する限り所望の投与経路で投与されてよい。 有効成分の性質に応じて、 例えば経口的、 経皮的、 鼻腔内的、 経気管支的、 筋内 的、 腹腔内、 静脈内、 関節内、 または皮下等に行われうるがそれらに限定されな い。 また、 全身的または局所的に投与され得る。 インビトロ （エタスビボを含む ) での適用においては、 本発明の組成物は標的細胞に接触するように添加される 。 例えば細胞培養液に添加される。 本発明の組成物は特に血中での安定性に優れ ていることから、 静脈注射等の血中投与に用いられる注射剤などとして有用であ る。
本発明の方法により製造さ； たマイナス鎖 RNAゥィルスのへマグルチニン活性 有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む複合体は、 必要に応じて薬理学 的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。 「薬学的に 許容される担体または媒体」 とは、 該複合体と共に投与することが可能であり、 複合体による薬剤または遺伝子の細胞への導入を有意に阻害しない材料である。 このような担体または媒体としてな、 例えば滅菌水、 生理食塩水、 培養液、 血清 、 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などと適宜組み合わせて製剤ィヒすることが考えら れる。 マイナス鎖 RNAウィルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液 を含んでよい。 また本発明の組成物は、 脱イオン水、 5%デキストロース水溶液等 の担体または媒体を含んでいてもよい。 また、 リボソームの膜安定化剤 （例えば コレステロール等のステロール類） を含んでいてもよい。 また、 抗酸化剤 （例え ばトコフエロールまたはビタミン Eなど） を含んでいてもよい。 さらに、 その他に も、 植物油、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 殺生物剤等が含有されていてもよい 。 また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。 本発明の組成物は、 水 溶液、 カプセル、 懸濁液、 シロップなどの形態であり得る。 また本発明の,袓成物 は溶液、 凍結乾燥物、 またはエアロゾルの形態の組成物であってよい。 凍結乾燥 物の場合は安定化剤としてソルビトール、 シユークロース、 アミノ酸及ぴ各種蛋 白質等を含んでいてもよい。 マイナス鎖 RNAウィルスベクターを含む組成物は試薬 として、 および医薬として有用である。
本発明の組成物の投与量は、 疾患、 患者の体重、 年齢、 性別、 症状、 投与目的 、 投与組成物の形態、 投与方法、 導入する薬剤または遺伝子等により異なるが、 当業者であれば適宜決定することが可能である。 マイナス鎖 RNAウィルスの感染性 ウィルスを含む組成物であれば、 投与量は好ましくは約 105 CIU/mlから約 10u CIU /ml、 より好ましくは約 107 CIU/mlから約 109 CIU/ml、 最も好ましくは約 1 X 108 CI U/mlから約 5 X 108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与すること が好ましい。 ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 109 CII！〜 2 X 1010 ひが 好ましく、 投与回数は、 1回ま は臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能 であり、 1日の投与回数についても同様である。 ヒト以外の動物についても、 例 えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比 （例えば平均値） で上記の投与量を換算した量を投与することができる。 雇 27
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本発明の組成物の投与の対象となる生物としては特に制限はない。 例えば、 二 ヮトリ、 ゥズラ、 マウス、 ラット、 ィヌ、 プタ、 ネコ、 ゥシ、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 サル、 およぴヒトなどを含む鳥類、 哺乳動物、 およびその他の脊椎動物が 挙げられる。 本発明の方法をインビトロ （エタスビボを含む） で用いる場合は、 適用個体としては、 例えばヒト、 非ヒト哺乳動物および鳥類などが挙げられる。 本発明の方法をインビボで用いる場合は、 適用個体としては特に非ヒト哺乳動物 および鳥類などが挙げられる。
また本発明は、 マイナス鎖 RNAゥィルスのへマグルチニン活性を有するェンべ口 ープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、 細胞に結合する化合物が結 合している抗体またはその断片に関する。 このような抗体またはその断片は、 マ イナス鎖 RNAウィルスまたはその処理物に添加することにより該蛋白質に結合し、 これによりへマダルチェン活性を低下させるが、 細胞に結合する化合物により細 胞への接着を助ける働きが維持される。 従って、 このような抗体またはその断片 は、 本発明の薬剤または遺伝子運搬組成物の製造に極めて有用である。 抗体また はその断片は、 上記のように抗体の L鎖および/または H鎖の可変領域を含む所望の 断片等であってよい。 具体的には、 例えば Fab、 Fab (t)、 Fab'、 F(ab' ) 2、 Fv、 sc Fv などが挙げられる。 特に、 F (ab' ) 2は好適に用いられる。 細胞に結合するィ匕合 物としては、 特に細胞表面の受容体のリガンドが好ましく、 例えば葉酸トランス フェリン、 エリスロポエチン、 抗体、 レクチン、 ガラク トース、 マンノースなど を例示することができる。
本発明の抗体またはその断片は、 薬学的に許容される担体と共に組成物とする ことができる。 このような担体としては、 例えば水、 アルコール、 グリセロール 、 塩、 蛋白質、 ゼラ^ン、 公知の p!L锾衝剤、 安定剤、 懸濁剤、 保存剤 どが挙げ られる。
また本発明は、 （a ) マイナス鎖 RMウィルスのへマグルチニン活性を有するェ ンべロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、 細胞に結合する化合 物が結合している抗体またはその断片、 および （b ) 該ヱンベロープ蛋白質を有 する細胞膜を含む薬剤または遺伝子運搬組成物を含むキットに関する。 該ェンベ ロープ蛋白質を有する細胞膜を含む薬剤または遺伝子運搬組成物としては、 例え ば感染性ゥィルス粒子、 あるいは不活化ウィルスまたは該ウィルスのェンベロー プを含むリポソームなどが挙げられる。 感染性ウィルス粒子は例えばマイナス鎖 R NAウィルスであってもよく、 マイナス鎖 RNAゥィルスのへマグルチ-ン活性を有す るェンベロープ蛋白質を含む他のウィルスであってもよい。 これらに上記抗体ま たはその断片を添加することにより、 該エンベロープ蛋白質に抗体またはその断 片が結合し、 へマグルチ二ン活性が低下した薬剤または遺伝子運搬組成物を調製 することができる。 例えば生体内投与において血中安定性を高めたい場合など、 目的に合わせて適宜へマグルチニン活性を制御することが可能となる。 これらは 使用直前に混和することで容易に調製できるため、 非常に使いやすいシステムと なる。 図面の簡単な説明
図 1は、 SeVベクターのエンベロープ蛋白 （Hおよび F蛋白） への TPEGおよび SP A- PEG修飾試薬による PEG修飾を模式的に示す図である。
図 2は、 SeVベクタ一およぴ TPEGf! 飾 SeVベクタ一によるラット血液に対する溶 血活性を、 37°C、 15分の条件で測定した結果を示す図である。
図 3は、 SeVベタターおよび TPEG^飾 SeVベタターのラット血液中での安定十生を 調べた結果を示す図である。 37°Cで 1、 15および 30分処理した後に、 血漿を分離 して、 HeLa細胞に感染を行い、 24時間後の LacZ遺伝子発現を定量した結果である 。 結果は 3例の平均値士標'準偏差で表した。 ' 図 4は、 SeVベクターおよび TPEGf^飾 SeVベクターを SDS電気泳動を行い、 銀染色 法により染色した結果を示す写真である。 HN蛋白と F蛋白の泳動位置を矢印で示す 。 0は SeVベクターを、 8から 10は表 2の検体番号 8から 10に相当する。 PC蘭雇 27
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図 5は、 SeVベクターおよび SPA-PEG5K修飾 SeVベクターをゥサギ抗 SeV抗血清存 在下 （10、 100および 1000倍希釈血清） で LLCMK2細胞に遺伝子導入後の LacZ発現を X- gal染色法により評価した結果を示す写真である。
図 6は、 SeVベクターに葉酸結合型抗 HNモノクローナル抗体で、 HN蛋白への選択 的修飾を行う模式図である。
図 7は、 H - 1、 HN-1/F(ab' ) 2およびその NHS法により調製した葉酸結合型抗体 で修飾した SeVベクターの H Jを示す図である。 横軸は抗体濃度、 縦軸は赤血球凝 集活性の log表記 （log2(HAU) ) を表す。
図 8は、 SeVべクタ一、 HN- 1修飾 SeVべクタ一およぴ葉酸結合 HN - 1修飾 SeVベタタ 一のニヮトリ赤血球に対する溶血活性を調べた結果を示す図である。 SeVベクター は 1 X 107、 1 108ぉょび1 109 /1111で、 修飾ベクターはいずれも 1 X 109 pfu/mL の SeVベクターを 100 μ g/mLの抗体で修飾したベタターでの結果を示す。 図の縦軸 は、 遊離したへモグロビン量を 570nmにおける吸光度で示した。
図 9は、 SeVベクタ一、 HN- 1修飾 SeVベクタ一およぴ葉酸結合 H - 1修飾 SeVベクタ 一を KB細胞に感染を行！/、、 2日後に LacZ遺伝子発現を調べた結果を示す図である。 過剰葉酸存在条件とは、 感染実験において、 培養液中に ImMの葉酸を添カ卩して行つ た系を示す。 結果は 3例の平均値土標準誤差で示した。
図 1 0は、 HN- 1または HN- 1/F (ab' ) 2およびその葉酸結合体で SeVベタターを修飾 して、 KB細胞に感染したときの、 感染 2日後の LacZ遺伝子発現を調べた結果を示す 図である。 3例の平均値土標準誤差で示した。
図 1 1は、 SeVベクターを HN- 1または EDC法で調製した葉酸結合 HN- 1で抗体量を 変えて修飾したベクターの HAUの変化を示す図である。 横軸は抗体濃度、 縦軸は赤 血球凝集活性の log表記 （log2 (HAU) ) を表チ。
図 1 2は、 PFG修飾した SeVのタイター変化を示す図である。 PEG反応量を変えて SeVを修飾し、 修飾 SeVベタターの相対感染効率を調べた。
図 1 3は、 PFG修飾した SeVの HA活性変化を示す図である。 PEG反応量を変えて Se Vを^飾し、 修食 SeVベクターの HA †生を調べた。
図 1 4は、 PFfrf 飾した SeVの感染性と HA活性の相関を示す図である。 PEG 飾に より、 HA活性に対する感染性は上昇し得ることが分かる。
図 1 5は、 銀染色により PFG^飾した SeVの組成蛋白を分析した結果を示す写真 である。 エンベロープ蛋白である Fと HNに由来するパンドが PEG反応量の増大に伴 つて減少し、 代わりに高分子量画分にパンドが出現した。
図 1 6は、 ウェスタンプロッティングにより PFG修飾した SeVの組成蛋白を分析 した結果を示す写真である。
図 1 7は、 PEG修飾した SeVの中和抗体への抵抗性を示す図おょぴ写真である。 修飾 SeVの総粒子数 （総蛋白量） を一定にした条件で比較した。
図 1 8は、 PEG10K修飾 SeVの in vivo評価を示す図である。 修飾 SeVの投与スケジ ュールぉよび投与条件、 およぴ抗 SeV抗体価の変化が示されている。
図 1 9は、 PEG10K修飾 SeVの in vivo評価を示す写真である。 図 1 8に示した修 飾 SeVの in vivo投与における、 肺での導入遺伝子の発現を示す。
図 2 0は、 PEG修飾 SeVの 4 °C保存条件での感染性の維持効果を示す図である。 図 2 1は、 ポリエチレンィミン （PEI750K) の修飾効果を示す図である。 PEIは 、 PEG^飾 SeVの感染性を上昇させた。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明する力 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 なお、 本明細書中に引用された文献は、 すべて本明 細書の一部として組み込まれる。
[実施例 1 ] ' NLS-LacZ遺伝子搭载 SeVベクターの調製と精製 '
核移行シグナル付き LacZ遺伝子 (NLS-LacZ) を搭載した NLS- LacZZSeVは既報の 方法により作製した （Kato et al. , Genes Cells, 1996, 1， 569-579； Hasan et al. , J. Gen. Virol. , 1997, 78， 2813-2820) 。 このべクタ を鶏有性卵 （10日 卵） に接種して、 35. 3°Cにて 3日間培養後、 しょう尿液を回収した。 4, 000rpm、 15 分の遠心後、 上清を 10, 000rpm、 1時間遠心してベクターを沈殿させた。 PBSに再懸 濁後、 蔗糖密度勾配 （30/50%) に重層し、 25，000rpm、 1時間遠心した （Beckman, ローター SW28) 。 蔗糖界面のベクターを回収、 遠心沈殿後、 PBSに再懸濁して精製 ベクターのストック （以下 SeVベクターと表記） を調製した。 ベクターの蛋白濃度 は、 等容の 2% SDS溶液で可溶ィ匕したものを検体として用い、 BSAを標品として、 BC A protein assay (Pierce社） にて測定した。 赤血球凝集活性 (HAU) は以下のよ うに求めた。 ベクターを 96well丸底プレート （旭テクノグラス） 内で PBSで順次 2 倍希釈を行った （各 50μ 1) 。 各 wellに PBSで洗浄した 1%ニヮトリ赤血球液を 50μ 1 ずつ加え、 4°Cで 1時間静置後に判定を行った。 H Jは血球凝集を引き起こすベクタ 一の最大希釈倍数で表した。 また、 pfu (プラーク ·フォーミング'ユニット） の 算出は、 SeV 1HAU=約 106 Pfuの関係を用いた。 精製ベクターは lmg蛋白/ ml =4096 〜5120HAU/ml=約 5 X 109pfu/mlであった。
[実施例 2 ] TPEG修飾 SeVベクタ一の調製
実施例 1の SeVベクターのストツクを PBSで 2mg蛋白/ mlに希釈した。 この溶液 0. 5 mlに 0. 5Mほう酸緩衝液 (pH8. 5) を 0. 5ml加えて、 lmg蛋白/ mlの pH8. 5溶液を調製し た。 トレシル活性化 PEG試薬 （TPEG、 分子量 5000： Shearwater Polymers社） lmgを 上記溶液に攪拌しながら少量ずつ加え、 室温で 90分反応を行った （図 1 ) 。 反応 終了後、 反応液を氷冷 PBS 14mlで希釈して、 15, 000rpm、 1時間の遠心 （Beckman、 ローター SW28. D によりベクターを回収し、 0. 8mlの PBSに再懸濁して TPEG修飾 SeV ベクターを得た。 修飾ベクターの蛋白濃度および HAUは実施例 1と同様に求めた。
[実施例 3 ] TPEG修飾 SeVベタターによるインビトロ遺伝子発現
実施例 1の SeV クタ一のストツクを PBSで希釈して、 1 X 105pfu/mlとした。 実 施例 2の TPEGf 飾 SeVべクターは未修飾べクターと蛋白濃度を揃えることでウィル ス粒子数を同一にした。 実験前日に HeLa細胞 （ヒト子宮頸部癌由来） を 12wellプ レート （住友ベークライト） に lwellあたり 5 X 104細胞数 （10%非働化ゥシ胎児血 03 05527
37
清 （以下 FCS) 添加 EM培地 lml/well) でシードした。 培地を 0. 5mlに減らし、 上 記べクター希釈液を 50 ju lZwellでカ卩え （SeVベタター換算で 5X 103pfu/well、 moi =0. 1) 、 37°C、 5% C02で感染を行った。 1時間後にベクターを除き、 培地で 2回洗 浄後、 新たに 2mlの培地を加え、 37°C、 5% C02で 24時間培養した。 LacZ遺伝子発現 の測定は、 Galacto- Light Plus™ (Tropix社） のプロトコールに従って行った。 細 胞蛋白の測定は BCA法 （Pierce社） に従った。 結果は細胞蛋白あたりの light unit (RLU/ μ g protein) で表した。
表 1に TPEG- SeVベクターの HAUと遺伝子発現量を示す。 同一蛋白濃度、 即ち同一 ウィルス粒子数で、 TPEG- SeVベクターは SeVべクターに比べて 2, 000分の 1以下の HA Uであった。 一方、 同一粒子数での HeLa細胞における遺伝子発現は約 50%維持して いた。 このように、 細胞への遺伝子導入能を極端に損なうことなく、 HAUのみを著 しく減少したべクターを調製することが可能となった。
タンパク濃度 HAU/mg LacZ発現量
(mg/ml) (RLU/ g cell protein)
SeVベクター 0.93 5120 2335604+72774
TP EG修飾 SeVベクター 0.99 2 1046353+29841
[実施例 4 ] 溶血活性試験 ·
SD系ラット （ォス） をエーテル麻酔下、 頸静脈よりへパリン処理シリンジで採 取した新鮮血液を実験に供した。 実施例 1の SeVベタターおょぴ実施例 2の TPEGl!i 飾 SeVベクターを PBSで希釈して、 1から 1000 蛋白/ mlの溶液を調製した。 ベクタ 一希釈液 50 μ 1と 37°Cに保温したラット血液 50/i lを混和し、 15分間インキュベー シヨンを行った。 4°Cで氷冷後、 血漿を遠心分離した。 血漿中に放出されたへモグ ロビン量を 570nmにおける吸光度 （0D570) により測定した。 なお、 ベクター溶液 JP03/05527
38
の代わりに PBSを用いたときを陰性対照、 蒸留水を陽性対照 （100%溶血） として、 以下の計算式よりベクターの溶血活性を算出した。
溶血活性 (%) = { (ベクター溶液の 0D570) — （PBSでの 0D570) } / { (蒸留 水の 0D570) - (PBSでの 0D570) } X 100
図 2に示すように、 SeVべクターはベクター濃度に依存した強い溶血活性を示し た。 一方、 TPEG修飾 SeVベクターの溶血活性は非常に低いことがわかった。 TPEG^ 飾 SeVベクター 1000/z gの溶血活性は SeVベクター に相当することから、 安全 性が約 200倍向上していると考えられた。
[実施例 5 ] ラット血液中での安定性試験
実施例 1の SeVベクタ一を PBSで希釈して、 1 X 108pfu/mlとした。 実施例 2の TPE 飾 SeVベクターはウィルス蛋白濃度が同じになるように PBSで希釈した。 ベクタ 一希釈液 250 μ 1に、 SD系ラット （ォス） の新鮮血液 250μ 1を混和して、 37°Cでィ ンキュベーシヨンを行った。 所定の時間経過後に、 血液を 80 サンプリングして 、 4°Cで遠心分離を行い血漿を回収した。 血漿 10 1を PBSで 50倍に希釈した溶液 50 〃1を用いて、 実施例 3記載の方法に準じて、 HeLa細胞における LacZ遺伝子努現を 調べた。
図 3に示すように、 SeVベクターは血液処理直後から著しく不安定化され、 15分 の処理で血液未処理に比べて 1000分の 1にまで遺伝子発現能は低下した。 一方、 T PEG^飾 SeVベクターでは、 血液中での安定性が改善されており、 未修飾ベクター に比べて著しく高い遺伝子発現能を維持していた。
[実施例 6 ] SPA- PEG2K修飾 SeVベタターの調製
実施例 1の SeVベクターのストック溶液を PBSで希釈して 2mg蛋白/ mlに調製した 。 この溶液を 0. 5Mほう酸緩衝液 (pH8. 5) で 2倍希釈しそ、 lmg蛋白/ ml溶液を調製 した。 分子量 2000のスクシ-ミジル'プロピオン酸誘導体 PEG試薬 （SPA- PEG2K、 S hearwater Polymers社） 1、 2または 4mgを上記溶液に攪拌しながら少量ずつ加え、 室温で 30分反応を行った （図 1 ) 。 反応終了後、 反応液を氷冷 PBS 1½1で希釈を 行い、 13, 000rpm、 1時間の遠心 （Beckman、 ローター SW28. 1) によりベクターを回 収し、 0. 8mlの PBSに再懸濁して、 SPA- PEG2K修飾 SeVベクターを得た （表 2、 検体 番号 1〜3) 。 修飾ベクターの蛋白濃度は実施例 1と同様に求めた。
表 2 検体名 検体番号 PEG反応量 (mg) HAU/mgタンパク LacZ遺伝子発現比 (％)
SeVベクター
(実施例 1 ) 4096 100.0 ± 7.5
SPA-PEG2K修飾 1 1 1024 29.1 2.6
(実施例 6)
2 2 512 4.7 ± 0.2
3 4 <1 0.5 ± 0.01
SPA - PEG5K修飾 4 1 2048 115.4 ± 1 .2
(実施例 7)
5 2.5 2048 93.1 ± 4.2
6 5 512 42.7 ± 4.9
7 10 <1 1.6 ± 0.1
8 10 1024 95.3 ± 9.7
SPA - PEG20K修飾
(実施例 8) 9 20 4 4 & 3 ± 1.5
10 40 <1 0.2 ± 0.02
[実施例 7 ] SPA - PEG5K修飾 SeVベクタ一の調製
実施例 6の SPA- PEG2Kを分子量 5000の SPA- PEG5K (Shearwater Polymers社） に変 更して、 PEG反応量を 1、 2. 5、 5または 10mgで同様に反応 ·精製を行い、 SPA- PEG5 K修飾 SeVを得た （表 2、 検体番号 4〜7)。
[実施例 8 ] SPA-PEG20K修飾 SeVベクタ一の調製
実施例 6の SPA- PEG2Kを分子量 20, 000の SPA- PEG20K (Shearwater Polymers社） に変更して、 PEG反応量を 10、 20または 40mgで同様に反応 *精製を行い、 SPA- PEG 20K修飾 SeVを得た （表 2、 検体番号 8〜10) 。'
図 4に SPA- PEG20K修飾べクターを SDS -電気泳動を行 1/ヽ、 銀染色により各構成蛋 白を染色した結果を示す。 PEG反応量の増大に伴って、 HN蛋白に由来するパンドが 減少し、 代りに高分子量画分にパンドが出現した。 これは、 PEGが結合した HN蛋白 が高分子化されたものと推測された。 一方、 F蛋白のパンドの減少は少なかつた。 このことから、 SeVエンベロープへの PEGj 飾では、 H と Fの 2種の蛋白のうち へ の修飾が主となることがわかつた。
[実施例 9 ] SPA - PEG修飾 SeVベクタ一の画活性とインビトロ遺伝子発現 実施例 1の SeVベクターおよび実施例 6、 7および 8に記載の PEG修飾 SeVベタタ 一 （検体番号 1から 10) について、 実施例 1に記載の方法で HAU活性を測定した。 さらに、 HeLa細胞における LacZ遺伝子発現を、 感染 moiを 0. 5、 感染後の培養日数 を 2日間に変更した以外は実施例 3記載の方法に従つて測定した。
表 2に HAUと LacZ発現の結果を示す。 PEGの反応量の増加に伴い、 得られる修飾 体の H Jは低下した。 LacZ遺伝子発現は SeVベクターに比べると低下する力 PEG反 応量を表に示したように制限することにより、 発現能の低下を抑えたまま HAUを大 幅に低下させることができた。 このように、 修飾条件を選ぶことで、 十分な発現 能を有する修飾ベクターが得られることがわかった。
[実施例 1 0 ] 血球存在下での SPA - PEG修飾 SeVベタターによるインビトロ遺伝 子発現
実施例 3と同様に、 HeLa細胞を準備した。 実験直前に培養液を除き、 代りに I X 109個/ mlに調製した PBS洗浄ニヮトリ赤血球を 300 /z l添加した。 対照群は赤血球液 の代りに PBSを用いた。 実施例 1の SeVベクターまたは表 2に記載の PEG修飾 SeVベ クタ一 （検体番号 1、 2、 4、 5、 6、 8および 9) を 50 1加え、 37°Cで 5分の極短時間 での感染を行った。 ベクター添加量は表 2を基に、 同じ発現効率となるように調 整した。 実施例 3に準じて、 細胞を処理し、 48時間後における LacZ遺伝子発現を 測定した。
表 3に^血球存在下での各検体の遺伝子発現量を示す。 結果は、 赤血球非存在 下での発現量を 100とした相対比で示した。 SeVベクターでは赤血球の存在により 、 遺伝子発現量は約 20%にまで低下した。 一方、 PEG^飾検体は HAU活性の低下に 伴って、 赤血球とのインタラクションが低減するので、 その結果、 赤血球存在下 でも高い遺伝子導入を示した。 これらの結果は、 PEG^飾 SeVベクターは、 臨床の 場において、 血液を介しての短時間での遺伝子導入の可能性を示唆するものであ る。
表 3 検体名 検体番号 赤血球存在下での
LacZ遺伝子発現比 (％)
SeVベクター
22.5 ± 4.2
(実施例 1 )
SPA-PEG2K修飾 1 47.6 ± 2.0
(実施例 6) 2 49.2 ± 13.8
4 34.4 ± 3.4
SPA-PEG5K修飾
(実施例 7) 5 46.7 ± 4.0
6 53.9 ± 4.8
SPA-PEG20K修飾 8 46.1 士 9.7
(実施例 8) 9 49.6 ± 6.1
[実施例 1 1 ] 中和抗体存在下での SPA- PEG5K修飾 SeVベクタ一による遺伝子導 入
( 1 ) SPA - PEG5K修飾 SeVベタタ一の調製
実施例 1に準じて NLS - LacZ/SeVベクターを調製 ·精製を行い、 ストックを調製 した。 このベクターに対して、 SPA- PEG5K (5mg) を実施例 7に記載の方法に準じ て反応を行い、 SPA- PEG5K修飾 SeVベクターを調製した。 ベクターの LLCMK2細胞に 対するタイターは以下のように求めた。 実験前日にLLCMK2細胞を6 wellプレート (住友べ一クライト） に lwel 1あたり 1 X 106細胞数 （10%FCS添加 MEM培地 2ml/vrel 1 ') でシードした。 ベクターを 1% FCS含有 PBSで 1 mg蛋白/ mlに希釈して、 さらに 10 倍希釈系列を調製した。 前記細胞の培地を除去し、 希釈ベクター溶液を 1 wellあ たり 1 mLを添加して、 37°C、 5% C02で 1時間感染を行った。 ベクター溶液を除去し た後、 培地で洗浄、 新たな培地を wellあたり 2 ml加えて、 さらに 37°C、 5% C02で 培養を続けた。 2日後に培地を除き、 PBSで洗浄した後、 LacZ遺伝子を発現してい る細胞を ]3 -Gal staining kit (Invitrogen) により X - gal染色を行った。 x200倍 の視野における感染細胞数を well内の任意の 10個所で計数し、 その平均値と視野 の面積から well全体でのタイターを次式により求めた。
LacZ感染タイター （CIU/mL) = (感染細胞数） X 854. 865 X (希釈倍数）
その結果、 SeVベクターおよび SPA - PEG5K修飾 SeVのタイターはそれぞれ、 1. 4X 1 010 CIU/mlおよび 2. 7 X 109 CIU/mlであつた。
( 2 ) 中和抗体存在下での遺伝子導入
実施例 1 1一 （ 1 ) 記載の SeVベタターおよぴ SPA- PEG5K修飾 SeVベタタ一を PBS で希积して、 1 X 107 CIU/mlに調製した。 ベクター溶液 30/z lに、 SeVをゥサギに免 疫して調製した抗 SeV抗血清 （56 、 1時間処理） の 10、 100および 1000倍希釈血清 または PBS 30 μ ΐを添加して、 室温で 1時間処理した。 実験前日に LLCMK2細胞を 12w ellプレート （住友ベークライト） に lwellあたり 2 X 105細胞数 （10% FCS添加 MEM 培地 lml/well) でシードした。 培地を 0. 5ralに減らし、 前記抗血清処理ベクター 溶液 40 1をゥエルに加え、 37°C、 5% C02で 1時間感染を行った。 以下、 実施例 1 1一 （1 ) 同様に 2日後の LacZ遺伝子発現を X- gal染色で評価した。
図 5に示すように、 SeVベクターは抗血清の存在により、 遺伝子導入効率が著し く低下した。 一方、 SPA-PEG5K修飾 SeVベクターは抗血清存在下でも十分な遺伝子 導入能を維持できた。
[実施例 1 2 ] 抗 HNモノクローナル抗体、 H -1の調製および精製
抗 HNモノクローナル抗体、 HN - 1を産生するハイプリ ドーマ細胞 （Miura et al. , Exp. Cell Res. , 1982, 141, 409-420) を Hybridoma - SFM培地 （Gibco - BRL) で 37 °C、 5% ( 02で継代培養を続け、 2 X 105 '細胞数/ mlの細胞浮遊液 1000mlを調製した。 さらに、 2週間培養を続けた後、 3，000rpm、 10分の遠心分離により得た上清を 0. 45 μ ηιのフィルターで濾過を行った。 モノクローナル抗体の精製は Protein Gカラム クロマトグラフィーにより行った。 培養上清を 20fflMりん酸ナトリウム緩衝液 (PH7 5527
43
. 0) で平衡化した 5mlの Protein Gカラム （フアルマシア） にペリスターポンプ （ P - 1ポンプ：ブアルマシア） を用いて流速 4. 2ml/分で添加して、 抗体をカラムに結 合させた。 20mMリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7. 0) で洗浄した後、 0. 1Mグリシン - 塩酸緩衝液 (pH2. 7) で抗体を溶出した。 溶出液を 1M トリス-塩酸緩衝液 (pH9. 0 ) で中和後、 限外濾過 （セントリプラス一 2 0、 分子量カット 30, 000 :アミコン ) で濃縮した。 PBSで平衡化した PD- 10脱塩カラム （フアルマシア） で PBSにパッフ ァー交換した後、 再度限外濾過で濃縮して、 HN- 1の PBS溶液 160 /i lを得た。 蛋白 濃度をゥシ ·ガンマグロプリンを標品として、 BCA protein assay (Pierce社） に. より求めた結果、 37. 6mg/mlであった。
[実施例 1 3 ] 抗 HNモノクローナル抗体、 H - 1の F (ab，）2 フラグメント化 実施例 1 2の精製モノクローナル抗体 HN- 1を 0. 2M酢酸緩衝液 (pH4. 5) で希釈 して 2mg蛋白/ mlに調製した。 蛋白溶液 2. 351111に0.
Figure imgf000044_0001
に調製したぺプシン （Sig ma社） の 0. 2M酢酸緩衝液 (pH4. 5) を 2. 35ml添カ卩して、 37°Cで 21時間反応を行った 。 1N水酸化ナトリウム 700〃 1で中和した後、 PBSを加えて全量 25mlとした。 この 溶液を PBSで平衡ィヒした lmlの Protein Aカラム （フアルマシア） に負荷し、 未反応 の抗体を吸着させた。 カラムを素通りした画分を回収し、 実施例 1 2に準じて限 外濾過により濃縮した。 濃縮液をさらに、 PBSで平衡ィ匕したセフアデックス 75カラ ム （フアルマシア） を用いたゲル濾過法により精製した。 限外濾過により濃縮し 、 H -1の F(ab，）2 フラグメント （以下 HN- 1/F (ab，） 2 ) の PBS溶液を 300 1回収し た。 実施例 1 2同様に蛋白濃度測定を行った結果、 4. 08mg/mlの HN-1/F(ab' ) 2 を 得た。
[実施例 1 4 ] NHS法による葉酸結合モノクローナル抗体の調製
( 1 ) HS活性化棄酸の合成 '
合成は Robertらの方法 （Journal of Biological Chemistry: Feb. 4, 269 (5)， 3198-3204, 1994) に準じて行った。 即ち、 葉酸 （Sigma社） をジメチルスルフォ キシド （DMS0) に溶解して、 50mg/mlの溶液を調製した。 250 μ 1のトリェチルアミ ン （Pierce社） 、 470mgのジシクロへキシルカルポジイミド （東京化成） 、 および 260mgの N-ヒドロキシスクシンイミド （NHS、 Sigma社） を順に加え、 室温、 暗所で ー晚攪拌した。 析出した副反応物を濾過により除去し、 濾過液を 250mlのジェチル エーテルに攪拌しながら滴下した。 析出した黄色沈殿をエーテル洗浄を繰り返し 、 減圧乾燥して、 NHS活性化葉酸を得た。
( 2 ) 葉酸結合 HN - 1の調製
実施例 1 2の方法に準じて精製した HN- 1の 2. Omg蛋白/ ml PBS溶液 100 1と 0. 5M ほう酸緩衝液 (pH8. 5) 100 μ 1を混和したものを反応溶液とした。 実施例 1 4一 ( 1 ) 記載の NHS活性化葉酸の DMS0溶液 （5mgまたは 10mg/ral) 2. 5// 1を滴下して、 室温、 暗所 1時間反応を行った。 室温、 暗所で 1時間反応を行った後に、 PBSで平衡 化した PD- 10カラムで未反応の葉酸を除去し、 蛋白画分を回収した。 P艮外濾過法で 濃縮して、 葉酸結合 -1を得た。 蛋白濃度は実施例 1 2に準じて測定した。
( 3 ) 葉酸結合 HN- 1/F(ab，）2 の調製
実施例 1 4一 ( 2 ) の HN- 1 を HN- 1/F(ab，）2溶液に、 NHS活性化葉酸の濃度を 10 mg/mlに変更して、 同様に反応、 精製を行い葉酸結合 HN- 1/F(ab' )2 を得た。
[実施例 1 5 ] 葉酸結合モノクローナル抗体修飾 SeVベタターの HA †生 実施例 1記載の NLS- LacZ/SeVを PBSで 1 X 108pfu/ralに希釈し、 96ゥエル丸底プ レートに 50 μ 1ずつ分注した。 実施例 1 2の方法に準じて精製した ΗΝ- 1、 実施例 1 3の ΗΝ - 1/F(ab' ) 2、 および実施例 1 4に記載した葉酸結合 HN-1ならびに葉酸結合 HN-1/F (ab， ) 2 を PBSで希釈して 1力 ら 100 μ g蛋白/ mlに調製した。 抗体希釈液 50 μ 1をベクターと混和して、 室温で 30分静置して、 修飾ベクターを調製した （図 6 ) 。 その後、 実施例 1の方法に従って、 H Jを測定した。
図 7に HAUの測定結果を^す。 いずれの修飾体も抗体添加量の増加に伴って； ΗΑ Uが低下し、 lO /z g/ml以上の抗体濃度では検出限界以下となった。 また、 葉酸の結 合による HAUの阻害活性の極端な低下は認められなかつた。 これらのことから、 赤 血球とのインタラクションを著しく低減させた、 葉酸結合抗体修飾 SeVベタタ一の 調製が可能となった。
[実施例 1 6 ] 葉酸結合モノクローナル抗体修飾 SeVベタターの溶血活性 実施例 1記載の NLS- LacZZSeVを PBSで 1 X 109pfu/mlに希釈し、 96ゥエル丸底プ レートに 50 1ずつ分注した。 実施例 1 2の方法に準じて精製した HN- 1、 およぴ実 施例 1 4に記載した葉酸結合 HN- 1を PBSで 100 μ g蛋白/ mlに希釈した。 抗体希釈液 または PBS 50 μ 1をベクターと混和して、 室温で 30分静置して、 修飾ベクターを 調製した。 溶血活性は、 実施例 4記載の方法のラット血液を I X 109細胞数/ mLの二 ヮトリ赤血球 PBS溶液に、 インキュベート時間を 30分に変更した以外は同様に行い 、 溶血活性を調べた。
図 8に溶血活性の測定結果を示す。 HN- 1および葉酸結合 HN- 1で修飾した SeVベタ ターの溶血活性は非常に小さかった。 SeVベクターの溶血活性と比較すると、 1/10 0濃度の SeVべクターよりも低い溶血活性であった。
[実施例 1 7 ] 葉酸結合モノクローナル抗体修飾 SeVベクタ一のインビトロ遺伝 子導入試験
実施例 1 5の、 SeVベクターを l X l07pfu/mlに、 抗体濃度を 10 g/mlに変更して 修飾ベクターを調製した。 実験前日に KB細胞 （ヒト鼻咽腔ガン由来） を 12wellプ レートに lwellあたり 2 X 105細胞数 （10e/。FCS添加、 葉酸不含 RPMI1640培地： Gibco - BRL、 lml/well) でシードした。 実験 1時間前に培地を 0. 5mlの葉酸不含 RPMI 1640 培地または同培地に ImMの葉酸を添加した培地に交換して使用した。 上記ベクター 液を 20 / /wellで加え、 37°C、 5% C02で感染を行った。 3時間後にベクターを除 き、 培地で 2回洗浄後、 新たにゥエルあたり 2mlの培地を加え、 37°C、 5% C02で 48 時間培養した。 LacZ遺伝子発現の測定は実施例 3に準じて行つた。
図 9 ίこ KB細胞における LacZ遺伝子発現の結果を示す。 Hi卜 1修飾 SeVベクターの遺 伝子発現は、 未修飾の SeVベクターの 100分の 1以下となり、 HAUの消失に伴う遺伝 子導入の低下を認めた。 一方、 葉酸結合 HN- 1については、 葉酸非結合に比べ有意 な遺伝子発現の増加を認め、 未修飾 SeVベタタ一の約 15%の遺伝子導入を示した。 過剰の葉酸が培地中に存在したときに、 葉酸結合 HN-1において遺伝子導入に阻害 が認められたことから、 葉酸結合 HN-1による遺伝子導入は、 リガンドとして結合 した葉酸が KB細胞の葉酸レセプターに結合し、 その後 F蛋白による融合により起こ つたと推測された。
図 1 0に抗体分子が HN- 1/F(ab' )2 のときの比較を行った。 HN- 1同様に HN- 1/F(a b' ) 2 においても、 葉酸結合のときにのみ高い遺伝子導入を示した。
[実施例 1 8 ] EDC法による葉酸結合 HN - 1の調製と修飾体の評価
( 1 ) EDC法による葉酸結合 HN- 1の調製
Leamonらの報告の方法に従って調製した （Journal of Biological Chemistry, 1992, 267, (35), 24966-24971) 。 即ち、 ジメチルスルフォキシド （DMS0) に溶解し た、 10mg/mlの葉酸 （Sigma社） 溶液 lmlに 21. 7mg/mlの 1 -ェチル -3- (-ジメチルアミ ノプロピル）カルポジイミド （EDC : Sigma社） の DMS0溶液 lmlを加え、 室温、 喑所 で 30分静置した。 PBSで lmg蛋白/ mlに調製した実施例 1 2の HN- 1溶液 300 μ 1に前記 の葉酸一 EDC溶液 16. 6 i lを攪拌しながら滴下した。 室温、 暗所で 1時間反応を行つ た後に、 実施例 1 4— ( 2 ) と同様にして葉酸結合 HN-1を得た。
( 2 ) 葉酸結合 HN - 1修飾 SeVベクタ一の HA活性
実施例 1 5の葉酸結合 HN- 1を実施例 1 8— （ 1 ) 記載のものに変更して修飾べ クタ一を調製し、 HAUを測定した。
図 1 1に示すように、 EDC法で調製した葉酸結合 HN- 1についても同様に、 SeVベ クタ一を修飾することでその HAUを消失させる効果があった。
( 3 ) 葉酸結合 HN-1修飾 SeVベタターによる遺伝子発現
実施例 1の SeVベタタ一の 1 X 107pfu/ml溶液と、実施例 1 2の HN- 1ならぴに実施 例 1 8— （ 1 ) 記載の葉酸結合 HN- 1の 100 μ g/ml溶液を'用いて修飾べクターを調製 した。 実施例 1 6の KB細胞に加えて、 A549細胞 （ヒト肺カルシノーマ） を使用し て、 同様に感染実験を行った。
表 4に葉酸レセプターを高発現している KB細胞と、 レセプターがほとんどない A 549細胞 (Wang et al. , Bioconjugate Chemistry. 1997， 8, 673-679) の遺伝子 発現の比較を行った。 葉酸結合 HN-1修飾 SeVベクターは KB細胞の、 過剰葉酸非存在 下でのみ高い遺伝子導入を示したことから、 HN蛋白のへマグルチニン活性に置き 換えた葉酸リガンドが葉酸レセプターへの結合を担うことにより特異的に遺伝子 導入をすることがわかった。
表 4
LacZ遺伝子発現相対比 （SeVベクター、 過剰葉酸 （-) を 100%とする） 過剰葉酸 K B細胞 A 5 4 9細胞
100.0±10.9 100.0+6.6
SeVベクタ一
+ 107.7±12.3 142.1+13.3
HN - 1修飾
0.5±0.1 0.8±0.1
SeVベクター
14.8+1.3 3.2+0.7
葉酸結合 HN- 1修飾
SeVベクタ一
+ 2.4+0.1 2.4±0.6
[実施例 1 9 ] GFP搭載 SeVベタターの調製と精製
GFP遺伝子を搭載した SeV/GFPは既報の方法により作製した （Kato et al. , Gene s Cells, 1996, 1, 569 - 579; Hasan et al. , J. Gen. Virol. , 1997, 78， 2813-2 820) 。 このベクターを鶏有精卵 （10日卵） に接種して、 35. 3°Cにて 3日間培養後 、 しょう尿液を回収した。 4°C, 3000 rpm, 30 minの遠心後、 上清を 4°C， 35000g, 1 h遠心してベクターを沈殿させた。 PBSに再懸濁後、 再度 4°C， 3000 rpm, 30 mi nの遠心をし、 上清を 4°C, 35000g， 1 h遠心してベクターを沈殿させた。 PBSに再 懸濁して精製ベクターのストック （以下 SeV^クタ一と表記） を調製した。 ベクタ 一の蛋白濃度は、 等容の 3% Triton Χ-100溶液で可溶ィヒしたものを検体として用い 、 BSAを標品として、 BCA Protein assay (Pierce社） にて測定した。 精製べクタ 一は約 1 mg蛋白/ mlであった。 雇 27
48
[実施例 2 0 ] SPA-PEG2K修飾 SeVベクターの調製
実施例 1 9の SeVベタターのストツク 0. 5 mlに 0. 5 mlホゥ酸緩衝液 (pH8. 5) を 加え、 0. 5 mg蛋白/ mlの pH8. 5溶液を調製した。 分子量 2000のスクシニミジル ·プ 口ピオン酸誘導体 PEG試薬 （SPA- PEG2K、 Shearwater Polymers社） を 0、 2、 4、 6、 8、 10 mgを上記溶液に攪拌しながら少量ずつ加え、 室温で 1時間反応を行った。 反応終了後、 反応液を 4°C, 15000 rpra, 1 h遠心後、 沈殿を水冷 PBSに懸濁し、 再 度 4°C， 15000 rpm, 1 h遠心によりベクターを回収し、 0. 5 mlの PBSに再懸濁して 、 SPA- PEG2K修飾 SeVベクターを得た。 修飾ベクターの蛋白濃度は実施例 1 9と同 様に求めた。
[実施例 2 1 ] SPA - PEG5K修飾 SeVベタターの調製
実施例 2 0の SPA- PEG2Kを分子量 5000の SPA- PEG5K (Shearwater Polymers社） に 変更して PEG反応量を 0、 5、 10、 15、 20、 25 mgで同様に反応 ·精製を行い、 SPA - P EG5K修飾 SeVを得た。 修飾ベクターの蛋白濃度は実施例 1 9と同様に求めた。
[実施例 2 2 ] PEG2NHS - 10K修飾 SeVベクタ一の調製
実施例 2 0の SPA- PEG2Kを分子量 10000の PEG2NHS- 10K ( 2本鎖、 Shearwater Pol ymers社） に変更して PEG反応量を 0、 10、 20、 30、 40、 50 mgで同様に反応 ·精製 を行い、 PEG2NHS-10K修飾 SeVを得た。 修飾ベクターの蛋白濃度は実施例 1 9と同 様に求めた。
[実施例 2 3 ] PEG^飾 SeVベタターの赤血球凝集活性 (HAU) と in vitro感染性 (CIU)
実施例 2 0、 2 1、 2 2に記載した PEG^飾 SeVべクタ一について赤血球凝集活 性 （HAU) 及ぴ in vitro感染性 （CIU) を調べた。 図 1 2、 1 3および 1 4に示し たように、 上記 3種類 PEG^ SeVべクタ一の HAU及ぴ CIUを測定したところ、 何れ も PEG反応量の増加によって HAUと CIUが低下する傾向が見られた。 分子量が大き いほど、 反応量の增カ卩による HAUと CIUの低減幅が小さい。 また、 Uと CIUの相関 を考察したところ、 適量の SPA-PEG5K修飾した場合、 未修飾と比べて 1 HAUあたり の CIUが約 7- 8倍高かった。 これは PEG^飾によって感染性を維持しつつ、 赤血球凝 集を低減し、 血中安定性を向上できる可能性を示すと考えられる。
HAUは以下のように求めた。 ベクターを 96 well丸底プレート （旭テクノグラス 社） 内で PBSで順次 2倍希釈を行った （50 μ ΐ) 。 各 wellに PBSで洗浄した 1%ニヮト リ赤血球液を 50 1ずつ加え、 4°Cで 1時間静置後に判定を行った。 画は赤血球凝 集を引き起こすベクターの最大希釈倍数で表した。
CIUは以下のように求めた。 ベクターを PBS/1%BSAで順次 10倍希釈を行い、 24 - we 11でコンブルエントになった LLC-MK2細胞へ 10 1/well感染させ、 2日後、 wellあ たりの GFP発現細胞数を数えて算出した。
[実施例 2 4 ] PEG^飾の確認
実施例 2 0、 2 1、 2 2に記載した PEG^飾 SeVベタタ を 0. 5 μ g/laneを用いて SDS- PAGEを行つた。 図 1 5に示したように、 ゲルを銀染色してウイルスべクタ一 の組成蛋白を分析したところ、 エンベロープ蛋白である Fと HNに由来するバンドが PEG反応量の増大に伴って減少し、 代わりに高分子量画分にパンドが出現した。 HN 蛋白と比べて F蛋白量の減少が少なかったことから、 比較的に HN蛋白が F蛋白より 多く修飾されたことが考えられる。 また、 図 1 6に示したように、 ウェスタンプ ロッテイングでゥサギ由来の抗 F1 ポリクローナル抗体とマウス由来抗 H モノク 口ーナル抗体を用 ヽて PEG^飾 SeVベクタ一のェンベロープ蛋白である Fと HN蛋白を 分析したところ、 銀染色と同じような結果が得られた。
[実施例 2 5 ] 中和抗体存在下での PEG2- NHS10K修飾 SeVベタターによる in vitr oでの遺伝子導入
実施例 2 2に準じて PEG反応量を 0、 15、 20、 25mgで同様に反応 '精製を行い、 P EG2-NHS10K修飾 SeVを得た。 修飾ベクターの蛋白 度は実施例 1 9と同様に求めた 。 ベクター溶液を PBS/1%BSAで希釈し、 O. Ol ^u g/ μ Ιに調製した。 ベクター溶液 35 に、 SeVをゥサギに免疫して調製した抗 SeV抗血清 （56°C、 1時間処理） の 10、 100及ぴ 1000倍希釈血清または PBS/1%BSA 35 μ 1を添加して、 室温で 1時間処理し た。 24-wellにコンフルェントになった LLC- K2細胞へ上記抗血清処理ベクター溶 液を wellあたり 20 / l加え、 感染を行った。 感染後 3日目の GFP発現は蛍光顕微 鏡で写真を撮影し、 また蛍光プレートリーダを用いて励起波長 485 nm、 蛍光波長 530 nmで測定した GFP蛍光強度で定量的に評価した。
図 1 7に示したように、 未修飾の SeVベクターは抗体濃度の増加によって感染効 率が低下する傾向が見られたが、 PEG2- NHS10Kの修飾によって、 その低下が押さえ られ、 どの抗体濃度でも未修飾と比べて感染効率が高く、 最大約70%の感染効率 の改善が見られた。
[実施例 2 6 ] PEG2- NHS10K修飾 SeVべクターによる in vivoでの遺伝子導入 実施例 2 5に PEG反応量を 0 mgで調製した未修飾 SeVコントロールと 20 mgで調製 した PEG修飾 SeVを用いてマウスへの繰り返し投与を行った。 図 1 8および 1 9に 示したように、 実験群は 5グループに分け、 1回目で Ludf erase搭載 SeVを点鼻投 与して抗 SeV抗体を作らせ、 2週間後にグルー 7¾では GFP搭載の未修飾 SeVコント ロール、 グノレープ Cでは、 PEG修飾 SeVを用いて 2回目投与を行った。 グループ Aは 未処置コントロール、 Dと Eは 1回のみ投与のコントロールとした。 1回目投与の 前、 投与後 1週間、 2週間の時点でマウスから採血し、 市販の ELISAキット （プレ ザィム 「生研 J デンカ生研株式会社） を用いて抗 SeV抗体価を測定した。 1回目 投与をしたグループ B、 Cのマウスでは抗 SeV抗体価の上昇が見られた。 この抗体価 が十分上がった 2週間目に 2回目の投与を行い、 2日後マウスを解剖し、 肺での G FP発現を蛍光顕微鏡で観察し、 写真を撮影した。
図 1 9の蛍光写真で示したように、 1回目の投与では、 広い範囲にわたって SeV の感染が見られ、 未修飾と PEG修飾したべクタ一の間に大きな差は見られなかつた 。 2回目の投^では、 未修飾の場合、 GFP発現が全体像からほとんど見えず、 拡大 しても肺表面の一部にまばらにしカ 察できなかった。 一方、 PEGf!i飾した場合、 1回目と比べれば少なかつたが、 GFP発現細胞は未修飾と比べて多く、 より広い範 囲に観察された。 特に拡大した写真に見られるような GFP発現細胞のコロニーが観 察された。
[実施例 2 7 ] PEG 飾による SeVの 4°C保存条件での感染性維持効果
実施例 2 0の SPA- PEG2Kを分子量 20000の PEG2NHS-20K ( 2本鎖、 Shearwater Pol ymers社） に変更して PEG反応量を 10、 20、 40 mgで、 分子量 40000の PEG2NHS- 40K ( 2本鎖、 Shearwater Polymers社） に変更して PEG反応量を 20、 40、 80 mgで、 同様 に反応 ·精製を行い、 PEG2NHS - 20K修飾 SeVと PEG2NHS- 40K修飾 SeVを得た。 修飾べ クタ一の蛋白濃度は実施例 1 9と同様に求めた。
実施例 5で用いた方法で、 4°Cで 8日と 2 0日保存した上記 PE (^飾 SeVと未処置 SeVの CIUを測定した。 図 2 0に示したように、 未処置 SeVコントロールは 4°Cで 2 週間保存した後、 タイターが 3分の 1に低下したが、 適量の高分子量の 2本鎖 PEG で修飾したものは最大 80%近!、感染効率を維持した。
[実施例 2 8 ] PEI修飾による PEGl!i飾 SeVの感染効率の改善
実施例 2 1に PEG反応量を 0、 5、 10、 15 mgで調製したものを分子量 750000の pol yethylenimine (PEI, SIGMA社）を用いて PEI : SeV重量比 0、 0. 01、 0. 025、 0. 05、 0 . 1、 0. 2で修飾し、 LLC- MK2細胞への感染効率を測定した （測定方法は実施例 2 3 を参照） 。 図 2 1に示したように、 一定量の PEI添加では、 PEG修飾した SeVの感 染効率を約 10倍増加する効果があつた。 PEG 飾量が多いほど PEIの感染効率の改 善効果があった。 分子量 25000の PEI (SIGMA社） でも同様な結果が得られた。 産業上の利用の可能性
薬物治療または遺伝子治療において薬物 （特に高分子化合物） や核酸等の生理 活性物質を、 目的とする細胞または細胞内 a織に到達させるシステム、 すなわち ドラッグデリパリ一システム （Drug Delivery System；以下単に DDSと言う） は重 要な技術分野である。 DDSはウィルスベクターを用いて、 あるいは人工的なまたは 半人工的な輸送担体 （キャリアー） に、 所望の生理活性物質を封入または担持さ せた組成物を投与することにより実施することができるが、 本発明によりこの両 方においてへマダルチ-ン活性を低下させ、 血中での安定性およぴ遺伝子導入効 率を向上させることが可能となった。 例えばウィルスベクターを用レ、た DDSでは、 マイナス鎖醒ゥィルスベクターあるいは該ウイルスのへマグルチ二ン活性を持つ エンベロープ遺伝子でシユード化したウイルスベクターなどに本発明を適用すれ ば、 へマグルチニン活性を特異的に低下させたウィルスベクターを製造すること ができる。 また人工的にリボソーム等を調製する場合においても、 本発明を適用 することによりへマグルチニン活性を低下させることができる。 本発明を用いて 製造される DDSのための組成物は、 生体内への適用に極めて優れた効果を発揮する

Claims

請求の範囲
1 . マイナス鎖 RNAウィルスのへマダルチュン活性を有するエンベロープ蛋白質を 有する細胞膜を含む、 薬剤または遺伝子運搬組成物であって、 （a ) 該蛋白質に 化合物が付加されており、 （b ) 該化合物が付加されていない場合に比べへマグ ルチニン活性が低下しており、 （c ) 該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導 入する能力を有する、 組成物。
2 . さらに （d ) 該ィ匕合物が付加されていない場合に比ぺ赤血球に対する溶血活 性が低下している、 請求項 1に記載の組成物。
3 . 該組成物が、 該マイナス鎖 RNAウィルスの感染性ウィルス粒子を含む組成物で ある、 請求項 1または 2に記載の組成物。
4. 該組成物が、 該マイナス鎖 RNAウィルスの不活ィ匕ウィルスまたは該ウィルスの エンベロープの部分を含む、 請求項 1または 2に記載の組成物。
5 . 該マイナス鎖 RNAウィルスが、 パラミクソウィルス科ウィルスである、 請求項 1力 ら 4のいずれかに記載の糸且成物。
6. 該パラミクソウィルス科ウィルスが、 センダイウィルスである、 請求項 5に 記載の組成物。
7. 該蛋白質に付加されている化合物が分子量 1, 800以上である、 請求項 1から 6 のいずれかに記載の組成物。
8 . 該蛋白質に付加されている化合物が分子量 4, 500以上である、 請求項 7に記載 の組成物。
9 . 該蛋白質に付加されている化合物が分子量 16, 000以上である、 請求項 8に記 载の組成物。 ' '
1 0. 該蛋白質に付加されている化合物がポリエチレングリコールである、 請求 項 1から 9のいずれかに記載の組成物。
1 1 . 該蛋白質が、 さらにポリエチレンィミンと共に複合体を形成している、 請 求項 1から 10のいずれかに記載の組成物。
12. 該蛋白質が、 細胞に結合する化合物と共に複合体を形成している、 請求項 1力 ら 11のいずれかに記載の組成物。
13. 該細胞に結合する化合物が、 該蛋白質に付加されている化合物と結合して いる、 請求項 12に記載の組成物。
14. 該蛋白質に付加されている化合物が、 該蛋白質に結合する抗体またはその 断片である、 請求項 12または 13に記載の組成物。
15. 該細胞に結合する化合物が、 細胞表面の受容体のリガンドである、 請求項 12から 14のいずれかに記載の組成物。
16. 該リガンドが葉酸である、 請求項 15に記載の組成物。
17. マイナス鎖 RNAウィルスのへマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質 に結合する抗体またはその断片であって、 細胞に結合する化合物が結合している 抗体またはその断片。
18. 抗体またはその断片が F(ab')2である、 請求項 17に記載の抗体またはその 断片。
19. 細胞に結合する化合物が細胞表面の受容体のリガンドである、 請求項 17 または 18に記載の抗体またはその断片。
20. 該リガンドが葉酸である、 請求項 19に記載の抗体またはその断片。
21. (a) マイナス鎖 RNAウィルスのへマグルチニン活性を有するエンベロープ 蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、 細胞に結合する化合物が結合し ている抗体またはその断片、 および （b) 該エンベロープ蛋白質を含む業剤また は遺伝子運搬組成物、 を含む薬剤または遺伝子運搬キット。
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