JPWO2002042481A1 - 血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用 - Google Patents

Abstract

本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用を提供する。パラミクソウイルスベクターを用いることにより、個体組織に血管新生遺伝子を効率良く導入することが可能となった。インビボ投与で導入されたＦＧＦ２遺伝子は、虚血組織において浮腫を伴うことなく血管新生遺伝子を発現し、虚血による壊死を防止した。本発明のベクターは、虚血組織を対象とした遺伝子治療に好適に用いられる。

Description

技術分野
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関する。
背景技術
近年、血管新生を誘導する増殖因子を用いた虚血疾患の治療に関する研究が進められている。例えば、心筋梗塞や急性虚血肢に対して、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）（Ｂａｆｆｏｕｒ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１６（２）：１８１−９１，１９９２）や内皮細胞増殖因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＥＣＧＦ）（Ｐｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５４（６）：５７５−８３，１９９３）の投与による治療効果が調べられている。より最近では、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ／ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒ；ＶＰＦ）が、心筋虚血および肢虚血の動物モデルにおいて、血管形成を促進することが示されている（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９０（５　Ｐｔ　２）：ＩＩ２２８−３４，１９９４；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３（２）：６６２−７０，１９９４）。
また、最近、血管新生を誘導する増殖因子を用いたヒト遺伝子治療の臨床試験が開始され、これを重症の虚血肢の血管新生治療に対して臨床応用する研究も進められている。内皮細胞特異的な増殖因子である血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）はこの目的にかなう治療遺伝子と見なされており、実際、プラスミドベクターを用いたヒトへの遺伝子導入において比較的良好な治療効果が報告されている（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９７，１１１４−１１２３（１９９８）；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２８，９６４−９７３（１９９８））。しかしながら、プラスミドを用いた筋肉への遺伝子導入および発現効率はさほど高くなく、ＶＥＧＦの筋中遺伝子投与の有害な副作用や毒性レベルについては、現在のところほとんど報告がない。最近の報告によれば、トランスジェニック（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８６，２５１１−２５１４（１９９９））またはアデノウイルス（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．６，４６０−４６３（２０００））によるＶＥＧＦの過剰発現が、遺伝子を導入された動物において異常な血管形成を起すこと、さらにプラスミドによる筋中へのＶＥＧＦ遺伝子導入が、ヒトの虚血肢において一過的な浮腫を起すことが示されているが（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９７，１１１４−１１２３（１９９８）；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２８，９６４−９７３（１９９８））、これらの詳細な機構は不明である。また、ＶＥＧＦの過剰発現は血管新生シグナルのバランスを崩し、血管腫様の脆弱毛細管を形成する可能性が考えられる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．６，１１０２−１１０３（２０００））。また、ＶＥＧＦをｉｎ　ｖｉｖｏで血管壁へ遺伝子導入した場合、血管腫様の内皮増殖により新生内膜の顕著な肥厚をもたらし、赤血球の血管外遊出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を引き起こし得る（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５，３１３−３２３（１９９６））。またレトロウイルスを用いて心筋に恒常的にＶＥＧＦを過剰発現させた場合でも同様の病理所見が観察されている（Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１０２，８９８−９０１（２０００））。また特に臨床適用を考えた場合、局所的に発現させたこれらの血管新生因子が全身の循環系に漏れ出すレベルは極めて重要な問題であり、予想外の血管新生の合併症による糖尿病性網膜症や腫瘍増殖が懸念される。
一方、主幹動脈が急性に閉塞することにより発症する急性重症虚血肢は主に血栓性閉塞に起因し、血管新生治療の対象となる重要な虚血疾患の一つである。急性重症虚血肢の後期治療の成績は極めて不良であり、多くの場合肢切断に至る。さらに肢切断に至った患者の生命予後も不良であり、１年生存率は５０％と低い。プラスミドによる遺伝子発現レベルは低く、このようなより重篤な急性動脈閉塞などに対する有効性は未だ不明である。
発明の開示
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその用途を提供することを課題とする。より詳しくは、本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクター、該ベクターを含む血管新生組成物、および該ベクターを利用して虚血組織の血管新生を促進する方法を提供する。
本発明者らの予備的な研究によれば、急性重症虚血肢のマウスモデルにおいて、プラスミドをベースにしたＶＥＧＦ１６５の遺伝子導入では救肢に成功しなかった（データ省略）。導入遺伝子をより強く発現させることにより、より良好な結果が得られるかを確かめるため、本発明者らは、様々な器官で高い効率で遺伝子を導入できることが示唆されている組み換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）を介した遺伝子導入により治療遺伝子を導入する研究を行った。実施例において本発明者らは、虚血肢治療のためのツールとして２つの組み換えＳｅＶベクター、すなわちヒトＶＥＧＦ１６５を発現するＳｅＶベクター、および、蛋白質として投与した時に血管新生作用を示す増殖因子であることが知られているＦＧＦ２（ｂＦＧＦとも言う）（Ｂａｆｆｏｕｒ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｓｕｒｇ．１６：１８１−１９１（１９９２））に着目し、マウスＦＧＦ−２を発現するＳｅＶベクターを構築して用いた。これらのベクターを用いて、（１）ＳｅＶを介した筋中遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルとカイネティクス、（２）血管新生因子の高発現が急性重症虚血肢の肢壊死を防げるか、若しくは逆に有害に作用するか、そして（３）筋中において高発現させた血管新生蛋白質が全身の循環系へ漏れ出すか否かについて実験を行った。
虚血モデルには、外腸骨動静脈から膝上大腿動静脈まで全てを抜去（重症虚血モデル）して得られるＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス下肢脱落モデル（ａｕｔｏ−ａｍｐｕｔａｔｉｏｎモデル）、同操作後の生理的血管新生により下肢脱落に至らないＣ５７ＢＬ／６マウス救肢モデル（ｌｉｍｂ　ｓａｌｖａｇｅモデル）を用いた。ヒトＶＥＧＦ１６５、マウスＦＧＦ２、またはルシフェラーゼを発現するベクター（それぞれＳｅＶ−ｈＶＥＧＦ１６５、ＳｅＶ−ｍＦＧＦ２、またはＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を構築し、虚血手術２日前に大腿筋、下腿筋に投与し、手術後１０日まで下肢の状態を観察した。
ルシフェラーゼ遺伝子を用いたマウス下肢骨格筋への遺伝子導入では、１００μｇのプラスミド投与での発現レベル（ヒト６０ｋｇに対し２００ｍｇ：臨床使用量の２５〜５０倍に相当）に比較して、ＳｅＶでは５〜１２０倍高い遺伝子発現が得られた。種々の培養細胞では、ＳｅＶ−ｈＶＥＧＦ１６５、ＳｅＶ−ｍＦＧＦ２ともに５０〜５００ｎｇ／１０^５ｃｅｌｌｓ／２４　ｈｏｕｒｓと高い蛋白の分泌を認めた。ＳｅＶ−ｍＦＧＦ２の筋肉内投与は、非投与対照（ベースライン）に比べＦＧＦ２レベルを５〜１００倍に上昇させたのに対して、ＳｅＶ−ｈＶＥＧＦ１６５の投与では筋肉において限られた発現しか示さず（最大でもベースラインの２倍）、内因性ＶＥＧＦの発現を顕著に増加させた。ＳｅＶ−ｈＶＥＧＦ１６５の投与においては、ベクター投与を受けた筋肉組織が投与後２日目には広汎な壊死に陥り、後肢の脱落を促進する結果となった。一方、ＳｅＶ−ｍＦＧＦ２投与では内因性ＶＥＧＦの発現を伴い、救肢において有意な治療効果が得られた。双方で血清中に有意なベクター由来蛋白の流出を認めなかった（＜５ｐｇ／ｍｌ）。救肢モデルでは手術のみ、ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群、およびＳｅＶ−ｍＦＧＦ２群において全て救肢されたが、ＳｅＶ−ｈＶＥＧＦ群だけは１／３以上の個体の下肢が脱落した。下肢脱落モデルではＦＧＦ２群でのみ高い救肢効果が得られ、他の群ではほとんどの下肢が脱落した。
本発明において、組み換えセンダイウイルスベクターの筋中投与が、導入遺伝子の発現を顕著に増強させることが実証された。組み換えセンダイウイルスベクターはプラスミドベクターに比べ１０〜１００倍以上高い発現を示したが、ＶＥＧＦ１６５を発現する組み換えセンダイウイルスベクターのｉｎ　ｖｉｖｏ投与においては、マウスの急性重症虚血肢における肢脱落をかえって増悪化させることが明らかとなった。ＳｅＶ−ｈＶＥＧＦ１６５の投与は浮腫を誘起させ（実施例４、図８）、虚血手術後の血流の回復を妨げた（実施例５、図１１および１２）。そして、虚血による肢脱落の比率を有意に増悪化させた（実施例５、図９および１０）。これはＶＥＧＦの強い血管透過性亢進作用が一因であると考えられる。これに対し、ＦＧＦ２を発現するセンダイウイルスベクターの投与は一定して高い治療効果を示した。どちらのモデルにおいても、全身の循環系に分泌された組み換え蛋白質は検出されないことから、他臓器への影響が少なく安全域が高いことが示唆された。これらの結果は、ヒトへの臨床適用において、特定の肢状態におけるＶＥＧＦの望ましくない効果に注意を払う必要があることを示している。そして、より広いレンジで安全性と治療効果を示すＦＧＦ２の遺伝子治療が、安全な遺伝子治療系と成り得ることが示された。また本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける治療遺伝子の導入における強力なツールであるＳｅＶベクターの有効性を実証すると共に、急性重症虚血肢に対する臨床治療における利用を可能とする。
即ち、本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関し、より具体的には、
（１）血管新生遺伝子を発現可能にコードするパラミクソウイルスベクター、
（２）血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、（１）に記載のパラミクソウイルスベクター、
（３）パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、（１）に記載のパラミクソウイルスベクター、
（４）Ｆ遺伝子を欠損している、（１）に記載のパラミクソウイルスベクター、
（５）（１）に記載のパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞、並びに薬学的に許容できる担体を含む、血管新生組成物、
（６）虚血組織を処置するための、（５）に記載の組成物、
（７）筋中投与用である、（５）に記載の組成物、
（８）（５）から（７）のいずれかに記載の血管新生組成物を投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法、に関する。
本発明により、（１）肢虚血が誘導する内因性ＶＥＧＦは筋中に局在するよりむしろ全身循環系に拡散するのに対し、本発明のベクターを介したＶＥＧＦ１６５の発現は全身循環系には有意に漏出しない、（２）内因性ＦＧＦ２の発現に比べ５〜１００倍高いレベルで外来性ＦＧＦ２を発現させても全身循環系への有意な拡散は見られない、（３）ＦＧＦ２のこのレベルの発現は内因性ＶＥＧＦの発現を誘導し、肢の血流を顕著に増加させ有意な救肢効果を示す、そして（４）ＶＥＧＦ１６５の過剰発現はＦＧＦ２とは対照的に肢破壊を誘導する、ことが示された。これらの知見は、特にＦＧＦ２は臨床応用に適しており、急性重症肢虚血の処置における治療血管新生因子として広い安全域を持っていることを示唆している。また本発明は、肢虚血に対するＶＥＧＦ１６５の遺伝子導入が深刻な有害効果をもたらし得ることを初めて明示するものである。
興味深いことに、肢虚血により誘導される内因性ＶＥＧＦは筋中に濃縮されるのではなく、全身循環系に拡散した。虚血手術が筋肉および内皮細胞（ＥＣ）において内因性ＶＥＧＦの発現を誘導することは知られていたが（Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．Ｚ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６２，３８８−３９９（１９９５））、本発明は、内因性ＶＥＧＦが、局所的な血管新生ではなく全身的な血管新生反応を誘導する可能性を示す初めての実験データを開示する。ＡｓａｈａｒａらはＶＥＧＦの全身投与は内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ；ＥＰＣｓ）の移動性を上昇させることを示しており（Ａｓａｈａｒａ，Ｔ，ｅｔ　ａｌ，ＥＭＢＯ　Ｊ．１８，３９６４−３９７２（１９９９））、肢虚血に対する生理的反応による側肢血管（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ　ｖｅｓｓｅｌｓ）の形成は、既存の血管から放出される増殖性ＥＣによる局所的血管新生（Ｉｓｎｅｒ　Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６，６１５−６１９（２０００））よりも、ＥＰＣを介した「血管新生様」の新血管形成（”ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｌｉｋｅ”　ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に、ある程度依存している可能性がある。虚血肢への遺伝子導入によるＶＥＧＦの誘導は有意な血流をもたらさず、肢脱落を起すことが判明したが、この場合、ＶＥＧＦは「血管新生因子」ではなく、主に「血管透過因子」として作用しているのかも知れない。これは、筋肉の組織学的観察によりＶＥＧＦ１６５群でより重篤な筋肉間浮腫が見られたことによっても支持される。
第二に、本発明によりＦＧＦ２の遺伝子治療はそれ自身のみで虚血肢の処置において効果を有しており、またｉｎ　ｖｉｖｏにおける内因性ＶＥＧＦの機能も関与していることが示された。ＦＧＦ２の遺伝子導入による筋中のＶＥＧＦのトータルな蛋白質濃度はＶＥＧＦ遺伝子導入における場合と同等であるが、ＦＧＦ２遺伝子治療自体は、ＶＥＧＦ遺伝子治療とは異なり十分な効果を示した。これらの知見は、虚血肢の治療に必要な血液を灌流させ、しかも血管漏出を起さないような成熟血管が形成されるには、ＶＥＧＦだけでなくＦＧＦ２も必要であることを示唆している。ＶＥＧＦにより誘導される未成熟血管の血管漏出を抑制する作用を持つ血管新生因子であるａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１がこれに貢献している可能性も考えられる。
ＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＳｅＶ−ＦＧＦ２と同様のレベルで遺伝子産物を分泌させることが示されていることから、ｉｎ　ｖｉｖｏの筋中において、注入されたＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５が、なぜＳｅＶ−ＦＧＦ２やＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと同じような発現を示さないのかは完全には明らかではない。組織学的な解析と同様、レーザードップラー灌流像（ＬＤＰＩ）解析でも筋組織の強い破壊と血液の灌流の低下が示されたことから、ＶＥＧＦ１６５が誘導する浮腫などの組織破壊の結果として、例えばチューブリン（Ｍｏｙｅｒ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，５４０５−５４０９（１９８６））やホスホグリセレートキナーゼ（Ｏｇｉｎｏ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５９９９−３６００８（１９９９））などのＳｅＶが媒介する転写の細胞内機構が障害される可能性が考えられる。あるいは、比較的低いレベルの内因性ＶＥＧＦ１６５遺伝子の発現（約２００ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ）が重症虚血筋では顕著に増加（１，４００ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ）するために、肢脱落が促進される可能性も考えられる。これらの結果は、筋中のＶＥＧＦ濃度の増加は、例えベースラインの２倍程度の低レベルであるとしても、重症の肢虚血をもたらす可能性を強く示唆している。
血管新生はよく調和された過程であり、多数の因子が関与していると考えられている。これらの因子の中でもＶＥＧＦの生物学的機能は、その用量に高度に依存しており、アレルが１つ欠失しただけでも致命的な欠損をもたらす（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８０，４３５−４３９（１９９６））。血管の統合および成熟の全過程においてＶＥＧＦの持続的な発現が必要であり、一過的なＶＥＧＦの発現は短時間の血管新生反応しか誘導せず（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０，９９−１１５（２０００））、さらにＶＥＧＦが誘導する毛細管様構造は既存の血管とはほとんど連結しない（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　２，５４９−５５８（１９９８））。従って、本発明の結果からは、十分なＦＧＦ２が存在しない場合に、筋中のＶＥＧＦ濃度が２倍を上回ると、非常に有毒となる可能性が示唆される。これらを考え合わせると、治療的血管新生においてＶＥＧＦは臨床的に非常に高い可能性を持つことに変りはないが、ＶＥＧＦの使用には、従来以上に注意を払うべきであることが示唆される。そして急性重症肢虚血の救肢における筋肉内へのＦＧＦ２遺伝子の導入は、安全で顕著な治療的効果を発揮することが実証された。
本発明において「パラミクソウイルスベクター」とは、パラミクソウイルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を指す。本発明のパラミクソウイルスベクターはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）であってもよく、また、感染力を持つウイルス粒子であってもよい。ここで「感染力」とは、組み換えパラミクソウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の遺伝子を導入することのできる能力を言う。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。複製能は、例えばサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２またはＣＶ−１などを用いて調べることができる。
本明細書において、「組み換え」パラミクソウイルスベクターとは、遺伝子操作により構築されたパラミクソウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるパラミクソウイルスベクターを言う。組み換えパラミクソウイルスベクターは、例えば、組み換えパラミクソウイルスｃＤＮＡを再構成して生成することができる。
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科に属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ　ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ　ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ　ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ　ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なパラミクソウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）、並びにその他の多くのパラミクソウイルス属ウイルスが含まれる。本発明のパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウイルスベクターを製造するための材料として使用することができる。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
パラミクソウイルス属　ＮＰ　　Ｐ／Ｃ／Ｖ　Ｍ　Ｆ　ＨＮ　−　　Ｌ
ルブラウイルス属　　　ＮＰ　　Ｐ／Ｖ　　　Ｍ　Ｆ　ＨＮ（ＳＨ）Ｌ
モービリウイルス属　　ＮＰ　　Ｐ／Ｃ／Ｖ　Ｍ　Ｆ　Ｈ　　−　　Ｌ
例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。
本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。一般に、遺伝子は蛋白質をコードしてもよく、また蛋白質をコードしていなくてもよい。遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその用途を提供する。本発明者等は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターをｉｎ　ｖｉｖｏで筋中に投与することにより、投与部位において導入遺伝子を高発現させることができることを実証した。本発明者等によるマウス虚血後肢の救肢実験では、血管新生遺伝子（ＦＧＦ２）をコードする組み換えパラミクソウイルスベクターの投与により、虚血組織の壊死が防止され、後肢の脱落を予防できることが示された。これらのベクターは虚血組織において効果的に血管新生を誘導し壊死を防止するために有用であり、本発明のベクターは虚血疾患に対する遺伝子治療に好適に用いられ得る。
また、本発明者等により、組み換えパラミクソウイルスベクターを利用して筋中に投与された遺伝子が、１〜２週間にわたり持続的に発現することが示された。このことは、組み換えパラミクソウイルスベクターを利用して血管新生因子の遺伝子治療を行った場合に、持続的な治療効果を得ることができるという利点をもたらす。さらに、筋中投与された組み換えパラミクソウイルスベクターから発現された血管新生因子は、全身の循環系では検出されず、対象組織以外での望ましくない副作用を惹起しない点でも有用であることが示された。このようにパラミクソウイルスベクターが血管新生遺伝子の導入において様々な利点を有するという本発明により得られた知見は、特に、虚血組織を標的とした遺伝子治療などにおいて大きな進歩をもたらす可能性を示している。
また、安全性の面においても、ヒトへの病原性が否定されているため、パラミクソウイルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好適に用いられうることが示唆される。第一に、プラスミドＤＮＡ等による外来遺伝子の発現は、多くの場合、導入したＤＮＡの核局在化または核膜の消失が必要であることが、遺伝子発現の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウイルスなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）の両方によってウイルスの複製に伴って駆動される。これは、センダイウイルスが宿主の染色体と相互作用しないことを示しており、染色体異常による細胞の癌化および不死化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ　１５：５３３−５４０，１９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうることを示唆し、センダイウイルスベクターが、血管新生遺伝子の遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。
本発明において血管新生遺伝子とは、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および／または血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）を直接または間接に促進する活性を有する因子をコードする遺伝子を指す。該因子は蛋白質またはペプチドであってもよく、また機能的ＲＮＡ（リボザイムやアンチセンスＲＮＡ）などの核酸であってもよい。血管新生蛋白質としては、例えば、酸性線維芽細胞増殖因子（ａｃｉｄｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　２；ＦＧＦ２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とも言われる）、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ；Ａｎｇ）（Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２を含む）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒａｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、血小板由来内皮増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＩＧＦ）、エリスロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ）−８、および一酸化窒素合成酵素（ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＯＳ）が挙げられる（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．ａｎｄ　Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．，Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９，１９９１；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．ａｎｄ　Ｓｈｉｎｇ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１６）：１０９３１−４，１９９２；Ｓｙｍｅｓ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ　Ｓｎｉｄｅｒｍａｎ，Ａ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．５（４）：３０５−１２，１９９４）。
本発明において好ましい血管新生蛋白質としては、例えば、ａＦＧＦ、ＦＧＦ２、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−α、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、およびＮＯＳなどが例示でき、これらから選択される蛋白質をコードする遺伝子を用いてベクターを作製することができる。
本発明に用いる血管新生蛋白質の中で特に好ましい蛋白質は、ＶＥＧＦにより誘導される未熟な血管新生ではなく、新生した内皮細胞に間葉系細胞が接着し、壁細胞に分化して血管を取り囲む作用を有する蛋白質である。血管形成は３つのプロセス（脈管形成、血管新生、血管成熟）からなることが知られ、成熟した血管形成は種々の転写因子ノックアウト実験から複数の遺伝子の関与が知られている。特に転写因子ＳＣＬ／ｔａｌ−１は主として脈管形成に関与し、ＨＩＦ−１、Ｉｄ、ＥＴＳ−１、ＨＯＸＤ_３

ａｃｔｏｒ）またはｄＨＡＮＤ遺伝子をノックアウトすると壁細胞が発達できず胎生致死となることが知られている。
従って本発明に用いる血管新生遺伝子としては、ＬＫＬＦおよびｄＨＡＮＤを含む、間葉系の未成熟な細胞において壁細胞の成熟に関与するところの転写因子を誘導する遺伝子であることがより好ましい。ＦＧＦ２の刺激は、これらの転写因子の誘導に直接関与しているか、他の増殖因子であるアンギオポイエチンおよびＨＧＦ等を通じて間葉系の細胞の増殖分化を促していると考えられる。
血管新生蛋白質は、好ましくは、該蛋白質を分泌させる分泌シグナル配列を含む。但し、ＦＧＦ２などは天然の典型的な分泌シグナルを持たなくても細胞外に分泌される（実施例参照）。このような蛋白質は、必ずしも分泌シグナルを持つ必要はない。これらの血管新生因子をコードする遺伝子は、例えば塩基配列情報を基にして設計したプライマーを用いたＰＣＲなどの公知の方法により調製することができる。本発明において用いられる特に好ましい血管新生因子としては、広範囲の発現レベルにおいて安定した治療効果を発揮するＦＧＦ２が例示できる（Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ　Ｊ．５：２５２３−２５２８；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．Ａ，ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ４９９４５５９；Ｂａｉｒｄ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ５１５５２１４；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ，ＵＳ６１２１２４６；ＷＯ９７／１４３０７）。
ベクターの搭載する血管新生遺伝子は、遺伝子導入の標的個体と同じ種に由来する遺伝子でなくとも効果を期待できるが、標的個体と同一種の遺伝子が好ましい。ベクターの搭載する血管新生遺伝子は、好ましくは哺乳動物の血管新生遺伝子であり、ヒトへの適用のためにはヒト遺伝子であることが好ましい。
本発明の血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターは、特に虚血組織の処置に有用である。すなわち、本発明のベクターを用いた血管新生遺伝子の遺伝子導入により、血管新生を促進し、虚血による壊死を防止することができる。本発明において虚血組織としては、虚血を起した組織および虚血を起しつつある組織であれは特に制限はない。このような組織には、例えば、筋肉、脳、腎臓、および肺が含まれる。本発明のベクター投与の対象となる虚血疾患には、例えば脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢の虚血、虚血性心筋症、および心筋虚血が挙げられる。本発明において、虚血組織の処置とは、虚血組織の治療または虚血障害の予防を指し、具体的には虚血組織の壊死の防止、虚血組織の生存、虚血組織における血管の新生の促進、組織再生、または虚血に起因する障害の防止・低減等を意味する。
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法を提供する。また本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを投与することを特徴とする、虚血組織を処置する方法を提供する。投与対象となる個体に特に制限はなく、例えばヒトを含む所望の哺乳動物が挙げられる。また投与対象として、特に非ヒト哺乳動物が挙げられ、具体的には、例えばサル等を含む霊長類（原猿、真猿の広鼻猿、および狭鼻猿の類人猿などを含む）、マウス、ラット、モルモットを含むげっ歯類、およびウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等が含まれる。本発明のベクターを用いれば、これらの動物に対する虚血治療が可能であり、あるいはヒト虚血治療のモデルとして利用することもできる（Ｍｏｒｉｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５：７１９−７３０；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　１１０：２５９−２７０）。
本発明の血管新生を誘導する方法は、具体的には以下を含む。〔１〕血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を投与する工程を含む、血管新性を誘導する方法、〔２〕血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、〔１〕に記載の方法、〔３〕投与が筋中投与である、〔１〕または〔２〕に記載の方法、〔４〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。また本発明の虚血組織を処置する方法は、具体的には以下を含む。〔１〕血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を投与する工程を含む、虚血組織を処置する方法、〔２〕血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、〔１〕に記載の方法、〔３〕投与が筋中投与である、〔１〕または〔２〕に記載の方法、〔４〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
投与はインビボであってもエクスビボであってもよい。インビボ投与の場合は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを筋肉注射、皮下注射、カテーテル投与等の当業者に公知の投与経路により注入することができる。エクスビボ投与の場合は、予め体外で細胞にこのベクターを導入する。その後、ベクターを導入した細胞を筋肉注射、皮下注射、カテーテル投与等により個体内に注入する。エクスビボ投与においてベクターを導入する細胞は、投与個体と異種または同種であってよいが、好ましくは同種、より好ましくは投与個体から採取した細胞である。さらに最も好ましくは、血管内皮細胞を形成または血管内皮細胞に分化し得る細胞すなわち血管内皮前駆細胞を含む、骨髄または血液由来の細胞である。薬学的有効量の本発明のベクターを投与することにより、投与組織において血管新生を誘導することができる。これにより、例えば脳、心臓、腎臓、肺、および四肢等の虚血において、組織の壊死および脱落を防止する治療が可能である。
また、本発明は、虚血組織を処置するための、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターの用途および使用を提供する。具体的には、本発明は、
〔１〕虚血組織を処置するための、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクター、
〔２〕血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子２〔ＦＧＦ２〕である、〔１〕に記載のベクター、
〔３〕筋中投与用である、〔１〕または〔２〕に記載のベクター、
〔４〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のベクター、を提供する。また本発明は、上記パラミクソウイルスベクターを含む、虚血組織を処置するための組成物を提供する。この組成物は、上記パラミクソウイルスベクター以外に、薬学的に許容される所望の担体を含んでよい。例えば本発明のベクターを生理的溶液と組み合わせて注射剤として、あるいは固体または半固体（ゲル）と組み合わせて体内埋め込み型製剤として製剤化して用いることができる。
本発明において血管新生遺伝子の導入に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、特に制限はない。好適なパラミクソウイルスベクターとして、例えば、複製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型パラミクソウイルスのゲノムは、３’の短いリーダー領域に続き、Ｎ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、Ｍ（マトリックス）、Ｆ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）、およびＬ（ラージ）蛋白質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、短い５’トレイラー領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能な本発明のベクターを製造することができる。また、ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。なお、本発明のパラミクソウイルスベクターにおいては、ウイルス遺伝子の配置は野生型ウイルスから改変されていてもよい。
また、本発明に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例えば、センダイウイルスベクターを再構成させる場合、ＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子から作られる蛋白質群がトランスに必要だと考えられているが、該蛋白質群をコードする遺伝子自体は、本発明のウイルスベクターに必ずしも含まれている必要なはい。例えば、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ベクターゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ベクターの再構成を行うことができる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、パラミクソウイルスベクターが細胞に伝播してゆくためには、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているが、パラミクソウイルスベクターをＲＮＰとして調製する場合は、これらの蛋白質は必要ない。ＲＮＰに含まれるゲノムに、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウイルス粒子が形成される。感染性ウイルスを産生するＲＮＰベクターとしては、例えばＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子をコードするウイルスゲノムＲＮＡと、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質とを含むＲＮＰが挙げられる。このようなＲＮＰを細胞内に導入すると、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質の働きによりウイルスゲノムが発現、複製され、感染性ウイルスベクターが増幅する。
ＲＮＰを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ　＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：３０１５）。複製型ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、鶏卵、個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染させて増幅または継代することができる。
また、Ｍ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子が含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、特にＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。遺伝子の欠損とは、その遺伝子の機能が実質的に失われることをいい、その遺伝子が蛋白質をコードする場合においては、その野生型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質が発現しないことを言う。例えば、その遺伝子が転写されないこと、ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ変異体であること、または欠失していることなどであってよい。好ましくは、遺伝子の欠損とはその遺伝子のコード領域の少なくとも一部が、より好ましくは全部が欠失していることである。例えば、Ｆ遺伝子が欠損しているベクターは、好ましくはＦ蛋白質のコード領域の一部、より好ましくは全部を欠失しているベクターである。本発明のＦ遺伝子欠損ベクターは、より好ましくは、そのネガティブ鎖ゲノムにおいて欠損したＦ遺伝子の３’隣接部位のスタートシグナル配列をさらに欠損している。これにより、欠損部位からの必要のないポリペプチドの発現を抑制することができる。欠損部位に必要のないポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する場合には、部位特異的変異導入等によりそのＯＲＦを除去することが好ましい（後述）。
Ｆ遺伝子を欠損したベクターの製造においては、例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０）。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエンベロープに含むベクターを作製することもできる。このようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のパラミクソウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などに含まれる遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的には、例えば複製因子であるＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるＦ蛋白質を改変することにより、膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めたパラミクソウイルスベクターを作製することもできる。
また本発明におけるパラミクソウイルスベクターとしては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏにおける遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に好適である。
本発明のウイルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に血管新生遺伝子をコードする。外来遺伝子を含む組み換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、ベクター導入の標的とする組織（虚血組織等）において発現させたい所望の血管新生遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウイルスベクターのゲノムをコードするＤＮＡ（ウイルスベクターＤＮＡ）に対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクターＤＮＡにおいては、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間などに、６の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい（Ｃａｌａｉｎ　Ｐ．ａｎｄ　Ｒｏｕｘ　Ｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７（８），４８２２−４８３０）。外来遺伝子は、ウイルスの各遺伝子（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子）の前および／または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜Ｅ−Ｉ−Ｓ配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入し、各遺伝子の間にＥ−Ｉ−Ｓ配列を配置する。あるいは、ＩＲＥＳと共に外来遺伝子を挿入し得る。
挿入した外来遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいては、挿入位置がウイルスゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの３’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、ＮＰ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をＮＰ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においては３’側）またはＮＰ遺伝子とＰ遺伝子の間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖ＲＮＡの５’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、Ｌ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も５’側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはＬ遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の５’隣接部位）、またはＬ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の３’隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウイルスベクターの投与による血管新生遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、投与するウイルス力価を制限することができる他、例えばベクターにおける血管新生遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、個々のウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な治療効果が得られるようにすることも可能である。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターＤＮＡ中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明のベクターは、このように挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はなく、別の血管新生遺伝子であってもよく、また、その他の遺伝子であってもよい。
外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　２：４５７−４６６の記載に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、所望の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子を、ＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムをコードするＤＮＡに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅回収する。増幅された断片の両端がＮｏｔＩ部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、ＮｏｔＩ制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側（センス鎖）合成ＤＮＡ配列及びリバース側（アンチセンス鎖）合成ＤＮＡ配列（プライマーセット）を作成する。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、ＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを含め、ｃＤＮＡの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ　Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ　Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。さらに挿入断片の３’側にセンダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、Ｉ配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終止コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行い、増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを介さずにＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：５７８−５９８，１９９７，Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　２：４５７−４６６，１９９７；Ｌｉ，Ｈ．Ｏ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７４，６５６４−６５６９，２０００）。例えば、まずＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ−タンパク質をコードする配列の５’末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７８：２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスベクターＤＮＡを試験管内または細胞内で転写させ、ウイルスのＬ、Ｐ、およびＮＰタンパク質の共存下でＲＮＰを再構成させると、このＲＮＰを含むウイルスベクターを生成させることができる。本発明は、血管新生遺伝子をコードする本発明のパラミクソウイルスベクターのゲノムを転写および複製する蛋白質の共存下、該ゲノムをコードするＤＮＡを細胞内で転写させる工程、および生成したパラミクソウイルスベクターを回収する工程を含む、該ベクターの製造方法を提供する。パラミクソウイルスベクターのゲノムを転写および複製する蛋白質としては、例えばＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質である。また本発明は、該ＤＮＡからなる、本発明のパラミクソウイルスベクター製造用ＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のパラミクソウイルスベクターを製造するための、該ベクターのゲノムをコードするＤＮＡの使用に関する。ウイルスベクターＤＮＡからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ　Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含む所望のパラミクソウイルスベクターをＤＮＡから再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
例えば、ベクターＤＮＡを細胞内に導入する方法には、次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ　＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ　１１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ_２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ　＃Ｄ−９８８５　Ｍ．Ｗ．５×１０^５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、本発明においては、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ　Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ　Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに限定されない。
ｃＤＮＡからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿上で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２を７０〜８０％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ　ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間が適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜５μｇの上記の組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド（２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、１２−０．２５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｌ、より好ましくは例えば１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションして培養する。培養３〜７日後に培養液を回収する。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。培養上清に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる。ＨＡは「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆　Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｏ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ　Ｂａｋｅｒ　ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）により決定することができる。混入し得るワクシニアウイルスｖＴＦ７−３を除去するために、得られた尿液試料を適宜希釈（例えば１０^６倍）して、鶏卵で再増幅させることができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返すことができる。得られたウイルスストックは−８０℃で保存することができる。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、サル腎由来のＬＬＣＭＫ２細胞、ＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。また、次に述べるＦ欠失センダイウイルスの大量生産には、トリプシン耐性の細胞（例えばＬＬＣＭＫ２など）が好ましい。
Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、例えば以下のように行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
１．外来遺伝子搭載用Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）の全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８，２８１３−２８２０，１９９７）（「ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８^＋」ともいう）をＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損はＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行ない、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いてａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲ法としては、Ｆの上流にはｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ（配列番号：５）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ（配列番号：６）、Ｆ遺伝子の下流にはｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：７）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ（配列番号：８）のプライマー対を用い、得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このようにして得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して断片を回収し、ｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦを得る。
なお、この構造はＦ遺伝子のＥＩＳ配列（ＳｅＶ特異的配列、Ｅ；ｅｎｄ，Ｉ；ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ，Ｓ；ｓｔａｒｔ）が残存し、下流のＦ遺伝子のＯＲＦは除かれているものの、この部位の連結に用いたプライマー由来の５アミノ酸ペプチドが発現する可能性のある構造になっている。
Ｆ遺伝子の欠損位置への外来遺伝子の挿入は、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位を利用して行う。このためには、例えば外来遺伝子断片をＮｓｉＩ−ｔａｉｌｄプライマーおよびＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
例えば実際にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰ）を構築する場合には、まずＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲによる増幅を行なう。ＥＧＦＰ遺伝子断片の塩基数を６の倍数（Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＲＮＡ　２，１０３３−１０４５，１９９６）に合わせるため、５’末端はＮｓｉ−ｔａｉｌｅｄプライマー（５’−ａｔｇｃａｔａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃ／配列番号：９）、３’末端はＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマー（５’−ｔｇｃｃｇｇｃｔａｔｔａｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃ／配列番号：１０）を用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を制限酵素ＭｓｉＩとＮｇｏＭＩＶで消化してゲルから断片を回収し、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にあるＮｓｉＩとＮｇｏＭＩＶという制限酵素部位に連結し、シークエンスを確認する。ここからＥＧＦＰ遺伝子を含むＤｒａＩＩＩ断片を回収し、ｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰを得る。
ＮＰ遺伝子の前の位置への外来遺伝子の挿入は、ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ或いはｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰの制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を利用して行う。ただし、ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦの場合は、欠失したＦ遺伝子位置に連結に用いたプライマー由来の５アミノ酸ペプチドが発現する可能性のある構造になっており、またｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰの場合はＧＦＰが共発現するので、必要であればそのペプチド及びＧＦＰが共発現する可能性のない遺伝子の構築を行う。そのためには下記の様に行なう。
ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩとＮｈｅＩで消化してＦ欠損部位を含む領域の断片（６２８８ｂｐ）を回収し、Ｌｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）にクローニングし、ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ／ΔＦ−ＧＦＰとする。欠損させたＦ遺伝子上流のＥＩＳ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子の欠損はＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法により行なう。すなわち、ＧＦＰ遺伝子上流で制限酵素ＳｅｘＡＩの認識配列をデザインしたｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’−ｇｔｔｔａｃｃａｇｇｔｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃａａｇｃａｃ／配列番号：１１）とＧＦＰ遺伝子下流で制限酵素ＳｅｘＡＩの認識配列をデザインしたｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’−ｃｔｔｔｃａｃｃｔｇｇｔａｃａａｇｃａｃａｇａｔｃａｔｇｇａｔｇｇ／配列番号：１２）でＰＣＲを行ない、目的の大きさの断片（１０８５５ｂｐ）を切り出してそのままライゲーションを行ない、欠損させたＦ遺伝子上流のＥＩＳ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子を欠失させる。
ただし、この場合、プライマーデザイン上のＳｅｘＡ１に挟まれた配列１５ｂｐが余分に挿入されている。そこで、プラスミドを大腸菌ＳＣＳ１１０株にトランスフォームして調製し（ＳｅｘＡ１はメチル化の影響を受け切断出来なくなるのでｄｃｍ⁻／ｄａｍ⁻のＳＣＳ１１０株を利用する）、制限酵素ＳｅｘＡ１で消化後、１６２８ｂｐ及び９２１９ｂｐの２つの遺伝子断片を回収してライゲーションを行ない、余分な１５ｂｐを欠失させ、６の倍数でＦ遺伝子上流のＥＩＳ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子を欠失させたＬｉｔｍｕｓＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ／ΔＦ（Δ５ａａ）を調製する。このプラスミドをＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化して断片を回収し、ｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＳａｌＩ／ＮｈｅＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ（Δ５ａａ）を得る。
このプラスミドへの外来遺伝子挿入は、例えばＮＰ遺伝子の前に位置する制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を利用して行う。
２．ｈＦＧＦ２遺伝子搭載Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡの構築
ヒトのＦＧＦ２（ｈＦＧＦ２）ｃＤＮＡの取得には種々の方法があるが、例えば、患者本人の了承を得て採取したヒト大伏在静脈から分離した血管平滑筋細胞よりＲＴ−ＰＣＲにてｃＤＮＡを分離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）、ＥｃｏＲＩ（３’末端）にサブクローニングして調製することができる。その際、ｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡの遺伝子配列はＡｂｒａｈａｍらの報告（Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．５（１０），２５２３−２５２８，１９８６）を参照することができる。
ＮＰ遺伝子の前に位置する制限酵素ＮｏｔＩの位置にｈＦＧＦ２遺伝子を挿入するためには、ｈＦＧＦ２遺伝子の３’端側にＳｅＶ特異的配列（ＥＩＳ配列）を付加して両端にＮｏｔＩ認識配列を有するフラグメントを調製すればよい。具体的には、上記ｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡを鋳型にして、開始コドンを含むＮ末端側プライマー（５’−ａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃａａａｇｔｔｃａｃｔｔａｔｇｇｃａｇｃｃｇｇｇａｇｃａｔｃａｃｃａｃｇｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｔｇｃｃｃｇａｇｇａｔｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｃｃ／配列番号：１３）および終止コドン領域とＥＩＳ配列とを含むＣ末端側プライマー（５’−ａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｔｇａａｃｔｔｔｃａｃｃｃｔａａｇｔｔｔｔｔｃｔｔａｃｔａｃｇｇｔｃａｇｃｔｃｔｔａｇｃａｇａｃａｔｔｇｇａａｇａａａａａｇｔａｔａｇｃ／配列番号：１４）を用いてＰＣＲを行ない、ＮｏｔＩ消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてｐＢＳ−ｈＦＧＦ２を調製する。塩基配列を確認し、得られた遺伝子に変異がある場合は、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って目的の配列に修正する。ｐＢＳ−ｈＦＧＦ２をＮｏｔＩで消化後、ｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡを含む断片をｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ（Δ５ａａ）のＮＰ遺伝子の前に位置するＮｏｔＩ部位に挿入し、ｈＦＧＦ２遺伝子搭載Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡ　ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ（Δ５ａａ）を構築する。ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ（Δ５ａａ）は、以後ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦとも表記する。
３．Ｆ発現プラスミドの構築
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）の発現には、Ｃｒｅ　ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミド；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２），１１１５−１１２１，１９９８）を利用することができる。ｐＵＣ１８／ＫＳをＳｔｙＩ及びＢｓｔＵＩで消化し、ＳｅＶ−Ｆ遺伝子を含む断片（１７８３ｂｐ）を切り出し、平滑末端処理後、ｐＣＡＬＮｄＬｗのユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、Ｆ発現プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
４．ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
Ｆ欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した非動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。Ｃｒｅ　ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆをリン酸カルシウム法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入する。
具体的には、例えば、１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％　ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、例えば５ｍｌ　１枚、２ｍｌ２枚、０．２ｍｌ２枚に蒔き、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を１２００μｇ／ｍｌ含む１０ｍｌの１０％　ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて例えば３０株を回収する。各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ遺伝子の安定導入株の選択は以下の方法で行う。すなわち、Ｆ蛋白質の発現量をウェスタンブロッティングで半定量的に解析することで行うことができる。各クローンのＦ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１，１９９５；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２），１１１５−１１２１，１９９８）によりｍｏｉ＝３で感染させて行う。感染３日後に、細胞の培養上清を取り除いた後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、スクレーパーで細胞を剥がし、１５００×ｇで５分間遠心し細胞を回収する。該細胞は−８０℃で保存し、解凍後１５０μＬのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、更に同量の２×Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ−ＢＭＥ　ｓａｍｐｌｅ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（０．６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ　６．８），５％　ＳＤＳ，２５％　２−ＭＥ，５０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０２５％　ＢＰＢ，Ｏｗｌ社製）を加え、９８℃３分間加熱処理後、電気泳動用試料に供する。該試料（１レーンあたり１×１０^５細胞）を周知のプロトコールに従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングを行う。ウェスタンブロッティングにおける一次抗体に抗ＳｅＶ−Ｆ抗体（ｆ２３６）を１／１０００希釈で用い、各クローンのＳｅＶ−Ｆの発現を半定量的に解析する。
このような方法で、ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物を誘導発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞の作出が確認される。以後、ＳｅＶ−Ｆ遺伝子誘導発現前の該細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆと表記し、誘導発現後の細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄと表記する。
５．Ｆ欠失ＳｅＶウイルスの再構成及び増幅
血管新生遺伝子を含むＦ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡを、Ｆ発現ヘルパー細胞にトランスフェクションして発現させることにより、ウイルスを再構成することができる。例えば、上記ｈＦＧＦ２遺伝子搭載Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ）を用いる場合は、このｃＤＮＡを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで直径１０ｃｍのペトリ皿に蒔き、２４時間培養後、ソラレンと長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３，８１２２−８１２６，１９８６）に室温で１時間感染させる（ｍｏｉ＝２〜３、好適にはｍｏｉ＝２が用いられる）。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブ５本が装備されたＵＶ　Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる。細胞を２回洗浄して、プラスミドｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ、ｐＧＥＭ／ＮＰ、ｐＧＥＭ／Ｐ、ｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１，５６９−５７９，１９９６）およびｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ（ＷＯ００／７００７０）をそれぞれ１２μｇ、４μｇ、２μｇ、４μｇおよび４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（１μｇ　ＤＮＡ／５μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ　３ｍｌに入れ、細胞に添加して培養する。３〜５時間培養後、細胞を血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド４０μｇ／ｍｌ（ＡｒａＣ、Ｓｉｇｍａ）およびトリプシン７．５μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を含み、血清を含まないＭＥＭで２４時間培養する。
培養上清を除き、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞を重層する。具体的には血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）に分散したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞を、培養上清を除いた細胞に重層し、４８時間培養を継続する。スクレイパーにてこれらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁し（１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、凍結融解を３回繰り返し行う。このライセートをＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞（４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ　１２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）にかけ（２００μｌ／ｗｅｌｌ）、さらに３００μｌ／ｗｅｌｌの血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）を添加し、１５〜２４時間培養する。培養上清を除き、血清を含まないＭＥＭで洗浄後、新たな血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）を添加し、５〜９日間培養を行い上清を回収する。回収した上清には再構成されたＦ欠失型ＳｅＶ粒子が含まれており、ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞へ感染し、同じように血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養を行うことで（或いはそれを繰り返すことで）Ｆ欠失型ＳｅＶを増幅することができる。
その際、Ｆ欠失型ＳｅＶ粒子が含まれている培養上清を、０．２２μｍのフィルターに繰り返し２回通すことで、再構成時のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼの発現に利用したリコンビナントワクシニアウイルスの混入をほとんど回避することができる。具体的には、２回以上ＡｒａＣを含み血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で増幅した培養上清（Ｐ２以降のサンプル）について０．２２μｍのフィルターに２回通し、更に１回ＡｒａＣを含み血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で増幅した培養上清を、リコンビナントワクシニアウイルスの混入を回避して増幅したＦ欠失型ＳｅＶとして取り扱うことができる。
欠損型ウイルスベクターを調製する場合、例えば、ゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる２種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているため、エンベロープ遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなり長い外来遺伝子を保持することができる。また、元々感染性のないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ｅｘ　ｖｉｖｏ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては血管新生遺伝子または血管新生を促進する遺伝子であれば特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、血管新生を抑制する遺伝子のアンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
回収したパラミクソウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、薬学的に許容される所望の担体または媒体と共に組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えば本発明のパラミクソウイルスベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明のパラミクソウイルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。また本発明のパラミクソウイルスベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明は、本発明のベクターおよび薬学的に許容される担体を混合する工程を含む、本発明の血管新生組成物の製造方法を提供する。また本発明は、本発明の血管新生組成物の製造のための、本発明のベクターの使用に関する。本発明の組成物は医薬組成物としても有用である。本発明は、本発明のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、虚血治療製剤に関する。また本発明は、本発明のベクターまたは上記組成物の医薬としての使用にも関する。
上記のようにして得られたパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む組成物を投与することで、パラミクソウイルスベクターが持つ血管新生遺伝子を導入することができる。本発明は、本発明のパラミクソウイルスベクターまたは本発明の血管新生組成物を投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法を提供する。この方法は、特に虚血組織を処置するための方法として有用である。投与部位に特に制限はないが、虚血の処置においては、導入遺伝子産物が虚血組織に集中し、全身の循環系に漏れ出さないように虚血組織またはその周辺に局所投与されるか、または適当な遺伝子送達系（ジーンデリバリーシステム）により目的の組織周辺に局所発現させることが好ましい。例えば、本発明のパラミクソウイルスベクター含有組成物を虚血組織内またはその外からｉｎ　ｖｉｖｏで投与し、外来遺伝子を虚血組織で発現させることにより実施することができる。また、ｅｘ　ｖｉｖｏによる投与を行ってもよい。例えば、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを感染させた細胞を虚血組織局所、あるいは虚血組織を還流する動脈内に注入してもよい。
例えば、カテーテルを用いた局所投与も選択され得る。例えば、２つのバルーンにより血管を隔離し、バルーンで隔離された血管の間隙にベクター組成物を注入するダブルバルーンカテーテル法や、多孔性バルーンを用いた投与法等により本発明のベクターを投与してもよい（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　１（８６４７）：１１０６−８，１９８９；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ，Ｈ．ａｎｄ　Ｔｈｕｎｇ，Ｓ．Ｎ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１５（２）：４７５−８１，１９９０；ＷＯ９３／０００５１；ＷＯ９３／０００５２）。これらの投与においては、ヒドロゲルをコートしたバルーンを用いることもできる（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５（４）：４８７−５０１，１９９６）。
例えば心筋梗塞や狭心症、その他の虚血性心疾患における治療においては、例えばカテーテルを用いて心室内腔より心筋内に直接本発明のベクター組成物を注入することができる。また、本発明のベクターをカテーテルにより局所注入することにより、冠状動脈内の狭窄部分の血管新生や側副血行路の発達を促進することができる。
しかし、カテーテルによるベクター投与は、インキュベーションに比較的長時間が必要であるほか、バルーンによる血管損傷なども懸念される。また、虚血組織内の瀰漫性の血管にカテーテルを挿入することは困難である場合も多い。本発明の虚血組織における処置においては、特に筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ；ＩＭ）へのベクターの投与が好ましい。筋肉内への注入はカテーテルを介した投与よりも簡便であり、血管を損傷させる危険も低い。本発明のベクターは、例えば虚血組織またはその近傍の横紋筋に投与される。横紋筋は骨格筋および心筋を含む。ウイルスベクターの投与前に、筋肉の再生を誘発することにより導入遺伝子の発現を増強することが知られているブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）を投与してもよい。また、皮下（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ；ＩＤ）投与も選択し得る。筋内へのベクターの導入は、例えば、経皮的に導入する方法や開皮して直接導入する方法が挙げられる。ベクターの導入の際には、筋上膜を破損しないように処置することに留意する必要がある。投与は、例えば針とシリンジを用いて行いうる他、針を使わないバイオインジェクターにより投与することも可能である。投与は一箇所または複数箇所に投与し得る。また、投与は１回または複数回行うことができる。
本発明のベクターをマトリックスの形で投与することも有用である。知られている方法としては、アテロコラーゲンマトリックスにウイルスベクターを分散させて、凍結乾燥により固形化しマトリックスが徐々に崩壊することを応用するもので、一時的遺伝子発現で知られているアデノウイルスベクターや裸のＤＮＡの効果持続化に関する報告がある（Ｏｃｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　５，７０７−７１０，１９９９）。本発明のウイルスベクターは、このような助剤と共存させることが可能であり、凍結乾燥可能である。また発現効果を増強するためにカチオン脂質を共存させることもできる。
投与可能な小さなマトリックスであっても、１８Ｇ程度の注射針により長期間に亘り成長因子等を徐放できることは知られている。例えば、蛋白質の製剤において、成長ホルモン等の持続時間は、成長ホルモン等を単独で投与した場合に比べて、血液中の持続時間が長く、例えば、７日以上である。通常、１０日以上に亘る持続も達成できると報告されている（特開平１０−００１４４０）。そのため、製剤の投与回数、患者に与える苦痛を著しく低減できる。前記製剤は、例えば、皮下や筋肉内に投与される固形注射剤（植込み剤など）や、座剤などの粘膜吸収剤として利用できる。剤形は、注射剤として用いる場合には、注射針で投与可能な柱状又は粒状である場合が多い。好ましい製剤の形状には、角柱状、円柱状などの柱状および球状などの粒状が含まれる。
本発明の非経口製剤の大きさも、投与形態に応じて選択でき、患者に過度の苦痛を与えることのない大きさであればよい。注射剤としては、柱状マトリックスで構成されている場合、例えば、直径３ｍｍ以下（例えば、０．１〜３ｍｍ）、長さ３０ｍｍ以下（例えば、０．５〜３０ｍｍ）、好ましくは１４Ｇ以下の注射針で投与可能な直径１．３ｍｍ以下（例えば、０．１〜１．２ｍｍ）、長さが２０ｍｍ以下（例えば、０．５〜２０ｍｍ）、さらに好ましくは直径０．１〜１ｍｍ、長さ１〜２０ｍｍ程度であり、円柱が好ましい。また、粒状マトリックスで構成された注射剤の粒径は、最大直径１ｍｍ以下（例えば、０．１μｍ〜１ｍｍ程度）、好ましくは１５０μｍ以下（例えば、０．５〜１００μｍ程度）、さらに好ましくは１〜１００μｍ程度である。また、マトリックスの重量は、製剤の形態に応じて選択でき、注射剤においては、例えば、４０ｍｇ以下、好ましくは１〜２５ｍｇ程度である場合が多い。
本発明のパラミクソウイルスベクターにより導入する遺伝子としては、血管新生および／または血管形成を促進するものであれば特に制限はないが、例えば上記のように、ａＦＧＦ、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ（Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２を含む）、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−α、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＮＯＳなどをコードする遺伝子が挙げられる。これらの蛋白質には、それぞれのファミリーに属する各メンバーやアイソフォームなどを含む。本発明のパラミクソウイルスにより導入する血管新生遺伝子の好適な一例として、特にＦＧＦ２をコードする遺伝子が挙げられる。ＦＧＦ２は、例えば急性虚血の治療への応用が期待される。例えば、急性重症虚血肢の治療等において有意な治療効果が期待できる。また、ＦＧＦ２は、心筋梗塞における治療効果も示されている（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７（５０７５）：１４０１−３，１９９２）。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などの形態であり得る。好ましくは分泌蛋白質である。また、人工的に構築した蛋白質であってもよい。人工的な蛋白質としては、例えば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などの形態であり得る。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子は、虚血組織で内因的に発現が誘導される遺伝子であってもよく、また発現が誘導されない遺伝子を異所的に発現させてもよい。また、アンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムなどを発現させて虚血組織で発現する望ましくない遺伝子の機能を抑制することもできる。
本発明のベクターは、様々な虚血疾患および血管新生により治療可能な疾患に対する遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺伝子治療には、例えば、血管切断や梗塞、血管解離等による血流遮断による虚血に対する治療が挙げられる。本発明のベクター投与の対象となる虚血疾患には、例えば脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢の虚血、虚血性心筋症、および心筋虚血が挙げられる。また、遺伝子治療の対象となる組織には特に制限はなく、例えば、筋肉、脳、腎臓、および肺が含まれる。また、移植における血管新生の促進にも有用である。また、様々な疾患モデルの作製や、疾患モデル等における治療方法の開発または評価においても有用である。
ベクターの投与により血管新生が促進されたかは、例えば剖検試料中の毛細管数や毛細管密度の計側や、血管造影による画像解析等により確認することができる。また、ドップラー灌流像解析による血流量の解析により測定することもできる。虚血組織の処置の効果は、組織の壊死または脱落を巨視的または組織切片の顕微鏡観察などにより確認することができる。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、薬学的有効量のベクターを対象組織に投与され、これによりこのベクターが対象組織の細胞に導入される。「薬学的有効量」とは、所望の治療または予防効果を少なくとも部分的にもたらすように対象組織の細胞に遺伝子が導入される量を言う。所望の血管新生遺伝子を含む本発明のパラミクソウイルスベクターの有効量が投与されることにより、ベクターが導入された細胞から血管新生因子が産生される。好ましくは、所望の血管新生遺伝子を有する本発明のベクターの有効量が投与されることにより、投与された組織中で有意なレベルの血管新生因子が検出される。「有意なレベル」とは、本発明のベクターにより導入された遺伝子の発現量（転写産物または翻訳産物の量）が検出可能であることを指す。例えば、導入する遺伝子に対応する内因性遺伝子がある場合、導入した遺伝子の最大発現レベルが、内因的な発現レベルに対し有意に上昇していることを指す。好ましくは、投与部位における血管新生遺伝子の発現量が、内因的な発現量の約１．２倍以上、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約２倍以上、より好ましくは約１０倍以上、最も好ましくは約２０倍以上の発現が得られることを言う。但し、導入遺伝子の発現量は、その有効発現量レベルおよび中毒レベルを考慮して決められるべきである。
細胞に導入された遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出・定量することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎ　ｓｉｔｕでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。また、導入遣伝子発現産物の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。好ましくは、投与するベクター量は約１０^５　ｃｅｌｌ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｕｎｉｔｓ（ＣＩＵ）／ｍｌから約１０^１１ＣＩＵ／ｍｌの範囲内であるとよい。より好ましくは、投与するベクタの量は約１０^７ＣＩＵ／ｍｌから約１０^９ＣＩＵ／ｍｌの範囲内であるとよい。最も好ましくは、約１×１０^８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０^８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。本発明のウイルス含有組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
ヒトにおける投与量は、通常、投与部位１箇所につき２×１０^８ＣＩＵ〜２×１０^１０ＣＩＵの範囲であることが好ましく、より好ましくは２×１０^９ＣＩＵを中心とした投与量、例えば５×１０^８ＣＩＵ〜１×１０^１０ＣＩＵなどである。投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば投与する動物とヒトとの体重比または投与標的部位（虚血組織など）の重量比もしくは容積比に応じて投与箇所を増減または投与量を換算して投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通じて引用された文献はすべて、本明細書に組み込まれる。
組み換えＳｅＶは以前の記載（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　２（７）：４５７−６６，１９９７；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，９７０−９７３（２０００）；Ｋａｔｏ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１，５６９−５７９（１９９６）；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８，２８１３−２８２０（１９９７））に従って調製した。
ウイルスの力価は、ニワトリ赤血球を用いたヘマグルチネーションアッセイにより決定した。高力価のストック（１０^９ｐｆｕ／ｍｌ）は使用時まで−８０℃で保存した。ヒトＶＥＧＦ１６５　ｃＤＮＡは以前に記載のようにＲＴ−ＰＣＲで単離した（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５，３１３−３２３（１９９６））。マウスＦＧＦ２　ｃＤＮＡは今村博士（Ｎａｔｉｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）より供与されたｃＤＮＡの部分配列に基づき、ＰＣＲにより全長マウスＦＧＦ２　ｃＤＮＡを調製した（Ｉｍａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，１５６７−１５７０（１９９０））。具体的には、開始コドン領域および終止コドン領域を欠失したマウスＦＧＦ２　ｃＤＮＡの部分断片（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｍ３０６４４の７〜４３５番目の断片）を鋳型に用いて、マウスＦＧＦ２　ｃＤＮＡの開始コドンを含むＮ末端側プライマー（５’−ＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＧＣＴＴＣＣＣ−３’／配列番号：１５）および終止コドン領域とＳｅＶ特異的配列とを含むＣ末端側プライマー（５’−ＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＴ−３’／配列番号：１６）を用いて完全長ｃＤＮＡを増幅した。このようにして調製したヒトＶＥＧＦ１６５　ｃＤＮＡおよびマウスＦＧＦ２　ｃＤＮＡは、塩基配列が正しいことを確認した後、ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７８：２８１３−２８２０）のＮｏｔＩ部位に挿入した。ヒトＶＥＧＦ１６５またはマウスＦＧＦ２を発現するセンダイウイルスベクターは、それぞれＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５またはＳｅＶ−ＦＧＦ２と名付けた。ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．７８（Ｐｔ　１１）：２８１３−２８２０，１９９７；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９７０−９７３，２０００）およびｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９７０−９７３，２０００）は上記と同様に調製した。
統計解析において、本実施例の全てのデータは平均±Ｓ．Ｄ．として表した。救肢以外のデータはＳｃｈｅｆｆｅの修正を加えた一元配置分散分析により解析した。救肢データの解析は、救肢の割合を救肢スコア（ｌｉｍｂ　ｓａｌｖａｇｅ　ｓｃｏｒｅ；ＬＳＳ）として表し、Ｋａｐｌａｎ−Ｍａｙｅｒ法により解析した。救肢実験の統計的有意差はｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて決定し、全ての解析において、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
［実施例１］虚血により誘導される内因性ＶＥＧＦの発現は後肢筋中の局所的な蛋白質蓄積を起さない
血管新生因子の治療効果または有害効果を明らかにするため、本発明者らは、２つの異なる手術を用いた虚血肢の３つのモデルを構築した（図１）。すなわち、（１）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全大腿動静脈および伏在動静脈切除による中度の虚血肢（図１左に示した中度虚血モデル）（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，１６６７−１６７９（１９９８）；Ｋａｌｋａ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９７，３４２２−３４２７（２０００））、（２）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全外腸骨動静脈、大腿動静脈、およびそれらの周囲の分枝血管を全て切除するモデル（図１右に示した重症虚血モデル）、（３）免疫不全ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスを用いて前記（２）と同じ手術を行うモデル（すなわち、ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスにおける重症虚血モデル）である。
成獣雄Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス（６−８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｇｒａｄｅ）はＫＢＴ　Ｏｒｉｅｎｔａｌ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｓｕ，Ｓａｇａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。動物実験は認可された手順を採用し、九州大学における動物、組み換えＤＮＡ、および病原性感染実験委員会による研究動物の飼育および使用の推奨手順および日本国政府の法律（Ｎｏ．１０５）および告知（Ｎｏ．６）に従った。また、米国国立衛生研究所の「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ」および「Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ」（ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＩＨ　８０−２３，ｒｅｖｉｓｅｄ　１９８５）にも従った。
ペントバルビタールの腹腔内注射により十分麻酔した状態で皮膚を切開し、中度虚血モデルでは、表層の全大腿動静脈および伏在動静脈［大腿深動脈（ｄｅｅｐ　ｆｅｍｏｒａｌ　ａｒｔｅｒｉｅｓ）の直下から膝窩動静脈まで］を結紮し切除した（図１左）（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，１６６７−１６７９（１９９８）；Ｋａｌｋａ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９７，３４２２−３４２７（２０００））。重症虚血モデルでは、さらに外腸骨動静脈から大腿深動脈までの切除を行った（図１右）。これらのモデルにおける肢の回復状態の再現性は、同一の術者（Ｉ．Ｍ．）による３〜５回の別々の実験により確認し、各手術では各モデルにつき１０個体以上の動物を用いた。それぞれの救肢実験は、同一の実験者が同一条件の実験を４回繰り返して行った。
前記（１）のモデルでは決して肢は失われず、場合により指の壊死の徴候を見せるのみであった。上記（２）のモデル（すなわちＣ５７ＢＬ／６マウスにおける重症虚血モデル）では肢の壊死は起こらず（これを「救肢モデル（ｌｉｍｂ　ｓａｌｖａｇｅ　ｍｏｄｅｌ）」とも呼ぶ）、上記（３）のモデル（ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスにおける重症虚血モデル）では全ての動物で手術１０日以内にほぼ肢全体が脱落した（これを「下肢脱落モデル（ｌｉｍｂ　ａｍｐｔａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ）」とも呼ぶ）。免疫適合性ＢＡＬＢ／ｃマウスの重症虚血モデルでは、ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスと同程度の肢の壊死が観察された（データ省略）。ＢＡＬＢ／ｃ系統のマウスはＣ５７ＢＬ／６系統に比べ増殖因子に対する血管新生の感受性が高いことが報告（Ｒｏｈａｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１４，８７１−８７６（２０００））されていることを考え合わせると、これらの結果は、Ｃ５７ＢＬ／６系統の救肢は血管新生に対する感受性よりもむしろ、側肢（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ　ｌｉｍｂ）の循環がより高いことによる可能性が示唆される。
上記の中度および重症虚血モデルを用いて、虚血筋および血清のＶＥＧＦおよびＦＧＦ２の内因的発現を調べた。手術２日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから各肢筋（全大腿筋および腓骨筋）および血清を採取し、組織をホモジェナイズまたは溶解後、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に供した。組み換え蛋白質の合成は、ヒトＶＥＧＦまたはマウスＦＧＦ２用のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて説明書に従って定量した。全蛋白質濃度をｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により決定し値を標準化した（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，９７０−９７３（２０００））。
全大腿筋と腓骨筋との間に蛋白質濃度の有意な差は見られなかったことから、両者を各群に含めて解析を行った。興味深いことに、虚血手術は２つの虚血肢モデル（中度モデル：８４７．５±１８７．７ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、重症モデル：８９５．４±２０９．５ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、各ｎ＝１２）において、未処理マウスのベースライン（４８９．７±１０８．６ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、ｎ＝１２）に比べ、ＦＧＦ２蛋白質の濃度を有意に上昇させた（ｐ＜０．００１）（図２）。一方、重症虚血群では虚血によるＶＥＧＦ蛋白質の発現の上昇が見られたが、筋中において有意ではなかった（未処理：１７４．７±４３．１、中度：１１９．２±５３．４、および重症：２４２．５±２４４．３、ｎ＝１２）。ＶＥＧＦは組織の虚血でより強く発現が誘導される内皮増殖因子としてよく知られており（Ｓｈｗｅｉｋｉ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３５９，８４３−８４５（１９９２）；Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，４６０４−４６１３（１９９６））、この結果はそれと一致しないように見える。そこで、ＶＥＧＦが全身の循環系に放出される可能性を考え、血清中のＶＥＧＦレベルを測定した。すると予想通り、重症度に依存して血清中のＶＥＧＦ蛋白質レベルの増加が観察されたが、血清中のＦＧＦ２は検出されなかった（図２右）。
本発明者らは、肢虚血は高分子または中分子量型のＶＥＧＦよりも、ヘパラン硫酸との相互作用能が低い低分子型のＶＥＧＦアイソフォーム（Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１１３２２−１１３２６（１９９５））を誘導すると予想した。これを確かめるため、ＶＥＧＦ１８８、１６４、１４４、および１２０を含むマウスＶＥＧＦのスプライシングフォーム（Ｂｕｒｃｈａｒｄｔ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．６０，３９８−４０４（１９９９））を識別できるプライマーセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＣ５７ＢＬ／６マウス雄（手術なし、中度虚血モデル、および重症虚血モデル）の手術１日後の大腿筋におけるＶＥＧＦアイソフォームの発現の解析を行った。プライマー対は以前記載（Ｂｕｒｃｈａｒｄｔ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．６０，３９８−４０４（１９９９））されたラットＶＥＧＦのエクソン１およびエクソン８用のものを利用し、マウスＶＥＧＦアイソフォームの配列に対応するフォワードプライマー（５’−ＴＧＣ　ＡＣＣ　ＣＡＣ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＧＧＡ−３’／配列番号：１７）およびリバースプライマー（５’−ＴＣＡ　ＣＣＧ　ＣＣＴ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＧＴＣ　ＡＣＡ　Ｔ−３’／配列番号：１８）を用いた。最も小さいマウスＶＥＧＦアイソフォーム（ＶＥＧＦ１１５）の検出には、上記と同様のフォワードプライマー、およびＶＥＧＦ１１５特異的リバースプライマー（５’−ＣＴＡ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　Ｇ−３’／配列番号：１９）を用いた（Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３０３３−３０３８（１９９８））。ＲＴ−ＰＣＲの条件は文献と同様にして行った（Ｂｕｒｃｈａｒｄｔ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．６０，３９８−４０４（１９９９）；Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３０３３−３０３８（１９９８））。
その結果、虚血に関連する内因性ＶＥＧＦの発現は１６４アイソフォームのみ観察され、その他のアイソフォームの明確な発現は検出されなかった（図３）。さらに、既知のもっとも小さいアイソフォームであるＶＥＧＦ１１５（Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３０３３−３０３８（１９９８））の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したが、検出することはできなかった。
［実施例２］マウス後肢への組み換えセンダイウイルスを介した筋中遺伝子導入のカイネティクス
カイネティクスの解析のため、まずホタルルシフェラーゼを用いて導入遺伝子の発現レベルと時間経過を調べた。ルシフェラーゼアッセイはルミノメーター（Ｍｏｄｅｌ　ＬＢ　９５０７，ＥＧ＆Ｇ　Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて文献に従って行った（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，９７０−９７３（２０００））。データはｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔ　ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎで表した。全蛋白質濃度をｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により決定し、これによりルシフェラーゼアッセイの値を標準化した。重症虚血肢モデルでは明らかに肢筋が重度の破壊を受け、導入遺伝子の発現の低下が示唆されたため、中度虚血モデル（図１左）を用いて解析を行った。遺伝子の注入は、手術時に大腿筋および下腿筋、それぞれ２箇所に２５μｌずつ行った。以下の投与量はその合計を示す。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）（６〜８週齢，平均３０ｇ）に１００μｇのｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（臨床用量のおよそ５０倍の量）（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９７，１１１４−１１２３（１９９８）；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２８，９６４−９７３（１９９８））を投与したところ、遺伝子導入の２日後の測定では比較的高いルシフェラーゼ活性（平均±Ｓ．Ｄ．＝５．１±３．９×１０^６ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝６）を示したのに対し、１０^７プラークフォーミングユニット（ｐｆｕ）のＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの投与ではその約５倍（２．４±３．８×１０^７ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２）、１０^８ｐｆｕのＳｅＶの投与では約１２０倍（７．３±４．７×１０^８ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝６）の発現を示した（図４左）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中度虚血モデルにルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ）またはＳｅＶ−ｌｕｃを上記と同様に投与し、導入遺伝子発現の時間経過を測定した。１０^８ｐｆｕのＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを筋中に投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの中度虚血モデルでも、時間経過と共に発現の低下が見られた（ｄａｙ　２：７．３±４．３×１０^８ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２、ｄａｙ　７：３．４±４．７×１０^７ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２、およびｄａｙ　１４：２．６±１．２×１０^４ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２）（図４右）。１０^８ｐｆｕのＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを筋中に投与したＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ免疫不全マウスの中度虚血モデルにおけるルシフェラーゼ活性は、ｄａｙ　７まではＣ５７ＢＬ／６マウスと同様の時間経過を示したが、後期においてもその発現が維持された（ｄａｙ　２：９．４±３．７×１０^８ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２、ｄａｙ　７：１．３±１．９×１０^７ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２、およびｄａｙ　１４：０．９±１．３×１０^７ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｎ＝１２）。
次に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける血管新生蛋白質の分泌を、筋肉系の初代ウシ血管平滑筋細胞（ＢＳＭＣｓ）および心筋芽細胞（Ｈ９Ｃ２）に加え、初代ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）およびＣＯＳ７細胞を含む様々な培養細胞を用いて測定した。本実施例で用いたＦＧＦ２ベクター（ＳｅＶ−ＦＧＦ２）は蛋白質分泌のための古典的なシグナル配列を持たないが、本発明者らおよび他者の研究により、分泌配列を持たないＦＧＦ２でも細胞外に発現されることが報告されている（Ｐｉｏｔｒｏｗｉｃｚ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７０４２−７０４７（１９９７）；Ｑｕ，Ｚ．，ｅｔ　ａｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６，１１１９−１１２８（１９９８）；Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．Ｚ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６２，３８８−３９９（１９９５））。予想通り、用量依存的に培養上清中にＦＧＦ２蛋白質の効率的な分泌が検出され、そのレベルはＶＥＧＦ１６５と同等であった［例えば、ＭＯＩ＝１００では、ＶＥＧＦ１６５　ｖｓ　ＦＧＦ２＝４，３５４±２，７９４　ｖｓ　３，６８２±１，０６３（ＨＵＶＥＣの場合），２７５±５８　ｖｓ　３９８±１５４（ＢＳＭＣの場合）；１６，９８７±４，７４８　ｖｓ　５，９７６±３８１（Ｈ９Ｃ２の場合）；３８，６４８±４，９１３　ｖｓ　１，５４７，２３７±１７６，５０２（ＣＯＳ７の場合）、それぞれｐｇ／１０^５細胞／２４時間、ｎ＝３］（図５）。
［実施例３］ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＳｅＶを介した血管新生因子の筋中発現のカイネティクス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中度虚血モデル（図１左）へのＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５、およびＳｅＶ−ＦＧＦ２のｉｎ　ｖｉｖｏ筋中投与における血管新生因子の筋中発現を調べた。投与は大腿筋および腓骨筋のそれぞれ２箇所、２５μｌずつ２６ゲージ注射針にて、手術時に一回のみ投与した。
血管新生因子のｉｎ　ｖｉｖｏ発現の結果は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの結果およびｉｎ　ｖｉｖｏレポーター遺伝子の結果と比べ興味深いものであった。図６に示したように、ＳｅＶ−ＦＧＦ２を介した蛋白質合成は用量依存的に増加し、高力価のベクター導入では内因性遺伝子の発現の約１００倍に達した（大腿筋：基底状態：４２９±７９、虚血：９７４±１５０、１０^６ｐｆｕ：４，９１３±３１３、１０^７ｐｆｕ：１３，４６９±１２，６１１、および１０^８ｐｆｕ：４６，７０３±１２，０９２　ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、各ｎ＝６、腓骨筋：基底状態：５５０±１０４、虚血：７２０±１２８、１０^６ｐｆｕ：１，３７６±１５８、１０^７ｐｆｕ：８，２５２±８，１９０、および１０^８ｐｆｕ：５９，７０４±３５，２９７ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、各ｎ＝６）。ＳｅＶ−ＦＧＦ２投与群では、最も高い力価においても有意な血清ＦＧＦ２は検出されなかった。これに対し、ＶＥＧＦ１６５の用量依存的な増加は、ＦＧＦ２のそれに比べはるかに少なく、１０^７ｐｆｕでも２倍に届かず、１０^８ｐｆｕでは逆にＳｅＶ由来のヒトＶＥＧＦ１６５蛋白質の発現はほとんど検出されなかった（大腿筋：基底状態：１７６±４４、虚血：１４３±６４、１０^６ｐｆｕ：１５９±６７、１０^７ｐｆｕ：２２４±２１６、および１０^８ｐｆｕ：＜５ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、各ｎ＝６、腓骨筋：基底状態：１７３±４５、虚血：９５±２８、１０^６ｐｆｕ：１８６±３０、１０^７ｐｆｕ：１７２±１０１、および１０^８ｐｆｕ：＜５ｐｇ／ｇ　ｍｕｓｃｌｅ、各ｎ＝６）。内因性マウスＶＥＧＦの血清レベルは中度肢虚血では有意に増加したが（３７．７±１５．４ｐｇ／ｍｌ，ｎ＝６）、ベクター由来のヒトＶＥＧＦ１６５は有意には検出されず、筋中で発現させたＶＥＧＦ１６５は全身の循環系には拡散しないことが示唆される。
［実施例４］虚血により誘導される内因性ＶＥＧＦの発現は血管新生遺伝子の導入により顕著に増強される
本発明者らは、ＶＥＧＦ１６５とＦＧＦ２の発現パターンの違いには、内因性ＶＥＧＦの発現が関与しているのではないかと考えた。内因性ＶＥＧＦの過剰な発現は、強すぎる透過性作用を介して組織の虚血を増悪させ、ＳｅＶからの転写を負に調節する可能性がある。またｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ＦＧＦ２の血管新生作用は、部分的には内因性ＶＥＧＦの発現の増強によりもたらされていることが示されている（Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９２，３６５−３７１（１９９５））。
そこで、外来的に導入した血管新生因子遺伝子により媒介される筋中での内因性マウスＶＥＧＦ蛋白質合成の変化を、マウスＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡ系を用いて調べた。図７に示したように、ＶＥＧＦ１６５ではなく、ＦＧＦ２の遺伝子導入は、正常循環（手術なし）および中度虚血の両方の肢条件において筋中の内因性マウスＶＥＧＦレベルを顕著に上昇させた。重症肢虚血では、２つの血管新生因子の遺伝子導入の両者において、内因性マウスＶＥＧＦの発現を劇的に上昇させ、特にＶＥＧＦＩ６５は虚血のみ（Ｍｏｃｋ）に比べ７倍程度まで上昇させた。
これをさらに詳細に調べるため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血モデルにおける血管新生因子の遺伝子導入による効果を組織学的に観察した（図８）。虚血手術後に偽導入を行った場合（ｍｏｃｋ）は、分散した密な筋線維（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ　ｐｉｃｎｏｔｉｃ　ｍｕｓｃｌｅ　ｆｉｂｅｒｓ）は細胞内浮腫（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅｄｅｍａ）を伴い、２日後には炎症性の浸潤が見られた。これらの所見はＶＥＧＦ１６５の遺伝子導入により顕著に増強された一方、ＦＧＦ２の遺伝子導入では明らかに抑制された（図８）。
［実施例５］外来的に導入されたＶＥＧＦ１６５は、急性重症虚血肢において救肢因子ではなく肢破壊因子として働く
上記の知見を基に、上記の中度および重症虚血肢モデルを用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける血管新生因子の遺伝子導入による治療効果を調べた。先に示したように、ＶＥＧＦ１６５では最も高い力価である１０^８ｐｆｕの投与において導入遺伝子産物の産生が見られなかったことから、１０^７ｐｆｕのウイルス投与によりｉｎ　ｖｉｖｏ治療効果を観察した。ここで、肢の壊死の程度を４段階の救肢スコアに分類した（Ｌｉｍｂ　Ｓａｌｖａｇｅ　Ｓｃｏｒｅ；ＬＳＳ）。ＬＳＳ＝４：完全な救肢（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｌｉｍｂ　ｓａｌｖａｇｅ）、ＬＳＳ＝３：足蹠から先の壊死（ｌｉｍｂ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｂｅｌｏｗ　ｈｅｅｌ）、ＬＳＳ＝２：膝から先の壊死（ｌｉｍｂ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｂｅｌｏｗ　ｋｎｅｅ）、ＬＳＳ＝１：膝より上までの壊死（ｌｉｍｂ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｂｏｖｅ　ｋｎｅｅ）、およびＬＳＳ＝０：鼠径靭帯周辺からの全下肢脱落（ｔｏｔａｌ　ａｕｔｏ　ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ　ａｒｏｕｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｇｕｉｎａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ）。この分類に基づき、まずＳｅＶを介した血管新生因子の発現の毒性をＣ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血肢の救肢モデルを用いて調べた。血管新生遺伝子の導入は実施例２と同様に行った。
虚血術の２日前にベクターの注入を行った場合、全ての群で全ての肢が完全に維持された（データ省略）。手術時にベクターの注入を行った場合、ＶＥＧＦ１６５投与群以外は、ＦＧＦ２投与群を含め、全ての群のマウスで完全に救肢された（％ＬＬＳ＝１００％）。しかしながら、図９および１０に示したように、ＶＥＧＦ１６５投与マウスでは肢が脱落する個体が観察された（５／１０は肢脱落した。％ＬＬＳ＝５２．２％，他の群と比べた場合ｐ＜０．０００１）（図１０Ａ）。この結果から、ＶＥＧＦ１６５の遺伝子導入による肢破壊効果が示唆される。次に、ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスの重症虚血モデル（脱落肢モデル）を用いて、血管新生因子の遺伝子治療の効果を検証した。その結果、ＳｅＶ−ＦＧＦ２投与はｎｕ／ｎｕマウスの肢脱落を有意に抑制した（２／１０が肢脱落，％ＬＬＳ＝７７．５％）のに対し、ＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５の投与（８／１０が肢脱落，％ＬＬＳ＝１５．０％）は、ルシフェラーゼ発現ＳｅＶの投与（５／６が肢脱落，％ＬＬＳ＝１６．７％）と同様、後肢の予後を改善させなかった（図１０Ｂ）。この結果は、ＦＧＦ２の遺伝子導入が救肢効果を持つことを明確に示している。
次に、重症虚血手術を行った左足の血流の回復に対する筋肉内遺伝子導入処置による効果をレーザードップラー灌流像解析により測定した（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，１６６７−１６７９（１９９８）；Ｍｕｒｏｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１５２７−１５３６（２０００））。遺伝子導入の条件は、前述の図１０Ａ（救肢モデル）と全く同じ条件とし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血モデル（救肢モデル）を用いた。虚血肢（左）／正常肢（右）の血流比の測定を、レーザードップラー灌流像（ｌａｓｅｒ　Ｄｏｐｐｌｅｒ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｍａｇｅ；ＬＤＰＩ）解析機（Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｅｖｏｎ，ＵＫ）を用いて文献に従って行った（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，１６６７−１６７９（１９９８）；Ｍｕｒｏｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１５２７−１５３６（２０００））。具体的には、体温によるデータの変動を最小限に抑えるため、レーザースキャニングを行う前に、マウスを３７℃の恒温板に置いた。予め決めた時間（実験前および手術後２、４、７、および１０日）に、それぞれの個体の目的の部位（肢および足）を２回連続してスキャニングを行った（図１１）。２回のスキャニングで本質的な違いは見られなかった。レーザースキャニング後、保存した画像をコンピュータによる血流量の測定にかけ、虚血および非虚血足の平均血流量を算出した。周囲の光や温度の影響によるデータの変動を抑えるため、ＬＤＰＩインデックスは右肢（非虚血）の血流値に対する左肢（虚血）の血流値の比として表した。
ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｍｏｃｋ）およびＳｅＶ−ＦＧＦ２の投与は、いずれも４日目において大腿上部周辺に明らかな血流が検出され、特にＦＧＦ２投与群では４、７、および１０日目において腓骨筋への有意な血流が見られ、同時期のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ投与群では大腿筋に限られた血流が見られたのと差が見られた（図１１）。代表的な結果では、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ投与群の肢は軽度の萎縮（ｍｉｌｄｌｙ　ａｔｒｏｐｈｉｃ　ｌｉｍｂ）を起すものがあった一方、ＦＧＦ２投与群のほとんどの肢は障害を示さなかった。これらとは対照的に、ＶＥＧＦ１６５投与マウスは大腿筋にほとんど血流が見られず、下肢脱落を起した（図１１）。ＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５を投与された全てのマウスは、少なくとも膝レベルにおいて肢を失った。以下に、それぞれの投与群における肢血流の観察結果を詳述する。
１．ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを投与した個体
手術直後は左下肢の血流はほとんど見られなかった。次第に血流が回復し、４日目頃には大腿部の中央付近まで血流の回復が見られた。しかし１０日目までこの個体の下腿までの血流は回復しなかった。結果として、パネル右端に示したように下肢は腐らなかったが、やや萎縮していた。同様の個体は１／３程度で観察された。これよりも回復が進んだ例も認められた。
２．ＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５を投与した個体
上記と同様に、手術直後はほとんど血流が消失した。以後、経時的に観察しても大腿部の血行の回復はほとんど認めず、結果としてパネル右端に示したように大腿の中程より下肢が脱落した。１０個体の全例で全く同様の結果を得た。
３．ＳｅＶ−ＦＧＦ２投与個体
上記と同様に、手術直後の左下肢の血流ははほとんど消失した。血流の消失範囲はＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを投与した個体と同程度であった。４日目頃から強い血流（赤いスポットで示される）が大腿部に現われ、７日目には既に弱いながら下腿の血行が認められた。１０日目には、僅か（青で示される）ながら左下肢全体に有意な血行が認められ、結果として、パネル右端に示したように下肢は外見上全く正常のまま維持された。
各群において、ドップラー像に基づく大腿筋の血流を統計学的に比較した。図１２に示したように、ＳｅＶ−ＦＧＦ２投与マウスは、ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ投与マウスに比べ、肢血流の生理的回復時の血流は有意に高い値を示した。これに対し、ＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５投与マウスの大腿筋の血流は低い値に留まり、手術後７日目以降は多くの動物で下肢中央部またはそれより上部から肢が脱落した。
［実施例６］複製能欠損型センダイウイルスベクターを用いた急性虚血肢治療
１．血管新生遺伝子搭載Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）の全長ゲノムｃＤＮＡを含むｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８，２８１３−２８２０，１９９７）からＦ遺伝子を欠失させたプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）のＦ遺伝子の欠損部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したプラスミド（ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰ）を構築するため、まずＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲによる増幅を行なった。ＥＧＦＰ遺伝子断片の塩基数を６の倍数（Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＲＮＡ　２，１０３３−１０４５，１９９６）に合わせるため、５’末端はＮｓｉ−ｔａｉｌｅｄプライマー（５’−ａｔｇｃａｔａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃ／配列番号：９）、３’末端はＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマー（５’−ｔｇｃｃｇｇｃｔａｔｔａｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃ／配列番号：１０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を制限酵素ＭｓｉＩとＮｇｏＭＩＶで消化してゲルから断片を回収し、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にあるＮｓｉＩとＮｇｏＭＩＶという制限酵素部位に連結し、シークエンスを確認した。ここからＥＧＦＰ遺伝子を含むＤｒａＩＩＩ断片を回収し、ｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰを得た。ただし、ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦの場合は、Ｆ遺伝子のＥＩＳ配列（ＳｅＶ特異的配列、Ｅ；ｅｎｄ，Ｉ；ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ，Ｓ；ｓｔａｒｔ）が残存し、下流のＦ遺伝子のＯＲＦは除かれているものの、この部位の連結に用いたプライマー由来の５アミノ酸ペプチドが発現する可能性のある構造になっている。またｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰの場合はＧＦＰが共発現するので、そのペプチド及びＧＦＰが共発現する可能性のないベクターの構築を行った。そのためには下記の様に組み換えを行なった。
ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩとＮｈｅＩで消化してＦ欠損部位を含む領域の断片（６２８８ｂｐ）を回収し、Ｌｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）にクローニングし、ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ／ΔＦ−ＧＦＰとした。欠損させたＦ遺伝子上流のＥＩＳ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子の欠損はＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法により行なった。すなわち、ＧＦＰ遺伝子上流で制限酵素ＳｅｘＡＩの認識配列をデザインしたｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’−ｇｔｔｔａｃｃａｇｇｔｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃａａｇｃａｃ／配列番号：１１）とＧＦＰ遺伝子下流で制限酵素ＳｅｘＡＩの認識配列をデザインしたｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’−ｃｔｔｔｃａｃｃｔｇｇｔａｃａａｇｃａｃａｇａｔｃａｔｇｇａｔｇｇ／配列番号：１２）でＰＣＲを行ない、目的の大きさの断片（１０８５５ｂｐ）を切り出してそのままライゲーションを行ない、欠損させたＦ遺伝子上流のＥＩＳ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子を欠失させた。
この場合、プライマーデザイン上のＳｅｘＡ１に挟まれた配列１５ｂｐが余分に挿入されている。そこで、プラスミドを大腸菌ＳＣＳ１１０株にトランスフォームして調製し（ＳｅｘＡ１はメチル化の影響を受け切断出来なくなるのでｄｃｍ⁻／ｄａｍ⁻のＳＣＳ１１０株を利用した）、制限酵素ＳｅｘＡ１で消化後、１６２８ｂｐ及び９２１９ｂｐの２つの遺伝子断片を回収してライゲーションを行ない、余分な１５ｂｐを欠失させ、６の倍数でＦ遺伝子上流のＥＩＳ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子を欠失させたＬｉｔｍｕｓＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ／ΔＦ（Δ５ａａ）を調製した。このプラスミドをＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化して断片を回収し、ｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＳａｌＩ／ＮｈｅＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／△Ｆ（Δ５ａａ）を得た。このプラスミドへの血管新生遺伝子（例としてヒトＦＧＦ２を用いた）挿入は、ＮＰ遺伝子の前に位置する制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を利用して以下のように行った。
２．ｈＦＧＦ２遺伝子搭載Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡの構築
ヒトのＦＧＦ２（ｈＦＧＦ２）ｃＤＮＡは、患者本人の了承を得て採取したヒト大伏在静脈から分離した血管平滑筋細胞よりＲＴ−ＰＣＲにて分離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）、ＥｃｏＲＩ（３’末端）にサブクローニングして調製した。その際、ｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡの遺伝子配列はＡｂｒａｈａｍらの報告（Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．５（１０），２５２３−２５２８，１９８６）と同一であることを確認した。
ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ（Δ５ａａ）のＮＰ遺伝子の前に位置する制限酵素ＮｏｔＩの位置にｈＦＧＦ２遺伝子を挿入するために、まずｈＦＧＦ２遺伝子の３’端側にＳｅＶ特異的配列（ＥＩＳ配列）を付加して両端にＮｏｔＩ認識配列を有するフラグメントを調製した。具体的には、上記ｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡを鋳型にして、開始コドンを含むＮ末端側プライマー（５’−ａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃａａａｇｔｔｃａｃｔｔａｔｇｇｃａｇｃｃｇｇｇａｇｃａｔｃａｃｃａｃｇｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｔｇｃｃｃｇａｇｇａｔｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｃｃ／配列番号：１３）および終止コドン領域とＥＩＳ配列とを含むＣ末端側プライマー（５’−ａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｔｇａａｃｔｔｔｃａｃｃｃｔａａｇｔｔｔｔｔｃｔｔａｃｔａｃｇｇｔｃａｇｃｔｃｔｔａｇｃａｇａｃａｔｔｇｇａａｇａａａａａｇｔａｔａｇｃ／配列番号：１４）を用いてＰＣＲを行ない、ＮｏｔＩ消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてｐＢＳ−ｈＦＧＦ２を調製し、塩基配列を確認した。ｐＢＳ−ｈＦＧＦ２をＮｏｔＩで消化後、ｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡを含む断片をｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ（Δ５ａａ）のＮＰ遺伝子の前に位置するＮｏｔＩ部位に挿入し、ｈＦＧＦ２遺伝子搭載Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡ　ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ（Δ５ａａ）を構築した（ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ（Δ５ａａ）は、ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦとも表記する）。また、複製能を有するウイルスｃＤＮＡをコードするｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位にもｈＦＧＦ２　ｃＤＮＡを含むＮｏｔＩ断片を挿入し、ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２を構築した。ｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２からは、公知の方法（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　２：４５７−４６６）によりヒトＦＧＦ２を発現する複製型ＳｅＶベクターを調製し、ＳｅＶ−ｈＦＧＦ２とした。
３．Ｆ欠失ＳｅＶウイルスの再構成及び増幅
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）をＣｒｅ　ＤＮＡリコンビナーゼにより誘導的に発現するＦ発現ヘルパー細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ；ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）を用いて、Ｆ欠損ＳｅＶベクターの再構築を行った（ＳｅＶ−Ｆ遺伝子誘導発現前の該細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆと表記し、誘導発現後の細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄと表記する）。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで直径１０ｃｍのペトリ皿に蒔き、２４時間培養後、ソラレンと長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３，８１２２−８１２６，１９８６）に室温で１時間感染させた（ｍｏｉ＝２）。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、１５ワットバルブ５本が装備されたＵＶ　Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。細胞を２回洗浄して、プラスミドｐＳｅＶ１８^＋ｈＦＧＦ２／ΔＦ、ｐＧＥＭ／ＮＰ、ｐＧＥＭ／Ｐ、ｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１，５６９−５７９，１９９６）およびｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ（ＷＯ００／７００７０）をそれぞれ１２μｇ、４μｇ、２μｇ、４μｇおよび４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（１μｇ　ＤＮＡ／５μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ　３ｍｌに入れ、細胞に添加して培養した。３〜５時間培養後、細胞を血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド４０μｇ／ｍｌ（ＡｒａＣ、Ｓｉｇｍａ）およびトリプシン７．５μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を含み、血清を含まないＭＥＭで２４時間培養した。
培養上清を除き、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞を重層した。具体的には血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）に分散したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞を、培養上清を除いた細胞に重層し、４８時間培養を継続した。スクレイパーにてこれらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁し（１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、凍結融解を３回繰り返し行った。このライセートをＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞（４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ　１２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）にかけ（２００μｌ／ｗｅｌｌ）、さらに３００μｌ／ｗｅｌｌの血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）を添加し、１５〜２４時間培養した。培養上清を除き、血清を含まないＭＥＭで洗浄後、新たな血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）を添加し、５〜９日間培養を行い上清を回収した。回収した上清をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞へ感染し、同じように血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養を行うことでＦ欠失型ＳｅＶを増幅した。
その際、Ｆ欠失型ＳｅＶ粒子が含まれている培養上清を、０．２２μｍのフィルターに繰り返し２回通すことで、再構成時のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼの発現に利用したリコンビナントワクシニアウイルスの混入を除去した。具体的には、２回以上ＡｒａＣを含み血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で増幅した培養上清（Ｐ２以降のサンプル）について０．２２μｍのフィルターに２回通し、更に１回ＡｒａＣを含み血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で増幅した培養上清を回収し、リコンビナントワクシニアウイルスの混入を回避して増幅したＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ−ｈＦＧＦ２／ΔＦ）を得た。
４．複製型および複製能欠失型ヒトＦＧＦ２発現ＳｅＶベクターを用いた虚血肢遺伝子治療
実施例１に記載のＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス重症虚血モデル（脱落肢モデル）を用いて、複製型および複製能欠失型ヒトＦＧＦ２発現ＳｅＶベクターの投与による治療効果を検証した。血管新生遺伝子の導入は実施例２と同様に行った。ベクターの注入は手術時に行った。手術後の肢脱落を観察し、各時点における救肢率（肢が残っている個体の割合）を算出した（図１３）。
対照のルシフェラーゼ発現ＳｅＶ（ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を投与したマウスでは、非投与マウスと同様に高い頻度で肢が脱落した。これに対し、ヒトＦＧＦ２発現ベクター（ＳｅＶ−ｈＦＧＦ２およびＳｅＶ−ｈＦＧＦ２／ΔＦ）を投与した場合は肢脱落を有意に抑制した。本実施例により、ヒトＦＧＦ２を発現するパラミクソウイルスベクターが虚血治療のため血管新生遺伝子として高い効果を有することが示された。さらに、複製能欠失型パラミクソウイルスベクターが虚血治療に有効であることを実証した。
産業上の利用の可能性
本発明により、虚血組織を標的とした遺伝子治療のための基盤技術が提供された。これにより、虚血組織の血管新生を効果的に誘導し、壊死を防止することが可能となる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、中度（左）および重症（右）のマウス急性後肢虚血の手術手順の模式図である。分枝した線は後肢の動脈および静脈を示す。血管の切除部位を短い太い線で示した。
図２は、後肢虚血に伴う筋中（左）および血清（右）での内因性ＶＥＧＦ（黒）およびＦＧＦ２（白）の発現を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中度および重症虚血モデルを用いた。手術２日後に全大腿筋および腓骨筋（ｎ＝６）および血清（ｎ＝６）を採取し、ＥＬＩＳＡに供した。値はそれぞれ筋の全抽出蛋白質または容量で標準化し、平均±Ｓ．Ｄ．で表した。筋の値は大腿筋および腓骨筋の両者のデータを含む（従って各群ｎ＝１２）。平均の値を図に示した。＊ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５（一元配置分散分析による解析）。
図３は、虚血によるＶＥＧＦの発現の誘導をＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた結果を示す写真である。
図４は、ＳｅＶを介した筋中へのホタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子導入における発現レベル（左）および時間経過（右）を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中度虚血モデルにおいて、未処理、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｇ）投与、またはＳｅＶ−ｌｕｃ（１０^７ｐｆｕまたは１０^８ｐｆｕ）投与によるルシフェラーゼ活性を調べた（左）。右パネルは中度虚血モデルへのルシフェラーゼ遺伝子の導入における発現レベルの時間経過を示す。白丸：Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｇ）投与、濃い丸：Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＳｅＶ−ｌｕｃ（１０^８ｐｆｕ）投与、薄い丸：ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスへのＳｅＶ−ｌｕｃ（１０^８ｐｆｕ）投与。太い線は導入遺伝子発現が有意となるカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）値を表す。各グラフとも、遺伝子発現のレベルは同じスケールを用いている。ｌｏｇスケールであることに注意。
図５は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける血管新生蛋白質の分泌を、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＣＯＳ７細胞、ウシ血管平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）、および心筋芽細胞（Ｈ９Ｃ２）を用いて測定した結果を示す図である。「ベーサルな放出（ｂａｓａｌ　ｒｅｌｅａｓｅ）」は、ベクターなしにおける各因子の産生量を表す。導入遺伝子由来の発現が有意となるレベルをカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）値として示した。
図６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中度の虚血肢に外来的に導入したＦＧＦ２（ａ）およびＶＥＧＦ（ｂ）遺伝子の筋中（左）および血清（右）でのｉｎ　ｖｉｖｏの発現を示す図である。手術後直ぐにそれぞれのベクター溶液５０μｌを大腿筋および腓骨筋に注入した。手術２日後に全大腿筋および腓骨筋（ｎ＝６）および血清（ｎ＝６）を採取し、マウスＦＧＦ２（ａ）、ならびにマウスおよびヒトＶＥＧＦ（ｂ）のＥＬＩＳＡに供した。値はそれぞれ筋の全抽出蛋白質または容量で標準化し、平均±Ｓ．Ｄ．で表した。平均の値を図に示した。ｌｏｇスケールであることに注意。
図７は、遺伝子導入による内因性マウスＶＥＧＦの発現増強を示す図である。手術なし（左）、中度虚血（中央）、および重症虚血（右）のＣ５７ＢＬ／６マウスの肢筋中における内因性マウスＶＥＧＦの発現の遺伝子導入による増強を示す。手術の直後に、５０μｌの各ベクター溶液を大腿筋および腓骨筋に注入した。手術２日後に全大腿筋および腓骨筋および血清（各ｎ＝６、全部でｎ＝１２）を採取し、マウスＶＥＧＦのＥＬＩＳＡに供した。値は筋の全抽出蛋白質で標準化し、平均±Ｓ．Ｄ．で表した。平均の値を図に示した。＊ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５（一元配置分散分析による解析）。
図８は、遺伝子導入によるマウス肢筋の組織像を示す写真である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを重症虚血手術に供し、図７と同様に処理して、手術２日後に組織学的観察を行った。未処理動物（左上；非虚血（ｎｏ　ｉｓｈｅｍｉａ））に比べ、明確な炎症性浸潤およびストローマ細胞の浮腫が偽投与（ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；ｍｏｃｋ）の大腿筋（右上）において認められた。重篤な筋線維の破壊、細胞内浮腫、および炎症性浸潤がＶＥＧＦ１６５処理動物で観察された（左下；ＶＥＧＦ１６５）。これらの傷害は、ＦＧＦ２遺伝子導入により抑制された（右下；ＦＧＦ２）。各群とも６個体を用い、同様の結果を得た。ヘマトキシリン・エオシン染色。オリジナル倍率×２００。
図９は、左後肢に手術して１０日後における重症虚血マウスの筋中への血管新生因子遺伝子の外来導入の治療または増悪効果を示す写真である。各図に救肢スコア（ｌｉｍｂ　ｓａｌｖａｇｅ　ｓｃｏｒｅ；ＬＳＳ）を示した。上段はＣ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血モデル［救肢モデル（ｌｉｍｂ　ｓａｌｖａｇｅ　ｍｏｄｅｌ）］における典型的な増悪効果を示す。ＶＥＧＦ１６５を導入したマウスは全肢が脱落（中央上パネル）したが、ルシフェラーゼの対照（左上パネル）およびＦＧＦ２処理マウス（右上パネル）は救肢された。下段はＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスの重症虚血モデル［下肢脱落モデル（ａｕｔｏ−ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ）］における典型的な治療効果を示す。ＦＧＦ２処理したマウスは救肢され（右下パネル）たが、ルシフェラーゼの対照（左下パネル）およびＶＥＧＦ１６５処理マウス（右下パネル）では後肢がほぼ全て脱落した。
図１０は、救肢モデルおよび脱落肢モデルにおけるベクター投与後の後肢の予後曲線を示す図である。投与個体中で肢が残っている個体の割合（救肢率）を示した。血管新生遺伝子の筋中への遺伝子導入により、Ａに示されたＣ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血モデル（救肢モデル）ではＶＥＧＦ１６５の増悪効果が、Ｂに示されたＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスの重症虚血モデル（下肢脱落モデル）ではＦＧＦ２の治療効果が示されている。各群は３回の別々の実験を行った（ｎ＝１０）。曲線はＫａｐｌａｎ−Ｍａｙｅｒ法による。データはｌｏｇ−ｒａｎｋ検定により解析した。＊ｐ＜０．０００１。
図１１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血（救肢モデル）を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける血管新生効果をレーザードップラー灌流像解析により測定した結果を示す写真である。ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５、およびＳｅＶ−ＦＧＦ２を１０^７ｐｆｕで投与して、血液の灌流の回復を観察した。各群は同一個体の時間経過を示す。上段は、ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ処理マウス（Ｍｏｃｋ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の血流回復の時間経過の典型的な結果を示す。大腿筋の血液再灌流は手術４日後から認められ、７日目には明確に観察された。しかし、１０日目でも下腿部の明確な灌流は検出されず、肢は萎縮し指の壊死の徴候が見られた（一番右のパネル）。中段はＳｅＶ−ＶＥＧＦ１６５処理マウスの典型的な時間経過を示す。大腿部および下腿部において、観察期間中、明確で有意な再灌流は認められず、肢は脱落した（一番右のパネル）。下段は、ＳｅＶ−ＦＧＦ２処理マウスの典型的な時間経過を示す。４日目までに大腿部で明確な再灌流を認め、１０日目までには肢全体で有意な血流が見られ、完全に救肢された（一番右のパネル）。
図１２は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの重症虚血（救肢モデル）における血管新生遺伝子治療による血液灌流の回復を示す図である。図１１と同様の実験における虚血肢および非虚血肢の平均血流量を算出し、右肢（非虚血）の血流値に対する左肢（虚血）の血流値の比として表した。＊ｐ＜０．０１（他の全ての群との比較において）、＃ｐ＜０．０５（他の全ての群との比較において）、＃＃ｐ＜０．０５［偽投与群（ｍｏｃｋ）との比較において］。
図１３は、マウス重症虚血モデル（脱落肢モデル）におけるｈＦＧＦ２遺伝子搭載複製型ＳｅＶベクターまたはｈＦＧＦ２遺伝子搭載Ｆ欠失型ＳｅＶベクター投与による救肢率の経時的観察結果を示す図である。実験個体数（ｎ）およびベクターの投与量は図中に示した。

Claims (8)

1. 血管新生遺伝子を発現可能にコードするパラミクソウイルスベクター。
2. 血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
3. パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
4. Ｆ遺伝子を欠損している、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
5. 請求項１に記載のパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞、並びに薬学的に許容できる担体を含む、血管新生組成物。
6. 虚血組織を処置するための、請求項５に記載の組成物。
7. 筋中投与用である、請求項５に記載の組成物。
8. 請求項５から７のいずれかに記載の血管新生組成物を投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法。

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