BR112018072849B1

BR112018072849B1 - proteína de capsídeo variante de vírus adeno-associado, ácido nucleico isolado, vírion de raav infeccioso e respectivo uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112018072849B1
Application number: BR112018072849-7A
Authority: BR
Inventors: David H. Kirn; Melissa KOTTERMAN; David Schaffer
Original assignee: 4D Molecular Therapeutics Inc.
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2020-12-22
Also published as: CO2018013255A2; ES2941502T3; US11419949B2; MX2018013463A; CN109476707A; CA3023592A1; US20210069349A1; BR112018072849A2; CN115925999A; PE20190129A1; CL2018003196A1; EP4206216A1; WO2017197355A3; EP3445773B1; RU2018142768A; US11364308B2; PH12018502387A1; CN116333057A; KR20190005223A; AU2017261812B2

Abstract

São aqui fornecidas proteínas de capsídeo do vírus adenoassociado (AAV) variante tendo uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental que, quando presente em um vírion de AAV, confere uma infecciosidade aumentada de um ou mais tipos de células retinais em comparação com a infecciosidade das células retinais por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental não modificada. São também fornecidos vírions de AAV recombinantes e composições farmacêuticas dos mesmos compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV variante como aqui descrita, métodos para produzir estas proteínas e vírions de capsídeo de rAAV e métodos para uso destas proteínas de capsídeo de rAAV e vírions na pesquisa e na prática clínica, por exemplo, na aplicação de sequências de ácido nucleico a uma ou mais células da retina para o tratamento de distúrbios e doenças da retina.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

[001] De acordo com o 35 U.S.C. §119(e), este Pedido reivindica prioridade para a data de depósito do pedido de patente provisório dos Estados Unidos com o n° de série 62/336.441 depositado em 13 de maio de 2016; pedido de patente provisório dos Estados Unidos com o n° de série 62/378.106, depositado em 22 de agosto de 2016; pedido de patente provisório dos Estados Unidos com o n° de Série 62/384.590, depositado em 7 de setembro de 2016; pedido de patente provisório dos Estados Unidos com o n° de série 62/454.612, depositado em 3 de fevereiro de 2017; estando as revelações das mesmas aqui incorporadas, por referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS FORNECIDA COMO ARQUIVO DE TEXTO

[002] Uma Listagem de Sequência é fornecida aqui como um arquivo de texto, “4D_ST25.txt” criado em 12 de maio de 2017 e com um tamanho de 198 KB. O conteúdo do arquivo de texto é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção aqui divulgada se refere em geral ao campo de vírions de vírus adeno-associados (AAV) compreendendo proteínas de capsídeo de variantes e a geração de tais capsídeos variantes com o uso de técnicas de evolução dirigida.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] As doenças da retina hereditárias abrangem um grande grupo de doenças genéticas heterogêneas que afetam aproximadamente de 1 em 3.000 pessoas (maior que 2 milhões de pessoas em todo o mundo) e são uma importante fonte de perda da visão grave ou cegueira. Doenças da retina multifatoriais complexas como degeneração macular úmida relacionada à idade (wAMD) e retinopatia diabética (DR) impactam ainda mais indivíduos, com 1,7 milhão de americanos vivendo atualmente com perda da visão grave central associada a wAMD e quase um terço dos adultos com mais de 40 anos com diabetes sendo deficientes visuais. Estas doenças são tipicamente associadas com a disfunção ou morte de um ou mais tipos de células da retina, em alguns casos devido à ausência de expressão ou função de uma proteína chave, por exemplo, RPE65 em LCA2, em outros casos devido a mutações genéticas que criam produtos de gene tóxicos, por exemplo, mutações dominantes que afetam a flexão da proteína rodopsina, ou ainda em outros casos, devido a alterações na fisiologia da retina induzidas pela expressão ectópica de uma proteína, por exemplo, VEGF em wAMD.

[005] Uma abordagem para abordar esta grande necessidade não médica é a terapia mediada por vírus adeno-associado baseado em genes (AAV), na qual um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) é usado para liberar um gene a um ou mais tipos de células na retina, por exemplo, para substituir um gene ausente, para corrigir um gene defeituoso dominante ou para fornecer um modelo para a terapia de proteína contínua. Embora a terapia genética clínica baseada em AAV tenha sido cada vez mais bem sucedida, ainda está repleta de deficiências em relação a propriedades do vetor viral, incluindo, por exemplo, o direcionamento das células desejadas da retina com alta eficiência. Por exemplo, foram identificados e caracterizados múltiplos sorotipos de AAV de primatas homólogos e numerosos sorotipos de primatas não humanos, com o AAV2 sendo o melhor caracterizado entre os sorotipos de AAV e o primeiro a ser adaptado como veículo de liberação de genes no olho. No entanto, estes AAVs (incluindo AAV2) não foram relatados como eficazes na transdução dos tipos de células mais profundos da retina quando liberados via administração intravítrea. Em consequência, existe uma necessidade na técnica de novas variantes de AAV com capacidades de transdução superiores que forneçam uma liberação baseada em genes mais eficaz para as células da retina para o tratamento da doença ocular. Existe uma necessidade na técnica para tais variantes de AAV que exibem um perfil de transdução da retina melhorado. Em alguns casos, em termos gerais, em outros casos preferencialmente para certos tipos de células da retina em comparação com AAVs de tipo selvagem e variantes de AAV como conhecido na técnica.

[006] O AAV de ocorrência natural é um vírus de DNA de fita simples que contém três quadros de leitura abertos, rep, cap e aap. O primeiro gene, rep, codifica quatro proteínas necessárias para a replicação do genoma (Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40), o segundo, cap, expressa três proteínas estruturais (VP1-3) que se juntam para formar o capsídeo viral, e o terceiro expressa a proteína de ativação de montagem (AAP) que é essencial para a montagem do capsídeo. O AAV depende da presença de um vírus auxiliar, tal como um adenovírus ou herpesvírus, para replicação ativa. Na ausência de um vírus auxiliar, o AAV estabelece um estado latente no qual seu genoma é mantido episomalmente ou integrado ao cromossomo hospedeiro no local AAVS1.

[007] Podem ser usadas técnicas de evolução dirigida in vitro e in vivo para selecionar variantes de AAV que proporcionam uma melhoria em relação aos vetores de aplicação de genes baseados em AAV atuais. Tais técnicas de evolução dirigidas são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, na publicação PCT WO 2014/194132 e Kotterman & Schaffer (Nature Review Genetics, AOP, publicada online em 20 de maio de 2014; doi: 10.1038/nrg3742), ambos dos quais estão aqui incorporados na sua totalidade, a título de referência. A evolução dirigida é uma abordagem de engenharia do capsídeo que emula a evolução natural através de ciclos iterativos de diversificação genética e processos de seleção, permitindo assim o acúmulo de mutações benéficas que melhoram progressivamente a função de uma biomolécula, como um vírion baseado em AAV. Nesta abordagem, os genes de cap de AAV de tipo selvagem são diversificados para criar grandes bibliotecas genéticas que são empacotadas para gerar bibliotecas de partículas virais, e a pressão seletiva é aplicada para isolar variantes originais com fenótipos superiores que podem superar as barreiras de aplicação de genes.

[008] As variantes de AAV foram reveladas, por exemplo, nas patentes dos Estados Unidos números 9.193.956, 9.186. 419, 8.632.764, 8.663.624, 8.927.514, 8.628.966, 8.263.396, 8.734.809, 8.889.641, 8.632.764, 8.691.948, 8.299.295, 8.802.440, 8.445.267, 8.906.307, 8.574.583, 8.067.015, 7.588.772, 7.867.484, 8.163.543, 8.283.151, 8.999.678, 7.892.809, 7.906.111, 7.259.151, 7.629.322, 7.220.577, 8.802.080, 71998951, 8.318.480, 8.962.332, 7.790.449, 7.282.199, 8.906.675, 8.524.446, 7.712.893, 6.491.907, 8.637.255, 7.186.522, 7.105.345, 6.759.237, 6.984.517, 6.962.815, 7.749.492, 7.259.151, e 6.156.303, publicação dos Estados Unidos números 2013/0295614, 2015/0065562, 2014/0364338, 2013/0323226, 2014/0359799, 2013/0059732, 2014/0037585, 2014/0056854, 2013/0296409, 2014/0335054 2013/0195801, 2012/0070899, 2011/0275529, 2011/0171262, 2009/0215879, 2010/0297177, 2010/0203083, 2009/0317417, 2009/0202490, 2012/0220492, 2006/0292117, e 2004/0002159, publicação Europeia números 2692731A1, 2383346B1, 2359865B1, 2359866B1, 2359867B1, e 2357010B1, 1791858B1, 1668143B1, 1660678B1, 1664314B1, 1496944B1, 1456383B1, 2341068B1, 2338900B1, 1456419B1, 1310571B1, 1456383B1, 1633772B1, e 1135468B1, publicação internacional números (PCT) WO 2014/124282, WO 2013/170078, WO 2014/160092, WO 2014/103957, WO 2014/052789, WO 2013/174760, WO 2013/123503, WO 2011/038187, WO 2008/124015e WO 2003/054197, no entanto, nenhuma destas referências revela as modalidades e/ou características e/ou composição das estruturas de matéria das variantes de AAV descritas pela presente invenção.

[009] Todos os documentos e referências citados na presente invenção e nos documentos de patente referenciados, são aqui incorporadas, a título de referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] São fornecidas pela presente invenção a proteína de capsídeo de vírus adeno-associado AAV variante tendo uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental, quando presente em um vírion de AAV, confere infecciosidade aumentada de um ou mais tipos de células da retina em comparação com a infecciosidade de células da retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental não modificada. São também fornecidos vírions de AAV recombinantes e composições farmacêuticas dos mesmos compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV variante como descrita pela presente invenção, métodos de produzir proteínas e vírions de capsídeo de variante de rAAV e métodos para usar estas proteínas e vírions de capsídeo de rAAV em investigação e na prática clínica, por exemplo em a aplicação de sequências de ácidos nucleicos a uma ou mais células da retina para o tratamento de distúrbios e doenças da retina.

[0011] Em alguns aspectos da divulgação, proteínas de capsídeo de vírus adeno-associados variantes (AAV) são fornecidas, estas proteínas de capsídeo de AAV variantes tendo uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos em relação a um capsídeo de AAV parental que, quando presente em um vírion de AAV, confere infecciosidade aumentada de um ou mais tipos de células da retina (por exemplo, uma célula de fotorreceptores) (por exemplo, varetas; cones), uma células ganglional da retina (RGC), uma célula glial (por exemplo, uma célula glial de Müller, uma célula microglial), uma célula bipolar, uma célula amácrina, uma célula horizontal e/ou uma célula de epitélio pigmentado da retina (RPE)) em comparação com a infecciosidade das células retina por um vírion de AAV compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV parental que não compreende a modificação da sequência de aminoácidos.

[0012] Em alguns aspectos da divulgação, vírions de AAV recombinantes (rAAV são fornecidos, estes vírions de rAAV compreendendo uma proteína de capsídeo de variante como descrita pela presente invenção, em que os vírions de rAAV exibem uma infecciosidade aumentada de um ou mais tipos de células da retina por exemplo, uma célula de fotorreceptores) (por exemplo, varetas; cones), uma células ganglional da retina (RGC), uma célula glial (por exemplo, uma célula glial de Müller, uma célula microglial), uma célula bipolar, uma célula amácrina, uma célula horizontal e/ou uma célula de epitélio pigmentado da retina (RPE) em relação à infecciosidade da célula da retina por um vírion de AAV compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV parental não modificada correspondente. Em algumas modalidades, o vírion de rAAV exibe uma infecciosidade aumentada de todas as células da retina em relação ao vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental. Em outras modalidades, o vírion de rAAV exibe uma infecciosidade aumentada de certos tipos de células da retina, mas não outros em relação ao vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental. Colocado de outra forma, o vírion de rAAV exibe uma infecciosidade aumentada que é preferencial para certos tipos de células da retina, mas não para outros, por exemplo, o rAAV demonstra uma infecciosidade preferencialmente aumentada de um ou mais tipos de células selecionadas dentre células fotorreceptoras, células ganglionares da retina, células gliais, células bipolares, célula horizontal de células amácrinas e/ou células do epitélio pigmentado da retina (RPE), mas não demonstram uma infecciosidade aumentada de todos os tipos de células.

[0013] Em algumas modalidades, o vírion de rAAV compreende um ácido nucleico heterólogo. Em algumas dessas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que codifica um polipeptídeo. Em outras dessas modalidades, a sequência de ácido nucleico heteróloga codifica um RNA que não codifica um polipeptídeo, por exemplo, a sequência de ácido nucleico heteróloga, um agente de interferência de RNA, um RNA guia para uma nuclease, etc.

[0014] Também são aqui fornecidas composições farmacêuticas compreendendo os vírions de rAAV infecciosos em questão e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0015] Também é fornecido o uso de um vírion de rAAV compreendendo uma proteína de capsídeo de variante como revelada pela presente invenção em um método de distribuição de um ácido nucleico heterólogo a uma célula alvo (tal como uma célula de retina) por contato da célula alvo com o vírion de rAAV. Em algumas modalidades, a célula alvo in vivo, tal como no olho de um indivíduo em necessidade de tratamento para uma doença ocular. Em outras modalidades, a célula alvo está in vitro.

[0016] Também são aqui fornecidos métodos de tratamento de uma doença ocular pela administração a um indivíduo necessitado de tal tratamento de uma quantidade eficaz de vírion de rAAV compreendendo uma proteína de capsídeo de variante como descrita pela presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz dos vírions de rAAV.

[0017] Também são aqui fornecidos um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica uma proteína de capsídeo de AAV variante como revelado pela presente invenção e uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico isolado. Em inda outras modalidades, o ácido nucleico isolado e/ou a célula hospedeira isolada compreende o rAAV.

[0018] Em alguns aspectos, a proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos (um “peptídeo heterólogo” ou “inserção de peptídeo”) na alça GH da proteína de capsídeo, em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, em que a proteína da capsídeo de variante, quando presente em um vírion de AAV, confere uma infecciosidade aumentada de uma célula da retina em comparação com a infecciosidade de uma célula da retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente. Em algumas modalidades, o peptídeo compreende a sequência selecionada dentre o grupo que consiste em QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) e LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41). Em algumas modalidades, o peptídeo consiste essencialmente na sequência selecionada dentre o grupo que consiste em QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) e LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41). Em alguns aspectos, a proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, em que a proteína da capsídeo de variante, quando presente em um vírion de AAV, confere infecciosidade aumentada de uma célula da retina em comparação com a infecciosidade de uma célula da retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente.

[0019] Em aspectos relacionados, a proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo e ou mais substituições de aminoácidos em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, em que a proteína da capsídeo de variante, quando presente em um vírion de AAV, confere infecciosidade aumentada de uma célula da retina em comparação com a infecciosidade de uma célula da retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente.

[0020] É apresentado, também pela presente invenção, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreendendo o peptídeo heterólogo LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) e uma substituição P34A em relação a AAV2.

[0021] É apresentado, também pela presente invenção, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreendendo o peptídeo heterólogo LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) e as substituições de aminoácidos N312K, N449D, N551S, I698V e L735Q em relação a AAV2.

[0022] São apresentados, também pela presente invenção, métodos para a fabricação e/ou liberação de um rAAV compreendendo um capsídeo de AAV variante como revelado pela presente invenção. Além disso, são fornecidos pela presente invenção kits compreendendo um rAAV compreendendo um capsídeo de AAV variante como revelado pela presente invenção e para uso nos métodos revelados pela presente invenção.

[0023] Em outras modalidades, o vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de variante nos parágrafos anteriores pode incorporar qualquer uma das modalidades anteriores ou subsequentemente reveladas. De fato, é apreciado que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer sub combinação adequada. Todas as combinações das modalidades referentes à invenção são especificamente abrangidas pela invenção e são reveladas pela presente invenção como se cada uma das combinações fosse divulgada individualmente e explicitamente. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e elementos das mesmas são também especificamente abrangidas pela invenção e são reveladas pela presente invenção apenas como se cada e todas de tais subcombinações fossem individualmente e explicitamente da presente reveladas pela presente invenção.

[0024] O Sumário da Invenção não se destina a definir as Reivindicações nem pretende limitar o escopo da invenção de qualquer maneira.

[0025] Outras características e vantagens da invenção aqui reveladas serão evidentes a partir das seguintes figuras, descrição detalhada e Reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] A invenção é melhor compreendida a partir da seguinte descrição detalhada quando lida em conjunto com os desenhos anexos. O arquivo de patente ou pedido de patente contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária. É enfatizado que, de acordo com a prática comum, as várias características dos desenhos não estão em escala. Por outro lado, as dimensões das várias características são arbitrariamente expandidas ou reduzidas para maior clareza. As figuras estão incluídas nos desenhos a seguir.

[0027] A FIG. 1 representa modalidades de uma metodologia de evolução dirigida. A etapa (a) representa a geração de uma biblioteca de capsídeos virais compreendendo combinações de técnicas de mutação de DNA e genes de cap. A etapa (b) representa o empacotamento dos vírus de tal modo que cada partícula viral é composta por um capsídeo mutante envolvendo o gene de cap que codifica e purifica esse capsídeo. A biblioteca de capsídeo é então colocada sob pressão seletiva in vitro ou in vivo. Neste aspecto da tecnologia de evolução dirigida, tecidos ou material celular de interesse são colhidos para isolamento de variantes de AAV que infectaram com sucesso esse alvo e os vírus bem sucedidos são recuperados. A etapa (c) representa o enriquecimento de estágio 1 de clones bem sucedidos através de seleção repetida. A etapa (d) representa o enriquecimento do estágio 2 de genes caps selecionados que são submetidos a rediversificação e etapas de seleção adicionais para aumentar iterativamente a aptidão viral. A etapa (e) representa as variantes, identificadas como ocorrências durante os Estágios de Seleção de Vetor 1 e 2, que serão fabricadas como vetores AAV recombinantes e caracterizados quanto ao nível de transdução de vários tipos de células e alvos de tecidos. Pela natureza do processo de evolução dirigida de AAV, variantes que são reveladas pela presente invenção já demonstraram a capacidade de transduzir células da retina e liberar um genoma (o genoma que codifica o gene cap variante) durante o processo de seleção.

[0028] A FIG. 2 fornece um esquema de montagem plano da retina mostrando onde amostras a partir das quais os genomas virais são amplificados são coletadas através de uma ampla área da retina.

[0029] A FIG. 3 mostra uma amplificação por PCR de genomas virais da camada de células ganglionares (GCL), camada nuclear interna (INL), camada nuclear fotorreceptora/externa (ONL) e tecido da retina de camada de epitélio pigmentar da retina de um ciclo representativo de seleção. Tanto o olho direito (imagem superior) quanto o olho esquerdo (imagem inferior) foram injetados com biblioteca. A retina interna (in), a retina média (média) e a retina externa/periférica (externa) foram amostradas. Bandas dentro de caixas vermelhas representam amplificação bem sucedida de genomas virais.

[0030] As FIGS. 4A-4D representa a frequência de motivos dentro da análise de sequenciamento. A Figura 4A fornece a análise de

[0031] A FIG. 5 fornece um modelo tridimensional representativo de AAV2 contendo um heptâmero aleatório seguindo o aminoácido 587.

[0032] A FIG. 6 fornece um alinhamento de SEQ ID NOS: 1-11 de AAV do tipo selvagem que mostra locais de aminoácidos entre e através dos sorotipos AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B e AAV4-10 do tipo selvagem (ocorrendo naturalmente).

[0033] A FIG. 7 fornece imagens de fluorescência do fundo do olho tomadas com Heidelberg Spectralis TM da retina de um macaco Verde Africano após administração intravítrea de 2x1011 genomas de vetores (vg) de AAV2 aplicando um transgene GFP sob o controle do promotor CMV (AAV2.CMV.GFP). As imagens foram tiradas na linha de base (A) e aos 14 dias (B), 28 dias (C) e 42 dias (D) após a injeção.

[0034] A FIG. 8 fornece imagens de fluorescência do fundo de olho tomadas com um Heidelberg Spectralis TM da retina de um macaco Verde Africano após administração intravítrea de 2x1011 genomas vetoriais (vg) da nova variante de AAV LAISDQTKHA + P34A aplicando um transgene GFP sob o controle do promotor de CMV (LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP). As imagens foram tiradas na linha de base (A) e aos 14 dias (B), 28 dias (C) e 42 dias (D) após a injeção.

[0035] A FIG. 9 fornece imagens de fluorescência do fundo de olho tomadas com um Heidelberg Spectralis TM da retina de macacos Cinomolgos após administração intravítrea da nova variante de AAV LAISDQTKHA + P34A aplicando um transgene GFP sob o controle do promotor CAG (LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP). (A) A retina de um macaco injetado intravitrealmente com 2x1011 vg de vetor, capturada 14 dias (A1), 21 dias (A2) e 28 dias (A3) após a injeção. (A) A retina de um macaco injetado intravitrealmente com 1x1012 vg de vetor, capturada 14 dias (A1) e 21 dias (A2) após a injeção.

[0036] As FIGS. 10A-10E fornecem os resultados da análise imuno-histoquímica da retina de um macaco injetado axialmente com 1x1012 vg da nova variante de AAV LAISDQTKHA+P34A aplicando um transgene GFP sob o controle do promotor CAG, analisado três semanas após a injeção. Toda a imuno-histoquímica é fornecida juntamente com a imagem de fluorescência do fundo de olho, com uma caixa vermelha para indicar aproximadamente onde a análise da retina foi realizada. Figura 10A: O epitélio pigmentar da retina (RPE) robusto e a transdução fotorreceptora foram observados com o uso de um anticorpo específico para GFP (vermelho). A imunocoloração de fotorreceptores cone com o uso de um anticorpo M/L opsina é mostrada em branco. Figuras 10B e 10C: O fotorreceptor de haste e cone robusto (Figura 10B) e a transdução do RPE (Figura 10C) foram observados por fluorescência direta de EGFP (verde) e por imuno-histoquímica com o uso de um anticorpo específico para GFP (vermelho). Melanossomas no RPE aparecem em preto na imagem. Figura 10D: A transdução de fotorreceptores de cone (identificados por opsina M/L, branca) e células ganglionares da retina (RGC) e ao redor da fóvea foi observada por fluorescência direta de EGFP (verde) e por imuno-histoquímica com o uso de um anticorpo específico para GFP (vermelho). As imagens nos painéis no meio são uma ampliação maior (63X) da área denotada por uma caixa branca no painel esquerdo. Figura 10E: A transdução de células ganglionares da retina (RGC) e a camada de células ganglionares da retina foi observada por fluorescência direta de EGFP (painéis da direita, verde; painel inferior direito é uma ampliação de 63X do painel superior direito); o painel superior esquerdo mostra a região sob iluminação de campo claro.

[0037] As FIGS. 11A-11F fornecem dados sobre a transdução in vitro de células epiteliais pigmentares da retina (RPE) por vírus de AAV recombinante compreendendo o novo capsídeo LAISDQTKHA + P34A variante de AAV e um transgene de GFP sob o controle do promotor CAG. Células que foram diferenciadas em células de RPE de uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas (Figuras 11A e 11C) ou de células- tronco pluripotentes humanas (FB-iPSC) (Figuras 11B e 11D) foram infectadas com a nova variante de LAISDQTKHA+P34A.CAG.GFP ou controle de tipo selvagem AAV2.CAG.GFP. Figuras 11A e 11B: A imageamento de imunofluorescência das culturas de células 7 dias após infecção em uma MOI de 500 demonstra que o novo capsídeo de variante de AAV (painéis da esquerda) transduz células de RPE melhor do que o capsídeo de AAV2 de tipo selvagem (painéis da direita). Figuras 11C e 11D: A quantificação da porcentagem de células de RPE positivas para GFP em cada cultura por citometria de fluxo revela que a nova variante de capsídeo da AAV fornece uma melhoria significativa, dependente da dose, no número de células transduzidas em relação ao capsídeo de AAV2 de tipo selvagem, independentemente da fonte de células. Figuras 11E e 11F: A quantificação da quantidade de GFP em cada cultura através de Western blot revela que a nova variante de AAV fornece uma melhoria significativa na expressão do transgene em relação ao capsídeo do tipo selvagem, independentemente da fonte de célula.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0038] Antes dos métodos e composições presentes serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a um método ou composição particular descrita e como tal pode variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada pela presente invenção é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não pretende ser limitativos, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas Reivindicações anexas.

[0039] A invenção revelada pela presente invenção é ilustrada nas figuras e descrição. No entanto, embora as modalidades particulares sejam ilustradas nas figuras, não há intenção de limitar a invenção à modalidade específica ou modalidades ilustradas e/ou reveladas. Pelo contrário, a invenção revelada se destina a abranger todas as modificações, construções alternativas e equivalentes abrangidas pelo espírito e escopo da invenção. Dessa forma, as figuras destinam-se a serem ilustrativas e não restritivas.

[0040] Quando uma faixa de valores é fornecida, é entendido que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre os limites superior e inferior dessa faixa é também especificamente revelado. Cada faixa menor entre qualquer valor declarado ou valor interveniente em uma faixa estabelecida e qualquer outro valor declarado ou interveniente nessa faixa estabelecida está abrangida no escopo da invenção. Os limites superior e inferior destas faixas menores podem independentemente ser incluídos ou excluídos na faixa, e cada faixa em que qualquer um dos dois ou ambos os limites estão incluídos nas faixas menores é também abrangido pela invenção, submetida a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Quando a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos estão também incluídos na invenção.

[0041] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados pela presente invenção têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, alguns métodos e materiais potenciais e preferenciais são agora descritos. Todas as publicações mencionadas pela presente invenção são aqui incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em relação aos quais as publicações são citadas. Deve ser entendido que a presente divulgação substitui qualquer divulgação de uma publicação incorporada na medida em que existe uma contradição.

[0042] Como será evidente para os versados na técnica ao ler esta divulgação, cada uma das modalidades individuais descritas e ilustradas pela presente invenção tem componentes e características discretas que podem ser prontamente separadas de ou combinadas com as características de qualquer uma das outras várias modalidades sem sair do escopo ou espírito da presente invenção. Qualquer método recitado pode ser executado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível.

[0043] Note-se que tal como usado pela presente invenção e nas Reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um vírion de AAV recombinante” inclui uma pluralidade de tais vírions e a referência a “célula fotorreceptora” inclui referência a uma ou mais células fotorreceptoras e equivalentes das mesmas conhecidas do versados na técnica, e assim por diante. Note-se ainda que as Reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Dessa forma, esta declaração tem por objetivo servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como “somente”, “apenas” e similares em conexão com a menção de elementos de Reivindicação, ou uso de uma limitação “negativa”.

[0044] As publicações discutidas pela presente invenção são fornecidas apenas para a sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de antedatar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação que podem necessitar de confirmação independente.

DEFINIÇÕES

[0045] Exceto onde definido em contrário, todos os termos científicos e técnicos utilizados pela presente invenção têm o mesmo significado que é comumente compreendido pelo versado na técnica a que esta tecnologia pertence.

[0046] Vírus adeno-associado é um parvovírus não patogênico composto de um genoma de DNA de fita simples de 4,7 kb dentro de um capsídeo icosaédrico não envelopado. O genoma contém três quadros de leitura abertos (ORF) flanqueados por repetições terminais invertidas (ITR) que funcionam como a origem viral e sinal de empacotamento. O ORF de rep codifica quatro proteínas não estruturais que desempenham funções na replicação viral, regulação transcricional, integração específica de local e montagem do vírion. O ORF de cap codifica três proteínas estruturais (VP 1-3) que se juntam para formar um capsídeo viral 60-mer. Finalmente, uma ORF presente como um quadro de leitura alternativo dentro do gene de cap produz a proteína de ativação de montagem (AAP), uma proteína viral que localiza as proteínas do capsídeo de AAV ao nucléolo e funciona no processo de montagem do capsídeo.

[0047] Existem vários sorotipos de ocorrência natural (“tipo selvagem”) e mais de 100 variantes de AAV conhecidas, cada um dos quais difere na sequência de aminoácidos, particularmente dentro das regiões hipervariáveis das proteínas de capsídeo e, assim, nas suas propriedades de liberação de genes. Nenhum AAV foi associado a qualquer doença humana, tornando o AAV recombinante atrativo para aplicações clínicas.

[0048] Para os fins da presente divulgação, a terminologia “AAV” é uma abreviação para vírus adeno-associado, incluindo, mas não se limitando a, o próprio vírus e derivados do mesmo. Salvo indicação em contrário, a terminologia se refere a todos os subtipos ou sorotipos e às formas recombinante e competente para replicação. O termo “AAV” inclui, mas não se limita a, AAV tipo 1 (AAV-1 ou AAV1), AAV tipo 2 (AAV-2 ou AAV2), AAV tipo 3A (AAV-3A ou AAV3A), AAV tipo 3B (AAV-3B ou AAV3B), AAV tipo 4 (AAV-4 ou AAV4), AAV tipo 5 (AAV-5 ou AAV5), AAV tipo 6 (AAV-6 ou AAV6), AAV tipo 7 (AAV-7 ou AAV7), tipo AAV 8 (AAV-8 ou AAV8), AAV tipo 9 (AAV-9 ou AAV9), AAV tipo 10 (AAV-10 ou AAV10 ou AAVrh10), AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV caprino, AAV equino, AAV primata, AAV não primata e AAV ovino. “AAV primata” se refere ao AAV que infecta primatas, “AAV não primata” se refere a AAV que infectam mamíferos não primatas, “AAV bovino” se refere a AAV que infectam mamíferos bovinos, etc.

[0049] As sequências genômicas de vários sorotipos de AAV, assim como as sequências das repetições terminais nativas (TRs), proteínas de Rep e subunidades do capsídeo são conhecidas na técnica. Essas sequências podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos, como o GenBank. Consulte, por exemplo, Números de Acesso do GenBank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729.1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) e AAO88208 (AAVrh10); estando as revelações das mesmas aqui incorporadas, a título de referência para o ensino de ácido nucleico de AAV e sequências de aminoácidos. Consulte também, por exemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel- Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73: 3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et. al. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33: 375-383; publicações de patentes internacionais WO00/28061, WO99/61601, WO98/11244; e patente U.S. n°6.156.303.

[0050] As sequências de proteínas de cap (capsídeo) existentes naturalmente associadas com sorotipos de AAV são conhecidas na técnica e incluem aquelas descritas pela presente invenção como AAV1 (SEQ ID NO:1), AAV2 (SEQ ID NO:2), AAV3A (SEQ ID NO:3), AAV3B (SEQ ID NO:4), AAV4 (SEQ ID NO:5), AAV5 (SEQ ID NO:6), AAV6 (SEQ ID NO:7), AAV7 (SEQ ID NO:8), AAV8 (SEQ ID NO:9), AAV9 (SEQ ID NO:10), AAV10 (SEQ ID NO:11) e AAVrh10 (SEQ ID NO:12). Os termos “proteína de capsídeo de AAV variante” ou “variante de AAV” se referem a uma proteína de capsídeo de AAV compreendendo uma sequência de aminoácidos que inclui pelo menos uma modificação ou substituição (incluindo deleção, inserção, mutação pontual, etc.) em relação a uma existência natural ou sequências de proteínas de capsídeo de AAV do tipo selvagem, por exemplo, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 12, da presente invenção. Uma proteína de capsídeo de AAV variante pode ter cerca de 80% de identidade ou mais da sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo do tipo selvagem, por exemplo, 85% de identidade ou mais, 90% de identidade ou mais ou 95% de identidade ou mais da sequência de aminoácidos da proteína de capsídeo do tipo selvagem, por exemplo, 98% ou 99% de identidade com a proteína de capsídeo do tipo selvagem. Uma proteína de capsídeo de AAV variante pode não ser uma proteína de capsídeo de tipo selvagem.

[0051] Para os fins da presente divulgação, “vírion de AAV” ou “partícula viral de AAV” se refere a uma partícula viral composta por pelo menos uma, proteína de capsídeo de AAV e um polinucleotídeo de AAV encapsulado.

[0052] Para os propósitos da presente divulgação, a terminologia “rAAV” é uma abreviação que se refere ao vírus adeno-associado recombinante. “Recombinante”, quando aplicado a um polinucleotídeo, significa que o polinucleotídeo é o produto de várias etapas de combinações de clonagem, restrição ou ligação, e outros procedimentos que resultam em uma construção que é distinta de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Um vírus recombinante é uma partícula viral compreendendo um polinucleotídeo recombinante. Os termos incluem respectivamente réplicas da construção de polinucleotídeo original e descendência da construção do vírus original.

[0053] O termo “vetor de rAAV” abrange vírions de rAAV (isto é, partículas virais de rAAV) (por exemplo, um vírion de rAAV infeccioso), que por definição incluem um polinucleotídeo de rAAV; e também abrange polinucleotídeos que codificam rAAV (por exemplo, um polinucleotídeo de cadeia simples que codifica rAAV (ss-rAAV), um polinucleotídeo de cadeia dupla que codifica rAAV (ds-rAAV), por exemplo, plasmídeos que codificam rAAV e similares).

[0054] Se um vírion de AAV compreende um polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo que não seja um genoma de AAV do tipo selvagem, por exemplo, um transgene a ser entregue a uma célula alvo, um agente RNAi ou agente de CRISPR para ser entregue a uma célula alvo, etc.), é tipicamente referido como um “vírion de AAV recombinante (rAAV)” ou uma “partícula viral de rAAV”. Em geral, o polinucleotídeo heterólogo é flanqueado por pelo menos uma, e em geral, por duas sequências repetidas terminais invertidas de AAV (ITRs).

[0055] O termo “empacotamento” se refere a uma série de eventos intracelulares que resultam na montagem e encapsidação de uma partícula de AAV. Os genes “rep” e “cap” de AAV se referem a sequências de polinucleotídeos que codificam proteínas de replicação e encapsidação de vírus adeno-associados. Os rep e cap de AAV são chamados como “genes de empacotamento” de AAV.

[0056] A terminologia “vírus auxiliar” para AAV se refere a um vírus que permite que o AAV (por exemplo, AAV de tipo selvagem) seja replicado e empacotado por uma célula de mamífero. Uma variedade desses vírus auxiliares para AAV são conhecidos na técnica, incluindo adenovírus, herpesvírus e poxvírus, tais como vaccinia. Os adenovírus abrangem vários subgrupos diferentes, embora o Adenovírus tipo 5 do subgrupo C seja mais comumente usado. Numerosos adenovírus de origem humana, não humana em mamíferos e aves são conhecidos e estão disponíveis em depositários como o ATCC. Os vírus da família do herpes incluem, por exemplo, vírus simplex de herpes (HSV) e vírus Epstein-Barr (EBV), bem como vírus citomegalovírus (CMV) e vírus da pseudo-raiva (PRV); que também estão disponíveis em depositários como o ATCC.

[0057] A terminologia “função(ões) do vírus auxiliar” se refere a função(ões) codificada(s) em um genoma do vírus auxiliar que permite a replicação e empacotamento do AAV (em conjunto com outros requisitos para replicação e empacotamento descritos pela presente invenção). Como descrito pela presente invenção, a “função do vírus auxiliar” pode ser fornecida de várias maneiras, incluindo fornecer vírus auxiliar ou fornecer, por exemplo, sequências de polinucleotídeo que codificam a(s) função(ões) necessária(s) a uma célula produtora em trans. Por exemplo, um plasmídeo ou outro vetor de expressão compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam uma ou mais proteínas adenovirais é transfectado para uma célula produtora juntamente com um vetor de rAAV.

[0058] A terminologia vírus “infeccioso” ou partícula viral é aquela que compreende um capsídeo viral montado competentemente e é capaz de aplicar um componente polinucleotídico em uma célula para a qual a espécie viral é trópica. O termo não implica necessariamente qualquer capacidade de replicação do vírus. Os ensaios para contagem de partículas virais infecciosas são descritos em outra parte desta divulgação e na técnica. A infecciosidade viral pode ser expressa como a razão entre partículas virais infecciosas e partículas virais totais. Os métodos para determinar a razão entre partículas virais infecciosas e partículas virais totais são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11: S337 (descrevendo um ensaio de titulação infecciosa de TCID50); e Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. Consulte também os exemplos.

[0059] O termo “tropismo”, como usado pela presente invenção, refere-se ao direcionamento preferencial por um vírus (por exemplo, um AAV) de células de uma espécie hospedeira particular ou de tipos de células particulares dentro de uma espécie hospedeira. Por exemplo, um vírus que pode infectar células do coração, pulmão, fígado e músculo tem um tropismo mais amplo (isto é, aumentado) em relação a um vírus que pode infectar apenas células pulmonares e musculares. O tropismo também pode incluir a dependência de um vírus em tipos particulares de moléculas de superfície celular do hospedeiro. Por exemplo, alguns vírus podem infectar apenas células com glicosaminoglicanas de superfície, enquanto outros vírus podem infectar apenas células com ácido siálico (tais dependências podem ser testadas usando várias linhagens celulares deficientes em determinadas classes de moléculas como potenciais células hospedeiras para infecção viral). Em alguns casos, o tropismo de um vírus descreve as preferências relativas do vírus. Por exemplo, um primeiro vírus pode infectar todos os tipos de células, mas tem muito mais sucesso em infectar essas células com glicosaminoglicanas superficiais. Um segundo vírus pode ser considerado como tendo um tropismo similar (ou idêntico) ao primeiro vírus se o segundo vírus também preferir as mesmas características (por exemplo, o segundo vírus também é mais bem sucedido em infectar essas células com glicosaminoglicanas superficiais), mesmo se a eficiências de transdução absoluta não forem similares. Por exemplo, o segundo vírus pode ser mais eficiente do que o primeiro vírus infectando cada tipo de célula testada, mas se as preferências relativas forem similares (ou idênticas), o segundo vírus ainda pode ser considerado como tendo um tropismo similar (ou idêntico). como o primeiro vírus. Em algumas modalidades, o tropismo de um vírion compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV variante em questão não é alterado em relação a um vírion de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o tropismo de um vírion compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV variante em questão é expandido (ou seja, mais amplo) em relação a um vírion de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o tropismo de um vírion compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV variante em questão reduzido em relação a um vírion de ocorrência natural.

[0060] A terminologia vírus “competente para replicação” (por exemplo, um AAV competente para replicação) se refere a um vírus do tipo selvagem fenotipicamente que é infeccioso e também é capaz de ser replicado em uma célula infectada (isto é, na presença de um vírus auxiliar ou vírus auxiliar funcionando). No caso do AAV, a competência de replicação em geral requer a presença de genes de empacotamento de AAV funcionais. Em geral, os vetores de rAAV, como descritos pela presente invenção, são incompetentes para replicação em células de mamífero (especialmente em células humanas) em virtude da falta de um ou mais genes de empacotamento de AAV. Tipicamente, tais vetores de rAAV carecem de quaisquer sequências de genes de empacotamento de AAV de modo a minimizar a possibilidade de que sejam gerados AAV competentes para replicação por recombinação entre genes de empacotamento de AAV e um vetor de rAAV de entrada. Em muitas modalidades, as preparações de vetor de rAAV como descritas pela presente invenção são aquelas que contêm poucos ou nenhum AAV competentes para replicação (rcAAV, também chamado de RCA) (por exemplo, menos de cerca de 1 rcAAV por 102 partículas de rAAV, menos de cerca de 1 rcAAV por 104 partículas de rAAV, menos de cerca de 1 rcAAV por 10 partículas de rAAV, menos de cerca de 1 rcAAV por 1012 partículas de rAAV, ou sem rcAAV).

[0061] O termo “polinucleotídeo” se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, e pode ser interrompido por componentes não nucleotídicos. Se presente, modificações na estrutura de nucleotídeos podem ser conferidas antes ou depois da montagem do polímero. O termo polinucleotídeo, tal como usado pela presente invenção, refere-se indistintamente a moléculas de cadeia dupla e de cadeia simples. Exceto onde especificado em contrário ou requerido, qualquer modalidade que compreende um polinucleotídeo engloba tanto a forma de cadeia dupla como cada uma das duas formas de cadeia simples complementares conhecidas ou previstas para formar a forma de cadeia dupla.

[0062] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma certa porcentagem de “identidade de sequência” para outro polinucleotídeo ou polipeptídeo, significando que, quando alinhados, essa porcentagem de bases ou aminoácidos é a mesma quando se comparam as duas sequências. A similaridade entre sequências pode ser determinada de várias maneiras diferentes. Para determinar a identidade da sequência, as sequências podem ser alinhadas usando os métodos e programas de computador, incluindo o BLAST, disponíveis na Internet em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Outro algoritmo de alinhamento é o FASTA, disponível no pacote Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, EUA, uma subsidiária integral da Oxford Molecular Group, Inc. Outras técnicas para o alinhamento estão descritas em Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. De particular interesse são programas de alinhamento que permitem lacunas na sequência. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite lacunas nos alinhamentos das sequências. Consulte Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Além disso, o programa GAP usando o método de alinhamento Needleman e Wunsch pode ser usado para alinhar sequências. Consulte J. Mol. Biol. 48: 443- 453 (1970).

[0063] O termo “gene” se refere a um polinucleotídeo que desempenha uma função de algum tipo na célula. Por exemplo, um gene pode conter um quadro de leitura aberto que é capaz de codificar um produto de gene. Um exemplo de um produto de gene é uma proteína, que é transcrita e traduzida do gene. Outro exemplo de um produto de gene é um RNA, por exemplo, um produto de RNA funcional, por exemplo, um aptâmero, um RNA interferente, um RNA ribossômico (rRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA não codificador (ncRNA), um RNA guia para nucleases, etc., que é transcrito, mas não transladado.

[0064] A terminologia “produto de expressão genético” ou “produto de gene” é uma molécula resultante da expressão de um gene particular, como definido acima. Os produtos de expressão genéticos incluem, por exemplo, um polipeptídeo, um aptâmero, um RNA interferente, um RNA mensageiro (mRNA), um rRNA, um tRNA, um RNA não codificante (ncRNA) e similares.

[0065] O termo “agente de siRNA” (“pequena interferência” ou “RNA de interferência curta” (ou siRNA)) é um duplex de RNA de nucleotídeos que é direcionado a um interesse genético (um “gene alvo”). Um “duplex de RNA” se refere à estrutura formada pelo emparelhamento complementar entre duas regiões de uma molécula de RNA, formando uma região de RNA de cadeia dupla (dsRNA). O siRNA é “dirigido” a um gene em que a sequência de nucleotídeos da parte dúplex do siRNA é complementar a uma sequência de nucleotídeos do gene alvo. Em algumas modalidades, o comprimento do duplex de siRNAs é menor que a 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o duplex pode ter 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o comprimento do duplex tem 19-25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o direcionamento do gene mediado por siRNA é realizado através do uso de interferência de RNA dirigida por DNA (ddRNAi) que é uma técnica de silenciamento genético que usa construções de DNA para ativar as vias de interferência de RNA endógeno (RNAi) de uma célula animal. Tais construções de DNA são desenhadas para expressar RNAN de fita dupla auto-complementares, tipicamente RNAs em forma de grampo curto (shRNA), que uma vez processados provocam o silenciamento de um gene ou genes alvo. Qualquer RNA, incluindo mRNAs ou RNAs virais endógenas, pode ser silenciado através do projeto de construções para expressar RNA de fita dupla ao alvo de mRNA desejado. Dessa forma, a parte do duplex de RNA de um agente de siRNA pode fazer parte de uma estrutura em forma de grampo curta referida como shRNA. Em adição a parte de dúplex, a estrutura em forma de grampo pode conter uma parte de alça colocada entre as duas sequências que formam o dúplex. A alça pode variar em comprimento. Em algumas modalidades, a alça é de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 11 ou 13 nucleotídeos de comprimento. A estrutura em forma de grampo também pode conter partes salientes de 3 'ou 5'. Em algumas modalidades, a saliência é uma 3’ ou um 5' saliência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de comprimento. Em geral, o nível do produto de expressão (por exemplo, mRNA, polipeptídeo, etc.) de um gene alvo é reduzido por um agente de siRNA (por exemplo, um siRNA, um shRNA, etc.) que contém sequências de nucleotídeos específicas de fita dupla que são complementares para pelo menos um segmento de 19-25 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, uma sequência de 20-21 nucleotídeos) do transcrito do gene alvo, incluindo a região 5 'não traduzida (UT), a ORF ou a região 3' UT. Em algumas modalidades, os RNAs de interferência curtos têm cerca de 19-25 nm de comprimento. Consulte, por exemplo, os pedidos PCT WOO/44895, W099/32619, WO01/75164, WO01/92513, WO01/29058, WO01/ 89304, WO02/16620, e WO02/29858; e publicações de patente U.S. n° 20040023390 para descrições de tecnologia de siRNA. O siRNA e/ou shRNA podem ser codificados por uma sequência de ácido nucleico, e a sequência de ácido nucleico também pode incluir um promotor. A sequência de ácido nucleico também pode incluir um sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação mínimo sintético.

[0066] A terminologia “RNA antisense” engloba RNA que é complementar a um produto de expressão genético. Por exemplo, um RNA antisense dirigido para um mRNA específico é um agente baseado em RNA (ou pode ser um RNA modificado) que é complementar ao mRNA, em que a hibridização do RNA antisense com o mRNA altera a expressão do mRNA (por exemplo, através da alteração da estabilidade do RNA, alterando a tradução do RNA, etc.). Também incluídos s em “RNA antisense” são os ácidos nucleicos que codificam um RNA antisense.

[0067] Com relação aos “agentes de CRISPR/Cas9”, o termo “CRISPR” engloba sistemas de repetições palindrômicas curtas e regularmente interespaçadas/CRISPR- associado (Cas) que evoluíram para fornecer bactérias e archaea com imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos usando RNAs de CRISPR (crRNAs) para guiar o silenciamento de ácidos nucléicos invasores. A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante da mesma, ou seja, proteína similar a Cas9) contém naturalmente atividade de endonuclease de DNA que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA de ocorrência natural ou sintéticas chamadas crRNA e tracrRNA (também chamadas de RNAs guia). Em alguns casos, as duas moléculas são covalentemente ligadas para formar uma única molécula (também chamada de RNA guia único (“sgRNA”)). Assim, a proteína Cas9 ou similar a Cas9 associa-se a um RNA de direcionamento de DNA (termo que abrange a configuração de RNA guia de duas moléculas e a configuração de RNA guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou similar a Cas9 e orienta a proteína a uma sequência de ácido nucleico alvo.

[0068] Se a proteína Cas9 ou similar a Cas9 mantiver sua função enzimática natural, clivará o DNA alvo para criar uma ruptura de fita dupla, o que pode levar à alteração do genoma (isto é, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição, etc.), alterando assim a expressão gênica. Algumas variantes do Cas9 (variantes que são abrangidas pelo termo similar a Cas9) foram alteradas de tal forma que elas têm uma atividade de clivagem do DNA diminuída (em alguns casos, elas clivam uma única fita em vez de ambas as fitas do DNA alvo, enquanto em outros casos, elas foram severamente reduzidas a nenhuma atividade de clivagem do DNA). As proteínas similares a Cas9 com atividade de clivagem de DNA diminuída (mesmo sem atividade de clivagem de DNA) podem ainda ser guiadas para um DNA alvo para bloquear a atividade da RNA polimerase. Alternativamente, a proteína Cas9 ou similar a Cas9 pode ser modificada fundindo um domínio de ativação da transcrição de VP64 à proteína Cas9 e codificando a proteína de fus com uma proteína de fusão com uma proteína auxiliar MS2-P65- HSF1 e um RNA guia único compreendendo aptâmeros de MS2 RNA na tetra-alça e alça de célula para formar um complexo Mediador de Ativação Sinérgica (Cas9-SAM) na célula que ativa a transcrição. Assim, proteínas similares a Cas9 inativas enzimaticamente podem ser dirigidas para um local específico em um DNA alvo por um RNA de direcionamento de DNA, de modo a bloquear ou ativar a transcrição do DNA alvo. O termo “agentes de CRISPR/Cas9”, tal como usado pela presente invenção, abrange todas as formas de CRISPR/Cas9, como descrito acima ou como é conhecido na técnica.

[0069] Informações detalhadas sobre os agentes CRISPR podem ser encontradas, por exemplo em (a) Jinek et. al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21: “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”; (b) Qi et al., Cell. 2013 Feb 28; 152(5): 1173-83: “Repurposing CRISPR as an RNA- guided platform for sequence- specific control of gene expression”, e (c) pedido de patente U.S. número 13/842.859 e número de pedido PCT PCT/US13/32589; todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Assim, o termo “agente de CRISPR”, tal como usado pela presente invenção engloba qualquer agente (ou ácido nucleico que codifica esse agente), compreendendo sequências que ocorrem naturalmente e/ou sintéticas, que podem ser utilizadas no sistema baseado em Cas9 (por exemplo, Cas9 ou similar a Cas9 e a uma proteína, qualquer componente de um RNA de direcionamento para DNA, por exemplo, um RNA similar a crRNA, RNA similar a tracrRNA, um RNA guia único, etc., um polinucleotídeo doador e similares).

[0070] Por “nucleases de dedo de zinco” (ZFNs) entende-se endonucleases de DNA artificial geradas por fusão de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. As ZFNs podem ser projetadas para alvejar as sequências de DNA desejadas e isso permite que as nucleases do dedo de zinco clivem sequências-alvo únicas. Quando introduzidos em uma célula, as ZFNs podem ser usadas para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla. Para mais informações sobre o uso de ZFNs, consulte, por exemplo: Asuri et al., Mol Ther. 2012 Feb;20(2):329- 38; Bibikova et al. Science. 2003 May 2;300 (5620):764; Wood et al. Science. 2011 Jul 15; 333(6040):307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 Aug;15(8):875-85; Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 Oct;40(10):759-65; Ekker et al., Zebrafish 2008 Summer;5(2): 121-3; Young et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 26;108(17):7052-7; Goldberg et al., Cell. 2010 Mar 5; 140(5):678-91; Geurts et al., Science. 2009 Jul 24;325 (5939):433; Flisikowska et al., PLoS One. 2011;6(6):e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 2011 Jun 13; Hauschild et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jul 19;108(29): 12013-7; and Yu et al., Cell Res. 2011 Nov;21(l 1): 1638-40; todos os quais estando aqui incorporados por referência para seus ensinamentos relacionados a ZFNs. O termo “agente de ZFN” engloba uma nuclease de dedo de zinco e/ou um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease de dedo de zinco.

[0071] A terminologia “nuclease efetora similar a ativador de transcrição” ou agentes de “TALEN” se refere a nucleases efetoras similares a ativadores de transcrição (TALENs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fusão de um domínio efetor de ligação de DNA TAL (similar a ativador de transcrição) a um domínio de clivagem de DNA. Os TALENS podem ser manipulados rapidamente para ligar praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quando introduzidos em uma célula, as TALENs podem ser usadas para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla. Para mais informações sobre o uso de TALENs, consulte, por exemplo: Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 2011 Jul 7;29 (8):731-4; Wood et al. Science. 2011 Jul 15;333 (6040):307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):695-6; and Huang et. al., Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):699-700; todos os quais estando aqui incorporados por referência para seus ensinamentos relacionados a TALENs. O termo “agente de TALEN” engloba um TALEN e/ou um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um TALEN.

[0072] A terminologia “elemento de controle” ou “sequência de controle” se refere a uma sequência de nucleotídeos envolvida em uma interação de moléculas que contribui para a regulação funcional de um polinucleotídeo, incluindo replicação, duplicação, transcrição, processamento, tradução ou degradação do polinucleotídeo. A regulação pode afetar a frequência, velocidade ou especificidade do processo e pode ser de natureza intensiva ou inibitória. Os elementos de controle conhecidos na técnica incluem, por exemplo, sequências reguladoras da transcrição, tais como promotores e intensificadores. Um promotor é uma região de DNA capaz de, sob certas condições, se ligar à polimerase de RNA e iniciar a transcrição de uma região de codificação normalmente localizada a jusante (na direção 3’) do promotor. Os promotores podem estar atuando de forma onipresente, isto é, ativos em muitos tipos de células, por exemplo, promotores de CAG ou de CMV; ou tecido ou célula específica, por exemplo, o promotor rho, que é ativo em hastes, ou o promotor de opsina, que é ativo em cones.

[0073] A terminologia “operacionalmente ligada” ou “operacionalmente ligada” se refere a uma justaposição de elementos genéticos, em que os elementos estão em uma relação que lhes permite operar da maneira esperada. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma região de codificação se o promotor ajudar a iniciar a transcrição da sequência de codificação. Pode haver resíduos intervenientes entre o promotor e a região de codificação, desde que esta relação funcional seja mantida.

[0074] A terminologia “vetor de expressão” abrange um vetor compreendendo uma região de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e é utilizado para efetuar a expressão da proteína em uma célula alvo pretendida. Um vetor de expressão também pode compreender elementos de controle operacionalmente ligados à região de codificação para facilitar a expressão da proteína no alvo. A combinação de elementos de controle e um gene ou genes aos quais eles estão operacionalmente ligados para expressão é por vezes referida como um “cassete de expressão”, um grande número dos quais são conhecidos e disponíveis na técnica ou podem ser prontamente construídos a partir de componentes que estão disponíveis na técnica.

[0075] O termo “heterólogo” significa derivado de uma entidade genotipicamente distinta daquela do resto da entidade à qual está sendo comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma espécie diferente é um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operacionalmente ligado a uma sequência de codificação com a qual não é naturalmente encontrado ligado é um promotor heterólogo. Assim, por exemplo, um rAAV que inclui uma sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica um produto de gene heterólogo é um rAAV que inclui um polinucleotídeo normalmente não incluído em um AAV de tipo selvagem de ocorrência natural e o produto de gene heterólogo codificado é um produto de gene normalmente não codificado por um AAV de tipo selvagem que ocorre naturalmente.

[0076] A terminologia “alteração genética” e “modificação genética” (e as variantes gramaticais das mesmas) são aqui utilizadas indistintamente para referir um processo em que um elemento genético (por exemplo, um polinucleotídeo) é introduzido em uma célula que não por mitose ou meiose. O elemento pode ser heterólogo para a célula, ou pode ser uma cópia adicional ou versão melhorada de um elemento já presente na célula. A alteração genética pode ser efetuada, por exemplo, por transfecção de uma célula com um plasmídeo recombinante ou outro polinucleotídeo através de qualquer processo conhecido na técnica, tal como eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio ou contato com um complexo polinucleotídeo-lipossoma. A alteração genética também pode ser efetuada, por exemplo, por transdução ou infecção com um vírus de DNA ou de RNA ou vetor viral. Geralmente, o elemento genético é introduzido em um cromossomo ou minicromossomo na célula; mas qualquer alteração que altere o fenótipo e/ou genótipo da célula e sua progênie está incluída neste termo.

[0077] No que diz respeito à modificação de células, a terminologia “geneticamente modificada” ou “transformada” ou “transfectada” ou “transduzida” por DNA exógeno (por exemplo, através de um vírus recombinante) refere-se a quando tal DNA foi introduzido no interior da célula. A presença do DNA exógeno resulta em mudança genética permanente ou transitória. O DNA transformador pode ou não ser integrado (ligado covalentemente) ao genoma da célula. Um “clone” é uma população de células derivadas de uma única célula ou ancestral comum por mitose. Uma “linhagem celular” é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro por muitas gerações.

[0078] Como usado pela presente invenção, uma célula é referida como “estavelmente” alterada, transduzida, geneticamente modificada ou transformada com uma sequência genética se a sequência estiver disponível para desempenhar a sua função durante a cultura prolongada da célula in vitro e/ou durante um período prolongado de tempo in vivo. Em geral, tal célula é “hereditariamente” alterada (geneticamente modificada) na medida em que é introduzida uma alteração genética que é também hereditária pela progênie da célula alterada.

[0079] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui usados indistintamente para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, formação de ligações dissulfetos, glicosilação, lipidação, fosforilação ou conjugação com um componente de marcado. Polipeptídeos tais como polipeptídeos antiangiogênicos, polipeptídeos neuroprotetores e similares, quando discutidos no contexto da aplicação de um produto de gene a um indivíduo mamífero, e composições para o mesmo, referem-se ao polipeptídeo intacto respectivo, ou a qualquer fragmento ou derivado geneticamente modificado deste, que retém a função bioquímica desejada da proteína intacta. Similarmente, referências a ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos antiangiogênicos, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos neuroprotetores, e outros tais ácidos nucleicos para uso na aplicação de um produto de gene a um indivíduo mamífero (que pode ser referido como “transgenes” para ser aplicado a uma célula receptora), incluem polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo intacto ou qualquer fragmento ou derivado geneticamente modificado que possua a função bioquímica desejada.

[0080] Como usado pela presente invenção, um plasmídeo, ácido nucleico, vetor, vírus, vírion, célula hospedeira, proteína ou outra substância “isolada” se refere a uma preparação da substância desprovida de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde a substância ou substância similar ocorre naturalmente ou é inicialmente preparada a partir de. Assim, por exemplo, uma substância isolada pode ser preparada usando uma técnica de purificação para enriquecê-la a partir de uma mistura fonte. O enriquecimento pode ser medido em uma base absoluta, como o peso por volume de solução, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura fonte. Enriquecimentos crescentes das modalidades desta divulgação estão cada vez mais isolados. Um plasmídeo, ácido nucleico, vetor, vírus, célula hospedeira ou outra substância isolada é, em algumas modalidades, purificado, por exemplo, de cerca de 80% a cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% pura, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, puro.

[0081] Como usado pela presente invenção, os termos “tratamento”, “tratar” e similares, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, como usado pela presente invenção, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) evitar que a doença (e/ou sintomas causados pela doença) ocorra em um indivíduo que possa estar predisposto à doença ou em risco de adquirir a doença, mas ainda não tenha sido diagnosticado como portador da doença; (b) inibir a doença (e/ou sintomas causados pela doença), ou seja, impedir seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença (e/ou sintomas causados pela doença), isto é, causar a regressão da doença (e/ou sintomas causados pela doença), isto é, melhorar a doença e/ou um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, as composições e métodos em questão podem ser dirigidos para o tratamento da doença da retina. Métodos não limitativos para avaliar as doenças da retina e seu tratamento incluem a medição da função da retina e suas alterações, por exemplo, alterações na acuidade visual (por exemplo, acuidade visual corrigida, deambulação, navegação, detecção de objetos e discriminação), mudanças no campo visual (por exemplo, perimetria estática e cinética do campo visual), exame clínico (exame com lâmpada de fenda dos segmentos anterior e posterior do olho), responsividade eletrofisiológica a todos os comprimentos de onda claras e escuras (por exemplo, todas as formas de eletrorretinografia (ERG) e padrão], todas as formas de potencial evocado visual (VEP), eletro-oculografia (EOG), visão de cores, adaptação ao escuro e/ou sensibilidade ao contraste, medindo alterações na anatomia ou saúde com o uso de medidas anatômicas e/ou fotográficas, por exemplo, Tomografia Óptica de Conferência), fotografia de fundo de olho, óptica adaptativa, oftalmoscopia de varredura a laser, fluorescência e/ou autofluorescência, medição da motilidade ocular e movimentos oculares (por exemplo, nys tagmus, preferência de fixação e estabilidade), medindo os resultados relatados (alterações relatadas pelo paciente em atividades e comportamentos visuais e não visualmente guiados, resultados relatados pelo paciente [PRO], avaliações baseadas em questionários de qualidade de vida, atividades diárias e medidas de função neurológica (por exemplo, ressonância magnética funcional (MRI)).

[0082] Os termos “indivíduo”, “hospedeiro”, “sujeito” e “paciente” são aqui usados de forma intercambiável, e se referem a um mamífero, incluindo, mas, sem limitação, humanos; primatas não humanos, incluindo símios; animais de esporte de mamíferos (por exemplo, cavalos); animais de fazenda mamíferos (por exemplo, ovelhas, cabras, etc.); animais de estimação (cães, gatos, etc.); e roedores (por exemplo, camundongos, ratos, etc.).

[0083] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano que foi anteriormente exposto naturalmente a AAV e, como resultado, abriga anticorpos anti-AAV (isto é, anticorpos neutralizantes de AAV). Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano que foi anteriormente administrado com um vetor AAV (e como resultado pode abrigar anticorpos anti-AAV) e precisa de readministração de vetor para tratamento de uma condição diferente ou para tratamento adicional da mesma condição. Com base em resultados positivos em ensaios clínicos envolvendo a aplicação do gene AAV para, por exemplo, fígado, músculo e retina - todos os tecidos afetados por anticorpos neutralizantes contra este veículo - existem muitas dessas aplicações terapêuticas/alvos de doença.

[0084] O termo “quantidade eficaz” como usado pela presente invenção é uma quantidade suficiente para efetuar resultados clínicos benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para fins desta divulgação, uma quantidade eficaz de um composto (por exemplo, um vírion de rAAV infeccioso) é uma quantidade que é suficiente para paliar, melhorar, estabilizar, reverter, prevenir, retardar ou atrasar a progressão (e/ou sintomas associados com) um estado de doença em particular (por exemplo, uma doença da retina). Consequentemente, uma quantidade eficaz de um vírion de rAAV infeccioso é uma quantidade do vírion de rAAV infeccioso que é capaz de distribuir eficazmente um ácido nucleico heterólogo a uma célula alvo (ou células alvo) do indivíduo. Quantidades eficazes podem ser determinadas pré-clinicamente, por exemplo, detectando na célula ou tecido o produto de gene (RNA, proteína) que é codificado pela sequência de ácido nucleico heteróloga utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica, por exemplo, RT-PCR, transferência de western, ELISA, fluorescência ou outras leituras de repórter e similares. Quantidades eficazes podem ser determinadas clinicamente, por exemplo, detectando uma alteração no início ou progressão da doença com o uso de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, autofluorescência de fundo de olho, angiografia de fluoresceína, OCT, microperimetria, óptica adaptativa, etc. como conhecido na técnica.

[0085] A terminologia “célula da retina” se refere a qualquer um dos tipos de células que compõem a retina, tais como, mas não se limitando a, células ganglionares da retina (RG), células amácrinas, células horizontais, células bipolares, fotorreceptoras, células gliais de Müller, células microgliais e epitélio pigmentar da retina (RPE). A terminologia “células fotorreceptoras” se refere na presente invenção a, mas não se limita a, células de haste ou “hastes” e células cônicas ou “cones”. A terminologia “células de Müller” ou “glia Müller” se refere às células da glia que suportam os neurônios na retina dos vertebrados.

[0086] A terminologia “evolução dirigida” se refere a uma metodologia de engenharia do capsídeo, in vitro e/ou in vivo, que emula a evolução natural através de ciclos iterativos de diversificação genética e processos de seleção, acumulando mutações benéficas que melhoram progressivamente a função de uma biomolécula. A evolução dirigida envolve frequentemente um método in vivo referido como “biopanning” para a seleção de variantes de AAV a partir de uma biblioteca, variantes essas que possuem um nível mais eficiente de infecciosidade de um tipo de célula ou tecido de interesse.

DESCRIÇÃO DET ALHADA

[0087] Os vírus adeno-associados (AAVs) são uma família de parvovírus com um genoma de DNA de fita única de 4.7 kb contido dentro de um capsídeo não envelopado. O genoma viral de um AAV de ocorrência natural tem 2 repetições terminais invertidas (ITR) - que funcionam como a origem de replicação viral e sinal de empacotamento - flanqueando 2 quadro de leitura aberto primários (ORF): rep (que codifica proteínas que funcionam na replicação viral, regulação transcricional, integração sítio específica e montagem do vírion) e cap. O ORF de cap codifica 3 proteínas estruturais que se juntam para formar um capsídeo viral de 60 mer. Muitas variantes e sorotipos de AAV de ocorrência natural foram isolados e nenhum foi associado a doença humana.

[0088] Versões recombinantes de AAV podem ser usadas como vetores de aplicação de genes, onde um marcador ou gene terapêutico de interesse é inserido entre as ITRs no lugar de rep e cap. Estes vetores mostraram que transduzem ambas células em divididas e não divididas in vitro e in vivo e podem resultar em expressão transgênica estável durante anos em tecido pós-mitótico. Consulte, por exemplo, Knipe DM, Howley PM. Fields’ Virology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2007; Gao G-P, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 11854-9; Atchison RW, Casto BC, Hammon WM. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science 1965; 149: 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A 1966; 55: 1467-74; Blacklow NR, Hoggan MD, Rowe WP. Isolation of adenovirus-associated viruses from man. Proc Natl Acad Sci U S A 1967; 58: 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology 1984; 134: 52-63; Mayor HD, Melnick JL. Small deoxyribonucleic acid-containing viruses (picodnavirus group). Nature 1966; 210: 331-2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from Cinomolgos monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology 2004; 330: 375-83; Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther 2004; 11: 805-10.

[0089] O AAV recombinante (referido aqui simplesmente como “AAV”) tem proporcionado resultados promissores em um número crescente de testes clínicos. No entanto, existem impedimentos à aplicação de genes que podem limitar a utilidade do AAV, tais como respostas imunes anti-capsídeos, baixa transdução de certos tecidos, uma incapacidade para aplicação dirigida para tipos específicos de células e uma capacidade de carga relativamente baixa. Em muitas situações, não há conhecimento mecanismos suficientes para capacitar efetivamente o projeto racional com a capacidade de melhorar o AAV. Como alternativa, a evolução dirigida surgiu como uma estratégia para criar novas variantes de AAV que atendam às necessidades biomédicas específicas. As estratégias de evolução dirigidas aproveitam os processos de diversificação e seleção genética para permitir o acúmulo de mutações benéficas que melhoram progressivamente a função de uma biomolécula. Neste processo, os genes de cap de AAV de tipo selvagem são diversificados para criar grandes bibliotecas genéticas que são empacotadas para gerar bibliotecas de partículas virais, e a pressão seletiva é aplicada para isolar variantes novas que podem superar as barreiras de aplicação de genes. É importante ressaltar que a base mecanicista subjacente a um problema de aplicação de genes não precisa ser conhecida pela evolução dirigida da função, o que pode, assim, acelerar o desenvolvimento de vetores aprimorados.

[0090] Tipicamente, as variantes reveladas pela presente invenção foram geradas através do uso de uma biblioteca e/ou bibliotecas de AAV. Uma tal biblioteca ou bibliotecas de AAV é/são gerada(s) por mutação do gene de cap, o gene que codifica as proteínas estruturais do capsídeo de AAV, através de uma faixa de técnicas de evolução dirigida conhecidas e disponíveis para o versado na técnica no campo de engenharia de genoma viral. Consulte, por exemplo, Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. 15th Annu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J. Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J. Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J. T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J. T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); and Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009). Tais técnicas, sem limitação, são as seguintes: i) propenso a erros de PCR para introduzir mutações pontuais aleatórias n o quadro de leitura aberto (ORF) de cap de AAV a uma taxa predeterminada, modificável; ii) Recombinação viral in vitro ou in vivo ou “mistura de DNA” para gerar quimeras aleatórias de genes de cap de AAV para produzir uma biblioteca de genes com múltiplos sorotipos de AAV; iii) inserções de peptídeos aleatórias em locais definidos do capsídeo por ligação de oligonucleotídeos degenerados no ORF de cap; iv) inserções definidas de sequências que codificam peptídeos em locais aleatórios do ORF de cap de AAV usando mutagênese de transpóson; v) substituição de alças de superfície de capsídeos de AAV por bibliotecas de sequências de peptídeos projetadas bioinformaticamente com base no nível de conservação de cada posição de aminoácido entre os sorotipos e variantes naturais de AAV para gerar bibliotecas “alça-troca”; vi) substituição aleatória de aminoácidos em posições de degeneração entre os sorotipos de AAV para gerar bibliotecas de variantes ancestrais (Santiago-Ortiz et al., 2015); e uma combinação de tais técnicas.

[0091] O embaralhamento de DNA gera quimeras que combinam suas propriedades parentais de maneiras únicas e muitas vezes benéficas; no entanto, alguns podem ser incapazes de empacotamento que, com efeito, reduz a diversidade da biblioteca. A concentração de diversidade da biblioteca é conseguida através de técnicas de inserção de peptídeos tais como, mas não se limitando a, iii-iv) acima. A diversidade da biblioteca também se concentra em técnicas tais como v) acima, e essa concentração é dirigida para regiões hipervariáveis múltiplas, que se encontram em alças expostas na superfície, do capsídeo de AAV. Embora muitas das técnicas gerem capsídeos de variantes com apenas uma pequena área do capsídeo mutado, essas técnicas podem ser combinadas com estratégias adicionais de mutagênese para modificar o capsídeo completo.

[0092] Uma vez que a biblioteca ou bibliotecas de AAV é/são gerada(s), os vírus são então empacotados, de tal modo que cada partícula de AAV é compreendida por um capsídeo mutante envolvendo um gene de cap que codifica aquele capsídeo e purificada. As variantes da biblioteca são então submetidas a técnicas de pressão seletiva in vitro e/ou in vivo conhecidas e prontamente disponíveis para o versado na técnica no campo de AAV. Consulte, por exemplo, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77- 87 (2006); and Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011). Por exemplo, mas não se limitando a, as variantes de AAV podem ser selecionadas utilizando i) colunas de afinidade em que a eluição de diferentes frações produz variantes com propriedades de ligação alteradas; ii) células primárias - isoladas de amostras de tecido ou linhagens celulares imortais que mimetizam o comportamento de células no corpo humano - que produzem variantes de AAV com eficácia aumentada e/ou especificidade tecidular; iii) modelos de animais - que mimetizam um ambiente clínico de terapia gênica - que produzem variantes de AAV que infectaram com sucesso o tecido alvo; iv) modelos de xenoenxerto humano que produzem variantes de AAV que infectaram células humanas enxertadas; e/ou uma combinação de técnicas de seleção dos mesmos.

[0093] Uma vez que os vírus são selecionados, estes podem ser recuperados por técnicas conhecidas, tais como, mas não se limitando a, replicação mediada por adenovírus, amplificação por PCR, sequenciamento e clonagem de nova geração e similares. Os clones de vírus são então enriquecidos através de ciclos repetidos das técnicas de seleção e o DNA de AAV é isolado para recuperar os genes de cap de variante selecionados de interesse. Tais variantes selecionadas podem ser submetidas a modificação ou mutação adicional e, como tal, servem como um novo ponto de partida para etapas de seleção adicionais para aumentar de forma iterativa a aptidão viral de AAV. No entanto, em certos casos, capsídeos bem sucedidos foram gerados sem mutação adicional.

[0094] As variantes de AAV reveladas pela presente invenção foram geradas pelo menos em parte através do uso da metodologia de evolução dirigida in vivo, tal como as técnicas descritas acima, envolvendo o uso de telas de retina de primatas após administração intravítrea. Dessa forma, os capsídeos variantes de AAV revelados pela presente invenção compreendem uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos que conferem transdução mais eficiente de células da retina de primatas do que uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente. Como usado pela presente invenção, uma “proteína de capsídeo de AAV parental correspondente” se refere a uma proteína de capsídeo de AAV do mesmo sorotipo de tipo selvagem ou variante de AAV como a proteína da capsídeo AAV variante em questão, mas que não compreende a uma ou mais modificações de sequência de aminoácidos da proteína de capsídeo de AAV variante em questão.

[0095] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV variante em questão compreende um peptídeo heterólogo de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos inseridos por ligação covalente em uma alça de GH da proteína de capsídeo de AAV ou alça IV, em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente. Por “alça de GH”, ou alça IV, da proteína de capsídeo de AAV se entende a parte acessível pelo solvente chamada na técnica como a alça de GH, ou alça IV, da proteína de capsídeo de AAV. Para a alça de GH/alça IV de capsídeo de AAV, consulte, por exemplo, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; and Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955. Assim, por exemplo, o local de inserção pode estar dentro dos aminoácidos 411-650 de uma proteína de capsídeo de VP1 de AAV. Por exemplo, o local de inserção pode estar dentro dos aminoácidos 571-612 de AAV1 de VP1, aminoácidos 570-611 de VP1 de AAV2, dentro dos aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3A, dentro dos aminoácidos 571- 612 de VP1 de AAV3B, dentro de aminoácidos 569-610 de VP1 de AAV4, nos aminoácidos 560-601 de VP1 de AAV5, nos aminoácidos 571 a 612 de VP1 de AAV6, nos aminoácidos 572 a 613 de VP1 de AAV7, nos aminoácidos 573 a 614 de VP1 de AAV8, dentro de aminoácidos 571 a 612 de VP1 de AAV9, ou dentro dos aminoácidos 573 a 614 de VP1 de AAV10, ou os aminoácidos correspondentes de qualquer uma das variantes dos mesmos. Os versados na técnica saberiam, com base em uma comparação das sequências de aminoácidos das proteínas de capsídeo de vários sorotipos de AAV, em que um local de inserção “correspondente aos aminoácidos de AAV2” estaria em uma proteína de capsídeo de qualquer sorotipo de AAV dado. Consulte também a Figura 6 para um alinhamento de SEQ ID NOS: 1-11 de AAV do tipo selvagem que fornece locais de aminoácidos entre e através dos sorotipos AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B e AAV4-10 do tipo selvagem (ocorrendo naturalmente).

[0096] Em certas modalidades, o local de inserção é um local de inserção único entre dois aminoácidos adjacentes localizados entre os aminoácidos 570-614 de VP1 de qualquer sorotipo de AAV de tipo selvagem ou variante de AAV, por exemplo, o local de inserção é entre dois aminoácidos adjacentes localizados em aminoácidos 570-610, aminoácidos 580-600, aminoácidos 570-575, aminoácidos 575-580, aminoácidos 580-585, aminoácidos 585-590, aminoácidos 590-600, ou aminoácidos 600-614 de VP1 de qualquer sorotipo ou variante de AAV. Por exemplo, o local de inserção pode ser entre os aminoácidos 580 e 581, aminoácidos 581 e 582, aminoácidos 583 e 584, aminoácidos 584 e 585, aminoácidos 585 e 586, aminoácidos 586 e 587, aminoácidos 587 e 588, aminoácidos 588 e 589, ou aminoácidos 589 e 590. O local de inserção pode ser entre os aminoácidos 575 e 576, os aminoácidos 576 e 577, os aminoácidos 577 e 578, os aminoácidos 578 e 579, ou os aminoácidos 579 e 580. O local de inserção pode ser entre os aminoácidos 590 e 591, aminoácidos 591 e 592, aminoácidos 592 e 593, aminoácidos 593 e 594, aminoácidos 594 e 595, aminoácidos 595 e 596, aminoácidos 596 e 597, aminoácidos 597 e 598, aminoácidos 598 e 599, ou aminoácidos 599 e 600. Por exemplo, o local de inserção pode estar entre os aminoácidos 587 e 588 de AAV2, entre os aminoácidos 590 e 591 de AAV1, entre os aminoácidos 588 e 589 de AAV3A, entre os aminoácidos 588 e 589 de AAV3B, entre os aminoácidos 584 e 585 de AAV4, entre os aminoácidos 575 e 576 de AAV5, entre os aminoácidos 590 e 591 de AAV6, entre os aminoácidos 589 e 590 de AAV7, entre os aminoácidos 590 e 591 de AAV8, entre os aminoácidos 588 e 589 de AAV9, ou entre aminoácidos 588 e 589 de AAV10.

[0097] Em algumas modalidades, uma inserção de peptídeo revelada pela presente invenção tem um comprimento de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoácidos, 17 aminoácidos, 18 aminoácidos, 19 aminoácidos ou 20 aminoácidos. Em outra modalidade, uma inserção de peptídeo revelada pela presente invenção compreende de 1 a 4 aminoácidos espaçadores no terminal de amina (terminal N) e/ou no terminal carboxila (terminal C) de qualquer uma das inserções de peptídeo reveladas pela presente invenção. Exemplos de aminoácidos espaçadores incluem, mas, sem limitação, leucina (L), alanina (A), glicina (G), serina (S), treonina (T) e prolina (P). Em certas modalidades, uma inserção de peptídeo compreende 2 aminoácidos espaçadores no terminal N e 2 aminoácidos espaçadores no terminal C. Em outras modalidades, uma inserção de peptídeo compreende 2 aminoácidos espaçadores no terminal N e 1 aminoácidos espaçadores no terminal C.

[0098] As inserções de peptídeos reveladas pela presente invenção não foram previamente descritas e/ou inseridas em um capsídeo de AAV. Sem o desejo de se vincular à teoria, a presença de qualquer uma das inserções de peptídeos reveladas pode atuar para diminuir a afinidade do capsídeo de variante pelo sulfato de heparina que provavelmente reduz a ligação à matriz extracelular na frente da retina do primata. Além disso, os motivos de inserção de peptídeos revelados pela presente invenção podem conferir transdução aumentada de células da retina de primatas através da adição de um domínio de ligação ao receptor da superfície celular.

[0099] Em algumas modalidades preferenciais, o peptídeo de inserção compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das fórmulas abaixo.

[00100] Em alguns aspectos, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 10 aminoácidos de comprimento, de Fórmula 1a: Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3 onde cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X 1 é selecionado dentre Gln, Asn, His, Ile e Ala X 2 é selecionado dentre Ala, Gln, Asp, Ser, Lys e Pro X 3 é selecionado dentre Asp, Ile, Thr e Asn X4 é selecionado dentre Thr, Ser, Tyr, Gln, Glu, Ala e X 5 é selecionado dentre Thr, Lys e Asn X6 é selecionado dentre Lys, Asn e Glu X7 é selecionado dentre Asn, Thr, lie, His, Asp e Ala.

[00101] Em certas modalidades, o peptídeo de inserção de Fórmula 1a compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21) e QANANEN (SEQ ID NO:22).

[00102] Em outros aspectos, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 10 aminoácidos em comprimento, de Fórmula 1b: Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3 onde cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X1 é selecionado dentre Gln, Asn, His e Ile X2 é selecionado dentre Ala, Gln, Asp e Ser X3 é selecionado dentre Asp e Ile X4 é selecionado dentre Thr, Tyr e Gln X5 é selecionado dentre Thr e Lys X6 é selecionado dentre Lys e Asn X7 é selecionado dentre Asn, Thr, Ile e His

[00103] Em certas modalidades, o peptídeo de inserção de Fórmula 1b compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), NQDYTKT (SEQ NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17) e HQDTTKN (SEQ ID NO:19).

[00104] Em outros aspectos, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 10 aminoácidos de comprimento, de Fórmula 1c. Y1Y2X1X2AspX3ThrLysX4Y3 onde cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X1 é selecionado dentre Gln, Asn, His e Ile X2 é selecionado dentre Ala, Gln e Ser X3 é selecionado dentre Thr, Tyr e Gln X4 é selecionado dentre Asn, Thr e His

[00105] Em certas modalidades, o peptídeo de inserção de Fórmula 1c compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), NQDYTKT (SEQ NO:16) e HQDTTKN (SEQ ID NO:19).

[00106] Em outros aspectos, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 10 aminoácidos de comprimento, de Fórmula 1d: Y1Y2X1X2AspX3ThrThrX4Y3 onde cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X1 é selecionado dentre Gln e Ile X2 é selecionado dentre Ala e Ser X3 é selecionado dentre Thr e Gln X4 é selecionado dentre Asn e His

[00107] Em certas modalidades, o peptídeo de inserção de Fórmula 1d compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre QADTTKN (SEQ ID NO:13) e ISDQTKH (SEQ ID NO:14).

[00108] Em outros aspectos, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 11 aminoácidos em comprimento, de Fórmula Ie. Y1Y2X1X2AsnX3AsnGluX4Y3 Onde cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X1 é selecionado dentre Gln e Ile X2 é selecionado dentre Ala e Ser X3 é selecionado dentre Glu e Ala X4 é selecionado dentre Asn e His

[00109] Em outras modalidades, um peptídeo de inserção de Fórmula 1e compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre ISNENEH (SEQ ID NO:21), e QANANEN (SEQ ID NO:22).

[00110] Em ainda outra modalidade, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 11 aminoácidos de comprimento, de Fórmula IIa: Y1Y2X1X2DX3TKX4Y3. em que cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X1 é selecionado dentre Q, N, A, H, e I; X2 é selecionado dentre Q, A, P, e S; X3 é selecionado dentre T, Y, S, e Q; e X4 é selecionado dentre T, N, A e H.

[00111] Em uma outra modalidade de uma inserção de peptídeo de uma sequência de aminoácidos da fórmula X1X2DX3TKX4, a inserção do peptídeo é selecionada dentre o grupo consistindo em QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA, NQDYTKT (SEQ NO:16), HQDTTKN (SEQ ID NO:19) e HPDTTKN (SEQ ID NO:18).

[00112] Em algumas dessas modalidades, um peptídeo de inserção pode ser um peptídeo de 7 a 11 aminoácidos de comprimento, de Fórmula IIb: Y1Y2X1X2DX3TKX4Y3

[00113] Em que cada um de Y1-Y3, se presente, é selecionado independentemente dentre Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro X1 é selecionado dentre N, A e H; X2 é selecionado dentre Q, P, e S; X3 é selecionado dentre T, Y, e S; e X4 é selecionado dentre T, N e A.

[00114] Em uma outra modalidade de uma inserção de peptídeo de uma sequência de aminoácidos da fórmula X1X2DX3TKX4, a inserção do peptídeo é selecionada dentre o grupo consistindo em ASDSTKA, NQDYTKT (SEQ NO:16), HQDTTKN (SEQ ID NO:19) e HPDTTKN (SEQ ID NO:18).

[00115] Em outras modalidades, o peptídeo de inserção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre KDRAPST (SEQ ID NO:26), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25) e GKSKVID (SEQ ID NO:23).

[00116] Em algumas modalidades, o peptídeo de inserção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre ASDSTKA (SEQ ID NO:15), QANANEN (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25) e KDRAPST (SEQ ID NO:26)

[00117] Em outras modalidades preferenciais, o peptídeo de inserção tem de 1 a 3 aminoácidos espaçadores (Y1-Y3) no terminal amino e/ou carboxila de uma sequência de aminoácidos selecionada dentre QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25) e KDRAPST (SEQ ID NO:26). Em certas de tais modalidades, o peptídeo de inserção é selecionado do grupo que consiste em: LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) e LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41).

[00118] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de variante de AAV em questão não inclui quaisquer outras modificações de sequência de aminoácidos diferentes de uma inserção de peptídeo de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos na alça de GH, ou na alça de IV. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de variante de AAV compreende uma inserção de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) e LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), e o capsídeo de variante de AAV não inclui quaisquer outras substituições, inserções ou deleções de aminoácidos (ou seja, a proteína de capsídeo de variante de AAV compreende a dita inserção e, por outro lado, é idêntica à proteína de capsídeo de AAV correspondente). Em outras palavras, a proteína de capsídeo de variante de AAV compreendendo a dita inserção é, de outro modo, idêntica à proteína de capsídeo de AAV parental na qual o peptídeo foi inserido. Como outro exemplo, a proteína de capsídeo de variante de AAV em questão compreende uma inserção de peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada de QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) e LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), em que a inserção de peptídeo está localizada entre os aminoácidos 587 e 588 de VP1 do capsídeo de AAV2 ou os aminoácidos correspondentes de um VP1 de outro AAV parental, por exemplo, entre os aminoácidos 588 e 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 ou AAV9, entre os aminoácidos 586 e 587 de VP1 de AAV4, entre os aminoácidos 577 e 578 de VP1 de AAV5, entre os aminoácidos 589 e 590 de VP1 de AAV7, entre os aminoácidos 590 a 591 de VP1 de AAV8 ou AAV10, etc., em que a sequência de proteína de capsídeo de AAV variante é, de outro modo, idêntica à sequência de proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, por exemplo, de SEQ ID NOs: 1-12.

[00119] Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de AAV variante em questão, além de compreender uma inserção de peptídeo, por exemplo, como aqui divulgado ou como conhecido na técnica, compreende cerca de 1 a cerca de 100 substituições ou deleções de aminoácidos, por exemplo, 1 a cerca de 5, de cerca de 2 a cerca de 4, de cerca de 2 a cerca de 5, de cerca de 5 a cerca de 10, de cerca de 10 a cerca de 15, de cerca de 15 a cerca de 20, de cerca de 20 a cerca de 25, de cerca de 25-50, de cerca de 50-100 substituições ou deleções de aminoácidos em comparação com a proteína do capsídeo de AAV parental. Assim, em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo de variante em questão compreende uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, ou 98% ou mais, por exemplo, ou 99% de identidade com o capsídeo de AAV parental correspondente, por exemplo, uma proteína de capsídeo de tipo selvagem, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1-12.

[00120] Em uma outra modalidade, a uma ou mais substituições de aminoácidos estão no(s) resíduo(s) de aminoácido(s) 1, 15, 34, 57, 66, 81, 101, 109, 144, 164, 176, 188, 196, 226, 236, 240, 250, 312, 363, 368, 449, 456, 463, 472, 484, 524, 535, 551, 593, 698, 708, 719, 721, e/ou 735 da proteína de capsídeo VP1 de AAV2 como numerados antes da inserção do peptídeo, ou do(s) resíduo(s) de aminoácido correspondente(s) de outra proteína de capsídeo de AAV. Em algumas dessas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas do grupo que consiste em M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, e L735Q da proteína de capsídeo VP1 de AAV2 como numeradas antes da inserção de peptídeo, ou do(s) resíduo(s) de aminoácido(s) correspondente(s) de outra proteína de capsídeo de AAV.

[00121] Em uma modalidade preferida, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de ISDQTKH (SEQ ID NO:14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29) e LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas do grupo que consiste em: M1L+L15P+P535S, P34A, P34A+S721L, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, Q164K+V708I, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, N312K, N312K+N449D+D472N+N551S+I698V+L735Q, P363L, R484C+V708I, T456K e V708I. De um modo preferido, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV.

[00122] Em uma modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) ou LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre os aminoácidos 587 e 588 de VP1 de AAV2 ou os aminoácidos correspondentes de outro capsídeo de AAV, e compreende ainda uma substituição de aminoácido P34A no resíduo 34 em relação a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou no resíduo correspondente de outro capsídeo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou no capsídeo de AAV parental correspondente. Em uma modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos 98% de identidade de sequência ou é 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKAAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAISDQTKHARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:42)

[00123] Em outra modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) ou LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre os aminoácidos 587 e 588 da proteína de capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV e compreende uma substituição de aminoácidos N312K em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV e opcionalmente compreende ainda as substituições de aminoácidos N449D, D472N, N551S, I698V e/ou L735Q em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 ou as substituições correspondentes em outro sorotipo de AAV parental. Em uma modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) ou LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre os aminoácidos 587 e 588 de AAV2 de AAV2 de capsídeo de AAV2 ou a posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo e compreende as substituições de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V e L735Q em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO:2) ou substituições nos resíduos correspondentes em outro sorotipo de AAV parental. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Em uma modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos 98% de identidade de sequência ou é 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLKFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSE YQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYF PSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTD TPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRNQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSE YSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEK TSVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAISDQTKHARQA ATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGL KHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSK RWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNQ (SEQ ID NO:43)

[00124] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo localizada entre os aminoácidos 588 e 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 ou AAV9, aminoácidos 586 e 587 de AAV4, aminoácidos 577 e 578. de AAV5, aminoácidos 589 e 590 de AAV7, ou aminoácidos 590 a 591 de AAV8 ou AAV10, a inserção de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de ISDQTKH (SEQ ID NO: 14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) e LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28), e b) uma substituição de valina por isoleucina no aminoácido 709 de AAV3A ou AAV3B, uma substituição de alanina por isoleucina na posição 709 de AAV1 ou AAV6, uma substituição de asparagina por isoleucina no aminoácido 707 de AAV4 ou aminoácido 709 de AAV9 ou uma substituição de treonina por isoleucina no aminoácido 710 de AAV7 ou aminoácido 711 de AAV8 ou AAV10 ou uma substituição de glutamina por isoleucina no aminoácido 697 de AAV5 e opcionalmente, por outro lado, idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 3-12. Em modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) ou LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 2 a 5 de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos.

[00125] Ainda em outra modalidade, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) ou LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido valina para isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[00126] Ainda em outra modalidade, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) ou LGISDQTKHA (SEQ ID NO: 29) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLGISDQTKHARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:44)

[00127] Em uma modalidade preferida, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de QADTTKN (SEQ ID NO: 13) e LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos, de preferência, selecionados de S109T, P250S, A524T, A593E, I698V, V708I, e/ou V719M. O sítio de inserção de peptídeo está, de preferência, localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. Em uma modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QADTTKN (SEQ ID NO: 13) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 ou a posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV e compreende uma substituição de aminoácido I698V em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV, em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente na posição correspondente. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos correspondente é uma substituição de aminoácido I699V em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV3A, AAV3B ou AAV9, uma substituição de I687V em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV5, uma substituição de I700V em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV7, uma substituição de I701V em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV8 ou AAV10. Em uma modalidade particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos 98% de identidade de sequência ou é 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAQADTTKNARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:45)

[00128] Em outras modalidades particularmente preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QADTTKN (SEQ ID NO: 13) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 ou a posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV e compreende uma substituição de aminoácido V719M e, opcionalmente, uma substituição de aminoácido V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV, em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente na posição correspondente.

[00129] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo localizada entre os aminoácidos 588 e 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 ou AAV9, aminoácidos 586 e 587 de AAV4, aminoácidos 577 e 578. de AAV5, aminoácidos 589 e 590 de AAV7, ou aminoácidos 590 a 591 de AAV8 ou AAV10, a inserção de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de QADTTKN (SEQ ID NO: 13) e LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), e b) uma substituição de valina por isoleucina no aminoácido 709 de AAV3A ou AAV3B, uma substituição de alanina por isoleucina na posição 709 de AAV1 ou AAV6, uma substituição de asparagina por isoleucina no aminoácido 707 de AAV4 ou aminoácido 709 de AAV9 ou uma substituição de treonina por isoleucina no aminoácido 710 de AAV7 ou aminoácido 711 de AAV8 ou AAV10 ou uma substituição de glutamina por isoleucina no aminoácido 697 de AAV5. Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo localizada entre os aminoácidos 588 e 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 ou AAV9, aminoácidos 586 e 587 de AAV4, aminoácidos 577 e 578 de AAV5, aminoácidos 589 e 590 de AAV7 ou aminoácidos 590 a 591 de AAV8 ou AAV10, a inserção de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de QADTTKN (SEQ ID NO: 13) e LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27), e b) uma substituição de aminoácidos serina por treonina na posição 109 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAV10 ou na posição 108 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV5 ou AAV6. Em modalidades preferidas, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QADTTKN (SEQ ID NO: 13) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 e compreende uma substituição de serina por treonina no aminoácido 109 (S109T) ou uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 (V708I) em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos e, de preferência, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou maior sequência de aminoácidos identidade a todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades preferidas, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QADTTKN (SEQ ID NO: 13) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou a posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV e compreende uma substituição de serina por treonina no aminoácido 109 e uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2.

[00130] Ainda em outra modalidade, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QADTTKN (SEQ ID NO: 13) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) pelo menos uma substituição de aminoácidos, em que a sequência de aminoácidos de capsídeo de variante não compreende uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2. e não compreende uma substituição de serina por treonina no aminoácido 109 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2.

[00131] Ainda em outra modalidade, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QADTTKN (SEQ ID NO: 13) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 27) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00132] Em outra modalidade preferida, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de HDITKNI (SEQ ID NO: 17), IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) e LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, R389S, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de S109T, R389S, A593E e/ou V708I. De um modo preferido, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. Em uma modalidade preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos HDITKNI (SEQ ID NO: 17) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) ou LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e compreende uma substituição de aminoácido S109T em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2.

[00133] Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos HDITKNI (SEQ ID NO: 17) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) ou LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAHDITKNIARQAAT ADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKH PPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRW NPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:46)

[00134] Em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAHDITKNIA entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) pelo menos uma substituição de aminoácido, em que a sequência de aminoácido de capsídeo de variante não compreende uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2. Ainda em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos DITKNIA (SEQ ID NO: 61) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de sequências de aminoácidos IAHDITKNIA (SEQ ID NO: 60) ou LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2. Em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAHDITKNIA (SEQ ID NO: 32) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) duas ou mais substituições de aminoácidos, em que a sequência de aminoácidos de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2.

[00135] Em uma outra modalidade preferida, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de NQDYTKT (SEQ ID NO:16) e LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de S109T, S109T+S463Y, D368H e V708I. De um modo preferido, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. Em uma modalidade preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e compreendem uma substituição de aminoácidos V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLANQDYTKTARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:47)

[00136] Em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido S109T em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 2 e, opcionalmente, uma substituição de aminoácido S463Y, em que o capsídeo de variante é pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% idêntica a todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em modalidades relacionadas, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido S109T em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00137] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo localizada entre os aminoácidos 588 e 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 ou AAV9, aminoácidos 586 e 587 de AAV4, aminoácidos 577 e 578 de AAV5, aminoácidos 589 e 590 de AAV7 ou aminoácidos 590 a 591 de AAV8 ou AAV10, a inserção de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) e LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31), e b) uma substituição de aminoácido asparagina por lisina na posição 313 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV1 ou AAV6, ou na posição 314 em comparação com a sequência de aminoácido AAV9, ou uma substituição de serina por lisina na posição 312 de AAV3A ou AAV3B ou na posição 315 de AAV8 ou AAV10, ou uma substituição de arginina por lisina na posição 303 de AAV4 ou AAV5, ou na posição 314 de AAV7. Em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NQDYTKT (SEQ ID NO: 16) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 31) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido N312K, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos.

[00138] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) e LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. Em uma modalidade preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e compreende uma substituição de aminoácido V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos PNSTHGS (SEQ ID NO: 25) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAPNSTHGSA (SEQ ID NO: 40) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAPNSTHGSARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ IDNO:48)

[00139] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de NKTTNKDA (SEQ ID NO: 62) e LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De um modo preferido, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. Em uma modalidade preferida, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NKTTNKDA (SEQ ID NO: 62) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e compreende uma substituição de aminoácido N449D em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos NKTTNKDA (SEQ ID NO: 62) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 35) entre aminoácidos 587 e 588 de capsídeo AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLANKTTNKDARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:49)

[00140] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de TNRTSPD (SEQ ID NO:24) e LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. Em uma modalidade relacionada, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo localizada entre os aminoácidos 588 e 589 de VP1 de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 ou AAV9, aminoácidos 586 e 587 de AAV4, aminoácidos 577 e 578. de AAV5, aminoácidos 589 e 590 de AAV7, ou aminoácidos 590 a 591 de AAV8 ou AAV10, a inserção de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de TNRTSPD (SEQ ID NO:24) e LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), e b) uma substituição de valina por isoleucina no aminoácido 709 de AAV3A ou AAV3B, uma substituição de alanina por isoleucina na posição 709 de AAV1 ou AAV6, uma substituição de asparagina por isoleucina no aminoácido 707 de AAV4 ou aminoácido 709 de AAV9 ou uma substituição de treonina por isoleucina no aminoácido 710 de AAV7 ou aminoácido 711 de AAV8 ou AAV10 ou uma substituição de glutamina por isoleucina no aminoácido 697 de AAV5. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos. Ainda em outra modalidade, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e b) uma substituição de aminoácido valina por isoleucina no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2.

[00141] Ainda em outra modalidade, a proteína de capsídeo de variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 39) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLATNRTSPDARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:50)

[00142] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de GKSKVID (SEQ ID NO: 23) e LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante compreende uma inserção de peptídeo localizada entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 compreendendo a sequência de aminoácidos GKSKVID (SEQ ID NO: 23) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAGKSKVIDA. (SEQ ID NO: 38) e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o capsídeo de AAV variante compreende a) uma inserção de peptídeo compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAGKSKVIDA (SEQ ID NO: 38) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e compreende pelo menos uma substituição de aminoácido.

[00143] Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAGKSKVIDARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:51)

[00144] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de ASDSTKA (SEQ ID NO:15) e LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ASDSTKA (SEQ ID NO: 15) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 30) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAASDSTKAARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:52)

[00145] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de KDRAPST (SEQ ID NO: 26) e LAKDRAPTSA (SEQ ID NO: 41), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos KDRAPST (SEQ ID NO: 26) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAKDRAPTSA (SEQ ID NO: 41) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAKDRAPSTARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:53)

[00146] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de HQDTTKN (SEQ ID NO: 19) e LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que os aminoácidos substituídos não ocorrem naturalmente em uma ou mais das posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos HQDTTKN (SEQ ID NO: 19) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAHQDTTKNA (SEQ ID NO: 34) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAHQDTTKNARQA ATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGL KHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSK RWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:54)

[00147] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de ISNENEH (SEQ ID NO:21) e LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que os aminoácidos substituídos não ocorrem naturalmente em uma ou mais das posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos ISNENEH (SEQ ID NO: 21) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LPISNENEHA (SEQ ID NO: 36) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLPISNENEHARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:55)

[00148] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção do peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de QANANEN (SEQ ID NO:22) e LPQANANENA (SEQ ID NO:37), e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o(s) aminoácido(s) substituído(s) não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos QANANEN (SEQ ID NO: 22) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LPQANANENA (SEQ ID NO: 37) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos: MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADA EFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEH SPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGL GTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRT WALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP SQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNT PSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEY SWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLPQANANENARQAA TADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:56)

[00149] Em outra modalidade, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo a) uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo, em que a inserção de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de HPDTTKN (SEQ ID NO: 18) e LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33) e b) uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a substituição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que os aminoácidos substituídos não ocorrem naturalmente nas posições correspondentes: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q e uma combinação dos mesmos. De preferência, o sítio de inserção de peptídeo está localizado entre os aminoácidos 587 e 588 do capsídeo de AAV2 ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV. O capsídeo de AAV variante pode ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ. ID NO: 2. Ainda em outra modalidade, o capsídeo de variante compreende uma inserção de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos HPDTTKN (SEQ ID NO: 18) ou compreendendo, consistindo essencialmente na, ou consistindo na sequência de aminoácidos LAHPDTTKNA (SEQ ID NO: 33) entre os aminoácidos 587 e 588 de capsídeo de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência ou 100% idêntica à seguinte sequência de aminoácidos:

[00150] MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHK DDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDN PYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKT APGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPL GQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWM GDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNR FHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLT STVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAV GRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLI DQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRV SKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQS GVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNL AHPDTTKNARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGH FHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSV EIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYL TRNL (SEQ ID NO:57).

[00151] Em vários aspectos, uma proteína de capsídeo de AAV variante é fornecida compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, em que a proteína de capsídeo de variante, quando presente em um vírion de AAV, confere uma infecciosidade aumentada de uma célula da retina em comparação com a infecciosidade de uma célula da retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente.

[00152] Em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácido P34A em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou uma substituição de aminoácido P33A em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo AAV5 (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, identidade da sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6 e compreende uma substituição de aminoácido P34A ou P33A em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 ou AAV5, respectivamente. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição de aminoácido P34A em comparação com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido P34A em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo de AAV2 apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00153] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 164 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o aminoácido substituído não ocorre naturalmente na posição correspondente. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácido em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 164 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o vírion de rAAV compreende uma substituição de aminoácido glutamina por lisina no aminoácido 164 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV1, AAV2 ou AAV6 ou no aminoácido 165 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV7, AAV8 ou AAV10; ou compreende uma substituição de serina por lisina no aminoácido 160 de AAV5 ou compreende uma substituição de alanina por lisina no aminoácido 164 de AAV9. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 164 (por exemplo, Q164K) em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2), em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo de AAV2 apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição de aminoácido Q164K em comparação com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende as substituições de aminoácidos Q164K e V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou as substituições correspondentes em outro sorotipo parental de AAV (isto é, diferente de AAV2) e é pelo menos 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos para todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2

[00154] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 698 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o aminoácido substituído não ocorre naturalmente na posição correspondente. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácido em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 698 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o vírion de rAAV compreende uma substituição de aminoácido isoleucina para valina no aminoácido 698 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 ou no aminoácido 699 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV3A, AAV3B ou AAV9, ou no aminoácido 687 de AAV5, ou no aminoácido 700 de AAV7, ou no aminoácido 701 de AAV8 ou AAV10. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 699 (por exemplo, I698V) em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2), em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo de AAV2 apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição de aminoácido I698V em comparação com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00155] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 109 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2). Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácido em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 109 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácidos de serina em treonina na posição 109 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAV10 ou na posição 108 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV5 ou AAV6. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido S109T em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos. Em outras modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido S109T e uma substituição de aminoácido A593E em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2. Em algumas modalidades a proteína de capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos S109T e A493V e, opcionalmente, de A593E e/ou V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou as substituições correspondentes em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2) e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende as substituições de aminoácidos S109T, A493V, A593E e V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou as substituições correspondentes em outro sorotipo parental de AAV (isto é, diferente de AAV2) e é pelo menos 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos para todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 Em outras modalidade preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos S109T e V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácidos em relação ao comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 ou é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00156] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 593 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2). Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácido em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 593 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido glicina por glutamato no aminoácido 594 em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV1, AAV3A, AAV6 ou AAV9, ou no aminoácido 583 de AAV5, ou no aminoácido 596 de AAV8 ou AAV10, ou uma substituição de aminoácido arginina por glutamato no aminoácido 594 de AAV3B, ou uma substituição de aminoácido aspartato por glutamato no aminoácido 592 de AAV4 ou uma substituição de aminoácido glutamina por glutamato na posição 595 de AAV7. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido A593E em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e não compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A e S196P. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende as substituições de aminoácidos A593E e N596D em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou menos, cerca de 99% de identidade com o comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2. Em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende as substituições de aminoácidos A593E e N596D em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos de AAV2. Em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende as substituições de aminoácidos A593E e V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade em relação ao comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2. Em outras modalidades, o capsídeo de variante compreende as substituições de aminoácidos A593E e V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos de AAV2.

[00157] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o aminoácido substituído não ocorre naturalmente na posição correspondente. De preferência, o vírion de rAAV não compreende uma substituição de prolina por serina no aminoácido 250 em comparação com AAV2 ou um aminoácido correspondente em outro sorotipo parental de AAV. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de valina por isoleucina (V708I) no aminoácido 708 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos com o comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a proteína de capsídeo de variante não compreende uma substituição de aminoácido P250S. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de valina por isoleucina no aminoácido 709 de AAV3A ou AAV3B, uma substituição de alanina por isoleucina na posição 709 de AAV1 ou AAV6, uma substituição de asparagina por isoleucina no aminoácido 707 de AAV4 ou aminoácido 709 de AAV9 ou uma substituição de treonina por isoleucina no aminoácido 710 de AAV7 ou aminoácido 711 de AAV8 ou AAV10 ou uma substituição de glutamina por isoleucina no aminoácido 697 de AAV5. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido V708I em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 2 a 5, de 5 a 10 ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos e em que a proteína de capsídeo de variante não compreende uma substituição de aminoácido P250S. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido V708I e compreende também uma substituição de aminoácido A593E e/ou S109T em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2. Em outras modalidades relacionadas, o capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos de V708I e A593E em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos de AAV2. Em outras modalidades relacionadas, o capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos de V708I e S109T em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2, em que a proteína de capsídeo de variante é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos de AAV2. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos V708I e V719M em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácidos em relação ao comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 ou é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos V708I e R733C em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácidos em relação ao comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 ou é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, a proteína de capsídeo de variante compreende substituições de aminoácidos V708I e G727D em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 e tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácidos em relação ao comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 ou é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00158] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 196 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o aminoácido substituído não ocorre naturalmente na posição correspondente e é opcionalmente diferente de prolina. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 196 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) e é opcionalmente diferente de uma substituição de S196P. Em modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido serina por tirosina no aminoácido 196 de AAV2 ou AAV9 ou no aminoácido 197 de AAV7, AAV8 ou AAV10 ou no aminoácido 186 de AAV5; ou uma substituição de alanina por tirosina no aminoácido 196 de AAV1 ou AAV6; ou uma substituição de metionina por tirosina no aminoácido 191 de AAV4; ou uma substituição de treonina por tirosina no aminoácido 196 de AAV3A ou AAV3B. Em uma modalidade relacionada, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição de aminoácido S196Y em comparação com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e é, de outro modo, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 196 diferente de uma substituição de S196P (por exemplo, compreende uma substituição de S196Y) em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2), em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo de AAV2 apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00159] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 175 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o aminoácido substituído não ocorre naturalmente na posição correspondente. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácido em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 175 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácido Q175H em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 como apresentada na SEQ ID NO: 2 ou uma substituição de glutamina por histidina na posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 175 (por exemplo, Q175H) em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2), em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, de 5 a 10 ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo de AAV2 apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00160] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 64 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV (ou seja, diferente de AAV2), em que o aminoácido substituído não ocorre naturalmente na posição correspondente. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade da sequência de aminoácido em todo o comprimento da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 2 e compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 64 em comparação com a sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o vírion de rAAV compreende uma substituição de aminoácido P64S em comparação com a sequência de aminoácidos de AAV2 como apresentada na SEQ ID NO: 2 ou uma substituição de prolina por serina na posição correspondente em outro sorotipo parental de AAV. Em modalidades relacionadas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma substituição de aminoácidos no aminoácido 64 (por exemplo, P64S) em comparação com a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV2 (SEQ ID NO: 2), em que a proteína de capsídeo de variante compreende de 1 a 5, 5 a 10, ou de 10 a 15 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína de capsídeo de AAV2 apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00161] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com uma sequência de capsídeo de AAV do tipo selvagem selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 e 12 e também compreende i) uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+ +A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K, e I698V e/ou (ii) uma inserção de peptídeo selecionada do grupo que consiste em QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), PQANANEN (SEQ ID NO:63), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), GKSKVID (SEQ ID NO:23), PISNENEH (SEQ ID NO:64), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), e LPISNENEHA (SEQ ID NO:36). Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos e/ou inserções de peptídeos especificadas e é, de outro modo, idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1-12.

[00162] Em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante é uma proteína de capsídeo ancestral. Por uma proteína de capsídeo ancestral entende-se um ancestral evolutivo de uma proteína de capsídeo que é encontrado na natureza hoje, por exemplo: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13, que é gerado in silico por substituição aleatória de aminoácidos em posições de degenerescência entre as proteínas de capsídeo de AAV que são encontradas na natureza hoje. Um exemplo não limitativo de um capsídeo ancestral é fornecido abaixo, em que as posições de degenerescência (resíduos 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) estão marcados como um “X”:

[00163] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQD DGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNP YLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTA PGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPL GEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWL GDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSXSXGXTNDNHYFGYSTPWGYFDFN RFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNL TSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAV GRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLI DQYLYYLXRTQSTGGTAGXXELLFSQXGPXXMSXQAKNWLPGPCYRQQR VSKTLXQNNNSNFAWTGATKYHLNGRXSLVNPGVAMATHKDDEXRFFPSS GVLIFGKXGAGXNNTXLXNVMXTXEEEIKTTNPVATEXYGVVAXNLQSSNT APXTGXVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGF GLKHPPPQILIKNTPVPANPPXXFXXAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKE NSKRWNPEIQYTSNYAKSXNVDFAVXXXGVYXEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:58)

[00164] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo ancestral compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos com o comprimento total da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo ancestral compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos a todo o comprimento da sequência de aminoácidos de AAV2, por exemplo, como apresentado na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo ancestral compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais, de identidade de sequência de aminoácidos com o comprimento total da sequência de aminoácidos da sequência ancestral divulgada na SEQ ID NO: 58 ou na SEQ ID NO: 2 e compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: Alanina (A) em 264, Alanina (A) em 266, Serina (S) em 268, Alanina (A) em 448, Treonina (T) em 459, Arginina (R) em 460, Alanina (A) em 467, Serina (S) em 470, Asparagina (N) em 471, Alanina (A) em 474, Serina (S) em 495, Asparagina (D) em 516, Asparagina (D) em 533, Glutamina (Q) em 547, Alanina (A) em 551, Alanina (A) em 555, Ácido glutâmico (E) em 557, Metionina (M) em 561, Serina (S) em 563, Glutamina (Q) em 577, Serina (S) em 583, Valina (V) em 593, Treonina (T) em 596, Alanina (A) em 661, Valina (V) em 662, Treonina (T) em 664, Prolina (P) em 665, Treonina (T) em 710, Ácido aspártico (D) em 717, Asparagina (N) em 718, Ácido glutâmico (E) em 719, e Serina (S) em 723. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de capsídeo de variante compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, em alguns casos 100% de identidade de sequência de aminoácidos com o comprimento total da sequência de aminoácidos seguinte e compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: Alanina (A) em 264, Alanina (A) em 266, Serina(s) em 268, Alanina (A) em 448, Treonina (T) em 459, Arginina (R) em 460, Alanina (A) em 467, Serina(s) a 470, asparagina (N) a 471, alanina (A) a 474, Serina(s) a 495, asparagina (D) a 516, asparagina (D) a 533, glutamina (Q) a 547, alanina (A) a 551, alanina (A) a 555, ácido glutâmico (E) a 557, metionina (M) a 561, serina(s) a 563, glutamina (Q) a 577, Serina(s) a 583, Valina (V) a 593, Treonina (T) a 596, Alanina (A) a 661, Valina (V) a 662, Treonina (T) a 664, Prolina (P) a 665, Treonina (T) a 710, Ácido Aspártico (D) a 717, asparagina (N) a 718, ácido glutâmico (E) a 719 e Serina(s) a 723:

[00165] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQK QDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGD NPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAK TAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQ PLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTW LGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDF NRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANN LTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQA VGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPL IDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQR VSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPS SGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSN TAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGF GLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKEN SKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:59).

[00166] Em outras modalidades, uma proteína de capsídeo de AAV variante compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica a uma sequência de capsídeo de AAV do tipo selvagem selecionada do grupo consistindo na variante ancestral divulgada aqui como SEQ ID NO: 58, compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: Alanina (A) em 264, Alanina (A) em 266, Serina (S) em 268, Alanina (A) em 448, Treonina (T) em 459, Arginina (R) em 460, Alanina (A) em 467, Serina (S) em 470, Asparagina (N) em 471, Alanina (A) em 474, Serina (S) em 495, Asparagina (D) em 516, Asparagina (D) em 533, Glutamina (Q) em 547, Alanina (A) em 551, Alanina (A) em 555, Ácido glutâmico (E) em 557, Metionina (M) em 561, Serina (S) em 563, Glutamina (Q) em 577, Serina (S) em 583, Valina (V) em 593, Treonina (T) em 596, Alanina (A) em 661, Valina (V) em 662, Treonina (T) em 664, Prolina (P) em 665, Treonina (T) em 710, Ácido aspártico (D) em 717, Asparagina (N) em 718, Ácido glutâmico (E) em 719, e Serina (S) em 723; e também compreende i) uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K, e I698V e/ou (ii) uma inserção de peptídeo selecionada do grupo que consiste em QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), PQANANEN (SEQ ID NO:63), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), GKSKVID (SEQ ID NO:23), PISNENEH (SEQ ID NO:64), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), e LPISNENEHA (SEQ ID NO:36). Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV variante compreende a uma ou mais substituições de aminoácidos e/ou inserções de peptídeos especificadas e é, de outro modo, idêntico à SEQ ID NO: 59.

[00167] As variantes de AAV aqui divulgadas foram geradas através do uso da evolução dirigida in vivo envolvendo o uso de rastreios de retina de primatas após administração intravítrea. Em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo de variante reveladas pela presente invenção, quando presentes em um vírion de AAV, conferem transdução aumentada de uma célula da retina em comparação com a transdução da célula da retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente ou AAV de tipo selvagem. Por exemplo, em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo de variante reveladas pela presente invenção, quando presentes em um vírion de AAV, conferem transdução mais eficiente de células da retina de primatas do que vírions de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente ou proteína de capsídeo de AAV de tipo selvagem, por exemplo, as células absorvem mais vírions de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV variante em questão do que os vírions de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental ou de AAV de tipo selvagem. Em algumas de tais modalidades, o vírion de AAV variante ou rAAV variante exibe pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, a pelo menos 50 vezes, ou mais de 50 vezes, transdução aumentada de uma célula da retina, em comparação com a transdução da célula da retina por um rAAV ou vírion de AAV de tipo selvagem compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente. Em certas de tais modalidades, as proteínas de capsídeo de variante reveladas pela presente invenção, quando presentes em um vírion de AAV, conferem transdução mais ampla das células da retina de primata do que vírions de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente ou a proteína de capsídeo de AAV de tipo selvagem. Em outras palavras, o vírion de AAV variante transduz tipos de células não transduzidos por vírions compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente e, consequentemente, mais tipos de células na retina do que o vírion de AAV parental correspondente. Em algumas modalidades, o vírion de AAV variante transduz, de preferência, uma célula da retina, por exemplo, um vírion de rAAV em questão infecta uma célula da retina com 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, ou mais de 50 vezes, do que outra célula da retina ou uma célula não retiniana, por exemplo, uma célula fora do olho. Em algumas modalidades, a célula da retina transduzida é uma célula fotorreceptora (por exemplo, bastonetes; cones). Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula ganglionar da retina (RGC). Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula epitelial da retina (célula RPE). Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula glial de Müller. Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula microglial. Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula amácrina. Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula bipolar. Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula horizontal. Um aumento na transdução de uma célula da retina, por exemplo, aumento da eficiência de transdução, transdução mais ampla, transdução mais preferencial, etc., pode ser prontamente avaliado in vitro ou in vivo por qualquer número de métodos na técnica para medir a expressão gênica. Por exemplo, o AAV pode ser empacotado com um genoma compreendendo um cassete de expressão compreendendo um gene repórter, por exemplo, uma proteína fluorescente, sob o controle de um promotor ubíquo ou específico de tecido, e a extensão da transdução avaliada detectando a proteína fluorescente, por exemplo, microscópio fluorescente. Como outro exemplo, o AAV pode ser empacotado com um genoma compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificada em barra, e a extensão da transdução avaliada por detecção da sequência de ácido nucleico, por exemplo, por PCR. Como outro exemplo, o AAV pode ser empacotado com um genoma compreendendo um cassete de expressão compreendendo um gene terapêutico para o tratamento de uma doença da retina, e a extensão da transdução avaliada por detecção do tratamento da doença da retina em um doente afligido que foi administrado a AAV.

[00168] As doenças oculares que podem ser tratadas com o uso de um vector ou vírion de rAAV variante e/ou método aqui divulgado incluem, mas, sem limitação, doenças monogênicas, doenças genéticas complexas, doenças adquiridas e lesões traumáticas. Exemplos de doenças monogênicas incluem, mas não estão limitadas a, síndrome de Bardet-Biedl; Doença de Batten; Distrofia Cristalina de Bietti; coroideremia; atrofia coriorretiniana; degeneração coriorretiniana; distrofias de cones ou cones-bastonetes (autossômicas dominantes, autossômicas recessivas e ligadas a X); cegueira noturna estacionária congênita (autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao cromossomo X); distúrbios da visão a cores, incluindo acromatopsia (incluindo ACHM2, ACHM3, ACHM4 e ACHM5), protanopia, deuteranopia e tritanopia; ataxia de Friedreich; amaurose congênita de Leber (autossômica dominante e autossômica recessiva), incluindo, mas não se limitando a, LCA1, LCA2, LCA3, LCA4, LCA6, LCA7, LCA8, LCA12 e LCA15; Neuropatia Óptica Hereditária de Leber; distrofia macular (autossômica dominante e autossômica recessiva), incluindo, mas sem limitação, degeneração macular aguda, melhor distrofia macular viteliforme, distrofia padrão, distrofia macular de Carolina do Norte, drusas herdadas, distrofia de fundo de Sorsby, malattia levantanesa e retinopatia geneticamente determinada de prematuridade; doença ocular do desenvolvimento da retina; albinismo ocular; atrofias ópticas (autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada a X); retinite pigmentosa (características autossômicas dominantes, autossômicas recessivas, ligadas a X e herdadas mitocondrialmente), exemplos dos quais incluem RP1, RP2, RP3, RP10, RP20, RP38, RP40 e RP43; retinosquise ligada a X; doença de Stargardt; e síndrome de Usher, incluindo, mas não se limitando a, USH1B, USH1C, USH1D, USH1F, USH1G, USH2A, USH2C, USH2D e USH3. Exemplos de doenças genéticas complexas incluem, mas, sem limitação, glaucoma (ângulo aberto, fecho de ângulo, baixa tensão, tensão normal, congenital, neovascular, pigmentar, pseudoexfoliação); formas relacionadas à idade e outras formas de degeneração macular, ambas as formas exsudativa e não exsudativa (autossômica dominante e autossômica recessiva), como degeneração macular aguda, degeneração macular viteliforme; retinopatia da prematuridade; e síndrome de Vogt Koyanagi-Harada (VKH). Exemplos de doenças adquiridas incluem, mas, sem limitação, neurorretinopatia macular aguda; neuropatia óptica isquêmica anterior e neuropatia óptica isquêmica posterior; doença de Behçet; oclusão da veia da retina do ramo; neovascularização coroidal; retinopatia diabética, incluindo retinopatia diabética proliferativa e complicações associadas; uveíte diabética; edema, tal como edema macular, edema macular cistoide e edema macular diabético; distúrbios da membrana epirretiniana; telangiectasia macular; coroidite multifocal; disfunção retiniana diabética não retinopatia; tumores oculares; atrofias ópticas; descolamento da retina; distúrbios da retina, tais como oclusão da veia da retina central, vitreorretinopatia proliferativa (RVP), doença arterial da retina e oclusiva venosa, oclusão vascular, doença da retina uveítica; efusão uveal; doença infecciosa e infiltrativa da retina; doenças do nervo óptico, como atrofia óptica adquirida. Exemplos de lesões traumáticas incluem, mas, sem limitação, histoplasmose; traumatismo do nervo óptico; trauma ocular que afeta um sítio ou localização ocular posterior; trauma da retina; infecção viral do olho; infecção viral do nervo óptico; uma condição ocular posterior causada por ou influenciada por um tratamento com laser ocular; condições oculares posteriores causadas por ou influenciadas por uma terapia fotodinâmica; fotocoagulação, retinopatia por radiação; e oftalmia simpática.

[00169] Em outra modalidade, um capsídeo de variante divulgado aqui compreende um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene, tal como, sem limitação, um RNA interferente, um RNA não codificante longo, um RNA não codificante curto, um RNA antisente, um aptâmero, um polipeptídeo, um anticorpo secretado, um anticorpo de cadeia única, um domínio de VHH, um receptor solúvel, um anticorpo, um knottin, um DARPin, uma centurina, um chaperona, uma nuclease sítio específica que fornece knock-down sítio específico da função do gene ou uma nuclease sítio específica modificada que fornece ativação específica do gene da transcrição.

[00170] Um vírion de rAAV variante aqui divulgado compreende um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene. Em algumas modalidades, o produto de gene é um RNA interferente. Em algumas modalidades, o produto de gene é um RNA não codificante longo. Em algumas modalidades, o produto de gene é um RNA não codificante curto. Em algumas modalidades, o produto de gene é um RNA antisense. Em algumas modalidades, o produto de gene é um aptâmero. Em algumas modalidades, o produto de gene é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o produto de gene é um anticorpo secretado. Em algumas modalidades, o produto de gene é um anticorpo de cadeia única. Em algumas modalidades, o produto de gene é um domínio de VHH. Em algumas modalidades, o produto de gene é um receptor solúvel. Em algumas modalidades, o produto de gene é um anficorpo. Em algumas modalidades, o produto de gene é um knottin. Em algumas modalidades, o produto de gene é um DARPin. Em algumas modalidades, o produto de gene é uma centurina. Em algumas modalidades, o produto de gene é uma chaperona. Em algumas modalidades, o produto de gene é uma nuclease sítio específica que fornece um knock-down sítio específico da função do gene.

[00171] O uso do produto de gene inclui, mas, sem limitação, melhora do nível de um fator em uma célula, melhora do nível de um fator em uma célula vizinha através da secreção de um fator, diminuição do nível de um fator em uma célula, ou diminuição do nível de um fator em uma célula vizinha através da secreção de um fator. O produto de gene pode ser projetado para suplementar o nível de um defeito no produto de gene ausente, diminuir o nível de um defeito no produto de gene ausente, introduzir um novo produto de gene de suporte, suplementar o nível de um produto de gene de suporte, diminuir o nível de um produto de gene com impedimento, ou ambos, diminuir o nível de um produto de gene com impedimento e introduzir ou suplementar o nível de um produto de gene de suporte.

[00172] Os produtos de gene fornecidos pelas variantes de AAV em questão podem ser utilizados para alterar o nível de produtos de gene ou atividade de produto de gene, diretamente ou indiretamente ligados a doenças e traumas da retina. Os genes cujos produtos de gene estão diretamente ou indiretamente ligados a doenças genéticas incluem, por exemplo, fator de ribosilação de ADP tipo 6 (ARL6); proteína de interação BBAsoma 1 (BBIP1); proteína BBSoma 1 (BBS1); proteína BBSoma 2 (BBS2); proteína BBSoma 4 (BBS4); proteína BBSoma 5 (BBS5); proteína BBSoma 7 (BBS7); proteína BBSoma 9 (BBS9); proteína BBSoma 10 (BBS10); proteína BBSoma 12 (BBS12); proteína centrossomal de 290 kDa (CEP290); proteína de transporte intraflagelar 172 (IFT172); proteína de transporte intraflagelar 27 (IFT27); inositol polifosfato-5-fosfatase E (INPP5E); membro 13 da subfamília J do canal de retificação interna de potássio (KCNJ13); fator de transcrição com fecho de leucina tipo 1 (LZTFL1); proteína da síndrome de McKusick-Kaufman (MKKS); proteína do tipo 1 da síndrome de Meckel (MKS1); proteína de nefronoftise 3 (NPHP1); antígeno de câncer de cólon definido sorologicamente 8 (SDCCAG8); proteína 32 contendo motivo tripartido (TRIM32); domínio de repetição tetratricopeptídeo 8 (TTC8); proteína da doença de Batten (CLN3); citocromo P450 4V2 (CYP4V2); Proteína de escolta de Rab 1 (CHM); Proteína 13 contendo domínio (reguladora positiva) PR (PRDM13); receptor acoplado a proteína G RPE-retinal (RGR); membro 1 da família do domínio TEA (TEAD1); proteína de receptor de interação com aril- hidrocarboneto do tipo 1 (AIPL1); fator de transcrição homeobox do fotorreceptor tipo-otx do cone-haste (CRX); proteína ativadora da guanilato ciclase 1A (GUCA1A); guanilato ciclase específica da retina (GUCY2D); membro 3 da família associada à membrana de transferência de fosfatidilinositol (PITPNM3); prominina 1 (PROM1); periferina (PRPH); periferina 2 (PRPH2); proteína 1 de exocitose sináptica da membrana de regulação (RIMS1); semaforina 4A (SEMA4A); homólogo humano da proteína C. elegans unc119 (UNC119); Transportador de cassete de ligação de ATP - da retina (ABCA4); Domínio de metalopeptidase ADAM 9 (ADAM9); fator de transcrição de ativação 6 (ATF6); estrutura 2 de leitura aberta do cromossoma 21 (C21orf2); estrutura 37 de leitura aberta do cromossoma 8 (C8orf37); canal de cálcio; dependente de voltagem; subunidade alfa 2/delta 4 (CACNA2D4); membro da família 1 relacionado com caderina (protocaderina 21) (CDHR1); proteína do tipo ceramida cinase (CERKL); subunidade alfa do canal de cátions ligado a cone cGMP fotorreceptor (CNGA3); subunidade beta 3 do canal de cátions ligado por nucleótidos cíclicos de cone (CNGB3); ciclina M4 (CNNM4); proteína de ligação a nucleotídeo guanina (proteína G); polipeptídeo de atividade de transdução alfa 2 (GNAT2); membro V da subfamília de canal de potássio 2 (KCNV2); fosfodiesterase 6C (PDE6C); fosfodiesterase 6H (PDE6H); proteína B centriolar de proteoma de centriolo 1 (POC1B); Membro RAB28 da família de oncogene RAS (RAB28); fator de transcrição homeobox 2 da dobra neural anterior e retina (RAX2); 11-cis retinol desidrogenase 5 (RDH5); proteína 1 de interação com regulador de RP GTPase (RPGRIP1); membro 5 da família semelhante a tubulina tirosina- ligase (TTLL5); subunidade alfa-1 de canal de cálcio dependente de voltagem tipo L (CACNA1F); regulador de GTPase de retinite pigmentosa (RPGR); subunidade alfa de transducina de bastontes (GNAT1); subunidade beta da fosfodiesterase de bastonetes cGMP (PDE6B); rodopsina (RHO); proteína 4 de ligação de cálcio (CABP4); receptor acoplado a proteína G 179 (GPR179); rodopsina cinase (GRK1); receptor de glutamato metabotrópico 6 (GRM6); proteína 3 dos domínios de transmembrana semelhantes a imunoglobulina de repetição rico em leucina (LRIT3); arrestina (antígeno-s) (SAG); 24° família de portadores de soluto (SLC24A1); canal de cálcio de potencial de receptor transiente, subfamília M, membro 1 (TRPM1); nictalopin (NYX); opsina do cone verde (OPN1LW); opsina do cone vermelho (OPN1MW); opsina do cone azul (OPN1SW); frataxina (FXN); inosina monofosfato desidrogenase 1 (IMPDH1); proteína homeobox 2 de ortodentula (OTX2); homólogo 1 de crumbs (CRB1); proteína 1 contendo domínio de morte (DTHD1); fator 6 de diferenciação de crescimento (GDF6); proteína homóloga de Chlamydomonas de transporte intraflagelar 140 (IFT140); proteína B1 contendo motivo de QI (IQCB1); lebercilina (LCA5); lecitina retinol aciltransferase (LRAT); nucleotídeo de nicotinamida adenililtransferase 1 (NMNAT1); proteína RD3 (RD3); retinol desidrogenase 12 (RDH12); proteína de 65 kD específica do epitélio pigmentar da retina (RPE65); proteína associada à espermatogênese 7 (SPATA7); proteína tipo tubby (TULP1); genes mitocôndricos (KSS, LHON, MT-ATP6, MT-TH, MT-LT1, MT-TP, MT-TS2, desidrogenases NADH [MT-ND] codificadas mitocondrialmente); bestrofina 1 (BEST1); colageno de proteína 5 relacionado com necrose tumoral e C1q (C1QTNF5); proteína 1 da matriz extracelular tipo fibrilina contendo EGF (EFEMP1); alongamento da proteína de ácidos graxos muito longos (ELOVL4); homólogo 2 de fascina da retina, proteína de agregação de actina (FSCN2); proteína 1B ativadora da guanilato ciclase (GUCA1B); hemicentina 1 (HMCN1); proteoglicano 1 da matriz interfotorreceptora (IMPG1); proteína 1 semelhante a retinite pigmentosa 1 (RP1L1); inibidor tecidular de metaloproteinases-3 (TIMP3); fator de complemento H (CFH); fator de complemento D (CFD); complemento do componente 2 (C2); complemento do componente 3 (C3); fator de complemento B (CFB); modulador de autofagia regulada por dano ao DNA 2 (DRAM2); proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (VCAN); mitofusina 2 (MFN2); membro 1 do grupo F da subfamília do receptor nuclear (NR2F1); atrofia óptica 1 (OPA1); proteína transmembrana 126A (TMEM126A); homólogo A da translocase 8 da membrana mitocondrial interna (TIMM8A); anidrase carbônica IV (CA4); hexocinase 1 (HK1); proteína 7 tipo kelch (KLHL7); grupo E3 da subfamília 2 de receptores nucleares (NR2E3); zipper leucina da retina neural (NRL); membro 3 da subfamília W da família 2 de receptores olfativos (OR2W3); fator 3 de processamento pré-mRNA (PRPF3); fator 4 de processamento de pré- mRNA (PRPF4); fator 6 de processamento pré-mRNA (PRPF6); fator 8 de processamento pré-mRNA (PRPF8); fator 31 de processamento de pré- mRNA (PRPF31); proteína de membrana do segmento externo da retina 1 (ROM1); proteína 1 da retinite pigmentosa (RP1); proteína 1 associada a PIM1-cinase (RP9); pequena ribonucleoproteína nuclear de 200kDa (SNRNP200); fosfoproteína 2 secretada (SPP2); proteína rica em arginina/serina de topoisomerase I (TOPORS); proteína de ligação 2 do tipo fator de ribosilação de ADP- (ARL2BP); estrutura 71 de leitura aberta do cromossoma 2 (C2orf71); clarina-1 (CLRN1); subunidade alfa do canal controlado por cGMP de bastonete (CNGA1); subunidade beta do canal controlado por cGMP de bastonete (CNGB1); citocromo P450 4V2 (CYP4V2); sintetase de difosfato de desidrodolichil (DHDDS); polipeptídeo box DEAH 38 (DHX38); subunidade 1 do complexo de proteína de membrana de ER (EMC1); homólogo de spacemaker/olhos fechados (EYS); família com similaridade de sequências 161 do membro A (FAM161A); receptor 125 acoplado a proteína G (GPR125); N- acetiltransferase de heparano-alfa-glucosaminida (HGSNAT); isocitrato desidrogenase 3 beta específica de NAD(+) (IDH3B); proteoglicano 2 da matriz interfotorreceptora (IMPG2); proteína KIAA1549 (KIAA1549); proteína centrossomal kizuna (KIZ); cinase associada a células germinais masculinas (MAK); receptor de tirosina cinase do proto-oncogene c-mero (MERTK); mevalonato cinase (MVK); NIMA (nunca na mitose do gene A) relacionada com cinase 2 (NEK2); proteína de diferenciação neuronal 1 (NEUROD1); subunidade alfa de fosfodiesterase cGMP (PDE6A); bastonetes gama específicos de cGMP de fosfodiesterase 6G (PDE6G); proteína progressiva de degeneração em bastonetes (PRCD); proteína de ligação ao retinol 3 (RBP3); proteína de ligação ao retinaldeído 1 (RLBP1); membro 14 da família 7 de portadores de soluto (SLC7A14); usherina (USH2A); proteína do dedo de zinco 408 (ZNF408); proteína do dedo de zinco 513 (ZNF513); proteína 1 da síndrome oral-facial-digital (OFD1); retinite pigmentosa 2 (RP2); retinosquisina (RS1); proteína 12 contendo domínio da ab-hidrolase (ABHD12); gene 23 semelhante a caderina (CDH23); proteína centrossomal de 250 kDa (CEP250); membro 2 da família de ligação de cálcio e integrina (CIB2); whirlina (DFNB31); homólogo de suscetibilidade a desmaio audiogênico monogênico (GPR98); histidil-tRNA sintetase (HARS); miosina VIIA (MYO7A); protocaderina 15 (PCDH15); harmonina (USH1C); homólogo humano de proteína de suporte de camundongo contendo repetições de anquirina e domínio SAM (USH1G); distrofina (DMD); norrina (NDP); fosfoglicerato cinase (PGK1); calpaína 5 (CAPN5); homólogo de receptor frizzled-4 Wnt (FZD4); proteína da membrana integral 2B (ITM2B); proteína 5 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP5); micro RNA 204 (MIR204); proteína de retinoblastoma 1 (RB1); tetrassopina 12 (TSPAN12); estrutura 65 de leitura aberta do cromossoma 12 (C12orf65); caderina 3 (CDH3); proteína relacionada a frizzled do tipo membrana (MFRP); ornitina aminotransferase (OAT); grupo V da fosfolipase A2 (PLA2G5); proteína 4 de ligação ao retinol (RBP4); regulador da sinalização da proteína G 9 (RGS9); regulador da proteína de ligação 9 de sinalização da proteína G (RGS9BP); ARMS2; proteína do grupo 6 de complementação de deficiência de reparo de roedor com complementação cruzada de reparo de excisão (ERCC6); fibulina 5 (FBLN5); serina peptidase 1 de HtrA (HTRA1); receptor toll tipo 3 (TLR3); e receptor toll tipo 4 (TLR4).

[00173] Os genes cujos produtos de gene induzem ou promovem a apoptose são aqui chamados de “genes pró-apoptóticos” e os produtos desses genes (mRNA; proteína) são chamados de “produtos de gene pró- apoptóticos”. Os alvos pró-apoptóticos incluem por exemplo, produtos de gene Bax; Oferta de produtos de gene Bid; Produtos de gene Bak; Produtos de gene Bad; Bcl-2; Bcl-X1. Produtos de gene anti-apoptóticos incluem inibidor de apoptose ligado a X.

[00174] Os genes cujos produtos de gene induzem ou promovem a angiogênese são aqui chamados de “genes pró-angiogênicos” e os produtos desses genes (mRNA; proteína) são chamados de “produtos de gene pró-angiogênicos”. Os alvos pró-angiogênicos incluem, por exemplo, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); receptor do fator de crescimento endotelial vascular 1 (VEGFR1); receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2); Tirosina-cinase 1 relacionada com Fms (Fltl); fator de crescimento da placenta (PGF); Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); angiopoietinas; ouriço sônico. Os genes cujos produtos de gene inibem a angiogese são aqui chamados de “genes antiangiogênicos” e os produtos desses genes (mRNA; proteína) são chamados de “produtos de gene antiangiogênicos”. Os produtos de gene antiangiogênicos incluem endostatina; tumstatina; angiostatina; fator derivado do epitélio de pigmento (PEDF) e proteínas de fusão ou anticorpos que são específicos para pró-angiogênicos alvos e/ou seus receptores, por exemplo, as proteínas de fusão anti-VEGF sFLT1 ou Eylea, os anticorpos específicos de VEGF LucentisTM e AvastinTM, etc.

[00175] Os genes cujos produtos de gene funcionam como imunomoduladores, por exemplo, fatores do complemento, receptores tipo toll, são chamados de “genes imunomoduladores”. Os genes imunomoduladores exemplificadores incluem citocinas, quimiocinas e as proteínas de fusão ou anticorpos que são específicos para os mesmos e/ou os seus receptores, por exemplo, a proteína de fusão anti-IL-6 RilonaceptTM, o anticorpo específico de H do Fator do Complemento lampamizumab, etc. Os genes cujos produtos de gene funcionam como fatores neuroprotetores, por exemplo, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR); fator neurotrófico derivado de glial (GDNF); fator de viabilidade do cone derivado de bastonete (RdCVF); fator de crescimento de fibroblastos (FGF); neurturina (NTN); fator neurotrófico ciliar (CNTF); fator de crescimento nervoso (NGF); neurotrofina-4 (NT4); fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); fator de crescimento epidérmico. Os genes cujos produtos de gene funcionam como opsinas responsivas à luz, por exemplo, opsina; rodopsina; rodopsina de canal; rodopsina halo.

[00176] Em alguns casos, um produto de gene de interesse é uma endonuclease sítio específica que prevê o knock-down sítio específico da função do gene, por exemplo, onde a endonuclease faz nocaute em um alelo associado a uma doença da retina. Por exemplo, quando um alelo dominante codifica uma cópia defeituosa de um gene que, quando do tipo selvagem, é uma proteína estrutural da retina e/ou fornece função da retina normal, uma endonuclease sítio específica pode ser alvo para o alelo defeituoso e fazer nocaute no alelo defeituoso.

[00177] Além para nocautear um alelo defeituoso, uma nuclease sítio específica também pode ser usada para estimular a recombinação homóloga com um DNA doador que codifica uma cópia funcional da proteína codificada pelo alelo defeituoso. Assim, por exemplo, um vírion de rAAV em questão pode ser usado para administrar tanto uma endonuclease sítio específica que nocauteia um alelo defeituoso, como pode ser usado para fornecer uma cópia funcional do alelo defeituoso, resultando no reparo do alelo defeituoso, assim, fornecendo a produção de uma proteína da retina funcional (por exemplo, retinosquisina funcional, RPE65 funcional, periferina funcional, etc.). Ver, por exemplo, Li et al. (2011) Nature 475:217. Em algumas modalidades, um vírion de rAAV aqui divulgado compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma endonuclease sítio específica; e uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma cópia funcional de um alelo defeituoso, em que a cópia funcional codifica uma proteína da retina funcional. As proteínas da retina funcionais incluem, por exemplo, retinosquisina, RPE65, proteína 1 de interação com o regulador de GTPase da retinite pigmentosa (RGPR), periferina, periferia-2 e semelhantes.

[00178] As endonucleases sítio específicas que são adequadas para uso incluem, por exemplo, meganucleases; nucleases de dedos de zinco (ZFNs); nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENs); e repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente /associadas a CRISPR (Cas), onde tais endonucleases sítio específicas são de ocorrência não natural e são modificadas para atingir um gene específico. Tais nucleases específicas do local podem ser manipuladas para terem como alvo locais específicos dentro de um genoma, e a junção de extremidade não homóloga pode, depois, reparar a quebra ao inserir ou deletar vários nucleotídeos. Tais endonucleases sítio específicas (também chamadas de “INDELs”) então jogam a proteína fora da estrutura e efetivamente nocauteiam o gene. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. n°. 2011/0301073.

[00179] Em algumas modalidades do vetor de rAAV variante divulgado aqui, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse está operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Os promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor de citomegalovus (CMV) (Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55(2): 431-441), o intensificador precoce de CMV/promotor de β-actina de galinha (CBA)/intron de β-globina de coelho (CAG) (Miyazaki et al. (1989) Gene 79(2): 269-277, CBSB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13(6): 1074-1084), promotor do fator 1α de alongamento humano (EF1α) (Kim et al. (1990) Gene 91(2): 217-223), promotor de fosfoglicerato cinase humana (PGK) (Singer-Sam et al. (1984) Gene 32(3): 409-417, promotor de cadeia pesada mitocondrial (Loderio et al. (2012) PNAS 109(17): 6513- 6518), promotor de ubiquitina (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261: 101- 105). Em outras modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse é operacionalmente ligada a um promotor indutivel. Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse é operacionalmente ligada a um elemento regulador específico para o tipo de tecido ou específico para o tipo celular. Por exemplo, em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse é operacionalmente ligada a um elemento regulador específico de fotorreceptores (por exemplo, um promotor específico de fotorreceptores), por exemplo, um elemento regulador que confere expressão seletiva do gene operacionalmente ligado em uma célula fotorreceptora. Os elementos reguladores específicos de fotorreceptores adequados incluem, por exemplo, um promotor de rodopsina; um promotor de rodopsina cinase (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); um promotor do gene da beta fosfodiesterase (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med.9:1015); um promotor do gene da retinite pigmentosa (Nicoud et al. (2007) supra); um intensificador do gene da proteína de ligação a interfotorreceptor de retinoide (IRBP) (Nicoud et al. (2007) supra); um promotor do gene IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp. Eye Res. 55: 225), um promotor do gene da opsina (Tucker et al. (1994) PNAS 91:2611-2615), um promotor do gene da retinosqusina (Park et al. (2009) Gene Therapy 16 (7): 916-926), um promotor do gene da proteína do homeodomínio de CRX (Furukawa et al. (2002) The Journal of Neuroscience 22 (5): 1640-1647), polipetídeo 1 de atividade de transdução de proteína alfa de ligação a nucleotídeo guanina (GNAT1) (Lee et al. (2010) Gene Therapy 17:1390-1399), um promotor do gene da proteína de zipper de leucina específica da retina neural (NRL) (Akimoto et al. (2006) PNAS 103(10): 3890-3895), promotor de arrestina de cone humano (hCAR) (Li et al. (2002) Biochemistry and Molecular Biology 43: 1375-1383), e os promotores PR2.1, PR1.7, PR1.5 e PR1.1 (Ye et al. (2016) Human Gene Therapy 27(1): 72-82)). Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse está operacionalmente ligada a um elemento regulador específico da célula do epitélio pigmentar da retina (por exemplo, um promotor específico de RPE), por exemplo, um elemento regulador que confere expressão seletiva do gene operacionalmente ligado em uma célula de RPE. Os elementos reguladores específicos de RPE adequados incluem, por exemplo, um promotor do gene RPE65 (Meur et al. (2007) Gene Therapy 14: 292-303), um promotor do gene da proteína de ligação ao retinaldeído celular (CRALBP) (Kennedy et al. (1998) Journal of Biological Chemistry 273: 5591-5598), um promotor do gene do fator derivado do epitélio do pigmento (PEDF aka serpin F1) (Kojima et al. (2006) Molecular and Cellular Biochemistry 293(1-2): 63-69), e um promotor de distrofia macular viteliforme (VMD2) (Esumi et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry 279(18): 19064-19073). Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse está operacionalmente ligada a um elemento regulador específico das células da glia de Müller (por exemplo, um promotor específico da glial), por exemplo, um elemento regulador que confere expressão seletiva do gene operacionalmente ligado em uma célula glial da retina. Os elementos reguladores específicos da glial adequados incluem, por exemplo, um promotor da proteína acídica fibrilar glial (GFAP) (Besnard et al. (1991) Journal of Biological Chemistry 266(28): 18877-18883). Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene de interesse está operacionalmente ligada a um elemento regulador específico de células bipolares (por exemplo, um promotor específico bipolar), por exemplo, um elemento regulador que confere expressão seletiva do gene operacionalmente ligado em uma célula bipolar. Os elementos reguladores específicos bipolares adequados incluem, por exemplo, um promotor GRM6 (Cronin et al. (2014) EMBO Molecular Medicine 6(9): 1175-1190).

[00180] Para os fins da invenção, a presente divulgação fornece um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de capsídeo de AAV variante como descrito acima. Um ácido nucleico isolado pode ser um vetor de AAV, por exemplo, um vetor de AAV recombinante.

[00181] A presente divulgação também fornece um método de tratamento de uma doença da retina, o método compreendendo a administração a um indivíduo com necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um vírion de rAAV variante compreendendo um transgene de interesse como descrito acima e divulgado aqui. Um versado na técnica seria prontamente capaz de determinar uma quantidade eficaz do vírion de rAAV em questão e que a doença foi tratada testando uma alteração em um ou mais parâmetros funcionais ou anatômicos, por exemplo, acuidade visual, campo visual, responsividade eletrofisiológica à luz e à escuridão, visão colorida, sensibilidade ao contraste, anatomia, saúde da retina e vasculatura, motilidade ocular, preferência de fixação e estabilidade.

[00182] Os métodos não limitativos para avaliar a função da retina e suas alterações incluem a avaliação da acuidade visual (por exemplo, melhor acuidade visual corrigida, de ambulação, navegação, detecção de objetos e discriminação), avaliação do campo visual (por exemplo, perimetria estática e cinética do campo visual), realização de um exame clínico (por exemplo, exame de lâmpada de fenda nos segmentos anterior e posterior do olho), avaliação da responsividade eletrofisiológica a todos os comprimentos de onda de claro e escuro (por exemplo, todas as formas de eletrorretinografia (ERG) [campo completo, multifocal, padrão], todas as formas de potencial visual evocado (VEP), eletro-oculografia (EOG), visão de cores, adaptação ao escuro e/ou sensibilidade ao contraste). Os métodos não limitativos para avaliar a anatomia e a saúde da retina e suas alterações incluem Tomografia por Coerência Óptica (OCT), fotografia de fundo de olho, oftalmoscopia por varredura de óptica adaptativa (AO-SLO), fluorescência e/ou autofluorescência; medição da motilidade ocular e dos movimentos oculares (por exemplo, nistagmo, de preferência, de fixação e estabilidade), medição dos resultados relatados (alterações relatadas pelo paciente em atividades e atividades visuais e não visualmente orientadas, resultados relatados pelo paciente [PRO], avaliações baseadas em questionário de qualidade de vida, atividades diárias e medições de função neurológica (por exemplo, imageamento por ressonância magnética funcional (MRI)).

[00183] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do vírion de rAAV em questão resulta em uma diminuição na taxa de perda da função da retina, integridade anatômica, ou saúde da retina, e. uma diminuição de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes ou mais na taxa de perda e, consequentemente, na progressão da doença, por exemplo, uma diminuição de 10 vezes ou mais na taxa de perda e, consequentemente, na progressão da doença. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz do vírion de rAAV em questão resulta em um ganho na função visual, função da retina, uma melhoria na motilidade ocular e/ou melhoria na função neurológica, por exemplo, uma melhoria de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes ou mais na função da retina, saúde ou anatomia da retina, e/ou melhoria na motilidade ocular, por exemplo, uma melhoria de 10 vezes ou mais na função da retina, anatomia ou saúde da retina, e/ou melhora na motilidade ocular. Como será prontamente apreciado pela pessoa versada na técnica, a dose necessária para alcançar o efeito de tratamento desejado estará tipicamente na faixa de 1 x 108 a cerca de 1 x 1015 vírions recombinantes, tipicamente referidos pelos peritos na especialidade como 1 x 1O8 a cerca de 1 x 1015 de “genomas de vetores”.

[00184] Um vírion de rAAV em questão pode ser administrado via injeção intraocular, por exemplo, por injeção intravítrea, por injeção subrretiniana, por injeção supracoroidal, ou por qualquer outro modo conveniente ou via de administração que resultará na aplicação do vírion de rAAV ao olho. Outros mancestodos convenientes ou vias de administração incluem, sem limitação, injeções intravenosas, intra- arteriais, perioculares, intracameral, subconjuntivais e subencaixe e administração tópica e intranasal. Quando administrado via injeção intravítrea, o vírion de rAAV em questão é capaz de se mover através do vítreo e atravessar a membrana limitante interna (também referida aqui como uma membrana limitante interna, ou “ILM”; uma membrana acelular fina e transparente na superfície da retina que forma a fronteira entre a retina e o corpo vítreo, formada por astrócitos e os pés de extremidade das células de Müller), e/ou se move através das camadas da retina com mais eficiência, em comparação com a capacidade de um vírion de AAV que compreende a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente.

[00185] Uma proteína de capsídeo variante aqui divulgada é isolada, por exemplo, purificada. Em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo variante divulgada aqui é incluída em um vetor de AAV ou em um vírion de AAV recombinante (rAAV). Em outras modalidades, tais vetores de AAV variante e/ou vírions de AAV variante são utilizados em um método in vivo ou ex vivo de tratamento de doença ocular na retina de primatas.

[00186] A presente descrição fornece ainda células hospedeiras tais como, sem limitação, células hospedeiras isoladas (geneticamente modificadas) compreendendo um ácido nucleico em questão. Uma célula hospedeira de acordo com a invenção aqui divulgada, pode ser uma célula isolada, tal como uma célula de uma cultura de células in vitro. Tal célula hospedeira é útil para produzir um vírion de rAAV variante em questão, como aqui descrito. Em uma modalidade, essa célula hospedeira é estavelmente e geneticamente modificada com um ácido nucleico. Em outras modalidades, uma célula hospedeira é transitoriamente e geneticamente modificada com um ácido nucleico. Um tal ácido nucleico é introduzido de forma estável ou transiente em uma célula hospedeira, com o uso de técnicas estabelecidas, incluindo, mas não se limitando a, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossomas e semelhantes. Para transformação estável, um ácido nucleico geralmente incluirá ainda um marcador selecionável, por exemplo, qualquer um de vários marcadores selecionáveis bem conhecidos, tais como resistência a neomicina e semelhantes. Uma tal célula hospedeira é gerada por introdução de um ácido nucleico em qualquer uma de uma variedade de células, por exemplo, células de mamífero, incluindo, por exemplo, células de murino e células de primatas (por exemplo, células humanas). As células de mamífero exemplificadoras incluem, mas, sem limitação, células primárias e linhagens de células, onde as linhagens de células exemplificadoras incluem, mas, sem limitação, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, fibroblastos de camundongo 3T3, fibroblastos C3H10T1/2, Células de CHO e semelhantes. Exemplos de células hospedeiras incluem, sem limitação, células HeLa (por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), células de CHO (por exemplo, ATCC n°s. CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por exemplo, ATCC n°. CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC n° CRL- 1658), células Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC n° CCL10), células PC12 (ATCC n° CRL1721), células de COS, Células de COS-7 (ATCC n°. CRL1651), células RAT1, células L de camundongo (ATCC n°. CCLI.3), células de rim embrionáro humano (HEK) (ATCC n°. CRL1573), células HLHepG2 e semelhantes. Uma célula hospedeira pode também ser preparada com o uso de um baculovírus para infectar células de inseto, tais como células Sf9, que produzem AAV (ver, por exemplo, Patente U.S. n°. 7.271.20; Pedido de Patente U.S. n°. 122/297.958). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada inclui, além de um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de capsídeo de AAV variante, como descrito acima, um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais proteínas rep de AAV. Em outras modalidades, uma célula hospedeira compreende ainda um vetor de rAAV variante. Um vírion de rAAV variante pode ser gerado utilizando tais células hospedeiras. Os métodos para gerar um vírion de rAAV são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. n° 2005/0053922 e Publicação de Patente U.S. n°. 2009/0202490.

[00187] A presente divulgação fornece adicionalmente uma composição farmacêutica compreendendo: a) o vírion de rAAV variante, como descrito acima e aqui divulgado; e b) um veículo, diluente, excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o veículo, diluente, excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitável é adequado para uso em um paciente humano ou não humano. Tais excipientes, veículos, diluentes e tampões incluem qualquer agente farmacêutico que possa ser administrado sem toxicidade indevida. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas, sem limitação, líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos nos mesmos, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e semelhantes; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsionantes, surfactantes, substâncias tamponantes de pH e semelhantes, podem estar presentes em tais veículos. Uma grande variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica e não necessita ser discutida em detalhes aqui. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis têm sido amplamente descritos em uma variedade de publicações, incluindo, por exemplo, A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7° ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. Em alguns aspectos da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1015 vírus recombinantes ou 1 x 108 a cerca de 1 x 1015 genomas de vetor, em que cada referido vírus recombinante compreende um genoma que codifica um ou mais produtos de gene.

[00188] Os exemplos a seguir são apresentados para fornecer ao versado na técnica uma descrição e divulgação completas para orientação sobre como fazer e usar os capsídeos de AAV variante aqui divulgados, e não pretendem limitar o escopo da invenção aqui divulgada. Além disso, os seguintes exemplos não pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados.

EXEMPLOS

[00189] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a fornecer aos versados na técnica uma descrição e divulgação completas de como fazer e usar a presente invenção, e não pretendem limitar o escopo do que os inventores consideram como sendo a sua invenção, nem eles pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio ponderal, a temperatura é em graus centígrados e a pressão é próxima da atmosférica.

[00190] Métodos gerais em bioquímica molecular e celular podem ser encontrados em livros textos padrões como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. Os reagentes, vetores de clonagem e kits para manipulação genética referidos nesta divulgação estão disponíveis em fornecedores comerciais tais como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich e ClonTech.

Exemplo 1

[00191] Injeção Intravítrea e Coleta de Tecido. Utilizou-se um único macaco Cinomolgos macho (macaca fascicularis) com 4-10 anos de idade e pesando pelo menos 4 kg através de injeção intravítrea através da esclerótica (aproximadamente 3 mm atrás do limbo com o uso de um procedimento e dispositivo de administração adequado para uso humano). O animal foi anestesiado e administrado com 100 μL de anestésico tópico da biblioteca em cada olho

[00192] A eutanásia foi realizada por pessoal veterinário treinado, com injeção intravenosa de 100 mg/kg de pentobarbital sódico no dia 14 ± 3. Os olhos foram nucleados e armazenados a 4°C até a dissecção.

[00193] Dissecção de tecido. Os olhos foram cortados ao longo da ora serrata com um bisturi, e o segmento anterior foi removido. Cortes de alívio foram feitos na retina ao redor da fóvea para permitir a montagem plana da retina, e o vítreo foi removido. Seis amostras da retina de cada quadrante (superior, inferior, nasal e temporal) foram coletadas, como mostrado na Figura 2, e material celular correspondente às células de RPE, fotorreceptores, células biopolares, células amácrinas, células horizontais e/ou ganglionares foram isoladas.

[00194] Evolução Dirigida. O processo de evolução dirigida é mostrado na Figura 1A-1E. Resumidamente, é criada uma biblioteca de capsídeo viral compreendendo mais de 20 combinações proprietárias da técnica de mutação de DNA e genes cap (Figura 1A). Os vírus são então empacotados (Figura 1B) - tal que cada partícula é composta de um capsídeo mutante em torno do gene cap que codifica esse capsídeo - e purificada. A biblioteca de capsídeo é colocada sob pressão seletiva in vivo. O tecido ou material celular de interesse é colhido para isolar variantes de AAV que infectaram com sucesso esse alvo, e os vírus bem sucedidos são recuperados. Os clones bem sucedidos são enriquecidos através da seleção repetida (Estágio I - Figura 1D). Os genes cap selecionados então passam por rediversificação proprietária e são enriquecidos através de etapas adicionais de seleção para aumentar iterativamente a aptidão viral (Estágio 2 - Figura 1D). As variantes identificadas durante os estágios de seleção de vetores 1 e 2 demonstram a capacidade de transduzir as células da retina de primatas (Figura 1E).

[00195] Recuperação bem sucedida de Genomas de Capsídeo de AAV: Ciclos 1-6. Os capsídeos recuperados de cada ciclo de seleção foram usados para embalar a biblioteca injetada para iniciar o ciclo subsequente de seleção. A recuperação de genes de capsídeo de tecido representa a internalização bem sucedida de vetores da biblioteca no tecido de interesse. Após o 4° ciclo, a diversificação adicional da biblioteca foi incorporada antes da embalagem da biblioteca e da injeção para o 5° ciclo. A recuperação dos genomas virais de RPE, PR, camada nuclear interna (INL) e tecido da retina da camada de células ganglionares (GCL) a partir de um ciclo representativo de seleção são mostrados na Figura 3. Bandas dentro das caixas representam recuperação bem sucedida de genomas virais.

[00196] Análise de Sequenciamento: Ciclos 3-6. Durante os ciclos 3- 6, a sequenciação foi realizada em clones individuais dentro da biblioteca para determinar a frequência de variantes dentro da população. As variantes foram avaliadas quanto à presença de motivos dentro dos dados de sequenciamento. As variantes foram agrupadas em motivos com base na presença de uma variação unificadora (por exemplo, uma mutação pontual específica ou sequência de inserção de peptídeo específica em uma localização consistente dentro de capsídeo) que ocorreu em múltiplas sequências. Motivos representando pelo menos 5% da população sequenciada em dois ou mais ciclos da seleção ou pelo menos 10% da população sequenciada em um ou mais ciclos da seleção estão representados na Figura 4A (análise de sequenciamento do ciclo 3), 4B (análise de sequenciamento do ciclo 4), 4C (análise de sequenciamento do ciclo 5) e 4D (análise de sequenciamento do ciclo 6).

[00197] Vários clones representativos que foram identificados como conferindo aumento da infecciosidade das células da retina estão listados na Tabela 1 abaixo (cada clone contém a(s) substituição(ões) e/ou inserção(ões) identificada(s) e idêntica(s) à SEQ ID NO: 2; de sequências e frequência (entre parênteses) são listadas para cada clone): Tabela 1. Modificações na sequência de aminoácidos da proteína de capsídeo de VP1 de AAV que conferem uma maior infecciosidade de uma ou mais células da retina. As substituições listadas na coluna 2 são baseadas na sequência de aminoácidos para o AAV2 do tipo selvagem, isto é, na ausência de peptídeo inserido.

[00198] Também identificado como um capsídeo com uma infecciosidade aumentada de uma ou mais células da retina, foi um clone com a seguinte sequência ancestral do capsídeo de VP1:

[00199] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQD DGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNP YLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTA PGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPL GEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMDNANEGADGVGNASGNWHCDSTWL GDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFN RFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNL TSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAV GRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLI DQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRV SKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSS GVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNT APVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGF GLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKEN SKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL. (SEQ ID NO: 59)

[00200] Esta variante de capsídeo ancestral é evoluída a partir do capsídeo ancestral de SEQ ID NO: 58, em que as posições de degeneração (resíduos 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) evoluíram para compreender a Alanina (A) em 264, Alanina (A) em 266, Serina (S) em 268, Alanina (A) em 448, Treonina (T) em 459, Arginina (R) em 460, Alanina (A) em 467, Serina (S) em 470, Asparagina (N) em 471, Alanina (A) em 474, Serina (S) em 495, Asparagina (D) em 516, Asparagina (D) em 533, Glutamina (Q) em 547, Alanina (A) em 551, Alanina (A) em 555, ácido glutâmico (E) em 557, Metionina (M) em 561, Serina (S) em 563, Glutamina (Q) em 577, Serina (S) em 583, Valina (V) em 593, Treonina (T) em 596, Alanina (A) em 661, Valina (V) em 662, Treonina (T) em 664, Prolina (P) em 665, Treonina (T) em 710, Ácido Áspártico (D) em 717, Asparagina (N) em 718, Ácido glutâmico (E) em 719, e Serina (S) em 723.

[00201] Os vírions de AAV variante aqui divulgados podem incorporar parâmetros de projeto, características, modificações, vantagens e variações razoáveis, racionais, que são facilmente evidentes para os versados na técnica no campo da manipulação de vetores virais de AAV. Exemplo 2

[00202] A evolução dirigida foi empregada para descobrir novas variantes de vírus adeno-associados (AAV) com aplicação de genes superiores às células da retina após administração intravítrea (IVT), uma via de administração com vantagens significativas sobre outros métodos de aplicação de genes ao olho humano (Exemplo 1). O tropismo celular após administração intravítrea do novo AAV variante compreendendo uma substituição de P34A e o peptídeo LAISDQTKHA (SEQ ID NO: 28) inserido no aminoácido 588 (LAISDQTKHA + P34A) foi avaliado in vivo em primatas não humanos (NHP) como um exemplo representativo da capacidade das variantes de AAV contendo ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) para transduzir as células da retina.

[00203] Os vírions de AAV recombinantes compreendendo um capsídeo de AAV2 ou o novo capsídeo de variante LAISDQTKHA + P34A e um genoma compreendendo um transgene de proteína fluorescente verde (GFP) operacionalmente ligado a um promotor de CMV (AAV2.CMV.GFP e LAISDQTKHA + P34A.CMV.GFP, respectivamente) ou um promotor CAG (AAV2.CAG.EGFP e LAISDQTKHA + P34A.CAG.EGFP, respectiva- mente) foram fabricados com o uso de métodos padrões. Macacos Verdes Africanos (Figuras 7, 8) ou Cinomolgos (Figura 9) foram injetados intravitrealmente com várias doses de vetor variando de 4x1010 vg a 1x1012 1e12 vg por olho (ver legendas da figura para detalhes) e a transdução de células da retina foi avaliada em vida por imageamento de fluorescência de fundo com um Heidelberg SpectralisTM.

[00204] A aplicação intravítrea de AAV compreendendo a nova variante LAISDQTKHA + P34A resultou em expressão de transgenes mais ampla e mais robusta através da retina de NHP do que de AAV2 (Figuras 7-9). As imagens revelam que o novo capsídeo de AAV variante fornece expressão robusta dentro do centro da fóvea (uma área rica em cones); no anel parafoveal (uma área rica em células ganglionares da retina) e na periferia (uma área rica em muitos tipos de células, incluindo bastonetes, Müller glia, células amácrinas, células bipolares) tão cedo quanto 2 semanas após a injeção. Em contraste, e consistente com os resultados relatados por outros, o AAV2 do tipo selvagem fornece uma expressão mais fraca que está primariamente no anel parafoveal e só pode ser detectada em momentos posteriores. A análise imuno-histoquímica de várias regiões da retina realizada 3 semanas após injeção confirmou que muitos tipos de células da retina, incluindo células epiteliais pigmentares da retina, fotorreceptores de bastonetes e de cone e células ganglionares da retina, foram transduzidos com sucesso através da retina (Figuras 10A-10E).

[00205] Este estudo ilustra a aplicação de genes superiores pela variante compreendendo ISDQTKH seguindo uma via clinicamente preferida de administração em comparação com AAV2 clinicamente relevante. Eficácia semelhante é alcançável com outras variantes compreendendo este motivo de inserção de peptídeo. Do mesmo modo, eficácia semelhante é alcançável com outras variantes reveladas pela presente invenção que foram identificadas com o uso da mesma abordagem de evolução dirigida. Exemplo 3

[00206] O tropismo celular do novo AAV variante LAISDQTKHA + P34A para células epiteliais de pigmento da retina (RPE) e células fotorreceptoras (PR) foi avaliado in vitro em células de RPE e células PR geradas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por fibroblastos (FB-iPSC) ou células-tronco embrionárias humanas (ESC).

[00207] Os vírions de AAV compreendendo um capsídeo de AAV2 ou o novo capsídeo de variante LAISDQTKHA + P34A e um genoma compreendendo um transgene de proteína verde fluorescente (EGFP) operacionalmente ligado a um promotor CAG (AAV2.CAG.EGFP e LAISDQTKHA + P34A.CAG.EGFP, respectivamente) foram fabricados com o uso de métodos padrões. As culturas humanas de células do EPR foram geradas a partir da linhagem celular de células-tronco embrionárias humanas ESI-017 ou de células-tronco pluripotentes induzidas por derivados de fibroblastos humanos (“FB-iPSC”) com o uso de um protocolo de diferenciação de 45 dias. A maturação em células de RPE foi confirmada pela detecção da expressão de marcadores de EPR maduros incluindo RPE65 e BEST1; a síntese de VEGF e PEDF; e a capacidade de fagocitar segmentos externos dos bastonetes. As culturas de PR foram geradas por um paradigma de formação de taças de olho em várias etapas e confirmadas para compreender PRs por detecção da expressão de Recoverina e S Opsina após 179 dias em cultura.

[00208] Em relação a AAV2, LAISDQTKHA + P34A forneceu uma eficiência de transdução e expressão transgênicas significativamente maiores em culturas de EPR humano sete dias após a infecção, conforme determinado por imunofluorescência (Figuras 11A-B), citometria de fluxo (aumento de 2,7 vezes; Figuras 11C-D) e análise de Western blot (Figuras 11E-F). A transdução e a expressão robustas foram igualmente alcançadas com o uso de LAISDQTKHA + P34A.CAG.EGFP em culturas de PR humanas aos 32 dias após a infecção. Este estudo ilustra a capacidade superior das variantes compreendendo ISDQTKH (SEQ ID NO: 14) para aplicação de genes às células da retina.

[00209] O anteriormente exposto ilustra meramente os princípios da invenção. Será apreciado que os versados na técnica serão capazes de conceber várias disposições que, embora não explicitamente descritas ou mostradas aqui, incorporam os princípios da invenção e estão incluídas dentro do seu espírito e escopo. Além disso, todos os exemplos e linguagem condicional aqui citados se destinam principalmente a ajudar o leitor a compreender os princípios da invenção e os conceitos contribuídos pelos inventores para promover a técnica, e devem ser considerados sem limitação a tais exemplos e condições especificamente recitados.

[00210] Além disso, todas as declarações que aqui descrevem princípios, aspectos e modalidades da invenção, bem como os exemplos específicos da mesma, se destinam a abranger os seus equivalentes estruturais e funcionais. Adicionalmente, pretende-se que tais equivalentes incluam os equivalentes atualmente conhecidos e os equivalentes desenvolvidos no futuro, ou seja, quaisquer elementos desenvolvidos que desempenhem a mesma função, independentemente da estrutura. O escopo da presente invenção, portanto, não se destina a ser limitado às modalidades exemplificadoras mostradas e descritas aqui. Pelo contrário, o escopo e o espírito da presente invenção são incorporados pelas Reivindicações anexas.

Claims

1. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), compreendendo uma inserção de peptídeo na alça de GH da proteína de capsídeo em relação a uma proteína de capsídeo de AAV parental correspondente, caracterizada por que a inserção de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos ISDQTKH (SEQ ID NO:14) e em que o local de inserção está localizado entre os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 587 e 588 de VP1 de AAV2 (SEQ ID NO:2) ou na posição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo AAV.

2. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a inserção peptídeo compreende a sequência de aminoácidos Y1Y2ISDQTKHY3, em que cada um dentre Y1-Y3 é independentemente selecionado a partir de Ala, Leu, Gly, Ser, Thr e Pro.

3. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por que a inserção do peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28).

4. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizada por que a proteína de capsídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em relação a VP1 de AAV2 (SEQ ID NO:2) ou uma ou mais substituições correspondentes na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV.

5. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, caracterizada por que a proteína de capsídeo compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos em relação a VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou a(s) substituição(ões) correspondente(s) na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L e L735Q.

6. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com a Reivindicação 5, caracterizada por que a proteína de capsídeo compreende uma substituição de aminoácido P34A em relação a VP1 de AAV2 (SEQ ID NO:2) ou a substituição correspondente na proteína de capsídeo de outro sorotipo de AAV.

7. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com a Reivindicação 6, caracterizada por que a proteína de capsídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:42.

8. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com a Reivindicação 7, caracterizada por que a proteína de capsídeo consiste na sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:42.

9. Proteína de Capsídeo de Vírus Adeno-Associado Variante (AAV), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizada por que a proteína de capsídeo confere a um vírion de AAV recombinante infeccioso (rAAV) uma infecciosidade aumentada, de uma célula de retina em comparação com a infecciosidade da célula de retina por um vírion de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV parental correspondente.

10. Ácido Nucleico Isolado, caracterizado por que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de capsídeo de AAV variante conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9.

11. Vírion de rAAV Infeccioso, caracterizado por que compreende uma proteína de capsídeo de AAV variante conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9.

12. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda um ácido nucleico heterólogo que codifica um produto de gene.

13. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que o produto de gene é uma proteína ou RNA interferente curto.

14. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a proteína de capsídeo de AAV variante compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:42 e em que o ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de proteína-1 de escolta Rab.

15. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que o capsídeo de AAV variante consiste na sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:42 e em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de proteína-1 de escolta Rab é operacionalmente ligada a um promotor CAG.

16. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a proteína de capsídeo de AAV variante compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:42 e em que o ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína reguladora de GTPase de retinite pigmentosa.

17. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que a proteína de capsídeo de AAV variante consiste na sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:42.

18. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína reguladora de GTPase de retinite pigmentosa é operativamente ligada a um promotor rodopsina-quinase.

19. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a proteína de capsídeo de AAV variante compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:42 e em que o ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que inibe a atividade do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

20. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que a proteína de capsídeo de AAV variante consiste na sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:42.

21. Vírion de rAAV Infeccioso, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o polipeptídeo é uma proteína ou anticorpo de fusão.

22. Composição Farmacêutica, caracterizada por que compreende um vírion de rAAV conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 13 a 21 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

23. Uso de Vírion de rAAV, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 13 a 21, e/ou de Composição Farmacêutica, conforme definida na Reivindicação 22, caracterizado por que é para a fabricação de um medicamento.

24. Uso de Vírion de rAAV, conforme definido na Reivindicação 14 ou 15, e/ou de Composição Farmacêutica, que compreende um víron de rAAV, conforme definido na Reivindicação 14 ou 15, caracterizado por que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de coroideremia.

25. Uso de Vírion de rAAV, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 16 a 18, e/ou de Composição Farmacêutica, que compreende um vírion de rAAV, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 16 a 18, caracterizado por que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de retinite pigmentosa ligada a X.

26. Uso de Vírion de rAAV, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 19 a 21, e/ou de Composição Farmacêutica, que compreende um vírion de rAAV, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 19 a 21, caracterizado por que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de degeneração macular relacionada com a idade úmida, retinopatia diabética, edema macular diabético ou neovascularização coroidal.

27. Uso de Vírion de rAAV, e/ou de Composição Farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 23, 24, 25 e 26, caracterizado por que o vírion de rAAV ou composição farmacêutica é adequado(a) para a administração por injeção intravitreal.

28. Uso de Vírion de rAAV, e/ou de Composição Farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 23, 24, 25 e 26, caracterizado por que o medicamento é para tratar um indivíduo humano.