TW202130653A - 具改進生產產率及肝臟趨性之ａａｖ３ｂ變異體 - Google Patents

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Abstract

本文提供新穎的AAV殼體及包含該殼體的rAAV。於一具體實施例，運用所述AAV殼體的載體顯示與先前技術的AAV相較下，於選擇的組織中增加轉導。

Description

具改進生產產率及肝臟趨性之AAV3B變異體
[政府支持聲明]
本發明係於美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予的授權號為P01HL059407之政府支持下進行。美國政府在本發明中擁有一定權利。
本文提供新穎的AAV殼體及包含該殼體的rAAV。於一具體實施例，運用所述AAV殼體的載體顯示與先前技術的AAV相較下，於選擇的組織中增加轉導。
腺相關病毒(Adeno-associated virus，AAV)載體於人類基因治療中具有遠大的前景，且由於其提供長期基因表現的能力及缺乏致病性，已於各種研究中被廣泛使用於靶向肝臟、肌肉、心臟、腦、眼睛、腎臟及其它組織。AAV屬於小病毒科(parvovirus family)，含有單股DNA基因體，其兩側有反向末端重複(inverted terminal repeat)。已報導有數十種天然存在的AAV殼體；它們獨特的殼體結構使其能夠識別並轉導不同的細胞類型及器官。
自1981年開始第一項試驗以來，在基於AAV載體的基因治療的臨床試驗中尚未報告任何與載體相關的毒性。在臨床試驗中，AAV載體不斷積累的安全記錄，結合已證明的功效，顯示AAV為一有吸引力的平台。尤其，AAV容易操作，由於該病毒具有單股DNA病毒，其具有相對較小的基因體(~4.7 kb)及相對簡單的遺傳組分-反向末端重複序列(ITR)、Rep 及Cap 基因。AAV載體中僅需要ITR及AAV殼體蛋白，ITR用作載體生產的複製及包裝訊息，且殼體蛋白藉由形成殼體來容納載體基因體DNA並確定組織趨性而扮演中心角色。
由於其低的免疫原性和非致病性，AAV為最有效的基因治療載體候選物之一。然而，儘管能夠有效的基因轉移，但目前在臨床中使用的AAV載體可能會因對病毒的預先存在的免疫力和受限制的組織趨性而受到阻礙。如此，需要另外的AAV載體。
[發明摘述]
提供一種工程化AAV3B殼體，其有用於產生用以遞送基因產物的rAAV載體。rAAV特別適合於人類遞送，但亦可利用於非人類動物，包括例如狗及貓。rAAV可於組成物中而用於作為用於基因編輯、作為疫苗等其它適合的用途之基因治療產物。
於一具體實施例，工程化殼體具有AAV3B.AR2.08之胺基酸序列(SEQ ID NO：15)。於另一具體實施例，工程化殼體具有AAV3B.AR2.16之胺基酸序列(SEQ ID NO：29)。亦提供一種編碼SEQ ID NO：16之AAV3B.AR2.08核酸序列，其用於生產AAV殼體並與載體基因體組合而形成rAAV3B.AR2.08 rAAV顆粒。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.08核酸序列具有SEQ ID NO：16之序列或與其至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%相同的序列。於某些具體實施例，提供編碼SEQ ID NO：30之AAV3B.AR2.16核酸序列，其用於生產AAV殼體並與載體基因體形成rAAV3B.AR2.16 rAAV顆粒。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.16核酸序列具有SEQ ID NO：30之序列或與其至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%相同的序列。
本文提供一種具有殼體之重組腺相關病毒(rAAV)，該殼體具有AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)之序列，且具有包裝於殼體中的載體基因體，該基因體包含非AAV核酸序列。
本文提供一種rAAV，其具有殼體，該殼體係由AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)之序列編碼，或由與SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28、或32共享至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%相同的序列編碼，且具有包裝於殼體中的載體基因體，該基因體包含非AAV核酸序列。
本文提供一種具有殼體之rAAV，該殼體係由SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、或32編碼。於某些具體實施例，該rAAV具有AAV反向末端重複及異源性核酸序列，該異源性核酸序列與引導由該異源性核酸序列編碼的產物於目標細胞中表現之調控序列可操作地連接。於某些具體實施例，ITRs為來自與供應殼體的AAV不同的AAV。於某些具體實施例，ITRs來自AAV2。
本文提供一種rAAV，其包含： (A)包含下列一種以上之殼體：殼體蛋白包含：vp1蛋白之異源族群、vp2蛋白之異源族群、vp3蛋白之異源族群；其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
本文提供一種藉由投予具有殼體之rAAV而轉導肝臟組織之方法，該殼體選自AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)。
本文提供一種產生具AAV殼體的rAAV之方法，包括培養宿主細胞的步驟，其中宿主細胞含有：(a)編碼AAV殼體蛋白之分子AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：16)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：30)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)；(b)功能性rep基因；(c)包含AAV反向末端重複(ITRs)及轉基因之袖珍基因(minigene)；及(d)足夠的輔助功能，以允許袖珍基因包裝至AAV殼體蛋白中。
提供一種至少包含AAV及生理學上可相容的載劑、緩衝劑、佐劑、及/或稀釋劑之組成物。
提供一種遞送轉基因至細胞之方法，該方法包含將細胞與rAAV接觸的步驟。於某些具體實施例，該rAAV包含轉基因。
本文提供一種包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體包含具有選自下列之胺基酸序列：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)，另包含非AAV核酸序列。
本文提供一種包含編碼AAV殼體蛋白的核酸序列之核酸分子，其中該核酸序列選自AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：4)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：16)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：30)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)。於某些具體實施例，該核酸分子包含編碼AAV殼體蛋白及功能性AAV rep蛋白之AAV序列。於某些具體實施例，該核酸分子為質體。
本文提供一種以編碼AAV殼體蛋白的核酸轉染的宿主細胞。
[發明詳細說明]
除非另有定義，否則本文所使用的技術及科學術語具有與本發明所屬技術領域中具通常知識者通常所理解的含義相同的含義，並藉由參考公開文獻，其為本發明所屬技術領域中具通常知識者提供許多方面的一般指導。提供以下定義僅係為了使其明確，並無意限制所請求的發明。如本文所用，術語「一」或「一種」係指一個或多個，例如，「一種眼細胞」應理解為表示一個或多個眼細胞。如此，術語「一個」、「一個或多個」、及「至少一個」於本文中可互換使用。如本文所用，除非另外說明，否則術語「約」係指與給定參考的10%的變異性。雖然說明書中呈現的各種具體實施例使用「包含」語言，但於其它情形下，亦意圖使用「由…構成」或「基本上由…構成」的語言來解釋及描述相關的具體實施例。
關於下列描述，其意圖本文所述的每種組成物於本發明之方法之另一具體實施例中為有用的。此外，亦意圖所述的每種組成物在另一個實施方案中，本身為本發明之一具體實施例。
腺相關病毒(AAV)媒介的基因治療為一種有前途的治療疾病的方法，尤其是治療很少有有效治療方法的罕見疾病。從天然來源分離的AAV在基因傳遞效率和特異性方面有局限性。定向演化已被用於生產可以克服彼等缺點的AAV突變體。
我們使用計分卡方法來產生AAV3B高度變異區(HVR)VIII的初始多樣性。然後，我們進行於人類肝細胞異種移植的Fah–/– /Rag2–/– /Il2rg–/– (FRG)小鼠進行選擇，方法係藉由靜脈內注入庫並自從這些小鼠中單離的人類肝細胞中回收AAV cDNA，製備新的庫以用於下一回合。使用經過驗證的條碼系統，在非人類靈長類動物(NHP)中評估十六種顯示相對頻率顯著增加的AAV3B變異體。在肝臟轉導方面，此16個變異體中的大多數優於AAV3B，其中一些顯示高的肝臟特異性。以治療性轉基因進一步評估兩個變異體對於NHP中的肝臟基因治療，初步結果證實NHP條碼評估結果。
「重組AAV」或「rAAV」為含有兩種元件之DNAse抗性病毒顆粒：AAV殼體及包裝在AAV殼體內的含有至少非AAV編碼序列之載體基因體。除非另有指明，此術語可與用語「rAAV載體」交互使用。rAAV為「複製缺陷病毒」或「病毒載體」，因其缺乏任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能產生子代。於某些具體實施例，唯一的AAV序列係AAV反向末端重複序列(inverted terminal repeat sequences，ITRs)，通常位於載體基因體的最末端5'和3'末端，以允許位於ITR之間的基因及調控序列被包裝於AAV殼體。
如本文所使用，「載體基因體」係指被包裝於形成病毒顆粒的rAAV殼體內的核酸序列。此種核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITRs)。於本文之實施例中，載體基因體由5'至3'至少包含AAV 5'ITR、編碼序列、及AAV 3'ITR。可以選擇來自AAV2(與殼體不同來源的AAV)的ITR、或除了全長ITR之外的ITR。於某些具體實施例，ITR來自與在生產期間提供rep功能的AAV相同的AAV來源或反式互補(transcomplementing)AAV。此外，可以使用其它ITR。又，載體基因體含有指導基因產物表現的調控序列。於此更詳細地討論載體基因體的適合組件。載體基因體有時於本文稱為「袖珍基因」。
rAAV由AAV殼體及載體基因體所構成。AAV殼體為vp1之異源族群、vp2之異源族群、及vp3蛋白之異源族群之集合。如本文所使用，當用於指vp殼體蛋白，術語「異源」或其任何語法變體係指由不相同的元件組成的群體，例如，具有具不同修飾的胺基酸序列之vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。
如本文所使用，與vp1、vp2及vp3蛋白連結的術語「異源族群」(或者稱為同功型(isoform))，係指殼體內vp1、vp2及vp3蛋白之胺基酸序列的差異。AAV殼體含有vp1蛋白內、vp2蛋白內及vp3蛋白內的亞群，其具有來自預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括某些脫醯胺的天冬醯胺(N或Asn)殘基。例如，某些亞群包含天冬醯胺-甘胺酸對中的至少一、二、三或四個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)位置，且可選擇進一步包含其它脫醯胺的胺基酸，其中該脫醯胺造成胺基酸改變其及它可選擇的修飾。
如本文所使用，vp蛋白之「亞群」係指vp蛋白的組，其具有至少一個共同定義的特徵，且由參考組的至少一個組成員至少於所有成員組成，除非另有指明。例如，vp1蛋白之「亞群」可為於組裝的AAV殼體中至少一個(1)vp1蛋白且少於所有vp1蛋白，除非另有指明。vp3蛋白之「亞群」可為於組裝的AAV殼體中至少一個(1)vp3蛋白至少於所有vp3蛋白，除非另有指明。例如，vp1蛋白可為vp蛋白之亞群；vp2蛋白可為vp蛋白之各别的亞群，vp3為組裝的AAV殼體中vp蛋白的又另一亞群。於另一例中，vp1、vp2及vp3蛋白可含有具有不同修飾的亞群，例如，至少一、二、三或四個高度脫醯胺的天冬醯胺，例如，於天冬醯胺-甘胺酸對中。
除非另有指明，高度脫醯胺係指與參考胺基酸位置上的預測胺基酸序列比較時，於參考胺基酸位置上至少45%脫醯胺、至少50%脫醯胺、至少60%脫醯胺、至少65%脫醯胺、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、或至多約100%脫醯胺。此種百分比可使用2D-膠體、質譜法技術、或其它適合的技術確定。
不欲受限於理論，咸信AAV殼體中vp蛋白之至少高度脫醯胺的殘基的脫醯胺為本質上主要是非酵素性，這是由殼體蛋白中的功能基團引起的，該官能團使選定的天冬醯胺脫醯胺，並在較小程度上使麩醯胺酸殘基脫醯胺。多數的脫醯胺vp1蛋白之有效的殼體組裝指出此等事件或者在殼體組裝後發生，或者各別單體(vp1、vp2或vp3)中的脫醯胺在結構上具有良好的耐受性，並且在很大程度上不會影響組裝動力學。VP1-獨特(VP1-u)區(~aa 1-137)中的廣泛脫醯胺，通常被認為在細胞進入之前位於內部，暗示VP脫醯胺作用可能發生在殼體組裝之前。
不欲受限於理論，N之脫醯胺可通過其C端殘基的主鏈氮原子對Asn的側鏈醯胺基碳原子進行親核攻擊。咸信形成中間環閉合琥珀醯亞胺殘基。然後琥珀醯亞胺殘基進行快速水解以產生最終產物天冬胺酸(Asp)或異天冬胺酸(IsoAsp)。因此，於某些具體實施例，天冬醯胺(N或Asn)的脫醯胺作用導致Asp或IsoAsp，其可通過琥珀醯亞胺中間體相互轉化，例如如下說明。
Figure 02_image001
如本文提供者，於VP1、VP2或VP3中各脫醯胺的N可獨立為天冬胺酸(Asp)、異天冬胺酸(isoAsp)、天冬胺酸酯(aspartate)、及/或Asp與isoAsp之相互轉化摻混物、或其組合。可能存在任何合適的α-及異天冬胺酸的比率。例如，於某些具體實施例，該比率可為10：1至1：10的天冬胺酸對異天冬胺酸，約50：50的天冬胺酸：異天冬胺酸，或約1：3的天冬胺酸：異天冬胺酸，或其它選擇的比率。
於某些具體實施例，一個以上麩醯胺酸(Q)可脫醯胺成麩胺酸(Glu)，即，α-麩胺酸、γ-麩胺酸(Glu)、或α-及γ-麩胺酸的摻混物，其可通過共通的戊二醯亞胺中間體相互轉化。可能存在任何合適的α-及γ-麩胺酸的比率。例如，於某些具體實施例，該比率可為10：1至1：10的α對γ，約50：50的α：γ，或約1：3的α：γ，或其它選擇的比率。
Figure 02_image003
如此，rAAV包括具脫醯胺的vp1、vp2及/或vp3蛋白之rAAV殼體中的胺基酸的亞群，其至少包括包含至少一個高度脫醯胺的天冬醯胺之至少一個亞群。此外，其它修飾可包括異構物化，特別是於選擇的天冬胺酸(D或Asp)殘基位置。於再其它具體實施例，修飾可包括於Asp位置的醯胺化。
於某些具體實施例，AAV殼體含有具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5至至少約25個脫醯胺的胺基酸殘基位置的vp1、vp2及vp3之亞群，其至少1至10%、至少10至 25%、至少25至50%、至少50至70%、至少70至100%、至少75至100%、至少80-100%、或至少90-100%為脫醯胺，當與vp蛋白之經編碼的胺基酸序列比較時。多數的此等可為N殘基。然而，Q殘基亦可為被脫醯胺。
如本文所使用，「經編碼的胺基酸序列」係指基於被轉譯成胺基酸的參考核酸序列的已知DNA密碼子的轉譯而預測的胺基酸。
於某些具體實施例，rAAV具有AAV殼體，該AAV殼體具有vp1、vp2及vp3蛋白，該等vp蛋白具有包含於此處提供的表中呈示位置處的二、三、四、五個或以上之脫醯胺的殘基的組合的亞群且藉由引述併入於此。
可使用2D-膠體電泳、及/或質譜法、及/或蛋白質模擬技術來確定rAAV中的脫醯胺。線上層析可使用Acclaim PepMap管柱及Thermo UltiMate 3000 RSLC系統(Thermo Fisher Scientific與Q Exactive HF以NanoFlex源(Thermo Fisher Scientific)偶聯進行。MS數據使用Q Exactive HF數據相關性前20位方法(data-dependent top-20 method)獲得，從調查掃描(200-2000 m/z)動態選擇最豐富的尚未定序的前驅體離子。經由較高能量的碰撞解離片段進行定序，以預測的自動增益控制確定1e5離子的目標值，並使用4m/z的窗口進行前驅體的單離。於m/z200處以120,000的解析率獲得調查掃描。於m/z200處HCD光譜的解析率可設定為30,000，最大離子注入時間為50ms，且標準化的碰撞能量為30。S透鏡RF水平可設定為50，以得到來自消化的肽佔據的m/z區域的最佳傳遞。前驅體離子可自片段化選擇以單個、未分配或六個以上的電荷狀態被排除。可使用BioPharma Finder 1.0軟體(Thermo Fischer Scientific)分析獲得的數據。對於肽譜分析(peptide mapping)，使用單一入口蛋白質FASTA數據庫進行檢索，其中脲甲基化(carbamidomethylation)設定為固定修飾；及氧化、去醯胺化及磷酸化設為可變修飾，10-ppm質量準確度、高蛋白酶特異性、及MS/MS譜之信賴水平為0.8。合適的蛋白酶之例可包括，例如，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脫醯胺肽的質譜鑑定相對簡單，由於脫醯胺增加完整的分子質量+0.984 Da(-OH和-NH2 基之間的質量差)。藉由脫醯胺肽的質量面積除以脫醯胺及天然肽面積的總和確定特定肽的脫醯胺百分比。考慮到可能的脫醯胺位點的數量，於不同位點脫醯胺的同量異位物種(isobaric species)可能在單峰內共同遷移。因此，來自具有多個潛在脫醯胺位點的肽的片段離子可用於定位或區分多個脫醯胺位點。於此等情形，觀察到的同位素模式內的相對強度可用於特異性地確定不同脫醯胺肽異構物的相對豐度(relative abundance)。此方法假設所有異構物種的片段化效率於脫醯胺位點係相同的且係獨立的。所屬技術領域中具通常知識者將理解，可以使用此等說明性方法的多種變型。例如，合適的質譜儀可包括例如四極柱飛行時間式質譜儀(quadrupole time of flight mass spectrometer (QTOF))，諸如Waters Xevo或Agilent 6530或軌道阱裝置(orbitrap instrument)，諸如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos (Thermo Fisher)。適合的液相層析系統包括例如Acquity UPLC系統，來自Waters或Agilent系統(1100或1200系列)。適合的數據分析軟體可包括例如 MassLynx (Waters)、Pinpoint and Pepfinder (Thermo Fischer Scientific)、Mascot (Matrix Science)、Peaks DB (Bioinformatics Solutions)。又可描述其它技術，例如X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267，2017年6月16日在線公開。
除了脫醯胺化之外，可能發生不會造成一個胺基酸轉化成不同的胺基酸殘基的其它修飾。此種修飾可包括以乙醯基化的殘基、異構物化、磷酸化、或氧化。
脫醯胺化之調節：於某些具體實施例，修飾AAV以改變天冬醯胺-甘胺酸對中的甘胺酸，以減少脫醯胺化。於其它具體實施例，改變天冬醯胺成為不同的胺基酸，例如，於較緩慢速率下脫醯胺的麩醯胺酸；或成為缺乏醯胺基的胺基酸(例如，麩醯胺酸及天冬醯胺含有醯胺基)；及/或成為缺乏胺基的胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸及組胺酸含有胺基)。如本文所使用，缺少醯胺或胺側基之胺基酸係指，例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、或色胺酸、及/或脯胺酸 。如所述修飾可為於經編碼的AAV胺基酸序列中發現的天冬醯胺-甘胺酸對中的一、二、或三個。於某些具體實施例，此種修飾並未於所有四個天冬醯胺-甘胺酸對中進行。如此，用於減少具有較低脫醯胺率的AAV及/或工程化AAV變異體的脫醯胺化的方法。此外，或者，可將一種以上其它醯胺胺基酸改變為非醯胺胺基酸以減少AAV之脫醯胺化。於某些具體實施例，如本文所述之突變的AAV殼體含有於天冬醯胺-甘胺酸對中的突變，如此甘胺酸被改變成丙胺酸或絲胺酸。突變的AAV殼體可含有一、二或三個突變體，其中於參考AAV本身包含四個NG對。於某些具體實施例，AAV殼體可含有一、二、三、或四個此種突變體，其中於參考AAV本身包含5個NG對。於某些具體實施例，突變的AAV殼體含有NG對中的僅單一個突變。於某些具體實施例，突變的AAV殼體含有兩個不同的NG對中的突變。於某些具體實施例，突變的AAV殼體含有定位於AAV殼體中的結構上分開的位置中的兩個不同的NG對中的突變。於某些具體實施例，突變並非位於VP1-獨特區域。於某些具體實施例，突變之一者係位於VP1-獨特區域中。可選擇地，突變的AAV殼體不含有NG對中的修飾，但含有突變，以最小化或消除定位於NG對的外部的一個或多個天冬醯胺或麩醯胺酸的脫醯胺作用。
於某些具體實施例，提供一種增加rAAV載體之效力之方法，其包含使AAV殼體工程化，其消除於野生型AAV殼體中的一個以上之NGs。於某些具體實施例，「NG」的「G」的編碼序列經工程化以編碼另一種胺基酸。於下列某些示例中，「S」或「A」被取代。然而，可選擇其它適合的胺基酸編碼序列。
胺基酸修飾可藉由習用的基因工程技術進行。例如，可產生含有經修飾的AAV vp密碼子的核酸序列，其中編碼於天冬醯胺-甘胺酸對中的甘胺酸的密碼子之一至三個被修飾以編碼除甘胺酸以外之胺基酸。於某些具體實施例，含有經修飾的天冬醯胺密碼子之核酸序列於天冬醯胺-甘胺酸對之一至三個可經工程化，如此經修飾的密碼子編碼除天冬醯胺以外之胺基酸。每一經修飾的密碼子可編碼不同的胺基酸。或者，一種以上之經改變的密碼子可編碼相同的胺基酸。於某些具體實施例，此等經修飾的核酸序列可用於產生具有比天然AAV3B變異體殼體低的脫醯胺化的殼體的突變的rAAV。此種突變的rAAV可具有降低的免疫原性及/或增加儲存穩定性，特別是懸浮液形式的儲存。
本文亦提供編碼具有減少的脫醯胺化之AAV殼體之核酸序列。設計編碼此AAV殼體的核酸序列係屬本技術領域範圍內，包括DNA(基因體或cDNA)或RNA(例如，mRNA)。可以對此種核酸序列進行密碼子優化以在所選系統(即細胞類型)中表現，且可藉由各種方法來設計。可以使用在線可用的方法(例如，GeneArt)、公開的方法或提供密碼子優化服務的公司(例如，DNA2.0)(Menlo Park, CA)來執行該優化。描述一種密碼子優化方法，例如，國際專利公開案WO 2015/012924，其藉由引用整體併入本文。亦參見例如， 美國專利公開案No. 2014/0032186及美國專利公開案No. 2006/0136184。產物的開放讀碼框(ORF)的整個長度適當地被修改。然而，於一些具體實施例，只有ORF的一個片段可被改變。藉由使用此等方法之一，可將頻率應用於任何指定的多肽序列，並產生編碼多肽的密碼子優化的編碼區的核酸片段。多種選項可用於對密碼子進行實際的改變或合成如本文所述之所設計的密碼子優化的編碼區。可以使用本項技術領域中具通常知識者熟知的標準及常規分子生物學操作進行此種修飾或合成。於一種方法中，藉由標準方法合成長度各自為80-90個核苷酸並跨越所需序列長度的一系列互補寡核苷酸對。合成此等寡核苷酸對，使得它們在退火時形成含有黏性末端的80-90個鹼基對的雙股片段，例如在該對中的每個寡核苷酸被合成以延伸超過與該對中另一寡核苷酸互補的區域3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基。每對寡核苷酸的單股末端被設計為與另一對寡核苷酸的單股末端退火。使寡核苷酸對退火，然後使約5-6個此等雙股片段經由黏性單股末端一起退火，然後將它們一起連接並選殖到標準細菌選殖載體中，例如，可獲自Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif的TOPO®載體。然後藉由標準方法對構築體進行定序。製備幾個由連接在一起的80至90個鹼基對片段之5至6個片段組成的構築體，即約500個鹼基對的片段，使得整個所需序列呈現於一系列質體構築體。然後以適合的限制酶切割此等質體的插入物並連接在一起以形成最終構築體。然後將最終的構築體選殖到標準的細菌選殖載體中，並定序。其它方法對於本項技術領域中具通常知識者而言將顯而易見。此外，基因合成係容易自商業上獲得。
於某些具體實施例，提供AAV殼體，其具有AAV殼體同功型 (即，VP1、VP2、VP3)之異源族群，該同功型含有多個高度脫醯胺化的「NG」位置。於某些具體實施例，此高度脫醯胺化的位置於下文參考預測的全長VP1胺基酸序列鑑定的位置中。於其它具體實施例，修飾殼體基因使得參考的「NG」被消融且突變體「NG」經工程化至另一位置。
如本文所使用，術語「目標組織」可指任何被意圖藉由對象AAV載體而轉導的細胞或組織。此術語可指肌肉、肝臟、肺臟、呼吸道上皮、中樞神經系統、神經元、眼睛(眼細胞)、或心臟之任何一種。於一具體實施例，目標組織為肝臟。於另一具體實施例，目標組織為心臟。於另一具體實施例，目標組織為腦。於另一具體實施例，目標組織為肌肉。
如本文所使用，術語「哺乳動物受試者」或「受試者」包括任何需要本文所述治療或預防之方法的哺乳動物，特別是包括人類。需要此種治療或預防之其它哺乳動物包括犬、貓、或其它家養動物、馬、家畜、實驗動物，包括非人類靈長類等。受試者可為雄性或雌性。
如本文所使用，術語「宿主細胞」可指其中從質體產生rAAV的包裝細胞系。或者，術語「宿主細胞」可指其中所欲轉基因表現的目標細胞。
A. AAV殼體 本文提供了新穎AAV3B變異體VP1、VP2、及VP3殼體蛋白。全長vp1序列呈示於序列表：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)。
於下列實施例，已觀察到AAV3B.AR2.08及AAV3B.AR2.16轉導人類肝臟(肝細胞)。AAV3B.AR2.08及AAV3B.AR2.16殼體特別適合於生產rAAV，該rAAV用於肝臟導向的基因治療、基因編輯、及其它rAAV媒介的基因產物的肝臟靶向。然而，此並不限制此等殼體的效用，其可用於靶向其它組織和器官，諸如彼等下文所述者。
AAV殼體由三個重疊的編碼序列構成，由於使用可替代的起始密碼子，其長度會變化。此等可變的蛋白質被稱為VP1、VP2、及VP3，以VP1最長且VP3最短。AAV顆粒由所有三個殼體蛋白構成，以~1:1:10(VP1:VP2:VP3)之比率。VP3包含於N端的VP1及VP2中，為構建顆粒的主要結構組件。殼體蛋白可使用幾種不同的編號系統來指稱。為了方便起見，如本文所使用，使用VP1編號來指稱AAV序列，該編號從VP1的第一個殘基的aa 1開始。然而，本文所述殼體蛋白包括VP1、VP2及VP3(在本文中可與vp1、vp2及vp3交替使用)。本發明的殼體的可變蛋白質的編號如下：
核酸 本文提供了編碼胺基酸1至736之AAV3B殼體變異體VP1核酸序列；編碼其各自SEQ ID NO之aa 138至736之VP2核酸序列；及/或編碼其各自SEQ ID NO之aa 203至736之VP3核酸序列且使用天然AAV3B作為參考(SEQ ID NO：34)。AAV3B殼體變異體由其各別SEQ ID No之vp1(nt 1至nt 2211)、vp2(nt 412至nt 2211)及vp3(nt 607至nt 2211)之至少一者之核酸編碼且使用天然AAV3B作為參考(SEQ ID NO：33)。於一具體實施例，AAV3B.AR2.08 VP1核酸序列編碼SEQ ID NO：15之胺基酸約1至約736(VP1)且亦生產SEQ ID NO：15之VP2(胺基酸約138至約736)及Vp3蛋白(胺基酸約203至約736)。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.08 VP1核酸序列為SEQ ID NO：16之全長，或與SEQ ID NO：16之約nt 1至約nt 2211的連續核苷酸序列之至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.08 VP2核酸序列為SEQ ID NO：16之全長，或與SEQ ID NO：16之約nt 412至約nt 2211的連續核苷酸序列之至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.08 VP3核酸序列為SEQ ID NO：16之全長，或與SEQ ID NO：16之約nt 607至約nt 2211的連續核苷酸序列之至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，於與SEQ ID NO：16具有所述同一性的序列，在nt 1744至nt 1783區域中的核酸編碼於SEQ ID NO：15之AAV3B.AR2.08之位置582至594的胺基酸。於其它具體實施例，所述同一性內的序列編碼SEQ ID NO：15之全長VP1、VP2、或VP3。
於另一具體實施例，AAV3B.AR2.16 VP1核酸序列編碼SEQ ID NO：29之胺基酸約1至約736(VP1)且亦生產SEQ ID NO：29之VP2(胺基酸約138至約736)及Vp3蛋白(胺基酸約203至約736)。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.16 VP1核酸序列為SEQ ID NO：30之全長，或與SEQ ID NO：30之約nt 1至約nt 2211的連續核苷酸序列之至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.16 VP2核酸序列為SEQ ID NO：30之全長，或與SEQ ID NO：30之約nt 412至約nt 2211的連續核苷酸序列之至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.16 VP3核酸序列為SEQ ID NO：30之全長，或與SEQ ID NO：30之約nt 607至約nt 2211的連續核苷酸序列之至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，提供編碼SEQ ID NO：30之AAV3B.AR2.16核酸序列，用於生產AAV殼體及包裝載體基因體以形成rAAV3B.AR2.16 rAAV顆粒。於某些具體實施例，AAV3B.AR2.16核酸序列具有SEQ ID NO：30之序列或與其至少90%同一性、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。於某些具體實施例，對於與SEQ ID NO：30具有所述同一性的序列，nt 1744至nt 1783之區域中的核酸編碼SEQ ID NO：30之AAV3B.AR2.16之位置582至594的胺基酸。於其它具體實施例，所述同一性內的序列編碼SEQ ID NO：29的全長VP1、VP2或VP3。
將本文所述殼體與AAV3B的比對示於圖2A–圖2S。
胺基酸 (aa) 序列 所有AAV3B變異體：其各自SEQ ID NO之aa vp1–1至736；vp2–aa 138至736；vp3–aa 203至736且使用天然AAV3B作為參考(SEQ ID NO：33)。將本文所述殼體與AAV3B之比對示於圖1A–圖1E。
於一具體實施例，AAV3B變異體殼體係由編碼AAV3B.AR2.08之VP1胺基酸序列(SEQ ID NO：15，約胺基酸1至約胺基酸736)的核酸序列生產，或由具有與其具有至少95%同一性、至少97%同一性、或至少99%同一性之序列生產，其中保留了SEQ ID NO：15的582至594位置的胺基酸。於某些具體實施例，於生產上另外使用編碼VP2特異性胺基酸序列(約胺基酸138至約胺基酸736)及/或VP3特異性胺基酸序列(約胺基酸203至約胺基酸736)的核酸序列。
於另一具體實施例，AAV3B變異體殼體係由編碼AAV3B.AR2.16之VP1胺基酸序列(SEQ ID NO：29)的核酸序列編碼，或由具有與其具有至少95%同一性、至少97%同一性、或至少99%同一性之序列生產，其中保留了SEQ ID NO：29的582至594位置的胺基酸。於某些具體實施例，編碼VP2-特異性胺基酸序列(約胺基酸138至約胺基酸736)及/或VP3-特異性胺基酸序列(約胺基酸203至約胺基酸736)的核酸序列係另外或替換地用於生產。
包含於本文者為包含下列任一者之vp1、vp2及vp3之至少一者的rAAV：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)。本文亦提供包含下列任一者之vp1、vp2及vp3之至少一者編碼的AAV殼體：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：4)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：16)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：30)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)。
於一具體實施例，提供一種組成物，其包括重組腺相關病毒(rAAV)之混合群體，該rAAV之每一者包含：(a)AAV殼體，包含約60個殼體蛋白，由vp1蛋白、vp2蛋白及vp3蛋白作成，其中vp1、vp2及vp3蛋白為：vp1蛋白之異源族群，其由編碼選擇的AAV vp1胺基酸序列之核酸序列所生產，vp2蛋白之異源族群，其由編碼選擇的AAV vp2胺基酸序列之核酸序列所生產，vp3蛋白之異源族群，其由編碼選擇的AAV vp3胺基酸序列之核酸序列所生產，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，於該AAV殼體中包含於天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中脫醯胺造成胺基酸改變；及(b)於AAV殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
於某些具體實施例，脫醯胺的天冬醯胺被脫醯胺成天冬胺酸、異天冬胺酸、互變的天冬胺酸/異天冬胺酸對、或其組合。於某些具體實施例，殼體進一步包含脫醯胺的麩醯胺酸，其被脫醯胺成(α)-麩胺酸、γ-麩胺酸、互變的(α)-麩胺酸/γ-麩胺酸對、或其組合。
於某些具體實施例，提供一種新穎的經單離AAV3B.AR2.01殼體。編碼AAV3B.AR2.01殼體的核酸序列被提供於SEQ ID NO：2且預測的被編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：1。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)之vp1(aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供rAAV，其包含經AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)及vp3 (nt 607至nt 2211)序列之至少一者編碼的AAV殼體。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)包含下列一或多者之AAV3B.AR2.01殼體：(1)AAV3B.AR2.01殼體蛋白，其包含選自下列之AAV3B.AR2.01 vp1蛋白之異源族群：由編碼SEQ ID NO：1的1至736之預測的胺基酸序列之核酸序列表現所生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：2所生產的vp1蛋白、或由與SEQ ID NO：2具有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白，該SEQ ID NO：2編碼SEQ ID NO：1的1至736之預測的胺基酸序列；選自下列之AAV3B.AR2.01 vp2蛋白之異源族群:由編碼SEQ ID NO：1的至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白，包含SEQ ID NO：2之至少核苷酸412至2211的序列所生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：2之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列所生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸138至736預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.01 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：2之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：2的至少核苷酸607至2211至少70%一致的核酸序列所生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：1之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：1的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.01殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.01殼體，其包含：vp1蛋白之異源族群，其由SEQ ID NO：1之胺基酸序列的核酸序列之產物編碼，vp2蛋白之異源族群，其由SEQ ID NO：1之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物編碼，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：1之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物。
於某些具體實施例，提供編碼AAV3B.AR2.01 vp1殼體蛋白之核酸序列於SEQ ID NO：2。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：2具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.01殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列與SEQ ID NO：2具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：1之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：2之核酸序列或與SEQ ID NO：2為至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：1。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：2之核酸序列或與SEQ ID NO：2之約nt 412至約nt 2211具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：1之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：2之約nt 607至約nt 2211的核酸序列或與SEQ ID NO：2具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：1之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.01之核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.01殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.02殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：4，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：3。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)、及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：4)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.02殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.02殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.02 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：3之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：4生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：4至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該SEQ ID NO：4編碼SEQ ID NO：3之1至736之預測的胺基酸序列，AAV3B.AR2.02 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：4之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：4之至少核苷酸412至2211至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該SEQ ID NO：4編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列，AAV3B.AR2.02 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：4之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白或由與SEQ ID NO：4之至少核苷酸607至2211至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該SEQ ID NO：4編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：3之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：3中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.02殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.02殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：3之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：3之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.02 vp1殼體蛋白之核酸序列被提供於SEQ ID NO：4。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：4具有70%至99.9%同一性的核酸序列以表現AAV3B.AR2.02殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：4具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：3之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：4之核酸序列或與SEQ ID NO：4具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：3。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：4之核酸序列或與SEQ ID NO：4之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：3之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：4之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：4之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：3之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.02之核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.02殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.03殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：6，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：5。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)、及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.03殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.03殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.03 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：5之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：6生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：6至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：5之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.03 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：6之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：6之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.03 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：6之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：6之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸203 至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：5之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：5中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.03殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.03殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：5之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：5之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.03 vp1殼體蛋白之核酸序列被提供於SEQ ID NO：6。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：6有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.03殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：6有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：5之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：6之核酸序列或與SEQ ID NO：6有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：5。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：6之核酸序列或與SEQ ID NO：6之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：5之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：6之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：6之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：5之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.03之核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.03殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.04殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：8，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：7。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)、及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.04殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.04殼體蛋白，包含： AAV3B.AR2.04 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：7之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：8生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：8至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：7之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.04 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：8之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：8之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.04 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：8之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：8之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203 至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：7中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.04殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作連結。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.04殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：7之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.04 vp1殼體蛋白之核酸序列被提供於SEQ ID NO：8。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：8具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.04殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：8有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：8之核酸序列或與SEQ ID NO：8具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：7。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：8之核酸序列或與SEQ ID NO：8之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：7之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：8之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：8之nt有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：7之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.04的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.04殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.05殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：10，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：9。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)、及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.05殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.05殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.05 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：9之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：10生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：10至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：9之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.05 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：10之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：10之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.05 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：10之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：10之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：9之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：9中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.05殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.05殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：9之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：9之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.05 vp1殼體蛋白之核酸序列被提供於SEQ ID NO：10。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：10具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.05殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：10具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：9之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：10之核酸序列或與SEQ ID NO：10具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：9。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：10之核酸序列或與SEQ ID NO：10之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：9之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：10之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：10之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：9之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.05的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.05殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.06殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：12，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：11。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.06殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.06殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.06 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：11之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：12生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：12至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：11之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.06 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：12之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：12之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.06 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：12之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：12之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：11之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：11中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.06殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.06殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：11之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：11之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.06vp1殼體蛋白之核酸序列被提供於SEQ ID NO：12。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：12具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.06殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：12具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：11之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：12之核酸序列或與SEQ ID NO：12具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：11。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：12之核酸序列或與SEQ ID NO：12之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：11之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：12之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：12之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：11之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.06的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.06殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.07殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：14，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：13。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.07殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.07殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.07 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：13之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：14生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：14至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：13之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.07 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：14之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：14之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.07 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：14之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：14之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：13之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：13中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.07殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.07殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：13之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：13之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.07 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：14。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：14具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.07殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：14具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：13之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：14之核酸序列或與SEQ ID NO：14具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：13。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：14之核酸序列或與SEQ ID NO：14之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：13之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：14之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：14之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：13之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.07的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.07殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.08殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：16，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：15。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：16)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.08殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.08殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.08 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：15之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：16生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：16至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：15之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.08 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：16之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：16之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.08 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：16之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：16之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：15之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸203至736之核酸序列之產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：15中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.08殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.08殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：15之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：15之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.08 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：16。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：16具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.08殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：16具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：15之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：16之核酸序列或與SEQ ID NO：16具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：15。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：16之核酸序列或與SEQ ID NO：16之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：15之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：16之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：16之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：15之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.08的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.08殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.10殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：18，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：17。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：17)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.10殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.10殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.10 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：17之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：18生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：18至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：17之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.10 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：18之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：18之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.10 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：18之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：18之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：17之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：17之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：17中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.10殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.10殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：17之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：17之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.10 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：18。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：18具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.10殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：18具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：17之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：18之核酸序列或與SEQ ID NO：18具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：17。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：18之核酸序列或與SEQ ID NO：18之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：17之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：18之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：18之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：17之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.10的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.10殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.11殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：20，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：19。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.11殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.11殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.11 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：19之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：20所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：20至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：19之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.11 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：20之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：20之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.11 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：20之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：20之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：19之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：19之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：19中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.11殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.11殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：19之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：19之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.11 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：20。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：20具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.11殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：20具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：19之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：20之核酸序列或與SEQ ID NO：20具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：19。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：20之核酸序列或與SEQ ID NO：20之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：19之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：20之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：19之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.11的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.11殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.12殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：22，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：21。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.12殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.12殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.12 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：21之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：22所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：22至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：21之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.12 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：22之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：22之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.12 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：22之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：22之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：21之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：21之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：21中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.12殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.12殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：21之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：21之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.12 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：22。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：22具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.12殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：22具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：21之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：22之核酸序列或與SEQ ID NO：22具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：21。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：22之核酸序列或與SEQ ID NO：22之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：21之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：22之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：22之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：21之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.12的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.12殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.13殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：24，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：23。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.13殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.13殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.13 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：23之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：24所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：24至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：23之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.13 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：24之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：24之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.13 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：24之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：24之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：23之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：23之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：23中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.13殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.13殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：23之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：23之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.13 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：24。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：24具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.13殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：24具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：23之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：24之核酸序列或與SEQ ID NO：24具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：23。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：24之核酸序列或與SEQ ID NO：24之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：23之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：24之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：24之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：23之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.13的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.13殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.14殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：26，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：25。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.14殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.14殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.14 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：25之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：26所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：26至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：25之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.14 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：26之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：26之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.14 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：26之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：26之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：25之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：25之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：25中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.14殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.14殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：25之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：25之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.14 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：26。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：26具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.14殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：26具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：25之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：26之核酸序列或與SEQ ID NO：26具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：25。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：26之核酸序列或與SEQ ID NO：26之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：25之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：26之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：26之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：25之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.14的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.14殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.15殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：28，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：27。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.15殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.15殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.15 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：27之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：28所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：28至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：27之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.15 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：28之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：28之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.15 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：28之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：28之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：27之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：27之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：27中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.15殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.15殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：27之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：27之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.15 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：28。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：28具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.15殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：28具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：27之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：28之核酸序列或與SEQ ID NO：28具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：27。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：28之核酸序列或與SEQ ID NO：28之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：27之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：28之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：28之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：27之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.15的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.15殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.16殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：30，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：29。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：30)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.16殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.16殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.16 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：29之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：30所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：30至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：29之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.16 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：30之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：30之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.16 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：30之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：30之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：29之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：29中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.16殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.16殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：29之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.16 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：30。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：30具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.16殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：30具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：30之核酸序列或與SEQ ID NO：30具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：29。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：30之核酸序列或與SEQ ID NO：30之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：29之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：30之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：30之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：29之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.16的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.16殼體。
於某些具體實施例，提供一種新穎經單離AAV3B.AR2.17殼體。編碼AAV之核酸序列被提供於SEQ ID NO：32，及預測的經編碼的胺基酸序列被提供於SEQ ID NO：31。本文提供一種rAAV，其包含AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)之vp1 (aa 1至736)、vp2 (aa 138至736)及vp3 (aa 203至736)之至少一者。本文亦提供包含AAV殼體之rAAV，該AAV殼體由AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)之vp1 (nt 1至nt 2211)、vp2 (nt 412至nt 2211)、及vp3 (nt 607至nt 2211)之至少一者編碼。
於另一態樣，提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.17殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.17殼體蛋白，包含：AAV3B.AR2.17 vp1蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：31之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp1蛋白，由SEQ ID NO：32所生產的vp1蛋白，或由與SEQ ID NO：32至少70%一致的核酸序列生產的vp1蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：31之1至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.17 vp2蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：32之至少核苷酸412至2211之序列而生產的vp2蛋白，或由與SEQ ID NO：32之至少核苷酸412至2211有至少70%一致的核酸序列而生產的vp2蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；AAV3B.AR2.17 vp3蛋白之異源族群，選自：由編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現而生產的vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：32之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白，或由與SEQ ID NO：32之至少核苷酸607至2211具有至少70%一致的核酸序列而生產的vp3蛋白，該核酸序列編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列；及/或(2)vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：31之胺基酸序列的核酸序列之產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：31之至少胺基酸203至736的核酸序列的產物，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，包含於SEQ ID NO：31中天冬醯胺-甘胺酸對中至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及(B)於AAV3B.AR2.17殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼可操作地連接至序列的產物之非AAV核酸序列，該序列引導於宿主細胞中產物的表現。
於某些具體實施例，AAV3B.AR2.17殼體包含：vp1蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：31之胺基酸序列之核酸序列的產物，vp2蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物，及vp3蛋白之異源族群，其為編碼SEQ ID NO：31之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物。
於某些具體實施例，編碼AAV3B.AR2.17 vp1殼體蛋白的核酸序列被提供於SEQ ID NO：32。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：32具有70%至99.9%同一性之核酸序列以表現AAV3B.AR2.17殼體蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為與SEQ ID NO：32具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。然而，可選擇編碼SEQ ID NO：31之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAV殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：32之核酸序列或與SEQ ID NO：32具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：31。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：32之核酸序列或與SEQ ID NO：32之約nt 412至約nt 2211有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列，其編碼SEQ ID NO：31之vp2殼體蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：32之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：32之nt具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼SEQ ID NO：31之vp3殼體蛋白(約aa 203至736)。
本發明亦涵蓋編碼變異體AAV3B.AR2.17的核酸序列，其中已改變一個以上殘基以便減少脫醯胺化，或本文鑑定的其它修飾。此種核酸序列可用於生產突變體AAV3B.AR2.17殼體。
B. rAAV載體及組成物 於另一態樣，本文所述為利用本文所述AAV殼體序列、包括其片段的分子，用以生產有用於遞送異源性基因或其它核酸序列至目標細胞的病毒載體。於某些具體實施例，有用於於本文所述組成物及方法中的載體至少含有編碼如本文所述之所選擇的AAV殼體之序列，例如，AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)殼體、或其片段，包括vp1、vp2、或vp3殼體蛋白。於另一具體實施例，有用的載體至少含有編碼所選擇的AAV血清型rep蛋白的序列或其片段。可選擇地，此種載體可含有AAV cap及rep蛋白兩者。於載體中，提供AAVrep 及cap 兩者，AAVrep 及AAVcap 序列可兩者為一血清型起源，例如，所有AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17起源。或者，可使用載體其中rep 序列來自不同於提供cap 序列的野生型AAV的AAV，例如，提供ITRs及rep 的相同AAV。
於一具體實施例，rep 及cap 序列由各自的來源(例如，各自的載體、或一宿主細胞及一載體)表現。於另一具體實施例，此等rep 序列於框內與不同AAV血清型的cap 序列融合以形成嵌合AAV載體，諸如描述於美國專利No. 7,282,199的AAV2/8，其藉由引用併入本文。可選擇地，載體進一步含有袖珍基因，該袖珍基因包含選擇的轉基因，該轉基因兩側為AAV 5' ITR及AAV 3' ITR。於另一具體實施例，AAV為自互補的AAV(self-complementary AAV)(sc-AAV)(參見，美國2012/0141422，其藉由引用併入本文)。自互補的載體包裝反向重複基因體，其可折疊成dsDNA而無需在多個載體基因體之間進行DNA合成或鹼基配對。因為scAAV不需要在表現前將單股DNA (ssDNA)基因體轉化成雙股DNA (dsDNA)，故其為更有效率的載體。然而，此效率的權衡損失了載體一半的編碼能力，ScAAV可用於小的蛋白質編碼基因(最高~55 kd)和任何目前可用的基於RNA的療法。
假型化載體(pseudotyped vector)有用於此，其中一AAV之殼體以異源性殼體蛋白替換。於說明目的，具有AAV2 ITRs之利用如本文所述AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17殼體的AAV載體用於下文所述實施例中。參見上列引述的Mussolino等人。除非另有指明，AAV ITRs及本文所述其它選擇的AAV組件，可各自選自任何AAV血清型，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其它已知及未知的AAV血清型。於一所述具體實施例，使用AAV血清型2之ITRs。然而，可由其它適合的血清型選擇ITR。使用所屬技術領域中具通常知識者可使用的技術，可容易自一AAV血清型輕易單離此等ITRs或其它AAV組件。此等AAV可被單離或獲自學術、商業或公眾來源(例如，American Type Culture Collection, Manassas, VA)。或者，AAV序列可透過合成或藉由參考公開的序列諸如可於文獻或資料庫中取得之其它適合的方式獲得，例如，GenBank、PubMed等。
本文描述之rAAV亦包含載體基因體。載體基因體至少由非-AAV或異源性核酸序列(轉基因)所構成，如下所述，及其調控序列，及5’及3’AAV反向末端重複(ITRs)。其為被包裝至殼體蛋白且被遞送至選擇的目標細胞的袖珍基因。
轉基因為核酸序列，為與轉基因兩側的載體序列為異源性，其編碼感興趣的多肽、蛋白質、或其它產物。核酸編碼序列以允許目標細胞中的轉基因轉錄、轉譯及/或表現的方式可操作地連接至調控組件。異源性核酸序列(轉基因)可衍生自任何有機體。AAV可包含一種以上轉基因。
治療性轉基因 由轉基因編碼的有用產物包括許多基因產物，其替換缺陷或不足的基因，失活或「剔除(knock-out)」、或「敲減(knock-down)」或減少基因表現，其以不期望的高水平表現，或遞送具有所欲治療效果的基因產物。於大部分具體實施例，治療將為「體細胞基因治療(somatic gene therapy)」，即，轉移基因至不產生精子或卵的身體細胞。於某些具體實施例，轉基因表現蛋白質具有天然人類序列之序列。然而，於其它具體實施例，表現合成蛋白質。此種白質可被意圖用於治療人類，或於其它具體實施例，被設計用於治療動物，包括伴侶動物，諸如犬或貓群，或用於治療與人類接觸的牲畜或其它動物。
適合的基因產物之例可包括彼等與家族性高膽固醇血症、肌肉營養不良、囊性纖維化、及罕見或孤兒疾病有關者。此種罕見疾病之例可包括脊髓性肌萎縮症(spinal muscular atrophy，SMA)、亨汀頓氏症(Huntington's Disease)、雷特氏症候群(Rett Syndrome)(例如，甲基-CpG-結合蛋白2(MeCP2)；UniProtKB-P51608)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS))、杜顯型肌肉營養不良(Duchenne Type Muscular dystrophy)、弗氏運動失調(Friedrichs Ataxia)(例如，frataxin)、與2型脊髓小腦共濟失調(SCA2)/ALS相關的ATXN2；與ALS相關的TDP-43、顆粒蛋白前體(顆粒蛋白前體)(PRGN)(與非阿茲海默氏腦變性(non-Alzheimer’s cerebral degenerations有關)，包括額顳葉癡呆症(frontotemporal dementia (FTD))、進行性非流利性失語(progressive non-fluent aphasia (PNFA))及語意型失智症(semantic dementia))等。參見，例如，www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php；rarediseases. info.nih.gov /diseases。於一具體實施例，轉基因不為人類低密度脂蛋白受體(hLDLR)。於另一具體實施例，轉基因不為工程化人類低密度脂蛋白受體(hLDLR)變異體，諸如彼等於WO 2015/164778所述者。
適合的基因之例可包括，例如，激素以及生長和分化因子，包括但不限於胰島素、升糖素、類升糖素肽-1(GLP1)、生長激素(GH)、副甲狀腺素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)、卵泡刺激激素(FSH)、黃體激素(LH)、人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、血管抑制素、顆粒性白血球聚落刺激因子(GCSF)、紅血球生成素(EPO)(包括，例如，人類、犬或貓EPO)、結締組織生長因子(CTGF)、神經營養因子，包括，例如，鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素生長因子I及II(IGF-I及IGF-II)、轉形生長因子α超家族之任一者，包括TGFα、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、或骨塑型蛋白(bone morphogenic proteins，BMP)BMPs 1-15之任一者、生長因子之heregluin/neuregulin/ARIA/neu分化因子(NDF)家族之任一者、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經滋養素(neurotrophins)NT及NT-4/5、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor (CNTF))、神經膠質細胞株衍生神經營養因子(glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF))、neurturin、聚蛋白(agrin)、信號素(semaphorins)/腦衰蛋白(collapsins)之家族之任一者、神經導向因子-1(netrin-1)及神經導向因子-2(netrin-2)、肝細胞生長因子(HGF)、ephrins、noggin、音蝟因子(sonic hedgehog)及酪胺酸羥化酶。
其它有用的轉基因產物包括調節免疫系統的蛋白質，包括，未限於，細胞激素(cytokines)及淋巴激素(lymphokines)諸如促血小板生成素(TPO)、介白素(IL)IL-1至IL-36 (包括，例如，人類介白素IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、IL-31、IL-35)、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子、Fas配位體、腫瘤壞死因子α及β、干擾素α、β、及γ、幹細胞因子、flk-2/flt3配位體。由免疫系統產生的基因產物亦有用於本發明。此等包括，但未限於，免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD及IgE、嵌合免疫球蛋白、人類化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合T細胞受體、單鏈T細胞受體、第I及II型MHC分子、以及工程化免疫球蛋白及MHC分子。例如，於某些具體實施例，rAAV抗體可被設計用來遞送犬或貓抗體，例如，抗IgE、抗IL31、抗IL33、抗CD20、抗NGF、抗GnRH。有用的基因產物亦包括補體調節蛋白諸如補體調節蛋白、膜輔因子調節蛋白(membrane cofactor protein (MCP))、衰變加速因子(decay accelerating factor (DAF))、CR1、CF2、CD59、及C1酯酶抑制劑(C1 esterase inhibitor (C1-INH))。
再其它有用的基因產物包括激素、生長因子、細胞激素、淋巴激素、調節蛋白及免疫系統蛋白之受體之任一者。本發明涵括膽固醇調節及/或脂質調節用之受體，包括低密度脂蛋白(LDL)受體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL)受體、及清道夫受體(scavenger receptors)。本發明亦涵蓋諸如類固醇激素受體超家族(包括糖皮質激素受體和雌激素受體、維生素D受體和其它核受體)之基因產物。此外，有用的基因產物包括轉錄因子，諸如jun 、fos 、max、mad、血清反應因子(serum response factor (SRF))、AP-1、AP2、myb 、MyoD及肌細胞生成素(myogenin)、含ETS-盒蛋白、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-盒結合蛋白(CCAAT-box binding proteins)、干擾素調節因子(IRF-1)、Wilms腫瘤蛋白、ETS-結合蛋白、STAT、GATA-盒結合蛋白，例如， GATA-3、及翼狀螺旋(winged helix)蛋白之叉頭(forkhead)家族。
其它有用的基因產物包括羥甲基膽色烷合成酶(hydroxymethylbilane synthase (HMBS))、胺甲醯基合成酶I(carbamoyl synthetase I)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ornithine transcarbamylase (OTC))、精胺基琥珀酸合成酶(arginosuccinate synthetase)、治療精胺基琥珀酸裂解酶缺乏症之精胺基琥珀酸裂解酶(arginosuccinate lyase (ASL))、精胺酸酶(arginase)、胡索醯乙醯乙酸水解酶(fumarylacetate hydrolase)、苯丙胺酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)、恆河猴α胎兒蛋白(rhesus alpha- fetoprotein (AFP))、絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotrophin (CG))、葡萄糖-6-磷酸酶(葡萄糖-6-磷酸酶)、紫質膽質原脫胺基酶(porphobilinogen deaminase)、胱硫醚貝他合成酶(cystathione beta-synthase)、支鏈酮酸脫羧基酶(branched chain ketoacid decarboxylase)、白蛋白、異戊醯輔酶A脫氫酶(isovaleryl-coA dehydrogenase)、丙醯輔酶A羧化酶(propionyl CoA carboxylase)、甲基丙二酸單醯輔酶A變位酶(methyl malonyl CoA mutase)、戊二基輔酶A脫氫酶(glutaryl CoA dehydrogenase)、胰島素、β-葡糖苷酶(beta-glucosidase)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylate)、肝磷酸化酶(hepatic phosphorylase)、磷酸化酶激酶(phosphorylase kinase)、甘胺酸脫羧基酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化轉膜調節子(cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR))序列、及肌肉萎縮蛋白(dystrophin)基因產物[例如，微-或巨-肌肉萎縮蛋白]。又其它有用的基因產物包括酵素，如可有用於酵素替代療法(enzyme replacement therapy)，其有用於各種由於酵素活性不足而引起的疾病。例如，含甘露糖-6-磷酸的酵素可用於溶小體儲積症(lysosomal storage diseases)之治療(例如， 包括編碼β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase (GUSB))之適合的基因)。於另一例中，基因產物為泛素蛋白連接酶E3A (ubiquitin protein ligase E3A (UBE3A))。另有用的基因產物包括UDP葡萄糖醛酸基轉移酶家族1成員A1(UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A1 (UGT1A1))。
於某些具體實施例，rAAV可用於基因編輯系統中，該系統可涉及一個rAAV或多種rAAV備料的共同投予。例如，rAAV可經工程化以遞送SpCas9、SaCas9、ARCUS、Cpf1(也已知為Cas12a)、CjCas9及其它合適的基因編輯構築體。
又其它有用的基因產物包括用於治療血友病的基因產物，包括血友病B(包括因子IX)和血友病A(包括因子VIII及其變異體，例如異二聚體的輕鏈和重鏈以及B缺失的域；美國專利號6,200,560及美國專利號6,221,349)。於一些具體實施例，袖珍基因包含因子VIII重鏈的最初57個鹼基對，其編碼10個胺基酸訊息序列，以及人類生長激素(hGH)多腺苷酸化序列。於另外的具體實施例中，袖珍基因另包含A1及A2域，以及5個來自B域之N端的胺基酸、及/或B域之C端之85個胺基酸，以及A3、C1及C2域。於再其它具體實施例，提供編碼因子VIII重鏈及輕鏈之核酸於單一袖珍基因，其被編碼B域之14 胺基酸的42個核酸分隔開[美國專利號6,200,560]。
其它有用的基因產物包括非自然發生的多肽，諸如包含插入、刪除或胺基酸取代之具有非自然發生的胺基酸序列嵌合或雜合多肽。例如，於某些免疫功能受損的病患中單鏈工程化免疫球蛋白為有用的。非自然發生的基因序列之其它型式包括反義分子及催化性核酸，諸如，核糖酵素(ribozymes)，其可被用來減少目標的過表現。
基因表現的減少及/或調節對於治療以細胞過度增殖為特徵的過度增殖性疾病特別理想，如癌症和牛皮癬。目標多肽包括彼等與正常細胞相比在過度增殖細胞中專門產生或以更高水平產生的多肽。目標抗體包括由致癌基因編碼的多肽，該致癌基因例如為myb、myc、fyn、及易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk及EGRF。除了致癌基因產物作為目標抗原外，用於抗癌治療和保護療程的目標多肽包括由B細胞淋巴瘤產生的抗體的可變區及T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區，於一些具體實施例，其亦使用作為自體免疫疾病的目標抗原。其它腫瘤相關多肽可用於作為目標多肽，諸如腫瘤細胞中發現有較高水平表現的多肽，包括被單株抗體17-1A識別的多肽和葉酸結合多肽。
其它合適的治療性多肽和蛋白質包括通過賦予針對與自體免疫相關之目標的廣泛基礎的保護性免疫反應，可用於治療罹患自體免疫疾病及失調的個體的多肽和蛋白質，該目標包括細胞受體及產生「自我」導向抗體的細胞。T細胞媒介的自體免疫疾病包括類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis (RA))、多發性硬化症(multiple sclerosis (MS))、休格倫氏症候群(Sjögren's syndrome)、結節病(sarcoidosis)、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自體免疫甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis)、反應性關節炎(reactive arthritis)、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、硬皮病(scleroderma)、多發性肌炎(polymyositis)、皮肌炎(dermatomyositis)、牛皮癬、血管炎、韋格納肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎。此等疾病中的每一種皆具有與內源性抗原結合並引發與自體免疫疾病相關的炎性級聯反應的T細胞受體(TCR)。
可經由本文提供的rAAV遞送另外說明的基因用以治療例如，肝臟適應症，包括但未限於，葡萄糖-6-磷酸酶，與肝醣儲積症或缺乏1A型(GSD1)有關；磷酸烯醇式丙酮酸-羧激酶(PEPCK)，與PEPCK缺乏有關；第五型類细胞週期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5))，亦已知為絲胺酸/蘇胺酸激酶9(STK9)，與癲癇發作和嚴重的神經發育障礙有關；半乳糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶(galactose-1 phosphate uridyl transferase)，與半乳糖血症(galactosemia)有關；苯丙胺酸羥化酶(PAH)，與苯丙酮尿症(phenylketonuria (PKU))有關；與原發性高草酸鹽尿症第1型(Primary Hyperoxaluria Type 1)有關的基因產物，包括羥基酸氧化酶1(Hydroxyacid Oxidase 1 (GO/HAO1))及AGXT，支鏈α-酮酸脫氫酶(branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase)，包括BCKDH、BCKDH-E2、BAKDH-E1a及BAKDH-E1b，與楓糖尿症(Maple syrup urine disease)有關；延胡索醯乙醯乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase)，與酪胺酸血症第1型有關；甲基丙二酸輔酶A變位酶(methylmalonyl-CoA mutase)，與甲基丙二酸血症(methylmalonic academia)有關；中鏈醯輔酶A脫氫酶(medium chain acyl CoA dehydrogenase)，與中鏈醯輔酶A缺乏症有關；鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)，與鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症有關；精胺基琥珀酸合成酶(argininosuccsinate synthase (ASS1))，與瓜胺酸血症(citrullinemia)有關；卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT))缺乏症；甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia (MMA))；與尼曼匹克症第Cl型(Niemann-Pick disease, type C1))有關的NPC1；丙酸血症(propionic academia (PA))；與轉甲狀腺素蛋白相關遺傳性類澱粉變性(Transthyretin (TTR)-related Hereditary Amyloidosis)有關的TTR；低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白質，與家族性高膽固醇血症(FH)有關，LDLR變異體，諸如彼等描述於WO 2015/164778者；PCSK9；ApoE及ApoC蛋白，與癡呆有關；尿核苷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucouronosyltransferase)，與克-納氏症(Crigler-Najjar disease)有關；腺苷脫胺酶(adenosine deaminase)，與嚴重複合型免疫缺乏症(severe combined immunodeficiency disease)有關；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)，與痛風及萊希-尼亨症候群(Lesch-Nyan syndrome)有關；生物素酶(biotimidase)，與生物素酶缺乏症有關；與法布瑞氏症(Fabry disease)有關的α-半乳糖苷酶(Aalpha-半乳糖苷酶 A (a-Gal A))；與GM1神經節苷脂儲積症有關的β-半乳糖苷酶(GLB1)；與威爾森氏症(Wilson’s Disease)有關的ATP7B；β-葡萄糖腦甘酯(beta-glucocerebrosidase)，與高雪氏症(Gaucher disease)第2及3型有關；過氧化體膜蛋白(peroxisome membrane protein)70 kDa，與齊氏症候群(Zellweger syndrome)有關；與異染性白質失養症(metachromatic leukodystrophy)有關的芳基硫酸酯酶A (ARSA)，與克拉培氏病(Krabbe disease)有關的半乳糖腦苷酯酶(galactocerebrosidase (GALC))酵素，與龐貝氏症(Pompe disease)有關的α-葡萄糖苷酶(GAA)；神經髓磷脂酶(sphingomyelinase (SMPD1))基因，與A型尼曼匹克氏症(Nieman Pick disease type A)有關；與成人發作第II型瓜胺酸血症(CTLN2)有關的精胺基琥珀酸合成酶；與尿素循環代謝障礙有關的胺甲醯基-磷酸合成酶1(CPS1)；運動神經元存活蛋白((survival motor neuron (SMN))protein)，與脊髓性肌肉萎縮症有關；與法伯脂肪肉芽腫病(Farber lipogranulomatosis)有關的神經醯胺酶(ceramidase)；與GM2神經節苷脂儲積症及Tay-Sachs及Sandhoff病有關的β-己醣胺酶(b-hexosaminidase)；與天門冬醯胺基葡糖尿(aspartyl-glucosaminuria)有關的天門冬醯胺基葡萄糖酶(aspartylglucosaminidase)；與岩藻糖沉積症(fucosidosis)有關的α-岩藻糖苷酶(α-fucosidase)；與α-甘露糖沉積症有關的α-甘露糖苷酶(α-mannosidase)；紫質膽質原脫胺基酶，與急性間歇性紫質症(acute intermittent porphyria (AIP))有關；用於α-1抗胰蛋白酶缺乏(肺氣腫(emphysema))之治療之α-1抗胰蛋白酶；用於治療因地中海貧血或腎衰竭引起的貧血之促紅血球形成素(erythropoietin)；治療缺血性疾病(ischemic diseases)之血管內皮生長因子、促血管生成素-1(angiopoietin-1)及纖維母細胞生長因子；及治療於下列所見的血管阻塞之凝血酶調節素(thrombomodulin)及組織因子路徑抑制劑，例如，動脈粥樣硬化、血栓症或栓塞；芳香族胺基酸脫羧酶(AADC)，及治療帕金森氏症之酪胺酸羥化酶(TH)；β腎上腺素受體，受磷蛋白(phospholamban)、肌(內)質網腺苷三磷酸酶-2(sarco(endo)plasmic reticulum adenosine triphosphatase-2 (SERCA2))及心臟腺苷酸環化酶(cardiac adenylyl cyclase)之反義或突變型用於充血性心臟衰竭的治療；治療各種癌症之腫瘤抑制基因諸如p53；胞激素，諸如各種介白素之一者，用於治療炎症及免疫疾病以及癌症；治療肌肉營養不良之肌肉萎縮蛋白(dystrophin)或迷你肌肉萎縮蛋白(minidystrophin)及肌肉萎縮相關蛋白(utrophin)或迷你肌肉萎縮相關蛋白(miniutrophin)；及治療糖尿病之胰島素或GLP-1。
另外有興趣的基因及疾病包括，例如，與疾病有關的肌張力異常蛋白(dystonin)基因，如遺傳性第IV型感覺及自主神經病變(Hereditary Sensory and Autonomic Neuropathy Type VI)(DST基因編碼肌張力異常蛋白；由於蛋白質的大小(~7570 aa)可能需要雙重AAV載體；SCN9A相關疾病，其中功能突變體的喪失導致無法感覺疼痛，而功能突變體的獲得引起疼痛狀況，如肢端紅痛症(erythromelagia)。另一情況係由於NEFL基因(神經纖維絲輕鏈)發生突變而導致的恰克-馬利-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth(CMT))1F和2E型，其特徵為進行性周圍運動和感覺神經病變，具有可變的臨床和電生理表現。與CMT有關的其它基因產物包括粒線體融合蛋白2(mitofusin 2 (MFN2))。
於某些具體實施例，本文所述rAAV可用於治療黏多醣症(MPS)。此種rAAV可含有攜帶編碼治療MPS I (赫勒氏(Hurler)、赫勒-施艾氏(Hurler-Scheie)及施艾氏症候群)之α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase)(IDUA)之核酸序列；編碼治療MPS II (韓特氏症(Hunter syndrome))之己醛醣酸鹽-2-硫酸脂酶之核酸序列；編碼治療MPSIII A、B、C、及D (聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo syndrome))之磺醯胺酶(sulfamidase)(SGSH)之核酸序列；編碼治療MPS IV A及B (莫奎歐氏症(Morquio syndrome))之N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶(GALNS)之核酸序列；編碼治療MPS VI (馬－拉二氏症(Maroteaux-Lamy syndrome))之芳基硫酸酯酶B (ARSB)之核酸序列；編碼治療MPSI IX (玻尿酸酶缺乏)之玻尿酸酶之核酸序列及編碼治療MPS VII (Sly syndrome)之β-葡萄醣醛酸酶之核酸序列。
免疫原性轉基因 於一些具體實施例，可使用包含編碼與癌症有關的基因產物(例如，腫瘤抑制物)之核酸的rAAV載體治療癌症，藉由投予攜帶rAAV載體之rAAV至具有癌症的受試者。於一些具體實施例，包含編碼抑制與癌症有關的基因產物的表現(例如，致癌基因)之小干擾核酸(例如，shRNAs、miRNAs)之核酸的rAAV載體可被使用於治療癌症，藉由投予攜帶該rAAV載體之rAAV至具有癌症的受試者。於一些具體實施例，可使用包含編碼與癌症有關的基因產物的核酸或抑制與癌症有關的基因表現的功能性RNA的rAAV載體於研究目的，例如，研究癌症或確定治療癌症的療法。下列為已知與癌症發展有關的示例性基因的非限制列表(例如，致癌基因及腫瘤抑制物)：AARS、ABCB1、ABCC4、ABI2、ABL1、ABL2、ACK1、ACP2、ACY1、ADSL、AK1、AKR1C2、AKT1、ALB、ANPEP、ANXA5、ANXA7、AP2M1、APC、ARHGAP5、ARHGEF5、ARID4A、ASNS、ATF4、ATM、ATP5B、ATP5O、AXL、BARD1、BAX、BCL2、BHLHB2、BLMH、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTK、CANX、CAP1、CAPN1、CAPNS1、CAV1、CBFB、CBLB、CCL2、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCT5、CCYR61、CD24、CD44、CD59、CDC20、CDC25、CDC25A、CDC25B、CDC2L5、CDK10、CDK4、CDK5、CDK9、CDKL1、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2D、CEBPG、CENPC1、CGRRF1、CHAF1A、CIB1、CKMT1、CLK1、CLK2、CLK3、CLNS1A、CLTC、COL1A1、COL6A3、COX6C、COX7A2、CRAT、CRHR1、CSF1R、CSK、CSNK1G2、CTNNA1、CTNNB1、CTPS、CTSC、CTSD、CUL1、CYR61、DCC、DCN、DDX10、DEK、DHCR7、DHRS2、DHX8、DLG3、DVL1、DVL3、E2F1、E2F3、E2F5、EGFR、EGR1、EIF5、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC3、ETV1、ETV3、ETV6、F2R、FASTK、FBN1、FBN2、FES、FGFR1、FGR、FKBP8、FN1、FOS、FOSL1、FOSL2、FOXG1A、FOXO1A、FRAP1、FRZB、FTL、FZD2、FZD5、FZD9、G22P1、GAS6、GCN5L2、GDF15、GNA13、GNAS、GNB2、GNB2L1、GPR39、GRB2、GSK3A、GSPT1、GTF2I、HDAC1、HDGF、HMMR、HPRT1、HRB、HSPA4、HSPA5、HSPA8、HSPB1、HSPH1、HYAL1、HYOU1、ICAM1、ID1、ID2、IDUA、IER3、IFITM1、IGF1R、IGF2R、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5、IL1B、ILK、ING1、IRF3、ITGA3、ITGA6、ITGB4、JAK1、JARID1A、JUN、JUNB、JUND、K-ALPHA-1、KIT、KITLG、KLK10、KPNA2、KRAS2、KRT18、KRT2A、KRT9、LAMB1、LAMP2、LCK、LCN2、LEP、LITAF、LRPAP1、LTF、LYN、LZTR1、MADH1、MAP2K2、MAP3K8、MAPK12、MAPK13、MAPKAPK3、MAPRE1、MARS、MAS1、MCC、MCM2、MCM4、MDM2、MDM4、MET、MGST1、MICB、MLLT3、MME、MMP1、MMP14、MMP17、MMP2、MNDA、MSH2、MSH6、MT3、MYB、MYBL1、MYBL2、MYC、MYCL1、MYCN、MYD88、MYL9、MYLK、NEO1、NF1、NF2、NFKB1、NFKB2、NFSF7、NID、NINE、NMBR、NME1、NME2、NME3、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH4、NPM1、NQO1、NR1D1、NR2F1、NR2F6、NRAS、NRG1、NSEP1、OSM、PA2G4、PABPC1、PCNA、PCTK1、PCTK2、PCTK3、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDPK1、PEA15、PFDN4、PFDN5、PGAM1、PHB、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIM1、PKM2、PKMYT1、PLK2、PPARD、PPARG、PPIH、PPP1CA、PPP2R5A、PRDX2、PRDX4、PRKAR1A、PRKCBP1、PRNP、PRSS15、PSMA1、PTCH、PTEN、PTGS1、PTMA、PTN、PTPRN、RAB5A、RAC1、RAD50、RAF1、RALBP1、RAP1A、RARA、RARB、RASGRF1、RB1、RBBP4、RBL2、REA、REL、RELA、RELB、RET、RFC2、RGS19、RHOA、RHOB、RHOC、RHOD、RIPK1、RPN2、RPS6 KB1、RRM1、SARS、SELENBP1、SEMA3C、SEMA4D、SEPP1、SERPINH1、SFN、SFPQ、SFRS7、SHB、SHH、SIAH2、SIVA、SIVA TP53、SKI、SKIL、SLC16A1、SLC1A4、SLC20A1、SMO、神經鞘磷脂磷酸二脂酶1(sphingomyelin phosphodiesterase 1 (SMPD1))、SNAI2、SND1、SNRPB2、SOCS1、SOCS3、SOD1、SORT1、SPINT2、SPRY2、SRC、SRPX、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5B、STC1、TAF1、TBL3、TBRG4、TCF1、TCF7L2、TFAP2C、TFDP1、TFDP2、TGFA、TGFB1、TGFBI、TGFBR2、TGFBR3、THBS1、TIE、TIMP1、TIMP3、TJP1、TK1、TLE1、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF6、TNFSF7、TNK1、TOB1、TP53、TP53BP2、TP5313、TP73、TPBG、TPT1、TRADD、TRAM1、TRRAP、TSG101、TUFM、TXNRD1、TYRO3、UBC、UBE2L6、UCHL1、USP7、VDAC1、VEGF、VHL、VIL2、WEE1、WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WT1、XRCC1、YES1、YWHAB、YWHAZ、ZAP70、及ZNF9。
rAAV載體可包含轉基因、編碼調節細胞凋亡之蛋白質或功能性RNA的核酸。下列為與細胞凋亡有關基因的非限制列表且編碼此等基因的產物的核酸及其類似物及編碼抑制此等基因表現的小干擾核酸(例如，shRNAs、miRNAs)及其類似物，於本發明之某些具體實施例有用於作為轉基因：RPS27A、ABL1、AKT1、APAF1、BAD、BAG1、BAG3、BAG4、BAK1、BAX、BCL10、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L10、BCL2L11、BCL2L12、BCL2L13、BCL2L2、BCLAF1、BFAR、BID、BIK、NAIP、BIRC2、BIRC3、XIAP、BIRC5、BIRC6、BIRC7、BIRC8、BNIP1、BNIP2、BNIP3、BNIP3L、BOK、BRAF、CARD10、CARD11、NLRC4、CARD14、NOD2、NOD1、CARD6、CARDS、CARDS、CASP1、CASP10、CASP14、CASP2、CASP3、CASP4、CASP5、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CFLAR、CIDEA、CIDEB、CRADD、DAPK1、DAPK2、DFFA、DFFB、FADD、GADD45A、GDNF、HRK、IGF1R、LTA、LTBR、MCL1、NOL3、PYCARD、RIPK1、RIPK2、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF14、TNFRSF19、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF25、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、TNFRSF9、TNFSF10、TNFSF14、TNFSF18、CD40LG、FASLG、CD70、TNFSF8、TNFSF9、TP53、TP53BP2、TP73、TP63、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、及TRAF5。
有用的轉基因產物亦包括miRNAs。miRNAs及其它小干擾核酸通過目標信使RNA(mRNA)的目標RNA轉錄物裂解/降解或轉譯抑制來調節基因表現。miRNA天然表現，通常作為最終的19-25個非轉譯RNA產物。miRNA透過與目標mRNA的3'非轉譯區(UTR)進行序列特異性相互作用來展現其活性。此等內源表現的miRNA形成髮夾前驅體，隨後被加工成miRNA雙套，並進一步加工成「成熟」的單股miRNA分子。此成熟miRNA引導多蛋白複合物miRISC，其根據與成熟miRNA的互補性，識別目標miRNA的目標位置，例如，於3′ UTR區。
於本發明之某些具體實施例中，下列miRNA基因及其同源物的非限制性列表有用於作為轉基因或作為轉基因編碼的小干擾核酸之目標(例如，miRNA海綿、反義寡核苷酸、TuD RNAs)：hsa-let-7a、hsa-let-7a*、hsa-let-7b、hsa-let-7b*、hsa-let-7c、hsa-let-7c*、hsa-let-7d、hsa-let-7d*、hsa-let-7e、hsa-let-7e*、hsa-let-7f、hsa-let-7f-1*、hsa-let-7f-2*、hsa-let-7g、hsa-let-7g*、hsa-let-71、hsa-let-71*、hsa-miR-1、hsa-miR-100、hsa-miR-100*、hsa-miR-101、hsa-miR-101*、hsa-miR-103、hsa-miR-105、hsa-miR-105*、hsa-miR-106a、hsa-miR-106a*、hsa-miR-106b、hsa-miR-106b*、hsa-miR-107、hsa-miR-10a、hsa-miR-10a*、hsa-miR-10b、hsa-miR-10b*、hsa-miR-1178、hsa-miR-1179、hsa-miR-1180、hsa-miR-1181、hsa-miR-1182、hsa-miR-1183、hsa-miR-1184、hsa-miR-1185、hsa-miR-1197、hsa-miR-1200、hsa-miR-1201、hsa-miR-1202、hsa-miR-1203、hsa-miR-1204、hsa-miR-1205、hsa-miR-1206、hsa-miR-1207-3p、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1208、hsa-miR-122、hsa-miR-122*、hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-1225-3p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1226、hsa-miR-1226*、hsa-miR-1227、hsa-miR-1228、hsa-miR-1228*、hsa-miR-1229、hsa-miR-1231、hsa-miR-1233、hsa-miR-1234、hsa-miR-1236、hsa-miR-1237、hsa-miR-1238、hsa-miR-124、hsa-miR-124*、hsa-miR-1243、hsa-miR-1244、hsa-miR-1245、hsa-miR-1246、hsa-miR-1247、hsa-miR-1248、hsa-miR-1249、hsa-miR-1250、hsa-miR-1251、hsa-miR-1252、hsa-miR-1253、hsa-miR-1254、hsa-miR-1255a、hsa-miR-1255b、hsa-miR-1256、hsa-miR-1257、hsa-miR-1258、hsa-miR-1259、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b、hsa-miR-125b-1*、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-126、hsa-miR-126*、hsa-miR-1260、hsa-miR-1261、hsa-miR-1262、hsa-miR-1263、hsa-miR-1264、hsa-miR-1265、hsa-miR-1266、hsa-miR-1267、hsa-miR-1268、hsa-miR-1269、hsa-miR-1270、hsa-miR-1271、hsa-miR-1272、hsa-miR-1273、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-1274a、hsa-miR-1274b、hsa-miR-1275、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-1276、hsa-miR-1277、hsa-miR-1278、hsa-miR-1279、hsa-miR-128、hsa-miR-1280、hsa-miR-1281、hsa-miR-1282、hsa-miR-1283、hsa-miR-1284、hsa-miR-1285、hsa-miR-1286、hsa-miR-1287、hsa-miR-1288、hsa-miR-1289、hsa-miR-129*、hsa-miR-1290、hsa-miR-1291、hsa-miR-1292、hsa-miR-1293、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-1294、hsa-miR-1295、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-1296、hsa-miR-1297、hsa-miR-1298、hsa-miR-1299、hsa-miR-1300、hsa-miR-1301、hsa-miR-1302、hsa-miR-1303、hsa-miR-1304、hsa-miR-1305、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307、hsa-miR-1308、hsa-miR-130a、hsa-miR-130a*、hsa-miR-130b、hsa-miR-130b*、hsa-miR-132、hsa-miR-132*、hsa-miR-1321、hsa-miR-1322、hsa-miR-1323、hsa-miR-1324、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-134、hsa-miR-135a、hsa-miR-135a*、hsa-miR-135b、hsa-miR-135b*、hsa-miR-136、hsa-miR-136*、hsa-miR-137、hsa-miR-138、hsa-miR-138-1*、hsa-miR-138-2*、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-141、hsa-miR-141*、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-143*、hsa-miR-144、hsa-miR-144*、hsa-miR-145、hsa-miR-145*、hsa-miR-146a、hsa-miR-146a*、hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-147、hsa-miR-147b、hsa-miR-148a、hsa-miR-148a*、hsa-miR-148b、hsa-miR-148b*、hsa-miR-149、hsa-miR-149*、hsa-miR-150、hsa-miR-150*、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-152、hsa-miR-153、hsa-miR-154、hsa-miR-154*、hsa-miR-155、hsa-miR-155*、hsa-miR-15a、hsa-miR-15a*、hsa-miR-15b、hsa-miR-15b*、hsa-miR-16、hsa-miR-16-1*、hsa-miR-16-2*、hsa-miR-17、hsa-miR-17*、hsa-miR-181a、hsa-miR-181a*、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-181b、hsa-miR-181c、hsa-miR-181c*、hsa-miR-181d、hsa-miR-182、hsa-miR-182*、hsa-miR-1825、hsa-miR-1826、hsa-miR-1827、hsa-miR-183、hsa-miR-183*、hsa-miR-184、hsa-miR-185、hsa-miR-185*、hsa-miR-186、hsa-miR-186*、hsa-miR-187、hsa-miR-187*、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-18a*、hsa-miR-18b、hsa-miR-18b*、hsa-miR-190、hsa-miR-190b、hsa-miR-191、hsa-miR-191*、hsa-miR-192、hsa-miR-192*、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193b、hsa-miR-193b*、hsa-miR-194、hsa-miR-194*、hsa-miR-195、hsa-miR-195*、hsa-miR-196a、hsa-miR-196a*、hsa-miR-196b、hsa-miR-197、hsa-miR-198、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-19a、hsa-miR-19a*、hsa-miR-19b、hsa-miR-19b-1*、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-200a、hsa-miR-200a*、hsa-miR-200b、hsa-miR-200b*、hsa-miR-200c、hsa-miR-200c*、hsa-miR-202、hsa-miR-202*、hsa-miR-203、hsa-miR-204、hsa-miR-205、hsa-miR-206、hsa-miR-208a、hsa-miR-208b、hsa-miR-20a、hsa-miR-20a*、hsa-miR-20b、hsa-miR-20b*、hsa-miR-21、hsa-miR-21*、hsa-miR-210、hsa-miR-211、hsa-miR-212、hsa-miR-214、hsa-miR-214*、hsa-miR-215、hsa-miR-216a、hsa-miR-216b、hsa-miR-217、hsa-miR-218、hsa-miR-218-1*、hsa-miR-218-2*、hsa-miR-219-1-3p、hsa-miR-219-2-3p、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-22*、hsa-miR-220a、hsa-miR-220b、hsa-miR-220c、hsa-miR-221、hsa-miR-221*、hsa-miR-222、hsa-miR-222*、hsa-miR-223、hsa-miR-223*、hsa-miR-224、hsa-miR-23a、hsa-miR-23a*、hsa-miR-23b、hsa-miR-23b*、hsa-miR-24、hsa-miR-24-1*、hsa-miR-24-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-25*、hsa-miR-26a、hsa-miR-26a-1*、hsa-miR-26a-2*、hsa-miR-26b、hsa-miR-26b*、hsa-miR-27a、hsa-miR-27a*、hsa-miR-27b、hsa-miR-27b*、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-297、hsa-miR-298、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29a*、hsa-miR-29b、hsa-miR-296-1*、hsa-miR-296-2*、hsa-miR-29c、hsa-miR-29c*、hsa-miR-300、hsa-miR-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-302a、hsa-miR-302a*、hsa-miR-302b、hsa-miR-302b*、hsa-miR-302c、hsa-miR-302c*、hsa-miR-302d、hsa-miR-302d*、hsa-miR-302e、hsa-miR-302f、hsa-miR-30a、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30b、hsa-miR-30b*、hsa-miR-30c、hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-30d、hsa-miR-30d*、hsa-miR-30e、hsa-miR-30e*、hsa-miR-31、hsa-miR-31*、hsa-miR-32、hsa-miR-32*、hsa-miR-320a、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-320d、hsa-miR-323-3p、hsa-miR-323-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-326、hsa-miR-328、hsa-miR-329、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-335、hsa-miR-335*、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-33a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-33b、hsa-miR-33b*、hsa-miR-340、hsa-miR-340*、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-342-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-346、hsa-miR-34a、hsa-miR-34a*、hsa-miR-34b、hsa-miR-34b*、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-363、hsa-miR-363*、hsa-miR-365、hsa-miR-367、hsa-miR-367*、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-370、hsa-miR-371-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-373*、hsa-miR-374a、hsa-miR-374a*、hsa-miR-374b、hsa-miR-374b*、hsa-miR-375、hsa-miR-376a、hsa-miR-376a*、hsa-miR-376b、hsa-miR-376c、hsa-miR-377、hsa-miR-377*、hsa-miR-378、hsa-miR-378*、hsa-miR-379、hsa-miR-379*、hsa-miR-380、hsa-miR-380*、hsa-miR-381、hsa-miR-382、hsa-miR-383、hsa-miR-384、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-410、hsa-miR-411、hsa-miR-411*、hsa-miR-412、hsa-miR-421、hsa-miR-422a、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-424*、hsa-miR-425、hsa-miR-425*、hsa-miR-429、hsa-miR-431、hsa-miR-431*、hsa-miR-432、hsa-miR-432*、hsa-miR-433、hsa-miR-448、hsa-miR-449a、hsa-miR-449b、hsa-miR-450a、hsa-miR-450b-3p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-452、hsa-miR-452*、hsa-miR-453、hsa-miR-454、hsa-miR-454*、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-484、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-487a、hsa-miR-487b、hsa-miR-488、hsa-miR-488*、hsa-miR-489、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-490-5p、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-492、hsa-miR-493、hsa-miR-493*、hsa-miR-494、hsa-miR-495、hsa-miR-496、hsa-miR-497、hsa-miR-497*、hsa-miR-498、hsa-miR-499-3p、hsa-miR-499-5p、hsa-miR-500、hsa-miR-500*、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-501-5p、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-503、hsa-miR-504、hsa-miR-505、hsa-miR-505*、hsa-miR-506、hsa-miR-507、hsa-miR-508-3p、hsa-miR-508-5p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-509-3p、hsa-miR-509-5p、hsa-miR-510、hsa-miR-511、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-513a-3p、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-513b、hsa-miR-513c、hsa-miR-514、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516b、hsa-miR-517*、hsa-miR-517a、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c、hsa-miR-518c*、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518e、hsa-miR-518e*、hsa-miR-518f、hsa-miR-518f*、hsa-miR-519a、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e、hsa-miR-519e*、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-521、hsa-miR-522、hsa-miR-523、hsa-miR-524-3p、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-526b、hsa-miR-526b*、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-539、hsa-miR-541、hsa-miR-541*、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-544、hsa-miR-545、hsa-miR-545*、hsa-miR-548a-3p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-548b-3p、hsa-miR-5486-5p、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-548e、hsa-miR-548f、hsa-miR-548g、hsa-miR-548h、hsa-miR-548i、hsa-miR-548j、hsa-miR-548k、hsa-miR-5481、hsa-miR-548m、hsa-miR-548n、hsa-miR-548o、hsa-miR-548p、hsa-miR-549、hsa-miR-550、hsa-miR-550*、hsa-miR-551a、hsa-miR-551b、hsa-miR-551b*、hsa-miR-552、hsa-miR-553、hsa-miR-554、hsa-miR-555、hsa-miR-556-3p、hsa-miR-556-5p、hsa-miR-557、hsa-miR-558、hsa-miR-559、hsa-miR-561、hsa-miR-562、hsa-miR-563、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-567、hsa-miR-568、hsa-miR-569、hsa-miR-570、hsa-miR-571、hsa-miR-572、hsa-miR-573、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-575、hsa-miR-576-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-577、hsa-miR-578、hsa-miR-579、hsa-miR-580、hsa-miR-581、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-582-5p、hsa-miR-583、hsa-miR-584、hsa-miR-585、hsa-miR-586、hsa-miR-587、hsa-miR-588、hsa-miR-589、hsa-miR-589*、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-592、hsa-miR-593、hsa-miR-593*、hsa-miR-595、hsa-miR-596、hsa-miR-597、hsa-miR-598、hsa-miR-599、hsa-miR-600、hsa-miR-601、hsa-miR-602、hsa-miR-603、hsa-miR-604、hsa-miR-605、hsa-miR-606、hsa-miR-607、hsa-miR-608、hsa-miR-609、hsa-miR-610、hsa-miR-611、hsa-miR-612、hsa-miR-613、hsa-miR-614、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-616、hsa-miR-616*、hsa-miR-617、hsa-miR-618、hsa-miR-619、hsa-miR-620、hsa-miR-621、hsa-miR-622、hsa-miR-623、hsa-miR-624、hsa-miR-624*、hsa-miR-625、hsa-miR-625*、hsa-miR-626、hsa-miR-627、hsa-miR-628-3p、hsa-miR-628-5p、hsa-miR-629、hsa-miR-629*、hsa-miR-630、hsa-miR-631、hsa-miR-632、hsa-miR-633、hsa-miR-634、hsa-miR-635、hsa-miR-636、hsa-miR-637、hsa-miR-638、hsa-miR-639、hsa-miR-640、hsa-miR-641、hsa-miR-642、hsa-miR-643、hsa-miR-644、hsa-miR-645、hsa-miR-646、hsa-miR-647、hsa-miR-648、hsa-miR-649、hsa-miR-650、hsa-miR-651、hsa-miR-652、hsa-miR-653、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-655、hsa-miR-656、hsa-miR-657、hsa-miR-658、hsa-miR-659、hsa-miR-660、hsa-miR-661、hsa-miR-662、hsa-miR-663、hsa-miR-663b、hsa-miR-664、hsa-miR-664*、hsa-miR-665、hsa-miR-668、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-675、hsa-miR-7、hsa-miR-708、hsa-miR-708*、hsa-miR-7-1*、hsa-miR-7-2*、hsa-miR-720、hsa-miR-744、hsa-miR-744*、hsa-miR-758、hsa-miR-760、hsa-miR-765、hsa-miR-766、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-767-5p、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-768-5p、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-770-5p、hsa-miR-802、hsa-miR-873、hsa-miR-874、hsa-miR-875-3p、hsa-miR-875-5p、hsa-miR-876-3p、hsa-miR-876-5p、hsa-miR-877、hsa-miR-877*、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-886-3p、hsa-miR-886-5p、hsa-miR-887、hsa-miR-888、hsa-miR-888*、hsa-miR-889、hsa-miR-890、hsa-miR-891a、hsa-miR-891b、hsa-miR-892a、hsa-miR-892b、hsa-miR-9、hsa-miR-9*、hsa-miR-920、hsa-miR-921、hsa-miR-922、hsa-miR-923、hsa-miR-924、hsa-miR-92a、hsa-miR-92a-1*、hsa-miR-92a-2*、hsa-miR-92b、hsa-miR-92b*、hsa-miR-93、hsa-miR-93*、hsa-miR-933、hsa-miR-934、hsa-miR-935、hsa-miR-936、hsa-miR-937、hsa-miR-938、hsa-miR-939、hsa-miR-940、hsa-miR-941、hsa-miR-942、hsa-miR-943、hsa-miR-944、hsa-miR-95、hsa-miR-96、hsa-miR-96*、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-99a*、hsa-miR-99b、及hsa-miR-99b*。例如，可能感興趣的是靶向8號染色體開放閱讀框(open reading frame)72(C9orf72)的miRNA，其表現與肌萎縮性側索硬化(ALS)相關的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase (SOD1))。
miRNA抑制了其靶向的mRNA的功能，結果抑制mRNA編碼的多肽的表現。如此，阻斷(部分或全部)miRNA的活性(例如使miRNA沉默)可以有效地誘導或恢復其表現被抑制的多肽的表現(活性化該多肽)。於一具體實施例，透過許多方法中之任一種，藉由於細胞中抑制miRNA活性而達成miRNA之目標之mRNA編碼的多肽之活性化。例如，藉由與小干擾核酸(例如，反義寡核苷酸、miRNA海綿、TuD RNA)雜交可達成miRNA的活性的阻斷，該小干擾核酸與miRNA互補或實質上互補，因而阻斷miRNA與其目標mRNA的相互作用。如本文所使用，質實上與miRNA互補的小干擾核酸為能夠與miRNA雜交者，且阻斷miRNA的活性。於一些具體實施例，實質上與miRNA互補的小干擾核酸為除了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個鹼基外，皆與miRNA互補的小干擾核酸。「miRNA抑制劑」為阻斷miRNA功能、表現及/或加工的試劑。例如，此等分子包括但未限於，抑制miRNA與Drosha複合物相互作用的微小RNA特異性反義、微小RNA海綿、強誘餌(tough decoy)RNAs (TuD RNAs)及微小RNA寡核苷酸(雙股、髮夾、短寡核苷酸)。
又其它有用的轉基因可包括彼等編碼免疫球蛋白的基因，其賦予對病原體的被動免疫力。「免疫球蛋白分子」為包含共價結合在一起並且能夠與抗原特異性結合的免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈之免疫活性部分的蛋白質。免疫球蛋白分子為任一類型(例如， IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如， IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。於本文中術語「抗體」及「免疫球蛋白」可交互使用。
「免疫球蛋白重鏈」為一含有免疫球蛋白之抗原結合域(antigen binding domain)之至少一部分及免疫球蛋白重鏈可變區之至少一部分或免疫球蛋白重鏈恆定區之至少一部分之多肽。如此，免疫球蛋白衍生的重鏈與免疫球蛋白基因超家族的成員具有顯著的胺基酸序列同源性區域。例如，Fab片段中的重鏈為免疫球蛋白衍生的重鏈。
「免疫球蛋白輕鏈」為一含有免疫球蛋白之抗原結合域之至少一部分及免疫球蛋白輕鏈可變區之至少一部分或免疫球蛋白輕鏈恆定區之至少一部分之多肽。如此，免疫球蛋白衍生的輕鏈與免疫球蛋白基因超家族的成員具有顯著的胺基酸序列同源性區域。
「免疫黏附素(immunoadhesin)」為一嵌合、類抗體的分子，其將結合蛋白質的功能域(通常為受體、配位體、或細胞黏附分子)，與免疫球蛋白恆定域(該免疫球蛋白恆定域通常包括鉸鏈區域及Fc區域)結合。
「片段抗原結合(fragment antigen-binding)」(Fab)片段」係與抗原結合的抗體上的區域。其係由重鏈及輕鏈之每一者的一個恆定區與一個可變區組成。
基於尋求針對其進行保護的疾病的致病物(病原)選擇抗病原構築體。此等病原可為病毒、細菌或真菌來源，並且可用於預防人類感染人類疾病，或用於非人類哺乳動物或其它動物以預防獸醫疾病。
rAAV可包括編碼抗體的基因，特別是針對病毒病原的中和抗體。此類抗病毒抗體可包括針對A型流感、B型流感及C型流感中的一種或多種的抗流感抗體。A型病毒為最具毒性的人類病原體。與大流行有關的A型流感的血清型包括：H1N1，導致了1918年的西班牙流感和2009年的豬流感；H2N2，導致了1957年的亞洲流感；H3N2，導致了1968年香港流感；H5N1，導致了2004年禽流感；H7N7；H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；及H10N7。其它目標病原性病毒包括：沙狀病毒(arenaviruses)(包括funinvirus、馬丘波病毒(Machupo virus)及賴薩病毒(Lassa virus))、絲狀病毒(filoviruse)(包括馬堡病毒(Marburg virus)及依波拉病毒(Ebola virus))、漢他病毒(hantavirus)、微小病毒科(picornaviridae)(包括鼻病毒(rhinovirus)、ECHO病毒(echovirus))、冠狀病毒(coronavirus)、副黏液病毒(paramyxovirus)、麻疹病毒屬(morbillivirus)、呼吸道融合病毒(respiratory synctial virus)、披衣病毒(togavirus)、柯沙奇病毒(coxsackievirus)、JC病毒、小病毒(parvovirus)B19、副流感病毒、腺病毒、里奧病毒(reoviruses)、天花(主天花病毒(Variola major (Smallpox))及來自痘病毒科的牛痘(Vaccinia)(Cowpox)、及水痘帶狀皰狀病毒(varicella-zoster)(假性狂犬病(pseudorabies))。由沙狀病毒科的成員(賴薩熱)(該科亦與淋巴球性脈絡叢腦膜炎(Lymphocytic choriomeningitis (LCM)))、絲狀病毒(依波拉病毒)、及漢他病毒(puremala)引起的病毒出血熱。微小病毒的成員(鼻病毒之亞科)與人類普通感冒有關。冠狀病毒科，包括許多非人類病毒，如傳染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性腸胃病毒(豬)、豬血凝素腦脊髓炎病毒(豬)、貓傳染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠狀病毒(貓)、犬冠狀病毒(狗)。已推定人類呼吸道冠狀病毒與普通感冒、非A、B或C型肝炎及突發性急性呼吸道症候群(SARS)有關。副黏液病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、德國麻疹病毒屬(rubulavirus)(腮腺炎病毒(mumps virus)、型副流感病毒、4型副流感病毒、新城病毒(Newcastle disease virus)(雞)、牛瘟、麻疹病毒屬(morbillivirus)，其包括麻疹和犬瘟熱，及肺炎病毒屬(pneumovirus)，其包括呼吸道融合病毒(RSV)。小病毒科包括貓小病毒(貓腸炎)、貓泛白血球減少症病毒、犬小病毒、及豬小病毒。腺病毒科包括病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)，其引起呼吸道疾病。如此，於某些具體實施例，如本文所述之rAAV載體可為經工程化以表現抗依波拉抗體，例如，2G4、4G7、13C6、抗流感抗體，例如，FI6、CR8033、及抗RSV抗體，例如，帕利珠單抗(palivizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)。亦可選擇針對細菌病原體之中和抗體構築體用於本發明。於一具體實施例，中和抗體構築體係針對細菌本身。於另一具體實施例，中和抗體構築體係針對由細菌所產生的毒素。空氣傳播的細菌病原之例包括例如，腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis )(腦膜炎)、克雷白氏肺炎(Klebsiella pneumonia )(肺炎)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )(肺炎)、類寄疽假單胞菌(Pseudomonas pseudomallei )(肺炎)、鼻疽假單胞菌(Pseudomonas mallei )(肺炎)、不動桿菌(Acinetobacter)(肺炎)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis )、腔隙莫拉菌(Moraxella lacunata )、產鹼桿菌屬(Alkaligenes )、心桿菌屬(Cardiobacterium )、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )(流感)、副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae )、百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis )(百日咳)、土拉文氏菌(Francisella tularensis )(肺炎/發熱)、退伍軍人菌(Legionella pneumonia )(退伍軍人病)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci )(肺炎)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae )(肺炎)、結核分枝桿菌(結核病(TB))、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii )(TB)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium )(肺炎)、星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides )(肺炎)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis )(炭疽)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )(肺炎)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )(猩紅熱)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )(肺炎)、白喉桿菌(Corynebacteria diphtheria )(白喉)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae )(肺炎)。
rAAV可包括編碼抗體的基因，特別是針對如炭疽之致病因子(一種由炭疽桿菌所產生的毒素)的細菌病原的中和抗體。已描述針對保護劑(PA)(形成類毒素之三種肽之一)的中和抗體。另外兩種多肽由致死因數(LF)和水腫因數(EF)組成。抗-PA中和抗體已描述為有效於進行針對炭疽的被動免疫。參見，例如， 美國專利號7,442,373；R. Sawada-Hirai et al, J Immune Based Ther Vaccines. 2004；2：5. (2004年5月12日在線)。已描述及/或可生成其它抗炭疽毒素中和抗體。相似地，可使用針對其它細菌及/或細菌毒素的中和抗體來產生如在此所述的遞送AAV的抗病原構築體。
抗傳染病的抗體可能由寄生蟲或真菌引起，包括例如，麴菌屬(Aspergillus species)、繖狀犁頭黴(Absidia corymbifera )、匍枝根黴(Rhixpus stolonifer )、毛黴菌(Mucor plumbeaus )、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )、莢膜組織孢漿菌(Histoplasm capsulatum )、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、粗球黴菌(Coccidioides immitis )、青黴菌(Penicillium species)、乾草小多孢菌(Micropolyspora faeni )、普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris )、互生鏈隔孢菌(Alternaria alternate )、嗜果枝孢菌(Cladosporium species)、長蠕孢黴屬(Helminthosporium )、及葡萄穗黴屬(Stachybotrys species)。
rAAV可包括編碼抗體的基因，特別是針對疾病的病原因子之中和抗體，該疾病如阿茲海默氏症(AD)、帕金森氏症(PD)、GBA關聯的帕金森氏症(GBA-PD)、類風濕性關節炎(RA)、腸躁症候群(Irritable bowel syndrome)(IBS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、癌症、腫瘤、全身性硬化症、氣喘及其它疾病。此種抗體並無限制，可為例如，α-突觸核蛋白(alpha-synuclein)、抗血管內皮生長因子(VEGF)(抗VEGF)、抗VEGFA、抗PD-1、抗PDL1、抗CTLA-4、抗TNF-alpha、抗IL-17、抗IL-23、抗IL-21、抗IL-6、抗IL-6受體、抗IL-5、抗IL-7、抗Factor XII、抗IL-2、抗HIV、抗IgE、抗腫瘤壞死因子受體-1(TNFR1)、抗缺刻蛋白(notch)2/3、抗缺刻蛋白1、抗OX40、抗erb-b2 受體酪胺酸激酶3 (ErbB3)、抗ErbB2、抗β細胞成熟抗原、抗B淋巴球刺激因子、抗CD20、抗HER2、抗顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、抗抑癌蛋白(oncostatin)M (OSM)、抗淋巴球活化基因3 (LAG3)蛋白、抗CCL20、抗血清澱粉樣P成分(SAP)、抗脯胺酸羥化酶抑制劑、抗CD38、抗醣蛋白IIb/IIIa、抗CD52、抗CD30、抗IL-1beta、抗表皮生長因子受體、抗CD25、抗RANK配位體、抗補體系統蛋白C5、抗CD11a、抗CD3受體、抗α-4 (α4)整合素、抗RSV F蛋白、及抗整合素α4 β7 。對於所屬技術領域中具通常知識者而言，其它病原及疾病仍然為顯而易見。其它適合的抗體可包括彼等有用於治療阿茲海默氏症者，諸如例如，抗β類澱粉(例如，克雷內治單抗(crenezumab)、索拉珠單抗(solanezumab)、阿杜卡單抗(aducanumab))、抗β類澱粉纖絲、抗β類澱粉斑、抗tau(anti-tau)、巴皮紐阻單抗(bapineuzamab)等。治療多種適應症之其它適合的抗體包括彼等描述者，例如，PCT/US2016/058968，2016年10月27日申請，公開為WO 2017/075119A1。
減少及/或調節基因表現對於治療以細胞過度增殖為特徵的過度增殖性疾病特別理想，如癌症和牛皮癬。目標多肽包括與正常細胞相比在過度增殖細胞中專門產生或以更高水平產生的彼等多肽。目標抗原包括由致癌基因編碼的多肽，如myb、myc、fyn、及易位基因 bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk及EGRF。除了致癌基因產物作為目標抗原外，抗癌治療及保護療法用之目標多肽包括由B細胞淋巴瘤產生的抗體的可變區及T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區，於一些具體實施例，其亦使用作為自體免疫疾病的目標抗原。其它腫瘤相關多肽可用於作為目標多肽，諸如腫瘤細胞中發現有較高水平表現的多肽，包括被單株抗體17-1A識別的多肽和葉酸結合多肽。
其它合適的治療性多肽和蛋白質包括通過賦予針對與自體免疫相關之目標的廣泛基礎的保護性免疫反應，可用於治療罹患自體免疫疾病及失調的個體的多肽和蛋白質，該目標包括細胞受體及產生「自我」導向抗體的細胞。T細胞媒介的自體免疫疾病包括類風濕性關節炎 (RA)、多發性硬化症(MS)、休格倫氏症候群、結節病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自體免疫甲狀腺炎、反應性關節炎、強直性脊柱炎、硬皮病、多發性肌炎、皮肌炎、牛皮癬、血管炎、韋格納肉芽腫病、克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎。此等疾病中的每一種皆具有與內源性抗原結合並引發與自體免疫疾病相關的炎性級聯反應的T細胞受體(TCR)。
替代地或附加地，載體可包含本發明的AAV序列及編碼誘導對所選免疫原的免疫反應的肽、多肽或蛋白質的轉基因。例如，免疫原可選自多種病毒科。需要針對其進行免疫反應的理想病毒科之例包括小核糖核酸病毒(picornavirus)科，其包括鼻病毒，負責約50%的普通感冒病例；腸病毒屬，其包括脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)、柯沙奇病毒、ECHO病毒、及人類腸病毒如A型肝炎病毒；及口蹄疫病毒屬(apthovirus)，其引起口蹄疫，主要於非人類動物。微小病毒科之病毒中，目標抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4及VPG。另外的病毒科包括杯狀病毒科(calcivirus family)，其涵蓋諾瓦克病毒群(Norwalk group of viruses)，其為傳染性腸胃炎的重要致病因子。希望用於靶向抗原以誘導於人類及非人類動物中的免疫反應的另一種病毒科為披衣病毒科(togavirus family)，該病毒科包括α病毒屬(alphavirus)，該病毒屬包括辛得比斯病病毒(Sindbis virus)、羅斯河病毒(RossRiver virus)、以及委内瑞拉、東方及西方馬腦炎、以及風疹病毒屬(rubivirus)(包括風疹病毒)。黄病毒科(flaviviridae family)包括登革熱、黄熱病、日本腦炎、聖路易腦炎(St. Louis encephalitis)、以及蜱傳染腦炎的病毒。其它目標抗原可由C型肝炎病毒或冠狀病毒科產生，其包括許多非人類病毒如傳染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性腸胃病毒(豬)、豬血凝素腦脊髓炎病毒(豬)、貓傳染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠狀病毒(貓)、犬冠狀病毒(狗)以及人類呼吸道冠狀病毒，此等病毒可引起感冒及/或非A型、B型或C型肝炎。於冠狀病毒科，目標抗原包括E1(亦稱為M或基質蛋白)、E2(亦稱為S或棘蛋白(Spike protein))、E3 (亦稱為HE或血凝素酯酶)糖蛋白(不存在於所有冠狀病毒中)、或者N (核酸蛋白殼)。再其它抗原可為針對棒狀病毒科(rhabdovirus family)被靶向的，其包括水泡性病毒屬(vesiculovirus)(例如，水泡性口炎病毒)及麗沙病毒屬(lyssavirus)(例如，狂犬病)。於棒狀病毒科中，可源自G蛋白或N蛋白。絲狀病毒科(filoviridae)可為一種適合的抗原來源，其包括出血熱病毒如馬堡病毒及依波拉病毒。副黏病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、德國麻疹病毒(腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城病毒(雞)、牛瘟病毒、麻疹病毒(包括麻疹及犬瘟熱病毒)、以及肺炎病毒(包括呼吸道融合病毒)。流感病毒被分類於正黏液病毒科，為一種適合的抗原來源(例如，HA蛋白、N1蛋白)。崩芽病毒科(bunyavirus family)包括崩芽毒屬(加利福尼亞腦炎，拉克羅斯(La Crosse))、弗氏病毒(phlebovirus)(裂谷熱)、漢他病毒(普馬拉病毒(puremala)為一種出血熱病毒)、內羅畢病毒(nairovirus)(奈洛比綿羊病)以及各種未命名bungavirus。沙狀病毒科提供針對LCM及賴薩熱病毒的抗原來源。里奧病毒科包括里奧病毒屬、輪狀病毒(rotavirus)(其引起而童急性胃腸炎)、環狀病毒(orbivirus)、及cultivirus(科羅拉多蜱熱、勒邦博病(Lebombo)(人類)、馬腦炎、藍舌病)。
反轉錄病毒科(retrovirus family)包括致癌病毒(oncorivirinal)亞科，其涵蓋此類人類及獸醫疾病如猫白血病病毒、HTLVI及HTLVII、慢病毒(lentivirinal)(包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒、以及泡沫病毒(spumavirinal))。於HIV及SIV之間，已描述許多適合的抗原且可容易被選擇。適合的HIV及SIV抗原之例包括(未限於)gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat及Rev蛋白質，以及其各種片段。此外，已描述對此等抗原的多種修飾。為此目的之適合抗原為所屬技術領域中具通常知識者已知。例如，可選擇編碼gag、pol、Vif、及Vpr、Env、Tat及Rev及其它蛋白質等的序列。參見，例如，經修飾的gag蛋白質描述於美國專利5,972,596。亦參見，描述於D.H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (March 2001)、及R.R. Amara, et al, Science, 292:69-74 (6 April 2001)之HIV及SIV蛋白質。此等蛋白質或其次單元可被單獨遞送，或經由各別載體或形成單一載體組合遞送。
乳多泡病毒科(papovavirus family)包括多瘤病毒(polyomavirus)亞科(BKU和JCU病毒)及乳頭瘤病毒(papillomavirus)亞科(與癌症或乳頭狀瘤的惡性進展相關)。腺病毒科包括引起呼吸性疾病及/或腸炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。小病毒科包括貓小病毒(貓腸炎)、貓泛白血球減少症病毒(feline panleucopeniavirus)、犬小病毒、以及豬小病毒。皰疹病毒科包括α皰疹病毒科，包括單純皰疹病毒屬(HSVI、HSVII)、水痘皰疹病毒屬(varicellovirus)(假性狂犬病、水痘-帶狀皰疹)以及β皰疹病毒亞科，包括巨細胞病毒屬(HCMV、鼠巨細胞病毒)以及γ皰疹病毒亞科，包括淋巴隱病毒屬(lymphocryptovirus)、EBV(伯奇氏淋巴瘤(Burkitts lymphoma))、傳染性鼻氣管炎、馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)、以及猴病毒屬(rhadinovirus)。痘病毒科包括索痘病毒亞科(subfamily chordopoxvirinae)，包括正痘病毒屬(orthopoxvirus)(天花屬(天花)和牛痘屬(牛痘))、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、豬痘病毒、以及昆蟲痘病毒亞科(subfamily entomopoxvirinae)。肝病毒科(hepadnavirus family)包括B型肝炎病毒。一種可以作為適合抗原來源的未分類病毒是D型肝炎病毒。再其它病毒來源可以包括禽類傳染性黏液囊病病毒和豬繁殖和呼吸障礙綜合症病毒。α病毒科包括馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
本發明亦可涵蓋有用於免疫人類或非人類動物以對抗其它病原的免疫原，該病原包括細菌、真菌、寄生性微生物或多細胞寄生蟲，其感染人類和非人類脊椎動物或者是來自癌細胞或腫瘤細胞。細菌性病原之例包括病原性革蘭氏陽性球菌(包括肺炎雙球菌)；葡萄球菌；以及鏈球菌。病原性革蘭氏陰性球菌包括腦膜炎球菌；淋球菌。病原性腸道革蘭氏陰性桿菌包括腸桿菌屬；假單胞菌屬、不動桿菌屬及艾肯菌屬(eikenella)；類鼻疽(melioidosis)；沙門氏菌屬；賀氏菌屬；嗜血桿菌屬；莫拉氏菌屬(moraxella)；杜克嗜血桿菌(H. ducreyi )(引起軟下疳(chancroid))；布魯氏菌屬(Brucella)；土倫病法蘭西斯氏菌(Franisella tularensis) (引起兔熱病)；耶氏桿菌(Yersinia)(巴斯德菌屬)；念珠狀鏈桿菌(streptobacillus moniliformis)及螺菌屬(spirillum)；革蘭氏陽性桿菌包括單核細胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)；紅斑丹毒絲菌(erysipelothrix rhusiopathiae)；白喉棒狀桿菌(白喉)；霍亂菌；炭疽桿菌(炭疽)；杜諾凡病菌(donovanosis)(腹股溝肉芽腫(granuloma inguinale))；以及巴通體病菌(bartonellosis)。由病原性厭氧細菌引起的疾病包括破傷風；肉毒桿菌中毒；其它梭狀芽孢桿菌病；結核病；麻風病；以及其它分枝桿菌病。病原性螺旋體病包括梅毒；密螺旋體病(treponematoses): 莓疹病(yaws)、品他病(pinta)及地方性梅毒；以及鉤端螺旋體病(leptospirosis)。由高等病原性細菌和病原性真菌引起的其它感染包括放線菌病；諾卡氏放線菌病；隱球菌病、芽生菌病(blastomycosis)、組織胞漿菌病以及球孢子菌病；念珠菌病、麴菌病及白黴菌症(mucormycosis)；孢子絲菌病(sporotrichosis)；副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、波氏黴菌病(petriellidiosis)、球擬酵母菌屬(torulopsosis)、足分枝菌病(mycetoma)及著色芽生菌病(chromomycosis)；以及皮膚真菌病。立克次氏體感染包括斑疹傷寒、洛磯山斑疹熱、Q熱、及立克次氏體痘。黴漿菌及披衣菌感染之例包括：肺炎黴漿菌；性病性淋巴肉芽腫(lymphogranuloma venereum)；鸚鵡熱；及週產期披衣菌感染(perinatal chlamydial infections)。病原性真核生物包括病原性原生動物和蠕蟲且由其產生的感染包括:阿米巴病；瘧疾；利什曼病；錐蟲病；弓形蟲病；卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii )；Trichans；弓蟲(Toxoplasma gondii )；焦蟲病；梨形鞭毛蟲症；旋毛蟲病；絲蟲病；血吸蟲病；線蟲病；吸蟲(trematode)或吸蟲(fluke)病；及絛蟲(cestode)(絛蟲(tapeworm))感染。
此等有機體及/或其產生的毒素中有許多已被疾病控制中心[(CDC), Department of Health and Human Services, USA]認定為是具有用於生物攻擊的潛力的物質。例如，一些此類生物物質包括炭疽桿菌(炭疽)、肉毒桿菌及其毒素(肉毒桿菌毒素)、鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)(兔熱病)及病毒性出血熱，其所有目前皆被分類為A類物質；伯內特科克斯立克次體(Coxiella burnetti)(Q熱)、布氏桿菌(布氏桿菌病)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen)及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌及其毒素(腸毒素B)，其所有目前皆被分類為B類物質；及尼帕病毒(Nipan virus)和漢他病毒，其所有目前皆被分類為C類物質。此外，其它如此分類或不同分類的有機體可於將來被鑒定及/或用於這種目的。容易理解的是，本文所述的病毒載體及其它構築體有用於遞送來自此等有機體、病毒、其毒素或其它副產物的抗原，其將預防及/或治療此等生物物質引起的感染或其它不良反應。
本發明之載體投予以遞送免疫原，該免疫原針對T細胞的可變區誘發免疫反應(包括CTL)以消除彼等T細胞。於類風濕性關節炎(RA)中，已描繪出涉及此疾病的T細胞受體(TCRs)的數種特異性可變區。此等TCRs包括V-3、V-14、V-17及Vα-17。如此，遞送編碼此等多肽的至少一者的核酸序列將誘發免疫反應，該免疫反應將靶向RA中涉及的T細胞。於多發性硬化症(MS)，已描繪出涉及此疾病的TCRs的數種特異性可變區。此等TCRs包括V-7及Vα-10。如此，遞送編碼此等多肽的至少一者的核酸序列將誘發免疫反應，該免疫反應將靶向MS中涉及的T細胞。於硬皮病，已描繪出涉及此疾病的TCRs的數種特異性可變區。此等TCRs包括V-6、V-8、V-14及Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28及Vα-12。如此，遞送編碼此等多肽的至少一者的核酸序列將誘發免疫反應，該免疫反應將靶向硬皮病中涉及的T細胞。
於一具體實施例，選擇轉基因以提供光遺傳學治療。在光遺傳學治療中，人造光受體係通過將光激活通道或泵向剩餘的視網膜迴路中尚存的細胞類型進行基因遞送而構築。此對於失去大量光受體功能，但神經節細胞和視神經的雙極細胞迴路仍然完整的患者特別有用。於一具體實施例，異源性核酸序列(轉基因)為一種視蛋白(opsin)。視蛋白序列可衍生自任何適合的單或多細胞有機體，包括人類、藻類及細菌。於一具體實施例，該視蛋白為視紫質(rhodopsin)、光蛋白(photopsin)、L/M波長(紅/綠)-視蛋白、或短波長(S)視蛋白(藍)。於另一具體實施例，該視蛋白為光敏通道蛋白(channelrhodopsin)或鹽系菌視紫紅質(halorhodopsin)。
於另一具體實施例，選擇轉基因以用於基因增強治療(gene augmentation therapy)，即，提供缺失或有缺陷的基因的替代副本。於此具體實施例中，所屬技術領域中具通常知識者可容易地選擇轉基因以提供必要的替代基因。於一具體實施例，此缺失或有缺陷的基因係關於眼疾。於另一具體實施例，轉基因為NYX、GRM6、TRPM1L或GPR179且該眼疾為先天性停滯型夜盲症(Congenital Stationary Night Blindness)。參見，例如，Zeitz et al, Am J Hum Genet. 2013 Jan 10；92(1):67-75. Epub 2012年12月13日，其藉由引用併入本文。於另一具體實施例，轉基因為RPGR。於另一具體實施例，該基因為CHM編碼的Rab escort protein 1 (REP-1)，與無脈絡膜(無脈絡膜)有關。
於另一具體實施例，選擇轉基因以用於基因抑制治療(gene suppression therapy)，即，一種以上天然基因的表現於轉錄或轉譯水平被中斷或抑制。此可使用短髮夾RNA(shRNA)或本領域眾所周知的其它技術來完成。參見，例如，Sun et al, Int J Cancer. 2010 Feb 1；126(3):764-74 and O'Reilly M, et al. Am J Hum Genet. 2007 Jul；81(1):127-35，其藉由引用而併入本文。於此具體實施例中，所屬技術領域中具通常知識者基於所欲使沉默的基因可容易選擇。
於另一具體實施例，轉基因包含多於1種之轉基因。此可使用帶有二種以上異源性序列的單一載體或使用各自帶有一種以上異源性序列的二種以上之二種以上而完成。於一具體實施例，rAAV用於基因抑制(或敲除(knockdown))和基因增強共治療。於敲除/增強共治療中，感興趣的基因的缺陷拷貝被沉默，且提供未突變的拷貝。於一具體實施例，此係使用兩種以上共同投予的載體實現。參見，Millington-Ward et al, Molecular Therapy, April 2011, 19(4):642–649 其藉由引用併入本文。基於所欲結果，所屬技術領域中具通常知識者可容易選擇該轉基因。
於另一具體實施例，選擇轉基因以用於基因矯正治療(gene correction therapy)。其可使用下列完成，例如，鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)誘導的DNA雙股斷裂與外源DNA供體基質結合來實現。參見，例如，Ellis et al, Gene Therapy (epub January 2012)20:35-42 其藉由引用併入本文。於一具體實施例，該轉基因編碼選自巨核酸酶(meganuclease)、鋅指核酸酶、類轉錄活化因子核酸酶(transcription activator‐like (TAL)effector nuclease (TALEN))及常間回文重複序列叢集(clustered, regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR))/內核酸酶 (Cas9, Cpf1, etc)的核酸酶。適合的巨核酸酶之例描述於例如，美國專利8,445,251；US 9,340,777；US 9,434,931；US 9,683,257、及WO 2018/195449。其它適合的酵素包括可以核酸編程的方式結合RNA之核酸酶失活的釀膿鏈球菌(S. pyogenes)CRISPR/Cas9(Nelles et al, Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9, Cell, 165(2):P488-96 (2016年4月))，及鹼基編輯器(base editors)(例如，Levy et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses, Nature Biomedical Engineering, 4, 97-110 (2020年1月))。於某些具體實施例，該核酸酶不為鋅指核酸酶。於某些具體實施例，該核酸酶不為CRISPR-有關的核酸酶。於某些具體實施例，該核酸酶不為TALEN。於一具體實施例，該核酸酶不為巨核酸酶。於某些具體實施例，該核酸酶為歸巢內切酶(homing endonuclease)之LAGLIDADG (SEQ ID NO：45)家族之一員。於某些具體實施例，該核酸酶為歸巢內切酶之I-CreI家族之一員，其辨識並切出22個鹼基對辨識序列SEQ ID NO：46 – CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG。參見，例如，WO 2009/059195。描述用於合理設計單-LAGLIDADG歸巢內切酶的方法，其能夠全面地重新設計ICreI和其它歸巢內切酶以靶向廣泛不同的DNA位點，包括於哺乳動物、酵母、植物、細菌及病毒基因體中的位點(WO 2007/047859)。
適合的基因編輯目標包括，例如，肝臟表現的基因，例如(無限制)，前蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9))(膽固醇相關失調)、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin)(TTR)(甲狀腺素運載蛋白類澱粉變性症(transthyretin amyloidosis)、HAO、載脂蛋白(apolipoprotein)C-III (APOC3)、第VIII因子、第IX因子、低密度脂蛋白受體(LDLr)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase)(LPL)(脂蛋白脂酶缺乏)、卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT))、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)、肌肽酶(carnosinase)(CN1)、神經鞘磷脂磷酸二脂酶(SMPD1)(尼曼匹克症)、；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT)、支鏈α-酮酸脫氫酶複合物(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase complex)(BCKDC)楓糖尿症(maple syrup urine disease)、紅血球生成素(EPO)、胺甲醯基-磷酸合成酶(CPS1)、N-乙醯麩胺酸合成酶(N-Acetylglutamate Synthetase)(NAGS)、精胺基琥珀酸合成酶(瓜胺酸血症)、精胺基琥珀酸裂解酶(ASL)(精胺基琥珀酸酵素缺乏症(Argininosuccinic Aciduria))、及精胺酸酶(AG)。
其它基因編碼目標可包括例如，羥甲基膽色烷合成酶(HMBS)、胺甲醯基合成酶I、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)、精胺基琥珀酸合成酶、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、治療精胺基琥珀酸裂解酶缺乏用之精胺基琥珀酸裂解酶(ASL)、精胺酸酶、胡索醯乙醯乙酸水解酶、苯丙胺酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶、恆河猴甲型胎兒蛋白(AFP)、恆河猴絨毛膜促性腺激素(CG)、葡萄糖-6-磷酸酶、紫質膽質原脫胺基酶、胱硫醚貝他合成酶、支鏈酮酸脫羧基酶、白蛋白、異戊醯輔酶A脫氫酶、丙醯輔酶A羧化酶、甲基丙二酸單醯輔酶A變位酶(MUT)、戊二基輔酶A脫氫酶、胰島素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘胺酸脫羧基酶、H-蛋白、T蛋白、囊性纖維化轉膜調節子(CFTR)序列、及肌肉萎縮蛋白基因產物[例如，微-或巨-肌肉萎縮蛋白]。又其它有用的基因產物包括酵素，如可有用於酵素替代療法，其有用於各種由於酵素活性不足而引起的疾病。例如，含甘露糖-6-磷酸的酵素可用於溶小體儲積症之治療((例如，包括編碼β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase (GUSB))之適合的基因))。於另一例中，基因產物為泛素蛋白連接酶E3A。葡萄糖-6-磷酸酶，與肝醣儲積症或缺乏1A型(GSD1)有關；磷酸烯醇式丙酮酸-羧激酶(PEPCK)，與PEPCK缺乏有關；第五型類细胞週期蛋白依賴激酶，亦已知為絲胺酸/蘇胺酸激酶9(STK9)，與癲癇發作和嚴重的神經發育障礙有關；半乳糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶，與半乳糖血症有關；苯丙胺酸羥化酶(PAH)，與苯丙酮尿症(PKU)有關；與原發性高草酸鹽尿症第1型有關的基因產物，包括羥基酸氧化酶1 (GO/HAO1)及AGXT，支鏈α-酮酸脫氫酶，包括BCKDH、BCKDH-E2、BAKDH-E1a、及BAKDH-E1b，與楓糖尿症有關；延胡索醯乙醯乙酸水解酶，與酪胺酸血症第1型有關；甲基丙二酸輔酶A變位酶，與甲基丙二酸血症有關；中鏈醯輔酶A脫氫酶，與中鏈醯輔酶A缺乏症有關；鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)，與鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症有關；精胺基琥珀酸合成酶(ASS1)，與瓜胺酸血症有關；卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT)缺乏症；甲基丙二酸血症(MMA)；與尼曼匹克症第Cl型有關的NPC1；丙酸血症(PA)；與轉甲狀腺素蛋白相關遺傳性類澱粉變性有關的TTR；低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白質，與家族性高膽固醇血症(FH)有關，LDLR變異體，諸如彼等描述於WO 2015/164778者；PCSK9；ApoE及ApoC蛋白，與癡呆有關；尿核苷酸葡萄糖醛酸轉移酶，與克-納氏症有關；腺苷脫胺酶，與嚴重複合型免疫缺乏症有關；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶，與痛風及萊希-尼亨症候群有關；生物素酶，與生物素酶缺乏症有關；與法布瑞氏症有關的α-半乳糖苷酶；與GM1神經節苷脂儲積症有關的β-半乳糖苷酶(GLB1)；與威爾森氏症有關的ATP7B；β-葡萄糖腦甘酯，與高雪氏症(Gaucher disease)第2及3型有關；過氧化體膜蛋白70 kDa，與齊氏症候群有關；與異染性白質失養症有關的芳基硫酸酯酶A (ARSA)，與克拉培氏病(Krabbe disease)有關的半乳糖腦苷酯酶(galactocerebrosidase (GALC))酵素，與龐貝氏症有關的α-葡萄糖苷酶(GAA)；神經髓磷脂酶(SMPD1))基因，與A型尼曼匹克氏症有關；與成人發作第II型瓜胺酸血症(CTLN2)有關的精胺基琥珀酸合成酶；與尿素循環代謝障礙有關的胺甲醯基-磷酸合成酶1(CPS1)；運動神經元存活蛋白(SMN)，與脊髓性肌肉萎縮症有關；與法伯脂肪肉芽腫病有關的神經醯胺酶；與GM2神經節苷脂儲積症及Tay-Sachs及Sandhoff病有關的β-己醣胺酶；與天門冬醯胺基葡糖尿有關的天門冬醯胺基葡萄糖酶；與岩藻糖沉積症有關的α-岩藻糖苷酶；與α-甘露糖沉積症有關的α-甘露糖苷酶；紫質膽質原脫胺基酶，與急性間歇性紫質症(AIP)有關；用於α-1抗胰蛋白酶缺乏(肺氣腫)之治療之α-1抗胰蛋白酶；用於治療因地中海貧血或腎衰竭引起的貧血之促紅血球形成素；治療缺血性疾病之血管內皮生長因子、促血管生成素-1及纖維母細胞生長因子；治療於下列所見的血管阻塞之凝血酶調節素及組織因子路徑抑制劑，例如，動脈粥樣硬化、血栓症、或栓塞；芳香族胺基酸脫羧酶(AADC)，及治療帕金森氏症之酪胺酸羥化酶(TH)；β腎上腺素受體，受磷蛋白、肌(內)質網腺苷三磷酸酶-2(SERCA2)及心臟腺苷酸環化酶之反義或突變型用於充血性心臟衰竭的治療；治療各種癌症之腫瘤抑制基因諸如p53；胞激素，諸如各種介白素之一者，用於治療炎症及免疫疾病以及癌症；治療肌肉營養不良之肌肉萎縮蛋白或迷你肌肉萎縮蛋白及肌肉萎縮相關蛋白或迷你肌肉萎縮相關蛋白；及，治療糖尿病之胰島素或GLP-1。
於一具體實施例，本文所述殼體有用於CRISPR-Cas雙載體系統，描述於US公開專利申請案2018/0110877，2018年4月26日申請，其藉由引用併入本文。殼體亦有用於遞送歸巢內切酶或其它巨核酸酶。
於另一具體實施例，此處有用的轉基因包括報導子序列，其表現產生可偵測到的信號。此種報導子序列包括，但未限於，編碼下列的DNA序列：β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、氯黴素乙醯基轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)、蟲螢光素酶、膜結合蛋白，包括例如，CD2、CD4、CD8、流感血球凝集素蛋白、及所屬技術領域中其它熟知者，存在或可以通過常規方法產生針對其的高親和力抗體、及融合蛋白，包含適當融合至抗原標籤域的膜結合蛋白，其中抗原標籤域來自如血球凝集素或Myc。
於某些具體實施例，除了轉基因編碼序列，可包括另外的非AAV編碼序列，例如，肽、多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它有興趣的基因產物。有用的基因產物可包括miRNAs。miRNAs及其它小干擾核酸經由目標RNA轉錄物的裂解/降解或目標傳訊RNA (mRNA)的轉譯壓制而調節基因表現。天然地表現miRNAs，通常作為最終19-25個非轉譯的RNA產物。miRNAs展示其活性，通過與目標mRNAs 之3′未轉譯區域(UTR)的序列特異性相互作用。此等內源性表現的miRNAs形成髮夾前驅物，並進一步成「成熟」單股miRNA分子。此成熟miRNA引導一種多蛋白複合體(multiprotein complex)，miRISC，其識別目標位，例如，於目標mRNAs之3′ UTR區域，基於其與成熟miRNA的互補性。
此等上述編碼序列，當與驅動其表現調節元件有關時，提供可通過常規手段檢測到的信號，包括酵素、射線照相、比色、螢光或其它光譜測定、螢光激活細胞分選測定及免疫測定，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及免疫組織化學。例如，於標記序列為LacZ基因的情況下，通過測定β-半乳糖苷酶活性來檢測攜帶信號的載體的存在。當轉基因為綠色螢光蛋白或蟲螢光素酶時，可以通過在發光計中通過顏色或發光來目測帶有信號的載體。
理想地，轉基因編碼在生物學和醫學上有用的產物，如蛋白質、肽、RNA、酵素或催化性RNA。理想的RNA分子包括shRNA、tRNA、dsRNA、核醣體RNA、催化RNA及反義RNA。有用的RNA序列之一例係在被治療的動物中消除靶向的核酸序列的表現的序列。
調控序列包括習用控制元件，其如本文所述以允許編碼產物於以質體載體轉染的細胞中或產生的病毒感染的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與編碼序列可操作地連接。如本文所使用，「可操作地連接」序列包括與感興趣的基因連續的表現控制序列及在反式或距離上起作用以控制感興趣的基因起作用的表現控制序列兩者。
表現控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；有效的RNA加工訊息如剪接及多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質mRNA的序列；增強轉譯效率的序列(即Kozak一致序列)；增強蛋白質穩定性的序列；及當需要時，增加編碼產物分泌的序列。許多表現控制序列，包括啟動子，在本領域中為已知且可被利用。
本文提供的構築體中有用的調控序列亦可含有內含子，期望位於啟動子/增強子序列與基因之間。一期望內含子序列衍生自SV-40，為100 bp微型內含子剪接供體/剪接受體(splice donor/splice acceptor)，稱為SD-SA。另外適合的序列包括土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus)轉錄後元件。(參見，例如，L. Wang and I. Verma, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:3906-3910)。多腺苷酸化訊息可衍生自許多適合種，包括，但未限於SV-40、人類及牛。
在本文所述的方法中有用的rAAV的另一調節組件為內部核醣體進入位點(internal ribosome entry site (IRES))。可以使用IRES序列或其它適合的系統從單個基因轉錄物中產生一個以上的多肽。IRES(或其它適合的序列)用於產生包含多條多肽鏈的蛋白質，或從相同細胞或在同一細胞內表現兩種不同的蛋白質。示例性IRES為脊髓灰質炎病毒內部核醣體進入序列，其支持在感光受體、RPE和神經節細胞中的轉基因表現。較佳地，IRES位於rAAV載體中轉基因的3’。
於一具體實施例，AAV包含啟動子(或啟動子之功能性片段)。可以於可期望的目標細胞中表現選擇的轉基因的多種建構或誘導性啟動子中選擇在rAAV中使用的啟動子。於一具體實施例，目標細胞為眼細胞。啟動子可以來自任何物種，包括人類。期望地，於一具體實施例，啟動子為「細胞特異性的」。術語「細胞特異性的」係指為重組載體選擇的特定啟動子可指導所選轉基因在特定細胞組織中的表現。於一具體實施例，啟動子對於轉基因在肌肉細胞中的表現為特異性的。於另一具體實施例，啟動子對於在肺中表現為特異性的。於另一具體實施例，啟動子對於在肝臟細胞中表現為特異性的。於另一具體實施例，啟動子對於在呼吸道上皮中表現為特異性的。於另一具體實施例，啟動子對於在神經元中表現為特異性的。於另一具體實施例，啟動子對於在心臟中表現為特異性的。
表現匣通常含有啟動子序列作為表現控制序列之一部分，例如， 位於選擇的5’ ITR序列及免疫球蛋白構築體編碼序列。於一具體實施例，於肝臟表現為期望的。如此，於一具體實施例，使用肝臟-特異性啟動子。肝臟-特異性啟動子之例可包括，例如，甲狀腺素結合球蛋白(TBG)、白蛋白，Miyatake et al., (1997)J. Virol., 71:5124 32；B型肝炎病毒核啟動子，Sandig et al., (1996)Gene Ther., 3:1002 9；或人類α1-抗胰蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PECK)、或α胎兒蛋白(AFP)，Arbuthnot et al., (1996)Hum. Gene Ther., 7:1503 14)。組織特異性啟動子、構築性啟動子、調節啟動子[參見，例如， WO 2011/126808及WO 2013/04943]、或對生理學提示反應的啟動子可用於本文所述的載體中。於另一具體實施例，於肌肉中表現為期望的。如此，於一具體實施例，使用肌肉-特異性啟動子。於一具體實施例，啟動子為MCK系啟動子，如dMCK (509-bp)或tMCK (720-bp)啟動子(參見，例如，Wang et al, Gene Ther. 2008 Nov；15(22):1489-99. doi：10.1038/gt.2008.104. Epub 2008 Jun 19，其藉由引用併入本文)。另外有用的啟動子為SPc5-12啟動子(參見Rasowo et al, European Scientific Journal June 2014 edition vol.10, No.18，其藉由引用併入本文)。於某些具體實施例，可使用對眼或其子部件(subpart)(例如，視網膜)為特異性之啟動子。
於一具體實施例，啟動子為CMV啟動子。於另一具體實施例，啟動子為TBG啟動子。於另一具體實施例，使用CB7啟動子。CB7為一雞β-肌動蛋白啟動子，具巨細胞病毒增強子元件。或者可使用其它肝臟-特異性啟動子[參見，例如， 肝臟特異性基因啟動子資料庫，Cold Spring Harbor, rulai.schl.edu/LSPD，α1-抗胰蛋白酶(A1AT)；人類白蛋白，Miyatake et al.,  J. Virol., 71:5124 32 (1997), humAlb；及B型肝炎病毒核啟動子，Sandiget al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996)]。TTR最小增強子/啟動子，α-抗胰蛋白酶啟動子，LSP (845 nt)25(需要無內含子scAAV)。
啟動子可選自不同來源，例如， 人類巨細胞病毒(CMV)立即-早期增強子/啟動子、SV40早期增強子/啟動子、JC多瘤病毒(polymovirus)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)或神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、單純皰疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(LAP)、勞斯肉瘤病毒(rouse sarcoma virus (RSV))末端長重複序列(long terminal repeat (LTR))啟動子、神經元特異性啟動子(NSE)、血小板衍生的生長因子(PDGF)啟動子、hSYN、黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone (MCH))啟動子、CBA、基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein)啟動子(MPP)、及雞β-肌動蛋白啟動子。
表現匣可含有至少一個增強子，即， CMV增強子。再其它增強子元件可包括，例如， 載脂蛋白增強子、斑馬魚增強子、GFAP增強子元件、及腦特異性增強子如描述於WO 2013/1555222、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件。另外或者，其它，例如，雜合人類巨細胞病毒-立即早期(IE)-PDGR (hybrid human cytomegalovirus (HCMV)-immediate early (IE)-PDGR)啟動子或可選擇其它啟動子-增強子元件。本文有用的其它增強子序列包括IRBP增強子(Nicoud 2007、J Gene Med. 2007 Dec；9(12):1015-23)、立即早期巨細胞病毒增強子、衍生自免疫球蛋白基因者或SV40增強子、在小鼠近端啟動子鑑定出的順式作用元件(cis-acting element)等。
除了啟動子，表現匣及/或載體可含有其它適當轉錄起始、終止、增強子序列、有效的RNA加工訊息如剪接及多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質mRNA的序列；增強轉譯效率的序列(即Kozak一致序列)；增強蛋白質穩定性的序列；及當需要時，增加編碼產物分泌的序列。許多適合的多腺苷酸(polyA)為已知。於一例中，多腺苷酸為兔β球蛋白，如127 bp兔β球蛋白多腺苷酸化訊息(GenBank # V00882.1)。於其它具體實施例，選擇SV40 polyA訊息。可選擇再其它適合的多腺苷酸序列。於某些具體實施例，包括內含子。一適合內含子為雞β-肌動蛋白內含子。於一具體實施例，該內含子為875 bp (GenBank # X00182.1)。於另一具體實施例，使用可獲自Promega的嵌合內含子。然而，可選擇其它適合的內含子。於一具體實施例，包括分隔子(spacers)使得載體基因體為與天然AAV載體基因體(例如，4.1至5.2 kb之間)為大約相同大小。於一具體實施例，包括分隔子使得載體基因體為約4.7 kb。參見，Wu et al, Effect of Genome Size on AAV Vector Packaging, Mol Ther. 2010 Jan；18(1)：80–86，其藉由引用併入本文。
於某些具體實施例，表現匣進一步包含可操作地連接至轉基因編碼序列的背根節特異性miRNA脫靶序列(dorsal root ganglion (drg)-specific miRNA detargeting sequences)。於某些具體實施例，串接miRNA目標序列為連續或以1至10個核酸之分隔子分開，其中該分隔子不為miRNA目標序列。於某些具體實施例，有至少二個drg-特異性miRNA序列位於功能性轉基因編碼序列的3’。於某些具體實施例，至少有二個drg-特異性miRNA串接重複的第一者起始於距離轉基因編碼序列3’端之20個核苷酸內。於某些具體實施例，該至少有二個drg-特異性miRNA串接重複的第一者起始於距離轉基因編碼序列3’端之至少100個核苷酸內。於某些具體實施例，該miRNA串接重複序列包含長度200至1200個核苷酸。於某些具體實施例，至少有二個drg-特異性miRNA目標序列位於功能性轉基因編碼序列的5’。某些具體實施例，二個drg-特異性miRNA目標序列位於功能性轉基因編碼序列的5’及3’。於某些具體實施例，表現匣mRNA或DNA正股的至少第一及/或至少第二miRNA目標序列的該miRNA目標序列選自(i)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA (miR183, SEQ ID NO：41)；(ii)AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA (SEQ ID NO：42)；(iii)AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA (SEQ ID NO：43)；或(iv)AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC (SEQ ID NO：44)。於某些具體實施例，表現匣mRNA或DNA正股的至少第一及/或至少第二miRNA目標序列的該miRNA目標序列為AGTGAATTCTACCAGTGCCATA (miR183, SEQ ID NO：41)。於某些具體實施例，表現匣mRNA或DNA正股的至少第一及/或至少第二miRNA目標序列的該miRNA目標序列為AGTGAATTCTACCAGTGCCATA (miR182, SEQ ID NO：42)。於某些具體實施例，二或多個連續miRNA目標序列為連續的且未被間隔子分隔開。於某些具體實施例，二或多個連續miRNA目標序列被間隔子分隔開且各間隔子獨立選自一種以上之(A)GGAT；(B)CACGTG；或(C)GCATGC。於某些具體實施例，位於miRNA目標序列之間的間隔子可位於第一miRNA目標序列之3’及/或最後的miRNA目標序列之5’。於某些具體實施例，miRNA目標序列之間的間隔子為相同。參見國際專利申請案案號PCT/US19/67872，2019年12月20日申請，美國臨時專利申請案第63/023,594號，2020年5月12日申請，美國臨時專利申請案第63/038,488號，2020年6月12日申請，美國臨時專利申請案第63/043,562號，2020年6月24日申請，及美國臨時專利申請案第63/079,299號，2020年9月16日申請，其所有皆藉由引用而完整併入本文。
此等及其它常見載體及調節元件的選擇為習用且許多這樣的序列為可用的。參見，例如，Sambrook et al，且參考引用其中例如，第3.18-3.26及16.17-16.27頁及Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989。當然，並非所有載體及表現控制序列都將同樣良好地表現本文所述的所有轉基因。然而，所屬技術領域中具通常知識者可於此等以及其它表現控制序列中進行選擇，而不脫離本發明的範圍。
於另一具體實施例，提供一種產生重組腺相關病毒之方法。藉由培養宿主細胞產生適合的重組腺相關病毒(AAV)，該宿主細胞含有編碼本文所述AAV殼體蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；袖珍基因，至少由AAV反向末端重複(ITRs)及編碼期望轉基因的異源性核酸序列；及充足的輔助功能以允許將袖珍基因包裝於AAV殼體蛋白中。可將需要在宿主細胞中培養以將AAV袖珍基因包裝在AAV殼體中的組分以反式提供給宿主細胞。或者，可以由穩定的宿主細胞提供所需組份之任一種以上(例如，袖珍基因、rep 序列、cap 序列、及/或輔助功能)，該穩定的宿主細胞已使用所屬技術領域中具通常知識者已知方法被工程化為含有一種以上之所需組分。
本文亦提供用本文所述之以AAV轉染的宿主細胞。最適合地，此種穩定的宿主細胞將在誘導型啟動子的控制下包含所需的組分。然而，所需的組分可為於構築性啟動子之控制下。於此提供適合的誘導性及構築性啟動子之例，於下面討論適合與轉基因一起使用的調節元件。在再另一個替代方案中，選擇的穩定宿主細胞可含有構築性啟動子控制下的選擇的組分及在一個或多個誘導性啟動子控制下的其它選擇的組分。例如，可以產生穩定的宿主細胞，其衍生自293細胞(在構築性啟動子的控制下含有E1輔助功能)，但在誘導性啟動子的控制下含有rep及/或cap蛋白。所屬技術領域中具通常知識者亦可產生其它穩定的宿主細胞。於於另一具體實施例，宿主細胞包含如本文所述的核酸分子。
產生本文所述的rAAV所需的袖珍基因、rep序列、cap 序列及輔助功能可以以轉移其上攜帶的序列的任何遺傳元件的形式遞送至包裝宿主細胞。選擇的遺傳元件可藉由任何適合的方法遞送，包括本文所述的彼等方法。用於構建本發明之任何具體實施例的方法為核酸操作技術人員已知且包括基因工程、重組工程、及合成技術。參見，例如，Sambrook et al, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY。相似地，產生rAAV病毒顆粒的方法為眾所周知，且選擇適合的方法並非對本發明的限制。參見，例如，K. Fisher et al, 1993J. Virol. , 70:520-532及美國專利案5,478,745等。此等公開文獻藉由引用而併入本文。
本文亦提供用於產生本文描述的載體的質體。此種質體描述於實施例部分。
C. 醫藥組成物及投予
於一具體實施例，如上所述，任選地通過常規方法評估含有用於目標細胞中的所需轉基因和啟動子的重組AAV是否被污染，然後調配成被意圖投予需要其之受試者之醫藥組成物中。這種調配劑涉及醫藥上及/或生理學上可接受的媒劑或載劑，如緩衝鹽水或其它緩沖劑，例如HEPES，以維持pH於適當生理學上的水平，可選擇其它藥物、醫藥劑、安定劑、緩衝劑、載劑、佐劑、稀釋劑等。於注射，載體通常為液體。示例性的生理上可接受的載劑包括無菌、無熱原(pyrogen)的水和無菌、無熱原的磷酸鹽緩衝鹽水。於美國專利公開號7,629,322中提供了各式各樣之此種已知載劑，藉由引用被併入本文中。於一具體實施例，該載劑為等滲透壓氯化鈉溶液。於另一具體實施例，該載劑為平衡的鹽溶液。於一具體實施例，該載劑包括吐溫(Tween)。若病毒要長期保存，則可於甘油或Tween20存在下將其冷凍。於另一具體實施例，醫藥上可接受的載劑包含表面活性劑，如全氟辛烷(Perfluoron液體)。將該載體調配於適於輸注於人類受試者的緩衝液/載劑中。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附到輸液管上但不干擾rAAV體內結合活性的成分。
在本文描述的方法之某些具體實施例中，將該醫藥組成物肌肉內投予至受試者。於其它具體實施例，醫藥組成物藉由靜脈內投予。於其它具體實施例，藉由腦室內注射投予醫藥組成物。可有用於本文所述方法的投予之其它型式包括，但未限於，直接遞送至所欲器官(例如，眼睛、肝臟)，包括視網膜下或玻璃體內遞送、經口、吸入、鼻內、氣管內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、及其它非腸胃道路徑之投予。若需要，可組合投予路徑。
該組成物可以約0.1 µL至約10 mL的體積被遞送，包括該範圍內的所有數值，取決於待治療區域的大小、使用的病毒力價、投予途徑、及此方法所期望的效果。於一具體實施例，體積為約50 µL。於另一具體實施例，體積為約70 µL。於另一具體實施例，體積為約100 µL。於另一具體實施例，體積為約125 µL。於另一具體實施例，體積為約150 µL。於另一具體實施例，體積為約175 µL。於再另一具體實施例，體積為約200 µL。於另一具體實施例，體積為約250 µL。於另一具體實施例，體積為約300 µL。於另一具體實施例，體積為約450 µL。於另一具體實施例，體積為約500 µL。於另一具體實施例，體積為約600 µL。於另一具體實施例，體積為約750 µL。於另一具體實施例，體積為約850 µL。於另一具體實施例，體積為約1000 µL。於另一具體實施例，體積為約1.5 mL。於另一具體實施例，體積為約2 mL。於另一具體實施例，體積為約2.5 mL。於另一具體實施例，體積為約3 mL。於另一具體實施例，體積為約3.5 mL。於另一具體實施例，體積為約4 mL。於另一具體實施例，體積為約5 mL。於另一具體實施例，體積為約5.5 mL。於另一具體實施例，體積為約6 mL。於另一具體實施例，體積為約6.5 mL。於另一具體實施例，體積為約7 mL。於另一具體實施例，體積為約8 mL。於另一具體實施例，體積為約8.5 mL。於另一具體實施例，體積為約9 mL。於另一具體實施例，體積為約9.5 mL。於另一具體實施例，體積為約10 mL。
於調控序列控制下，攜帶編碼期望的轉基因的核酸序列之重組腺相關病毒之有效濃度期望範圍為每毫升約107 至1014 載體基因體(vg/mL)(亦稱為基因體拷貝/mL(GC/mL))。於一具體實施例，rAAV載體基因體以即時PCR測量。於另一具體實施例，rAAV載體基因體以數位PCR測量。參見，Lock et al, Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr；25(2):115-25. doi：10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14，其藉由引用併入本文。於另一具體實施例，rAAV感染單元如S.K. McLaughlin et al, 1988 J. Virol., 62:1963所述測量，其藉由引用併入本文。
較佳地，濃度為由約1.5 x 109 vg/mL至約1.5 x 1013 vg/mL，更佳為由約1.5 x 109 vg/mL至約1.5 x 1011 vg/mL。於一具體實施例，有效濃度為約1.4 x 108 vg/mL。於一具體實施例，有效濃度為約3.5 x 1010 vg/mL。於另一具體實施例，有效濃度為約5.6 x 1011 vg/mL。於另一具體實施例，有效濃度為約5.3 x 1012 vg/mL。於再另一具體實施例，有效濃度為約1.5 x 1012 vg/mL。於另一具體實施例，有效濃度為約1.5 x 1013 vg/mL。本文所述的所有範圍均包括端點。
於一具體實施例，劑量為體重之由約1.5 x 109 vg/kg至約1.5 x 1013 vg/kg，且更佳為約1.5 x 109 vg/kg至約1.5 x 1011 vg/kg。於一具體實施例，劑量為約1.4 x 108 vg/kg。於一具體實施例，劑量為約3.5 x 1010 vg/kg。於另一具體實施例，劑量為約5.6 x 1011 vg/kg。於另一具體實施例，劑量為約5.3 x 1012 vg/kg。於再另一具體實施例，劑量為約1.5 x 1012 vg/kg。於另一具體實施例，劑量為約1.5 x 1013 vg/kg。於另一具體實施例，劑量為約3.0 x 1013 vg/kg。於另一具體實施例，劑量為約1.0 x 1014 vg/kg。本文所述的所有範圍均包括端點。
於一具體實施例，有效劑量(被遞送的總基因體拷貝)為由約107 至1013 個載體基因體。於一具體實施例，總劑量為約108 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約109 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約1010 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約1011 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約1012 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約1013 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約1014 個基因體拷貝。於一具體實施例，總劑量為約1015 個基因體拷貝。
期望使用最低有效濃度的病毒，以降低不良作用如毒性的風險。已開發於此等範圍內的再其它劑量及投予量，可以由主治醫師選擇，考量欲被治療的受試者(較佳為人類)的身體狀況、受試者的年齡、特定的疾病和若為進展性時疾病的程度而定。例如，靜脈內遞送可需要劑量之級數為1.5 X 1013 vg/kg。
D. 方法 於另一態樣，提供轉導目標細胞或組織之方法。於一具體實施例，該方法包括投予具有如本文所述之AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17殼體的AAV。如下列例所示，本發明人等已呈示本文所述的AAV3B突變體有效地轉導肝臟、心臟及肌肉組織。因此，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含具有AAV3B.AR2.01殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.02殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.03殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.04殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.05殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之投予具有AAV3B.AR2.06殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.07殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.08殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.10殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.11殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.12殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.13殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.14殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.15殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.16殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肝臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.17殼體之rAAV。於一具體實施例，運用靜脈內投予。於另一具體實施例，運用ICV投予。
本文亦提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.01殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.02殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.03殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.04殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.05殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.06殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.07殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.08殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.10殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAVAAV3B.AR2.11殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.12殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.13殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.14殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.15殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.16殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導心臟之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.17殼體之rAAV。於一具體實施例，運用靜脈內投予。於另一具體實施例，運用ICV投予。
本文亦提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.01殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAVAAV3B.AR2.02殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.03殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.04殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.05殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.06殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.07殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.08殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.10殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.11殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.12殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.13殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.14殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.15殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.16殼體之rAAV。於另一具體實施例，本文提供一種轉導肌肉之方法，其包含投予具有AAV3B.AR2.17殼體之rAAV。於一具體實施例，運用靜脈內投予。於另一具體實施例，運用ICV投予。
如本文所討論，包含如本文所述AAV殼體之載體能夠以高水平轉導目標組織。如此，本文提供一種遞送轉基因至肝臟細胞之方法。此方法包括將細胞與具有AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17殼體之rAAV接觸，其中該rAAV包含該轉基因。於另一具體實施例，該方法包括將細胞與具有本文所述任一殼體之rAAV接觸，其中該rAAV包含該轉基因。於另一態樣，提供具有AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17殼體之rAAV用於遞送轉基因至肝臟之用途。
於另一具體實施例，提供一種轉導CNS組織之方法。該方法包括將細胞與具有AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17殼體之rAAV接觸。於一具體實施例，運用腦大池內注射。
於一具體實施例，rAAV之劑量為每劑約1 x 109 GC至約1 x 1015 基因體拷貝(GC)(治療平均體重70公斤的受試者)，對人類受試者較佳為1.0 x 1012 GC至2.0 x 1015 GC。於另一具體實施例，劑量為受試者之小於約1 x 1014 GC/kg體重。於特定具體實施例，投予病患的劑量為至少約1.0 x 109 GC/kg、約1.5 x 109 GC/kg、約2.0 x 109 GC/g、約2.5 x 109 GC/kg、約3.0 x 109 GC/kg、約3.5 x 109 GC/kg、約4.0 x 109 GC/kg、約4.5 x 109 GC/kg、約5.0 x 109 GC/kg、約5.5 x 109 GC/kg、約6.0 x 109 GC/kg、約6.5 x 109 GC/kg、約7.0 x 109 GC/kg、約7.5 x 109 GC/kg、約8.0 x 109 GC/kg、約8.5 x 109 GC/kg、約9.0 x 109 GC/kg、約9.5 x 109 GC/kg、約1.0 x 1010 GC/kg、約1.5 x 1010 GC/kg、約2.0 x 1010 GC/kg、約2.5 x 1010 GC/kg、約3.0 x 1010 GC/kg、約3.5 x 1010 GC/kg、約4.0 x 1010 GC/kg、約4.5 x 1010 GC/kg、約5.0 x 1010 GC/kg、約5.5 x 1010 GC/kg、約6.0 x 1010 GC/kg、約6.5 x 1010 GC/kg、約7.0 x 1010 GC/kg、約7.5 x 1010 GC/kg、約8.0 x 1010 GC/kg、約8.5 x 1010 GC/kg、約9.0 x 1010 GC/kg、約9.5 x 1010 GC/kg、約1.0 x 1011 GC/kg、約1.5 x 1011 GC/kg、約2.0 x 1011 GC/kg、約2.5 x 1011 GC/kg、約3.0 x 1011 GC/kg、約3.5 x 1011 GC/kg、約4.0 x 1011 GC/kg、約4.5 x 1011 GC/kg、約5.0 x 1011 GC/kg、約5.5 x 1011 GC/kg、約6.0 x 1011 GC/kg、約6.5 x 1011 GC/kg、約7.0 x 1011 GC/kg、約7.5 x 1011 GC/kg、約8.0 x 1011 GC/kg、約8.5 x 1011 GC/kg、約9.0 x 1011 GC/kg、約9.5 x 1011 GC/kg、約1.0 x 1012 GC/kg、約1.5 x 1012 GC/kg、約2.0 x 1012 GC/kg、約2.5 x 1012 GC/kg、約3.0 x 1012 GC/kg、約3.5 x 1012 GC/kg、約4.0 x 1012 GC/kg、約4.5 x 1012 GC/kg、約5.0 x 1012 GC/kg、約5.5 x 1012 GC/kg、約6.0 x 1012 GC/kg、約6.5 x 1012 GC/kg、約7.0 x 1012 GC/kg、約7.5 x 1012 GC/kg、約8.0 x 1012 GC/kg、約8.5 x 1012 GC/kg、約9.0 x 1012 GC/kg、約9.5 x 1012 GC/kg、約1.0 x 1013 GC/kg、約1.5 x 1013 GC/kg、約2.0 x 1013 GC/kg、約2.5 x 1013 GC/kg、約3.0 x 1013 GC/kg、約3.5 x 1013 GC/kg、約4.0 x 1013 GC/kg、約4.5 x 1013 GC/kg、約5.0 x 1013 GC/kg、約5.5 x 1013 GC/kg、約6.0 x 1013 GC/kg、約6.5 x 1013 GC/kg、約7.0 x 1013 GC/kg、約7.5 x 1013 GC/kg、約8.0 x 1013 GC/kg、約8.5 x 1013 GC/kg、約9.0 x 1013 GC/kg、約9.5 x 1013 GC/kg、或約1.0 x 1014 GC/kg體重。
治療過程可選擇性地涉及重複投予相同的rAAV或不同的載體(例如，rAAV3B.AR2.08或rAAV3B.AR2.16)，特別是對於彼等出生前、新生兒、嬰兒、學步兒童、學齡前兒童、小學生或青少年病患。於一具體實施例，彼等非成人病患經歷肝細胞的活躍增殖，如此需要重複投予如本文所述的為複製缺陷的rAAV。於另一具體實施例，對於沒有天然功能性hLDLR蛋白的非成人患者，特別是在出生前、新生兒或嬰兒階段，先暴露於任選地通過另一種rAAV遞送的功能性hLDLR可能會誘導更好的耐受性和較低的免疫原性，從而導致更高的功效和效率。
於一具體實施例，該方法進一步包括受試者接受免疫抑製劑共療法(immune suppressant co-therapy)。例如，若檢測到針對AAV殼體的不期望的高中和抗體水平，則可以在遞送如揭示的rAAV或組成物之前開始此種免疫抑製劑共療法。於某些具體實施例，作為預防措施，亦可以在遞送rAAV之前開始共療法。於某些具體實施例，免疫抑制共療法在rAAV的遞送後開始，例如，如果在治療後觀察到不希望的免疫反應。
用於此類共療法的免疫抑制劑包括，但未限於糖皮質激素、類固醇、抗代謝藥、T細胞抑制劑、巨環內酯類(macrolides)(例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物)，以及細胞生長抑制劑，包括烷化劑、抗代謝藥、細胞毒性抗生素、抗體、或對免疫親和素(immunophilin)有活性的藥劑。免疫抑制劑可包括強體松、氮芥、亞硝基脲、鉑化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰基嘌呤、氟尿嘧啶、放線菌素、蒽環類、絲裂黴素C、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、IL-2受體- (CD25-)或CD3定向抗體、抗IL-2抗體、環孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片藥物或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。於某些具體實施例，免疫抑制治療可於rAAV投予之前0、1、2、7或更多日前開始，或者在rAAV投予之後0、1、2、3、7或更多日開始。此類療法可在同一日涉及單一藥物(例如強體松)或兩種或多種藥物(例如去氫皮質醇(prednisolone)、嗎替麥考酚酯(micophenolate mofetil，MMF)及/或西羅莫司(即雷帕黴素))共同投予。此等藥物中的一種以上可於基因治療後以相同劑量或調整劑量繼續使用。視需要，此種治療可持續約1週(7日)、兩週、三週、約60日或更長時間。在某些具體實施例，選擇無他克莫司的療程。
下列實施例係為說明本發明的某些具體實施例，而非對其之限制。
E.實施例
實施例1：材料及方法 藉由定向演化(建庫(Library construction)和FRG小鼠選擇)單離AAV3B變異體，並以條碼評估進一步選擇/評估。
建庫 1.藉由使用Q5 DNA聚合酶(NEB)及引子01+引子02的PCR產生DNA片段。 2.將片段以「無疤」方式(藉由使用識別位點與其裂解位點不同的限制酶BsmBI的獨特特性)加載到AAV庫骨架中，並進行電穿孔以生成初始庫L3BSCAR0(其圖譜及序列為L3BSC)。 3.將質體庫與質體pAdΔF6和pRep一起轉染到HEK293細胞中以產生包裝的AAV庫。
引子名稱 序列
引子01 CGGTCACGTCTCCCAACAGAGCAGTATGGAACTGTCGCARMCVACMWCCAGVRCMRCRRCRMAGCTCCCAHCABASRGACAGTCAATGATCAGGGAGCC (SEQ ID NO：35)
引子02 GCCAGTCGTCTCCGGTCTTGCCACACCATGCCAGGTAAGGCTCCCTGATCATTGACTGT (SEQ ID NO：36)
引子03 CGGTCACGTCTCCCAACAGAGCAGTATGGAACTGTCGCA (SEQ ID NO： 37)
引子04 GCCAGTCGTCTCCGGTCTTGCCACACCATGCCAGGTAA (SEQ ID NO：38)
引子05 GGCGAACAGCGGACACCGATATGAA (SEQ ID NO：39)
引子06 GGCTCTCGTCGCGTGAGAATGAGAA (SEQ ID NO：40)
FRG 小鼠選擇 為了選擇用於人類肝臟趨性的庫，將包裝好的AAV庫以≥1 x1012 GC/小鼠之劑量靜脈內注射到人類肝細胞異種移植的Fah –/– /Rag2 –/– /Il2rg –/– (FRG)小鼠中(Yecuris, OR, USA)。四週後，用膠原酶(collagenase)灌注收集肝細胞。然後藉由以抗H-2kb抗體塗覆的磁珠處理肝細胞來富集人類肝細胞，以去除鼠肝細胞。然後使用Q5 DNA聚合酶、引子03及引子04通過RT-PCR自人類肝細胞中回收AAV信號，然後將其加載到庫骨架中，以生成新的庫(圖(map)和序列仍為L3BSC)以用於下一輪選擇。
藉由次世代定序(NGS)監測多樣性變化(變異頻率變化)。
經過兩輪FRG小鼠選擇後，我們挑選16個變異體(變異體具有最高頻率)，並使用條碼評估系統評估其性能。
條碼評估系統 藉由讀取處理前後每個條碼的頻率變化，DNA條碼可用於評估多個測試物品，同時用DNA條碼標記每個測試物品。我們的條碼評估系統用於同時評估各種AAV殼體的性能。該系統的關鍵組件為一系列條碼的順式質體，每個質體均帶有獨特的6-bp DNA條碼。除DNA條碼以外，順式質體相同。順式質體的骨架為用於自互補AAV載體的順式質體---一種轉基因匣，在匣的5'端側接有缺陷的ITR(ΔITR)，在其3'端側接正常的ITR。轉基因匣為CB8啟動子-- SV40內含子-- eGFP-- SV40 polyA信號。再者，移除eGFP轉基因中的所有ATG密碼子，因此沒有蛋白質表現(所得的ORF被命名為dEGFP- dead eGFP)，並且在dEGFP後方插入6-bp的條碼。
將條碼的順式質體與pAdΔF6混合，然後將帶有AAV殼體基因的反式質體三聯轉染HEK293細胞，以製備AAV載體。製備物中的每個載體都具有經測試的殼體作為其殼體，並在其基因體中攜帶來自順式質體的DNA條碼。因此，條碼與測試殼體連結。
對於要測試的多個殼體，分別生產AAV載體製劑，因而每個殼體都連結唯一的DNA條碼。然後將製劑混合在一起進行動物研究。將合併的載體注射到動物體內後，然後收集各種組織並將其保存於RNAlater溶液中。然後可進行PCR及RT-PCR，然後藉由NGS讀取條碼頻率。
條碼名稱 條碼序列
BC01 ATCACG
BC02 CGATGT
BC03 TTAGGC
BC04 TGACCA
BC05 ACAGTG
BC06 GCCAAT
BC07 CAGATC
BC08 ACTTGA
BC09 GATCAG
BC10 TAGCTT
BC11 GGCTAC
BC12 CTTGTA
概述 1.將組織收集於RNAlater(Qiagen)中。將保存的樣品儲存於-20°C或-80°C。 2.按照製造商的說明，使用Trizol(Ambion)萃取RNA。 3.DNase I處理：100 µL反應系統，2 µL DNase I重組體，無RNase(Roche，10 U/µL)，≤100 µg Trizol萃取的RNA，37°C 1小時。 4.按照製造商的說明，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)進行清理。 5.按照RT的手冊(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，Applied Biosystems)進行RT，使用oligo dT(Invitrogen，目錄號18418012，0.1 µg oligo dT /1 µg總RNA)。1 µg總RNA/10 µL反應。包括RT–對照。 6.PCR：Q5 DNA聚合酶。於50 µL反應，≤ 5µL cDNA，2.5 µL之10 µM引子05及2.5 µL之10 µM 引子06。98 ºC 30s，x次循環(98 ºC 10s, 72 ºC 17s)，72 120s，4ºC無窮。 7.以NGS讀取PCR產物以獲得樣品中條碼的頻率。
實施例2：藉由定向演化開發改良的非人類靈長類動物肝臟轉導的AAV3B變異體
概述 使用記分卡方法評估AAV3B高可變區(HVR)VIII中的多樣性(圖3A–圖3C)。然後，我們對人類肝細胞異種移植的Fah–/– /Rag2–/– /Il2rg–/– (FRG)小鼠進行選擇，藉由靜脈內注射庫並由從彼等小鼠中單離的人類肝細胞中回收AAV cDNA，以製備用於下回合的新庫。以經過驗證的條碼系統，在非人靈長類動物(NHP)中評估16種顯示相對頻率增加的AAV3B變異體。在肝臟轉導方面，這十六種變體中的大多數皆優於AAV3B，其中一些表現出較高的肝臟特異性。以治療性轉基因進一步評估兩個變體，用於NHP中的肝臟基因治療，初步結果證實NHP條碼評估結果。
基於工程化形式的 AAV3B ，創建對人類肝細胞具有高趨性和 NAb 識別率低的載體。 我們檢查AAV3B的HVR VIII，並著眼於與其它AAV血清型相比的非保守胺基酸上。將AAV3B VP1與其它180種AAV進行比對，並根據比對序列之間的變異性在582-594之間選擇了10個胺基酸。為了使突變體的活力最大化，設計了簡併密碼子，其目的是引入在其它AAV中比對位置出現的替代胺基酸。將突變的殼體序列選殖到AAV殼體表現質體中，與輔助質體(pAdΔF6)和pRep混合，然後轉染到293細胞中以產生經包裝的AAV庫。
使用具有人類肝細胞異種移植物的FRG小鼠以從庫中選擇具有人類肝臟趨性的AAV突變體。FRG代表Fah(-/-)、Rag-2(-/-)和IL2rg(-/-)的三重突變體。Fah為酪胺酸分解代謝途徑中的一個基因，除非補充藥物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲醯基)1,3-環己二酮(NTBC)以阻斷毒性代謝物的累積，否則Fah的缺失會導致肝臟損傷。當撤回NTBC時，可從人供體中導入肝細胞，且Rag-2(-/-)和IL2rg(-/-)的雙重敲除會引起嚴重的免疫缺陷，並使人類肝細胞得以存活。自Yecuris(Tigard，OR，USA)購買具有重配人類肝細胞的FRG小鼠，並以每隻動物至少1 x 1012 GC的靜脈注射該庫。在第28日，用膠原酶灌注肝臟以收取肝細胞。在注射的4隻動物中，回收了多達4000萬個人類肝細胞，存活率超過95%。使用為小鼠特異性標誌物之具有抗H2-kb的磁珠，用於自收取的細胞中去除小鼠肝細胞。使用靶向設計突變的引子於經由RT-PCR擴增含有HVR VIII的DNA片段。將DNA片段選殖回到殼體表現質體中，以進行下一輪篩選。
為了從庫中選擇對人類肝細胞具有高趨性的載體，我們將AAV3B文注射至異種移植人類肝細胞的FRG小鼠中。從單離的人類肝細胞中回收的RNA片段使用側接工程化HVRVIII區域的引子進行RT-PCR，然後重新選殖到設計為表現AAV3B VP1的順式質體中以重複進行選擇。我們從選擇前(表示為AR0)、第一輪(AR1)之後和第二輪人源化FRG選擇(AR2)之後的質體開始對庫進行次世代定序(NGS)，並檢查了每個變異體的頻率(圖3D)。發現在AR2中頻率最高的18個AAV3B變異體於定序庫中的標準化頻率不斷增加，此暗示此等變異體在轉導人類肝細胞方面可能具有相對優勢。於序列表中提供胺基酸及DNA序列。
實施例3：AAV3B變異體–條碼評估 將條碼化的AAV3B變異體以2x1013 gc/kg的劑量靜脈注射到兩個NHP(B6134和V208L)中。與注射的載體有關的細節示於圖4A和圖4B。載體投予後7日，收取組織。比較條碼的倍數變化。對於動物B6134，測試的每個變異體的倍數變化示於圖4D及圖4E(肝臟)、圖4F(心臟及肌肉)、圖4G(CNS)、及圖4H(其它組織)。對於動物V208L，每個測試變異體的倍數變化示於圖4I及圖4J(肝臟)、圖4K(心臟及肌肉)、圖4L(CNS)、圖4M(其它組織)。
條碼化的AAV3B變異體亦經由腦大池內(ICM)注射~1.8 x1013 及~2.9 x1013 gc /動物的劑量至兩個NHP(E499P和B4404)中(圖6A)。與注射的載體有關的細節示於圖5A及圖5B。載體投予後十四日，收取組織。比較條碼的倍數變化。
對於動物E499P，於大腦皮質及小腦的倍數變化示於圖5C(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5D(對AAV3B的歸一化)。對於動物E499P，於海馬、紋狀體、丘腦的倍數變化示於圖5E(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5F(對AAV3B的歸一化)。對於動物E499P，於脊髓的倍數變化示於圖5G(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5H(對AAV3B的歸一化)。
對於動物B4404，於大腦皮質及小腦的倍數變化示於圖5I(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5J(對AAV3B的歸一化)。對於動物B4404，於海馬、紋狀體、丘腦的倍數變化示於圖5K(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5L(對AAV3B的歸一化)。對於動物B4404，於脊髓的倍數變化示於圖5M(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5N(對AAV3B的歸一化)。
實施例4：用於治療高膽固醇血症的AAV3B變異體的表徵 以使用密碼子優化的三突變hLDLR，我們選擇AAV3B.AR2.08及AAV3B.AR2.16，進一步評估其作為第二代臨床候選藥物的潛力。生產以下載體： a. AAV8.TBG.PI.hLDLR.rBG b. AAV3B.AR2.16.TBG.PI.hLDLR.rBG c. AAV3B.AR2.16.TBG.IVS2.hLDLR011.bGH d. AAV3B.AR2.16.TBG.IVS2.hLDLR011-triple.bGH e. AAV3B.AR2.08.TBG.IVS2.hLDLR011-triple.bGH f. AAV3B.TBG.IVS2.hLDLR011-triple.bGH
rAAV以其殼體和載體基因體命名，格式為「殼體.載體基因體」。AAV殼體可為「AAV8」、「AAV3B.AR2.08」或「AAV3B.AR2.16」殼體。基於載體基因體以「.」分隔的啟動子、內含子、hLDLR編碼序列及polyA序列，進一步標註載體基因體。
如本文所使用，「TBG」表示TBG啟動子。「PI」係指Genbank#U47121 (Promega Corporation，Madison，Wisconsin)的嵌合內含子，而「IVS2」意指人類β-球蛋白內含子2。術語「rBG」提供rAAV中兔β-球蛋白多腺苷酸化信號，而bGH代表來自牛生長激素的多腺苷酸化信號。
關於LDLR編碼序列，「hLDLR」或「LDLR」表示該編碼序列係編碼野生型hLDLR蛋白的人類野生型編碼序列；「hLDLR011」或「LDLR011」表示編碼野生型hLDLR蛋白的工程化編碼序列；及「hLDLR011-triple」或「hLDLR011.triple」或「LDLR011.trip」係指經工程化的編碼序列，其編碼具有三個胺基酸取代的hLDLR蛋白，即L318D/K809R/C818A。
當提及載體基因體或rAAV顆粒而未指定殼體時，使用類似的格式，如下所示：「AAV.啟動子(可選擇的).內含子(可選擇的).hLDLR編碼序列.polyA(可選擇的)」。
A. 非人類靈長類動物 (NHPs) 研究 試驗三個rAAV，包括AAV8.TBG.PI.hLDLr.rBG.KanR、AAV3B‐AR2.08.TBG.IVS2.hLDLR011(L318D, K809R, C818A). bGH、或AAV3B‐AR2.16.TBG.IVS2.hLDLR011 (L318D, K809R,C818A).bGH。每一該rAAV被IV遞送至四隻動物。二隻動物接受2.5 x 1013 GC/kg(圖中指名為「高」)及二隻接受7.5 x 1012 GC/kg(其被指為「低劑量」或「較低劑量」)。
從rAAV投予日(第0日)開始，動物經口接受去氫皮質醇(1 mg/kg/日)以進行短暫免疫抑制。投予載體後約八週，藉由逐漸減少每日劑量使動物逐漸減少去氫皮質醇。測量注射動物的LDL及PCSK9水平，以評估載體的功效。
為了監測轉基因的穩定性，每隻動物在第18日接受至少一次肝活檢。活檢樣本中的載體基因體拷貝顯示出劑量依賴性。與AAV8或AAV3B-AR2.16相比，較低劑量的AAV3B-AR2.08造成較高的載體基因體拷貝。AAV3B-AR2.16組中的兩隻動物(在圖8E中以星號標記)具有1：5中和抗體(Nab)力價，被認為是陰性，但可能影響基因轉移的效率。當類固醇開始逐漸減少時，AAV3B‐AR2.08組中的LDL水平開始回到基線。AAV3B-AR2.08組中的所有四隻動物均接受第二次活檢，並顯示肝臟中的載體GC降低。參見圖10A中的RA3345(M)對RA3345-d83(即在第83日的RA3345(M))和RA3380(F)對RA3380-d88(即在第88日的RA3380(F))。
B. AAV 殼體及 hLDLR 表現匣的比較 在四個NHP上測試上述六個rAAV。一雄性和一雌性NHP接受2.5 x 1013 GC/kg(在圖中標記為「高」，也稱為「高劑量」或「較高劑量」)或7.5 x 1012 GC/kg(被稱為「低劑量」或「較低劑量」)。
從rAAV投予當日(第0日)開始，動物每日口服1 mg/kg體重/日的去氫皮質醇，持續8週。然後通過逐漸減少每日劑量使動物逐漸減少去氫皮質醇。
在第18日對肝臟進行活檢，並在rAAV投予後四個月(第120日)進行完整的屍檢。亦監測臨床病理、細胞因子、補體、脂質和T細胞反應的水平。
C. 使用包含天然 hLDLR 編碼序列的 rAAV 比較 AAV8 與 AAV3B.AR2.16 使用PI內含子及野生型hLDLR編碼序列比較AAV8及AAV3B.AR2.16之AAV殼體。
實驗結果顯示rAAV顆粒成功地將載體基因體遞送至肝臟。簡而言之，評估來自第18日活檢以及第120日屍檢的肝樣品。藉由二倍體基因體將載體基因體的基因體拷貝(GC)標準化，並繪製於圖7A。此外，繪製相關的LDLR mRNA相對表現(圖7B)。觀察到劑量依賴性，即，更高的劑量導致細胞中更多載體拷貝。儘管在大多數動物中觀察到載體拷貝隨時間的推移略有下降，但是在第120日，在任何動物中都沒有消除載體基因體，暗示rAAV治療具有長期效果。
此外，在投予AAV顆粒後第18日，在肝臟中發現hLDLR蛋白的旺盛表現，藉由西方墨點法(WB)、原位雜交(ISH)和免疫組織化學(IHC)顯示。參見圖11、圖12A和圖12B。於第120日，在藉由WB、ISH和IHC所示的AAV8顆粒處理的動物中以及在以WB所示的高劑量的AAV3B.AR2.16顆粒處理的動物中，肝臟LDLR蛋白的表現水平降低。即使於第120日，肝臟中仍觀察到LDLR表現。
低劑量的AAV8顆粒在投予後並未導致LDL的顯著降低。以高劑量的AAV8顆粒治療的標識為RA3344的雄性動物在第0日顯示LDL水平降至起始水平的四分之一，而標識為RA3403的雌性動物之LDL水平無明顯變化(圖6A)。然而，兩種劑量的AAV3B.AR2.16顆粒通過治療後LDL水平的顯著降低證明其有效性(圖6C)，暗示AAV3B.AR2.16殼體比AAV8更有效地遞送至肝細胞。
經由測量有或沒有類固醇時的ALT和AST水平，進一步評估對肝臟的潛在毒性(圖6B及圖6D)。於注射後的雌性動物中和在用高劑量的AAV3B.AR2.16顆粒處理的兩隻動物的AST水平中觀察到瞬時增加。以高劑量的AAV8顆粒治療的雄性動物的AST水平亦顯示相似的增加。然而，所有ALT和AST水平皆回到正常值，表明沒有發生長期肝臟損傷。
D. 三個 hLDLR 表現匣的比較
進行研究以評估三個hLDLR表現匣(「hLDLR」相對於「hLDLR011」相對於「hLDLR011.triple」)。使用AAV3B.AR2.16殼體以遞送包含表達匣之一者的載體基因體。
在經由ISH和IHC顯示的第18日(圖14A和圖14B)活檢的所有組的肝樣品中鑑定hLDLR蛋白的表現。IHC影像在角落處提供了相應的LDL水平，顯示LDLR表現水平與LDL降低之間呈正相關。與LDL水平有關的更多結果繪製於圖8E。與藉由野生型LDLR編碼序列實現的75%降低相比，在更高的劑量下，兩種工程化序列在投予時均提供接近100%的降低。較低劑量的rAAV.hLDLR011顆粒導致LDL降低約75%及約100%降低，而較低劑量的rAAVhLDLR011.triple顆粒導致約50%降低及約80%降低。此數據暗示與野生型序列相比，經工程化的hLDLR編碼序列在治療高膽固醇血症方面為更佳候選物。
關於肝臟毒性，觀察到工程化的hLDLR編碼序列相對於野生型序列的優點。在以rAAV.hLDLR011或rAAV.hLDLR011.triple顆粒治療的動物的低劑量和高劑量組中，ALT以及AST的水平相對較低且穩定。然而，高劑量的包含野生型hLDLR序列的rAAV顆粒在投予時於一動物中的ALT水平及兩動物的AST水平導致瞬時增加。
此外，亦研究以AAV8.hLDLR或AAV3B.AR2.08.hLDLR011.triple或AAV3B.AR1.16.hLDLR011.triple處理的動物的PCSK9水平。以AAV8.hLDLR顆粒治療的動物的LDL水平遵循PCSK9水平的變化。參見，例如，從第14日至第42日識別為17C027的動物。然而，在以AAV.hLDLR011.triple顆粒治療的其它兩組中未發現這種模式。參見，例如，從第14日到第28日，識別為RA33289的動物。數據暗示AAV.hLDLR011.triple顆粒的有益作用。此外，觀察到PCSK9水平升高的rAAV投予量下降，暗示PSCK9對由於rAAV注射引起的LDL水平降低及/或LDLR水平升高做出反應，如此，如果控制不當，可能會對降低LDL水平起負面作用。
E. AAV3B 殼體與兩個 AAV3B 變異體的比較 ( 均包含 hLDLR011.triple 編碼序列 ) 經由使用包含hLDLR011.triple編碼序列的rAAV顆粒，將兩個試驗的AAV3B變異體(即，AAV3B.AR2.08和AAV3B.AR2.16)與原始AAV3B殼體進一步比較(參見，例如，圖8A-圖8F)。
在所有治療的動物中均觀察到LDLR表現。與AAV3B顆粒相比，AAV3B變異體顆粒在降低LDL水平方面顯示出更好的效果(圖8C和圖8E)。例如，變異體組中的LDL在治療時達到較低水平，並在較長時間內保持低於治療前水平。此外，在以AAV3B顆粒治療的動物中，ALT水平以持續方式升高，而AAV3B變異體組僅顯示出暫時的升高。此等結果導出結論，從功效和安全性的角度來看，AAV3B變異體比原始AAV3B殼體更為有利。
有趣的是，儘管投予後有初始反應，但是在注射AAV3B.AR2.08.hLDLR011.triple的動物中，ALT水平和LDL水平具有相似的趨勢(參見，圖8D)。此外，圖18A及圖18B提供於第18日、第83/88日及第120日的LDLR蛋白表現的ISH和IHC結果。發現漸進的減少，暗示hLDLR表現匣及/或hLDLR表現細胞的清除機制。
F. LDLR 在 DKO 小鼠肝臟中表現的時程 建立同型合子FH(HoFH)的雙敲除LDLR-/- Apobec-/- 小鼠模型(DKO小鼠)。我們評估IVS.hLDLR011-triple載體在120日內的可持續表現。雄性DKO小鼠以7.5 x1012 GC/kg的高劑量接受了AAV8.IVS.hLDLR011-triple載體的IV投予。在基因轉移後的多個時間點觀察到血清中LDL-C水平的穩定降低。在載體輸注後第1、3、7、14及120日收取肝臟組織(n=5隻小鼠/時間點)並收集血清樣品。通過PCR分析測得的肝細胞轉導效率顯示於第1日每個細胞的二倍體載體基因體拷貝在不同時間點減少兩倍，並在不同時間點穩定的轉基因表現(hLDLR mRNA)。與第1日相比，在第3、7、14及120日，hLDLR蛋白表現高2-3倍(藉由西方墨點法分析相對表現)。肝臟的IHC染色與原位雜交分析顯示在不同時間點hLDLR表現的高水平。
儘管觀察到hLDLR表現匣被逐漸去除，但在整個觀察期內直至投予rAAV後第120日仍顯示出持續的hLDLR產生(就RNA和蛋白質水平兩者而言，以及低LDL水平)。然後將此等結果與使用AAV3B變異體載體以低劑量顆粒投予的NHP進行比較。參見，圖19A–圖19B。
實施例5：與其它AAV載體比較 圖20A及圖20B顯示多重殼體之IM遞送後血清中肌肉轉導和分泌的蛋白質水平的比較。來自肌肉選擇性啟動子或LacZ的表現mAb的載體被IM遞送。數據顯示AAVrh91實現與AAV1及AAV6類似的肌肉轉導，但產量更高。
(序列表非關鍵詞文字) 對於包含在數字標識符號＜223＞下的自由文本的序列，提供了下列資訊。
SEQ ID NO: ＜223＞下的自由文本
1 ＜223＞合成構築體
2 ＜223＞合成構築體
3 ＜223＞合成構築體
4 ＜223＞合成構築體
5 ＜223＞合成構築體
6 ＜223＞合成構築體
7 ＜223＞合成構築體
8 ＜223＞合成構築體
9 ＜223＞合成構築體
10 ＜223＞合成構築體
11 ＜223＞合成構築體
12 ＜223＞合成構築體
13 ＜223＞合成構築體
14 ＜223＞合成構築體
15 ＜223＞合成構築體
16 ＜223＞合成構築體
17 ＜223＞合成構築體
18 ＜223＞合成構築體
19 ＜223＞合成構築體
20 ＜223＞合成構築體
21 ＜223＞合成構築體
22 ＜223＞合成構築體
23 ＜223＞合成構築體
24 ＜223＞合成構築體
25 ＜223＞合成構築體
26 ＜223＞合成構築體
27 ＜223＞合成構築體
28 ＜223＞合成構築體
29 ＜223＞合成構築體
30 ＜223＞合成構築體
31 ＜223＞合成構築體
32 ＜223＞合成構築體
35 ＜223＞合成構築體
36 ＜223＞引子序列
37 ＜223＞引子序列
38 ＜223＞引子序列
39 ＜223＞引子序列
40 ＜223＞引子序列
41 ＜223＞miRNA目標序列
42 ＜223＞miRNA目標序列
43 ＜223＞miRNA目標序列
44 ＜223＞miRNA目標序列
45 ＜223＞合成構築體
46 ＜223＞合成構築體
本說明書中引用的所有文件均藉由引用而完整併入本文。2019年10月21日提交的美國臨時專利申請案第62/924,112號及2020年5月15日提交的美國臨時專利申請案第63/025,753號藉由引用與其序列表一起完整併入。此處提交的標記為「19-9050PCT_ST25.txt」的序列表及其中的序列和文本藉由引用併入本文。儘管已經參考特定具體實施例而描述本發明，但應當理解，可在不脫離本發明的精神下進行修飾。意圖此種修飾落入所附申請專利範圍之範疇內。
無。
圖1A–圖1E顯示本文所述的AAV3B突變體之胺基酸序列與AAV3B天然序列之比對。 圖2A–圖2S顯示本文所述的AAV3B突變體之核酸序列與AAV3B天然序列之比對。 圖3A–圖3D顯示定向演化平台的工作流程。圖3A及圖3描述AAV定向演化的一般過程。圖3C為記分卡方法的圖解。比對約180個天然AAV的殼體序列，並於HVR.VIII中選擇10個可變的表面暴露位點進行誘變。於每個位點，根據比對選擇頻率最高的胺基酸，並將其併入簡併寡核苷酸(degenerate oligos)中進行誘變。圖3D描述條碼評估系統。帶有CB8.eGFP轉基因盒的自互補AAV載體被用作條碼載體的骨架。首先，消除eGFP基因內的所有ATG。然後將6 bp條碼插入eGFP基因之後。每個條碼載體為單獨產生的。然後將載體聚集一起，之後注入動物體內。收集各種組織並將其保存於-80°C的RNAlater溶液中。使用次世代定序(Next generation sequencing (NGS)以分析來自彼等組織的PCR和RT-PCR產物中的條碼頻率。 圖4A–圖4M顯示了以2×1013 gc/kg IV的劑量注射至兩個NHP(B6134和V208L)中的條碼AAV3B變異體的設計和評估結果。圖4A及圖4B顯示與評估的殼體有關的細節，包括來自兩回合人類化FRG小鼠選擇的AAV3B記分卡變異體。AAV3B及AAV8為對照殼體。動物B6134於屍檢時(第7日)具有ALT升高(圖4C)。(圖4D-圖4M)載體投予後7日，收取組織，並比較條碼倍數變化(相對於輸入顯示，設置為1)。對於動物B6134，將測試的每個變異體的倍數變化示於圖4D及圖4E(肝臟)、圖4F(心臟和肌肉)、圖4G(CNS)、及圖4H(其它組織)。對於動物V208L，將每個測試變異體的倍數變化示於圖4I及圖4J(肝臟)、圖4K(心臟和肌肉)、圖4L(CNS)、圖4M(其它組織)。從左至右標識欄。Lv：肝臟，LV C：尾葉，LV L：左葉，Lu：肺臟，Lu：左上肺，Mu：肌肉，P：胰臟，K：腎臟，xx.g：xx之基因體DNA，xx.R：xx 右，xx.L：xx 左，xx.RL：xx 右下，等等。 圖5A–圖5N顯示經由腦大池內(ICM)注射以每隻動物約1.8 x 1013 及〜2.9 x 1013 gc的劑量注射到兩個NHP(E499P及B4404)中的條碼AAV3B變異體的設計及評估結果。與注射的載體有關的細節示於圖5A及圖5B。投予載體14日後，收取組織。比較條碼倍數變化。對於動物E499P，大腦皮質及小腦的倍數變化示於圖5C(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5D(對AAV3B的歸一化)。於動物E499P，海馬(hippocampus)、紋狀體(striatum)、及丘腦(thalamus)的倍數變化示於圖5E(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5F(對AAV3B的歸一化)。於動物E499P，脊髓的倍數變化示於圖5G(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5H(對AAV3B的歸一化)。於動物B4404，大腦皮質及小腦的倍數變化示於圖5I(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5J(對AAV3B的歸一化)。於動物B4404，於海馬、紋狀體、及丘腦的倍數變化示於圖5K(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5L(對AAV3B的歸一化)。於動物B4404，於脊髓的倍數變化示於圖5M(對變異體輸入頻率的歸一化)及圖5N(對AAV3B的歸一化)。從左至右標識欄。 圖6A–圖6D提供以類固醇或無類固醇治療之AAV8與AAV3B.AR2.16之比較。 圖7A提供於靜脈(iv)注射2.5 x 1013 GC/kg或7.5 x 1012 GC/kg載體後第18日(d18)及120日(d120)之於非人類的靈長類肝臟中含hLDLR表現匣的載體之基因體拷貝。 圖7B提供肝臟中LDLR mRNA水平。 圖8A–圖8F提供有或無類固醇共同治療的AAV3B及工程化變異體之比較。 圖9A提供於靜脈(iv)注射2.5 x 1013 GC/kg或7.5 x 1012 GC/kg載體後第18日、第83/88日及第120日於非人類的靈長類肝臟中含hLDLR表現匣之載體之基因體拷貝。 圖9B提供肝臟中LDLR mRNA水平。 圖10A提供於第18日、第83/88日及第120日NHP之肝臟中hLDLR表現匣載體基因體拷貝(GC)。 圖10B顯示AAV3B及兩個工程化變異體在同一時間點於肝臟中LDLR mRNA的水平。進行肝臟生檢並藉由qPCR測量來自生檢樣品的載體基因體拷貝。此兩變異體的載體基因體拷貝數高於AAV3B，表明它們為適合肝臟基因治療的候選物。 圖11顯示西方墨點法檢測來自所指NHP的肝臟樣品的LDLR水平。 圖12A及圖12B提供使用ISH(圖12A)和IHC(圖12B)在rAAV投予第18日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖13A及圖13B提供使用ISH(圖13A)和IHC(圖13B)在rAAV投予第120日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖14A及圖14B提供使用ISH(圖14A)和IHC(圖14B)在rAAV投予第18日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖15A及圖15B提供使用ISH(圖15A)和IHC(圖15B)在rAAV投予第120日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖16A及圖16提供使用ISH(圖16A)和IHC(圖16B)在rAAV投予第18日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖17A及圖17B提供使用ISH(圖17A)和IHC(圖17B)在rAAV投予第120日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖18A及圖18B提供使用ISH(圖18A)和IHC(圖18B)在rAAV投予第18日、第83/88日、及第120日後所指示的NHP的肝臟LDLR表現水平。 圖19A及圖19B提供所述LDLR-/- Apobec-/- 小鼠模型與NHP的比較，包括肝臟血清LDL、肝臟中的載體拷貝、及LDLR mRNA。 圖20A及圖20B顯示肌肉內(IM)遞送多個殼體後血清中的肌肉轉導與分泌的蛋白質水平的比較。IM遞送載體以表現在小鼠中從肌肉選擇的啟動子或LacZ的mAb。數據顯示，AAVrh91實現與AAV1及AAV6類似的肌肉轉導，但具有更高的產量。AAV3B變異體於肌肉轉導方面優於AAV8及親源AAV3B殼體，且具有高產量。
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無。

Claims (39)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含殼體且具有包裝於該殼體中的載體基因體，該載體基因體包含非AAV核酸序列，其中該殼體係選自： (a)AAV3B.AR2.08殼體，其係由編碼SEQ ID NO：15之胺基酸序列的核酸序列或由編碼與該胺基酸序列具有至少95%同一性的胺基酸序列的核酸序列所製造，其保留AAV3B.AR2.08之SEQ ID NO：15之位置582至594上的胺基酸；或 (b)AAV3B.AR2.16殼體，其係由編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列的核酸序列或由編碼與該胺基酸序列具有至少95%同一性的胺基酸序列的核酸序列所製造，其保留AAV3B.AR2.16之SEQ ID NO：29之位置582至594上的胺基酸。
  2. 如請求項1之rAAV，其中該殼體為AAV3B.AR2.08殼體。
  3. 如請求項2之rAAV，其中該AAV3B.AR2.08殼體係由SEQ ID NO：16之核酸序列或由與編碼SEQ ID NO：15之SEQ ID NO：16有至少90%同一性的序列所編碼。
  4. 如請求項1之rAAV，其中該殼體為AAV3B.AR2.16殼體。
  5. 如請求項4之rAAV，其中該AAV3B.AR2.16殼體係由SEQ ID NO：29之核酸序列或由與編碼SEQ ID NO：30之SEQ ID NO：29有至少90%同一性的序列所編碼。
  6. 如請求項1至5中任一項之rAAV，其中該載體基因體包含組織特異性啟動子。
  7. 如請求項6之rAAV，其中該組織特異性啟動子為肝臟特異性、肌肉特異性、或眼特異性啟動子。
  8. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含 具有下列序列之殼體：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)；及 具有包裝於該殼體中的載體基因體，該載體基因體包含非AAV核酸序列。
  9. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含 具有由下列序列所編碼的序列之殼體：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)，或 具有由與SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32之任一者共享至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的序列所編碼的序列之殼體；及 具有包裝於該殼體中的載體基因體，該載體基因體包含非AAV核酸序列。
  10. 如請求項9之rAAV，其中該殼體係由SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28、或32所編碼。
  11. 如請求項1至10中任一項之rAAV，其進一步包含AAV反向末端重複及異源性核酸序列，該異源性核酸序列與引導由該異源性核酸序列編碼的產物於目標細胞中表現之調控序列可操作地連接。
  12. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含： (A)AAV3B.AR2.01殼體，其包含下列一種以上： (1)AAV3B.AR2.01殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.01 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.01 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：1的1至736之預測的胺基酸序列之核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：2所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：1的1至736之預測的胺基酸序列的SEQ ID NO：2有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.01 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.01 vp2蛋白選自:由編碼SEQ ID NO：1的至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、包含SEQ ID NO：2之至少核苷酸412至2211的序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：2之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.01 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.01 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：2之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：2的至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：1之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：1之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：1之至少胺基酸203至736之核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：1的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.01殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  13. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含： (A)AAV3B.AR2.02殼體，其包含下列一種以上： (1)AAV3B.AR2.02殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.02 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.02 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：3之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：4生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：3之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：4有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.02 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.02 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：4之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：4之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.02 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.02 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：4之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸203 至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：4之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：3之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：3之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：3之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：3的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.02殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  14. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.03殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.03殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.03 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.03 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：5之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：6生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：5之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：6有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.03 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.03 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：6之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：6之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.03 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.03 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：6之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸203 至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：6之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：5之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：5之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：5之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：5的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.03殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  15. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.04殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.04殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.04 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.04 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：7之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：8生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：7之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：8有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.04 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.04 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：8之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：8之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.04 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.04 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：8之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203 至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：8之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：7之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：7的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.04殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  16. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.05殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.05殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.05 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.05 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：9之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、 由SEQ ID NO：10生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：9之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：10有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.05 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.05 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：10之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：10之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.05 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.05 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：10之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸203 至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：10之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：9之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：9之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：9之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：9的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.05殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  17. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.06殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.06殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.06 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.06 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：11之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：12生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：11之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：12有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.06 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.06 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：12之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：12之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.06 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.06 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：12之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：12之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：11之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：11之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：11之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：11的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.06殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  18. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.07殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.07殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.07 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.07 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：13之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：14生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：13之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：14有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.07 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.07 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：14之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：14之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.07 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.07 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：14之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：14之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：13之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：13之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：13之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：13的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.07殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  19. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.08殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.08殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.08 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.08 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：15之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：16生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：15之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：16有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.08 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.08 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：16之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：16之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列而生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.08 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.08 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：16之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：16之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：15之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：15之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：15之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：15的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.08殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  20. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.10殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.10殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.10 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.10 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：17之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：18生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：17之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：18有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.10 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.10 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：18之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：18之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.10 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.10 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：18之至少核苷酸607至2211的序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：17之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：18之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：17之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：17至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：17之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：17的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.10殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  21. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.11殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.11殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.11 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.11 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：19之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：20所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：19之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：20有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.11 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.11 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：20之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：20之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.11 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.11 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：20之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：19之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：20之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：19之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：19至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：19之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：19的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.11殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  22. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.12殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.12殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.12 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.12 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：21之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：22所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：21之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：22有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.12 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.12 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：22之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：22之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.12 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.12 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：22之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：22之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：21之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：21至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：21之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：21的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.12殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  23. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.13殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.13殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.13 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.13 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：23之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：24所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：23之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：24有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.13 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.13 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：24之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：24之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.13 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.13 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：24之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：23之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：24之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：23之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：23至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：23之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：23的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.13殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  24. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.14殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.14殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.14 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.14 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：25之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：26所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：25之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：26有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.14 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.14 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：26之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：26之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.14 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.14 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：26之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：25之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：26之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：25之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：25至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：25之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：25的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.14殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  25. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.15殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.15殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.15 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.15 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：27之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：28所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：27之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：28有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.15 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.15 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：28之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：28之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.15 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.15 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：28之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：27之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：28之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：27之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：27至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：27之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：27的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.15殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  26. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.16殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.16殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.16 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.16 vp1蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：29之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：30所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：29之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：30有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白； AAV3B.AR2.16 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.16 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：30之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：30之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.16 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.16 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：30之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：29之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：30之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：29至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：29之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：29的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.16殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  27. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(A)AAV3B.AR2.17殼體，其包含下列一種以上：(1)AAV3B.AR2.17殼體蛋白，其包含： AAV3B.AR2.17 vp1蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.17 vp1蛋白之異源族群選自：由編碼SEQ ID NO：31之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp1蛋白、由SEQ ID NO：32所生產的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：31之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：32有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp1蛋白；AAV3B.AR2.17 vp2蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.17 vp2蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：32之至少核苷酸412至2211之序列所生產的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：32之至少核苷酸412至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp2蛋白； AAV3B.AR2.17 vp3蛋白之異源族群，該AAV3B.AR2.17 vp3蛋白選自：由編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所生產的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：32之至少核苷酸607至2211之序列所生產的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：31之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：32之至少核苷酸607至2211有至少70%同一性的核酸序列所生產的vp3蛋白；及/或 (2)為編碼SEQ ID NO：31之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp1蛋白之異源族群、為編碼SEQ ID NO：31至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列之產物的vp2蛋白之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：31之至少胺基酸203至736的核酸序列之產物的vp3蛋白之異源族群，其中：vp1、vp2及vp3蛋白含有具胺基酸修飾的亞群，其包含於SEQ ID NO：31的天冬醯胺-甘胺酸對中的至少兩個高度脫醯胺的天冬醯胺(N)，且可選擇進一步包含含有其它脫醯胺的胺基酸的亞群，其中該脫醯胺造成胺基酸改變；及 (B)於AAV3B.AR2.17殼體中的載體基因體，該載體基因體包含核酸分子，該核酸分子包含AAV反向末端重複序列及編碼產物之非AAV核酸序列，該非AAV核酸序列與引導該產物於宿主細胞中表現的序列可操作地連接。
  28. 一種轉導肝臟組織之方法，其包含投予具有如請求項1至27中任一項之rAAV。
  29. 一種產生包含AAV殼體之重組腺相關病毒(AAV)之方法，其包含培養宿主細胞之步驟，該宿主細胞含有：(a)編碼下列AAV殼體蛋白之分子： AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：16)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：30)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)；(b)功能性rep基因；(c)包含AAV反向末端重複(ITRs)及轉基因的袖珍基因；及(d)足夠的輔助功能，以允許袖珍基因包裝至AAV殼體蛋白中。
  30. 一種宿主細胞，其經如請求項1至27中任一項之rAAV轉染。
  31. 一種組成物，其包含至少如請求項1至27中任一項之rAAV及生理學上可相容的載劑、緩衝劑、佐劑、及/或稀釋劑。
  32. 一種包含AAV殼體之重組腺相關病毒(AAV)，該AAV殼體具有選自下列之胺基酸序列：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：1)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：3)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：5)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：7)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：9)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：11)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：13)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：15)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：17)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：19)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：21)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：23)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：25)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：27)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：29)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：31)，進一步包含非AAV核酸序列。
  33. 一種核酸分子，其包含編碼AAV殼體蛋白之核酸序列，其中該核酸序列係選自：AAV3B.AR2.01 (SEQ ID NO：2)、AAV3B.AR2.02 (SEQ ID NO：4)、AAV3B.AR2.03 (SEQ ID NO：6)、AAV3B.AR2.04 (SEQ ID NO：8)、AAV3B.AR2.05 (SEQ ID NO：10)、AAV3B.AR2.06 (SEQ ID NO：12)、AAV3B.AR2.07 (SEQ ID NO：14)、AAV3B.AR2.08 (SEQ ID NO：16)、AAV3B.AR2.10 (SEQ ID NO：18)、AAV3B.AR2.11 (SEQ ID NO：20)、AAV3B.AR2.12 (SEQ ID NO：22)、AAV3B.AR2.13 (SEQ ID NO：24)、AAV3B.AR2.14 (SEQ ID NO：26)、AAV3B.AR2.15 (SEQ ID NO：28)、AAV3B.AR2.16 (SEQ ID NO：30)、或AAV3B.AR2.17 (SEQ ID NO：32)。
  34. 如請求項33之核酸分子，其中該分子進一步包含編碼AAV殼體蛋白及功能性AAV rep蛋白之AAV序列。
  35. 如請求項33或34之核酸分子，其中該分子為質體。
  36. 一種宿主細胞，其以如請求項33至35中任一項之核酸分子轉染。
  37. 一種遞送轉基因至細胞之方法，該方法包含將細胞與如請求項1至27中任一項之rAAV接觸的步驟，其中該rAAV包含轉基因。
  38. 一種如請求項1至27中任一項之rAAV或如請求項31之組成物之用途，其用於遞送所欲基因產物至需要其之受試者中。
  39. 一種如請求項1至27中任一項之rAAV或如請求項31之組成物在製造用於靶向肝臟以遞送基因療法的藥物之用途。
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