KR20210075994A

KR20210075994A - 복제 결함 바이러스 벡터 및 바이러스의 감염성을 측정하는 방법

Info

Publication number: KR20210075994A
Application number: KR1020217010729A
Authority: KR
Inventors: 윈 덴 청; 젠홍 리
Original assignee: 리젠엑스바이오 인크.
Priority date: 2018-10-15
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2021-06-23
Also published as: EP3867412A1; CA3115524A1; JP2022514112A; WO2020081415A1; CN112912518A; US20210324483A1; AU2019362833A1; IL282195A

Abstract

본 명세서에는 복제 결함 바이러스 및 바이러스 벡터의 감염성의 개선된 측정 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스는 재조합 AAV이다.

Description

복제 결함 바이러스 벡터 및 바이러스의 감염성을 측정하는 방법

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 미국 가출원 제62/745,859호(출원일: 2018년 10월 15일)의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

재조합 아데노-연관 바이러스(Adeno-Associated Virus: AAV)-기반 벡터는 현재 개발 중인 가장 널리 사용되는 유전자 요법 제품이다. rAAV 벡터 시스템의 바람직한 사용은 부분적으로 야생형 바이러스와 연관된 질환의 결여, 분열하지 않는 세포뿐만 아니라 분열하는 세포에 형질도입하는 AAV의 능력 및 임상 시험에서 관찰되고, 유전자 요법 적응증에서 전달에 대해 큰 가능성을 나타내는 결과적인 장기간의 강력한 트랜스진(transgene) 발현으로 인한 것이다. 추가로, 상이한 자연 발생 및 재조합 rAAV 벡터 혈청형(serotype)은 상이한 조직, 기관 및 세포를 특이적으로 표적으로 하고, 벡터에 대한 임의의 기존 면역을 회피하는 것을 돕고, 따라서 AAV-기반 유전자 요법의 치료 적용을 확장시킨다.

복제 결함 바이러스(replication defective virus), 예를 들어, AAV 기반 유전자 요법이 후기 임상 단계 및 상업적 사용을 위해 보다 광범위하게 채택될 수 있기 이전에, 재조합 바이러스 입자의 대규모 생산을 위한 새로운 방법이 개발될 필요가 있다. 희석 종점 분석(TCID50 감염성 역가 검정(infectious titer assay)이라고 공지됨)의 제한에 의한 감염성 역가의 절대 정량이 시험관내에서 재조합 바이러스, 예를 들어, AAV, 제제의 감염성을 측정하기 위한 표준 방법이었다. TCID50 감염성 역가 검정은 AAV 벡터 제제가 감염성이라는 것을 확인하는데 유용하였지만, 이의 큰 검정 변동성(최대 200%의 기하 변동 계수(geometric coefficient of variation))은 제품 적합성, 비교 가능성 및 안정성을 지원하는데 있어서 이의 적용성을 제한한다. 따라서, 복제 결함 바이러스 입자, 예를 들어, rAAV 입자를 포함하는 조성물의 감염성을 측정하는 보다 정확한 방법이 필요하다.

본 개시내용은 바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 표적 세포를 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 접종을 허용하는 조건 하에서 시험 조성물 및 기준 조성물과 접촉시키는 단계, 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계, 각각 시험 조성물 및 기준 조성물이 접종된 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계 및 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(viral genome copy: VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(target cell genome copy: TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 10배 미만 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 방법은 평행선 모델(parallel-line model)을 사용하여 기준 샘플과 비교하여 시험 샘플의 감염성을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플에서 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 중합효소 연쇄 반응은 정량적 중합효소 연쇄 반응이다. 일부 실시형태에서, 중합효소 연쇄 반응은 디지털 중합효소 연쇄 반응이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV, 아데노바이러스, 백시니아(vaccinia) 또는 렌티바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 레트로바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, AAV는 재조합 AAV(rAAV)이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 Huh-7 세포이다.

본 개시내용은 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 갖는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 검출 가능하게 표지되고, 여기서 검출 가능한 표지는 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 FAM, JOE, TAMRA 및 ROX 중 하나 이상을 포함한다.

본 개시내용은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 생물학적 샘플로부터의 DNA를 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 관심대상 폴리뉴클레오타이드의 생산 방법을 제공한다.

본 개시내용은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 개시내용은 바이러스 입자를 포함하는 기준 샘플의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 샘플의 감염성을 결정하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 (a) 바이러스 서열을 증폭시킬 수 있는, 선택적으로 프로브를 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, (b) 표적 세포 게놈 서열을 증폭시킬 수 있는, 선택적으로 프로브를 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 및 (c) 바이러스 기준 샘플 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 서열을 증폭시킬 수 있는, 선택적으로 프로브를 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포 게놈 서열을 증폭시킬 수 있는, 선택적으로 프로브를 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 개시내용은 상이한 조건 하에서 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트 하에서 표적 세포에 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 접종하는 단계; 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계; 각각 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트 하에서 접종된 표적 세포로부터 제1 핵산 샘플 및 제2 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및 제1 핵산 샘플 및 제2 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 제공한다.

[1] 바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법으로서,

[a] 표적 세포에 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물을 별개로 접종하는 단계;

[b] 상기 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계;

[c] 각각 상기 시험 조성물이 접종된 상기 표적 세포 및 상기 기준 조성물이 접종된 상기 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및

[d] 상기 시험 핵산 샘플 및 상기 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.

[2] 바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법으로서,

[a] 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물의 연속 희석물을 제조하는 단계;

[b] 표적 세포에 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물의 연속 희석물을 별개로 접종하는 단계;

[c] 상기 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계;

[d] 각각 상기 시험 조성물이 접종된 상기 표적 세포 및 상기 기준 조성물이 접종된 상기 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및

[e] 상기 시험 핵산 샘플 및 상기 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.

[3] [2]에 있어서, 상기 연속 희석물은 10배 미만의 희석물인, 방법.

[4] [2]에 있어서, 상기 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물인, 방법.

[5] [2]에 있어서, 상기 연속 희석물은 2배 희석물인, 방법.

[6] [2] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 연속 희석물은 적어도 2배 희석물, 적어도 3배 희석물, 적어도 5배 희석물 또는 적어도 10배 희석물을 포함하는, 방법.

[7] [2] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 연속 희석물은 2배 희석물 내지 20배 희석물을 포함하는, 방법.

[8] [2] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 평행선 모델을 사용하여 상기 기준 조성물과 비교하여 상기 시험 조성물의 상기 감염성을 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법.

[9] [8]에 있어서, 상기 기준 조성물과 비교하여 상기 시험 조성물의 상기 감염성을 계산하는 단계는,

[a] 시험 조성물 및 기준 조성물의 각각의 희석물에 대해서 VGC:TCGC 비를 계산하는 단계;

[b] 시험조성물 및 기준 조성물에 대한 로그 VGC:TCGC 비 대 로그 희석을 플로팅하는 단계;

[c] 상기 시험 조성물 데이터 지점 및 상기 기준 조성물 데이터 지점을 공통 기울기를 사용하여 시험 조성물 선 및 기준 조성물 선에 피팅하는 단계; 및

[d] 하기 수학식으로서 상기 기준 조성물과 비교하여 상기 시험 조성물의 상기 감염성을 계산하는 단계를 포함하는, 방법:

[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 변동 계수(cv)는 약 100% 미만, 약 50% 미만 또는 약 25% 미만인, 방법.

[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 세포에 접종하는 단계는,

[a] 약 5분 내지 약 3일 동안,

[b] 약 12시간 내지 약 36시간 동안,

[c] 약 18시간 내지 약 30시간 동안,

[d] 약 1시간, 약 2시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간 또는 약 36시간 동안,

[e] 약 1일 또는 약 1.5일 또는 약 2일 동안 또는

[f] 약 24시간 동안

바이러스 입자의 존재 하에서 상기 표적 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 방법.

[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 조성물에서 상기 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정되는, 방법.

[13] [12]에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 정량적 중합효소 연쇄 반응인, 방법.

[14] [12]에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 디지털 중합효소 연쇄 반응인, 방법.

[15] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스인, 방법.

[16] [15]에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV, 아데노바이러스, 백시니아 또는 렌티바이러스인, 방법.

[17] [15]에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 레트로바이러스인, 방법.

[18] [15]에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV인, 방법.

[19] [18]에 있어서, 상기 AAV는 재조합 AAV(rAAV)인, 방법.

[20] [19]에 있어서, 상기 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.

[21] [20]에 있어서, 상기 rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.

[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포인, 방법.

[23] [22]에 있어서, 상기 표적 세포는 Huh-7 세포인, 방법.

[24] [1] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물은 동일한 역가를 갖되, 상기 역가는 밀리리터당 게놈 카피(GC)로 측정되는, 방법.

[25] [1] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물은 상이한 역가를 갖되, 상기 역가는 밀리리터당 게놈 카피(GC)로 측정되는, 방법.

[26] [24] 또는 [25]에 있어서, 상기 시험 조성물의 상기 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ rAAV 입자인, 방법.

[27] [24] 내지 [26] 중 어느 하나에 있어서, 상기 기준 조성물의 상기 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ rAAV 입자인, 방법.

[28] 단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 포함하는,

[a] 5' - GGACATCATGAAGCCCCTT - 3'(서열번호 1),

[b] 5' - TCCAACACACTATTGCAATGAAAA - 3'(서열번호 2),

[c] 5' - AGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAA - 3'(서열번호 3),

[d] 5' - TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT - 3'(서열번호 4),

[e] 5' - CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT - 3'(서열번호 5) 또는

[f] 5' - TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCA - 3'(서열번호 6)

의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 갖는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.

[29] 단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 갖고, 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.

[30] 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드.

[31] 조성물로서, (i) [28] 내지 [30] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 검출 가능한 표지를 포함하되, 상기 표지는 상기 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착되는, 조성물.

[32] [31]에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광 표지인, 조성물.

[33] [32]에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 FAM, JOE, TAMRA 및 ROX 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.

[34] 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머.

[35] 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 각각 서열번호 4 및 5의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머.

[36] 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물로서, 상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조합물.

[37] 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물로서, 상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조합물.

[38] 관심대상 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법으로서, 생물학적 샘플로부터의 DNA를 [34] 또는 [35]의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.

[39] 관심대상 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법으로서, 생물학적 샘플로부터의 DNA를 [36] 또는 [37]의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.

[40] 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트로서, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.

[41] [34]의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트.

[42] [36]의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트.

[43] [34]의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 기준 샘플의 감염성과 비교하여 rAAV 시험 샘플의 감염성을 결정하기 위한 키트.

[44] [43]에 있어서, [35]의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 더 포함하는, 키트.

[45] [36]의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 rAAV 시험 조성물의 감염성을 결정하기 위한 키트.

[46] [45]에 있어서, [37]의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 더 포함하는, 키트.

[47] [40] 내지 [46] 중 어느 하나에 있어서, rAAV 기준 조성물을 더 포함하는, 키트.

[48.] 상이한 조건 하에서 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법으로서,

[a] 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트 하에서 표적 세포에 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 접종하는 단계;

[c] 각각 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트 하에서 접종된 표적 세포로부터 제1 핵산 샘플 및 제2 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및

[d] 상기 제1 핵산 샘플 및 상기 제2 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.

[49.] [48]에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트는 동일한 표적 세포를 사용하는, 방법.

[50.] [48]에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트는 상이한 표적 세포를 사용하는, 방법.

[51.] [50]에 있어서, 상기 상이한 표적 세포는 상이한 유전자 변형을 포함하는, 방법.

[52.] [50]에 있어서, 상기 상이한 표적 세포는 상기 표적 세포 중 하나에서의 유전자 변형의 존재를 제외하고는 동일한, 방법.

[53.] [49] 내지 [52] 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 세포에 접종하는 단계는 표적 세포에 상기 조성물의 연속 희석물을 접종하는 것을 포함하는, 방법.

[54.] [53]에 있어서, 상기 연속 희석물은 2배 희석물인, 방법.

[55.] [53] 또는 [54]에 있어서, 상기 표적 세포에 접종하는 단계는 표적 세포에 상기 조성물의 연속 희석물을 접종하는 것을 포함하는, 방법.

[56.] [53] 내지 [55] 중 어느 하나에 있어서, 평행선 모델을 사용하여 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트 하에서 상기 조성물의 상대 감염성을 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법.

[57.] [56]에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트 하에서 상기 조성물의 상대 감염성을 계산하는 상기 단계는,

[a] 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트의 각각의 희석물에 대해서 VGC:TCGC 비를 계산하는 단계;

[b] 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트에 대한 로그 VGC:TCGC 비 대 로그 희석을 플로팅하는 단계;

[c] 제1 조건 데이터 지점 및 제2 조건 데이터 지점을 공통 기울기를 사용하여 제1 조건 선 및 제2 조건 선에 피팅하는 단계; 및

[d] 하기 수학식으로서 상기 제2 조건과 비교하여 상기 제1 조건 하에서의 상기 감염성을 계산하는 단계

를 포함하는, 방법:

.

[58.] [53] 내지 [57] 중 어느 하나에 있어서, 변동 계수(cv)는 약 100% 미만, 약 50% 미만 또는 약 25% 미만인, 방법.

[59.] [53] 내지 [58] 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 조성물에서 상기 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정되는, 방법.

[60.] [59]에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 정량적 중합효소 연쇄 반응인, 방법.

[61.] [59]에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 디지털 중합효소 연쇄 반응인, 방법.

[62.] [48] 내지 [61] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스인, 방법.

[63.] [62]에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV, 아데노바이러스, 백시니아 또는 렌티바이러스인, 방법.

[64.] [62]에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 레트로바이러스인, 방법.

[65.] [62]에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV인, 방법.

[66.] [65]에 있어서, 상기 AAV는 재조합 AAV(rAAV)인, 방법.

[67.] [66]에 있어서, 상기 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.

[68.] [67]에 있어서, 상기 rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.

[69.] [48] 내지 [68] 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 조건 세트 하의 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포를 포함하는, 방법.

[70.] [22] 또는 [69]에 있어서, 적어도 하나의 조건 세트 하의 상기 표적 세포는 Huh-7 세포를 포함하는, 방법.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 단리된 rAAv 입자를 포함하는 조성물의 감염성을 결정하는 방법을 포함하며, 이 조성물은 불순물(예를 들어, rAAV 생산 배양물)을 포함하는 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시킴으로써 생산되며, rAAV 입자를 단리시키는 방법은 하나 이상의 가공 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 멸균 여과 중 적어도 하나이다. 추가 실시형태에서, 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 멸균 여과 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6개를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가공은 수거된 세포 배양물의 원심분리를 포함하지 않는다.

본 개시내용 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 원심분리, 심층 여과, 접선 유동 여과, 초여과, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해서 불순물을 포함하는 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시키는 단계, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 rAAV 입자의 감염성을 결정하는 단계 및 단리된 rAAV 입자를 제형화하여 약제학적 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.

본 개시내용 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 약제학적 단위 투여형의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 원심분리, 심층 여과, 접선 유동 여과, 초여과, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해서 불순물을 포함하는 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시키는 단계, 본 명세서세 개시된 방법을 사용하여 rAAV 입자의 감염성을 결정하는 단계 및 단리된 rAAV 입자를 제형화하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 추가의 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 보다 자명할 것이다.

도 1은 상대 감염성 방법의 작업흐름을 도시한 도면.
도 2는 평행선 모델을 사용한 상대 감염성의 계산을 도시한 도면.

본 명세서에는 복제 결함 바이러스, 예를 들어, AAV 벡터를 포함하는 조성물의 감염성을 결정하는 방법이 제공된다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 명세서에 개시된 방법이 상당히 개선된 정확성을 제공한다는 것을 발견하였다. 특히, 본 명세서에 개시된 방법은 감염성을 측정하는 현재 표준인 TCID50 검정보다 상당한 이점을 제공한다. 이점은 더 적은 샘플 가공을 사용한 개선된 정확성, 개선된 재현성 및 더 신속한 결과를 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법의 개선된 정확성 및 속도는 이러한 방법을 복제 결함 바이러스(예를 들어, AAV)를 포함하는 약제학적 조성물의 개발 및 생산에서의 다양한 적용에 적합하게 만든다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법은, 이러한 방법이 상이한 부형제를 포함하는 상당히 많은 수의 샘플의 감염성의 신속하고 고도로 정확한 비교를 가능하게 하고/하거나 상이한 시간 기간 동안 상이한 조건 하에서 저장되었기 때문에, 제형 개발에 사용하기에 양호하게 적합하다. 본 명세서에 개시된 방법은 또한 예를 들어, 로트 방출 검정(lot release assay)에서 약제학적 투여량의 생물학적 활성을 결정하는데 상당히 적합하다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복제 결함 바이러스, 예를 들어, AAV 벡터를 포함하는 조성물의 감염성의 작은 차이를 검출 및 정량할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 기준 표준품의 희석 시리즈와 병행하여 복제 결함 바이러스 시험 샘플의 희석 시리즈로 부착성 세포를 감염시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 희석 시리즈는 2배, 3배 또는 5배 희석 시리즈이다. 감염 기간 후에, 세포를 세척하고, 수집하고, PCR, 예를 들어, ddPCR에 적용하여 세포에 존재하는 바이러스 벡터 DNA를 정량한다. 각각의 희석물에서 회수된 바이러스 벡터 DNA의 양을 사용하여 기준 표준품과 비교하여 샘플의 감염성을 계산한다. 본 명세서에 기재된 방법은 복제 결함 바이러스를 포함하는 조성물의 상이한 배취의 감염성을 비교할 뿐만 아니라 분해로 인한 감염성의 변화를 정량하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 또한 공정 및 제형 개발을 뒷받침하기 위한 플랫폼 방법으로서의 상이한 프로젝트에 걸쳐서 상이한 인간 세포를 감염시키는 복제 결함 바이러스 벡터의 능력을 비교하거나, 재조합 방식으로 조작된 변이체에 대한 감염성의 개선을 평가하거나, 바이러스 감염 동역학을 프로빙하거나 또는 변이체, 예를 들어, 상이한 캡시드를 포함하는 변이체의 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 벡터는 AAV이다. 당업자는 본 명세서에 기재된 방법이 또한 예를 들어, 복제 결함 바이러스의 조성물에 의한 감염에 관대한 세포를 스크리닝 및 식별하기 위해서, 바이러스 조성물에 의한 개선된 감염성을 위한 조건을 스크리닝 및 식별하는데 사용될 수 있음을 인식한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상이한 세포주에서 바이러스 제제의 상대 감염성을 결정하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 유전자 변형을 포함하는, 예를 들어, 트랜스진을 포함하는 세포주의 변이체에 대한 바이러스 제제의 상대 감염성을 결정하는데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16 및 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 rAAV 혈청형에 적합하다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV8 입자의 감염성을 측정하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV8 유도체 입자, rAAV8 변형 입자 또는 rAAV8 위형 입자의 감염성을 측정하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV9 입자의 감염성을 측정하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 방법을 사용하여 rAAV9 유도체 입자, rAAV9 변형 입자 또는 rAAV9 위형 입자의 감염성을 측정하는데 사용된다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속한 당업계의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 개시된 방법의 이해를 용이하게 하기 위해서, 다수의 용어 및 구를 하기에 정의한다.

예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법에 사용된, 조성물 중의 성분의 양, 조성물 중의 성분의 농도, 유량, rAAV 입자 수율, 공급 부피, 염 농도 등 및 이들의 값 및 범위를 수식하는 "약"은 예를 들어, 농축액 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 취급 절차를 통해서; 이들 절차에서의 부주의한 오류로 인해서; 조성물을 제조하거나 방법을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이를 통해서; 유사한 고려사항을 통해서 일어날 수 있는 수치 양의 변화를 지칭한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 농도를 갖는 조성물 또는 혼합물의 노화로 인해서 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 농도를 갖는 조성물 또는 혼합물의 혼합 또는 가공으로 인해서 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해서 수식되든 수식되지 않든, 청구범위는 그 양에 대한 등가물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 제시된 수치 또는 범위보다 대략 10 내지 20% 더 크거나 더 작은 범위를 지칭한다. 추가 실시형태에서, "약"은 제시된 수 또는 범위의 ± 10%를 지칭한다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낸다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "복제 결함"은 효과적인 복제를 완결할 수 없는 바이러스 벡터를 지칭한다. 복제-결함 바이러스는 바이러스 게놈 복제 또는 바이러스 입자의 합성 및 조립에 본질적인 하나 이상의 기능에 대한 돌연변이체 또는 결함성이다. 복제-결함 바이러스는 손실된 유전자 산물을 발현하는 보완(complementing) 세포주에서 증식될 수 있다. 그러나, 정상 표적 세포에서, 복제-결함 바이러스는 바이러스 유전자 산물을 발현할 수 있지만, 감염성 자손 바이러스 입자를 형성하도록 복제하지 않는다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 또는 바이러스 벡터는 바이러스 게놈 복제에 본질적인 하나 이상의 기능에 대한 바이러스 또는 벡터 돌연변이체 또는 결함성이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 또는 바이러스 벡터는 바이러스 입자의 합성 및 조립에 본질적인 하나 이상의 기능에 대한 바이러스 또는 벡터 돌연변이체 또는 결함성이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 또는 바이러스 벡터는 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 또는 바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터, HSV 또는 HSV 벡터 또는 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 또는 바이러스 벡터는 AAV 바이러스 또는 바이러스 벡터이다. 복제 결함 바이러스 벡터는 예를 들어, 미국 특허 제7198784호, 제9408905호, 제9862931호, 제8067156호, 미국 특허 출원 공개 제20150291935호, 제20120220492호, 제20180291351호 및 제20170175137호에 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해서 포함된다.

"AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 약어이며, 바이러스 자체 또는 이의 변형, 유도체 또는 위형을 지칭하는데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고, 모든 아형(subtype) 및 자연 발생 형태 및 재조합 형태 둘 다를 포괄한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 지칭한다. 용어 "AAV"는 AAV 1형(AAV1), AAV 2형(AAV2), AAV 3형(AAV3), AAV 4형(AAV4), AAV 5형(AAV5), AAV 6형(AAV6), AAV 7형(AAV7), AAV 8형(AAV8), AAV 9형(AAV9), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV 및 양 AAV 및 이들의 변형, 유도체 또는 위형을 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, 그 등등이다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16의 유도체, 변형 또는 위형이다.

AAV 입자에 적용되는 바와 같은 "재조합"은 AAV 입자가 본래 AAV 입자와 구별되는 AAV 입자 작제물을 야기하는 하나 이상의 절차의 생성물인 것을 의미한다.

재조합 아데노-연관 바이러스 입자 "rAAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 이종 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈이 아닌 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 캡시드화된(encapsidated) 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. rAAV 입자는 임의의 변형, 유도체 또는 위형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 또는 이들의 유도체/변형/위형)을 포함하는 임의의 AAV 혈청형을 가질 수 있다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/변형/위형 및 이러한 혈청형/유도체/변형/위형의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Asokan et al., Mol. Ther. 20(4):699-708 (2012)] 참고). 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.

본 개시내용의 rAAV 입자는 임의의 혈청형 또는 혈청형의 임의의 조합(예를 들어, 2개 이상의 혈청형을 포함하는, 예를 들어, rAAV2, rAAV8 및 rAAV9 입자 중 2개 이상을 포함하는 rAAV 입자의 집단)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10 또는 다른 rAAV 입자 또는 이들 둘 이상의 조합이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV8 또는 rAAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 2개 이상의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16 캡시드 단백질로부터 선택된 2개 이상의 혈청형의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9의 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 갖는다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "디지털 PCR" 또는 "dPCR"은 샘플이 다수의 작은 하위-샘플로 분배되고, 그 다음 각각 PCR 증폭 반응에 적용되는 임의의 PCR 방법을 지칭한다. PCR 증폭 후, 개별 하위-샘플에서 표적 특이적 PCR 최종 생성물의 존재 또는 부재를 검출함으로써 표적 특이적 PCR 최종 생성물을 함유하는 하위샘플(양성 반응) 및 비-표적 특이적 PCR 최종 생성물을 함유하는 하위-샘플(음성 반응)의 비를 결정한다. 프아종 분포를 고려하여, 양성 하위-샘플 반응 및 음성 하위-샘플 반응의 비로부터 출발 샘플에서 표적 서열의 카피 수 및 농도를 계산한다. 종래의 PCR과 달리, 디지털 PCR은 초기 샘플의 목표 농도를 결정하기 위해 수행되는 증폭 주기의 수에 의존하지 않기 때문에, 표적 핵산을 정량화하고 절대 정량을 제공하기 위해 불확실한 지수 데이터에 의존하지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "디지털 소적 PCR"은 초기 샘플이 몇몇 소적으로 분할되는 디지털 PCR 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 디지털 PCR 반응은 단일 dPCR 반응에서 다중 표적 서열의 정량을 허용하는 멀티플렉스 PCR이다. 일부 실시형태에서, dPCR 반응은 초기 샘플이 하위 샘플을 구성하는 몇몇 소적으로 분할되는 디지털 소적 PCR^TM 또는 ddPCR^TM 반응이다.

구 "기준 표준품", "기준 표준품", 또는 "기준 조성물"은 바이러스 입자를 생성시키기 위해서 사용되는 벡터의 양호하게 특징규명된 샘플을 지칭하며, 이러한 구는 전체적으로 상호 교환 가능하게 사용된다. 기준 표준품은 임상 물질을 대표하거나 달리 인증되거나 일관된 방식으로 바이러스 입자를 생성하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 기준 표준품은 내부 또는 외부의 신뢰할 만한 공급원으로부터 선택될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "정제시키는", "정제", "분리시키다", "분리시키는", "분리", "단리시키다", "단리시키는" 또는 "단리"는 표적 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 샘플로부터 rAAV 입자의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 생성물의 순도는 샘플로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 rAAV의 순도는 본 명세서에 기재된 방법을 사용함으로써 샘플로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.

본 개시내용 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수 형태를 포함한다.

본 명세서에서 실시형태가 "포함하는"이라는 언어와 함께 기재된 곳마다, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 관점에서 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 실시형태가 "본질적으로 이루어진"이라는 언어와 함께 기재된 곳마다, "이루어진"의 관점에서 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 또한 이해된다.

본 명세서에서 구, 예컨대, "A 및/또는 B"에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A와 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)을 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 구 예컨대, "A, B 및/또는 C"에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 실시형태 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

본 개시내용의 실시형태가 마쿠스 군 또는 다른 대안의 군의 관점에서 기재된 경우, 개시된 방법은 전체로 열거된 전체 군뿐만 아니라 그 군의 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군 및 또는 군 구성원 중 하나 이상이 없는 주요 군을 포함한다. 개시된 방법은 또한 개시된 방법에서 임의의 그룹 구성원 중 하나 이상의 명시 적 배제를 고려한다.

바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 표적 세포를 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 접종을 허용하는 조건 하에서 시험 조성물 및 기준 조성물과 접촉시키는 단계, 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계, 각각 시험 조성물 및 기준 조성물로 접종된 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계 및 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 임의의 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 시험 또는 기준 조성물에서 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 감염은 바이러스 게놈의 표적 세포 내로의 도입을 야기한다. 접종 이후에 세포외 바이러스 입자의 제거는 감염에 의해서 표적 세포에 도입되지 않은 바이러스 게놈을 제거한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 미만의 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 내지 10배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 5분 내지 약 3일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플에서 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서, 선택적으로 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 평행선 모델을 사용하여 기준 샘플과 비교하여 시험 샘플의 감염성을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 평행선 방법은 상대적인 효력에 기초하여 기준 물질에 대해서 하나 이상의 시험 물질을 비교하기 위한 강력한 생물통계학적 분석 방법이다(Finney, D.J., Statistical method in biological assay (Charles Griffin & Co., Ltd. 1952); Wardlaw, A.C., Practical Statistics for Experimental Biologists 210 (Wiley 1986) (2000)). 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.eB, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 Huh-7 세포이다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물을 제조하는 단계; 표적 세포를 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 접종을 허용하는 조건 하에서 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물과 접촉시키는 단계, 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계, 각각 시험 조성물 및 기준 조성물로 접종된 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계 및 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 미만의 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 내지 10배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 5분 내지 약 3일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플에서 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서, 선택적으로 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 평행선 모델을 사용하여 기준 샘플과 비교하여 시험 샘플의 감염성을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 Huh-7 세포이다.

일부 실시형태에서, 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하기 위한 본 명세서에 개시된 방법은 표적 세포를 시험 조성물 및 기준 조성물로 별개로 접종하는 단계; 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계; 각각 시험 조성물 및 기준 조성물로 접종된 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 미만의 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 내지 10배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 5분 내지 약 3일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플에서 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서, 선택적으로 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 평행선 모델을 사용하여 기준 샘플과 비교하여 시험 샘플의 감염성을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 Huh-7 세포이다.

일부 실시형태에서, 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하기 위한 본 명세서에 개시된 방법은 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물을 제조하는 단계; 표적 세포를 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물로 접종하는 단계; 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계; 각각 시험 조성물 및 기준 조성물로 접종된 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 미만의 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 내지 10배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 5분 내지 약 3일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플에서 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서, 선택적으로 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 평행선 모델을 사용하여 기준 샘플과 비교하여 시험 샘플의 감염성을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 Huh-7 세포이다.

본 명세서에 기재된 방법은 복제 결함 바이러스 입자를 포함하는 시험 샘플의 상대 감염성을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV, 아데노바이러스, 백시니아 또는 렌티바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 레트로바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자이다.

일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 유전적으로 동일한 단리된 바이러스 입자를 포함한다. 유전적으로 동일한 단리된 바이러스 입자는 동일하거나 실질적으로 동일한 게놈 및 동일하거나 실질적으로 동일한 바이러스 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 개별적으로 단리되거나 단리 후에 개별적으로 가공된 유전적으로 동일한 바이러스 입자를 포함한다. 따라서, 당업자는 개시된 방법이 상이한 배취에서 생산된 유전적으로 동일한 단리된 바이러스 입자의 감염성을 비교하는데 사용될 수 있다는 것을 이해한다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 동일한 단리된 바이러스 입자의 상이한 배취가 동일한 공정을 사용하여 생산되었다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 동일한 단리된 바이러스 입자의 상이한 배취는 상이한 상류 및/또는 하류 공정을 사용하여 생산되었다. 일부 실시형태에서, 상이한 상류 공정은 상이한 숙주 세포, 상이한 배양 배지, 상이한 조직 배양 공정 및 상이한 수거 공정 중 하나 이상을 사용하였다. 일부 실시형태에서, 상이한 하류 공정은 상이한 정제 단계, 상이한 완충액, 상이한 가공 온도, 상이한 제형 완충액 및 상이한 저장 온도 중 하나 이상을 사용하였다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 동일한 단리된 바이러스 입자의 상이한 배취는 상이한 시간 기간 동안 저장되었다.

일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물 중에 함유된 바이러스 입자는 유전적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 시험 바이러스 입자 및 기준 바이러스 입자는 상이한 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 바이러스 입자 및 기준 바이러스 입자는 상이한 바이러스 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 바이러스 입자 및 기준 바이러스 입자는 상이한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 캡시드 폴리펩타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 유전적으로 동일한 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 유전적으로 동일한 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 유전적으로 동일한 rAAV 입자를 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 표적 세포를 바이러스 입자와 접촉시키기 전에 희석된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 표적 세포를 바이러스 입자와 접촉시키기 전에 연속적으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 동일한 희석 배율(dilution factor)을 사용하여 연속적으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 10 미만의 희석 배율로 연속적으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9의 희석 배율로 연속적으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 2 미만의 희석 배율로 연속적으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 9배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 2배이다.

본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 적어도 2배 희석물, 적어도 3배 희석물, 적어도 5배 희석물 또는 적어도 10배 희석물을 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 2배 희석물 내지 20배 희석물을 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 2배 희석물 내지 30배 희석물을 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물의 연속 희석물은 3배 희석물, 4배 희석물, 5배 희석물, 6배 희석물, 7배 희석물, 8배 희석물, 9배 희석물, 10배 희석물, 15배 희석물 또는 20배 희석물을 포함한다.

당업자는 본 명세서에 개시된 방법은 바이러스 조성물 이외의 변수가 감염 공정의 효력에 영향을 미치는 방법을 결정하기에 또한 적합하다는 것을 이해한다. 따라서, 본 명세서에는 상이한 조건 하에서 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트 하에서 표적 세포에 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 접종하는 단계; 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계; 각각 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트 하에서 접종된 표적 세포로부터 제1 핵산 샘플 및 제2 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및 제1 핵산 샘플 및 제2 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트는 상이한 표적 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트는 상이한 유전자 변형을 포함하는 상이한 표적 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트는 표적 세포 중 하나에서의 유전자 변형의 존재를 제외하고는 동일한 상이한 표적 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형은 트랜스진의 존재이다. 일부 실시형태에서, 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트는 상이한 조직 유형을 나타내는 표적 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트는 모체 세포주로부터 유래된 상이한 계통인 표적 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 바이러스 조성물의 연속 희석물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 조성물의 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 미만의 희석물이다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플 및 기준 샘플의 연속 희석물은 2배 내지 10배 희석물이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 5분 내지 약 3일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플에서 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서, 선택적으로 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 평행선 모델을 사용하여 기준 샘플과 비교하여 시험 샘플의 감염성을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 바이러스 입자는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 AAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 조건 중 적어도 하나는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 및 A549 세포의 군으로부터 선택된 표적 세포의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 조건 중 적어도 하나는 표적 세포로서의 Huh-7 세포의 사용을 포함한다.

시험 샘플 및 기준 샘플에서 바이러스 입자에 의한 감염에 취약하다고 당업계에 공지된 임의의 세포 또는 세포주는 본 명세서에 기재된 방법을 위한 표적 세포로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 부착 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 부유 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 포유동물 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK21, HEK293, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 Huh-7 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 BHK 세포, COS 세포, PerC6 세포 또는 Vero 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 곤충 세포, 예를 들어, SF-9 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 HEK293 세포를 사용한다.

표적 세포는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 배지에서 유지될 수 있다. 이들 배지는 비제한적으로 변형 이글 배지(Modified Eagle Medium: MEM) 및 둘베코 변형 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM)를 포함한 하이클론 래보러토리즈사(Hyclone Laboratories) 및 JRH에 의해서 생산된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 인비트로젠사(Invitrogen)/써모피셔사(ThermoFisher)로부터의 Dynamis™ 배지, FreeStyle™ 293 발현 배지 또는 Expi293™ 발현 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 Dynamis™ 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 무혈청 배지, 동물-성분 무함유 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함하는 세포 배양물을 사용한다. 일부 실시형태에서, 배지은 동물-성분 무함유 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 우 태아 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민-무함유 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 영양제, 염, 완충제 및 첨가제(예를 들어, 소포제) 중 1종 이상이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 혈청이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 우태아 혈청이 보충된다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 표적 세포는 혈청 기아처리 세포(serum starved cell)이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 바이러스 입자와 접촉하기 전에 24시간 동안 혈청이 기아처리된다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 표적 세포는 다중-웰 플레이트, 예를 들어, 96웰 또는 384웰 플레이트에서 바이러스 입자와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 96웰 플레이트에서 수행된다. 다중-웰 플레이트의 사용이 동일한 검정에서의 동일한 접종 반응의 복제물, 삼중 복제물 또는 더 많은 복제물의 사용을 가능하게 한다는 것이 이해된다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 바이러스 입자가 표적 세포에 도입되기에 적합한 조건 하에서 바이러스 입자의 존재 하에서 표적 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 5분 내지 약 3일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 12시간 내지 약 36시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 18시간 내지 약 30시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 1시간, 약 2시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간 또는 약 36시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 1일 또는 약 1.5일 또는 약 2일 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 접종하는 것은 표적 세포를 바이러스 입자의 존재 하에서 약 24시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 것은 접종된 표적 세포를 용해시키지 않으면서 세포외 바이러스 입자를 제거하기에 적합한 임의의 완충액과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수 또는 둘베코 인산염 완충 식염수로 세척된다.

당업자에 공지된 임의의 방법이 접종된 세포로부터 핵산 샘플을 단리시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 다중-웰 플레이트, 예를 들어, 96-웰 플레이트를 가공하는데 적합한 상업적으로 입수 가능한 시스템 및 시약을 사용하여 단리된다. 적합한 시스템 및 시약은 Extracta^TM DNA 프렙 추출 시약(Prep Extraction Reagent), Wizard® SV 96 게놈 DNA 정제 시스템(Genomic DNA Purification System) 및 GenElute 96웰 조직 게놈 DNA 정제 키트(GenElute 96 Well Tissue Genomic DNA Purification Kit)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 DNA 샘플이다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 RNA 샘플이다.

당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, VGC 대 TGCG 비는 차세대 서열결정, 정량적 PCR(qPCR) 또는 디지털 PCR(dPCR)에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, VGC 대 TGCG 비는 qPCR에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, VGC 대 TGCG 비는 dPCR에 의해서, 예를 들어, 소적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, VGC 대 TGCG 비를 결정하는데 사용되는 PCR(예를 들어, dPCR) 반응은 멀티플렉스 PCR 반응이다. 일부 실시형태에서, 멀티플렉스 PCR(예를 들어, dPCR) 반응은 바이러스 게놈 특이적 반응 및 표적 세포 게놈 특이적 반응을 포함한다.

당업자는 임의의 바이러스 게놈 특이적 서열이 PCR에 의한 증폭에 표적화되어 qPCR 또는 dPCR을 사용하여 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 수 또는 농도를 결정할 수 있다는 것을 이해한다. 유사하게, 임의의 표적 세포 게놈 특이적 서열은 PCR에 의한 증폭에 표적화되어 qPCR 또는 dPCR을 사용하여 샘플에서 표적 세포 게놈 카피(TCGC) 수 또는 농도를 결정할 수 있다. 샘플에서 바이러스 게놈 또는 표적 세포 게놈 특이적 서열의 카피 수 또는 농도를 결정하기 위한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 프로브 조합물을 설계하기 위한 소프트웨어 툴은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 온라인, 예를 들어, 타카라사(Takara), 뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England Biolabs), 인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈사(Integrated DNA Technologies) 및 바이오라드사(BioRad)의 웹사이트에서 입수 가능하다. 이들 소프트웨어 툴 중 임의의 것을 사용하여 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 및 표적 세포 게놈 카피 수 또는 농도를 결정하기 위한 프라이머 및 프로브를 설계할 수 있다.

일부 실시형태에서, 바이러스 게놈 특이적 서열 표적은 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소이다. 일부 실시형태에서, 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소 내에서 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소 내에서 표적 서열을 검출할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 공유 부착된 제1 형광 표지 및 3' 단부에 공유 부착된 제2 형광 표지를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 형광 표지는 FAM이고, 제2 형광 표지는 TAMRA이다.

일부 실시형태에서, 표적 세포 게놈 특이적 서열 표적은 인간 알부민 유전자이다. 일부 실시형태에서, 인간 알부민 유전자 내에서 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인간 알부민 유전자 내에서 표적 서열을 검출할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 공유 부착된 제1 형광 표지 및 3' 단부에 공유 부착된 제2 형광 표지를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 형광 표지는 FAM이고, 제2 형광 표지는 TAMRA이다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 기준 조성물의 감염성과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플에서 결정된 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비로부터 기준 조성물과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 평행선 모델을 사용하여 기준 조성물과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계는 각각의 시험 조성물 및 기준 조성물의 희석물에 대한 VGC:TCGC 비를 계산하는 단계; 시험 조성물 및 기준 조성물에 대한 로그 VGC:TCGC 비 대 로그 희석물을 플로팅하는 단계; 공통 기울기를 사용하여 시험 조성물 선 및 기준 조성물 선에 시험 조성물 데이터 지점 및 기준 조성물 데이터 지점을 피팅하는 단계; 및 안티로그(절편(시험 샘플)-절편(기준 샘플)/공통 기울기)로서 기준 조성물과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 상대 감염성을 결정하는 방법의 재현성 및 정확성은 50% 조직 배양 감염성 용량(TCID50) 검정의 재현성 및 정확성보다 더 높다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 상대 감염성 측정치의 변동 계수(cv)는 약 100% 미만, 약 50% 미만 또는 약 25% 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 상대 감염성 측정치의 변동 계수(cv)는 약 25% 미만이다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 기준 조성물의 감염성과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 시험 조성물 및 기준 조성물은 동일한 역가를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 기준 조성물의 감염성과 비교하여 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 시험 조성물 및 기준 조성물은 상이한 역가를 갖는다. 일부 실시형태에서, 역가는 밀리리터당 바이러스 게놈 카피(GC)로 측정된다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물 및 기준 조성물은 rAAV 입자를 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 갖는다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+10GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 갖는다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 갖는다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+10GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 갖는다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 갖는다.

본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+10GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+11GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+12GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 1×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 조성물의 역가 및 기준 조성물의 역가는 적어도 약 5×10e+13GC/㎖ 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 갖는다.

본 명세서에 개시된 방법은 임의의 AAV 캡시드 혈청형으로부터 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자의 감염성을 측정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV9 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 또는 AAV.7m8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100%의 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.

추가 실시형태에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다.

rAAV 입자

제공된 방법은 임의의 단리된 재조합 AAV 입자의 생산, 임의의 단리된 재조합 AAV 입자를 포함하는 조성물의 생산 또는 임의의 단리된 재조합 AAV 입자의 투여를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에서 사용하기에 적합하다. 이와 같이, rAAV는 당업계에 공지된 임의의 혈청형, 변형 또는 유도체, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 둘 이상의 혈청형을 포함하는 rAAV 입자의 집단)을 가질 수 있고, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7,AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 rAAV 입자 또는 이들 둘 이상의 조합물을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형으로부터의 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전문이 참조에 의해 포함된 문헌[Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068]에 기재된 바와 같은 Anc80 또는 Anc80L65의 캡시드를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 하기 아미노산 삽입물 중 하나를 갖는 캡시드를 포함한다: 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 및 미국 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 LGETTRP 또는 LALGETTRP. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9,458,517호; 및 제9,587,282호 및 미국 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 AAV.7m8의 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제9,585,971호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAVPHP.B를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제9,840,719호 및 국제 특허 공개 제WO 2015/013313호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV.Rh74 및 RHM4-1을 포함하며, 이들 특허 각각은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 특허 공개 제WO 2014/172669호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV rh.74를 포함하며, 상기 특허는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌[Georgiadis et al., 2016, Gene Therapy 23: 857-862 및 Georgiadis et al., 2018, Gene Therapy 25: 450]에 기재된 바와 같은 AAV2/5의 캡시드를 포함하며, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 특허 공개 제WO 2017/070491호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV2tYF를 포함하며, 상기 특허는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌[Puzzo et al., 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418]에 기재된 바와 같은 AAVLK03 또는 AAV3B의 캡시드를 포함하며, 상기 문헌은 전문이 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제8,628,966; 제8,927,514호; 제9,923,120호 및 국제 특허 공개 제WO 2016/049230호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10, HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15 또는 HSC16을 포함하며, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 포함된다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드를 포함한다: 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다: 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 제WO 2003/052051호(예를 들어, 서열번호 2 참고), 제WO 2005/033321호(예를 들어, 서열번호 123 및 88 참고), 제WO 03/042397호(예를 들어, 서열번호 2, 81, 85 및 97 참고), 제WO 2006/068888호(예를 들어, 서열번호 1 및 3 내지 6 참고), 제WO 2006/110689호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고), 제WO2009/104964호(예를 들어, 서열번호 1 내지 5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참고), 제WO 2010/127097호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고) 및 제WO 2015/191508호(예를 들어, 서열번호 80 내지 294 참고) 및 미국 출원 공개 제20150023924호(예를 들어, 서열번호 1, 5 내지 10 참고)에 개시된 캡시드 단백질을 갖고, 이들 각각의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 제WO 2003/052051호(예를 들어, 서열번호 2 참고), 제WO 2005/033321호(예를 들어, 서열번호 123 및 88 참고), 제WO 03/042397호(예를 들어, 서열번호 2, 81, 85 및 97 참고), 제WO 2006/068888호(예를 들어, 서열번호 1 및 3 내지 6 참고), 제WO 2006/110689호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고), 제WO2009/104964호(예를 들어, 서열번호 1 내지 5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참고), 제WO 2010/127097호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고) 및 제WO 2015/191508호(예를 들어, 서열번호 80 내지 294 참고) 및 미국 출원 공개 제20150023924호(예를 들어, 서열번호 1, 5 내지 10 참고)에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.

AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257; 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호; 제WO 2003/052051호, 제WO 2005/033321호, 제WO 03/042397호, 제WO 2006/068888호, 제WO 2006/110689호, 제WO2009/104964호, 제W0 2010/127097호 및 제 WO 2015/191508호 및 미국 출원 공개 제20150023924호에 교시되어 있다.

제공된 방법은 트랜스진을 암호화하는 재조합 AAV의 생산에 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 트랜스진은 하기 표 1A 내지 표 1C으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부 (2) 조절 제어 요소, 예컨대, a) 프로모터/인핸서, b) 폴리A 신호 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 트랜스진을 위한 핵산 서열 암호. 무손상 또는 실질적으로 무손상인 단클론성 항체(mAb)를 발현시키기 위한 다른 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부 (2) 조절 제어 요소, 예컨대, a) 프로모터/인핸서, b) 폴리A 신호 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 항체의 경쇄 Fab 및 중쇄 Fab 또는 중쇄 또는 경쇄 Fab 및 선택적으로 중쇄 Fc 영역을 위한 트랜스진을 위한 핵산 서열 암호. 무손상 또는 실질적으로 무손상인 mAb를 발현시키기 위한 더 다른 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부; (2) 조절 제어 요소, 예컨대, a) 프로모터/인핸서, b) 폴리A 신호 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 항-VEGF(예를 들어, 세바시주맙(sevacizumab), 라니비주납(ranibizumab), 베바시주맙(bevacizumab) 및 브롤루시주맙(brolucizumab)), 항-EpoR(예를 들어, LKA-651), 항-ALK1(예를 들어, 아스크린바쿠맙(ascrinvacumab)), 항-C5(예를 들어, 테시돌루맙(tesidolumab) 및 에쿨리주맙(eculizumab)), 항-CD105(예를 들어, 카로툭시맙(carotuximab)), 항-CC1Q(예를 들어, ANX-007), 항-TNFα(예를 들어, 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab) 및 골리무맙(golimumab)), 항-RGMa(예를 들어, 엘레자누맙(elezanumab)), 항-TTR(예를 들어, NI-301 및 PRX-004), 항-CTGF(예를 들어, pamrevlumab), 항-IL6R(예를 들어, 사트랄리주맙(satralizumab) 및 사릴루맙(sarilumab)), 항-IL4R(예를 들어, 두필루맙(dupilumab)), 항-IL17A(예를 들어, 익세키주맙(ixekizumab) 및 세쿠키누맙(secukinumab)), 항- IL-5(예를 들어, 메폴리주맙(mepolizumab)), 항-IL12/IL23(예를 들어, 유스테키누맙(ustekinumab)), 항-CD19(예를 들어, 이네빌리주맙(inebilizumab)), 항-ITGF7 mAb(예를 들어, 에트롤리주맙(etrolizumab)), 항-SOST mAb(예를 들어, 로모소주맙(romosozumab)), 항-pKal mAb(예를 들어, 라나델루맙(lanadelumab)), 항-ITGA4(예를 들어, 나탈리주맙(natalizumab)), 항-ITGA4B7(예를 들어, 베돌리주맙(vedolizumab)), 항-BLyS(예를 들어, 벨리무맙(belimumab)), 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)), 항-RANKL(예를 들어, 덴소맙(densomab)), 항-PCSK9(예를 들어, 알리로쿠맙(alirocumab) 및 에볼로쿠맙(evolocumab)), 항-ANGPTL3(예를 들어, 에비나쿠맙(evinacumab)*), 항-OxPL(예를 들어, E06), 항-fD(예를 들어, 람팔리주맙(lampalizumab)) 또는 항-MMP9(예를 들어, 안데칼릭시맙(andecaliximab))의 중쇄 Fab; 선택적으로 치료용 항체의 네이티브 형태와 동일한 아이소타입의 Fc 폴리펩타이드, 예컨대, IgG 아이소타입 아미노산 서열 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 Fc; 및 항-VEGF(예를 들어, 세바시주맙(sevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 베바시주맙(bevacizumab) 및 브롤루시주맙(brolucizumab)), 항-EpoR(예를 들어, LKA-651), 항-ALK1(예를 들어, 아스크린바쿠맙(ascrinvacumab)), 항-C5(예를 들어, 테시돌루맙(tesidolumab) 및 에쿨리주맙(eculizumab)), 항-CD105 또는 항-ENG(예를 들어, 카로툭시맙(carotuximab)), 항-CC1Q(예를 들어, ANX-007), 항-TNFα(예를 들어, 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab) 및 골리무맙(golimumab)), 항-RGMa(예를 들어, 엘레자누맙(elezanumab)), 항-TTR(예를 들어, NI-301 및 PRX-004), 항-CTGF(예를 들어, 팜레브루맙(pamrevlumab)), 항-IL6R(예를 들어, 사트랄리주맙(satralizumab) 및 사릴루맙(sarilumab)), 항-IL4R(예를 들어, 두필루맙(dupilumab)), 항-IL17A(예를 들어, 익세키주맙(ixekizumab) 및 세쿠키누맙(secukinumab)), 항- IL-5(예를 들어, 메폴리주맙(mepolizumab)), 항-IL12/IL23(예를 들어, 우스테키누납(ustekinumab)), 항-CD19(예를 들어, 이네빌리주맙(inebilizumab)), 항-ITGF7 mAb(예를 들어, 에트롤리주맙(etrolizumab)), 항-SOST mAb(예를 들어, 로모소주맙(romosozumab)), 항-pKal mAb(예를 들어, 라나델루맙(lanadelumab)), 항-ITGA4(예를 들어, 나탈리주맙(natalizumab)), 항-ITGA4B7(예를 들어, 베돌리주맙(vedolizumab)), 항-BLyS(예를 들어, 벨리무맙(belimumab)), 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)), 항-RANKL(예를 들어, 덴소맙(densomab)), 항-PCSK9(예를 들어, 알리로쿠맙(alirocumab) 및 에볼로쿠맙(evolocumab)), 항-ANGPTL3(예를 들어, 에비나쿠맙(evinacumab)), 항-OxPL(예를 들어, E06), 항-fD(예를 들어, 람팔리주맙(lampalizumab)) 또는 항-MMP9(예를 들어, 안데칼릭시맙(andecaliximab))의 경쇄를 위한 핵산 서열 암호(여기서 중쇄(Fab 및 선택적으로 Fc 영역) 및 경쇄는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 또는 가요성 링커에 의해서 분리되어, 동일한 양의 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장함).

[표 1A]

[표 1B]

[표 1c]

일부 실시형태에서, 본 명세서에는 항-VEGF Fab를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 항-VEGF Fab를 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 라니비주맙(ranibizumab)을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 이두로니다제(IDUA)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 IDUA를 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 이두로네이트 2-설파타제(IDS)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 IDS를 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 저밀도 지질단백질 수용체(low-density lipoprotein receptor: LDLR)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 LDLR을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 트라이펩티딜 펩티다제 1(TPP1) 단백질을 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 TPP1을 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 VEGF 수용체 1의 비-막 연관 스플라이스 변이체(sFlt-1)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 감마-사코글리칸, Rab Escort 단백질 1(REP1/CHM), 레티노이드 아이소머로하이드롤라제(retinoid isomerohydrolase: RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(cyclic nucleotide gated channel alpha 3: CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(cyclic nucleotide gated channel beta 3: CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카복실라제(aromatic L-amino acid decarboxylase: AADC), 리소좀-연관 구성원 단백질 2 아이소폼 B(lysosome-associated membrane protein 2 isoform B: LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제(retinitis pigmentosa GTPase regulator: RPGR), 레티노쉬신(retinoschisin: RS1),　근소포체 칼슘(sarcoplasmic reticulum calcium) ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주-유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(aquaporin1: AQP1), 디스트로핀(dystrophin), 마이오튜불라린 1(myotubularin 1: MTM1), 폴리스타틴(follistatin: FST), 글루코스-6-포스파타제(glucose-6-phosphatase: G6Pase), 아포지질단백질 A2(apolipoprotein A2: APOA2), 유리딘 다이포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1: UGT1A1), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B: ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다제(N-acetyl-alpha-glucosaminidase: NAGLU), 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase: GAA), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase: GLA), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase: GLB1), 지질단백질 리파제(lipoprotein lipase: LPL), 알파 1-항트립신(alpha 1-antitrypsin: AAT), 포스포다이에스터라제 6B(phosphodiesterase 6B: PDE6B), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase: OTC), 생존 운동 뉴런(survival motor neuron: SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(neurturin: NRTN), 뉴로트로핀(Neurotrophin)-3 (NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase: PBGD), 신경 성장 인자(NGF), 미토콘드리아 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자(proto-oncogene), 타이로신 카이나제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다.

추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 AAV 캡시드는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형 AAV 캡시드이다. 위형 rAAV 입자의 생성 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001)] 참고).

추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2종 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다.

특정 실시형태에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 자가-상보성 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol. 8, Number 16, Pages 1248-1254]; 및 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호 참고, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨).

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV4의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV5의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.

추가 실시형태에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 모자이크 AAV 입자는 AAV의 상이한 혈청형으로부터의 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물로 구성된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.

추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 rAAV 입자는 (a) AAV ITR을 포함하는 핵산 벡터 및 (b) AAVx(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16)로부터 유래된 캡시드 단백질로 구성된 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 구성된 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질을 함유하는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질로 구성된 위형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 rAAV8 또는 rAAV9 입자는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형 입자이다. 위형 rAAV 입자의 생성 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001)] 참고).

추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2종 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다. 추가 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2개 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.

rAAV 입자의 단리 방법

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 불순물을 포함하는 공급물(예를 들어, rAAV 생산 배양물)로부터 rAAV 입자를 단리시키는 단계, 단리된 rAAV 입자의 게놈 역가를 결정하는 단계, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 단리된 rAAV 입자의 감염성을 결정하는 단계 및 단리된 rAAV 입자를 제형화하여 약제학적 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 생산하는 방법은 불순물을 포함하는 공급물(예를 들어, rAAV 생산 배양물)로부터 rAAV 입자를 단리시키는 단계, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 단리된 rAAV 입자의 감염성을 결정하는 단계 및 단리된 rAAV 입자를 제형화하여 약제학적 조성물을 생산하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 약제학적 단위 투여형의 생산 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 불순물을 포함하는 공급물(예를 들어, rAAV 생산 배양물)로부터 rAAV 입자를 단리시키는 단계, 단리된 rAAV 입자의 게놈 역가를 결정하는 단계, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 단리된 rAAV 입자의 감염성을 결정하는 단계 및 단리된 rAAV 입자를 제형화하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 약제학적 단위 투여형을 생산하는 방법은 불순물을 포함하는 공급물(예를 들어, rAAV 생산 배양물)로부터 rAAV 입자를 단리시키는 단계, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 단리된 rAAV 입자의 감염성을 결정하는 단계 및 단리된 rAAV 입자를 제형화하는 단계를 포함한다.

단리된 rAAV 입자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 단리시키는 방법은 하류 가공, 예컨대, 예를 들어, 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 멸균 여과 또는 이들의 임의의 조합물(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 멸균 여과 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6개를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자를 단리시키는 방법은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4차 아민 리간드를 사용한 AEX 크로마토그래피), 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4차 아민 리간드를 사용한 AEX 크로마토그래피), 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.

형질주입, 안정적인 세포주 생산 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 허피스 바이러스-AAV 하이브리드 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 비롯한, 다수의 방법이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다. rAAV 바이러스 입자의 생산을 위한 rAAV 생산 배양물은 (1) 예를 들어, 인간-유래 세포주, 예컨대, HeLa, A549 또는 HEK293 세포 및 이들의 유도체(HEK293T 세포, HEK293F 세포), 포유동물 세포주, 예컨대, Vero 또는 곤충-유래 세포주, 예컨대, 바큘로바이러스 생산 시스템의 경우 SF-9를 포함한 적합한 숙주 세포; (2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예컨대, 온도 민감성 아데노바이러스), 허피스 바이러스, 바큘로바이러스에 의해서 제공되는, 적합한 헬퍼 바이러스 기능 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물; (3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; (4) AAV ITR 서열이 측접된 트랜스진(예컨대, 치료용 트랜스진); 및 (5) rAAV 생산을 지원하기 위한 적합한 배지 및 배지 성분이 모두 필요하다. 당업계에 공지된 적합한 배지가 rAAV 벡터의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 이들 배지는 비제한적으로 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 변형 이글 배지(MEM), 둘베코 변형 배지(DMEM) 및 Sf-900 II SFM 배지를 포함한 하이클론 래보러토리즈사 및 JRH에 의해서 생산된 배지를 포함한다.

rAAV 생산 배양물은 사용될 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 온도 범위, 다양한 시간 길이 등) 하에서 일상적으로 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생산 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 롤러 보틀, 중공 섬유 필터, 마이크로캐리어 및 패킹층 또는 유동층 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생산 배양물은 또한 부유-개작 숙주 세포(suspension-adapted host cell), 예컨대, HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포를 포함할 수 있고, 이것은 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flask), 교반 탱크 생물반응기 및 일회용 시스템, 예컨대, 웨이브 백 시스템(Wave bag system)을 포함한 다양한 방식으로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 부유 배양으로 성장하도록 개작된 HEK293 세포이다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 부유 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다.

일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물은 고밀도 세포 배양물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 약 1×10E+06개 세포/㎖ 내지 약 30×10E+06개　세포/㎖의 총 세포 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포 중 약 50% 초과가 살아 있는 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포 또는 SF-9 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 부유 배양으로 성장하도록 개작된 HEK293 세포이다.

제공된 방법의 추가 실시형태에서 rAAV 생산 배양물은 rAAV 입자를 포함하는 부유 배양물을 포함한다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 부유 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 부유 배양은 포유동물 세포 또는 곤충 세포의 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부유 배양은 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포의 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부유 배양은 HEK293 세포의 배양을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자의 생산 방법은 rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; 세포 배양물에 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨), 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨) 또는 이들의 조합물을 포함한다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 출원 제PCT/US19/45926호(출원일: 2019년 8월 9일, 발명의 명칭: "SCALABLE METHOD FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION")에 개시된 바와 같이 생산된다.

재조합 AAV 입자는 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물의 수거에 의해서 또는 생산 배양물로부터의 소모된 배지의 수거에 의해서 rAAV 생산 배양물로부터 수거될 수 있되, 단 세포는 rAAV 입자가 무손상 숙주 세포로부터 배지로 방출되는 당업계에 공지된 조건 하에서 배양되어야 한다. 재조합 AAV 입자는 또한 생산 배양물의 숙주 세포의 용해에 의해서 rAAV 생산 배양물로부터 수거될 수 있다. 적합한 세포 용해 방법이 또한 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 다중 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유동 및 화학물질, 예컨대, 세제 및/또는 프로테아제로의 처리를 포함한다.

수거 시, rAAV 생산 배양물은 하기 중 하나 이상을 함유할 수 있다: (1) 숙주 세포 단백질; (2) 숙주 세포 DNA; (3) 플라스미드 DNA; (4) 헬퍼 바이러스; (5) 헬퍼 바이러스 단백질; (6) 헬퍼 바이러스 DNA; 및 (7) 예를 들어, 혈청 단백질, 아미노산, 트랜스페린 및 다른 저분자량 단백질을 포함한 배지 성분. rAAV 생산 배양물은 생성물-관련 불순물, 예를 들어, 불활성 벡터 형태, 빈 바이러스 캡시드, 응집된 바이러스 입자 또는 캡시드, 잘못 접힌 바이러스 캡시드, 분해된 바이러스 입자를 추가로 함유할 수 있다.

일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물 수거물을 정화시켜 숙주 세포 부스러기를 제거한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물은 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해서 정화된다. 정화는 또한 당업계에 공지된 다양한 다른 표준 기술, 예컨대, 원심분리 또는 당업계에 공지된 0.2mm 이상의 공극 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물은 원심분리에 의해서 정화된다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물의 정화는 원심분리를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 여과를 사용하여 정화된다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 심층 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 심층 여과 및 멸균 여과를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 1종 이상의 상이한 여과 배지를 포함하는 필터 트레인(filter train)을 사용하여 정화된다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 심층 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 1종 이상의 심층 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 2종의 심층 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 멸균 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 2종의 심층 여과 배지 및 멸균 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 필터 매질은 다공성 심층 필터이다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC 및 멸균 등급 필터 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC 및 Sartopore® 2 XLG 0.2㎛를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 그것을 심층 필터와 접촉시키기 전에 전처리된다. 일부 실시형태에서, 전처리는 염을 수거된 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전처리는 화학 응집제(flocculent)를 수거된 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 그것을 심층 필터와 접촉시키기 전에 전처리되지 않는다.

일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 PCT 국제 특허 출원 제PCT/US2019/029539호(출원일: 2019년 4월 27일, 발명의 명칭: "SCALABLE CLARIFICATION PROCESS FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION")에 개시된 여과에 의해서 정화된다.

일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물 수거물은 뉴클레아제(예를 들어, Benzonase®) 또는 엔도뉴클레아제(예를 들어, 세라티아 마세센스(Serratia marcescens)로부터의 엔도뉴클레아제)로 처리되어 생산 배양물 중에 존재하는 고분자량 DNA를 소화시킨다. 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 소화는 당업계에 공지된 표준 조건 하에서 일상적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 소화는 1 내지 2.5단위/㎖의 Benzonase®의 최종 농도에서 주변 온도 내지 37℃ 범위의 온도에서 30분 내지 수 시간 동안 수행된다.

멸균 여과는 멸균 등급 필터 매질을 사용한 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 또는 0.22㎛ 공극 필터이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 폴리에터설폰(PES)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 폴리바이닐리덴 플루오라이드(PVDF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.8㎛ 프리-필터 및 0.2㎛ 최종 필터 막의 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 1.2㎛ 프리-필터 및 0.2㎛ 최종 필터 막의 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 또는 0.22㎛ 공극 필터이다. 추가 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2㎛ 공극 필터이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 Sartopore® 2 XLG 0.2㎛, Durapore™ PVDF Membranes 0.45㎛ 또는 Sartoguard® PES 1.2㎛ + 0.2㎛ 공칭 공극 크기 조합이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 Sartopore® 2 XLG 0.2㎛이다.

일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 크로마토그래피 매질, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 매질에 적용되기 전에 접선 유동 여과("TFF")를 통해서 농축된다. TFF 초여과를 사용한 바이러스의 대규모 농축은 문헌[Paul et al., Human Gene Therapy 4:609-615 (1993)]에 기재되어 있다. 정화된 공급물의 TFF 농축은 기술적으로 관리 가능한 부피의 정화된 공급물을 크로마토그래피에 적용되게 할 수 있고, 긴 재순환 시간을 필요로 하는 일 없이 칼럼의 보다 타당한 크기 설정을 허용한다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 2배 내지 적어도 10배 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 10배 내지 적어도 20배 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 20배 내지 적어도 50배 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 약 20배 농축된다. 당업자는 또한 TFF가 또한 투석을 통해서 정화된 공급물로부터 소분자 불순물(예를 들어, 배지 성분, 혈청 알부민 또는 다른 혈청 단백질을 포함하는 세포 배양물 오염물질)을 제거하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물을 투석시켜 소분자 불순물을 제거한다. 일부 실시형태에서, 투석은 약 3 내지 약 10 투석 부피의 완충액의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투석은 약 5 투석 부피의 완충액의 사용을 포함한다. 당업자는 또한 TFF가 또한 정제 공정에서 다음 단계를 수행하기 전에 완충액을 교환하는 것이 바람직한 정제 공정의 임의의 단계에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 정화된 공급물로부터 rAAV를 단리시키는 방법은 TFF를 사용하여 완충액을 교환시키는 것을 포함한다.

친화도 크로마토그래피를 사용하여 조성물로부터 rAAV 입자를 단리시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정화된 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시킨다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피를 사용하여 접선 유동 여과에 적용된 정화된 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시킨다. 적합한 친화도 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있고, 이것은 비제한적으로 AVB Sepharose™, POROS™ CaptureSelect™ AAVX 친화도 수지, POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화도 수지 및 POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화도 수지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화도 수지이다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화도 수지이다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROS™ CaptureSelect™ AAVX 친화도 수지이다.

음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 조성물로부터 rAAV 입자를 단리시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 최종 농축 및 폴리쉬(polish) 단계로서 친화도 크로마토그래피 이후에 사용된다. 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있고, 비제한적으로 Unosphere Q(바이오라드사(Biorad), 미국 캘리포니아주 허큘스 소재) 및 N-하전된 아미노 또는 이미노 수지, 예컨대, 예를 들어, POROS 50 PI 또는 임의의 DEAE, TMAE, 3차 또는 4차 아민 또는 당업계에 공지된 PEI계 수지(미국 특허 제6,989,264호; 문헌[Brument et al., Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); Gao et al., Hum. Gene Therapy11:2079-2091(2000)])을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 4차 아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 매질은 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 글리시딜메타크릴레이트-에틸렌다이메타크릴레이트 또는 스타이렌-다이바이닐벤젠 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIMmultus™ QA-1 어드밴스트 복합 칼럼(4차 아민), CIMmultus™ DEAE-1 어드밴스트 복합 칼럼(다이에틸아미노), CIM® QA Disk(4차 아민), CIM® DEAE 및 CIM® EDA Disk(에틸렌 다이아미노)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIMmultus™ QA-1 어드밴스트 복합 칼럼(4차 아민)이다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIM® QA Disk(4차 아민)이다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIM QA(비아 세퍼레이션사(BIA Separations), 슬로베니아 소재)이다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 BIA CIM® QA-80(칼럼 부피는 80㎖임)이다. 당업자는, 하류 정제 단계에 의해서 도입될 수 있는 불순물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 불순물을 제거하면서, rAAV가 수지에 결합되어 유지되도록 하는 적합한 이온 농도의 세척 완충액이 식별될 수 있다는 것을 인식할 수 있다.

일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 출원 제PCT/US2019/037013호(출원일: 2019년 6월 13일, 발명의 명칭 "Anion Exchange Chromatography for Recombinant AAV production")에 개시된 방법에 따라서 수행된다.

일부 실시형태에서, rAAV 입자의 단리 방법은 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물에서 벡터 게놈 역가, 캡시드 역가 및/또는 충전(full) 캡시드 대 빈(empty) 캡시드의 비를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 역가는 정량적 PCR(qPCR) 또는 디지털 PCR(dPCR) 또는 소적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 캡시드 역가는 혈청형-특이적 ELISA에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 충전 캡시드 대 빈 캡시드의 비는 분석용 초원심분리(Analytical Ultracentrifugation: AUC) 또는 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy: TEM)에 의해서 결정된다.

일부 실시형태에서, 벡터 게놈 역가, 캡시드 역가 및/또는 충전 캡시드 대 빈 캡시드의 비는 분광광도법에 의해서, 예를 들어, 260nm에서 조성물의 흡광도를 측정하고; 280nm에서 조성물의 흡광도를 측정함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 조성물의 흡광도를 측정하기 전에 변성되지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 조성물의 흡광도를 측정하기 전에 변성된다. 일부 실시형태에서, 260nm 및 280nm에서의 조성물의 흡광도는 분광광도계를 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 260nm 및 280nm에서의 조성물의 흡광도는 HPLC를 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 흡광도는 피크 흡광도이다. 260nm 및 280nm에서 조성물의 흡광도를 측정하는 몇몇 방법은 당업계에 공지되어 있다. 단리된 재조합 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 벡터 게놈 역가 및 캡시드 역가를 결정하는 방법은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 출원 제PCT/US19/29540호(출원일: 2019년 4월 27일, 발명의 명칭: "Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome copies and full/empty ratios of adeno-associated virus particles")에 개시되어 있다.

추가 실시형태에서 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 생산된 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합한 생물학적으로 허용 가능한 제형, 기체, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "약제학적으로 허용 가능한" 조성물은 생물학적으로 바람직하거나 달리 바람직한 물질이며, 예를 들어, 이 물질은 실질적인 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 약제학적 조성물은 예를 들어, 개시된 방법에 따라서 단리된 rAAV를 대상체에게 투여할 때 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달과 양립성인 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀션(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르(elixir), 분산 및 현탁 배지, 코팅, 등장제 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 또는 결정을 포함한다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 보존제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제)가 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 제시된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 바와 같이, 특정 투여 또는 전달 경로와 양립성이도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 다양한 경로에 의해서 투여되기에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 rAAV 입자 및 방법 및 용도에 적절한 약제학적 조성물 및 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315] 참고).

일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적 단위 용량이다. "단위 용량"은 치료될 대상체를 위한 단위 투여형으로서 적절한 물리적으로 구별되는 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 1회 이상의 용량으로 투여되는 경우 목적하는 효과(예를 들어, 예방적 또는 치료적 효과)를 생성하도록 계산된 선택적으로 약제학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 회합된 미리 결정된 양을 함유한다. 단위 용량 형태는 예를 들어, 액체 조성물 또는 동결-건조 또는 동결건조 상태의 조성물; 예를 들어, 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있는 멸균 액체 담체를 포함할 수 있는 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있다. 개별 단위 용량 형태는 다회-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 서열, 플라스미드, 벡터 게놈 및 재조합 바이러스 입자 및 이의 약제학적 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해서 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 포장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 혈청형은 AAV8이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 혈청형은 AAV9이다.

폴리뉴클레오타이드

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드는 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소를 포함하는 재조합 바이러스 또는 바이러스 벡터의 게놈 카피 수를 검출 또는 결정하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드는 인간 알부민 유전자를 포함하는 인간 표적 세포의 게놈 카피 수를 검출 또는 결정하는데 유용하다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 단리된 폴리뉴클레오타이드는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환을 포함하는,

5' - GGA CAT CAT GAA GCC CCT T - 3'(서열번호 1),

5' - TCC AAC ACA CTA TTG CAA TGA AAA - 3'(서열번호 2),

5' - AGC ATC TGA CTT CTG GCT AAT AAA GGA A - 3'(서열번호 3),

5' - TGA AAC ATA CGT TCC CAA AGA GTT T - 3'(서열번호 4),

5' - CTC TCC TTC TCA GAA AGT GTG CAT AT - 3'(서열번호 5), 또는

5' - TGC TGA AAC ATT CAC CTT CCA TGC A - 3'(서열번호 6)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 단리된 폴리뉴클레오타이드는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 갖고, 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 검출 가능한 표지를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 표지는 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 FAM, JOE, TAMRA 및 ROX 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 제공하며, 여기서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 제공하며, 여기서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 4 및 5의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 제공하며, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 제공하며, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 올리고뉴클레오타이드는 프로브이고, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3 및 6으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 프로브는 검출 가능한 표지를 포함한다. 검출 가능한 표지는 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착될 수 있다. 검출 가능한 표지는 형광 표지, 예를 들어, FAM, JOE, TAMRA 및 ROX일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 프로브는 FAM, JOE, TAMRA 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공유 부착된 형광 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 프로브는 5' 단부에 공유 부착된 제1 형광 표지 및 3' 단부에 공유 부착된 제2 형광 표지를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 프로브는 형광 리포터 및 켄처 염료(quencher dye)를 포함하는 이중 표지된 프로브이다. 일부 실시형태에서, 켄처는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET)을 통해서 리포터에 의해서 형광을 켄칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 켄처는 정적 켄칭을 통해서 리포터에 의해서 형광을 켄칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광 리포터는 FAM, JOE, T AMRA 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되고, 켄처는 TAMRA이다.

본 명세서에는 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소 또는 인간 알부민 유전자 내의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소 내에서 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인간 알부민 유전자 내에서 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 명세서에는 qPCR 또는 dPCR 반응을 사용하여 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소 또는 인간 알부민 유전자 내에서 표적 서열을 검출할 수 있는 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 토끼 베타-글로빈 폴리A 요소 내에서 표적 서열을 검출할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 알부민 유전자 내에서 표적 서열을 검출할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 공유 부착된 제1 형광 표지 및 3' 단부에 공유 부착된 제2 형광 표지를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 형광 표지는 FAM이고, 제2 형광 표지는 TAMRA이다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플로부터의 DNA를 본 명세서에 기재된 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 관심대상 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플로부터의 DNA를 본 명세서에 기재된 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 관심대상 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

키트

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트로서, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 rAAV 시험 조성물의 감염성을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 rAAV 기준 조성물을 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는, 상이한 조건 하에서 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 rAAV 기준 조성물을 더 포함한다.

실시예

실시예 1. 상대 감염성은 시험관내에서 AAV 벡터의 감염성의 차이를 정량하기 위한 실현 가능한 방법이다.

시험관내 감염성을 측정하는 방법은 AAV 유전자 요법 제품에 대한 제품 적합성, 비교 가능성 및 안정성을 뒷받침하기 위해서 사용되었다. TCID50 감염성 역가 검정은 AAV 바이러스 벡터의 시험관내 감염성을 측정하기 위해서 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나이지만, 매우 큰 검정 변동성이 문제이다. 예를 들어, TCID50 감염성 역가 검정을 사용한 rAAV2 및 rAAV9 기준 표준 물질의 감염성 측정치는 각각 191%의 기하 CV(SD = 0.46 log10IU/㎖) 및 209% 기하 CV(SD = 0.49 log10IU/㎖)를 가졌다. 높은 검정 변동성은 TCID50을 상이한 벡터 제제에서의 감염성의 차이 또는 분해 결과로서의 감염성의 변화를 측정하는데 있어서 실현 불가능한 툴로 만든다.

AAV 벡터의 시험관내 감염성의 작은 차이를 검출 및 정량할 수 있는 상대 감염성 방법을 개발하였다. 방법의 개략도를 도 1 및 도 2에 제시한다. 정확한 상대 감염성 측정치를 제공하기 위해서, 시험 샘플 및 기준 표준품에서 벡터 게놈 농도의 정확한 정량이 중요하다. 또한 공지된 생물학적 활성 또는 감염성을 갖는 양호하게 특징규명된 기준 표준품을 사용하는 것이 중요하다.

간략하면, 제1일에, 2개의 96웰 에지 플레이트에 HuH-7 세포를 40,000 내지 50,000개의 세포/웰로 시딩하였다. 제2일에, 세포를 밤새 혈청 기아처리하였다. 제3일에, 시험 샘플 및 기준 표준품의 연속 희석물을 0.001% Pluronic F-68을 함유한 배지에서 반복물로 제조하고, 희석된 시험 샘플 및 기준 표준품을 세포로 옮기고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 제4일에, 세포를 DPBS로 세척하고, 웰을 단백질분해 효소 및 교원분해성 효소(collagenolytic enzyme)의 세포 탈착 용액인 Accutase^TM로 처리하고, 세포를 펠릿화하고, 세포 펠릿으로부터 DNA를 추출하였다. 멀티플렉싱된 ddPCR 반응을 설정하여 DNA 샘플 내의 바이러스 게놈 카피 수 및 표적 세포 게놈 카피 수를 결정하였다. 토끼 글로빈 폴리 A 특이적 프라이머/프로브(서열번호 1 내지 3)를 사용하여 바이러스 게놈 카피 수를 결정하였다. 인간 알부민 특이적 프라이머/프로브(서열번호 4 내지 6)를 사용하여 표적 세포 게놈 카피 수를 결정하였다. 평행선 모델을 사용하여 상대 감염성을 도 2에 도시된 바와 같이 결정하였다.

검정의 선형성, 정확성 및 정밀성을 평가하기 위해서, 200%, 150%, 125%, 100%, 75% 또는 50%의 rAAV8 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 기준으로서 100% rAAV 입자를 포함하는 출발 조성물을 사용하여 측정하였다. 하기에 나타낸 결과를 9회의 상이한 실시에 걸쳐서 수집하였다(N=20).

강제 분해 후 상대 감염성의 비교. 60℃에서 10분 동안 인큐베이션된 rAAV 샘플의 상대 감염성을 측정하였다. 미처리 샘플(-80℃에서 저장)의 상대 감염성을 또한 대조군으로서 측정하였다. 60℃에서 인큐베이션된 샘플에 대한 관찰된 상대 감염성은 375%(표준 오차 42%)였다. 미처리 대조군의 상대 감염성은 99%(표준 오차 6%)였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 상대 감염성 방법은 강제 분해 시 감염성의 변화를 검출할 수 있다. 상대 감염성은 응집으로 인한 GC-함유 입자의 흡수 증가로 인해서 증가될 수 있었다.

상이한 rAAV 벡터에서의 상대 감염성의 비교. 상이한 페이로드를 포함하는 AAV9 벡터 및 AAV8 벡터의 상대 감염성을 측정하였다. 얻은 결과를 하기에 제시한다. 상이한 재조합 벡터에 대해서 상이한 ddPCR 방법을 사용하였다.

다수의 배취에서의 상대 감염성의 비교. 동일한 재조합 AAV8 벡터의 다수의 배취의 상대 감염성을 측정하였다. 얻은 결과를 하기에 제시한다.

본 명세서에 기재된 시험관내 상대 감염성 방법은 AAV 벡터의 감염성의 작은 차이를 검출할 수 있다. 상대 감염성 방법은 50 내지 200% 상대 감염성에서 선형이고, 정확하고, 정밀하다. 상대 감염성 방법은 50 내지 200% 상대 감염성에서 선형이고, 정확하고, 정밀하다. 그리고 상대 감염성 방법은 상이한 제제, 생성물 및 AAV 캡시드 혈청형에 걸쳐서 감염성을 비교하기 위한 유용한 툴이다.

실시예 2. 시험관내에서 상이한 세포를 감염시키는 AAV 벡터의 능력 비교

본 명세서에 개시된 시험관내 상대 감염성을 측정하는 방법은 또한 바이러스 감염에 관대한 세포를 스크리닝 및 식별하고, 바이러스 감염에 대한 세포의 민감성을 조절하는 인자를 식별하기에 유용하다. 일 실시형태에서, 바이러스 감염에 관대한 세포 및 조건을 스크리닝 또는 식별하기 위해서, 공지된 생물학적 활성 또는 감염성을 갖는 기준 표준품 또는 단일 AAV 벡터의 시험관내 상대 감염성을 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 상이한 세포 기질 상에서 병렬로 측정한다.

인간 접착성 HEK293 세포주의 상이한 변이체의 비교. 제1일에, 96웰 에지 플레이트에 인간 접착성 HEK293 세포주의 상이한 변이체를 30,000개 세포/웰로 시딩하였다. 제2일에, 세포를 밤새 혈청 기아처리하였다. 제3일에, 단일 AAV8 벡터 기준 표준품의 연속 희석물을 0.001% Pluronic F-68을 함유한 배지에서 반복물로 제조하고, 희석된 기준 표준품을 세포로 옮기고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 제4일에, 세포를 DPBS로 세척하고, 웰을 단백질분해 효소 및 교원분해성 효소(collagenolytic enzyme)의 세포 탈착 용액인 Accutase^TM로 처리하고, 세포를 펠릿화하고, 세포 펠릿으로부터 DNA를 추출하였다. 멀티플렉싱된 ddPCR 반응을 설정하여 DNA 샘플 내의 바이러스 게놈 카피 수 및 표적 세포 게놈 카피 수를 결정하였다. 토끼 글로빈 폴리 A 특이적 프라이머/프로브(서열번호 1 내지 3)를 사용하여 바이러스 게놈 카피 수를 결정하였다. 인간 알부민 특이적 프라이머/프로브(서열번호 4 내지 6)를 사용하여 표적 세포 게놈 카피 수를 결정하였다. 평행선 모델을 사용하여 상대 감염성을 도 2에 도시된 바와 같이 결정하였다. 얻은 결과를 하기에 제시한다.

결과는, 상대 감염성 방법이 세포 변형 및 바이러스 감염에 대한 세포의 민감성을 조절하는 인자를 식별하는데 유용한 툴을 제공한다는 것을 입증한다.

개시된 방법이 가장 실질적이고 바람직한 실시형태인 것으로 현재 간주되는 것과 관련하여 기재되었지만, 본 개시내용에 포함되는 방법은 개시된 실시형태에 제한되지 않고, 그 반대로, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주에 포함되는 다양한 변형 및 등가의 배열을 포함하도록 의도된다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 및 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 둘 다를 포함한 수탁 번호/데이터베이스 서열은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 또는 수탁 번호/데이터베이스 서열이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조에 의해 그렇게 제시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO INC. CHEUNG, Win Den LI, Zhenhong <120> METHODS FOR MEASURING THE INFECTIVITY OF REPLICATION DEFECTIVE VIRAL VECTORS AND VIRUSES <130> 6728.0501 <140> PCT/US19/056042 <141> 2019-10-14 <150> US 62/745,859 <151> 2018-10-15 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 1 ggacatcatg aagcccctt 19 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 2 tccaacacac tattgcaatg aaaa 24 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 3 agcatctgac ttctggctaa taaaggaa 28 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 4 tgaaacatac gttcccaaag agttt 25 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 5 ctctccttct cagaaagtgt gcatat 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 6 tgctgaaaca ttcaccttcc atgca 25

Claims

바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법으로서,
a. 표적 세포에 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물을 별개로 접종하는 단계;
b. 상기 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계;
c. 각각 상기 시험 조성물이 접종된 상기 표적 세포 및 상기 기준 조성물이 접종된 상기 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및
d. 상기 시험 핵산 샘플 및 상기 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(viral genome copy: VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(target cell genome copy: TCGC)의 비를 결정하는 단계
를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
바이러스 입자를 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법으로서,
a. 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물의 연속 희석물을 제조하는 단계;
b. 표적 세포에 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물의 연속 희석물을 별개로 접종하는 단계;
c. 상기 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계;
d. 각각 상기 시험 조성물이 접종된 상기 표적 세포 및 상기 기준 조성물이 접종된 상기 표적 세포로부터 시험 핵산 샘플 및 기준 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및
e. 상기 시험 핵산 샘플 및 상기 기준 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계
를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 연속 희석물은 10배 미만의 희석물인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 연속 희석물은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 8배 희석물인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 연속 희석물은 2배 희석물인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속 희석물은 적어도 2배 희석물, 적어도 3배 희석물, 적어도 5배 희석물 또는 적어도 10배 희석물을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속 희석물은 2배 희석물 내지 20배 희석물을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 평행선 모델(parallel-line model)을 사용하여 상기 기준 조성물과 비교하여 상기 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계를 더 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 기준 조성물과 비교하여 상기 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계는,
a. 시험 조성물 및 기준 조성물의 각각의 희석물에 대해서 VGC:TCGC 비를 계산하는 단계;
b. 시험 조성물 및 기준 조성물에 대한 로그 VGC:TCGC 비 대 로그 희석을 플로팅하는 단계;
c. 상기 시험 조성물 데이터 지점 및 상기 기준 조성물 데이터 지점을 공통 기울기를 사용하여 시험 조성물 선 및 기준 조성물 선에 피팅하는 단계; 및
d. 하기 수학식으로서 상기 기준 조성물과 비교하여 상기 시험 조성물의 감염성을 계산하는 단계
를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법:
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변동 계수(coefficient of variation: cv)는 약 100% 미만, 약 50% 미만 또는 약 25% 미만인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포에 접종하는 단계는,
a. 약 5분 내지 약 3일 동안,
b. 약 12시간 내지 약 36시간 동안,
c. 약 18시간 내지 약 30시간 동안,
d. 약 1시간, 약 2시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간 또는 약 36시간 동안,
e. 약 1일 또는 약 1.5일 또는 약 2일 동안 또는
f. 약 24시간 동안
바이러스 입자의 존재 하에서 상기 표적 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 조성물에서 상기 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정되는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 정량적 중합효소 연쇄 반응인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 디지털 중합효소 연쇄 반응인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV(Adeno-Associated Virus), 아데노바이러스, 백시니아(vaccinia) 또는 렌티바이러스인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 레트로바이러스인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 AAV는 재조합 AAV(rAAV)인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 혈청형(serotype)의 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 표적 세포는 Huh-7 세포인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물은 동일한 역가를 갖되, 상기 역가는 밀리리터당 게놈 카피(GC)로 측정되는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 조성물 및 상기 기준 조성물은 상이한 역가를 갖되, 상기 역가는 밀리리터당 게놈 카피(GC)로 측정되는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 시험 조성물의 상기 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ rAAV 입자인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 조성물의 상기 역가는 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖ rAAV 입자인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 감염성을 결정하는 방법.
단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환을 포함하는,
a. 5' - GGA CAT CAT GAA GCC CCT T - 3'(서열번호 1),
b. 5' - TCC AAC ACA CTA TTG CAA TGA AAA - 3'(서열번호 2),
c. 5' - AGC ATC TGA CTT CTG GCT AAT AAA GGA A - 3'(서열번호 3),
d. 5' - TGA AAC ATA CGT TCC CAA AGA GTT T - 3'(서열번호 4),
e. 5' - CTC TCC TTC TCA GAA AGT GTG CAT AT - 3'(서열번호 5), 또는
f. 5' - TGC TGA AAC ATT CAC CTT CCA TGC A - 3'(서열번호 6)
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 갖는, 단리된 뉴클레오타이드.
단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드를 갖고, 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오타이드.
조성물로서, (i) 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 검출 가능한 표지를 포함하되, 상기 표지는 상기 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착되는, 조성물.
제31항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광 표지인, 조성물.
제32항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 FAM, JOE, TAMRA 및 ROX 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머.
한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 각각 서열번호 4 및 5의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머.
프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물로서, 상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조합물.
프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물로서, 상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조합물.
관심대상 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법으로서, 생물학적 샘플로부터의 DNA를 제34항 또는 제35항의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법.
관심대상 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법으로서, 생물학적 샘플로부터의 DNA를 제36항 또는 제37항의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 방법.
샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트로서, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트.
제34항의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트.
제36항의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는, 샘플에서 rAAV를 검출하기 위한 키트.
제34항의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 기준 샘플의 감염성과 비교하여 rAAV 시험 샘플의 감염성을 결정하기 위한 키트.
제43항에 있어서, 제35항의 한 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 더 포함하는, 키트.
제36항의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 포함하는 기준 조성물의 감염성과 비교하여 rAAV 시험 조성물의 감염성을 결정하기 위한 키트.
제45항에 있어서, 제37항의 프로브, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합물을 더 포함하는, 키트.
제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 기준 조성물을 더 포함하는, 키트.
상이한 조건 하에서 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법으로서,
a. 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트 하에서 표적 세포에 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 접종하는 단계;
b. 상기 접종된 세포를 세척하여 세포외 바이러스 입자를 제거하는 단계;
c. 각각 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트 하에서 접종된 표적 세포로부터 제1 핵산 샘플 및 제2 핵산 샘플을 단리시키는 단계; 및
d. 상기 제1 핵산 샘플 및 상기 제2 핵산 샘플에서 바이러스 게놈 카피(VGC) 대 표적 세포 게놈 카피(TCGC)의 비를 결정하는 단계
를 포함하는, 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제48항에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트는 동일한 표적 세포를 사용하는, 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제48항에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트는 상이한 표적 세포를 사용하는, 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제50항에 있어서, 상기 상이한 표적 세포는 상이한 유전자 변형을 포함하는, 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제50항에 있어서, 상기 상이한 표적 세포는 상기 표적 세포 중 하나에서의 유전자 변형의 존재를 제외하고는 동일한, 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포에 접종하는 단계는 표적 세포에 상기 조성물의 연속 희석물을 접종하는 것을 포함하는, 바이러스 입자의 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제53항에 있어서, 상기 연속 희석물은 2배 희석물인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 표적 세포에 접종하는 단계는 표적 세포에 상기 조성물의 연속 희석물을 접종하는 것을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 평행선 모델을 사용하여 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트 하에서 상기 조성물의 상대 감염성을 계산하는 단계를 더 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제56항에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트 하에서 상기 조성물의 상대 감염성을 계산하는 단계는,
a. 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트의 각각의 희석물에 대해서 VGC:TCGC 비를 계산하는 단계;
b. 제1 조건 세트 및 제2 조건 세트에 대한 로그 VGC:TCGC 비 대 로그 희석을 플로팅하는 단계;
c. 제1 조건 데이터 지점 및 제2 조건 데이터 지점을 공통 기울기를 사용하여 제1 조건 선 및 제2 조건 선에 피팅하는 단계; 및
d. 하기 수학식으로서 상기 제2 조건과 비교하여 상기 제1 조건 하에서의 감염성을 계산하는 단계
를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법:

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제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 변동 계수(cv)는 약 100% 미만, 약 50% 미만 또는 약 25% 미만인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 조성물에서 상기 VGC 및 TCGC는 중합효소 연쇄 반응에 의해서 결정되는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제59항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 정량적 중합효소 연쇄 반응인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제59항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 디지털 중합효소 연쇄 반응인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제48항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자는 복제 결함 바이러스인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제62항에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV, 아데노바이러스, 백시니아 또는 렌티바이러스인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제62항에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 레트로바이러스인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제62항에 있어서, 상기 복제 결함 바이러스는 AAV인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제65항에 있어서, 상기 AAV는 재조합 AAV(rAAV)인, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제66항에 있어서, 상기 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제48항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조건 세트 하의 표적 세포는 BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh-7, Hepa1-6 또는 A549 세포를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.
제22항 또는 제69항에 있어서, 적어도 하나의 조건 세트 하의 상기 표적 세포는 Huh-7 세포를 포함하는, 바이러스 입자를 포함하는 시험 조성물의 상대 감염성을 결정하는 방법.