CN116217661A - 提高aav病毒脑靶向性的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了提高AAV病毒脑靶向性的多肽及其应用。发明人研究发现,使用SDGTVANPFR替换野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586‑588位氨基酸得到的衣壳蛋白突变体MutE,可以有效提高AAV病毒脑组织感染能力,并降低对肝脏的感染能力,从根本上解决AAV载体大脑靶向性的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及提高AAV病毒脑靶向性的多肽及其应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种广泛应用于基因治疗的递送载体,其原理是通过基因工程方法将AAV基因组ITR之间序列替换成目的基因序列,经细胞感染传递到靶细胞,达到基因治疗目的。基于重组AAV具有安全性、高效性、稳定性、持续性、特异性、低整合性等特点,使得AAV成为基因治疗领域主要递送手段之一。在基因治疗应用过程中,活体动物往往需要注射高剂量、高纯度的AAV病毒,而高昂的AAV生产成本成为基因治疗过程中的瓶颈之一。
伴随着基因治疗下游研发技术的成熟,上游AAV生产通量的问题的限制变得越来越明显。为了解决这个问题,现有的策略集中在以下两个方面,一是优化现有的AAV生产工艺;二是寻找包装能力、组织靶向性更好的病毒载体。AAV生产工艺更多的是通过其外部包装条件的优化,不涉及AAV本身的改造。而基于AAV病毒的结构特征,其病毒特征如组织靶向性、免疫原性、包装产量等特征主要由其表面衣壳蛋白决定。如何对AAV衣壳蛋白的改造,进行提高提高AAV病毒的包装产量,是一项亟待解决的问题。
AAV衣壳蛋白与其靶向性的关系尚不明确,现有技术中,主要通过突变体发现具有特定靶向性或高靶向性的AAV衣壳蛋白。提高AAV病毒脑靶向性的多肽报导较少,CN113748122A公开了编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白突变体的核酸,通过AAV随机肽病毒文库进行大量的筛选得到。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足,提供提高AAV病毒脑靶向性的多肽及其应用。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供:提高AAV病毒脑靶向性的多肽,其序列为SDGTVANPFR,用于替换野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586-588位氨基酸。
本发明的第二个方面,提供:一种AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE,使用多肽SDGTVANPFR替换野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586-588位氨基酸得到。更为具体的,AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
本发明的第三个方面,提供:表达本发明第二个方面所述AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE的DNA分子。
本发明的第四个方面,提供:一种表达体系,其可表达本发明第二个方面所述AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE,或含有本发明第三个方面所述的DNA分子序列。
在一些表达体系的实例中,所述表达体系为重组AAV载体。AAV载体的衣壳蛋白被本发明衣壳蛋白突变体MutE替代。
在一些表达体系的实例中,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其突变体中的任意一种。
在一些表达体系的实例中,所述表达体系还包括编码功能性基因产物的核酸分子。
本发明的第五个方面,提供:一种AAV载体,具有本发明第二个方面所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE。
本发明的第六个方面,提供:一种组合物,包括本发明第四个方面所述的表达体系及可接受的载体。
本发明的第七个方面,提供:一种转基因动物模型的构建方法,包括向动物体内导入本发明第六个方面所述的组合物。
本发明的有益效果是:
本发明的一些实例的衣壳蛋白突变体MutE,可以有效提高AAV病毒大脑靶向性,从根本上解决AAV载体,特别是AAV9穿透血脑屏障效率的问题。
附图说明
图1为本发测试例中所构建的突变质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2为本发明实施例中pAAV9包装质粒图谱。
图3为本发明实施例中构建得到的pAAV9-MutE包装质粒图谱。
图4为本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-Luciferase表达质粒图谱。
图5为本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pHelper辅助质粒图谱。
图6为本发测试例中的本发明方案制备得到的腺相关病毒变体和对照组野生型腺相关病毒的病毒颗粒总量的检测结果图。
图7为本发明实施例的野生型和MutE感染小鼠6W活体成像图。
图8为本发明实施例的野生型和MutE感染小鼠6W的荧光定量图。
图9为本发明实施例的野生型Cap586-588和MutE序列的序列比对图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例提供了一种腺相关病毒变体(AAV9-MutE),所述腺相关病毒变体的制备包括以下步骤:
1、质粒构建
通过基因合成(生工生物工程有限公司)MutE和Mut001-Mut024等氨基酸序列(表1)对应的核酸序列,
将合成得到的序列通过现有方法克隆至pAAV9质粒,将Cap9 586-588氨基酸替换成突变序列,构建pAAV-突变质粒载体;
连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α,挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。
表1
序列名称 | 序列信息 | 序列编号 |
AAV9-MutE | SDGTVANPFR | 3 |
AAV9-Mut001 | SAQNISRING | 5 |
AAV9-Mut002 | SAQYNSRLNS | 6 |
AAV9-Mut003 | SAQNIIRSNG | 7 |
AAV9-Mut004 | SAQSISRISG | 8 |
AAV9-Mut005 | SAQRCSARSL | 9 |
AAV9-Mut006 | SAQTSCAGSL | 10 |
AAV9-Mut007 | SAQRSCATRL | 11 |
AAV9-Mut008 | SAQRCSMTRL | 12 |
AAV9-Mut009 | SAQRGSCGRL | 13 |
AAV9-Mut010 | SAQSSCGPST | 14 |
AAV9-Mut011 | SAQRSCGATL | 15 |
AAV9-Mut012 | SAQRASPCAL | 16 |
AAV9-Mut013 | SAQNASPCGT | 17 |
AAV9-Mut014 | SAQRSCARSR | 18 |
AAV9-Mut015 | SAQGPTCGGL | 19 |
AAV9-Mut016 | SAQRGSCGSN | 20 |
AAV9-Mut017 | SAQRSPCGSL | 21 |
AAV9-Mut018 | SAQRSCGSRV | 22 |
AAV9-Mut019 | SAQRTCASLL | 23 |
AAV9-Mut020 | SAQRSCTRPL | 24 |
AAV9-Mut021 | SAQATSCALL | 25 |
AAV9-Mut022 | SAQGPCAGSV | 26 |
AAV9-Mut023 | SAQASVPCSV | 27 |
AAV9-Mut024 | SAQSSCGGTD | 28 |
结果如图1所示。经琼脂糖凝胶电泳鉴定,突变质粒构建成功,稳定性较好。
和AAV9-MutE等突变病毒包装
AAV9-WT质粒和AAV9-突变质粒采用病毒包装三质粒系统转染至HEK293T细胞中,质粒图谱分别如图2~图5所示,包括以下步骤:
A 细胞培养
(1)从液氮罐中取出一株HEK293T细胞,将细胞迅速放入37℃水浴中,轻轻晃动,使细胞迅速解冻,200×g离心5min,弃上清,重悬至10ml DMEM完全培养基中,置于10cm培养皿,在37℃,5%的CO2中培养;
(2)培养48-72小时后,细胞汇合度达80%左右,可对细胞进行传代培养;
(3)吸掉培养上清,加入5mlPBS缓冲液洗涤1次,加入1.5mlTrypLESelect(1×)消化液,37℃消化3-5min,加入4.5mlDMEM完全培养基终止消化;
(4)吹打细胞形成细胞悬液,按1:4-1:5的比例进行传代,接种至T300瓶中培养。
B细胞转染
(1)将上述细胞培养48h,细胞汇合度达80%-90%,可对细胞进行转染;
(2)每瓶细胞,向1mL DMEM培养基中依次加入包装质粒、pHelper、pAAV-CAG-Lucifersae共60μg,混匀,即为“质粒稀释液”;
(3)另取1mlDMEM培养基,加入180ugPEI混匀,即为“PEI稀释液”;
(4)将“PEI稀释液”倒入“质粒稀释液”中,快速混匀,在室温静置25分钟,形成转染复合物,将转染复合物加入80mlDMEM培养基中,轻晃混匀;
(5)取出T300细胞培养瓶,弃培养上清,加入含用转染复合物的培养基;
(6)在37℃,5%的CO2中培养。
C病毒收获
(1)转染后细胞继续培养72小时,开始进行病毒收获;
(2)将培养上清收于离心瓶中,每ml上清中加入0.245mL的50% PEG8000溶液(含0.5mol/L NaCl),充分混匀,2-8℃静置过夜;
(3)向培养瓶中细胞加入5ml 0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液(含全能核酸酶),37 ℃处理1-2h,然后加入0.55ml的5mol/L NaCl,充分混匀后4℃、3000g离心15min,收集上清,暂存于2-8℃;
(4)将PEG8000浓缩后的上清4℃、3000g离心15min,去上清,加入2ml 0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液(含全能核酸酶),37 ℃处理1-2h,然后加入0.22ml的5mol/LNaCl,充分混匀后,3000g离心15min,收集上清。将两上清并入一个离心管。
D 病毒纯化
1)取一支Ultra-Clear离心管,在底部相继加入0.5mL 60% Iodixanol,2mL 40%Iodixanol,1.5mL 25% Iodixanol,1.5 mL 15% Iodixanol,收集的病毒悬液,最后Trislysis buffer进行配平;
2)10℃、230000g,升8降9超速离心18h;
3)取一支超滤管,用1mL PBS缓冲液浸润滤膜;
4)用移液枪小心抽取超速离心管40%Iodixanol-60%Iodixanol中间液层,避免吸到蛋白,转移到超滤管;
5)加入适量PBS缓冲液r吹打均匀,4500g离心3-5 min,重复此步骤5-7次至去除Iodixanol;
6)加入1mL PBS缓冲液吹打40~50下成病毒悬液,转移到EP管中;
7)用5mL注射器吸取EP管中病毒悬液0.22μm过滤器过滤,收取20μL病毒液做检测样品后,以100μL每管分装,得到腺相关病毒变体。
对比例1
本对比例提供了一种野生型腺相关病毒(AAV9-WT),与实施例1的制备方法的区别仅在于腺相关病毒衣壳蛋白的序列采用野生型AAV9衣壳蛋白序列。
测试例
病毒滴度检测
(1)病毒裂解
1)分别取实施例1和对比例的病毒样品20μL;
2)分别加入10%SDS、0.5mol/L EDTA、proteinaseK各1μL,混匀;
3)恒温混匀仪中56℃孵育1小时,然后90℃孵育10min;
4)取10ul病毒裂解液,10倍梯度稀释至10000倍,即为病毒稀释液,备用。
(2)标准曲线用标准品的制备
取原液2×1012copies/mL的质粒标准品,用超纯水ddH2O按照比例稀释为6个梯度作为标准品的模板2×1011 copies/mL、2×1010copies/mL、2×109copies/mL、2×108copies/mL、2×107copies/mL、2×106copies/mL。
(3)绝对定量qPCR
1)取0.2mL PCR管,配制如下反应体系,每个病毒稀释液3个重复。2× qPCR Mix10μL;正向、反向引物各0.2μL;5μL病毒稀释液;4.2μL ddH2O。
扩增引物:
正向引物 5’- GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’(SEQ ID NO.:1);
反向引物 5’- CGGCCTCAGTGAGCGA-3’(SEQ ID NO.:2)。
2)PCR扩增
预变性:95℃,2 min;
40×循环:95℃,15s;60℃,60s。
3)qPCR数据处理:病毒滴度=稀释倍数*病毒基因数组拷贝数。
实验结果如图6所示,从图中可以看出,本发明方案将AAV9-WT病毒包装三质粒系统(包含 pAAV9、pAAV-CAG-Lucifersae、pHelper三个质粒)和AAV9-突变病毒包装三质粒系统(包含pAAV9-MutE、pAAV-CAG-Lucifersae、pHelper三个质粒)分别等量转染至HEK293T细胞中,其中,AAV9-MutE病毒颗粒总量为AAV9-WT的72%,其余24个突变体病毒总颗粒数为AAV9-WT的43%-0.1%,选择AAV9-MutE进行小鼠体内感染能力测试。
小鼠脑组织感染效果测试
(1)分别取实施例1和对比例样品3E+11vg,稀释至200ul,尾静脉注射至C57BL-6J小鼠,每种病毒注射3只;
(2)病毒注射6W后,腹腔注射150mpk d-ludiferin(15mg/ml,in DPBS withoutCa2+ or Mg2+;
(3)10-15分钟后,用活体成像仪进行图像拍摄和分析。
病毒注射6W后,活休成像结果如图7所示,从图中可以看出AAV9-MutE病毒在大脑中的表达显著强于AAV9-WT病毒,而在肝脏中的表达弱于AAV9-WT。对成像结果进行定量分析,结果如图8所示,AAV9-MutE病毒在大脑中表达量是AAV9-WT病毒的4.2倍,在肝中的表达量为AAV9-WT病毒的0.7倍。证明本申请方案制备得到的腺相关病毒变体AAV9-MutE在大脑中的组织特异性和表达效果均有显著提高。
腺相关病毒变体衣壳蛋白的序列MutE和野生型AAV9衣壳蛋白的序列比对结果图如图9所示。腺相关病毒变体衣壳蛋白MutE的序列相对于野生型AAV9衣壳蛋白的区别在于,野生型AAV9衣壳蛋白(GenBank::UUJ74914.1,参见www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/UUJ74914.1)序列586-588位氨基酸被一段氨基酸序列SDGTVANPFR进行替换,腺相关病毒变体衣壳蛋白Cap9的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
综上所述,本发明方案制备得到的腺相关病毒变体相较野生型能够显著增强AAV9病毒的大脑靶向性。
腺相关病毒变体衣壳蛋白Cap9的氨基酸序列:
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSDGTVANPFRAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ IDNO.:4)。
以上是对本发明所作的进一步详细说明,不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的简单推演或替换,都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.提高AAV病毒脑靶向性的多肽,其序列为SDGTVANPFR,用于替换野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586-588位氨基酸。
2.一种AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE,其特征在于,使用多肽SDGTVANPFR替换野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586-588位氨基酸得到。
3.表达权利要求2所述AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE的DNA分子。
4.一种表达体系,其特征在于,其可表达权利要求2所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体MutE,或含有权利要求3所述的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的表达体系,其特征在于,所述表达体系为重组AAV载体。
6.根据权利要求5所述的表达体系,其特征在于,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其突变体中的任意一种。
7.根据权利要求4~6任一项所述的表达体系,其特征在于,所述表达体系还包括编码功能性基因产物的核酸分子。
8.一种AAV载体,其特征在于,其具有权利要求2所述的衣壳蛋白。
9.一种组合物,包括权利要求4~7任一项所述表达体系及可接受的载体。
10.一种转基因动物模型的构建方法,包括向动物体内导入权利要求9所述的组合物。
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PB01 | Publication | ||
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