KR20220070443A - 반복성 dna와 연관된 장애의 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents

반복성 dna와 연관된 장애의 치료용 조성물 및 방법 Download PDF

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그레고리 알렉산드로비치 독신
마티아스 하이덴라이히
노르제한 압둘-마난
루 간
지안밍 리우
구오시앙 루안
제스퍼 그로마다
존 패트릭 레오나드
자카리 마이클 뎃와일러
피터 토마스 할록
데이비드 에소피
지젤 도밍게즈 구티에레즈
Original Assignee
버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

트리뉴클레오티드 반복을 절제하기 위한 것뿐만 아니라 트리뉴클레오티드 반복과 연관된 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 포괄된다.

Description

반복성 DNA와 연관된 장애의 치료용 조성물 및 방법
본 출원은 2019년 8월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/892,445; 2020년 3월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/993,616; 및 2020년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/067,489에 대한 우선권의 이익을 주장하며; 이들 모두는 그 전체가 참고로 포함된다.
EFS-WEB을 통해 제출된 서열 목록에 대한 참고
이 출원은 .txt 형식에서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2020년 8월 25일에 생성된 "2020-08-25 01245-0002-00PCT_ST25.txt"로 명명된 서열 목록을 함유하고 크기에서는 크기 11.7MB이다. 이 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 명세서의 일부이고 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
트리뉴클레오티드 반복 및 자가-상보성을 갖는 기타 서열을 포함하는 반복적인 DNA 서열은 현저한 유전적 불안정성을 나타내는 경향이 있고 신경 및 신경근 질환의 주요 원인으로 인식된다. 특히, 다양한 유전자 내 또는 근처에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)은 근긴장성 이영양증 유형 1(DM1), 헌팅턴병 및 다양한 유형의 척수소뇌성 운동실조와 같은 퇴행성 병태를 포함하여 다수의 신경 및 신경근의 병태와 연관되어 있다.
CRISPR-기반 게놈 편집은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 사용하여 게놈 DNA의 서열-특이적 절단을 제공할 수 있다. 포유동물 세포에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제에 의한 절단은 DNA-의존성 세린/트레오닌 단백질 키나제(DNA-PK) 의존성인 비-상동 말단 연결(NHEJ) 경로를 통해 가장 일반적으로 복구된다. 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역 근처의 개별 이중 가닥 파손의 NHEJ 복구는 전형적으로 다음 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역의 절제를 초래하지 않으며, 이는 문제가 있는 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 유전자형을 개선하기 위해 게놈 편집을 적용하는 것은 사소한 일이 아니다는 것을 의미한다. 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역의 양측 상에 절단하는 가이드 RNA의 쌍을 제공하는 것은 NHEJ를 통해 어느 정도까지 절제를 초래하지만 파손은 상당한 수의 세포에서 개재하는 반복 또는 자가-상보성 서열의 손실 없이 단순히 다시 봉인된다. 따라서, 반복적인 DNA 서열의 절제를 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 있다.
RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, DNA로부터 반복 또는 자가-상보성 서열을 절제하기 위한 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역 내 또는 근처의 표적에 엔도뉴클레아제를 표적화하는 적어도 하나의 가이드 RNA, 및 선택적으로 DNA-PK 억제제를 사용하는 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 이러한 방법은 특히 트리뉴클레오티드 반복과 연관된 유전자형을 개선할 수 있다. 반복 서열 내 또는 근처의 DNA의 절단과 조합된 DNA-PK의 억제는 증가된 빈도로 반복 서열의 절제를 제공한다는 것이 밝혀졌다. DNA-PK 억제제가 있거나 없이, 뉴클레오티드 반복을 절제하는 방법에 사용하기에 특히 적합한 가이드 RNA 및 가이드 RNA의 조합이 또한 개시된다.
따라서, 다음의 실시형태가 제공된다.
실시형태 1 하기를 포함하는 조성물:
i) 하기를 포함하는, 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산:
a. 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 및 1386으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 3354, 4010, 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 2322, 1770, 1538, 2514, 2458, 2194, 2594, 2162, 및 2618로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
d. 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
e. 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 및 3722로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
f. 서열번호: 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 및 2322로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
g. 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
h. 서열번호: 3378, 3354, 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 및 2506으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
i. 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
j. 서열번호: 3314, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
k. 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 및 2258로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
l. 서열번호: 3914 및 3418로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
m. 서열번호: 3938; 또는
n. 서열번호: 3916, 3420, 및 3940으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
o. 임의의 하나의 a) 내지 n)의 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 서열; 또는
p. 임의의 하나의 a) 내지 o)의 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 스페이서 서열; 또는
ii) 하기를 포함하는, 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산:
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f. 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3330 및 2506; 및 3330 및 2546으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
g. 서열번호: 1153 및 1129; 또는
h. 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3354 및 2546; 3354 및 2506; 3378 및 2546; 및 3378 및 2506으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
i. 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 및 3330 및 2498로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
j. 임의의 a) 내지 i)의 제1 및 제2 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
k. 임의의 a) 내지 j)의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
실시형태 2 하기를 포함하는 조성물:
스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 다음을 포함함:
a. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 및 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 및 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906 및 3746으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 3778 및 1778; 3778 및 1746; 3778 및 1770; 3778 및 1586; 3778 및 1914; 3778 및 2210; 4026 및 1778; 4026 및 1746; 4026 및 1770; 4026 및 1586; 4026 및 1914; 4026 및 2210; 3794 및 1778; 3794 및 1746; 3794 및 1770; 3794 및 1586; 3794 및 1586; 3794 및 1914; 3794 및 2210; 4010 및 1778; 4010 및 1770; 4010 및 1746; 4010 및 1586; 4010 및 1914; 4010 및 2210; 3906 및 1778; 3906 및 1778; 3906 및 1746; 3906 및 1770; 3906 및 1586; 3906 및 1914; 3906 및 2210; 3746 및 1778; 3746 및 1746; 3746 및 1770; 3746 및 1586; 3746 및 1914; 및 3746 및 2210으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
d. 서열번호: 3256, 2896, 3136, 및 3224로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 및 616으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
e. 서열번호: 3256 및 4989; 3256 및 984; 3256 및 616; 2896 및 4989; 2896 및 672; 2896 및 760; 3136 및 4989; 3136 및 560; 3224 및 4989; 3224 및 976; 및 3224 및 760으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
f. 임의의 a) 내지 e)의 제1 및 제2 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
g. 임의의 a) 내지 f)의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
실시형태 2b는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 2709-4076으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 101-2708로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 실시형태 2.2709-2.4076은 추가 특징을 갖는 실시형태 12b에 따른 실시형태이다. 실시형태 2.2709-2.4076, 2.05070-2.05334, 및 2.46768-2.52898에서 약어는 다음과 같이 사용된다: "emb."는 실시형태를 의미하고; "s.s."는 스페이서 서열을 의미하고; "SID"는 서열번호(들)를 의미한다. emb. 2.2709에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2709 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2710에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2710 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2711에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2711 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2712에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2712 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2713에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2713 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2714에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2714 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2715에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2715 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2716에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2716 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2717에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2717 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2718에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2718 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2719에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2719 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2720에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2720 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2721에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2721 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2722에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2722 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2723에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2723 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2724에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2724 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2725에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2725 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2726에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2726 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2727에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2727 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2728에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2728 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2729에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2729 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2730에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2730 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2731에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2731 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2732에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2732 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2733에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2733 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2734에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2734 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2735에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2735 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2736에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2736 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2737에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2737 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2738에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2738 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2739에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2739 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2740에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2740 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2741에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2741 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2742에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2742 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2743에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2743 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2744에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2744 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2745에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2745 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2746에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2746 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2747에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2747 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2748에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2748 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2749에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2749 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2750에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2750 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2751에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2751 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2752에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2752 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2753에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2753 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2754에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2754 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2755에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2755 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2756에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2756 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2757에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2757 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2758에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2758 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2759에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2759 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2760에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2760 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2761에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2761 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2762에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2762 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2763에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2763 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2764에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2764 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2765에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2765 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2766에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2766 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2767에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2767 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2768에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2768 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2769에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2769 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2770에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2770 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2771에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2771 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2772에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2772 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2773에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2773 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2774에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2774 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2775에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2775 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2776에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2776 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2777에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2777 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2778에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2778 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2779에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2779 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2780에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2780 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2781에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2781 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2782에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2782 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2783에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2783 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2784에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2784 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2785에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2785 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2786에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2786 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2787에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2787 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2788에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2788 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2789에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2789 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2790에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2790 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2791에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2791 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2792에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2792 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2793에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2793 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2794에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2794 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2795에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2795 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2796에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2796 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2797에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2797 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2798에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2798 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2799에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2799 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2800에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2800 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2801에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2801 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2802에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2802 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2803에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2803 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2804에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2804 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2805에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2805 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2806에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2806 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2807에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2807 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2808에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2808 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2809에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2809 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2810에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2810 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2811에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2811 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2812에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2812 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2813에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2813 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2814에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2814 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2815에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2815 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2816에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2816 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2817에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2817 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2818에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2818 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2819에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2819 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2820에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2820 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2821에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2821 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2822에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2822 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2823에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2823 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2824에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2824 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2825에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2825 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2826에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2826 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2827에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2827 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2828에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2828 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2829에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2829 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2830에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2830 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2831에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2831 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2832에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2832 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2833에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2833 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2834에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2834 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2835에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2835 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2836에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2836 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2837에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2837 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2838에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2838 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2839에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2839 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2840에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2840 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2841에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2841 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2842에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2842 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2843에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2843 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2844에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2844 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2845에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2845 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2846에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2846 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2847에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2847 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2848에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2848 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2849에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2849 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2850에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2850 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2851에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2851 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2852에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2852 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2853에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2853 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2854에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2854 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2855에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2855 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2856에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2856 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2857에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2857 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2858에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2858 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2859에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2859 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2860에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2860 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2861에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2861 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2862에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2862 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2863에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2863 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2864에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2864 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2865에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2865 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2866에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2866 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2867에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2867 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2868에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2868 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2869에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2869 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2870에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2870 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2871에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2871 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2872에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2872 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2873에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2873 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2874에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2874 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2875에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2875 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2876에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2876 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2877에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2877 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2878에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2878 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2879에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2879 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2880에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2880 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2881에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2881 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2882에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2882 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2883에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2883 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2884에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2884 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2885에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2885 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2886에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2886 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2887에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2887 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2888에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2888 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2889에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2889 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2890에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2890 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2891에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2891 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2892에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2892 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2893에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2893 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2894에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2894 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2895에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2895 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2896에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2896 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2897에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2897 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2898에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2898 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2899에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2899 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2900에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2900 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2901에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2901 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2902에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2902 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2903에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2903 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2904에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2904 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2905에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2905 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2906에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2906 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2907에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2907 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2908에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2908 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2909에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2909 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2910에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2910 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2911에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2911 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2912에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2912 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2913에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2913 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2914에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2914 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2915에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2915 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2916에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2916 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2917에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2917 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2918에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2918 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2919에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2919 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2920에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2920 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2921에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2921 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2922에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2922 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2923에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2923 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2924에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2924 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2925에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2925 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2926에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2926 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2927에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2927 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2928에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2928 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2929에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2929 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2930에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2930 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2931에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2931 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2932에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2932 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2933에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2933 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2934에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2934 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2935에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2935 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2936에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2936 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2937에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2937 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2938에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2938 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2939에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2939 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2940에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2940 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2941에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2941 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2942에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2942 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2943에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2943 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2944에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2944 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2945에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2945 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2946에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2946 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2947에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2947 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2948에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2948 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2949에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2949 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2950에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2950 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2951에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2951 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2952에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2952 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2953에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2953 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2954에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2954 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2955에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2955 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2956에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2956 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2957에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2957 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2958에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2958 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2959에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2959 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2960에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2960 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2961에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2961 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2962에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2962 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2963에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2963 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2964에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2964 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2965에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2965 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2966에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2966 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2967에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2967 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2968에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2968 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2969에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2969 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2970에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2970 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2971에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2971 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2972에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2972 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2973에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2973 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2974에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2974 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2975에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2975 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2976에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2976 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2977에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2977 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2978에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2978 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2979에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2979 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2980에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2980 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2981에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2981 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2982에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2982 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2983에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2983 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2984에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2984 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2985에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2985 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2986에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2986 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2987에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2987 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2988에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2988 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2989에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2989 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2990에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2990 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2991에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2991 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2992에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2992 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2993에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2993 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2994에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2994 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2995에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2995 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2996에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2996 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2997에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2997 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2998에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2998 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.2999에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 2999 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3000에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3000 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3001에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3001 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3002에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3002 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3003에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3003 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3004에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3004 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3005에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3005 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3006에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3006 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3007에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3007 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3008에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3008 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3009에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3009 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3010에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3010 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3011에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3011 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3012에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3012 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3013에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3013 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3014에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3014 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3015에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3015 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3016에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3016 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3017에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3017 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3018에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3018 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3019에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3019 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3020에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3020 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3021에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3021 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3022에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3022 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3023에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3023 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3024에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3024 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3025에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3025 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3026에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3026 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3027에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3027 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3028에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3028 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3029에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3029 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3030에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3030 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3031에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3031 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3032에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3032 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3033에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3033 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3034에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3034 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3035에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3035 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3036에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3036 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3037에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3037 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3038에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3038 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3039에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3039 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3040에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3040 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3041에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3041 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3042에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3042 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3043에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3043 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3044에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3044 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3045에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3045 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3046에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3046 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3047에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3047 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3048에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3048 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3049에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3049 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3050에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3050 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3051에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3051 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3052에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3052 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3053에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3053 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3054에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3054 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3055에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3055 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3056에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3056 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3057에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3057 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3058에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3058 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3059에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3059 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3060에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3060 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3061에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3061 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3062에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3062 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3063에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3063 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3064에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3064 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3065에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3065 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3066에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3066 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3067에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3067 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3068에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3068 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3069에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3069 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3070에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3070 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3071에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3071 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3072에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3072 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3073에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3073 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3074에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3074 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3075에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3075 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3076에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3076 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3077에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3077 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3078에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3078 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3079에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3079 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3080에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3080 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3081에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3081 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3082에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3082 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3083에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3083 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3084에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3084 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3085에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3085 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3086에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3086 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3087에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3087 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3088에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3088 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3089에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3089 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3090에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3090 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3091에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3091 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3092에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3092 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3093에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3093 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3094에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3094 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3095에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3095 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3096에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3096 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3097에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3097 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3098에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3098 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3099에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3099 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3100에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3100 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3101에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3101 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3102에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3102 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3103에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3103 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3104에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3104 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3105에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3105 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3106에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3106 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3107에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3107 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3108에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3108 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3109에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3109 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3110에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3110 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3111에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3111 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3112에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3112 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3113에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3113 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3114에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3114 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3115에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3115 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3116에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3116 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3117에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3117 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3118에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3118 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3119에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3119 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3120에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3120 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3121에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3121 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3122에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3122 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3123에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3123 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3124에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3124 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3125에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3125 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3126에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3126 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3127에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3127 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3128에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3128 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3129에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3129 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3130에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3130 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3131에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3131 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3132에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3132 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3133에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3133 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3134에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3134 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3135에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3135 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3136에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3136 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3137에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3137 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3138에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3138 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3139에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3139 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3140에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3140 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3141에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3141 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3142에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3142 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3143에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3143 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3144에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3144 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3145에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3145 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3146에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3146 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3147에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3147 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3148에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3148 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3149에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3149 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3150에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3150 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3151에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3151 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3152에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3152 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3153에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3153 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3154에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3154 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3155에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3155 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3156에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3156 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3157에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3157 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3158에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3158 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3159에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3159 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3160에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3160 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3161에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3161 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3162에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3162 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3163에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3163 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3164에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3164 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3165에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3165 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3166에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3166 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3167에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3167 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3168에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3168 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3169에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3169 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3170에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3170 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3171에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3171 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3172에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3172 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3173에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3173 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3174에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3174 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3175에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3175 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3176에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3176 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3177에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3177 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3178에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3178 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3179에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3179 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3180에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3180 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3181에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3181 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3182에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3182 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3183에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3183 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3184에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3184 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3185에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3185 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3186에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3186 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3187에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3187 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3188에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3188 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3189에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3189 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3190에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3190 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3191에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3191 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3192에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3192 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3193에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3193 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3194에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3194 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3195에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3195 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3196에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3196 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3197에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3197 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3198에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3198 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3199에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3199 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3200에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3200 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3201에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3201 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3202에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3202 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3203에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3203 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3204에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3204 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3205에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3205 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3206에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3206 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3207에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3207 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3208에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3208 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3209에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3209 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3210에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3210 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3211에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3211 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3212에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3212 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3213에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3213 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3214에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3214 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3215에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3215 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3216에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3216 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3217에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3217 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3218에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3218 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3219에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3219 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3220에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3220 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3221에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3221 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3222에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3222 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3223에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3223 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3224에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3224 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3225에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3225 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3226에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3226 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3227에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3227 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3228에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3228 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3229에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3229 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3230에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3230 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3231에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3231 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3232에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3232 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3233에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3233 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3234에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3234 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3235에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3235 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3236에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3236 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3237에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3237 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3238에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3238 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3239에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3239 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3240에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3240 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3241에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3241 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3242에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3242 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3243에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3243 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3244에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3244 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3245에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3245 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3246에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3246 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3247에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3247 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3248에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3248 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3249에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3249 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3250에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3250 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3251에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3251 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3252에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3252 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3253에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3253 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3254에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3254 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3255에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3255 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3256에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3256 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3257에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3257 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3258에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3258 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3259에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3259 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3260에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3260 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3261에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3261 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3262에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3262 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3263에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3263 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3264에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3264 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3265에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3265 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3266에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3266 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3267에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3267 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3268에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3268 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3269에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3269 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3270에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3270 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3271에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3271 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3272에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3272 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3273에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3273 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3274에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3274 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3275에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3275 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3276에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3276 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3277에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3277 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3278에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3278 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3279에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3279 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3280에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3280 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3281에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3281 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3282에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3282 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3283에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3283 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3284에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3284 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3285에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3285 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3286에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3286 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3287에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3287 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3288에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3288 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3289에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3289 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3290에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3290 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3291에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3291 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3292에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3292 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3293에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3293 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3294에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3294 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3295에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3295 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3296에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3296 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3297에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3297 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3298에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3298 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3299에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3299 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3300에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3300 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3301에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3301 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3302에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3302 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3303에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3303 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3304에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3304 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3305에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3305 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3306에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3306 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3307에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3307 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3308에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3308 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3309에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3309 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3310에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3310 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3311에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3311 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3312에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3312 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3313에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3313 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3314에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3314 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3315에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3315 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3316에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3316 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3317에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3317 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3318에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3318 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3319에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3319 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3320에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3320 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3321에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3321 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3322에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3322 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3323에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3323 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3324에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3324 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3325에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3325 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3326에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3326 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3327에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3327 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3328에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3328 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3329에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3329 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3330에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3330 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3331에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3331 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3332에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3332 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3333에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3333 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3334에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3334 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3335에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3335 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3336에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3336 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3337에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3337 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3338에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3338 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3339에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3339 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3340에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3340 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3341에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3341 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3342에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3342 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3343에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3343 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3344에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3344 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3345에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3345 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3346에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3346 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3347에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3347 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3348에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3348 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3349에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3349 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3350에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3350 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3351에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3351 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3352에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3352 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3353에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3353 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3354에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3354 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3355에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3355 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3356에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3356 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3357에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3357 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3358에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3358 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3359에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3359 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3360에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3360 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3361에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3361 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3362에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3362 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3363에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3363 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3364에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3364 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3365에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3365 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3366에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3366 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3367에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3367 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3368에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3368 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3369에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3369 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3370에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3370 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3371에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3371 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3372에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3372 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3373에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3373 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3374에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3374 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3375에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3375 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3376에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3376 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3377에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3377 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3378에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3378 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3379에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3379 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3380에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3380 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3381에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3381 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3382에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3382 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3383에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3383 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3384에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3384 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3385에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3385 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3386에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3386 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3387에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3387 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3388에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3388 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3389에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3389 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3390에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3390 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3391에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3391 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3392에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3392 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3393에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3393 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3394에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3394 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3395에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3395 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3396에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3396 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3397에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3397 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3398에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3398 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3399에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3399 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3400에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3400 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3401에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3401 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3402에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3402 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3403에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3403 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3404에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3404 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3405에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3405 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3406에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3406 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3407에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3407 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3408에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3408 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3409에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3409 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3410에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3410 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3411에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3411 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3412에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3412 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3413에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3413 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3414에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3414 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3415에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3415 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3416에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3416 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3417에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3417 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3418에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3418 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3419에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3419 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3420에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3420 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3421에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3421 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3422에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3422 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3423에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3423 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3424에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3424 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3425에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3425 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3426에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3426 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3427에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3427 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3428에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3428 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3429에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3429 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3430에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3430 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3431에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3431 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3432에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3432 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3433에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3433 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3434에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3434 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3435에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3435 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3436에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3436 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3437에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3437 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3438에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3438 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3439에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3439 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3440에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3440 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3441에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3441 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3442에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3442 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3443에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3443 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3444에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3444 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3445에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3445 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3446에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3446 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3447에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3447 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3448에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3448 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3449에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3449 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3450에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3450 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3451에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3451 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3452에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3452 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3453에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3453 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3454에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3454 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3455에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3455 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3456에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3456 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3457에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3457 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3458에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3458 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3459에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3459 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3460에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3460 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3461에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3461 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3462에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3462 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3463에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3463 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3464에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3464 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3465에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3465 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3466에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3466 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3467에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3467 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3468에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3468 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3469에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3469 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3470에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3470 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3471에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3471 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3472에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3472 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3473에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3473 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3474에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3474 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3475에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3475 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3476에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3476 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3477에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3477 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3478에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3478 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3479에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3479 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3480에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3480 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3481에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3481 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3482에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3482 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3483에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3483 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3484에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3484 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3485에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3485 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3486에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3486 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3487에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3487 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3488에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3488 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3489에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3489 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3490에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3490 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3491에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3491 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3492에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3492 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3493에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3493 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3494에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3494 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3495에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3495 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3496에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3496 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3497에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3497 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3498에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3498 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3499에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3499 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3500에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3500 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3501에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3501 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3502에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3502 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3503에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3503 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3504에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3504 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3505에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3505 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3506에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3506 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3507에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3507 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3508에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3508 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3509에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3509 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3510에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3510 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3511에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3511 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3512에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3512 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3513에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3513 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3514에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3514 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3515에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3515 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3516에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3516 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3517에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3517 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3518에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3518 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3519에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3519 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3520에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3520 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3521에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3521 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3522에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3522 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3523에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3523 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3524에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3524 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3525에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3525 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3526에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3526 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3527에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3527 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3528에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3528 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3529에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3529 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3530에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3530 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3531에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3531 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3532에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3532 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3533에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3533 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3534에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3534 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3535에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3535 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3536에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3536 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3537에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3537 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3538에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3538 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3539에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3539 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3540에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3540 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3541에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3541 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3542에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3542 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3543에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3543 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3544에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3544 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3545에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3545 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3546에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3546 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3547에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3547 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3548에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3548 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3549에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3549 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3550에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3550 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3551에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3551 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3552에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3552 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3553에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3553 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3554에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3554 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3555에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3555 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3556에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3556 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3557에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3557 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3558에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3558 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3559에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3559 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3560에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3560 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3561에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3561 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3562에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3562 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3563에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3563 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3564에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3564 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3565에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3565 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3566에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3566 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3567에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3567 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3568에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3568 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3569에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3569 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3570에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3570 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3571에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3571 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3572에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3572 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3573에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3573 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3574에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3574 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3575에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3575 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3576에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3576 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3577에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3577 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3578에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3578 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3579에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3579 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3580에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3580 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3581에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3581 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3582에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3582 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3583에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3583 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3584에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3584 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3585에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3585 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3586에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3586 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3587에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3587 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3588에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3588 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3589에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3589 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3590에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3590 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3591에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3591 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3592에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3592 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3593에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3593 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3594에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3594 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3595에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3595 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3596에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3596 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3597에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3597 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3598에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3598 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3599에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3599 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3600에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3600 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3601에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3601 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3602에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3602 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3603에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3603 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3604에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3604 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3605에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3605 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3606에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3606 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3607에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3607 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3608에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3608 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3609에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3609 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3610에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3610 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3611에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3611 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3612에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3612 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3613에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3613 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3614에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3614 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3615에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3615 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3616에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3616 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3617에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3617 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3618에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3618 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3619에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3619 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3620에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3620 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3621에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3621 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3622에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3622 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3623에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3623 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3624에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3624 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3625에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3625 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3626에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3626 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3627에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3627 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3628에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3628 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3629에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3629 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3630에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3630 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3631에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3631 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3632에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3632 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3633에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3633 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3634에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3634 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3635에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3635 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3636에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3636 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3637에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3637 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3638에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3638 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3639에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3639 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3640에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3640 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3641에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3641 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3642에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3642 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3643에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3643 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3644에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3644 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3645에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3645 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3646에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3646 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3647에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3647 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3648에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3648 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3649에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3649 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3650에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3650 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3651에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3651 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3652에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3652 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3653에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3653 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3654에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3654 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3655에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3655 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3656에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3656 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3657에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3657 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3658에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3658 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3659에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3659 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3660에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3660 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3661에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3661 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3662에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3662 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3663에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3663 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3664에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3664 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3665에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3665 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3666에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3666 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3667에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3667 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3668에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3668 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3669에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3669 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3670에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3670 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3671에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3671 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3672에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3672 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3673에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3673 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3674에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3674 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3675에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3675 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3676에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3676 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3677에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3677 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3678에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3678 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3679에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3679 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3680에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3680 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3681에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3681 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3682에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3682 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3683에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3683 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3684에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3684 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3685에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3685 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3686에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3686 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3687에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3687 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3688에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3688 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3689에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3689 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3690에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3690 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3691에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3691 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3692에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3692 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3693에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3693 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3694에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3694 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3695에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3695 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3696에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3696 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3697에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3697 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3698에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3698 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3699에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3699 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3700에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3700 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3701에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3701 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3702에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3702 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3703에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3703 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3704에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3704 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3705에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3705 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3706에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3706 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3707에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3707 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3708에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3708 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3709에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3709 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3710에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3710 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3711에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3711 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3712에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3712 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3713에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3713 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3714에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3714 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3715에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3715 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3716에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3716 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3717에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3717 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3718에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3718 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3719에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3719 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3720에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3720 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3721에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3721 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3722에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3722 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3723에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3723 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3724에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3724 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3725에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3725 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3726에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3726 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3727에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3727 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3728에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3728 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3729에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3729 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3730에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3730 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3731에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3731 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3732에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3732 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3733에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3733 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3734에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3734 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3735에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3735 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3736에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3736 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3737에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3737 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3738에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3738 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3739에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3739 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3740에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3740 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3741에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3741 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3742에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3742 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3743에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3743 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3744에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3744 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3745에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3745 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3746에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3746 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3747에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3747 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3748에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3748 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3749에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3749 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3750에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3750 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3751에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3751 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3752에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3752 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3753에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3753 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3754에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3754 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3755에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3755 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3756에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3756 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3757에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3757 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3758에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3758 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3759에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3759 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3760에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3760 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3761에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3761 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3762에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3762 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3763에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3763 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3764에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3764 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3765에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3765 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3766에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3766 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3767에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3767 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3768에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3768 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3769에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3769 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3770에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3770 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3771에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3771 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3772에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3772 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3773에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3773 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3774에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3774 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3775에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3775 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3776에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3776 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3777에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3777 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3778에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3778 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3779에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3779 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3780에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3780 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3781에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3781 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3782에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3782 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3783에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3783 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3784에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3784 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3785에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3785 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3786에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3786 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3787에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3787 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3788에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3788 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3789에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3789 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3790에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3790 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3791에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3791 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3792에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3792 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3793에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3793 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3794에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3794 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3795에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3795 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3796에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3796 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3797에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3797 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3798에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3798 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3799에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3799 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3800에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3800 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3801에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3801 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3802에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3802 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3803에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3803 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3804에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3804 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3805에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3805 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3806에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3806 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3807에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3807 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3808에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3808 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3809에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3809 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3810에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3810 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3811에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3811 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3812에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3812 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3813에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3813 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3814에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3814 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3815에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3815 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3816에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3816 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3817에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3817 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3818에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3818 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3819에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3819 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3820에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3820 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3821에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3821 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3822에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3822 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3823에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3823 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3824에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3824 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3825에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3825 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3826에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3826 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3827에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3827 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3828에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3828 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3829에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3829 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3830에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3830 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3831에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3831 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3832에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3832 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3833에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3833 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3834에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3834 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3835에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3835 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3836에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3836 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3837에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3837 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3838에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3838 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3839에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3839 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3840에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3840 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3841에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3841 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3842에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3842 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3843에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3843 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3844에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3844 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3845에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3845 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3846에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3846 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3847에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3847 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3848에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3848 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3849에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3849 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3850에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3850 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3851에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3851 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3852에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3852 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3853에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3853 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3854에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3854 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3855에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3855 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3856에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3856 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3857에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3857 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3858에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3858 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3859에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3859 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3860에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3860 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3861에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3861 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3862에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3862 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3863에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3863 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3864에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3864 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3865에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3865 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3866에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3866 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3867에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3867 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3868에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3868 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3869에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3869 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3870에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3870 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3871에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3871 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3872에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3872 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3873에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3873 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3874에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3874 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3875에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3875 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3876에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3876 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3877에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3877 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3878에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3878 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3879에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3879 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3880에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3880 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3881에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3881 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3882에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3882 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3883에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3883 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3884에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3884 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3885에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3885 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3886에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3886 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3887에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3887 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3888에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3888 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3889에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3889 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3890에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3890 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3891에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3891 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3892에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3892 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3893에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3893 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3894에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3894 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3895에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3895 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3896에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3896 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3897에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3897 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3898에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3898 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3899에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3899 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3900에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3900 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3901에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3901 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3902에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3902 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3903에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3903 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3904에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3904 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3905에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3905 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3906에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3906 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3907에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3907 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3908에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3908 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3909에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3909 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3910에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3910 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3911에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3911 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3912에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3912 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3913에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3913 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3914에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3914 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3915에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3915 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3916에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3916 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3917에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3917 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3918에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3918 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3919에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3919 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3920에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3920 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3921에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3921 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3922에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3922 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3923에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3923 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3924에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3924 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3925에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3925 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3926에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3926 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3927에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3927 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3928에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3928 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3929에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3929 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3930에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3930 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3931에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3931 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3932에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3932 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3933에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3933 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3934에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3934 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3935에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3935 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3936에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3936 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3937에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3937 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3938에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3938 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3939에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3939 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3940에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3940 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3941에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3941 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3942에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3942 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3943에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3943 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3944에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3944 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3945에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3945 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3946에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3946 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3947에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3947 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3948에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3948 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3949에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3949 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3950에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3950 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3951에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3951 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3952에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3952 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3953에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3953 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3954에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3954 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3955에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3955 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3956에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3956 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3957에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3957 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3958에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3958 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3959에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3959 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3960에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3960 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3961에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3961 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3962에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3962 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3963에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3963 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3964에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3964 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3965에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3965 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3966에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3966 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3967에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3967 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3968에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3968 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3969에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3969 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3970에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3970 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3971에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3971 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3972에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3972 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3973에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3973 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3974에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3974 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3975에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3975 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3976에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3976 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3977에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3977 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3978에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3978 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3979에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3979 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3980에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3980 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3981에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3981 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3982에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3982 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3983에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3983 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3984에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3984 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3985에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3985 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3986에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3986 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3987에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3987 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3988에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3988 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3989에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3989 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3990에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3990 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3991에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3991 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3992에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3992 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3993에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3993 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3994에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3994 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3995에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3995 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3996에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3996 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3997에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3997 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3998에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3998 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.3999에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 3999 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4000에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4000 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4001에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4001 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4002에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4002 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4003에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4003 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4004에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4004 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4005에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4005 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4006에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4006 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4007에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4007 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4008에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4008 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4009에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4009 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4010에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4010 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4011에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4011 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4012에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4012 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4013에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4013 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4014에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4014 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4015에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4015 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4016에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4016 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4017에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4017 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4018에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4018 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4019에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4019 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4020에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4020 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4021에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4021 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4022에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4022 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4023에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4023 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4024에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4024 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4025에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4025 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4026에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4026 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4027에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4027 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4028에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4028 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4029에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4029 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4030에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4030 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4031에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4031 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4032에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4032 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4033에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4033 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4034에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4034 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4035에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4035 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4036에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4036 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4037에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4037 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4038에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4038 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4039에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4039 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4040에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4040 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4041에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4041 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4042에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4042 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4043에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4043 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4044에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4044 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4045에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4045 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4046에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4046 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4047에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4047 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4048에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4048 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4049에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4049 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4050에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4050 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4051에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4051 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4052에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4052 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4053에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4053 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4054에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4054 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4055에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4055 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4056에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4056 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4057에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4057 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4058에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4058 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4059에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4059 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4060에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4060 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4061에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4061 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4062에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4062 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4063에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4063 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4064에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4064 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4065에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4065 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4066에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4066 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4067에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4067 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4068에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4068 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4069에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4069 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4070에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4070 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4071에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4071 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4072에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4072 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4073에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4073 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4074에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4074 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4075에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4075 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다. emb. 2.4076에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 4076 & SID 101-2708 중 임의의 하나이다.
실시형태 2c는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 5001-5496으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 5497-6080으로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 실시형태 2.05070-2.05334는 추가 특징을 갖는 실시형태 12c에 따른 실시형태이다. 약어의 의미는 상기를 참고한다. emb. 2.05070에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 5070 & SID 5497-6080 중 임의의 하나이다. emb. 2.05262에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 5262 & SID 5497-6080 중 임의의 하나이다. emb. 2.05310에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 5310 & SID 5497-6080 중 임의의 하나이다. emb. 2.05334에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 5334 & SID 5497-6080 중 임의의 하나이다.
실시형태 2d는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 46597-53028로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 7301-46596에서 선택된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 실시형태 2.46768-2.52898은 추가 특징을 갖는 실시형태 12d에 따른 실시형태이다. 약어의 의미는 상기를 참고한다. emb. 2.46768에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 46768 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.46967에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 46967 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.47032에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 47032 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.47047에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 47047 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50538에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50538 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50674에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50674 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50682에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50682 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50706에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50706 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50714에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50714 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50898에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50898 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.50978에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 50978 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51058에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51058 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51162에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51162 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51362에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51362 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51394에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51394 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51466에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51466 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51474에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51474 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51490에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51490 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51498에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51498 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51506에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51506 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51650에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51650 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51658에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51658 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51682에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51682 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51706에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51706 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51746에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51746 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51754에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51754 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51762에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51762 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51810에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51810 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51898에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51898 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51914에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51914 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51930에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51930 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.51954에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 51954 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52066에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52066 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52082에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52082 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52090에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52090 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52098에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52098 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52106에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52106 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52250에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52250 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52258에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52258 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52266에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52266 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52290에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52290 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52298에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52298 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52306에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52306 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52354에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52354 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52386에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52386 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52418에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52418 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52434에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52434 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52458에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52458 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52474에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52474 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52498에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52498 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52506에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52506 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52522에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52522 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52530에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52530 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52546에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52546 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52554에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52554 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52594에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52594 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52610에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52610 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52618에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52618 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52634에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52634 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52666에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52666 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다. emb. 2.52898에서, 제1 및 제2 s.s.는 각각 SID 52898 & SID 7301-46596 중 임의의 하나이다.
실시형태 3 하기를 포함하는 조성물:
i) 하기를 포함하는, 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산:
a. 서열번호: 5262, 5782, 5830, 5926, 5950, 5998, 6022, 5310, 및 5334로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 5830, 6022, 5262, 및 5310으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 5262, 5334, 및 5830으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
d. 서열번호: 5262; 또는
e. 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 및 5312로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
f. a) 내지 e)의 스페이서 서열 중 임의의 하나의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 서열; 또는
g. a) 내지 f)의 스페이서 서열 중 임의의 하나에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 스페이서 서열; 또는
ii) 하기를 포함하는, 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산:
a. 서열번호: 5782 및 5262; 5830 및 5262; 5926 및 5262; 5950 및 5262; 및 5998 및 5262로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 5830 및 5262; 및 6022 및 5310으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 5334 및 5830; 또는
d. a) 내지 c) 중 임의의 제1 및 제2 스페이서 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
e. a) 내지 d) 중 임의의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
실시형태 4 하기를 포함하는 조성물:
i) 하기를 포함하는, 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산:
a. 서열번호: 28130, 34442, 45906, 26562, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 49986, 51762, 51754, 52290, 52298, 51474, 52306, 50682, 51706, 52098, 50714, 51498, 52498, 50978, 51746, 52106, 51506, 50674, 52082, 52506, 50538, 52066, 52386, 52090, 52266, 52474, 52258, 52434, 50706, 51490, 52458, 51466, 52354, 51914, 51362, 51058, 50170, 51954, 52250, 51930, 51682, 52594, 52610, 51162, 49162, 50898, 49226, 51658, 52554, 52634, 51394, 49034, 52546, 52522, 52618, 52530, 28322, 26530, 26578, 26602, 26634, 26626, 26698, 26746, 26754, 26786, 26882, 27722, 27730, 27738, 27770, 27754, 27762, 27802, 27850, 27842, 27922, 27946, 27986, 28114, 28122, 28146, 28186, 28194, 28338, 28346, 28322, 28378, 28370, 28458, 28506, 28634, 28642, 28650, 34442, 및 45906으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 51706, 51058, 51754, 52090, 52594, 52098, 52298, 52106, 51682, 52066, 52354, 52458, 52290, 52498, 51658, 51930, 51162, 52506, 51762, 51746, 52386, 52258, 52530, 52634, 27850, 28634, 26882, 28650, 28370, 28194, 26626, 26634, 26786, 26754, 27770, 26578, 28130, 27738, 28338, 28642, 26602, 27754, 27730, 및 28122로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
d. 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
e. a) 내지 d) 중 임의의 하나의 스페이서 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 서열; 또는
f. a) 내지 e) 중 임의의 하나의 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 스페이서 서열; 또는
ii) 하기를 포함하는, 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산:
a. 서열번호: 47047 및 7447; 7463 및 46967; 46768 및 7680; 및 47032 및 7447로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 47047 및 7447; 또는
c. 서열번호: 52898 및 26546; 또는
d. a) 내지 c) 중 임의의 제1 및 제2 스페이서 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
e. a) 내지 d) 중 임의의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
실시형태 5 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 선행하는 실시형태들 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 6 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제인, 선행하는 실시형태 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 7 Cas 뉴클레아제는 Cas9인, 실시형태 6의 조성물.
실시형태 8 Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 것인, 실시형태 7의 조성물.
실시형태 9 Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 것인, 실시형태 7의 조성물.
실시형태 10 Cas 뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제인, 실시형태 6의 조성물.
실시형태 11 DNA-PK 억제제를 추가로 포함하는, 선행하는 실시형태들 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 12 가이드 RNA는 sgRNA인, 선행하는 실시형태들 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 13 sgRNA는 변형된, 실시형태 12의 조성물.
실시형태 14 변형은 하나 이상의 2' 위치 및/또는 포스포디에스테르 연결을 변경시키는, 실시형태 13의 조성물.
실시형태 15 변형은 sgRNA의 처음 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 실시형태 13-14 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 16 변형은 sgRNA의 마지막 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 실시형태 13-15 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 17 변형은 포스포로티오에이트 변형, 2'-OMe 변형, 2'-O-MOE 변형, 2'-F 변형, 2'-F 변형, 2'-O-메틴-4' 브릿지 변형, 3'-티오포스포노아세테이트 변형 또는 2'-데옥시 변형 중 하나 이상을 포함하는, 실시형태 13-16 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 18 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물.
실시형태 19 가이드 RNA는 지질 나노입자(LNP) 또는 바이러스 벡터와 회합되는, 선행하는 실시형태 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 20 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터인, 실시형태 19의 조성물.
실시형태 21 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 실시형태 19의 조성물.
실시형태 22 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, AAVrh74, 또는 AAV9 벡터이고, 여기서 AAV에 이어지는 숫자는 AAV 혈청형을 나타내는, 실시형태 21의 조성물.
실시형태 23 AAV 벡터는 AAV 혈청형 9 벡터인, 실시형태 22의 조성물.
실시형태 24 AAV 벡터는 AAVrh10 벡터인, 실시형태 22의 조성물.
실시형태 25 AAV 벡터는 AAVrh74 벡터인, 실시형태 22의 조성물.
실시형태 26 바이러스 벡터는 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 실시형태 19-25 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 27 바이러스 벡터를 포함하며, 여기서 바이러스 벡터는 근육-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터 , SPc5-12 프로모터, 또는 CK8e 프로모터인, 실시형태 19-26 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 28 바이러스 벡터는 뉴런-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 뉴런-특이적 프로모터는 에놀라제 프로모터인, 실시형태 19-25 중 임의의 하나의 조성물.
실시형태 29 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 방법.
실시형태 30 자가-상보성 영역을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 자가-상보성 영역에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 자가-상보성 영역을 절제하는 방법으로서, 여기서 자가-상보성 영역이 절제되는, 방법.
실시형태 31 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제되는, 방법.
실시형태 32 자가-상보성 영역은 회문 서열, 직접 반복, 역전된 반복, GC-풍부 서열, 또는 AT-풍부 서열을 포함하고, 선택적으로 여기서 GC-풍부함 또는 AT-풍부함은 루프-형성 서열에 의해 선택적으로 중단된 적어도 10개 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%인, 실시형태 30의 방법.
실시형태 33 세포로 전달되는, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 실시형태 29-32 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 34 표적은 (i) TNR 또는 자가-상보성 영역에 있거나 (ii) TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 있는, 실시형태 29-33 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 35 DM1, HD, FA, FXS, FXTAS, FXPOI, FXES, XSBMA, SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA12, SCA17, 또는 DRPLA를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 실시형태 29-34 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 36 TNR이 DMPK 유전자의 3' 비번역된 영역(UTR)에서 CTG인, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 37 DMPK 유전자의 3' UTR의 적어도 일부를 절제하는 것을 포함하고, 여기서 절제는 근긴장성 이영양증 유형 1(DM1)의 치료를 초래하는, 실시형태 36의 방법.
실시형태 38 TNR은 FMR1 유전자 내에 있는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 39 절제는 취약 X 증후군의 치료를 초래하는, 실시형태 38의 방법.
실시형태 40 TNR은 FXN 유전자 내에 있는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 41 절제는 프리드리히 운동실조(FA)의 치료를 초래하는, 실시형태 40의 방법.
실시형태 42 TNR이 헌팅턴, 프라탁신(FXN), 취약 X 정신 지체 1(FMR1), 취약 X 정신 지체 2(FMR2), 안드로겐 수용체(AR), 아리스타리스 관련 호메오박스(ARX), 아탁신 1(ATXN1), 아탁신 2(ATXN2), 아탁신 3(ATXN3), 칼슘 전압-개폐 채널 소단위 알파1 A(CACNA1A), 아탁신 7(ATXN7), ATXN8 반대쪽 가닥 lncRNA(ATXN8OS), 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 소단위 B 베타 이소형(PPP2R2B), TATA 결합 단백질(TBP) 또는 아트로핀-1(ATN1) 유전자 내에 있거나, 또는 TNR이 FMR2의 5' UTR에 인접하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 43 헌팅턴(HTT)에서 절제는 헌팅턴병(HD)의 치료를 초래하고; FXN에서 절제는 프리드리히 운동실조(FA)의 치료를 초래하고; FMR1에서 절제는 취약 X 증후군(FXS), 취약 X 연관된 원발성 난소 부전증(FXPOI) 또는 취약 X-연관된 떨림/운동실조 증후군(FXTAS)의 치료를 초래하고; FMR2에서 또는 FMR2의 5' UTR에 인접한 절제는 취약 XE 증후군(FXES)의 치료를 초래하고; AR에서 절제는 X-연결된 척수 및 구근 근위축증(XSBMA)의 치료를 초래하고; ATXN1에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 1(SCA1)의 치료를 초래하고, ATXN2에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 2(SCA2)의 치료를 초래하고, ATXN3에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 3(SCA3)의 치료를 초래하고, CACNA1A에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 6(SCA6)의 치료를 초래하고, ATXN7에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 7(SCA7)의 치료를 초래하고, ATXN8OS에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 8(SCA8)의 치료를 초래하고, PPP2R2B에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 12(SCA12)의 치료를 초래하고, TBP에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 17(SCA17)의 치료를 초래하고, 또는 ATN1에서 절제는 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(DRPLA)의 치료를 초래하는, 실시형태 42의 방법.
실시형태 44 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 TNR이 절제되는, 실시형태 29 또는 31-43 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 45 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 40-60, 60-80, 80-100, 100-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-700, 700-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 또는 9000-10,000 TNR이 절제되는, 실시형태 29 또는 31-43 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 46 TNR이 DMPK 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 DMPK 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 증가하는 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 활성; 포스포렘만, 디하이드로피리딘 수용체, 미오제닌, L-유형 칼슘 채널 베타 소단위 및/또는 미오신 포스파타제 표적화 소단위의 인산화 증가; 미오신 포스파타제의 억제 증가; 및/또는 근육 손실, 근육 약화, 과다수면, 하나 이상의 실행 기능 결핍, 인슐린 저항성, 백내장 형성, 대머리, 또는 남성 불임이나 저출산을 개선하는 것 중 하나 이상을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 47 TNR이 HTT 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 HTT 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 선조체 뉴런 상실, 비자발적 운동, 과민성, 우울증, 작은 불수의적 움직임, 빈약한 협응, 새로운 정보를 배우거나 결정을 내리는 데 어려움, 걷기, 말하기 및/또는 삼키기 어려움 및/또는 사고 및/또는 추론 능력에서 감퇴 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 48 TNR이 FMR1 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 FMR1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 FMR1 전사체 또는 취약 X 정신 지체 단백질 수준, 정상적으로 FMRP와 연관된 mRNA의 번역 조절장애, 저하된 수준의 포스포-코필린(CFL1), 증가된 수준의 포스포-코필린 포스파타제 PPP2CA, 뉴런 시냅스로의 감소된 mRNA 이송, HSP27, HSP70 및/또는 CRYAB의 증가된 발현, 라민 A/C 이소형의 비정상적인 세포 분포, 조기-발현 폐경 예컨대 40세 이전의 폐경, 난소 발달 또는 기능에서의 결함, 증강된 수준의 혈청 성선자극호르몬(예를 들어, FSH), 진행성 의도 진전, 파킨슨병, 인지 저하, 전신 뇌 위축, 발기 부전 및/또는 발달 지연 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 49 TNR이 FMR2 유전자 내에 있거나 FMR2의 5' UTR에 인접하고, TNR의 절제는 FMR2 유전자 내 또는 이에 인접한 확장된-반복과 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 하나 이상의 비정상적인 FMR2 발현, 발달 지연, 불량한 눈 접촉, 언어의 반복적 사용, 및 손짓을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 50. TNR이 AR 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 AR 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 AR 발현; 안드로겐 수용체 단백질의 C-말단으로 잘린 단편의 생산; 카스파제-3에 의해 및/또는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통한 안드로겐 수용체 단백질의 단백질분해; CREB-결합 단백질을 포함하는 핵 내포물의 형성; p44/42, p38 및/또는 SAPK/JNK의 비정상적인 인산화; 근육 약화; 근육 소모; 걷기, 삼키기 및/또는 말하기 어려움; 여성형유방; 및/또는 남성 불임 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 51 TNR이 ATXN1 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 ATXN1을 포함하는 응집체의 형성; 푸르키네 세포사; 운동실조; 근육 경직; 빠르고 비자발적인 안구 운동; 사지 마비, 따끔거림 또는 통증; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 52 TNR이 ATXN2 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN2 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 ATXN2 생산; 푸르키네 세포사; 운동실조; 말하기 또는 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 소모; 통제되지 않은 근육 긴장; 및/또는 비자발적 경련 운동 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 53 TNR이 ATXN3 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN3 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 ATXN3 수준; 비정상적인 베클린-1 수준; 자가포식의 억제; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2의 조절 장애; 운동실조; 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 경직; 통제되지 않은 근육 긴장; 떨림; 불안한 다리 증상; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 54 TNR이 CACNA1A 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 CACNA1A 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 CACNA1A-발현 세포에서 비정상적인 CaV2.1 전압-개폐 칼슘 채널; 운동실조; 말하기 어려움; 비자발적 안구 운동; 이중 시력; 팔 협응의 상실; 떨림; 및/또는 조절되지 않는 근육 긴장 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 55 TNR이 ATXN7 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN7 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 히스톤 아세틸화; 비정상적인 히스톤 탈유비퀴틴화; CRX에 의한 전사활성화의 장애; ATXN7을 포함하는 핵 내포물의 형성; 운동실조; 보행의 불균형; 손, 언어 및/또는 눈 운동의 빈약한 협응; 망막 변성; 및/또는 색소성 황반 이영양증 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 56 TNR이 ATXN8OS 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN8OS 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 ATXN8OS mRNA를 포함하는 리보핵 내포물의 형성; 비정상적인 KLHL1 단백질 발현; 운동실조; 말하기 및/또는 걷기 어려움; 및/또는 비자발적 안구 운동 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 57 TNR이 PPP2R2B 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 PPP2R2B 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 PPP2R2B 발현; 비정상적인 포스파타제 2 활성; 운동실조; 소뇌 변성; 걷기 어려움; 및/또는 손, 언어 및/또는 안구 운동의 빈약한 협응 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 58 TNR이 TBP 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 TBP 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 전사 개시; 비정상적인 TBP 단백질 축적(예를 들어, 소뇌 뉴런 내); 비정상적인 소뇌 뉴런 세포 사멸; 운동실조; 걷기 어려움; 근육 약화; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 59 TNR이 ATN1 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 전사 조절; 비정상적인 ATN1 단백질 축적(예를 들어, 뉴런 내); 비정상적인 뉴런 세포 사멸; 비자발적 운동; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 실시형태 29 또는 31-35 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 60 실시형태 1-28 중 임의의 하나의 조성물을 포함하는 약학적 조성물.
실시형태 61 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 1-2, 2b, 2.2709-2.4076, 또는 5-28 중 임의의 하나의 조성물, 또는 실시형태 60의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 62 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 1-2, 2b, 2.2709-2.4076, 또는 5-28 중 임의의 하나의 조성물, 또는 실시형태 60의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 63 단 하나의 gRNA만 투여되고 DMPK 유전자의 3' UTR에서 CTG 반복은 절제되는, 실시형태 61 또는 62의 방법.
실시형태 64 gRNA는 하기를 포함하는 스페이서 서열을 포함하는, 실시형태 63의 방법:
a. 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
d. 서열번호: 3314, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
e. 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 및 2258로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
f. 서열번호: 3914; 또는
g. 서열번호: 3418; 또는
h. 서열번호: 3938; 또는
i. 서열번호: 3916, 3420, 및 3940으로부터 선택된 스페이서 서열.
실시형태 65 FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 2c, 2.05070-2.05334, 3, 또는 5-28 중 임의의 하나의 조성물, 또는 실시형태 60의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 66 FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 2c, 2.05070-2.05334, 3, 또는 5-28 중 임의의 하나의 조성물, 또는 실시형태 60의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 67 단 하나의 gRNA만 투여되고 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR은 절제되는, 실시형태 65 또는 실시형태 66의 방법.
실시형태 68 gRNA는 하기를 포함하는 스페이서 서열을 포함하는, 실시형태 67의 방법:
a. 서열번호: 5830, 6022, 5262, 및 5310로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 5262, 5334, 및 5830으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
c. 서열번호: 5262
d. 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 및 5312로부터 선택된 스페이서 서열.
실시형태 69 FXN 유전자의 인트론에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 2d, 2.46768-2.52898, 4-28 중 임의의 하나의 조성물, 또는 실시형태 60의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 70 FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 2d, 2.46768-2.52898, 4-28 중 임의의 하나의 조성물, 또는 실시형태 60의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 71 단 하나의 gRNA만 투여되고 FXN 유전자의 5' UTR에서 TNR은 절제되는, 실시형태 69 또는 실시형태 70의 방법.
실시형태 72 gRNA는 다음을 포함하는 스페이서 서열을 포함하는, 실시형태 71의 방법:
a. 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
b. 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030으로부터 선택된 스페이서 서열.
실시형태 73 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 실시형태 29-59 또는 61-72 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 74 DNA-PK 억제제는 화합물 6인, 실시형태 73의 방법.
실시형태 75 DNA-PK 억제제는 화합물 3인, 실시형태 73의 방법.
실시형태 76 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제1 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제1 스트레치는:
a. spCas9를 갖는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 반복을 통해 계속하거나; 또는
b. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
c. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
d. 서열번호: 53413이거나; 또는
e. 서열번호: 53414이거나; 또는
f. 서열번호: 53415인, 방법.
실시형태 77 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제2 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제2 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제2 스트레치는:
a. spCas9를 갖는 DMPK-D15 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
b. spCas9를 갖는 DMPK-D35 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
c. 서열번호: 53416이거나; 또는
d. 서열번호: 53417인, 방법.
실시형태 78 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서
i. 제1 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제1 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제1 스트레치는:
a. spCas9를 갖는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 반복을 통해 계속하거나; 또는
b. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
c. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
d. 서열번호: 53413이거나; 또는
e. 서열번호: 53414이거나; 또는
f. 서열번호: 53415이고; 그리고
ii. 제2 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제2 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제2 스트레치는:
a. spCas9를 갖는 DMPK-D15 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
b. spCas9를 갖는 DMPK-D35 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
c. 서열번호: 53416이거나; 또는
d. 서열번호: 53417인, 방법.
실시형태 79 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 실시형태 76-78의 방법.
실시형태 80 DNA-PK 억제제가 화합물 6인, 실시형태 79의 방법.
실시형태 81 DNA-PK 억제제가 화합물 3인, 실시형태 79의 방법.
실시형태 82 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 실시형태 76-81 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 83 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제인, 실시형태 82의 방법.
실시형태 84 Cas 뉴클레아제는 Cas9인, 실시형태 83의 방법.
실시형태 85 Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 것인, 실시형태 84의 방법.
실시형태 86 Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 것인, 실시형태 84의 방법.
실시형태 87 Cas 뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제인, 실시형태 83의 방법.
실시형태 88 실시형태 76-87 중 임의의 하나의 방법으로서,
(i) U29 절단 부위는 다음 서열: ttcacaaccgctccgag*cgtggg에서 *에 상응하는 뉴클레오티드 45,770,383과 45,770,384 사이의 chr19 상에 있으며;
(ii) U30 절단 부위는 다음 서열: gctgggcggagacccac*gctcgg에서 *에 상응하는 45,770,385와 45,770,386 사이인: chr19이고;
(iii) D15 절단 부위는 다음 서열: ggctgaggccctgacgt*ggatgg에서 *에 상응하는 45,770,154와 45,770,155 사이인: chr19이고; 그리고
(iv) D35 절단 부위는 다음 서열: cacgcacccccacctat*cgttgg에서 *에 상응하는 45,770,078과 45,770,079 사이인: chr19인, 방법.
실시형태 89 DNA의 TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) i. 세포를 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제와 접촉시키는 것;
ii. i)에서 사용된 것과 동일한 유형의 세포를 DNA-PK 억제제는 없지만 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 것;
b) 단계 a) ii)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a) i)에서 접촉된 세포로부터 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 것; 및
c) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA를 선택하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 90 TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA의 쌍에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) i. 세포를 가이드 RNA의 쌍, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제와 접촉시키는 것;
ii. i)에서 사용된 것과 동일한 유형의 세포를 DNA-PK 억제제는 없지만 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 것;
b) 단계 a) ii)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a) i)에서 접촉된 세포로부터 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 것; 및
c) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA의 쌍을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 91 DNA-PK 억제제는 화합물 6인, 실시형태 89 또는 실시형태 90의 방법.
실시형태 92 DNA-PK 억제제는 화합물 3인, 실시형태 89 또는 실시형태 90의 방법.
실시형태 93 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 DMPK 유전자의 3' UTR로 지향시키는, 실시형태 89-92 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 94 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 FMR1 유전자의 5' UTR로 지향시키는, 실시형태 89-92 중 임의의 하나의 방법.
실시형태 95 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 FXN 유전자의 5' UTR로 지향시키는, 실시형태 89-92 중 임의의 하나의 방법.
도 1은 5' 비번역된 영역(UTR), 인트론, 엑손 또는 3' UTR에 위치한 확장된 트리뉴클레오티드 서열(삼각형)을 함유하는 유전자의 예시적인 구조의 개략도를 도시한다. 트리뉴클레오티드 반복 확장의 예는 FMR1 유전자의 5'UTR 내 (CGG)n, HTT 유전자의 엑손 1 내 (CAG)n, FXN 유전자의 제1 인트론 내 (GAA)n 및 DMPK 유전자의 3' UTR 내 (CTG)n을 포함한다.
도 2a-2b는 2개 gRNA를 사용한 트리뉴클레오티드 반복 절제의 개요를 도시한다. 오류-경향이 있는 NHEJ에 의해 매개되는 다양한 DNA 수선 결과를 갖는 2개 gRNA 전략(도 2a). DNA-PKi로 NHEJ 수선을 억제함에 의해 개선된 트리뉴클레오티드 반복 절제(도 2b). NHEJ: 비-상동성 말단 연결; MMEJ: 미세상동성-매개된 말단 연결.
도 3은 단일 gRNA를 사용한 트리뉴클레오티드 반복 절제의 개요를 도시한다. DNA-PKi로 NHEJ 수선 기계를 억제함에 의해 향상된 MMEJ 수선 및 개선된 트리뉴클레오티드 반복 절제.
도 4는 바이러스 패키징 및 전달과 관련하여 하나의 gRNA를 사용하는 트리뉴클레오티드 반복 절제를 위한 AAV 벡터의 개요를 도시한다.
도 5는 DNA 쌍을 이루는 이중 가닥 절단이 유도된 후 표준 비-상동성 말단 연결(C-NHEJ) 및 미세상동성-매개된 말단 연결(MMEJ) DNA 수선 경로의 개략도를 도시한다. MMEJ 이외의 경로(HDR을 포함하지만 이에 제한되지 않음)는 편집 조건, 유전자좌 서열 구성 및 세포 유형에 의존하여 MRE11-RAD50-NBS1 복합체(MRN)의 다운스트림에서 활성화될 수 있다.
도 6은 DM1에서 CTG 트리뉴클레오티드 확장의 단일 gRNA 절제에 대한 모델을 도시한다. DNA 이중 가닥 파손(DSB)은 C-NHEJ 및 MMEJ (또는 다른 대안) 경로를 활성화한다. MMEJ는 DSB 주변에 미리-존재하는 미세상동성(박스)에 의존한다. MRN (MRE11-RAD50-NBS1 복합체)/5' 절제의 CtIP 자극 및 CTG 2차 구조 절단은 DNA-PK가 억제될 때 우세한 수선 경로이다. MMEJ 이외의 경로는 편집 조건, 유전자좌 서열 구성 및 세포 유형에 의존하여 MRN/CtIP(HDR 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 다운스트림에서 활성화될 수 있다.
도 7은 SpCas9 RNP 전기천공 후 야생형 심근세포에서 절제된 DNA 및 야생형의 DNA 겔-전기영동에 의한 분리를 도시한다. PCR 증폭된 DMPK1 CTG 반복 유전자좌는 gRNA 쌍 A-H 중 하나로 표적화한 후 도시된다(표 6 참고).
도 8a-c는 짝지어진 gRNA 접근법을 사용하여 DM1에 대한 질환 모델에서 CTG 반복 절제를 도시한다. DM1 심근세포(도 8a) 및 1차 섬유아세포(도 8b)에서의 SpCas9 RNP 전기천공은 CTG 반복의 절제를 도시한다. 도 8a의 가장 왼쪽 패널은 도 7의 밴드 B 및 C의 재생성이다. DNA 겔-전기영동은 PCR 증폭된 DMPK1 유전자좌의 야생형 및 절제된 DNA를 분리한다. 2개 gRNA 쌍(DM1 쌍 1 및 2)의 예가 도시된다. 도 8c는 CTG 반복을 포함하는 윈도우의 절제의 생어-시퀀싱에 의한 확인을 도시한다.
도 9a-9b는 2개 gRNA 및 SpCas9를 갖는 일차 DM1 섬유아세포에서 CTG 반복 절제 후 표현형 구제를 도시한다. 도 9a는 FISH에 의해 입증된 대조군(-)과 비교하여 감소된 CUG RNA 병소를 도시한다. 도 9b는 면역형광에 의해 입증된 대조군(-)과 비교하여 감소된 MBNL1 단백질 병소를 도시한다.
도 10a-e는 일차 DM1 섬유아세포에서 이중 gRNA CTG 반복 절제 후 질환 표현형의 구제를 도시한다. 도 10a-10d는 MBNL1(도 10a), NCOR2(도 10b), FN1(도 10c) 및 KIF13A(도 10d) mRNA에서 RNA 스플라이싱의 부분적 복원을 보여주는 qPCR 결과를 도시한다. 도 10a-10d에서 수직 축은 야생형 비율로 정규화된 총 전사물에 대한 미스-스플라이싱된 전사물의 비율로 표현된다(즉, 야생형 세포는 정규화된 비율 1을 제공함). 도 10e는 절제된 DM1 섬유아세포에서 구제 백분율(즉, 100% 구제는 환자 편집된 및 건강한 비처리된 것이 동일함을 의미하고 50% 구제는 건강한 미처리된 것에서보다 편집된 환자에서 2배 만큼 많은 미스-스플라이싱이 있다는 것을 의미하도록, 건강한 비처리된 환자와 편집된 환자 값 사이의 비율)로 표현되는, 미스-스플라이싱 보정의 정량적 분석을 도시한다.
도 11은 DM1 일차 섬유아세포에서 CUG 병소의 수에 대한 표시된 가이드 쌍의 효과를 도시한다. 증가된 수의 세포는 FISH에 의해 입증된 바와 같이 편집되지 않은 대조군 세포(흰색 막대)와 비교하여 0 CUG 병소를 갖는 세포 핵을 도시한다. SpCas9에 대해 도시된 4개 DM1 sgRNA 쌍(5개의 각 세트에서 두 번째에서 다섯 번째 막대로 A-D 쌍)의 예.
도 12는 hTert-형질전환된 DM1 섬유아세포에서 쌍을 이룬 gRNA CTG 반복 절제는 DNA-PKi 화합물 6(10uM)으로 개선된다는 것을 도시한다. DMPK1 유전자좌는 PCR에 의해 증폭되었고, 야생형 DNA는 DNA 겔-전기영동에 의해 분리되었다. 조건당 3개의 생물학적 복제가 도시된다(1-3).
도 13은 hTert 형질전환된 DM1 섬유아세포(좌측, 억제제 없음)에서 단일 gRNA를 사용한 CTG 반복 절단 및 DNA-PK 억제 후 증강된 반복 절단(우측, 10uM 화합물 6)을 도시한다. DNA 겔-전기영동은 절제된 DNA에서 야생형을 분리한다. 6개 개별 gRNA(4, 5, 6, 7, 9 및 10)에 대한 반복 절제 실험이 도시되어 있다.
도 14a-14e는 DM1 형질전환된 섬유아세포에서 CUG 병소의 수에 대한 표시된 가이드 쌍 플러스 또는 마이너스 DNA-PK 억제제의 효과를 도시한다. SpCas9를 사용한 가이드 쌍 A, B, C 및 D는 각각 도 14b, 14c, 14d 및 14e에 도시되어 있다. 증가된 수의 세포는 FISH에 의해 입증된 바와 같이 편집되지 않은 대조군 세포(도 14a)와 비교하여 0 CUG 병소를 갖는 세포 핵을 도시한다. x축은 핵당 CUG 병소의 수를 도시한다. 효과는 DNA-PKi(10uM 화합물 6)의 존재에서 더욱 강화된다.
도 15a-d는 형질전환된 DM1 섬유아세포에서 gRNA 쌍을 사용한 CTG 반복 절제 후 질환 표현형의 구제를 도시한다. RNA 스플라이싱의 부분적 복원은 MBNL1(도 15a), NCOR2(도 15b), FM1(도 15c)에서 qPCR에 의해 확인되었으며, 관찰된 효과는 DNA-PKi(10uM, 화합물 6)의 존재에서 더욱 강화되었다. 더욱이, 편집은 표적화된 DMPK 유전자의 발현을 유의하게 변경하지 않는다(도 15d). 모의-처리된(M) 및 AAVS1(NT)을 표적화하는 대조군 가이드로 처리된 세포도 분석되었다.
도 16은 인간 DMPK 유전자좌에서 단일 gRNA CTG 반복 절제에 사용된 gRNA의 개요를 도시한다. gRNA는 CTG 반복의 5' 또는 3' 부위를 표적화하도록 설계되었다. 단지 예시적인 가이드만 도시되어 있다.
도 17은 FMR1의 5' UTR 영역 및 CGGn 반복에 대한 예시적인 시험된 gRNA의 개략도를 도시한다.
도 18은 M28 CHOC2 및 모자이크 CHOC1 뉴런 전구체 세포(NPC)에서의 CGG 반복 절제를 도시한다. 5개의 가능한 5' gRNA는 반복의 좌측에 도시되고 하나의 가능한 3' gRNA는 반복의 우측에 도시된다. 세포는 SpCas9 RNP 전기천공 후 3' gRNA와 조합하여 gRNA a-e(5' gRNA) 중 하나로 처리되었다. ΔCGG: CGG 절제된 iPSC로부터 유래된 대조군. C1 및 C2: CHOC1 편집되지 않은 대조군. 참고: PCR은 C1 대조군 레인에 대해 실패했다.
도 19는 특정 가이드 서열의 표적 서열과 중첩되는 CHOC1 NPC에서 작은 사전-존재하는 결실(CHOC1 Δ)의 위치를 나타내는 5' UTR 유전자형 분석 결과를 도시한다. 도 19는 또한 예시적인 가이드 위치에 대한 CHOC1 Δ의 개략도를 포함한다.
도 20은 단일 gRNA(서열번호: 5262)를 사용한 절제 후 단일 CHOC1 클론으로부터의 시퀀싱 판독의 표현을 도시한다.
도 21a-b는 SpCas9 RNP 전기천공 후 단일 또는 쌍을 이룬 gRNA를 사용한 CGG 반복 절제에 대한 증거를 도시한다. 도 21a는 분화된 유사분열-후 CHOC2 뉴런에서 DNA-PK 억제제로 처리하지 않은 CGG 반복 절제를 도시한다. 화살표는 생어-시퀀싱에 의해 확인된 절제된 DNA 밴드를 나타낸다. 도 21b는 CHOC2 뉴런 전구체 세포(NPC)에서 SpCas9로 단일 가이드 절제 실험을 도시한다. PCR 증폭된 FMR1 DNA는 Agilent의 2200 TapeStation을 사용하여 전기영동으로 분리되었다. gRNA GDG_Cas9_Fmr1_1(서열번호: 5262)(레인 B1=DMSO; 레인 A2=화합물 6)은 CGG 반복의 절제를 도시한다.
도 22는 Cpf1 또는 SpCas9와 쌍을 이룬 gRNA 접근법에서 DNA-PK 억제제("+ 억제제"; 1uM 화합물 3)로 치료의 iPS 세포 내 프라탁신 유전자좌(4670 및 68FA)에서 GAA 반복 절제에 대한 효과를 도시한다.
도 23은 iPS 세포를 DNA-PK 억제제(1uM 화합물 3)로 처리하고 프라탁신 유전자좌에서 쌍을 이룬 가이드 GAA 반복 절제시 관찰된 모든 NHEJ 수선에서 50% MMEJ 수선으로의 이동을 도시한다. 점선은 예상된 절단 부위를 나타낸다. 굵게 표시되고 밑줄이 그어진 문자는 삽입된 뉴클레오티드를 나타낸다(NHEJ 수선에서 전형적임). 굵게 표시된 문자는 수선의 2개 말단에서 미세상동성을 강조 표시한다(명확성을 위해 양 말단에 표시되지만 실제 시퀀스에서는 미세 상동성 서열의 단지 하나의 카피만 보존됨).
도 24a-c는 DNA-PK 억제제가 있거나("+ Inh.") 또는 없는("- Inh.") spCas9를 갖는 FA iPSC에서 GAA 절제 후 상승된 FXN 수준을 도시한다. 도 24a는 iPSC에서 Cas9-매개된 유전자 편집을 위한 작업흐름을 도시한다. 도 24b, 대조군에 비교하여 0.4, 1.5, 5 및 11kb 단편의 쌍을 이룬 gRNA 절제 후 대표적인 웨스턴 블롯(AAVS1 gRNA, 스페이서 서열 서열번호: 31). 도 24c는 편집되지 않은 대조군에 비교하여 FACS에 의해 분류된 개별 클론의 분석을 도시한다.
도 25는 취약한-X 유전자좌에서 MMEJ-기반 CGG-반복 절제에 대한 모델을 도시한다. 단일 gRNA 및 5' DNA 절제를 사용한 절단은 CGG 반복 부위의 업스트림 부위에 미세상동성을 갖는 말단(상자)을 초래하여, MMEJ 수선를 촉진한다.
도 26a-c는 리포펙타민 3000 형질감염을 갖는 HEK293T 세포에서 업스트림 sgRNA(도 26a), 다운스트림 sgRNA(도 26b), 및 CTG 반복 확장 내에 또는 이에 인접하여 위치된 sgRNA(도 26c)를 포함한 DMPK의 3' UTR을 표적화하는 sgRNA의 편집 효율(% 삽입결실)을 도시한다. 게놈 DNA를 형질감염 72시간 후에 단리하고 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석에 의해 편집 효율을 평가했다(오차 막대 = 3개 복제로부터의 SEM).
도 27a-c는 리포펙타민 2000 형질감염을 갖는 HEK293T 세포에서 업스트림 sgRNA(도 27a), 다운스트림 sgRNA(도 27b), 및 CTG 반복 확장 내에 또는 이에 인접하여 위치된 sgRNA(도 27c)를 포함한 DMPK의 3' UTR을 표적화하는 sgRNA의 편집 효율(% 삽입결실)을 도시한다. 게놈 DNA를 형질감염 48시간 후에 단리하고 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석에 의해 편집 효율을 평가했다(오차 막대 = 4개 복제로부터의 SEM).
도 28a-b는 TIDE 분석에 의한, 1:6 Cas9:sgRNA의 비율에서 3가지 농도의 Cas9(10pmole(삼각형), 20pmole(정사각형) 및 30pmol(원))에서 DM1 근모세포에서 DMPK의 3' UTR을 표적화하는 개별 sgRNA의 편집 효율을 도시한다. 퍼센트 편집 효율은 Y 축(도 28a) 및 히트맵(도 28b) 상에 표시된다.
도 29는 HEK 293T 세포 및 DM1 근모세포에서 42개 개별 sgRNA에 대한 퍼센트 편집 효율 결과의 스피어만 상관관계를 도시한다. 스피어만 상관관계 값, rho = 0.528. p-값 = 0.0002.
도 30은 DM1 근모세포에 RNP(20pmol)에서 전달된 개별 sgRNA 및 Cas9를 사용하여 유도된 낮은-빈도 큰 삽입결실을 도시한다. DMPK 3' UTR 영역을 GoTaq PCR로 증폭하고 DNA 겔 전기영동으로 시각화했다; PCR 생성물을 절제하고 생거 시퀀싱을 수행했다.
도 31a-b는 DM1 근모세포에 RNP에서 전달된 개별 sgRNA 및 Cas9를 사용하여 유도된 낮은-빈도 큰 삽입결실을 도시한다. 도 31a는 sgRNA 서열번호: 3938(DMPK-U14) 및 DM383 대조군에 대한 생거 시퀀싱 흔적을 도시한다. 도 31b는 2가지 농도의 Cas9(20pmol 및 30pmol)에서 sgRNA 및 Cas9로 DM1 근모세포의 처리에 이은 DNA 겔 전기영동에 의한 PCR 생성물을 도시한다.
도 32는 DM1 근모세포 내 RNP에서 전달된 DMPK 및 Cas9의 3' UTR을 표적화하는 개별 sgRNA에 의해 유도된 예시적인 큰 삽입결실, 및 큰 삽입결실을 유도함에 의해 CTG 반복을 추가로 절제하는 예시적인 sgRNA를 묘사한다. 화살표는 각 sgRNA에 대한 게놈 표적 부위를 나타낸다.
도 33a-c는 DM1 근모세포에서 쌍을 이룬 sgRNA를 사용한 CTG 반복 절제를 도시한다. 도 33a는 DMPK의 WT 및 질환 대립유전자에서 선별된 sgRNA에 대한 표적 부위의 개략도를 도시한다. 도 33b는 야생형 DNA 및 절제된 DNA("더블컷 편집 대립유전자"로 지칭됨)의 DNA 겔-전기영동에 의한 PCR 생성물의 분리를 도시한다. 도 33c는 신호의 소실 ddPCR 검정에 의해 측정된 개별 sgRNA 및 sgRNA의 쌍에 대한 CTG 반복 절제 효율을 도시한다. U1은 서열번호: 3778(DMPK-U27)이고; U2는 서열번호: 3386(DMPK-U56)이고; U3은 서열번호: 3354(DMPK-U58)이고; D1은 서열번호: 2514(DMPK-D15)이고; D2는 서열번호: 2258(DMPK-D34)이고; D3은 서열번호: 2210(DMPK-D42)이다. 쌍 1은 sgRNA 서열번호: 3778(DMPK-U27) 및 sgRNA 서열번호: 2258(DMPK-D34)에 상응하고; 쌍 2는 sgRNA 서열번호: 3778(DMPK-U27) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42)에 상응하고; 쌍 3은 sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2258(DMPK-D34)에 상응하고; 쌍 4는 sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42)에 상응하고; 쌍 5는 sgRNA 서열번호: 3354(DMPK-U58) 및 sgRNA 서열번호: 2514(DMPK-D15)에 상응한다.
도 34a-b는 DM1 및 건강한 대조군 샘플에 비교하여 FISH에 의한 개별 sgRNA 또는 쌍을 이룬 sgRNA를 사용하여 DM1 근모세포에서 (CUG)n 반복 RNA 병소의 감소를 도시한다. 면역형광은 단일 절단 sgRNA 1 및 쌍 4를 도시한다(도 34a). 결과는 sgRNA 1-6 및 쌍 1-5에 대해 핵당 관찰된 (CUG)n 반복 RNA 병소의 수의 % 상대적 빈도로 도시된다(도 34b). sgRNA1은 서열번호: 3778(DMPK-U27)이고; sgRNA2는 서열번호: 3386(DMPK-U56)이고; sgRNA3은 서열번호: 3354(DMPK-U58)이고; sgRNA4는 서열번호: 2514(DMPK-D15)이고; sgRNA5는 서열번호: 2258(DMPK-D34)이고; sgRNA6은 서열번호: 2210(DMPK-D42)이다. 쌍 1은 sgRNA 서열번호: 3778(DMPK-U27) 및 sgRNA 서열번호: 2258(DMPK-D34)에 상응하고; 쌍 2는 sgRNA 서열번호: 3778(DMPK-U27) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42)에 상응하고; 쌍 3은 sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2258(DMPK-D34)에 상응하고; 쌍 4는 sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42)에 상응하고; 쌍 5는 sgRNA 서열번호: 3354(DMPK-U58) 및 sgRNA 서열번호: 2514(DMPK-D15)에 상응한다.
도 35a-b는 DM1 및 건강한 대조군에 비교하여 FISH에 의한 개별 sgRNA 또는 쌍을 이룬 sgRNA를 사용하여 DM1 근관에서 (CUG)n 반복 RNA 병소의 감소를 도시한다. 면역형광은 sgRNA1(서열번호: 3778, DMPK-U27) 및 쌍 4(sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42))에 대한 DAPI, 근원성, MBLN1, 및 (CUG)n RNA 병소에 대해 도시된다(도 35a). 결과는 sgRNA 1-6 및 쌍 1-5에 대해 핵당 관찰된 (CUG)n 반복 RNA 병소의 수의 % 상대적 빈도로 도시된다(도 35b). sgRNA1은 서열번호: 3778(DMPK-U27)이고; sgRNA2는 서열번호: 3386(DMPK-U56)이고; sgRNA3은 서열번호: 3354(DMPK-U58)이고; sgRNA4는 서열번호: 2514(DMPK-D15)이고; sgRNA5는 서열번호: 2258(DMPK-D34)이고; sgRNA6은 서열번호: 2210(DMPK-D42)이다. 쌍 1은 sgRNA 서열번호: 3778(DMPK-U27) 및 sgRNA 서열번호: 2258(DMPK-D34)에 상응하고; 쌍 2는 sgRNA 서열번호: 3778(DMPK-U27) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42)에 상응하고; 쌍 3은 sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2258(DMPK-D34)에 상응하고; 쌍 4는 sgRNA 서열번호: 3386(DMPK-U56) 및 sgRNA 서열번호: 2210(DMPK-D42)에 상응하고; 쌍 5는 sgRNA 서열번호: 3354(DMPK-U58) 및 sgRNA 서열번호: 2514(DMPK-D15)에 상응한다.
도 36a-d는 DM1 근관에서 쌍을 이룬 sgRNA를 사용하여 CTG 반복 절제에 의한 미스-스플라이싱의 교정을 도시한다. 결과는 BIN1(도 37a), DMD(도 37b), KIF13A(도 37c) 및 CACNA2D1(도 37d) mRNA에서 RNA 스플라이싱의 부분적 복원을 보여주는 qPCR 데이터를 도시한다.
도 37은 DM1 근모세포에서 SpCas9로의 단일 가이드 절제 실험을 도시한다. 도 37은 절제된 CTG 반복 +/- 3uM 화합물 6 및 8개 개별 가이드(DMPK-U10(서열번호: 3914), DMPK-U40(서열번호: 3514), DMPK-D59(서열번호: 1778), DMPK-D13(서열번호: 2458), DMPK-U16(서열번호: 3858), DMPK-U54(서열번호: 3418), DMPK-D63(서열번호: 1706), 또는 DMPK-D34(서열번호: 2258))의 예시적 흔적에 대한 Agilent의 2200 TapeStation을 사용한 전기영동에 의해 분리된 PCR 증폭된 DMPK DNA를 도시한다. 화합물 6 처리된 샘플에서 더 두드러진 밴드는 DMSO 대조군(동그라미쳐짐)에 비해 증강된 절제 비율을 나타낸다.
도 38a-c는 가이드 쌍(서열번호: 3330 및 2554)을 갖는 SpCas9 RNP 전달 +/- 3uM 화합물 6(열린 원(+ Inh), 흑색 원(-Inh)) 후 이중 gRNA CTG 반복 절제 후 DM1 근모세포에서 미스-스플라이싱 교정을 도시한다(도 38a). AAVS1 gRNA(도 38b) 및 모의 전기천공 세포(도 38c)는 대조군으로 작용했다. 미스-스플라이싱 교정은 유전자 GFTP1, BIN1, MBNL2, DMD, NFIX, GOLGA4 및 KIF13A에 대해 평가되었다. 주어진 스플라이싱 이벤트의 빈도는 NGS에 의해 측정되었다; 데이터는 모의 처리된 것에 정규화된다.
도 39a-b는 spCas9 및 가이드 쌍(서열번호: 3330(GDG_DMPK3) 및 서열번호: 2506(CRISPR-3)(도 39a); 또는 서열번호: 3330(GDG_DMPK3) 및 서열번호: 2546(CRISPR-4)(도 39b))을 함유하는 RNP로 처리된 DM1 환자 섬유아세포에서 CTG 반복 절제에 대한 DNA-PK 억제제의 용량 반응을 도시한다. 섬유아세포는 증가하는 용량의 화합물 6(30nM, 300nM, 3μM 및 10μM) 또는 DMSO로 처리되었다. 절제된 생성물은 DNA 겔 전기영동에 의해 밴드로 관찰된다.
도 40은 DM1 환자 섬유아세포에서 2개 gRNA(서열번호: 1153(gRNA 1), 서열번호: 1129(gRNA2))에 대한 화합물 6이 있거나 없는 SaCas9로 단일 gRNA 절제의 예시적인 DNA 전기영동을 도시한다.
도 41a-b는 DMPK 유전자의 3' UTR을 표적화하는 42개 개별 SpCas9 sgRNA로 편집된 DM1 환자 근모세포로부터의 DMPK의 PCR 증폭된 3'UTR 영역의 전기영동도의 합성을 도시한다. 전기천공 후 세포를 DMSO(상단 행) 또는 3uM 화합물 6(하단 행)과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 화살표는 편집되지 않은 건강한 대립유전자의 예상된 크기를 나타낸다. 편집되지 않은 질환(확장된 CTG 대립유전자는 증폭되지 않음). 화살표 아래의 밴드는 추정 편집된 대립유전자이다. 모의 = RNP 없이 전기천공됨. NTC(비-표적화 대조군)는 게놈에서 다른 곳을 표적화하는 RNP로 전기천공된다. 도 41a는 복제 1을 도시하고, 도 41b는 복제 2를 도시한다.
도 42a-f는 DNA-PK 억제가 있거나 없는 단일 절단 절제 실험에 대한 예시적인 PacBio 시퀀싱 결과를 도시한다. 도 42a는 모의 가이드로의 결과를 도시하고; 도 42b는 가이드 DMPK-D43으로의 결과를 도시하고; 도 42c는 DMPK-D51로의 결과를 도시하고; 도 42d는 가이드 DMPK-U10으로의 결과를 도시하고; 도 42e는 가이드 DMPK-U52로의 결과를 도시하고; 도 42f는 결과 가이드 DMPK-U58을 도시한다. 결과는 건강한 대립유전자에 대한 판독 계수를 도시한다. 1195-bp 앰플리콘(양성 가닥에 대해 도시됨)에 걸쳐 있는 각 조건에 대한 누적 수치를 판독한다. 흑색 실선 영역은 3' UTR을 나타내고 패턴화된 영역은 반복을 나타낸다. 점선은 sgRNA의 절단 부위를 나타낸다. 관심 있는 영역에서 제로 반복인 각 조건에서 판독의 대략적인 분획(즉, 반복 절제가 있는 판독의 분획). 이는 (품질 관리 수행 후) 반복 영역에 상응하는 CIGAR 문자열의 일부를 추출함에 의해 계산되었다. 가이드는 앰플리콘을 따라 절단 부위의 위치에 의해 정렬된다. 품질 관리 후 각 조건에 대한 길이 분포를 판독한다.
도 43a-e는 DMPK 유전자의 3' UTR(CTG 반복의 22 sgRNA 업스트림 및 20 다운스트림)를 표적화하는 42개 SpCas9 sgRNA의 모든 쌍별 조합으로 편집된 DM1 환자 섬유아세포로부터의 DMPK의 PCR 증폭된 3'UTR 영역의 전기영동도의 합성을 도시한다. 각 가이드 쌍으로 미리-장입된 RNP로 전기천공한 후 세포를 DMSO(각 쌍의 상단 열) 또는 3uM 화합물 6(각 쌍에 대해 하단 열)과 함께 24시간 동안 인큐베이션했다. 화살표는 편집되지 않은 건강한 대립유전자의 예상된 크기를 나타낸다. 편집되지 않은 환자 대립유전자는 증폭되지 않는다. 화살표 아래의 밴드는 추정 편집된 대립유전자이고; 건강한 라인 위의 밴드는 추정 중복 또는 기타 복잡한 재배열이다. 도 43a는 스크린의 플레이트 1을 도시한다. 도 43b는 스크린의 플레이트 2를 도시한다. 도 43c는 스크린의 플레이트 3을 도시한다. 도 43d는 스크린의 플레이트 4를 도시한다. 도 43e는 스크린의 플레이트 5를 도시한다.
도 44는 FA 림프모구성 세포주(LCL)에서 다양한 Cas9 및 sgRNA 농도를 갖는 조건의 스크린에서 FXN 유전자를 표적화하는 sgRNA에 대한 % 삽입결실 효율의 히트맵을 도시한다.
도 45는 2개 환자 세포주(GM14518 및 GM03665)에서 FXN 유전자에서 GAA 반복의 업스트림을 표적화하는 56개 개별 sgRNA에 대한 삽입결실 효율(%)을 나타내는 히트맵을 도시한다. 전달된 RNP의 농도는 "높음"(15pmol Cas9 + 45pmol sgRNA) 또는 "낮음"(7.5pmol Cas9 + 22.5pmol sgRNA)으로 표시된다.
도 46은 2개 환자 세포주(GM14518 및 GM03665)에서 FXN 유전자에서 GAA 반복의 다운스트림을 표적화하는 40개 개별 sgRNA에 대한 삽입결실 효율(%)을 나타내는 히트맵을 도시한다. 전달된 RNP의 농도는 "높음"(15pmol Cas9 + 45pmol sgRNA) 또는 "낮음"(7.5pmol Cas9 + 22.5pmol sgRNA)으로 표시된다. sgRNA 서열번호: 26562(FXN-D25)에 대한 삽입결실 효율은 표적화된 가이드 RNA 서열 내에 위치한 GM14518 환자 계통에 존재하는 SNP(단일 뉴클레오티드 다형성)로 인해 계산될 수 없었다. CDC42BPB 및 RELA는 각각 그의 알려진 높은 및 중간 효율로 인해 실험적 검정 대조군으로 사용되었다.
도 47a-c는 GAA 반복(서열번호: 52666 및 26562)에 측접하는 가이드 쌍과 함께 RNP 전기천공을 사용하여 FA 심근세포에서 SpCas9로 이중 가이드 절제 실험을 도시한다. GAA 절제는 3uM 화합물 6으로 유의하게 개선되었고(도 47a) 더 높은 FXN mRNA(도 47b, GAA+Inh)) 및 FXN 단백질 수준(도 47c, GAA+Inh)을 초래하였다. "NTC"는 비-표적화 대조군을 지칭한다. "GAA"는 GAA 반복에 측접하는 쌍 가이드를 지칭한다.
도 48은 RNP 전기천공을 사용하여 야생형(WT) 및 FA iPSC에서 Cpf1(Cas12a) 및 SpCas9로의 이중 가이드 절제 실험을 도시한다. 도 48은 Cpf1(박스, GD1&2(서열번호: 47047 및 7447)) 및 SpCas9(Cas9 LG5&11(서열번호: 52666 및 26562))로 GAA 반복 절제 후 절제된 DNA 밴드를 보여주는 DNA 겔-전기영동을 도시한다.
도 49는 야생형 iPSC-유래된 피질 뉴런에서 Cpf1(Cas12a)로의 이중 가이드 절제 실험을 도시한다. 다음 가이드 쌍으로 RNP 전기천공을 사용하여 Cpf1로 GAA 반복 절제 후 절제된 DNA 밴드를 보여주는 DNA 겔-전기영동: 가이드 1&2(서열번호: 47047 및 7447); 가이드 3&4(서열번호: 7463 및 46967); 가이드 5&6(서열번호: 46768 및 7680); 가이드 7&2(서열번호: 47032 및 7447).
도 50은 성체 YG8+/- 마우스에서 뉴런을 표적화하기 위한 예시적인 AAV 벡터 디자인을 도시한다. hSynapsin 1 프로모터는 뉴런에서 AsCpf1(Cas12a, 벡터 1) 및 mCherry-KASH(벡터 2)의 발현을 유도한다. 2개 Cpf1 gRNA(서열번호: 47047 및 7447)를 하나의 U6 프로모터의 제어 하에 탠덤으로 클로닝하여 GAA 반복을 절제하였다.
도 51a-c는 성체 YG8+/- 마우스의 선조체 안으로 이중 AAV 전달(1:1 비율)을 갖는 프리드라이히의 운동실조에 대한 생체내 마우스 모델에서 AsCpf1(Cas12a)로의 이중 가이드 절제 실험을 도시한다. 도 51a는 mCherry 양성 선조체를 나타내는 정위 주사 2주 후의 뇌 조직학을 도시한다. 도 51b는 FACS에 의한 표적화된 뉴런의 핵 분류를 도시한다. 도 51c는 표적화된 뉴런(mCherry +) 대 비-표적화된 세포(mCherry -)에서 Cpf1로 GAA 반복 절제 후 절제된 DNA 밴드를 나타내는 DNA 겔-전기영동을 도시한다.
도 52는 CTG 반복 영역을 확인하기 위해 게놈 DNA를 Bgl I로 분해에 이어 서던 블롯 분석에 의한 야생형 iPSC 세포주에 비교된 DM1 iPSC 세포주 SB1의 특성규명을 도시한다. SB1 세포는 ~300 CTG 반복의 CTG 반복 영역을 함유한다(CTG 반복 대립유전자는 ~4.4kB로 도시됨).
도 53은 DMPK 유전자의 3' UTR에서 CTG 반복 영역의 결실을 검출하기 위해 사용된 2개 신호의 소실(LOS) 디지털 액적 PCR(ddPCR) 검정(5' LOS ddPCR 검정 및 3' LOS ddPCR 검정)에 대한 개략도를 도시한다.
도 54는 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SpCas9를 사용한 편집 효율성의 평가를 위해 선택된 6개 업스트림 gRNA(CTG 반복 영역의 5' 측)(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 및 3746) 및 6개 다운스트림 gRNA(CTG 반복 영역의 3' 측)(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210)의 개략도를 도시한다.
도 55는 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SpCas9로 6개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 및 3746) 및 6개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210)에 대한 퍼센트 편집 효율성 결과를 도시한다.
도 56은 2개 LOS ddPCR 검정(5' 및 3')에 의한 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SpCas9로 각각의 6개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210)와 각각의 6개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 및 3746)인 36개 쌍 조합에 대해 그리고 개별 gRNA로 시험된 gRNA에 대해 CTG 반복 영역의 퍼센트 결실을 도시한다. 도시된 % 결실은 양 LOS ddPCR 검정에서 조합된 평균 반복 결실이다.
도 57은 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SpCas9 gRNA 쌍 및 개별 gRNA에 걸친 5' 및 3' LOS ddPCR 결과의 비교를 도시한다. 결과는 퍼센트 결실로 도시된다.
도 58은 DM1 iPSC 세포주 4033-4에서 SpCas9를 사용한 편집 효율성의 평가를 위해 선택된 5개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 3906, 및 3746) 및 5개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586 및 2210)의 개략도를 도시한다.
도 59는 개별 gRNA로서 시험된 gRNA에 대해 그리고 2개 LOS ddPCR 검정(5' 및 3')에 의해 DM1 iPSC 세포주 4033-4에서 SpCas9와 5개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 3906, 및 3746) 및 5개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 및 2210)의 25개 쌍 조합에 대해 CTG 반복 영역의 퍼센트 결실을 도시한다. 결과는 5' 및 3' LOS ddPCR 검정 둘 모두에 대한 퍼센트 결실로 도시된다.
도 60a-b는 SB1 세포(도 60a)(~1kb CTG 반복 대립유전자)(n=1) 및 4033-4 세포(도 60b)(~7.5kb CTG 반복 대립유전자)(n=2)에서 SpCas9를 갖는 gRNA 쌍 및 개별 gRNA에 걸친 평균 반복 결실을 도시한다. 양 5' 및 3' LOS ddPCR 검정이 각 실험에 사용되었다.
도 61은 DM1 심근세포에서 SpCas9를 사용한 편집 효율성의 평가를 위해 선택된 5개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 3906, 및 3746) 및 5개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 및 2210)의 개략도를 도시한다.
도 62는 DM1 iPSC SB1 세포에서 편집 효율성에 비교하여 DM1 심근세포에서 SpCas9로 5개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 3906, 및 3746) 및 5개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 및 2210)의 편집 효율성을 도시한다. 편집 효율성은 퍼센트 삽입결실로 도시된다(n=1).
도 63은 DM1 심근세포("CM") 및 DM1 iPSC SB1 세포("iPSC")에서 SpCas9를 갖는 3개 gRNA 쌍(서열번호: 3746/2210, 4026/1586, 및 3778/1778)에 대한 CTG 반복 영역의 퍼센트 결실을 도시한다(n=1).
도 64는 개별 gRNA로서 시험된 gRNA에 대해 그리고 2개 LOS ddPCR 검정(5' 및 3')에 의해 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SpCas9와 6개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 및 3746) 및 6개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914 및 2210)의 36개 쌍 조합에 대해 CTG 반복 영역의 퍼센트 결실을 도시한다. 화살표는 하이브리드 캡처 표적-외 분석을 기반으로 "깨끗한"(백색), "표적-외 <1%"(회색) 또는 "표적-외 >1%"(흑색)으로 식별된 gRNA 쌍을 나타낸다.
도 65는 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SaCas9를 사용한 편집 효율성의 평가를 위해 선택된 30개 업스트림 gRNA 및 30개 다운스트림 gRNA의 개략도를 도시한다.
도 66은 야생형 iPSC 세포에서 SaCas9를 사용한 30개 업스트림 gRNA 및 30개 다운스트림 gRNA 퍼센트 편집 효율성 결과를 도시한다.
도 67은 DM1 iPSC 세포주 SB1에서 SaCas9를 사용한 CTG 반복 결실의 평가를 위해 선택된 4개 업스트림 gRNA(서열번호: 3256, 2896, 3136, 및 3224) 및 6개 다운스트림 gRNA(서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 및 616)의 개략도를 도시한다.
도 68a-b는 saCas9 gRNA에 대한 퍼센트 CTG 반복 결실(도 68a) 및 편집 효율성(도 68b)을 도시한다. 퍼센트 반복 결실 데이터는 3' LOS ddPCR 검정에서 쌍 및 개별 saCas9 gRNA에 대해 도시된다. spCas9 gRNA 쌍(서열번호: 3746 및 2210)을 대조군으로 사용했다. 도 68b에서, #2는 gRNA Sa2를 지칭하고, #3은 gRNA Sa3을 지칭하고, #4는 gRNA Sa4를 지칭하고, #21은 gRNA Sa21을 지칭하고, #1은 gRNA Sa1을 지칭하고, #10은 gRNA Sa10을 지칭하고, #17은 gRNA Sa17을 지칭하고, #19는 gRNA Sa19를 지칭하고, #25는 gRNA Sa25를 지칭하고, #29는 gRNA Sa29를 지칭한다(또한 표 21 참고).
이제 본 발명의 특정 실시형태에 대한 참조가 상세하게 이루어 질 것이며, 그 예는 첨부하는 도면에 예시되어 있다. 본 발명은 예시된 실시형태와 관련하여 기술되지만, 그것들은 본 발명을 이들 실시형태로 제한하도록 의도되지 않음이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 포함된 실시형태에 의해 정의된 바와 같이 본 발명에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포괄하도록 의도된다.
본 교시내용을 상세하게 기술하기 전에, 본 개시내용은 변경될 수 있는 특정 조성물 또는 공정 단계에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참고를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "가이드"에 대한 언급은 복수의 가이드를 포함하고 "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다.
수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 측정된 및 측정가능한 값은 유효 숫자 및 측정과 연관된 오류를 고려하여 대략적인 것으로 이해된다. 또한, "포함하다", "포함한다", "포함하는", "함유하다", "함유한다", "함유하는", "포괄하다", "포괄한다", "포괄하는"의 사용은 제한하려는 의도가 아니다. 전술한 일반적인 설명 및 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적일 뿐이며 교시내용을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성요소를 "포함하는"을 인용하는 명세서의 실시형태는 또한 인용된 구성요소로 "구성하는" 또는 "본질적으로 구성되는" 것으로 고려되며; 다양한 구성요소를 "구성하는"을 인용하는 명세서의 실시형태는 또한 인용된 구성요소를 "포함하는" 또는 "본질적으로 구성되는" 것으로 고려되며; 그리고 다양한 구성요소로 "본질적으로 구성되는"을 인용하는 명세서의 실시형태는 또한 인용된 구성요소를 "구성하는" 또는 "포함하는" 것으로 고려된다(이 상호교환성은 청구범위에서 이들 용어의 사용에 적용되지 않는다). 용어 "또는"은 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한 포괄적인 의미, 즉 "및/또는"과 동등한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 조직화 목적만을 위한 것이고 원하는 주제를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서에 정의된 임의의 용어 또는 본 명세서의 다른 명시적 내용과 모순되는 경우 본 명세서가 우선한다. 본 교시내용이 다양한 실시형태와 관련하여 기술되지만, 본 교시내용은 이러한 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시내용은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 다양한 대안, 변형 및 등가물을 포괄한다.
I. 정의
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 다음 용어 및 구문은 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다:
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 통상적인 RNA, DNA, 혼합 RNA-DNA, 및 이들의 유사체인 중합체를 포함하여, 골격을 따라 함께 연결된 질소성 헤테로사이클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 핵산 "골격"은 당-포스포디에스테르 연결, 펩티드-핵산 결합("펩티드 핵산" 또는 PNA; PCT 번호 WO 95/32305), 포스포로티오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결, 또는 이의 조합 중 하나 이상을 포함한 다양한 연결로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스 또는, 예를 들어 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환 같은 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 질소성 염기는 통상적인 염기(A, G, C, T, U), 이의 유사체(예를 들어, 5-메톡시우리딘, 슈도우리딘 또는 N1-메틸슈도우리딘 또는 기타와 같은 변형된 우리딘); 이노신; 퓨린 또는 피리미딘의 유도체(예를 들어, N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자- 또는 아자-피리미딘, 5 또는 6 위치에 치환기를 갖는 피리미딘 염기(예를 들어, 5-메틸시토신), 2, 6 또는 8 위치에서 치환기를 갖는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸히드라진-피리미딘, 및 O4-알킬-피리미딘일 수 있다; 미국 특허 번호 5,378,825 및 PCT 번호 WO 93/13121). 일반적인 논의는 The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams 등, ed., 11th ed., 1992를 참고한다). 핵산은 골격이 중합체의 위치(들)에 대한 무 질소성 염기를 포함하는 하나 이상의 "무염기성" 잔기를 포함할 수 있다(미국 특허 번호 5,585,481). 핵산은 통상적인 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 연결만을 포함할 수 있거나, 통상적인 성분 및 치환 둘 모두를 포함할 수 있다(예를 들어, 2' 메톡시 연결이 있는 통상적인 염기, 또는 통상적인 염기 및 하나 이상의 염기 유사체 둘 모두를 함유하는 중합체). 핵산은 상보적 RNA 및 DNA 서열에 대한 혼성화 친화도를 증강시키는 당 형태를 모방하는 RNA에 잠긴 바이사이클릭 푸라노스 단위가 있는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드 단량체를 함유하는 유사체인, "잠금 핵산"(LNA)을 포함한다(Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41). RNA 및 DNA는 상이한 당 모이어티를 가지고 RNA에 우라실 또는 이의 유사체 및 DNA에 티민 또는 이의 유사체의 존재에 의해 상이할 수 있다.
"가이드 RNA", "gRNA", 및 간단히 "가이드"는 crRNA(CRISPR RNA로도 알려짐), 또는 crRNA와 trRNA(tracrRNA로도 알려짐)의 조합을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA, sgRNA)로 또는 2개의 별도 RNA 분자(이중 가이드 RNA, dgRNA)에 연계될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 자연적으로-발생하는 서열일 수 있거나, 자연적으로-발생하는 서열과 비교하여 변형 또는 변이가 있는 trRNA 서열일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "스페이서 서열"은 때때로 본 명세서 및 문헌에서 "가이드 서열" 또는 "표적화 서열"로도 지칭되며, 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA 내의 서열을 지칭하고 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위해 가이드 RNA를 표적 서열로 지향시키는 기능을 한다. 가이드 서열은 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스(즉, Spy Cas9, SpCas9) 및 관련 Cas9 상동체/이종상동체의 경우 길이가 20개 염기 쌍일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열, 예를 들어 길이가 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24-, 또는 25-뉴클레오티드가 가이드로 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 예를 들어 유전자 또는 염색체 상에 있고 가이드 서열에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372로부터 선택된 서열 중 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 연속 뉴클레오티드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호: 101-4988, 5001-7264 또는 7301-53372로부터 선택된 서열에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3 또는 4개 미스매치를 함유할 수 있으며, 여기서 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20 또는 그 초과의 염기 쌍이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 가이드 서열이 적어도 17, 18, 19, 20 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 1-4개 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 가이드 서열이 20개 뉴클레오티드를 포함하는 1, 2, 3, 또는 4개 미스매치를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372로부터 선택된 서열을 포함하고, 여기서 5' 말단 뉴클레오티드가 구아닌이 아닌 경우, 하나 이상의 구아닌(g)이 서열의 5' 끝에서 서열에 첨가된다. 5' g 또는 gg는 전사, 예를 들어 RNA 중합효소 III-의존성 U6 프로모터 또는 T7 프로모터에 의한 발현을 위해 일부 경우에 필요로 된다. 일부 실시형태에서, 5' 구아닌은 본 명세서에 개시된 가이드 서열 또는 가이드 서열의 쌍 중 임의의 하나에 첨가된다.
RNA-표적화된 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이기 때문에 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥(즉, 주어진 서열 및 서열의 역 상보체) 둘 모두 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 상보적"인 것으로 언급되는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA가 표적 서열의 역 상보체에 결합하도록 지시할 수 있음을 이해되어야 한다. 따라서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 상보체에 결합하는 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T에 대한 U의 치환을 제외하고는 표적 서열(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오티드와 동일하다.
본 명세서에 사용된 "가이드 RNA의 쌍" 또는 "가이드 쌍" 또는 "gRNA 쌍" 또는 "쌍을 이룬 가이드 RNA"는 동일한 스페이서 서열을 갖지 않는 2개 가이드 RNA를 지칭한다. 첫 번째 스페이서 서열은 쌍의 gRNA 중 하나의 스페이서 서열을 지칭하고, 두 번째 스페이서 서열은 쌍의 다른 gRNA의 스페이서 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍의 사용은 또한 2개의 절단이 이루어지는 "이중 절단" 또는 "이중절단" 전략으로 지칭된다. 대조적으로, 일부 실시형태에서, 단 하나의 가이드 RNA의 사용은 하나의 절단이 이루어지는 "단일 절단" 또는 "단일절단" 전략으로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 "RNA-표적화된 엔도뉴클레아제"는 RNA 및 DNA 결합 활성 및 DNA 절단 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체, 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 소단위을 의미하며, 여기서 DNA 결합 활성은 서열-특이적이고 RNA의 서열에 의존한다. 예시적인 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 절단효소/닉카아제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "Cas 단백질"이라고도 하는 "Cas 뉴클레아제"는 Cas 절단효소 및 Cas 닉카아제를 포함한다. Cas 절단효소/닉카아제는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 소단위, 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 소단위, 및 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 클래스 1 Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 클래스 2 Cas 뉴클레아제이다. 본 명세서에 사용된 "클래스 2 Cas 뉴클레아제"는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 단일-사슬 폴리펩티드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 클래스 2 Cas 절단효소/닉카아제(예를 들어, H840A, D10A 또는 N863A 변이체)를 포함하며, 이는 RNA-가이드된 DNA 절단효소 또는 닉카아제 활성을 추가로 갖는다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 예를 들어 Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9(예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0) (예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1) (예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 그의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질, Zetsche 등, Cell, 163: 1-13 (2015)은 Cas9와 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전체가 참고로 포함된다. 예를 들어 Zetsche의 표 S1 및 S3을 참고한다. 예를 들어, Makarova 등, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov 등, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)를 참고한다. 클래스 1은 유형 I, III 및 IV Cas 뉴클레아제로 나뉜다. 클래스 2는 유형 II, V 및 VI Cas 뉴클레아제로 나뉜다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 유형 I, II, III, IV, V 또는 VI Cas 뉴클레아제이다.
본 명세서에 사용된 "리보핵단백질"(RNP) 또는 "RNP 복합체"는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 절단효소 또는 Cas 닉카아제(예를 들어, Cas9)와 함께 가이드 RNA를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 Cas9와 같은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 표적 서열로 안내하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하고 작용제는 표적 서열에 결합하며, 이는 절단 또는 닉킹이 뒤따를 수 있다.
본 명세서에 사용된 "자가-상보적 영역"은, 예를 들어, 영역이 적어도 하나의 유리 이중-가닥 말단을 가질 때 그 자체에 대한 혼성화를 통해 이차 구조(예를 들어, 헤어핀, 십자형 등)를 형성할 수 있는 핵산의 임의의 부분을 지칭한다. 다양한 형태의 반복 및 GC-풍부 또는 AT-풍부 핵산은 자가-상보성으로 자격을 가지고 이차 구조를 형성할 수 있다. 일부 불일치 염기 및/또는 비-표준 염기 쌍의 존재에도 이차 구조가 형성될 수 있으므로 자가-상보성은 완벽한 자가-상보성을 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 자가-상보성 영역은 40개 뉴클레오티드를 포함한다. 자가-상보성 영역은 루프-형성 서열에 의해 중단될 수 있으며, 이는 반드시 자가-상보성일 필요는 없으며 헤어핀 또는 기타 이차 구조에서 줄기를 형성하는 자가-상보성 영역의 세그먼트 사이에 단일-가닥 상태로 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용된 제1 서열은, 제2 서열에 대한 제1 서열의 정렬이 그의 완전한 상태에서 제2 서열의 위치의 X% 이상이 제1 서열과 일치한다는 것을 나타내는 경우 제2 서열에 "적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함하는" 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 서열 AAG에 대해 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는데, 이는 정렬이 제2 서열의 모든 3개 위치에 대한 일치가 있다는 점에서 100% 동일성을 제공하기 때문이다. RNA와 DNA 사이의 차이(일반적으로 우리딘에서 티미딘으로 또는 그 반대로 교환)와 변형된 우리딘과 같은 뉴클레오시드 유사체의 존재는 관련 뉴클레오티드(예를 들어, 티미딘, 우리딘 또는 변형된 우리딘)가 동일한 상보체를 갖는 한 폴리뉴클레오티드 간의 동일성 또는 상보성의 차이에 기여하지 않다(예를 들어, 모든 티미딘, 우리딘 또는 변형된 우리딘에 대한 아데노신; 또 다른 예는 시토신 및 5-메틸시토신이며, 이 둘 모두는 상보체로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 가짐). 따라서 예를 들어, X가 슈도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘 또는 5-메톡시우리딘과 같은 임의의 변형된 우리딘인 서열 5'-AXG는 둘 모두 동일한 서열에 완벽하게 상보성(5'-CAU)이라는 점에서 AUG와 100% 동일한 것으로 간주된다. 예시적인 정렬 알고리즘은 당업계에 잘 알려진 Smith-Waterman 및 Needleman-Wunsch 알고리즘이다. 당업자는 정렬될 주어진 서열의 쌍에 적합한 알고리즘 및 매개변수 설정의 선택이 있다는 것을 이해할 것이다; 일반적으로 유사한 길이 및 아미노산의 경우 >50% 또는 뉴클레오티드의 경우 >75%의 예상된 동일성에 대해, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI에서 제공하는 Needleman-Wunsch 알고리즘 인터페이스의 기본 설정이 있는 Needleman-Wunsch 알고리즘이 일반적으로 적합하다.
"mRNA"는 DNA가 아니고 폴리펩티드로 번역될 수 있는(즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로 작용할 수 있는) 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 골격을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA 포스페이트-당 골격의 당은 본질적으로 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기, 또는 이의 조합으로 구성된다.
본 명세서에 기재된 가이드 RNA 조성물 및 방법에 유용한 가이드 서열은 표 2 및 서열 목록과 출원 전반에 걸쳐 제시되어 있다.
본 명세서에 사용된 "표적 서열"은 gRNA의 가이드 서열에 상보성을 갖는 표적 유전자 내의 핵산 서열을 지칭한다. 표적 서열과 가이드 서열의 상호작용은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제가 표적 서열 내에서 결합하고 잠재적으로 (작용제의 활성에 의존하여) 닉킹하거나 절단하도록 지시한다.
본 명세서에 사용된 "치료"는 대상체에서 질환 또는 장애에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하고, 질환 또는 질환의 전개(질환이 공식적으로 진단되기 전 또는 후에 발생할 수 있음, 예를 들어, 대상체가 질환의 전개 가능성이 있거나 초래할 가능성이 있는 유전자형을 갖고 있는 경우)를 억제하는 것, 그 전개를 저지하는 것, 질환의 하나 이상의 증상을 완화하는 것, 질환을 치유하는 것, 또는 질환의 하나 이상의 증상의 재발을 방지하는 것을 포함한다. 예를 들어, DM1의 치료는 DM1의 증상을 완화시키는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "개선"은 표현형 또는 증상에 대한 임의의 유익한 효과, 예컨대 그 중증도 감소, 그 전개 둔화 또는 지연, 그 전개 저지, 또는 이를 부분적으로 또는 완전히 역전 또는 제거하는 것을 지칭한다. 발현 수준과 같은 정량적 표현형의 경우에, 개선은 발현 수준을 변경하여 건강하거나 영향을 받지 않은 세포 또는 개체에서 볼 수 있는 발현 수준에 더 가깝게 하는 것을 포괄한다.
본 명세서에 사용된, 표적 서열은 표적의 절단에 이어 MMEJ 또는 기타 비-NHEJ 수선이 감지가능한 정도로 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열의 절제를 초래하는 경우 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열 "근처"에 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열의 10, 20, 30, 40, 50 또는 100개 뉴클레오티드 내에 있고, 여기서 표적으로부터 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열까지의 거리는 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열의 가장 가까운 뉴클레오티드와 절단되는 표적에서의 부위 사이의 뉴클레오티드의 수로 측정된다.
본 명세서에 사용된, 서열의 "절제"는 비제한적으로 하나 또는 2개의 이중 가닥 절단 이벤트 또는 2개 이상의 닉킹 이벤트에 이어 수선 생성물에 서열을 포함하지 않는 임의의 수선 과정을 포함하는 과정을 포함하여, 원래 발생한 핵산(예를 들어, gDNA와 같은 DNA)으로부터 서열의 제거를 초래하는 과정을 의미하며, 이는 원위 말단의 결찰(예를 들어, 도 5), 절단(예를 들어, 도 5 및 6), 또는 절제되는 영역의 적어도 일부에 의한 이차 구조 형성(예를 들어, 도 6) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "확장된 아미노산 반복"은 폴리펩티드의 야생형 버전에서 정상적으로 나타나는 것보다 더 많은 경우의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드에서 주어진 아미노산(예를 들어, 글루타민, 알라닌 등 중 하나)의 세그먼트를 지칭한다. 엑손에서 발생하는 것으로 열거된 표 1의 트리뉴클레오티드 반복의 경우, 정상 범위는 상응하는 폴리펩티드의 야생형 버전에서 정상적으로 나타나는 것같은 아미노산의 경우의 범위를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "DM1 근모세포"는 DM1과 연관된 유전자형을 갖는 근육 세포의 전구체를 지칭하고, 예를 들어 DM1을 갖는 대상체로부터 유래되거나 단리된 세포를 포함한다. DM1 근모세포는 일차 세포, 배양된 세포 또는 세포주를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 부형제"는 활성 성분이 아닌 약학적 제형에 포함되는 제제를 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 예를 들어 약물 전달을 돕거나 안정성 또는 생체이용성을 지원하거나 증강시킬 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지에 부분적으로 의존하는, 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용가능한 오차를 의미한다.
Ⅱ. 반복적 DNA 절제의 개요
RNA-지시된 엔도뉴클레아제가 TNR에 측접하는 부위에 엔도뉴클레아제를 표적화하는 단일 또는 쌍을 이룬 가이드 RNA와 조합하여 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역을 절단할 수 있다는 본 발명자들의 발견뿐만 아니라 DNA-PK 억제제는 그러한 서열의 개선된 절제를 제공한다는 본 발명자들의 결론에 기초한 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 도 2a-b에 예시된 바와 같이, DNA-PK를 억제하는 것은 미세상동성-매개된 말단 접합(MMEJ)을 포함할 가능성이 있는 하나 이상의 대체 경로를 위해 비-상동성의 말단 접합(NHEJ) 경로를 통한 수선을 감소 또는 제거하는 것으로 간주된다.
추가로, 본 발명자들은 또한 DNA-PK 억제제가 도 3에 예시된 바와 같이 하나의 gRNA와 조합하여 Cas9 또는 Cpf1과 같은 RNA-지시된 뉴클레아제에 의한 트리뉴클레오티드 반복의 절제를 촉진할 수 있음을 발견했다. 다시, DNA-PK를 억제하는 것은 비-상동성의 말단 접합(NHEJ) 경로를 통해 수선을 줄이거나 제거하는 것으로 간주되며, 이는 단지 하나의 gRNA만 사용되는 경우 일반적으로 하나 이상의 대체 경로를 위해 트리뉴클레오티드 반복 절제를 초래하지 않는다. 대체 수선 경로는 절단 부위에서 DNA 말단의 엑소뉴클레오리틱 절제를 포함하여 트리뉴클레오티드 반복의 절제를 초래한다. 도 4에 예시된 바와 같이, 단일 gRNA를 제공하는 것은 AAV 벡터와 같은 더 작은 벡터의 사용을 용이하게 한다.
도 5는 RNA-지시된 뉴클레아제에 의한 2개 부위에서 절단에 이은 수선 경로를 보다 상세히 예시한다. 규범적 NHEJ(C-NHEJ)는 일반적으로 더 빠른 경로이고 DNA-PK 의존성이다. 절단 부위가 TNR에 측접하는 경우, C-NHEJ는 양 이중-가닥 파손(DSB)을 재밀봉하여 TNR을 보존하거나 TNR을 포함하지 않는 DNA의 말단의 단일 접합을 일으켜 절제를 초래할 수 있다. DNA-PK의 억제는 말단 절개를 포함하여 MRE11-RAD50-NBS1 복합체(MRN)에 의한 작용에 대한 증가된 기회를 제공한다. 미세상동성 검색은 MMEJ 경로의 일부로 계속될 수 있으며 TNR이 절제된 수선 생성물이 생성될 수 있다.
도 6은 RNA-지시된 뉴클레아제에 의해 한 부위에서 절단에 이은 수선 경로를 보다 상세히 예시한다. C-NHEJ는 이중-가닥 파손을 재밀봉하고 TNR을 완전히 또는 실질적으로 보존하면서 작은 삽입 또는 결실(삽입결실)의 도입을 가능하게 할 수 있다. DNA-PK의 억제는 말단 절개 및 잠재적으로 5' 절개의 CtIP 자극과 CTG 이차 구조의 절단을 포함하여 MRE11-RAD50-NBS1 복합체(MRN)에 의한 작용에 대한 증가된 기회를 제공한다. 미세상동성 검색은 MMEJ 경로의 일부로 계속될 수 있으며 TNR이 절제된 수선 생성물이 생성될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 다양한 장애와 관련된 유전자형을 개선하기 위해 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열을 절제하는 데 사용될 수 있다. 표 1은 예시적인 유전자, 장애 및 트리뉴클레오티드 반복에 관한 정보를 제공한다.
[표 1]
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III. 트리뉴클레오티드 반복 및 자가-상보성 영역을 절제하는 방법; 치료 방법
본 개시내용은 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역을 절제하고/하거나 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 gRNA(예를 들어, gRNA의 쌍) 또는 gRNA를 인코딩하는 벡터는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산과 조합하여 세포에 전달된다. 예시적인 gRNA, 벡터, 및 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 본 명세서에서, 예를 들어 요약 및 구성 섹션에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 세포에 전달하는 것을 추가로 포함한다.
DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 선택적으로 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6이다.
일부 실시형태에서, DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 화합물 3 또는 화합물 6인 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다.
자가-상보성 영역을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 자가-상보성 영역 또는, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 선택적으로 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 자가-상보성 영역을 절제하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 자가-상보성 영역은 절제된다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6이다.
일부 실시형태에서, TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는, 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 선택적으로 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 제공되며, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제된다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6이다.
일부 실시형태에서, 자가-상보성 영역을 절제하는 방법 및/또는 DNA에서 TNR을 절제하는 방법은 표 1에 제공된 질환 또는 장애의 치료를 위한 것이다.
DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 DMPK 유전자의 3' UTR에서 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호 101-4988 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6이다.
DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 DMPK 유전자의 3' UTR에서 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 또는 1386 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 또는 1386 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 3354, 4010, 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 2322, 1770, 1538, 2514, 2458, 2194, 2594, 2162, 또는 2618 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 또는 2594 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 또는 2594 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 또는 3722 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 또는 2322 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 또는 2210 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3378, 3354, 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 또는 2506 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 또는 2498 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3314, 2690, 2554, 또는 2498 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 또는 2258 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. . 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3916, 3420, 또는 3940 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3914를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3418을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 3938을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 5001-7264 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6이다.
FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 5262, 5782, 5830, 5926, 5950, 5998, 6022, 5310 및 5334 중 어느 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 5262, 5782, 5830, 5926, 5950, 5998, 6022, 5310, 및 5334 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 5830, 6022, 5262, 또는 5310 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 5262, 5334, 및 5830 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 또는 5312 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 5262를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 5264를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 FXN 유전자의 5' UTR 내 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호 7301-53372 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6이다.
FXN 유전자의 인트론에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호 28130, 34442, 45906, 26562, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 49986, 51762, 51754, 52290, 52298, 51474, 52306, 50682, 51706, 52098, 50714, 51498, 52498, 50978, 51746, 52106, 51506, 50674, 52082, 52506, 50538, 52066, 52386, 52090, 52266, 52474, 52258, 52434, 50706, 51490, 52458, 51466, 52354, 51914, 51362, 51058, 50170, 51954, 52250, 51930, 51682, 52594, 52610, 51162, 49162, 50898, 49226, 51658, 52554, 52634, 51394, 49034, 52546, 52522, 52618, 52530, 28322, 26530, 26578, 26602, 26634, 26626, 26698, 26746, 26754, 26786, 26882, 27722, 27730, 27738, 27770, 27754, 27762, 27802, 27850, 27842, 27922, 27946, 27986, 28114, 28122, 28146, 28186, 28194, 28338, 28346, 28322, 28378, 28370, 28458, 28506, 28634, 28642, 28650, 34442, 또는 45906 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함한다. TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호 28130, 34442, 45906, 26562, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 49986, 51762, 51754, 52290, 52298, 51474, 52306, 50682, 51706, 52098, 50714, 51498, 52498, 50978, 51746, 52106, 51506, 50674, 52082, 52506, 50538, 52066, 52386, 52090, 52266, 52474, 52258, 52434, 50706, 51490, 52458, 51466, 52354, 51914, 51362, 51058, 50170, 51954, 52250, 51930, 51682, 52594, 52610, 51162, 49162, 50898, 49226, 51658, 52554, 52634, 51394, 49034, 52546, 52522, 52618, 52530, 28322, 26530, 26578, 26602, 26634, 26626, 26698, 26746, 26754, 26786, 26882, 27722, 27730, 27738, 27770, 27754, 27762, 27802, 27850, 27842, 27922, 27946, 27986, 28114, 28122, 28146, 28186, 28194, 28338, 28346, 28322, 28378, 28370, 28458, 28506, 28634, 28642, 28650, 34442, 또는 45906 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 51706, 51058, 51754, 52090, 52594, 52098, 52298, 52106, 51682, 52066, 52354, 52458, 52290, 52498, 51658, 51930, 51162, 52506, 51762, 51746, 52386, 52258, 52530, 52634, 27850, 28634, 26882, 28650, 28370, 28194, 26626, 26634, 26786, 26754, 27770, 26578, 28130, 27738, 28338, 28642, 26602, 27754, 27730, 및 28122 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030 중 어느 하나의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA 또는 단 하나의 gRNA를 인코딩하는 벡터만이 제공되거나 전달되며, 즉, 상기 방법은 TNR 또는 자가-상보성 영역 근처에서 절단을 촉진하는 둘 이상의 가이드를 제공하는 것을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하거나 질환을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 단 하나의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단 하나의 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 단 하나의 gRNA를 투여하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 및 2594로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 및 2594에서 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복부가 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3314, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 및 2258로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3914, 3418, 또는 3938로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3916, 3420, 또는 3940으로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3914의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3418의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 DMPK 유전자의 3' UTR의 CTG 반복이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 3938의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
일부 실시형태에서, FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하거나 질환을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 단 하나의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법에 대한 방법이 제공되며, 상기 방법은 단 하나의 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA를 투여하는 방법이 제공되며, 여기서 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 5830, 6022, 5262, 및 5310으로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 5262, 5334 및 5830으로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024 또는 5312로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 5262의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 5264의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
일부 실시형태에서, FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하거나 질환을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 단 하나의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법에 대한 방법이 제공되며, 상기 방법은 단 하나의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA를 투여하는 방법이 제공되며, 여기서 FXN 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FXN 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단 하나의 gRNA, 및 FXN 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제된 경우, gRNA는 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030으로부터 선택된 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA 쌍, 또는 가이드 RNA 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포에 제공되거나 전달된다. 예를 들어, TNR이 DMPK 유전자의 3' UTR에 있는 경우, 제1 및 제2 스페이서는 다음 서열번호의 쌍 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 2162 및 3658; 2202 및 4010; 2202 및 4026; 2202 및 3914; 2202 및 3938; 2202 및 3858; 2202 및 3818; 2202 및 3794; 2202 및 3802; 2202 및 3746; 2202 및 3778; 2202 및 3770; 2202 및 3722; 2202 및 3690; 2202 및 3682; 2202 및 3330; 2202 및 3354; 2202 및 3394; 2202 및 3386; 2178 및 4010; 2178 및 4026; 2178 및 3914; 2178 및 3938; 2178 및 3858; 2178 및 3818; 2178 및 3794; 2178 및 3802; 2178 및 3746; 2178 및 3778; 2178 및 3770; 2178 및 3722; 2178 및 3690; 2178 및 3682; 2178 및 3330; 2178 및 3354; 2178 및 3394; 2178 및 3386; 2170 및 4010; 2170 및 4026; 2170 및 3914; 2170 및 3938; 2170 및 3858; 2170 및 3818; 2170 및 3794; 2170 및 3802; 2170 및 3746; 2170 및 3778; 2170 및 3770; 2170 및 3722; 2170 및 3690; 2170 및 3682; 2170 및 3330; 2170 및 3354; 2170 및 3394; 2170 및 3386; 2162 및 4010; 2162 및 4026; 2162 및 3914; 2162 및 3938; 2162 및 3858; 2162 및 3818; 2162 및 3794; 2162 및 3802; 2162 및 3746; 2162 및 3778; 2162 및 3770; 2162 및 3722; 2162 및 3690; 2162 및 3682; 2162 및 3330; 2162 및 3354; 2162 및 3394; 2162 및 3386; 1706 및 3418; 1706 및 3370; 1706 및 3514; 1706 및 3658; 1706 및 4010; 1706 및 4026; 1706 및 3914; 1706 및 3938; 1706 및 3858; 1706 및 3818; 1706 및 3794; 1706 및 3802; 1706 및 3746; 1706 및 3778; 1706 및 3770; 1706 및 3722; 1706 및 3690; 1706 및 3682; 1706 및 3330; 1706 및 3354; 1706 및 3394; 1706 및 3386; 2210 및 3418; 2210 및 3370; 2210 및 3514; 2210 및 3658; 2210 및 4010; 2210 및 4026; 2210 및 3914; 2210 및 3938; 2210 및 3858; 2210 및 3818; 2210 및 3794; 2210 및 3802; 2210 및 3746; 2210 및 3778; 2210 및 3770; 2210 및 3722; 2210 및 3690; 2210 및 3682; 2210 및 3330; 2210 및 3354; 2210 및 3394; 2210 및 3386; 1778 및 3418; 1778 및 3370; 1778 및 3514; 1778 및 3658; 1778 및 4010; 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2514 및 3778; 2514 및 3770; 2514 및 3722; 2514 및 3690; 2514 및 3682; 2514 및 3330; 2514 및 3354; 2514 및 3394; 2514 및 3386; 2458 및 3418; 2458 및 3370; 2458 및 3514; 2458 및 3658; 2458 및 4010; 2458 및 4026; 2458 및 3914; 2458 및 3938; 2458 및 3858; 2458 및 3818; 2458 및 3794; 2458 및 3802; 2458 및 3746; 2458 및 3778; 2458 및 3770; 2458 및 3722; 2458 및 3690; 2458 및 3682; 2458 및 3330; 2458 및 3354; 2458 및 3394; 2458 및 3386; 2194 및 3418; 2194 및 3370; 2194 및 3514; 2194 및 3658; 2194 및 4010; 2194 및 4026; 2194 및 3914; 2194 및 3938; 2194 및 3858; 2194 및 3818; 2194 및 3794; 2194 및 3802; 2194 및 3746; 2194 및 3778; 2194 및 3770; 2194 및 3722; 2194 및 3690; 2194 및 3682; 2194 및 3330; 2194 및 3354; 2194 및 3394; 2194 및 3386; 2594 및 3418; 2594 및 3370; 2594 및 3514; 2594 및 3658; 2594 및 4010; 2594 및 4026; 2594 및 3914; 2594 및 3938; 2594 및 3858; 2594 및 3818; 2594 및 3794; 2594 및 3802; 2594 및 3746; 2594 및 3778; 2594 및 3770; 2594 및 3722; 2594 및 3690; 2594 및 3682; 2594 및 3330; 2594 및 3354; 2594 및 3394; 2594 및 3386; 2618 및 3418; 2618 및 3370; 2618 및 3514; 2618 및 3658; 2618 및 4010; 2618 및 4026; 2618 및 3914; 2618 및 3938; 2618 및 3858; 2618 및 3818; 2618 및 3794; 2618 및 3802; 2618 및 3746; 2618 및 3778; 2618 및 3770; 2618 및 3722; 2618 및 3690; 2618 및 3682; 2618 및 3330; 2618 및 3354; 2618 및 3394; 및 2618 및 3386. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 다음 서열번호로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 2162 및 3658; 2202 및 4010; 2202 및 4026; 2202 및 3914; 2202 및 3938; 2202 및 3858; 2202 및 3818; 2202 및 3794; 2202 및 3802; 2202 및 3746; 2202 및 3778; 2202 및 3770; 2202 및 3722; 2202 및 3690; 2202 및 3682; 2202 및 3330; 2202 및 3354; 2202 및 3394; 2202 및 3386; 2178 및 4010; 2178 및 4026; 2178 및 3914; 2178 및 3938; 2178 및 3858; 2178 및 3818; 2178 및 3794; 2178 및 3802; 2178 및 3746; 2178 및 3778; 2178 및 3770; 2178 및 3722; 2178 및 3690; 2178 및 3682; 2178 및 3330; 2178 및 3354; 2178 및 3394; 2178 및 3386; 2170 및 4010; 2170 및 4026; 2170 및 3914; 2170 및 3938; 2170 및 3858; 2170 및 3818; 2170 및 3794; 2170 및 3802; 2170 및 3746; 2170 및 3778; 2170 및 3770; 2170 및 3722; 2170 및 3690; 2170 및 3682; 2170 및 3330; 2170 및 3354; 2170 및 3394; 2170 및 3386; 2162 및 4010; 2162 및 4026; 2162 및 3914; 2162 및 3938; 2162 및 3858; 2162 및 3818; 2162 및 3794; 2162 및 3802; 2162 및 3746; 2162 및 3778; 2162 및 3770; 2162 및 3722; 2162 및 3690; 2162 및 3682; 2162 및 3330; 2162 및 3354; 2162 및 3394; 2162 및 3386. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 및 2162 및 3658로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3778 및 2514; 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2514; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 3354 및 2514; 3354 및 2258; 및 3354 및 2210으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 및 3354 및 2514로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3330 및 2506; 및 3330 및 2546으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3354 및 2546; 3354 및 2506; 3378 및 2546; 3378 및 2506으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 및 3330 및 2498로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 1153 및 1129를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 또는 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 또는 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906 및 3746으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 3778 및 1778; 3778 및 1746; 3778 및 1770; 3778 및 1586; 3778 및 1914; 3778 및 2210; 4026 및 1778; 4026 및 1746; 4026 및 1770; 4026 및 1586; 4026 및 1914; 4026 및 2210; 3794 및 1778; 3794 및 1746; 3794 및 1770; 3794 및 1586; 3794 및 1586; 3794 및 1914; 3794 및 2210; 4010 및 1778; 4010 및 1770; 4010 및 1746; 4010 및 1586; 4010 및 1914; 4010 및 2210; 3906 및 1778; 3906 및 1778; 3906 및 1746; 3906 및 1770; 3906 및 1586; 3906 및 1914; 3906 및 2210; 3746 및 1778; 3746 및 1746; 3746 및 1770; 3746 및 1586; 3746 및 1914; 및 3746 및 2210으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 3256, 2896, 3136, 및 3224로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 및 616으로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 서열번호: 3256 및 4989; 3256 및 984; 3256 및 616; 2896 및 4989; 2896 및 672; 2896 및 760; 3136 및 4989; 3136 및 560; 3224 및 4989; 3224 및 976; 및 3224 및 760으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
일부 실시형태에서, FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하거나 질환을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 5782 및 5262; 5830 및 5262; 5926 및 5262; 5950 및 5262; 및 5998 및 5262로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 5830 및 5262; 및 6022 및 5310으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍는 서열번호: 5334 및 5830을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
일부 실시형태에서, FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하거나 질환을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 47047 및 7447; 7463 및 46967; 46768 및 7680; 47032 및 7447로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍는 서열번호: 47047 및 7447을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍는 서열번호: 52898 및 36546을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
일부 실시형태에서, DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 제1 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제1 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 지향시키고, 여기서 제1 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 반복을 통해 계속된다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 서열번호: 53413이다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 서열번호: 53414이다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 서열번호: 53415이다.
일부 실시형태에서, DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 제2 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제2 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 지향시키고, 여기서 제2 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-D15 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드에서 시작하여 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드까지 계속된다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-D35 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드까지 계속된다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 서열번호: 53416이다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 서열번호: 53417이다.
일부 실시형태에서, DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제1 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 지향시키고, 제2 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제2 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시킨다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 반복을 통해 계속된다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 서열번호: 53413이다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 서열번호: 53414이다. 일부 실시형태에서, 제1 스트레치는 서열번호: 53415이다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-D15 절단 부위의 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드까지 계속된다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 spCas9를 갖는 DMPK-D35 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드까지 계속된다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 서열번호: 53416이다. 일부 실시형태에서, 제2 스트레치는 서열번호: 53417이다. 일부 실시형태에서, 방법은 DNA-PK 억제제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다.
일부 실시형태에서, 방법은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 것이다(spCas9). 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cpf1이다.
임의의 전술한 방법 및 본 명세서에 기술된 임의의 다른 방법은 상기 섹션, 다음 논의 및 실시예를 포함하여 본 명세서에 기술된 추가 특징 중 임의의 것과 실행가능한 정도로 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역 내 부위로 또는 그 근처의 부위로 지향시킨다. 예를 들어, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 20, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에서 절단하도록 지시될 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 측접하는(즉, 그의 반대편 상에 있는) 부위의 쌍으로 지향시키는 적어도 한 쌍의 gRNA가 제공된다. 예를 들어, TNR 또는 자가-상보성 영역에 측접하는 부위의 쌍은 각각 TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 20, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 있을 수 있지만 그의 반대편 상에 있을 수 있다.
DNA-PK 억제제가 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 경우, 이는 당업계에 공지된 임의의 DNA-PK 억제제일 수 있다. DNA-PK 억제제는, 예를 들어 WO2014/159690; WO2013/163190; WO2018/013840; WO 2019/143675; WO 2019/143677; WO 2019/143678; 및 Robert 등, Genome Medicine (2015) 7:93에 자세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서 DNA-PK 억제제는 NU7441, KU-0060648, 또는 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 하나이고(구조는 하기에 도시됨), 이들 각각은 또한 전기한 인용문 중 적어도 하나에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6이다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 3이다. 예시적인 DNA-PK 억제제에 대한 구조는 다음 표 1A와 같다. 달리 표시되지 않는 한, 명칭 또는 구조에 의한 DNA-PK 억제제에 대한 언급은 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포괄한다.
[표 1A]
Figure pct00004
Figure pct00005
DNA-PK 억제제가 사용되는 전기한 실시형태 중 임의의 것에서, 그것은 절제를 촉진하기 위해 단 하나의 gRNA 또는 단 하나의 gRNA를 인코딩하는 벡터와 조합하여 사용될 수 있으며, 즉, 방법은 TNR 또는 자가-상보성 영역 근처에서 절단을 촉진하는 둘 이상의 가이드를 제공하는 것을 항상 포함하는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역은 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애일 수 있는, 반복 확장 장애와 같은 장애와 연관된 유전자좌 또는 유전자로부터 절제된다. 반복 확장 장애는 영향을 받지 않은 개체가 정상 범위의 반복 횟수를 갖는 대립유전자를 갖고, 장애가 있거나 장애의 위험이 있는 개체가 정상 범위에 비해 상승된 범위에서의 반복 횟수를 갖는 1개 또는 2개의 대립유전자를 갖는 장애이다. 예시적인 반복 확장 장애는 표 1에 열거되고 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 반복 확장 장애는 표 1에 열거된 장애 중 임의의 하나이다. 일부 실시형태에서, 반복 확장 장애는 DM1이다. 일부 실시형태에서, 반복 확장 장애는 HD이다. 일부 실시형태에서, 반복 확장 장애는 FXS이다. 일부 실시형태에서, 반복 확장 장애는 척수소뇌 운동실조이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 표 1에 열거된 유전자이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 DMPK이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 HTT이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 프라탁신이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 FMR1이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 아탁신이다. 일부 실시형태에서, 트리뉴클레오티드 반복이 절제되는 유전자좌 또는 유전자는 일종의 척수소뇌 운동실조와 연관된 유전자이다.
절제되는 반복의 수는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000, 또는 전기한 숫자 중 임의의 두 개에 의해 경계된 범위 내, 포괄적, 또는 상기 요약에 열거된 범위 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 절제되는 반복의 수는, 예를 들어 병리학적, 전돌연변이, 위험 또는 중간 범위로서 표 1에 열거된 범위에 있다.
일부 실시형태에서, 반복 또는 자가-상보성 영역의 절제는 반복 또는 자가-상보성 영역과 연관된 적어도 하나의 표현형 또는 증상 또는 반복 또는 자가-상보성 영역과 연관된 장애와 연관된 적어도 하나의 표현형 또는 증상을 개선한다. 이는 반복 또는 자가-상보성 영역을 포괄하거나 그 근처에서 유전자의 비정상적인 발현을 개선하거나, 반복 또는 자가-상보성 영역을 포괄하는 유전자에 의해 인코딩되는 유전자 생성물(비코딩 RNA, mRNA 또는 폴리펩티드)의 비정상적인 활성을 개선하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, TNR이 DMPK 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 DMPK 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선할 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 증가하는 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 활성; 포스포렘만, 디하이드로피리딘 수용체, 미오제닌, L-유형 칼슘 채널 베타 소단위 및/또는 미오신 포스파타제 표적화 소단위의 인산화를 증가시키는 것; 미오신 포스파타제의 억제를 증가시키는 것; 및/또는 근육 손실, 근육 약화, 과다수면, 하나 이상의 실행 기능 결핍, 인슐린 저항성, 백내장 형성, 대머리, 또는 남성 불임 또는 저출산을 개선하는 것일 수 있다.
TNR이 HTT 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 HTT 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 선조체 뉴런 손실, 비자발적 운동, 과민성, 우울증, 작은 비자발적 운동, 협응 불량, 새로운 정보를 배우거나 결정을 내리는 데 어려움, 걷기, 말하기 및/또는 삼키기 어려움 및/또는 사고 및/또는 추론 능력의 감소 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 FMR1 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 FMR1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 FMR1 전사체 또는 취약 X 정신 지체 단백질 수준, 일반적으로 FMRP와 관련된 mRNA의 번역 조절장애, 포스포-코필린(CFL1)의 감소된 수준, 포스포-코필린 포스파타제 PPP2CA의 증가된 수준, 뉴런 시냅스로의 감소된 mRNA 전달, HSP27, HSP70 및/또는 CRYAB의 증가된 발현, 라민 A/C 이소폼의 비정상적인 세포 분포, 조기-발병 폐경 예컨대 40세 이전의 폐경, 난소 발달 또는 기능의 결함, 혈청 성선자극호르몬(예를 들어, FSH) 수치 상승, 진행 의도 진전, 파킨슨병, 인지 저하, 전신 뇌 위축, 발기부전, 및/또는 발달 지연 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 FMR2 유전자 내에 있거나 FMR2의 5' UTR에 인접한 경우, TNR의 절제는 FMR2 유전자 내 또는 이에 인접한 확장된-반복과 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어 비정상적인 FMR2 발현, 발달 지연, 좋지 않은 눈맞춤, 반복적인 언어의 사용, 손짓 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 AR 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 AR 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 AR 발현; 안드로겐 수용체 단백질의 C-말단으로 잘린 단편의 생성; 카스파제-3에 의해 및/또는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통한 안드로겐 수용체 단백질의 단백질분해; CREB-결합 단백질을 포함하는 핵 내포물의 형성; p44/42, p38 및/또는 SAPK/JNK의 비정상적인 인산화; 근육 약화; 근육 소모; 걷기, 삼키기 및/또는 말하기 어려움; 여성형 유방; 및/또는 남성불임 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 ATXN1 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어 ATXN1을 포함하는 응집체의 형성; 푸르키네 세포사; 운동실조; 근육 경직; 빠르고 비자발적인 안구 운동; 사지 마비, 따끔거림 또는 통증; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 ATXN2 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN2 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 ATXN2 생산; 푸르키네 세포사; 운동실조; 말하기 또는 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 소모; 통제되지 않은 근육 긴장; 및/또는 비자발적 경련 운동 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 ATXN3 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN3 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 ATXN3 수준; 비정상적인 베클린-1 수준; 자가포식의 억제; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2의 조절 장애; 운동실조; 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 경직; 통제되지 않은 근육 긴장; 떨림; 불안한 다리 증상; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 CACNA1A 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 CACNA1A 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어 CACNA1A-발현 세포에서 비정상적인 CaV2.1 전압-개폐 칼슘 채널; 운동실조; 말하기 어려움; 비자발적 안구 운동; 이중 시력; 팔 협응의 상실; 떨림; 및/또는 조절되지 않는 근육 긴장 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 ATXN7 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN7 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상 히스톤 아세틸화; 비정상적인 히스톤 탈유비퀴틴화; CRX에 의한 전사활성화의 장애; ATXN7을 포함하는 핵 내포물의 형성; 운동실조; 보행의 불균형; 손, 언어 및/또는 눈 운동의 빈약한 협응; 망막 변성; 및/또는 색소성 황반 이영양증 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 ATXN8OS 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN8OS 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어 ATXN8OS mRNA를 포함하는 리보핵 내포물의 형성; 비정상적인 KLHL1 단백질 발현; 운동실조; 말하기 및/또는 걷기 어려움; 및/또는 비자발적 안구 운동 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 PPP2R2B 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 PPP2R2B 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 PPP2R2B 발현; 비정상적인 포스파타제 2 활성; 운동실조; 소뇌 변성; 걷기 어려움; 및/또는 손, 언어 및/또는 안구 운동의 빈약한 협응 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 TBP 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 TBP 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 전사 개시; 비정상적인 TBP 단백질 축적(예를 들어, 소뇌 뉴런); 비정상적인 소뇌 뉴런 세포 사멸; 운동실조; 걷기 어려움; 근육 약화; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
TNR이 ATN1 유전자 내에 있는 경우, TNR의 절제는 확장된-반복 ATN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형, 예를 들어, 비정상적인 전사 조절; 비정상적인 ATN1 단백질 축적(예를 들어, 뉴런 내); 비정상적인 뉴런 세포 사멸; 비자발적 운동; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA, 벡터, DNA-PK 억제제, 조성물, 또는 약학적 제형 중 임의의 하나 이상은 본 명세서에 기재된 방법 또는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 치료 및/또는 예방은 의약/조성물의 단일 용량, 예를 들어 1회 치료로 달성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 gRNA, 벡터, 조성물 또는 약학적 제형 중 임의의 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA, 벡터, 조성물 또는 약학적 제형는 단일 용량으로, 예를 들어 1회에 투여된다. 일부 실시형태에서, 단일 용량은 지속적인 치료 및/또는 예방을 달성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 지속적인 치료 및/또는 예방을 달성한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 지속적인 치료 및/또는 예방은 적어도 i) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15주; ii) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월; 또는 iii) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 연장되는 치료 및/또는 예방을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA, 벡터, 조성물 또는 약학적 제형의 단일 용량은 대상체의 수명의 기간 동안 본 명세서에 기재된 임의의 징후를 치료 및/또는 예방하기에 충분하다.
일부 실시형태에서, 서열번호: 101-4988, 5001-7264 또는 7301-53372 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 TNR을 절제하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA는 TNR을 절제하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 TNR-연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 투여하는 것을 포함하는, 확장된 트리뉴클레오티드 반복을 포함하는 mRNA의 생성을 감소 또는 제거하는 방법이 제공된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 투여하는 것을 포함하는, 확장된 아미노산 반복을 포함하는 단백질의 생성을 감소 또는 제거하는 방법이 제공된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 확장된 아미노산 반복을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 감소시키기 위해 투여된다. gRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 이들 방법 중 임의의 것은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 및 DNA-PK 억제제와 함께 표 2 또는 서열목록의 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 DSB를 유도하고, 수선 동안 미세상동성-매개된 말단 연결( MMEJ)은 표적화된 유전자의 돌연변이를 초래한다. 일부 실시형태에서, MMEJ는 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 서열의 절제를 초래한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 소, 돼지, 원숭이, 양, 개, 고양이, 물고기 또는 가금류이다.
일부 실시형태에서, (예를 들어, 본 명세서에 제공된 조성물에서) 표 2 및/또는 서열 목록에서의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA의 용도는 DM1과 같은 표 1에 열거된 장애를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 제공된다. 이러한 용도는 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제의 투여와 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA, 조성물 및 제형은 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA, 조성물 및 제형은 근육내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA, 조성물 및 제형은 두개내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA, 조성물 및 제형은 생체외에서 세포에 투여된다. DNA-PK 억제제가 투여되는 경우, 가이드 RNA를 포함하는 조성물과 동일한 조성물 또는 상이한 조성물로 투여될 수 있고, 가이드 RNA와 동일하거나 상이한 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 정맥내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 경구로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA, 조성물 및 제형은 DNA-PK 억제제와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 그 자체의 투여 일정에 따라 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 단일 투여는 TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제하기에 충분하다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 1회 초과 투여는 치료 효과를 최대화하는 데 유리할 수 있다.
병용 요법
일부 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이, 표적화된 유전자와 연관된 장애 및/또는 이의 하나 이상의 증상을 개선하기에 적합한 추가 요법과 함께, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것(예를 들어, 표 2 및/또는 서열 목록에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 중 하나 이상 (예를 들어, 본 명세서에 제공된 조성물 내)을 포함하는 조합 요법을 포함한다. 다양한 장애, 예컨대 표 1에 열거된 것 및/또는 이의 하나 이상의 증상을 개선하는데 사용하기에 적합한 추가 요법은 당업계에 공지되어 있다.
gRNA 조성물의 전달
본 명세서에 개시된 방법 및 용도는 본 명세서에 기재된 gRNA 및 조성물을 전달하기 위한 임의의 적합한 접근법을 사용할 수 있다. 예시적인 전달 접근법은 바이러스 벡터와 같은 벡터; 지질 나노입자; 형질감염; 및 전기천공을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 연관된 벡터 또는 LNP는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는 데 사용하기 위한 것이다.
벡터가 사용되는 경우, 비-통합 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10(예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 US 9,790,472의 서열번호: 81 참고), AAVrh74(예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 US 2015/0111955의 서열번호: 1 참고), 또는 AAV9 벡터이며, 여기서 AAV 다음의 숫자는 AAV 혈청형을 나타낸다. 자가-상보성 AAV(scAAV) 벡터와 같은 AAV 벡터 또는 이의 혈청형의 임의의 변이체는 AAV 벡터, AAV1 벡터 등의 일반 용어 내에 포괄된다. 예를 들어, 다양한 AAV 벡터의 상세한 논의에 대해서는 McCarty 등, Gene Ther. 2001;8:1248-54, Naso 등, BioDrugs 2017; 31:317-334, 및 거기에 인용된 참고문헌을 참고한다.
일부 실시형태에서, 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 벡터)는 예를 들어, gRNA를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조직-특이적(예를 들어, 근육-특이적) 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터, 또는 SPc5-12 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 근육-특이적 프로모터는 CK8 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 근육-특이적 프로모터는 CK8e 프로모터이다. 근육-특이적 프로모터는, 예를 들어, US2004/0175727 A1; Wang 등, Expert Opin Drug Deliv. (2014) 11, 345-364; Wang 등, Gene Therapy (2008) 15, 1489-1499에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 에놀라제 프로모터와 같은 뉴런-특이적 프로모터이다. 예를 들어, 뉴런-특이적 프로모터를 포함한 조직-특이적 프로모터의 자세한 논의에 대해서는 Naso 등, BioDrugs 2017; 31:317-334; Dashkoff 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 2016;3:16081 및 그기에 인용된 참고문헌을 참고한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 서열에 부가하여, 벡터는 가이드 RNA를 인코딩하지 않는 핵산을 추가로 포함한다. 가이드 RNA를 인코딩하지 않는 핵산은 프로모터, 인핸서, 조절 서열, 및 Cas9와 같은 뉴클레아제일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 Cas9과 같은 Cas 뉴클레아제일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 sgRNA 및 mRNA 또는 Cpf1을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 Cas9와 같은 Cas 단백질일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 인코딩하는 crRNA, trRNA, 및 mRNA를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 것이다(즉, Spy Cas9 또는 SpCas9). 일부 실시형태에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA(sgRNA일 수 있음)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 전부 또는 일부에 의해 측접된 가이드 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이로 구성하는 핵산은 벡터 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 벡터 서열은 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 이로 구성된다.
지질 나노입자(LNP)는 뉴클레오티드 및 단백질 카고의 전달을 위한 공지된 수단이고, 본 명세서에 개시된 가이드 RNA, 조성물 또는 약학적 제형의 전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 단백질과 함께 핵산, 단백질, 또는 핵산을 전달한다.
일부 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 개시된 gRNA 중 임의의 하나를 대상체에게 전달하는 방법을 포함하며, 여기서 gRNA는 LNP와 회합된다. 일부 실시형태에서, gRNA/LNP는 또한 Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 mRNA와 연관된다.
일부 실시형태에서, 발명은 개시된 gRNA 중 임의의 하나 및 LNP를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 Cas9 또는 Cas9를 코딩하는 mRNA를 추가로 포함한다.
전기천공은 카고의 전달을 위한 잘 알려진 수단이고, 임의의 전기천공 방법론이 본 명세서에 개시된 gRNA 중 임의의 하나의 전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전기천공을 사용하여 본 명세서에 개시된 gRNA 및 Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 mRNA 중 임의의 하나를 전달할 수 있다.
일부 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 개시된 gRNA 중 임의의 하나를 생체외 세포에 전달하는 방법을 포함하며, 여기서 gRNA는 LNP와 회합된 벡터에 의해 또는 수성 용액에서 인코딩된다. 일부 실시형태에서, gRNA/LNP 또는 gRNA는 또한 (예를 들어, 동일한 벡터, LNP 또는 용액에서) Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 서열과 회합된다.
DNA-PK 억제제로 gRNA 조성물의 스크리닝
일부 실시형태에서, TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA에 대한 스크리닝을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 세포를 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제와 접촉시키는 단계; b) DNA-PK 억제제 없이 단계 a)를 반복하는 단계; c) 단계 b)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a)에서 접촉된 세포로부터 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 단계; 및 d) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA에 대한 스크리닝을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) i) 세포(예를 들어, 근모세포)를 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제; 및 ii) i)에서 사용된 것과 동일한 유형의 세포를 DNA-PK 억제제가 없는 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계; b) 단계 a) ii)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a) i)에서 접촉된 세포로부터 DNA에서의 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 단계; 및 c) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA의 쌍을 스크리닝하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 세포를 가이드 RNA의 쌍, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제와 접촉시키는 단계; b) DNA-PK 억제제 없이 단계 a)를 반복하는 단계; c) 단계 b)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a)에서 접촉된 세포로부터 DNA에서의 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 단계; 및 d) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA의 쌍을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA의 쌍을 스크리닝하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) i) 세포(예를 들어, 근모세포)를 가이드 RNA의 쌍, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 및 DNA-PK 억제제, 및 ii) a), i)에서 사용된 것과 동일한 유형의 세포를 DNA-PK 억제제가 없이 가이드 RNA의 쌍, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계; b) 단계 a), ii)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a), i)에서 접촉된 세포로부터 DNA에서의 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 단계; 및 c) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA의 쌍을 선택하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "절제가 개선됨" 또는 "개선된 절제"는 DNA에서의 TNR 또는 자가-상보성 영역의 더 큰 양의 절제 및/또는 (예를 들어, 결실의 크기 또는 위치에 기반하여) 보다 바람직한 절제 생성물을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍이 세포의 DNA로부터 DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역의 개선된 절제를 갖는지 여부를 결정하는 것은 DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역을 둘러싼 DNA의 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 세포의 게놈 DNA의 PCR에 의해 수행될 수 있다. PCR 생성물은 DNA 겔 전기영동으로 평가되고 DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제에 대해 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제는 시퀀싱 방법(예를 들어, 생거 시퀀싱, PacBio 시퀀싱)에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA에서 TNR 또는 자가-상보성 영역의 결실 퍼센트는 ddPCR 검정을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 도 53 참고). 일부 실시형태에서, "절제가 개선된다" 또는 "개선된 절제"는 DMPK의 경우: CUG 병소 감소, MBNL1 병소 감소, 또는 MBNL1, NCOR2, FN1 및/또는 KIF13A mRNA의 개선된 스플라이싱 효율과 같은 세포 특징을 평가함에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 DMPK 유전자의 3' UTR로 지향시킨다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 FMR1 유전자의 5' UTR로 지향시킨다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 FXN 유전자의 5' UTR로 지향시킨다.
일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 화합물 6 또는 화합물 3이다. 일부 실시형태에서, 세포는 야생형 세포, 예를 들어, 야생형 iPSC 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 질환 세포, 예를 들어 환자로부터 유래된 세포, 예를 들어 DM1 iPSC 세포, DM1 근모세포, DM1 섬유아세포이다. 스크리닝은 단일 가이드 절제에 대한 DNA-PK 억제의 향상을 평가하기 위해 증가하는 용량으로 DNA-PK 억제제를 추가하는 것을 포함할 수 있다. 스크리닝은 쌍을 이룬 가이드 절제에 대한 DNA-PK 억제의 향상을 평가하기 위해 증가하는 용량으로 DNA-PK 억제제를 추가하는 것을 포함할 수 있다.
IV. 조성물
가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 조성물
DNA의 트리뉴클레오티드 반복(TNR) 또는 자가-상보성 영역과 연관된 질환 및 장애(예를 들어, 표 1의 질환 및 장애)를 치료하고, 예를 들어, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)와 함께 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 사용하는, DNA로부터 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역을 절제하는데 유용한 조성물이 본 명세서에 제공된다. 조성물은 가이드 RNA(들) 또는 가이드 RNA(들)를 인코딩하는 벡터(들)를 포함할 수 있고, 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역과 연관된 질환을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체에게 투여될 수 있고, 추가로 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 DNA-PK 억제제를 포함하거나 이와 조합하여 투여될 수 있다. 예시적인 가이드 서열은 표 2 및 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372의 서열 목록에 나타나 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역 내 또는 그 근처의 부위로 지향시킨다. 예를 들어, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 20, 30, 40, 또는 50 뉴클레오티드 내에서 절단하도록 지시될 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 측접하는(즉, 그 반대편 상에) 한 쌍의 부위로 지향시키는 적어도 한 쌍의 gRNA가 제공된다. 예를 들어, TNR 또는 자가-상보성 영역에 측접하는 부위의 쌍은 각각 TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 20, 30, 40, 또는 50 뉴클레오티드 내이지만 그의 반대편 상에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표 2 및/또는 서열 목록으로부터의 가이드 서열을 포함하고 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 임의의 전기한 실시형태에 따른 한 쌍의 부위로 지향시키는 gRNA의 쌍이 제공된다.
표 2 및 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372에서 서열 목록에 제시된 각각의 가이드 서열은, 예를 들어, 사용 중인 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제에 적합한 임의의 공지된 서열을 사용하여 crRNA를 형성하거나 인코딩하도록 추가의 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA는 (5'에서 3'으로) 적어도 스페이서 서열 및 제1 상보성 도메인을 포함한다. 제1 상보성 도메인은 이중 또는 모듈식 gRNA의 경우에 tracrRNA에서 또는 sgRNA의 경우에 동일한 분자의 일부일 수 있는 제2 상보성 도메인에 충분히 상보적이어서 듀플렉스를 형성한다. 예를 들어, 제1 및 제2 상보성 도메인을 포함하는 crRNA 및 gRNA 도메인의 자세한 논의는 US 2017/0007679를 참고한다. 예를 들어, 그 3' 말단에서 가이드 서열을 따르기 위해 SpCas9와 함께 사용하기에 적합한 예시적인 서열은 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(서열번호: 99)이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열의 3' 말단을 따르기 위해 SpCas9와 함께 사용하기 위한 예시적인 서열은 서열번호: 99에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호: 99와 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 뉴클레오티드만큼 다른 서열이다. tracrRNA가 사용되는 경우, 일부 실시형태에서, 이는 (5'에서 3'으로) 제2 상보적 도메인 및 근위 도메인을 포함한다. sgRNA의 경우, 상기 가이드 서열은, 예를 들어, 사용되는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제에 적절한 임의의 공지된 서열을 사용하여 sgRNA를 형성하거나 인코딩하기 위한 추가의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 (5'에서 3'으로) 적어도 스페이서 서열, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 및 근위 도메인을 포함한다. sgRNA 또는 tracrRNA는 꼬리 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 연결 도메인은 헤어핀-형성일 수 있다. 예를 들어, 제2 상보성 도메인, 연결 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인을 포함하는, crRNA 및 gRNA 도메인의 자세한 논의 및 예에 대해서는 US 2017/0007679를 참고한다. 예를 들어, 가이드 서열의 3' 말단을 따르기 위해 SpCas9와 함께 사용하기에 적합한 예시적인 서열은 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호: 100)이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열의 3' 말단을 따르기 위해 SpCas9와 함께 사용하기 위한 예시적인 서열은 서열번호: 100에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호: 100과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 뉴클레오티드만큼 다른 서열이다.
일반적으로, gRNA를 인코딩하는 DNA 벡터의 경우, 본 명세서에 기재된 임의의 RNA 서열 중 U 잔기는 T 잔기로 대체될 수 있다.
[표 2]: 예시적인 가이드 서열 및 염색체 좌표(Hg38 좌표)
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SID는 서열번호를 의미한다. 표 2에서 설명은 다음과 같은 의미를 갖는다. 표적 유전자좌가 먼저 표시되고, 가이드가 (정방향 가닥의 방향으로) 반복 영역의 5' 또는 3' 절단을 지시하는지 여부를 나타내기 위해 5 또는 3이 표시되거나 가이드가 반복 영역 내에 또는 반복이 발생하는 세그먼트(예를 들어, UTR 또는 인트론)의 외부에 속한다는 것을 나타내기 위해 O이 이어지고, 서열이 상응하는 가닥을 나타내기 위해 "정방향" 또는 "역방향"이 이어지고, 서열의 게놈 좌표(인간 게놈의 버전 GRCh38)이 이어진다. 따라서, 예를 들어, 서열번호: 101의 경우, 지정 "DMPK 3 정방향 19:45769716-45769738"은 가이드가 DMPK의 반복 영역의 3' 절단을 지시하고 염색체 19 위치 45769716-45769738의 정방향 가닥의 서열에 상응함을 의미한다. As/LbCpf1은 때때로 본 명세서에서 Cpf1로 지칭된다. 가이드의 조합이 반복 영역의 5' 및 3' 절단을 지시하는 데 사용되는 경우, 당업자는 DMPK, FMR1 또는 FXN과 같은 주어진 표적에 대해 본 명세서에 개시된 5' 가이드 및 본 명세서에 개시된 3' 가이드의 조합을 선택할 수 있다.
하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 조성물은 본 명세서에 개시된 스페이서 서열 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다(예를 들어, 표 2 및 서열 목록 참고).
다음은 DMPK: 서열번호: 101-4988에 대한 가이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 서열번호: 101-4988 중 임의의 하나를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 서열번호: 101-4988 중 임의의 하나의 스페이서 서열을 포함한다. 다음은 FMR1: 서열번호: 5001-7264에 대한 가이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 서열번호: 5001-7264 중 임의의 하나를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 서열번호: 5001-7264 중 임의의 하나의 스페이서 서열을 포함한다. 다음은 FXN: 서열번호: 7301-53372에 대한 가이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 서열번호: 7301-53372 중 임의의 하나를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 서열번호: 7301-53372 중 임의의 하나의 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA), 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어 Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 근긴장성 이영양증 유형 1과 연관된 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 유전자(DMPK)의 CTG 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열번호: 101-4988에서 서열 목록에 제시된 DMPK 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열번호: 101-4988에서 서열 목록에 제시된 DMPK 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 또는 1386 중 임의의 하나의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 DMPK 가이드 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2에 제시된 가이드 서열에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 trRNA를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 각각의 조성물 및 방법 실시형태에서, crRNA(스페이서 서열 포함) 및 trRNA는 단일 RNA(sgRNA)로서 회합될 수 있거나 별도의 RNA(dgRNA) 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA 성분은, 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 또는 1386으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 3354, 4010, 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 2322, 1770, 1538, 2514, 2458, 2194, 2594, 2162, 및 2618로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 및 3722로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 및 2322로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3378, 3354, 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 및 2506으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3314, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 및 2258로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3914, 2114, 2618, 및 3418로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3916, 3420, 및 3940으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3914 및 3418로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3938을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 또는 1386으로부터 선택된 FXN 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서 gRNA는 DNA-PK 억제로 DMPK 유전자로부터 TNR의 단일 절단 절제에 유용하다. 일부 실시형태에서, DNA-PK 억제제는 단일 절단 절제를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3914의 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3418의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서 gRNA는 서열번호: 3938의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서 gRNA는 서열번호: 3916의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3420의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 3940의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 하기로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 2162 및 3658; 2202 및 4010; 2202 및 4026; 2202 및 3914; 2202 및 3938; 2202 및 3858; 2202 및 3818; 2202 및 3794; 2202 및 3802; 2202 및 3746; 2202 및 3778; 2202 및 3770; 2202 및 3722; 2202 및 3690; 2202 및 3682; 2202 및 3330; 2202 및 3354; 2202 및 3394; 2202 및 3386; 2178 및 4010; 2178 및 4026; 2178 및 3914; 2178 및 3938; 2178 및 3858; 2178 및 3818; 2178 및 3794; 2178 및 3802; 2178 및 3746; 2178 및 3778; 2178 및 3770; 2178 및 3722; 2178 및 3690; 2178 및 3682; 2178 및 3330; 2178 및 3354; 2178 및 3394; 2178 및 3386; 2170 및 4010; 2170 및 4026; 2170 및 3914; 2170 및 3938; 2170 및 3858; 2170 및 3818; 2170 및 3794; 2170 및 3802; 2170 및 3746; 2170 및 3778; 2170 및 3770; 2170 및 3722; 2170 및 3690; 2170 및 3682; 2170 및 3330; 2170 및 3354; 2170 및 3394; 2170 및 3386; 2162 및 4010; 2162 및 4026; 2162 및 3914; 2162 및 3938; 2162 및 3858; 2162 및 3818; 2162 및 3794; 2162 및 3802; 2162 및 3746; 2162 및 3778; 2162 및 3770; 2162 및 3722; 2162 및 3690; 2162 및 3682; 2162 및 3330; 2162 및 3354; 2162 및 3394; 2162 및 3386; 1706 및 3418; 1706 및 3370; 1706 및 3514; 1706 및 3658; 1706 및 4010; 1706 및 4026; 1706 및 3914; 1706 및 3938; 1706 및 3858; 1706 및 3818; 1706 및 3794; 1706 및 3802; 1706 및 3746; 1706 및 3778; 1706 및 3770; 1706 및 3722; 1706 및 3690; 1706 및 3682; 1706 및 3330; 1706 및 3354; 1706 및 3394; 1706 및 3386; 2210 및 3418; 2210 및 3370; 2210 및 3514; 2210 및 3658; 2210 및 4010; 2210 및 4026; 2210 및 3914; 2210 및 3938; 2210 및 3858; 2210 및 3818; 2210 및 3794; 2210 및 3802; 2210 및 3746; 2210 및 3778; 2210 및 3770; 2210 및 3722; 2210 및 3690; 2210 및 3682; 2210 및 3330; 2210 및 3354; 2210 및 3394; 2210 및 3386; 1778 및 3418; 1778 및 3370; 1778 및 3514; 1778 및 3658; 1778 및 4010; 1778 및 4026; 1778 및 3914; 1778 및 3938; 1778 및 3858; 1778 및 3818; 1778 및 3794; 1778 및 3802; 1778 및 3746; 1778 및 3778; 1778 및 3770; 1778 및 3722; 1778 및 3690; 1778 및 3682; 1778 및 3330; 1778 및 3354; 1778 및 3394; 1778 및 3386; 2258 및 3418; 2258 및 3370; 2258 및 3514; 2258 및 3658; 2258 및 4010; 2258 및 4026; 2258 및 3914; 2258 및 3938; 2258 및 3858; 2258 및 3818; 2258 및 3794; 2258 및 3802; 2258 및 3746; 2258 및 3778; 2258 및 3770; 2258 및 3722; 2258 및 3690; 2258 및 3682; 2258 및 3330; 2258 및 3354; 2258 및 3394; 2258 및 3386; 2114 및 3418; 2114 및 3370; 2114 및 3514; 2114 및 3658; 2114 및 4010; 2114 및 4026; 2114 및 3914; 2114 및 3938; 2114 및 3858; 2114 및 3818; 2114 및 3794; 2114 및 3802; 2114 및 3746; 2114 및 3778; 2114 및 3770; 2114 및 3722; 2114 및 3690; 2114 및 3682; 2114 및 3330; 2114 및 3354; 2114 및 3394; 2114 및 3386; 1642 및 3418; 1642 및 3370; 1642 및 3514; 1642 및 3658; 1642 및 4010; 1642 및 4026; 1642 및 3914; 1642 및 3938; 1642 및 3858; 1642 및 3818; 1642 및 3794; 1642 및 3802; 1642 및 3746; 1642 및 3778; 1642 및 3770; 1642 및 3722; 1642 및 3690; 1642 및 3682; 1642 및 3330; 1642 및 3354; 1642 및 3394; 1642 및 3386; 1738 및 3418; 1738 및 3370; 1738 및 3514; 1738 및 3658; 1738 및 4010; 1738 및 4026; 1738 및 3914; 1738 및 3938; 1738 및 3858; 1738 및 3818; 1738 및 3794; 1738 및 3802; 1738 및 3746; 1738 및 3778; 1738 및 3770; 1738 및 3722; 1738 및 3690; 1738 및 3682; 1738 및 3330; 1738 및 3354; 1738 및 3394; 1738 및 3386; 2258 및 3418; 2258 및 3370; 2258 및 3514; 2258 및 3658; 2258 및 4010; 2258 및 4026; 2258 및 3914; 2258 및 3938; 2258 및 3858; 2258 및 3818; 2258 및 3794; 2258 및 3802; 2258 및 3746; 2258 및 3778; 2258 및 3770; 2258 및 3722; 2258 및 3690; 2258 및 3682; 2258 및 3330; 2258 및 3354; 2258 및 3394; 2258 및 3386; 2114 및 3418; 2114 및 3370; 2114 및 3514; 2114 및 3658; 2114 및 4010; 2114 및 4026; 2114 및 3914; 2114 및 3938; 2114 및 3858; 2114 및 3818; 2114 및 3794; 2114 및 3802; 2114 및 3746; 2114 및 3778; 2114 및 3770; 2114 및 3722; 2114 및 3690; 2114 및 3682; 2114 및 3330; 2114 및 3354; 2114 및 3394; 1706 및 3386; 1642 및 3418; 1642 및 3370; 1642 및 3514; 1642 및 3658; 1642 및 4010; 1642 및 4026; 1642 및 3914; 1642 및 3938; 1642 및 3858; 1642 및 3818; 1642 및 3794; 1642 및 3802; 1642 및 3746; 1642 및 3778; 1642 및 3770; 1642 및 3722; 1642 및 3690; 1642 및 3682; 1642 및 3330; 1642 및 3354; 1642 및 3394; 1642 및 3386; 1738 및 3418; 1738 및 3370; 1738 및 3514; 1738 및 3658; 1738 및 4010; 1738 및 4026; 1738 및 3914; 1738 및 3938; 1738 및 3858; 1738 및 3818; 1738 및 3794; 1738 및 3802; 1738 및 3746; 1738 및 3778; 1738 및 3770; 1738 및 3722; 1738 및 3690; 1738 및 3682; 1738 및 3330; 1738 및 3354; 1738 및 3394; 1738 및 3386; 1746 및 3418; 1746 및 3370; 1746 및 3514; 1746 및 3658; 1746 및 4010; 1746 및 4026; 1746 및 3914; 1746 및 3938; 1746 및 3858; 1746 및 3818; 1746 및 3794; 1746 및 3802; 1746 및 3746; 1746 및 3778; 1746 및 3770; 1746 및 3722; 1746 및 3690; 1746 및 3682; 1746 및 3330; 1746 및 3354; 1746 및 3394; 1746 및 3386; 2322 및 3418; 2322 및 3370; 2322 및 3514; 2322 및 3658; 2322 및 4010; 2322 및 4026; 2322 및 3914; 2322 및 3938; 2322 및 3858; 2322 및 3818; 2322 및 3794; 2322 및 3802; 2322 및 3746; 2322 및 3778; 2322 및 3770; 2322 및 3722; 2322 및 3690; 2322 및 3682; 2322 및 3330; 2322 및 3354; 2322 및 3394; 2322 및 3386; 1770 및 3418; 1770 및 3370; 1770 및 3514; 1770 및 3658; 1770 및 4010; 1770 및 4026; 1770 및 3914; 1770 및 3938; 1770 및 3858; 1770 및 3818; 1770 및 3794; 1770 및 3802; 1770 및 3746; 1770 및 3778; 1770 및 3770; 1770 및 3722; 1770 및 3690; 1770 및 3682; 1770 및 3330; 1770 및 3354; 1770 및 3394; 1770 및 3386; 1538 및 3418; 1538 및 3370; 1538 및 3514; 1538 및 3658; 1538 및 4010; 1538 및 4026; 1538 및 3914; 1538 및 3938; 1538 및 3858; 1538 및 3818; 1538 및 3794; 1538 및 3802; 1538 및 3746; 1538 및 3778; 1538 및 3770; 1538 및 3722; 1538 및 3690; 1538 및 3682; 1538 및 3330; 1538 및 3354; 1538 및 3394; 1538 및 3386; 2514 및 3418; 2514 및 3370; 2514 및 3514; 2514 및 3658; 2514 및 4010; 2514 및 4026; 2514 및 3914; 2514 및 3938; 2514 및 3858; 2514 및 3818; 2514 및 3794; 2514 및 3802; 2514 및 3746; 2514 및 3778; 2514 및 3770; 2514 및 3722; 2514 및 3690; 2514 및 3682; 2514 및 3330; 2514 및 3354; 2514 및 3394; 2514 및 3386; 2458 및 3418; 2458 및 3370; 2458 및 3514; 2458 및 3658; 2458 및 4010; 2458 및 4026; 2458 및 3914; 2458 및 3938; 2458 및 3858; 2458 및 3818; 2458 및 3794; 2458 및 3802; 2458 및 3746; 2458 및 3778; 2458 및 3770; 2458 및 3722; 2458 및 3690; 2458 및 3682; 2458 및 3330; 2458 및 3354; 2458 및 3394; 2458 및 3386; 2194 및 3418; 2194 및 3370; 2194 및 3514; 2194 및 3658; 2194 및 4010; 2194 및 4026; 2194 및 3914; 2194 및 3938; 2194 및 3858; 2194 및 3818; 2194 및 3794; 2194 및 3802; 2194 및 3746; 2194 및 3778; 2194 및 3770; 2194 및 3722; 2194 및 3690; 2194 및 3682; 2194 및 3330; 2194 및 3354; 2194 및 3394; 2194 및 3386; 2594 및 3418; 2594 및 3370; 2594 및 3514; 2594 및 3658; 2594 및 4010; 2594 및 4026; 2594 및 3914; 2594 및 3938; 2594 및 3858; 2594 및 3818; 2594 및 3794; 2594 및 3802; 2594 및 3746; 2594 및 3778; 2594 및 3770; 2594 및 3722; 2594 및 3690; 2594 및 3682; 2594 및 3330; 2594 및 3354; 2594 및 3394; 2594 및 3386; 2618 및 3418; 2618 및 3370; 2618 및 3514; 2618 및 3658; 2618 및 4010; 2618 및 4026; 2618 및 3914; 2618 및 3938; 2618 및 3858; 2618 및 3818; 2618 및 3794; 2618 및 3802; 2618 및 3746; 2618 및 3778; 2618 및 3770; 2618 및 3722; 2618 및 3690; 2618 및 3682; 2618 및 3330; 2618 및 3354; 2618 및 3394; 및 2618 및 3386.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 2162 및 3658; 2202 및 4010; 2202 및 4026; 2202 및 3914; 2202 및 3938; 2202 및 3858; 2202 및 3818; 2202 및 3794; 2202 및 3802; 2202 및 3746; 2202 및 3778; 2202 및 3770; 2202 및 3722; 2202 및 3690; 2202 및 3682; 2202 및 3330; 2202 및 3354; 2202 및 3394; 2202 및 3386; 2178 및 4010; 2178 및 4026; 2178 및 3914; 2178 및 3938; 2178 및 3858; 2178 및 3818; 2178 및 3794; 2178 및 3802; 2178 및 3746; 2178 및 3778; 2178 및 3770; 2178 및 3722; 2178 및 3690; 2178 및 3682; 2178 및 3330; 2178 및 3354; 2178 및 3394; 2178 및 3386; 2170 및 4010; 2170 및 4026; 2170 및 3914; 2170 및 3938; 2170 및 3858; 2170 및 3818; 2170 및 3794; 2170 및 3802; 2170 및 3746; 2170 및 3778; 2170 및 3770; 2170 및 3722; 2170 및 3690; 2170 및 3682; 2170 및 3330; 2170 및 3354; 2170 및 3394; 2170 및 3386; 2162 및 4010; 2162 및 4026; 2162 및 3914; 2162 및 3938; 2162 및 3858; 2162 및 3818; 2162 및 3794; 2162 및 3802; 2162 및 3746; 2162 및 3778; 2162 및 3770; 2162 및 3722; 2162 및 3690; 2162 및 3682; 2162 및 3330; 2162 및 3354; 2162 및 3394; 2162 및 3386. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 및 2162 및 3658. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 3778 및 2514; 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2514; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 3354 및 2514; 3354 및 2258; 및 3354 및 2210. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 및 3354 및 2514. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3330 및 2506; 및 3330 및 2546. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3354 및 2546; 3354 및 2506; 3378 및 2546; 3378 및 2506. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 다음으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다: 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 및 3330 및 2498. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 1153 및 1129를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 및 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 및 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906 및 3746으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3778 및 1778; 3778 및 1746; 3778 및 1770; 3778 및 1586; 3778 및 1914; 3778 및 2210; 4026 및 1778; 4026 및 1746; 4026 및 1770; 4026 및 1586; 4026 및 1914; 4026 및 2210; 3794 및 1778; 3794 및 1746; 3794 및 1770; 3794 및 1586; 3794 및 1586; 3794 및 1914; 3794 및 2210; 4010 및 1778; 4010 및 1770; 4010 및 1746; 4010 및 1586; 4010 및 1914; 4010 및 2210; 3906 및 1778; 3906 및 1778; 3906 및 1746; 3906 및 1770; 3906 및 1586; 3906 및 1914; 3906 및 2210; 3746 및 1778; 3746 및 1746; 3746 및 1770; 3746 및 1586; 3746 및 1914; 및 3746 및 2210으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3256, 2896, 3136, 및 3224로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 다음 서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 및 616으로부터 선택된 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 3256 및 4989; 3256 및 984; 3256 및 616; 2896 및 4989; 2896 및 672; 2896 및 760; 3136 및 4989; 3136 및 560; 3224 및 4989; 3224 및 976; 및 3224 및 760으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고, 여기서 스트레치는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 반복을 통해 계속된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고 여기서 스트레치는 서열번호: 53413: gtgggtctccgcccagctccagtcctgtgatccgggcccgccccctagcggccggggagggaggggccgggtccgcggccggcgaacggggctcgaagggtccttgtagccgggaatgctgctgctg이다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고, 여기서 스트레치는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고 여기서 스트레치는 서열번호: 53414: tgggtctccgcccagctccagtcctgtgatccgggcccgccccctagcggccggggagggaggggccgggtccgcggccggcgaacgggg이다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고, 여기서 스트레치는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고 여기서 스트레치는 서열번호: 53415: tgggtctccgcccagctccagtcctgtgatccgggcccgccccctagcggccggggagggaggggccgggtccgcggccggc이다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고, 여기서 스트레치는 DMPK-U15 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U51 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고, 여기서 스트레치는 서열번호: 53416: gatgggcaaactgcaggcctgggaaggcagcaagccgggccgtccgtgttccatcctccacgcacccccacctatcgttggttcgcaaagtgcaaagctttcttgtgcatgacgccctgctctggggagcgtctggcgcgatctctgcctgctt이다.
일부 실시형태에서, 스트레치는 DMPK-U35 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 DMPK-U51 절단 부위 전의 1 뉴클레오티드를 통해 계속된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드로 지향시키고, 여기서 스트레치는 서열번호: 53417: gttggttcgcaaagtgcaaagctttcttgtgcatgacgccctgctctggggagcgtctggcgcgatctctgcctgctt이다.
U29 절단 부위는 chr19: 뉴클레오티드 45,770,383과 45,770,384 사이(Hg38 좌표 사용)이며, 이는 다음 서열: ttcacaaccgctccgag*cgtggg에서 *에 상응한다.
U30 절단 부위는 chr19: 45,770,385와 45,770,386 사이(Hg38 좌표 사용)이며, 이는 다음 서열: gctgggcggagacccac*gctcgg에서 *에 상응한다.
D15 절단 부위는 chr19: 45,770,154와 45,770,155 사이(Hg38 좌표 사용)이며, 이는 다음 서열: ggctgaggccctgacgt*ggatgg에서 *에 상응한다.
D35 절단 부위는 chr19: 45,770,078과 45,770,079 사이(Hg38 좌표 사용)이며, 이는 다음 서열: cacgcaccccccacctat*cgttgg에서 *에 상응한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 근긴장성 이영양증 유형 1과 연관된 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 유전자(FXN)에서 CTG 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열로 지향시키는 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 FXN 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 FXN 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 FXN 가이드 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 표시된 가이드 서열에 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 trRNA를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 각각의 조성물 및 방법 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA(sgRNA)로서 회합될 수 있거나 별도의 RNA(dgRNA) 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA 성분은, 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 28130, 34442, 45906, 26562, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 49986, 51762, 51754, 52290, 52298, 51474, 52306, 50682, 51706, 52098, 50714, 51498, 52498, 50978, 51746, 52106, 51506, 50674, 52082, 52506, 50538, 52066, 52386, 52090, 52266, 52474, 52258, 52434, 50706, 51490, 52458, 51466, 52354, 51914, 51362, 51058, 50170, 51954, 52250, 51930, 51682, 52594, 52610, 51162, 49162, 50898, 49226, 51658, 52554, 52634, 51394, 49034, 52546, 52522, 52618, 52530, 28322, 26530, 26578, 26602, 26634, 26626, 26698, 26746, 26754, 26786, 26882, 27722, 27730, 27738, 27770, 27754, 27762, 27802, 27850, 27842, 27922, 27946, 27986, 28114, 28122, 28146, 28186, 28194, 28338, 28346, 28322, 28378, 28370, 28458, 28506, 28634, 28642, 28650, 34442, 또는 45906으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 28130, 34442, 45906, 26562, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 49986, 51762, 51754, 52290, 52298, 51474, 52306, 50682, 51706, 52098, 50714, 51498, 52498, 50978, 51746, 52106, 51506, 50674, 52082, 52506, 50538, 52066, 52386, 52090, 52266, 52474, 52258, 52434, 50706, 51490, 52458, 51466, 52354, 51914, 51362, 51058, 50170, 51954, 52250, 51930, 51682, 52594, 52610, 51162, 49162, 50898, 49226, 51658, 52554, 52634, 51394, 49034, 52546, 52522, 52618, 52530, 28322, 26530, 26578, 26602, 26634, 26626, 26698, 26746, 26754, 26786, 26882, 27722, 27730, 27738, 27770, 27754, 27762, 27802, 27850, 27842, 27922, 27946, 27986, 28114, 28122, 28146, 28186, 28194, 28338, 28346, 28322, 28378, 28370, 28458, 28506, 28634, 28642, 28650, 34442, 또는 45906으로부터 선택된 FXN 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 51706, 51058, 51754, 52090, 52594, 52098, 52298, 52106, 51682, 52066, 52354, 52458, 52290, 52498, 51658, 51930, 51162, 52506, 51762, 51746, 52386, 52258, 52530, 52634, 27850, 28634, 26882, 28650, 28370, 28194, 26626, 26634, 26786, 26754, 27770, 26578, 28130, 27738, 28338, 28642, 26602, 27754, 27730, 및 28122로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 47047 및 7447; 7463 및 46967; 46768 및 7680; 47032 및 7447로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍는 서열번호: 47047 및 7447을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 52898 및 26546을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 근긴장성 이영양증 유형 1과 연관된 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 유전자(FMR1)에서의 CTG 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 FMR1 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 FMR1 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 FMR1 가이드 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 표 2 또는 서열 목록에 제시된 가이드 서열에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 trRNA를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 각각의 조성물 및 방법 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA(sgRNA)로서 회합될 수 있거나 별도의 RNA(dgRNA) 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA 성분은, 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5262, 5782, 5830, 5926, 5950, 5998, 6022, 5310 및 5334로부터 선택된 스페이서 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5830, 6022, 5262, 및 5310으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부에서 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5262, 5334, 및 5830으로부터 선택된 스페이서 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 및 5312로부터 선택된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5262를 포함하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5264로부터 선택된 스페이서 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA, 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 gRNA는 서열번호: 5262, 5782, 5830, 5926, 5950, 5998, 6022, 5310 또는 5334로부터 선택된 FMR1 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 5782 및 5262; 5830 및 5262; 5926 및 5262; 5950 및 5262; 및 5998 및 5262로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 5830 및 5262; 및 6022 및 5310으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 쌍 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 조성물로서 제공되며, 여기서 가이드 RNA의 쌍은 서열번호: 5334 및 5830을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 헌팅턴병과 연관된 헌팅턴(HTT) 유전자에서 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 취약 XE 증후군과 연관된 취약 X 정신 지체 2(FMR2) 유전자 내 또는 또는 그에 인접한 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 X-연관 척수 및 구근 근위축증(케네디병)과 연관된 안드로겐 수용체(AR) 유전자에서 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 ARX-연관 영아 간질 뇌병증, 조기 영아 간질 뇌병증 1, 오타하라 증후군, 파팅턴 증후군 또는 웨스트 증후군과 연관된 아리스타리스 관련된 호메오박스(ARX) 유전자에서 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 아탁신 1(ATXN1), 아탁신 2(ATXN2), 아탁신 3(ATXN3), 칼슘 전압-개폐 채널 소단위 알파1 A(CACNA1A), 아탁신 7(ATXN7), ATXN8 반대쪽 가닥 lncRNA(ATXN8OS/SCA8), 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 소단위 B 베타 이소형(PPP2R2B), 또는 척수소뇌 운동실조의 형태와 연관된 TATA 결합 단백질(TBP) 유전자에서 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)를 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(DRPLA)와 연관된 아트로핀-1(ATN1) 유전자에서 반복 영역 내 또는 그 근처의 표적 DNA 서열에 지향시키는 가이드 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 각각의 조성물, 용도 및 방법 실시형태에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA는 예를 들어, 표 2 및 서열 목록에 제시된 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자, 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유적으로 연결되지 않을 수 있지만, crRNA의 부분과 trRNA 사이의 염기쌍을 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 각각의 조성물, 용도 및 방법 실시형태에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유적으로 연결된 표 2에 제시낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA(또는 이의 일부)를 포함할 수 있다. sgRNA는 표 2 및 서열 목록에 제시된 가이드 서열의 17, 18, 19 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 crRNA의 부분과 trRNA 사이의 염기쌍을 통해 스템-루프 구조를 형성한다. 일부 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 포스포디에스테르 결합이 아닌 하나 이상의 결합을 통해 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, trRNA는 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템에서 유래된 trRNA 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, trRNA는 절단되거나 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다. 일부 실시형태에서, trRNA는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 100 초과의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, trRNA는 예를 들어 하나 이상의 헤어핀 또는 스템-루프 구조, 또는 하나 이상의 벌지 구조와 같은 특정 2차 구조를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA (또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산)를 포함하는 조성물이 제공되며 여기서 하나 이상의 gRNA는 서열번호: 101-4988, 5001-7264 또는 7301-53372 중 임의의 하나의 가이드 서열을 포함한다.
일 양태에서, 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372의 핵산 중 임의의 것에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
다른 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나, 예를 들어, 적어도 2개의 gRNA, 또는 적어도 하나, 예를 들어, 적어도 2개의 gRNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372의 가이드 서열 중 임의의 2개 이상으로부터 선택된 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 각각 서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372의 임의의 핵산에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA를 코딩하는 핵산은 벡터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 벡터이다.
본 명세서에 기술된 임의의 것과 같은 임의의 유형의 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 gRNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 비-통합 바이러스 벡터(즉, 벡터로부터 숙주 염색체 내로 서열을 삽입하지 않음)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 근육-특이적 프로모터를 포함한다. 예시적인 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터, 또는 SPc5-12 프로모터를 포함한다. US 2004/0175727 A1; Wang 등, Expert Opin Drug Deliv. (2014) 11, 345-364; Wang 등, Gene Therapy (2008) 15, 1489-1499를 참고한다. 일부 실시형태에서, 근육-특이적 프로모터는 CK8 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 근육-특이적 프로모터는 CK8e 프로모터이다. 임의의 전기한 실시형태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있다.
본 명세서에 개시된 가이드 RNA 조성물은 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역, 예컨대 DMPK 유전자에서 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역 내 또는 그 근처의 표적 서열을 인식(예를 들어, 혼성화)하도록 설계된다. 예를 들어, 표적 서열은 가이드 RNA를 포함하는 제공된 Cas 절단효소에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 절단효소와 같은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA에 의해 표적 서열로 지향될 수 있으며, 여기서 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 절단효소는 표적 서열을 절단한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 트리뉴클레오티드 반복 확장 질환과 연관된 임의의 유전자와 같은, 관심 있는 유전자 내의 표적 서열을 기반으로 결정된다. 관심 있는 예시적인 유전자는 표 1에 열거되어 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 돌연변이(예를 들어, 뉴클레아제-매개된 DSB의 수선으로 인한 절제)는 유전자의 특정 영역에서 절단이 발생하는 경우 보다 효율적으로 제공될 수 있고/있거나 더 잘 용인될 수 있고, 따라서 DSB의 위치화는 결과로 나타날 수 있는 절제-후 대립유전자의 중요한 요소이다.
일부 실시형태에서, 가이드 서열은 관심 있는 인간 유전자에 존재하는 표적 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 100% 상보성이거나 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 적어도 하나의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 1, 2, 3, 또는 4개 미스매치를 함유할 수 있으며, 여기서 가이드 서열의 총 길이는 20이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 1-4개 미스매치를 함유할 수 있으며 여기서 가이드 서열은 20개 뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 또는 제형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다.
변형된 gRNA
일부 실시형태에서, gRNA는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 gRNA는 "변형된" gRNA 또는 "화학적으로 변형된" gRNA로 지칭되어, 규범적 A, G, C 및 U 잔기 대신 또는 이에 부가하여 사용되는 하나 이상의 비-자연 및/또는 자연 발생 성분 또는 구성의 존재를 기술한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 비-규범적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드로 합성되며, 여기서 "변형된"이라고 지칭된다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 골격 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체(예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어 대체(예시적인 당 변형); (iii) "데포스포" 링커로 포스페이트 모이어티의 대량의 대체(예시적인 골격 변형); (iv) 비-규범적 핵염기를 포함하는 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형(예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형).
상기에 열거된 것과 같은 화학적 변형은 2, 3, 4 또는 그 초과의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드(집합적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 gRNA를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기, 또는 변형된 당 및 변형된 포스포디에스테르를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA의 모든 염기는 변형되며, 예를 들어 모든 염기는 포스포로티오에이트 기와 같은 변형된 포스페이트 기를 갖는다. 특정 실시형태에서, gRNA 분자의 포스페이트 기의 전부 또는 실질적으로 전부가 포스포로티오에이트 기로 대체된다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 1, 2, 3 또는 그 초과의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA에서 위치 중 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%)는 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드이다.
비변형 핵산은, 예를 들어 세포내 뉴클레아제 또는 혈청에서 발견되는 뉴클레아제에 의해 분해되는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서 본 명세서에 기재된 gRNA는, 예를 들어 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체내 및 생체외 둘 모두에서 세포의 모집단 내로 도입될 때 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천적 면역 반응"은 단일 가닥의 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함한다.
골격 변형의 일부 실시형태에서, 변형된 잔기의 포스페이트 기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함에 의해 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 잔기, 예를 들어 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트 기로 비변형된 포스페이트 모이어티의 다량의 대체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 비대칭 전하 분포를 갖는 비하전된 링커 또는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 비변형된 포스페이트 기에서 인 원자는 비키랄이다. 그러나, 비-가교 산소 중 하나를 상기 원자 또는 원자의 그룹 중 하나로 대체하면 인 원자에 키랄을 부여할 수 있다. 입체유전자의 인 원자는 "R" 배열(여기서는 Rp) 또는 "S" 배열(여기서는 Sp)을 가질 수 있다. 골격은 또한 가교 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오시드에 연결하는 산소)의 질소(가교된 포스포로아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌포스포네이트)로의 대체에 의해 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 하나 또는 연결 산소 둘 모두에서 발생할 수 있다.
포스페이트 기는 특정 골격 변형에서 커넥터를 함유하는 비-인에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하전된 포스페이트 기는 중성 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 비제한적으로, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥시드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드는 또한 포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대용물로 대체되어 구성될 수 있다. 이러한 변형은 골격 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 대용물 골격에 의해 묶일 수 있다. 예는 비제한적으로 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산(PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 당 그룹에 대한 하나 이상의 변형, 즉 당에서 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실 기(OH)는 변형될 수 있으며, 예를 들어, 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기에 대한 변형은 하이드록실이 더 이상 탈양성자화되어 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 하이드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR을 포함할 수 있으며 여기서 R은, 예를 들어 H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16 , 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실 기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실 기 변형은 2' 하이드록실 기를 플루오라이드로 대체하는 2'-플루오로 변형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실 기 변형은 2' 하이드록실이 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 가교에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠금" 핵산(LNA)을 포함할 수 있으며, 여기서 예시적인 가교는 메틸렌, 프로필렌, 에테르 또는 아미노 가교; O-아미노(여기서 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노 (여기서 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실 기 변형은 리보스 고리가 C2'-C3' 결합을 결하는 "비잠금" 핵산(UNA)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실 기 변형은 메톡시에틸 기 (MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 2' 변형은 수소(즉, 예를 들어, 부분적으로 dsRNA의 돌출 부분에서 데옥시리보스 당); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로 또는 요오도); 아미노(여기서 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기서 아미노는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서, R은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 본 명세서에 기재된 아미노로 선택적으로 치환될 수 있다.
당 변형은 리보스에서 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학적 배열을 보유하는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있는 당 그룹을 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 당으로서, 예를 들어 아라비노스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 비염기성 당을 포함할 수 있다. 이들 비염기성 당은 또한 하나 이상의 구성 당 원자에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어 L-뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
변형된 핵산 안으로 합체될 수 있는, 본 명세서에 기술된 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 핵염기라고도 지칭되는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 핵염기는 변형된 핵산 안으로 합체될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 완전히 대체될 수 있다. 뉴클레오티드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체, 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 예를 들어 염기의 자연 발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 이용하는 실시형태에서, 각각의 crRNA 및 tracr RNA는 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 및/또는 tracr RNA의 일 또는 양 말단에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 실시형태에서, sgRNA의 일 또는 양 말단에 있는 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형될 수 있고/있거나 내부 뉴클레오시드가 변형될 수 있고/있거나 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 실시형태는 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 실시형태는 3' 말단 변형을 포함한다.
2'-O-메틸의 변형이 포괄된다.
뉴클레오티드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 당 고리 상의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오티드 결합 친화도와 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다. 2'-플루오로(2'-F)의 변형이 포괄된다.
포스포로티오에이트(PS) 연결 또는 결합은, 예를 들어 뉴클레오티드 염기 사이의 결합에서 포스포디에스테르 연결에서 하나의 비가교 포스페이트 산소에 대해 황이 치환된 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 생성하는 경우, 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 S-올리고로 지칭될 수 있다.
비염기성 뉴클레오티드는 질소성 염기를 결하는 뉴클레오티드를 지칭한다.
역전된 염기는 정상적인 5'에서 3' 연결에서 역전된 연결(즉, 5'에서 5' 연결 또는 3'에서 3' 연결)을 가진 염기를 지칭한다.
비염기성 뉴클레오티드는 역전된 연결로 부착될 수 있다. 예를 들어, 비염기성 뉴클레오티드는 5'에서 5' 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오티드에 부착될 수 있거나, 또는 비염기성 뉴클레오티드는 3'에서 3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오티드에서 역전된 비염기성 뉴클레오티드는 역전된 비염기성 말단 캡으로 또한 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 5' 말단에서 처음 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상 및 3' 말단에서 마지막 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 역전된 비염기성 뉴클레오티드, PS 결합, 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키기 위해 당업계에 널리 공지된 다른 뉴클레오티드 변형이다.
일부 실시형태에서, 5' 말단에서 처음 4개 뉴클레오티드 및 3' 말단에서 마지막 4개 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 5' 말단에서 처음 3개 뉴클레오티드 및 3' 말단에서 마지막 3개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 말단에서 처음 3개 뉴클레오티드 및 3' 말단에서 마지막 3개 뉴클레오티드는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
리보핵단백질 복합체
일부 실시형태에서, 표 2 또는 서열 목록으로부터 하나 이상의 가이드 서열 및 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 뉴클레아제, 예컨대 Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제를 포함하는 하나 이상의 gRNA를 포함하는 조성물이 포괄된다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 엔도뉴클레아제 활성으로도 지칭될 수 있는 절단효소 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제를 포함한다. Cas9 뉴클레아제의 예는 S. 피오게네스, S. 아우레우스, 및 기타 원핵생물(예를 들어, 다음 단락의 목록 참조)의 유형 II CRISPR 시스템의 것들, 및 이들의 변형된(예를 들어, 조작된 또는 돌연변이체) 버전을 포함한다. 예를 들어, US2016/0312198 A1; US 2016/0312199 A1 참고. Cas 뉴클레아제의 다른 예는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체 또는 이의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 소단위; 및 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 또는 이의 Cas3 소단위를 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 유형-IIA, 유형-IIB, 또는 유형-IIC 시스템으로부터의 것일 수 있다. 다양한 CRISPR 시스템 및 Cas 뉴클레아제의 논의에 대해서는 예를 들어 Makarova 등, Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova 등, Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov 등, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)를 참고한다.
Cas 뉴클레아제가 유래될 수 있는 비-제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 종, 스타필로코커스 아우레우스, 리스테리아 인노쿠아, 락토바실러스 가세리, 프란시셀라 노비시다, 월리넬라 숙시노게네스, 수테렐라 워즈워슨시스, 감마프로테오박테리움, 나이세리아 메닌지티디스, 캄필로박터 제주니, 파스퇴렐라 멀토시다, 피브로박터 숙시노겐, 로도스피릴룸 루브룸, 노카디오프시스 다손빌레이, 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포랑기움 로세움, 스트렙토스포랑기움 로세움, 알리시클로바실러스 아시도칼다리우스, 바실러스 슈도마이코이데스, 바실러스 셀레니티리듀센스, 엑시구오박테리움 시비리쿰, 락토바실러스 델브루에키이, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 부흐네리, 트레포네마 덴티콜라, 마이크로실라 마리나, 버콜데리알레스 박테리움, 폴라로모나스 나프탈레니보란스, 폴라로모나스 종, 크로코스패라 왓소니이, 시아노테세 종, 마이크로시스티스 에어루기노사, 시네코코커스 종, 아세토할로븀 아라바티큠, 암모니펙스 데겐시, 칼디셀룰로시럽터 베스키이, 칸디다투스 데술포루디스, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 디피실레, 피네골디아 마그나, 나트라네로비우스 써모필루스, 페로토마큘럼 써모프로피오니큠, 에씨디티오바실러스 칼두스, 에씨디티오바실러스 페로옥시단스, 알로크로마티움 비노섬, 마리노박터 종, 니트로소코커스 할로필루스, 니트로소코커스 왓소니, 슈도알테로모나스 할로플랑크티스, 크테도노박터 라세미퍼, 메타노할로비움 에베스티가툼, 아나바에나 바리아빌리스, 노듈라리아 스퍼미게나, 노스톡 종, 아르쓰로스피라 맥시마, 아르쓰로스피라 플라텐시스, 아르쓰로스피라 종, 링비아 종, 마이크로콜레우스 크토노플라스테스, 오실라토리아 종, 페트로토가 모빌리스, 써모시포 아프리카누스, 스트렙토코커스 파스퇴리아누스, 나이세리아 시네레아, 캄필로박터 라리, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스, 코리네박테리움 디프테리아, 에시드아미노코커스 종, 라크노스피라세애 박테리아 ND2006 및 아카리오클로리스 마리나를 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 나이세리아 메닌지티디스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 에시드아미노코커스 종으로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 라크노스피라세아세애 박테리아 ND2006으로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 추가 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 툴라렌시스, 라크노스피라세애 박테리움, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움, 파쿠박테리아 박테리움, 스미텔라, 에시드아미노코커스, 칸디다투스 메탄플라즈마 터미튬, 유박테리움 엘리겐스, 모락셀라 보보쿨리, 렙토스피라 이나다이, 포르피로모나스 크레비오리카니스, 프레보텔라 디시엔스, 또는 포르피로모나스 마카에로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 특정 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 에시드아미노코커스 또는 라크노스피라세애로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 함께 gRNA는 리보핵단백질 복합체(RNP)로 불린다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제와 함께 gRNA는 Cas RNP로 불린다. 일부 실시형태에서, RNP는 유형-I, 유형-II, 유형-III, 유형-IV, 또는 유형-V 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas12 또는 Cas12a(이전에는 Cpf1로 알려짐)와 같은 유형-V 시스템에서 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas9와 함께 gRNA는 Cas9 RNP로 불린다.
야생형 Cas9에는 2개 뉴클레아제 도메인: RuvC 및 HNH가 있다. RuvC 도메인은 비-표적 DNA 가닥을 절단하고 HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 하나 초과의 RuvC 도메인 및/또는 하나 초과의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 각각의 조성물, 용도 및 방법 실시형태에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 파손을 유도한다.
일부 실시형태에서, 단백질의 한 도메인 또는 영역이 상이한 단백질의 일부로 대체된 키메라 Cas 뉴클레아제가 사용된다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레아제로부터의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 변형된 뉴클레아제일 수 있다.
다른 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 유형-I CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 유형-III CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 단일-가닥 닉카아제 활성을 가지며, 즉, 하나의 DNA 가닥을 절단하여 "틈"으로도 알려진 단일-가닥 파손을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 닉카아제를 포함한다. 닉카아제는 dsDNA에 틈을 만드는 효소이며, 즉 DNA 이중 나선의 한 가닥은 자르고 다른 가닥은 자르지 않는다. 일부 실시형태에서, Cas 닉카아제는 세포내핵분해 활성 부위가 예를 들어 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 불활성화된 Cas 뉴클레아제(예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)의 버전이다. 예를 들어, Cas 닉카아제 및 예시적인 촉매 도메인 변경의 논의에 대해서는 미국 특허 번호 8,889,356를 참고한다. 일부 실시형태에서, Cas9 닉카아제와 같은 Cas 닉카아제는 비활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 갖는다.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인만을 함유하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 그 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레아제 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 활성을 갖는 RuvC 도메인을 가지는 닉카아제가 사용된다. 일부 실시형태에서, 비활성 RuvC 도메인을 가지는 닉카아제가 사용된다. 일부 실시형태에서, 감소된 활성을 갖는 HNH 도메인을 가지는 닉카아제가 사용된다. 일부 실시형태에서, 비활성 HNH 도메인을 가지는 닉카아제가 사용된다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소 또는 변경시키기 위해 치환된다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 D10A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기반)를 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등 (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771 참고. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기반)를 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등 (2015) 참고. 추가의 예시적인 아미노산 치환은 D917A, E1006A, 및 D1255A(프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1(FnCpf1) 서열(UniProtKB - A0Q7Q2(CPF1_FRATN) 기반)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 닉카아제를 인코딩하는 mRNA는 각각 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 상보적인 가이드 RNA의 쌍과 조합하여 제공된다. 이 실시형태에서, 가이드 RNA는 닉카아제를 표적 서열로 지향시키고 표적 서열의 반대 가닥 상에 틈을 생성(즉, 이중 닉킹)함에 의해 DSB를 도입한다. 일부 실시형태에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선하고 표적-외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 닉카아제는 DNA의 반대 가닥을 표적화하는 2개의 별도 가이드 RNA와 함께 사용되어 표적 DNA에 이중 틈을 생성한다. 일부 실시형태에서, 닉카아제는 표적 DNA에서 이중 틈을 생성하기 위해 근접하도록 선택된 2개의 별도 가이드 RNA와 함께 사용된다.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 절단효소 및 닉카아제 활성을 결한다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 dCas DNA-결합 폴리펩티드를 포함한다. dCas 폴리펩티드는 본질적으로 촉매(절단효소/닉카아제) 활성을 결하지만 DNA-결합 활성을 가지고 있다. 일부 실시형태에서, dCas 폴리펩티드는 dCas9 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 절단효소 및 닉카아제 활성이 결여된 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 dCas DNA-결합 폴리펩티드는 그의 세포내핵분해 활성 부위가 예를 들어 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 불활성화된 Cas 뉴클레아제(예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)의 버전이다. 예를 들어, US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1 참고.
일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 이종 기능적 도메인을 포함한다(예를 들어, 융합 폴리펩티드이거나 이를 포함한다).
일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 세포의 핵 안으로 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제의 이송을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능적 도메인은 핵 국소화 신호(NLS)일 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 1-10개 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 1-5개 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 하나의 NLS와 융합될 수 있다. 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 그것은 또한 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 서열 내에 삽입될 수 있다. 다른 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 하나 초과의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 2, 3, 4, 또는 5개 NLS와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 2개 NLS와 융합될 수 있다. 특정 상황에서 2개 NLS는 같거나(예를 들어, 2개 SV40 NLS) 다를 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 카르복시 말단에서 연결된 2개 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 2개 NLS와 융합될 수 있으며, 하나는 N-말단에서 그리고 하나는 C-말단에서 연결된다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 3개 NLS와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 NLS 없이 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제의 세포내 반감기를 변형할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 단백질 분해를 위한 신호 펩티드로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 분해는 예를 들어 프로테아좀, 리소좀 프로테아제 또는 칼페인 프로테아제와 같은 단백질 분해 효소에 의해 매개될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴-유사 단백질(UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비-제한적인 예는 소형 유비퀴틴-유사 변형자(SUMO), 유비퀴틴 교차-반응성 단백질(UCRP, 인터페론-자극 유전자-15(ISG15)으로도 공지됨), 유비퀴틴-관련 변형자-1(URM1), 신경-전구체-세포-발현된 발달적으로 하향조절된 단백질-8(NEDD8, S. 세레비지애에서 Rub1로도 지칭됨), 인간 백혈구 항원 F-연관(FAT10), 자가포식-8(ATG8) 및 -12(ATG12), Fau 유비퀴틴-유사 단백질(FUB1), 멤브레인-고정 UBL(MUB), 유비퀴틴 접힘-수정자-1(UFM1) 및 유비퀴틴-유사 단백질-5(UBL5)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비-제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비-제한적인 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire,), 청록색 형광 단백질(예를 들어, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611 mStrawberry, Jred) 및 주황색 형광 단백질(mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 기타 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 비-제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 티오레독신(TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 비오틴 카르복실 캐리어 단백질(BCCP), 폴리-His 및 칼모듈린을 포함한다. 비-제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 특정 소기관, 세포 유형, 조직 또는 기관으로 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 근육으로 표적화할 수 있다.
추가 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 효과기 도메인일 수 있다. RNA-표적화된 엔도뉴클레아제가 그의 표적 서열로 지향될 때, 예를 들어 Cas 뉴클레아제가 gRNA에 의해 표적 서열로 지향될 때, 효과기 도메인은 표적 서열을 변형하거나 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 도메인은 핵산 결합 도메인 또는 뉴클레아제 도메인(예를 들어, 비-Cas 뉴클레아제 도메인)으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능적 도메인은 FokI 뉴클레아제와 같은 뉴클레아제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9,023,649 참고.
gRNA의 효능의 결정
일부 실시형태에서, gRNA의 효능은 RNP를 형성하는 다른 성분과 함께 전달되거나 발현될 때 결정된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9와 같은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 함께 발현된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas 뉴클레아제 또는 닉카아제, 예를 들어, Cas9 뉴클레아제 또는 닉카아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 이미 안정적으로 발현하는 세포주에 전달되거나 세포주에서 발현된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNP의 일부로서 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제 또는 닉카아제, 예를 들어, Cas9 뉴클레아제 또는 닉카아제를 인코딩하는 mRNA와 함께 세포에 전달된다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA의 사용은, 예를 들어 DNA-PK 억제제의 존재에서, 세포의 기구에 의한 수선시 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역의 절제를 생성할 수 있는 DNA의 이중-가닥 파손을 초래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 특정 gRNA의 효능은 시험관내 모델에 기반하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델은 하기 실시예 섹션에 기재된 임의의 이러한 세포주와 같은 표적 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역을 함유하는 세포주이다.
일부 실시형태에서, 특정 gRNA의 효능은 gRNA 선택 과정에 대한 다중 시험관내 세포 모델에 걸쳐 결정된다. 일부 실시형태에서, 선택된 gRNA와 데이터의 세포주 비교가 수행된다. 일부 실시형태에서, 다중 세포 모델에서 교차 스크리닝이 수행된다.
일부 실시형태에서, 특정 gRNA의 효능은 생체내 모델에 기반하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 생체내 모델은 설치류 모델이다. 일부 실시형태에서, 설치류 모델은 확장된 트리뉴클레오티드 반복 또는 자가-상보성 영역을 포함하는 유전자를 발현하는 마우스이다. 유전자는 표 1에 열거된 임의의 유전자의 인간 버전 또는 설치류(예를 들어, 뮤어라인) 상동체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 인간 DMPK이다. 일부 실시형태에서, 유전자는 DMPK의 설치류(예를 들어, 뮤어라인) 상동체이다. 일부 실시형태에서, 생체내 모델은 비-인간 영장류, 예를 들어 시노몰구스 원숭이이다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 효능은 관심 있는 트리뉴클레오티드 반복의 절제량에 의해 측정된다. 절제량은 임의의 적절한 방법, 예를 들어 정량적 시퀀싱; 정량적 PCR; 서던 블롯의 정량적 분석; 등에 의해 결정될 수 있다.
추가 실시형태가 제공된다:
실시형태 1A는 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 방법이다.
실시형태 2A는 자가-상보성 영역을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 자가-상보성 영역에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 자가-상보성 영역을 절제하는 방법이며, 여기서 자가-상보성 영역은 절제된다.
실시형태 3A는 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이며, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제된다.
실시형태 4A 자가-상보성 영역은 회문 서열, 직접 반복, 역전된 반복, GC-풍부 서열, 또는 AT-풍부 서열을 포함하고, 여기서 선택적으로 GC-풍부함 또는 AT-풍부함은 루프-형성 서열에 의해 선택적으로 중단된 적어도 10개 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%인, 실시형태 2A의 방법.
실시형태 5A RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포로 전달되는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법.
실시형태 6A 표적이 (i) TNR 또는 자가-상보성 영역에 있거나 (ii) TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 있는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법.
실시형태 7A TNR이 DMPK 유전자의 3' 비번역된 영역(UTR)에서 CTG인, 실시형태 1A, 3A, 5A, 및 6A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 8A 절제가 근긴장성 이영양증 유형 1(DM1)의 치료를 초래하는, 실시형태 7A의 방법.
실시형태 9A TNR이 헌팅턴, 프라탁신(FXN), 취약 X 정신 지체 1(FMR1), 취약 X 정신 지체 2(FMR2), 안드로겐 수용체(AR), 아리스타리스 관련 호메오박스(ARX), 아탁신 1(ATXN1), 아탁신 2(ATXN2), 아탁신 3(ATXN3), 칼슘 전압-개폐 채널 소단위 알파1 A(CACNA1A), 아탁신 7(ATXN7), ATXN8 반대 가닥 lncRNA(ATXN8OS), 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55kDa 조절 소단위 B 베타 이소형(PPP2R2B), TATA 결합 단백질(TBP) 또는 아트로핀-1(ATN1) 유전자 내에 있거나, 또는 TNR이 FMR2의 5' UTR에 인접하는, 실시형태 1A, 3A, 5A, 및 6A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 10A 헌팅턴(HTT)에서 절제는 헌팅턴병(HD)의 치료를 초래하고; FXN에서 절제는 프리드리히 운동실조(FA)의 치료를 초래하고; FMR1에서 절제는 취약 X 증후군(FXS), 취약 X 연관된 원발성 난소 부전증(FXPOI) 또는 취약 X-연관된 떨림/운동실조 증후군(FXTAS)의 치료를 초래하고; FMR2에서 또는 FMR2의 5' UTR에 인접한 절제는 취약 XE 증후군(FXES)의 치료를 초래하고; AR에서 절제는 X-연결된 척수 및 구근 근위축증(XSBMA)의 치료를 초래하고; ATXN1에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 1(SCA1)의 치료를 초래하고, ATXN2에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 2(SCA2)의 치료를 초래하고, ATXN3에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 3(SCA3)의 치료를 초래하고, CACNA1A에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 6(SCA6)의 치료를 초래하고, ATXN7에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 7(SCA7)의 치료를 초래하고, ATXN8OS에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 8(SCA8)의 치료를 초래하고, PPP2R2B에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 12(SCA12)의 치료를 초래하고, TBP에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 17(SCA17)의 치료를 초래하고, 또는 ATN1에서 절제는 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(DRPLA)의 치료를 초래하는, 실시형태 9A의 방법.
실시형태 11A DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 포함하는 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법.
실시형태 12A 하기를 포함하는 조성물:
스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산으로서, 여기서 스페이서 서열은:
서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
서열번호: 101-4988, 5001-7264, 또는 7301-53372로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 스페이서 서열; 또는
서열번호: 101-4988, 5001-7264 또는 7301-53372로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 스페이서 서열을 포함하거나; 또는
스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은:
서열번호: 2709-4076으로부터 선택되는 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 101-2708로부터 선택되는 제2 스페이서 서열; 또는
서열번호: 2709-4076으로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제1 스페이서 서열 및 서열번호: 101-2708로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제2 스페이서 서열; 또는
서열번호: 2709-4076으로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 101-2708로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 제2 스페이서 서열을 포함하거나; 또는
스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은:
서열번호: 5001-5496으로부터 선택되는 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 5497-6080으로부터 선택되는 제2 스페이서 서열; 또는
서열번호: 5001-5496으로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제1 스페이서 서열 및 서열번호: 5497-6080으로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제2 스페이서 서열; 또는
서열번호: 5001-5496으로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 5497-6080으로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 제2 스페이서 서열을 포함하거나; 또는
스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은:
서열번호: 46597-53028로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 7301-46596으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
서열번호: 46597-53028로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제1 스페이서 서열 및 서열번호: 7301-46596으로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제2 스페이서 서열; 또는
서열번호: 46597-53028로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 7301-46596으로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 제2 스페이서 서열을 포함함.
실시형태 13A는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 실시형태 12A의 조성물이며, 여기서 스페이서 서열은 서열번호 3378, 3354 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 2506, 4010, 4026, 3914, 3938, 3858, 3818, 3794, 3746, 3778, 3770, 3722, 3690, 3658, 3514, 3370, 3418, 3394, 3386, 3802, 3682, 2618, 2594, 2458, 2514, 2258, 2322, 2210, 2194, 2114, 1914, 1778, 1770, 1738, 1706, 1746, 1642, 1538, 2202, 2178, 2170, 또는 2162 중 임의의 하나이다.
실시형태 14A 스페이서 서열이 서열번호: 3378의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 15A 스페이서 서열이 서열번호: 3354의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 16A 스페이서 서열이 서열번호: 3346의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 17A 스페이서 서열이 서열번호: 3330의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 18A 스페이서 서열이 서열번호: 3314의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 19A 스페이서 서열이 서열번호: 2658의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 20A 스페이서 서열이 서열번호: 2690의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 21A 스페이서 서열이 서열번호: 2546의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 22A 스페이서 서열이 서열번호: 2554의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 23A 스페이서 서열이 서열번호: 2498의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 24A 스페이서 서열이 서열번호: 2506의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 25A 스페이서 서열이 서열번호: 4010의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 26A 스페이서 서열이 서열번호: 4026의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 27A 스페이서 서열이 서열번호: 3914의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 28A 스페이서 서열이 서열번호: 3938의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 29A 스페이서 서열이 서열번호: 3858의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 30A 스페이서 서열이 서열번호: 3818의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 31A 스페이서 서열이 서열번호: 3794의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 32A 스페이서 서열이 서열번호: 3746의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 33A 스페이서 서열이 서열번호: 3778의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 34A 스페이서 서열이 서열번호: 3770의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 35A 스페이서 서열이 서열번호: 3272의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 36A 스페이서 서열이 서열번호: 3690의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 37A 스페이서 서열이 서열번호: 3658의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 38A 스페이서 서열이 서열번호: 3514의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 39A 스페이서 서열이 서열번호: 3370의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 40A 스페이서 서열이 서열번호: 3418의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 41A 스페이서 서열이 서열번호: 3394의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 42A 스페이서 서열이 서열번호: 3386의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 43A 스페이서 서열이 서열번호: 3802의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 44A 스페이서 서열이 서열번호: 3682의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 45A 스페이서 서열이 서열번호: 2618의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 46A 스페이서 서열이 서열번호: 2594의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 47A 스페이서 서열이 서열번호: 2458의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 48A 스페이서 서열이 서열번호: 2514의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 49A 스페이서 서열이 서열번호: 2258의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 50A 스페이서 서열이 서열번호: 2322의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 51A 스페이서 서열이 서열번호: 2210의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 52A 스페이서 서열이 서열번호: 2194의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 53A 스페이서 서열이 서열번호: 2114의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 54A 스페이서 서열이 서열번호: 1914의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 55A 스페이서 서열이 서열번호: 1778의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 56A 스페이서 서열이 서열번호: 1770의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 57A 스페이서 서열이 서열번호: 1738의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 58A 스페이서 서열이 서열번호: 1706의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 59A 스페이서 서열이 서열번호: 1746의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 60A 스페이서 서열이 서열번호: 1642의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 61A 스페이서 서열이 서열번호: 1538의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 62A 스페이서 서열이 서열번호: 2202의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 63A 스페이서 서열이 서열번호: 2178의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 64A 스페이서 서열이 서열번호: 2170의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 65A 스페이서 서열이 서열번호: 2162의 서열을 갖는, 실시형태 13A의 조성물.
실시형태 66A 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 포함하는, 실시형태 12A의 조성물로서, 여기서
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3346이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 2554이고; 또는
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3346이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 1498이고; 또는
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3330이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 2554이고; 또는
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3330이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 2498이고; 또는
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3378이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 2546이고; 또는
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3354이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 2546이고; 또는
제1 스페이서 서열은 서열번호: 3354이고, 제2 스페이서 서열은 서열번호: 2506이다.
실시형태 67A RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 더 포함하는, 실시형태 12A의 조성물.
실시형태 68A DNA-PK 억제제를 더 포함하는, 실시형태 12A 또는 67A의 조성물.
실시형태 69A 가이드 RNA가 sgRNA인, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 70A sgRNA가 변형된, 실시형태 69A의 방법 또는 조성물.
실시형태 71A 변형이 하나 이상의 2' 위치 및/또는 포스포디에스테르 연결을 변경하는, 실시형태 70A의 방법 또는 조성물.
실시형태 72A 변형이 sgRNA의 처음 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 실시형태 70A-71A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 73A 변형이 sgRNA의 마지막 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 실시형태 70A-72A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 74A 변형이 포스포로티오에이트 변형, 2'-OMe 변형, 2'-O-moe 변형, 2'-F 변형, 2'-O-메틴-4' 브릿지 변형, 3'-티오포스포노아세테이트 변형 및 2'-데옥시 변형 중 하나 이상을 포함하는, 실시형태 70A-73A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 75A DNA-PK 억제제는 NU7441, KU-0060648, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6인, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 76A DNA-PK 억제제는 화합물 3 또는 화합물 6인, 실시형태 75A의 방법 또는 조성물.
실시형태 77A 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 TNR이 절제되는, 선행하는 실시형태들 중 임의의 방법 또는 조성물.
실시형태 78A 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 40-60, 60-80, 80-100, 100-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-700, 700-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 또는 9000-10,000 TNR이 절제되는, 선행하는 실시형태들 중 임의의 방법 또는 조성물.
실시형태 79A 선행 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 DMPK 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 DMPK 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 증가하는 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 활성; 포스포렘만, 디하이드로피리딘 수용체, 미오제닌, L-유형 칼슘 채널 베타 소단위 및/또는 미오신 포스파타제 표적화 소단위의 인산화 증가; 미오신 포스파타제의 억제 증가; 및/또는 근육 손실, 근육 약화, 과다수면, 하나 이상의 실행 기능 결핍, 인슐린 저항성, 백내장 형성, 대머리, 또는 남성 불임이나 저출산을 개선하는 것 중 하나 이상을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 80A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 HTT 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 HTT 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 선조체 뉴런 상실, 비자발적 운동, 과민성, 우울증, 작은 불수의적 움직임, 빈약한 협응, 새로운 정보를 배우거나 결정을 내리는 데 어려움, 걷기, 말하기 및/또는 삼키기 어려움 및/또는 사고 및/또는 추론 능력에서 감퇴 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 81A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 FMR1 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 FMR1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 FMR1 전사체 또는 취약 X 정신 지체 단백질 수준, 정상적으로 FMRP와 연관된 mRNA의 번역 조절장애, 저하된 수준의 포스포-코필린(CFL1), 증가된 수준의 포스포-코필린 포스파타제 PPP2CA, 뉴런 시냅스로의 감소된 mRNA 이송, HSP27, HSP70 및/또는 CRYAB의 증가된 발현, 라민 A/C 이소형의 비정상적인 세포 분포, 조기-발현 폐경 예컨대 40세 이전의 폐경, 난소 발달 또는 기능에서의 결함, 증강된 수준의 혈청 성선자극호르몬(예를 들어, FSH), 진행성 의도 진전, 파킨슨병, 인지 저하, 전신 뇌 위축, 발기 부전 및/또는 발달 지연 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 82A 선행 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 FMR2 유전자 내에 있거나 FMR2의 5' UTR에 인접하고, 여기서 TNR의 절제는 FMR2 유전자 내 또는 이에 인접한 확장된-반복과 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 하나 이상의 비정상적인 FMR2 발현, 발달 지연, 불량한 눈 접촉, 언어의 반복적 사용, 및 손짓을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 83A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 AR 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 AR 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 AR 발현; 안드로겐 수용체 단백질의 C-말단으로 잘린 단편의 생산; 카스파제-3에 의해 및/또는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통한 안드로겐 수용체 단백질의 단백질분해; CREB-결합 단백질을 포함하는 핵 내포물의 형성; p44/42, p38 및/또는 SAPK/JNK의 비정상적인 인산화; 근육 약화; 근육 소모; 걷기, 삼키기 및/또는 말하기 어려움; 여성형유방; 및/또는 남성 불임 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 84A 선행 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 ATXN1 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 ATXN1을 포함하는 응집체의 형성; 푸르키네 세포사; 운동실조; 근육 경직; 빠르고 비자발적인 안구 운동; 사지 마비, 따끔거림 또는 통증; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 85A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 ATXN2 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN2 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 ATXN2 생산; 푸르키네 세포사; 운동실조; 말하기 또는 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 소모; 통제되지 않은 근육 긴장; 및/또는 비자발적 경련 운동 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 86A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 ATXN3 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN3 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 ATXN3 수준; 비정상적인 베클린-1 수준; 자가포식의 억제; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2의 조절 장애; 운동실조; 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 경직; 통제되지 않은 근육 긴장; 떨림; 불안한 다리 증상; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 87A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 CACNA1A 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 CACNA1A 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 CACNA1A-발현 세포에서 비정상적인 CaV2.1 전압-개폐 칼슘 채널; 운동실조; 말하기 어려움; 비자발적 안구 운동; 이중 시력; 팔 협응의 상실; 떨림; 및/또는 조절되지 않는 근육 긴장 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 88A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 ATXN7 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN7 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 히스톤 아세틸화; 비정상적인 히스톤 탈유비퀴틴화; CRX에 의한 전사활성화의 장애; ATXN7을 포함하는 핵 내포물의 형성; 운동실조; 보행의 불균형; 손, 언어 및/또는 눈 운동의 빈약한 협응; 망막 변성; 및/또는 색소성 황반 이영양증 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 89A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 ATXN8OS 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN8OS 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 ATXN8OS mRNA를 포함하는 리보핵 내포물의 형성; 비정상적인 KLHL1 단백질 발현; 운동실조; 말하기 및/또는 걷기 어려움; 및/또는 비자발적 안구 운동 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 90A 선행 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 PPP2R2B 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 PPP2R2B 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 PPP2R2B 발현; 비정상적인 포스파타제 2 활성; 운동실조; 소뇌 변성; 걷기 어려움; 및/또는 손, 언어 및/또는 안구 운동의 빈약한 협응 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 91A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 TBP 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 TBP 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 전사 개시; 비정상적인 TBP 단백질 축적(예를 들어, 소뇌 뉴런 내); 비정상적인 소뇌 뉴런 세포 사멸; 운동실조; 걷기 어려움; 근육 약화; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 92A 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 여기서 TNR은 ATN1 유전자 내에 있고, 여기서 TNR의 절제는 확장된-반복 ATN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 전사 조절; 비정상적인 ATN1 단백질 축적(예를 들어, 뉴런 내); 비정상적인 뉴런 세포 사멸; 비자발적 운동; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법 또는 조성물.
실시형태 93A 조성물이 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 선행 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 94A 가이드 RNA가 지질 나노입자(LNP)와 회합되거나 바이러스 벡터에 의해 인코딩되는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 95A 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터인, 실시형태 94A의 방법 또는 조성물.
실시형태 96A 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 실시형태 95A의 방법 또는 조성물.
실시형태 97A AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9 벡터이고, 여기서 AAV 다음의 숫자는 AAV 혈청형을 나타내는, 실시형태 96A의 방법 또는 조성물.
실시형태 98A AAV 벡터가 AAV 혈청형 9 벡터인, 실시형태 96A의 방법 또는 조성물.
실시형태 99A 바이러스 벡터가 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 실시형태 94A-98A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 100A 바이러스 벡터가 근육-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터, 또는 SPc5-12 프로모터인, 실시형태 94A-99A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 101A 바이러스 벡터가 뉴런-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 뉴런-특이적 프로모터는 에놀라제 프로모터인, 실시형태 94A-100A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 102A DM1, HD, FA, FXS, FXTAS, FXPOI, FXES, XSBMA, SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA12, SCA17, 또는 DRPLA를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물의 용도.
실시형태 103A DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 화합물 3 또는 화합물 6인 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 104A 자가-상보성 영역을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 자가-상보성 영역으로 또는 그 근처에 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 화합물 3 또는 화합물 6인 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 자가-상보성 영역을 절제하는 방법으로서, 여기서 자가-상보성 영역이 절제되는, 방법.
실시형태 105A TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 화합물 3 또는 화합물 6인 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제되는, 방법.
실시형태 106A DNA-PK 억제제가 화합물 3인, 실시형태 103A 또는 105A의 방법.
실시형태 107A TNR이 프라탁신 유전자 내에 있는, 실시형태 106A의 방법.
실시형태 108A DNA-PK 억제제가 화합물 6인, 실시형태 103A 또는 105A의 방법.
실시형태 109A TNR이 DMPK 유전자의 3' UTR 내 CTG인, 실시형태 108A의 방법.
실시형태 110A TNR이 프라탁신 유전자 내에 있는, 실시형태 108A의 방법.
실시형태 111A RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포로 전달되는, 실시형태 103A-110A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 112A DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호 3378, 3354, 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 2506, 4010, 4026, 3914, 3938, 3858, 3818, 3794, 3746, 3778, 3770, 3722, 3690, 3658, 3514, 3370, 3418, 3394, 3386, 3802, 3682, 2618, 2594, 2458, 2514, 2258, 2322, 2210, 2194, 2114, 1914, 1778, 1770, 1738, 1706, 1746, 1642, 1538, 2202, 2178, 2170, 또는 2162 중 어느 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 113A TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호 3378, 3354, 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 2506, 4010, 4026, 3914, 3938, 3858, 3818, 3794, 3746, 3778, 3770, 3722, 3690, 3658, 3514, 3370, 3418, 3394, 3386, 3802, 3682, 2618, 2594, 2458, 2514, 2258, 2322, 2210, 2194, 2114, 1914, 1778, 1770, 1738, 1706, 1746, 1642, 1538, 2202, 2178, 2170, 또는 2162 중 어느 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제되는, 방법.
실시형태 114A DNA-PK 억제제가 전달되는, 실시형태 112A 또는 113A의 방법.
실시형태 115A DNA-PK 억제제가 화합물 6인, 실시형태 114A의 방법.
실시형태 116A 스페이서 서열이 서열번호: 3378의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 117A 스페이서 서열이 서열번호: 3354의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 118A 스페이서 서열이 서열번호: 3346의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 119A 스페이서 서열이 서열번호: 3330의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 120A 스페이서 서열이 서열번호: 3314의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 121A 스페이서 서열이 서열번호: 2658의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 122A 스페이서 서열이 서열번호: 2690의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 123A 스페이서 서열이 서열번호: 2546의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 124A 스페이서 서열이 서열번호: 2554의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 125A 스페이서 서열이 서열번호: 2498의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 126A 스페이서 서열이 서열번호: 2506의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 127A 스페이서 서열이 서열번호: 4010의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 128A 스페이서 서열이 서열번호: 4026의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 129A 스페이서 서열이 서열번호: 3914의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 130A 스페이서 서열이 서열번호: 3938의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 131A 스페이서 서열이 서열번호: 3858의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 132A 스페이서 서열이 서열번호: 3818의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 133A 스페이서 서열이 서열번호: 3794의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 134A 스페이서 서열이 서열번호: 3746의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 135A 스페이서 서열이 서열번호: 3778의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 136A 스페이서 서열이 서열번호: 3770의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 137A 스페이서 서열이 서열번호: 3722의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 138A 스페이서 서열이 서열번호: 3690의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 139A 스페이서 서열이 서열번호: 3658의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 140A 스페이서 서열이 서열번호: 3514의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 141A 스페이서 서열이 서열번호: 3370의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 142A 스페이서 서열이 서열번호: 3418의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 143A 스페이서 서열이 서열번호: 3394의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 144A 스페이서 서열이 서열번호: 3386의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 145A 스페이서 서열이 서열번호: 3802의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 146A 스페이서 서열이 서열번호: 3682의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 147A 스페이서 서열이 서열번호: 2618의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 148A 스페이서 서열이 서열번호: 2594의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 149A 스페이서 서열이 서열번호: 2458의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 150A 스페이서 서열이 서열번호: 2514의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 151A 스페이서 서열이 서열번호: 2258의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 152A 스페이서 서열이 서열번호: 2322의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 153A 스페이서 서열이 서열번호: 2210의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 154A 스페이서 서열이 서열번호: 2194의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 155A 스페이서 서열이 서열번호: 2114의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 156A 스페이서 서열이 서열번호: 1914의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 157A 스페이서 서열이 서열번호: 1778의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 158A 스페이서 서열이 서열번호: 1770의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 159A 스페이서 서열이 서열번호: 1738의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 160A 스페이서 서열이 서열번호: 1706의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 161A 스페이서 서열이 서열번호: 1746의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 162A 스페이서 서열이 서열번호: 1642의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 163A 스페이서 서열이 서열번호: 1538의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 164A 스페이서 서열이 서열번호: 2202의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 165A 스페이서 서열이 서열번호: 2178의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 166A 스페이서 서열이 서열번호: 2170의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 167A 스페이서 서열이 서열번호: 2162의 서열을 갖는, 실시형태 112A-115A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 168A RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포로 전달되는, 실시형태 112A-167A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 169A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3346 및 2554의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 170A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3346 및 2498의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 171A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3330 및 2554의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 172A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3330 및 2498의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 173A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3378 및 2546의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 174A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3378 및 2506의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 175A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3354 및 2546의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 176A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 3354 및 2506의 서열을 갖는, 실시형태 168A의 방법.
실시형태 177A FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 5830, 6022, 5070, 5310, 5334, 5622, 5926, 5950, 또는 5998 중 어느 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 178A TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 5830, 6022, 5070, 5310, 5334, 5622, 5926, 5950, 또는 5998 중 어느 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제되는, 방법.
실시형태 179A DNA-PK 억제제가 전달되는, 실시형태 177A 또는 178A의 방법.
실시형태 180A 스페이서 서열은 서열번호: 5830의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 181A 스페이서 서열은 서열번호: 6022의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 182A 스페이서 서열은 서열번호: 5070의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 183A 스페이서 서열은 서열번호: 5310의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 184A 스페이서 서열은 서열번호: 5334의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 185A 스페이서 서열은 서열번호: 5622의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 186A 스페이서 서열은 서열번호: 5926의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 187A 스페이서 서열은 서열번호: 5950의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 188A 스페이서 서열은 서열번호: 5998의 서열을 갖는, 실시형태 177A-179A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 189A RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포로 전달되는, 실시형태 177A-188A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 190A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 5830 및 5070의 서열을 갖는, 실시형태 189A의 방법.
실시형태 191A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 6022 및 5310의 서열을 갖는, 실시형태 189A의 방법.
실시형태 192A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 5622 및 5070의 서열을 갖는, 실시형태 189A의 방법.
실시형태 193A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 5926 및 5070의 서열을 갖는, 실시형태 189A의 방법.
실시형태 194A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 5950 및 5070의 서열을 갖는, 실시형태 189A의 방법.
실시형태 195A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 5998 및 5070의 서열을 갖는, 실시형태 189A의 방법.
실시형태 196A FXN 유전자의 인트론에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 16690, 34442, 45906, 15994, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047 또는 49986 중 임의의 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 방법.
실시형태 197A TNR을 포함하는 세포에 i) 서열번호: 16690, 34442, 45906, 15994, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 또는 49986 중 어느 하나의 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) 선택적으로 DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제되는, 방법.
실시형태 198A DNA-PK 억제제가 전달되는, 실시형태 196A 또는 197A의 방법.
실시형태 199A DNA-PK 억제제가 화합물 3인, 실시형태 198A의 방법.
실시형태 200A 스페이서 서열이 서열번호: 16690의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 201A 스페이서 서열이 서열번호: 34442의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 202A 스페이서 서열이 서열번호: 45906의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 203A 스페이서 서열이 서열번호: 15994의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 204A 스페이서 서열이 서열번호: 52666의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 205A 스페이서 서열이 서열번호: 51322의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 206A 스페이서 서열이 서열번호: 46599의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 207A 스페이서 서열이 서열번호: 49986의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 208A 스페이서 서열이 서열번호: 52898의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 2096A 스페이서 서열이 서열번호: 26546의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 210A 스페이서 서열이 서열번호: 7447의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 211A 스페이서 서열이 서열번호: 47047의 서열을 갖는, 실시형태 196A-199A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 212A RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포에 전달되는, 실시형태 196A-211A 중 어느 하나의 방법.
실시형태 213A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 52898 및 26546의 서열을 갖는, 실시형태 212A의 방법.
실시형태 214A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 47047 및 7447의 서열을 갖는, 실시형태 212A의 방법.
실시형태 215A 제1 및 제2 스페이서는 서열번호: 52666 및 15994의 서열을 갖는, 실시형태 212A의 방법.
실시형태 216A 단 하나의 gRNA 또는 단 하나의 gRNA를 인코딩하는 벡터가 제공되거나 전달되는, 실시형태 1A-4A, 6A-167A, 177A-188A, 또는 196A-211A 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
실시형태 1B는 하기를 포함하는 조성물임:
스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 하기를 포함하는, 조성물:
i. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 또는 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열; 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 또는 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 및/또는
ii. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 또는 4506으로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 또는 4992로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 갖는 제2 스페이서 서열; 및/또는
iii. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 또는 4506으로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 또는 4992로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제2 스페이서 서열.
실시형태 2B는 하기를 포함하는 조성물임:
스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 하기를 포함하는, 조성물:
iv. 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906 또는 3746으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 또는 2210으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 및/또는
v. 서열번호: 3256, 2896, 3136, 또는 3224로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 또는 616으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 및/또는
vi. 서열번호: 3778 및 1778; 3778 및 1746; 3778 및 1770; 3778 및 1586; 3778 및 1914; 3778 및 2210; 4026 및 1778; 4026 및 1746; 4026 및 1770; 4026 및 1586; 4026 및 1914; 4026 및 2210; 3794 및 1778; 3794 및 1746; 3794 및 1770; 3794 및 1586; 3794 및 1586; 3794 및 1914; 3794 및 2210; 4010 및 1778; 4010 및 1770; 4010 및 1746; 4010 및 1586; 4010 및 1914; 4010 및 2210; 3906 및 1778; 3906 및 1778; 3906 및 1746; 3906 및 1770; 3906 및 1586; 3906 및 1914; 3906 및 2210; 3746 및 1778; 3746 및 1746; 3746 및 1770; 3746 및 1586; 3746 및 1914; 또는 3746 및 2210으로부터 선택된 제1 스페이서 서열 및 제2 스페이서 서열; 및/또는
vii. 서열번호: 3256 및 4989; 3256 및 984; 3256 및 616; 2896 및 4989; 2896 및 672; 2896 및 760; 3136 및 4989; 3136 및 560; 3224 및 4989; 3224 및 976; 또는 3224 및 760으로부터 선택된 제1 스페이서 서열 및 제2 스페이서 서열.
실시형태 3B는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 실시형태 1B 또는 2B의 조성물이다.
실시형태 4B는 가이드 RNA가 sgRNA인, 선행하는 실시형태 중 임의의 것의 조성물이다.
실시형태 5B는 sgRNA가 변형된, 실시형태 4B의 조성물이다.
실시형태 6B는 변형이 하나 이상의 2' 위치 및/또는 포스포디에스테르 연결을 변경시키는, 실시형태 5B의 조성물이다.
실시형태 7B는 변형이 sgRNA의 처음 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경시키는, 실시형태 5B-6B 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 8B는 변형이 sgRNA의 마지막 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경시키는, 실시형태 5B-7B 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 9B는 변형이 포스포로티오에이트 변형, 2'-OMe 변형, 2'-O-MOE 변형, 2'-F 변형, 2'-O-메틴-4' 브릿지 변형, 3'-티오포스포노아세테이트 변형 및 2'-데옥시 변형 중 어느 하나를 포함하는, 실시형태 5B-8B 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 10B는 조성물이 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 11B는 가이드 RNA가 지질 나노입자(LNP)와 회합되거나 바이러스 벡터에 의해 인코딩되는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 12B는 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터인, 실시형태 11B의 조성물이다.
실시형태 13B는 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 실시형태 12B의 조성물이다.
실시형태 14B는 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, AAVrh74, 또는 AAV9 벡터이고, 여기서 AAV 다음의 숫자는 AAV 혈청형을 나타내는, 실시형태 13B의 조성물이다.
실시형태 15B는 AAV 벡터가 AAV 혈청형 9 벡터인, 실시형태 14B의 조성물이다.
실시형태 16B는 바이러스 벡터가 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 실시형태 11B-15B 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 17B는 바이러스 벡터가 근육-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터, 또는 SPc5-12 프로모터인, 실시형태 11B-16B 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 18B는 바이러스 벡터가 뉴런-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 뉴런-특이적 프로모터는 에놀라제 프로모터인, 실시형태 11B-17B 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 19B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 560의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 20B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 584의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 21B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 608의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 22B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 616의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 23B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 656의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 24B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 672의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 25B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 688의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 26B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 696의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 27B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 712의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 28B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 744의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 29B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 752의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 30B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 760의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 31B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 840의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 32B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 864의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 33B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 960의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 34B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 976의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
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실시형태 36B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1008의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 37B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1056의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 38B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1128의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 39B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1136의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 40B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1152의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 41B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1224의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 42B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1240의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 43B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1272의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 44B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1338의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 45B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1346의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 46B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1370의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 47B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1378의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 48B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1386의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 49B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1394의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 50B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1402의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 51B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1410의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 52B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1418의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 53B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1426의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 54B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1434의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 55B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1442의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 56B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1458의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 57B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1474의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 58B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1482의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 59B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1490의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 60B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1498의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 61B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1514의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 62B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1538의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 63B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1546의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 64B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1554의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 65B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1562의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 66B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1578의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 67B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1586의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 68B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1594의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 69B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1602의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 70B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1610의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 71B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1626의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 72B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1634의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 73B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1642의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 74B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1650의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 75B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1658의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 76B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1690의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 77B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1706의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 78B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1714의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 79B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1738의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 80B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1746의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 81B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1770의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 82B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1778의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 83B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1786의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 84B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1802의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 85B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1810의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 86B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1818의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 87B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1826의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 88B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1834의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 89B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1842의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 90B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1850의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 91B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1890의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 92B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1914의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
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실시형태 94B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1938의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 95B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1946의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 96B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1962의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 97B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1970의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 98B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1978의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 99B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1986의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 100B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 1994의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 101B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2010의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 102B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2018의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 103B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2026의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
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실시형태 110B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2162의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 111B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2170의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
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실시형태 132B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2434의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 133B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2442의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 134B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2458의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 135B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2466의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 136B는 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2474의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
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실시형태 237B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4010의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 238B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4018의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 239B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4026의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 240B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4034의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 241B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4042의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 242B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4208의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 243B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4506의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 244B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4989의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 245B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4990의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 246B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4991의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 247B는 제1 스페이서 서열이 서열번호: 4992의 서열을 갖는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 248B는 DM1을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약품의 제조를 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 조성물의 용도이다.
실시형태 249B는 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 근이영양증을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 DMPK 유전자의 3' UTR에서 TNR을 포함하는 세포에 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 전달하는 것을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 하기를 포함한다:
i. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 또는 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 또는 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; 및 ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산.
실시형태 250B는 DMPK 유전자의 3' UTR에서 TNR을 포함하는 세포에 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 전달하는 것을 포함하는 DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법이며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 하기를 포함한다:
ii. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 또는 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 또는 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산; 및 ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제됨.
실시형태 251B는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 제1 및 제2 스페이서를 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 세포로 전달되는, 실시형태 249B-250B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 252B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3778 및 1778의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 253B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3778 및 1746의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 254B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3778 및 1770의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 255B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3778 및 1586의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 256B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3778 및 1914의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 257B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3778 및 2210의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 258B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4026 및 1778의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 259B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4026 및 1746의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 260B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4026 및 1770의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 261B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4026 및 1586의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 262B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4026 및 1914의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 263B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4026 및 2210의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 264B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3794 및 1778의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 265B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3794 및 1746의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 266B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3794 및 1770의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 267B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3794 및 1586의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 268B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3794 및 1914의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 269B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3794 및 2210의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 270B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4010 및 1778의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 271B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4010 및 1746의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 272B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4010 및 1770의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 273B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4010 및 1586의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 274B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4010 및 1914의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 275B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 4010 및 2210의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 276B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3906 및 1778의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 277B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3906 및 1746의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 278B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3906 및 1770의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 279B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3906 및 1586의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 280B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3906 및 1914의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 281B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3906 및 2210의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 282B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3746 및 1778의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 283B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3746 및 1746의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 284B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3746 및 1770의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 285B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3746 및 1586의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 286B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3746 및 1914의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 287B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3746 및 2210의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 288B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 4989의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 289B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 560의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 290B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 672의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 291B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 976의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 292B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 760의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 293B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 984의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 294B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3256 및 616의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 295B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 4989의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 296B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 560의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 297B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 672의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 298B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 976의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 299B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 760의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 300B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 984의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 301B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 2896 및 616의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 302B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 4989의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 303B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 560의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 304B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 672의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 305B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 976의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 306B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 760의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 307B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 984의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 308B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3136 및 616의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 309B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 4989의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 310B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 560의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 311B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 672의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 312B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 976의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 313B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 760의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 314B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 984의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 315B는 제1 및 제2 스페이서 서열이 서열번호: 3224 및 616의 서열을 갖는, 실시형태 249B-251B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 316B는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 실시형태 249B-315B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 317B는 가이드 RNA가 sgRNA인, 실시형태 249B-316B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 318B는 sgRNA가 변형된, 실시형태 317B의 방법이다.
실시형태 319B는 변형이 하나 이상의 2' 위치 및/또는 포스포디에스테르 연결을 변경하는, 실시형태 318B의 방법이다.
실시형태 320B는 변형이 sgRNA의 처음 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 실시형태 318B-319B의 방법이다.
실시형태 321B는 변형이 sgRNA의 마지막 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 실시형태 318B-320B의 방법이다.
실시형태 322B는 변형이 포스포로티오에이트 변형, 2'-OMe 변형, 2'-O-MOE 변형, 2'-F 변형, 2'- O-메틴-4' 브릿지 변형, 3'-티오포스포노아세테이트 변형 및 2'-데옥시 변형 중 하나 이상을 포함하는, 실시형태 318B-321B의 방법이다.
실시형태 323B는 조성물이 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 실시형태 249B-322B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 324B는 가이드 RNA가 지질 나노입자(LNP)와 회합되거나 바이러스 벡터에 의해 인코딩되는, 실시형태 249B-323B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 325B는 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터인, 실시형태 324B의 방법이다.
실시형태 326B는 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 실시형태 325B의 방법이다.
실시형태 327B는 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, AAVrh74, 또는 AAV9 벡터이고, 여기서 AAV 다음의 숫자는 AAV 혈청형을 나타내는, 실시형태 326B의 방법이다.
실시형태 328B는 AAV 벡터가 AAV 혈청형 9 벡터인, 실시형태 327B의 방법이다.
실시형태 329B는 바이러스 벡터가 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 실시형태 324B-328B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 330B는 바이러스 벡터가 근육-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터, 또는 SPc5-12 프로모터인, 실시형태 324B-329B 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 331B는 바이러스 벡터가 뉴런-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 뉴런-특이적 프로모터는 에놀라제 프로모터인, 실시형태 324B-330B 중 어느 하나의 방법이다.
실시예
다음 실시예는 특정 개시된 실시형태를 예시하기 위해 제공되고 어떤 식으로든 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
1. 재료 및 방법
가이드 RNA 및 프라이머 서열. 프라이머 서열은 추가 서열의 표에 제시되어 있다. Cas9 가이드 RNA는 단일 가이드 형식(sgRNA)으로 달리 표시되지 않는 한 이중 가이드(dgRNA) 형식으로 사용되었다. crRNA는 추가 서열의 표에 열거된 스페이서 서열을 함유하고 IDT로부터 AltR-crRNA로 획득되었다. SpCas9와 함께 사용된 tracrRNA는 AltR-tracrRNA(IDT 카탈로그 번호 1072534)였다.
섬유아세포 불멸화. 2x105 섬유아세포(GM04033 및 GM07492, Coriell Institute)를 6웰 플레이트에 접종했다. 다음날 섬유아세포는 10ug/mL 폴리브렌을 갖는 hTERT-네오 렌티바이러스로 MOI 5에서 형질도입되었다. 배지는 형질도입 24시간 후에 변경되었다. 세포는 MEM+15% FBS+NEAA에서 형질도입 48시간 후 0.5mg/ml G418로 선택되었다.
불멸화된 섬유아세포 전기천공 & DNA-PK 억제제 처리(쌍을 이룬 가이드). 200uM crRNA(IDTE에 재현탁됨, IDT 카탈로그 번호 11-01-02-05) 및 200uM tracrRNA(IDT 듀플렉스 완충액에 재현탁됨, 카탈로그 번호 11-01-03-01)를 1:1로 혼합하고 사전-어닐링했다(95℃에서 5분 인큐베이션된 다음 실온으로 냉각됨). 달리 명시되지 않는 한, RNP 어셈블리는 2μL의 100μM 사전-어닐링된 5' 가이드, 2μL의 100μM 사전-어닐링된 3' 가이드 및 2μL의 가이드의 쌍이 사용된 뉴클레아제, 또는 4μL의 100μM 사전-어닐링된 가이드 및 2μL의 단 하나의 가이드만 사용된 뉴클레아제를 사용하여 수행되었다. 각 RNP는 삼중으로 어셈블리되었다. SpCas9(IDT) 스톡 용액은 10ug/ul의 농도를 가졌다.
가이드(100uM 사전-어닐링됨) 및 SpCas9 단백질(10ug/ul IDT)을 1.7ml 에펜도르프 튜브에서 각 뉴클레오펙션에 대해 혼합하고 실온에서 ~10분 동안 인큐베이션하여 RNP를 사전-어셈블리했다. (참고: 실험은 일반적으로 각 조건에 대해 생물학적 삼중으로 수행되었다.)
20ul의 P2 뉴클레오펙션 용액(Lonza, 카탈로그 번호 V4XP-2032; 실온으로 예열되고 포함된 보충제를 첨가함에 의해 제조됨)을 각 RNP 혼합물에 첨가하였다.
세포 제조: 04033 hTert-형질전환된 DM1 환자 섬유아세포 및 7492 hTert-형질전환된 건강한 대조군 섬유아세포를 T175 플라스크에서 융합될 때까지 팽창시켰다. 세포를 PBS-로 1x 세정하고, 5ml의 1x TrypLE 익스프레스로 7분간 처리하고, 25ml의 혈청-함유 배지(GlutaMAX를 갖는 MEM, 15% FBS, 1xNEAA)에서 세정하였다.
세포를 500g에서 5분 동안 회전시키고 새로운 배지에 재-현탁시켰다. 현탁액을 44uM 필터를 통해 여과하여 단일 세포 현탁액을 보장했다. 세포를 계수하고 15ml 원뿔형 튜브에서 전기천공 조건당 ~300K로 분취했다. 모든 분취량을 500g에서 5분 동안 펠렛화하고 뉴클레오펙션 직전에 배지를 제거했다.
뉴클레오펙션: 20ul의 RNP/P2 혼합물을 사용하여 300K 세포 펠렛을 재현탁하고 생성된 현탁액을 16웰 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 다음 설정으로 론자 X-유닛(Lonza Bioscience) 상에서 뉴클레오펙션을 수행했다: 용액 P2 및 펄스 코드 EN150.
도말(plating): 각 뉴클레오펙션된 웰(20ul 중 ~300K 세포)을 1ml의 미리-가온된 (1) 평범한 배지 또는 (2) 10uM 화합물 6이 보충된 배지를 함유하는 12-웰 플레이트(웰당 8ul)의 2개 웰로 분할했다. 배지는 도말 24시간 후 모든 웰에서 (화합물 6이 없는) 평범한 배지로 변경되었다. 세포는 대부분의 웰이 합류에 가까워질 때까지 3일마다 배지 교체로 10일 동안 팽창했다.
수확: 뉴클레오펙션 후 10일차에 세포를 PBS-로 1x 세정하고, 200ul의 1X TrypLE 익스프레스로 7분 동안 처리하고, 2ml의 혈청-함유 배지에서 세정했다. 세포를 500g에서 5분 동안 펠렛화하고 1ml의 신선한 배지에 재-현탁시켰다.
CUG 초점 FISH 검정: 세포를 계수하고 웰당 5K 세포로 사중으로 384웰 고함량 이미징 플레이트에 도말하였다. 세포는 고정 전에 밤새 부착되도록 하였다.
유전자형 분석을 위한 샘플의 준비: 100ul의 세포 현탁액을 500g에서 5분 동안 1.7ml 튜브에서 펠렛화했다. 세포 펠렛을 100ul의 Lucigen QuickExtract 완충액에 재-현탁하고 65℃에서 15분 동안 용리시킨 다음 98℃에서 2분 동안 열 불활성화시켰다. 추출물은 -80℃에서 보관되었다.
스플라이싱 검정을 위한 샘플의 준비: 모든 나머지 세포를 500g에서 5분 동안 1.7ml 튜브에 펠렛화했다. 배지를 제거하고 펠렛을 RNA 처리될 때까지 동결시켰다.
유전자형 분석: PCR 마스터믹스를 20ul 반응에 대해 다음과 같이 제조했다: 10ul Phusion 2x 마스터 믹스, 1ul 10uM DMPK-nest-F 프라이머, 1ul 10uM DMPK-nest-R 프라이머, 7ul의 물. QuickExtract DNA 추출 완충액에서 샘플 3ul를 각 반응에 대한 마스터 믹스 17ul에 추가했다. 사이클링은 터치다운 프로그램으로 수행되었다: 30초 동안 98℃, 그 다음 10초 동안 98℃에서 용융, 10초 동안 72℃에서 어닐링(주기당 0.5C씩 감소), 30초 동안 72℃에서 팽창의 8주기. 10초 동안 98℃, 10초 동안 68℃, 30초 동안 72℃의 27주기가 이어졌다. 10분 동안 72℃에서 최종 팽창. 생성물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석되었다.
전기천공 & DNAPK-I 처리(개별 가이드)
프로토콜은 본 명세서에 표시된 것을 제외하고 쌍을 이룬 가이드 프로토콜에 대해 상기에서 기술된 바와 같다. P3 용액 및 펄스 코드 CA137을 사용하여 전기천공을 수행하고 10uM 화합물 6을 포함하거나 포함하지 않는 24웰 플레이트에서 성장시켰다. RNP 어셈블리는 상기에서 기술된 바와 같이 4μL 사전-어닐링된 100μM 가이드 및 2μL Cas9를 사용하여 수행했다. 수확: 뉴클레오펙션 48시간 후, 세포를 PBS-로 1x 세정하고, 200ul의 1X TrypLE 익스프레스로 7분 동안 처리하고, 2ml의 혈청-함유 배지에서 세정했다. 세포를 500g에서 5분 동안 펠렛화하고 1ml의 신선한 배지에 재-현탁시켰다.
유전자형 분석을 위해 50ul의 세포 현탁액을 500g에서 5분 동안 1.7ml 튜브에 펠렛화했다. 세포 펠렛을 100ul의 Lucigen QuickExtract 완충액에 재-현탁하고 65℃에서 15분 동안 용리한 다음 98℃에서 2분 동안 열 불활성화했다. 추출물은 -80℃에서 보관했다.
형광 제자리 혼성화(FISH)/IF 공동-염색
MBNL1/(CUG)n 초점 영상화는 DM1 섬유아세포에서 DMPK 가이드 RNA로 CTG 반복 절제를 평가하기 위한 직교 방법으로 사용되었다.
세포를 4% PFA로 실온에서 15분 동안 고정하고 실온에서 1x PBS에서 10분 동안 5회 세정했다. 즉시 프로빙하지 않으면 세포를 4℃에서 보관했다.
형광 제자리 혼성화(FISH) 절차를 위해, 세포를 실온에서 5분 동안 1x PBS에서 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화시켰다.
세포를 실온에서 10분 동안 30% 포름아미드, 2x SSC로 미리 세정하였다. 그런 다음 세포를 37℃에서 2시간 동안 30% 포름아미드, 2x SSC, 2ug/mL BSA, 66ug/mL 효모 tRNA, 2mM 바나딜 복합체에서 1ng/uL의 Alexa546-(CAG)10 프로브로 프로빙했다.
그런 다음 세포를 42℃에서 30% 포름아미드, 2x SSC에서 30분 동안, 그 다음 37℃에서 30% 포름아미드, 2x SSC에서 30분 동안, 그 다음 실온에서 10분 동안 1x SSC에서, 그리고 마지막으로 실온에서 10분 동안 1x PBS에서 세정하였다. 다음으로 세포를 1x PBS + 1% BSA에서 항-MBNL1 항체(1:1000 희석, santacruz, 3A4)로 4℃에서 밤새 프로빙했다. 세포를 1x PBS로 실온에서 10분 동안 2회 세정하였다. 세포를 1x PBS + 1% BSA(1:500 희석)에서 염소 항-토끼 Alexa 647로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 1x PBS로 실온에서 10분 동안 2회 세정하였다. 세포를 Hoechst 용액(0.1mg/ml)으로 5분 동안 염색한 다음 1x PBS로 5분 동안 한 번 세정했다.
PBS를 흡인하고 웰당 신선한 PBS(100ul)를 첨가하였다. 이미징 플레이트를 접착성 알루미늄 호일로 밀봉하고 MetaXpress(Molecular Devices)를 사용하여 이미징했다.
iPS 세포의 전기천공
iPS 세포 안으로의 전기천공을 위한 SpCas9 RNP를 다음과 같이 제조하였다. SpCas9 crRNA를 IDTE에서 200μM로 재현탁하고 tracrRNA는 듀플렉스 완충액에서 200μM로 재현탁하였다. 동일한 양의 200uM crRNA 및 200uM tracrRNA를 PCR 튜브에서 혼합하고 95℃로 가열하고 실온으로 냉각하여 100μM에서의 가이드 복합체를 제공했다.
Cpf1 가이드를 IDTE 내 100mM에서 재현탁하였다.
도 22에 상응하는 실험을 위한 RNP 복합체는 각각 2μL의 5' 가이드, 3' 가이드 및 뉴클레아제를 어셈블링하여 제조하였다.
도 24에 상응하는 실험을 위한 RNP 복합체는 각각 4μL의 5' 가이드 및 3' 가이드(또는 하나의 가이드만 사용된 경우 8μL의 하나의 가이드) 및 3μL의 뉴클레아제를 어셈블링하여 제조되었다.
세포 펠렛을 100ul의 사전-혼합된 P3 뉴클레오펙션 용액에 재현탁하고 사전-어셈블링된 RNP를 함유하는 튜브로 옮겼다. 100ul의 RNP/세포 혼합물을 뉴클레오펙션 큐벳으로 옮겼다. 용액 P3 및 펄스 코드 CA137에 대해 설정된 Lonza X-유닛을 사용하여 뉴클레오펙션을 수행하였다. 세포는 큐벳으로부터 Laminin-코팅된 플레이트에서 예열된 배지로 즉시 이동되어 통증 배지 또는 3uM 화합물 6(도 24에 상응하는 실험의 경우) 또는 1μM 화합물 3(도 22 및 23에 상응하는 실험의 경우)이 보충된 배지 사이에 각 뉴클레오펙션을 분할하였다. 다음날, 배지는 StemFlex + 10uM 록 억제제로 변경하였다. 그 다음날, 배지는 록 억제제가 없는 StemFlex로 다시 변경하였다. 배양은 총 5일 동안 계속되었다.
ReLeSR을 사용하여 37℃에서 6분 동안 세포를 단리하고 2ml StemFlex로 세정했다. 추가 배양 및 클론 단리를 위해 200μl를 2ml StemFlex + 4ul Lamin 411이 있는 새로운 6-웰 디쉬 안으로 계대시켰다. 나머지는 다음과 같이 1.7ml 튜브 안으로 분할되었다: 단백질을 위해 600ul; 및 DNA 추출을 위해 100ul.
제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen 혈액 및 조직 키트를 사용하여 DNA를 추출했다. 유전자형 분석은 중첩 PCR로 수행되었다:
PCR1:
프라이머: GDO_FA_F7 및 GDO_FA_R7
Figure pct00121
사이클링 조건:
Figure pct00122
완료에 이어서, PCR을 1:10으로 희석하고 2ul를 다음 반응(PCR2)에서 투입물로 사용했다:
프라이머: GDO_FA_F2 및 GDO_FA_R2
Figure pct00123
사이클링 조건:
Figure pct00124
생성물을 2% 아가로스 겔에서 분석했다.
심근세포 분화 프로토콜
심근세포를 다음과 같이 제조하였다. iPSC의 배양물은 흡인에 의해 분화된 세포로부터 정제된 다음, 아큐타제로 처리되었다. 세포를 ROCKi(10uM 최종 농도)가 있는 StemFlex에 ㎠당 0.133 X 106 세포로 도말하고 2일 동안 StemFlex를 공급했다. 그런 다음("0일차"에) 배지를 소분자 CHIR99021(StemCell Tech. 카탈로그 번호 72052)을 갖는 RPMI/B27 -인슐린으로 변경했다(농도는 라인에 따라 다름). 1-3일차 동안 배지를 RPMI/B27 -인슐린으로 변경했다. 3-5일차 동안 배지를 소분자 IWP2(Tocris 카탈로그 번호 3533)(5uM)가 있는 RPMI/B27 -인슐린으로 변경했다. 5-7일차 동안 배지를 RPMI/B27 -인슐린으로 변경했다. 7-11일차 동안 배지를 RPMI/B27 +인슐린으로 변경했다. 11-15일차 동안 배지를 CDM3L로 변경했다:
Figure pct00125
심근세포 뉴클레오펙션 프로토콜
플레이트는 다음과 같이 제조되었다. 1mg/ml 피브로넥틴을 PBS에서 1:100으로 희석하고 24-웰 플레이트 내 웰당 200ul를 첨가했다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 두었다. 피브로넥틴을 제거하고 500ul의 iCell 심근세포 유지 배지를 각 웰에 첨가하고 37℃로 예열했다.
RNP는 본질적으로 섬유아세포 실험에 대해 상기에 기술된 절차에 따라 제조되었다. RNP 복합체 어셈블리에 이어서, 20ul의 P3 용액(추가된 보충 있음)을 각 RNP에 추가하고 1ul의 전기천공 인핸서(IDT)를 각 RNP 혼합물에 추가했다.
세포를 제조하기 위해, 배지는 6-웰 디쉬에서 성장한 iPSC-유래 심근세포로부터 흡인되고 세포는 웰당 2ml PBS로 1X 세정되었다. 1ml의 TrypLE™ 선택 효소(10X)가 웰당 첨가되고 세포는 37℃에서 10분 동안 인큐베이션되었다.
세포를 부드럽게 피펫팅하고 6웰 플레이트에서 웰당 1ml FBS + 8ml PBS를 갖는 15mL 튜브에 첨가하여 TrypLE 효소를 불활성화시켰다. 세포를 1000RPM에서 5분 동안 회전시키고 PBS를 흡인하고 세포를 신선한 iCell 심근세포 유지 배지에 재현탁시켰다. 세포를 100um 필터를 통해 50mL 튜브로 통과시키고, 이를 통해 재현탁된 세포를 천천히 피펫팅했다. 세포를 계수하고 15ml 튜브에서 뉴클레오펙션당 ~100K 심근세포를 분취했다. 세포를 1000RPM에서 5분 동안 펠렛화하고 뉴클레오펙션 이전에 배지를 제거했다.
20ul의 RNP/P3 혼합물을 사용하여 ~100k 세포 펠렛을 재현탁하고 현탁액을 16웰 전기천공 큐벳으로 옮겼다. P3 및 펄스 코드 CA137로 설정된 용액을 갖는 Lonza X-유닛에서 뉴클레오펙션을 수행했다. 뉴클레오펙션 후 세포를 준비된 24웰 플레이트에 도말하고 수확 이전 48시간 동안 재도포했다.
배지를 제거하고 100ul의 QuickExtract DNA 추출 완충액을 각 웰에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 모든 세포를 제거한 다음, PCR 튜브로 옮겼다. 65℃에서 15분 동안 용리를 수행한 다음 98℃에서 2분 동안 비활성화했다. 용리액은 -80℃에서 보관되었다.
신경 전구 세포의 제조
기저 배지는 다음과 같이 제조되었다:
Figure pct00126
다음 배지도 사용되었다. 배지 2: 기저 배지 + 1μM LDN 193189 + 10μM SB431542. 배지 3: 기저 배지 + 1μM LDN 193189 + 10μM SB431542 + 1μM 사이클로파민 + 10ng/mL FGF2. 배지 4: 기저 배지 + 1μM 사이클로파민 + 10ng/mL FGF2. 배지 5: 기저 배지 + 10ng/mL FGF2. NPC 성숙 시딩 배지: 기저 배지 + 1:100 라미닌 + 1:1,000 Y-27632 ROCK 억제제. BrainPhys 성숙 배지:
Figure pct00127
신경 재-패터닝을 위한 iPSC를 시딩하기 위해, 인간 iPSC는 대략 80% 컨플루언스까지 6-웰 플레이트에서 라미닌5-1-1(1:400)로 시딩 시에 보충된 StemFlex 배지를 사용하여 계대배양되었다. 매달 마이코플라즈마 분석 및 정기적인 핵형 분석(5-10 계대)은 일반적으로 배양 인공물이 전파되는 것을 방지하기 위해 수행되었다.
분화를 위해 시딩하는 날(0일차로 정의됨)에, iPSC를 비정상적인 자발적 분화에 대해 검사하였다. 일반적으로, 배양물의 10% 미만은 분화되거나 느슨한 형태를 나타내야 한다. 배양 배지를 흡인하고 세포를 3mL Dulbecco의 PBS(DPBS, 2가 양이온-유리, Thermo Fisher #14190144)로 한 번 헹구었다. DPBS를 흡인하고 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase 용액(Thermo Fisher #A1110501)을 즉시 분배했다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 균일하고 완전한 해리를 보장한 다음 37℃ 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션했다. 플레이트는 iPSC 콜로니가 플레이트에서 해리되도록 하기 위해 3-5분마다 테이프로 단단히 고정되었다.
Accutase는 전형적으로 StemFlex(StemCell Tech #85850) 또는 StemFlex(Thermo Fisher #A3349401)인 적어도 2mL의 가온된(25-35℃) 배양 배지로 중화되었다. 세포 용액을 부드럽게 마쇄하여 덩어리진 세포를 추가로 해리시켰다.
세포 용액을 깨끗한 50mL 원추형 튜브로 옮기고 5분 동안 ~150 RCF에서 원심분리하여 세포를 펠렛화했다.
상청액을 흡인한 후, Y-27632 ROCK 억제제(1:1000 v/v)가 보충된 1mL의 가온된 StemFlex를 첨가하고 손등에 대해 튜브를 부드럽게 두드려 세포 펠렛을 분해했다. 추가로 9mL의 배양 배지를 첨가하고 부드럽게 뒤집어 혼합하였다. ViCell Cell Viability Analyzer 또는 동등한 장치를 사용하여 생존 세포 계수를 얻었다. 6E6 생존 세포를 Y-27632 ROCK 억제제(1:1000)가 보충된 총 12mL iPSC 배양 배지로 희석한 다음, 매트리겔-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 2mL의 세포 용액을 분주하고(웰당 1E6 세포 시딩 밀도), 그 다음 각 웰에 세포를 고르게 분포시키기 위해 각 방향(왼쪽에서 오른쪽으로, 앞에서 뒤로)으로 플레이트를 수직으로 3-4회 흔든다. 배양은 37℃, 5% CO2, 85% RH 인큐베이터에서 유지되었다. 그런 다음 플레이트를 시딩 후 적어도 3시간 동안 방해받지 않은 상태로 두었다. 매일 배지를 완전히 흡인하고 다음 배지 일정에 따라 교체했다(12일차에 대해서는 아래 참조). 각 6-웰 플레이트에 대해 적어도 12-13mL의 배지(웰당 2mL)를 준비하고 가온한다. 배양은 형태학적 이질성(첫 주 후에 낮아야 함) 또는 매트리겔 층 파괴에 대해 검사되었다. 배지 일정:
Figure pct00128
재-패턴화된 NPC 계대
12일차에, 형태학적 이질성에 대해 배양물을 검사한 후, 배양 배지를 흡인하고 세포를 3mL Dulbecco의 PBS(DPBS, 2가 양이온-유리, Thermo Fisher #14190144)로 한번 헹구었다. 그런 다음 DPBS를 흡인하고 이어서 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase 용액(Thermo Fisher #A1110501)을 즉시 분주했다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 균일하고 완전한 해리를 보장한 다음 37℃ 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션했다. 플레이트는 iPSC 콜로니가 플레이트에서 해리되도록 하기 위해 3-5분마다 단단히 두드려졌다. Accutase는 적어도 2mL의 가온된(25-35℃) 배지 4로 중화되었다. 세포 용액을 부드럽게 마쇄하여 임의의 덩어리진 세포를 추가로 해리시켰다.
세포 용액을 깨끗한 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 300 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인하고 Y-27632 ROCK 억제제(1:1000 v/v)가 보충된 1mL의 가온된 배양 배지를 첨가하고 튜브를 손등에 부드럽게 두드려 세포 펠렛을 분해했다. 추가 9mL의 배양 배지를 첨가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 세포 용액을 혼합하였다. 세포를 계수하고 9E6 생존 세포를 Y-27632 ROCK 억제제(1:1000)가 보충된 총 12mL iPSC 배양 배지로 희석했다. 2mL의 세포 용액을 매트리겔-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주했다(웰당 1.5E6 세포 유지 밀도). 플레이트를 각 방향(왼쪽에서 오른쪽으로, 앞에서 뒤로)으로 수직으로 3-4회 흔들어 각 웰에 세포가 고르게 분포되도록 했다. 배양은 37℃, 5% CO2, 85% RH 인큐베이터에서 유지되었다. 플레이트를 시딩 후 적어도 3시간 동안 방해받지 않은 상태로 두었다.
매일 배지를 완전히 흡인하고 상기의 배지 일정에 따라 교체했다(웰당 2mL 배지).
NPC는 주당 한번 계대되었고 FACS 분류 최종 NPC(계대 3 동안 발생) 이전에 두번 계대되었다.
NPC 유세포분석 라벨링 프로토콜
단일-세포 현탁액이 생성되었고 NPC가 고도로 밀집하고(9E6/6-웰 플레이트에 시딩됨, 5-7일 동안 전파되도록 허용됨) 형태학적으로 균질하다는 것이 확인되었다. 배양 배지를 흡인하고 세포를 2가 양이온-유리 Dulbecco의 PBS(Thermo Fisher, #14190250)로 한번 세정한 다음 흡인하고 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase(Thermo Fisher, #A1110501)를 첨가하고 이어서 37℃에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 단단히 두드려 부착된 NPC를 제거했다.
2mL의 가온된(~35℃) DMEM-F12(Thermo Fisher, #11320033)를 첨가하여 Accutase를 중화시켰다. 세포를 22℃에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 펠렛화했다. 상층액을 흡인하고 NPC를 5mL 가온된 DMEM-F12에 재현탁했다. ViCell Cell Counting 시스템을 사용하여 세포 계수를 생성했다.
NPC를 면역표지하기 위해 다음 절차가 사용되었다: 2-5E7 세포를 50mL 원추형 튜브에 분주하고; 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고; 세포 펠렛을 요동하지 않도록 주의하면서 상층액을 흡인하고, 양이온-유리 DPBS에서 세포를 한번 세정하고; 세포를 부드럽게 마쇄하여 덩어리를 부수고; 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의한 세포를 펠렛화하고; 상층액을 흡인한다. 고정가능한 염료 Zombie Aqua(BioLegend, #423102)를 사용하여 각 웰에 희석된(1:250) 염료 100μL을 분주하여 살아있는/죽은 세포를 표지한다(자가형광 대조군 또는 형광 마이너스 1 대조군 제외). 세포를 포일하고 4℃에서 15-30분 동안 인큐베이션하고; 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의한 세포를 펠렛화하고; 상층액을 흡인하고; 양이온-유리 DPBS에서 세포를 한번 세정한다. 세포를 부드럽게 마쇄하여 덩어리를 부수고; 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고; 상층액을 흡인한다. 차가운(4℃) 세포 염색 완충액(BioLegend, #420201)을 4C(포일됨)에서 30분 동안 사용하여 비-특이적 라벨링을 차단한다. 분주 후 세포를 부드럽게 마쇄하여 덩어리를 부순다. 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고; 상층액을 흡인한다. 세포 염색 완충액에 희석된 5E6 총 세포당 100μL의 항체(아래 표 참조)를 각 샘플에 분주한다(자가형광 대조군 또는 형광 마이너스 1 대조군 제외). 분주 후 세포를 부드럽게 분쇄하여 덩어리를 부순다. 샘플을 포일하고 4C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 참고: 단일-염색 보정 대조군은 물-용리된 세포(Zombie Aqua L/D) 또는 항체 포획 비드(Thermo Fisher, #A10497)를 사용하여 생성할 수 있다.
Figure pct00129
인큐베이션 후, 5mL 세포 염색 완충액으로 세포를 세정한다. 세포를 부드럽게 마쇄하여 덩어리를 부수고 고르게 세정한다. 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인한다. 차가운 세포 염색 완충액에서 세포를 한번 더 세정한다. 덩어리를 부수기 위해 세포를 부드럽게 마쇄한다. 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인한다.
노르모신(1:500)이 보충된 사전-분류 완충액(BD Bioscience, #563503)에서 세포를 mL당 7-10E6 세포의 최종 농도로 재현탁한다. BD FACSAria Fusion에서 분류될 때까지(1-2시간 이내) 포일에 넣고 4C에서 보관한다. 사전-코팅되고 Y-27632 ROCK 억제제(1:1000), 노르모신(1:500) 및 15mMolar HEPES(Thermo Fisher #15630080, 1:67 희석의 1M 스톡)가 보충된 7mL 배지 5가 충진된, 냉각된 15mL 원뿔형 튜브 안으로 분류한다.
NPC 유세포분석 분류 및 분석
NPC 분류 및 분석을 위해 다음 절차를 사용했다. 300RPM 샘플 교반 및 4℃ 샘플 보관과 함께 100-미크론 노즐(100μm-20psi)에 대한 표준 설정을 사용하여 기기(BD FACSAria Fusion)를 설정한다. 비드(BD Biosciences, #655051; 350μL DPBS에 1방울)를 사용하여 CS&T를 실행한다. CS&T 설정에서 전압을 수정하지 않는다. Accudrop 보정을 실행한다(BD Biosciences, #345249; 500μL DPBS에 1방울). 왼쪽 편향판 위치는 보정을 위해 32로, 분류를 위해 58-60으로 설정되어야 한다. 방울이 70% 에탄올을 갖는 7mL로 충진된 15mL 원뿔형 튜브의 중앙에 부딪히는지 확인한다. 각 샘플에 대해, 정지 게이트로 P1 스캐터 게이트를 갖는 10,000개 사전-분류 이벤트를 수집한다. 아래에 나타난 바와 같이 게이트를 설정한다. 수집: FSC-A/SSC-A P1 -> SSC-H/SSC-W P2 -> FSC-H/FSC-W P3 -> L/D Zombie Aqua (-) (살아있는 세포) -> CD184 (+) -> Tra-1-60 (-)/SSEA4 (-) (비-iPSCs) -> CD44 (-)/CD271 (-) (비-교세포, 비-신경 능선) -> CD24 (+)/CD15 (lo/mid) (NPC). 각 줄에서 1.5-2E6 세포를 분류한다. 모든 샘플은 분류 전후에 차갑게 유지한다. Y-27632 ROCK 억제제(1:1000)가 보충된 2mL의 배지 5에 현탁된 1.5E6 생존가능 NPC를 매트리겔-코팅된 6-웰 플레이트 안으로 시딩한다.
NPC 스케일 업
NPC를 스케일 업하기 위해 다음 절차가 사용되었다: 주당 한번 NPC를 계대한다. 계대 4의 경우(FACS 분류-후 1차 계대): NPC가 고도로 밀집하고(9E6/6-웰 플레이트에 시딩됨, 5-7일 동안 전파되도록 허용됨) 형태학적으로 균질한지 확인한다. 배양 배지를 흡인하고, 2가 양이온-유리 Dulbecco의 PBS(Thermo Fisher, #14190250)로 한번 세정한다. DPBS를 흡인하고 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase(Thermo Fisher, #A1110501)를 분주한다. 8-10분 동안 37C에서 인큐베이션한다. 부착된 NPC를 제거하기 위해 단단히 두드린다. Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 1mL의 가온된(~35C) 배지 5를 추가하여 Accutase를 중화한다. 22℃에서 5분 동안 300xg에서 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인하고 Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 5mL 가온된 배지 5에서 NPC를 재현탁한다. ViCell 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 계수를 생성한다. Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 12mL의 배지 5에서 9E6 생존가능한 NPC를 재현탁한다. 매트리겔-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 2mL를 분주한다. 계대 5의 경우, 상기의 절차를 반복하지만 Y-27632 ROCKi(1:1,000)가 보충된 15mL의 배지 5에서 12.5E6 NPC를 시딩하도록 스케일 업한다. 모든 세포를 매트리겔 코팅된 T75 플라스크 안으로 분주한다.
NPC 뱅킹/동결보존
NPC의 뱅킹/동결보존을 위해 다음 절차가 사용되었다: NPC가 고도로 밀집하고(T75 형식의 12.5E6/플레이트에서 시딩됨, 5-7일 동안 전파되도록 허용됨) 형태학적으로 균질한지 확인한다. 배양 배지를 흡인하고, 2가 양이온-유리 Dulbecco의 PBS(Thermo Fisher, #14190250)로 한번 세정한다. DPBS를 흡인하고 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase(Thermo Fisher, #A1110501)를 분주한다. 37C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 부착된 NPC를 제거하기 위해 단단히 두드린다. Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 2mL의 가온된(~35C) 기저 배지를 추가하여 Accutase를 중화한다.
22℃에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인하고 Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 5mL 가온된 기저 배지에 NPC를 재현탁한다. ViCell 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 계수를 생성한다. NPC는 1mL CryoStor10(StemCell Technologies, #07930)에서 12.5E6/mL로 뱅킹된다. 원하는 수의 뱅킹된 분취량을 채우는 데 필요한 세포의 수를 계산한 다음 Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 NPC-함유 기저 배지의 필요한 부피를 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 분주한다. 22℃에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화한다. 필요한 부피의 CryoStor10(원하는 분취량당 1mL)에 NPC를 재현탁하고 2mL 동결바이알(Corning, #430659)에 분주한다. 충진된 동결바이알을 Mr. Frosty 냉동 용기(Thermo, #5100-0001)로 빠르게 옮긴다. -80℃에서 적어도 24시간 동안 보관한 다음 액체 질소에서 장기-보관으로 옮긴다.
뉴런 성숙
폴리에틸렌이민-코팅된 플레이트를 제조하기 위해 다음 절차를 사용했다: 474mL의 멸균 증류수에 25mL의 붕산염 완충액 pH 8.2(20X; Sigma, #08059) 및 1mL의 폴리에틸렌이민(50%; Sigma, #03880)을 첨가한다. Stripette로 PEI를 휘젖는다. 필터를 멸균하고 4℃에서 <1개월 동안 보관한다. 0.1% PEI를 세포 배양 플레이트에 분주하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. PEI를 흡인한다. 멸균 증류수로 4회 세정한다. 건조 흡인한다. 밤새 세포 배양 후드에서 공기-건조한다. <2주 동안 4℃에서 보관한다.
뉴런 성숙을 위해, 다음 절차가 사용되었다: 재시딩의 일에 NPC가 고도로 밀집하고(12.5E6/T75 플레이트에서 시딩됨, 5-7일 동안 전파되도록 허용됨) 형태학적으로 균질한지 확인한다. 배양 배지를 흡인하고 2가 양이온-유리 Dulbecco의 PBS(Thermo Fisher, #14190250)로 한번 세정한다. DPBS를 흡인하고 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase(Thermo Fisher, #A1110501)를 분주한다. 8-10분 동안 37C에서 인큐베이션한다. 부착된 NPC를 제거하기 위해 단단히 두드린다. Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 2mL의 가온된(~35C) 기저 배지를 추가하여 Accutase를 중화한다. 22℃에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인하고 Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 5mL 가온된 기저 배지에서 NPC를 재현탁한다. ViCell 세포 계수 시스템(또는 등가물)을 사용하여 세포 계수를 생성한다.
라미닌(1:100) 및 Y-27632 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 기저 배지에서 필요한 수의 생존가능 NPC를 재현탁한다. 폴리에틸렌이민-코팅된 용기에 세포 용액을 분주한다. 다음 날(DIV1)은 라미닌(1:1,000)으로 기저 배지의 전체 배지 교체를 수행한다. DIV 2에서 라미닌(1:1,000), 및 PD 0332991(1:5,000), DAPT(1:2,500), 라미닌(1:1,000)이 보충된 BrainPhys로 50:50 혼합의 기저 배지의 전체 배지 교체를 수행한다. DIV 3-5에서 PD 0332991(1:5,000), DAPT(1:2,500), 라미닌(1:1,000)이 보충된 BrainPhys로 매일 전체 배지 교체를 수행한다. DIV7+로부터 PD 0332991(1:5,000), DAPT(1:2,500), 라미닌(1:1,000)이 보충된 BrainPhys로 주당 2-3회 ½ 배지 교체를 수행한다.
NPC 뉴클레오펙션
RNP 복합체는 섬유아세포 실험을 위해 상기에 기술된 바와 같이 본질적으로 제조되었다.
다음 절차를 사용하여 세포를 제조하였다. 기저 배지 준비: Neurobasal 500mL와 Advanced DMEM/F12 500mL를 조합한 다음 SM1 보충제 20mL(VitA 없음), N2-B 보충제 10mL, GlutaMax 10mL 및 Normocin 2mL를 추가한다.
세포 배양 용기를 코팅하기 위해: 매트리겔을 4C의 얼음 위에서 밤새 해동한다. 5mL 매트리겔을 495mL의 차가운 DMEM(1% vol/vol) 안으로 희석하고 4C에 보관한다. 12웰 플레이트의 웰당 0.5mL를 분주하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 도말하기 직전에 매트리겔 용액을 흡인한다.
세포를 준비하기 위해: 배양 배지를 흡인하고 2가 양이온-유리 Dulbecco의 PBS로 한번 세정한다. DPBS를 흡인하고 1mL의 가온된(25-35℃) Accutase를 분주한다. 37C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 플라스크를 두드려 부착된 NPC를 제거한다. 2mL의 가온된(~35C) 기저 배지(상기 참조)를 추가하여 Accutase를 중화한다. 22℃℃에서 5분 동안 300xg에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛화한다. 상층액을 흡인하고 5mL 가온된 기저 배지에 NPC를 재현탁하고(상기 참조), 40um 셀 스트레이너를 통과시키고 계수한다. 뉴클레오펙션당 2.5E6에서 15ml 튜브에 세포를 할당한다.
뉴클레오펙션: 100ul의 사전-혼합된 P3 뉴클레오펙션 용액에 세포 펠렛을 재현탁하고 사전-어셈블링된 RNP를 함유하는 튜브로 옮긴다. 100ul의 RNP/세포 혼합물을 뉴클레오펙션 큐벳으로 옮긴다. Lonza X-유닛을 사용하여 뉴클레오펙션한다. 용액을 P3 및 사용된 펄스 코드 CA137로 설정했다. DPBS에서 세포를 1x 세정한다. 큐벳으로부터 락 억제제를 함유하는 사전-가온된 배지를 갖는 12웰 사전-코팅된 디쉬로 세포를 즉시 이동시킨다. 회수를 위해, 다음날 배지를 10ng/mL FGF-2가 보충된 기저 배지로 교체한다. 상기와 같이 매일 10ng/mL FGF-2가 보충된 배지 교체로 총 5일 동안 배양을 계속한다. 수확을 위해: Accutase를 사용하여 37C에서 10분 동안 세포를 단리한다. DPBS로 1X 세정하고, 세포를 펠렛화하고, PBS를 제거하고 -80C에서 펠렛을 동결한다.
제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen 혈액 및 조직 키트를 사용하여 DNA를 추출했다. DNA를 HindIII로 단리하고 표준 기술을 사용하여 PCR/아가로스 전기영동에 의해 크기 조정했다. PCR 프라이머:
5'-AGTTCAGCGGCCGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT-3' (서열번호: 55);
5'-CAAGTCGCGGCCGCCTTGTAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCA-3' (서열번호: 56).
뉴런 뉴클레오펙션
뉴런(예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 NPC로부터 분화됨)은 다음과 같이 뉴클레오펙션되었다. RNP는 섬유아세포 실험을 위해 상기에 기술된 바와 같이 본질적으로 준비되었다.
동봉된 보충제를 AD1 뉴클레오펙션 용액에 첨가하고 350ul의 용액을 각 RNP 복합체 튜브에 첨가하였다. 7.5ul의 100uM 전기천공 인핸서가 뉴클레오펙션 직전에 각 RNP 튜브에 첨가되었다.
배지는 한 번에 하나의 웰 세포에서 제거되고 350ul의 RNP-함유 뉴클레오펙션 용액으로 대체되었다. 모든 웰을 대체한 다음 전극을 기포를 방지하면서 웰에 부드럽게 삽입했다. 세포는 용액 AD1 및 펄스 코드 EH-158로 설정된 Lonza Y-유닛 뉴클레오펙터를 사용하여 뉴클레오펙션되었다. 뉴클레오펙션 후, RNP 용액을 부드럽게 제거하고 신선한 사전-가온된 Brainphys 배지(성숙 프로토콜에 기술됨)로 대체했다. 세포를 수확하기 이전에 37℃에서 72시간 동안 회복되도록 하였다. 수확하기 위해 배지를 제거하고 세포를 500ul의 PBS에 재-현탁시키고, 펠렛화하고, PBS를 제거하고, 펠렛을 동결시켰다.
NPC 뉴클레오펙션에 대해 상기 기재된 바와 같이 DNA 추출 및 유전자형 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯 프로토콜
세포 펠렛을 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 보충된 1x MSD 용리 완충액에 재현탁시켰다. 50μl 용리 완충액은 200K 세포에 대해 사용되었다.
용리액을 4℃에서 10분 동안 21000 x g에서 원심분리에 의해 청징화하기 전에 소용돌이 처리하고 20Amp(Cole Parmer 초음파 분쇄기 사용)에서 간단히(5-10초) 초음파처리했다. 수득된 상청액은 단백질 추정(BCA 검정)에 사용할 수 있다.
4x LDS 완충액을 청징화된 상청액에 첨가하여 1x LDS의 최종 농도를 얻은 후 100℃에서 5분 동안 끓였다.
5-15μg의 세포 용리액을 1x MES SDS 실행 완충액이 있는 4-12% NuPage Bis-tris 겔에서 실행하고, 이어서 트랜스블롯 터보 시스템(카탈로그 # 1704150에 대한 사용 설명서)을 사용한 0.2μM 니트로셀룰로스 멤브레인 상으로 옮겼다. 블롯은 LiCoR PBS 차단 완충액(카탈로그 # 927-40000)으로 실온에서 1시간 동안 차단되었다. 1시간 후, 4℃에서 흔들면서 0.2% 트윈-20을 갖는 LiCor PBS 차단 완충액 중 1차 항체에서 밤새 인큐베이션을 수행했다. 농도는 1차 항체 효율에 따라 다양했다.
다음날, 멤브레인을 PBS-T(0.1% 트윈-20)로 3x 세정하고 이어서 0.1% 트윈-20을 갖는 LiCoR PBS 차단 완충액 내 1:10000 희석에서 2차 항체(LiCor IRdye 800 또는 680)에서 1시간 인큐베이션했다. 멤브레인을 PBS-T(0.1% 트윈-20)로 3회 세정하고, Odyssey CLx 검출기를 사용하여 LiCor 형광의 신호 검출을 진행하였다. 사용된 항체(Abcam): 빈큘린: ab129002(1:5000); 프라탁신: ab110328(1:250).
RNA 추출 & qRT-PCR
DM1 섬유아세포에서 이중 DMPK 가이드 RNA에 의한 CTG 반복 절제의 기능적 판독으로서 미스-스플라이싱 보정을 사용하였다. 전체 RNA는 20ul의 부피로 Quick-RNA 96 키트(ZYMO Research)를 사용하여 추출되었다. 10ul의 RNA를 사용하여 고용량 cDNA RT 키트(Thermo Fisher 4368814)로부터 10ul의 2x RT 마스터믹스와 혼합하여 제1 가닥 cDNA를 생성했다. 반응 혼합물을 회전시켜 기포를 제거하고 열 순환기 안으로 장입했다.
역전사를 25℃에서 10분, 37℃에서 120분, 및 85℃에서 5분으로 이루어진 3-단계 프로그램을 사용하여 수행하고, 이어서 4℃에서 유지했다.
스플라이싱은 Quantstudio 12K 플렉스 실시간 PCR 시스템에서 PowerUp SYBR 그린 마스터믹스(Thermo Fisher A25742)를 사용하여 qRT-PCR에 의해 평가되었다. 1x 반응 10ul의 조성은 하기 표 3에 제시되어 있다. 프라이머 서열은 추가 서열의 표에 열거되어 있다.
[표 3]
Figure pct00130
재료의 공급원
표 4에 열거된 재료는 표시된 공급업체로부터 입수했다.
[표 4]
Figure pct00131
Figure pct00132
Figure pct00133
2. 쌍을 이룬 gRNA를 사용한 심근세포 및 섬유아세포에서 DMPK의 TNR 절제
PCR 및 겔 전기영동에 의한 절제의 분석. 심근세포를 spCas9를 포함하는 RNP 및 상기에 기술된 바와 같이 전기천공을 통해 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌를 측접하는 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍으로 처리하였다. gRNA 쌍은 표 5 및 6에 표시된 바와 같이 A-H 쌍 중 하나였다.
[표 5] 예시적인 DMPK 가이드
Figure pct00134
[표 6] 예시적인 DMPK 가이드 쌍
Figure pct00135
다음 18-mer 스페이서 서열을 포함하는 가이드의 쌍을 시험했다: 서열번호: 3348 및 2556; 서열번호: 3348 및 2500; 서열번호: 3332 및 2556; 서열번호: 3332 및 2500; 서열번호: 3356 및 2548; 서열번호: 3356 및 2508; 서열번호: 3380 및 2548; 서열번호: 3380 및 2508. 보다 구체적으로, 시험된 가이드는 표 6에 나타낸 바와 같이 도 7에서 시험된 20-mer 가이드 쌍이었다.
처리는 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 프라이머를 사용하여 PCR의 생성물의 전기영동 분리를 나타내는 도 7에 표시된 정도로 CTG 반복 유전자좌의 절제를 초래하였다.
야생형 및 이형접합 DM1 환자 심근세포를 iPSC로부터 제조하고 spCas9를 포함하는 RNP 및 상기 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍으로 처리하였다. gRNA 쌍은 표 6에 나타낸 바와 같이 쌍 B 및 C와 각각 동일한 쌍 1 또는 2(도 8a에 도시됨) 중 하나였다. 처리는 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 프라이머를 사용한 PCR의 생성물의 전기영동 분리를 나타내는, 도 8a에서 지시된 정도로 CTG 반복 유전자좌의 절제를 초래하였다.
야생형 및 이형접합 DM1 환자 섬유아세포를 spCas9를 포함하는 RNP 및 상기에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍으로 처리하였다. gRNA 쌍은 표 6에 나타낸 바와 같이 쌍 1 또는 2(도 8b에 도시됨) 중 하나였다. 처리는 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 프라이머를 사용한 PCR의 생성물의 전기영동 분리를 나타내는, 도 8b에서 지시된 정도로 CTG 반복 유전자좌의 절제를 초래하였다.
CTG 반복 유전자좌의 절제는 대표적인 생성물에 대한 생거 시퀀싱에 의해 확인되었다(도 8c).
CUG 병소에 대한 FISH 및 MBNL1 병소에 대한 면역형광에 의한 절제의 분석. 1차 DM1 및 야생형 섬유아세포는 spCas9를 포함하는 RNP 및 상기에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍, 또는 무 gRNA(음성 대조군)로 처리했다. gRNA 쌍은 표 6에 지시된 바와 같은 A-D 쌍 중 하나였다. 처리된 세포의 샘플은 상기에 기재된 바와 같은 DMPK1 mRNA의 CUG 반복 영역에 대해 Alexa546-(CAG)10 프로브(IDT로부터 맞춤-주문)를 사용하여 FISH에 의해 검정되었다. 처리된 세포의 샘플은 또한 MBNL1 단백질 병소에 대한 면역형광에 의해 검정되었다.
핵당 CUG 병소의 수가 결정되었고 도 9a에 도시되어 있으며, 가이드 쌍 A-D 각각은 음성 대조군에 비해 핵당 CUG 병소에서 감소를 제공한다. 각각의 처리된 세포 모집단 및 편집되지 않은 세포에서 핵당 CUG 병소의 수의 히스토그램이 도 11에 도시되어 있다.
핵당 MBNL1 병소의 수가 결정되었고 도 9b에 도시되어 있으며, 가이드 쌍 A-D 각각은 음성 대조군에 비해 핵당 MBNL1 병소에서 감소를 제공한다.
RNA 스플라이싱의 분석. 일차 DM1 섬유아세포를 gRNA 쌍 7(표 6에서의 쌍 C와 동일)을 함유하는 RNP로 처리하거나 또는 상기 기재된 바와 같이 gRNA 없는 모의-처리하거나, 또는 처리하지 않았다. 스플라이싱은 MBNL1(도 10a), NCOR2(도 10b), FN1(도 10c) 및 KIF13A(도 10d) mRNA에서 검정되었다. 결과는 gRNA 쌍 7을 함유하는 RNP로 처리한 후 각각의 검정된 mRNA에서 미스-스플라이싱에서의 감소를 나타냈다. 도 10e는 절제된 DM1 섬유아세포에서 구제 백분율로 표현된, 미스-스플라이싱 교정의 정량적 분석을 도시한다.
3. DNA-PK의 억제로 DMPK의 TNR 절제
hTert-형질전환된 DM1 섬유아세포를 10uM의 DNA-PK 억제제 화합물 6의 존재 또는 부재, 및 DMPK gRNA 쌍 A-D 중 하나를 함유하는 RNP로 상기 기재된 바와 같이 처리하였다(표 6 참조). 처리는 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 프라이머를 사용하여 PCR의 생성물의 전기영동 분리를 나타내는 도 12에 표시된 정도로 CTG 반복 유전자좌의 절제를 초래하였다. 화합물 6을 처리한 샘플에서는 절제 생성물을 나타내는 밴드가 눈에 띄게 더 강하였고, 야생형 생성물을 나타내는 밴드는 눈에 띄게 덜 강렬하였다.
서열번호: 3332, 3316, 2660, 2692, 2556, 및 2500의 18-mer 스페이서 서열을 포함하는 gRNA를 시험하였다. 보다 구체적으로, 시험된된 가이드는 표 5 및 표 6에 나타난 바와 같은 20-mer 가이드였다.
hTert-형질전환된 DM1 섬유아세포를 10uM의 DNA-PK 억제제 화합물 6의 존재 또는 부재로, 및 다음 DMPK gRNA 중 하나를 함유하는 RNP로 상기 기재된 바와 같이 처리하였다: DMPK-U57(서열번호: 3330)(gRNA # 4), DMPK-U60(서열번호: 3314)(gRNA #5), DMPK-R12(서열번호: 2658)(gRNA #6), DMPK-R08(서열번호: 2690)(gRNA#7), DMPK-D03(서열번호: 2554)(gRNA #9), 또는 DMPK-D10(서열번호: 2498)(gRNA #10)(표 5, 도 13, 도 16 참조). 처리는 DMPK1의 CTG 반복 유전자좌에 측접하는 프라이머를 사용하여 PCR의 생성물의 전기영동 분리를 나타내는, 도 13에 나타낸 정도로 CTG 반복 유전자좌의 절제를 초래하였다. 화합물 6으로 처리된 샘플에서, 절제 생성물을 나타내는 밴드는 가이드 DMPK-U60, DMPK-R08, DMPK-D03 및 DMPK-D10에 대해 눈에 띄게 더 강렬했고, 야생형 생성물을 나타내는 밴드는 가이드 DMPK-U60, DMPK-R12 및 DMPK-R08에 대해 눈에 띄게 덜 강렬하였다.
hTert-형질전환된 DM1 섬유아세포를 10uM의 DNA-PK 억제제 화합물 6의 존재 또는 부재로, 및 다음 DMPK gRNA 쌍 중 하나를 함유하는 RNP로 상기 기재된 바와 같이 처리하였다: A, B, C, 또는 D(표 6 참조). 세포는 상기에 기술된 바와 같이 FISH에 의해 핵당 CUG 병소에 대해 검정되었다. 도 14는 gRNA 쌍 A, B, C, 또는 D로 삼중 실험 및 편집되지 않은 건강한 세포 및 환자 세포에 대한 핵당 CUG 병소의 히스토그램을 도시한다. 화합물 6의 존재에서 각 가이드 쌍으로 처리는 화합물 6의 부재에서 가이드 쌍으로 처리된 세포보다 0 병소를 갖는 세포의 더 큰 빈도를 제공하였고, 이는 편집되지 않은 환자 세포보다 0 병소를 갖는 세포의 더 큰 빈도를 나타냈다.
hTert-형질전환된 DM1 섬유아세포를 10uM의 DNA-PK 억제제 화합물 6의 존재 또는 부재로, 및 다음 DMPK gRNA 쌍 중 하나를 함유하는 RNP로 상기 기재된 바와 같이 처리하였다: A, B, C, 또는 D. 쌍 A = 가이드 DMPK-U59 및 DMPK-D03; 쌍 B = 가이드 DMPK-U59 및 DMPK-D10; 쌍 C = 가이드 DMPK-U57 및 DMPK-D03; 쌍 D = 가이드 DMPK-U57 및 DMPK-D10((상기에 표시된 서열, 표 5 및 서열 목록). 모의-처리(M) 및 AAVS1을 표적화하는 대조군 가이드로 처리된 세포(NT)(스페이서 서열: accccacagtggggccacta, 서열번호: 31)가 또한 분석되었다. 미스-스플라이싱된 전사체의 백분율은 상기에 기술된 바와 같이 MBNL1(도 15a), NCOR2(도 15b) 및 FM1(도 15c)에 대해 결정되었다. 상대적인 DMPK 발현 또한 결정되었다(도 15d). RNA 스플라이싱의 부분적 복원은 MBNL1, NCOR2 및 FM1 각각에 대한 qPCR에 의해 확인되었으며, 많은 결과가 화합물 6의 존재에서 추가 향상을 나타냈다. 편집은 DMPK의 발현을 유의하게 변경하지 않았다.
도 16은 인간 DMPK 유전자좌에서 단일 gRNA CTG 반복 절제에 사용된 예시적인 gRNA의 개요를 도시한다. gRNA는 CTG 반복의 부위 5' 또는 3'을 표적화하도록 설계되었고, 예를 들어 서열번호: 3378(gRNA #1), 서열번호: 3354(gRNA #2), 서열번호: 3346(gRNA#3), 서열번호: 3330(gRNA #4), 서열번호: 3314(gRNA #5), 서열번호: 2658(gRNA #6), 서열번호: 2690(gRNA #7), 서열번호: 2546(gRNA #8), 서열번호: 2554(gRNA #9), 서열번호: 2498(gRNA #10), 및 서열번호: 2506(gRNA #11)을 포함하는 가이드를 포함한다.
4. 트리뉴클레오티드 반복과 중첩하는 가이드 쌍을 사용한 FMR1의 반복의 절제
M28 CHOC2 및 모자이크 CHOC1 뉴런 전구체 세포(NPC)를 전기천공을 통해 5' 및 3' FMR1 gRNA 및 SpCas9의 조합으로 처리하였다. 다양한 가이드에 의해 표적화된 FMR1에서의 위치가 도 17에 표시되어 있다. 가이드로 처리된 세포로부터 다음과 같이 DNA를 분리하였다. 각각의 레인 A-E에 대한 3' 가이드는 서열번호: 5262의 스페이서 서열을 가졌다. 5' 가이드는 레인 A 내지 E에 대해 각각 서열번호: 5782, 5830, 5926, 5950 또는 5998의 스페이서 서열을 가졌다. 절제는 PCR 및 겔 전기영동으로 분석하였다(도 18). 절제 생성물은 시험된 각 가이드 조합에 대해 관찰가능하였다.
5. CHOC1 세포 및 CHOC2 세포에서 FMR1의 CGG 반복의 절제
a. CHOC1 세포에서 FMR1의 CGG 반복의 절제
CHOC1 세포는 표적화된 유전자좌의 PCR 및 전기영동을 사용하여 유전자형 결정되었으며(도 19), 이는 5' UTR에서 기존의 결실을 드러냈다. 결실은 특정 gRNA 결합 부위를 제거한 CGG 반복 영역의 71-bp 손실 5'으로 시퀀싱함에 의해 특징되어 졌다(데이터는 도시되지 않음).
그럼에도 불구하고, 결실된 영역에서의 서열을 표적화하고 따라서 무효하여야만 하는 5' 가이드와 쌍을 이룬, FMR1의 CGG 반복 영역의 부위 3'을 표적화하는 하나의 gRNA로 CHOC1 세포의 처리는 여전히 반복 절제를 초래하여, 하나의 효과적인 가이드를 사용하여 반복을 절제할 수 있음을 나타낸다. 단일 가이드 RNA(서열번호: 5262)로 이러한 절단을 거친 클론으로부터의 서열이 도 20에 도시되어 있다. 접합 서열은 MMEJ 경로를 통한 수선과 일치하였다.
b. CHOC2 세포에서 FMR1의 CGG 반복의 절제
SpCas9 RNP 전기천공 후 분화된 유사분열-후 CHOC2 뉴런에서 단일 또는 쌍을 이룬 gRNA를 사용하여 CGG 반복 절제를 평가하였다. CHOC2 유사분열-후 뉴런을 DNA-PK 억제 없이 하기 표 7a에 나타낸 바와 같이 spCas9 및 가이드를 포함하는 RNP로 처리하였다. 서열번호는 스페이서 영역 서열에 대해 제공되었다. 서열에 대해서는 표 2 및/또는 서열 목록을 참고한다.
[표 7a]
Figure pct00136
CGG 반복의 절제를 PCR에 의해 분석하였다(도 21a). 3' 가이드 서열번호: 5262를 사용한 실험은 CGG 반복 절제 생성물(도 21a, 레인 3)을 나타내는 가시 밴드를 제공했으며, 이는 생거 시퀀싱(미도시)에 의해 확인되었다.
FMR1의 CGG 반복의 절제는 DNA-PK 억제제의 처리로 추가로 평가되었다. CHOC2 뉴런 전구체 세포(NPC)를 spCas9 및 가이드를 포함하는 RNP로 하기 표 7b에 나타낸 바와 같이 처리하였다. 서열번호는 스페이서 영역 서열에 대해 제공되었다. 서열에 대해서는 표 2 및/또는 서열 목록을 참고한다. 전기천공에 이어서, CHOC2 NPC를 하기 표 7b에 나타낸 바와 같이 DMSO 또는 3μM DNA-PK 억제제(화합물 6)로 처리하였다.
[표 7b]
Figure pct00137
PCR에 의해 FMR1 DNA를 증폭하고 Agilent's 2200 TapeStation을 사용하여 전기영동에 의해 PCR 생성물을 분리함에 의해 CGG 반복의 절단을 분석하였다(도 21b). 3' 가이드 서열번호: 5262를 사용한 실험은 CGG 반복의 절제를 보여주었다(도 21b, 레인 B1 및 A2). 참고로, 도 21b, 레인 A2에서 더 두드러진 밴드(작은 화살촉)는 DMSO 대조군과 비교하여 3uM 화합물 6으로 향상된 CTG 절제를 입증한다.
서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 및 5312의 18-mer 스페이서 서열을 포함하는 gRNA를 시험하였다. 보다 구체적으로, 시험된 가이드는 표 7a 및 7b에 나타낸 바와 같은 20-mer 가이드였다.
6. FXN의 프라탁신 유전자좌에서 GAA 반복의 절제
iPS 세포(야생형, 4670, 또는 68FA)는 1μM 화합물 3의 존재 또는 부재로 프라탁신 유전자좌에서 GAA 반복을 측접하는, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(Cpf1 또는 Cas9) 및 프라탁신 gRNA로 다음과 같이 처리되었다. Cpf1 FXN gRNA 1 및 2: 각각 서열번호: 47047 및 7447; SpCas9 FXN gRNA 1 및 2: 서열번호: 52898 및 26546. 반복 절제는 PCR 및 전기영동에 의해 분석되었다(도 22). GAA 반복 절제는 화합물 3의 존재에서 개선되었다. 절제를 겪은 클론은 프라탁신 유전자좌에서 서열분석되었다(도 23). 화합물 3의 부재에서 절제를 겪은 클론으로부터의 서열은 단지 NHEJ에 의한 수선과 일치하였다. 화합물 3의 존재에서 절제를 겪은 클론으로부터의 서열 중 50%는 MMEJ에 의한 수선을 나타내었고 50%는 NHEJ에 의한 수선을 나타내었다. 따라서, 화합물 3을 사용한 처리는 MMEJ 수선에 유리하게 NHEJ 수선의 빈도를 감소시켰다.
FXN 유전자좌에서 반복의 절제는 상승된 FXN 수준을 초래하였다(도 24b-c). 구체적으로, 도 24a의 작업흐름에 예시된 바와 같이, FA iPSC는 SpCas9 및 0.4, 1.5, 5 또는 11kb 단편의 절제를 생성하도록 표적화된 가이드 쌍을 포함하는 RNP로 전기천공되었고 화합물 6(도 24a에서 "Inh.")의 존재 또는 부재로 성장되고, 대량으로(도 24b) 또는 FACS에 의해 단리된 단일 세포의 다음 클론 확장(도 24c)으로 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 시험된 가이드 쌍은 다음과 같다: 쌍 1(서열번호: 52666 및 26562); 쌍 2(GDG_SpCas9_FA_680bp_5 (서열번호: 51322) 및 GDG_SpCas9_FA_880bp_3 (서열번호: 28130)); 쌍 3(GDG_SpCas9_FA_1kb_5 (서열번호: 50394) 및 GDG_SpCas9_FA_4kb_3 (서열번호: 34442)); 쌍 4(GDG_SpCas9_FA_1.3kb_5 (서열번호: 49986) 및 GDG_SpCas9_FA_10kb_3 (서열번호: 45906)). 대량 FXN 발현은 모든 DNA-PK-억제제 처리된 모집단에서 대조군에 비해 현저히 증가하였다(도 24b). 증가된 발현을 갖는 다중 클론은 DNA-PK 억제제로 처리되지 않은 모집단으로부터 단리되었다.
7. FMR1의 취약한-X 유전자좌에서 MMEJ-기반 CGG-반복 절제에 대한 모델
도 25는 FMR1의 취약 X 유전자좌에서 MMEJ 경로를 통한 CGG 반복 절제를 위한 기전을 예시한다. 표시된 위치에서 절단은 DNA 말단의 5' 절제가 뒤따르며, 이는 마지막 2개 뉴클레오티드가 G 및 A(5'에서 3' 방향)인 3' 말단을 노출시킨다. 미세상동성 검색은 상보적 가닥에서 여러 TC 디뉴클레오티드 중 하나를 식별할 수 있다(도 25에서 상자 및 두꺼운 화살촉으로 표시됨). MMEJ에서 임의의 이들 TC 디뉴클레오티드의 사용으로 인한 수선 생성물은 반복 영역을 결할 것이다.
8. DMPK의 3' UTR에서 sgRNA 스크리닝
a. 재료 및 방법
sgRNA 선택 . DMPK 유전자의 3' 비번역된 영역(UTR)은 센스 또는 안티센스 가닥에서 NGG 또는 NAG SpCas9 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 스캔되었고, PAM에 인접한 20-뉴클레오티드 sgRNA 스페이서 서열이 동정되었다. NGG PAM을 갖는 172개 sgRNA와 NAG PAM을 갖는 46개 sgRNA가 HEK293T 세포에서 편집 효율성의 평가를 위해 선택되었다(표 8).
플라스미드 . sgRNA, SpCas9 및 EGFP를 발현하는 올인원 발현 벡터 pU6-sgRNA-Cbh-SpCas9-2A-EGFP를 사용하여 개별 sgRNA를 서브클로닝했다. 각 sgRNA에 대한 상단 및 하단 가닥 올리고를 어닐링한 다음 이전에 기술된 바와 같이 pU6-sgRNA-Cbh-SpCas9-2A-EGFP 벡터의 BbsI 제한 부위 내로 서브클로닝했다(Ran, F.A. 등(2013) Nat. Protoc. 8:2281-2308; PMID: 24157548).
형질감염 및 PCR 증폭 . 개별 sgRNA를 함유하는 pU6-sgRNA-Cbh-SpCas9-2A-EGFP 벡터는 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염 시약(Thermo Fisher Scientific)으로 리포펙타민 3000 (및 72시간 형질감염 시간) 또는 리포펙타민 2000 (및 48시간 형질감염 시간)을 사용하여 CELLSTAR 블랙 96-웰 플레이트(Greiner)에 시딩된 HEK293T 세포로 형질감염되었다. 형질감염 후, 0.5mg/ml의 프로테이나제 K(Viagen)가 보충된 DirectPCR 용리 시약(Viagen)을 사용하여 게놈 DNA를 단리하고 후속 PCR을 위한 주형으로 사용했다. DMPK 3' UTR 영역은 GoTaq 그린 마스터 믹스(Promega) 및 3' UTR 영역에 측접하는 PCR 프라이머(서열번호: 32 및 33)를 사용하여 증폭되었다(추가 서열 표). 증폭은 다음 주기화 매개변수를 사용하여 수행되었다: 95℃에서 2분 동안 1 주기; 95℃에서 30초, 63℃에서 30초, 및 72℃에서 90초 동안의 40 주기; 72℃에서 5분 동안 1 주기.
생거 시퀀싱 및 TIDE 분석 . PCR 생성물은 정제 및 생거 시퀀싱을 위해 GeneWiz로 보내졌다. 시퀀싱 프라이머 UTRsF3(서열번호: 34)은 CTG 반복의 sgRNA 업스트림에 대해 사용된 반면 역 PCR 프라이머(서열번호: 33)는 다운스트림 sgRNA 및 CTG 반복 영역과 중첩하는 13개 sgRNA에 대해 사용되었다. 역 PCR 프라이머(서열번호: 33)에 근접한 위치에 있는 sgRNA(DMPK-D75, DMPK-D76, DMPK-D85, DMPK-D86, DMPK-D102, DMPK-D103, DMPK-D104, DMPK-D105, DMPK-D119, DMPK-D120, DMPK-D121, DMPK-D122, DMPK-D123, DMPK-D124, DMPK-D125, DMPK-D126, DMPK-D127, DMPK-D128, DMPKD129)는 시퀀싱 프라이머 UTRsF2(서열번호: 35)를 사용하여 서열분석되었다. 삽입결실 값은 생거 시퀀싱에서 얻은 전기영동도와 함께 TIDE 분석 알고리즘(DeskGen/Vertex)을 사용하여 추정되었다. TIDE는 주형-매개된 편집 이벤트의 비율을 정량화하기 위해 시퀀싱 전기영동도에서 삽입결실의 스펙트럼의 복구를 기반으로 하는 방법이다(Brinkman, E.A. 등 (2014) Nucleic Acids Res. 42: e168; PMID: 25300484).
sgRNA의 표적-외 스코어링 . 표적-외 부위는, 구체적으로, NGG 또는 NAG의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열뿐만 아니라 프로토스페이서 서열과 관련하여 최대 3개 불일치 또는 최대 2개 불일치 및 1개 DNA/RNA 돌출이 있는 것으로 동정된 임의의 부위인, hg38 인간 참조 게놈에 대한 서열 유사성을 기반으로 각 sgRNA에 대해 계산적으로 예측되었다. 표적-외 점수는 그런 다음 이들 계산적으로 예측된 표적-외 부위를 기반으로 하여 각 sgRNA에 대해 계산되었다.
구체적으로, 각각의 표적-외 부위는 표적 부위 및 그의 PAM 서열에 대한 부위의 서열 유사성의 부위의 정도에 기반하여 편집될 확률을 나타내는 가중치가 주어졌다: (i) 미스매치 수에 기초한 가중치는 Haeussler, M. 등. (2016) Genome Biol., 17(148); PMID: 27380939에서 경험적 데이터의 공개된 메타분석으로부터 계산되었다(DNA/RNA 돌출이 표적-외 부위에 존재하는 경우, DNA/RNA 돌출이 있는 부위에서 표적-외 편집이 미스매치보다 덜 자주 관찰된다는 경험적 데이터에 기반하여 돌출이 2개 추가의 미스매치로 계산되었다); 및 (ii) PAM 서열에 기반한 가중치는 Doench, J. G. 등. (2016) Nat Biotechnol., 34 (2): 184-191; PMID: 26780180으로부터 절단 빈도 결정 모델을 사용했다. 각 표적-외 부위의 가중치는 미스매치의 수를 기반으로 하는 부위의 가중치와 PAM 서열을 기반으로 하는 부위의 가중치를 곱하여 계산되었다. 각 sgRNA에 대한 전반적인 표적-외 점수는 연관된 모든 예측된 표적-외 부위에 대한 가중치의 합으로 계산되었다. 전반적으로, sgRNA에 대한 표적-외 점수는 그 sgRNA에 대한 표적-외 부위의 수의 예상된 값에 상응한다. 표적-외 점수가 높을수록 표적-외 편집이 있을 가능성이 더 큰 sgRNA와 상응한다.
b. 결과
DMPK 유전자의 CTG 반복 확장에 측접하는 218개 sgRNA(표 8)는 CTG 반복 확장을 편집하기 위해 선택되었다. DMPK 코딩 서열 및 mRNA 성숙에 대한 간섭을 피하기 위해, 모든 선택된 sgRNA는 정지 코돈과 마지막 엑손의 말단 사이의 DMPK 유전자의 3'UTR 내에 위치되었다. 이들 218개 sgRNA 중 76개(DMPK-U01 - DMPK-U76)는 CTG 반복 확장의 업스트림(정지 코돈과 CTG 반복 확장 사이)에 위치되고 129개 sgRNA(DMPK-D01 - DMPK-D129)는 CTG 반복 확장의 다운스트림(CTG 반복 확장과 DMPK의 마지막 엑손의 말단 사이)에 위치되고, 13개 sgRNA(DMPK-R01 - DMPK-R13)는 CTG 반복 확장과 완전히 또는 부분적으로 중첩한다.
서열번호: 4020, 4012, 4004, 4044, 4036, 4028, 3956, 3948, 3996, 3916, 3980, 3908, 3900, 3940, 3852, 3884, 2828, 3820, 3844, 3796, 3788, 3764, 3812, 3748, 3780, 3740, 3772, 3724, 3756, 3692, 3668, 3660, 3636, 3588, 3548, 3532, 3644, 3516, 3508, 3492, 3620, 3612, 3604, 3580, 3444, 3524, 3412, 3380, 3436, 3372, 3428, 3420, 3396, 3388, 3332, 3356, 3348, 3316, 3932, 3892, 3836, 3804, 3708, 3700, 3684, 3676, 3572, 3556, 3540, 3500, 3484, 3460, 3476, 3452, 2669, 2668, 2652, 2644, 2628, 2620, 2708, 2692, 2684, 2612, 2676, 2660, 2604, 2596, 2636, 2556, 2548, 2588, 2540, 2580, 2572, 2524, 2500, 2492, 2468, 2460, 2452, 2516, 2508, 2420, 2484, 2476, 2696, 2444, 2436, 2372, 2380, 2356, 2348, 2340, 2316, 2300, 2284, 2276, 2268, 2332, 2260, 2324, 2244, 2236, 2292, 2252, 2220, 2228, 2212, 2196, 2148, 2140, 2124, 2108, 2100, 2092, 2132, 2116, 2036, 2028, 2060, 2052, 2044, 1916, 1788, 1780, 1772, 1844, 1740, 1708, 1692, 1748, 1716, 1652, 1644, 1612, 1588, 1564, 1548, 1580, 1540, 1380, 1372, 1924, 1900, 1908, 1796, 1764, 1700, 1676, 1724, 1364, 1452, 2204, 2180, 2172, 2164, 2020, 2012, 1892, 1964, 1948, 1852, 1820, 1660, 1636, 1604, 1556, 1436, 1428, 1340, 1348, 1980, 1996, 1988, 1972, 1940, 1932, 1812, 1836, 1828, 1804, 1628, 1596, 1516, 1500, 1492, 1484, 1476, 1460, 1444, 1420, 1412, 1404, 1396, 및 1388의 18-mer 스페이서 서열을 포함하는 가이드가 시험되었다. 보다 구체적으로, 예시된 가이드는 표 8에 나타난 바와 같은 20-mer 가이드였다.
편집 효율을 평가하기 위해, 개별 sgRNA를 pU6-sgRNA-Cbh-SpCas9-2A-EGFP 벡터 안으로 서브클로닝하고, 양 대립유전자 상의 DMPK 유전자에 5개 CTG 반복을 함유하는 HEK293T 세포 안으로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염 후 48시간(리포펙타민 2000의 경우) 또는 72시간(리포펙타민 3000의 경우)에 추출하고, CTG 반복 확장 및 sgRNA 표적 부위를 덮는 1174 bp 서열을 PCR에 의해 증폭시켰다. 그런 다음 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석을 사용하여 각 sgRNA에 의해 생성된 삽입결실의 빈도를 정량화했다. 결과는 업스트림 가이드(도 26a), 다운스트림 가이드(도 26b), 및 CTG 반복 확장 내에 또는 인접하여 위치한 가이드(도 26c)에 대한 리포펙타민 3000을 사용한 형질감염으로부터 도시된다. 결과는 또한 업스트림 가이드(도 27a), 다운스트림 가이드(도 27b), 및 CTG 반복 확장 내에 또는 인접하여 위치한 가이드(도 27c)에 대한 리포펙타민 2000을 사용한 형질감염으로부터 도시된다. 리포펙타민 2000 형질감염으로, 13개 업스트림 sgRNA는 40%보다 큰 삽입결실을 유도하고 36개 업스트림 sgRNA는 20%보다 큰 삽입결실을 유도했으며, DMPK-U32는 가장 높은 활성(65% 삽입결실 값)을 나타냈다(도 27a). 5개 다운스트림 sgRNA는 40%보다 큰 삽입결실을 유도하고 51개 다운스트림 sgRNA는 20%보다 큰 삽입결실을 유도했으며, DMPK-D87은 가장 높은 활성(60% 삽입결실 값)을 나타냈다(도 27b). CTG 반복 영역과 중첩하는 13개 sgRNA 중 8개는 5개 초과의 연속적인 CTG 또는 CAG 반복 서열을 함유하고 따라서 HEK293T 세포에서 어떠한 삽입결실도 생성하지 않았다(도 27c). 5개 나머지 CTG 반복 영역 sgRNA 중에서, DMPK-R06은 20%의 가장 높은 삽입결실 값을 초래했다(도 27c). 도 26 및 27에 도시된 원시 데이터뿐만 아니라 표적-외 점수를 제공하는 표 8을 또한 참고한다.
[표 8]
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
* 가이드는 예를 들어 숫자에 선행하는 제로 없이 "U6" 또는 "U06"으로 전체에 걸쳐 지칭될 수 있다.
9. DNA-PK 억제의 존재 및 부재로 DMPK의 CTG 반복 절제
a. 재료 및 방법
DM1 근모세포 및 근관의 제조 . 건강한 인간 근모세포(P01431-18F) 및 DM1 환자 근모세포(03001-32F)를 쿡 미요사이트로부터 획득했다. 일차 인간 근모세포는 Myotonic™ 기저 배지(Cook myosite, MB-2222) 및 MyoTonic™ 성장 보충물(Cook myosite, MS-3333)로 구성된 성장 배지에서 배양되었다. 배양 배지를 MYOTONIC DIFFERENTIATION MEDIA(Cook myoite, MD-5555)로 변경하여 근모세포 분화를 유도하였다. 분화 배지로 교체한 후 근관이 형성되었고, 분화 유도 7일 후에 근관 샘플을 수집하였다. 일차 인간 근모세포를 뉴클레오펙션 3일 전에 제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 인간 CD56 양성 선택 키트 II(StemCell Tech 17855)로 추가 정제하고 RNP의 뉴클레오펙션까지 성장 배지에서 유지했다.
sgRNA 선택 . 42개 sgRNA가 DM1 근모세포에서 추가 평가를 위해 HEK293 T 세포(실시예 8)의 DMPK 3' UTR 스크린에서 선택되었다. sgRNA는 HEK293 T 세포에서 편집 효율성, 인 실리코 표적-외 점수 및 CTG 반복 영역에 측접한 영역의 적용범위를 기반으로 선택되었다. 42개 sgRNA 중에서 22개 업스트림 및 20개 다운스트림 sgRNA가 선택되었다(표 9).
RNP의 제조 . Cas9 및 sgRNA를 함유하는 RNP는 1:6(단일-절단 스크린) 및 1:3(이중-절단 스크린) Cas:sgRNA의 비율로 제조되었다. 단일 절단 스크리닝을 위해, RNP 복합체는 10uL의 전기천공 완충액에서 각각 30, 20 또는 10pmole의 Cas9 및 180,120 또는 60pmole의 sgRNA로 어셈블링되었다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 이 용액 10uL를 10uL 뉴클레오펙션 완충액에서 3x105 일차 근모세포와 혼합했다. 이중-절단 스크린의 경우, RNP 복합체는 5uL 전기천공 완충액에서 10pmole Cas9 및 30pmole sgRNA가 있는 개별 sgRNA에 대해 먼저 어셈블링되었다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 2개 RNP를 1:1 비율로 혼합한 다음 10uL 전기천공 완충액에서 2x105 일차 근모세포와 혼합하여 각 반응에서 최종 RNP가 20pmole cas9 + 30pmole sgRNA1 + 30pmole sgRNA2를 함유하도록 했다.
DM1 근모세포로 RNP의 전달 . DM1 근모세포(Cook myosite 03001-32F; 단일-절단 스크린의 경우 반응당 3x105 세포, 이중-절단 스크린의 경우 반응당 2x105 세포)를 Cas9/sgRNA RNP로 뉴클레오펙션했다. 론자 뉴클레오펙터 96-웰 셔틀 시스템이 Cas9(Aldevron) 및 화학적으로 변형된 sgRNA(Synthego)를 전달하는 데 사용되었다. 단일-절단 스크린에서 3가지 용량의 Cas9(10, 20 또는 30pmol)가 평가되었다. 이중-절단 스크린에서는 20pmol Cas9가 사용되었다. 전기천공 후, 뉴클레오펙션 셔틀 장치의 각 웰로부터의 근모세포를 96-웰 세포 배양 플레이트의 6개 동일한 웰로 분할하였다. 전기천공 24시간 후, 새로운 배지를 교체했다. 이들 근모세포는 37℃/5% CO2에서 전기천공 후 72시간까지 배양한 다음 DNA 추출 및 형광 제자리 혼성화(FISH) 염색을 위해 수확하거나 배양 배지를 추가 7일 동안 MYOTONIC DIFFERENTIATION MEDIA(Cook myoite, MD-5555)로 교체함에 의해 근관 분화를 유도했다. 그런 다음 DM1 근관을 FISH 또는 RNA 추출을 위한 수확을 위해 고정했다.
PCR 증폭 . 뉴클레오펙션 후 3일차에, 실시예 8에 기재된 바와 같이 DM1 근모세포의 게놈 DNA를 단리하고 증폭시켰다.
생거 시퀀싱 및 TIDE 분석 . PCR 생성물을 실시예 8에 기재된 바와 같이 분석하였다.
PacBio 시퀀싱 . PacBio 긴 판독 시퀀싱을 사용하여 DMPK CTG 반복 근처의 Cas9 유전자 편집에 대한 가이드 및 DNA PK 억제제 처리의 영향을 조사했다. ~1.2kb 앰플리콘에서 편집의 전체 복잡성을 캡처하기 위해 Illumina 짧은 판독 시퀀싱(<<300NT 판독)에 비해 긴 판독 시퀀싱이 선택되었다. DMPK 유전자의 CTG 반복을 중심으로 하는 1219 NT 앰플리콘을 증폭하는 유전자 특이적 프라이머 CGCTAGGAAGCAGCCAATGA(서열번호: 53374) 및 TAGCTCCTCCCAGACCTTCG(서열번호: 53375)에 PacBio 특이적 16 NT 인덱스가 첨부되었다. 정방향 및 역방향 프라이머에 대한 최종 형식은 /5Phos/GGGT(16NT_index) CGCTAGGAAGCAGCCAATGA(서열번호: 53376) 및 /5Phos/CAGT(16NT_index) TAGCTCCTCCCAGACCTTCG(서열번호: 53377)였다. 5' 인산화는 SMRTBell 어댑터의 결찰을 촉진하고 정방향 또는 역방향 프라이머에 추가된 GGGT 또는 CAGT 염기는 결찰 효율을 정상화하는 것뿐만 아니라 탈다중화를 촉진하는 데 도움이 된다.
PacBio 라이브러리를 생성하기 위해, WT 또는 DM1 세포를 96웰 플레이트에서 가이드 및/또는 화합물로 처리했다. 제조업체의 지시에 따라 DirectPCR 용리 시약(Viagen Bio, 301-C)를 사용하여 DNA를 회수하고 향후 사용을 위해 동결시켰다. 이 용해물 2μl를 NEB의 2XQ5 PCR 믹스(New England Biolabs, M0491)와 함께 25μl PCR에 사용했다. 인덱싱된 프라이머는 각각 250nM으로 포함되었다. 사용된 모든 프라이머와 인덱스는 아래에 나타나 있다. 기울기는 69℃의 최적 어닐링 온도를 식별하는 데 사용되었고 총 30 주기를 사용하여 SMRTBell 결찰을 위한 충분한 앰플리콘을 생성하면서 편집 분포를 왜곡할 수 있는 불필요한 증폭을 최소화했다. 사용된 주기화 매개변수는 아래와 같다.
Figure pct00144
PCR을 분자 생물학 등급의 물에 1:10으로 희석하고 고감도 D5000 테이프(Agilent, 5067-5592)를 사용하여 Agilent 4200 TapeStation(Agilent, G2991AA)에서 실행했다. 현저한 피크 ~1200 뉴클레오티드(NT)가 일부 샘플에서 검출되었을 뿐만 아니라 몇몇 더 작은 밴드도 검출되었는데, 이는 결실을 나타낸다. 샘플을 풀링하고 2개 순차적 0.7 X 비율 AmpureXP 비드 단계(Beckman Coulter, A63880)로 정제했다. 제조업체의 프로토콜에 따라 100μl 및 25μl TE로 일련의 용출을 수행했다. 샘플을 SMRTBell 어댑터에 결찰하고 10시간 데이터 수집 동안 8M SMRTCell을 사용하여 PacBio Sequel II(Fornax Biosciences) 상에서 시퀀싱했다. 서열 탈다중화, 어댑터 제거 및 원형 컨센서스 서열로의 서브리드의 처리는 Fornax Biosciences에 의해 수행되었다. PacBio 바코드 프라이머- 인덱스(IDT Technologies)는 표 9에 나타나 있다.
[표 9]
Figure pct00145
PacBio 데이터는 PacBio SMRT 도구 명령줄 프로그램을 사용하여 처리되었다. 원형 컨센서스 서열은 각각 ccs 및 리마 도구를 사용하여 호출되고 탈다중화되었다. 그런 다음 pbmm2(mimimap2용 랩퍼)를 사용하여 판독을 앰플리콘에 정렬했다. 정렬을 위해, pbmm2에서 RNA 시퀀싱 사전설정이, 이들 설정이 큰 결찰을 보다 정확하게 감지할 수 있다는 가정 하에(RNA 시퀀싱 정렬이 이미 인트론을 감지하도록 설정되어 있기 때문임) 사용되었다.
품질 관리를 위해, 적어도 30의 매핑 점수(MAPQ)를 갖는 기준 앰플리콘에 매핑되지 않은 모든 판독이 제거되었다. 400개 미만 또는 1500개 초과의 염기쌍 길이인 판독도 제거되었다. 부가하여, 다중 정렬에 걸쳐 분할된 판독, 정렬의 시작 또는 끝에서 20개 초과의 소프트-클리핑된 염기를 갖는 판독, 전체 CIGAR 문자열에 걸쳐 있는 적어도 10bp 내에 있지 않은 판독이 제거되었다.
CIGAR 문자열은 각 판독에서 관찰된 모든 변이체를 호출하도록 구문분석되었다. PacBio 시퀀싱은 이러한 영역에서 비교적 높은 오류율을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에 단독중합체 영역에서 짧은 삽입결실은 가짜일 가능성이 있는 것으로 표시되었다. 파일업은 bedtools genomecov 도구로 생성되었다.
액적 디지털 PCR(ddPCR) . ddPCR 프라이머 및 프로브 서열은 Primer3Plus(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)로 설계되었다. 표적 프라이머/프로브 세트가 CTG 반복 절제를 검출하기 위해 사용되었고, 참고 프라이머/프로브 세트가 DMPK 유전자의 엑손 1에 위치한 영역을 증폭하기 위한 대조군으로 사용되었다. 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 10에 열거되어 있다.
[표 10]
Figure pct00146
24uL의 ddPCR 반응은 12μL의 프로브용 슈퍼믹스(dUTP 없음)(Bio-Rad Laboratories), 1μL의 참고 프라이머 믹스(21.6μM), 1μL의 참고 프로브(6μM), 1μL의 표적 프라이머 믹스(21.6 μM), 1μL의 표적 프로브(6 μM) 및 8μL의 샘플 게놈 DNA로 구성되었다. QX200 액적 생성기(Bio-Rad Laboratories)와 함께 프로브 오일을 사용하여 액적을 생성했다. 액적을 96웰 PCR 플레이트로 옮기고 밀봉하고 C1000 딥 웰 써모사이클러(Bio-Rad Laboratories)에서 다음 주기화 프로토콜 하에서 순환하였다: 95℃에서 10분, 이어서 94℃에서 30초의 40 주기(변성) 및 58℃에서 1분(어닐링)에 이어서 98℃에서 10분(효소 비활성화) 및 무한 4℃ 유지의 사후-주기화 단계. 그런 다음 순환된 플레이트를 딥-웰 블록을 갖는 C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories) 상에서 실행되는 Bio-Rad QX200 액적 판독기를 사용하여 FAM 및 HEX 채널로 옮겨 판독했다. 모든 ddPCR 반응은 다음 열 주기화 조건 하에서 실행되었다. 1) 10분 동안 95℃; 2) 30초 동안 94℃; 3) 1분 동안 58℃; 4) 단계 2와 단계 3을 39회 반복한다; 5) 10분 동안 98℃. ddPCR 분석은 Bio-Rad QuantaSoft 프로 소프트웨어에 의해 수행되었다.
형광 제자리 혼성화(FISH).
MBNL1/(CUG)n 병소 영상화는 DM1 근모세포에서 DMPK sgRNA를 갖는 CTG 반복 절제를 평가하기 위한 직교 방법으로 사용되었다. 미오제닌 항체는 근모세포에서 분화된 근관에서 근핵을 식별하는 데 사용되었다.
세포를 4% PFA로 실온에서 15분 동안 고정하고 실온에서 1x PBS에서 각각 10분 동안 5회 세정하였다. 즉시 조사하지 않으면 세포를 4℃에서 보관했다.
FISH 절차를 위해, 세포를 실온에서 5분 동안 1x PBS에서 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화시켰다.
세포를 실온에서 10분 동안 30% 포름아미드, 2x SSC로 미리 세정하였다. 그런 다음 세포를 30% 포름아미드, 2x SSC, 2μg/mL BSA, 66μg/mL 효모 tRNA, 2mM 바나딜 복합체에서 1ng/μL의 Cy3-PNA(CAG)5 프로브(PNA Bio, F5001)로 80℃에서 15분 동안 프로빙했다.
그런 다음 세포를 30분 동안 42℃에서 30% 포름아미드, 2x SSC에서, 그 다음 37℃에서 30분 동안 30% 포름아미드, 2x SSC에서, 그 다음 실온에서 10분 동안 1x SSC에서, 그리고 마지막으로 실온에서 10분 동안 1x PBS에서 세정하였다. 다음으로 세포를 1x PBS + 1% BSA에서 항-MBNL1 항체(1:1000 희석, Santacruz, 3A4) 항-미오제닌 항체(1:500 희석, Abcam - 근관 샘플 전용)로 4℃에서 밤새 프로빙했다. 세포를 1x PBS로 실온에서 각각 10분 동안 2회 세정하였다. 세포를 1x PBS + 1% BSA(1:500 희석)에서 염소 항-토끼 Alexa 647 및 염소 항-토끼 Alexa 488(근관 전용)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 1x PBS로 실온에서 각각 10분 동안 2회 세정하였다. 세포를 Hoechst 용액(0.1mg/ml)으로 5분 동안 염색한 다음 1x PBS로 5분 동안 한번 세정했다.
PBS를 흡인하고 웰당 신선한 PBS(100μl)를 첨가하였다. 이미징 플레이트를 접착성 알루미늄 호일로 밀봉하고 MetaXpress(Molecular Devices)를 사용하여 이미징했다.
RNA 추출 및 qRT-PCR . DM1 근관에서 sgRNA의 쌍에 의한 CTG 반복 절제의 기능적 판독값으로 미스-스플라이싱 보정이 사용되었다. RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ 키트(Thermal Fisher, AM1728)로 추출하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 qRT-PCR에 의해 분석했다.
프라이머 서열은 추가 서열의 표에 열거되어 있다.
b. DM1 근모세포에서 DMPK의 편집 효율성을 위한 sgRNA의 스크리닝
DMPK 유전자의 CTG 반복 확장에 측접하는 42개 sgRNA가 CTG 반복 확장을 편집하기 위해 선택되었다. 이들 42개 sgRNA 중 22개는 CTG 반복 확장의 업스트림(정지 코돈과 CTG 반복 확장 사이)에 위치하고 20개는 CTG 반복 확장의 다운스트림(CTG 반복 확장과 DMPK의 마지막 엑손의 말단 사이에 위치했거나 또는 CTG 반복 확장과 부분적으로 중첩한다.
서열번호: 3332, 3916, 3420, 3748, 3780, 3396, 4028, 3692, 3796, 3388, 3940, 3684, 3820, 3660, 3724, 3804, 3860, 3516, 3772, 3372, 3356, 4012, 2204, 1708, 2212, 2172, 1780, 2260, 2116, 2180, 1644, 1740, 1748, 2324, 1772, 1540, 2516, 2460, 2196, 2596, 2164, 또는 2620의 18-mer 스페이서 서열을 포함하는 gRNA가 시험되었다. 보다 구체적으로, 시험된 가이드는 표 11에 나타낸 바와 같은 예시된 20-mer 가이드였다.
편집 효율을 평가하기 위해, 개별 sgRNA를 spCas9와 함께 RNP로 제조하고 DM1 근모세포에 전달했다. 게놈 DNA를 세포에서 단리하고 PCR로 증폭했다. 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석을 사용하여 각 sgRNA에 의해 생성된 삽입결실의 빈도를 정량화했다. 결과는 TIDE 분석에 의한 편집 효율 %로서 3가지 농도 spCas9(10, 20, 또는 30pmol)에서 업스트림 및 다운스트림 가이드에 대해 도시된다(도 28a, 도 28b). 20pmol spCas9에서 편집 효율 %는 표 11에 나타나 있다.
[표 11]
Figure pct00147
Figure pct00148
* 염색체 재배열을 유발할 수 있음.
DM1 근모세포에서 편집 효율을 Spearman 상관관계를 사용하여 HEK293T 세포에서 얻은 것과 비교했다(분석에 사용된 HEK293 T 세포 데이터에 대해서는 실시예 8 참고). 도 29는 양 세포 유형에서 시험된 42개 업스트림 및 다운스트림 가이드 RNA에 대한 Spearman 상관관계 플롯(x축 상의 근모세포 및 y축 상의 HEK293 T 세포)을 도시한다. 비교는 rho-0.528의 Spearman 상관 관계 값 및 0.0002의 p-값을 초래했다.
DMPK의 3' UTR을 표적화하는 개별 sgRNA의 편집 효율을 가시화하기 위해, 처리된 DM1 근모세포의 게놈 DNA로부터의 PCR 생성물을 DNA 겔 전기영동으로 분리하였다(도 30). 일부 sgRNA의 경우 DM1 근모세포에서 유도된 낮은-빈도 큰 삽입결실(>50bp)로 인해 높은 편집 효율이 TIDE 점수에 반영되지 않았다. 예를 들어, sgRNA DMPK-U14(서열번호: 3938)는 생거 시퀀싱(도 31a) 및 DNA 겔 전기영동(도 31b)에 의해 입증된 바와 같이 낮은-빈도 큰 삽입결실을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 다른 sgRNA는 또한 표 11에 나타나고 도 32에 묘사된 바와 같이 DM1 근모세포에서 큰 삽입결실을 유도하였다. 중요하게는, 일부 개별 sgRNA는 CTG 반복 영역의 절제를 초래하는 큰 삽입결실을 유도하였다(표 11, 도 32 참고).
DM1 근모세포에서의 TIDE 점수(예를 들어, >30% 편집 효율, 표 11)에 기반하여, 15개 업스트림 sgRNA(DMPK-U57, DMPK-U10, DMPK-U54, DMPK-U26, DMPK-U27, DMPK-U55, DMPK-U6, DMPK-U32, DMPK-U22, DMPK-U56, DMPK-U14, DMPK-U67, DMPK-U20, DMPK-U34, DMPK-U30) 및 11개 다운스트림 sgRNA(DMPK-D87, DMPK-D63, DMPK-D42, DMPK-D89, DMPK-D59, DMPK-D34, DMPK-D51, DMPK-D88, DMPK-D68, DMPK-D62, DMPK-D35)가 DM1 근모세포에서 쌍으로 스크리닝을 위해 식별되었다.
c. DM1 근모세포에서 예시적인 가이드 쌍을 갖는 DMPK의 CTG 반복 절제
3개 업스트림 sgRNA(서열번호: 3778, 3386, 3354) 및 3개의 다운스트림 sgRNA(서열번호: 2514, 2258, 2210)를 포함하는 sgRNA의 쌍을 선택하고 DM1 근모세포에서 CTG 반복 절단의 효율에 대해 시험했다. 각 sgRNA는 개별적으로 시험되었으며 다음 sgRNA는 쌍으로 시험되었다(서열번호: 3778 및 2258(쌍 1); 3778 및 2210(쌍 2); 3386 및 2258(쌍 3); 3386 및 2210(쌍 4); 3354 및 2514(쌍 5)).
CTG 반복 절제 효율을 평가하기 위해, sgRNA의 쌍을 spCas9(20pmol)를 갖는 RNP로 제조하고 뉴클레오펙션에 의해 DM1 근모세포에 전달하였다. CTG 반복 절단은 개별 sgRNA(서열번호: 3778, 3386, 3354, 2514, 2258, 2210) 또는 sgRNA 쌍(서열번호: 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 3354 및 2514)으로 처리된 DM1 환자 근모세포에서 야생형 대립유전자의 PCR에 의해 평가하고(도 33a의 도식) 건강한 근모세포와 비교했다. 야생형 대립유전자 및 이중-절단 편집 대립유전자를 DNA 겔 전기영동에 의해 분리하였다(도 33b).
CTG 반복 절제는 신호의 소실 ddPCR 검정을 사용하여 추가로 측정되었다(도 33a의 도식). 질환 대립유전자의 보정 %는 개별 sgRNA와 비교하여 시험된 sgRNA의 쌍에 대해 더 컸다(도 33c).
CTG 반복 절제는 DM1 근모세포(도 34) 및 DM1 근관(도 35)에서 sgRNA 쌍 또는 개별 sgRNA로 처리에 이어 FISH에 의한 (CUG)n RNA 병소의 감소를 측정함에 의해 추가로 평가되었다. 일반적으로 CTG 반복의 돌연변이 전사체를 갖는 세포는 핵 RNA 병소에 억류된다. 따라서, CTG 반복을 절제하는 sgRNA로 처리된 근모세포는 (CUG)n RNA 병소에서의 감소를 나타낸다.
CUG 반복 RNA의 축적은 스플라이싱을 정상적으로 조절하는 단백질의 기능을 방해하여 다른 유전자의 미스-스플라이싱된 mRNA 생성물의 발현을 초래할 수 있다. 다른 유전자의 스플라이싱에 대한 DMPK에서 CTG 반복 절단의 영향은 sgRNA 쌍(서열번호: 3386/2210)을 사용하여 DM1 근관에서 평가되었다. 결과는 qPCR에 의해 BIN1(도 36a), DMD(도 36b), KIF13A(도 36c) 및 CACNA2D1(도 36d) mRNA에서 RNA 스플라이싱의 부분적 복원을 보여주는 것을 나타났다.
d. DNA-PK 억제가 있는 DM1 근모세포에서 DMPK의 CTG 반복 절제
DM1 근모세포에서 편집 효율에 대한 스크린으로부터의 개별 가이드 RNA를 DNA-PK 억제의 존재 및 부재로 CTG 반복 절제에 대해 추가로 분석하였다. 구체적으로, DM1 근모세포를 3μM 화합물 6 또는 DMSO를 갖는 spCas9 및 가이드 RNA(DMPK-U10(서열번호: 3914), DMPK-U40(서열번호: 3514), DMPK-D59(서열번호: 1778), DMPK-D13(서열번호: 2458), DMPK-U16(서열번호: 3858), DMPK-U54(서열번호: 3418), DMPK-D63(서열번호: 1706), 또는 DMPK-D34(서열번호: 2258))를 함유하는 RNP로 처리하였다. 샘플은 PCR 및 TapeStation 전기영동에 의해 처리되었다. 화합물 6 처리된 샘플에서 더 두드러진 밴드는 DMSO 대조군과 비교하여 증강된 절제 비율을 나타낸다(도 37, 동그라미).
DNA-PK 억제의 존재 및 부재로 이중 gRNA CTG 반복 절제 후 DM1 근모세포에서 미스-스플라이싱 보정을 또한 평가하였다. DM1 근모세포를 3μM 화합물 6의 존재 및 부재로, spCas9 및 가이드 RNA(DMPK-U57 및 GDG_Cas9_Dmpk3으로도 지칭된 서열번호: 3330; 및 DMPK-D03 및 GDG_Cas9_Dmpk_6으로도 지칭된 서열번호: 2554)를 함유하는 RNP로 처리하였다. 미스-스플라이싱 보정은 gRNA의 쌍(도 38a), AAVS1 gRNA(도 38b), 또는 모의 전기천공(도 38c)으로 처리된 세포에서 유전자 GFTP1, BIN1, MBNL2, DMD, NFIX, GOLGA4 및 KIF13A에 대해 평가되었다.
e. 예시적인 가이드 쌍을 갖는 DNA-PK 억제제의 용량 반응
DMPK의 CTG 반복 절제에 대한 DNA-PK 억제의 용량 반응을 DM1 환자 섬유아세포(실시예 1에서 상술한 세포)에서 평가하였다. 세포는 spCas9 및 가이드 쌍(서열번호: 3330(GDG_DMPK3) 및 서열번호: 2506(CRISPR-3); 또는 서열번호: 3330(GDG_DMPK3) 및 서열번호: 2546(CRISPR-4))과 증가하는 용량의 화합물 6(30nM, 300nM, 3μM 및 10μM) 또는 DMSO을 함유하는 RNP로 처리되었다. 절제된 생성물에 상응하는 더 강한 밴드는 DNA-PKi의 증가하는 용량을 갖는 두 쌍 모두에 대해 관찰되었다(도 39a 및 39b).
f. SaCas9 및 DNA-PK 억제제로 DMPK의 CTG 반복 절제
단일 가이드 절제는 saCas9를 사용하여 DNA-PK 억제제(화합물 6)의 존재 및 부재로 DM1 환자 섬유아세포(실시예 1에서 상술한 세포)에서 평가되었다. 세포는 saCas9 및 개별 가이드를 함유하는 RNP로 처리되었다(도 40b)(서열번호: 1153(gRNA 1); 서열번호: 1129(gRNA2)).
g. DNA-PK 억제를 갖는 개별 sgRNA로 CTG 반복 절제의 스크리닝
DMPK의 3' UTR을 표적화하는 42개 개별 SpCas9 sgRNA(표 11)의 스크린은 DMSO 또는 3uM 화합물 6을 갖는 DM1 근모세포에서 수행되었다. 전기천공 후 세포를 DMSO 또는 3uM 화합물 6과 함께 24시간 동안 인큐베이션했다. 도 41a-b는 2회 복제 실험으로부터 편집된 세포로부터의 DMPK의 PCR 증폭된 3'UTR 영역의 전기영동도의 합성물을 도시한다. 비-표적화 대조군 gRNA는 CDC42BPB gRNA(GAGCCGCACCUUGGCCGACA)(서열번호: 53408) 및 RELA gRNA(GAUCUCCACAUAGGGGCCAG)(서열번호: 53409)를 포함했다. 단일 절단 절제 실험에 대한 예시적인 PacBio 시퀀싱 판독 파일업 결과는 DNA-PK 억제로 개선된 증강된 절제를 나타낸다(도 42a-f).
h. DNA-PK 억제를 갖는 가이드 쌍으로 CTG 반복 절제의 스크리닝
DMPK 유전자의 3' UTR을 표적화하는 42개 SpCas9 sgRNA(표 11, CTG 반복의 22개 sgRNA 업스트림 및 20개 다운스트림)의 모든 쌍별 조합의 스크린을 DM1 환자 섬유아세포(실시예 1에서 상술한 세포)에서 수행하였다. 각 가이드 쌍이 사전-장입된 RNP로 전기천공한 후 세포를 DMSO 또는 3uM 화합물 6과 함께 24시간 동안 인큐베이션했다. 도 43a-e는 편집된 세포로부터의 DMPK의 PCR 증폭된 3'UTR 영역의 전기영동도의 합성물을 도시한다. 샘플(도 42a-e에 도시된 결과에 상응)을 하기 표 12A-E에 나타낸 바와 같이 5개 플레이트 상에서 실행하였다.
[표 12a]
Figure pct00149
[표 12b]
Figure pct00150
[표 12c]
Figure pct00151
[표 12d]
Figure pct00152
[표 12e]
Figure pct00153
10. 개별 프라탁신 sgRNA의 스크린
a. 재료 및 방법
sgRNA 선택 . FXN 유전자의 인트론 1 내에 GAA 반복을 함유하는 선택된 영역은 센스(+1) 또는 안티센스 가닥(-1) 상에서 NGG SpCas9 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 스캔되었고 가이드 서열은 PAM에 인접한 20-뉴클레오티드 sgRNA 스페이서 서열에 기반하여 생성되었다. 218개 sgRNA는 GAA 반복의 업스트림 영역(chr9: 69 035 950 - 69 037 295) 내에서 확인되었고 173개 sgRNA는 GAA 반복의 다운스트림 영역(chr9: 69 037 307 - 69 038 600)에서 식별되었다. 업스트림 및 다운스트림 영역 둘 모두에서 각 sgRNA에 대해 인-하우스 알고리즘을 사용하여 계산된 표적 외 예측을 수행했다. 총 391개 sgRNA 중에서 96개 sgRNA의 서브세트를 선택하여 긴 반복 길이의 2개 환자 세포주에서 그리고 Cas9/sgRNA RNP 농도의 스크린을 위한 2개의 RNP(리보핵단백질) 복합체 농도(도 44 참고)에서 편집 효능을 평가하는 스크린으로 이동했다). sgRNA의 선택 기준에는 낮은 표적 외 점수 및 게놈 위치가 포함되었다. 이 단일-절단 sgRNA 스크린에서 총 45개 sgRNA(GAA 반복의 25개 sgRNA 업스트림 및 GAA 반복의 20개 sgRNA 다운스트림)가 sgRNA 쌍 조합 스크린으로 이동하도록 선택되었다(표 14). 선택 기준에는 시험된 조건 전반에 걸친 높은 편집 효율, 게놈 위치 및 SNP(단일 뉴클레오티드 다형성)의 존재가 포함되었다.
FA 환자 세포로의 RNP 복합체의 전기천공 . Lonza 뉴클레오펙터 96-웰 셔틀 시스템이 Cas9(Aldevron) 및 화학적으로 변형된 sgRNA(Synthego)를 두 개의 세포주로 전달하는 데 사용되었으며, 이는 긴 GAA 반복: GM14518(림프모구양 세포주) 및 GM03665 (섬유아세포 세포주) (Coriell Institute)를 가진 두 명의 환자에서 파생되었다. 12uL의 전기천공 완충액의 부피에서 36pmol의 Cas9 및 108pmol sgRNA를 포함하는 RNP 복합체를 먼저 어셈블링했다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 이 용액을 2가지 희석액에서 세포와 혼합하여 각 세포주에 대해 2가지 농도의 RNP가 전달되었다: 하나는 15pmol Cas9 + 45pmol sgRNA("높음")를 갖고 다른 하나는 7.5pmol Cas9 +22.5pmol sgRNA("낮음")을 갖는다. 전기천공에 이어서, 세포를 37℃/5% CO2에서 72시간 동안 배양한 다음 DNA 추출을 위해 수확했다.
생거 시퀀싱 및 ICE 분석 . 각 가이드에 대한 관련 유전자좌는 PCR에 의해 증폭되었고 생성물은 생거 시퀀싱을 위해 GeneWiz로 전송되었다. 분석되는 유전자좌의 길이와 복잡성으로 인해 시퀀싱 프라이머는 각 sgRNA에 대해 맞춤화되었다. 적절한 유전자좌의 증폭 및 시퀀싱에 사용된 프라이머 서열은 추가 서열의 표(서열번호: 36-54)에 나타나 있다. 삽입결실 값은 ICE(CRISPR 편집의 추론) 분석 알고리즘(Synthego)을 사용하여 추정되었다. ICE 분석은 생거 시퀀싱 데이터를 사용하여 삽입결실의 식별 및 우세를 정량화하는 방법이다(Hsiau, T. 등(2018) bioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/251082v3).
b. 프라탁신 sgRNA의 단일-절단 스크린의 결과
FXN 유전자의 GAA 반복에 측접하는 96개 sgRNA를 포괄하는 세트를 편집 효능 평가를 위해 선택했다. 이들 중 56개 sgRNA는 GAA 반복의 업스트림에 위치하고 40개 sgRNA는 GAA 반복의 다운스트림에 위치했다. 편집 효능을 평가하기 위해, 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 단백질을 함유하는 RNP 복합체를 뉴클레오펙션에 의해 환자 세포주에 전달했다. 편집 효율에 대한 포괄적인 개요를 얻고 최고의 절단 효능을 가진 선도적 sgRNA를 차별화하기 위해 2가지 RNP 농도가 사용되었다. 부가적으로, 상이한 세포 유형/공여체 간의 삽입결실 효능의 일관성을 각 sgRNA에 대해 평가했다. 이들 세포 유형은 환자 림프모세포와 긴 반복 길이의 섬유아세포로 구성되었다. 도 45 8은 GAA 반복 확장의 업스트림에 위치한 56개 sgRNA의 삽입결실 효능을 도시한다. 이들 중, 29개 sgRNA는 50%보다 높은 삽입결실 효능을 가졌으며, 이는 시험된 조건 간에 일치했다. 도 46은 모든 조건에서 50%보다 높은 효능을 갖는 21개 sgRNA와 함께, GAA 반복의 다운스트림에 위치한 40개 sgRNA의 삽입결실 효능을 도시한다. 게놈 위치 및 SNP 평가에 부가하여 이들 결과는 반복 절제 효율에 대한 sgRNA 쌍 조합 스크린에서 평가하기 위한 45개 sgRNA(GAA 반복의 25개 sgRNA 업스트림 및 GAA 반복의 20개 sgRNA 다운스트림)의 세트를 선택하는 기준을 제공했다. 평가되는 다른 판독값에는 FXN mRNA의 구조 및 단백질 수준이 포함된다. sgRNA 쌍 스크린은 20개 다운스트림 sgRNA와 쌍을 이룬 선택된 25개 업스트림 sgRNA의 모든 가능한 조합을 평가하여 총 500개의 조합을 생성할 것이다.
[표 13]. GAA 반복을 함유하는 FXN의 제1 인트론의 선택된 영역 내에서 선택된 가이드 RNA.
Figure pct00154
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[표 14]. 반복 확장 절제 효율과 FXN mRNA 및 단백질 구조를 위한 이중-절단 스크린을 위한 선별된 sgRNA.
Figure pct00165
Figure pct00166
11. DNA-PK 억제로 심근세포에서 FXN의 프라탁신 유전자좌에서 GAA 반복 절제
FA 유사분열-후 심근세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 iPSC의 배양물로부터 제조하였다.
세포를 24시간 동안 spCas9 및 GAA 반복에 측접하는 가이드 쌍(서열번호: 52666 및 26562) 및 화합물 6(3μM) 또는 DMSO로 처리했다. 반복 절제의 비율은 7일차 및 14차일에 ddPCR 검정에 의해 평가하였다(도 47a). 14일차의 FXN mRNA의 상대적 수준은 qPCR에 의해 평가되었고(도 47b), 프라탁신 단백질의 수준은 14일차에 웨스턴 블롯에 의해 측정되었다(도 47c). DNA-PK 억제제로 처리는 GAA 반복 절제 비율을 증강시키고 유사분열-후 심근세포에서 증가된 FXN mRNA 수준과 프라탁신 단백질을 초래했다.
12. FA iPSC에서 FXN의 프라탁신 유전자좌에서 GAA 반복 절제
GAA 반복 절제는 RNP 전기천공을 사용하여 야생형(WT) 및 FA iPSC(4670)에서 Cpf1(Cas12a) 및 SpCas9로 평가되었다. DNA 겔-전기영동은 Cpf1 가이드 RNA(GD1&2)(서열번호: 47047 및 7447) 및 SpCas9 가이드 RNA(Cas9 LG5&11)(서열번호: 52666 및 26562)를 사용하여 Cpf1(상자, 도 48)로 GAA 반복 절제 후 절제된 DNA 밴드를 나타냈다.
13. Cpf1로 피질 뉴런에서 FXN의 프라탁신 유전자좌에서 GAA 반복 절제
추가 Cpf1 가이드 쌍은 하기 표 15에 나타낸 바와 같이 iPSC-유래된 피질 뉴런에서 GAA 반복 절제를 위해 선택되었다.
[표 15]
Figure pct00167
서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030의 18-mer 스페이서 서열을 포함하는 gRNA를 시험했다. 보다 구체적으로, 시험된 가이드는 표 15에 나타낸 바와 같은 시험된 20-mer 가이드였다.
gRNA의 쌍을 iPSC-유래된 피질 뉴런에서 Cpf1(Cas12a)로 시험했다. 다음 가이드 쌍이 사용되었다: 가이드 1&2(서열번호: 47047 및 7447); 가이드 3&4(서열번호: 7463 및 46967); 가이드 5&6(서열번호: 46768 및 7680); 가이드 7&2(서열번호: 47032 및 7447). PCR 생성물의 DNA 겔 전기영동은 GAA 반복 절단 후 절제된 DNA 밴드를 나타냈다(도 49).
GAA 반복 절제는 Cpf1 및 gRNA(서열번호 47047 및 7447)를 사용하여 야생형 iPSC-유래된 피질 뉴런의 단일 세포 핵에서 추가로 확인되었다. 세포 핵은 제조업체의 프로토콜에 따라 핵 단리 키트: Nuclei EZ prep(Sigma, NUC101)을 사용하여 준비했다. 마우스 뇌로부터의 핵 단리를 위해, 조직 샘플을 각각 막자 A 및 막자 B(Sigma)로 2ml 용리 완충액에서 2 x 25x 도운싱했다. 그런 다음 용리액을 얼음 상의 1ml 팔콘 튜브 안으로 5분 동안 옮겼다. 용리액을 500xg에서 5분 동안 스핀다운하고 펠렛을 1ml 용리 완충액에 재현탁하고 추가 3ml 용리 완충액을 첨가하고 5분 동안 얼음 상에서 유지했다. 용리액을 500xg에서 5분 동안 스핀다운하고 펠렛을 1ml 재현탁 완충액에 재현탁했다. 핵의 형광 표지를 위해 Vybrant DyeCycle Ruby Stain(Thermo Fisher, V10309, 1:800) 또는 Hoechst(Invitrogen, H3570, 1:10,000)를 첨가했다. 그런 다음 단리된 핵을 BD FACSMelody Cell Sorter(BD Biosciences)를 사용하여 QuickExtract DNA 추출 용액(Lucigen, QE9050)으로 분류했다. 시퀀싱 결과는 균질한 GAA 반복 절제를 갖는 8/10 핵과 이종성 GAA 절제를 갖는 2/10 핵을 보여주었다.
14. 성체 마우스 뇌에서 FXN의 프라탁신 유전자좌에서 생체내 GAA 반복 절제
AAV 벡터는 성체 YG8+/- 마우스에서 뉴런을 표적화하기 위해 설계되었다(도 50). YG8+/- 마우스는 확장된 GAA 반복을 가진 인간 프라탁신 이식유전자를 담지한다. hSynapsin 1 프로모터는 뉴런에서 AsCpf1(Cas12a, 벡터 1) 및 mCherry-KASH(벡터 2)의 발현을 유도한다. 2개 Cpf1 gRNA(서열번호: 47047 및 7447)를 하나의 U6 프로모터의 제어 하에 무작위로 클로닝하여 GAA 반복부를 절제하였다.
이중 가이드 절제 실험을 성체 YG8+/- 마우스의 층 안으로 이중 AAV 전달(1:1 비율)을 갖는 프리드라이히의 아탁시스의 마우스 모델에서 AsCpf1(Cas12a)로 수행하였다.
이형접합 성체 수컷 FXN em2.1Lutzy Tg(FXN)YG8Pook/J 마우스(Jackson laboratory, 030930)를 마취시키고 IACUC 승인 절차에 따라 개두술을 수행했다. 1ul의 혼합된 AAV(1:1)를 선조체(0.5mm 브레그마, 1.5mm 측면, 2.5mm 깊이) 안으로 주입했다. 누출을 방지하기 위해, 피펫을 빼기 전에 3분 동안 제자리에 유지했다. 절개부를 봉합하고 수술-후 진통제를 투여하고 IACUC 승인 프로토콜 및 동물의 안락사에 대한 AVMA 지침에 따라 AAV 주사 2주 후에 마우스를 안락사시켰다. 뇌 샘플은 mCherry-KASH 표지된 선조체 뉴런의 진동 분절화 및 형광 영상화를 위해 4% PFA에 고정되었다. 핵 단리 및 FACS를 위해, 선조체를 절개하고 충격 동결시켰다. 다음 AAV1 벡터가 사용되었다: a) hSyn-Cas12a 및 b) Cas12a sgRNA( Sap I)_hSyn_mCh-KASH(SignaGen, ~2.5x10^6 Vg/ml)(아래 표 16 및 각각 서열번호: 53411 및 53412 참고).
모든 AAV 작제물은 Genescript에 의해 합성되었다. Cas12a 및 gRNA 어레이 서열은 다른 곳에서 공개되었다(Zetsche 등, Nat Biotech, 2017). gRNA 어레이 DNA 올리고는 일-방향 어닐링을 사용하고 다른 곳(Zetsche 등, Nat Biotech, 2017)에 기재된 대로 Cas12a sgRNA 벡터의 점착성-말단 디자인 및 SapI 제한을 사용하여 클로닝되었다.
이중 Cas12a sgRNA 어레이를 클로닝하기 위해 다음 fw 올리고가 사용되었다:
agaTACCATGTTGGCCAGGTTAGTC TAATTTCTACTCTTGTAGAT CCAGCATCTCTGGAAAAATAG(서열번호: 53410) 및 (Cas12a 어레이: 이태릭체: Cas12a 직접 반복체, 굵은체: 스페이서, aga: SapI 클로닝 돌출부).
결과는 이중 Cas12a sgRNA로 생체내 뉴런에서 GAA 반복의 성공적인 절제를 나타냈다. 정위 주사 2주 후 뇌의 조직학은 mCherry 양성 선조체를 나타냈다(도 51a). 핵은 FACS에 의해 표적화된 뉴런을 분류하였다(도 51b). DNA 겔-전기영동은 표적화된 뉴런(mCherry +) 대 비-표적화된 세포(mCherry -)에서 Cpf1로 GAA 반복 절제 후 절제된 DNA 밴드를 나타냈다(도 51c). 절제된 DNA 밴드의 단일 클론 생거 시퀀싱 분석은 생체내 뉴런에서 성공적인 GAA 반복 절제를 나타냈다.
[표 16]
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
15. DMPK에서 가이드 쌍으로 CTG 반복 절제
a. 재료 및 방법
가이드 및 프라이머 서열. 프라이머 서열은 추가 서열의 표(서열번호: 55-62)에 도시되어 있다. SpCas9를 갖는 gRNA에 사용된 crRNA 및 tracrRNA는 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(서열번호: 98)였다. SaCas9를 갖는 gRNA에 사용된 crRNA 및 tracrRNA는 GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAU(서열 번호: 97)였다.
SpCas9-발현 HEK293 T 세포의 제조 및 형질감염. CRISPR Cas9 뉴클레아제를 안정적으로 발현하는 세포주는 Genecopoeia에서 구입했다. Cas9는 인간 AAVS1 Safe Harbor 유전자좌(PPP1R2C로도 알려짐)에서 통합된다. 이 세포주는 또한 copGFP와 퓨로마이신 내성 유전자를 발현한다. 별도로 형질감염되거나 형질도입된 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 조합하여 이 세포주는 표적화된 게놈 부위에서 이중-가닥 DNA 파손(DSB)을 유지할 것이다. HEK 293 T 세포를 발현하는 Cas9는 MessengerMax 리포펙타민-기반 전달을 사용하여 개별 IVT gRNA로 형질감염되었다. 게놈 DNA를 세포에서 단리하고 PCR로 증폭했다. 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석을 사용하여 각 sgRNA에 의해 생성된 삽입결실의 빈도를 정량화했다.
DM1 iPSC 세포주의 제조 및 전기천공. SB1 세포주: 세포를 성체 여성 DM1 환자로부터 말초혈액 단핵 세포에서 단리하고 (Nicholas E. Johnson(버지니아 커먼웰스 대학교)으로부터 세포의 공급원) CytoTune®-iPS 센다이 재프로그래밍 키트로 재프로그래밍했다. 클론 SB1을 포함하는 개별 iPSC 클론을 단리했다. SB1 세포주는 나노스트링 검정에 의해 iPSC 세포주와 일치하는 전분화능 시그니처를 가졌다. 고해상도 aCGH 핵형분석은 총체적인 게놈 이상을 나타내지 않았다. 서던 분석은 SB1 세포주가 병원성 CTG 반복 확장(~300 CTG 반복)을 함유한다는 것을 확인시켜주었다(도 52).
4033-4 세포주: 성체 DM1 남성에서 유래된 모 섬유아세포주(GM04033, Coriell Institute)를 CytoTune®-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트를 사용하여 재프로그래밍했다. 클론 4033-4를 포함하는 개별 iPSC 클론을 단리했다. 서던 블롯 분석은 4033-4 세포주가 병원성 CTG 반복 확장(~3000 CTG 반복)을 함유한다는 것을 확인시켜주었다.
DM1 iPSC 세포의 전기천공: DM1 iPSC 세포(반응당 200,000개)를 다음과 같이 제조된 RNP와 혼합하였다.
광범위하게, 도 54-60 및 도 67-68에 상응하는 실험을 위한 RNP 복합체는 각각 1.5μg의 5' 가이드, 3' 가이드 및 3μg의 SpCas9(도 54-60), 또는 SaCas9 뉴클레아제(도 67-68)를 어셈블링함에 의해 제조되었다. 가이드 RNA를 1.5μg/μl로 희석하고 Cas9 뉴클레아제를 3μg/μl로 희석하고 1μl의 각 성분을 함께 조합하고 실온에서 최소 10분 동안 함께 복합화했다.
2μg 가이드 및 2μg의 SaCas9 뉴클레아제를 어셈블링함에 의해 도 55-56에 상응하는 실험을 위한 RNP 복합체를 제조하였다. 개별적으로 화학적으로 합성된 가이드 RNA를 2μg/μl로 희석하고 Cas9 뉴클레아제를 2μg/μl로 희석하고 1μl의 각 성분을 함께 조합하고 실온에서 최소 10분 동안 함께 복합화했다.
세포를 Lonza 뉴클레오펙터(CA-137 설정)로 전기천공하고 전기천공 후 72시간에 수확하였다. 게놈 DNA를 단리하여 TIDE 분석 및 ddPCR 결실 분석을 위한 후속 PCR을 위한 주형으로 사용했다.
시퀀싱 및 TIDE 분석. PCR은 게놈 DNA에 대해 다음과 같이 수행하였다.
PCR 샘플:
Figure pct00171
PCR 조건:
Figure pct00172
PCR 생성물은 AMPure 비드-기반 PCR 정제(Beckman Coulter)를 사용하여 정리했다. AMPure 비드 병을 볼텍싱하고 팔콘 튜브 안으로 분주했다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션에 이어서, 85μL의 비드를 PCR 생성물의 각 웰에 첨가하고 위아래로 10회 피펫팅하고 10분 동안 인큐베이션했다. 그 다음 비드 혼합물을 자석 위에 5분 동안 두었다. 액체를 흡인하고 플레이트를 자석 상에 유지하면서 비드를 70% EtOH로 2번 세정했다. 그런 다음 플레이트를 자석에서 제거하고 20μL의 dH2O를 비드에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합했다. 5-10분 동안 인큐베이션에 이어서, 플레이트를 1분 동안 자석 위에 두었다. DNA를 함유하는 dH2O를 제거하고 PCR 농도를 나노드롭으로 분석했다.
PCR 생성물은 순방향 프라이머(서열번호: 57) 및 역방향 프라이머(서열번호: 58)를 사용하여 서열분석을 위해 보내졌다. 삽입결실 값은 TIDE 분석 알고리즘을 사용하여 추정되었다. TIDE는 주형-매개된 편집 이벤트의 비율을 정량화하기 위해 시퀀싱 전기영동도에서 삽입결실의 스펙트럼의 복구를 기반으로 하는 방법이다(Brinkman, E.A. 등 (2014) Nucleic Acids Res. 42: e168; PMID: 25300484).
2개 신호의 소실(LOS) 액적 디지털 PCR(ddPCR) 검정. 신호의 소실 ddPCR 검정은 CTG 반복 영역의 5' 또는 CTG 영역의 3'인 DMPK의 3' UTR의 영역을 증폭하고 CTG 반복 영역의 성공적인 결실의 결과로 증폭된 영역을 표적화하는 프로브의 신호의 소실을 감지한다(도 53 검정의 개략도 참고). "이중" 또는 "2" LOS ddPCR 검정은 5' LOS 및 3' LOS 검정 둘 모두로부터의 결과를 지칭한다.
5' LOS ddPCR 검정을 위해, 정방향 프라이머(서열번호: 59), 역방향 프라이머(서열번호: 60) 및 프로브(서열번호: 61)가 사용되었다.
3' LOS ddPCR 검정을 위해, 정방향 프라이머(서열번호: 62), 역방향 프라이머(서열번호: 63), 및 프로브(서열번호: 64)가 사용되었다.
ddPCR 샘플을 실온에서 설정했다. DNA 샘플을 10-20ng/μL의 농도로 희석했다. 희석된 DNA(4μL)를 21μL의 ddPCR 혼합물에 첨가했다.
dd PCR 혼합물:
Figure pct00173
플레이트를 열 밀봉으로 밀봉하고 볼텍싱에 의해 혼합한 다음 잠시 원심분리했다. 최종 부피는 25μL였다.
샘플을 자동 디지털 생성을 위해 96웰 플레이트로 옮겼다. 액적(40μL)이 생성되었고 플레이트를 PCR 기계로 옮겼다.
3-단계 사이클링 프로토콜을 실행했다:
Figure pct00174
5' 및 3' 신호의 소실(LOS) ddPCR에 사용된 참고 유전자는 RPP30이었다.
DM1 심근세포에 대한 분화 프로토콜. DM1 심근세포는 DM1 iSPC 세포주 SB1로부터 제조하였다. 세포를 2일 동안 Wnt(4μM CHIR)로 활성화하고, 이어서 2일 동안 Wnt 비활성화(4μM WNT-C59)했다. 세포를 6일 동안 CDM3 배지에서 회복 기간 동안 휴지시켰다. 그런 다음 세포를 1일 동안 대사 선택을 위해 CDM3-무 글루코스 배지로 옮겼다.
DM1 심근세포(반응당 250,000개)를 다음과 같이 제조된 RNP와 혼합하였다. 개별적으로 화학적으로 합성된 가이드 RNA를 1.5μg/μl로 희석하고 Cas9 뉴클레아제를 3μg/μl로 희석하고 1μl의 각 성분을 함께 조합하고 실온에서 최소 10분 동안 함께 복합화했다.
도 61-64에 상응하는 실험을 위한 RNP 복합체는 각각 1.5μg의 5' 가이드, 3' 가이드 및 3μg의 SpCas9 뉴클레아제를 어셈블링함에 의해 제조되었다.
세포를 Lonza 뉴클레오펙터(CA-137 설정)로 전기천공하고 iCell 유지 배지에서 인큐베이션했다. 전기천공 후 72시간에 세포를 수확하였다. 게놈 DNA를 단리하여 TIDE 분석 및 ddPCR 결실 분석을 위한 후속 PCR에 대한 주형으로 사용했다.
표적-외 분석 및 하이브리드 캡처 검정. 상동성-의존적 표적-외 부위 지명. 표적-외 부위를 3가지 예측 알고리즘인: CCTop, CRISPOR 및 COSMID을 사용하여 hg38 인간 참고 게놈에 대한 서열 유사성 및 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 존재를 기반으로 하여 각각의 sgRNA에 대해 계산적으로 예측하였다. CCTop 및 CRISPOR는 sgRNA 서열과 관련하여 최대 3개의 불일치가 있는 잠재적인 표적-외 부위를 지정하는 데 사용되었다. COSMID 알고리즘은 갭이 있는 표적-외 부위를 지정할 수 있고 sgRNA 서열과 관련하여 갭이 없는 최대 3개 불일치 또는 1개 갭이 있는 최대 2개 불일치가 있는 잠재적인 표적-외 부위를 지정하는 데 사용되었다. 3가지 알고리즘 모두 최적의 SpCas9 NGG PAM이 있는 잠재적인 표적-외 부위를 지정했다. 대체 PAM이 또한 COSMID(NAG) 및 CCTop(NAG, NGA, NAA, NCG, NGC, NTG 및 NGT)을 사용한 검색에 포함되었다. 예측된 표적-외 부위는 낮은-복합성 영역과 중첩하는 부위를 제외하기 위해 필터링되었는데 이는 이들 영역에 바르지 않은 판독 매핑 및 삽입결실 호출을 초래하는 무차별 프로브 강화 및 시퀀싱 오류가 발생하기 때문이다. 총 577개 잠재적인 표적-외 부위가 12개 sgRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210)에 걸쳐 지정되었다.
하이브리드 캡처 프로브 라이브러리 디자인. 표적-상 부위 및 표적-외 부위에서 편집 퍼센트는 하이브리드 캡처 검정을 사용하여 측정되었다. 하이브리드 캡처 프로브를 생성하여 표적-상 부위 및 예측된 표적-외를 함유하는 게놈의 영역을 풍부하게 했다. 각 부위에 대해 100bp 측접하는 영역이 부위의 업스트림과 다운스트림 둘 모두에 추가된 다음 120bp 프로브가 양 측접하는 영역을 포함하는 부위에 걸쳐 타일링되었다. 모든 예측된 표적-외 부위뿐만 아니라 표적-상 부위에 대해 부위당 다중 프로브가 설계되었다. 모든 12개 sgRNA로부터 하이브리드 캡처 프로브를 함께 풀링하고 하나의 Agilent SureSelect 프로브 세트를 주문했다. 하이브리드 캡처 라이브러리의 총 표적 영역은 124.85 킬로베이스였다.
편집된 샘플 및 대조군 샘플의 생성. 하이브리드 캡처 검정 샘플은 10μg sgRNA 및 10μg SpCas9 뉴클레아제를 어셈블링함에 의해 제조된 RNP로 2개 WT 공여체 iPSC 주(반응당 1000,000개 세포)를 전기천공함에 의해 생성했다. 세포를 Lonza 뉴클레오펙터(CA-137 설정)로 전기천공하고 전기천공 후 72시간에 수확했다. 샘플은 12개 sgRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210)에 대해 생성되었다. 단지 10μg의 SpCas9 뉴클레아제로 전기천공된 대조군 샘플도 생성되었다. 하이브리드 캡처에 이어서 시퀀싱을 위해 게놈 DNA를 단리했다(QIAamp UCP Micro Kit). 단지 하나의 공여체만이 sgRNA 서열번호: 2210에 대해 이용가능했다.
하이브리드 캡처 라이브러리 준비. 하이브리드 캡처 프로브를 사용한 표적-상 및 표적-외 영역의 하이브리드 캡처 농후화를 Agilent SureSelectXT HS 제조업체 프로토콜(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에서 200ng 입력 게놈 DNA 샘플에 대해 기술된 샘플 준비에 따라 수행했다. 간단히 말해서, 게놈 DNA는 Covaris LE220 기기를 사용한 음향 전단에 의해 단편화되었다. DNA 단편은 말단 수선된 다음 3' 말단에서 아데닐화되었다. 5' 및 3' 특정 어댑터를 DNA 단편에 결찰하고 어댑터-결찰된 DNA 단편을 증폭하고 인덱싱 프라이머로 인덱싱했다. 어댑터-결찰된 DNA 단편은 Agilent 4200 TapeStation에서 Agilent D1000 ScreenTape 검정을 사용하여 검증되었고 Qubit dsDNA BR 검정 키트와 함께 Qubit 3.0 형광계를 사용하여 정량화되었다. 1000ng 어댑터-결찰된 DNA 단편을 제조 권장사항에 따라 1.5시간 동안 사전-프로그래밍된 열순환기를 사용하여 비오틴화된 RNA 미끼로 혼성화했다. 혼성화된 DNA는 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)에 의해 캡처되었다. 광범위한 세정 후, 캡처된 DNA 단편을 제한 주기 PCR로 풍부화했다. 사후-캡처된 DNA 라이브러리는 Agilent 4200 TapeStation에서 Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape 검정을 사용하여 검증되었고 Qubit dsDNA HS 검정 키트와 함께 Qubit 3.0 형광계를 사용하여 정량화되었다. 라이브러리는 서브풀당 4-5개 라이브러리를 갖는, 50ng/라이브러리의 농도로 서브풀링되었다. 서브풀을 10mM Tris-HCl pH 8.0에서 1:10으로 희석하고 KAPA 라이브러리 정량화 키트 - 유니버설을 사용하여 qPCR에 의해 정량화했다. 서브풀을 4nM으로 정규화하고 동등하게 조합하여 최종 시퀀싱 풀을 생성했다.
하이브리드 캡처 라이브러리 시퀀싱 및 분석. 최종 시퀀싱 풀은 다음 구성: 150 x 8 x 8 x 150을 갖는 Illumina 고출력 v2.5 시약 키트를 사용하여 스파이크되고 시퀀싱된 5% PhiX를 갖는 1.8pM의 최종 농도에서 Illumina NextSeq 기계(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 상에 장입되어 3000X 커버리지를 달성한다.
Illumina 베이스콜을 FASTQ 형식으로 변환하고 bcl2fastq 대화 소프트웨어를 사용하여 샘플별 바코드에 의해 역다중화했다. 시퀀싱 데이터는 인간 게놈 빌드 hg38에 대한 기본 매개변수를 사용하여 BWA MEM 알고리즘과 정렬되었다. 정렬된 판독의 탈-중복은 SAMtools로 완료되었다. 각각의 표적-상 부위 및 예측된 표적-외 부위에 대해, 부위를 커버하는 일차 판독 정렬 및 각 말단에 대한 추가 20개 염기가 삽입결실 정량화를 위해 고려되었다. 잠재적 SpCas9 절단 부위의 10bp 내에 삽입결실을 함유하는 모든 판독의 합을 필터링 기준을 통과한 절단 부위에 정렬된 총 판독의 수로 나누어, 그 후보 절단 부위에서 삽입결실 빈도를 제공했다. 적어도 한 쌍의 편집된 샘플과 대조군 샘플 사이에 적어도 0.2% 삽입결실 빈도 차이가 있는 부위는 유의미한 CRISPR/Cas9 편집을 나타낼 수 있는 부위를 식별하기 위해 통계적 시험을 거쳤다. 이러한 부위에 대해, 일-꼬리의 쌍을 이룬 스튜던트스 t-테스트를 수행하여 대조군과 비교하여 편집된 샘플에서 유의하게 많은 편집에 대해 시험하였다. 시험 결과가 P < 0.05로 유의한 경우, 부위는 확인된 표적-외인 것으로 간주되었다. 단지 두 공여체가 11개 sgRNA에 대해 이용가능하고 단지 일 공여체가 12번째 sgRNA(서열번호: 2210)에 대해 이용가능하였기 때문에, 통계적 시험에 실패한 부위는 수동으로 검사되었고 필요한 경우 "잠재적 표적-외 부위"로 주석을 달았고, 더 많은 공여체와 더 높은 시퀀싱 깊이로 더 조사될 수 있다.
하이브리드 캡처 검정 샘플은 아래 나타난 바와 같이 준비되었다.
Figure pct00175
b. SpCas9로 HEK293 T 세포에서 gRNA의 스크리닝
개별 gRNA의 편집 효율을 평가하기 위해, SpCas9를 발현하는 HEK293 T 세포에서 스크리닝을 위해 DMPK 유전자의 CTG 반복 영역에 측접하는 169개 gRNA를 선택하였다. 세포는 리포펙타민-기반 전달을 사용하여 개별 gRNA로 형질감염되었다. 게놈 DNA를 세포에서 단리하고 PCR에 의해 증폭했다. 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석을 사용하여 각 sgRNA에 의해 생성된 삽입결실의 빈도를 정량화했다. 결과는 TIDE 분석에 의한 편집 효율 %로 표시된다(표 17).
[표 17]
Figure pct00176
Figure pct00177
Figure pct00178
Figure pct00179
* 동일한 가이드(서열번호 기준)는 "U" 번호 및 "T" 번호로 전체에 걸쳐 지칭될 수 있다.
c. SpCas9로 DM1 iPSC 세포주에서 gRNA의 스크리닝
가이드 RNA는 2개 DM1 iPSC 세포주(SB1 및 4033-4)에서 스크리닝을 위해 선택되었다. 양 세포주는 병원성 CTG 반복 영역을 함유한다.
6개 업스트림 gRNA(CTG 반복 영역의 5' 측)(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 및 3746) 및 6개 다운스트림 gRNA(CTG 반복 영역의 3' 측)(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914 및 2210)(도 54 개략도 참고)는 SpCas9로 RNP로서 전달된 SB1 세포에서 편집 효율에 대해 시험되었다. 결과는 퍼센트 편집 효율로 표시된다(도 55).
동일한 gRNA가 SB1 세포에서 단독으로 또는 쌍으로 DMPK 유전자의 CTG 반복 영역을 결실시키는 능력에 대해 추가로 평가되었다. 36개 쌍 조합이 CTG 반복 영역 결실에 대해 평가되었다. 2개 신호의 소실 ddPCR 검정을 사용하여 반복 결실을 검출하였다(도 53 개략도 참고). CTG 반복 영역 결실의 백분율은 SB1 세포에서 36개 쌍에 걸쳐 27% 내지 65% 범위였다(표 18). 도 56에 나타낸 % 결실은 개별 gRNA 및 쌍에 대한 LOS 검정 둘 모두로부터의 조합된 평균 반복 결실이다. 각각의 5' 및 3' LOS 검정으로부터 결실 효율 결과뿐만 아니라 양 LOS 검정으로부터 평균 반복 결실은 개별 gRNA 및 쌍에 대해 표 18에 나타나 있다. SpCas9 쌍 및 개별 gRNA에 걸친 5' 및 3' LOS ddPCR 결과의 비교가 도 57에 나타나 있다. 가이드 RNA(T34)는 개별 가이드로서 CTG 반복 영역 결실 활성을 나타내었고 단독으로 반복 결실을 유발할 수 있다(도 56, 도 57).
[표 18]
Figure pct00180
Figure pct00181
가이드 RNA는 또 다른 DM1 iPSC 세포주(4033-4)에서 SpCas9로 추가의 시험을 위해 선택되었다. 5개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 3906, 및 3746) 및 5개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586 및 2210)가 선택되었다(도 58 개략도 참고). 2개 신호의 소실 ddPCR 검정을 사용하여 반복 결실을 검출하였다(도 53 개략도 참고). 도 59는 4033-4 세포에서 SpCas9 gRNA 쌍 및 개별 gRNA에 걸친 5' 및 3' LOS ddPCR 결과의 비교를 도시한다. 결과는 퍼센트 결실로 도시된다.
유사한 CTG 반복 결실이 DM1 iPSC 세포주 SB1(도 60a)과 DM1 iPSC 세포주 4033-4(도 60b) 사이에서 관찰되었다. DM1 iPSC 세포주 SB1은 ~1kb CTG 반복 대립유전자를 갖고 DM1 iPSC 세포주 4033-4는 ~7.5kb CTG 반복 대립유전자를 갖는다는 것이 추가로 결정되었다.
d. SpCas9로 DM1 심근세포의 gRNA 쌍의 스크리닝
가이드 RNA는 SpCas9로 DM1 심근세포에서 추가 시험을 위해 선택되었다. DMPK의 DM3' UTR에서 CTG 반복의 5개 업스트림 gRNA(서열번호: 3778, 4026, 3794, 3906 및 3746) 및 5개 다운스트림 gRNA(서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586 및 2210)(도 61 개략도 참고)가 DM1 심근세포에서 SpCas9로 개별 편집 효율에 대해 먼저 평가되었다(도 62). 편집 결과는 DM1 iPSC SB1 세포로 얻은 바와 같이 DM1 심근세포에서 유사했다(도 62).
3쌍의 gRNA(서열번호: 3746 및 2210; 4026 및 1586; 3778 및 1778)는 DM1 심근세포에서 CTG 반복 결실에 대해 시험되었고 5' LOS ddPCR 및 3' LOS ddPCR에 의해 DM1 iPSC SB1 세포로 얻은 것과 유사한 % 결실을 나타냈다(도 63).
e. 표적-외 분석
12개 가이드 RNA가 하이브리드 캡처 검정을 사용하여 SpCas9로 표적-외 활성에 대해 시험되었다(서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210). 부위 및 2 공여체에 걸친 표적-상 부위에서의 편집 및 최대 표적-외 편집의 결과가 표 19에 나타나 있다:
[표 19]
Figure pct00182
표적-외 데이터에 기초하여, gRNA의 쌍은 "깨끗한", "표적-외 <1%" 또는 "표적-외 >1%"로 식별되었다. SB1 세포에서 25% 초과의 CTG 반복 결실을 또한 갖는 SpCas9로 다중 "깨끗한" gRNA 쌍이 식별되었다(도 64).
f. SaCas9로 gRNA의 스크리닝
DMPK의 3' UTR에서 CTG 반복의 30개 업스트림 gRNA 및 30개 다운스트림 gRNA를 선택하고(도 65 개략도 참고) TIDE 분석에 의해 야생형 iPSC 주(도 66, 표 20)에서 SaCas9로 개별 편집 효율에 대해 시험했다. 사용된 야생형 iPSC 세포인, 세포주 번호 0052는 Rutgers University Cell 및 DNA Repository를 통해 이용가능한 GMP-등급 iPSC 주이다.
[표 20]
Figure pct00183
Figure pct00184
4개 업스트림 gRNA(서열번호: 3256, 2896, 3136, 및 3224) 및 6개 다운스트림 gRNA(서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 및 616)가 saCas9로 DM1 iPSC SB1 세포에서 CTG 반복 영역 결실의 평가를 위해 선택되었다(도 67 개략도 참고). saCas9 gRNA 쌍 및 개별 saCas9 gRNA에 대한 CTG 반복 영역 결실의 백분율은 3' LOS ddPCR 검정으로부터의 결과에 기반하여 도 68a에 도시되어 있다. 5' LOS 검정은 ddPCR 프라이머 부위(n=1)를 녹아웃시키는 단일 gRNA로 인해 결실을 정확하게 묘사하지 않았다. 5' 및 3' LOS ddPCR로부터의 데이터가 표 21에 나타나 있다. spCas9 gRNA 쌍(서열번호: 3746/2210)이 대조군으로 사용되었다. 퍼센트 편집 효율은 도 68b에 개별 saCas9 gRNA에 대해 도시되어 있다.
[표 21]
Figure pct00185
이 설명 및 예시적인 실시형태는 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 양, 백분율 또는 비율을 나타내는 모든 수, 및 기타 수치는 모든 경우에, 아직 그렇게 변형되지 않은 범위로, 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 표시되지 않는 한, 다음 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한 청구범위의 범주에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라 각 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 자릿수의 관점에서 그리고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the", 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은 명시적이고 명백하게 하나의 참조에 제한되지 않는 한 복수 첨조를 포함한다는 것에 유의한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 그 문법적 변형은 비-제한적인 것으로 의도되어, 목록에 있는 항목의 인용은 열거된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목의 배제를 위한 것이 아니다.
추가 서열의 표
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
프라이머는 각각 F 및 R을 사용하여 정방향 또는 역방향 프라이머로 표시된다. 주어진 형태의 mRNA에 특이적인 생성물을 증폭하기 위한 qPCR 프라이머는 "Ex5in"과 같은 텍스트를 포함하는 설명을 가지며, 이는 프라이머가 표시된 mRNA의 엑손 5의 존재에서 생성물을 제공함을 나타낸다. 모든 예상되는 형태의 mRNA로부터 생성물을 증폭하기 위한 qPCR 프라이머는 "전체(total)"를 포함하는 설명을 갖는다.

Claims (95)

  1. 하기를 포함하는 조성물:
    i) 하기를 포함하는, 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산,
    a. 서열번호: 4018, 4010, 4002, 4042, 4034, 4026, 3954, 3946, 3994, 3914, 3978, 3906, 3898, 3938, 3922, 3858, 3850, 3882, 3826, 3818, 3842, 3794, 3786, 3762, 3810, 3746, 3778, 3738, 3770, 3722, 3754, 3690, 3666, 3658, 3634, 3586, 3546, 3530, 3642, 3514, 3506, 3490, 3618, 3610, 3602, 3578, 3442, 3522, 3410, 3378, 3434, 3370, 3426, 3418, 3394, 3386, 3330, 3354, 3346, 3314, 3930, 3890, 3834, 3802, 3706, 3698, 3682, 3674, 3570, 3554, 3538, 3498, 3482, 3458, 3474, 3450, 2667, 2666, 2650, 2642, 2626, 2618, 2706, 2690, 2682, 2610, 2674, 2658, 2602, 2594, 2634, 2554, 2546, 2586, 2538, 2578, 2570, 2522, 2498, 2490, 2466, 2458, 2450, 2514, 2506, 2418, 2482, 2474, 2394, 2442, 2434, 2370, 2378, 2354, 2346, 2338, 2314, 2298, 2282, 2274, 2266, 2330, 2258, 2322, 2242, 2234, 2290, 2250, 2218, 2226, 2210, 2194, 2146, 2138, 2122, 2106, 2098, 2090, 2130, 2114, 2034, 2026, 2058, 2050, 2042, 1914, 1786, 1778, 1770, 1842, 1738, 1706, 1690, 1746, 1714, 1650, 1642, 1610, 1586, 1562, 1546, 1578, 1538, 1378, 1370, 1922, 1898, 1906, 1794, 1762, 1698, 1674, 1722, 1362, 1450, 2202, 2178, 2170, 2162, 2018, 2010, 1890, 1962, 1946, 1850, 1818, 1658, 1634, 1602, 1554, 1434, 1426, 1338, 1346, 1978, 1994, 1986, 1970, 1938, 1930, 1810, 1834, 1826, 1802, 1626, 1594, 1514, 1498, 1490, 1482, 1474, 1458, 1442, 1418, 1410, 1402, 1394, 및 1386으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 3354, 4010, 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 2322, 1770, 1538, 2514, 2458, 2194, 2594, 2162, 및 2618로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    d. 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    e. 서열번호: 3330, 3914, 3418, 3746, 3778, 3394, 4026, 3690, 3794, 3386, 3938, 3682, 3818, 3658, 및 3722로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    f. 서열번호: 2202, 1706, 2210, 2170, 1778, 2258, 2114, 2178, 1642, 1738, 1746, 및 2322로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    g. 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906, 3746, 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    h. 서열번호: 3378, 3354, 3346, 3330, 3314, 2658, 2690, 2546, 2554, 2498, 및 2506으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    i. 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    j. 서열번호: 3314, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    k. 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 및 2258로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    l. 서열번호: 3914; 또는
    m. 서열번호: 3418; 또는
    n. 서열번호: 3938; 또는
    o. 서열번호: 3916, 3420, 및 3940으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    p. 임의의 하나의 a) 내지 o)의 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 서열; 또는
    q. 임의의 하나의 a) 내지 p)의 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 스페이서 서열; 또는
    ii) 하기를 포함하는, 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산:
    a. 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 2162 및 3658; 2202 및 4010; 2202 및 4026; 2202 및 3914; 2202 및 3938; 2202 및 3858; 2202 및 3818; 2202 및 3794; 2202 및 3802; 2202 및 3746; 2202 및 3778; 2202 및 3770; 2202 및 3722; 2202 및 3690; 2202 및 3682; 2202 및 3330; 2202 및 3354; 2202 및 3394; 2202 및 3386; 2178 및 4010; 2178 및 4026; 2178 및 3914; 2178 및 3938; 2178 및 3858; 2178 및 3818; 2178 및 3794; 2178 및 3802; 2178 및 3746; 2178 및 3778; 2178 및 3770; 2178 및 3722; 2178 및 3690; 2178 및 3682; 2178 및 3330; 2178 및 3354; 2178 및 3394; 2178 및 3386; 2170 및 4010; 2170 및 4026; 2170 및 3914; 2170 및 3938; 2170 및 3858; 2170 및 3818; 2170 및 3794; 2170 및 3802; 2170 및 3746; 2170 및 3778; 2170 및 3770; 2170 및 3722; 2170 및 3690; 2170 및 3682; 2170 및 3330; 2170 및 3354; 2170 및 3394; 2170 및 3386; 2162 및 4010; 2162 및 4026; 2162 및 3914; 2162 및 3938; 2162 및 3858; 2162 및 3818; 2162 및 3794; 2162 및 3802; 2162 및 3746; 2162 및 3778; 2162 및 3770; 2162 및 3722; 2162 및 3690; 2162 및 3682; 2162 및 3330; 2162 및 3354; 2162 및 3394; 2162 및 3386; 1706 및 3418; 1706 및 3370; 1706 및 3514; 1706 및 3658; 1706 및 4010; 1706 및 4026; 1706 및 3914; 1706 및 3938; 1706 및 3858; 1706 및 3818; 1706 및 3794; 1706 및 3802; 1706 및 3746; 1706 및 3778; 1706 및 3770; 1706 및 3722; 1706 및 3690; 1706 및 3682; 1706 및 3330; 1706 및 3354; 1706 및 3394; 1706 및 3386; 2210 및 3418; 2210 및 3370; 2210 및 3514; 2210 및 3658; 2210 및 4010; 2210 및 4026; 2210 및 3914; 2210 및 3938; 2210 및 3858; 2210 및 3818; 2210 및 3794; 2210 및 3802; 2210 및 3746; 2210 및 3778; 2210 및 3770; 2210 및 3722; 2210 및 3690; 2210 및 3682; 2210 및 3330; 2210 및 3354; 2210 및 3394; 2210 및 3386; 1778 및 3418; 1778 및 3370; 1778 및 3514; 1778 및 3658; 1778 및 4010; 1778 및 4026; 1778 및 3914; 1778 및 3938; 1778 및 3858; 1778 및 3818; 1778 및 3794; 1778 및 3802; 1778 및 3746; 1778 및 3778; 1778 및 3770; 1778 및 3722; 1778 및 3690; 1778 및 3682; 1778 및 3330; 1778 및 3354; 1778 및 3394; 1778 및 3386; 2258 및 3418; 2258 및 3370; 2258 및 3514; 2258 및 3658; 2258 및 4010; 2258 및 4026; 2258 및 3914; 2258 및 3938; 2258 및 3858; 2258 및 3818; 2258 및 3794; 2258 및 3802; 2258 및 3746; 2258 및 3778; 2258 및 3770; 2258 및 3722; 2258 및 3690; 2258 및 3682; 2258 및 3330; 2258 및 3354; 2258 및 3394; 2258 및 3386; 2114 및 3418; 2114 및 3370; 2114 및 3514; 2114 및 3658; 2114 및 4010; 2114 및 4026; 2114 및 3914; 2114 및 3938; 2114 및 3858; 2114 및 3818; 2114 및 3794; 2114 및 3802; 2114 및 3746; 2114 및 3778; 2114 및 3770; 2114 및 3722; 2114 및 3690; 2114 및 3682; 2114 및 3330; 2114 및 3354; 2114 및 3394; 2114 및 3386; 1642 및 3418; 1642 및 3370; 1642 및 3514; 1642 및 3658; 1642 및 4010; 1642 및 4026; 1642 및 3914; 1642 및 3938; 1642 및 3858; 1642 및 3818; 1642 및 3794; 1642 및 3802; 1642 및 3746; 1642 및 3778; 1642 및 3770; 1642 및 3722; 1642 및 3690; 1642 및 3682; 1642 및 3330; 1642 및 3354; 1642 및 3394; 1642 및 3386; 1738 및 3418; 1738 및 3370; 1738 및 3514; 1738 및 3658; 1738 및 4010; 1738 및 4026; 1738 및 3914; 1738 및 3938; 1738 및 3858; 1738 및 3818; 1738 및 3794; 1738 및 3802; 1738 및 3746; 1738 및 3778; 1738 및 3770; 1738 및 3722; 1738 및 3690; 1738 및 3682; 1738 및 3330; 1738 및 3354; 1738 및 3394; 1738 및 3386; 2258 및 3418; 2258 및 3370; 2258 및 3514; 2258 및 3658; 2258 및 4010; 2258 및 4026; 2258 및 3914; 2258 및 3938; 2258 및 3858; 2258 및 3818; 2258 및 3794; 2258 및 3802; 2258 및 3746; 2258 및 3778; 2258 및 3770; 2258 및 3722; 2258 및 3690; 2258 및 3682; 2258 및 3330; 2258 및 3354; 2258 및 3394; 2258 및 3386; 2114 및 3418; 2114 및 3370; 2114 및 3514; 2114 및 3658; 2114 및 4010; 2114 및 4026; 2114 및 3914; 2114 및 3938; 2114 및 3858; 2114 및 3818; 2114 및 3794; 2114 및 3802; 2114 및 3746; 2114 및 3778; 2114 및 3770; 2114 및 3722; 2114 및 3690; 2114 및 3682; 2114 및 3330; 2114 및 3354; 2114 및 3394; 1706 및 3386; 1642 및 3418; 1642 및 3370; 1642 및 3514; 1642 및 3658; 1642 및 4010; 1642 및 4026; 1642 및 3914; 1642 및 3938; 1642 및 3858; 1642 및 3818; 1642 및 3794; 1642 및 3802; 1642 및 3746; 1642 및 3778; 1642 및 3770; 1642 및 3722; 1642 및 3690; 1642 및 3682; 1642 및 3330; 1642 및 3354; 1642 및 3394; 1642 및 3386; 1738 및 3418; 1738 및 3370; 1738 및 3514; 1738 및 3658; 1738 및 4010; 1738 및 4026; 1738 및 3914; 1738 및 3938; 1738 및 3858; 1738 및 3818; 1738 및 3794; 1738 및 3802; 1738 및 3746; 1738 및 3778; 1738 및 3770; 1738 및 3722; 1738 및 3690; 1738 및 3682; 1738 및 3330; 1738 및 3354; 1738 및 3394; 1738 및 3386; 1746 및 3418; 1746 및 3370; 1746 및 3514; 1746 및 3658; 1746 및 4010; 1746 및 4026; 1746 및 3914; 1746 및 3938; 1746 및 3858; 1746 및 3818; 1746 및 3794; 1746 및 3802; 1746 및 3746; 1746 및 3778; 1746 및 3770; 1746 및 3722; 1746 및 3690; 1746 및 3682; 1746 및 3330; 1746 및 3354; 1746 및 3394; 1746 및 3386; 2322 및 3418; 2322 및 3370; 2322 및 3514; 2322 및 3658; 2322 및 4010; 2322 및 4026; 2322 및 3914; 2322 및 3938; 2322 및 3858; 2322 및 3818; 2322 및 3794; 2322 및 3802; 2322 및 3746; 2322 및 3778; 2322 및 3770; 2322 및 3722; 2322 및 3690; 2322 및 3682; 2322 및 3330; 2322 및 3354; 2322 및 3394; 2322 및 3386; 1770 및 3418; 1770 및 3370; 1770 및 3514; 1770 및 3658; 1770 및 4010; 1770 및 4026; 1770 및 3914; 1770 및 3938; 1770 및 3858; 1770 및 3818; 1770 및 3794; 1770 및 3802; 1770 및 3746; 1770 및 3778; 1770 및 3770; 1770 및 3722; 1770 및 3690; 1770 및 3682; 1770 및 3330; 1770 및 3354; 1770 및 3394; 1770 및 3386; 1538 및 3418; 1538 및 3370; 1538 및 3514; 1538 및 3658; 1538 및 4010; 1538 및 4026; 1538 및 3914; 1538 및 3938; 1538 및 3858; 1538 및 3818; 1538 및 3794; 1538 및 3802; 1538 및 3746; 1538 및 3778; 1538 및 3770; 1538 및 3722; 1538 및 3690; 1538 및 3682; 1538 및 3330; 1538 및 3354; 1538 및 3394; 1538 및 3386; 2514 및 3418; 2514 및 3370; 2514 및 3514; 2514 및 3658; 2514 및 4010; 2514 및 4026; 2514 및 3914; 2514 및 3938; 2514 및 3858; 2514 및 3818; 2514 및 3794; 2514 및 3802; 2514 및 3746; 2514 및 3778; 2514 및 3770; 2514 및 3722; 2514 및 3690; 2514 및 3682; 2514 및 3330; 2514 및 3354; 2514 및 3394; 2514 및 3386; 2458 및 3418; 2458 및 3370; 2458 및 3514; 2458 및 3658; 2458 및 4010; 2458 및 4026; 2458 및 3914; 2458 및 3938; 2458 및 3858; 2458 및 3818; 2458 및 3794; 2458 및 3802; 2458 및 3746; 2458 및 3778; 2458 및 3770; 2458 및 3722; 2458 및 3690; 2458 및 3682; 2458 및 3330; 2458 및 3354; 2458 및 3394; 2458 및 3386; 2194 및 3418; 2194 및 3370; 2194 및 3514; 2194 및 3658; 2194 및 4010; 2194 및 4026; 2194 및 3914; 2194 및 3938; 2194 및 3858; 2194 및 3818; 2194 및 3794; 2194 및 3802; 2194 및 3746; 2194 및 3778; 2194 및 3770; 2194 및 3722; 2194 및 3690; 2194 및 3682; 2194 및 3330; 2194 및 3354; 2194 및 3394; 2194 및 3386; 2594 및 3418; 2594 및 3370; 2594 및 3514; 2594 및 3658; 2594 및 4010; 2594 및 4026; 2594 및 3914; 2594 및 3938; 2594 및 3858; 2594 및 3818; 2594 및 3794; 2594 및 3802; 2594 및 3746; 2594 및 3778; 2594 및 3770; 2594 및 3722; 2594 및 3690; 2594 및 3682; 2594 및 3330; 2594 및 3354; 2594 및 3394; 2594 및 3386; 2618 및 3418; 2618 및 3370; 2618 및 3514; 2618 및 3658; 2618 및 4010; 2618 및 4026; 2618 및 3914; 2618 및 3938; 2618 및 3858; 2618 및 3818; 2618 및 3794; 2618 및 3802; 2618 및 3746; 2618 및 3778; 2618 및 3770; 2618 및 3722; 2618 및 3690; 2618 및 3682; 2618 및 3330; 2618 및 3354; 2618 및 3394; 및 2618 및 3386으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 2162 및 3658; 2202 및 4010; 2202 및 4026; 2202 및 3914; 2202 및 3938; 2202 및 3858; 2202 및 3818; 2202 및 3794; 2202 및 3802; 2202 및 3746; 2202 및 3778; 2202 및 3770; 2202 및 3722; 2202 및 3690; 2202 및 3682; 2202 및 3330; 2202 및 3354; 2202 및 3394; 2202 및 3386; 2178 및 4010; 2178 및 4026; 2178 및 3914; 2178 및 3938; 2178 및 3858; 2178 및 3818; 2178 및 3794; 2178 및 3802; 2178 및 3746; 2178 및 3778; 2178 및 3770; 2178 및 3722; 2178 및 3690; 2178 및 3682; 2178 및 3330; 2178 및 3354; 2178 및 3394; 2178 및 3386; 2170 및 4010; 2170 및 4026; 2170 및 3914; 2170 및 3938; 2170 및 3858; 2170 및 3818; 2170 및 3794; 2170 및 3802; 2170 및 3746; 2170 및 3778; 2170 및 3770; 2170 및 3722; 2170 및 3690; 2170 및 3682; 2170 및 3330; 2170 및 3354; 2170 및 3394; 2170 및 3386; 2162 및 4010; 2162 및 4026; 2162 및 3914; 2162 및 3938; 2162 및 3858; 2162 및 3818; 2162 및 3794; 2162 및 3802; 2162 및 3746; 2162 및 3778; 2162 및 3770; 2162 및 3722; 2162 및 3690; 2162 및 3682; 2162 및 3330; 2162 및 3354; 2162 및 3394; 및 2162 및 3386으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 2202 및 3418; 2202 및 3370; 2202 및 3514; 2202 및 3658; 2178 및 3418; 2178 및 3370; 2178 및 3514; 2178 및 3658; 2170 및 3418; 2170 및 3370; 2170 및 3514; 2170 및 3658; 2162 및 3418; 2162 및 3370; 2162 및 3514; 및 2162 및 3658로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    d. 서열번호: 3778 및 2514; 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2514; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 3354 및 2514; 3354 및 2258; 및 3354 및 2210으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    e. 서열번호: 3778 및 2258; 3778 및 2210; 3386 및 2258; 3386 및 2210; 및 3354 및 2514로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    f. 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3330 및 2506; 및 3330 및 2546으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    g. 서열번호: 1153 및 1129; 또는
    h. 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 3330 및 2498; 3354 및 2546; 3354 및 2506; 3378 및 2546; 및 3378 및 2506으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    i. 서열번호: 3346 및 2554; 3346 및 2498; 3330 및 2554; 및 3330 및 2498로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    j. 임의의 a) 내지 i)의 제1 및 제2 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드을 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    k. 임의의 a) 내지 j)의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
  2. 조성물로서, 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 스페이서 서열의 쌍은 다음을 포함하는, 조성물:
    a. 서열번호: 2856, 2864, 2880, 2896, 2904, 2912, 2936, 2944, 2960, 2992, 3016, 3024, 3064, 3096, 3112, 3128, 3136, 3144, 3160, 3168, 3192, 3200, 3208, 3216, 3224, 3232, 3240, 3248, 3256, 3264, 3314, 3330, 3346, 3354, 3370, 3378, 3386, 3394, 3410, 3418, 3426, 3434, 3442, 3450, 3458, 3474, 3482, 3490, 3498, 3506, 3514, 3522, 3530, 3538, 3546, 3554, 3570, 3578, 3586, 3602, 3610, 3618, 3634, 3642, 3658, 3674, 3682, 3690, 3698, 3706, 3722, 3746, 3762, 3770, 3778, 3794, 3802, 3818, 3826, 3834, 3850, 3858, 3890, 3898, 3906, 3914, 3922, 3930, 3938, 3946, 3994, 4010, 4018, 4026, 4034, 4042, 4208, 및 4506으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 560, 584, 608, 616, 656, 672, 688, 696, 712, 744, 752, 760, 840, 864, 960, 976, 984, 1008, 1056, 1128, 1136, 1152, 1224, 1240, 1272, 1338, 1346, 1370, 1378, 1386, 1394, 1402, 1410, 1418, 1426, 1434, 1442, 1458, 1474, 1482, 1490, 1498, 1514, 1538, 1546, 1554, 1562, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1626, 1634, 1642, 1650, 1658, 1690, 1706, 1714, 1738, 1746, 1770, 1778, 1786, 1802, 1810, 1818, 1826, 1834, 1842, 1850, 1890, 1914, 1930, 1938, 1946, 1962, 1970, 1978, 1986, 1994, 2010, 2018, 2026, 2042, 2050, 2058, 2090, 2114, 2130, 2162, 2170, 2178, 2202, 2210, 2226, 2242, 2258, 2266, 2274, 2282, 2298, 2314, 2322, 2330, 2338, 2346, 2354, 2370, 2378, 2394, 2418, 2434, 2442, 2458, 2466, 2474, 2498, 2506, 2514, 2522, 2546, 2554, 2570, 2586, 2658, 4989, 4990, 4991, 및 4992로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 3778, 4026, 3794, 4010, 3906 및 3746으로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 1778, 1746, 1770, 1586, 1914, 및 2210으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 3778 및 1778; 3778 및 1746; 3778 및 1770; 3778 및 1586; 3778 및 1914; 3778 및 2210; 4026 및 1778; 4026 및 1746; 4026 및 1770; 4026 및 1586; 4026 및 1914; 4026 및 2210; 3794 및 1778; 3794 및 1746; 3794 및 1770; 3794 및 1586; 3794 및 1586; 3794 및 1914; 3794 및 2210; 4010 및 1778; 4010 및 1770; 4010 및 1746; 4010 및 1586; 4010 및 1914; 4010 및 2210; 3906 및 1778; 3906 및 1778; 3906 및 1746; 3906 및 1770; 3906 및 1586; 3906 및 1914; 3906 및 2210; 3746 및 1778; 3746 및 1746; 3746 및 1770; 3746 및 1586; 3746 및 1914; 및 3746 및 2210으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    d. 서열번호: 3256, 2896, 3136, 및 3224로부터 선택된 제1 스페이서 서열, 및 서열번호: 4989, 560, 672, 976, 760, 984, 및 616으로부터 선택된 제2 스페이서 서열; 또는
    e. 서열번호: 3256 및 4989; 3256 및 984; 3256 및 616; 2896 및 4989; 2896 및 672; 2896 및 760; 3136 및 4989; 3136 및 560; 3224 및 4989; 3224 및 976; 및 3224 및 760으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    f. 임의의 a) 내지 e)의 제1 및 제2 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    g. 임의의 a) 내지 f)의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
  3. 하기를 포함하는 조성물:
    i) 하기를 포함하는, 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산:
    a. 서열번호: 5262, 5782, 5830, 5926, 5950, 5998, 6022, 5310, 및 5334로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 5830, 6022, 5262, 및 5310으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 5262, 5334, 및 5830으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    d. 서열번호: 5262; 또는
    e. 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 및 5312로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    f. 임의의 하나의 a) 내지 e)의 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 서열; 또는
    g. 임의의 하나의 a) 내지 f)의 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 스페이서 서열; 또는
    ii) 하기를 포함하는, 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산:
    a. 서열번호: 5782 및 5262; 5830 및 5262; 5926 및 5262; 5950 및 5262; 및 5998 및 5262로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 5830 및 5262; 및 6022 및 5310으로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 5334 및 5830; 또는
    d. 임의의 a) 내지 c)의 제1 및 제2 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 제1 및 제2 서열; 또는
    e. 임의의 a) 내지 d)의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
  4. 하기를 포함하는 조성물:
    i) 하기를 포함하는, 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산:
    a. 서열번호: 28130, 34442, 45906, 26562, 52666, 51322, 46599, 52898, 26546, 7447, 47047, 49986, 51762, 51754, 52290, 52298, 51474, 52306, 50682, 51706, 52098, 50714, 51498, 52498, 50978, 51746, 52106, 51506, 50674, 52082, 52506, 50538, 52066, 52386, 52090, 52266, 52474, 52258, 52434, 50706, 51490, 52458, 51466, 52354, 51914, 51362, 51058, 50170, 51954, 52250, 51930, 51682, 52594, 52610, 51162, 49162, 50898, 49226, 51658, 52554, 52634, 51394, 49034, 52546, 52522, 52618, 52530, 28322, 26530, 26578, 26602, 26634, 26626, 26698, 26746, 26754, 26786, 26882, 27722, 27730, 27738, 27770, 27754, 27762, 27802, 27850, 27842, 27922, 27946, 27986, 28114, 28122, 28146, 28186, 28194, 28338, 28346, 28322, 28378, 28370, 28458, 28506, 28634, 28642, 28650, 34442, 및 45906으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 51706, 51058, 51754, 52090, 52594, 52098, 52298, 52106, 51682, 52066, 52354, 52458, 52290, 52498, 51658, 51930, 51162, 52506, 51762, 51746, 52386, 52258, 52530, 52634, 27850, 28634, 26882, 28650, 28370, 28194, 26626, 26634, 26786, 26754, 27770, 26578, 28130, 27738, 28338, 28642, 26602, 27754, 27730, 및 28122로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    d. 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    e. 임의의 하나의 a) 내지 d)의 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서 서열; 또는
    f. 임의의 하나의 a) 내지 e)의 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 스페이서 서열; 또는
    ii) 하기를 포함하는, 제1 및 제2 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산:
    a. 서열번호: 47047 및 7447; 7463 및 46967; 46768 및 7680; 및 47032 및 7447로부터 선택된 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 47047 및 7447; 또는
    c. 서열번호: 52898 및 26546; 또는
    d. 임의의 a) 내지 c)의 제1 및 제2 스페이서 서열 중 적어도 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 및 제2 스페이서 서열; 또는
    e. 임의의 a) 내지 d)의 제1 및 제2 스페이서 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 제1 및 제2 스페이서 서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제는 Cas9인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래되는, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래되는, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-PK 억제제를 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 sgRNA인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 sgRNA는 변형되는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 변형은 하나 이상의 2' 위치 및/또는 포스포디에스테르 연결을 변경시키는, 조성물.
  15. 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 sgRNA의 처음 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 sgRNA의 마지막 3개 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 모두를 변경하는, 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 포스포로티오에이트 변형, 2'-OMe 변형, 2'-O-MOE 변형, 2'-F 변형, 2'-O-메틴-4' 브릿지 변형, 3'-티오포스포노아세테이트 변형 또는 2'-데옥시 변형 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 지질 나노입자(LNP) 또는 바이러스 벡터와 회합되는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 또는 단순 포진 바이러스 벡터인, 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, AAVrh74, 또는 AAV9 벡터이고, 여기서 AAV 다음의 숫자는 AAV 혈청형을 나타내는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV 혈청형 9 벡터인, 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAVrh10 벡터인, 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAVrh74 벡터인 조성물.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 조성물.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터를 포함하고, 여기서 바이러스 벡터는 근육-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 근육-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, MHCK7 프로모터, SPc5-12 프로모터, 또는 CK8e 프로모터인, 조성물.
  28. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 뉴런-특이적 프로모터를 포함하고, 선택적으로 상기 뉴런-특이적 프로모터는 에놀라제 프로모터인, 조성물.
  29. DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 자가-상보성 영역을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 자가-상보성 영역에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하는 DNA에서 자가-상보성 영역을 절제하는 방법으로서, 여기서 자가-상보성 영역이 절제되는, 방법.
  31. DNA에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 TNR을 포함하는 세포에 i) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR에 또는 그 근처로 지향시키는 스페이서 서열 또는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 핵산; ii) RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산; 및 iii) DNA-PK 억제제를 전달하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 TNR이 절제되는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 자가-상보성 영역은 회문 서열, 직접 반복, 역전된 반복, GC-풍부 서열, 또는 AT-풍부 서열을 포함하고, 선택적으로 여기서 GC-풍부함 또는 AT-풍부함은 루프-형성 서열에 의해 선택적으로 중단된 적어도 10개 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%인, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포로 전달되는, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 TNR 또는 자가-상보성 영역에 또는 그 근처에 전달하는 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍, 또는 가이드 RNA의 쌍을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적은 (i) TNR 또는 자가-상보성 영역 내 또는 (ii) TNR 또는 자가-상보성 영역의 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 있는, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, DM1, HD, FA, FXS, FXTAS, FXPOI, FXES, XSBMA, SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA12, SCA17, 또는 DRPLA를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 방법.
  36. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 DMPK 유전자의 3' 비번역된 영역(UTR)에서 CTG인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 DMPK 유전자의 3' UTR의 적어도 일부를 절제하는 것을 포함하고, 여기서 절제는 근긴장성 이영양증 유형 1(DM1)의 치료를 초래하는, 방법.
  38. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 FMR1 유전자 내에 있는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 절제는 취약 X 증후군의 치료를 초래하는, 방법.
  40. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 FXN 유전자 내에 있는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 절제는 프리드리히 운동실조(FA)의 치료를 초래하는, 방법.
  42. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 헌팅턴, 프라탁신(FXN), 취약 X 정신 지체 1(FMR1), 취약 X 정신 지체 2(FMR2), 안드로겐 수용체(AR), 아리스타리스 관련 호메오박스(ARX), 아탁신 1(ATXN1), 아탁신 2(ATXN2), 아탁신 3(ATXN3), 칼슘 전압-개폐 채널 소단위 알파1 A(CACNA1A), 아탁신 7(ATXN7), ATXN8 반대쪽 가닥 lncRNA(ATXN8OS), 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 소단위 B 베타 이소형(PPP2R2B), TATA 결합 단백질(TBP) 또는 아트로핀-1(ATN1) 유전자 내에 있거나, 또는 상기 TNR이 FMR2의 5' UTR에 인접하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 헌팅턴(HTT)에서 상기 절제는 헌팅턴병(HD)의 치료를 초래하고; FXN에서 절제는 프리드리히 운동실조(FA)의 치료를 초래하고; FMR1에서 절제는 취약 X 증후군(FXS), 취약 X 연관된 원발성 난소 부전증(FXPOI) 또는 취약 X-연관된 떨림/운동실조 증후군(FXTAS)의 치료를 초래하고; FMR2에서 또는 FMR2의 5' UTR에 인접한 절제는 취약 XE 증후군(FXES)의 치료를 초래하고; AR에서 절제는 X-연결된 척수 및 구근 근위축증(XSBMA)의 치료를 초래하고; ATXN1에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 1(SCA1)의 치료를 초래하고, ATXN2에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 2(SCA2)의 치료를 초래하고, ATXN3에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 3(SCA3)의 치료를 초래하고, CACNA1A에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 6(SCA6)의 치료를 초래하고, ATXN7에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 7(SCA7)의 치료를 초래하고, ATXN8OS에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 8(SCA8)의 치료를 초래하고, PPP2R2B에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 12(SCA12)의 치료를 초래하고, TBP에서 절제는 척수소뇌 운동실조 유형 17(SCA17)의 치료를 초래하고, 또는 ATN1에서 절제는 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(DRPLA)의 치료를 초래하는, 방법.
  44. 제29항 또는 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 TNR이 절제되는, 방법.
  45. 제29항 또는 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 40-60, 60-80, 80-100, 100-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-700, 700-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 또는 9000-10,000 TNR이 절제되는, 방법.
  46. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 DMPK 유전자 내에 있고, 상기 TNR의 절제는 확장된-반복 DMPK 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 증가하는 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 활성; 포스포렘만, 디하이드로피리딘 수용체, 미오제닌, L-유형 칼슘 채널 베타 소단위 및/또는 미오신 포스파타제 표적화 소단위의 인산화 증가; 미오신 포스파타제의 억제 증가; 및/또는 근육 손실, 근육 약화, 과다수면, 하나 이상의 실행 기능 결핍, 인슐린 저항성, 백내장 형성, 대머리, 또는 남성 불임이나 저출산을 개선하는 것 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  47. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 HTT 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 HTT 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 선조체 뉴런 상실, 비자발적 운동, 과민성, 우울증, 작은 불수의적 움직임, 빈약한 협응, 새로운 정보를 배우거나 결정을 내리는 데 어려움, 걷기, 말하기 및/또는 삼키기 어려움 및/또는 사고 및/또는 추론 능력에서 감퇴 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  48. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 FMR1 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 FMR1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 FMR1 전사체 또는 취약 X 정신 지체 단백질 수준, 정상적으로 FMRP와 연관된 mRNA의 번역 조절장애, 저하된 수준의 포스포-코필린(CFL1), 증가된 수준의 포스포-코필린 포스파타제 PPP2CA, 뉴런 시냅스로의 감소된 mRNA 이송, HSP27, HSP70 및/또는 CRYAB의 증가된 발현, 라민 A/C 이소형의 비정상적인 세포 분포, 조기-발현 폐경 예컨대 40세 이전의 폐경, 난소 발달 또는 기능에서의 결함, 증강된 수준의 혈청 성선자극호르몬(예를 들어, FSH), 진행성 의도 진전, 파킨슨병, 인지 저하, 전신 뇌 위축, 발기 부전 및/또는 발달 지연 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 FMR2 유전자 내에 있거나 FMR2의 5' UTR에 인접하고, TNR의 절제는 FMR2 유전자 내 또는 이에 인접한 확장된-반복과 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 하나 이상의 비정상적인 FMR2 발현, 발달 지연, 불량한 눈 접촉, 언어의 반복적 사용, 및 손짓을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  50. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 AR 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 AR 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 AR 발현; 안드로겐 수용체 단백질의 C-말단으로 잘린 단편의 생산; 카스파제-3에 의해 및/또는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통한 안드로겐 수용체 단백질의 단백질분해; CREB-결합 단백질을 포함하는 핵 내포물의 형성; p44/42, p38 및/또는 SAPK/JNK의 비정상적인 인산화; 근육 약화; 근육 소모; 걷기, 삼키기 및/또는 말하기 어려움; 여성형유방; 및/또는 남성 불임 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  51. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 ATXN1 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 ATXN1을 포함하는 응집체의 형성; 푸르키네 세포사; 운동실조; 근육 경직; 빠르고 비자발적인 안구 운동; 사지 마비, 따끔거림 또는 통증; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  52. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 ATXN2 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN2 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 ATXN2 생산; 푸르키네 세포사; 운동실조; 말하기 또는 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 소모; 통제되지 않은 근육 긴장; 및/또는 비자발적 경련 운동 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  53. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 ATXN3 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN3 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 ATXN3 수준; 비정상적인 베클린-1 수준; 자가포식의 억제; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2의 조절 장애; 운동실조; 삼키기 어려움; 팔다리의 감각 상실 및 약화; 백치; 근육 경직; 통제되지 않은 근육 긴장; 떨림; 불안한 다리 증상; 및/또는 근육 경련 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  54. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 CACNA1A 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 CACNA1A 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 CACNA1A-발현 세포에서 비정상적인 CaV2.1 전압-개폐 칼슘 채널; 운동실조; 말하기 어려움; 비자발적 안구 운동; 이중 시력; 팔 협응의 상실; 떨림; 및/또는 조절되지 않는 근육 긴장 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  55. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 ATXN7 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN7 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 히스톤 아세틸화; 비정상적인 히스톤 탈유비퀴틴화; CRX에 의한 전사활성화의 장애; ATXN7을 포함하는 핵 내포물의 형성; 운동실조; 보행의 불균형; 손, 언어 및/또는 눈 운동의 빈약한 협응; 망막 변성; 및/또는 색소성 황반 이영양증 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  56. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 ATXN8OS 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATXN8OS 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 ATXN8OS mRNA를 포함하는 리보핵 내포물의 형성; 비정상적인 KLHL1 단백질 발현; 운동실조; 말하기 및/또는 걷기 어려움; 및/또는 비자발적 안구 운동 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  57. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 PPP2R2B 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 PPP2R2B 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 PPP2R2B 발현; 비정상적인 포스파타제 2 활성; 운동실조; 소뇌 변성; 걷기 어려움; 및/또는 손, 언어 및/또는 안구 운동의 빈약한 협응 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  58. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 TBP 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 TBP 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 전사 개시; 비정상적인 TBP 단백질 축적(예를 들어, 소뇌 뉴런 내); 비정상적인 소뇌 뉴런 세포 사멸; 운동실조; 걷기 어려움; 근육 약화; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  59. 제29항 또는 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 ATN1 유전자 내에 있고, TNR의 절제는 확장된-반복 ATN1 유전자와 연관된 하나 이상의 표현형을 개선하고, 상기 개선은 선택적으로 비정상적인 전사 조절; 비정상적인 ATN1 단백질 축적(예를 들어, 뉴런 내); 비정상적인 뉴런 세포 사멸; 비자발적 운동; 및/또는 인지 능력의 상실 중 하나 이상을 개선하는 것을 포함하는, 방법.
  60. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학적 조성물.
  61. DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제2항 또는 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제60항의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  62. DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제2항 또는 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제60항의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 단 하나의 gRNA가 투여되고 DMPK 유전자의 3' UTR에서 CTG 반복이 절제되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 gRNA는 하기를 포함하는 스페이서 서열을 포함하는, 방법:
    a. 서열번호: 3746, 3778, 3394, 3386, 3938, 3818, 3722, 3858, 3370, 1706, 2210, 2114, 1538, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 3330, 3746, 3778, 3394, 4026, 3386, 3938, 3818, 3722, 3802, 3858, 3514, 3770, 3370, 2202, 1706, 2210, 1778, 2114, 1738, 1746, 2322, 1538, 2514, 2458, 2194, 및 2594로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 3330, 3314, 2658, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    d. 서열번호: 3314, 2690, 2554, 및 2498로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    e. 서열번호: 3914, 3514, 1778, 2458, 3858, 3418, 1706, 및 2258로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    f. 서열번호: 3914; 또는
    g. 서열번호: 3418; 또는
    h. 서열번호: 3938; 또는
    i. 서열번호: 3916, 3420, 및 3940으로부터 선택된 스페이서 서열.
  65. FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제3항 또는 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제60항의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  66. FMR1 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 제3항 또는 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제60항의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 단 하나의 gRNA가 투여되고 FMR1 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 gRNA는 하기를 포함하는 스페이서 서열을 포함하는, 방법:
    a. 서열번호: 5830, 6022, 5262, 및 5310으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 5262, 5334 및 5830으로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    c. 서열번호: 5262
    d. 서열번호: 5264, 5336, 5832, 6024, 및 5312로부터 선택된 스페이서 서열.
  69. FXN 유전자의 인트론에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제4항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제60항의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  70. FXN 유전자의 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 제4항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제60항의 약학적 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 단 하나의 gRNA가 투여되고 FXN 유전자의 5' UTR에서 TNR이 절제되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 gRNA는 하기를 포함하는 스페이서 서열을 포함하는, 방법:
    a. 서열번호: 47047, 7447, 7463, 46967, 46768, 7680, 및 47032로부터 선택된 스페이서 서열; 또는
    b. 서열번호: 47045, 7445, 7461, 46766, 7678, 및 47030으로부터 선택된 스페이서 서열.
  73. 제29항 내지 제59항 또는 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 DNA-PK 억제제는 화합물 6인, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 DNA-PK 억제제는 화합물 3인, 방법.
  76. DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제1 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제1 스트레치는:
    a. spCas9를 갖는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오티드를 시작하고 반복을 통해 계속하거나; 또는
    b. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
    c. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
    d. 서열번호: 53413이거나; 또는
    e. 서열번호: 53414이거나; 또는
    f. 서열번호: 53415인, 방법.
  77. DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제2 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제2 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제2 스트레치는:
    a. spCas9를 갖는 DMPK-D15 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
    b. spCas9를 갖는 DMPK-D35 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
    c. 서열번호: 53416이거나; 또는
    d. 서열번호: 53417인, 방법.
  78. DMPK 유전자의 3' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(TNR)을 절제하는 방법으로서, 상기 방법은 스페이서 서열의 쌍을 포함하는 가이드 RNA의 쌍을 투여하는 것을 포함하며, 여기서
    i. 상기 제1 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제1 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제1 스트레치는:
    a. spCas9를 갖는 DMPK-U29 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 반복을 통해 계속하거나; 또는
    b. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U56 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
    c. spCas9를 갖는 DMPK-U30 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U52 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드를 통해 계속하거나; 또는
    d. 서열번호: 53413이거나; 또는
    e. 서열번호: 53414이거나; 또는
    f. 서열번호: 53415이고; 그리고
    ii. 제2 스페이서 서열은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 서열의 제2 스트레치 내의 임의의 뉴클레오티드에 대해 지향시키고, 여기서 제2 스트레치는:
    a. spCas9를 갖는 DMPK-D15 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-D51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
    b. spCas9를 갖는 DMPK-D35 절단 부위로부터 1 뉴클레오타이드를 시작하고 DMPK-U51 절단 부위 전의 1 뉴클레오타이드까지 계속하거나; 또는
    c. 서열번호: 53416이거나; 또는
    d. 서열번호: 53417인, 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-PK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 DNA-PK 억제제는 화합물 6인, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 상기 DNA-PK 억제제는 화합물 3인 방법.
  82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 또는 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제는 Cas9인, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래하는, 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래하는, 방법.
  87. 제83항에 있어서, 상기 Cas 뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제인, 방법.
  88. 제76항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 U29 절단 부위는 다음 서열: ttcacaaccgctccgag*cgtggg에서 *에 상응하는 뉴클레오티드 45,770,383과 45,770,384 사이인: chr19이고;
    (ii) 상기 U30 절단 부위는 다음 서열: gctgggcggagacccac*gctcgg에서 *에 상응하는 45,770,385와 45,770,386 사이인: chr19이고;
    (iii) 상기 D15 절단 부위는 다음 서열: ggctgaggccctgacgt*ggatgg에서 *에 상응하는 45,770,154와 45,770,155 사이인: chr19이고; 그리고
    (iv) 상기 D35 절단 부위는 다음 서열: cacgcacccccacctat*cgttgg에서 *에 상응하는 45,770,078과 45,770,079 사이인: chr19인, 방법.
  89. TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. i. 세포를 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제와 접촉시키는 것;
    ii. i)에서 사용된 것과 동일한 유형의 세포를 DNA-PK 억제제는 없지만 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 것;
    b. 단계 a) ii)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a) i)에서 접촉된 세포로부터 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 것; 및
    c. DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA를 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  90. TNR 또는 자가-상보성 영역을 절제할 수 있는 가이드 RNA의 쌍에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) i. 세포를 가이드 RNA의 쌍, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제, 및 DNA-PK 억제제와 접촉시키는 것;
    ii. i)에서 사용된 것과 동일한 유형의 세포를 DNA-PK 억제제는 없지만 가이드 RNA, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 것;
    b) 단계 a) ii)에서 접촉된 세포와 비교하여 단계 a) i)에서 접촉된 세포로부터 TNR 또는 자가-상보성 영역의 절제를 비교하는 것; 및
    c) DNA-PK 억제제가 없는 경우와 비교하여 DNA-PK 억제제의 존재에서 절제가 개선된 가이드 RNA의 쌍을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 DNA-PK 억제제는 화합물 6인, 방법.
  92. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 DNA-PK 억제제는 화합물 3인, 방법.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 DMPK 유전자의 3' UTR로 지향시키는, 방법.
  94. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 FMR1 유전자의 5' UTR로 지향시키는, 방법.
  95. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 쌍은 RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 FXN 유전자의 5' UTR로 지향시키는, 방법.
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