CN115698304A - 亲斑蛋白-2基因疗法的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于治疗心脏疾病例如致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)的亲斑蛋白‑2基因疗法的方法和组合物。

Description

亲斑蛋白-2基因疗法的方法和组合物

交叉引用

本专利申请要求2020年10月9日提交的美国临时申请号63/089,951、2021年4月7日提交的美国临时申请号63/172,053、2021年6月29日提交的美国临时申请号63/216,322，以及2021年7月30日提交的美国临时申请号63/227,801的权益，每个所述美国临时申请均通过引用以其整体并入本文中。

背景技术

致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)是在1/2000至1/5000人中发现的遗传性心脏病。ARVC的特点是心肌中纤维脂肪组织置换、心肌萎缩、显著右心室扩张、室性心律失常和心源性猝死(Wang等人，2018)。由于该疾病的亚临床表现，该疾病难以通过常规成像和ECG来诊断，特别是在其早期阶段。在晚期，该疾病进展为更明显的表现，例如室性心律失常和心室形态异常。发现年轻人和运动员的心脏骤停与ARVC和运动相关的心壁压力有关。到目前为止，还没有有效的ARVC治疗方法(Wang等人，2018)。

发明内容

在一方面，提供了用于在有需要的个体中治疗心脏疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用组合物，所述组合物包括(a)基因疗法载体，所述基因疗法载体包括与启动子和3'元件可操作地连接的编码亲斑蛋白(plakophilin)2(PKP2)多肽或其片段的核酸；和(b)药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，基因疗法载体包括选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒中的病毒载体。在一些实施方案中，基因疗法载体是腺相关病毒。在一些实施方案中，腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9。在一些实施方案中，腺相关病毒是具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列的AAV9。在一些实施方案中，心脏疾病或病症是致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)。在一些实施方案中，启动子是导致在包括心脏的组织中表达的启动子或心脏特异性启动子。在一些实施方案中，启动子引起在心肌、心外膜或两者中的表达。在一些实施方案中，心脏特异性启动子是PKP2启动子、肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。在一些实施方案中，PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，3'元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、牛生长激素聚腺苷酸化(bGH多聚A)序列或其组合。在一些实施方案中，基因疗法载体还包括心脏特异性增强子。在一些实施方案中，编码PKP2基因的核酸具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，核酸具有小于或等于约4.7kb的大小。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。在一些实施方案中，所述方法逆转、减少或防止以下中的至少一种：纤维脂肪组织置换；心肌萎缩；显著右心室扩张；室性心律失常；心源性猝死；运动引发的心脏事件；右心室心肌病、扩张或心力衰竭；左心室心肌病、扩张或心力衰竭；房性心律失常；晕厥；心悸；气短；或胸痛。在一些实施方案中，所述方法逆转、减少或防止心肌、心外膜或两者中的纤维脂肪组织置换。在一些实施方案中，所述方法恢复桥粒结构和/或功能。在一些实施方案中，所述方法恢复PKP2mRNA表达和/或PKP2蛋白和活性水平。在一些实施方案中，所述方法恢复对心脏病的一种或多种症状具有直接或间接影响的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，所述基因包括兰诺定(Ryanodine)受体2(Ryr2)、锚蛋白-B(Ank2)、Cacna1c(CaV1.2)、三合蛋白(Trdn)或肌集钙蛋白-2(Casq2)中的一种或多种。在一些实施方案中，个体被鉴定为在桥粒蛋白中具有至少一个变异。在一些实施方案中，桥粒蛋白是PKP2。在一些实施方案中，变异包括缺失、插入、单核苷酸变异或拷贝数变异。

在一方面，本文提供了用于在有需要的个体中治疗心脏疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用组合物，所述组合物包括基因疗法载体，所述基因疗法载体包括与至少一个启动子可操作地连接的编码亲斑蛋白2(PKP2)多肽或其片段的核酸；和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，基因疗法载体包括病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒。在一些实施方案中，基因疗法载体是腺相关病毒。在一些实施方案中，腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9。在一些实施方案中，腺相关病毒是AAV9或其衍生物。在一些实施方案中，AAV9具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，心脏疾病或病症是致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)。在一些实施方案中，所述组合物在静脉内、心内、心包或动脉内施用。在一些实施方案中，启动子是心脏特异性启动子。在一些实施方案中，启动子引起在心肌、心外膜或两者中的表达。在一些实施方案中，心脏特异性启动子是肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。在一些实施方案中，肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子是PKP2启动子。在一些实施方案中，PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子是β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，基因疗法载体还包括心脏特异性增强子。在一些实施方案中，编码PKP2基因的核酸具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。在一些实施方案中，所述方法逆转、减少或防止以下中的至少一种：纤维脂肪组织置换；心肌萎缩；显著右心室扩张；室性心律失常；心源性猝死；或运动引发的心脏事件；右心室心肌病、扩张或心力衰竭；左心室心肌病、扩张或心力衰竭；房性心律失常；晕厥；心悸；气短；或胸痛。在一些实施方案中，所述方法逆转、减少或防止心肌、心外膜或两者中的纤维脂肪组织置换。在一些实施方案中，所述方法恢复桥粒结构和/或功能。在一些实施方案中，所述方法恢复PKP2 mRNA表达和/或PKP2蛋白和活性水平。在一些实施方案中，所述方法恢复PKP2诱导的基因表达。在一些实施方案中，所述方法恢复对心脏病的一种或多种症状具有直接或间接影响的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，所述方法恢复兰诺定受体2(Ryr2)、锚蛋白-B(Ank2)、Cacna1c(CaV1.2)、三合蛋白(Trdn)或肌集钙蛋白-2(Casq2)中的一种或多种的表达。在一些实施方案中，个体被鉴定为在桥粒蛋白中具有至少一个变异。在一些实施方案中，桥粒蛋白是PKP2。在一些实施方案中，变异包括缺失、插入、单核苷酸变异或拷贝数变异。

在另一个方面，提供了基因疗法载体，其包括与至少一个启动子可操作地连接的亲斑蛋白2基因。在一些实施方案中，基因疗法载体包括病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒。在一些实施方案中，基因疗法载体是腺相关病毒。在一些实施方案中，腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9。在一些实施方案中，腺相关病毒是AAV9或其衍生物。在一些实施方案中，AAV9具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子是心脏特异性启动子。在一些实施方案中，启动子引起在心肌、心外膜或两者中表达。在一些实施方案中，心脏特异性启动子是肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。在一些实施方案中，肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子是PKP2启动子。在一些实施方案中，PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子是β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，基因疗法载体还包括心脏特异性增强子。在一些实施方案中，编码PKP2基因的核酸具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，将基因疗法载体配制在药学上可接受的载剂或赋形剂中，所述载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文中，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用而并入一样。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。经请求并且支付必要的费用后，专利局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

通过参考以下阐述其中利用了本公开的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，可以理解本公开的特征和优点，所述附图中：

图1说明心脏桥粒如何将细胞连接在一起。

图2显示ARVC疾病适应证和可能的疾病机制的总结。

图3A-3C显示第8天iPSCM中PKP2急性沉默的结果。图3A显示DSP从细胞膜消失。图3B显示了说明肌节密度降低的图表。图3C显示图案化iPSCM中细胞压实的混乱。

图4显示DSP膜定位的定量分析，如通过与PKG的共定位确定。

图5显示免疫印迹，其说明在PKP2被沉默的细胞中主要在不溶性级分中检测到的DSP蛋白总量减少。

图6A-6B显示通过AAV转导PKP2的结果。图6A显示AAV构建体的载体图。图6B显示了DSP膜定位恢复的免疫荧光图像。图6C显示PKP2沉默和AAV-PKP2转基因拯救后总DSP强度的量化。

图7A-7B显示通过AAV转导PKP2对收缩速度的影响的结果。图7A显示实验时间线。图7B显示两个收缩性测定，其证明PKP2沉默后对速度降低的功能性拯救。

图8显示人和小鼠PKP2α的AAV表达盒的第二代示意图。左侧图显示表达盒中的所有元件。右侧图显示表达盒中元件的排列。

图9A和图9B显示iPSC心肌细胞中PKP2沉默后第二代AAV-hPKP2α拯救收缩速度的结果。图9A显示以不同感染复数转导的细胞中可溶性和不溶性级分中的表达。图9B显示PKP2沉默后细胞中对收缩速度的拯救。

图10显示在野生型小鼠中第二代AAV-PKP2α的表达。

图11A-11G显示在野生型小鼠中第二代AAV9人和小鼠PKP2α的先导性表达安全性研究结果。图11A显示注射AAV9之前和之后的体重。图11B显示用AAV9人或小鼠PKP2α治疗的小鼠的射血分数。图11C和图11D显示通过内径测量的舒张末期和收缩期的LV结构。图11E、图11F和图11G通过QRS(11E)、QT间期(11F)和P/R幅度(11G)显示电生理活动。

图12显示PKP2-cKO小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图13A-13B显示PKP2-cKO小鼠的右心室(RV)扩张型心肌病。图13A(左图)显示的图像说明PKP2-cKO小鼠的舒张末期(RVIDd)RV内部尺寸增加。图13A(右图)显示PKP2-cKO小鼠的RVIDd随时间变化的图表。图13B(左图)显示的图像说明PKP2-cKO小鼠的RV面积增加。图13B(右图)显示PKP2-cKO小鼠的RV面积随时间变化的图表。

图14A-14B显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠左心室(LV)扩张型心肌病的发展。图14A(左图)显示PKP2-cKO小鼠的收缩末期(LVIDs)和舒张末期(LVIDd)LV内部尺寸增加的图像。图14A(右图)显示PKP2-cKO小鼠的LVIDs和LVIDd随时间增加的图。图14B显示以射血分数百分比测量的随时间的LV性能图。

图15显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠出现严重的电生理表型，特别是PKP2-cKO小鼠的QRS间期延长和P/R幅度比增加。顶部图显示对照和PKP2-cKO小鼠的示例性心电图。底部图显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠的QRS间期增加和P/R幅度增加的图。

图16A-16C显示纤维化、组织重塑基因和心力衰竭标志物的表达增强。图16A显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠的RV和LV(顶部)中的PKP2 RNA表达以及桥粒和Cx43蛋白表达(底部)。图16B显示与对照相比PKP2-cKO小鼠中的纤维化基因TGFβ1、Col1a1和Col3a1和组织重塑基因Timp1和Mmp2的表达增强。图16C显示与对照小鼠相比PKP2-cKO小鼠中的心力衰竭标志物NPPA和NPPB的表达增强。

图17显示了在PKP2-cKO ARVC小鼠模型中评估PKP2作为基因疗法的功效的实验设计。

图18A显示人和小鼠PKP2α的AAV表达盒示意图。图18B显示来自用AAV9:PKP2治疗的小鼠的小鼠和人PKP2α蛋白质表达的免疫印迹。

图19显示用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图20A-20C显示AAV9:PKP2治疗PKP2-cKO小鼠在减少RV和LV扩张和维持心脏功能方面的功效。图20A显示了说明AAV9:PKP2治疗的小鼠的射血分数改善的图。图20B显示了说明AAV9:PKP2治疗的小鼠中RV扩张减少的图。图20C显示了说明LVIDd(上)和LVIDs(下)改善的图。

图21A-21B显示用AAV:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的ECG参数的改善。图21A显示了对照和用AAV9:mPKP2和缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠的示例性原始ECG迹线。图21B显示了说明与用缓冲剂治疗相比，用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的P/R比、QT间期和QRS间期改善的图。

图22A-22B显示AAV9:PKP2治疗对PKP2-cKO小鼠心律失常的改善。图22A(顶部)显示了心律失常严重程度的分级表。图22A(底部)显示的图总结了与对照相比，用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的心律失常得分的改善。图22B显示的分布图显示与对照相比用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的心律失常严重程度的改善。每个点代表动物。

图23显示使用PKP2-cKO ARVC小鼠模型评估人PKP2作为基因疗法的功效的实验设计。

图24A-24D显示AAV9:hPKP2基因疗法治疗PKP2-cKO小鼠的结果。图24A显示射血分数的结果。图24B显示右心室大小的结果。图24C显示通过LVIDd测量的LV扩张。图24D显示通过LVIDs测量的LV扩张。

图25显示了AAV9:hPKP2基因疗法治疗PKP2-cKO小鼠的QT间期(顶部)、P/R比(中间)和心律失常得分(底部)的结果。

图26A-26B显示AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在降低右心室(图26A)和左心室(图26B)中的心力衰竭标志物、纤维化和组织重塑标志物的表达方面的结果。

图27A-27B显示AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在减少纤维化发展方面的结果。图27A显示来自对照和PKP2-cKO小鼠(接受和不接受AAV9:hPKP2治疗)的肌肉的组织学图像。图27B显示来自对照和PKP2-cKO小鼠(接受和不接受AAV9:hPKP2治疗)的胶原阳性组织的图。

图28A-28B显示在可溶性级分(图28A)和不溶性级分(图28B)中PKP2和其他桥粒蛋白的表达。

具体实施方式

致心律失常性右心室心肌病(ARVC)最常见的遗传基础是编码桥粒蛋白的基因突变。在功能上，桥粒是粘附的细胞间连接，其将间生式心肌细胞固定在一起。亲斑蛋白-2(PKP2)是桥粒基因之一，最常被确定为ARVC的致病因素。在位于膜的复合体内部，PKP2与桥粒蛋白、斑珠蛋白(PKG)和桥粒斑蛋白(DSP)相互作用。DSP锚定中间细丝，结蛋白，中间细丝形成交织的网络，以稳定心肌细胞、肌节和其他细胞器的收缩单位(图1,Brodehl等人,2018；Moncayo-Arlandi and Brugada,2017)。桥粒的丧失被认为会影响心肌细胞的细胞间粘附、信号转导和电耦合(Wang等人,2018)。此外，丢失的信号转导和电耦合是由含有连接蛋白的间隙连接(GJ)额外塌陷导致的联合缺陷结果。GJ在电耦合细胞中必不可少，并通过允许小分子在细胞之间流动来促进同步跳动(Green等人,2019)(图2关于ARVC疾病适应证和可能机制的总结)。此外，心外膜分化可促进在ARVC或ACM患者中观察到的纤维脂肪重塑(Kohela等人,2021)。

为了描绘桥粒的功能，生成了遗传小鼠系和患者衍生的iPSCM模型。PKP2的心脏敲除小鼠模型(Delmar小鼠模型,Cerrone等人,2017)显示出明显的早期双心室扩张、纤维化和调节Ca²⁺稳态的基因显著减少，揭示心律失常的潜在机制可能在明显的结构变化之前。一些携带PKP2突变的源自患者的iPSCM系显示出PKP2表达减少、Ca²⁺处理缺陷以及由在脂肪生成诱导培养基中培养而诱导的脂滴积累(Brodehl等人,2019)。

在具有PKP2突变的ARVC患者心脏样品中报告了PKP2在mRNA和蛋白质水平上的降低(Akdis等人,2016；Asimaki等人,2009)。针对一些桥粒基因突变(包括PKP2突变)提出无义介导的mRNA衰变(NMD)，这表明在平衡突变的转录物和蛋白质的表达方面鲜为人知的细胞机制(Gerull和Brodehl,2020；Mura等人,2003)。这些观察结果表明通过恢复心脏中WTPKP2的表达水平对ARVC进行基于基因疗法的干预的可能性。

治疗方法

本文在各个方面提供的PKP2基因疗法载体可用于治疗患有心脏疾病或病况的个体。“治疗”或“治疗病况或有需要的对象”是指(1)采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果，例如症状减轻；(2)预防疾病，例如，使易患该疾病(例如桥粒基因例如PKP2中的基因突变的携带者)但尚未经历或表现出该疾病的症状的患者不出现该疾病的临床症状；(3)抑制疾病，例如，阻止或减少该疾病或其临床症状的发展；(4)缓解疾病，例如使该疾病或其临床症状消退；或者(5)延缓疾病。在一方面，本文提供了用于在有需要的个体中治疗心脏疾病或病症的方法。在一些情况下，所述方法包括施用组合物，所述组合物包括基因疗法载体，所述基因疗法载体包括与至少一个启动子可操作地连接的编码亲斑蛋白2(PKP2)多肽或其片段的核酸；和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些情况下，心脏疾病或病症是致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)。在一些情况下，本文的治疗方法减少致心律失常性心肌病的至少一种症状，包括但不限于所述方法逆转、减少或防止以下中的至少一种：纤维脂肪组织置换；心肌萎缩；显著右心室扩张；室性心律失常；心源性猝死；或运动引发的心脏事件；右心室心肌病、扩张或心力衰竭；左心室心肌病、扩张或心力衰竭；房性心律失常；晕厥；心悸；气短；或胸痛。在一些实施方案中，所述方法逆转、减少或防止心肌、心外膜或两者中的纤维脂肪组织置换。在一些情况下，所述方法恢复桥粒结构和/或功能。在一些情况下，所述方法恢复PKP2 mRNA表达和/或PKP2蛋白和活性水平。在一些情况下，所述方法恢复PKP2诱导的基因表达。在一些情况下，PKP2诱导的基因表达包括其表达是导致一种或多种疾病表型的直接或间接因果因素的基因的表达。在一些实施方案中，所述方法恢复对心脏病的一种或多种症状具有直接或间接影响的一种或多种基因的表达。在一些情况下，所述方法恢复兰诺定受体2(Ryr2)、锚蛋白-B(Ank2)、Cacna1c(CaV1.2)、三合蛋白(Trdn)或肌集钙蛋白-2(Casq2)中的一种或多种的表达。

在本文提供的治疗方法的一些实施方案中，基因疗法载体包括病毒载体。任何合适的病毒载体都考虑用于本文的方法，包括但不限于选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒中的病毒载体。在一些情况下，基因疗法载体是腺相关病毒。在一些情况下，腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9或其衍生物。在一些情况下，腺相关病毒是AAV9或其衍生物。在一些情况下，AAV9具有与SEQ ID NO:7具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列。在一些情况下，腺相关病毒被修饰以改善心肌或心外膜中受影响的细胞例如心肌细胞的转导，例如，在一些情况下，腺相关病毒是AAV6、AAV8或AAV9的衍生物。在一些情况下，衍生物是美国专利申请号63/012,703中描述的任何AAV，该专利申请通过引用以其整体并入本文中。

在本文提供的一些实施方案或治疗方法中，包括基因疗法载体的组合物通过任何合适的途径施用以到达受影响的细胞。例如，在一些情况下，所述组合物在静脉内、心内、心包或动脉内施用。

在本文提供的治疗方法的一些实施方案中，PKP2由适合在心肌或心外膜中受影响的细胞和组织(例如心肌细胞)中表达的任何启动子表达。例如，在一些情况下，启动子是心脏特异性启动子。在一些情况下，心脏特异性启动子是肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。在一些情况下，启动子是PKP2启动子。在一些情况下，心脏特异性增强子与启动子组合。在一些情况下，肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列。在一些情况下，PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列。在一些情况下，启动子是组成型启动子。在一些情况下，组成型启动子是β-肌动蛋白启动子。

在本文提供的治疗方法的一些实施方案中，编码PKP2基因的核酸具有编码PKP2多肽的任何合适的序列，例如，编码具有SEQ ID NO:8的序列的多肽的任何核酸。例如，在一些情况下，PKP2基因具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下，PKP2基因具有与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下，编码PKP2基因的核酸序列经密码子优化。

在本文提供的治疗方法的一些实施方案中，基因疗法载体具有大小为约3kb至约5kb的基因表达盒。在一些实施方案中，基因表达盒具有约4kb至约5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有约4.2kb至约4.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有约4.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.6kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.4kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.3kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.2kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.1kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.6kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.1kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.3kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.1kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.2kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.3kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.4kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.6kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约5kb的大小。

在本文方法的各种实施方案中，包括PKP2基因的基因疗法载体被配制在包括药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物中。例如，在一些情况下，药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。

在本文提供的治疗方法的一些实施方案中，个体被鉴定为在桥粒蛋白中具有至少一个变异。在一些情况下，桥粒蛋白是PKP2。在一些情况下，变异包括缺失、插入、单核苷酸变异或拷贝数变异。在一些情况下，通过DNA测序、PCR、qPCR、原位杂交或鉴定个体中基因变异的另一种其他合适方法将个体鉴定为在桥粒蛋白中具有至少一个变异。

基因疗法载体

在另一个方面，提供了基因疗法载体，其包括与至少一个启动子可操作地连接的亲斑蛋白2基因。在一些情况下，基因疗法载体包括病毒载体。在一些情况下，病毒载体是用于治疗心脏疾病或病况的任何合适的病毒载体。在一些情况下，病毒载体适用于将基因递送至心肌、心外膜或两者中的细胞。在一些情况下，病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒。在一些情况下，基因疗法载体是腺相关病毒。在一些情况下，腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9或其衍生物。在一些情况下，腺相关病毒是AAV9或其衍生物。在一些情况下，AAV9具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列。在一些情况下，腺相关病毒是AAV6、AAV8或AAV9的衍生物，经优化用于根据本文的治疗方法转导细胞。在一些情况下，衍生物是美国专利申请号63/012,703中描述的任何AAV，该专利申请通过引用以其整体并入本文中。

在本文提供的基因疗法载体的一些实施方案中，PKP2由适合在受影响的细胞和组织(例如心肌细胞)中表达的任何启动子表达。在一些情况下，PKP2由在心肌、心外膜或两者的细胞中具有活性的启动子表达。例如，在一些情况下，启动子是心脏特异性启动子。在一些情况下，心脏特异性启动子是肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。在一些情况下，启动子是PKP2启动子。在一些情况下，心脏特异性增强子与启动子组合。在一些情况下，肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列。在一些情况下，PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列。在一些情况下，启动子是组成型启动子。在一些情况下，组成型启动子是β-肌动蛋白启动子。

在本文提供的基因疗法载体的一些实施方案中，编码PKP2基因的核酸具有编码PKP2多肽的任何合适的序列，例如，编码具有SEQ ID NO:8的序列的多肽的任何核酸。例如，在一些情况下，PKP2基因具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下，PKP2基因具有与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下，编码PKP2基因的核酸序列经密码子优化。

在本文提供的基因疗法载体的一些实施方案中，基因疗法载体包括3'元件。在一些实施方案中，3'元件使基因疗法载体的转录产物(例如，PKP2转录物)稳定。在一些实施方案中，3'元件包括牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，3'元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。

在本文提供的基因疗法载体的一些实施方案中，基因疗法载体具有大小为约3kb至约5kb的基因表达盒。在一些实施方案中，基因表达盒具有约4kb至约5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有约4.2kb至约4.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有约4.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.6kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.4kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.3kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.2kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4.1kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约4kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.6kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有不大于约3.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.1kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.3kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约3.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.1kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.2kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.3kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.4kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.5kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.6kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.7kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.8kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约4.9kb的大小。在一些实施方案中，基因表达盒具有至少约5kb的大小。

在本文提供的基因疗法载体的各种实施方案中，包括PKP2基因的基因疗法载体被配制在包括药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物中。例如，在一些情况下，药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。

在一些实施方案中，本文的基因疗法载体包括下表1中提供的核酸序列。

病毒载体

用于本文提供的方法和基因疗法载体的合适病毒载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下各项的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(例如，Li等人(1994)Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543-2549；Borras等人(1999)Gene Ther 6:515-524；Li和Davidson,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:7700-7704；Sakamoto等人(1999)Hum GeneTher 5:1088-1097；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(例如，Ali等人(1998)Hum Gene Ther 9(l):81-86,1998、Flannery等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6916-6921；Bennett等人(1997)InvestOpthalmol Vis Sci 38:2857-2863；Jomary等人(1997)Gene Ther 4:683-690；Rolling等人(1999),Hum Gene Ther 10:641-648；Ali等人(1996)Hum Mol Genet.5:591-594；WO 93/09239、Samulski等人(1989)J.Vir.63:3822-3828；Mendelson等人(1988)Virol.166:154-165；和Flotte等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:10613-10617；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(例如，Miyoshi等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:10319-10323；Takahashi等人(1999)J Virol 73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和源自逆转录病毒的载体，例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。许多合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购的。以示例的方式提供了以下载体；对于真核细胞：pXTl、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)和pAd(LifeTechnologies)。然而，考虑使用任何其他载体，只要它与本公开的方法兼容。

某些病毒通过受体介导的内吞作用而感染细胞或进入细胞并稳定且有效地表达病毒基因的能力已使其成为将外源核酸转移到细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选者。病毒载体被设想成包括控制序列，例如用于表达目的多肽的启动子。尽管许多病毒载体整合到宿主细胞基因组中，但如果需要，可以去除或改变允许这种整合的区段以防止这种整合。此外，在一些实施方案中，载体不包含哺乳动物复制起点。下文描述了病毒载体的非限制性示例，其被设想用于将编码PKP2的核酸递送到选定细胞中。在一些实施方案中，病毒载体源自复制缺陷型病毒。

通常，其他有用的病毒载体基于非细胞病变性真核病毒，其中非必需基因已被目的多肽替代。非致细胞病变性病毒包括某些逆转录病毒，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录成DNA，随后前病毒整合到宿主细胞DNA中。通常，逆转录病毒是复制缺陷的(例如，能够指导所需转录物的合成，但不能制造感染性颗粒)。这种遗传改变的逆转录病毒表达载体对于体内多核苷酸的高效转导具有通用用途。

在一些实施方案中，编码PKP2的多核苷酸被安置在已被工程化为表达特异性结合配体的感染性病毒中。因此，病毒颗粒将特异性地与靶细胞的同源受体结合并将内容物递送至细胞。在一些实施方案中，病毒被修饰以赋予特定的病毒嗜性，例如，病毒优先感染成纤维细胞、心脏细胞，或更特别地感染心脏成纤维细胞(CF)。对于AAV，在一些情况下，衣壳蛋白被突变以改变病毒载体的嗜性。例如，通常通过使用不同的包膜蛋白来修饰慢病毒嗜性；这被称为“假型化”。

在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。逆转录病毒通常将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外源遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并且通常被包装在特殊的细胞系中(Miller等人,Am.J.Clin.Oncol.,15(3):216-221,1992)。在一些实施方案中，逆转录病毒载体被改变以使其不整合到宿主细胞基因组中。

在一些实施方案中，重组逆转录病毒包括病毒多肽(例如逆转录病毒env)以帮助进入靶细胞。这样的病毒多肽在本领域中是公认的，例如，美国专利号5,449,614。在一些实施方案中，病毒多肽是双嗜性病毒多肽，例如双嗜性env，其有助于进入衍生自多个物种的细胞，包括原始宿主物种之外的细胞。在一些实施方案中，病毒多肽是帮助进入原始宿主物种之外的细胞中的异嗜性病毒多肽。在一些实施方案中，病毒多肽是亲嗜性(ecotropic)病毒多肽，例如亲嗜性env，其有助于进入原始宿主物种的细胞。

能够帮助逆转录病毒进入细胞的病毒多肽的示例包括但不限于：MMLV双嗜性env、MMLV亲嗜性env、MMLV异嗜性env、水疱性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1env、Gibbon猿白血病病毒(GALV)env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10A1 env基因及其变体，包括嵌合体。Yee等人(1994)Methods Cell Biol,Pt A:99-l 12(VSV-G)；美国专利号5,449,614。在一些情况下，病毒多肽被基因修饰以促进表达或增强与受体的结合。

在实施方案中，逆转录病毒构建体衍生自一系列逆转录病毒，例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV或本文所述的其他逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒构建体编码特定病毒的多于一个复制循环所必需的所有病毒多肽。在一些情况下，通过添加其他因子或其他病毒多肽来提高病毒进入的效率。在其他情况下，由逆转录病毒构建体编码的病毒多肽不支持多于一个复制循环，例如，美国专利号6,872,528。在这种情况下，添加其他因子或其他病毒多肽通常有助于促进病毒进入。在示例性实施方案中，重组逆转录病毒是包括VSV-g多肽但不包括HIV1 env多肽的HIV-1病毒。

在一些实施方案中，逆转录病毒构建体包括：启动子、多克隆位点和/或抗性基因。启动子的示例包括但不限于CMV、SV40、EFla、β-肌动蛋白；逆转录病毒LTR启动子和诱导型启动子。在一些实施方案中，逆转录病毒构建体包括包装信号(例如，衍生自MFG载体的包装信号；psi包装信号)。本领域已知的一些逆转录病毒构建体的示例包括但不限于：pMX、pBabeX或其衍生物。Onishi等人(1996)Experimental Hematology,24:324-329。在一些情况下，逆转录病毒构建体是自灭活型慢病毒载体(SIN)载体。Miyoshi等人(1998)J.Virol72(10):8150-8157。在一些情况下，逆转录病毒构建体是LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。Miyoshi等人(1998)J.Virol72(10):8150-8157；Onishi等人(1996)ExperimentalHematology,24:324-329；Riviere等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.,92:6733-6737。

在一些实施方案中，通过将核酸(例如，编码目的多肽或RNA的核酸)插入病毒基因组中代替一些病毒序列来构建逆转录病毒载体，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了包含gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人,Cell 33:153-159,1983)。当含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起被引入特定细胞系中(例如，通过磷酸钙沉淀或脂质转染)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装到病毒颗粒中，然后分泌到培养基中(Nicolas和Rubinstein,在:Vectors:A survey ofmolecular cloning vectors and their uses,Rodriguez和Denhardt,编辑,Stoneham:Butterworth,第494-513页,1988中；Temin,在:Gene Transfer,Kucherlapati(编辑),NewYork:Plenum Press,第149-188页,1986中；Mann等人,Cell,33:153-159,1983)。然后将含有重组逆转录病毒的培养基收集，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛多种细胞类型。然而，整合和稳定表达通常涉及宿主细胞的分裂(Paskind等人,Virology,67:242-248,1975)。

在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。关于慢病毒载体的信息可在例如Naldini等人,Science 272(5259):263-267,1996；Zufferey等人,Nat Biotechnol 15(9):871-875,1997；Blomer等人,J Virol.71(9):6641-6649,1997；美国专利号6,013,516和5,994,136中获得，每一个都通过引用以其整体并入本文中。慢病毒的一些示例包括人免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。慢病毒载体是通过减弱HIV毒力基因产生的，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失以使载体在生物学上安全。使用的慢病毒有时是复制和/或整合缺陷型。

重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，有时用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒(其中合适的宿主细胞用携带包装功能(即gag、pol和env以及rev和tat)的两种或更多种载体转染)描述于美国专利号5,994,136中，其通过引用以其整体并入本文中。在一些实施方案中，重组病毒通过包膜蛋白与抗体或特定配体的连接来靶向，以靶向特定细胞类型的受体。例如，有时通过将目的核酸区段(包括调节区)连同编码特定靶细胞类型上受体的配体的另一个基因一起插入病毒载体中来产生靶特异性载体。

慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998、美国专利号6,013,516和5,994,136，均通过引用并入本文中。通常，这些载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带必需序列以便掺入外源核酸、以便选择和将核酸转移到宿主细胞中。在一些情况下，将慢病毒载体与一种或多种慢病毒包装质粒(包括但不限于pMD2.G、pRSV-rev、pMDLG-pRRE和pRRL-GOI)同时引入细胞中。在一些实施方案中，将慢病毒载体单独或与慢病毒包装质粒组合地引入细胞中导致慢病毒载体被包装到慢病毒颗粒中。在一些实施方案中，慢病毒载体是非整合型慢病毒(NIL)载体。US8,119,119中提供了用于产生NIL载体的说明性方法，例如整合酶基因中的D64V替换。

在一些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒的遗传结构包括约36kb的线性双链DNA病毒，它允许用最长达7kb的外源序列替换大片段腺病毒DNA(Grunhaus等人,Seminar in Virology 200(2):535-546,1992)。在一些情况下，使用腺病毒辅助的转染将PKP2引入细胞中。已经报道了在使用腺病毒偶联系统的细胞系统中增加的转染效率(Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-7,1994；Cotten等人,Proc Natl Acad SciUSA,89(13):6094-6098,1992；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64,1994)。

在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。AAV是有吸引力的载体系统，因为它具有低整合频率并且可以感染非分裂细胞，因此使其可用于将多核苷酸递送到哺乳动物细胞中，例如在组织培养中(Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol,158:97-129,1992)或体内。关于rAAV载体的产生和使用的细节在美国专利号5,139,941和4,797,368中进行了描述，各自通过引用以其整体并入本文中。

AAV是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长约4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。AAV有多种血清型。AAV血清型基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中提供；并且AAV-11基因组在Virology,330(2):375-383(2004)中提供。美国专利9,434,928(通过引用并入本文)中提供了AAV rh.74基因组的序列。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列被包含在AAV ITR中。三个AAV启动子(命名为p5、pl9和p40以表示它们的相对图谱位置)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和pi9)，加上单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶特性，这些特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非一致翻译起始位点负责三种相关衣壳蛋白的产生。单个一致多聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka,Current Topics in Microbiology andImmunology,158:97-129(1992)中回顾了AAV的生命周期和遗传学。

AAV具有独特的特性，使其作为向细胞递送外源DNA的载体具有吸引力，例如在基因疗法中。培养中的细胞的AAV感染是非细胞病变的，人和其他动物的自然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而可以在体内靶向许多不同的组织。此外，AAV转导缓慢分裂的细胞和非分裂的细胞，并且通常作为转录活性的核附加体(染色体外元件)在那些细胞的生命期内基本上持续存在。对本公开特别重要的是，AAV，尤其是AAV9，能够感染心脏细胞，例如心肌、心外膜或两者的细胞(Prasad等人,2011；Piras等人,2016；Ambrosi等人,2019)。AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建变得可行。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号被包含在AAV基因组的ITR中，在一些情况下，基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)的内部约4.3kb的部分或全部被外源DNA替代。为了生成AAV载体，在一些情况下，rep和cap蛋白以反式形式提供。AAV的另一个显著特征是它是极其稳定和有活力的病毒。它容易承受用于灭活腺病毒的条件(56°至65℃几个小时)，从而降低了AAV的低温保存的重要性。在一些情况下，AAV甚至被冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抗性。本公开的AAV载体包括自互补的双链AAV载体、合成的ITR和/或具有增加的包装紧密度的AAV载体。US 8,784,799；US 8,999,678；US 9,169,494；US 9,447,433和US 9,783,824中提供了说明性方法，每一个都通过引用以其整体并入。

rAAV基因组中的AAV DNA被设想为来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh74。假型化的rAAV的产生公开于例如WO 01/83692中。还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。例如，参见Marsic等人,Mol.Therapy.22):1900-09(2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。本公开的AAV载体包括血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV39、AAV43、AAV.rh74和AAV.rh8的AAV载体。US 63/012,703；US 7,105,345；US 15/782,980；US 7,259,151；US 6,962,815；US 7,718,424；US 6,984,517；US 7,718,424；US 6,156,303；US 8,524,446；US 7,790,449；US 7,906,111；US 9,737,618；US App 15/433,322；US 7,198,951中提供了说明性的AAV载体，每一个都通过引用以其整体并入。

在一些实施方案中，AAV表达载体被假型化以增强靶向。为了促进心肌细胞中的基因转移和维持表达，考虑使用AAV6、AAV8和AAV9。在一些情况下，AAV2基因组被包装到分别产生假型化的载体AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8的衣壳中，如Balaji等人J Surg Res.184:691-98(2013)所述。在一些实施方案中，AAV9用于靶向在肌成纤维细胞样谱系中的表达，如Piras等人Gene Therapy 23:469-478(2016)所述。在一些实施方案中，使用AAV1、AAV6或AAV9，并且在一些实施方案中，AAV被工程化，如Asokari等人Hum Gene Ther.24:906-13(2013)；Pozsgai等人Mol Ther.25:855-69(2017)；Kotterman等人Nature ReviewsGenetics 15:445-51(2014)；和Schaffer等人的US20160340393A1所述。在一些实施方案中，病毒载体是被工程化以增加靶细胞感染性的AAV，如US20180066285A1中所述。

在一些实施方案中，本公开的AAV载体包括经修饰的衣壳，特别是作为被工程化以增强或促进心脏细胞或更特别是心肌细胞的体内或离体转导的衣壳；或逃避对象的免疫系统的衣壳；或改善的生物分布的衣壳。US 7,867,484；US 9,233,131；US 10,046,016；WO2016/133917；WO 2018/222503和WO 20019/060454中提供了说明性的AAV衣壳，其每一个都通过引用以其整体并入。在AAV衣壳(或特别是AAV9衣壳)中，一个或多个替换被考虑以增加对心肌、心外膜或两者中细胞的感染性。更具体地，在一些实施方案中，本公开的AAV载体，任选地基于AAV9的载体，在它们的衣壳蛋白中包括一个或多个替换。在一些实施方案中，本公开的AAV载体包括AAV-A9衣壳和/或血清型。应当理解，这些替换和插入被设想为组合在一起以产生可用于本公开中的各种衣壳蛋白。

生产病毒载体的方法

通常，通过将病毒DNA或RNA构建体引入生产细胞中来生产病毒载体。在一些情况下，生产细胞不表达外源基因。在其他情况下，生产细胞是“包装细胞”，其包括一种或多种外源基因，例如编码一种或多种gag、pol或env多肽和/或一种或多种逆转录病毒gag、pol或env多肽的基因。在一些实施方案中，逆转录病毒包装细胞包括编码有助于进入靶细胞的病毒多肽例如VSV-g的基因。在一些情况下，包装细胞包括编码一种或多种慢病毒蛋白的基因，例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev或nef。在一些情况下，包装细胞包括编码腺病毒蛋白如El A或El B或其他腺病毒蛋白的基因。例如，在一些情况下，包装细胞提供的蛋白质是逆转录病毒衍生的蛋白质，例如gag、pol和env；慢病毒衍生的蛋白质，例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev和nef；和腺病毒衍生的蛋白质，例如El A和E1 B。在许多示例中，包装细胞提供衍生自病毒的蛋白质，所述病毒不同于病毒载体所衍生自的病毒。从包装细胞生产重组病毒的方法及其用途已充分确认的；参见，例如，美国专利号5,834,256；6,910,434；5,591,624；5,817,491；7,070,994和6,995,009。

包装细胞系包括但不限于任何易于转染的细胞系。包装细胞系通常基于293T细胞、NIH3T3、COS或HeLa细胞系。包装细胞通常用于包装缺乏编码病毒包装所需蛋白质的至少一种基因的病毒载体质粒。提供由此类病毒载体或质粒编码的蛋白质所缺乏的蛋白质或多肽的任何细胞都被考虑用作包装细胞。包装细胞系的示例包括但不限于：Platinum-E(Plat-E)、Platinum-A(Plat-A)、BOSC 23(ATCC CRL 11554)和Bing(ATCC CRL 11270)。Morita等人(2000)Gene Therapy 7(12):1063-1066；Onishi等人(1996)ExperimentalHematology,24:324-329；美国专利号6,995,009。商业包装系也是有用的，例如Ampho-Pak293细胞系、Eco-Pak 2-293细胞系、RetroPack PT67细胞系和Retro-X通用包装系统(均可从Clontech获得)。

病毒载体质粒(或构建体)包括：pMXs、pMxs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo(pMXs-IB是携带杀稻瘟素抗性基因而不是pMXs-puro的嘌呤霉素抗性基因的载体)Kimatura等人(2003)Experimental Hematology 31:1007-1014；MFG Riviere等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.,92:6733-6737；pBabePuro；Morgenstern等人(1990)Nucleic AcidsResearch 18:3587-3596；LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG Miyoshi等人(1998)J.Vir.72:8150-8157等作为逆转录病毒系统，以及pAdexl Kanegae等人(1995)Nucleic Acids Research23:3816-3821等作为腺病毒系统。在示例性实施方案中，逆转录病毒构建体包括杀稻瘟素(例如，pMXs-IB)、嘌呤霉素(例如，pMXs-puro、pBabePuro)或新霉素(例如，pMXs-neo)。Morgenstern等人(1990)Nucleic Acids Research 18:3587-3596。

启动子和增强子

在一些实施方案中，编码PKP2的核酸可操作地连接至启动子和/或增强子以促进PKP2的表达。取决于所使用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任何一种，包括组成型、组织特异性和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等都适用于表达载体中(例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。

合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性示例包括CMV、CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I。在一些实施方案中，将使用能够赋予心脏特异性表达的启动子，包括但不限于赋予在心肌、心外膜或两者中表达的启动子(Prasad等人,2011)。合适的心脏特异性启动子的非限制性示例包括α-肌球蛋白重链(a-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)。在一些实施方案中，使用PKP2或结蛋白启动子。在一些情况下，使用具有心脏特异性表达的嵌合启动子。在一些情况下，心脏特异性增强子与启动子组合。

用于驱动PKP2表达的合适启动子的示例包括但不限于逆转录病毒长末端重复(LTR)元件；组成型启动子，例如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-la、β-肌动蛋白、磷酸甘油激酶(PGK)；诱导型启动子，例如含有Tet操纵基因元件的那些；和心脏特异性启动子，例如α-肌球蛋白重链(a-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)。在一些实施方案中，使用PKP2或结蛋白启动子。在一些实施方案中，使用具有心脏特异性表达的嵌合启动子。在一些情况下，心脏特异性增强子与启动子组合。

在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至细胞类型特异性转录调节元件(TRE)，其中TRE包括启动子和增强子。合适的TRE包括但不限于衍生自以下基因的TRE：肌球蛋白轻链2、α-肌球蛋白重链、AE3、心肌肌钙蛋白C和心肌肌动蛋白。Franz等人(1997)Cardiovasc.Res.35:560-566；Robbins等人(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492-505；Linn等人(1995)Circ.Res.76:584-591；Parmacek等人(1994)Cell.Biol.14:1870-1885；Hunter等人(1993)Hypertension 22:608-617；和Sartorelli等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047-4051。

可替代地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优点，所述启动子是指通常不与其自然环境中的核酸相关联的启动子。重组或异源增强子也指通常不与其自然环境中的核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子通常包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”的启动子或增强子，即，包含不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，有时使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR)与本文公开的组合物相关地产生序列(参见美国专利号4,683,202、美国专利号5,928,906，各自通过引用并入本文中)。

在一些实施方案中，本公开的载体包括一种或多种多聚A信号。可用于本公开的载体的示例性多聚A信号包括短多聚A信号和bGH多聚A信号。在一些实施方案中，本公开的载体包括一个或多个3'元件。说明性的3'元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。

基因疗法载体组合物

为了制备组合物，产生了载体和/或细胞，并根据需要或期望纯化该载体或细胞。载体和/或其他药剂有时悬浮在药学上可接受的载剂中。在一些实施方案中，组合物是冻干的。这些化合物和细胞通常被调整到适当的浓度，并且任选地与其他药剂组合。包括在单位剂量中的给定化合物和/或其他药剂的绝对重量变化大。施用的剂量和次数被考虑为由本领域技术人员优化的。

例如，在一些实施方案中，施用约10²-10¹⁰个载体基因组(vg)。在一些实施方案中，剂量为至少约10²vg、约10³vg、约10⁴vg、约10⁵vg、约10⁶vg、约10⁷vg、约10⁸vg、约10⁹vg、约10¹⁰vg、或更多的载体基因组。在一些实施方案中，剂量为约10²vg、约10³vg、约10⁴vg、约10⁵vg、约10⁶vg、约10⁷vg、约10⁸vg、约10⁹vg、约10¹⁰vg、或更多的载体基因组。

化合物的每日剂量也各不相同。这样的日剂量通常范围在例如至少约10²vg/天、约10³vg/天、约10⁴vg/天、约10⁵vg/天、约10⁶vg/天、约10⁷vg/天、约10⁸vg/天、约10⁹vg/天、约10¹⁰vg/天或每天更多载体基因组。

在一些实施方案中，本公开的方法包括通过心内注射、心肌内注射、心内膜注射、心内导管插入术或全身施用来施用本公开的载体或载体系统(例如rAAV载体)。在一些实施方案中，通过心内注射、心肌内注射、心内膜注射、心内导管插入术或全身施用来施用约1x10⁸至约1x10¹⁵GC的载体(例如AAV载体或慢病毒载体)以治疗对象(例如人)。在一些实施方案中，通过施用约1x10⁸至约1x10¹⁵ GC、约1x10⁸至约1x10¹⁵ GC、约1x10⁹至约1x10¹⁴ GC、约1x10¹⁰至约1x10¹³ GC、约1x10¹¹至约1x10¹² GC或约1x10¹²至约1x10¹³ GC的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过施用约1x10⁸至约1x10¹⁰ GC、约1x10⁹至约1x10¹¹ GC、约1x10¹⁰至约1x10¹² GC、约1x10¹¹至约1x10¹³ GC、约1x10¹²至约1x10¹⁴ GC或约1x10¹³至约1x10¹⁵ GC的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过施用至少1x10⁸、至少约1x10⁹、至少约1x10¹⁰、至少约1x10¹¹、至少约1x10¹²、至少约1x10¹³或至少约1x10¹⁵ GC的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过施用至多1x10⁸、至多约1x10⁹、至多约1x10¹⁰、至多约1x10¹¹、至多约1x10¹²、至多约1x10¹³或至多约1x10¹⁵ GC的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过心内注射或全身施用约1x10⁸至约1x10¹⁵ GC/kg的载体(例如AAV载体或慢病毒载体)来治疗对象(例如人)。在一些实施方案中，通过施用约1x10⁸至约1x10¹⁵ GC/kg、约1x10⁸至约1x10¹⁵ GC/kg、约1x10⁹至约1x10¹⁴ GC/kg、约1x10¹⁰至约1x10¹³ GC/kg、约1x10¹¹至约1x10¹² GC/kg或约1x10¹²至约1x10¹³ GC/kg的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过施用约1x10⁸至约1x10¹⁰ GC/kg、约1x10⁹至约1x10¹¹ GC/kg、约1x10¹⁰至约1x10¹² GC/kg、约1x10¹¹至约1x10¹³ GC/kg、约1x10¹²至约1x10¹⁴ GC/kg或约1x10¹³至约1x10¹⁵ GC/kg的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过施用至少1x10⁸、至少约1x10⁹、至少约1x10¹⁰、至少约1x10¹¹、至少约1x10¹²、至少约1x10¹³或至少约1x10¹⁵ GC/kg的载体来治疗对象。在一些实施方案中，通过施用至多1x10⁸、至多约1x10⁹、至多约1x10¹⁰、至多约1x10¹¹、至多约1x10¹²、至多约1x10¹³或至多约1x10¹⁵ GC/kg的载体来治疗对象。应当理解，载体的量和用于治疗的量不仅随所选的特定载剂而变化，而且随施用途径、所治疗病况的性质以及患者的年龄和病况而异。最终，在一些实施方案中，主治医疗保健提供者将确定适当的剂量。药物组合物被设想为以适当比例的每种化合物配制在单一单位剂型中以供施用。

有时将组合物配制成缓释(例如，使用微囊化，参见WO 94/07529和/或美国专利号4,962,091)。在适当的情况下，制剂方便地以离散的单位剂型呈现，并且在一些实施方案中，通过制药领域熟知的任何方法制备。此类方法通常包括将治疗剂与液体载剂、固体基质、半固体载剂、精细分散的固体载剂或其组合混合的步骤，然后，如果需要，将产品引入或成型到所需的递送系统中。

在一些实施方案中，包含化合物的一种或多种合适的单位剂型通过各种途径施用，包括肠胃外(包括皮下、静脉内、肌肉内和腹膜内)、心内、心包、口服、直肠、皮肤、透皮、胸内、肺内和鼻内(呼吸)途径。

本文提供的基因疗法载体制备成多种形式，包括水溶液、悬浮液、片剂、硬或软明胶胶囊、脂质体和其他缓释制剂，例如成形的聚合物凝胶。基因疗法载体的施用通常涉及在水溶液中肠胃外或局部施用。类似地，含有基因疗法载体的组合物有时以装置、支架或作为缓释制剂施用。美国专利号6,306,434和其中包含的参考文献中描述了不同类型的配制程序。

在一些实施方案中，载体被配制用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)并且通常以单位剂型存在于其中含有添加的防腐剂的安瓿、预装注射器、小体积输注容器或多剂量容器中。药物组合物通常采用油性或水性媒剂(vehicle)中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且有时含有配方剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的载剂包括盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水和本领域常用的其他材料。

所述组合物有时还包含其他成分，例如用于治疗心脏疾病、病况和损伤的药剂，例如抗凝血剂(例如，达肝素钠(dalteparin)(法安明(fragmin))、达那肝素钠(danaparoid)(低分子葡糖胺聚糖(orgaran))、依诺肝素(enoxaparin)(依诺肝素钠(lovenox))、肝素(heparin)、亭扎肝素(tinzaparin)(亭扎肝素钠(innohep))、和/或华法林(warfarin)香豆素(coumadin))、抗血小板药(例如，阿司匹林(aspirin)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、或潘生丁(dipyridamole))、血管紧张素转换酶抑制剂(例如，贝那普利(Benazepril)(洛汀新(Lotensin))、卡托普利(Captopril)(开搏通(Capoten))、伊那普利(Enalapril)(依那普利(Vasotec))、福辛普利(Fosinopril)(蒙诺(Monopril))、赖诺普利(Lisinopril)(心宁卫(Prinivil)、捷赐瑞(Zestril))、莫西普利(Moexipril)(Univasc)、培哚普利(Perindopril)(Aceon)、喹那普利(Quinapril)(恩久平(Accupril))、雷米普利(Ramipril)(Altace)、和/或群多普利(Trandolapril)(Mavik)、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(例如，坎地沙坦(Candesartan)(Atacand)、依普沙坦(Eprosartan)(依普罗沙坦(Teveten))、厄贝沙坦(Irbesartan)(Avapro)、氯沙坦(Losartan)(科素亚(Cozaar))、替米沙坦(Telmisartan)(美卡素(Micardis))、和/或缬沙坦(Valsartan)(代文(Diovan))、β阻滞剂(例如，醋丁洛尔(Acebutolol)(醋丁酰心安(Sectral))、阿替洛尔(Atenolol)(天诺敏(Tenormin))、倍他洛尔(Betaxolol)(可络畅(Kerlone))、比索洛尔(Bisoprolol)/氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)(Ziac)、比索洛尔(Bisoprolol)(洛尔比索(Zebeta))、卡替洛尔(Carteolol)(Cartrol)、美托洛尔(Metoprolol)(酒石酸美托洛尔(Lopressor)，美托洛尔缓释剂(Toprol XL))、纳多洛尔(Nadolol)(康加尔多(Corgard))、普萘洛尔(Propranolol)(心得安(Inderal))、索他洛尔(Sotalol)(盐酸索他洛尔(Betapace))、和/或噻吗洛尔(Timolol)(马来酸噻吗洛尔(Blocadren))，钙通道阻滞剂(例如，氨氯地平(Amlodipine)(络活喜(Norvasc)，氨氯地平(Lotrel))、苄普地尔(Bepridil)(伐斯可(Vascor))、地尔硫卓(Diltiazem)(合心爽(Cardizem)、盐酸地尔硫(Tiazac))、非洛地平(Felodipine)(波依定(Plendil))、硝苯地平(Nifedipine)(拜新同(Adalat)、心痛定(Procardia))、尼莫地平(Nimodipine)(尼莫通(Nimotop))、尼索地平(Nisoldipine)(苏拉尔(Sular))、维拉帕米(Verapamil)(卡兰片(Calan)、异搏定(Isoptin)、盐酸维拉帕米缓释胶囊剂(Verelan))、利尿剂(例如，阿米洛利(Amiloride)(蒙达清(Midamor))、布美他尼(Bumetanide)(普麦西(Bumex))、氯噻嗪(Chlorothiazide)(克尿塞(Diuril))、氯噻酮(Chlorthalidone)(海固酮(Hygroton))、呋塞米(Furosemide)(速尿灵(Lasix))、氢氯噻嗪(Hydro-chlorothiazide)(双氢氯噻嗪(Esidrix)、二氢氯噻(Hydrodiuril))、吲达帕胺(Indapamide)(和楼奏力(Lozol))和/或安体舒通(Spironolactone)(螺内酯(Aldactone))、血管扩张剂(vasodilators)(例如，硝酸异山梨酯(Isosorbide dinitrate)(速必瑞锭(Isordil))、奈西立肽(Nesiritide)(奈西利肽(Natrecor))、肼苯哒嗪(Hydralazine)(肼屈嗪(Apresoline))、硝酸盐(Nitrates)和/或米诺地尔(Minoxidil)、他汀类药物、烟酸、吉非罗齐(gemfibrozil)、氯贝丁酯(clofibrate)、地高辛(Digoxin)、洋地黄毒苷(Digitoxin)、拉诺辛(Lanoxin)、或其任何组合。

有时包括其他药剂，例如抗细菌剂、抗微生物剂、抗病毒剂、生物应答调节剂、生长因子；免疫调节剂、单克隆抗体和/或防腐剂。本文提供的组合物被设想为也可与其他形式的治疗联合使用。

本文所述的病毒载体适合施用于对象以治疗疾病或病症。在一些实施方案中，这种组合物呈单剂量、多剂量、以连续或间歇方式，这取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是响应于创伤性损伤还是更持续的治疗目的，以及技术从业人员已知的其他因素。在一些实施方案中，本文提供的化合物和组合物的施用在预先选择的时间段内连续施用，或者可替代地以一系列间隔剂量施用。考虑了局部和全身施用。在一些实施方案中，实现了病毒或非病毒载体的局部递送。在一些实施方案中，细胞和/或载体的局部递送用于在心脏内产生细胞群。在一些实施方案中，这样的局部群体充当心脏的“起搏细胞”。

定义

如本文所用，术语“心肌病”是指其中心脏异常扩大、增厚和/或僵硬的心肌(心脏肌肉)的任何疾病或功能障碍。因此，心肌泵血的能力通常会减弱。在一些情况下，该疾病或病症的病因是炎症性、代谢性、毒性、浸润性、纤维形成性、血液学、遗传或起源未知。有两种一般类型的心肌病：缺血性(由于缺氧)和非缺血性。在一些情况下，心肌病是致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)。

“心力衰竭(HF)是复杂的临床综合征，通常由任何结构性或功能性心血管病症引起，导致全身灌注不足以满足身体的代谢需求，而不会过度增加左心室充盈压。它的特征是特定的症状，例如呼吸困难和疲劳，以及体征，例如液体潴留。如本文所用，“慢性心力衰竭”或“充血性心力衰竭”或“CHF”可互换地指不间断的或持续形式的心力衰竭。CHF的常见危险因素包括老年、糖尿病、高血压和超重。根据左心室的收缩功能，CHF大致分为射血分数降低或保留的HF(HFrEF和HFpEF)。术语“心力衰竭”并不意味着心脏已经停止或完全衰竭，而是比健康人的正常情况更弱。在一些情况下，病况较轻，在运动时会引起明显的症状，在其他情况下，病况更严重，在一些情况下甚至会在休息时导致危及生命的症状。慢性心力衰竭最常见的症状包括气短、疲倦、腿部和脚踝肿胀、胸痛和咳嗽。在一些实施方案中，本公开的方法减少、预防或改善患有CHF(例如HFrEF)或处于CHF风险中的对象的一种或多种CHF(例如HFrEF)症状。在一些实施方案中，本公开提供了治疗CHF和有时导致CHF的病况的方法。

如本文所用，“急性心力衰竭”或“失代偿性心力衰竭”可互换地指反映心脏不能以与身体正常充盈压力的需要相称的速率泵血的体征和症状恶化的综合征。AHF通常在数天至数周的过程中逐渐发展并且然后失代偿，由于这些体征或症状的严重性而需要即刻或紧急治疗。在一些情况下，AHF是心脏收缩或舒张功能的原发性障碍或静脉或动脉血管异常收缩的结果，但通常代表多种因素的相互作用，包括容量超负荷。大多数AHF患者有慢性心力衰竭(CHF)失代偿，因此对CHF的病理生理学、表现和诊断的大部分讨论与对AHF的理解直接相关。在其他情况下，AHF是由对心脏的损伤或损害心脏功能的事件，例如急性心肌梗塞、严重高血压、心脏瓣膜损伤、心律异常、心脏炎症或感染、毒素和药物引起的。在一些实施方案中，本公开的方法减少、预防或改善患有AHF或处于AHF风险中的对象的一种或多种AHF症状。在一些实施方案中，本公开提供了治疗AHF和有时导致AHF的病况的方法。在一些情况下，AHF是与心肌梗塞相关的缺血的结果。

如本文所用，术语“对象”或“个体”是指任何动物，例如驯养动物、动物园动物或人。在一些情况下，“对象”或“个体”是哺乳动物，如狗、猫、马、牲畜、动物园动物或人。可替代地或组合地，对象或个体是驯养动物，例如鸟、宠物或农场动物。“对象”和“个体”的具体示例包括但不限于患有心脏疾病或病症的个体，以及具有心脏病症相关特征或症状(例如致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM))的个体。

除非另有说明，否则本公开的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。例如，参见Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)Current Protocols in Molecular Biology；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(1991)PCR 1:APractical Approach(IRLPress at Oxford University Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A PracticalApproach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)NucleicAcid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；IRL Press(1986)Immobilized Cells andEnzymes；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,第3版(2002)Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sohail(2004)Gene Silencing by RNAInterference:Technology and Application(CRC Press)；Sell(2013)Stem CellsHandbook。

除非上下文另有说明，否则本文描述的本公开的各种特征明确地意在可以以任何组合使用。此外，本公开还设想在一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。为说明起见，如果说明书声明复合物包括组分A、B和C，则明确地意在A、B或C中的任何一个或其组合可以单独或以任何组合被省略和声明放弃。

所有的数字标示，例如pH值、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，可在适当情况下以1.0或0.1的增量变化(+)或(-)，或者可替代地变化+/-15％，或者可替代地10％，或者可替代地5％，或者可替代地2％。尽管并非总是明确地陈述，但应当理解所有数字标示前都有术语“约”。应该理解，使用这种范围格式是为了方便和简洁，并且应该灵活地理解为包括明确指定为范围限制的数值，而且还包括包括在该范围内的所有单独的数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确指定。例如，约1至约200范围内的比率应理解为包括明确列举的约1和约200的限制，也包括单独的比率，例如约2、约3和约4，以及子范围例如约10至约50、约20至约100等。还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

必须注意的是，如本文和所附权利要求所用，单数形式“一种”、“一个”和“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“心肌细胞”包括多个心肌细胞。

此外，如本文所用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时组合的缺少。

当与本文提供的基因疗法载体或其组合物结合使用时，“施用(Administration)”、“施用(administering)”等均指直接施用，其在一些情况下包括体外施用至非心肌细胞、体内施用至非心肌细胞、由医学专业人士向对象施用或通过对象自我施用和/或间接施用，这在一些情况下是开具包括本文提供的基因疗法载体的组合物的行为。当在本文中关于细胞使用时，它是指将组合物引入细胞。通常，施用有效量，该量通常由本领域技术人员确定。考虑使用任何合适的施用方法。在一些情况下，通过例如将基因疗法载体加入细胞培养基中或体内注射到心脏损伤部位，将基因疗法载体施用于细胞。在一些情况下，通过例如血管内注射、心肌内递送等来实现对对象的施用。

如本文所用，术语“心脏细胞”是指存在于心脏中的任何提供心脏功能(例如心脏收缩或血液供应)或用于维持心脏结构的细胞。如本文所用的心脏细胞包括存在于心脏的心外膜、心肌或心内膜中的细胞。心肌细胞还包括，例如，心肌肉细胞或心肌细胞，以及心脏脉管系统的细胞，例如冠状动脉或静脉的细胞。心肌细胞的其他非限制性示例包括构成心肌、血管和心肌细胞支持结构的上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心脏干细胞或祖细胞、心脏传导细胞和心脏起搏细胞。在一些情况下，心脏细胞来源于干细胞，包括例如胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。

如本文所用，术语“心肌细胞”或“多个心肌细胞”是指天然存在于哺乳动物心脏中的含有肌节的横纹肌细胞，与骨骼肌细胞不同。心肌细胞的特点是表达特殊分子，例如肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、心脏α-肌动蛋白等蛋白质。如本文所用，术语“心肌细胞”是总称，包括任何心肌细胞亚群或心肌细胞亚型，例如心房、心室和起搏心肌细胞。

术语“培养物”或“细胞培养物”是指在人工体外环境中维持细胞。“细胞培养系统”在本文中用于指代细胞群以单层或悬浮液生长的培养条件。“培养基”在本文中用于指代用于细胞培养、生长或增殖的营养液。在一些情况下，培养基的特征在于功能特性，例如但不限于将细胞维持在特定状态(例如，多能状态、静止状态等)或使细胞成熟的能力，例如，在一些实施方案中，促进祖细胞分化成特定谱系的细胞(例如，心肌细胞)。

如本文所用，术语“表达(expression)”或“表达(express)”是指核酸或多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸或核酸来源于基因组DNA，在一些情况下，表达包括真核细胞中mRNA的剪接。在一些情况下，基因的表达水平是通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定的。

如本文所用，“表达盒”是包括编码一种或多种蛋白质或一种或多种核酸的一种或多种多核苷酸或核酸的DNA多核苷酸，其被配置为在宿主细胞中表达多核苷酸。通常，一种或多种多核苷酸的表达置于某些调节元件的控制之下，包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。此类多核苷酸被称为“可操作地连接”或“可操纵地连接”至调节元件(例如，启动子)。

本文采用的短语“药学上可接受的”是指在正确医学判断的范围内适用于与人和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。

“治疗(Treatment)”、“治疗(treating)”和“治疗(treat)”被定义为用药剂作用于疾病、病症或病况以减少或改善疾病、病症、病况和/或其症状的有害或任何其他不希望的影响。

如本文所用，术语“有效量”等是指足以诱导期望的生理结果(例如，疾病的治疗)的量。有时以一次或多次施用、应用或剂量施用有效量。这种递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间段、组合物的生物利用度、施用途径等。然而，应当理解，组合物(例如基因疗法载体)的特定量对任何特定对象的影响取决于多种因素，包括所使用的特定药剂的活性、对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、排泄率、组合物组合、所治疗的特定疾病的严重程度和施用形式。

如本文所用，关于多肽或核酸序列的术语“其等价物”是指不同于参考多肽或核酸序列但保留基本特性(例如，生物活性)的多肽或核酸。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列上与另一个参考多核苷酸不同。在一些情况下，变体的核苷酸序列的变化会改变参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。在一些情况下，核苷酸变化导致参考序列编码的多肽中的氨基酸替换、缺失、添加、融合和截短。通常，差异是有限的，因此参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。

如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用并且是指核苷酸(即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的任何长度的聚合形式。多核苷酸的非限制性示例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、载体、探针和引物。如本文所用，以基因名称(例如，“PKP2核酸”)开头的词语“多核苷酸”或“核酸”是指编码相应蛋白质(例如，“PKP2蛋白质”)的多核苷酸序列。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸的任何长度的聚合形式，其有时包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有经修饰的肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列、具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白、经免疫标记的蛋白等。如本文所用，以基因名称(例如，“PKP2蛋白”)开头的词“蛋白质”是指天然蛋白质或其功能变体。“天然蛋白质”是由生物体基因的基因组拷贝编码的蛋白质，该生物体优选载体所针对的生物体(例如，人、啮齿动物、灵长类动物或兽医感兴趣的动物)，呈任何基因功能异构体或功能等位基因变异。

如本文所用，蛋白质的“功能变体”或“变体”是具有任意数量的氨基酸替换、插入、截短或内部缺失的变体，其保留蛋白质的功能属性，包括例如蛋白质与其他因素组合诱导桥粒组织的能力。在一些情况下，功能变体是通过计算鉴定，例如仅具有保守替换的变体，或使用体外或体内测定进行实验鉴定。

如本文所用，多核苷酸序列的“密码子变体”是编码与具有一个或多个同义密码子替换的参考多核苷酸序列相同的蛋白质的多核苷酸序列。同义密码子的选择在本领域技术人员的技术范围内，作为遗传密码的编码是已知的。在一些情况下，使用各种计算工具(例如www.genscript.com上提供的GENSMARTTM密码子优化工具)执行密码子优化。通常，密码子优化用于增加异源系统中蛋白质的表达，例如当人编码序列在细菌系统中表达时。术语“密码子变体”旨在涵盖以这种方式优化的序列和针对其他目的优化的序列，例如去除CpG岛和/或隐匿起始位点。

术语“载体”是指包括待在体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸或蛋白质的大分子或分子复合物。载体有时是经修饰的RNA、脂质纳米颗粒(封装DNA或RNA)、转座子、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒、逆转录病毒、整合型慢病毒载体(LVV)或非整合型LVV。因此，如本文所用，“载体”包括用于转化的裸多核苷酸(例如质粒)以及用于将多核苷酸递送至细胞的任何其他组合物，包括能够转导细胞的载体和可用于细胞转染的载体。

如本文所用，术语“病毒载体”是指包括通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子，或指介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒通常包括各种病毒组分，有时除了一种或多种核酸之外还包括细胞组分。

术语“遗传修饰”是指在引入新核酸(即细胞外源性核酸)后在细胞中诱导的永久性或暂时性遗传改变。遗传改变通常通过将新核酸掺入心脏细胞的基因组中，或通过将新核酸作为染色体外元件的瞬时或稳定维持来实现。当细胞是真核细胞时，通常通过将核酸引入细胞基因组来实现永久性遗传改变。合适的遗传修饰方法包括病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。

图1显示了心脏桥粒将细胞连接在一起(Brodehl等人,2018；Moncayo-Arlandi和Brugada,2017)。顶部图中的红线被描绘为结蛋白——中间丝，其形成网络以稳定肌节和其他细胞器。桥粒的EM图片显示在左角。

图2显示ARVC疾病适应证和可能的疾病机制的总结。

图3A-3C显示第8天iPSCM中PKP2急性沉默的结果，显示出显著的细胞表型。在图3A和图3C中，绿色为PKP2，红色为DSP，蓝色为细胞核。在图3B中，绿色为肌节蛋白Actn2并且洋红色为MyBPC。

图4显示了沉默第8天DSP膜定位的定量测量，这是通过响应一系列剂量的siPKP2时其与另一种桥粒蛋白PKG的共定位来估计。

图5说明免疫印迹，其显示与沉默对照siNeg相比，在PKP2被沉默的细胞中，沉默PKP2导致桥粒中DSP蛋白的总量减少，主要在不溶性级分中检测到。

图6A显示AAV-PKP2基因疗法的载体图谱。图6B显示在PKP2沉默的第10天和AAV转导的第8天，通过使用AAV介导的基因递送至iPSCM表达PKP2转基因来恢复DSP膜位置。GFP与经flag标记的PKP2共同表达。flag标签为青色，DSP为红色，细胞核为蓝色。图6C显示iPSC心肌细胞中PKP2沉默后总DSP表达的AAV-PKP2转基因恢复。显示了在不存在或存在AAV-PKP2转基因拯救的情况下，在PKP2沉默后免疫荧光信号中总DSP强度的定量。

图7A-7B显示AAV PKP2转基因表达拯救了PKP2沉默后iPSCM的收缩速度。图7A显示PKP2沉默、AAV转导和收缩性记录时间表。图7B显示AAV-PKP2转基因部分恢复了PKP2沉默后的收缩速度。显示了在不存在或存在AAV-PKP2转基因拯救的情况下，在PKP2沉默后相对于核计数归一化的收缩速度。

图8显示人和小鼠PKP2α的第二代AAV表达盒的示意图。左表显示了表达盒中的所有元件。右侧图显示小鼠和人表达盒。

图9A-9B显示第二代AAV-hPKP2α部分地拯救iPSC心肌细胞中PKP2沉默后的收缩速度的初步结果。图9A显示人PKP2α转基因在iPSC心肌细胞中以剂量依赖性方式表达。图9B显示人PKP2α转基因在30K MOI下在PKP2沉默后显示对收缩速度的部分拯救。

图10显示了在12周龄C57BL/6动物中第二代AAV9人和小鼠PKP2α的表达分析。上图显示了在HBSS对照小鼠中内源性小鼠PKP2α的表达，以及在两个AAV9注射剂量(分别为1E13和5E13)下内源性和转导的小鼠PKP2α的表达。下图显示了转导的人PKP2α(一种稍大的同源物)的相应表达分析。

图11A-G显示在12周龄C57BL/6动物中第二代AAV9人和小鼠PKP2α的先导性表达安全性研究。图11A显示注射AAV9前的体重和注射AAV9后3周的体重。图11B显示在AAV9注射小鼠或人PKP2α后3周，通过射血分数百分比测量心脏功能。图11C和图11D显示通过内径测量的舒张末期和收缩期的LV结构。图11E-11G显示通过QRS(图11E)、QT间期(图11F)和P/R幅度(图11G)测量的电生理活动。

图12显示他莫昔芬诱导后PKP2-cKO小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。曲线显示PKP2-cKO小鼠在诱导后三周开始恶化，只有(七只中的)一只小鼠存活到六周。

图13A-13B显示PKP2-cKO小鼠的右心室(RV)扩张型心肌病。图13A(左图)显示的图像说明与对照小鼠相比，在他莫昔芬诱导后三周，PKP2-cKO小鼠的舒张末期(RVIDd)RV内部尺寸增加。图13A(右图)显示了与对照小鼠相比PKP2-cKO小鼠的RVIDd随时间变化的图。图13B(左图)显示的图像说明PKP2-cKO小鼠的RV面积增加。RV面积由虚线表示，显示在诱导后一周、诱导后三周和四周面积开始增加。图13B(右图)显示与对照小鼠相比，PKP2-cKO小鼠的RV面积随时间变化的图。

图14A-14B显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠左心室(LV)扩张型心肌病的发展。图14A(左图)显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠的收缩末期(LVIDs)和舒张末期(LVIDd)的LV内部尺寸增加的图像。LVIDs显示为左侧的黄线，LVIDd显示为右侧的红线。图14A(右图)显示与对照小鼠相比，PKP2-cKO小鼠的LVIDs和LVIDd随时间增加的图。图14B显示与对照小鼠相比，以射血分数百分比测量的随时间变化的LV性能图。

图15显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠出现严重的电生理表型，特别是显示PKP2-cKO小鼠的QRS间期延长和P/R幅度比增加。顶部图显示对照(顶部)和PKP2-cKO小鼠(底部)的示例性心电图。显示了与对照相比，PKP2-cKO小鼠的P波幅度增加。与对照小鼠相比，心电图还显示PKP2-cKO小鼠的R波幅度降低。此外，与对照相比，PKP2-cKO小鼠的QRS间期延长。底部图显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠的QRS间期增加和P/R幅度增加的图。

图16A-16C显示纤维化、组织重塑基因和心力衰竭标志物的表达增强。图16A显示与对照相比，PKP2-cKO小鼠的RV和LV(顶部)中的PKP2 RNA表达以及桥粒和Cx43蛋白表达(底部)。与对照相比，PKP2-cKO小鼠显示出在LV和RV中PKP2的表达约为一半。下图显示了免疫印迹，其显示桥粒中PKP2、DSP和PKG以及间隙连接中Cx43的LV蛋白水平降低。图16B显示与对照相比PKP2-cKO小鼠中的纤维化基因TGFβ1、Col1a1和Col3a1和组织重塑基因Timp1和Mmp2的表达增强。在这里，在RV和LV中，对照和PKP2-cKO小鼠之间TGFβ1和Timp1的表达增加。与对照小鼠相比，PKP2-cKO小鼠中的Col1a1和Col3a1也大大增加，其中与RV相比，在LV中的表达略微更高。与对照小鼠相比，PKP2-cKO小鼠中的Mmp2显示增加，其中与LV相比，在RV中的表达略微更高。未显示Mmp9在对照和PKP2-cKO小鼠之间有表达差异。图16C显示与对照小鼠相比PKP2-cKO小鼠中的心力衰竭标志物、NPPA和NPPB表达增强。在PKP2-cKO小鼠中与RV相比，在LV中NPPA和NPPB两者表达略微更高。

图17显示了在PKP2-cKO ARVC小鼠模型中评估PKP2作为基因疗法的功效的实验设计。研究中包括总共六个单独的治疗组，所有组均连续三天接受他莫昔芬治疗。它们是：用HBSS缓冲剂治疗的六只WT小鼠；用HBSS缓冲剂治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导前3周用3E13 vg/kg AAV9:人PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导前3周用5E13 vg/kg AAV9:小鼠PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导后立即用5E13 vg/kg AAV9:小鼠PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；以及在他莫昔芬诱导后1周用5E13 vg/kg AAV9:小鼠PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠。在他莫昔芬诱导前收集体重、超声心动图和EKG的基线读数。每周记录他莫昔芬诱导后的所有读数，包括B型、M型(RV、LV)和结构(LV内径)的超声心动图和用于定量心律失常和评估电生理参数的30分钟ECG。

图18A显示人和小鼠PKP2α的AAV表达盒示意图。AAV-pTnT600-mPKP2-WPRE有4199个碱基对，包括5’末端和3'末端的反向末端重复序列(ITR)、pcTNT启动子后随小鼠PKP2α的编码序列、然后是3'末端在3'ITR之前的WPRE和bGH。AAV-pTnT600-hPKP2op-WPRE有4324个碱基对，包括5’末端和3'末端的反向末端重复序列(ITR)、pcTNT启动子后随人PKP2α的密码子优化编码序列、然后是3'末端在3'ITR之前的WPRE和bGH。图18B显示来自用AAV9:PKP2治疗的野生型小鼠的小鼠和人PKP2α蛋白质表达的免疫印迹(参见图10中的完整印迹)。缓冲剂治疗的小鼠在左图中。中间图显示了来自用1E13病毒基因组/kg治疗的小鼠的免疫印迹，其中AAV9:mPKP2在顶部免疫印迹中，AAV9:hPKP2(密码子优化的)在底部免疫印迹中。右图显示了来自用5E13病毒基因组/kg治疗的小鼠的免疫印迹，其中AAV9:mPKP2在顶部免疫印迹中，AAV9:hPKP2(密码子优化的)在底部免疫印迹中。

图19显示用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。用缓冲剂治疗的小鼠以红线显示，存活概率在他莫昔芬诱导后三周开始下降，在他莫昔芬诱导后六周接近零。在他莫昔芬诱导后六周，所有治疗组的存活概率为90％或更高。

图20A-20C显示AAV9:PKP2治疗PKP2-cKO小鼠在减少RV和LV扩张和维持心脏功能方面的功效。图20A显示了说明AAV9:PKP2治疗的小鼠的射血分数改善的图。在此图中，与野生型和AAV9:PKP2治疗的小鼠相比，缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠的射血分数降低了34％。图20B显示了说明与缓冲剂治疗的小鼠(其显示为图中与野生型小鼠和AAV9:PKP2治疗的小鼠相比升高的红线)相比AAV9:PKP2治疗的小鼠中RV扩张减少的图。图20C显示了说明LVIDd(上)和LVIDs(下)改善的图。每个治疗组由单独的柱形图说明，其中左侧是野生型和缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠。

图21A-21B显示用AAV:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的ECG参数的改善。图21A显示了对照和用AAV9:PKP2和缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠的示例性原始ECG迹线。缓冲剂治疗的对照和PKP2-cKO小鼠的ECG迹线显示在顶部两个图上。AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠显示在底部两条迹线中。图21B显示的图说明与用缓冲剂治疗相比，用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的P/R比(顶部图)、QT间期(中间图)和QRS间期(底部图)改善。在每种情况下，缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠相比于经治疗的小鼠和野生型小鼠是异常值。

图22A-22B显示AAV9:PKP2治疗对PKP2-cKO小鼠心律失常的改善。图22A(顶部)显示了心律失常严重程度的分级表。级别5代表S-VT/VF/心源性猝死；4代表NSVT；3代表>100PVC、二联律和三联律；2代表>50，<100PVC；1代表<50PVC、PJC和AV阻滞；0代表<10PVC。图22A(底部)显示的图总结了与对照相比，用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的心律失常得分的改善。在他莫昔芬诱导后三周开始，缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠室性心律失常得分增加。图22B显示的分布图显示与对照相比用AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠的心律失常严重程度的改善。野生型小鼠显示在最左侧的柱形图中，然后是缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠，其显示平均得分为3。经治疗的小鼠由四个柱形图表示，平均而言，这些柱形图显示得分显著下降。

图23显示使用PKP2-cKO ARVC小鼠模型评估人PKP2作为基因疗法的功效的实验设计。PKP2-cKO小鼠连续三天用他莫昔芬治疗，然后用不同剂量的AAV9:hPKP2或HBSS治疗。

图24A-24D显示AAV9:hPKP2基因疗法治疗PKP2-cKO小鼠的结果。图24A显示射血分数结果，其中对照小鼠显示出高射血分数，该射血分数通过他莫昔芬诱导而降低且不受HBSS治疗影响。用增加剂量的AAV9:hPKP2治疗显著增加经治疗的小鼠的射血分数(P<0.05)。图24B显示右心室大小的结果。对照小鼠具有相对较小的RV大小，其随着他莫昔芬的诱导而增加并且不受HBSS治疗的影响。AAV9:hPKP2治疗显示剂量相关的RV大小减小。(较低两个剂量P<0.05，最高剂量P<0.01)。图24C显示通过LVIDd测量的LV扩张。图24D显示通过LVIDs测量的LV扩张。AAV9:hPKP2治疗显著降低了左心室扩张的增加，如通过LVIDd(P<0.05)和LVIDs(P<0.05，仅针对1e14剂量)测量。

图25显示了AAV9:hPKP2基因疗法治疗PKP2-cKO小鼠的QT间期(顶部)、P/R比(中间)和心律失常得分(底部)的结果。与用红色柱显示的HBSS治疗的PKP2-cKO小鼠相比，AAV9:hPKP2治疗在他莫昔芬诱导后4周显示PKP2-cKO小鼠中QT间期显著降低(P<0.05)，P/R比呈下降趋势，以及心律失常呈下降趋势。

图26A-26B显示AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在降低右心室(图26A)和左心室(图26B)中的心力衰竭标志物、纤维化和组织重塑标志物的表达方面的结果。AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在他莫昔芬诱导后4周显示出降低右心室和左心室中心力衰竭标志物、纤维化和组织重塑基因的表达的功效。分别在WT对照、PKP2-cKO和AAV9:hPKP2转导的心脏中估计PKP2的内源性和转基因mRNA水平。心力衰竭标志物是NPPA和NPPB。纤维化基因是Col1a1和Col3a1。组织重塑基因是Timp1。

图27A-27B显示AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在他莫昔芬诱导后四周减少右心室和左心室纤维化发展方面的结果。图27A显示呈红色的肌肉染色和呈蓝色的纤维化三色染色。黄色箭头突出显示PKP2-cKO小鼠心脏中具有显著纤维化的区域。图27B显示了量化对照和PKP2-cKO小鼠(接受和未接受AAV9:hPKP2治疗)中的胶原阳性组织的图。未经治疗的PKP2-cKO小鼠的胶原阳性组织数量最多，而用1e13治疗的小鼠的胶原阳性组织数量水平降低了约一半。用3e13或1e14治疗的小鼠具有接近对照小鼠的胶原水平。

图28A-28B显示在可溶性级分(图28A)和不溶性级分(图28B)中PKP2和其他桥粒蛋白的表达。在可溶性级分中未检测到DSP。注：*该动物在超声心动图检查前被发现死亡。**PKP2蛋白强度在相同的蛋白质印迹上相对于微管蛋白强度归一化。为简单起见，此处仅显示两个微管蛋白印迹中的一个。PKP2显示为两条带，即内源性小鼠PKP2和较大的人PKP2。

实施例

给出以下实施例的目的是为了说明本公开的各种实施方案，并不意味着以任何方式限制本公开。本实施例连同在此描述的方法目前代表优选实施方案，是示例性的，并且不旨在限制权利要求的范围。本领域技术人员将想到包括在由权利要求的范围限定的本公开的精神内的其中的变化和其他用途。

实施例1：PKP2耗竭的细胞模型

作为概念的初步证明，使用siRNA创建了PKP2耗竭的细胞模型。PKP2在诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSCM)中被耗竭。使用从Invitrogen购买的siRNA(包括siPKP2和阴性对照siRNA二者)(4390843Silencer Select阴性对照No.1siRNA；4392420测定Ids531202Silencer Select预设计siRNA#1；4392420测定Id s531203Silencer Select预设计siRNA#2；4392420测定Id s531204Silencer Select预设计siRNA#3；和4392420测定Ids10585 Silencer Select预设计siRNA#4)进行siRNA对PKP2的急性沉默。这种沉默导致DSP在第8天从细胞膜上消失，如图3A中的免疫荧光所示。定量测量DSP膜定位(图4)，这说明DSP-PKG共定位显著减少。通过免疫荧光法也观察到肌节密度的降低(图3B)。此外，通过免疫荧光观察到图案化iPSCM中细胞压实的混乱(图3C)。

进行siPKP2 iPSCM裂解物的免疫印迹，其显示，主要在PKP2被沉默的细胞的不溶性级分中检测到来自桥粒的DSP蛋白的总量减少(图5)。

实施例2：AAV9-PKP2拯救PKP2耗竭表型

通过递送由600nt心肌肌钙蛋白(TnT)启动子连同GFP驱动的AAV9变体CR9-01flag标记的PKP2表达以鉴定转导的细胞(图6A)，观察到DSP在PKP2沉默的iPSCM中重新定位回到膜处(图6B)，从而恢复桥粒结构。PKP2转基因经过密码子优化以抵抗siRNA介导的沉默。由于技术上的困难，不可能准确地定量有多少DSP特异性定位于发生细胞连接和存在桥粒的膜上。因此，定量了总细胞DSP强度，而不是定位于膜的DSP量。

为了证明PKP2转基因可以在功能上恢复心肌细胞的收缩性，通过SONY成像记录了基于明场的iPSCM收缩，并通过DANA Solutions Pulse分析软件分析了视频。实验时间线显示在图7A中。在本实验中，siRNA用于在第1天耗竭iPSCM细胞中的内源性PKP2表达。针对siRNA阴性对照或siPKP2使用两种siRNA浓度，5和1.25nM。组合两个siPKP2#3和#4以使转录物沉默。在第3天，使用AAV PKP2转导耗竭的细胞，从而在iPSCM中观察到响应于PKP2转基因表达，对收缩速度的拯救(图7B)。在AAV转导后第3、4、5、6、7和8天记录收缩性。从三个96孔板和分别用AAV 300K MOI或100K MOI在5和1.25nM siRNA转导的细胞平均化收缩速度。速度值进一步相对于分别对应于300K或100K MOI的平均核计数进行归一化。

实施例3：用第二代PKP2αAAV9治疗

开发了用于表达人或小鼠PKP2α的第二代AAV表达盒。第二代盒包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH多聚(A))。第二代载体示于图8中。

转基因拯救研究在PKP2沉默的iPSC心肌细胞中进行。初步结果表明，第二代AAV-hPKP2α在iPSC心肌细胞中部分拯救了PKP2沉默后的收缩速度。图9A显示人PKP2α转基因通过不同MOI(感染复数，感染每个细胞的病毒颗粒的平均数量)以剂量依赖性方式在iPSC心肌细胞中表达的结果。在AAV转导后3天，在细胞的可溶性和不溶性级分中评估PKP2和DSP(桥粒斑蛋白)表达。图9B显示人PKP2α转基因在30K MOI显示出在PKP2沉默后对收缩速度的部分拯救，如学生t检验所示，p值为0.0103，而没有AAV PKP2转基因时p值<0.0001。

进行了实验以研究在12周龄C57BL/6动物中第二代AAV9人和小鼠PKP2α的表达分析。该实验的结果示于图10中。分别以1E13和5E13 vg/kg的剂量向动物眶后静脉内施用AAV9-PKP2α。在注射后3.5周收获心脏LV组织。在此用蛋白质印迹分析LV组织的可溶性级分。上图显示了在HBSS对照小鼠中内源性小鼠PKP2α的表达，以及在两个AAV9注射剂量(分别为1E13和5E13)下内源性和转导的小鼠PKP2α的表达。下图显示了转导的人PKP2α(一种稍大的同源物)的相应表达分析。该人同源物经密码子优化。在AAV注射后3.5周，通过超声心动图未观察到不良心脏事件。

图11A-11G显示在12周龄C57BL/6动物中第二代AAV9人和小鼠PKP2α的先导性表达安全性研究在AAV注射后3周通过超声心动图未显示出任何不良心脏事件。分别以1E13和5E13 vg/kg的剂量向动物眶后静脉内施用AAV9-PKP2α。图11A显示注射AAV9前的体重和注射AAV9后3周的体重。图11B显示在AAV9注射小鼠或人PKP2α后3周，通过射血分数百分比测量心脏功能。图11C和11D显示通过内径测量的舒张末期和收缩期的LV结构。图11E-11F显示通过QRS、QT间期和P/R幅度测量的电生理活动。

实施例4：PKP2-cKO ARVC小鼠模型表征

对大约3月龄的四只野生型和七只PKP2-cKO ARVC小鼠(αMYHC-Cre-ER(T2)、PKP2^fl/fl)连续四天进行腹膜内注射他莫昔芬(玉米油中20mg/ml，100μl/小鼠(约75mg/kg))。在他莫昔芬诱导前收集体重、超声心动图和EKG的基线读数。每周记录他莫昔芬诱导后的所有读数，包括B型、M型(RV、LV)和结构(LV内径)的超声心动图和用于定量心律失常和评估电生理参数的30分钟ECG。在研究结束时收集末端组织，包括心脏和肺。

对小鼠进行了存活分析(图12)。Kaplan-Meier存活曲线显示在他莫昔芬诱导后三周PKP2-cKO小鼠的存活急剧下降，只有一只动物在他莫昔芬诱导后达到六周。诱导后三周，动物表现出严重的临床症状，包括猝死、水肿、活动减少、对异氟烷的耐受性降低。

PKP2-cKO小鼠早在他莫昔芬诱导后一周就出现RV扩张型心肌病。图13A的左侧图中显示在他莫昔芬诱导后三周，PKP2-cKO小鼠在舒张末期(RVIDd)出现增加的RV内部尺寸。图13A的右侧图总结了在他莫昔芬诱导的四周期间相对于体重归一化的RVIDd的连续增加。图13B的左侧图中显示RV面积每周增加的图像，表明RV扩张。图13B的右侧图总结了相对于体重归一化的RV面积增加。P值：学生t检验。误差线：s.e.m.*P<0.05，**P<0.01相比于对照。

PKP2-cKO小鼠在他莫昔芬诱导后出现LV扩张型心肌病。图14A的左侧图中显示在他莫昔芬诱导后三周，PKP2-cKO在收缩末期(LVIDs)和舒张末期(LVIDd)出现增加的LV内部尺寸。图14A的右侧图总结了在他莫昔芬诱导的四周期间相对于体重归一化的LVIDs和LVIDd的连续增加。图14B显示了在他莫昔芬诱导后两周后以射血分数％测量的LV性能急剧下降。P值：学生t检验。误差线：s.e.m.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001相比于对照。

PKP2-cKO小鼠出现QRS间期延长和P/R幅度比增加，表明心室传导紊乱和心室内阻滞。图15的顶部图显示在他莫昔芬诱导后三周，PKP2-cKO小鼠出现增加的P波幅度和降低的R波幅度。图15左底部图显示QRS间期的连续增加，右下图显示他莫昔芬诱导四周期间P/R幅度比的增加。P值：学生t检验。误差线：s.e.m.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001相比于对照。

PKP2-cKO小鼠出现自发性室性期前收缩(PVC)。表2显示了在30分钟连续记录期间获得的数据，一周时几乎没有PVC，而两周时在所有PKP2-cKO动物中偶尔检测到额外的收缩。PVC的发生在后期进一步增加，大多数动物显示超过100次PVC。从三周开始，在PKP2-cKO动物中观察到心源性猝死。

PKP2-cKO小鼠显示纤维化、组织重塑基因和心力衰竭标志物的表达增强。图16A的顶部图显示野生型和PKP2-cKO小鼠的RV和LV两者中的PKP2 mRNA表达。红点和蓝点代表每只老鼠。图16A的底部图显示桥粒中PKP2、DSP和PKG以及间隙连接中Cx43的LV蛋白水平降低的代表性免疫印迹。图16B显示PKP2-cKO小鼠表现出纤维化基因TGFβ1、Col1a1和Col3a1以及组织重塑基因Timp1和Mmp2的表达增强。图16C显示PKP2-cKO小鼠表现出心力衰竭标志物NPPA和NPPB的表达增强。

实施例5：PKP2-cKO ARVC小鼠模型中的PKP2基因疗法功效

图17显示使用PKP2-cKO ARVC小鼠模型评估PKP2作为基因疗法靶标的功效的实验设计。研究中包括总共六个单独的治疗组，所有组均连续三天接受他莫昔芬治疗。治疗组如下：用HBSS缓冲剂治疗的六只野生型小鼠；用HBSS缓冲剂治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导前三周用3E13 vg/kg AAV9:hman PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导前三周用5E13 vg/kg AAV9:小鼠PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导后立即用5E13 vg/kg AAV9:小鼠PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠；以及在他莫昔芬诱导后一周用5E13 vg/kg AAV9:小鼠PKP2治疗的十只PKP2-cKO ARVC小鼠。

在他莫昔芬诱导前收集体重、超声心动图和EKG的基线读数。每周记录他莫昔芬诱导后的所有读数，包括B型、M型(RV、LV)和结构(LV内径)的超声心动图和用于定量心律失常和评估电生理参数的30分钟ECG。末端组织(心脏和肺)将在研究结束时收集。

在野生型小鼠LV心脏组织中检测到AAV9:PKP2蛋白表达。图18A显示人和小鼠PKP2α的第二代AAV表达盒的示意图。图18B显示在眶后注射AAV9:PKP2后三周进行的代表性免疫印迹以显示小鼠和人PKP2的表达(完整印迹显示在图10中)。每次治疗(HBSS、1E13 vg/kg或5E13 vg/kg)共注射五只八周龄的C57BL6野生型小鼠。

Kaplan-Meier存活曲线显示，在所有AAV9:PKP2治疗组中，在他莫昔芬诱导6周后，AAV9:PKP2延长了PKP2-cKO小鼠的寿命。人和小鼠PKP2在延长经治疗的PKP2-cKO小鼠的寿命方面都表现出功效。在图19中，红线是用HBSS缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠，其在他莫昔芬诱导后三周显示急剧下降。相比之下，所有经AAV9-PKP2治疗的小鼠都存活到他莫昔芬诱导后20周。

PKP2-cKO小鼠的AAV9:PKP2治疗显示出减少RV和LV扩张和维持心脏功能的功效。图20A显示与HBSS治疗的小鼠相比，AAV9:PKP2治疗阻止了射血分数百分比的下降(如红线所示)。图20B显示AAV9:PKP2治疗以每周为基础显示RV扩张减少，如通过相对于体重归一化的RV面积所估计的。图20C显示在他莫昔芬诱导后四周，AAV9:PKP2治疗显著降低PKP2-cKO小鼠的LV扩张，如通过舒张末期的LV内部尺寸(LVIDd)(顶部图)和收缩末期的LV内部尺寸(LVIDs)(底部图)测量，均相对于体重归一化。误差线：s.e.m.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001相比于对照。

AAV9:PKP2治疗还显著改善了PKP2-cKO小鼠的ECG参数。图21A显示原始ECG迹线的示例，其显示AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠心脏的电生理行为显著改善。图21B显示AAV9:PKP2治疗与红线显示的用HBSS治疗的PKP2-cKO小鼠相比，显示出P/R比(顶部图)、QT间期(中间图)和QRS间期(底部图)的显著改善。

AAV9:PKP2治疗还显著降低了PKP2-cKO小鼠的心律失常。图22A(顶部)显示带有分级图的表格，用于对麻醉的PKP2-cKO小鼠在30分钟记录期间的自发性心律失常的严重程度进行分类。室性期前收缩(IPVC)、交界性早搏复合波(premature junctional complex)(PJC)、AV阻滞(房室传导阻滞)、非持续性室性心动过速(NSVT)、室上性心动过速(S-VT)和心室颤动。图22A(底部)总结了基于分级图的平均得分，显示了AAV9:PKP2治疗的PKP2-cKO小鼠心律失常的改善。图22B显示在他莫昔芬诱导后四周时每个治疗组中个体小鼠的分布。AAV9:PKP2治疗显示心律失常事件频率和严重程度均降低，如与红柱所示用HBSS缓冲剂治疗的PKP2-cKO小鼠相比心律失常得分得到改善所表明。

实施例6：在PKP2-cKOARVC小鼠模型中使用AAV9:hPKP2的PKP2基因疗法功效研究

使用PKP2-cKO ARVC小鼠模型确定人PKP2作为基因疗法靶标的功效。该研究共包括五个单独的治疗组。所有组均用他莫昔芬连续治疗三天。这些组包括：用HBSS缓冲剂治疗的四只野生型小鼠；用HBSS缓冲剂治疗的四只PKP2-cKOARVC小鼠；在他莫昔芬诱导后一周用1E13 vg/kg AAV9:人PKP2治疗的四只PKP2-cKO ARVC小鼠；在他莫昔芬诱导后一周用3E13 vg/kg AAV9:人PKP2治疗的三只PKP2-cKOARVC小鼠；和在他莫昔芬诱导后一周用1E14vg/kg AAV9:人PKP2治疗的三只PKP2-cKO ARVC小鼠。在他莫昔芬诱导前收集体重、超声心动图和EKG的基线读数。每周记录他莫昔芬诱导后的所有读数，包括B型、M型(RV、LV)和结构(LV内径)的超声心动图和用于定量心律失常和评估电生理参数的30分钟ECG。在他莫昔芬诱导后四周收集末端心脏组织。图23说明了实验设计。

AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在他莫昔芬诱导后四周显示出减少右心室(RV)和左心室(LV)扩张和维持心脏功能的功效。图24A-24D显示了该测定的结果。与HBSS治疗的小鼠相比，AAV9:hPKP2治疗阻止了射血分数百分比的下降(图24A)。AAV9:hPKP2治疗显示RV扩张减少，如通过相对于体重归一化的RV面积所估计的(图24B)。AAV9:hPKP2治疗显著降低PKP2-cKO小鼠的LV扩张，如通过舒张末期的LV内部尺寸(LVIDd)(图24C)和收缩末期的LV内部尺寸(LVIDs)(图24D)测量，均相对于体重归一化。P值由学生t检验确定，误差线：s.e.m.与对照相比，*P<0.05，**P<0.01。

与HBSS治疗的PKP2-cKO小鼠相比，AAV9:hPKP2治疗在他莫昔芬诱导四周显示PKP2-cKO小鼠中QT间期显著降低(图25顶部图)，P/R比呈下降趋势(图25中间图)，以及心律失常呈下降趋势(图25底部图)。P值由学生t检验确定，误差线为s.e.m.*与对照相比，P<0.05。由于本研究纳入的动物数量较少，P/R比和心律失常得分未达到统计学意义。此外，HBSS治疗组中的一只动物在他莫昔芬诱导后约4周在ECG记录后达到人道终点。1e13剂量组中的一只动物在超声心动图检查前被发现死亡。总体而言，这项研究的结果表明最佳有效剂量为3e13 vg/kg。

AAV9:hPKP2治疗PKP2-cKO小鼠在他莫昔芬诱导后四周显示出降低右心室(图26A)和左心室(图26B)中的心力衰竭标志物、纤维化和组织重塑基因的表达的功效。分别在野生型对照、PKP2-cKO和AAV9:hPKP2转导的心脏中估计PKP2的内源性和转基因mRNA水平。心力衰竭标志物是NPAA和NPPB。纤维化基因是Col1a1和Col3a1。组织重塑基因是Timp1。

PKP2-cKO小鼠的AAV9:hPKP2治疗在他莫昔芬诱导后四周显示出减少右心室和左心室中纤维化发展的功效(图27A)。肌肉染色显示为红色，纤维化的三色染色显示为蓝色。箭头突出显示PKP2-cKO小鼠心脏中具有显著纤维化的区域。胶原在图27B中定量，显示用AAV9:hPKP2治疗将胶原减少到几乎对照水平。

PKP2-cKO小鼠的AAV9:hPKP2治疗显示人PKP2转基因的剂量依赖性表达。在他莫昔芬诱导后四周估计LV组织的可溶性(图28A)和不溶性(图28B)级分中PKP2和其他桥粒蛋白DSP和PKG的总表达水平。在可溶性级分中未检测到DSP。注：*该动物在超声心动图检查前被发现死亡。**PKP2蛋白强度在相同的蛋白质印迹上相对于微管蛋白强度归一化。为简单起见，图28A-B中仅显示两个微管蛋白印迹中的一个。PKP2显示为两条带，即内源性小鼠PKP2和较大的人PKP2。

虽然本文已经示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对本领域技术人员而言将显而易见，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变型、改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (82)

1.一种用于在有需要的个体中治疗心脏疾病或病症的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包括基因疗法载体和药学上可接受的载剂或赋形剂，所述基因疗法载体包括与至少一个启动子可操作地连接的编码亲斑蛋白2(PKP2)多肽或其片段的核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述基因疗法载体包括病毒载体。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒。

4.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述基因疗法载体是腺相关病毒。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述腺相关病毒是AAV9或其衍生物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述AAV9具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述基因疗法载体靶向心肌、心外膜或两者中的细胞。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述心脏疾病或病症是致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述组合物在静脉内、心内、心包或动脉内施用。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述启动子是心脏特异性启动子。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述心脏特异性启动子指导基因在心肌、心外膜或两者中的表达。

13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述心脏特异性启动子是肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核酸序列。

15.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述启动子是PKP2启动子。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核酸序列。

17.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述组成型启动子是β-肌动蛋白启动子。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述基因疗法载体进一步包括心脏特异性增强子。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述基因疗法载体进一步包括3'元件。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述3'元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、牛生长激素聚腺苷酸化(bGH多聚A)序列或其组合。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中编码所述PKP2基因的所述核酸具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因疗法载体包括与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的核酸序列。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述方法逆转、减少或防止纤维脂肪组织置换、心肌萎缩、显著右心室扩张、室性心律失常、心源性猝死或运动引发的心脏事件中的至少一种。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述方法逆转、减少或防止心肌、心外膜或两者中的纤维脂肪组织置换。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述方法恢复桥粒结构和/或功能。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法恢复PKP2蛋白和活性水平。

29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述方法恢复PKP2诱导的基因表达。

30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述方法恢复兰诺定受体2(Ryr2)、锚蛋白-B(Ank2)、Cacna1c(CaV1.2)、三合蛋白(Trdn)或肌集钙蛋白-2(Casq2)中的一种或多种的表达。

31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述个体被鉴定为在桥粒蛋白中具有至少一个变异。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述桥粒蛋白是PKP2。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述变异包括缺失、插入、单核苷酸变异或拷贝数变异。

34.一种基因疗法载体，包括与至少一个启动子可操作地连接的亲斑蛋白2基因。

35.如权利要求34所述的基因疗法载体，其中所述基因疗法载体包括病毒载体。

36.如权利要求35所述的基因疗法载体，其中所述病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒。

37.如权利要求35或权利要求36所述的基因疗法载体，其中所述基因疗法载体是腺相关病毒。

38.如权利要求37所述的基因疗法载体，其中所述腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9。

39.如权利要求38所述的基因疗法载体，其中所述腺相关病毒是AAV9或其衍生物。

40.如权利要求39所述的基因疗法载体，其中所述AAV9具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列。

41.如权利要求34至40中任一项所述的基因疗法载体，其中所述基因疗法载体靶向心肌、心外膜或两者中的细胞。

42.如权利要求34至41中任一项所述的基因疗法载体，其中所述启动子是心脏特异性启动子。

43.如权利要求42所述的基因疗法载体，其中所述心脏特异性启动子指导基因在心肌、心外膜或两者中的表达。

44.如权利要求42或权利要求43所述的基因疗法载体，其中所述心脏特异性启动子是肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。

45.如权利要求43所述的基因疗法载体，其中所述肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核酸序列。

46.如权利要求34至45中任一项所述的基因疗法载体，其中所述启动子是PKP2启动子。

47.如权利要求46所述的基因疗法载体，其中所述PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核酸序列。

48.如权利要求34至41中任一项所述的基因疗法载体，其中所述启动子是组成型启动子。

49.如权利要求48所述的基因疗法载体，其中所述组成型启动子是β-肌动蛋白启动子。

50.如权利要求34至49中任一项所述的基因疗法载体，进一步包括心脏特异性增强子。

51.如权利要求34至50中任一项所述的基因疗法载体，其中所述基因疗法载体进一步包括3'元件。

52.如权利要求51所述的基因疗法载体，其中所述3'元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、牛生长激素聚腺苷酸化(bGH多聚A)序列或其组合。

53.如权利要求34至52中任一项所述的基因疗法载体，其中编码所述PKP2基因的所述核酸具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。

54.如权利要求34至53中任一项所述的基因疗法载体，其中所述基因疗法载体包括与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的核酸序列。

55.如权利要求34至54中任一项所述的基因疗法载体，其中所述基因疗法载体配制在药学上可接受的载剂或赋形剂中，所述药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。

56.一种用于在有需要的个体中治疗心脏疾病或病症的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包括(a)基因疗法载体，所述基因疗法载体包括与启动子和3'元件可操作地连接的编码亲斑蛋白2(PKP2)多肽或其片段的核酸；和(b)药学上可接受的载剂或赋形剂。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述基因疗法载体包括选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、牛痘病毒和疱疹病毒中的病毒载体。

58.如权利要求56所述的方法，其中所述基因疗法载体是腺相关病毒。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述腺相关病毒选自AAV6、AAV8和AAV9。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述腺相关病毒靶向心肌、心外膜或两者中的细胞。

61.如权利要求59所述的方法，其中所述腺相关病毒是AAV9，所述AAV9具有与SEQ IDNO:7具有至少95％同一性的核酸序列。

62.如权利要求56所述的方法，其中所述心脏疾病或病症是致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或致心律失常性心肌病(ACM)。

63.如权利要求56所述的方法，其中所述启动子是导致在包括心脏的组织中表达的启动子或心脏特异性启动子。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述心脏特异性启动子指导基因在心肌、心外膜或两者中的表达。

65.如权利要求63所述的方法，其中所述心脏特异性启动子是PKP2启动子、肌钙蛋白启动子或α-肌球蛋白重链启动子。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述PKP2启动子具有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的核酸序列。

67.如权利要求65所述的方法，其中所述肌钙蛋白启动子具有与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的核酸序列。

68.如权利要求56所述的方法，其中所述3'元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、牛生长激素聚腺苷酸化(bGH多聚A)序列或其组合。

69.如权利要求56所述的方法，其中所述基因疗法载体进一步包括心脏特异性增强子。

70.如权利要求56所述的方法，其中编码所述PKP2基因的所述核酸具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。

71.如权利要求56所述的方法，其中所述基因疗法载体包括与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的核酸序列。

72.如权利要求56所述的方法，其中所述核酸具有小于或等于约4.7kb的大小。

73.如权利要求56所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂或赋形剂包括缓冲剂、聚合物、盐或其组合。

74.如权利要求56所述的方法，其中所述方法逆转、减少或防止以下中的至少一种：纤维脂肪组织置换；心肌萎缩；显著右心室扩张；室性心律失常；心源性猝死；运动引发的心脏事件；右心室心肌病、扩张或心力衰竭；左心室心肌病、扩张或心力衰竭；房性心律失常；晕厥；心悸；气短；或胸痛。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述方法逆转、减少或防止心肌、心外膜或两者中的纤维脂肪组织置换。

76.如权利要求56所述的方法，其中所述方法恢复桥粒结构和/或功能。

77.如权利要求56所述的方法，其中所述方法恢复PKP2 mRNA表达和/或PKP2蛋白和活性水平。

78.如权利要求56所述的方法，其中所述方法恢复对所述心脏疾病的一种或多种症状具有直接或间接影响的一种或多种基因的表达。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述基因包括兰诺定受体2(Ryr2)、锚蛋白-B(Ank2)、Cacna1c(CaV1.2)、三合蛋白(Trdn)或肌集钙蛋白-2(Casq2)中的一种或多种。

80.如权利要求56所述的方法，其中所述个体被鉴定为在桥粒蛋白中具有至少一个变异。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述桥粒蛋白是PKP2。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述变异包括缺失、插入、单核苷酸变异或拷贝数变异。

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