CN108138154B - 用于治疗黏多糖贮积病的腺相关病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的腺相关病毒衍生的载体和包含该载体的药物组合物，其用于治疗溶酶体贮积病，特别是用于治疗II型黏多糖贮积病。

Description

用于治疗黏多糖贮积病的腺相关病毒载体
技术领域
本发明涉及用于表达所关注的蛋白质的载体以及它们在基因治疗中的用途。本发明还涉及有助于治疗黏多糖贮积病(MPS)(特别是用于治疗II型黏多糖贮积病)或Hunter综合征的载体和核酸序列。
背景技术
溶酶体是在动物细胞的细胞质中发现的细胞器，该细胞器包含超过50种水解酶，这些水解酶在破损的细胞成分的再循环过程中或者在病毒和细菌被吞噬之后分解生物分子。该细胞器包含多种类型的水解酶，包括蛋白酶,核酸酶,糖苷酶,脂肪酶,磷脂酶,磷酸酶和硫酸酯酶。所有的酶均为酸水解酶。
溶酶体贮积病(LSD)是由影响一个或多个溶酶体酶的遗传缺陷引起的。这些遗传疾病通常由溶酶体中存在的特定酶活性的缺陷而导致。在较小的程度上，这些疾病可能是由于与溶酶体生物合成有关的蛋白质的缺陷。
LSD是个别罕见的，但是作为一个群体，这些疾病在一般人群中是相对普通的。LSD的合并发病率为每5000个活产儿就有1名病患。参见Meikle P,et al.,JAMA 1999；281:249-254。但是，一般人群中的一些群体特别受到高发生率的LSD的折磨。例如由JewishCentral和Eastern European(Ashkenazi)个体得到的后代中，Gaucher和Tay-Sachs病的发病率分别为每600个新生儿1名病患，以及每3900个新生儿1名病患。
II型黏多糖贮积病(MPSII)还称为Hunter综合征并且首先由Dr.Charles Hunter描述，是一种艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)酶活性的缺陷或缺乏所导致的慢性进行性多系统LSD，其中所述的酶由IDS基因编码，并且与黏多糖(GAG)硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS)的溶酶体逐步降解有关，从而导致它们的病理学累积。参见Hunter,Proc R SocMed.1917；10(Sect Study Dis Child):104-16。由于X连锁隐性遗传，几乎所有的Hunter患者都是男性，但是文献中报告了一些Hunter综合征女性。参见Mossman et al.,Arch DisChild.1983；58:911-915,Gullén-Navarro et al.,Orphanet J Rare Dis.2013；25(8):92,Valstar et al.,J.Inherit.Metab.Dis.2008；31(2):240-52。
MPSII在临床上表征为中枢神经系统(CNS)的儿童期发病的进程性神经病。Hunter儿童在出生时通常是正常的，在2岁之前发展出症状。参见Schwartz et al.,ActaPaediatr Suppl.2007；96:63-70。临床过程通常开始于缓慢进展的认知缺损，然后是行为问题和进程性智力下降。运动丧失在较晚期发生。除了神经系统以外，MPSII患者遭受非神经的改变，包括复发性耳、鼻、喉咙和胸部感染,频繁腹泻和便秘,心力衰竭,粗糙的面部特征,身材矮小症,进行性关节僵硬和恶化,影响移动的骨骼畸形,以及肝和脾肿大。参见Neufeld and Muenzer,“The Mucopolysaccharidoses”in Scriver C,et al.,Eds.,“Themetabolic and molecular basis of inherited disease”,McGraw-Hill PublishingCo.,New York,NY,US,2001,pp.3421-3452。所述的疾病的临床表现谱根据患者具有的IDS活性的残余水平而大幅改变，所述的IDS活性水平通过IDS基因的潜在突变(到目前为止描述为IDS基因的突变>300)来测定(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php？gene＝IDS)。通常，描述2种MPSII临床形式。最严重的形式(在18个月至4岁发作)比轻微形式更常见3倍，并且表征为粗糙的面部特征,骨骼畸形,肝脾肿大以及导致智力迟钝的神经受累。参见Wraith et al.,Eur J Pediatr.2008；167(3):267-277。患者通常由于呼吸道阻塞疾病和心力衰竭而在生命的第二个十年中死亡。参见Wraith et al.,Eur J Pediatr.2008；167(3):267-277,Neufeld and Muenzer,supra。在一部分MPSII患者中还报告了一种更缓慢进展形式的疾病，其更晚发作，更长的生存并且较低的神经功能障碍，称为衰减表现型。参见Wraith et al.,Eur J Pediatr.2008；167(3):267-277,Neufeld and Muenzer,supra。
直到最近，仍没有用于MPSII综合征的特异批准的治疗，并且唯一可利用的治疗是使用广泛用于预防和管理疾病并发症的非特异性药品的症状性的。最近几年，2种主要的治疗选择已经可以利用：酶替代疗法(ERT)和造血干细胞移植(HSCT)。2种治疗方案的设计依赖于交叉校正的可能性，其基于以下事实：正常细胞分泌大量的靶向甘露糖-6-磷酸(M6P)的可溶性溶酶体酶，例如IDS，其随后可以被其他细胞通过质膜上的M6P受体由细胞外分隔区吸收，并靶向溶酶体。参见Enns et al.,Neurosurg Focus.2008；24(3-4):E12。此外，具有残余酶活性的阈值，该阈值通常较低，高于该阈值，细胞能够应对底物通量(substrateinflux)并且受试对象不受疾病的影响，表明正常活性的恢复无须改变临床过程。参见Neufeld,Annu Rev Biochem.1991；60:257-80。
由于2006年the Food and Drug Administration(FDA)和2007年the EuropeanMedicines Agency(EMA)的批准，重组人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(艾度硫酸酯酶,
Figure GDA0003094766510000031
Shire Pharmaceuticals)已经表明用于治疗MPSII患者。通过静脉内输注以0.5mg/kg剂量每周给予治疗，并且平均输注时间为1-3小时。参见Giugliani et al.,Genet Mol Biol.2010；33(4):589-604。
Figure GDA0003094766510000032
在经过96名Hunter患者的随机双盲安慰剂对照研究后被批准，其中所述的患者在基线情况下无意识减退并且具有中晚期疾病。参见Muenzer et al.,Genet Med.2006；8(8):465-73,Muenzer et al.,GenetMed.2011；13(2):95-101。在治疗一年后，
Figure GDA0003094766510000033
治疗的患者显示在6分钟内行走(6分钟行走测试)的距离比安慰剂组患者增加。参见Muenzer et al.,Genet Med.2011；13(2):95-101。使用
Figure GDA0003094766510000034
的ERT也显示改善了关节活动度(ROM)，并且减小了肝和脾的体积。参见Muenzer et al.,Genet Med.2011；13(2):95-101。此外，当对抗艾度硫酸酯酶的中和抗体不存在时，报告在50％长期治疗的患者中，发展出抗IDS抗体。参见Muenzer etal.,Genet Med.2011；13(2):95-101。
基于β同种型艾度硫酸酯酶(提出的商业名称为
Figure GDA0003094766510000035
(NCT01301898,http://clinicaltrials.gov))，在31名MPSII患者中的I/II期研究将
Figure GDA0003094766510000036
的效力与第二产品的效力比较。在24周过程中，2种蛋白质均采用静脉内给予，对于
Figure GDA0003094766510000037
剂量为0.5mg/kg/周，对于
Figure GDA0003094766510000038
剂量为0.5和1.0mg/kg/周。由
Figure GDA0003094766510000039
治疗得到的结果显示尿GAG排泄减少，并且在6分钟行走测试中具有改善的性能，但是所有剂量均不能在肺功能、心功能或关节活动性中介导治疗效力。参见Sohn etal.,Orphanet J Rare Dis.2013；8:42。
Figure GDA0003094766510000041
输注通常是安全且良好耐受的，但是报告几例不良事件，例如荨麻疹和皮疹。参见Sohn et al.,Orphanet J Rare Dis.2013；8:42。最近已经完成关键的PIII研究(http://clinicaltrials.gov,NCT01645189)，但是结果仍是不可利用的。
由于对
Figure GDA0003094766510000042
的超敏性，不得不在产品给予过程中利用医疗支持。在试验过程中，所描述的最严重的不良事件是在
Figure GDA0003094766510000043
输注过程中或者在产品给予后至多24小时的任何时间出现的过敏反应。参见Muenzer et al.,Genet Med.2006；8(8):465-73,Muenzer et al.,Genet Med.2011；13(2):95-101。可以威胁患者生命的这些过敏反应包括呼吸窘迫、组织缺氧、荨麻疹和/或喉咙或舌头的血管性水肿(http://elaprase.com/)，并且可以需要干预，例如苏醒或紧急器官切开术，以及使用吸入β肾上腺素能激动剂、肾上腺素或静脉注射糖皮质激素的治疗。参见Burton et al.,Mol GenetMetab.2011；103(2):113-20。ERT的其他缺点包括：1)在儿科患者中，实施1-3小时长的静脉内输注的困难，其中许多患者遭受精神疾病(http://elaprase.com/)；2)存在这样的事实：在临床研究中使用
Figure GDA0003094766510000044
治疗的50％患者对临床意义仍然未知的艾度硫酸酯酶的抗体呈阳性，但是其可能限制产品的长期效力，如肺功能测试表明的那样。参见Muenzeret al.,Mol Genet Metab.2007；90(3):329-37,Muenzer et al.,Genet Med.2006；8(8):465-73,Muenzer et al.,Genet Med.2011；13(2):95-101；以及3)治疗的高成本，其还包括家庭护理的成本。参见Wyatt et al.,Health Technol Asses.2012，16(39):1-543。
无论给予
Figure GDA0003094766510000045
的安全性关注或成本如何，静脉内给予重组IDS都不能到达CNS，至少在目前每周建议的0.5mg/kg的剂量下，可能限制了ERT治疗在Hunter患者中观察到的严重的神经退行性病变的潜在适用性。分别通过将1.2或10mg
Figure GDA0003094766510000046
/kg以每周静脉内给予2或7个月龄的MPSII小鼠而取得IDS脑活性的仅部分的挽救。参见Politoet al.,Hum Mol Genet.2010；19(24):4871-85。此外，即使在这些高剂量下，循环中的IDS活性在蛋白质给予后的72小时，也会恢复至治疗前的水平。参见Polito et al.,Hum MolGenet.2010；19(24):4871-85。事实上，静脉内ERT不能纠正GAG在MPSII小鼠模型的脑中的累积。参见Garcia et al.,Mol Genet Metab.2007；91(2):183-90。因此，
Figure GDA0003094766510000051
的适应症限于治疗疾病的非神经症状。
ERT的神经内传递的备选方法是将外生酶直接提供给CNS。每3周将20μg重组人类IDS给予5个月龄MPSII小鼠的侧脑室会增加IDS在大脑,小脑和身体器官(例如肝、心脏、肾脏和睾丸)中的活性。参见Higuchi et al.,Mol Genet Metab.2012；107(1-2):122-8。IDS活性的恢复使得短期记忆和自发活动恢复，并且使得细胞空泡减少以及小脑、肝和睾丸中溶酶体膨胀。此外，治疗效力是部分的，GAG含量未完全归一化，并且一些行为改变仍难以治疗。参见Higuchi et al.,Mol Genet Metab.2012；107(1-2):122-8。通过鞘内药品传递装置将艾度硫酸酯酶给予脑脊液(CSF)以直接治疗Hunter患者的CNS病理的近期安全性和剂量范围研究证明，在治疗6个月后，CSF GAG水平减少大约80-90％。参见Muenzer et al.,Genet.Med.2015；doi:10.1038/gim.2015.36and www.clincialtrials.gov(NCT00920647)。然而，植入治疗所需的永久性鞘内药品传递装置与实质性的风险和缺点有关，并且每位患者/年的治疗本身就具有极高的经济成本。
通过系统性给予到达CNS的另一种方式是使用分子特洛伊木马。该方法的实例是胰岛素受体抗体-艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶融合蛋白质(HIRMAb-IDS)，其可以通过受体介导的运送穿越血脑屏障(BBB)。在26周内每周将3,10和30mg/kg HIRMAb-IDS静脉内给予雄性幼年猕猴使得总注射剂量的1％被HIRMAb-IDS脑吸收。参见Boado et al.,BiotechnolBioeng.2014；111(11):2317-25。该研究还证明融合蛋白质的安全性，如未观察到融合相关的反应或免疫应答。
已经证明使用骨髓衍生的干细胞(骨髓移植，BMT)的造血干细胞移植(HSCT)在治疗患有其他MPS的患者的身体和精神病理学中是有效的。参见Peters et al.,Blood.1996；87(11):4894-902,Peters and Steward,Bone Marrow Transplant.2003；31(4):229-39and Yamada et al.,Bone Marrow Transplant.1998；21(6):629-34。通过HSCT进行纠正的潜在原理是供体单核细胞能够穿越毛细血管壁，甚至在血脑屏障处也是如此，此后，它们分化成组织巨噬细胞(在CNS的情况下分化成小神经胶质细胞)并分泌用于传递至多种细胞中的缺陷的酶。参见Krivit et al.,Cell Transplant.1995；4(4):385-92。在MPSII小鼠中实施的BMT会减少GAG在多种身体组织(包括肝、脾和肺)中的累积，但是不能减少在CNS中的累积。参见Akiyama et al.,Mol Genet Metab.2014；111(2):139-46。当BMT与ERT(0.5mg艾度硫酸酯酶/kg/每周)结合时，在MPSII小鼠治疗后7个月，观察到对心脏、肾脏和肺中GAG水平的其他作用，但是GAG在CNS中的累积保持在病理水平。参见Akiyama et al.,Mol GenetMetab.2014；111(2):139-46。但是，在MPSII患者中，临床效力的证据并非很强。在1982年至1991年接受BMT的10名Hunter患者的随访显示程度的程度高度变化。参见Vellodi et al.,J Inherit Metab Dis.1999；22(5):638-48。在BMT后的100天之内，这些患者中的4名患者死亡，并且在所述的过程之后的7年之内又有3名患者死亡。其中有3名患者在BMT后生存超过7年，其中的1名患者报告没有临床获益；第二名显示血浆中IDS活性最低程度的增加，而第三名患者中，尽管血浆中IDS活性稍微增加，但是没有对GAG含量归一化。参见Vellodi etal.,J Inherit Metab Dis.1999；22(5):638-48。脑部的核磁共振成像(MRI)显示在轻度MPSII表现型患者中在BMT后2.5年囊性病变的数量稍微减少。参见Seto et al.,AnnNeurol.2001；50(1):79-92。但是，相同的研究提供了关于另一名患有轻微表现型患者的数据，其在MRI下未显示改善。参见Seto et al.,Ann Neurol.2001；50(1):79-92。可能由于多种因素，临床结果在Hunter患者中显示是高度改变的；表现型、HSCT时的年龄、HSCT时的患者临床状态(例如神经损伤的程度、供体状态、供体嵌合状态、干细胞来源和酶活性)都表明会影响长期结果。参见Giugliani et al.,Genet Mol Biol.2010；33(4):589-604,Valayannopoulos et al.,Rheumatology.2011；5:v49-59。
当HSCT成功时，其可以有助于在身体水平某种程度的临床获益，酱烧行为问题和更好的睡眠模式，但是无论所述的治疗是否可以进行介导，认知缺损的任何明显的改善都保持含糊不清的。参见Giugliani et al.,Genet Mol Biol.2010；33(4):589-604,Valayannopoulos et al.,Rheumatology.2011；5:v49-59。由于高比率的发病率和死亡率、以及可变的神经认知获益，通常不建议将这种方法用于Hunter患者。参见Giugliani etal.,Genet Mol Biol.2010；33(4):589-604。
HSCT失败的貌似合理的解释是在植入的细胞中有限的IDS表达，导致CNS中不足的IDS交叉校正。编码人类IDS基因的慢病毒载体用于转导骨髓细胞，然后将它们移植到MPSII小鼠中。经处理的MPSII小鼠显示在移植后14周的T迷宫记忆测试中改善的性能。参见Podetz-Pedersen et al.,Mol Ther.2013；21:s1-s285。
考虑到用于MPSII的目前治疗选择的限制，需要备选的方法。体内基因疗法提供了用于MPSII和其他遗传疾病的一次性治疗的可能性，并且具有终身获益效果的前景。基于与不同给予途径结合的不同病毒载体的使用，多种基因疗法已经在MPSII疾病的动物模型中测试。
腺相关病毒(AAV)载体介导的基因转移作为许多体内基因疗法应用的选择方法特别快速地出现，这是由于这些载体的高的转导效率并缺乏病原性。AAV载体可以转导有丝分裂后的细胞，并且多个临床前和临床研究已经证明AAV载体介导的基因转移高效地驱动多种疾病的治疗转基因持续表达的潜力。参见Bainbridge et al.,N Engl J Med.2008；358(21):2231-9,Hauswirth et al.,Hum Gene Ther.2008；19(10):979-90,Maguire et al.,N Engl J Med.2008；358(21):2240-8,Niemeyer et al.,Blood 2009；113(4):797-806,Rivera et al.,Blood 2005；105(4):1424-30,Nathawani et al.,N Engl J Med.2011；365(25):2357-65and Buchlis et al.,Blood 2012；119(13):3038-41。
将AAV5-CMV-人类IDS载体系统性给予MPSII小鼠pups(p2)的颞浅静脉使得心脏、肾脏、肝、肺、肌肉和脾中的IDS活性增加，并且使脑中的IDS活性适度增加，这使得在单次载体给予后至多18个月身体组织和尿GAG含量降低。参见Polito et al.,Am J HumGenet.2009；85(2):296-301。此外，这种处理通过预防神经退行性病变并校正胶质增生和炎症而预防CNS病理的发展。在AAV注射后18个月的旷场测试中的小鼠评价证明在所述的处理下MPSII小鼠的粗大动作表现型的改善。参见Polito et al.,Am J Hum Genet.2009；85(2):296-301。
编码人类IDS基因(在肝特异性TBG启动子的控制之下)的AAV血清型8也已经用于治疗MPSII。在将载体静脉内给予2个月龄的MPSII小鼠后至多7个月，观察到血清、肝、脾、肺、心脏、肾脏和肌肉IDS活性增加，使得这些身体组织中GAG的储存完全校正。参见Cardoneet al.,Hum Mol Genet.2006；15(7):1225-36。但是，当将载体静脉内给予时，需要极高剂量(4x1012病毒基因组/小鼠)而取得IDS活性的稍微增加，以及脑中GAG累积的部分清除。参见Cardone et al.,Hum Mol Genet.2006；15(7):1225-36。类似地，将AAV8载体(其中人类IDS基因处于泛在延伸因子1-a(EF)启动子的控制之下)静脉内给予成年MPSII小鼠证明在给予后的至多24周，肝、心脏、脾和肾脏中的IDS活性增加，并且这些器官中的GAG累积完全校正。参见Jung et al.,Mol Cells.2010；30(1):13-8。脑中的IDS活性仅在短期(注射后6周)处死的动物组中增加，但是这不足以将CNS中的GAG含量归一化。参见Jung et al.,MolCells.2010；30(1):13-8。
上述提及的方法均不能完全恢复艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性，完全根除CNS和身体组织中细胞质内的包含物，或者校正所有的MPSII临床迹象。因此，需要具有更高效力和安全性概况的治疗MPSII的新方法。
发明概述
本发明提供了用于治疗黏多糖贮积病(特别是II型黏多糖贮积病(MPSII))或Hunter综合征的新的核苷酸序列。
在第一个方面中，本发明涉及编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)并且与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性的分离的核苷酸序列。具体而言，根据本发明该第一个方面的分离的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
在第二个方面中，本发明涉及质粒，其包含编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的核苷酸序列，特别是与SEQ ID NO:2具有至少75％一致性、优选地与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性的核苷酸序列。
在第三个方面中，本发明提供了用治疗II型黏多糖贮积病的新的重组载体。该重组载体具体为腺相关病毒载体(AAV)，其包含编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的核苷酸序列，特别是与SEQ ID NO:2具有至少75％一致性、优选地与SEQID NO:2具有75％至90％一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，腺相关病毒载体为血清型9(AAV9)。本发明的AAV9载体可以进一步包含与编码核苷酸序列连接的启动子，从而控制IDS的表达。合适的启动子为CAG启动子SEQ ID NO:14。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含治疗有效量的本发明所述的核苷酸序列或智力或重组载体。
此外，本发明的另一个方面涉及用作药剂的本发明所述的核苷酸序列或本发明所述的质粒、或者本发明所述的重组载体，其特别用于治疗II型黏多糖贮积病。
本发明还涉及生产根据本发明的质粒的方法，以及生产根据本发明的重组载体的方法。
在另一个方面中，本发明涉及分离的细胞，其包含编码IDS的核苷酸序列，特别是与SEQ ID NO:2具有至少75％一致性、优选地与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性的核苷酸序列。
附图简述
图1.pAAV-CAG-hIDS和AAV-CAG-hIDS的生成。(A)质粒pAAV-CAG-hIDS及其成分的示意图。(B)包含hIDS编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图2.pAAV-CAG-ohIDS-version1和AAV-CAG-ohIDS-version1的生成。(A)质粒pAAV-CAG-ohIDS-version1及其成分的示意图。(B)包含ohIDS-version1编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图3.pAAV-CAG-ohIDS-version2和AAV-CAG-ohIDS-version2的生成。(A)质粒pAAV-CAG-ohIDS-version2及其成分的示意图。(B)包含ohIDS-version2编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图4.pAAV-CAG-omIDS和AAV-CAG-omIDS的生成。(A)质粒pAAV-CAG-omIDS及其成分的示意图。(B)包含omIDS编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图5.将pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2水动力传递给健康小鼠。柱状图描绘了在给予30μg人类IDS编码质粒pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2后48小时测量的肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性。将注射生理盐水的WT小鼠的IDS活性设定为100％。值为每组5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05。
图6.将pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2水动力传递给MPSII小鼠。(A,B)柱状图描绘了在给予人类IDS编码质粒pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2后1周测量的肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性。将野生型和注射生理盐水的MPSII小鼠用作对照。将WT小鼠的IDS活性设定为100％。(C)在给予不同的人类IDS编码质粒后1周在肝、脾、心脏、尿路膀胱和睾丸中糖胺聚糖(GAG)含量的定量。值为每组5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001。
图7.将AAV9-CAG-hIDS,AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2血管内传递给MPSII小鼠。向MPSII小鼠静脉内注射1x1010vg编码野生型人类IDS的AAV9载体(AAV9-CAG-hIDS)，和2种不同形式的优化的人类IDS(AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2)。将野生型和未处理的MPSII小鼠用作对照。(A,B)柱状图描绘了在肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性。将WT小鼠的IDS活性设定为100％。(C)在给予不同的人类IDS编码质粒的动物的肝中糖胺聚糖(GAG)含量的定量。值为每组5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001。
图8.将AAV9-CAG-hIDS,AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2以Intra-CSF传递给MPSII小鼠。向2个月龄的MPSII小鼠的小脑延髓池中注射5x1010vg编码野生型人类IDS的AAV9(AAV9-CAG-hIDS)，或者2种不同形式的优化的人类IDS(AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2)。野生型(WT)、未处理的MPSII(MPSII)和给予非编码(Null)AAV9载体(MPSII-Null)的MPSII小鼠用作对照。(A)在载体传递后1.5个月，在脑的不同部分中分析艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的活性(部分I-V，其中部分I表示脑的大部分吻部，部分V表达大部分的尾部)。WT小鼠的IDS活性设定为100％。(B)在与(A)相同的脑部区域中糖胺聚糖(GAG)含量的定量。结果显示为每组5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001。
图9.将AAV9-CAG-hIDS,AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2以Intra-CSF传递给MPSII小鼠。向2个月龄的MPSII小鼠的小脑延髓池中注射5x1010vg编码野生型人类IDS的AAV9(AAV9-CAG-hIDS)，或者2种不同形式的优化的人类IDS(AAV-CAG-ohIDS-version1和AAV-CAG-ohIDS-version2)。野生型(WT)、未处理的MPSII(MPSII)和接受非编码(Null)AAV9载体(MPSII-Null)的MPSII小鼠用作对照。(A,B)在处理后1.5个月测量的肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性，表示为WT活性的％。(C)在身体器官中糖胺聚糖(GAG)含量的定量。结果显示为每组5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001。
图10.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A)在野生型(健康)小鼠、未处理的MPSII小鼠和通过脑池内(IC)注射在CSF中给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或AAV9-CAG-omIDS的MPSII小鼠的脑的不同部分(部分I-V)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。WT IDS活性设定为100％。在载体传递后4个月进行分析。(B)在与(A)相同的脑部区域中糖胺聚糖(GAG)的定量。结果显示为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。***P<0.001,****P<0.0001与MPSII-Null。
图11.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A)在野生型(健康)小鼠和小脑延髓池中给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010AAV9-CAG-omIDS的MPSII小鼠中，在对溶酶体标志物LAMP-2染色后在脑的不同区域中获得的信号强度的定量。分析是在载体传递后4个月进行的。(B)脑提取物中其他溶酶体酶的活性。IDUA,艾杜糖苷酸酶,α-L-,SGSH,N-磺氨基葡糖硫水解酶,NAGLU,N-乙酰葡糖胺糖苷酶,α,HGSNAT,乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶,GALNS半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶,GUSB,葡萄糖醛酸酶,β,HEXB,氨基己糖苷酶B。值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001与MPSII-Null。
图12.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。在针对溶酶体标志物LAMP2在脑部分染色后，在不同区域获得的信号强度的定量。在野生型(WT)小鼠和8个月的MPSII同窝幼崽中进行分析，其中所述的同窝幼崽以intra-CSF给予接受5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS。结果显示为每组2-6只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05和**P<0.01与MPSII-Null。
图13.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A,B)柱状图表示在由野生型(健康)小鼠和在小脑延髓池中给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS之前4个月的MPSII小鼠得到的前额,顶骨,枕叶皮质,上丘和丘脑部分中在针对星细胞标志物GFAP(A)和小神经胶质细胞标志物BSI-B4(B)免疫染色后测量的信号强度。结果显示为每组5只小鼠的平均值±SEM。**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001与MPSII-Null。
图14.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A,B)柱状图表示在由健康野生型(WT)小鼠和MPSII同窝幼崽得到的脑髓的部分中针对星细胞标志物GFAP(A)和针对小神经胶质细胞标志物BSI-B4(B)免疫染色后测量的信号强度，其中所述的同窝幼崽接受intra-CSF给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS。在载体传递后8个月进行分析。结果显示为每组2-6只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001与MPSII-Null。
图15.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。在2个月龄的野生型(健康)小鼠、未处理的MPSII小鼠和CSF中给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS载体的MPSII小鼠的肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性，表示为WT活性的％，并且在4个月后进行分析。WTIDS活性设定为100％。(C)身体器官中黏多糖(GAGs)的定量。结果显示为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001与MPSII-Null。
图16.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。在2个月龄的健康野生型(WT)小鼠、未处理的MPSII(MPSII)小鼠和CSF中给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS载体的MPSII小鼠的肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性，表示为WT活性的％，并且在4个月后进行分析。(C)在以intra-CSF给予AAV9-CAG-omIDS的MPSII小鼠的肝、肺和心脏中载体基因组拷贝数/二倍体基因组(vg/dg)的定量。由未处理的MPSII小鼠得到的组织用作对照。结果显示为(A和B)中每组4-5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001MPSII-Null。
图17.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A)相对于2个月龄的野生型(健康)小鼠、未处理的MPSII小鼠和CSF中给予5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS载体的MPSII小鼠的整个体重而言，肝的湿重，并且在4个月后进行分析。(B)在由与(A)相同的一组动物得到的肝提取物中其他溶酶体酶的活性。(C)在与(A)相同的动物组得到的血清中的b-氨基己糖苷酶(β-HEXO)活性，表示为WT活性的％。IDUA,艾杜糖苷酸酶,α-L-,SGSH,N-磺氨基葡糖硫水解酶,NAGLU,N-乙酰葡糖胺糖苷酶,α,HGSNAT,乙酰肝素-alpha-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶,GALNS半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶,GUSB,葡萄糖醛酸酶,β,HEXB,氨基己糖苷酶B。WT酶活性设定为100％。值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001与MPSII-Null。
图18.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。在2个月龄的天然野生型(健康)小鼠、未处理的MPSII小鼠和CSF中给予5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS载体的MPSII小鼠中，在整个旷场测试中进行运动和探究活性的评价，并在4个月后进行分析。(A)在中心处的时间，(B)在周围的时间，(C)在中心处的进入，(D)向中心的潜伏，(E)总体运动，(F)交叉线(Linescrossed)。值为每组17-22只动物的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01与MPSII-Null。
图19.编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。在健康的野生型(WT)小鼠、未处理的MPSII(MPSII)小鼠和在CSF中给予5x1010vg对照非编码载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omIDS载体的MPSII小鼠中生存的Kaplan-Meier分析。N＝24用于WT,N＝22用于未处理的MPSII,N＝27用于零注射的MPSII，以及N＝91用于接受治疗载体的小鼠。
图20.不同剂量(1.58x109,5x109,1.58x1010和5x1010vg/小鼠)的编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A)在2个月龄的野生型(健康)小鼠、未处理的MPSII小鼠和CSF中通过脑池内(IC)注射给予不同剂量AAV9-CAG-omIDS的MPSII小鼠的脑的不同部分(部分I-V)中的Iduronat-2-硫酸酯酶活性，并在1.5个月后进行分析。WT IDS活性设定为100％。(B)在与(A)中相同的脑的部分中的黏多糖(GAGs)定量。结果显示为每组5只动物的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001与未处理的MPSII。
图21.不同剂量(1.58x109,5x109,1.58x1010和5x1010vg/小鼠)的编码优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(AAV9-CAG-omIDS)的AAV9载体的Intra-CSF传递。(A,B)在2个月龄的野生型(健康)小鼠、未处理的MPSII小鼠和CSF中给予不同剂量AAV9-CAG-omIDS载体的MPSII小鼠的肝(A)和血清(B)中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性，表示为WT活性的％，并在1.5个月后进行分析。WT IDS活性设定为100％。(C)在身体器官中的黏多糖(GAGs)定量。结果显示为每组5只动物的平均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001与未处理的MPSII。
微生物有机体的保藏
质粒pAAV-CAG-hIDS(SEQ ID NO:3),pAAV-CAG-ohIDS-version1(SEQ ID NO:6)和pAAV-CAG-ohIDS-version2(SEQ ID NO:9)于2014年12月18日以登记编号DSM 29866,DSM29867和DSM 29868保藏于he DSMZ–Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig,Federal Republic ofGermany。
定义
术语“核苷酸序列”或“分离的核苷酸序列”是指核酸分子DNA或RNA，分别包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核酸可以是双链的，单链的，或者包含双链或单链序列的部分。
术语“％序列一致性”或“％一致性”是指在在将参照序列与候选序列比对以取得最大％序列一致性后，与参照序列中的核苷酸一致的候选序列核苷酸的百分率。可以通过本领域建立的任何方法或算法测定％序列一致性，例如ALIGN,BLAST和BLAST 2.0算法。参见Altschul S,et al.,Nuc Acids Res.1977；25:3389-3402 and Altschul S,et al.,JMol Biol.1990；215:403-410。
在本发明中，通过将参照序列与候选序列比对后一致的核苷酸数量除以参照序列中核苷酸的总数量，再将结果乘以100来计算％序列一致性或“％一致性”。
术语动词性的“编码”或分词性的“编码”是指决定核苷酸序列如何翻译成多肽或蛋白质的遗传密码。序列中核苷酸的顺序决定了沿着多肽或蛋白质的氨基酸的顺序。
术语“蛋白质”是指由一条或多条线性氨基酸或多肽链构成的大分子。蛋白质可以经过翻译后修饰，例如半胱氨酸残基转化成3-氧代丙氨酸，糖基化或与金属结合。蛋白质糖基化是将可以共价连接的不同的碳水化合物加入至氨基酸链中。
术语“有效量”是指足以达到预期目的的物质的量。例如增加艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性的AAV9载体的有效量为足以减少糖胺聚糖累积的量。治疗疾病或紊乱的表达载体的“治疗有效量”为足以减少或根除疾病或紊乱的迹象和症状的表达载体的量。给定物质的有效量将随着多种因素而改变，例如物质的本性、给予途径、接受物质的动物的尺寸和物种、以及给予物质的目的。在个体的情况下，技术人员可以根据本领域建立的方法凭经验确定有效量。
术语“个体”是指哺乳动物，优选为人类或非人类哺乳动物，更优选的是小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、马或灵长动物，更进一步优选的是人类。
术语“可操作地连接”是指启动子序列相对于所关注的基因的功能关系和位置(例如如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接)。通常，可操作地连接的启动子与所关注的序列相邻。但是，增强子不必与所关注的序列相邻以控制其表达。
术语“趋向性”是指其中病毒进化成优选地靶向特定宿主物种或这些物种内特定细胞类型的方式。
术语“基因治疗”是指将所关注的遗传物质(例如DNA或RNA)被转移至细胞中从而治疗或预防遗传性或获得性疾病或状况。所关注的遗传物质编码需要在体内生产的产物(例如蛋白质、多肽、肽或功能RNA)。例如所关注的遗传物质可以编码具有治疗价值的酶、激素、受体或多肽。
术语“重组病毒载体”或“病毒载体”是指由天然形成的病毒通过遗传改造技术得到的试剂，其中所述的遗传改造技术能够将所关注的遗传物质(例如DNA或RNA)转移至细胞中，这使得在靶细胞中所述的遗传物质(例如蛋白质多肽、肽或功能RNA)所编码的产物得以生产。
术语“重组质粒”或“质粒”是指通过遗传改造技术获得的小的环状双链自复制DNA分子，其中所述的遗传改造技术能够将所关注的遗传物质转移至细胞中，这使得在靶细胞中所述的遗传物质(例如蛋白质多肽、肽或功能RNA)所编码的产物得以生产。此外，术语“重组治疗”或“治疗”还指通过遗传改造技术获得的小的环状双链自复制DNA分子，其中所述的遗传改造技术是作为重组载体基因组载体的病毒载体的制造过程中使用的。
发明详述
本发明提供了用于治疗黏多糖贮积病(特别是II型黏多糖贮积病(MPSII))或Hunter综合征的新的核苷酸序列。
根据本发明的核苷酸序列编码了SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(称为IDS)，其为与糖胺聚糖硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的逐步降解有关的酶。“天然的IDS”或“野生型IDS”术语在本发明的内容中是指使用本领域那些技术人员已知的方法由宿主细胞获得或生产的、或者备选地使用用于各物种IDS的编码序列(CDS)作为起始材料化学合成的核苷酸序列。优选地，“天然IDS”或“野生型IDS”是由鼠科CDS(称为mIDS)或由人类CDS(称为hIDS)化学合成的。更优选地，核苷酸序列hIDS是由人类CDS化学合成的，并且相当于SEQ ID NO:2。
根据本发明，证据表明改性的核苷酸序列(还称为优化的核苷酸序列)介导了所关注的蛋白质的大量生产，这可能是由于mRNA的高效转录或更稳定的mRNA的转录、或者密码子更高效地使用。当这些序列分别得自鼠科和人类CDS时，这些序列在本发明中还称为“优化的序列”omIDS和ohIDS。有利的是，根据本发明的优化的序列为密码子优化的序列。
因此，本发明的第一个方面涉及分离的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，并且与SEQ ID NO:2具有75％至90％的一致性。具体而言，根据本发明的分离的核苷酸序列与SEQ ID NO:2具有75％,76％,77％,78％,79％,80％,82％,85％,87％或90％一致性。在优选的实施方案中，本发明的分离的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5所示的ohIDS-version1和SEQ ID NO:8所示的ohIDS-version2。
根据本发明，上文所述的分离的序列可以被插入主链质粒的多克隆位点(MCS)。具体而言，主链质粒为包含腺相关病毒(AAV)的ITR的质粒，在本发明中称为pAAV。
本发明的第二个方面提供了包含核苷酸序列的质粒，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，并且与SEQ ID NO:2具有至少75％一致性。有利的是，根据本发明的质粒与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性。具体而言，根据本发明的质粒包含与SEQ ID NO:2具有75％,76％,77％,78％,79％,80％,82％,85％,87％或90％一致性的分离的核苷酸序列。在优选的实施方案中，本发明的质粒包含核苷酸序列，其选自SEQ ID NO:2所示的hIDS，SEQ ID NO:5所示的ohIDS-version1，以及SEQID NO:8所示的ohIDS-version2。
根据上文提及的分离的序列，根据本发明的质粒还包含常规的控制元件，其可以以允许核苷酸序列在质粒转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与所述的核苷酸序列可操作地连接。具体而言，根据本发明的质粒包含与所关注的核苷酸序列可操作地连接的启动子作为控制元件。大量的启动子是本领域已知的，它们是天然的或嵌合的、构成性的或可诱导的、普遍的和/或组织特异性的。有利的是，在本发明的内容中使用的启动子为被称为组合的CAG启动子，其包含巨细胞病毒早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子。其进一步包含鸡β-肌动蛋白和兔β-球蛋白内含子的部分，它们赋予由所关注的核苷酸序列衍生得到的mRNA以稳定性。参见Alexopoulou A,et al.,BMC Cell Biology 2008；9(2):1-11。在本发明的pAAV质粒中所包含的CAG启动子具有序列SEQ ID NO:14。这种特定的CAG启动子允许缺失的酶在脑的所有区域和肝中长期表达。结果，糖胺聚糖(GAG)的溶酶体累积被校正，从而以这种方式预防MPSII的神经和身体改变特征。
在特别有利的实施方案中，根据本发明的质粒为SEQ ID NO:3所示的质粒pAAV-CAG-hIDS，其登记编号为DSM 29866。
在另一个特别有利的实施方案中，根据本发明的质粒为SEQ ID NO:6所示的质粒pAAV-CAG-ohIDS-version1，其登记编号为DSM 29867。
在另一个特别有利的实施方案中，根据本发明的质粒为SEQ ID NO:9所示的质粒pAAV-CAG-ohIDS-version2，其登记编号为DSM 29868。
本发明的第三个方面涉及用于治疗II型黏多糖贮积病的新的重组载体。应该理解的是本发明的载体为衣壳蛋白，以及其中所包含的用于将所关注的遗传物质转移至细胞中的载体基因组。除了所述的所关注的遗传物质以外，载体基因组还可以包含不同的功能元件，其包括用于转录的控制元件，例如启动子或操纵子；转录因子结合区或增强子，以及用于起始或终止翻译的控制元件。
根据本发明的载体衍生自腺相关病毒(AAV)，并且用于将所关注的核苷酸序列转移至靶细胞中。它们已经证实在多种组织中在转导有丝分裂后的细胞中具有高的效率。在本发明的内容中，载体用于将传递人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶编码序列(SEQ ID NO:2的hIDS)，或者优化形式的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶编码序列(SEQ ID NO:5的ohIDS-version1，或SEQ ID NO:8的ohIDS-version2)。腺相关载体为衍生自细小病毒科家族的腺相关病毒的载体。腺相关病毒基因组由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)形成的。这些病毒感染哺乳动物，但是是非病原性的(即，不会导致疾病)。它们可以感染分裂的或非分裂的细胞，并且根据血清型而产生趋向性改变。血清型是根据衣壳抗原作为病毒组的分类。通过衣壳蛋白确定的腺相关病毒的血清型定义了病毒的趋向性，并且允许它们进入特定的细胞类型。在本发明的内容中，AAV具有血清型1,2,5,7,8,9或10。优选地，AAV为血清型9(AAV9)，这是因为其在单次给予CSF时显示最佳的将遗传物质传递至脑以及外周器官的能力。本发明的AAV9载体由人类腺相关病毒血清型9的病毒衣壳以及改性基因组构成，其包含人类腺相关病毒血清型2的末端反向重复序列(ITR)，CAG启动子，人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)基因的编码序列或其最优化的形式(还称为根据本发明的核苷酸序列)，以及得自兔β-球蛋白基因的polyA。
因此，在这个方面中，本发明涉及包含核苷酸序列的重组AAV，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，并且与SEQ ID NO:2具有至少75％一致性。有利的是，根据本发明的重组AAV具有与SEQ ID NO:2的75％至90％的一致性。具体而言，根据本发明的重组AAV包含根据本发明的与SEQ ID NO:2具有75％,76％,77％,78％,79％,80％,82％,85％,87％或90％一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，在本发明的重组AAV中所包含的分离的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2所示的hIDS，SEQ ID NO:5所示的ohIDS-version1，和SEQ ID NO:8所示的ohIDS-version2。
在这个方面的有利的实施方案中，本发明涉及包含核苷酸序列的重组AAV9，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶IDS，并且与SEQID NO:2具有至少75％一致性。优选地，本发明的重组AAV9包含与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性的核苷酸序列。具体而言，本发明的重组AAV9包含根据本发明的与SEQ ID NO:2具有75％,76％,77％,78％,79％,80％,82％,85％,87％或90％一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，本发明的重组AAV9包含核苷酸序列，其选自SEQ ID NO:2所示的hIDS，SEQID NO:5所示的ohIDS-version1，以及SEQ ID NO:8所示的ohIDS-version2。
进一步惊人地发现，在相同的实体中，AAV9衣壳与编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的核苷酸序列、以及所选的启动子(特别是CAG启动子)的相关性允许在脑的所有区域中长期表达缺失的酶，特别是在所述的实体通过脑池内注射被传递至脑脊液(CSF)中时。结果，糖胺聚糖(GAG)的溶酶体累积被校正，从而通过该方式预防MSPII基本的神经改变特征。甚至在嗅球中也观察到这种作用，所述的嗅球远离于载体的给予位点(小脑延髓池)。此外，根据本发明的被传递至CSF中的AAV9载体能够到达系统性循环，从而转导肝。肝细胞生产和分泌酶使得血清中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性增加，最终导致在许多身体组织中溶酶体病理学减少。这表示根据本发明的载体超过现有方法的清除益处，其中所述的现有方法仅部分校正所述的疾病的临床迹象，并且通常在脑或系统性循环中发挥它们的作用，但是不能在这二者中同时发挥作用。
因此，本发明涉及AAV9载体，其包含与编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的核苷酸序列连接的CAG启动子。
具体而言，本发明的AAV9载体包含与核苷酸序列连接的CAG启动子，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，并且与SEQ IDNO:2具有至少75％一致性。有利地，本发明的AAV9载体包含与核苷酸序列连接的CAG启动子，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，并且与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性。具体而言，在根据本发明的AAV9载体中所包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:2具有75％,76％,77％,78％,79％,80％,82％,85％,87％或90％一致性。
在优选的实施方案中，本发明的重组载体为AAV9-CAG-hIDS(SEQ ID NO:4)，其包含与SEQ ID NO:14的CAG启动子可操作地连接的核苷酸序列SEQ ID NO:2。
在另一给优选的实施方案中，本发明的重组载体为AAV9-CAG-ohIDS-version1(SEQ ID NO:7)，其包含与SEQ ID NO:14的CAG启动子可操作地连接的核苷酸序列SEQ IDNO:5。
在另一给优选的实施方案中，本发明的重组载体为AAV9-CAG-ohIDS-version2(SEQ ID NO:10)，其包含与SEQ ID NO:14的CAG启动子可操作地连接的核苷酸序列SEQ IDNO:8。
上文所定义的本发明的重组载体可以得自也如上文所述的相应的质粒(使用本领域状态下已知的方法通过转染HEK293细胞)。
因此，本发明进一步提供了用于生产根据本发明的腺相关病毒载体AAV(特别是AAV9)的方法。所述的工艺包括以下步骤：
i)提供第一质粒，其包含编码所关注的蛋白质的被置于第一AAV末端重复序列和第二AAV末端重复序列之间的序列，与编码所关注的蛋白质的序列可操作地连接的CAG启动子；第二载体，其包含AAV rep基因和AAV cap基因；以及第三载体，其包含腺病毒辅助功能基因；
ii)与步骤i)的载体共转染感受态细胞；
iii)将步骤ii)的转染细胞培养足以生产病毒颗粒的时间；以及
iv)由步骤iii)的培养物纯化载体。
在优选的实施方案中，第一载体的AAV第一和第二末端重复序列为得自AAV血清型2的ITR。在另一个优选的实施方案中，第二载体的AAV rep基因得自AAV血清型2。在另一个优选的实施方案中，感受态细胞为HEK293细胞。在另一个优选的实施方案中，第二载体的AAV cap基因得自AAV血清型9。
本发明还提供了制备根据本发明的质粒的方法，其包括以下步骤：
i)具体使用MluI/EcoRI，通过消化，由起始质粒切割编码所关注的蛋白质的序列；
ii)克隆位于AAV主链质粒pAAV-CAG的2个限制性位点之间的编码所关注的蛋白质的序列，由此得到相应的质粒，其包含编码所关注的蛋白质的序列。
在另一个方面中，本发明考虑了药物组合物，其包含本发明所述的治疗有效量的分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒、或者本发明所述的AAV载体，特别是AAV9载体。
本发明的药物组合物包含处于药物可接受的载体中的本发明所述的分离的核苷酸序列，本发明所述的质粒，或者本发明所述的AAV载体。所述的组合物还可以包含至少一种辅助物质。辅助物质可以在载体、赋形剂、溶剂、稀释剂或佐剂中选择。可接受的载体、稀释剂或佐剂是非毒性的，并且优选地在使用剂量或浓度下是惰性的，而且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂；低分子量多肽、蛋白质，例如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物；氨基酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；糖醇；例如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(Pluronic
Figure GDA0003094766510000221
)和聚乙二醇(PEG)。
在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物适用于肠胃外给予。肠胃外给予的实例为静脉内、皮下、脑池内和肌肉内注射。优选地，根据本发明的药物组合物适用于静脉内或脑池内给予。适用于这种肠胃外给予的组合物包括无菌水性溶液或分散液、用于无菌溶液或分散液的即时制备物的无菌粉末。有利地，根据本发明的药物组合物被保护以防细菌和真菌的污染作用。
用于人类和动物的剂量可以根据各物种中具有其自己的基准的多种因素或其他因素(例如年龄、性别、体重或疾病的程度等)而改变。
本发明的另一个方面涉及本发明所述的分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒、或本发明所述的AAV载体(特别是AAV9载体)的治疗用途。如上文提及的那样，分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒或根据本发明的AAV载体(特别是AAV9载体)介导了缺失的IDS酶的表达，由此校正GAG的溶酶体累积。这可以校正II型黏多糖贮积病(MPSII)的所有临床迹象。在这个方面中，本发明还关于用作药剂的本发明所述的分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒或本发明所述的AAV载体。
具体而言，本发明涉及用于增加体内艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性的本发明所述的分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒或本发明所述的AAV载体，特别是AAV9载体。
在另一个优选的方面中，本发明涉及用于治疗II型黏多糖贮积病(MPSII)的本发明所述的分离的核苷酸序列、本发明所述的治疗或本发明所述的AAV载体，特别是AAV9载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明所述的分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒或本发明所述的AAV载体(特别是AAV9载体)用于制造治疗II型黏多糖贮积病(MPSII)的药剂的用途。
本发明的另一个实施方案涉及治疗II型黏多糖贮积病(MPSII)的方法，其包括向有需要的受试对象给予至少一种本发明所述的分离的核苷酸序列、本发明所述的质粒或本发明所述的AAV载体(特别是AAV9载体)的步骤。
本发明进一步提供了分离的细胞，其包含编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶SEQ IDNO:1的核苷酸序列。具体而言，根据本发明的细胞包含核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，并且与SEQ ID NO:2具有至少75％一致性，而且有利地与SEQ ID NO:2具有75％至90％一致性。具体而言，在根据本发明的分离的细胞中所包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:2具有75％,76％,77％,78％,79％,80％,82％,85％,87％或90％一致性。
在优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)SEQID NO:1的核苷酸序列SEQ ID NO:2。
在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)SEQ ID NO:1的核苷酸序列SEQ ID NO:5。
在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)SEQ ID NO:1的核苷酸序列SEQ ID NO:8。
以下实施例仅说明本发明的某些实施方案，并且不可以理解为以任何方式进行限定。
一般过程
1.重组AAV载体
本发明所述的AAV载体是通过三重转染得到的。制备载体所需的物质：HEK293细胞(表达腺病毒E1基因)，提供腺病毒功能的辅助质粒，提供得自血清型2的AAV rep基因和得自血清型9(AAV9)的cap基因的质粒，以及最后具有AAV2 ITR和所关注的构建体的主链质粒。
为了生成表达艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的AAV载体，将人类或鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的优化的或非优化的编码序列克隆至处于泛在杂交CAG启动子控制之下的AAV主链质粒中。使用EndoFree Plasmid Megaprep Kit(Qiagen)进行质粒的大规模生产。
使用具有改性的3种质粒，通过HEK293细胞的辅助无病毒转染，生成载体。参见Matsushita T,et al.,Gene Ther.1998；5:938-945and Wright J,et al.,Mol.Ther.2005；12:171-178。在转瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中，在补充10％FBS的DMEM中将细胞培养至70％融合，然后与以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼为血清型2AAV的病毒ITR(如上文所述)；2)携带AAV rep2和cap9基因的质粒；以及3)携带腺病毒辅助功能的质粒。通过2个连续的氯化铯梯度，采用之前所述的优化的方案纯化载体。参见Ayuso E,et al.,Gene Ther.2010；17:503-510。将载体针对PBS+0.001％
Figure GDA0003094766510000241
F68透析，过滤，并通过qPCR滴定，然后储存在-80℃下直至使用。
根据本领域公知的分子生物学技术构建本发明的载体。
2.动物
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺陷型模式小鼠(MPSII)购自Taconic(Germantown,NY12526USA,Stock TF1838)。感染的MPSII和健康对照小鼠是由半合子雄性小鼠和杂合子雌性小鼠自交得到的。采用PCR分析，在由鼠尾钳夹样品得到的基因组DNA上测定基因型，其中所述的PCR分析扩增了涵盖靶向突变的序列。各个正向和反向引物的序列为，正向引物：5’-TTT TGT GTA CTC CAA CCC CG-3’(SEQ ID NO:15)；反向引物：5’-TGT CTC CAT AAC AGCCCA GG-3’(SEQ ID NO:16)；反向引物突变：5’-GCC CTC ACA TTG CCA AAG GA -3’(SEQ IDNO:17)。使用标准的饮食(Harlan,Tekland)随意饲养小鼠，并保持在12h的光-暗循环(在9:00A.M.下光照)下。
3.将编码IDS的质粒水动力传递至小鼠中
对于pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2质粒的水动力传递而言，使3个月龄的MPSII和野生型动物通过鼠尾静脉注射在<5秒内接受体积等于动物体重10％的总剂量30μg的质粒。该技术使得编码转基因的质粒主要在肝中表达。参见Liu et al.,Gene Ther.1990；6(7):1258-66。最为对照，一组小鼠接受等体积的生理盐水溶液。将小鼠分成2组，并且在水动力注射质粒后48小时或1周处死小鼠。如以下部分中所述收获器官。
4.将载体给予小鼠
对于AAV9-CAG-omIDS载体intra-CSF传递给小鼠而言，将总剂量5x1010vg注射至2个月龄的MPSII动物的小脑延髓池中。相似的一组动物注射5x1010vg对照非编码(AAV9-Null)载体。在6个月和10个月龄下，即，在载体给予后4个月和8个月，麻醉小鼠并收获组织。
对于AAV9载体(包含野生型hIDS或者优化形式的IDS编码序列)的静脉内传递给小鼠而言，将总剂量1x1010vg的载体注射至3.5月龄MPSII动物的鼠尾静脉中。WT和未处理的MPSII动物用作对照。在载体给予后3周，麻醉小鼠并收获组织。
5.样品收集
在处死时，麻醉动物，然后使用12ml PBS经心脏灌注，从而完全清除组织中的血液。收集全脑和多个身体组织(包括肝、脾、胰腺、肾、肺、心脏、骨骼肌肉、睾丸、泌尿膀胱、肠和脂肪组织)，并在液氮中冷冻并储存在-80℃下，或者浸渍在福尔马林中用于随后的组织学分析。
6.艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性和糖胺聚糖定量
在Mili-Q水中，对脑、肝、肺和心脏样品进行超声波降解。所分析的血清保持未处理。如之前所述，使用4-甲基伞形酮衍生的荧光底物(Moscerdam Substrates,Oegstgeest,NL)测定艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。参见Voznyi et al.,J Inher Metab Diss 2001；24:675-680。脑、肝、肺和心脏活性水平对蛋白质的总量(使用Bradford蛋白质测试(Bio-Rad,Hercules,CA,US)定量)进行归一化。将血清活性对体积归一化。
对于糖胺聚糖(GAG)定量而言，将组织样品称重，然后使用蛋白酶K消化，并通过离心和过滤使提取物澄清。在组织提取物中使用Blyscan硫酸化糖胺聚糖试剂盒(Biocolor,Carrickfergus,County Antrim,GB)，使用4-硫酸软骨素作为标准品测定GAG水平。将GAG水平对组织湿重归一化。
7.其他溶酶体酶的活性
在500μl Mili-Q水中，对脑和肝样品进行超声波降解，并使用4-甲基伞形酮衍生的荧光底物测定上清液中酶的活性。所分析的血清保持未处理。在37℃下与4-甲基伞型基α-L-艾杜糖苷(Glycosynth)温育1h的15μg蛋白质中测试IDUA活性。参见Bacter et al.,Blood 2002；99(5)1857-9。如之前所述测量SGSH活性。参见Karpova et al.,J InheritMetab Dis.1996；19(3):278–285,Haurigot et al.,supra。简言之，将30μg蛋白质与4-MU-αGIcNS在47℃下首先温育17小时。在37℃下在0.2％BSA中在10U/mlα-葡萄糖苷酶(Sigma-Aldrich)存在下二次温育24小时。对于NAGLU活性而言，如之前所述，将30μg组织蛋白质提取物与4-甲基伞型基-α-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷(Moscerdam Substrates)在37℃下温育3h。参见Marsh et al.,Clin Genet.1985；27(3):258-62,Ribera et al.,supra。由30μg蛋白质提取物测定HGSNAT活性，其中所述的蛋白质提取物与乙酰基辅酶A和4-甲基伞型基-β-D-葡萄糖胺(MU-βGlcNH2,Moscerdam Substrates)在37℃下温育17h。参见Voznyi et al.,J Inh Metab Dis 1993；16:465-72。在37℃下首次温育17h的过程中，使用10μg蛋白质提取物和4-甲基伞型基β-D-吡喃半乳糖苷-6-硫酸钠Sal(MU-βGal-6S)通过2步法测试GALNS活性。加入Pi-缓冲剂(0.9M Na2HPO4/0.9M NaH2PO4缓冲剂,pH4.3+0.02％(w/v)Na-叠氮化物)和β-半乳糖苷酶(β-Gal-Ao,Sigma)，并在37℃下将混合物温育2h来实施第二步骤。参见vanDiggelen et al.,Clin Chim Acta 1990；187:131-40。由10μg蛋白质提取物测定GUSB酶的活性，其中所述的蛋白质提取物与4-甲基伞型基-β-D-葡糖苷酸(Sigma)在37℃下温育1h。通过将0.1μg蛋白质提取物与4-甲基伞型基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(Sigma)在37℃下温育1h来测定HEXB活性。在通过升高pH而终止反应后，使用FLx800荧光计(BioTekInstruments)测量释放的荧光。将所有的脑和肝的活性水平对蛋白质的总量(使用Bradford蛋白质测试(Bio-Rad,Hercules,CA,US)定量)归一化。
8.组织学分析
将组织在福尔马林中固定12-24h，包埋于石蜡中并切片。对于脑中LAMP2的免疫组织化学检测而言，使石蜡切片经过在柠檬酸盐缓冲剂pH6中的热诱导的抗原表位修复，然后在4℃下与大鼠抗LAMP2抗体(以1:500稀释)(Ab13524；Abcam,Cambridge,UK)过夜温育，随后与生物素化的兔抗大鼠抗体(以1:300稀释)温育(Dako,Glostrup,DK)。对于在脑样品中的GFAP免疫染色而言，将石蜡切片在4℃下与兔抗GFAP抗体(以1:1000稀释)(Ab6673；Abcam,Cambridge,UK)过夜温育，随后与生物素化的山羊抗兔抗体(以1:300稀释)(31820；Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)温育。使用ABC-Peroxidase染色试剂盒(Thermo Scientific,Waltham,MA,US)通过在1:100稀释下温育切片来扩大LAMP2和GFAP信号，并使用3,3-二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,US)作为色原体显像。
为了将脑样品中的小神经胶质细胞染色，将石蜡切片与BSI-B4凝集素(以1:100稀释)(L5391；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在4℃下过夜温育。使用3,3-二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,US)作为色原体使BSI-B4信号显像。使用光学显微镜(Eclipse 90i；Nikon,Tokyo,JP)得到亮视场的图像。
The NIS Elements Advanced Research 2.20软件用于定量每种动物各个脑部区域(原始放大倍数,×20)3-4个图像中的LAMP2,GFAP和BSI-B4信号，其中对所有的动物都使用相同的信号阈值背景。然后计算阳性区域的百分率，即，在图像中整个组织区域上阳性信号的面积，以像素计。
9.组织中载体基因组拷贝数的定量
在蛋白酶K(0.2mg/ml)中过夜组织消化后，使用MasterPureDNA PurificationKit(Epicenter)分离总的DNA。使用对HBB2序列(包含在polyA链段中)具有特异性的引物和探针的定量PCR用于定量20ng总DNA中的载体基因组拷贝数。正向引物：5’-CTT GAG CATCTG ACT TCT GGC TAA T-3’(SEQ ID NO:18)；反向引物：5’-GAT TTG CCC TCC CAT ATGTCC-3’(SEQ ID NO:19)；探针：5’-CCG AGT GAG AGA CAC AAA AAA TTC CAA CAC-3’(SEQID NO:20)。通过线性化质粒(包含polyA序列)的系列稀释而建立的参照标准曲线用于插入vg/样品的最终的值。
10.旷场测试
通过在9:00am至1:00pm实施的旷场测试来分析6个月龄小鼠的行为。将动物放置于明亮房间(41x41x30cm)的左下角，该房间穿过2束光柱(SedaCom32；Panlab)，其用于检测小鼠的水平和垂直运动。将面积表面分成3个方形的同心区域：中心(14x14cm)，周围(27x27cm)和边界(41x41cm)。使用可视跟踪系统(SmartJunior,Panlab)，在最初的3分钟测试中记录探索和运动活性。
11.统计学分析
所有结果表示为平均值±SEM。使用单因素ANOVA进行统计学比较。使用Dunnett’spost检验进行对照组和处理组之间的多个比较，并使用Tukey’s post检验进行所有组之间的比较。如果P<0.05，则认为具有统计学意义。Kaplan-Meier曲线用于评估生存，并且对数秩检验(the long-rank test)用于比较。
实施例
实施例1：pAAV-CAG-hIDS的构建
用于人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的CDS用作起始物质(NCBI ReferenceSequence:NM_000202.6)，并且化学合成以用于上述目的(GenScript Inc)。接受CDS并克隆至质粒pUC57_(AmpR)中，其侧翼为SwaI限制性位点。
由pUC57质粒上切割SwaI-SwaI人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶CDS片段，随后在提供具有平端Klenow片段(Fermentas)的5’和3’突出后，将所述的CDS片段克隆至AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。所得的质粒命名为pAAV-CAG-hIDS(登记编号为DSM 29866)。参见图1A和SEQ ID NO:3。
如之前所述生成pAAV-CAG质粒，其包含得自AAV2基因组的ITR，CAG启动子，得自兔β-球蛋白的polyA信号，以及用于克隆所关注的CDS的多克隆位点。CAG启动子为杂合启动子，其由CMV早期/中期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子构成。该启动子能够广泛地驱动潜在的表达。参见Sawicki J et al.,Exper Cell Res.1998；244:367–369,Huang J et al.,JGene Med.2003；5:900–908,Liu Y et al.,Exp Mol Med.2007；39(2):170-175。
实施例2：pAAV-CAG-ohIDS-version1的构建
设计并获得包含优化形式的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶cDNA序列(ohIDS)的表达盒。进行序列优化从而通过以下过程使人类中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白质生产效率最大：删除隐蔽剪接位点和用于增加RNA稳定性的RNA不稳定序列元件；加入RNA稳定序列元件；密码子优化和/或G/C含量适配；避免稳定的RNA二级结构等其他改变。用于人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(NCBI参照序列：NM_000202.6)的CDS用作用于序列优化的起始点(DNA2.0Inc)。接受优化的CDS并克隆在质粒pJ204:191476(AmpR)内，其在5’和3’的侧翼分别为MluI和EcoRI限制性位点。
由pJ204:191476质粒切割MluI/EcoRI优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶CDS片段，随后克隆在AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。所得的质粒命名为pAAV-CAG-ohIDS-version1(登记编号为DSM 29867)。参见图2A和SEQ ID NO:6。
实施例3：pAAV-CAG-ohIDS-version2的构建
用于人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(NCBI参照序列：NM_000202.6)的CDS经过序列优化(GeneScript Inc)。接受优化的CDS，并克隆在质粒pUC57(AmpR)中，其在5’和3’的侧翼分别为MluI和EcoRI限制性位点。
使用MluI和EcoRI消化pUC57-ohIDS质粒，从而切除优化的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶CDS。随后，将该片段克隆在pAAV-CAG主链质粒的相同的限制性位点之间，从而生成pAAV-CAG-ohIDS-version2质粒(登记编号为DSM 29868)。参见图3A和SEQ ID NO:9。
实施例4：pAAV-CAG-omIDS的构建
用于鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(NCBI参照序列：NM_010498.3)的CDS经过序列优化(GeneArt；Life Technologies)。接受优化的CDS，并克隆在质粒pMA-RQ(AmpR)中，其在5’和3’的侧翼分别为MluI和EcoRI限制性位点。
由pMA-RQ质粒上切除MluI/EcoRI优化的鼠科艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶CDS片段(SEQ ID NO:11)，并随后克隆在AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。所得的质粒命名为pAAV-CAG-omIDS。参加图4A和SEQ ID NO:12。
实施例5：AAV9-CAG-hIDS的生产
使用具有改性的3种质粒，通过HEK293细胞的辅助无病毒转染，生成载体AAV9-CAG-hIDS(SEQ ID NO:4)。参见Matsushita et al.,Gene Ther.1998；5(7):938-45,Wrightet al.,Mol Ther.2005；12(1)171-8。在转瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中，在补充10％FBS的DMEM中将细胞培养至70％融合，然后与以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼为AAV2 ITR(pAAV-CAG-hIDS)；2)携带AAV2 rep和AAV9 cap基因(pREP2CAP9)的质粒；以及3)携带腺病毒辅助功能的质粒。通过2个连续的氯化铯梯度，采用之前所述的优化的方案纯化载体。参见Ayuso E,et al.,Gene Ther.2010；17:503-510。将载体针对PBS+0.001％
Figure GDA0003094766510000301
F68透析，过滤，并通过qPCR滴定，然后储存在-80℃下直至使用。参见图1B。
实施例6：AAV9-CAG-ohIDS-version1的生产
使用具有改性的3种质粒，通过HEK293细胞的辅助无病毒转染，生成载体AAV9-CAG-ohIDS-version1(SEQ ID NO:7)。参见Matsushita et al.,and Wright et al.,supra。在转瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中，在补充10％FBS的DMEM中将细胞培养至70％融合，然后与以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼为AAV2ITR(pAAV-CAG-ohIDS-version1)；2)携带AAV2 rep和AAV9 cap基因(pREP2CAP9)的质粒；以及3)携带腺病毒辅助功能的质粒。通过2个连续的氯化铯梯度，采用之前所述的优化的方案纯化载体。参见Ayuso et al.,supra。将载体针对PBS+0.001％
Figure GDA0003094766510000302
F68透析，过滤，并通过qPCR滴定，然后储存在-80℃下直至使用。参见图2B。
实施例7：AAV9-CAG-ohIDS-version2的生产
使用具有改性的3种质粒，通过HEK293细胞的辅助无病毒转染，生成载体AAV9-CAG-ohIDS-version2(SEQ ID NO:10)。参见Matsushita et al.,and Wright et al.,supra。在转瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中，在补充10％FBS的DMEM中将细胞培养至70％融合，然后与以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼为AAV2ITR(pAAV-CAG-ohIDS-version2)；2)携带AAV2 rep和AAV9 cap基因(pREP2CAP9)的质粒；以及3)携带腺病毒辅助功能的质粒。通过2个连续的氯化铯梯度，采用之前所述的优化的方案纯化载体。参见Ayuso et al.,supra。将载体针对PBS+0.001％
Figure GDA0003094766510000311
F68透析，过滤，并通过qPCR滴定，然后储存在-80℃下直至使用。参见图3B。
实施例8：AAV9-CAG-omIDS的生产
使用具有改性的3种质粒，通过HEK293细胞的辅助无病毒转染，生成载体AAV9-CAG-omIDS(SEQ ID NO:13)。参见Matsushita et al.,and Wright et al.,supra。在转瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中，在补充10％FBS的DMEM中将细胞培养至70％融合，然后与以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼为AAV2 ITR(pAAV-CAG-omIDS)；2)携带AAV2 rep和AAV9 cap基因(pREP2CAP9)的质粒；以及3)携带腺病毒辅助功能的质粒。通过2个连续的氯化铯梯度，采用之前所述的优化的方案纯化载体。参见Ayusoet al.,supra。将载体针对PBS+0.001％
Figure GDA0003094766510000312
F68透析，过滤，并通过qPCR滴定，然后储存在-80℃下直至使用。参见图4B。
实施例9：将pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS- version2水动力注射至健康小鼠中
将总剂量30mg的质粒pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2(包含不同形式的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶表达盒)通过水动力鼠尾静脉注射给予2个月龄的WT小鼠。该技术使传递的质粒的表达靶向肝部。参见Liu et al.,GeneTher.1990；6(7):1258-66。
质粒传递后48小时，在给予编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的质粒的所有动物的肝和血清中，都记录艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性超过基线水平大幅升高。在肝和血清中，包含优化形式的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因的表达盒所达到的活性水平高于野生型基因所获得的活性水平。此外，在血清中，接受pAAV-CAG-ohIDS-version2质粒的动物显示艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性水平，其在统计学上高于使用其他2种质粒记录的活性水平。参见图5A和5B。
实施例10：将pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS- version2水动力注射至MPSII小鼠中
将总剂量30mg的质粒pAAV-CAG-hIDS,pAAV-CAG-ohIDS-version1和pAAV-CAG-ohIDS-version2(包含不同形式的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶表达盒)通过水动力鼠尾静脉注射给予3个月龄的MPSII受影响小鼠。
在质粒传递后1周收获组织。相对于接受生理盐水注射的MPSII动物，所有3种包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的质粒均介导艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性大幅升高；在肝中，活性范围为WT水平的1200％至2200％，在血清中，活性范围为WT的2000％至5700％。使用包含密码子优化形式的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因所达到的活性水平在统计学上高于由包含野生型基因的质粒所介导的水平。参见图6A和6B。
与在肝和血清中记录的高水平的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性一致，在使用所有质粒构建体分析的组织中，将GAG含量完全归一化。参见图6C。
实施例11：将AAV9-CAG-hIDS,AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS- version2静脉内传递至MPSII小鼠中
MPSII小鼠(3.5个月龄)通过鼠尾静脉接受1x1010vg AAV9载体的静脉内注射，其中所述的载体包含野生型或优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列。将分开的几组月龄匹配的WT和未处理的MPSII小鼠用作对照。在处理后3周，处死动物，收集血液和肝样品并进行分析。
静脉内给予剂量1x1010vg/小鼠的AAV9载体使转基因的表达主要靶向肝。参见Wuet al.,Mol.Ther.2006；14(3):316-27,Inagaki et al.,Mol.Ther.2006；14(1):45-33。在载体传递后3周在肝提取物中测量艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的活性时，在接受任何编码人类IDS载体的MPSII雄性小鼠中都记录酶活性明显升高。参见图7A。但是，这种升高在接受包含优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列(AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2)的AAV9载体的MPSII动物中明显更高。在接受具有野生型序列的载体的动物中所达到的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性水平是健康WT动物中所观察到的活性水平的大约2倍。参见图7A。使用包含优化的人类IDS序列的载体，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性水平是健康动物中或者在使用包含野生型IDS序列的载体处理的MPSII动物中所观察到的活性水平的几倍以上。参见图7A。
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶为可分泌的溶酶体酶，并且其在肝中的原样表达是循环酶的来源。参见Haurigot et al,supra。类似于在干提取物中所进行的观察，在使用包含优化的人类IDS序列的AAV9载体处理的MPSII动物的循环中，所得的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性水平是在健康动物或者在使用包含野生型人类IDS序列的载体处理的MPSII动物中所观察到的活性水平的几倍以上。参见图7B。
与在肝和血清中记录的高水平的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性一致，在使用AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2处理的MPSII小鼠的肝中，将GAG含量完全归一化。但是，在使用等剂量携带野生型IDS编码序列的AAV9载体处理的动物的肝中，GAG水平仅部分降低。参见图7C。
实施例12：AAV9-CAG-hIDS,AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS- version 2脑池内传递至MPSII小鼠中
2个月龄的MPSII小鼠接受总体积5μl的脑池内注射5x1010vg AAV9载体，其包含野生型或优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列。分开的几组年龄匹配的WT、未处理的MPSII小鼠和接受5x1010vg非编码载体(AAV9-CAG-Null)的MPSII小鼠用作对照。在3.5个月龄时，即，在处理后1.5个月，处死动物，收集样品并进行分析。
当在脑提取物中测量艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的活性时，在接受任何编码人类IDS载体的MPSII雄性小鼠中，都记录酶活性明显升高。参见图8A。但是，这种升高在接受包含优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列(AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2)的AAV9载体的MPSII动物中比使用包含野生型IDS序列的载体处理的那些MPSII动物高几倍以上。参见图8A。在接受具有优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列的载体的动物中所达到的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性水平与WT的活性水平几乎一样高，或者甚至更高；在脑的大部分吻部(部分I)，由包含优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列的载体衍生的IDS活性是WT水平的几乎2倍。参见图8A。
与整个脑部的IDS活性升高一致，表征疾病的底物的累积在经处理的MPSII小鼠的脑中被校正，其是通过GAG含量显著降低表明的。参加图8B。除了部分V以外，在所有所分析的区域中使用所有的构建体均观察到GAG水平的完全归一化，其中所述的部分V中，由包含野生型IDS序列的载体衍生的IDS的表达作用不明显。参见图8B。
给予CSF的AAV9载体渗透至外周，并转导肝。参见Haurigot et al.,ClinInvest.2013；123(8):3254-3271,Ribera et al.,Hum Mol Genet.2014；24(7):2078-2095。因此，在使用任何编码人类IDS的载体处理的MPSII小鼠的肝和血清中，都记录艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性的升高。参见图9A和9B。这种升高在接受包含优化的人类艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶序列(AAV9-CAG-ohIDS-version1和AAV9-CAG-ohIDS-version2)的AAV9载体的MPSII动物中再次明显高于使用包含野生型IDS序列的载体处理的那些MPSII动物。参见图9A和9B。当在不同的身体器官中，通过GAG含量定量来评价治疗效力时，在使用任何优化的编码人类IDS载体处理的MPSII小鼠的所有组织中，都观察到GAG水平的完全归一化。参见图9C。但是，接受野生型人类IDS序列的MPSII小鼠显示GAG含量在肝、心脏、肺和脾中完全归一化，但是在睾丸、肾、泌尿膀胱和脂肪组织中仅部分校正。参见图9C。
实施例13：AAV9-CAG-omIDS的脑池内传递
将总剂量5x1010的AAV9-CAG-omIDS载体的载体基因组以总体积5μl注射至2个月龄MPSII动物的小脑延髓池中。首先，在6个月龄时分析小鼠，即，在载体给予后4个月。intra-CSF传递AAV9-CAG-omIDS载体使得所分析的所有脑的区域中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的活性得以恢复，达到在健康动物中在不同区域所观察到的水平的平均40％水平。参见图10A。在载体传递4个月后，在经处理的MPSII小鼠的脑中，疾病的底物累积特征完全恢复，其通过所分析的所有脑的区域中GAG含量归一化表明。参见图10B。类似地，溶酶体分隔区的尺寸被完全归一化，其通过用于免疫检测溶酶体标志物LAMP2的信号强度的定量表明。LAMP2信号与溶酶体分隔区的尺寸成比例，其转而取决于累积的未降解的乙酰肝素和硫酸皮肤素的量。参见图11A。此外，在AAV9-CAG-omIDS传递后8个月，所述的处理对溶酶体扩张的作用保持稳定，表明治疗的长期效力。参见图12。
由于未降解底物的累积所导致的正常溶酶体动态平衡的破坏可以改变其他溶酶体酶(不同于突变直接影响的溶酶体酶)的活性。参见Ribera et al.,Hum MolGenet.2014；doi:10.1093/hmg/ddu727。在未处理的MPSII小鼠或使用对照“Null”载体处理的MPSII小鼠的脑中，IDUA(艾杜糖苷酸酶,α-L-),SGSH(N-磺氨基葡糖硫水解酶),NAGLU(N-乙酰葡糖胺糖苷酶,α),HGSNAT(乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶),GALNS(半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶),GUSB(葡萄糖醛酸酶,β),HEXB(氨基己糖苷酶B)的活性被改变，但是使用AAV9-CAG-omIDS的处理使这些活性返回至在健康WT动物中所观察到的水平，表明所述的载体能够恢复溶酶体动态平衡。参见图11B。
与溶酶体病理学的校正一致，炎症的所有迹象在经处理的MPSII小鼠的脑中小时。在处理后的4个月，用于检测星细胞增多(GFAP)和胶质细胞增生(BSI-B4)的染色的信号强度在经处理的MPSII小鼠和健康动物的不同的脑的区域中是相似的，这与给予对照“Null”AAV9载体的MPSII小鼠中记录的信号相反，这些小鼠中显示这些神经炎症的标志物具有明显的上调节。参见图13A和13B。此外，在10个月龄时，即，在基因转以后8个月，AAV9-CAG-omIDS处理对神经炎症产生有利的影响，其通过针对持续的GFAP和BSI-B4染色来评价，表明神经炎症的长期根除。参见图14A和14B。
给予CSF的AAV9载体渗透至外周，并转导肝。参见Haurigot et al.,ClinInvest.2013；123(8):3254-3271,Ribera et al.,Hum Mol Genet.2014；doi:10.1093/hmg/ddu727。因此，在基因转移后4个月，在使用AAV9-CAG-omIDS处理的MPSII小鼠的肝和血清中，都记录艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性的升高，分别达到在健康动物中所观察到的水平的大约1700％和700％水平。参见图15A和15B。当在不同的器官中，通过GAG含量定量来评价治疗的身体效力时，在大部分的组织(包括肝、心脏、肺、睾丸、脾和脂肪组织，不同之处为肾和泌尿膀胱)中，都观察到完全归一化，其中观察到GAG减少>50％。参见图15C。
在处理后4个月，在肺中IDS活性也升高，并且在心脏中特别高。参见图16A和16B。这2种器官(肺和心脏)呈现极低值的载体基因组拷贝数/二倍体基因组，表明在以剂量5X1010vg intra-CSF AAV9-CAG-omIDS传递后，这些器官高效转导的缺乏。参见图16C。该发现表明通过由循环吸收IDS而使得IDS缺陷的交叉校正。
与GAG含量数据一致，在2个月龄时，在使用AAV9-CAG-omIDS处理的6个月龄的MPSII小鼠中，肝的重量归一化。参见图17A。通过测量肝提取物中其他溶酶体酶的活性，提供intra-CSF AAV9-CAG-omIDS处理在MPSII小鼠中抵消溶酶体病理学的潜力的其他证明。相对于未处理的MPSII小鼠中或者使用对照“Null”载体处理的MPSII小鼠中的WT水平而言，IDUA,SGSH,NAGLU,HGSNAT,GALNS,GUSB,HEXB大幅改变。使用AAV9-CAG-omIDS的处理将所有这些酶的活性完全归一化。参见图17B。此外，溶酶体病理学的结果使得血清HEXB活性也升高，并且在AAV9-CAG-omIDS处理后完全归一化，参见图17C，从而提供溶酶体功能性整体校正的证明。
采用旷场测试，在6个月龄时评估intra-CSF给予AAV9-CAG-omIDS对行为的影响，其评价了小鼠在未知环境在红的一般运动和探索活性。在中性和外周所花费的时间、进入中心和外周的数量、以及快速运动的总量方面，与健康小鼠相比，未处理的和AAV9-null处理的MPSII小鼠展示降低的探索活性。脑池内给予AAV9-CAG-omIDS完全校正了MPSII小鼠的行为缺陷。参见图18A-F。
最后，通过比较未处理和处理MPSII小鼠的生存来评价intra-CSF AAV9-CAG-omIDS处理的治疗效力。AAV9-CAG-omIDS基因治疗大幅延长了MPSII小鼠的寿命。参见图19。在17个月龄时所有未处理的或AAV9-CAG-Null处理的MPSII小鼠都死亡，而接受AAV9-CAG-omIDS处理的76％MPSII小鼠存活。此外，65％处理的动物在22个月龄时仍存活。在该月龄时存活的野生型动物的％为79％。参见图19。
实施例14：不同剂量AAV9-CAG-omIDS的脑池内传递：剂量-应答研究
将4种不同剂量(1.58x109,5x109,1.58x1010和5x1010vg/小鼠)的总体积5μl的AAV9-CAG-omIDS载体通过脑池内注射给予2个月龄的MPSII动物。
载体给予后一个半月，处死动物，并收获组织。在脑的不同部分(部分I-V)中测量Iduronat-2-硫酸酯酶活性。活性随着剂量增加，并且在不同的区域中，WT活性范围由0.8增加至53％。参见图20A。当分析所述的处理对GAG储存的作用时，观察到相似的剂量-应答。但是，仅在2个最高剂量1.58x1010和5x1010vg/小鼠下记录GAG累积的完全校正。参见图20B。
在肝和血清中，活性也随着剂量增加，在肝中活性范围为20％增加至4300％，在血清中活性范围为0.4％增加至1100％。在使用2个最低剂量(1.58x109,5x109vg/小鼠)的血清中未检测IDS活性。参见图21A和21B。与活性数据一致，在外周组织中GAG含量的测量证明GAG含量在肝、心脏、肺、睾丸、脾、肾、泌尿膀胱和脂肪组织中的剂量-应答降低。在使用2个最高剂量(1.58x1010和5x1010vg/小鼠)的大部分组织中，取得GAG水平的完全或几乎完全的归一化，除了肺、泌尿膀胱和肾以外，在肺和泌尿膀胱中，记录降低>70％，而在肾中，观察到大约降低50％。参见图21C。
序列表
<110> 埃斯蒂维实验室股份有限公司（LABORATORIOS DEL DR. ESTEVE, S.A.）
巴塞罗那自治大学（UNIVERSITAT AUTONOMA DE BARCELONA）
<120> 用于治疗黏多糖贮积病的腺相关病毒载体
<130> PCT2212.6
<150> EP15382297
<151> 2015-06-05
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 550
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser
20 25 30
Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg
35 40 45
Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile
50 55 60
Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln
65 70 75 80
Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His
100 105 110
Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr
115 120 125
Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn
130 135 140
His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly
165 170 175
Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu
195 200 205
Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly
210 215 220
Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys
225 230 235 240
Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro
245 250 255
Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln
260 265 270
Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile
275 280 285
Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val
290 295 300
Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp
305 310 315 320
Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly
325 330 335
Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp
340 345 350
Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala
355 360 365
Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe
370 375 380
Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu
385 390 395 400
Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu
405 410 415
Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys
420 425 430
Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu
435 440 445
Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser
450 455 460
Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro
465 470 475 480
Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp
485 490 495
Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala
500 505 510
Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp
515 520 525
Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu
530 535 540
Phe Gln Leu Leu Met Pro
545 550
<210> 2
<211> 1653
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60
tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120
ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180
tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240
caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300
cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360
cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420
atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480
tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540
aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600
agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660
ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720
ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780
cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840
atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900
tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960
cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020
gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080
ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140
ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200
gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260
cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320
cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380
attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440
agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500
gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560
gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620
ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653
<210> 3
<211> 7900
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> pAAV-CAG-hIDS
<400> 3
aaatacgcgt atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct 60
gagctccgtc tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct 120
gaacgttctt ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa 180
gctggtgagg tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc 240
ctttgcgcag caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc 300
tgacaccacc cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc 360
caccatcccc cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt 420
tcaccctggg atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc 480
ttatcatcct tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga 540
actccatgcc aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc 600
tgacaaacag agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag 660
tcctttcttc ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga 720
atttcagaag ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga 780
tggcctaccc cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca 840
agccttaaac atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg 900
ccagagctac tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc 960
tttggacgat cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg 1020
ggctctaggt gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt 1080
tcccctgata ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct 1140
tttcccttac ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc 1200
catggacctt gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca 1260
ggttccacct cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa 1320
ccttctgaag cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc 1380
ccgtgaactg attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc 1440
tgacaagccg agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta 1500
taggtatact gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat 1560
ccatgcaggg gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa 1620
tgattcccaa ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tgagaattca tttaattcga 1680
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 1740
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 1800
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 1860
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 1920
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 1980
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 2040
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 2100
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 2160
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 2220
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 2280
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 2340
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcatt 2400
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 2460
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2520
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2580
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2640
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2700
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2760
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2820
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2880
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2940
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 3000
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3060
acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3120
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3180
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3240
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 3300
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 3360
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 3420
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 3480
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 3540
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3600
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3660
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 3720
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3780
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3840
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3900
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3960
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 4020
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 4080
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 4140
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 4200
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 4260
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 4320
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 4380
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 4440
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 4500
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 4560
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 4620
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 4680
tcaggcgatt ccaacatcca ataaatcata caggcaaggc aaagaattag caaaattaag 4740
caataaagcc tcagagcata aagctaaatc ggttgtacca aaaacattat gaccctgtaa 4800
tacttttgcg ggagaagcct ttatttcaac gcaaggataa aaatttttag aaccctcata 4860
tattttaaat gcaatgcctg agtaatgtgt aggtaaagat tcaaacgggt gagaaaggcc 4920
ggagacagtc aaatcaccat caatatgata ttcaaccgtt ctagctgata aattcatgcc 4980
ggagagggta gctatttttg agaggtctct acaaaggcta tcaggtcatt gcctgagagt 5040
ctggagcaaa caagagaatc gatgaacggt aatcgtaaaa ctagcatgtc aatcatatgt 5100
accccggttg ataatcagaa aagccccaaa aacaggaaga ttgtataagc aaatatttaa 5160
attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 5220
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 5280
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 5340
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 5400
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 5460
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 5520
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 5580
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtactatg gttgctttga cgagcacgta 5640
taacgtgctt tcctcgttag aatcagagcg ggagctaaac aggaggccga ttaaagggat 5700
tttagacagg aacggtacgc cagaatcctg agaagtgttt ttataatcag tgaggccacc 5760
gagtaaaaga gtctgtccat cacgcaaatt aaccgttgtc gcaatacttc tttgattagt 5820
aataacatca cttgcctgag tagaagaact caaactatcg gccttgctgg taatatccag 5880
aacaatatta ccgccagcca ttgcaacgga atcgccattc gccattcagg ctgcgcaact 5940
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctgcgc gctcgctcgc 6000
tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 6060
tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tccttgtagt 6120
taatgattaa cccgccatgc tacttatcta ctcgacattg attattgact agttattaat 6180
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 6240
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 6300
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 6360
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 6420
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 6480
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg 6540
tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt 6600
atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg 6660
cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 6720
cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 6780
ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg 6840
ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 6900
caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga 6960
cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gggccctttg 7020
tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc 7080
ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc 7140
cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc 7200
gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc 7260
gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg 7320
gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg 7380
tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg 7440
gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat 7500
tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg 7560
gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc 7620
ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc 7680
cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg 7740
ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 7800
gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 7860
catcattttg gcaaagaatt gattaattcg agcgaacgcg 7900
<210> 4
<211> 4319
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> AAV9-CAG-hIDS
<400> 4
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
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ggttctgagc tccgtctgcg tcgccctcgg atccgaaacg caggccaact cgaccacaga 2040
tgctctgaac gttcttctca tcatcgtgga tgacctgcgc ccctccctgg gctgttatgg 2100
ggataagctg gtgaggtccc caaatattga ccaactggca tcccacagcc tcctcttcca 2160
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gagacctgac accacccgcc tgtacgactt caactcctac tggagggtgc acgctggaaa 2280
cttctccacc atcccccagt acttcaagga gaatggctat gtgaccatgt cggtgggaaa 2340
agtctttcac cctgggatat cttctaacca taccgatgat tctccgtata gctggtcttt 2400
tccaccttat catccttcct ctgagaagta tgaaaacact aagacatgtc gagggccaga 2460
tggagaactc catgccaacc tgctttgccc tgtggatgtg ctggatgttc ccgagggcac 2520
cttgcctgac aaacagagca ctgagcaagc catacagttg ttggaaaaga tgaaaacgtc 2580
agccagtcct ttcttcctgg ccgttgggta tcataagcca cacatcccct tcagataccc 2640
caaggaattt cagaagttgt atcccttgga gaacatcacc ctggcccccg atcccgaggt 2700
ccctgatggc ctaccccctg tggcctacaa cccctggatg gacatcaggc aacgggaaga 2760
cgtccaagcc ttaaacatca gtgtgccgta tggtccaatt cctgtggact ttcagcggaa 2820
aatccgccag agctactttg cctctgtgtc atatttggat acacaggtcg gccgcctctt 2880
gagtgctttg gacgatcttc agctggccaa cagcaccatc attgcattta cctcggatca 2940
tgggtgggct ctaggtgaac atggagaatg ggccaaatac agcaattttg atgttgctac 3000
ccatgttccc ctgatattct atgttcctgg aaggacggct tcacttccgg aggcaggcga 3060
gaagcttttc ccttacctcg acccttttga ttccgcctca cagttgatgg agccaggcag 3120
gcaatccatg gaccttgtgg aacttgtgtc tctttttccc acgctggctg gacttgcagg 3180
actgcaggtt ccacctcgct gccccgttcc ttcatttcac gttgagctgt gcagagaagg 3240
caagaacctt ctgaagcatt ttcgattccg tgacttggaa gaggatccgt acctccctgg 3300
taatccccgt gaactgattg cctatagcca gtatccccgg ccttcagaca tccctcagtg 3360
gaattctgac aagccgagtt taaaagatat aaagatcatg ggctattcca tacgcaccat 3420
agactatagg tatactgtgt gggttggctt caatcctgat gaatttctag ctaacttttc 3480
tgacatccat gcaggggaac tgtattttgt ggattctgac ccattgcagg atcacaatat 3540
gtataatgat tcccaaggtg gagatctttt ccagttgttg atgccttgag aattcattta 3600
attcgagctc ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg 3660
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ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3780
aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3840
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tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 4080
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<220>
<221>
<222>
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<211> 7888
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> pAAV-CAG-ohIDS-版本1
<400> 6
cgcgtgccac catgccccca cctagaaccg gaagaggatt gctctggctc ggacttgtgc 60
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ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3720
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3780
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> AAV9-CAG-ohIDS-版本1
<400> 7
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
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atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
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ctccgacaag ccgagcctga aggacattaa gatcatgggg tactccatcc ggactattga 3420
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tatccatgcc ggagagctgt acttcgtgga ctcggacccg ctgcaggacc acaacatgta 3540
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> ohIDS-版本2
<400> 8
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<210> 9
<211> 7888
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> pAAV-CAG-ohIDS-版本2
<400> 9
cgcgtgccac catgcctcct cctagaactg gaagggggct gctgtggctg gggctggtcc 60
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gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3420
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3480
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ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3720
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ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 3900
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<211> 4307
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> AAV9-CAG-ohIDS-版本2
<400> 10
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
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gaacctgctg aaacatttca ggttcaggga cctggaggaa gatccttatc tgccaggaaa 3300
tcccagggag ctgatcgcct acagtcagta tccccgccct tcagacattc ctcagtggaa 3360
ctccgacaag ccatctctga aggatatcaa aattatggga tacagcatcc gcactattga 3420
ttaccgatat accgtgtggg tcgggttcaa ccccgacgag ttcctggcaa attttagtga 3480
tatccacgcc ggcgaactgt attttgtgga ctcagatcct ctgcaggacc ataacatgta 3540
caatgacagc cagggcggag atctgttcca gctgctgatg ccatgagaat tcgagctcgg 3600
tacccgggaa tcaattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg 3660
tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg 3720
gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 3780
ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa 3840
atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc 3900
tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 3960
ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 4020
gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 4080
gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat 4140
ccctcgacct gcagcccaag ctgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa 4200
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4260
cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 4307
<210> 11
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> omIDS
<400> 11
atgagcccac ctcccccacc cccaatctgg cggcagctga gcttcagcct gctgctgggc 60
agcttctgta tcgccctgga aagcgccaag cttgcccagg gcaacagcgc caccgacgcc 120
ctgaacatcc tgctgatcat cgtggacgac ctgaggccca gcctgggatg ctacggcgac 180
aagctggtcc gcagccccaa catcgaccag ctggcttctc acagcgtgct gttccagaac 240
gcattcgcac agcaggccgt gtgcgccccc agcagagtgt ctttcctgac cggcagaagg 300
cccgacacca ccagactgta cgacttcaac agctactggc gggtgcacag cggcaacttc 360
agcaccatcc cccagtactt caaagaaaac ggctacgtga ccatgagcgt gggcaaggtg 420
ttccaccccg gcatcagcag caaccacagc gacgactacc cctacagctg gtccttccca 480
ccctaccacc ccagcagcga gaagtacgag aacaccaaga cctgcaaggg ccaggacggc 540
aagctgcacg ccaacctgct gtgccctgtg gacgtggcag acgtgccaga gggaaccctg 600
cctgacaagc agagcaccga ggaagccatc agactgctgg aaaagatgaa gaccagcgcc 660
agccccttct tcctggccgt gggctaccac aagccccaca tccctttcag ataccccaaa 720
gagttccaga agctgtaccc cctggaaaac atcaccctgg cccccgaccc ccacgtgcca 780
gattctctgc cccccgtggc ctacaacccc tggatggata tccgcgagcg cgaggacgtg 840
caggctctga acatcagcgt gccctacggc cctatccccg aggacttcca gagaaagatc 900
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gccctggacg atctgagact ggcccacaac accatcattg ccttcaccag cgaccacggc 1020
tgggctctgg gagagcacgg cgagtgggcc aagtacagca acttcgacgt ggccaccaga 1080
gtgcccctga tgctgtacgt gcccggcaga accgcccctc tgcctgccgc tggacagaag 1140
ctgttccctt accgggaccc cttcgacccc gccagcgatt ggatggacgc cggcagacac 1200
accgaggacc tggtggaact ggtgtccctg ttccccaccc tggccggact ggctggactg 1260
cctgtgcccc ccagatgccc catccctagc ttccacgtcg aactgtgcag agagggccag 1320
aacctgcaga aacatctgca gctgcacgac ctggaagagg aacccgacct gttcggcaac 1380
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aacgacagcc agcacggcgg cctgctgcac agcctgaggc cttga 1665
<210> 12
<211> 7914
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> pAAV-CAG-omIDS
<400> 12
cgcgtgctag cgccaccatg agcccacctc ccccaccccc aatctggcgg cagctgagct 60
tcagcctgct gctgggcagc ttctgtatcg ccctggaaag cgccaagctt gcccagggca 120
acagcgccac cgacgccctg aacatcctgc tgatcatcgt ggacgacctg aggcccagcc 180
tgggatgcta cggcgacaag ctggtccgca gccccaacat cgaccagctg gcttctcaca 240
gcgtgctgtt ccagaacgca ttcgcacagc aggccgtgtg cgcccccagc agagtgtctt 300
tcctgaccgg cagaaggccc gacaccacca gactgtacga cttcaacagc tactggcggg 360
tgcacagcgg caacttcagc accatccccc agtacttcaa agaaaacggc tacgtgacca 420
tgagcgtggg caaggtgttc caccccggca tcagcagcaa ccacagcgac gactacccct 480
acagctggtc cttcccaccc taccacccca gcagcgagaa gtacgagaac accaagacct 540
gcaagggcca ggacggcaag ctgcacgcca acctgctgtg ccctgtggac gtggcagacg 600
tgccagaggg aaccctgcct gacaagcaga gcaccgagga agccatcaga ctgctggaaa 660
agatgaagac cagcgccagc cccttcttcc tggccgtggg ctaccacaag ccccacatcc 720
ctttcagata ccccaaagag ttccagaagc tgtaccccct ggaaaacatc accctggccc 780
ccgaccccca cgtgccagat tctctgcccc ccgtggccta caacccctgg atggatatcc 840
gcgagcgcga ggacgtgcag gctctgaaca tcagcgtgcc ctacggccct atccccgagg 900
acttccagag aaagatcaga cagagctact tcgccagcgt gtcctacctg gacacccaag 960
tgggacacgt gctgagcgcc ctggacgatc tgagactggc ccacaacacc atcattgcct 1020
tcaccagcga ccacggctgg gctctgggag agcacggcga gtgggccaag tacagcaact 1080
tcgacgtggc caccagagtg cccctgatgc tgtacgtgcc cggcagaacc gcccctctgc 1140
ctgccgctgg acagaagctg ttcccttacc gggacccctt cgaccccgcc agcgattgga 1200
tggacgccgg cagacacacc gaggacctgg tggaactggt gtccctgttc cccaccctgg 1260
ccggactggc tggactgcct gtgcccccca gatgccccat ccctagcttc cacgtcgaac 1320
tgtgcagaga gggccagaac ctgcagaaac atctgcagct gcacgacctg gaagaggaac 1380
ccgacctgtt cggcaacccc agagagctga tcgcctacag ccagtacccc agacccgccg 1440
acttccccca gtggaacagc gacaagccca gcctgaacga catcaaagtg atgggctaca 1500
gcatcaggac cgtggactac agatacaccg tgtgggtcgg attcgacccc agcgagttcc 1560
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aggaccacaa cgtgtacaac gacagccagc acggcggcct gctgcacagc ctgaggcctt 1680
gagcggccgc gaattcgagc tcggtacccg ggaatcaatt cactcctcag gtgcaggctg 1740
cctatcagaa ggtggtggct ggtgtggcca atgccctggc tcacaaatac cactgagatc 1800
tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg 1860
gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac 1920
tcggaaggac atatgggagg gcaaatcatt taaaacatca gaatgagtat ttggtttaga 1980
gtttggcaac atatgcccat atgctggctg ccatgaacaa aggttggcta taaagaggtc 2040
atcagtatat gaaacagccc cctgctgtcc attccttatt ccatagaaaa gccttgactt 2100
gaggttagat tttttttata ttttgttttg tgttattttt ttctttaaca tccctaaaat 2160
tttccttaca tgttttacta gccagatttt tcctcctctc ctgactactc ccagtcatag 2220
ctgtccctct tctcttatgg agatccctcg acctgcagcc caagctgtag ataagtagca 2280
tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 2340
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2400
cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 2460
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2520
cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 2580
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2640
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 2700
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 2760
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 2820
cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2880
ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2940
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3000
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3060
ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 3120
cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 3180
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 3240
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3300
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 3360
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 3420
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 3480
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 3540
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 3600
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 3660
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 3720
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 3780
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 3840
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 3900
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 3960
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4020
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4080
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4140
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4200
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4260
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4320
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 4380
cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 4440
ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 4500
gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 4560
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catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 4680
taaggagaaa ataccgcatc aggcgattcc aacatccaat aaatcataca ggcaaggcaa 4740
agaattagca aaattaagca ataaagcctc agagcataaa gctaaatcgg ttgtaccaaa 4800
aacattatga ccctgtaata cttttgcggg agaagccttt atttcaacgc aaggataaaa 4860
atttttagaa ccctcatata ttttaaatgc aatgcctgag taatgtgtag gtaaagattc 4920
aaacgggtga gaaaggccgg agacagtcaa atcaccatca atatgatatt caaccgttct 4980
agctgataaa ttcatgccgg agagggtagc tatttttgag aggtctctac aaaggctatc 5040
aggtcattgc ctgagagtct ggagcaaaca agagaatcga tgaacggtaa tcgtaaaact 5100
agcatgtcaa tcatatgtac cccggttgat aatcagaaaa gccccaaaaa caggaagatt 5160
gtataagcaa atatttaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt 5220
tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca 5280
aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta 5340
aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta 5400
cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg 5460
aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga 5520
aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg 5580
ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt 5640
tgctttgacg agcacgtata acgtgctttc ctcgttagaa tcagagcggg agctaaacag 5700
gaggccgatt aaagggattt tagacaggaa cggtacgcca gaatcctgag aagtgttttt 5760
ataatcagtg aggccaccga gtaaaagagt ctgtccatca cgcaaattaa ccgttgtcgc 5820
aatacttctt tgattagtaa taacatcact tgcctgagta gaagaactca aactatcggc 5880
cttgctggta atatccagaa caatattacc gccagccatt gcaacggaat cgccattcgc 5940
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 6000
agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct 6060
ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca 6120
ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctact cgacattgat 6180
tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 6240
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 6300
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 6360
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 6420
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 6480
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 6540
ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 6600
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 6660
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 6720
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 6780
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 6840
cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 6900
ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 6960
tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 7020
ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc 7080
gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 7140
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cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg 7260
tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc ccctccccga 7320
gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc 7380
gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg 7440
gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc 7500
gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct 7560
ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg 7620
cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg 7680
tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc 7740
tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct 7800
agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg 7860
ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag cgaa 7914
<210> 13
<211> 4333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> AAV9-CAG-omIDS
<400> 13
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
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cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgct agcgccacca tgagcccacc tcccccaccc ccaatctggc ggcagctgag 1980
cttcagcctg ctgctgggca gcttctgtat cgccctggaa agcgccaagc ttgcccaggg 2040
caacagcgcc accgacgccc tgaacatcct gctgatcatc gtggacgacc tgaggcccag 2100
cctgggatgc tacggcgaca agctggtccg cagccccaac atcgaccagc tggcttctca 2160
cagcgtgctg ttccagaacg cattcgcaca gcaggccgtg tgcgccccca gcagagtgtc 2220
tttcctgacc ggcagaaggc ccgacaccac cagactgtac gacttcaaca gctactggcg 2280
ggtgcacagc ggcaacttca gcaccatccc ccagtacttc aaagaaaacg gctacgtgac 2340
catgagcgtg ggcaaggtgt tccaccccgg catcagcagc aaccacagcg acgactaccc 2400
ctacagctgg tccttcccac cctaccaccc cagcagcgag aagtacgaga acaccaagac 2460
ctgcaagggc caggacggca agctgcacgc caacctgctg tgccctgtgg acgtggcaga 2520
cgtgccagag ggaaccctgc ctgacaagca gagcaccgag gaagccatca gactgctgga 2580
aaagatgaag accagcgcca gccccttctt cctggccgtg ggctaccaca agccccacat 2640
ccctttcaga taccccaaag agttccagaa gctgtacccc ctggaaaaca tcaccctggc 2700
ccccgacccc cacgtgccag attctctgcc ccccgtggcc tacaacccct ggatggatat 2760
ccgcgagcgc gaggacgtgc aggctctgaa catcagcgtg ccctacggcc ctatccccga 2820
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cttcaccagc gaccacggct gggctctggg agagcacggc gagtgggcca agtacagcaa 3000
cttcgacgtg gccaccagag tgcccctgat gctgtacgtg cccggcagaa ccgcccctct 3060
gcctgccgct ggacagaagc tgttccctta ccgggacccc ttcgaccccg ccagcgattg 3120
gatggacgcc ggcagacaca ccgaggacct ggtggaactg gtgtccctgt tccccaccct 3180
ggccggactg gctggactgc ctgtgccccc cagatgcccc atccctagct tccacgtcga 3240
actgtgcaga gagggccaga acctgcagaa acatctgcag ctgcacgacc tggaagagga 3300
acccgacctg ttcggcaacc ccagagagct gatcgcctac agccagtacc ccagacccgc 3360
cgacttcccc cagtggaaca gcgacaagcc cagcctgaac gacatcaaag tgatgggcta 3420
cagcatcagg accgtggact acagatacac cgtgtgggtc ggattcgacc ccagcgagtt 3480
cctggccaac ttcagcgaca tccacgccgg cgagctgtac ttcgtggaca gcgaccccct 3540
gcaggaccac aacgtgtaca acgacagcca gcacggcggc ctgctgcaca gcctgaggcc 3600
ttgagcggcc gcgaattcga gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc 3660
tgcctatcag aaggtggtgg ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga 3720
tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc 3780
tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 3840
actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 3900
gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 3960
tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 4020
ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 4080
attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 4140
agctgtccct cttctcttat ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag 4200
catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct 4260
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4320
agcgagcgcg cag 4333
<210> 14
<211> 646
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> CAG 启动子（CAG promoter）
<400> 14
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgg 646
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 正向引物（Forward Primer）
<400> 15
ttttgtgtac tccaaccccg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 逆向引物（Reverse Primer）
<400> 16
tgtctgcata acagcccagg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 逆向引物突变（Artificial Sequence）
<400> 17
gccctcacat tgccaaagga 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> HBB2序列特异性正向引物（Forward Primer specific for the HBB2 sequence）
<400> 18
cttgagcatc tgacttctgg ctaat 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> HBB2序列特异性逆向引物（Reverse Primer specific for the HBB2 sequence）
<400> 19
gatttgccct cccatatgtc c 21
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> HBB2序列特异性探针（Probe specific for the HBB2 sequence）
<400> 20
ccgagtgaga gacacaaaaa attccaacac 30

Claims (12)

1.一种编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8。
2.一种包含根据权利要求1所述的核苷酸序列的质粒。
3.根据权利要求2所述的质粒，其为SEQ ID NO:6所示的pAAV-CAG-ohIDS-version1，并且登记编号为DSM 29867。
4.根据权利要求2所述的质粒，其为SEQ ID NO:9所示的pAAV-CAG-ohIDS-version2，并且登记编号为DSM 29868。
5.一种重组的血清型9的腺相关病毒载体，所述AAV9载体包含根据权利要求1所述的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其为包含所述的核苷酸序列SEQ ID NO:5的AAV9-CAG-ohIDS-version1，其中所述的核苷酸序列SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14所示的CAG启动子连接。
7.根据权利要求5所述的重组载体，其为包含所述的核苷酸序列SEQ ID NO:8的AAV9-CAG-ohIDS-version2，其中所述的核苷酸序列SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:14所示的CAG启动子连接。
8.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1所述的核苷酸序列，根据权利要求2至4的任意一项所述的质粒，或者根据权利要求5至7的任意一项所述的重组载体。
9.根据权利要求1所述的核苷酸序列、根据权利要求2至4的任意一项所述的质粒或者根据权利要求5至7的任意一项所述的重组载体用于制备治疗II型黏多糖贮积病的药物中的用途。
10.一种生产权利要求5至7的任意一项所定义的载体的方法，其包括以下步骤：
i)提供第一质粒，其包含编码所述的所关注的蛋白质的、被置于第一AAV末端重复序列和第二AAV末端重复序列之间的序列，与编码所述的所关注的蛋白质的序列可操作地连接的CAG启动子；第二载体，其包含得自血清型9的AAV rep基因和AAV cap基因；以及第三载体，其包含所述的腺病毒辅助功能基因；
ii)与所述的步骤i)的载体共转染感受态细胞；
iii)培养所述的步骤ii)的转染细胞；以及
iv)由所述的步骤iii)的培养物纯化所述的表达载体。
11.一种制备根据权利要求2至4的任意一项所述的质粒的方法，其包括以下步骤：
i)特别使用MluI/EcoRI，由所述的起始质粒通过消化，切割编码所述的所关注的蛋白质的序列；
ii)将所述的编码所关注的蛋白质的序列克隆至所述的AAV主链质粒pAAV-CAG的2个限制性位点之间，由此得到所述的相应的质粒，其包含编码所述的所关注的蛋白质的序列。
12.一种包含根据权利要求1所述的核苷酸序列的分离的细胞。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9309534B2 (en) 2010-07-12 2016-04-12 Universidad Autonoma De Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
WO2016041588A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases
US11085055B2 (en) 2014-12-05 2021-08-10 Universitat Autonoma De Barcelona Viral vectors for the treatment of diabetes
EP3978614A3 (en) 2015-01-07 2022-07-27 Universitat Autònoma de Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
IL262211B2 (en) * 2016-04-15 2024-01-01 Univ Pennsylvania Gene therapy for the treatment of type II mucositis
AU2018253303A1 (en) 2017-04-14 2019-10-31 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2 sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells
BR112020005249A2 (pt) 2017-09-22 2020-09-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania terapia de gene para tratar mucopolissacaridose tipo ii
CN108715867A (zh) * 2018-05-31 2018-10-30 深圳市免疫基因治疗研究院 一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
CN108795985A (zh) * 2018-05-31 2018-11-13 深圳市免疫基因治疗研究院 一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
SG11202100781VA (en) * 2018-07-27 2021-02-25 Regenxbio Inc Treatment of mucopolysaccharidosis iva
WO2020099548A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-22 Esteve Pharmaceuticals, S.A. Animal model of mucopolysaccharidoses type iva
TW202039856A (zh) * 2019-03-28 2020-11-01 西班牙商艾斯提夫製藥股份有限公司 製造重組病毒載體之方法
EP4072595A1 (en) * 2019-12-10 2022-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno associated virus vectors for the treatment of hunter disease
CA3173207A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-14 Jacinthe GINGRAS Adeno-associated virus compositions for ids gene transfer and methods of use thereof
CN111718947B (zh) * 2020-06-18 2022-08-23 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于治疗ⅲa或ⅲb型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途
CN114480454B (zh) * 2020-10-27 2024-03-29 华东理工大学 用于治疗粘多糖贮积症ⅱ型的腺相关病毒载体、药物及其应用
WO2022173605A2 (en) 2021-02-10 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids)
WO2022221421A2 (en) * 2021-04-13 2022-10-20 Capsida, Inc. Aav compositions with high brain expression for treating mucopolysaccharidosis ii
AU2022329856A1 (en) * 2021-08-18 2024-03-28 Joint-Stock Company "Generium" Targeted delivery of therapeutic enzymes

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104540517A (zh) * 2012-06-29 2015-04-22 夏尔人类遗传性治疗公司 用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100762945B1 (ko) * 2004-09-08 2007-10-04 진동규 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주
CA3112632A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Biomarin Pharmaceutical Inc. Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof
ES2725200T3 (es) * 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
JPWO2011108451A1 (ja) * 2010-03-01 2013-06-27 日本ケミカルリサーチ株式会社 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法
EP2394667A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-14 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Vectors and sequences for the treatment of diseases
US20130236442A1 (en) * 2010-11-12 2013-09-12 Green Cross Corporation Iduronate-2-sulfatase and use thereof
WO2012101671A1 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
EP3460064B8 (en) * 2011-04-03 2024-03-20 The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna)
CA2868391A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 Stephane Bancel Polynucleotides comprising n1-methyl-pseudouridine and methods for preparing the same
WO2015126729A1 (en) * 2014-02-19 2015-08-27 Bioasis Technologies, Inc. P97-ids fusion proteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104540517A (zh) * 2012-06-29 2015-04-22 夏尔人类遗传性治疗公司 用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞

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