CN104540517A

CN104540517A - 用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞

Info

Publication number: CN104540517A
Application number: CN201380037937.XA
Authority: CN
Inventors: F·博尔戈; M·哈特莱因
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2015-04-22
Also published as: ES2718346T3; IL254560A0; US20140004593A1; MX336716B; JP6067849B2; EA201492183A1; IL274266A; US9719074B2; CO7240394A2; AU2016200460B2; US20180010108A1; KR20150030242A; MY189314A; NZ734670A; HK1209651A1; KR101710487B1; EP2874649A2; IL236343A; EA035511B1; GT201400302A

Abstract

本发明除其它事项以外提供了使用共表达I2S和FGE蛋白的细胞产生具有改善的效能和活性的重组I2S蛋白的方法和组合物。在一些实施方案中，将根据本发明的细胞工程化以同时过表达重组I2S和FGE蛋白。根据本发明的细胞适应于各种细胞培养条件。在一些实施方案中，本发明的细胞适应于大规模悬浮无血清培养。

Description

用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月29日提交的美国临时专利申请系列号61/666,719的优先权；其完整内容在此通过引用并入。

序列表

在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为“2006685-00340_SEQ_LIST”的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大小为25KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景

粘多糖贮积症II型(MPS II，亨特综合症)是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖(GAG)硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素切割末端2-O-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大，组织破坏和器官系统功能障碍。

一般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严重的、进行性的和限制寿命的。

酶替代疗法(ERT)是用于治疗亨特综合症(MPS II)的批准的疗法，其包括向亨特综合症患者施用外源替代I2S酶。

发明概述

本发明除其他事项外提供了用于产生重组I2S蛋白的改进的方法和组合物，所述重组I2S蛋白允许对于亨特综合症的更有效的酶替代疗法。本发明涵盖这样的发现：可由经工程化以共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞产生更具效能的重组I2S蛋白。出乎意料的是，由这种工程化细胞产生的重组I2S蛋白具有异常高水平的Cα-甲酰甘氨酸(FGly)转化百分比(例如，大于70％和高达100％)，从而导致重组I2S蛋白的显著增强的酶活性。此外，已使根据本发明的共表达I2S和FGE蛋白的哺乳动物成功地适应在大规模悬浮培养中生长。因此，本发明使得能够更高效地大规模生产高效能重组I2S蛋白。

因此，在一个方面，本发明提供了包含第一核酸和第二核酸的细胞，所述第一核酸编码具有与SEQ ID NO:1具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白，所述第二核酸编码包含与SEQ ID NO:5具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的同一性的氨基酸序列的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)蛋白，其中第一和/或第二核酸是外源的，并且其中一旦在细胞培养条件(例如，悬浮或贴壁培养)下培养后，细胞产生包含至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白。

在另一个方面，本发明提供了包含第一核酸和第二核酸的细胞，所述第一核酸编码具有与SEQ ID NO:1具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)，所述第二核酸编码包含与SEQID NO:5具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的同一性的氨基酸序列的甲酰甘氨酸产生酶(FGE)蛋白，其中第一和/或第二核酸是外源性的，并且其中一旦在细胞培养条件下培养后，细胞产生包含至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白，并且比生产率为大于约10皮克/细胞/日(例如，大于约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮克/细胞/日)。

在一些实施方案中，第一核酸编码具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列的I2S蛋白。在一些实施方案中，第二核酸编码具有与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列的FGE蛋白。

在一些实施方案中，第一和/或第二核酸可操作地连接至hCMV启动子。

在一些实施方案中，对第一和/或第二核酸进行密码子优化。在一些实施方案中，第一核酸具有与SEQ ID NO:7具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的序列。在具体实施方案中，第一核酸具有SEQ ID NO:7的序列。

在一些实施方案中，第二核酸包含与SEQ ID NO:8具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的序列。在一些实施方案中，第二核酸具有与SEQID NO:8相同的序列。

在一些实施方案中，第一和第二核酸均为外源性的(也称为重组的)。在一些实施方案中，将第一和/或第二核酸整合(例如，稳定地)在细胞的基因组中。在一些实施方案中，第一和/或第二核酸存在于一个或多个染色体外构建体中。

在一些实施方案中，本发明的细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，适合的哺乳动物细胞为人细胞。在某些实施方案中，适合的哺乳动物细胞为CHO细胞。

在一些实施方案中，根据本发明的细胞适应于悬浮培养。在其它实施方案中，根据本发明的细胞是贴壁的。

在其它方面，本发明提供了通过在使得重组I2S和FGE蛋白在细胞中共表达的条件下，培养本文中不同实施方案中描述的细胞来产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法。在一些实施方案中，大规模培养细胞。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模为生物反应器工艺。在一些实施方案中，适用于本发明的生物反应器为选自10L、200L、500L、1000L、1500L、2000L的规模。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模(例如，生物反应器)工艺包括灌注工艺。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模(例如，生物反应器)工艺包括分批培养。在一些实施方案中，适用于本发明的大规模工艺为滚瓶工艺。在一些实施方案中，悬浮培养根据本发明的细胞。在其它实施方案中，贴壁培养根据本发明的细胞。

在一些实施方案中，在无血清培养基(例如，无动物、化学成分确定的或无蛋白质的培养基)中培养根据本发明的细胞。在其它实施方案中，在含血清培养基中培养根据本发明的细胞。

在各个实施方案中，根据本发明的方法还包括纯化重组I2S蛋白的步骤。

在另一个方面，本发明提供了由本文中各个实施方案中描述的细胞或方法产生的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的制剂，其中所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性的氨基酸序列；并且包含至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组I2S蛋白具有至少约20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg或100U/mg的比活性，如使用肝素二糖作为底物通过体外硫酸酯释放活性测定所测定的。

除其它事项以外，本发明还提供了一种包含本文中各个实施方案中描述的重组I2S蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，以及通过向需要治疗的受试者施用本文中描述的重组I2S蛋白或包含所述重组I2S蛋白的药物组合物来治疗亨特综合症的方法。

如本文中所用，除非另有明确所指，否则术语“I2S蛋白”、“I2S”、“I2S酶”或语法等同物是指重组I2S蛋白分子的制剂。

如本申请中所用，术语“约”和“大致”可作为等同物使用。具有或不具有约/大致的用于本申请的任何数字旨在涵盖由相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。

本发明的其他特征、目的和优势在下面的详细描述中显而易见。然而，应当理解，所述详细描述，虽然表示本发明的实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，而非限制性的。根据所述详细描述，本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图简述

共同地构成附图的以下描述的图仅用于说明目的而不是为了限制。

图1描述了编码人艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，并且指示了蛋白质序列内用于N连接糖基化和半胱氨酸转化的潜在位点。

图2描述了用于共表达I2S和FGE的示例性构建体(即，SUMF1)设计。(A)分开的载体上的表达单位(用于共转染或随后的转染)；(B)相同载体上的表达单位(一次转染)：(1)分隔的顺反子和(2)转录连接的顺反子。

图3描述了观察到的与甲酰甘氨酸转化百分比相关的I2S比活性的示例性水平。

图4描述了相较于参考重组I2S酶，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的I2S-AF 2D和4D细胞系产生的重组I2S酶产生的示例性聚糖特征谱。

定义

为了使本发明更容易被理解，首先定义某些术语。对下列术语和其他术语的附加定义陈述于整个说明书中。

氨基酸：如本文中所用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指可并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的20种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文中所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰氨基酸，包括但不限于盐，氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代。氨基酸，包括在肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或利用其他化学基团的取代来进行修饰，所述其他化学基团可改变肽的循环半衰期而不会不利地影响它们的活性。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可以包含一种或多种翻译后修饰，例如与一种或多种化学实体(例如，甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等的缔合。在一些实施方案中，可在用于细胞培养的补充培养基中提供本发明的氨基酸，或可将所述氨基酸用于所述补充培养基。在一些实施方案中，提供于或用于补充细胞培养基中的氨基酸可以以盐或水合物的形式提供。

大致：如本文中所用，术语“大致”或“约”，如用于一个或多个目标值，意指与所述参照值相似的值。在某些实施方案中，除非另外指出或另外地根据上下文显而易见的(除其中这样的数值超过可能值的100％外)，否则术语“大致”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参照值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。

分批培养：如本文中所用，术语“分批培养”是指培养细胞的方法，在所述方法中在培养过程开始时提供最终将用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文中“培养基”的定义)以及细胞本身。通常在某一点停止分批培养，随后收获培养基中细胞和/或组分，并且任选地进行纯化。

生物利用度：如本文中所用，术语“生物利用度”通常是指到达受试者的血流的施用剂量的百分比。

生物活性：如本文中所用，短语“生物活性”是指在生物系统(例如，细胞培养物、生物体等)中具有活性的任何物质的特征。例如，当向生物体施用时对该生物体具有生物作用的物质被认为是有生物活性的。生物活性还可通过体外测定(例如，体外酶促测定如硫酸酯释放测定法)来确定。在具体实施方案中，当蛋白质或多肽具有生物学活性时，共有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物活性”部分。在一些实施方案中，从细胞培养系统产生和/或纯化蛋白质，当向受试者施用时，所述蛋白质显示生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要进一步加工以变得具有生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要翻译后修饰，例如但不限于，糖基化(例如，唾液酸化(sialyation))、法尼基化(farnysylation)、切割、折叠、甲酰甘氨酸转化及其组合，以变得具有生物活性。在一些实施方案中，作为前体(proform)形式(即未成熟的形式)产生的蛋白质可能需要额外的修饰来变得具有生物活性。

生物反应器：如本文所用，术语“生物反应器”是指用于宿主细胞培养物生长的容器。生物反应器可具有任何尺寸，只要它对于哺乳动物细胞的培养是有用的。通常情况下，生物反应器将至少为1升，并且可以是10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或以上或其间的任何容积。生物反应器的内部条件，包括但不限于pH值、克分子渗透压浓度、CO₂饱和度、O₂饱和度、温度及其组合，在培养期间通常受到控制。生物反应器可由适合于在本发明的培养条件下在培养基中保持细胞的任何材料(包括玻璃、塑料或金属)组成。在一些实施方案中，生物反应器可用于进行动物细胞培养。在一些实施方案中，生物反应器可用于进行哺乳动物细胞培养。在一些实施方案中，可将生物反应器与来源于这样的生物体的细胞和/或细胞系(例如但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞和人细胞)一起使用。在一些实施方案中，生物反应器可用于大规模细胞培养生产，并且通常为至少100升，并且可以为200、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或以上或其间的任何容。本领域普通技术人员将意识到，并且将能够选择适合的生物反应器用于实施本发明。

细胞培养物：如本文中所用，这些术语是指在适合于细胞群体存活和/或生长的条件下在培养基中生长的细胞群。如对于本领域普通技术人员将很清楚的，如本文中使用的这些术语可指包含细胞群和所述群于其中生长的培养基的组合。

培养：如本文中所用，术语“培养”或语法等同物是指在有利于生长或存活的条件下维持细胞的过程。术语“培养”和“细胞培养”或任何同义词在本申请中可互换使用。

培养皿：如本文中所用，术语“培养皿”是指可为培养细胞提供无菌环境的任何容器。示例性培养皿包括但不限于玻璃、塑料或金属容器。

酶替代疗法(ERT)：如本文中所用，术语“酶替代疗法(ERT)”指的是通过提供缺失的酶校正酶缺乏的任何治疗策略。在一些实施方案中，缺失的酶通过鞘内施用提供。在一些实施方案中，缺失的酶通过向血流内的输注提供。一旦施用，酶被细胞吸收并转运至溶酶体，在溶酶体中酶用于消除因酶缺乏而在溶酶体中积累的物质。通常情况下，为了使溶酶体酶替代疗法有效，将治疗性酶递送至其中表现贮积缺陷的靶组织中适合的细胞中的溶酶体中。

表达：如本文中所用，核酸序列的“表达”是指下列事件的一个或多个：(1)RNA模板从DNA序列的产生(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)RNA至多肽或蛋白质的翻译；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

补料分批培养：如本文所用，术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，在所述方法中，在培养过程开始后的某个时间给培养物提供额外的组分。所提供的组分通常包括已在培养过程中被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在某个点停止补料分批培养，并且收获培养基中的细胞和/或组分和任选地纯化其。

片段：如本文中所用，术语“片段”是指多肽，并且被定义为给定的多肽的任何分离的部分，所述部分对于该多肽是独特的，或具有该多肽的特征。如本文中所用，该术语还指给定的多肽的保留了全长多肽的至少一部分活性的任何分离的部分。优选地，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少10％。更优选，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。更优选，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。最优选，保留的活性的部分为全长多肽的活性的100％。如本文中所用，该术语还指包含至少在全长多肽中发现的已建立的序列元件的给定的多肽的任何部分。优选地，序列元件跨越全长多肽的至少4-5，更优选至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。

基因：如本文中所用，术语“基因”是指任何核苷酸序列DNA或RNA，所述核苷酸序列的至少某一部分编码分开的终产物，通常地(但不限于)多肽，所述产物在细胞过程的某一方面起作用。该术语并不意味仅指编码多肽或其它分离的终产物的编码序列，而且还可包括调节基础表达水平的编码序列之前和之后的区域，以及各个编码区段(“外显子”)之间的间插序列(“内含子”)。在一些实施方案中，基因可包括调节序列(例如，启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、终止序列、kozac序列、tata盒等)和/或修饰序列。在一些实施方案中，基因可包括对不编码蛋白质但相反地编码功能性RNA分子例如tRNA基因、RNAi诱导剂等的核酸的提及。

基因产物或表达产物：如本文中所用，术语“基因产物”或“表达产物”一般是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。

基因控制元件：如本文中所用，术语“基因控制元件”是指调节与其可操作地连接的基因的表达的任何序列元件。基因控制元件可通过升高或降低表达水平来起作用，并且可位于编码序列之前、之内或之后。基因控制元件可通过调节例如转录的起始、延伸或终止、mRNA剪接、mRNA编辑、mRNA稳定性、细胞内mRNA的定位、翻译的起始、延伸或终止而在基因表达的任何阶段起作用或在基因表达的任何其它阶段起作用。基因控制元件可单独地或彼此组合地起作用。

同源性：如本文中所用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，则它们被认为是彼此“同源的”。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的相似性，则它们被认为是彼此“同源的”。

同一性：如本文中所用，“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。两个核酸序列的百分比同一性的计算，例如，可通过为了最佳比较目的而比对两个序列(例如，可在第一和第二核酸序列的一个或两个中引入缺口来进行最佳比对，并且为了比较目的可忽略不相同的序列)来进行。在某些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度为参照序列的长度的至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大体上100％。随后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置上是相同的。通过考虑两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的测定可使用数学算法来实现。例如，例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4来测定，所述算法已被整合至ALIGN程序(2.0版)中。或者，可使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。各种其它序列比对程序是可用的，并且可被用来测定序列同一性，例如，Clustal。

提高、增加或减少：如本文中所用，术语“提高”、“增加”或“减少”或语法等同物，指示相对于基线测量，例如在本文中描述的治疗开始之前相同个体中的测量或在本文中描述的治疗不存在的情况下对照个体(或多个对照个体)中的测量的值。“对照个体”是患有与正在治疗的个体相同的溶酶体贮积病形式的个体，所述个体与正在治疗的个体年龄大致相同(以确保被治疗个体与对照个体的疾病分期是可比较的)。

鞘内施用：如本文中所用，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指至椎管内的注射(围绕脊髓的鞘内空间)。可使用各种技术，包括但不限于，通过钻孔的侧脑室注射或池穿刺或腰椎穿刺等。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰部区域或腰部区的IT施用或递送，即腰IT施用或递送。如本文中所用，术语“腰部区”或“腰部区域”指的是第三和第四腰(下背部)椎骨之间的区域，更包含地，脊椎的L2-S1区。

分离的：如本文中所用，术语“分离的”是指这样的物质和/或实体，所述物质和/或实体(1)已与当最初产生(无论是在自然界中还是在实验环境中)时与其结合的组分的至少一些分离，和/或(2)已通过人的手产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的与它们最初结合的其它组分分离。在一些实施方案中，分离物质具有约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或高于约99％的纯度。如本文中所用，如果物质基本上不含其它组分的话，则它是“纯的”。如本文中所用，分离的物质和/或实体的百分比纯度的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)。

培养基：如本文中所用，该术语指包含有素滋养生长细胞的营养物的溶液。通常情况下，这些溶液提供了细胞进行最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。该溶液还可包含增强高于最小速率的生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。在一些实施方案中，将培养基配制为对于细胞存活和增殖是最佳的pH和盐浓度。在一些实施方案中，培养基可以是“化学成分确定的培养基”—不含蛋白质、水解产物或未知组合物的组分的无血清培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的培养基不含动物来源的组分并且培养基中的所有组分具有已知的化学结构。在一些实施方案中，培养基可以是“基于血清的培养基”—已补充了动物来源的组分例如但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清和/或其组合的培养基。

核酸：如本文中所用，术语“核酸”以其最广泛的意义是指为寡核苷酸链或可被并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是作为寡核苷酸链或可通过磷酸二酯键并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指个别核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文所使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即，具有除磷酸二酯骨架外的类似物。例如，所谓的“肽核酸”，其在本领域是已知的并且在骨架中具有肽键而非磷酸二酯键，被认为在本发明的范围之内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可以从天然来源中纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当情况下，例如，在化学合成分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，例如具有经化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'方向显示。术语“核酸区段”在本文中用于指作为更长的核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；嵌入碱基；修饰糖(例如，2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中，本发明特别针对“未修饰核酸”，意指未经历化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

灌注工艺：如本文中所用，术语“灌注工艺”是指其中在培养过程开始之后将另外的组分连续地或半连续地提供给培养物的培养细胞的方法。所提供的组分通常包括已在培养过程中被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在连续或半连续的基础上收获培养基中的一部分细胞和/或组分并且任选地对其进行纯化。通常情况下，涉及灌注工艺的细胞培养过程被称为“灌注培养”。通常情况下，在灌注工艺过程中在新鲜培养基中提供营养补充剂。在一些实施方案中，新鲜培养基可与细胞培养过程中使用的基本培养基相同或相似。在一些实施方案中，新鲜的培养基可与基本培养基不同，但包含期望的营养补充剂。在一些实施方案中，新鲜培养基是化学成分确定的培养基。

蛋白质：如本文中所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，至少2个通过肽键彼此连接的氨基酸的串)。蛋白质可包括除氨基酸外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可另外地被加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是如由细胞产生的完整的多肽链(具有或不具有信号序列)，或可为其特征部分。在一些实施方案中，蛋白质有时可包括1个以上的多肽链，例如，通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式缔合。在一些实施方案中，多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以包含多种本领域已知的氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括，例如，末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指具有长度少于约100个氨基酸、少于约50个氨基酸、少于20个氨基酸或少于10个氨基酸的肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。

重组蛋白和重组多肽：如本文中所用，这些术语是指从宿主细胞表达的多肽，所述宿主细胞已经被基因工程化以表达该多肽。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于动物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于昆虫的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于酵母的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于原核生物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于哺乳动物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白可在来源于人的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，所述重组表达的多肽可与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。在一些实施方案中，重组表达的多肽对于宿主细胞可以是外来的，即对于在宿主细胞中正常表达的肽是异源的。或者，在一些实施方案中，重组表达的多肽可以是嵌合的，因为多肽的部分包含与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分对于宿主细胞是外来的。

替代酶：如本文中所用，术语“替代酶”是指可用于至少部分地替代待治疗的疾病中的有缺陷或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语“替代酶”是指可用于至少部分地替代待治疗的溶酶体贮积症中的有缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中积累的材料或者能够挽救或改善一种或多种溶酶体贮积病症状。适合于本发明的替代酶包括野生型溶酶体酶或经修饰的溶酶体酶并且可使用重组的和合成的方法来产生或从自然来源纯化而来。替代酶可以是重组的、合成的、基因活化的或天然的酶。

载体：如本文中所用，“载体”指能够运输与其缔合的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体能够在宿主细胞例如真核和/或原核细胞中染色体外复制和/或表达与其连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。

发明详述

本发明除其它事项以外提供了使用共表达I2S和FGE蛋白的细胞产生具有提高的效能和活性的重组I2S蛋白的方法和组合物。在一些实施方案中，根据本发明的细胞经工程化同时过表达重组I2S和FGE蛋白。根据本发明的细胞适应于各种细胞培养条件。在一些实施方案中，本发明的细胞适应于大规模无血清悬浮培养。

在以下小节中进一步详细地描述了本发明的各个方面。小节的使用并不意味着限制本发明。每一个小节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。

艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)

如本文中所用，I2S蛋白是可取代天然存在的艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的至少部分活性或挽救一个或多个与I2S缺乏相关的表型或症状的任何蛋白质或蛋白质的部分。如本文中所用，术语“I2S酶”和“I2S蛋白”以及语法等同物可互换使用。

通常情况下，人I2S蛋白作为前体形式产生。人I2S的前体形式包含信号肽(全长前体的氨基酸残基1-25)、原肽(全长前体的氨基酸残基26-33)和一条链(全长前体的残基34-550)，所述链可被进一步加工成42kDa的链(全长前体的残基的34-455)和14kDa的链(全长前体的残基446-550)。通常情况下，前体形式也称为全长前体或全长I2S蛋白，其含有550个氨基酸。已除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和典型野生型或天然存在的人I2S蛋白的全长前体的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于表1中。信号肽加以下划线。此外，人I2S蛋白同种型a和b前体的氨基酸序列也分别提供于表1中的SEQ ID NO：3和4。

表1.人艾杜糖-2-硫酸酯酶

因此，在一些实施方案中，I2S酶为成熟人I2S蛋白(SEQ ID NO:1)。如本文中公开的，SEQ ID NO:1代表人I2S蛋白的典型氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S蛋白可以是因在I2S基因的5’UTR内的可选择起始位点上的转录产生的SEQ ID NO:1的剪接同种型和/或变体。在一些实施方案中，适合的替代酶可以是成熟人I2S蛋白的同源物或类似物。例如，成熟人I2S蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的I2S蛋白(例如，SEQ IDNO:1)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰成熟人I2S蛋白。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶与成熟人I2S蛋白(SEQ ID NO:1)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶具有与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶与成熟人I2S蛋白(SEQ ID NO:1)大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶具有与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶包含成熟人I2S蛋白的片段或部分。

或者，I2S酶是全长I2S蛋白。在一些实施方案中，I2S酶可以是全长人I2S蛋白的同源物或类似物。例如，全长人I2S蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的全长I2S蛋白(例如，SEQ ID NO:2)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰全长人I2S蛋白。因此，在一些实施方案中，I2S酶与全长人I2S蛋白(SEQ ID NO:2)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶具有与SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶与SEQ ID NO:2大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶具有与SEQ ID NO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶包含全长人I2S蛋白的片段或部分。如本文中所用，全长I2S蛋白通常包含信号肽序列。

在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶为人I2S同种型a蛋白。在一些实施方案中，适合的I2S酶可以是人I2S同种型a蛋白的同源物或类似物。例如，人I2S同种型a蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的人I2S同种型a蛋白(例如，SEQ ID NO:3)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰人I2S同种型a蛋白。因此，在一些实施方案中，I2S酶与人I2S同种型a蛋白(SEQ ID NO:3)大体上同源。在一些实施方案中，I2S酶具有与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S酶与SEQ ID NO:3大体上同一。在一些实施方案中，适用于本发明的I2S酶具有与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适用于本发明的I2S酶包含人I2S同种型a蛋白的片段或部分。如本文中所用，人I2S同种型a蛋白通常包含信号肽序列。

在一些实施方案中，I2S酶为人I2S同种型b蛋白。在一些实施方案中，I2S酶可以是人I2S同种型b蛋白的同源物或类似物。例如，人I2S同种型b蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的人I2S同种型b蛋白(例如，SEQ ID NO:4)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分I2S蛋白活性的修饰人I2S同种型b蛋白。因此，在一些实施方案中，I2S酶与人I2S同种型b蛋白(SEQ ID NO:4)大体上同源。在一些实施方案中，I2S酶具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，I2S酶与SEQ ID NO:4大体上同一。在一些实施方案中，I2S酶具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的I2S酶包含人I2S同种型b蛋白的片段或部分。如本文中所用，人I2S同种型b蛋白通常包含信号肽序列。

人I2S蛋白的同源物或类似物可按照对于本领域普通技术人员来说是已知的用于改变多肽序列的方法，例如见于汇编此类方法的参考资料中的方法来制备。在一些实施方案中，氨基酸的保守取代包括在下列组内的氨基酸间的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。在一些实施方案中，“保守氨基酸取代”是指不改变在其中进行氨基酸取代的蛋白质的相关电荷或大小特征的氨基酸取代。

在一些实施方案中，I2S酶包含结合于细胞表面上的受体以促进细胞摄取和/或溶酶体靶向的部分。例如，这样的受体可以是不依赖于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)，其结合甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。此外，CI-MPR也结合其它蛋白质，包括IGF-Ⅱ。适合的溶酶体靶向部分可以是IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段(例如，包括那些具有与野生型成熟人IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列的肽)。在一些实施方案中，M6P残基结合的受体可以是阳离子依赖性的。

甲酰甘氨酸生成酶(FGE)

通常情况下，I2S的酶活性受保守半胱氨酸(例如，对应于成熟人I2S(SEQID NO:1)的氨基酸59)至甲酰甘氨酸的翻译后修饰影响，所述甲酰甘氨酸也被称为2-氨基-3-氧代丙酸或氧代-丙氨酸。这种翻译后修饰一般在蛋白质合成过程中发生于内质网中，并且由甲酰甘氨酸生成酶(FGE)催化。I2S的酶比活性通常与I2S具有甲酰甘氨酸修饰所达到的程度正相关。例如，具有相对高的甲酰甘氨酸修饰量的I2S蛋白制剂通常具有相对高的酶比活性；然而具有相对低的甲酰甘氨酸修饰量的I2S蛋白制剂通常具有相对低的酶比活性。

因此，适合于产生根据本发明的重组I2S蛋白的细胞通常还表达FGE蛋白。在一些实施方案中，适合的细胞表达内源性蛋白FGE。在一些实施方案中，适合的细胞经工程化以表达与重组I2S组合的外源(也被称为重组的)甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。在一些实施方案中，适合的细胞经改造以激活内源FGE基因以便FGE蛋白的表达水平或活性升高。

通常情况下，人FGE蛋白产生为前体形式。人FGE的前体形式包含信号肽(全长前体的氨基酸残基1-33)和链(全长前体的残基34-374)。通常情况下，前体形式也称为为全长前体或全长FGE蛋白，其含有374个氨基酸。除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)和典型野生型或天然存在的人FGE蛋白的全长前体的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)示于表2中。

表2.人甲酰甘氨酸生成酶(FGE)

因此，在一些实施方案中，适合本发明的FGE酶为成熟人FGE蛋白(SEQID NO:5)。在一些实施方案中，适合的FGE酶可以是成熟人FGE蛋白的同源物或类似物。例如，成熟人FGE蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的FGE蛋白(例如，SEQ ID NO:5)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分FGE蛋白活性的修饰成熟人FGE蛋白。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与成熟人FGE蛋白(SEQ IDNO:5)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ IDNO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与成熟人FGE蛋白(SEQ IDNO:5)大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ IDNO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶包含成熟人FGE蛋白的片段或部分。

或者，适合本发明的FGE酶为全长FGE蛋白。在一些实施方案中，FGE酶可以是全长人FGE蛋白的同源物或类似物。例如，全长人FGE蛋白的同源物或类似物可以是相较于野生型或天然存在的全长FGE蛋白(例如，SEQID NO:6)包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留大部分FGE蛋白活性的修饰全长人FGE蛋白。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与全长人FGE蛋白(SEQ ID NO:6)大体上同源。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ ID NO:4具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶与SEQ ID NO:6大体上同一。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶具有与SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的FGE酶包含全长人FGE蛋白的片段或部分。如本文中所用，全长FGE蛋白通常包含信号肽序列。

编码示例性FGE蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列公开于US公开号20040229250中，其全部内容通过引用并入本文。

共表达I2S和FGE的细胞

本发明认识到对使用细胞培养系统进行生物活性I2S的高水平商业生产的需要。因为许多生产因素可影响特定宿主细胞的选择，所以本说明书中所公开的核酸分子针对广泛的原核和真核细胞和/或细胞系，包括但不限于，源自细菌菌株、酵母菌株、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞的细胞系。本发明的方面还提供了表达构建体以及用于表达本说明书中公开的天然存在的以及修饰的I2S和/或FGE蛋白的重组稳定细胞系的产生。此外，本发明的方面还提供了用于使用本说明书的公开核酸序列产生表达I2S和FGE的细胞系的方法。

编码I2S和/或FGE蛋白的核酸

在一些实施方案中，提供了核酸分子，其包含编码本文中各个实施方案中描述的目标重组基因(在本文中称为转基因)例如I2S和/或FGE蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，编码转基因的核酸可被修饰来提供编码的I2S和/或FGE蛋白的增加的表达，这也称为密码子优化。例如，编码转基因的核酸可通过改变编码序列的开放阅读框来进行修饰。如本文中所用，术语“开放阅读框”与“ORF”同义，并且意指潜在地能够编码蛋白质或蛋白质的部分的任何核苷酸序列。开放阅读框通常始于起始密码子(表示为，例如AUG(对于RNA分子)和以标准代码表示的DNA分子中的ATG)，并且按密码子三联体阅读直至读框终于终止密码子(表示为，例如UAA、UGA或UAG(对于RNA分子)和以标准代码表示的DNA分子中的TAA、TGA或TAG)。如本文中所用，术语“密码子”是指核酸分子中3个核苷酸的序列，其在蛋白质合成过程中指定特定的氨基酸序列；也称为三联体或密码子三联体。例如，在标准遗传密码中的64个可能的密码子中，两个密码子GAA和GAG编码氨基酸谷氨酰胺，而密码子AAA和AAG指定氨基酸赖氨酸。在标准遗传密码中，3个密码子是终止密码子，其不指定氨基酸。如本文中所用的，术语“同义密码子”是指编码单个氨基酸的密码子中的任一个和全部。除甲硫氨酸和色氨酸外，氨基酸由2至6个同义密码子编码。例如，在标准遗传密码中，编码氨基酸丙氨酸的4个同义密码子是GCA、GCC、GCG和GCU，指定谷氨酰胺的两个同义密码子是GAA和GAG，并且编码赖氨酸的两个同义密码子是AAA及AAG。

在一些实施方案中，编码的I2S和/或FGE蛋白的开放阅读框的核酸可使用标准密码子优化方法来进行修饰。用于密码子优化的各种商业算法是可用的，并且可用于实施本发明。通常情况下，密码子优化并不改变编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，密码子优化可导致氨基酸改变如取代、缺失或插入。通常情况下，这样的氨基酸改变大体上不改变蛋白质活性。

编码I2S和FGE蛋白的示例性核酸序列分别示于下面的SEQ ID NO：7和8中。

SEQ ID NO：7编码艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的示例性核酸序列

ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCAGCGAGACCCAGGCCAACAGCACCACCGACGCCCTGAACGTGCTGCTGATCATCGTGGACGACCTGCGCCCCAGCCTGGGCTGCTACGGCGACAAGCTGGTGCGCAGCCCCAACATCGACCAGCTGGCCAGCCACAGCCTGCTGTTCCAGAACGCCTTCGCCCAGCAGGCCGTGTGCGCCCCCAGCCGCGTGAGCTTCCTGACCGGCCGCCGCCCCGACACCACCCGCCTGTACGACTTCAACAGCTACTGGCGCGTGCACGCCGGCAACTTCAGCACCATCCCCCAGTACTTCAAGGAGAACGGCTACGTGACCATGAGCGTGGGCAAGGTGTTCCACCCCGGCATCAGCAGCAACCACACCGACGACAGCCCCTACAGCTGGAGCTTCCCCCCCTACCACCCCAGCAGCGAGAAGTACGAGAACACCAAGACCTGCCGCGGCCCCGACGGCGAGCTGCACGCCAACCTGCTGTGCCCCGTGGACGTGCTGGACGTGCCCGAGGGCACCCTGCCCGACAAGCAGAGCACCGAGCAGGCCATCCAGCTGCTGGAGAAGATGAAGACCAGCGCCAGCCCCTTCTTCCTGGCCGTGGGCTACCACAAGCCCCACATCCCCTTCCGCTACCCCAAGGAGTTCCAGAAGCTGTACCCCCTGGAGAACATCACCCTGGCCCCCGACCCCGAGGTGCCCGACGGCCTGCCCCCCGTGGCCTACAACCCCTGGATGGACATCCGCCAGCGCGAGGACGTGCAGGCCCTGAACATCAGCGTGCCCTACGGCCCCATCCCCGTGGACTTCCAGCGCAAGATCCGCCAGAGCTACTTCGCCAGCGTGAGCTACCTGGACACCCAGGTGGGCCGCCTGCTGAGCGCCCTGGACGACCTGCAGCTGGCCAACAGCACCATCATCGCCTTCACCAGCGACCACGGCTGGGCCCTGGGCGAGCACGGCGAGTGGGCCAAGTACAGCAACTTCGACGTGGCCACCCACGTGCCCCTGATCTTCTACGTCCCCGGCCGCACCGCCAGCCTGCCCGAGGCCGGCGAGAAGCTGTTCCCCTACCTGGACCCCTTCGACAGCGCCAGCCAGCTGATGGAGCCCGGCCGCCAGAGCATGGACCTGGTGGAGCTGGTGAGCCTGTTCCCCACCCTGGCCGGCCTGGCCGGCCTGCAGGTGCCCCCCCGCTGCCCCGTGCCCAGCTTCCACGTGGAGCTGTGCCGCGAGGGCAAGAACCTGCTGAAGCACTTCCGCTTCCGCGACCTGGAGGAGGACCCCTACCTGCCCGGCAACCCCCGCGAGCTGATCGCCTACAGCCAGTACCCCCGCCCCAGCGACATCCCCCAGTGGAACAGCGACAAGCCCAGCCTGAAGGACATCAAGATCATGGGCTACAGCATCCGCACCATCGACTACCGCTACACCGTGTGGGTGGGCTTCAACCCCGACGAGTTCCTGGCCAACTTCAGCGACATCCACGCCGGCGAGCTGTACTTCGTGGACAGCGACCCCCTGCAGGACCACAACATGTACAACGACAGCCAGGGCGGCGACCTGTTCCAGCTGCTGATGCCCTAG

SEQ ID NO：8编码全长前体甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的示例性核酸序列

ATGGCTGCGCCCGCACTAGGGCTGGTGTGTGGACGTTGCCCTGAGCTGGGTCTCGTCCTCTTGCTGCTGCTGCTCTCGCTGCTGTGTGGAGCGGCAGGGAGCCAGGAGGCCGGGACCGGTGCGGGCGCGGGGTCCCTTGCGGGTTCTTGCGGCTGCGGCACGCCCCAGCGGCCTGGCGCCCATGGCAGTTCGGCAGCCGCTCACCGATACTCGCGGGAGGCTAACGCTCCGGGCCCCGTACCCGGAGAGCGGCAACTCGCGC

ACTCAAAGATGGTCCCCATCCCTGCTGGAGTATTTACAATGGGCACAGATGATCCTCAGATAAAGCAGGATGGGGAAGCACCTGCGAGGAGAGTTACTATTGATGCCTTTTACATGGATGCCTATGAAGTCAGTAATACTGAATTTGAGAAGTTTGTGAACTCAACTGGCTATTTGACAGAGGCTGAGAAGTTTGGCGACTCCTTTGTCTTTGAAGGCATGTTGAGTGAGCAAGTGAAGACCAATATTCAACAGGCAGTTGCAGCTGCTCCCTGGTGGTTACCTGTGAAAGGCGCTAACTGGAGACACCCAGAAGGGCCTGACTCTACTATTCTGCACAGGCCGGATCATCCAGTTCTCCATGTGTCCTGGAATGATGCGGTTGCCTACTGCACTTGGGCAGGGAAGCGGCTGCCCACGGAAGCTGAGTGGGAATACAGCTGTCGAGGAGGCCTGCATAATAGACTTTTCCCCTGGGGCAACAAACTGCAGCCCAAAGGCCAGCATTATGCCAACATTTGGCAGGGCGAGTTTCCGGTGACCAACACTGGTGAGGATGGCTTCCAAGGAACTGCGCCTGTTGATGCCTTCCCTCCCAATGGTTATGGCTTATACAACATAGTGGGGAACGCATGGGAATGGACTTCAGACTGGTGGACTGTTCATCATTCTGTTGAAGAAACGCTTAACCCAAAAGGTCCCCCTTCTGGGAAAGACCGAGTGAAGAAAGGTGGATCCTACATGTGCCATAGGTCTTATTGTTACAGGTATCGCTGTGCTGCTCGGAGCCAGAACACACCTGATAGCTCTGCTTCGAATCTGGGATTCCGCTGTGCAGCCGACCGCCTGCCCACCATGGACTGA

在一些实施方案中，核苷酸变化可改变开放阅读框内的同义密码子，以与在被选择来表达I2S和/或FGE的特定异源细胞中发现的内源密码子使用一致。或者或另外地，核苷酸变化可能改变开放阅读框内的G+C含量，以更好地匹配在存在于异源宿主细胞中的内源核酸序列中发现的开放阅读框的平均G+C含量。核苷酸变化还可改变在I2S或FGE序列中发现的多聚单核苷酸区域或内部调控或结构位点。因而，设想了多种修饰或优化的核苷酸序列，包括但不限于，在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞以及哺乳动物细胞中提供增加的I2S和/或FGE蛋白的表达的核酸序列。

因此，在一些实施方案中，适合于本发明的编码I2S蛋白的核酸具有与SEQ ID NO：7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的编码FGE蛋白的核酸具有与SEQ ID NO：8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列。通常情况下，修饰核酸编码具有或不具有氨基酸序列改变的I2S和/或FGE蛋白。如果存在氨基酸改变，则这样的改变通常不显著改变I2S或FGE蛋白活性。

表达载体

可将编码如在本申请中描述的I2S和/或FGE蛋白的核酸序列分子克隆(插入)入合适的载体以用于在宿主细胞中扩增或表达。多种表达载体可被用于实施本发明，包括但不限于，原核表达载体；酵母表达载体；昆虫表达载体和哺乳动物表达载体。适合于本发明示例性载体包括但不限于基于病毒的载体(例如，基于AAV的载体、基于逆转录病毒的载体、基于质粒的载体)。在一些实施方案中，可将编码I2S和FGE蛋白的核酸序列分别插入分开的载体。在一些实施方案中，可将编码I2S和FGE蛋白的核酸序列分别插入同一载体中。通常情况下，编码I2S或FGE蛋白的核酸可操作地连接于各种调控序列或元件。

调控序列或元件

可将各种调控序列或元件整合在适合于本发明的表达载体中。示例性调控序列或元件包括但不限于启动子、增强子、阻遏子或抑制序列、5'非翻译(或非编码)序列、内含子、3'非翻译(或非编码)序列。

如本文中所用，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如，直接地或通过其他启动子结合蛋白或物质)并起始编码序列的的转录的DNA调控区。启动子序列通常通过转录起始位点结合于其3'末端，并向上游(5'方向)延伸以包含以任何水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。可将启动子与表达控制序列(包括增强子和阻遏序列)或与待表达的核酸可操作地连接，或可操作地连接于所述表达控制序列。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型的。在一些实施方案中，诱导型启动子可以是单向的或生物定向的。在一些实施方案中，启动子可以是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子可以是杂交启动子，其中包含转录调控区的序列获自一个来源并且包含转录起始区的序列获自第二来源。用于将控制元件连接于转基因内的编码序列的系统在本领域是公知的(一般的分子生物学和重组DNA技术描述于在Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，其通过引用并入本文中)。适合于插入转基因以在多种生长和诱导条件于各种宿主细胞中表达的商业载体本领域中也是公知的。

在一些实施方案中，可将特定启动子用于控制转基因在哺乳动物宿主细胞中的表达，例如但不限于，SRα-启动子(Takebe等人，Molec.and Cell.Bio.8:466-472(1988))、人CMV立即早期启动子(Boshart等人，Cell41:521-530(1985)；Foecking等人，Gene 45:101-105(1986))、人CMV启动子、人CMV5启动子、鼠CMV立即早期启动子、EF1-α-启动子、用于肝特异性表达的杂交CMV启动子(例如，通过将CMV立即早期启动子与人α-1-抗胰蛋白酶(HAT)或白蛋白(HAL)启动子的转录启动子元件缀合产生)或用于肝细胞瘤特异性表达的启动子(例如，其中将人白蛋白(HAL；约1000bp)或人α-1-抗胰蛋白酶(HAT，约2000bp)的转录启动子元件与人α-1-微球蛋白和bikunin前体基因(AMBP)的145长的增强子元件组合；HAL-AMBP和HAT-AMBP)、SV40早期启动子区域(Benoist等人，Nature 290:304-310(1981))、黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)立即早期启动子、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445(1981))；或金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人，Nature 296:39-42(1982))。在一些实施方案中，哺乳动物启动子是组成型启动子，例如，但不限于，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPTR)启动子、腺苷脱氨酶启动子、丙酮酸激酶启动子、β-肌动蛋白启动子以及对于本领域普通技术人员来说是已知的其他组成型启动子。

在一些实施方案中，特定启动子可用于控制转基因在原核宿主细胞的表达，例如但不限于β内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731(1978))；tac启动子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))；T7启动子、T3启动子、M13启动子或M16启动子；在酵母宿主细胞中，例如但不限于GAL1、GAL4或GAL10启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶Ⅲ(TDH3)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶Ⅱ(TDH2)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶Ⅰ(TDH1)启动子、丙酮酸激酶(PYK)、烯醇酶(ENO)或丙糖磷酸异构酶(TPI)。

在一些实施方案中，启动子可以是病毒启动子，其中有许多启动子能够在几个宿主细胞类型(包括哺乳动物细胞)中调节转基因的表达。已显示在真核细胞中驱动编码序列的组成型表达的病毒启动子包括例如猿病毒启动子、单纯疱疹病毒启动子、乳头状瘤病毒启动子、腺病毒启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)和其它逆转录病毒的长末端重复(LTR)、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子以及对于本领域普通技术人员来说是已知的其它病毒启动子。

在一些实施方案中，表达载体的基因控制元件还可包括分别牵涉转录和翻译的起始的5'非转录和5'非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、Kozak序列等。增强子元件可任选地用于增加待表达的多肽或蛋白质的表达水平。已显示在哺乳动物细胞中发挥作用的增强子元件的实例包括SV40早期基因增强子(如在Dijkema等人，EMBO J.(1985)4:761中描述的)和来源于劳斯肉瘤病毒(RSV)(如在Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777中描述的)和人巨细胞病毒(如Boshart等人，Cell(1985)41:521中描述的)的长末端重复(LTR)的增强子/启动子。表达载体的基因控制元件将还包括涉及转录和翻译终止的3'非转录和3'非翻译序列。分别地，例如多聚腺苷酸化(polyA)信号用于从启动子转录的mRNA的3'末端的稳定和加工。PolyA信号包括，例如，兔β球蛋白polyA信号、牛生长激素polyA信号、鸡β球蛋白终止子/polyA信号或SV40晚期polyA区。

可选择标记

表达载体将优选地，但任选地包含至少一种可选择标记。在一些实施方案中，可选择标记是可操作地连接于一个或多个基因调控元件的编码抗性基因的核酸序列，当在细胞毒性化学药品和/或药物存在的情况下生长时，该核酸序列赋予宿主细胞维持活力的能力。在一些实施方案中，可选择试剂可用于维持表达载体在宿主细胞内的保留。在一些实施方案中，可以使用可选择试剂以防止表达载体内的转基因序列的修饰(即甲基化)和/或沉默。在一些实施方案中，可选择试剂用于维持载体在宿主细胞内的附加型表达。在一些实施方案中，可选择试剂用于促进转基因序列至宿主细胞基因组中的稳定整合。在一些实施方案中，试剂和/或抗性基因可以包括，但不限于，氨甲蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、zeomycin、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)(对于真核宿主细胞)；四环素、氨苄青霉素、卡那霉素或氯霉素(对于原核宿主细胞)；和URA3、LEU2、HIS3、LYS2、HIS4、ADE8、CUP1或TRP1(对于酵母宿主细胞)。

可将表达载体转染、转化或转导入宿主细胞。如本文中所用，术语“转染”、“转化”和“转导”均指外源核酸序列至宿主细胞中的引入。在一些实施方案中，将包含编码I2S和/或FGE的核酸序列的表达载体同时转染、转化或转导入宿主细胞。在一些实施方案中，将包含编码I2S和/或FGE的核酸序列的表达载体依次转染、转化或转导入宿主细胞。例如，首先可将编码I2S蛋白的载体转染、转化或转导入宿主细胞，随后转染、转化或转导编码FGE蛋白的载体，反之亦然。本领域中公知的转化、转染和转导方法的实例包括脂质体递送，即Hawley-Nelson,Focus 15:73(1193)的lipofectamine^TM(Gibco BRL)法、电穿孔、Graham和van der Erb,Virology,52:456-457(1978)的CaPO₄递送法、DEAE-葡聚糖介导的递送、显微注射、生物轰击颗粒递送、聚凝胺介导的递送、阳离子介导的脂质递送、转导和病毒感染，例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒腺相关病毒和杆状病毒(Baculovirus)(昆虫细胞)。细胞宿主转化的一般方面在本领域中例如由Axel在美国专利号4,399,216；Sambrook，同上，第1-4和16-18章；Ausubel，同上，第1，9，13，15和16章中进行了描述。关于用于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人，Methods in Enzymology(1989),Keown等人，Methods in Enzymology,185:527-537(1990)和Mansour等人，Nature,336:348-352(1988)。

在被引入细胞后，表达载体可被稳定地整合在基因组中，或作为染色体外构建体存在。载体还可被扩增，并且多个拷贝可存在于基因组中或被整合在基因组。在一些实施方案中，本发明的细胞可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个拷贝的编码I2S蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明的细胞可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个拷贝的编码FGE蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明的细胞可包含多个拷贝(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个)的编码I2S和FGE蛋白的核酸。

宿主细胞

如本文中所用，术语“宿主细胞”指可用于产生重组I2S酶的细胞。具体地，宿主细胞适合于大规模产生重组I2S酶。适合的宿主细胞可来源于多种生物体，包括但不限于哺乳动物、植物、鸟类(例如，禽系统)、昆虫、酵母和细菌。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，适合的宿主细胞不是内体酸化缺陷型细胞。

哺乳动物细胞系

可按照本发明将易于进行细胞培养和多肽表达的任何哺乳动物细胞或细胞类型用作宿主细胞。可按照本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人胚胎肾293细胞(HEK293)、HeLa细胞、BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC号：85110503)、人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,TheNetherlands))、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(经亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.,36:59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、小鼠支持细胞(sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞病毒(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。在一些实施方案中，适合的哺乳动物细胞不是内体酸化缺陷型细胞。

此外，可按照本发明使用任何数目的表达多肽或蛋白质的商业可得和非商购可得的杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解，杂交瘤细胞系可能具有不同的营养需要和/或可能需要不同的培养条件来进行最佳生长和多肽或蛋白质表达，并将能够根据需要来修改条件。

非哺乳动物细胞系

可按照本发明将易于进行细胞培养和多肽表达的任何非哺乳动物来源的细胞或细胞类型用作宿主细胞。可按照本发明使用的非哺乳动物宿主细胞和细胞系的非限制性实例包括来源于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosacccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(对于酵母)；草地夜蛾(Sodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusis ni)、黑腹果蝇(Drosophila melangoster)和烟草天蛾(Manducasexta)(对于昆虫)；和大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣形芽孢杆菌(Bacilluslichenifonnis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridia perfringens)、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridia difficile)(对于细菌)；和来自两栖动物的非洲爪蟾(Xenopus Laevis)的细胞和细胞系。

适应贴壁生长对悬浮生长

在某些实施方案中，宿主细胞基于某些优选属性被选择用于产生细胞系，或在被选择用于培养细胞的特定条件下生长。本领域技术人员将理解，这样的属性可以基于已建立的细胞系(即表征的商购可得细胞系)的已知特征和/或性状或通过经验评价来确定。在一些实施方案中，可针对其在饲养层细胞上生长的能力选择细胞系。在一些实施方案中，可针对其在悬浮液中生长的能力选择细胞系。在一些实施方案中，可针对作为贴壁单层细胞生长的能力选择细胞系。在一些实施方案中，可将这样的细胞与任何组织培养皿或用适当的粘附基质处理的任何器皿一起使用。在一些实施方案中，适当的粘附基质选自胶原蛋白(例如胶原蛋白I、II、II或IV)、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、BD Matrigel^TM、基底膜基质、硫酸皮肤素蛋白聚糖、多聚-D-赖氨酸和/或其组合。在一些实施方案中，可在特定生长条件下选择和修饰贴壁宿主细胞以在悬浮液中生长。这样的修饰贴壁细胞以在悬浮液中生长的方法在本领域中是已知的。例如，可通过随时间逐渐从生长培养基除去动物血清来对细胞进行调节，以在悬浮培养中生长。

细胞系选择和评价

根据本发明，针对其以商业可行性规模产生重组I2S蛋白的能力选择经工程化以表达重组I2S蛋白的细胞。具体地，根据本发明的工程化细胞能够以高水平和/或以高酶活性产生重组I2S。在一些实施方案中，一旦在培养条件(例如，标准大规模悬浮或贴壁培养条件)下培养后，期望的细胞可以以如下量产生I2S酶：5皮克/细胞/日或大于5皮克/细胞/日(例如，大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮克/细胞/日)。在一些实施方案中，一旦在细胞培养条件(例如，标准大规模悬浮或贴壁培养条件)下培养后，期望的细胞能够以在如下范围内的量产生I2S酶：约5-100皮克/细胞/日(例如，约5-90皮克/细胞/日、约5-80皮克/细胞/日、约5-70皮克/细胞/日、约5-60皮克/细胞/日、约5-50皮克/细胞/日、约5-40皮克/细胞/日、约5-30皮克/细胞/日、约10-90皮克/细胞/日、约10-80皮克/细胞/日、约10-70皮克/细胞/日、约10-60皮克/细胞/日、约10-50皮克/细胞/日、约10-40皮克/细胞/日、约10-30皮克/细胞/日、约20-90皮克/细胞/日、约20-80皮克/细胞/日、约20-70皮克/细胞/日、约20-60皮克/细胞/日、约20-50皮克/细胞/日、约20-40皮克/细胞/日、约20-30皮克/细胞/日)。

如上所讨论的，通常情况下，I2S的酶活性受保守半胱氨酸(例如，在氨基酸59上)至甲酰甘氨酸的翻译后修饰影响。这种翻译后修饰一般在蛋白质合成过程中发生于内质网中，并且由FGE催化。I2S的酶活性通常与I2S具有甲酰甘氨酸修饰所达到的程度正相关。例如，具有相对高的甲酰甘氨酸修饰量的I2S制剂通常具有相对高的酶比活性；然而具有相对低的甲酰甘氨酸修饰量的I2S制剂通常具有相对低的酶比活性。

还可以预期，I2S与FGE蛋白或mRNA之间的比率还可以影响所产生的重组I2S蛋白上的甲酰甘氨酸修饰。在一些实施方案中，在期望的细胞中表达的I2S和FGE具有不同的蛋白质和/或mRNA表达水平。在一些实施方案中，I2S蛋白或mRNA表达水平为FGE的蛋白质或mRNA水平的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8、9或10倍。在一些实施方案中，重组FGE蛋白或mRNA表达水平为I2S的蛋白质或mRNA水平的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8、9或10倍。

在一些实施方案中，一旦在细胞培养条件(例如，标准大规模悬浮或贴壁细胞培养条件)下培养后，期望的细胞可产生I2S蛋白，该蛋白包含至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。在一些实施方案中，一旦在细胞培养条件(例如，标准大规模悬浮或贴壁细胞培养条件)下培养后，期望的细胞可以以如下量产生I2S酶：约5皮克/细胞/日的量或大于约5皮克/细胞/日(例如，大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮克/细胞/日)，该酶包含至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

FGly转化百分比

各种方法是已知的，并且可以用于测定FGly转化百分比。通常，甲酰甘氨酸转化率的百分比(％FG)可使用下列公式来计算：

例如50％FG意味着一半的纯化的重组I2S是无酶活性的(无任何治疗效果)。各种方法可用于计算％FG。例如，可使用肽图谱。简言之，可使用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或糜蛋白酶)将I2S蛋白消化成短肽。可使用色谱法(例如，HPLC)分离和表征短肽，以便可相较于对照(例如，无FGly转化的I2S蛋白或具有100％FGly转化的I2S蛋白)测定每一个肽(特别地包含对应于成熟人I2S的位置59的位置的肽)的性质和量。可测定包含FGly的肽的量(对应于活性I2S分子的数目)和具有FGly和Cys的肽的总量(对应于总的I2S分子的数目)，和计算反映％FG的比率。

比活性

如上所讨论的，通常情况下，I2S的酶活性受保守半胱氨酸(例如，在氨基酸59)至甲酰甘氨酸的翻译后修饰影响。因此，I2S的酶活性通常与I2S具有甲酰甘氨酸修饰所达到的程度正相关。例如，具有相对高的甲酰甘氨酸修饰量的I2S制剂通常具有相对高的酶比活性；然而具有相对低的甲酰甘氨酸修饰量的I2S制剂通常具有相对低的酶比活性。

如本领域技术人员可理解的，由本发明的细胞产生的重组I2S蛋白的酶活性可通过各种体外和体内测定来测量。在一些实施方案中，如使用肝素二糖作为底物通过体外硫酸酯释放活性测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性为至少约20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg或100U/mg。在一些实施方案中，如使用肝素二糖作为底物通过体外硫酸酯释放活性测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性在约20-100U/mg(例如，约20-90U/mg、约20-80U/mg、约20-70U/mg、约20-60U/mg、约20-50U/mg、约20-40U/mg、约20-30U/mg、约30-100U/mg、约30-90U/mg、约30-80U/mg、约30-70U/mg、约30-60U/mg、约30-50U/mg、约30-40U/mg、约40-100U/mg、约40-90U/mg、约40-80U/mg、约40-70U/mg、约40-60U/mg、约40-50U/mg)的范围内。下文中提供了用于使用肝素二糖作为底物进行体外硫酸酯释放活性测定的示例性条件。通常情况下，该测定测量I2S从天然来源的底物肝素二糖释放硫酸根离子的能力。所释放的硫酸酯可通过离子色谱法来进行定量。在一些情况下，离子色谱法配备有电导率检测器。作为一个非限制性实例，首先将样品缓冲交换至10mM乙酸钠(pH 6)，以解除配制缓冲液中磷酸根离子产生的抑制作用。随后用反应缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.4)将样品稀释至0.075mg/ml，并在37℃于30μL反应体积中以0.3μg I2S/100μg底物的酶与底物比与肝素二糖温育2小时。然后通过在100℃加热3分钟来终止反应。使用具有IonPac AG18保护柱的Dionex IonPac AS18分析柱进行分析。以1.0mL/分钟将等度方法与30mM氢氧化钾一起使用，持续15分钟。从在1.7至16.0纳摩尔的范围内的硫酸酯标准的线性回归分析计算由I2S样品释放的硫酸酯的量。该报告值表达为单位每mg蛋白质，其中1个单位定义为每小时释放的1微摩尔的硫酸酯，并且蛋白质浓度通过A280测量来测定。

在一些实施方案中，还可使用本领域已知的各种其它方法，例如测量4-甲基伞形酮基-硫酸酯至硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)的水解的4-MUF测定来测定由本发明的细胞产生的重组I2S蛋白的酶活性。在一些实施方案中，如通过体外4-MUF测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性为至少约2U/mg、4U/mg、6U/mg、8U/mg、10U/mg、12U/mg、14U/mg、16U/mg、18U/mg或20U/mg。在一些实施方案中，如通过体外4-MUF测定测量的，产生的重组I2S蛋白的期望的酶活性在约0-50U/mg(例如，约0-40U/mg、约0-30U/mg、约0-20U/mg、约0-10U/mg、约2-50U/mg、约2-40U/mg、约2-30U/mg、约2-20U/mg、约2-10U/mg、约4-50U/mg、约4-40U/mg、约4-30U/mg、约4-20U/mg、约4-10U/mg、约6-50U/mg、约6-40U/mg、约6-30U/mg、约6-20U/mg、约6-10U/mg)的范围内。下文中提供了用于进行体外4-MUF测定的示例性条件。通常情况下，4-MUF测定测量I2S蛋白将4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)水解成硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)的能力。1毫单位的活性被定义为在37℃于1分钟内将1纳摩尔的4-MUF-SO₄转化成4-MUF所需的酶的量。通常情况下，通过具有已知活性的I2S测试样品产生的平均荧光单位(MFU)可用于产生标准曲线，该曲线可被用来计算目标样品的酶活性。

细胞培养基和条件

各种细胞培养基和条件可用于使用根据本发明的工程化的细胞产生重组I2S蛋白。例如，可在含血清或无血清的培养基中产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，在无血清培养基中产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，在无动物的培养基，即缺乏动物来源组分的培养基中产生重组I2S蛋白。在一些实施方案中，在化学成分确定的培养基中产生重组I2S蛋白。如本文中所用，术语“化学成分确定的营养培养基”是指基本上所有的化学成分是已知的培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的培养基不含动物来源的组分如血清、血清来源的蛋白质(例如，白蛋白或胎球蛋白)，以及其他组分。在一些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质(例如，蛋白质生长因子或细胞因子)。在一些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质水解产物。在其他情况下，化学成分确定的营养培养基是不含蛋白质的培养基，即，不包含蛋白质、水解产物或未知组合物的组分的无血清培养基。

在一些实施方案中，化学成分确定的培养基可补充一种或多种动物来源组分。这样的动物来源的组分包括但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清、人血清和血清来源的蛋白质例如白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。

各种细胞培养条件可以用于大规模产生重组I2S蛋白，包括但不限于滚瓶培养、生物反应器分批培养和生物反应器补料分批培养。在一些实施方案中，重组I2S蛋白是由悬浮培养的细胞产生的。在一些实施方案中，重组I2S蛋白是通过贴壁细胞产生的。

示例性细胞培养基和培养条件在实施例部分中进行了描述。用于产生重组I2S蛋白的另外的示例性方法和组合物在与其同一日提交的标题为“用于产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法和组合物(Methods and Compositions forProducing Recombinant Iduronate-2-Sulfatase)”的临时申请中进行了描述，所述临时申请的全部公开内容通过引用并入本文。

表达的I2S蛋白的纯化

各种方法可用于纯化或分离根据本文所述的各种方法产生的I2S蛋白。在一些实施方案中，表达的I2S蛋白被分泌至培养基中，从而可以例如通过离心或过滤(例如，作为纯化过程的第一步骤)除去细胞和其他固体。或者或另外地，将表达的I2S蛋白结合在宿主细胞的表面上。在本实施方案中，将表达多肽或蛋白质的宿主细胞裂解以进行纯化。哺乳动物宿主细胞的裂解可以通过本领域普通技术人员公知的许多方法，包括利用玻璃珠进行的物理破碎和对高pH条件的暴露来实现。

可通过标准方法(包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心或差异溶解度、乙醇沉淀)或通过任何其它可获得的用于蛋白质纯化的技术(参见，例如Scopes,ProteinPurification Principles and Practice第2版，Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编辑)，Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ Press,1999；和Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编辑)，Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology(Methods in EnzymologySeries，第182卷),Academic Press,1997，将所有参考资料通过引用并入本文)分离和纯化I2S蛋白。对于具体地免疫亲和色谱法，可通过将蛋白质结合于包含抗体的亲和柱来使其分离，所述抗体是针对该蛋白质产生的并且被附着至固定载体。或者，可通过标准重组技术将亲和标签例如流感病毒衣壳蛋白序列、多聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶连接于蛋白质，以使其通过在适当的亲和柱上通过来容易地纯化。可以在任何或所有阶段添加蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮肽素、胃酶抑素或抑肽酶以在纯化过程中减少或消除所述多肽或蛋白质的降解。当必需裂解细胞以分离和纯化表达的多肽或蛋白质时，特别想要蛋白酶抑制剂。

示例性纯化方法描述于下面的实施例部分中。另外的纯化方法描述于与其同一日提交的标题为“重组I2S蛋白的纯化(Purification of Recombinant I2SProtein)”的临时申请中，所述临时申请的全部公开内容通过引用并入本文。

药物组合物和施用

可按照已知的方法向亨特综合症患者施用纯化的重组I2S蛋白。例如，可静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻))递送纯化的重组I2S蛋白。

在一些实施方案中，可通过静脉内施用向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。

在一些实施方案中，通过鞘内施用向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。如本文中所用的，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指至椎管(围绕脊髓的鞘内空间)内的注射。可使用各种技术，包括但不限于，通过钻孔的侧脑室注射或池穿刺或腰椎穿刺等。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰部区或区域的IT施用或递送，即腰IT施用或递送。如本文中所用，术语“腰部区域”或“腰部区”指的是第三和第四腰(下背部)椎骨之间的区，更包含地，脊椎的L2-S1区域。

在一些实施方案中，通过皮下(即皮肤下方)向受试者施用重组I2S或包含其的药物组合物。为此目的，可使用注射器注射制剂。然而，用于该制剂的施用的其它装置是可获得的，例如注射装置(例如，Inject-ease^TM和Genject^TM装置)；注射器笔(例如GenPen^TM)；无针装置(例如，MediJector^TM和BioJector^TM)；和皮下贴片递送系统。

在一些实施方案中，可将鞘内施用与其他施用途径(例如，静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻))一起使用。

本发明设想了治疗有效量的本文中描述的重组I2S或包含所述重组I2S的药物组合物的单次以及多次施用。可定期施用重组I2S或包含其的药物组合物，这取决于受试者的病况(例如，溶酶体贮积病)的性质、严重性和程度。在一些实施方案中，可定期(例如，每年一次，每六个月一次，每五个月一次，每三个月一次，每两月一次(每两个月一次)，每月一次(每个月一次)，每两周一次(每隔两周一次)，每周一次，每日一次或连续地)周期性施用治疗有效的量的重组I2S或包含其的药物组合物。

可用生理上可接受的载体或赋形剂配制重组I2S或包含其的药物组合物以制备药物组合物。载体和治疗剂可以是无菌的。所述制剂应该适合施用模式。

适合的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖例如甘露醇、蔗糖或其他糖、葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等及其组合。必要时，可将药物制剂与助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，所述助剂其不与活性化合物产生不利反应或干扰它们的活性。在一些实施方案中，使用适合于静脉内施用的水溶性载体。

必要时，组合物或药剂还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂。还可利用常规粘合剂和载体如甘油三酯将组合物配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可按照常规程序将组合物或药剂配制为适于向人类施用的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，单独地提供成分或以单位剂型将成分混合在一起，例如，作为标明活性剂的量的密闭容器例如安瓿或小袋中的干燥的冻干粉剂或无水浓缩物。当将通过输注施用组合物时，可用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶分配所述组合物。当通过注射施用组合物时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水以便可在施用前混合成分。

如本文中所用，主要基于本发明的药物组合物中包含的治疗剂的总量确定术语“治疗有效量”。通常，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在的疾病或病症)。例如，治疗有效量可以是足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如足以调节溶酶体酶受体或它们的活性，从而治疗这样的溶酶体贮积病或其症状(例如，在向受试者施用本发明的组合物后减少或消除“斑状体”或细胞空泡形成的存在或发生率)的量。通常地，向需要其的受试者施用的治疗剂(例如，重组溶酶体酶)的量将取决于受试者的特征。这样的特征包括受试者的状态、疾病的严重度、一般健康状况、年龄、性别和体重。取决于这些和其他相关因素，本领域普通技术人员将能够容易地确定适当的剂量。此外，可任选地将客观和主观测定用于鉴定最佳剂量范围。

通常在可包括多个单位剂量的给药方案中施用治疗有效量。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以例如取决于施用途径、取决于与其它药剂的组合而变化。同样地，对于任何特定患者的具体的治疗有效量(和/或单位剂量)还可取决于多种因素，包括被治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体药剂的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或使用的特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及在医学领域中公知的类似因素。

另外的示例性药物组合物和施用方法描述于标题为“用于艾杜糖-2-硫酸酯酶的CNS递送的方法和组合物(Methods and Compositions for CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase)”的PCT公布WO2011/163649；和2012年3月30日提交的标题为“艾杜糖醛酸2硫酸酯酶的皮下施用(Subcutaneous administration of iduronate 2sulfatase)”的临时申请序列号61/618,638，将这两者的全部公开内容通过引用并入本文。

应当进一步理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和施用或监督酶替代疗法的施用的人的专业判断来随时间调整具体剂量方案，并且本文中所陈述的剂量范围仅是示例性的并且无意限定本发明的范围或实践。

实施例

实施例1.共表达重组I2S和FGE的最优化的细胞系的产生

本实施例举例说明可用于产生重组I2S蛋白的共表达重组I2S和FGE的示例性最优化的细胞系。对于本领域技术人员将很明确的是许多替代方法、表达载体和克隆技术是可获得的。

人艾杜糖的2-硫酸酯酶(I2S)的典型成熟形式是525个氨基酸的糖蛋白，其经历大量的加工和翻译后修饰以进行酶的激活，如糖基化和半胱氨酸至甲酰甘氨酸的转化(图1)。在哺乳动物细胞中，I2S酶内的保守半胱氨酸残基(即，在氨基酸59上)通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)被转化为甲酰甘氨酸。I2S酶的活性位点内的半胱氨酸至甲酰甘氨酸的转化是产生人硫酸酯酶的活性形式中的一个重要步骤。本实验的目的是工程化共表达I2S和FGE的最优化人细胞系以用于产生活性重组I2S。

图2举例说明了许多用于共表达I2S和FGE的示例性构建体设计。例如，I2S和FGE的表达单位可以位于单独的载体，并且可共转染或单独转染单独的载体(图2A)。或者，I2S和FGE的表达单位可以位于同一载体(图2B)。在一种配置中，I2S和FGE可以在相同的载体上，但在单独的启动子控制下，也被称为单独的顺反子(图2B(1))。或者，I2S和FGE可以设计为转录连接的顺反子，即，I2S和FGE被设计为在相同启动子控制下的一个开放阅读框(图2B(2))。通常情况下，内部核糖体进入位点(IRES)被设计来允许信使RNA的不依赖于帽的翻译起始(图2B(2))。

将人细胞系工程化以共表达具有SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列的人I2S蛋白和具有SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的人甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。

SEQ ID NO：2

＞全长前体艾杜糖-2-硫酸酯酶

MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP

SEQ ID NO：6

全长人FGE前体：

MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD

为了产生表达I2S的细胞系，用编码具有SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列的I2S蛋白的密码子优化的核酸序列(SEQ ID NO.7)和编码SEQ ID NO.6中显示的人FGE酶的核酸序列(SEQ ID NO.8)稳定地转染细胞。

SEQ ID NO：7

＞智人密码子优化的艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)、转录变体1、mRNA

ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCAGCGAGACCCAGGCCAACAGCACCACCGACGCCCTGAACGTGCTGCTGATCATCGTGGACGACCTGCGCCCCAGCCTGGGCTGCTACGGCGACAAGCTGGTGCGCAGCCCCAACATCGACCAGCTGGCCAGCCACAGCCTGCTGTTCCAGAACGCCTTCGCCCAGCAGGCCGTGTGCGCCCCCAGCCGCGTGAGCTTCCTGACCGGCCGCCGCCCCGACACCACCCGCCTGTACGACTTCAACAGCTACTGGCGCGTGCACGCCGGCAACTTCAGCACCATCCCCCAGTACTTCAAGGAGAACGGCTACGTGACCATGAGCGTGGGCAAGGTGTTCCACCCCGGCATCAGCAGCAACCACACCGACGACAGCCCCTACAGCTGGAGCTTCCCCCCCTACCACCCCAGCAGCGAGAAGTACGAGAACACCAAGACCTGCCGCGGCCCCGACGGCGAGCTGCACGCCAACCTGCTGTGCCCCGTGGACGTGCTGGACGTGCCCGAGGGCACCCTGCCCGACAAGCAGAGCACCGAGCAGGCCATCCAGCTGCTGGAGAAGATGAAGACCAGCGCCAGCCCCTTCTTCCTGGCCGTGGGCTACCACAAGCCCCACATCCCCTTCCGCTACCCCAAGGAGTTCCAGAAGCTGTACCCCCTGGAGAACATCACCCTGGCCCCCGACCCCGAGGTGCCCGACGGCCTGCCCCCCGTGGCCTACAACCCCTGGATGGACATCCGCCAGCGCGAGGACGTGCAGGCCCTGAACATCAGCGTGCCCTACGGCCCCATCCCCGTGGACTTCCAGCGCAAGATCCGCCAGAGCTACTTCGCCAGCGTGAGCTACCTGGACACCCAGGTGGGCCGCCTGCTGAGCGCCCTGGACGACCTGCAGCTGGCCAACAGCACCATCATCGCCTTCACCAGCGACCACGGCTGGGCCCTGGGCGAGCACGGCGAGTGGGCCAAGTACAGCAACTTCGACGTGGCCACCCACGTGCCCCTGATCTTCTACGTGCCCGGCCGCACCGCCAGCCTGCCCGAGGCCGGCGAGAAGCTGTTCCCCTACCTGGACCCCTTCGACAGCGCCAGCCAGCTGATGGAGCCCGGCCGCCAGAGCATGGACCTGGTGGAGCTGGTGAGCCTGTTCCCCACCCTGGCCGGCCTGGCCGGCCTGCAGGTGCCCCCCCGCTGCCCCGTGCCCAGCTTCCACGTGGAGCTGTGCCGCGAGGGCAAGAACCTGCTGAAGCACTTCCGCTTCCGCGACCTGGAGGAGGACCCCTACCTGCCCGGCAACCCCCGCGAGCTGATCGCCTACAGCCAGTACCCCCGCCCCAGCGACATCCCCCAGTGGAACAGCGACAAGCCCAGCCTGAAGGACATCAAGATCATGGGCTACAGCATCCGCACCATCGACTACCGCTACACCGTGTGGGTGGGCTTCAACCCCGACGAGTTCCTGGCCAACTTCAGCGACATCCACGCCGGCGAGCTGTACTTCGTGGACAGCGACCCCCTGCAGGACCACAACATGTACAACGACAGCCAGGGCGGCGACCTGTTCCAGCTGCTGATGCCCTAG

SEQ ID NO：8

＞智人全长前体甲酰甘氨酸生成酶(FGE)，mRNA

ATGGCTGCGCCCGCACTAGGGCTGGTGTGTGGACGTTGCCCTGAGCTGGGTCTCGTCCTCTTGCTGCTGCTGCTCTCGCTGCTGTGTGGAGCGGCAGGGAGCCAGGAGGCCGGGACCGGTGCGGGCGCGGGGTCCCTTGCGGGTTCTTGCGGCTGCGGCACGCCCCAGCGGCCTGGCGCCCATGGCAGTTCGGCAGCCGCTCACCGATACTCGCGGGAGGCTAACGCTCCGGGCCCCGTACCCGGAGAGCGGCAACTCGCGCACTCAAAGATGGTCCCCATCCCTGCTGGAGTATTTACAATGGGCACAGATGATCCTCAGATAAAGCAGGATGGGGAAGCACCTGCGAGGAGAGTTACTATTGATGCCTTTTACATGGATGCCTATGAAGTCAGTAATACTGAATTTGAGAAGTTTGTGAACTCAACTGGCTATTTGACAGAGGCTGAGAAGTTTGGCGACTCCTTTGTCTTTGAAGGCATGTTGAGTGAGCAAGTGAAGACCAATATTCAACAGGCAGTTGCAGCTGCTCCCTGGTGGTTACCTGTGAAAGGCGCTAACTGGAGACACCCAGAAGGGCCTGACTCTACTATTCTGCACAGGCCGGATCATCCAGTTCTCCATGTGTCCTGGAATGATGCGGTTGCCTACTGCACTTGGGCAGGGAAGCGGCTGCCCACGGAAGCTGAGTGGGAATACAGCTGTCGAGGAGGC CTGCATAATAGACTTTTCCCCTGGGGCAACAAACTGCAGCCCAAAGGCCAGCATTATGCCAACATTTGGCAGGGCGAGTTTCCGGTGACCAACACTGGTGAGGATGGCTTCCAAGGAACTGCGCCTGTTGATGCCTTCCCTCCCAATGGTTATGGCTTATACAACATAGTGGGGAACGCATGGGAATGGACTTCAGACTGGTGGACTGTTCATCATTCTGTTGAAGAAACGCTTAACCCAAAAGGTCCCCCTTCTGGGAAAGACCGAGTGAAGAAAGGTGGATCCTACATGTGCCATAGGTCTTATTGTTACAGGTATCGCTGTGCTGCTCGGAGCCAGAACACACCTGATAGCTCTGCTTCGAATCTGGGATTCCGCTGTGCAGCCGACCGCCTGCCCACCATGGACTGA

通过人CMV启动子控制I2S和FGE编码核酸序列。I2S mRNA的翻译导致550个氨基酸的全长I2S蛋白(SEQ ID NO：2)的合成，所述蛋白质包含25个氨基酸的信号肽。除去信号肽，并且从细胞分泌可溶性酶。

将细菌新霉素磷酸转移酶(neo)编码序列和/或杀稻瘟菌素S(Blasticidin S)脱氨酶(BSD)基因用于使得能够分别使用新霉素类似物G418和/或杀稻瘟菌素选择转染的细胞。此外，在I2S和/或FGE编码载体上使用小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因以允许通过甲氨蝶呤(MTX)选择来分离包含增加的拷贝的I2S和/或FGE编码序列的细胞系。

分离产生I2S的细胞，并使其经历适当的药物选择来分离具有增加的拷贝数的转染的I2S和/或FGE基因的细胞。通过ELISA进行I2S的定量。

也使细胞群在甲氨蝶呤(MTX)中经历分步选择以分离具有增加的I2S生产率的细胞。在MTX选择期间通过ELISA监控I2S的生产率。

经过多轮扩增后，随后通过从包含10％小牛血清的DMEM逐步减少至无血清的化学成分确定的培养基，使几个产生I2S的克隆在无血清培养基中经历悬浮培养适应。通过有限稀释克隆建立几个单独的克隆群体。通过I2S酶活性测定和ELISA筛选菌落。两个稳定的细胞系2D和4D显示高百分比的活力和I2S的强劲表达，并且被选择用于进一步开发。

实施例2.共表达I2S和FGE的稳定细胞系的评价

进行额外的实验以表征共表达I2S和FGE的两个细胞系2D和4D。

比活性

评价I2S酶的第一比活性。使用基于荧光的4-MUF测定分析从2D和4D细胞系产生的I2S酶的比活性。简言之，该测定测量了I2S底物4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)的水解。在4-MUF-SO₄底物被I2S切割后，该分子被转化成硫酸酯和天然发荧光的4-甲基伞形酮(4-MUF)。作为结果，I2S酶活性可以通过评价随时间的荧光信号的整体变化来测定。对于本实验，使从I2S-AF 2D和4D人细胞系产生的纯化的I2S酶与4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUF-SO₄)钾盐(Sigma目录号M-7133)温育。使用以1:100、1:200和1:20,000的原液稀释的商购可得的I2S酶，利用一系列对照参照样品进行测定的校准。在37℃运行酶测定，并使用校准的荧光计进行测定。使用对于每个参考标准获得的荧光值，使用下列公式确定变异系数百分比：

随后使用下列公式将百分比CV值用于计算每一个样品的修正平均荧光，以确定以mU/mL表示的报告酶的活性：

CFU＝负修正平均荧光

DF–稀释因子

1毫单位的活性是在37℃于1分钟内将1纳摩尔的4-甲基伞形酮基硫酸酯转化为4-甲基伞形酮所需的酶的量。

甲酰甘氨酸转化百分比

肽图谱可用于确定FGly转化百分比。I2S活化需要通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)进行的半胱氨酸(对应于成熟人I2S的位置59)至甲酰甘氨酸的转化，如下文中显示的：

因此，甲酰甘氨酸转化的百分比(％FG)可以使用下列公式计算：

例如，50％FG意指一半纯化的重组I2S无酶活性而没有任何治疗效果。

肽图谱用于计算％FG。简言之，使用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或糜蛋白酶)将重组I2S蛋白消化成短肽。使用HPLC分离和表征短肽。表征包含对应于成熟人I2S的位置59的位置的肽以确定相较于对照(例如，无FGly转化的I2S蛋白或具有100％FGly转化的I2S蛋白)位置59上的Cys是否被转化成FGly。可基于对应的峰面积测定包含FGly的肽的量(对应于活性I2S分子的数目)和具有FGly和Cys的肽的总量(对应于总的I2S分子的数目)，并计算反映％FG的比率。

FGly转化百分比与比活性之间的相关性

FGly转化百分比与比活性之间的示例性相关性示于图3中。如可以看到的，该数据表明更高百分比的甲酰甘氨酸转化导致更高的I2S酶活性。

聚糖图谱

测定由细胞系2D和4D产生的重组I2S蛋白的聚糖组成。使用阴离子交换色谱法进行聚糖组成的定量。如下所述，在这些条件下产生的重组I2S的聚糖图谱由七个峰群组成，根据递增量的负电荷(至少部分地因酶消化而从唾液酸和甘露糖-6-磷酸糖型产生)洗脱。简言之，使用如下方式处理利用无血清细胞培养方法(I2S-AF 2D无血清和I2S-AF 4D无血清)获得的纯化的重组I2S和产生的参照重组I2S：(1)使用纯化的神经氨酸酶(分离自产脲节杆菌(Arthrobacter Ureafaciens)(10mU/μL)，Roche Biochemical(Indianapolis,IN)，目录号269611(1U/100μL))以除去唾液酸残留物，(2)在37±1℃用碱性磷酸酶处理2小时以完全释放甘露糖-6-磷酸残留物，(3)碱性磷酸酶+神经氨酸酶或(4)无处理。使用配备有Dionex CarboPac PA1保护柱的CarboPac PA1分析柱，通过利用脉冲安培检测(HPAE-PAD)的高效阴离子交换色谱法分析每一种酶消化。对于每一种测定，运行一系列在0.4至2.0纳摩尔的范围内的唾液酸和甘露糖-6-磷酸标准。在环境柱温度下将使用在100mM氢氧化钠中的48mM乙酸钠的等度方法以1.0mL/分钟的流速运行至少15分钟，以洗脱每个峰。将从每个单独的运行产生的I2S-AF和参照I2S样品的数据分别组合成单个色谱来表示每个相应的重组蛋白的聚糖图谱。如图4中显示的，通过细胞系2D和4D产生的I2S的示例性聚糖图谱显示构成中性、单、双唾液酸化、单磷酸化、三唾液酸化和混合(单唾液酸化和封端的甘露糖-6-磷酸)、四唾液酸化和混合(双唾液酸化和封端的甘露糖-6-磷酸)以及二磷酸化聚糖的代表性洗脱峰(按洗脱顺序)。

实施例3.无血清悬浮细胞培养

本实施例显示大规模无血清悬浮培养可被开发来培养最优化的细胞系以产生重组I2S。

无血清悬浮细胞培养系统

简言之，使用实施例1的2D或4D细胞系建立种子培养物。将细胞转移至含有补充了MTX(以用于选择)的无血清化学成分确定的扩增培养基的250mL组织培养摇瓶中，用碳酸氢钠调节至pH7.3并在37℃、5％CO₂下生长数天。在培养物达到足够的细胞密度和活力后，将初始种子培养物用于将一系列逐步细胞培养扩增的第一扩增接种在500mL组织培养摇瓶中，随后接种于1L组织培养摇瓶中。

通过将每一个1L的培养物转移到10L Cellbag(Wave Europe)，并添加扩增培养基来进行分批培养扩增。在达到足够的细胞密度后，添加新的扩增培养基，并使细胞生长至足够的密度。将10L Cellbag转移到Wave系统(Wave Europe)，并改变培养条件以允许在连续培养基灌注的条件下生长。递送扩增生长培养基，并收集样品以进行pH、谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、铵、乳酸盐、pCO₂和克分子渗透压浓度的离线代谢物分析。

在达到足够的细胞密度后，将整个10L的细胞培养物转移至包含新鲜的扩增培养基的50L Wave Cellbag并使用Wave系统使其生长至足够的细胞密度。

随后使用200L的一次性生物反应器和离心灌注装置(CELLII单位，Pneumatic Scale Corporation)进行细胞扩增，所述装置被设计来浓缩细胞和澄清培养基，以在灌注介导的细胞培养过程中再循环。用50L培养物的一部分接种扩增培养基(调整至pH 7.10)，并使其生长至足够的细胞密度。

随后，将200L培养物的一部分用于接种在生产培养基(被调整至pH 7.20)中的2000L一次性生物反应器和离心机灌注装置(CELL II单位，Pneumatic Scale Corporation)中。使细胞在分批生长条件下生长。在为期2天的生长后，调整条件以进行连续灌注，直至到达过渡期。使细胞在灌注生长条件下生长持续24小时的过渡期。

对于生产期，使用2个Centritech CELL II单位。在过渡期开始后约24小时开始生产期，并且通过调节泄放速率来维持期望的时间。

虽然本文描述的某些化合物、组合物和方法已经根据某些实施方案进行特定的描述，但是下列实施例仅用于说明本发明的化合物，并且无意对其进行限制。

如本文在说明书中和权利要求书中使用的冠词“一个(a)”和“一种(an)”，除非清楚地表明与之相反，否则应该被理解为包括其复数个指示物。在某组的一个或多个成员之间包括“或者”的权利要求或者描述，被认为:如果一个、多于一个或所有组成员存在、被采用或者以其它方式与给定的产品或过程相关，那么就是符合的；除非指示相反或者以其它方式从上下文中明显可见。本发明包括这样的实施方案:其中所述组的只有一个成员存在、被采用或者以其它方式与给定的产品或过程相关。本发明也包括这样的实施方案:其中多于一个或者整个组成员存在、被采用或者以其他方式与给定的产品或过程相关。而且，应该理解，本发明涵盖来自一条或多条所列出的权利要求所有的变型、组合以及排列，其中一种或多种限制、元素、条款、描述性术语等根据所述相同基础权利要求(或者相关、任意其它权利要求)被引入到另一权利要求，除非以其它方式指出或者除非其对于本领域技术人员将明显地出现矛盾或者不一致。当元素以列表形式呈现(例如，在Markush组中或者类似的形式)时，应该理解，所述元素的每个亚组也被公开，并且任何元素可以从所述组删除。应该理解，一般而言，当本发明、或者本发明的某些方面，被指出包括特定的元素、特征等时，那么本发明或者本发明的方面的某些实施方案由这些元素、特征等组成或基本由其组成。为了鉴定起见，本文没有在每种情形中用过多的词汇明确地陈述那些实施方案。还应该理解，本发明的任何实施方案或者方面可以被明确地从所述权利要求排除，无论所述具体的排除是否在本说明书中叙述。本文所引用的出版物、网址和其它参考材料，为了描述本发明的背景以及提供关于其实践的其它细节，都通过引用并入本文。

Claims

1.一种细胞，其包含

第一核酸，其编码包含与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性的氨基酸序列的艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白；和

第二核酸，其编码包含与SEQ ID NO:5具有至少70％的同一性的氨基酸序列的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)蛋白，

其中所述第一和/或所述第二核酸是外源性的，并且其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产生包含至少约70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白。

2.一种细胞，其包含

其中所述第一和/或所述第二核酸是外源性的，并且其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产生包含至少约60％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白并且比生产率为大于约30皮克/细胞/日。

3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产生包含至少约80％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白。

4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产生包含至少约90％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白。

5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产生包含至少约95％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白。

6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中一旦在细胞培养条件下培养后，所述细胞产生包含至少约97％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化的I2S蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和/或所述第二核酸可操作地连接至hCMV启动子。

8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一核酸编码具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列的I2S蛋白。

9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第二核酸编码具有与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列的FGE蛋白。

10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一核酸包含与SEQ ID NO:7具有至少70％的同一性的序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一核酸包含SEQ ID NO:7的序列。

12.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第二核酸包含与SEQ ID NO:8具有至少70％的同一性的序列。

13.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第二核酸包含与SEQ ID NO:8相同的序列。

14.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和第二核酸均为外源性的。

15.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和/或第二核酸被整合在所述细胞的基因组中。

16.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述第一和/或第二核酸存在于一个或多个染色体外构建体中。

17.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

19.根据权利要求17所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

20.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞适应于悬浮培养。

21.一种产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，其包括在使所述重组I2S和FGE蛋白在前述权利要求中任一项所述的细胞中共表达的条件下培养所述细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，其中大规模培养所述细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述大规模是生物反应器工艺。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物反应器工艺是灌注工艺。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述生物反应器为选自10L、200L、500L、1000L、1500L或2000L的规模。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述大规模是滚瓶工艺。

27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中在无血清培养基中培养所述细胞。

28.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中在含血清培养基中培养所述细胞。

29.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中悬浮培养所述细胞。

30.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中贴壁培养所述细胞。

31.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述重组I2S蛋白的步骤。

32.一种重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白，其通过根据权利要求21-31中任一项所述的方法产生。

33.一种重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白，其由根据权利要求1-20中任一项所述的细胞产生。